蛍光顕微鏡装置
【課題】 簡単な構成で蛍光と標本の両方の光を観察可能にする安価な蛍光顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】 標本１３からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、前記標本１３を励起する励起光を発生する光源１、２２と、前記標本１３を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源２３と、前記参照光を前記標本１３に導く照明光学系と、前記標本１３からの光束を撮像装置１６に導く対物光学系と、前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本１３からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子５，１１を具備してなる蛍光顕微鏡装置。
【解決手段】 標本１３からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、前記標本１３を励起する励起光を発生する光源１、２２と、前記標本１３を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源２３と、前記参照光を前記標本１３に導く照明光学系と、前記標本１３からの光束を撮像装置１６に導く対物光学系と、前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本１３からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子５，１１を具備してなる蛍光顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡装置に関し、特にフォトアクティベート付き蛍光顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光顕微鏡装置は、参照光で標本を目視で観察し励起光を照射する位置を決め、標本に励起光を照射し標本から発生する蛍光を高感度テレビカメラ等の撮像素子を用いて検出している。近年、蛍光の発する位置を標本上の位置関係から同定するために、標本と蛍光とを撮像装置を用いて検出し、両者を重ねて観察することが行われている。この際、標本からの参照光の光強度と蛍光の光強度とが極端に違っているために（約一万倍以上異なる）、同じ高感度テレビカメラを用いて両者を検出することが困難であった。このため、顕微鏡の光学系中に光量センサーを配置して、参照光の光量を調節することも提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平１１−２５８５１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１の開示例は、顕微鏡の光学系中に光量センサーを配置して光量を検出すると共に、参照光の光量を制御するための制御装置等が必要となり、蛍光顕微鏡装置の構成が複雑となると共に高価になると言う問題がある。
【０００４】
本発明は、上記問題にかんがみて行われたものであり、簡単な構成で蛍光と標本の両方の光を検出可能にする安価な蛍光顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、前記標本を励起する励起光を発生する光源と、前記標本を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源と、前記参照光を前記標本に導く照明光学系と、前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置を提供する。
【０００６】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記励起光は、前記標本を第１励起状態にする第１励起光と、前記第１励起状態から蛍光を発生させる第２励起光を有する構成が好ましい。
【０００７】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記参照光は、前記蛍光の波長より長い波長であることが好ましい。
【０００８】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記光学素子は、少なくとも２枚のダイクロイックミラーからなり、第１ダイクロイックミラーは前記照明光学系に配置され、第２ダイクロイックミラーは前記対物光学系に配置されている構成が好ましい。
【０００９】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を透過し、前記参照光を反射し、前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過する構成が好ましい。
【００１０】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過し、前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過する構成が好ましい。
【００１１】
また、本発明は、標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、標本を第１の励起状態に励起する第１の励起光を発生する第１の励起光源と、前記第１の励起状態から前記蛍光を発生させる第２の励起光を発生する第２の励起光源と、前記標本に前記第１の励起光の照射位置を位置付けする為に用いる参照光を発生する参照光源と、前記第１の励起光と、前記第２の励起光と、前記参照光とを前記標本に導く照明光学系と、前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、前記照明光学系と前記対物光学系の少なくとも一方に、前記参照光の光強度を減衰させる光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡単な構成で蛍光と標本の両方の光を検出可能にする安価な蛍光顕微鏡装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態に関し図面を参照しつつ説明する。
【００１４】
図１は、本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図２は、第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図３は、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図４は、第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図５は、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図６は、第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図８は、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図９は、第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図１０は、本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図１１は、第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００１５】
本発明の実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置は、光感受性蛍光タンパク（Ｐｈｏｔｏ Ａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：略称ＰＡＧＦＰ）と呼ばれる物質の蛍光を観察するのに好適であるフォトアクティベート付き蛍光顕微鏡装置に相当する。このＰＡＧＦＰは、人工的に細胞内で生成されるタンパク質の一種で、生成された状態では光を当てても蛍光を発しないが、特定の波長のレーザ光（例えば、波長４０５ｎｍ）を照射するとレーザ光を照射された部分が変化し（以後、第１励起状態と記す）、別の波長の光を照射（例えば、波長４８８ｎｍ）すると、蛍光（例えば、波長５０５ｎｍ）を発する、所謂ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）としての特性を示すものである。これ以外にも別の特性を持つ光感受性蛍光タンパク質があり、異なる波長のレーザ照射によって特性を変化させることができる。なお、本発明の実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置はレーザ光の波長を変えることによって種々のＰＡＧＦＰの蛍光検出に用いることが可能である。
