腫瘍特異的組換え抗体およびその使用
【課題】 癌特異的マーカーに結合しかつヒトに投与されたときの免疫原性が低い抗体が求められている。さらに、毒素または免疫刺激成分を、たとえば融合タンパク質や免疫コンジュゲートとして癌特異的マーカーに送達して、腫瘍細胞を選択的に死滅させる抗体も当技術分野で求められている。
【解決手段】 １箇所または複数のフレームワーク領域および／または相補性決定領域を規定するアミノ酸配列がその免疫原性が低下するよう改変されている組換えＫＳ抗体を提供する。
【解決手段】 １箇所または複数のフレームワーク領域および／または相補性決定領域を規定するアミノ酸配列がその免疫原性が低下するよう改変されている組換えＫＳ抗体を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年５月３日に出願された米国特許出願第６０／２８８，５６４号に対して利益と優先権を主張するものであり、この出願を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に組換え抗体に関する。より詳細には、本発明はヒト上皮細胞接着分子を特異的に結合する組換え抗体ならびに診断、予後予測および治療用作用物質としてのその抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ここ数年にわたり、抗体療法の開発がかなり進歩してきている。たとえば、研究者等は、様々な癌特異的マーカーだけでなく、そのようなマーカーに特異的に結合する様々な抗体を特定している。抗体を使用して、マーカーを発現している癌細胞に特定の分子(たとえば毒素または免疫刺激成分(たとえばサイトカイン))を送達すると、癌細胞を選択的に死滅させることができる(たとえば特許文献１および２を参照)。
【０００４】
ＫＳ−１／４抗体は、ヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)に対するマウス由来のモノクローナル抗体である。ＥｐＣＡＭはある特定の上皮細胞表面の先端に非常に低レベルで発現する。たとえば、ＥｐＣＡＭは、腸管細胞の摂取した食物に面し、循環から離れた細胞表面で発現し、そこでは免疫系の大部分のタンパク質および細胞の影響を受けにくい(非特許文献１)。
【０００５】
しかし、ある特定の条件下では、ＥｐＣＡＭは特定の細胞たとえば上皮起源の腫瘍細胞上に高率に発現する。通常、そのような腫瘍細胞はその極性を失っており、その結果ＥｐＣＡＭが細胞表面全体にわたって発現される。したがって、ＥｐＣＡＭは抗体系免疫刺激成分を腫瘍細胞に向けるのに好都合な腫瘍特異的マーカーである(非特許文献２および３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５４１，０８７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５０，１５０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Balzarら、[1999年]J. Mol. Med. 第77巻：699〜712頁
【非特許文献２】Simonら、[1990年] Proc. Nat. Acad. Sci. USA 第78巻：2755〜2759頁
【非特許文献３】Perezら、[1989年]J Immunol.第142巻:3662〜3667頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし宿主哺乳動物中では抗体が免疫原性を伴う。これは抗体が自己由来でない場合により起こりやすい。その結果、抗体療法の有効性はしばしば抗体に向けられた免疫原性応答によるものである。免疫原性応答は、通常、抗体の全体または部分が宿主哺乳動物と異なる哺乳動物に由来する場合、たとえば抗体がマウス由来でありレシピアントがヒトである場合に増強される。したがって、マウス由来抗体の免疫原性を低減しまたは最小限に抑えるために、マウス由来抗体を改変してヒト抗体により近付けることが有用となろう。
【０００９】
したがって、たとえばキメラ抗体、抗体のヒト化および抗体の張り合わせ(veneering)を含む様々な取り組みが開発されているとはいえ、当技術分野では癌特異的マーカーに結合しかつヒトに投与されたときの免疫原性が低い抗体が求められている。さらに、毒素または免疫刺激成分を、たとえば融合タンパク質や免疫コンジュゲートとして癌特異的マーカーに送達して、腫瘍細胞を選択的に死滅させる抗体も当技術分野で求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒトＥｐＣＡＭを特異的に結合するが、ヒトにおける免疫原性が鋳型よりも低い組換え抗体であるマウス抗ＥｐＣＡＭ抗体を特定したことに基づく。特に、本発明は、１箇所または複数のフレームワーク領域および／または相補性決定領域を規定するアミノ酸配列がその免疫原性が低下するよう改変されている組換えＫＳ抗体を提供する。
【００１１】
本明細書で使用する用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、(i)未処置抗体(たとえばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)、(ii)たとえばＦａｂ断片、Ｆａｂ'断片、(Ｆａｂ')2断片、Ｆｖ断片、１本鎖抗体結合部位、ｓＦｖを含むその抗原結合部分、(iii)二重特異的抗体およびその抗原結合部分、および(iv)多重特異的抗体およびその抗原結合部分を意味すると理解される。
【００１２】
本明細書で使用する用語「結合特異的」、「特異的に結合する」、および「特異的結合」は、抗体の特定の抗原に対する結合親和性が少なくとも約１０6Ｍ‐1、より好ましくは少なくとも約１０7Ｍ‐1、より好ましくは少なくとも約１０8Ｍ‐1、最も好ましくは少なくとも約１０10Ｍ‐1であることを意味すると理解される。
【００１３】
本明細書で使用する用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、主として抗原と相互に作用する超可変領域または免疫グロブリン可変領域ループを意味すると理解される。免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶH)および免疫グロブリン軽鎖可変領域(ＶL)は、図１に示すようにフレームワーク領域の間に挿入されたＣＤＲを３箇所含んでいる。たとえば、配列番号１で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＣＤＲは、Ｓｅｒ２４からＬｅｕ３３(ＣＤＲ１)、Ａｓｐ４９からＳｅｒ５５(ＣＤＲ２)、およびＨｉｓ８８からＴｈｒ９６(ＣＤＲ３)のアミノ酸配列によって規定される。配列番号２で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列に関しては、ＣＤＲは、Ｇｌｙ２６からＡｓｎ３５(ＣＤＲ１)、Ｔｒｐ５０からＧｌｙ６６(ＣＤＲ２)、およびＰｈｅ９９からＴｙｒ１０５(ＣＤＲ３)によって規定される。本明細書で記載する他の抗体の対応するＣＤＲは、対応するＫＳ−１／４の重鎖または軽鎖の配列と揃えて図１Ａ〜１Ｃに示す。
【００１４】
本明細書で使用する用語「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、相補性決定領域に近接する免疫グロブリン可変領域を意味すると理解される。免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶH)および免疫グロブリン軽鎖可変領域(ＶL)は、図１に示すように、どちらも４箇所のＦＲを含む。たとえば、配列番号１で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＦＲは、Ｇｌｎ１からＣｙｓ２３(ＦＲ１)、Ｔｒｐ３４からＰｈｅ４８(ＦＲ２)、Ｇｌｙ５６からＣｙｓ８７(ＦＲ３)、およびＰｈｅ９７からＬｙｓ１０６(ＦＲ４)のアミノ酸配列によって規定される。配列番号２で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＦＲは、Ｇｌｎ１からＳｅｒ２５(ＦＲ１)、Ｔｒｐ３６からＧｌｙ４９(ＦＲ２)、Ａｒｇ６７からＡｒｇ９８(ＦＲ３)、およびＴｒｐ１０６からＳｅｒ１１６(ＦＲ４)のアミノ酸配列によって規定される。本明細書で記載する他の抗体のＦＲは、対応するＫＳ−１／４の重鎖または軽鎖の配列と揃えて図ＸおよびＹに示す。
【００１５】
本明細書で使用する用語「ＫＳ抗体」は、ハイブリドーマによって発現したマウス抗体ＫＳ−１／４が結合した同じヒトＥｐＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗体を意味すると理解される(たとえばCancer Res.1984年、第44巻(2)：681〜7頁を参照)。ＫＳ抗体は、(i)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ１配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹ(配列番号１のアミノ酸２４〜３１)、(ii)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ２配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ(配列番号１のアミノ酸４９〜５５)、(iii)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ３配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＨＱＲＳＧＹＰＹＴ(配列番号１のアミノ酸８８〜９６)、(iv)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ１配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ(配列番号２のアミノ酸２６〜３５)、(v)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ２配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤ(配列番号２のアミノ酸５０〜６２)、(vi)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ３配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＳＫＧＤＹ(配列番号２のアミノ酸配列１０１〜１０５)、または前記諸配列の任意の組合せを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明は、一態様において、その一部分によって免疫グロブリンＶLドメインのフレームワーク領域が規定されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭを特異的に結合する組換え抗体を提供する。一実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ１)が、配列番号５のアミノ酸残基１〜２３によって規定され、ここで、Ｘａａ１はＱまたはＥであり、Ｘａａ３はＬまたはＶであり、Ｘａａ１０はＩまたはＴであり、Ｘａａ１１はＭまたはＬであり、Ｘａａ１３はＡまたはＬであり、Ｘａａ１８はＫまたはＲであり、Ｘａａ２１はＭまたはＬであり、ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ３、Ｘａａ１０、Ｘａａ１１、Ｘａａ１３、Ｘａａ１８またはＸａａ２１に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。アミノ酸は各々の位置で標準の一文字略号で表示する。
【００１７】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ２)が配列番号５のアミノ酸残基３４〜４８によって規定され、ここでＸａａ４１はＳまたはＱであり、Ｘａａ４２はＳまたはＡであり、Ｘａａ４５はＰまたはＬであり、あるいはＸａａ４６はＷまたはＬであり、ただし、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４５またはＸａａ４６に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸配列と同じものではない。
【００１８】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ３)が配列番号５のアミノ酸残基５６〜８７によって規定され、ここでＸａａ５７はＦまたはＩであり、Ｘａａ６９はＳまたはＤであり、Ｘａａ７１はＳまたはＴであり、Ｘａａ７３はＩまたはＴであり、Ｘａａ７７はＭまたはＬであり、Ｘａａ７９はＡまたはＰであり、Ｘａａ８２はＡまたはＦであり、Ｘａａ８４はＴまたはＶであり、ただし、Ｘａａ５７、Ｘａａ６９、Ｘａａ７１、Ｘａａ７３、Ｘａａ７７、Ｘａａ７９、Ｘａａ８２またはＸａａ８４に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００１９】
別の態様では、本発明は、その一部分によって免疫グロブリンＶLドメインのフレームワーク領域が規定されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭを特異的に結合する組換え抗体を提供する。一実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ１)が配列番号６のアミノ酸残基１〜２５によって規定され、ここでＸａａ２はＩまたはＶであり、Ｘａａ９はＰまたはＡであり、Ｘａａ１１はＬまたはＶであり、あるいはＸａａ１７はＴまたはＳであり、ただし、Ｘａａ２、Ｘａａ９、Ｘａａ１１またはＸａａ１７に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００２０】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ２)が配列番号６のアミノ酸残基３６〜４９によって規定され、ここでＸａａ３８はＫまたはＲであり、Ｘａａ４０はＴまたはＡであり、あるいはＸａａ４６はＫまたはＥであり、ただし、Ｘａａ３８、Ｘａａ４０、Ｘａａ４６に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００２１】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ３)が配列番号６のアミノ酸残基６７〜９８によって規定され、ここでＸａａ６８はＦまたはＶであり、Ｘａａ６９はＡまたはＴであり、Ｘａａ７０はＦまたはＩであり、Ｘａａ７３はＥまたはＤであり、Ｘａａ７６はＡまたはＴであり、Ｘａａ８０はＦまたはＹであり、Ｘａａ８３はＩまたはＬであり、Ｘａａ８４はＮまたはＳであり、Ｘａａ８５はＮまたはＳであり、Ｘａａ８８はＮ、ＡまたはＳであり、Ｘａａ９１はＭまたはＴであり、あるいはＸａａ９３はＴまたはＶであり、ただし、Ｘａａ６８、Ｘａａ６９、Ｘａａ７０、Ｘａａ７３、Ｘａａ７６、Ｘａａ８０、Ｘａａ８３、Ｘａａ８４、Ｘａａ８５、Ｘａａ８８、Ｘａａ９１またはＸａａ９３に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ４)が配列番号６のアミノ酸残基１０６〜１１６によって規定されＸａａ１０８はＱまたはＴである。
【００２２】
別の実施形態では、免疫グロブリンＶLドメインが、(i)配列番号９のアミノ酸残基１〜２３と(ii)配列番号８のアミノ酸残基１〜２３とからなる群から選択されたＦＲ１配列を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンＶHドメインが配列番号１８のアミノ酸残基１〜２５によって規定されたＦＲ配列、および／または配列番号１８のアミノ酸残基６７〜９８によって規定されたＦＲ配列を含む。より好ましくはＶLドメインが配列番号９のアミノ酸１〜１０６によって規定されたアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶHドメインが配列番号１８のアミノ酸１〜１１６によって規定されたアミノ酸配列を含む。
【００２３】
さらに、抗体は、たとえば(i)配列番号１のアミノ酸残基２４〜３１、(ii)配列番号１のアミノ酸残基４９〜５５、および／または(iii)配列番号１のアミノ酸残基８８〜９６を含む、ＣＤＲ配列の少なくとも一部分を規定するアミノ酸配列を任意選択で含んでいてもよい。同様に、抗体は、たとえば(i)配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、(ii)配列番号２のアミノ酸配列５０〜６２、および／または(iii)配列番号２のアミノ酸残基１０１〜１０５を含む、ＣＤＲ配列の少なくとも一部分を規定するアミノ酸配列を任意選択で含んでいてもよい。
【００２４】
別の実施形態では、抗体は抗体−サイトカイン融合タンパク質の抗原標的部分(antigen targeting portion)を含む。サイトカインは好ましくはインターロイキンであり、より好ましくはインターロイキン２である。
【００２５】
別の態様では、本発明は本発明の抗体の少なくとも一部分をコードする発現ベクターを提供する。好ましい実施形態では、発現ベクターは配列番号４０で述べるヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明はＥｐＣＡＭの過剰発現を伴う疾患(たとえば、患部組織のＥｐＣＡＭレベルがその疾患に罹患していない組織よりも高い疾患)に罹患しているヒトの患者の診断、予後予測および／または治療を行う方法を提供する。この方法はそのような診断、予後予測または治療が必要な個人に本発明の抗体の一種を投与することを含む。
【００２７】
抗体はそれと結合した診断および／または治療用作用物質を任意選択で含む。作用物質を抗体と融合させて融合タンパク質を生成すればよい。あるいは、作用物質を抗体に化学的に結合させて免疫コンジュゲートを得てもよい。作用物質には、たとえば、トキシン、放射標識、サイトカイン、画像処理剤などが含まれると考える。好ましい実施形態では、本発明の抗体を融合タンパク質としてサイトカインと融合させる。好ましいサイトカインには、好ましくはインターロイキン２(ＩＬ−２)、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８などのインターロイキン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、エリスロポエチンなどの造血因子；ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝プロセス制御因子；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどのインターフェロン；およびケモカインが含まれる。抗体−サイトカイン融合タンパク質がサイトカイン生理活性を示すことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【図１Ｂ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【図１Ｃ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)を特異的に結合する組換え抗体を提供する。本発明の好ましい抗体は、可変領域が変更されており、そのためヒトにおける免疫原性が低下している。本発明の抗体可変領域は、ヒトの患者においてＥｐＣＡＭが過剰発現している腫瘍組織に対して、抗体および抗体融合タンパク質を標的とすることに、特に有用である。好ましい実施形態では、本発明の抗体をサイトカインと融合させて免疫サイトカインを得る。
【００３０】
本発明のタンパク質配列
本発明は、適切にヘテロ二量体化された場合に、ＫＳ抗原またはＫＳＡとしても知られているヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)に結合する抗体可変領域またはＶ領域配列のファミリーを開示する。本発明の好ましいタンパク質は本明細書で述べたようにヒトの患者を治療するのに有用である。したがって、好ましいＫＳ抗体変異型は、ヒトへの投与時の免疫原性を低減するために、ヒト化されているか、免疫原性除去(deimmunize)されているか、またはその両方である。本発明によれば、たとえば、ペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを減少する突然変異を導入してＴ細胞エピトープの潜在的存在を除去または弱化する免疫原性除去方法(たとえばＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７を参照)を使用するか、あるいは、非ヒトＴ細胞エピトープをヒト抗体中に存在するヒト自己エピトープと一致するように変化させる方法(たとえば米国特許第５，７１２，１２０号を参照)を使用することにより、マウスＫＳ抗体に免疫原性除去またはヒト化を施すことができる。
【００３１】
Ｉ．可変軽鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変軽鎖配列を備えている。
【００３２】
【表１】
【００３３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基１〜２３、すなわちＸ−Ｉ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ３位にＬもしくはＶ；Ｘａａ１０位にＩ、Ｔ、もしくはＳ；Ｘａａ１１位にＭもしくはＬ、Ｘａａ１２位にＳもしくはＡ；Ｘａａ１３位にＡ、Ｌ、もしくはＶ；Ｘａａ１７位にＥもしくはＱ、Ｘａａ１８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ１９位にＶもしくはＡ；およびＸａａ２１位にＭ、Ｌ、もしくはＩを有する。より好ましくは、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ３位にＶ、Ｘａａ１０位にＴもしくはＳ、Ｘａａ１１位にＬ、Ｘａａｌ２位にＡ、Ｘａａ１３位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１７位にＱ、Ｘａａ１８位にＲ、Ｘａａ１９位にＡ、およびＸａａ２１位にＬもしくはＩを有する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基２４〜３３、すなわちＳ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｌで表される、免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ１領域に以下のアミノ酸を１個、すなわちＸａａ３２位にＭまたはＩを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ１領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ３２位にＩを有する。
【００３５】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基３４〜４８、すなわちＷ−Ｙ−Ｘ−Ｑ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｉ−Ｘで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、その組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ３６位にＱもしくはＬ、Ｘａａ４１位にＳもしくはＱ；Ｘａａ４２位にＳ、Ａ、もしくはＰ；Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、Ｘａａ４６位にＷもしくはＬおよびＸａａ４８位にＦもしくはＹを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体はＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３６位にＬ、Ｘａａ４１位にＱ、Ｘａａ４２位にＡまたはＰ、Ｘａａ４５位にＬ、Ｘａａ４６位にＬおよびＸａａ４８位にＹを有する。