【００１６】
以下、それぞれの実施の形態に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００１７】
（第１実施の形態）
図１および図２を参照しつつ本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて説明する。
【００１８】
図１において、アーク光源１（例えば、水銀ランプ等）からの光は、コレクタレンズ２で集光され、リレーレンズ３を通過した後、励起フィルタ４で選択された波長の励起光（例えば、波長４８８ｎｍ）が第１ダイクロイックミラー５で反射されて、開口絞り６の位置に集光される。コレクタレンズ２とリレーレンズ３の間にはアーク光源１からの光を通過または遮断するシャッタ７が配置され、不図示のシャッタ制御装置でシャッタ７の開閉が制御される。
【００１９】
開口絞り６の位置に集光された励起光は、リレーレンズ８、視野絞り９、フィールドレンズ１０を介して第２ダイクロイックミラー１１に入射し、対物レンズ１２の方向に反射され、対物レンズ１２を介して図示しないステージに載置された標本１３に照射される。
【００２０】
照射された励起光によって標本１３から発生した蛍光は、対物レンズ１２で集光され、第２ダイクロイックミラー１１を通過してバリアフィルタ１４で検出する波長が選択透過され結像レンズ１５を介して、像面に載置された高感度撮像装置１６（例えば、高感度テレビカメラ等）で撮像され図示しない画像処理装置を介して不図示のモニタ等で観察される。なお、符号Ｉは、照明光学系の光軸を、符号Ｊは、対物光学系の光軸をそれぞれ示している。
【００２１】
また、アーク光源１とは別の場所に設けられたレーザユニット２１には、レーザ光源２２（例えば、波長４０５ｎｍ）とレーザ光源２３（例えば、波長６３３ｎｍ）が配置されている。レーザ光源２２からのレーザ光（以後、第１励起レーザ光と記す）はダイクロイックミラー２４でレーザユニット２１に接続された光ファイバ２５の入射端面２６方向に反射され、入射端面２６に入射する。レーザ光源２３からのレーザ光（以後、参照レーザ光と記す）はミラー２７で反射され、ダイクロイックミラー２４を透過して入射端面２６に入射する。第１励起レーザ光と参照レーザ光とは、その光軸Ｋが一致するように調整されており、標本１３に対して両方のレーザ光が同じ位置に照射されるように構成されている。
【００２２】
レーザ光源２２とダイクロイックミラー２４の間にはシャッタ２８が、レーザ光源２３とミラー２７の間にはシャッタ２９がそれぞれ配置され、不図示のシャッタ制御装置によりシャッタの開閉が制御され第１励起レーザ光と参照レーザ光の出射が選択される。なお、ダイクロイックミラー２４は、第１励起レーザ光は効率よく反射し、参照レーザ光は効率よく透過する特性を有している。
【００２３】
光ファイバ２５の入射端面２６に入射したレーザ光は、ファイバ２５を通じて照明光学系の光軸Ｉに沿って配置された出射端面３０に導かれる。射出端面３０から出射したレーザ光は、コレクタレンズ３１で集光され、照明光学系の光軸Ｉおよび対物光学系の光軸Ｊに沿って進行し対物レンズ１２を介して標本１３に照射される。なお、出射端面３０の位置を光軸Ｉに略垂直な平面内で移動させることによって、標本１３を移動させることなく標本１３に対するレーザ光の照射位置を変更することができる。このようにして、蛍光顕微鏡装置Ａが構成されている。
【００２４】
本第１実施の形態では、参照レーザ光を用いて標本１３上における第１励起レーザ光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００２５】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の参照光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００２６】
本第１実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ａ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００２７】
図２は、第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラー１１の分光特性をそれぞれ示す。
【００２８】
図２（ａ）において、曲線５ａは第１ダイクロイックミラー５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４５０ｎｍ未満の波長の光をほとんど透過し、これより長波長側の光をほとんど反射する特性を有している。曲線４ａはアーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を選択透過する励起フィルタ４の分光特性を示す。第１ダイクロイックミラー５は励起光を良好に反射する特性を有している。また、波長６３３ｎｍの参照レーザ光は、ほとんどが反射され数％以下が透過する分光特性を有している。
【００２９】
図２（ｂ）において、曲線１１ａは第２ダイクロイックミラー１１の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光および波長４８８ｎｍの励起光を含む波長５００ｎｍ未満の光をほとんど反射し、波長５０５ｎｍの蛍光を含む波長５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。曲線１４ａは、バリアフィルタ１４の分光特性を示す。
【００３０】
図１において、レーザユニット２１のシャッタ２９が開放され、参照レーザ光（２３）が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入された場合、第１ダイクロイックミラー５は、参照レーザ光の数％以下を透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１は、第１ダイクロイックミラー５で減光された参照レーザ光の数％以下を対物レンズ１２の方向に反射する。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の強度となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００３１】
この際、参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良いように構成することも可能である。
【００３２】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置を決定した後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光（２２）のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は、第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１でほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００３３】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００３４】
上述のように、本第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ａでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００３５】
（第２実施の形態）
次に、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００３６】
図３は、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００３７】
本第２実施の形態は、第１実施の形態の結像部にコンフォーカル装置を配置するため、第２ダイクロイックミラーの分光特性を変更している。その他、第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００３８】
図３において、標本１３からの参照レーザ光または蛍光は、第２ダイクロイックミラー１１１を通過し、結像レンズ１５によってコンフォーカル装置１０１に内蔵される高感度撮像装置１０１Ｅに全反射ミラー１０３を介して結像される。
【００３９】