【００３６】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基５６〜８７、すなわちＧ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、その組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ５９位にＡもしくはＳ、Ｘａａ６９位にＳ、Ｄ、もしくはＴ、Ｘａａ７１位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７３位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７５位にＳもしくはＮ、Ｘａａ７７位にＭもしくはＬ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＩ、Ｘａａ５９位にＳ、Ｘａａ６９位にＤもしくはＴ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７３位にＴ、Ｘａａ７５位にＮ、Ｘａａ７７位にＬ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦ、およびＸａａ８４位にＶを有する。
【００３７】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基９７〜１０６、すなわちＦ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｋ−Ｘ−Ｅ−Ｉ−Ｋで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１０３位にＬまたはＶを有する。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１０３位にＶを有する。
【００３８】
ＩＩ．可変重鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変重鎖配列を備えている。
【００３９】
【表２】
【００４０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基１〜２５、すなわちＱ−Ｘ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ａ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、Ｘａａ１１位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１６位にＥもしくはＳ、およびＸａａ１７位にＴもしくはＳを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、Ｘａａ１１位にＶ、Ｘａａ１６位にＳおよびＸａａ１７位にＳを有する。
【００４１】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基３６〜４９、すなわちＷ−Ｖ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸配列少なくとも１個、すなわち、Ｘａａ３８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ４０位にＴもしくはＡ、Ｘａａ４３位にＫもしくはＱ、およびＸａａ４６位にＫもしくはＥを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＲ、Ｘａａ４０位にＡ、Ｘａａ４３位にＱおよびＸａａ４６位にＥを有する。
【００４２】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基５０〜６６、すなわち、Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＤもしくはＫ、およびＸａａ６５位にＫもしくはＱを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＫ、およびＸａａ６５位にＱを有する。
【００４３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基６７〜９８、すなわちＲ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｑ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｒ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｆ−Ｃ−Ｖ−Ｒで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ；Ｘａａ６９位にＡ、Ｔ、もしくはＶ；Ｘａａ７０位にＦもしくはＩ、Ｘａａ７１位にＳもしくはＴ、Ｘａａ７２位にＬもしくはＡ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ７６位にＡもしくはＴ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＬ、Ｘａａ８０位にＦもしくはＹ、Ｘａａ８３位にＩもしくはＬ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ；Ｘａａ８８位にＮ、Ａ、もしくはＳ；Ｘａａ９１位にＭもしくはＴ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ６９位にＴもしくはＶ、Ｘａａ７０位にＩ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７２位にＡ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ７６位にＴ、Ｘａａ７９位にＬ、Ｘａａ８０位にＹ、Ｘａａ８３位にＬ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡもしくはＳ、Ｘａａ９１位にＴおよびＸａａ９３位にＶを有する。
【００４４】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基９９〜１０５、すなわちＦ−Ｘ−Ｓ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｙで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１００位にＩもしくはＭを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ３領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１００位にＭを有する。
【００４５】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基１０６〜１１６、すなわちＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１０８位にＱもしくはＴ、およびＸ１１１位にＳもしくはＴを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１０８位にＴ、およびＸ１１１位にＴを有する。
【００４６】
ＩＩＩ．精製可変軽鎖
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変軽鎖配列を備えている。
【００４７】
【表３】
【００４８】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基１〜２３、すなわちＸ−Ｉ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ３位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１０位にＩもしくはＴ、Ｘａａ１１位にＭもしくはＬ、Ｘａａ１３位にＡもしくはＬ、Ｘａａ１８位にＫもしくはＲ、およびＸａａ２１位にＭもしくはＬを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ３位にＶ、Ｘａａ１０位にＴ、Ｘａａ１１位にＬ、Ｘａａ１３位にＬ、Ｘａａ１８位にＲおよびＸａａ２１位にＬを有する。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ１１位にＡもしくはＬ、およびＸａａ２１位にＭもしくはＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ１１位にＬ、およびＸａａ２１位にＬを有する、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基３４〜４８、すなわちＷ−Ｙ−Ｑ−Ｑ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｉ−Ｆで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ４１位にＳもしくはＱ、Ｘａａ４２位にＳもしくはＡ、Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、およびＸａａ４６位にＷもしくはＬを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、Ｘａａ４１位にＱ、Ｘａａ４２位にＡ、Ｘａａ４５位にＬおよびＸａａ４６位にＬを有する。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体はＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ４２位にＳもしくはＡ、Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、およびＸａａ４６位にＷもしくはＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ４２位にＡ、Ｘａａ４５位にＬおよびＸａａ４６位にＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５２】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基５６〜８７、すなわちＧ−Ｘ−Ｐ−Ａ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ６９位にＳもしくはＤ、Ｘａａ７１位にＳもしくはＴ、Ｘａａ７３位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７７位にＭもしくはＬ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＩ、Ｘａａ６９位にＤ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７３位にＴ、Ｘａａ７７位にＬ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦおよびＸａａ８４位にＶを有する。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ６９位にＳもしくはＤ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下の置換基少なくとも１個、Ｘａａ５７位にＩ、Ｘａａ６９位にＤ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦ、およびＸａａ８４位にＶを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５４】
ＩＶ．精製可変重鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変重鎖配列を備えている。
【００５５】
【表４】
【００５６】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基１〜２５、すなわちＱ−Ｘ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ａ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、Ｘａａ１１位にＬもしくはＶ、およびＸａａ１７位にＴもしくはＳを有する。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、Ｘａａ１１位にＶ、およびＸａａ１７位にＳを有する。
【００５７】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、およびＸａａ１１位にＬもしくはＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、およびＸａａ１１位にＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基３６〜４９、すなわちＷ−Ｖ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｐ−Ｇ−Ｋ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ４０位にＴもしくはＡ、およびＸａａ４６位にＫもしくはＥを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＲ、Ｘａａ４０位にＡ、およびＸａａ４６位にＥを有する。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸、たとえばＸａａ４６位にＫまたはＥを有する、免疫グロブリン重ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基、たとえばＸａａ４６位にＥを有する、免疫グロブリン重ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。
【００６０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基５０〜６６、すなわちＷ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＤもしくはＫ、およびＸａａ６５位にＫもしくはＱを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のＣＤＲ２領域中のアミノ酸置換基、すなわちＸａａ６３位にＫ、およびＸａａ６５位にＱを有する。
【００６１】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基６７〜９８、すなわちＲ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｌ−Ｘ−Ｔ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｘ−Ｌ−Ｑ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｒ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｆ−Ｃ−Ｖ−Ｒで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ、Ｘａａ６９位にＡもしくはＴ、Ｘａａ７０位にＦもしくはＩ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ７６位にＡもしくはＴ、Ｘａａ８０位にＦもしくはＹ、Ｘａａ８３位にＩもしくはＬ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ；Ｘａａ８８位にＮ、Ａ、もしくはＳ；Ｘａａ９１位にＭもしくはＴ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ６９位にＴ、Ｘａａ７０位にＩ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ７６位にＴ、Ｘａａ８０位にＹ、Ｘａａ８３位にＬ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡもしくはＳ、Ｘａａ９１位にＴ、およびＸａａ９３位にＶを有する。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８８位にＮもしくはＡ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡ、およびＸａａ９３位にＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。
【００６３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基１０６〜１１６、すなわちＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１０８位にＱもしくはＴを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域中のアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１０８位にＴを有する。
【００６４】
したがって、好ましいＶ領域は、マウスＫＳ−１／４可変領域に対応するＶHおよび／またはＶＫ領域のＦＲドメイン中に置換基を含む。さらに、本発明の好ましいＶ領域は、マウスＫＳ−１／４可変領域に対してアミノ酸の挿入および欠失を含まない。
【００６５】
好ましい変異型には、マウスＫＳ−１／４との同一性／相同性が８０％より高い可変領域を有するタンパク質が含まれる。マウスＫＳ可変領域のアミノ酸配列またはその部分を基準配列として使用して、本発明の方法での成功がある程度見込めるだけのアミノ酸類似性を候補配列が備えているかどうかを判定することもできる。好ましくは、変異型配列は、マウスＫＳ可変重鎖または軽鎖ＦＲまたはＣＤＲに少なくとも７０％類似または６０％同一、より好ましくは少なくとも７５％類似または６５％同一、最も好ましくは８０％類似または７０％同一である。
【００６６】
候補ペプチド領域が、マウスＫＳ配列に対する必要な類似性または同一性百分率を有するかどうかを判定するために、SmithおよびWaterman(1981年)のJ. Mol. Biol. 第147巻：195〜197頁に記載されている動的なプログラミングアルゴリズムと、HenikoffおよびHenikoff(1992年)のPNAS第89巻：10915〜10919頁の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２の置換行列とを組み合わせて使用して、まず候補アミノ酸配列とマウスＫＳ配列を整列させる。本発明では、ギャップ挿入ペナルティーの適正値を−１２とし、ギャップ伸長ペナルティーの適正値を−４とする。ＧＣＧプログラム一式(Oxford Molecular Group、イングランド、オックスフォード)など、Smith-WatermanおよびＢＬＯＳＵＭ６２の行列のアルゴリズムを用いて整列を行うコンピュータープログラムは、市販されており、当分野の技術者に広く利用されている。候補配列と基準配列との整列が済んだら類似性百分率のスコアを算出すればよい。各配列の個々のアミノ酸をその互いの類似性に従って連続的に比較する。整列した２個のアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２行列での値が０または負の数である場合、その対の類似性スコアは０であり、そうでない場合、その対の類似性は１．０である。整列したアミノ酸対の類似性スコアの合計を生類似性スコア(raw similarity score)とする。次いでこの生類似性スコアを候補配列または基準配列の短い方のアミノ酸数で割ることによって正規化する。この正規化された生スコアが類似性百分率である。あるいは、同一性百分率を算出するには、整列した各配列のアミノ酸をここでも連続的に比較する。アミノ酸が同一でない場合その対の同一性スコアは０であり、そうでない場合その対の同一性スコアは１．０である。同一な整列アミノ酸の合計を生同一性(raw identity score)スコアとする。次いでこの生同一性スコアを候補配列または基準配列の短い方のアミノ酸数で割ることによって正規化する。この正規化された生スコアが同一性百分率である。類似性および同一性百分率を算出する目的では挿入および欠失を無視する。したがって最初の整列ではギャップペナルティーを使用してもこの算出ではそれを使用しない。
【００６７】
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、他の真核生物もしくは原核生物細胞などの細胞からのＫＳ抗体の発現を検定する方法も開示する(実施例１を参照)。好ましい方法では、ＫＳ抗体Ｖ領域を未処置のヒト抗体成分として発現させ、ヒトＦｃ領域を検出するＥＬＩＳＡによって真核細胞系からのその抗体の発現を検定する。ＫＳ抗体のＥｐＣＡＭへの結合を精密に定量化するには、Ｂｉａｃｏｒｅによる検定を使用すればよい。
【００６８】
ヒトの疾患のＫＳ抗体融合タンパク質での治療
本発明は、癌などのヒトの疾患を治療するのに有用なＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質の配列も開示する。ＫＳ−１／４−ＩＬ２など、あるＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質(たとえば実施例Ｘの構築物３を参照)を使用すると、この抗体に対する免疫応答が驚くほど少ない状態で癌に罹患しているヒトの患者を治療することができる。
【００６９】
ＫＳ−１／４(ＶＨ２／ＶＫ１)−ＩＬ２でヒトの癌を治療する間は、ＫＳ−１／４(構築物３)−ＩＬ２で治療するよりも免疫原性が少ないことがわかっている。具体的には、臨床試験の間、抗イディオタイプ抗体、および抗体−ＩＬ２接合部またはＩＬ−２部分に指向性のある抗体を有する患者が見られる頻度は、ＫＳ−１／４(構築物３)−ＩＬ２を有する患者よりもずっと低い。本発明の抗体可変領域は、他のサイトカイン類、たとえばインターロイキン１、２、６、１０、もしくは１２；インターフェロンαおよびβ；ＴＮＦ、およびＩＮＦγと融合させることもできる。以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明がより十分に理解されよう。
【実施例】
【００７０】
[実施例１]
ＫＳ抗体の発現およびその抗原結合活性の検定のための方法および試薬
１Ａ．細胞培養および形質移入
次の実施例では以下の一般的技術を使用した。一過性の形質移入については、リン酸カルシウムを用いるプラスミドＤＮＡの共沈によって、ヒト腎臓２９３細胞にプラスミドＤＮＡを導入した[Sambrook等(1989年)の「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク]。
【００７１】
安定した形質移入クローンを得るためにプラスミドＤＮＡを電気穿孔法によってマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞に導入した。ＮＳ／０細胞は１０％の胎児ウシ血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。約５×１０6個の細胞をＰＢＳで１度洗浄し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液(ＰＢＳ)中に再懸濁させた。次いで氷上のGene Pulser Cuvette(電極間ギャップ０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ)中で１０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡを細胞と共に１０分間インキュベートした。設定を０．２５Ｖかつ５００μＦとしたGene Pulser(ＢｉｏＲａｄ)を使用して電子穿孔法を行った。細胞を氷上で１０分間回復させ、その後増殖培地中に再懸濁させ、次いで２枚の９６ウェルプレートに塗末した。形質移入後２日目に導入する１００ｎＭのメトトレキサート(ＭＴＸ)の存在下で増殖させて、安定に形質移入されたクローンを選択した。細胞に３日毎にもう２〜３回養分補給を行い、ＭＴＸ耐性クローンを２〜３週間中に出現させた。クローンの上清を抗ヒトＦｃによるＥＬＩＳＡによって検定して高産生株を特定した[Gillies等(1989年)のJ. Immunol. Methods 第125巻：191頁］。高産生クローンを単離し１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中で増殖させた。
【００７２】
１Ｂ．ＥＬＩＳＡ
３種の異なるＥＬＩＳＡを利用してＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの上清中タンパク質産物濃度を決定した。抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡは、ヒトＦｃ含有タンパク質、たとえばキメラ抗体の量を測定するのに使用した。抗ヒトκＥＬＩＳＡは(キメラもしくはヒト免疫グロブリンの)κ軽鎖の量を測定するのに使用した。抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡは試験サンプル中のｍｕＦｃ含有タンパク質量を測定するのに使用した(以下の実施例１Ｃを参照)。以下に抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡを詳述する。
【００７３】
Ａ．プレートをコートする
ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno Research)を９６ウェルプレート(Nunc-Immuno plate Maxisorp)のウェル当り１００μｌ使用してＥＬＩＳＡプレートをコートした。コートしたプレートを覆い４℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ(Ｔｗｅｅｎ２０)で４回洗浄し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清を２００μｌ／ウェル使用してブロックした。ブロッキング緩衝液と共に３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで４回洗浄し、ペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。
【００７４】
Ｂ．試験サンプルおよび二次抗体とのインキュベート
ＰＢＳに１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎを含んだサンプル緩衝液で試験サンプルを適当な濃度に希釈した。既知の濃度の(ヒトＦｃとの)キメラ抗体を用いて検量線を作成した。検量線を作成するには、サンプル緩衝液で連続希釈を行って、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲の検量線を得る。プレートに１００μｌ／ウェルの希釈したサンプルおよび基準物質を加え、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。
【００７５】
インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに１００μｌの二次抗体を加え、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗ヒトＩｇＧ(Jackson Immuno Research)をサンプル緩衝液で約１：１２０，０００に希釈した。ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの各ロットについて、二次抗体の厳密な希釈度を決定する必要があった。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。
【００７６】
Ｃ．発色
１００μｌ／ウェルの基質溶液をプレートに加えた。この基質溶液は、新たに加えたＨ2Ｏ2 ０．０３％を含んだｐＨ５の０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液１５ｍｌにｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩(ＯＰＤ)３０ｍｇ(１錠)を溶解させることによって調製した。暗所において室温で３０分間発色させた。コートしたプレートや二次抗体などのロット間の変動性に応じて発色時間を変更した。検量線で発色を観察して反応を停止させる時間を決定した。反応は１００μｌ／ウェルの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることによって停止した。４９０ｎｍおよび６５０ｎｍの両方に設定し、４９０ｎｍのバックグラウンドＯＤから６５０ｎｍのバックグラウンドＯＤを減じるようにプログラムされたプレートリーダーでプレートを読み取った。
【００７７】
抗ヒトκＥＬＩＳＡは、使用した二次抗体がホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトκ(Southern Biotechnology Assoc. Inc.、アラバマ州バーミングハム)を、１：４０００希釈で使用したものであったことを除き、上述したものと同じ手順に従った。
【００７８】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno Research)を１００μｌ／ウェル使用してコートし、二次抗体がホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧであるＦｃγ(Jackson Immuno Research)を１：５０００希釈で使用したものであったことを除き、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡの手順も同様である。
【００７９】
１Ｃ．ＫＳ抗原(ＫＳＡ、ＥｐＣＡＭ)のクローニングおよびヒトＥｐＣＡＭ−マウスＦｃとしての可溶性形態の発現
Dynabeads mRNA Direct Kit(Dynal, Inc.、ニューヨーク州レークサクセス)を製造者の指示に従って使用して、ＬｎＣＡＰ細胞からメッセンジャーＲＮＡ(ＭＲＮＡ)を調製した。最初の鎖のｃＤＮＡをオリゴ(ｄＴ)および逆転写酵素で合成してから、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって、(ＫＳ抗原またはＫＳＡとしても知られている)上皮細胞接着分子をコードする全長ｃＤＮＡをクローン化した。ＰＣＲプライマーの配列は、PerezおよびWalker(1989年)のJ. Immunol. 第142巻：3662〜3667頁に記載の公表されている配列に基づいている。センスプライマ−の配列は、 ＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡ(配列番号２７)であり、ナンセンスプライマ−の配列は、ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴ(配列番号２８)であり、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンであるアンチコドンを太字で表示し、制限部位ＸｂａＩ(ＴＣＴＡＧＡ)およびＸｈｏＩ(ＣＴＣＧＡＧ)には下線を引いてある。ＰＣＲ産物をクローン化し、いくつかの独立したクローンの配列決定を行うことによってＫＳＡ配列が正確であることを確認した。ＬｎＣＡＰから得たＫＳＡのｃＤＮＡ配列は、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞から得られた公表されているＫＳＡ配列(PerezおよびWalker、1989年)と本質的に同一であった。しかし、１１５番目のアミノ酸残基の箇所がＬｎＣＡＰから得たヌクレオチド配列ではＡＣＧでなくＡＴＧ(Ｔｈｒの代わりにＭｅｔ)であり、２７７番目のアミノ酸残基の箇所がＬｎＣＡＰから得たヌクレオチド配列ではＡＴＧでなくＡＴＡ(Ｍｅｔの代わりにＩｌｅ)であった。
【００８０】
ＫＳ−１／４抗体が組換えＫＳＡに結合したことを免疫染色によって実証した。細胞、たとえばＣＴ２６、Ｂ１６などに適切な哺乳動物発現ベクター(米国特許第５，５４１，０８７号に記載のｐｄＣｓ)に入れた全長ＫＳＡを形質移入することによって、ＫＳＡを表面に発現させてから、ＫＳ−１／４抗体の免疫染色を行った。ＫＳＡの可溶性抗体としての発現についてはＫＳＡの膜貫通ドメインをコードするＤＮＡの部分が欠失していた。発現、検出および精製を行いやすくするために可溶性ＫＳＡをＫＳＡ−ｍｕＦｃとして発現させたがその構築を以下で記載する。可溶性ＫＳＡをコードする７８０ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片を、次のリンカー−アダプターを介してｍｕＦｃをコードするＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片(米国特許第５，７２６，０４４号)に連結した。
【００８１】
【表５】
【００８２】
可溶性ＫＳＡ−ｍｕＦｃをコードするＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐｄＣｓベクターに連結した。得られた発現ベクターｐｄＣｓ−ＫＳＡ−ｍｕＦｃを使用して細胞に形質移入を施し、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡによってＫＳＡ−ｍｕＦｃを発現する安定なクローンを特定した。
【００８３】
１Ｄ．抗原結合の測定
まず、供給業者のプロトコルに従って、ＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィー(Repligen、マサチューセッツ州ケンブリッジ)によって条件培地中のＫＳＡ−ｍｕＦｃを精製した。精製したＫＳＡ−ｍｕＦｃをＰＢＳ中５μｇ／ｍｌで１００μｌ／ウェル使用して、９６ウェルプレート(Nunc−Immuno plate、Maxisorp)をコートした。このアッセイは実施例１Ｂに記載のＥＬＩＳＡの手順と同様とした。簡潔に述べると、コートしたプレートを覆い４℃で終夜インキュベートした。次いでプレートを洗浄しブロックした。試験サンプルをサンプル緩衝液で適当な濃度に希釈し１００μｌ／ウェルをプレートに加えプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに二次抗体であるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ(Jackson Immuno Research)１００μｌを加え、サンプル緩衝液で約１：１２０，０００に希釈した。次いで実施例１Ｂに記載したとおりにプレートを発色させ、読み取った。
【００８４】
１Ｅ．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用する、ＥｐＣＡＭから得たＫＳ−１／４抗体のオン速度およびオフ速度の測定
ＫＳ−１／４およびＫＳ−ＩＬ２分子の抗原ＥｐＣＡＭに対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置(Biacore International AB、Uppsala、スウェーデン)を使用する、抗体−抗原相互作用の表面プラスモン共鳴分析によって測定した。製造業者が提供するアミン結合プロトコルを利用してＥｐＣＡＭ−マウスＦｃをＣＭ５センサーチップに結合させた。次いで、このチップを２５ｎｍと２００ｎＭの間の様々な濃度のＫＳ−１／４およびＫＳ−ＩＬ２に通し、それによってチップへの結合を観察した。ソフトウェアに組み込まれたカーブフィッティングルーチンを利用して、オン速度、オフ速度、結合定数および解離定数を算出した。
【００８５】
１Ｆ．ＥｐＣＡＭを発現する細胞系を使用する、ＫＳ−１／４抗体の結合親和性の測定
標準の技術を利用して、精製したＫＳ−１／４抗体を125Ｉでヨウ素化し、濃度を徐々に増加させてある標識タンパク質を、ＥｐＣＡＭ陽性細胞系ＰＣ−３と共にインキュベートした。飽和結合曲線を作成し、スキャッチャード分析(Scatchard analysis)によって解離定数を決定した。
【００８６】
[実施例２]
マウスＫＳ−１／４のＶHおよびＶKをコードするｃＤＮＡのクローンニングおよびＫＳ−１／４ハイブリドーマ由来抗体を発現させるベクターの構築
(R. Reisfeld、Scripps Research Instituteから提供を受けた)マウスＫＳ−１／４を発現するハイブリドーマから調製したメッセンジャーＲＮＡにオリゴ(ｄＴ)で逆転写を起こし、次いで、ＰＣＲ用の鋳型として使用して、重鎖可変領域(ＶH)および軽鎖可変領域(ＶK)をコードする配列を増幅した。ＰＣＲプライマーは公表されている配列(Beavers等、前記)に基づいて設計した。ＶH用のＰＣＲプライマーは以下の配列を備え、
【００８７】
【表６】
【００８８】
そのＣＴＣＧＡＧおよびＡＡＧＣＴＴ配列が、それぞれＶHを発現ベクター(以下参照)に連結するために使用されるＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を表し、逆プライマー中のＴＡＣが、ＰＣＲ産物のセンス鎖中にＧＴＡ、すなわちスプライス供与共通配列を導入することになるものであった。
【００８９】
ＶK用のＰＣＲプライマーは、以下の配列を備え、
【００９０】
【表７】
【００９１】
そのＴＣＴＡＧＡおよびＡＧＡＴＣＴ配列が、それぞれ、ＶKを発現ベクター(以下参照)に連結するために使用されるＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を表し、ＡＴＧが軽鎖の翻訳開始コドンであり、逆プライマーのＴＡＣがＰＣＲ産物のセンス鎖中にＧＴＡすなわちスプライス供与共通配列を導入することになるものであった。
【００９２】
マウスＫＳ−１／４抗体のＶHおよびＶKをコードするＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen、カリフォルニア州Carlsbad)中でクローン化した。いくつかのＶHおよびＶKクローンの配列決定を行い各々の共通配列を決定した。発現ベクターｐｄＨＬ７にそのＶHおよびＶK配列を段階的に導入した。連結には、ＶHでは特有のＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位、ならびにＶKでは特有のＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を利用した(ＶK挿入断片中の特有のＢｇｌＩＩとベクター中の特有のＢａｍＨＩは、適合するオーバーハングを有する)。得られた構築物は、ｐｄＨＬ７ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４と称するが、これは、キメラ抗体を発現させるための転写調節成分およびヒトＩｇ定常領域配列を既に含んでいた(Gillies等(1989年)のJ. Immunol. Methods 第125巻：191頁)。
【００９３】
発現ベクターｐｄＨＬ７はｐｄＨＬ２[Gillies等(1991年)のHybridoma第10巻：347〜356頁]由来であり以下の改変を伴う：発現ベクターｐｄＨＬ２では、軽鎖用および重鎖−サイトカイン用の転写単位が重鎖免疫グロブリン遺伝子のエンハンサーとメタロチオネインプロモーターとからなる。ｐｄＨＬ７では、これらの２個の転写単位がＣＭＶエンハンサー−プロモーター[Boshart等(1985年)のCell第41巻：521〜530頁]からなっていた。ＣＭＶエンハンサー−プロモーターをコードするＤＮＡは、市販のｐｃＤＮＡＩ(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サンディエゴ)のＡｆｌＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片から得た。
【００９４】
[実施例３]
マウスＫＳ−１／４抗体の発現研究
この実施例では、米国特許第４，９７５，３６９号に開示されているＶ領域配列をコードする抗体発現プラスミドを使用して実施した発現研究を論じる。
【００９５】
３Ａ．プラスミドの構築
ハイブリドーマＫＳ−１／４配列にコードされたキメラ抗体と、米国特許第４，９７５，３６９号に記載の諸配列にコードされたキメラ抗体とを直接に比較するために、米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶH配列をコードするｃＤＮＡを合成した。次いで既にＫＳ−１／４のＶKを含んでいるｐｄＨＬ７発現ベクターにこれを連結した。
【００９６】
米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶH配列を構築するために、ＶH配列の部分をコードするＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を完全な化学合成によって得た。部分的に重なり合うオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、連結した。次いで、この連結された二本鎖をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター(Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ)でサブクローニングした。
【００９７】
このＤＮＡは米国特許第４，９７５，３６９号のタンパク質配列ＩＱＱＰＱＮＭＲＴＭをコードしている。コード配列のすぐ３'側はｇｔａで始まるスプライス供与部位である。上部鎖５'末端側のｃｔａｇはＸｂａＩクローン化部位に対するオーバーハングである。ＸｂａＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのポリリンカーに導入(cloning)するためだけに作製した。この部位のすぐ後はＮｄｅＩ制限部位(ＣＡＴＡＴＧ)とした。下部鎖５'末端側のａｇｃｔはＨｉｎｄＩＩＩクローン化部位のオーバーハングである。このＨｉｎｄＩＩＩ付着末端は、後にＣγ１遺伝子の前にあるイントロン中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される[Gillies等(1991年)のHybridoma第10巻：347〜356頁]。
【００９８】
配列を確認した後ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を単離した。次いで、この断片、ならびにＶHのＮ末端側半分をコードするＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ断片を、ＫＳ−１／４のＶKを含む、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｄＨＬ７発現ベクターに連結した。得られた構築物、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４は、米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶKおよびＶH(ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４と呼ばれる)を含んでいた。
【００９９】
３Ｂ．ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４とＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の比較
プラスミドＤＮＡのｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４およびｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４を、上述のリン酸カルシウム共沈法によって並行してヒト腎臓２９３細胞に導入した。形質移入後５日目に、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびκＥＬＩＳＡ(ＥＬＩＳＡ法についての実施例１を参照)によって条件培地を検定したが、その結果を表１に要約する。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
結果は、２種の異なるＥＬＬＳＡの精度の範囲内で、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４が発現し、分泌されたこと、ならびに分泌された抗体が、おおよそ等モル量の重鎖および軽鎖からなっていたことを示した。一方、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の条件培地では、重鎖が少ないレベルでしか検出されず、それと結合したκ軽鎖はなかった。
【０１０２】
一過性に形質移入した２種の細胞系の全細胞溶解産物および条件培地全体についてウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット分析の手順は、(Sambrook等(1989年)、上記)に記載のとおりとした。全細胞溶解産物を分析するためには、形質移入した細胞を溶解し、遠心分離して壊死組織片を除去し、レーン毎に、５×１０5個の細胞に相当するものから得られた溶解産物を載せた。条件培地を分析するためには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、まず還元性条件下でのＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって、３００μＬの条件培地から得られたタンパク質産物を精製した。ウェスタンブロット転写後、そのブロットを、１：２０００希釈で用いた、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦｃγ(Jackson ImmunoResearch)とハイブリッド形成させた。
【０１０３】
ウェスタンブロット転写は、用いた条件下では、ｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４を形質移入した条件培地および溶解細胞の両方で重鎖が検出されたことを示した。この結果は、ｃｈＫＳ−１／４抗体の重鎖が(軽鎖と共に)細胞中で産生され、効率よく分泌されたことを示唆する。その一方で、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４を形質移入して得られた重鎖は、細胞溶解産物中だけでしか検出されず、条件培地中にはなかった。この結果は、細胞内で匹敵するレベルの重鎖が産生されたものの、分泌されなかったことを示唆するものであった。この発見は、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体では、少量の分泌重鎖と結合したκ軽鎖がなかったことが示されたＥＬＩＳＡのデータと一致していた。免疫グロブリン重鎖は通常、免疫グロブリン軽鎖なしでは正常に分泌されないことがわかっている[Hendershot等(1987年)のImmunology Today第8巻:111頁]。
【０１０４】
前述の例に加え、ＮＳ／０細胞にも、プラスミドｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４およびｐｄＨＬ７−ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４を電子穿孔法によって並行して形質移入した。実施例１に記載のとおりに、１００ｎＭのＭＴＸ存在下で安定なクローンを選択し、９６ウェルプレートに入ったＭＴＸ耐性クローンの条件培地を、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡによって実施例１に記載のとおりに検定した。結果を表２に要約する。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
９６ウェルの台でスクリーニングを行うと、ｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４構築物を用いて得たクローンの大部分は、約１００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの抗体を産生し、最良のクローンは、約１０〜５０μｇ／ｍＬを産生した。一方、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４構築物を用いて得たクローンの大部分は約０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの抗体を産生し、最高の産生量は約３００〜４００ｎｇ／ｍＬであった。ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の組成および結合特性を調べるためには、３００〜４００ｎｇ／ｍＬを産生したクローンを増殖させる必要があった。これらのクローンの２集団を増殖用に選択した。しかしこれらの発現レベルは非常に不安定であることがわかった。抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによって検定したところ、培養物が２００ｍＬに増えるまでに、両方のクローンの発現レベルが約２０ｎｇ／ｍＬに低下していた。抗κＥＬＩＳＡによって同じ条件培地を検定すると、２９３細胞中で一過性に発現させた場合と同様に、κ軽鎖が検出されなかった。
【０１０７】
以下の実験によって、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４重鎖と結合した検出可能なκ軽鎖がなかったことが示された。簡潔に述べると、各５０ｍＬの各クローンの条件培地をＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィーによって濃縮した。溶出物を抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡおよび抗κＥＬＩＳＡによって検定した。対照として、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４産生クローンの条件培地を同じ方法で処理し、同時に検定にかけた。ＥＬＩＳＡの結果を表３に要約する。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
結果は、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４重鎖と結合した検出可能なκ軽鎖が実際になかったことを示した。さらに、ＵＳ４，９７５，３６９抗体は、両方のクローンに由来するものが、２５３ｎｇ／ｍＬおよび３１３ｎｇ／ｍＬに濃縮してもＫＳ抗原を結合しなかったのに対し、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４抗体は、１０〜２０ｎｇ／ｍＬでＫＳ抗原を結合したことが示された(ＫＳ抗原への結合の測定についての実施例９を参照)。
【０１１０】
［実施例４］
変異体ＫＳ抗体の発現および特徴付け
標的分子に対する抗体の発現または親和性をかなり低下させる突然変異は、ヒトの治療目的にそれほど有効でないことが予想される。「張り合わせ」、「ヒト化」、「免疫原性除去」など、免疫原性を低下させる手法は、多くのアミノ酸置換基を導入するものであり、抗体の抗原への結合を妨害することもある(たとえば、米国特許第５，６３９，６４１号、米国特許第５，５８５，０８９号、ＰＣＴ公告番号ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ００／３４３１７を参照)。当技術分野では、上皮細胞接着分子に結合するが、その抗原を認識する元のマウスモノクローナル抗体と性質が異なる抗体配列のクラスが求められている。
【０１１１】
ＫＳ−１／４の重鎖および軽鎖可変(「Ｖ」)領域の様々な組合せの発現性(ability to be expressed)およびＥｐＣＡＭ結合能を試験した。それらの結果を表４〜６に要約し以下で説明する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
【表１３】
【０１１５】
これらの配列は次のように関連している。実施例で記載したように、ＶＨ０およびＶＫ０配列は、元のマウス由来ＫＳ−１／４(配列番号１および配列番号２)を発現するハイブリドーマ細胞系からＰＣＲ増幅によって得た。ＶＨ−'３６９は、米国特許第４，９７５，３６９号に開示されているＶＨ配列である。配列ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ２．１−２．４ＶＫ１、およびＶＫ２は、ペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを減少する突然変異を導入してＴ細胞エピトープの潜在的存在を除去または弱化する免疫原性除去技術を使用するか、あるいは非ヒトＴ細胞エピトープをヒト抗体中に存在する自己エピトープと一致するように変化させることによって得た。これらの構築物の設計を以下でさらに説明し、分析する。表６の構築物は、哺乳動物細胞に、対応する重鎖および軽鎖の各Ｖ領域を発現している核酸の組合せを形質移入することによって作製した。配列ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＫ６、ＶＫ７およびＶＫ８は、ヒトＢ細胞エピトープの潜在的存在を除去する目的で、以下で述べるように、ハイブリドーマＫＳ−１／４の表面残基をヒトの対応物に変更することによって生成した。構築物１から３は、哺乳動物細胞に、表４および以下に記載の重鎖および軽鎖の各Ｖ領域ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＫ６、ＶＫ７およびＶＫ８を発現する核酸の組合せを形質移入することによって生成した。
【０１１６】
４Ａ．ヒトＴ細胞エピトープがよりわずかなＫＳ抗体の特徴付け
配列ＶＨ２．１〜ＶＨ２．５を作製して、ＫＳ−１／４重鎖ＣＤＲ３領域でのあるアミノ酸の挿入および置換が許容されるかを試験した。前述の実施例に記載の方法に従って、軽鎖および重鎖の組合せであるＶＫ０／ＶＨ１、ＶＫ１／ＶＨ７、ＶＫ１／ＶＨ１、ＶＫ１／ＶＨ２、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２、ＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２およびＶＫ１／ＶＨ２．５−ＩＬ２の発現ベクターを構築し、これらに対応する抗体、および抗体−ＩＬ２融合タンパク質を発現させ、試験した。
【０１１７】
具体的には、配列ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＫ１およびＶＫ２は、完全化学合成によって得た。これらの各配列について、これらの領域のコード鎖および相補鎖全体を含む、一連の重複オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、リン酸エステル化し、連結した。次いで、連結された二重鎖の分子を、断片の末端に適切なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen、カリフォルニア州Carlsbad)に導入し、配列を確認した。次いで、これらのＤＮＡ断片を発現ベクターｐｄＨＬ７の適切な部位に挿入して、完全な重(「Ｈ」)鎖および軽(「Ｌ」)鎖をそれぞれ生成した。
【０１１８】
配列ＶＨ２．５は、標準の分子生物学的技術を使用して、１０８位がＧｉｎでなくＴｈｒになるよう１個のコドンを変更することによってＶＨ２から得た(表４)。
【０１１９】
抗体をＥＬＩＳＡによって試験し(表６)、表面プラスモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ装置およびソフトウェア)を使用して、そのＥｐＣＡＭへの結合能を比較した。ＥＬＩＳＡによる実験の結果は、主としてオフ速度を反映し、オン速度は反映しておらず、さらに、一般にそれほど正確でないと考えられるので、不十分なＥＬＩＳＡの結果は一般にある種の構築物をこれ以上の考察から除外するために使用された。しかし、ＥＬＩＳＡ試験によって良好な結合を示した抗体は、さらに特徴付けを行う必要があった。
【０１２０】
表面プラスモン共鳴分析の結果は以下のとおりであった。
【０１２１】
【表１４】
【０１２２】
ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２のオフ速度は、ＶＫ１／Ｖ２−ＩＬ２またはＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２よりも格段に速いので、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２は、あまり有用でない融合タンパク質であるとみなした。
【０１２３】
ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２とＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２は、ＣＤＲ３中のＶH１００位のメチオニン／イソロイシンの違いだけであることを考えると、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２のオフ速度がＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２よりも向上していたことは、この位置がＥｐＣＡＭと疎水性に接触すること、および若干長い方のメチオニン側鎖では接触の有効性が低いことを示している。タンパク質−タンパク質の相互作用の分野では、一般に、疎水性の相互作用はオフ速度の決定において重要な役割を担っているものの、オン速度決定におけるその役割の重大性はそれよりずっと低いと考えられている。
【０１２４】
４Ｂ．１個のアミノ酸が挿入されたＫＳ−１／４変異型の特徴付け
ＥｐＣＡＭに対するＫＳ抗体の親和性について、重鎖Ｖ領域のＣＤＲ３配列が重要であるかを、この領域にアミノ酸の挿入または置換を含む一連の変異型を用いて決定した。配列ＶＨ２．１、ＶＨ２．２、ＶＨ２．３およびＶＨ２．４は、標準の組換えＤＮＡ技術を使用して、ＶＨ２およびＶＫ１をコードする発現ベクターを操作することによって生成した。前述の実施例で記載したように、得られる発現ベクターをＮＳ／０細胞に形質移入し、分泌された抗体タンパク質を精製した。
【０１２５】
ＶＨ１変異型は、ＶＨ２変異型よりも最適でないことが判明し、ＣＤＲ３中のイソロイシンをメチオニンで置換できなかったことが示された。次の目的は、ＣＤＲ３中のアミノ酸の挿入によって結合特性がＶＨ１よりも良好なＫＳ−１／４重鎖Ｖ領域が得られるかを試験することであった。表６のデータは、ＶＫ１／ＶＨ２．１、ＶＫ１／ＶＨ２．２、ＶＫ１／ＶＨ２．３およびＶＫ１／ＶＨ２．４の結合を、ＶＫ１／ＶＨ１と比較するものである。ＫＳ−１／４ＶHのＣＤＲ３中にアミノ酸が挿入された構築物はどれも、ＶＨ１よりも抗原結合が向上しておらず、むしろ挿入変異型の抗原結合活性は、若干低下しまたは大いに低下していたことが判明した。
【０１２６】
これらの結果は、ＣＤＲ３中のアミノ酸の挿入が、一般にＫＳ−１／４重鎖Ｖ領域の抗原結合活性にとって有害であることを示唆している。このデータを分析すると普遍的な結論がいくつか浮かび上がる。詳細には、アミノ酸Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎからなる８４〜１０８位のＫＳ−１／４ＶHアミノ酸セグメントが、ＫＳ−１／４抗原結合にとって重要である。このセグメントは、一般に１個および多数のアミノ酸の置換には耐性であるが、発現および組立に有害な影響を及ぼし得るアミノ酸挿入には耐性でないフレームワークセグメントＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇを含む。さらに、このデータは、効率よく発現され、ＥｐＣＡＭに結合する抗体であるためには、８６、９１、９３、９４、および９５位のアミノ酸が疎水性アミノ酸であることが好ましいことを示唆している。
【０１２７】
Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＴｙｒからなるＶH ＣＤＲ３セグメントでのアミノ酸の挿入は、一般にＫＳ−１／４抗体のＥｐＣＡＭ抗原結合機能に有害であるが、ある種の挿入は、部分的な活性の喪失しか伴わずに許容される。同様に、これらの位置での置換も、一般にＥｐＣＡＭ抗原の結合に有害であるが、ある種の挿入が部分的な活性の喪失しか伴わずに許容される。
【０１２８】
４Ｃ．マウス表面残基がそのヒト対応物に変換してあるＫＳ−１／４抗体の活性誘導体の構築
マウス由来Ｖ領域の免疫原性を最小にするために、ＫＳ−１／４抗体内のアミノ酸をヒト抗体中に普通に見られるアミノ酸で置換することによって、抗体を調製した。また好ましいＫＳ誘導体ではヒトＥｐＣＡＭに対する特異的な結合親和性が保たれている。
【０１２９】
構築物１．ＫＳ−１／４軽鎖はヒト共通サブグループＩＩＩに最もよく似ており、重鎖はサブグループＩに最もよく似ていることがわかった。このような類似性に基づき、ヒト共通サブグループアミノ酸と、ＫＳ−１／４由来ＣＤＲと、非共通アミノ酸とからなる概念上の配列を作製した。Silicon GraphicsのWorkstationおよびＢｉｏＳｙｍ分子模型製作ソフトウェアを使用してこの構築物および以下の構築物について３次元モデルを作成した。
【０１３０】
その３次元モデルを観察すると、あるヒト由来アミノ酸がＣＤＲに接近しており、ＣＤＲの高次構造に影響を及ぼすようであることが明らかになった。この分析に基づき、軽鎖のヒトＳｅｒ２２、Ａｒｇ４４およびＰｈｅ６６を元に戻して、それぞれＴｈｒ、ＬｙｓおよびＴｙｒにした。重鎖ではこのような変更は必要ないと考えられた。構築物１の最終的な設計では、軽鎖がマウス軽鎖では見られない１８個のヒトアミノ酸を含み、重鎖がマウス重鎖では見られない２２個のヒトアミノ酸を含んでいた。
【０１３１】
構築物１を発現するＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドを使用して作製した。構築物１のタンパク質が効率よく発現されたが、ＥｐＣＡＭ結合アッセイで活性が１０分の１より低いことがわかった。
【０１３２】
構築物２．次いで、次の変更しか導入しないより穏やかな方法を採用した。
【０１３３】
【表１５】
【０１３４】
構築物２を発現するＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドおよび標準の組換えＤＮＡ技術を使用して作製した。構築物２のタンパク質は効率よく発現されなかった。さらに、構築物２の軽鎖とマウスＫＳ−１／４重鎖の組合せは効率よく発現されないが、構築物２の重鎖とマウスＫＳ−１／４軽鎖の組合せは効率よく発現されることがわかった。したがって、発現の欠陥は構築物２の軽鎖にあると思われた。
【０１３５】
構築物３．構築物２軽鎖の見かけ上の発現の欠陥に基づいて、構築物１の軽鎖のＮ末端部分とマウス軽鎖のＣ末端部分とを融合させることによって、新たな軽鎖を構築した。３５位および３６位のアミノ酸をコードするＫｐｎＩ部位を使用した。この軽鎖と構築物２の重鎖を組み合わせると、効率よく発現され、結合の有意な損失は認められなかった。
【０１３６】
構築物３は、構築物１または２と比べると、タンパク質の発現および抗原に対する親和性に関してより優れた特性を備えた抗体をもたらしたので、構築物３のＤＮＡ配列をｐｄＨＬ７ｓ−ＩＬ２に導入して、配列番号４０として開示しているｐｄＨＬ７ｓ−ＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２を得た。発現の目的で、実施例１Ａに記載のとおりに、このプラスミドＤＮＡを電気穿孔によってマウス骨髄腫細胞ＮＳ／０に導入して、安定に形質移入された細胞系を生成した。次いで、実施例１Ｂに記載のとおりに、ヒトＦｃでコートするＥＬＩＳＡにおいて、安定なクローンから取った培地の抗体の発現を検定した。この抗体融合タンパク質の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１および配列番号４２で示す。
【０１３７】
さらに、実施例１Ｆに記載の方法を使用して、ＰＣ−３腫瘍細胞の表面に発現されたＥｐＣＡＭに対する、ヨウ素化されたＶＫ８／ＶＨ７およびＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２の結合と、ヨウ素化されたＶＫ０／ＶＨ０−ＩＬ２の結合とを比較した。実験上の誤差の範囲内で、ＶＫ８／ＶＨ７とＶＫ０／ＶＨ０、およびＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２とＶＫ０／ＶＨ０−ＩＬ２について、本質的に同一な結合親和性が見られた。
【０１３８】
４Ｄ．活性なＫＳ−１／４抗体の構築に有用な構造−機能の関連性
まとめると、ＫＳ−１／４抗体の抗原結合活性、および開示されたＶ領域配列との融合タンパク質の抗原結合活性は、ＥｐＣＡＭに対するＫＳ−１／４抗体の配列の設計に、ならびにＫＳ−１／４抗体の適切な発現および分泌のために指標を提供している。特に、ＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域は、多数のアミノ酸置換を許容でき、活性を保持し得るが、ただしこれらのアミノ酸置換はＣＤＲ以外である。ＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域は、特にＣＤＲ内、またはＣＤＲ間のフレームワーク領域中のアミノ酸挿入を一般に許容しないようである。
【０１３９】
たとえば、ハイブリドーマＫＳ−１／４配列を出発「野生型」配列とする場合、データは、重鎖Ｖ領域が、活性をほとんどまたはまったく喪失せずに、９、１１、１６、１７、３８、４０、６９、７０、７１、７２、７６、７９、８０、８３、８８、９１および１１１位でのアミノ酸置換を許容できることを示す。同様に、軽鎖は、活性をほとんどまたはまったく喪失せずに、１、３、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２１、４１、４２、５９、７１、７３、７５、７７および１０３位でのアミノ酸置換を許容できる。これらの変更はＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域のＣＤＲ以外である。明らかに許容可能な１７個の重鎖アミノ酸置換基はＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約２１％に相当し、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約６８％に対してアミノ酸置換を試みた。同様に、明らかに許容される１８個の軽鎖アミノ酸置換基は、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約２３％に相当し、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約７２％に対してアミノ酸置換を試みた。有用性のかなり劣るタンパク質がもたらされたＣＤＲ以外でのアミノ酸置換例は、発現にマイナスの影響を及ぼすと思われた軽鎖でのＡｌａ７９Ｐｒｏの置換、および抗原結合にマイナスの影響を及ぼした重鎖でのＱ１０８Ｔの置換の２例だけである。したがって、ＫＳ−１／４抗体のＣＤＲ以外の重鎖または軽鎖配列にアミノ酸置換基を導入することができ、置換によって活性なタンパク質が得られる確立は高い。
【０１４０】
ＣＤＲでのアミノ酸の置換を伴う突然変異はしばしば抗原結合にマイナスの影響を及ぼす。たとえば重鎖でのＩ１００Ｍの置換は結合を約８分の１に低下させる。アミノ酸の挿入を伴う突然変異は一般にＫＳ−１／４配列の有用性にマイナスの影響を及ぼす。たとえばＶＨ−'３６９重鎖Ｖ領域は本明細所で記載する軽鎖を有する適切な抗体に組み立てることができない。ＶＨ２．１〜２．４の変異型は重鎖Ｖ領域ＣＤＲ３中にアミノ酸が挿入されており、それぞれの変異型が抗原結合に対してマイナスの影響力を有する。
【０１４１】
[実施例５]
ヒトにおけるＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２融合タンパク質の免疫原性
ヒトでの臨床試験では、患者２２名を対象に１日４時間のＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２静脈内注入連続３日間行うことを含む治療処置を１回または複数回受けた。治療処置ごとに１カ月の間隔を設けた(Weber等(2001年)のProc. Am. Soc. Clin. Oncology第20巻：259頁a)。各々の治療処置の前後に各患者から血清サンプルを採取し、全ＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２分子または(Ｆｖ領域なしの)Ｆｃ−ＩＬ２成分に対する抗体の反応性について試験した。免疫化前(pre−immune)血清ではいずれにも反応性が認められなかった。結果は、Ｆｖ領域単独、またはＦｖ領域およびＦｃ−ＩＬ２成分の両方に対して何らかの有意な免疫応答を経験した患者が４名しかいなかったことを示した。さらにこのような応答は、その後ｈｕＫＳ−ＩＬ２を作用させても増大するようには思われなかった。
【０１４２】
インターロイキン２部分はアジュバント効果を有しているので、抗体−ＩＬ２融合タンパク質の使用によって、Ｖ領域の免疫原性試験が特に厳密なものになると考えられる。したがって、ＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２融合タンパク質に対する抗体応答をはっきりと示したレシピアントは少数しかおらず、結果は、ＫＳ抗体(構築物３)をヒトに投与できることを示唆している。ＫＳ抗体(構築物３)が、対応するヒトアミノ酸残基で数個のアミノ酸残基が置換されているものの、ほとんど完全にマウス由来である可変領域を含んでいることを考慮すると、これらの結果は、特に有望である。
【０１４３】
同等な形態
本発明は、その精神または本質的な特徴から外れることなく、他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものでなく、すべての点で例示的なものであるとみなされる。すなわち、本発明の範囲は、これまでの記述でなく、添付の特許請求の範囲によって示され、請求項の同等性の意味および範囲から逸脱することなく生じるすべての変更がそこに含まれるものとする。
【０１４４】
参照による組み込み
本明細書で開示した各々の特許文献および特定の刊行物の開示を参照により全体として本出願に組み込む。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年５月３日に出願された米国特許出願第６０／２８８，５６４号に対して利益と優先権を主張するものであり、この出願を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に組換え抗体に関する。より詳細には、本発明はヒト上皮細胞接着分子を特異的に結合する組換え抗体ならびに診断、予後予測および治療用作用物質としてのその抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ここ数年にわたり、抗体療法の開発がかなり進歩してきている。たとえば、研究者等は、様々な癌特異的マーカーだけでなく、そのようなマーカーに特異的に結合する様々な抗体を特定している。抗体を使用して、マーカーを発現している癌細胞に特定の分子(たとえば毒素または免疫刺激成分(たとえばサイトカイン))を送達すると、癌細胞を選択的に死滅させることができる(たとえば特許文献１および２を参照)。
【０００４】
ＫＳ−１／４抗体は、ヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)に対するマウス由来のモノクローナル抗体である。ＥｐＣＡＭはある特定の上皮細胞表面の先端に非常に低レベルで発現する。たとえば、ＥｐＣＡＭは、腸管細胞の摂取した食物に面し、循環から離れた細胞表面で発現し、そこでは免疫系の大部分のタンパク質および細胞の影響を受けにくい(非特許文献１)。
【０００５】
しかし、ある特定の条件下では、ＥｐＣＡＭは特定の細胞たとえば上皮起源の腫瘍細胞上に高率に発現する。通常、そのような腫瘍細胞はその極性を失っており、その結果ＥｐＣＡＭが細胞表面全体にわたって発現される。したがって、ＥｐＣＡＭは抗体系免疫刺激成分を腫瘍細胞に向けるのに好都合な腫瘍特異的マーカーである(非特許文献２および３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５４１，０８７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５０，１５０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Balzarら、[1999年]J. Mol. Med. 第77巻：699〜712頁
【非特許文献２】Simonら、[1990年] Proc. Nat. Acad. Sci. USA 第78巻：2755〜2759頁
【非特許文献３】Perezら、[1989年]J Immunol.第142巻:3662〜3667頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし宿主哺乳動物中では抗体が免疫原性を伴う。これは抗体が自己由来でない場合により起こりやすい。その結果、抗体療法の有効性はしばしば抗体に向けられた免疫原性応答によるものである。免疫原性応答は、通常、抗体の全体または部分が宿主哺乳動物と異なる哺乳動物に由来する場合、たとえば抗体がマウス由来でありレシピアントがヒトである場合に増強される。したがって、マウス由来抗体の免疫原性を低減しまたは最小限に抑えるために、マウス由来抗体を改変してヒト抗体により近付けることが有用となろう。
【０００９】
したがって、たとえばキメラ抗体、抗体のヒト化および抗体の張り合わせ(veneering)を含む様々な取り組みが開発されているとはいえ、当技術分野では癌特異的マーカーに結合しかつヒトに投与されたときの免疫原性が低い抗体が求められている。さらに、毒素または免疫刺激成分を、たとえば融合タンパク質や免疫コンジュゲートとして癌特異的マーカーに送達して、腫瘍細胞を選択的に死滅させる抗体も当技術分野で求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒトＥｐＣＡＭを特異的に結合するが、ヒトにおける免疫原性が鋳型よりも低い組換え抗体であるマウス抗ＥｐＣＡＭ抗体を特定したことに基づく。特に、本発明は、１箇所または複数のフレームワーク領域および／または相補性決定領域を規定するアミノ酸配列がその免疫原性が低下するよう改変されている組換えＫＳ抗体を提供する。
【００１１】
本明細書で使用する用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、(i)未処置抗体(たとえばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)、(ii)たとえばＦａｂ断片、Ｆａｂ'断片、(Ｆａｂ')2断片、Ｆｖ断片、１本鎖抗体結合部位、ｓＦｖを含むその抗原結合部分、(iii)二重特異的抗体およびその抗原結合部分、および(iv)多重特異的抗体およびその抗原結合部分を意味すると理解される。
【００１２】
本明細書で使用する用語「結合特異的」、「特異的に結合する」、および「特異的結合」は、抗体の特定の抗原に対する結合親和性が少なくとも約１０6Ｍ‐1、より好ましくは少なくとも約１０7Ｍ‐1、より好ましくは少なくとも約１０8Ｍ‐1、最も好ましくは少なくとも約１０10Ｍ‐1であることを意味すると理解される。
【００１３】
本明細書で使用する用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、主として抗原と相互に作用する超可変領域または免疫グロブリン可変領域ループを意味すると理解される。免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶH)および免疫グロブリン軽鎖可変領域(ＶL)は、図１に示すようにフレームワーク領域の間に挿入されたＣＤＲを３箇所含んでいる。たとえば、配列番号１で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＣＤＲは、Ｓｅｒ２４からＬｅｕ３３(ＣＤＲ１)、Ａｓｐ４９からＳｅｒ５５(ＣＤＲ２)、およびＨｉｓ８８からＴｈｒ９６(ＣＤＲ３)のアミノ酸配列によって規定される。配列番号２で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域のアミノ酸配列に関しては、ＣＤＲは、Ｇｌｙ２６からＡｓｎ３５(ＣＤＲ１)、Ｔｒｐ５０からＧｌｙ６６(ＣＤＲ２)、およびＰｈｅ９９からＴｙｒ１０５(ＣＤＲ３)によって規定される。本明細書で記載する他の抗体の対応するＣＤＲは、対応するＫＳ−１／４の重鎖または軽鎖の配列と揃えて図１Ａ〜１Ｃに示す。
【００１４】
本明細書で使用する用語「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、相補性決定領域に近接する免疫グロブリン可変領域を意味すると理解される。免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶH)および免疫グロブリン軽鎖可変領域(ＶL)は、図１に示すように、どちらも４箇所のＦＲを含む。たとえば、配列番号１で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン軽鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＦＲは、Ｇｌｎ１からＣｙｓ２３(ＦＲ１)、Ｔｒｐ３４からＰｈｅ４８(ＦＲ２)、Ｇｌｙ５６からＣｙｓ８７(ＦＲ３)、およびＰｈｅ９７からＬｙｓ１０６(ＦＲ４)のアミノ酸配列によって規定される。配列番号２で示す、ＫＳ−１／４抗体の免疫グロブリン重鎖可変領域を規定するアミノ酸配列に関しては、ＦＲは、Ｇｌｎ１からＳｅｒ２５(ＦＲ１)、Ｔｒｐ３６からＧｌｙ４９(ＦＲ２)、Ａｒｇ６７からＡｒｇ９８(ＦＲ３)、およびＴｒｐ１０６からＳｅｒ１１６(ＦＲ４)のアミノ酸配列によって規定される。本明細書で記載する他の抗体のＦＲは、対応するＫＳ−１／４の重鎖または軽鎖の配列と揃えて図ＸおよびＹに示す。
【００１５】
本明細書で使用する用語「ＫＳ抗体」は、ハイブリドーマによって発現したマウス抗体ＫＳ−１／４が結合した同じヒトＥｐＣＡＭ抗原に特異的に結合する抗体を意味すると理解される(たとえばCancer Res.1984年、第44巻(2)：681〜7頁を参照)。ＫＳ抗体は、(i)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ１配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹ(配列番号１のアミノ酸２４〜３１)、(ii)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ２配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ(配列番号１のアミノ酸４９〜５５)、(iii)免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲ３配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＨＱＲＳＧＹＰＹＴ(配列番号１のアミノ酸８８〜９６)、(iv)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ１配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮ(配列番号２のアミノ酸２６〜３５)、(v)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ２配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤ(配列番号２のアミノ酸５０〜６２)、(vi)免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ３配列を少なくとも一部分規定するアミノ酸配列ＳＫＧＤＹ(配列番号２のアミノ酸配列１０１〜１０５)、または前記諸配列の任意の組合せを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明は、一態様において、その一部分によって免疫グロブリンＶLドメインのフレームワーク領域が規定されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭを特異的に結合する組換え抗体を提供する。一実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ１)が、配列番号５のアミノ酸残基１〜２３によって規定され、ここで、Ｘａａ１はＱまたはＥであり、Ｘａａ３はＬまたはＶであり、Ｘａａ１０はＩまたはＴであり、Ｘａａ１１はＭまたはＬであり、Ｘａａ１３はＡまたはＬであり、Ｘａａ１８はＫまたはＲであり、Ｘａａ２１はＭまたはＬであり、ただし、Ｘａａ１、Ｘａａ３、Ｘａａ１０、Ｘａａ１１、Ｘａａ１３、Ｘａａ１８またはＸａａ２１に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。アミノ酸は各々の位置で標準の一文字略号で表示する。
【００１７】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ２)が配列番号５のアミノ酸残基３４〜４８によって規定され、ここでＸａａ４１はＳまたはＱであり、Ｘａａ４２はＳまたはＡであり、Ｘａａ４５はＰまたはＬであり、あるいはＸａａ４６はＷまたはＬであり、ただし、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４５またはＸａａ４６に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸配列と同じものではない。
【００１８】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ３)が配列番号５のアミノ酸残基５６〜８７によって規定され、ここでＸａａ５７はＦまたはＩであり、Ｘａａ６９はＳまたはＤであり、Ｘａａ７１はＳまたはＴであり、Ｘａａ７３はＩまたはＴであり、Ｘａａ７７はＭまたはＬであり、Ｘａａ７９はＡまたはＰであり、Ｘａａ８２はＡまたはＦであり、Ｘａａ８４はＴまたはＶであり、ただし、Ｘａａ５７、Ｘａａ６９、Ｘａａ７１、Ｘａａ７３、Ｘａａ７７、Ｘａａ７９、Ｘａａ８２またはＸａａ８４に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００１９】
別の態様では、本発明は、その一部分によって免疫グロブリンＶLドメインのフレームワーク領域が規定されるアミノ酸配列を含む、ＥｐＣＡＭを特異的に結合する組換え抗体を提供する。一実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ１)が配列番号６のアミノ酸残基１〜２５によって規定され、ここでＸａａ２はＩまたはＶであり、Ｘａａ９はＰまたはＡであり、Ｘａａ１１はＬまたはＶであり、あるいはＸａａ１７はＴまたはＳであり、ただし、Ｘａａ２、Ｘａａ９、Ｘａａ１１またはＸａａ１７に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００２０】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ２)が配列番号６のアミノ酸残基３６〜４９によって規定され、ここでＸａａ３８はＫまたはＲであり、Ｘａａ４０はＴまたはＡであり、あるいはＸａａ４６はＫまたはＥであり、ただし、Ｘａａ３８、Ｘａａ４０、Ｘａａ４６に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。
【００２１】
別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ３)が配列番号６のアミノ酸残基６７〜９８によって規定され、ここでＸａａ６８はＦまたはＶであり、Ｘａａ６９はＡまたはＴであり、Ｘａａ７０はＦまたはＩであり、Ｘａａ７３はＥまたはＤであり、Ｘａａ７６はＡまたはＴであり、Ｘａａ８０はＦまたはＹであり、Ｘａａ８３はＩまたはＬであり、Ｘａａ８４はＮまたはＳであり、Ｘａａ８５はＮまたはＳであり、Ｘａａ８８はＮ、ＡまたはＳであり、Ｘａａ９１はＭまたはＴであり、あるいはＸａａ９３はＴまたはＶであり、ただし、Ｘａａ６８、Ｘａａ６９、Ｘａａ７０、Ｘａａ７３、Ｘａａ７６、Ｘａａ８０、Ｘａａ８３、Ｘａａ８４、Ｘａａ８５、Ｘａａ８８、Ｘａａ９１またはＸａａ９３に位置するアミノ酸残基の少なくとも１個は、配列番号２の対応する位置のアミノ酸と同じものではない。別の実施形態では、フレームワーク領域(ＦＲ４)が配列番号６のアミノ酸残基１０６〜１１６によって規定されＸａａ１０８はＱまたはＴである。
【００２２】
別の実施形態では、免疫グロブリンＶLドメインが、(i)配列番号９のアミノ酸残基１〜２３と(ii)配列番号８のアミノ酸残基１〜２３とからなる群から選択されたＦＲ１配列を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンＶHドメインが配列番号１８のアミノ酸残基１〜２５によって規定されたＦＲ配列、および／または配列番号１８のアミノ酸残基６７〜９８によって規定されたＦＲ配列を含む。より好ましくはＶLドメインが配列番号９のアミノ酸１〜１０６によって規定されたアミノ酸配列を含み、かつ／またはＶHドメインが配列番号１８のアミノ酸１〜１１６によって規定されたアミノ酸配列を含む。
【００２３】
さらに、抗体は、たとえば(i)配列番号１のアミノ酸残基２４〜３１、(ii)配列番号１のアミノ酸残基４９〜５５、および／または(iii)配列番号１のアミノ酸残基８８〜９６を含む、ＣＤＲ配列の少なくとも一部分を規定するアミノ酸配列を任意選択で含んでいてもよい。同様に、抗体は、たとえば(i)配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、(ii)配列番号２のアミノ酸配列５０〜６２、および／または(iii)配列番号２のアミノ酸残基１０１〜１０５を含む、ＣＤＲ配列の少なくとも一部分を規定するアミノ酸配列を任意選択で含んでいてもよい。
【００２４】
別の実施形態では、抗体は抗体−サイトカイン融合タンパク質の抗原標的部分(antigen targeting portion)を含む。サイトカインは好ましくはインターロイキンであり、より好ましくはインターロイキン２である。
【００２５】
別の態様では、本発明は本発明の抗体の少なくとも一部分をコードする発現ベクターを提供する。好ましい実施形態では、発現ベクターは配列番号４０で述べるヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
別の態様では、本発明はＥｐＣＡＭの過剰発現を伴う疾患(たとえば、患部組織のＥｐＣＡＭレベルがその疾患に罹患していない組織よりも高い疾患)に罹患しているヒトの患者の診断、予後予測および／または治療を行う方法を提供する。この方法はそのような診断、予後予測または治療が必要な個人に本発明の抗体の一種を投与することを含む。
【００２７】
抗体はそれと結合した診断および／または治療用作用物質を任意選択で含む。作用物質を抗体と融合させて融合タンパク質を生成すればよい。あるいは、作用物質を抗体に化学的に結合させて免疫コンジュゲートを得てもよい。作用物質には、たとえば、トキシン、放射標識、サイトカイン、画像処理剤などが含まれると考える。好ましい実施形態では、本発明の抗体を融合タンパク質としてサイトカインと融合させる。好ましいサイトカインには、好ましくはインターロイキン２(ＩＬ−２)、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８などのインターロイキン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、エリスロポエチンなどの造血因子；ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝プロセス制御因子；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγなどのインターフェロン；およびケモカインが含まれる。抗体−サイトカイン融合タンパク質がサイトカイン生理活性を示すことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【図１Ｂ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【図１Ｃ】軽鎖および重鎖変異型およびＫＳ抗体の共通配列を整列させて示す図である。免疫グロブリンフレームワーク領域(ＦＲ１〜ＦＲ４)を−で表示する。免疫グロブリン相補性決定領域(ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３)を*で表示する。個々のＫＳ抗体軽鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶＫ」と称するが、Ｋは軽鎖がκ鎖であることを指す。個々のＫＳ抗体重鎖Ｖ領域のセグメントを「ＶH」と称する。共通配列では置換できるアミノ酸を「Ｘ」で示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、ヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)を特異的に結合する組換え抗体を提供する。本発明の好ましい抗体は、可変領域が変更されており、そのためヒトにおける免疫原性が低下している。本発明の抗体可変領域は、ヒトの患者においてＥｐＣＡＭが過剰発現している腫瘍組織に対して、抗体および抗体融合タンパク質を標的とすることに、特に有用である。好ましい実施形態では、本発明の抗体をサイトカインと融合させて免疫サイトカインを得る。
【００３０】
本発明のタンパク質配列
本発明は、適切にヘテロ二量体化された場合に、ＫＳ抗原またはＫＳＡとしても知られているヒト上皮細胞接着分子(ＥｐＣＡＭ)に結合する抗体可変領域またはＶ領域配列のファミリーを開示する。本発明の好ましいタンパク質は本明細書で述べたようにヒトの患者を治療するのに有用である。したがって、好ましいＫＳ抗体変異型は、ヒトへの投与時の免疫原性を低減するために、ヒト化されているか、免疫原性除去(deimmunize)されているか、またはその両方である。本発明によれば、たとえば、ペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを減少する突然変異を導入してＴ細胞エピトープの潜在的存在を除去または弱化する免疫原性除去方法(たとえばＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７を参照)を使用するか、あるいは、非ヒトＴ細胞エピトープをヒト抗体中に存在するヒト自己エピトープと一致するように変化させる方法(たとえば米国特許第５，７１２，１２０号を参照)を使用することにより、マウスＫＳ抗体に免疫原性除去またはヒト化を施すことができる。
【００３１】
Ｉ．可変軽鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変軽鎖配列を備えている。
【００３２】
【表１】
【００３３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基１〜２３、すなわちＸ−Ｉ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ３位にＬもしくはＶ；Ｘａａ１０位にＩ、Ｔ、もしくはＳ；Ｘａａ１１位にＭもしくはＬ、Ｘａａ１２位にＳもしくはＡ；Ｘａａ１３位にＡ、Ｌ、もしくはＶ；Ｘａａ１７位にＥもしくはＱ、Ｘａａ１８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ１９位にＶもしくはＡ；およびＸａａ２１位にＭ、Ｌ、もしくはＩを有する。より好ましくは、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ３位にＶ、Ｘａａ１０位にＴもしくはＳ、Ｘａａ１１位にＬ、Ｘａａｌ２位にＡ、Ｘａａ１３位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１７位にＱ、Ｘａａ１８位にＲ、Ｘａａ１９位にＡ、およびＸａａ２１位にＬもしくはＩを有する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基２４〜３３、すなわちＳ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｌで表される、免疫グロブリン軽鎖ＣＤＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ１領域に以下のアミノ酸を１個、すなわちＸａａ３２位にＭまたはＩを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ１領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ３２位にＩを有する。
【００３５】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基３４〜４８、すなわちＷ−Ｙ−Ｘ−Ｑ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｉ−Ｘで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、その組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ３６位にＱもしくはＬ、Ｘａａ４１位にＳもしくはＱ；Ｘａａ４２位にＳ、Ａ、もしくはＰ；Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、Ｘａａ４６位にＷもしくはＬおよびＸａａ４８位にＦもしくはＹを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体はＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３６位にＬ、Ｘａａ４１位にＱ、Ｘａａ４２位にＡまたはＰ、Ｘａａ４５位にＬ、Ｘａａ４６位にＬおよびＸａａ４８位にＹを有する。
【００３６】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基５６〜８７、すなわちＧ−Ｘ−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、その組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ５９位にＡもしくはＳ、Ｘａａ６９位にＳ、Ｄ、もしくはＴ、Ｘａａ７１位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７３位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７５位にＳもしくはＮ、Ｘａａ７７位にＭもしくはＬ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＩ、Ｘａａ５９位にＳ、Ｘａａ６９位にＤもしくはＴ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７３位にＴ、Ｘａａ７５位にＮ、Ｘａａ７７位にＬ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦ、およびＸａａ８４位にＶを有する。
【００３７】
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号３の残基９７〜１０６、すなわちＦ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｋ−Ｘ−Ｅ−Ｉ−Ｋで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１０３位にＬまたはＶを有する。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１０３位にＶを有する。
【００３８】
ＩＩ．可変重鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変重鎖配列を備えている。
【００３９】
【表２】
【００４０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基１〜２５、すなわちＱ−Ｘ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ａ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、この組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、Ｘａａ１１位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１６位にＥもしくはＳ、およびＸａａ１７位にＴもしくはＳを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、Ｘａａ１１位にＶ、Ｘａａ１６位にＳおよびＸａａ１７位にＳを有する。
【００４１】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基３６〜４９、すなわちＷ−Ｖ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸配列少なくとも１個、すなわち、Ｘａａ３８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ４０位にＴもしくはＡ、Ｘａａ４３位にＫもしくはＱ、およびＸａａ４６位にＫもしくはＥを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＲ、Ｘａａ４０位にＡ、Ｘａａ４３位にＱおよびＸａａ４６位にＥを有する。
【００４２】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基５０〜６６、すなわち、Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＤもしくはＫ、およびＸａａ６５位にＫもしくはＱを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＫ、およびＸａａ６５位にＱを有する。
【００４３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基６７〜９８、すなわちＲ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｑ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｒ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｆ−Ｃ−Ｖ−Ｒで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ；Ｘａａ６９位にＡ、Ｔ、もしくはＶ；Ｘａａ７０位にＦもしくはＩ、Ｘａａ７１位にＳもしくはＴ、Ｘａａ７２位にＬもしくはＡ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ７６位にＡもしくはＴ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＬ、Ｘａａ８０位にＦもしくはＹ、Ｘａａ８３位にＩもしくはＬ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ；Ｘａａ８８位にＮ、Ａ、もしくはＳ；Ｘａａ９１位にＭもしくはＴ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ６９位にＴもしくはＶ、Ｘａａ７０位にＩ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７２位にＡ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ７６位にＴ、Ｘａａ７９位にＬ、Ｘａａ８０位にＹ、Ｘａａ８３位にＬ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡもしくはＳ、Ｘａａ９１位にＴおよびＸａａ９３位にＶを有する。
【００４４】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基９９〜１０５、すなわちＦ−Ｘ−Ｓ−Ｋ−Ｇ−Ｄ−Ｙで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１００位にＩもしくはＭを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ３領域にアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１００位にＭを有する。
【００４５】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号４の残基１０６〜１１６、すなわちＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１０８位にＱもしくはＴ、およびＸ１１１位にＳもしくはＴを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１０８位にＴ、およびＸ１１１位にＴを有する。
【００４６】
ＩＩＩ．精製可変軽鎖
別の実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変軽鎖配列を備えている。
【００４７】
【表３】
【００４８】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基１〜２３、すなわちＸ−Ｉ−Ｘ−Ｌ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｘ−Ｔ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ３位にＬもしくはＶ、Ｘａａ１０位にＩもしくはＴ、Ｘａａ１１位にＭもしくはＬ、Ｘａａ１３位にＡもしくはＬ、Ｘａａ１８位にＫもしくはＲ、およびＸａａ２１位にＭもしくはＬを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ３位にＶ、Ｘａａ１０位にＴ、Ｘａａ１１位にＬ、Ｘａａ１３位にＬ、Ｘａａ１８位にＲおよびＸａａ２１位にＬを有する。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＱもしくはＥ、Ｘａａ１１位にＡもしくはＬ、およびＸａａ２１位にＭもしくはＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ１位にＥ、Ｘａａ１１位にＬ、およびＸａａ２１位にＬを有する、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基３４〜４８、すなわちＷ−Ｙ−Ｑ−Ｑ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｉ−Ｆで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ４１位にＳもしくはＱ、Ｘａａ４２位にＳもしくはＡ、Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、およびＸａａ４６位にＷもしくはＬを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、Ｘａａ４１位にＱ、Ｘａａ４２位にＡ、Ｘａａ４５位にＬおよびＸａａ４６位にＬを有する。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体はＦＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ４２位にＳもしくはＡ、Ｘａａ４５位にＰもしくはＬ、およびＸａａ４６位にＷもしくはＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ４２位にＡ、Ｘａａ４５位にＬおよびＸａａ４６位にＬを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５２】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号５の残基５６〜８７、すなわちＧ−Ｘ−Ｐ−Ａ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｌ−Ｘ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｃで表される、免疫グロブリン軽鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ６９位にＳもしくはＤ、Ｘａａ７１位にＳもしくはＴ、Ｘａａ７３位にＩもしくはＴ、Ｘａａ７７位にＭもしくはＬ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＩ、Ｘａａ６９位にＤ、Ｘａａ７１位にＴ、Ｘａａ７３位にＴ、Ｘａａ７７位にＬ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦおよびＸａａ８４位にＶを有する。
【００５３】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ５７位にＦもしくはＩ、Ｘａａ６９位にＳもしくはＤ、Ｘａａ７９位にＡもしくはＰ、Ｘａａ８２位にＡもしくはＦ、およびＸａａ８４位にＴもしくはＶを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下の置換基少なくとも１個、Ｘａａ５７位にＩ、Ｘａａ６９位にＤ、Ｘａａ７９位にＰ、Ｘａａ８２位にＦ、およびＸａａ８４位にＶを有する、免疫グロブリン軽ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５４】
ＩＶ．精製可変重鎖
組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン可変重鎖配列を備えている。
【００５５】
【表４】
【００５６】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基１〜２５、すなわちＱ−Ｘ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ−Ｅ−Ｘ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｘ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ａ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、Ｘａａ１１位にＬもしくはＶ、およびＸａａ１７位にＴもしくはＳを有する。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、Ｘａａ１１位にＶ、およびＸａａ１７位にＳを有する。
【００５７】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＩもしくはＶ、Ｘａａ９位にＰもしくはＡ、およびＸａａ１１位にＬもしくはＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。したがって、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ２位にＶ、Ｘａａ９位にＡ、およびＸａａ１１位にＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ１を規定するアミノ酸配列を有している。
【００５８】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基３６〜４９、すなわちＷ−Ｖ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｐ−Ｇ−Ｋ−Ｇ−Ｌ−Ｘ−Ｗ−Ｍ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＫもしくはＲ、Ｘａａ４０位にＴもしくはＡ、およびＸａａ４６位にＫもしくはＥを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ２領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ３８位にＲ、Ｘａａ４０位にＡ、およびＸａａ４６位にＥを有する。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸、たとえばＸａａ４６位にＫまたはＥを有する、免疫グロブリン重ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ１領域に以下のアミノ酸置換基、たとえばＸａａ４６位にＥを有する、免疫グロブリン重ＦＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。
【００６０】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基５０〜６６、すなわちＷ−Ｉ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ｔ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｘ−Ｆ−Ｘ−Ｇで表される、免疫グロブリン重鎖ＣＤＲ２を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＣＤＲ２領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６３位にＤもしくはＫ、およびＸａａ６５位にＫもしくはＱを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下のＣＤＲ２領域中のアミノ酸置換基、すなわちＸａａ６３位にＫ、およびＸａａ６５位にＱを有する。
【００６１】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基６７〜９８、すなわちＲ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｓ−Ｌ−Ｘ−Ｔ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｘ−Ｌ−Ｑ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌ−Ｒ−Ｘ−Ｅ−Ｄ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｙ−Ｆ−Ｃ−Ｖ−Ｒで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ、Ｘａａ６９位にＡもしくはＴ、Ｘａａ７０位にＦもしくはＩ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ７６位にＡもしくはＴ、Ｘａａ８０位にＦもしくはＹ、Ｘａａ８３位にＩもしくはＬ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ；Ｘａａ８８位にＮ、Ａ、もしくはＳ；Ｘａａ９１位にＭもしくはＴ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ６９位にＴ、Ｘａａ７０位にＩ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ７６位にＴ、Ｘａａ８０位にＹ、Ｘａａ８３位にＬ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡもしくはＳ、Ｘａａ９１位にＴ、およびＸａａ９３位にＶを有する。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＦもしくはＶ、Ｘａａ７３位にＥもしくはＤ、Ｘａａ８４位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８５位にＮもしくはＳ、Ｘａａ８８位にＮもしくはＡ、およびＸａａ９３位にＴもしくはＶを有する、免疫グロブリン重鎖ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ３領域に以下の置換基少なくとも１個、すなわちＸａａ６８位にＶ、Ｘａａ７３位にＤ、Ｘａａ８４位にＳ、Ｘａａ８５位にＳ、Ｘａａ８８位にＡ、およびＸａａ９３位にＶを有する、免疫グロブリン重ＦＲ３を規定するアミノ酸配列を有している。
【００６３】
好ましい実施形態では、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、配列番号６の残基１０６〜１１６、すなわちＷ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓで表される、免疫グロブリン重鎖ＦＲ４を規定するアミノ酸配列を有している。より詳細には、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域に以下のアミノ酸少なくとも１個、たとえばＸａａ１０８位にＱもしくはＴを有する。より好ましくは、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＦＲ４領域中のアミノ酸置換基、たとえばＸａａ１０８位にＴを有する。
【００６４】
したがって、好ましいＶ領域は、マウスＫＳ−１／４可変領域に対応するＶHおよび／またはＶＫ領域のＦＲドメイン中に置換基を含む。さらに、本発明の好ましいＶ領域は、マウスＫＳ−１／４可変領域に対してアミノ酸の挿入および欠失を含まない。
【００６５】
好ましい変異型には、マウスＫＳ−１／４との同一性／相同性が８０％より高い可変領域を有するタンパク質が含まれる。マウスＫＳ可変領域のアミノ酸配列またはその部分を基準配列として使用して、本発明の方法での成功がある程度見込めるだけのアミノ酸類似性を候補配列が備えているかどうかを判定することもできる。好ましくは、変異型配列は、マウスＫＳ可変重鎖または軽鎖ＦＲまたはＣＤＲに少なくとも７０％類似または６０％同一、より好ましくは少なくとも７５％類似または６５％同一、最も好ましくは８０％類似または７０％同一である。
【００６６】
候補ペプチド領域が、マウスＫＳ配列に対する必要な類似性または同一性百分率を有するかどうかを判定するために、SmithおよびWaterman(1981年)のJ. Mol. Biol. 第147巻：195〜197頁に記載されている動的なプログラミングアルゴリズムと、HenikoffおよびHenikoff(1992年)のPNAS第89巻：10915〜10919頁の図２に記載されているＢＬＯＳＵＭ６２の置換行列とを組み合わせて使用して、まず候補アミノ酸配列とマウスＫＳ配列を整列させる。本発明では、ギャップ挿入ペナルティーの適正値を−１２とし、ギャップ伸長ペナルティーの適正値を−４とする。ＧＣＧプログラム一式(Oxford Molecular Group、イングランド、オックスフォード)など、Smith-WatermanおよびＢＬＯＳＵＭ６２の行列のアルゴリズムを用いて整列を行うコンピュータープログラムは、市販されており、当分野の技術者に広く利用されている。候補配列と基準配列との整列が済んだら類似性百分率のスコアを算出すればよい。各配列の個々のアミノ酸をその互いの類似性に従って連続的に比較する。整列した２個のアミノ酸に対応する、ＢＬＯＳＵＭ６２行列での値が０または負の数である場合、その対の類似性スコアは０であり、そうでない場合、その対の類似性は１．０である。整列したアミノ酸対の類似性スコアの合計を生類似性スコア(raw similarity score)とする。次いでこの生類似性スコアを候補配列または基準配列の短い方のアミノ酸数で割ることによって正規化する。この正規化された生スコアが類似性百分率である。あるいは、同一性百分率を算出するには、整列した各配列のアミノ酸をここでも連続的に比較する。アミノ酸が同一でない場合その対の同一性スコアは０であり、そうでない場合その対の同一性スコアは１．０である。同一な整列アミノ酸の合計を生同一性(raw identity score)スコアとする。次いでこの生同一性スコアを候補配列または基準配列の短い方のアミノ酸数で割ることによって正規化する。この正規化された生スコアが同一性百分率である。類似性および同一性百分率を算出する目的では挿入および欠失を無視する。したがって最初の整列ではギャップペナルティーを使用してもこの算出ではそれを使用しない。
【００６７】
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、他の真核生物もしくは原核生物細胞などの細胞からのＫＳ抗体の発現を検定する方法も開示する(実施例１を参照)。好ましい方法では、ＫＳ抗体Ｖ領域を未処置のヒト抗体成分として発現させ、ヒトＦｃ領域を検出するＥＬＩＳＡによって真核細胞系からのその抗体の発現を検定する。ＫＳ抗体のＥｐＣＡＭへの結合を精密に定量化するには、Ｂｉａｃｏｒｅによる検定を使用すればよい。
【００６８】
ヒトの疾患のＫＳ抗体融合タンパク質での治療
本発明は、癌などのヒトの疾患を治療するのに有用なＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質の配列も開示する。ＫＳ−１／４−ＩＬ２など、あるＫＳ抗体−ＩＬ２融合タンパク質(たとえば実施例Ｘの構築物３を参照)を使用すると、この抗体に対する免疫応答が驚くほど少ない状態で癌に罹患しているヒトの患者を治療することができる。
【００６９】
ＫＳ−１／４(ＶＨ２／ＶＫ１)−ＩＬ２でヒトの癌を治療する間は、ＫＳ−１／４(構築物３)−ＩＬ２で治療するよりも免疫原性が少ないことがわかっている。具体的には、臨床試験の間、抗イディオタイプ抗体、および抗体−ＩＬ２接合部またはＩＬ−２部分に指向性のある抗体を有する患者が見られる頻度は、ＫＳ−１／４(構築物３)−ＩＬ２を有する患者よりもずっと低い。本発明の抗体可変領域は、他のサイトカイン類、たとえばインターロイキン１、２、６、１０、もしくは１２；インターフェロンαおよびβ；ＴＮＦ、およびＩＮＦγと融合させることもできる。以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明がより十分に理解されよう。
【実施例】
【００７０】
[実施例１]
ＫＳ抗体の発現およびその抗原結合活性の検定のための方法および試薬
１Ａ．細胞培養および形質移入
次の実施例では以下の一般的技術を使用した。一過性の形質移入については、リン酸カルシウムを用いるプラスミドＤＮＡの共沈によって、ヒト腎臓２９３細胞にプラスミドＤＮＡを導入した[Sambrook等(1989年)の「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、ニューヨーク]。
【００７１】
安定した形質移入クローンを得るためにプラスミドＤＮＡを電気穿孔法によってマウス骨髄腫ＮＳ／０細胞に導入した。ＮＳ／０細胞は１０％の胎児ウシ血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地中で増殖させた。約５×１０6個の細胞をＰＢＳで１度洗浄し、０．５ｍｌのリン酸緩衝液(ＰＢＳ)中に再懸濁させた。次いで氷上のGene Pulser Cuvette(電極間ギャップ０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ)中で１０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡを細胞と共に１０分間インキュベートした。設定を０．２５Ｖかつ５００μＦとしたGene Pulser(ＢｉｏＲａｄ)を使用して電子穿孔法を行った。細胞を氷上で１０分間回復させ、その後増殖培地中に再懸濁させ、次いで２枚の９６ウェルプレートに塗末した。形質移入後２日目に導入する１００ｎＭのメトトレキサート(ＭＴＸ)の存在下で増殖させて、安定に形質移入されたクローンを選択した。細胞に３日毎にもう２〜３回養分補給を行い、ＭＴＸ耐性クローンを２〜３週間中に出現させた。クローンの上清を抗ヒトＦｃによるＥＬＩＳＡによって検定して高産生株を特定した[Gillies等(1989年)のJ. Immunol. Methods 第125巻：191頁］。高産生クローンを単離し１００ｎＭのＭＴＸを含有する増殖培地中で増殖させた。
【００７２】
１Ｂ．ＥＬＩＳＡ
３種の異なるＥＬＩＳＡを利用してＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの上清中タンパク質産物濃度を決定した。抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡは、ヒトＦｃ含有タンパク質、たとえばキメラ抗体の量を測定するのに使用した。抗ヒトκＥＬＩＳＡは(キメラもしくはヒト免疫グロブリンの)κ軽鎖の量を測定するのに使用した。抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡは試験サンプル中のｍｕＦｃ含有タンパク質量を測定するのに使用した(以下の実施例１Ｃを参照)。以下に抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡを詳述する。
【００７３】
Ａ．プレートをコートする
ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno Research)を９６ウェルプレート(Nunc-Immuno plate Maxisorp)のウェル当り１００μｌ使用してＥＬＩＳＡプレートをコートした。コートしたプレートを覆い４℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ(Ｔｗｅｅｎ２０)で４回洗浄し、ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清を２００μｌ／ウェル使用してブロックした。ブロッキング緩衝液と共に３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで４回洗浄し、ペーパータオル上で軽く叩いて乾燥させた。
【００７４】
Ｂ．試験サンプルおよび二次抗体とのインキュベート
ＰＢＳに１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎを含んだサンプル緩衝液で試験サンプルを適当な濃度に希釈した。既知の濃度の(ヒトＦｃとの)キメラ抗体を用いて検量線を作成した。検量線を作成するには、サンプル緩衝液で連続希釈を行って、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲の検量線を得る。プレートに１００μｌ／ウェルの希釈したサンプルおよび基準物質を加え、このプレートを３７℃で２時間インキュベートした。
【００７５】
インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに１００μｌの二次抗体を加え、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗ヒトＩｇＧ(Jackson Immuno Research)をサンプル緩衝液で約１：１２０，０００に希釈した。ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧの各ロットについて、二次抗体の厳密な希釈度を決定する必要があった。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。
【００７６】
Ｃ．発色
１００μｌ／ウェルの基質溶液をプレートに加えた。この基質溶液は、新たに加えたＨ2Ｏ2 ０．０３％を含んだｐＨ５の０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液１５ｍｌにｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩(ＯＰＤ)３０ｍｇ(１錠)を溶解させることによって調製した。暗所において室温で３０分間発色させた。コートしたプレートや二次抗体などのロット間の変動性に応じて発色時間を変更した。検量線で発色を観察して反応を停止させる時間を決定した。反応は１００μｌ／ウェルの４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることによって停止した。４９０ｎｍおよび６５０ｎｍの両方に設定し、４９０ｎｍのバックグラウンドＯＤから６５０ｎｍのバックグラウンドＯＤを減じるようにプログラムされたプレートリーダーでプレートを読み取った。
【００７７】
抗ヒトκＥＬＩＳＡは、使用した二次抗体がホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトκ(Southern Biotechnology Assoc. Inc.、アラバマ州バーミングハム)を、１：４０００希釈で使用したものであったことを除き、上述したものと同じ手順に従った。
【００７８】
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(Jackson Immuno Research)を１００μｌ／ウェル使用してコートし、二次抗体がホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧであるＦｃγ(Jackson Immuno Research)を１：５０００希釈で使用したものであったことを除き、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡの手順も同様である。
【００７９】
１Ｃ．ＫＳ抗原(ＫＳＡ、ＥｐＣＡＭ)のクローニングおよびヒトＥｐＣＡＭ−マウスＦｃとしての可溶性形態の発現
Dynabeads mRNA Direct Kit(Dynal, Inc.、ニューヨーク州レークサクセス)を製造者の指示に従って使用して、ＬｎＣＡＰ細胞からメッセンジャーＲＮＡ(ＭＲＮＡ)を調製した。最初の鎖のｃＤＮＡをオリゴ(ｄＴ)および逆転写酵素で合成してから、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって、(ＫＳ抗原またはＫＳＡとしても知られている)上皮細胞接着分子をコードする全長ｃＤＮＡをクローン化した。ＰＣＲプライマーの配列は、PerezおよびWalker(1989年)のJ. Immunol. 第142巻：3662〜3667頁に記載の公表されている配列に基づいている。センスプライマ−の配列は、 ＴＣＴＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡ(配列番号２７)であり、ナンセンスプライマ−の配列は、ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴ(配列番号２８)であり、翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンであるアンチコドンを太字で表示し、制限部位ＸｂａＩ(ＴＣＴＡＧＡ)およびＸｈｏＩ(ＣＴＣＧＡＧ)には下線を引いてある。ＰＣＲ産物をクローン化し、いくつかの独立したクローンの配列決定を行うことによってＫＳＡ配列が正確であることを確認した。ＬｎＣＡＰから得たＫＳＡのｃＤＮＡ配列は、ＵＣＬＡ−Ｐ３細胞から得られた公表されているＫＳＡ配列(PerezおよびWalker、1989年)と本質的に同一であった。しかし、１１５番目のアミノ酸残基の箇所がＬｎＣＡＰから得たヌクレオチド配列ではＡＣＧでなくＡＴＧ(Ｔｈｒの代わりにＭｅｔ)であり、２７７番目のアミノ酸残基の箇所がＬｎＣＡＰから得たヌクレオチド配列ではＡＴＧでなくＡＴＡ(Ｍｅｔの代わりにＩｌｅ)であった。
【００８０】
ＫＳ−１／４抗体が組換えＫＳＡに結合したことを免疫染色によって実証した。細胞、たとえばＣＴ２６、Ｂ１６などに適切な哺乳動物発現ベクター(米国特許第５，５４１，０８７号に記載のｐｄＣｓ)に入れた全長ＫＳＡを形質移入することによって、ＫＳＡを表面に発現させてから、ＫＳ−１／４抗体の免疫染色を行った。ＫＳＡの可溶性抗体としての発現についてはＫＳＡの膜貫通ドメインをコードするＤＮＡの部分が欠失していた。発現、検出および精製を行いやすくするために可溶性ＫＳＡをＫＳＡ−ｍｕＦｃとして発現させたがその構築を以下で記載する。可溶性ＫＳＡをコードする７８０ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ制限断片を、次のリンカー−アダプターを介してｍｕＦｃをコードするＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片(米国特許第５，７２６，０４４号)に連結した。
【００８１】
【表５】
【００８２】
可溶性ＫＳＡ−ｍｕＦｃをコードするＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐｄＣｓベクターに連結した。得られた発現ベクターｐｄＣｓ−ＫＳＡ−ｍｕＦｃを使用して細胞に形質移入を施し、抗ｍｕＦｃ ＥＬＩＳＡによってＫＳＡ−ｍｕＦｃを発現する安定なクローンを特定した。
【００８３】
１Ｄ．抗原結合の測定
まず、供給業者のプロトコルに従って、ＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィー(Repligen、マサチューセッツ州ケンブリッジ)によって条件培地中のＫＳＡ−ｍｕＦｃを精製した。精製したＫＳＡ−ｍｕＦｃをＰＢＳ中５μｇ／ｍｌで１００μｌ／ウェル使用して、９６ウェルプレート(Nunc−Immuno plate、Maxisorp)をコートした。このアッセイは実施例１Ｂに記載のＥＬＩＳＡの手順と同様とした。簡潔に述べると、コートしたプレートを覆い４℃で終夜インキュベートした。次いでプレートを洗浄しブロックした。試験サンプルをサンプル緩衝液で適当な濃度に希釈し１００μｌ／ウェルをプレートに加えプレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎで８回洗浄した。次いで、各ウェルに二次抗体であるホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ(Jackson Immuno Research)１００μｌを加え、サンプル緩衝液で約１：１２０，０００に希釈した。次いで実施例１Ｂに記載したとおりにプレートを発色させ、読み取った。
【００８４】
１Ｅ．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用する、ＥｐＣＡＭから得たＫＳ−１／４抗体のオン速度およびオフ速度の測定
ＫＳ−１／４およびＫＳ−ＩＬ２分子の抗原ＥｐＣＡＭに対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置(Biacore International AB、Uppsala、スウェーデン)を使用する、抗体−抗原相互作用の表面プラスモン共鳴分析によって測定した。製造業者が提供するアミン結合プロトコルを利用してＥｐＣＡＭ−マウスＦｃをＣＭ５センサーチップに結合させた。次いで、このチップを２５ｎｍと２００ｎＭの間の様々な濃度のＫＳ−１／４およびＫＳ−ＩＬ２に通し、それによってチップへの結合を観察した。ソフトウェアに組み込まれたカーブフィッティングルーチンを利用して、オン速度、オフ速度、結合定数および解離定数を算出した。
【００８５】
１Ｆ．ＥｐＣＡＭを発現する細胞系を使用する、ＫＳ−１／４抗体の結合親和性の測定
標準の技術を利用して、精製したＫＳ−１／４抗体を125Ｉでヨウ素化し、濃度を徐々に増加させてある標識タンパク質を、ＥｐＣＡＭ陽性細胞系ＰＣ−３と共にインキュベートした。飽和結合曲線を作成し、スキャッチャード分析(Scatchard analysis)によって解離定数を決定した。
【００８６】
[実施例２]
マウスＫＳ−１／４のＶHおよびＶKをコードするｃＤＮＡのクローンニングおよびＫＳ−１／４ハイブリドーマ由来抗体を発現させるベクターの構築
(R. Reisfeld、Scripps Research Instituteから提供を受けた)マウスＫＳ−１／４を発現するハイブリドーマから調製したメッセンジャーＲＮＡにオリゴ(ｄＴ)で逆転写を起こし、次いで、ＰＣＲ用の鋳型として使用して、重鎖可変領域(ＶH)および軽鎖可変領域(ＶK)をコードする配列を増幅した。ＰＣＲプライマーは公表されている配列(Beavers等、前記)に基づいて設計した。ＶH用のＰＣＲプライマーは以下の配列を備え、
【００８７】
【表６】
【００８８】
そのＣＴＣＧＡＧおよびＡＡＧＣＴＴ配列が、それぞれＶHを発現ベクター(以下参照)に連結するために使用されるＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を表し、逆プライマー中のＴＡＣが、ＰＣＲ産物のセンス鎖中にＧＴＡ、すなわちスプライス供与共通配列を導入することになるものであった。
【００８９】
ＶK用のＰＣＲプライマーは、以下の配列を備え、
【００９０】
【表７】
【００９１】
そのＴＣＴＡＧＡおよびＡＧＡＴＣＴ配列が、それぞれ、ＶKを発現ベクター(以下参照)に連結するために使用されるＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を表し、ＡＴＧが軽鎖の翻訳開始コドンであり、逆プライマーのＴＡＣがＰＣＲ産物のセンス鎖中にＧＴＡすなわちスプライス供与共通配列を導入することになるものであった。
【００９２】
マウスＫＳ−１／４抗体のＶHおよびＶKをコードするＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen、カリフォルニア州Carlsbad)中でクローン化した。いくつかのＶHおよびＶKクローンの配列決定を行い各々の共通配列を決定した。発現ベクターｐｄＨＬ７にそのＶHおよびＶK配列を段階的に導入した。連結には、ＶHでは特有のＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位、ならびにＶKでは特有のＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ部位を利用した(ＶK挿入断片中の特有のＢｇｌＩＩとベクター中の特有のＢａｍＨＩは、適合するオーバーハングを有する)。得られた構築物は、ｐｄＨＬ７ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４と称するが、これは、キメラ抗体を発現させるための転写調節成分およびヒトＩｇ定常領域配列を既に含んでいた(Gillies等(1989年)のJ. Immunol. Methods 第125巻：191頁)。
【００９３】
発現ベクターｐｄＨＬ７はｐｄＨＬ２[Gillies等(1991年)のHybridoma第10巻：347〜356頁]由来であり以下の改変を伴う：発現ベクターｐｄＨＬ２では、軽鎖用および重鎖−サイトカイン用の転写単位が重鎖免疫グロブリン遺伝子のエンハンサーとメタロチオネインプロモーターとからなる。ｐｄＨＬ７では、これらの２個の転写単位がＣＭＶエンハンサー−プロモーター[Boshart等(1985年)のCell第41巻：521〜530頁]からなっていた。ＣＭＶエンハンサー−プロモーターをコードするＤＮＡは、市販のｐｃＤＮＡＩ(Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サンディエゴ)のＡｆｌＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片から得た。
【００９４】
[実施例３]
マウスＫＳ−１／４抗体の発現研究
この実施例では、米国特許第４，９７５，３６９号に開示されているＶ領域配列をコードする抗体発現プラスミドを使用して実施した発現研究を論じる。
【００９５】
３Ａ．プラスミドの構築
ハイブリドーマＫＳ−１／４配列にコードされたキメラ抗体と、米国特許第４，９７５，３６９号に記載の諸配列にコードされたキメラ抗体とを直接に比較するために、米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶH配列をコードするｃＤＮＡを合成した。次いで既にＫＳ−１／４のＶKを含んでいるｐｄＨＬ７発現ベクターにこれを連結した。
【００９６】
米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶH配列を構築するために、ＶH配列の部分をコードするＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を完全な化学合成によって得た。部分的に重なり合うオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、連結した。次いで、この連結された二本鎖をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター(Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ)でサブクローニングした。
【００９７】
このＤＮＡは米国特許第４，９７５，３６９号のタンパク質配列ＩＱＱＰＱＮＭＲＴＭをコードしている。コード配列のすぐ３'側はｇｔａで始まるスプライス供与部位である。上部鎖５'末端側のｃｔａｇはＸｂａＩクローン化部位に対するオーバーハングである。ＸｂａＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのポリリンカーに導入(cloning)するためだけに作製した。この部位のすぐ後はＮｄｅＩ制限部位(ＣＡＴＡＴＧ)とした。下部鎖５'末端側のａｇｃｔはＨｉｎｄＩＩＩクローン化部位のオーバーハングである。このＨｉｎｄＩＩＩ付着末端は、後にＣγ１遺伝子の前にあるイントロン中のＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される[Gillies等(1991年)のHybridoma第10巻：347〜356頁]。
【００９８】
配列を確認した後ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片を単離した。次いで、この断片、ならびにＶHのＮ末端側半分をコードするＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ断片を、ＫＳ−１／４のＶKを含む、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐｄＨＬ７発現ベクターに連結した。得られた構築物、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４は、米国特許第４，９７５，３６９号に記載のＶKおよびＶH(ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４と呼ばれる)を含んでいた。
【００９９】
３Ｂ．ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４とＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の比較
プラスミドＤＮＡのｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４およびｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４を、上述のリン酸カルシウム共沈法によって並行してヒト腎臓２９３細胞に導入した。形質移入後５日目に、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡおよびκＥＬＩＳＡ(ＥＬＩＳＡ法についての実施例１を参照)によって条件培地を検定したが、その結果を表１に要約する。
【０１００】
【表８】
【０１０１】
結果は、２種の異なるＥＬＬＳＡの精度の範囲内で、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４が発現し、分泌されたこと、ならびに分泌された抗体が、おおよそ等モル量の重鎖および軽鎖からなっていたことを示した。一方、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の条件培地では、重鎖が少ないレベルでしか検出されず、それと結合したκ軽鎖はなかった。
【０１０２】
一過性に形質移入した２種の細胞系の全細胞溶解産物および条件培地全体についてウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット分析の手順は、(Sambrook等(1989年)、上記)に記載のとおりとした。全細胞溶解産物を分析するためには、形質移入した細胞を溶解し、遠心分離して壊死組織片を除去し、レーン毎に、５×１０5個の細胞に相当するものから得られた溶解産物を載せた。条件培地を分析するためには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、まず還元性条件下でのＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによって、３００μＬの条件培地から得られたタンパク質産物を精製した。ウェスタンブロット転写後、そのブロットを、１：２０００希釈で用いた、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧであるＦｃγ(Jackson ImmunoResearch)とハイブリッド形成させた。
【０１０３】
ウェスタンブロット転写は、用いた条件下では、ｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４を形質移入した条件培地および溶解細胞の両方で重鎖が検出されたことを示した。この結果は、ｃｈＫＳ−１／４抗体の重鎖が(軽鎖と共に)細胞中で産生され、効率よく分泌されたことを示唆する。その一方で、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４を形質移入して得られた重鎖は、細胞溶解産物中だけでしか検出されず、条件培地中にはなかった。この結果は、細胞内で匹敵するレベルの重鎖が産生されたものの、分泌されなかったことを示唆するものであった。この発見は、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体では、少量の分泌重鎖と結合したκ軽鎖がなかったことが示されたＥＬＩＳＡのデータと一致していた。免疫グロブリン重鎖は通常、免疫グロブリン軽鎖なしでは正常に分泌されないことがわかっている[Hendershot等(1987年)のImmunology Today第8巻:111頁]。
【０１０４】
前述の例に加え、ＮＳ／０細胞にも、プラスミドｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４およびｐｄＨＬ７−ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４を電子穿孔法によって並行して形質移入した。実施例１に記載のとおりに、１００ｎＭのＭＴＸ存在下で安定なクローンを選択し、９６ウェルプレートに入ったＭＴＸ耐性クローンの条件培地を、抗ｈｕＦｃ ＥＬＩＳＡによって実施例１に記載のとおりに検定した。結果を表２に要約する。
【０１０５】
【表９】
【０１０６】
９６ウェルの台でスクリーニングを行うと、ｐｄＨＬ７−ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４構築物を用いて得たクローンの大部分は、約１００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの抗体を産生し、最良のクローンは、約１０〜５０μｇ／ｍＬを産生した。一方、ｐｄＨＬ７−'３６９ｃｈＫＳ−１／４構築物を用いて得たクローンの大部分は約０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの抗体を産生し、最高の産生量は約３００〜４００ｎｇ／ｍＬであった。ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４抗体の組成および結合特性を調べるためには、３００〜４００ｎｇ／ｍＬを産生したクローンを増殖させる必要があった。これらのクローンの２集団を増殖用に選択した。しかしこれらの発現レベルは非常に不安定であることがわかった。抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡによって検定したところ、培養物が２００ｍＬに増えるまでに、両方のクローンの発現レベルが約２０ｎｇ／ｍＬに低下していた。抗κＥＬＩＳＡによって同じ条件培地を検定すると、２９３細胞中で一過性に発現させた場合と同様に、κ軽鎖が検出されなかった。
【０１０７】
以下の実験によって、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４重鎖と結合した検出可能なκ軽鎖がなかったことが示された。簡潔に述べると、各５０ｍＬの各クローンの条件培地をＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィーによって濃縮した。溶出物を抗Ｆｃ ＥＬＩＳＡおよび抗κＥＬＩＳＡによって検定した。対照として、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４産生クローンの条件培地を同じ方法で処理し、同時に検定にかけた。ＥＬＩＳＡの結果を表３に要約する。
【０１０８】
【表１０】
【０１０９】
結果は、ＵＳ４，９７５，３６９ｃｈＫＳ−１／４重鎖と結合した検出可能なκ軽鎖が実際になかったことを示した。さらに、ＵＳ４，９７５，３６９抗体は、両方のクローンに由来するものが、２５３ｎｇ／ｍＬおよび３１３ｎｇ／ｍＬに濃縮してもＫＳ抗原を結合しなかったのに対し、ハイブリドーマｃｈＫＳ−１／４抗体は、１０〜２０ｎｇ／ｍＬでＫＳ抗原を結合したことが示された(ＫＳ抗原への結合の測定についての実施例９を参照)。
【０１１０】
［実施例４］
変異体ＫＳ抗体の発現および特徴付け
標的分子に対する抗体の発現または親和性をかなり低下させる突然変異は、ヒトの治療目的にそれほど有効でないことが予想される。「張り合わせ」、「ヒト化」、「免疫原性除去」など、免疫原性を低下させる手法は、多くのアミノ酸置換基を導入するものであり、抗体の抗原への結合を妨害することもある(たとえば、米国特許第５，６３９，６４１号、米国特許第５，５８５，０８９号、ＰＣＴ公告番号ＷＯ９８／５２９７６、ＷＯ００／３４３１７を参照)。当技術分野では、上皮細胞接着分子に結合するが、その抗原を認識する元のマウスモノクローナル抗体と性質が異なる抗体配列のクラスが求められている。
【０１１１】
ＫＳ−１／４の重鎖および軽鎖可変(「Ｖ」)領域の様々な組合せの発現性(ability to be expressed)およびＥｐＣＡＭ結合能を試験した。それらの結果を表４〜６に要約し以下で説明する。
【０１１２】
【表１１】
【０１１３】
【表１２】
【０１１４】
【表１３】
【０１１５】
これらの配列は次のように関連している。実施例で記載したように、ＶＨ０およびＶＫ０配列は、元のマウス由来ＫＳ−１／４(配列番号１および配列番号２)を発現するハイブリドーマ細胞系からＰＣＲ増幅によって得た。ＶＨ−'３６９は、米国特許第４，９７５，３６９号に開示されているＶＨ配列である。配列ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ２．１−２．４ＶＫ１、およびＶＫ２は、ペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを減少する突然変異を導入してＴ細胞エピトープの潜在的存在を除去または弱化する免疫原性除去技術を使用するか、あるいは非ヒトＴ細胞エピトープをヒト抗体中に存在する自己エピトープと一致するように変化させることによって得た。これらの構築物の設計を以下でさらに説明し、分析する。表６の構築物は、哺乳動物細胞に、対応する重鎖および軽鎖の各Ｖ領域を発現している核酸の組合せを形質移入することによって作製した。配列ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＫ６、ＶＫ７およびＶＫ８は、ヒトＢ細胞エピトープの潜在的存在を除去する目的で、以下で述べるように、ハイブリドーマＫＳ−１／４の表面残基をヒトの対応物に変更することによって生成した。構築物１から３は、哺乳動物細胞に、表４および以下に記載の重鎖および軽鎖の各Ｖ領域ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＫ６、ＶＫ７およびＶＫ８を発現する核酸の組合せを形質移入することによって生成した。
【０１１６】
４Ａ．ヒトＴ細胞エピトープがよりわずかなＫＳ抗体の特徴付け
配列ＶＨ２．１〜ＶＨ２．５を作製して、ＫＳ−１／４重鎖ＣＤＲ３領域でのあるアミノ酸の挿入および置換が許容されるかを試験した。前述の実施例に記載の方法に従って、軽鎖および重鎖の組合せであるＶＫ０／ＶＨ１、ＶＫ１／ＶＨ７、ＶＫ１／ＶＨ１、ＶＫ１／ＶＨ２、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２、ＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２およびＶＫ１／ＶＨ２．５−ＩＬ２の発現ベクターを構築し、これらに対応する抗体、および抗体−ＩＬ２融合タンパク質を発現させ、試験した。
【０１１７】
具体的には、配列ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＫ１およびＶＫ２は、完全化学合成によって得た。これらの各配列について、これらの領域のコード鎖および相補鎖全体を含む、一連の重複オリゴヌクレオチドを化学的に合成し、リン酸エステル化し、連結した。次いで、連結された二重鎖の分子を、断片の末端に適切なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen、カリフォルニア州Carlsbad)に導入し、配列を確認した。次いで、これらのＤＮＡ断片を発現ベクターｐｄＨＬ７の適切な部位に挿入して、完全な重(「Ｈ」)鎖および軽(「Ｌ」)鎖をそれぞれ生成した。
【０１１８】
配列ＶＨ２．５は、標準の分子生物学的技術を使用して、１０８位がＧｉｎでなくＴｈｒになるよう１個のコドンを変更することによってＶＨ２から得た(表４)。
【０１１９】
抗体をＥＬＩＳＡによって試験し(表６)、表面プラスモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ装置およびソフトウェア)を使用して、そのＥｐＣＡＭへの結合能を比較した。ＥＬＩＳＡによる実験の結果は、主としてオフ速度を反映し、オン速度は反映しておらず、さらに、一般にそれほど正確でないと考えられるので、不十分なＥＬＩＳＡの結果は一般にある種の構築物をこれ以上の考察から除外するために使用された。しかし、ＥＬＩＳＡ試験によって良好な結合を示した抗体は、さらに特徴付けを行う必要があった。
【０１２０】
表面プラスモン共鳴分析の結果は以下のとおりであった。
【０１２１】
【表１４】
【０１２２】
ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２のオフ速度は、ＶＫ１／Ｖ２−ＩＬ２またはＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２よりも格段に速いので、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２は、あまり有用でない融合タンパク質であるとみなした。
【０１２３】
ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２とＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２は、ＣＤＲ３中のＶH１００位のメチオニン／イソロイシンの違いだけであることを考えると、ＶＫ１／ＶＨ１−ＩＬ２のオフ速度がＶＫ１／ＶＨ２−ＩＬ２よりも向上していたことは、この位置がＥｐＣＡＭと疎水性に接触すること、および若干長い方のメチオニン側鎖では接触の有効性が低いことを示している。タンパク質−タンパク質の相互作用の分野では、一般に、疎水性の相互作用はオフ速度の決定において重要な役割を担っているものの、オン速度決定におけるその役割の重大性はそれよりずっと低いと考えられている。
【０１２４】
４Ｂ．１個のアミノ酸が挿入されたＫＳ−１／４変異型の特徴付け
ＥｐＣＡＭに対するＫＳ抗体の親和性について、重鎖Ｖ領域のＣＤＲ３配列が重要であるかを、この領域にアミノ酸の挿入または置換を含む一連の変異型を用いて決定した。配列ＶＨ２．１、ＶＨ２．２、ＶＨ２．３およびＶＨ２．４は、標準の組換えＤＮＡ技術を使用して、ＶＨ２およびＶＫ１をコードする発現ベクターを操作することによって生成した。前述の実施例で記載したように、得られる発現ベクターをＮＳ／０細胞に形質移入し、分泌された抗体タンパク質を精製した。
【０１２５】
ＶＨ１変異型は、ＶＨ２変異型よりも最適でないことが判明し、ＣＤＲ３中のイソロイシンをメチオニンで置換できなかったことが示された。次の目的は、ＣＤＲ３中のアミノ酸の挿入によって結合特性がＶＨ１よりも良好なＫＳ−１／４重鎖Ｖ領域が得られるかを試験することであった。表６のデータは、ＶＫ１／ＶＨ２．１、ＶＫ１／ＶＨ２．２、ＶＫ１／ＶＨ２．３およびＶＫ１／ＶＨ２．４の結合を、ＶＫ１／ＶＨ１と比較するものである。ＫＳ−１／４ＶHのＣＤＲ３中にアミノ酸が挿入された構築物はどれも、ＶＨ１よりも抗原結合が向上しておらず、むしろ挿入変異型の抗原結合活性は、若干低下しまたは大いに低下していたことが判明した。
【０１２６】
これらの結果は、ＣＤＲ３中のアミノ酸の挿入が、一般にＫＳ−１／４重鎖Ｖ領域の抗原結合活性にとって有害であることを示唆している。このデータを分析すると普遍的な結論がいくつか浮かび上がる。詳細には、アミノ酸Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎからなる８４〜１０８位のＫＳ−１／４ＶHアミノ酸セグメントが、ＫＳ−１／４抗原結合にとって重要である。このセグメントは、一般に１個および多数のアミノ酸の置換には耐性であるが、発現および組立に有害な影響を及ぼし得るアミノ酸挿入には耐性でないフレームワークセグメントＡｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇを含む。さらに、このデータは、効率よく発現され、ＥｐＣＡＭに結合する抗体であるためには、８６、９１、９３、９４、および９５位のアミノ酸が疎水性アミノ酸であることが好ましいことを示唆している。
【０１２７】
Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＴｙｒからなるＶH ＣＤＲ３セグメントでのアミノ酸の挿入は、一般にＫＳ−１／４抗体のＥｐＣＡＭ抗原結合機能に有害であるが、ある種の挿入は、部分的な活性の喪失しか伴わずに許容される。同様に、これらの位置での置換も、一般にＥｐＣＡＭ抗原の結合に有害であるが、ある種の挿入が部分的な活性の喪失しか伴わずに許容される。
【０１２８】
４Ｃ．マウス表面残基がそのヒト対応物に変換してあるＫＳ−１／４抗体の活性誘導体の構築
マウス由来Ｖ領域の免疫原性を最小にするために、ＫＳ−１／４抗体内のアミノ酸をヒト抗体中に普通に見られるアミノ酸で置換することによって、抗体を調製した。また好ましいＫＳ誘導体ではヒトＥｐＣＡＭに対する特異的な結合親和性が保たれている。
【０１２９】
構築物１．ＫＳ−１／４軽鎖はヒト共通サブグループＩＩＩに最もよく似ており、重鎖はサブグループＩに最もよく似ていることがわかった。このような類似性に基づき、ヒト共通サブグループアミノ酸と、ＫＳ−１／４由来ＣＤＲと、非共通アミノ酸とからなる概念上の配列を作製した。Silicon GraphicsのWorkstationおよびＢｉｏＳｙｍ分子模型製作ソフトウェアを使用してこの構築物および以下の構築物について３次元モデルを作成した。
【０１３０】
その３次元モデルを観察すると、あるヒト由来アミノ酸がＣＤＲに接近しており、ＣＤＲの高次構造に影響を及ぼすようであることが明らかになった。この分析に基づき、軽鎖のヒトＳｅｒ２２、Ａｒｇ４４およびＰｈｅ６６を元に戻して、それぞれＴｈｒ、ＬｙｓおよびＴｙｒにした。重鎖ではこのような変更は必要ないと考えられた。構築物１の最終的な設計では、軽鎖がマウス軽鎖では見られない１８個のヒトアミノ酸を含み、重鎖がマウス重鎖では見られない２２個のヒトアミノ酸を含んでいた。
【０１３１】
構築物１を発現するＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドを使用して作製した。構築物１のタンパク質が効率よく発現されたが、ＥｐＣＡＭ結合アッセイで活性が１０分の１より低いことがわかった。
【０１３２】
構築物２．次いで、次の変更しか導入しないより穏やかな方法を採用した。
【０１３３】
【表１５】
【０１３４】
構築物２を発現するＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドおよび標準の組換えＤＮＡ技術を使用して作製した。構築物２のタンパク質は効率よく発現されなかった。さらに、構築物２の軽鎖とマウスＫＳ−１／４重鎖の組合せは効率よく発現されないが、構築物２の重鎖とマウスＫＳ−１／４軽鎖の組合せは効率よく発現されることがわかった。したがって、発現の欠陥は構築物２の軽鎖にあると思われた。
【０１３５】
構築物３．構築物２軽鎖の見かけ上の発現の欠陥に基づいて、構築物１の軽鎖のＮ末端部分とマウス軽鎖のＣ末端部分とを融合させることによって、新たな軽鎖を構築した。３５位および３６位のアミノ酸をコードするＫｐｎＩ部位を使用した。この軽鎖と構築物２の重鎖を組み合わせると、効率よく発現され、結合の有意な損失は認められなかった。
【０１３６】
構築物３は、構築物１または２と比べると、タンパク質の発現および抗原に対する親和性に関してより優れた特性を備えた抗体をもたらしたので、構築物３のＤＮＡ配列をｐｄＨＬ７ｓ−ＩＬ２に導入して、配列番号４０として開示しているｐｄＨＬ７ｓ−ＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２を得た。発現の目的で、実施例１Ａに記載のとおりに、このプラスミドＤＮＡを電気穿孔によってマウス骨髄腫細胞ＮＳ／０に導入して、安定に形質移入された細胞系を生成した。次いで、実施例１Ｂに記載のとおりに、ヒトＦｃでコートするＥＬＩＳＡにおいて、安定なクローンから取った培地の抗体の発現を検定した。この抗体融合タンパク質の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４１および配列番号４２で示す。
【０１３７】
さらに、実施例１Ｆに記載の方法を使用して、ＰＣ−３腫瘍細胞の表面に発現されたＥｐＣＡＭに対する、ヨウ素化されたＶＫ８／ＶＨ７およびＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２の結合と、ヨウ素化されたＶＫ０／ＶＨ０−ＩＬ２の結合とを比較した。実験上の誤差の範囲内で、ＶＫ８／ＶＨ７とＶＫ０／ＶＨ０、およびＶＫ８／ＶＨ７−ＩＬ２とＶＫ０／ＶＨ０−ＩＬ２について、本質的に同一な結合親和性が見られた。
【０１３８】
４Ｄ．活性なＫＳ−１／４抗体の構築に有用な構造−機能の関連性
まとめると、ＫＳ−１／４抗体の抗原結合活性、および開示されたＶ領域配列との融合タンパク質の抗原結合活性は、ＥｐＣＡＭに対するＫＳ−１／４抗体の配列の設計に、ならびにＫＳ−１／４抗体の適切な発現および分泌のために指標を提供している。特に、ＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域は、多数のアミノ酸置換を許容でき、活性を保持し得るが、ただしこれらのアミノ酸置換はＣＤＲ以外である。ＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域は、特にＣＤＲ内、またはＣＤＲ間のフレームワーク領域中のアミノ酸挿入を一般に許容しないようである。
【０１３９】
たとえば、ハイブリドーマＫＳ−１／４配列を出発「野生型」配列とする場合、データは、重鎖Ｖ領域が、活性をほとんどまたはまったく喪失せずに、９、１１、１６、１７、３８、４０、６９、７０、７１、７２、７６、７９、８０、８３、８８、９１および１１１位でのアミノ酸置換を許容できることを示す。同様に、軽鎖は、活性をほとんどまたはまったく喪失せずに、１、３、１０、１１、１２、１３、１７、１８、１９、２１、４１、４２、５９、７１、７３、７５、７７および１０３位でのアミノ酸置換を許容できる。これらの変更はＫＳ−１／４重鎖および軽鎖Ｖ領域のＣＤＲ以外である。明らかに許容可能な１７個の重鎖アミノ酸置換基はＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約２１％に相当し、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約６８％に対してアミノ酸置換を試みた。同様に、明らかに許容される１８個の軽鎖アミノ酸置換基は、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約２３％に相当し、ＣＤＲ以外のアミノ酸位置の約７２％に対してアミノ酸置換を試みた。有用性のかなり劣るタンパク質がもたらされたＣＤＲ以外でのアミノ酸置換例は、発現にマイナスの影響を及ぼすと思われた軽鎖でのＡｌａ７９Ｐｒｏの置換、および抗原結合にマイナスの影響を及ぼした重鎖でのＱ１０８Ｔの置換の２例だけである。したがって、ＫＳ−１／４抗体のＣＤＲ以外の重鎖または軽鎖配列にアミノ酸置換基を導入することができ、置換によって活性なタンパク質が得られる確立は高い。
【０１４０】
ＣＤＲでのアミノ酸の置換を伴う突然変異はしばしば抗原結合にマイナスの影響を及ぼす。たとえば重鎖でのＩ１００Ｍの置換は結合を約８分の１に低下させる。アミノ酸の挿入を伴う突然変異は一般にＫＳ−１／４配列の有用性にマイナスの影響を及ぼす。たとえばＶＨ−'３６９重鎖Ｖ領域は本明細所で記載する軽鎖を有する適切な抗体に組み立てることができない。ＶＨ２．１〜２．４の変異型は重鎖Ｖ領域ＣＤＲ３中にアミノ酸が挿入されており、それぞれの変異型が抗原結合に対してマイナスの影響力を有する。
【０１４１】
[実施例５]
ヒトにおけるＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２融合タンパク質の免疫原性
ヒトでの臨床試験では、患者２２名を対象に１日４時間のＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２静脈内注入連続３日間行うことを含む治療処置を１回または複数回受けた。治療処置ごとに１カ月の間隔を設けた(Weber等(2001年)のProc. Am. Soc. Clin. Oncology第20巻：259頁a)。各々の治療処置の前後に各患者から血清サンプルを採取し、全ＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２分子または(Ｆｖ領域なしの)Ｆｃ−ＩＬ２成分に対する抗体の反応性について試験した。免疫化前(pre−immune)血清ではいずれにも反応性が認められなかった。結果は、Ｆｖ領域単独、またはＦｖ領域およびＦｃ−ＩＬ２成分の両方に対して何らかの有意な免疫応答を経験した患者が４名しかいなかったことを示した。さらにこのような応答は、その後ｈｕＫＳ−ＩＬ２を作用させても増大するようには思われなかった。
【０１４２】
インターロイキン２部分はアジュバント効果を有しているので、抗体−ＩＬ２融合タンパク質の使用によって、Ｖ領域の免疫原性試験が特に厳密なものになると考えられる。したがって、ＫＳ抗体(構築物３)−ＩＬ２融合タンパク質に対する抗体応答をはっきりと示したレシピアントは少数しかおらず、結果は、ＫＳ抗体(構築物３)をヒトに投与できることを示唆している。ＫＳ抗体(構築物３)が、対応するヒトアミノ酸残基で数個のアミノ酸残基が置換されているものの、ほとんど完全にマウス由来である可変領域を含んでいることを考慮すると、これらの結果は、特に有望である。
【０１４３】
同等な形態
本発明は、その精神または本質的な特徴から外れることなく、他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するものでなく、すべての点で例示的なものであるとみなされる。すなわち、本発明の範囲は、これまでの記述でなく、添付の特許請求の範囲によって示され、請求項の同等性の意味および範囲から逸脱することなく生じるすべての変更がそこに含まれるものとする。
【０１４４】
参照による組み込み
本明細書で開示した各々の特許文献および特定の刊行物の開示を参照により全体として本出願に組み込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を規定する、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３１、（ｉｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を規定する、配列番号１のアミノ酸残基４９〜５５、および（ｉｉｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を規定する配列番号１のアミノ酸残基８８〜９６、ならびに、（ｉｖ）免疫グロブリン軽鎖フレーム領域を規定し、配列番号９のアミノ酸残基1〜２３からなるアミノ酸配列をさらに含む軽鎖と、
（ｂ）（ｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、（ｉｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ２配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基５０〜６２、および（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ３配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基１０１〜１０５、ならびに、（ｉｖ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸残基１〜２５および（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸残基６７〜９８からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖フレーム領域を規定するアミノ酸配列をさらに含む重鎖と、
を含む組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項２】
前記軽鎖が配列番号９のアミノ酸残基１〜１０６を含む、請求項1に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項３】
前記重鎖が配列番号１８のアミノ酸残基１〜１１６を含む、請求項1に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項４】
配列番号９のアミノ酸残基１〜１０６により規定されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖と、配列番号１８のアミノ酸残基１〜１１６により規定されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖とを含む、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体をコードする発現ベクター。
【請求項６】
前記抗体に融合されるサイトカインをさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項７】
前記サイトカインがＩＬ２である、請求項６に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体−サイトカイン融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号４１の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを有する、請求項７に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体−サイトカイン融合タンパク質。
【請求項９】
疾患の患部組織のＥｐＣＡＭレベルが該疾患に罹患していない組織よりも高いレベルを有するＥｐＣＡＭ過剰発現に関連する疾患を処置するための薬剤を製造するための請求項１から４のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１０】
疾患の患部組織のＥｐＣＡＭレベルが該疾患に罹患していない組織よりも高いレベルを有するＥｐＣＡＭ過剰発現に関連する疾患を処置するための薬剤を製造するための、請求項６から８のいずれかに記載の抗体−サイトカイン融合タンパク質の使用。
【請求項１】
（ａ）（ｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ１配列を規定する、配列番号１のアミノ酸残基２４〜３１、（ｉｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ２配列を規定する、配列番号１のアミノ酸残基４９〜５５、および（ｉｉｉ）抗体の軽鎖のＣＤＲ３配列を規定する配列番号１のアミノ酸残基８８〜９６、ならびに、（ｉｖ）免疫グロブリン軽鎖フレーム領域を規定し、配列番号９のアミノ酸残基1〜２３からなるアミノ酸配列をさらに含む軽鎖と、
（ｂ）（ｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ１配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基２６〜３５、（ｉｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ２配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基５０〜６２、および（ｉｉｉ）抗体の重鎖のＣＤＲ３配列を規定する、配列番号２のアミノ酸残基１０１〜１０５、ならびに、（ｉｖ）（ｉ）配列番号１８のアミノ酸残基１〜２５および（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸残基６７〜９８からなる群から選択される、免疫グロブリン重鎖フレーム領域を規定するアミノ酸配列をさらに含む重鎖と、
を含む組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項２】
前記軽鎖が配列番号９のアミノ酸残基１〜１０６を含む、請求項1に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項３】
前記重鎖が配列番号１８のアミノ酸残基１〜１１６を含む、請求項1に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項４】
配列番号９のアミノ酸残基１〜１０６により規定されるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖と、配列番号１８のアミノ酸残基１〜１１６により規定されるアミノ酸配列を含む抗体の重鎖とを含む、組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体をコードする発現ベクター。
【請求項６】
前記抗体に融合されるサイトカインをさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体。
【請求項７】
前記サイトカインがＩＬ２である、請求項６に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体−サイトカイン融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号４１の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを有する、請求項７に記載の組換え抗ＥｐＣＡＭ抗体−サイトカイン融合タンパク質。
【請求項９】
疾患の患部組織のＥｐＣＡＭレベルが該疾患に罹患していない組織よりも高いレベルを有するＥｐＣＡＭ過剰発現に関連する疾患を処置するための薬剤を製造するための請求項１から４のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１０】
疾患の患部組織のＥｐＣＡＭレベルが該疾患に罹患していない組織よりも高いレベルを有するＥｐＣＡＭ過剰発現に関連する疾患を処置するための薬剤を製造するための、請求項６から８のいずれかに記載の抗体−サイトカイン融合タンパク質の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【公開番号】特開２００９−１３１２８４（Ｐ２００９−１３１２８４Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６４７７５（Ｐ２００９−６４７７５）
【出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６２５（Ｐ２００２−５８７６２５）の分割
【原出願日】平成１４年５月３日（２００２．５．３）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５８７６２５（Ｐ２００２−５８７６２５）の分割
【原出願日】平成１４年５月３日（２００２．５．３）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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