コンフォーカル装置１０１は、励起光用レーザ光１０１Ｌと励起波長を選択する励起フィルタ１０１Ａ（例えば、波長４８８ｎｍ）と、ダイクロイックミラー１０１Ｂと、バリアフィルタ１０１Ｃと、励起用レーザ光を標本１３に照射、非照射を制御するシャッタ１０１Ｄと、標本１３からの参照レーザ光または標本１３からの蛍光を検出するための高感度撮像装置１０１Ｅが内蔵されている。このようにして、本第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｂが構成されている。
【００４０】
本第２実施の形態では、波長６３３ｎｍの参照レーザ光（２３）を用いて標本１３上における波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光（２２）の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００４１】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、コンフォーカル装置１０１の像面に載置されている高感度撮像装置１０１Ｅで検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１０１Ｅで検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１０１Ｅで検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００４２】
本第２実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｂ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性によって、コンフォーカル装置１０１に設けられた高感度撮像装置１０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００４３】
図４は、第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性をそれぞれ示す。
【００４４】
図４（ａ）の曲線５ａは、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を示し、その分光特性は第１実施の形態とほぼ同様である。
【００４５】
図４（ａ）において、曲線５ａは、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４５０ｎｍ未満の波長の光をほとんど透過し、これより長波長側の光をほとんど反射し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の数％以下を透過する分光特性を有している。
【００４６】
図４（ｂ）の曲線１１１ａは、第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性を示している。また、曲線１０１ａはコンフォーカル装置１０１内に配置されている励起フィルタ１０１Ａの特性を、曲線１０１ｂはコンフォーカル装置１０１内に配置されているダイクロイックミラー１０１Ｂの特性を、曲線１０１ｃはコンフォーカル装置１０１内に配置されているバリアフィルタ１０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００４７】
図４（ｂ）において、曲線１１１ａは、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４００ｎｍ未満の光をほとんど反射し、波長４８８ｎｍの励起用レーザ光および波長５０５ｎｍの蛍光を含む４００ｎｍ以上の波長の光をほとんど透過する特性を有している。曲線１０１ｂは、波長５０５ｎｍの蛍光を含む５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。
【００４８】
図３において、レーザユニット２１でシャッタ２９が開放され、参照レーザ光が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー５を数％以下が透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１１で数％以下が対物レンズ１２の方向に反射される。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の強度となりコンフォーカル装置１０１内に配置された高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。
【００４９】
この際、コンフォーカル装置１０１内に設けられているバリアフィルタ１０１Ｃを光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００以下に減衰した標本１３からの参照レーザ光を像面に配置した高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１１で減衰されているため、高感度撮像装置１０１Ｅの感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタの分光特性１０１Ｃを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１０１Ｃを光軸Ｊから外さなくても良いように構成することができる。
【００５０】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置を決定した後、バリアフィルタ１０１Ｃが光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光（２２）のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１ではほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはコンフォーカル装置１０１内においてバリアフィルタ１０１Ｃが挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光がコンフォーカル装置１０１内の高感度撮像装置１０１Ｅに入射することはない。
【００５１】
続いて、コンフォーカル装置１０１内に設けられている励起フィルタ１０１Ａによって選択された波長４８８ｎｍの励起用レーザ光を、シャッタ１０１Ｄを開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１０１Ｃを介して像面に配置された高感度撮像装置１０１Ｅで検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００５２】
上述のように、本第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｂでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置１０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、参照光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００５３】
（第３実施の形態）
次に、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００５４】
図５は、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図であり、図６は、第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。
【００５５】
本第３実施の形態は、第１実施の形態のアーク光源１系とレーザユニット２１から光ファイバ２５を介してレーザ光を導入するレーザ光系との配置を入れ替えた構成であり、第１実施の形態の一変形例である。光源の配置を入れ替えたため第１ダイクロイックミラー１０５の分光特性が変更されている。その他、第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００５６】
図５において、第１ダイクロイックミラー１０５は、アーク光源１からの励起光（例えば、波長４８８ｎｍ）を透過し、レーザユニット２１からの第１励起レーザ光（２２）（例えば、波長４０５ｎｍ）を反射し、参照レーザ光（２３）（例えば、波長６３３ｎｍ）を透過する構成としている。このようにして、本第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｃが構成されている。
【００５７】
本第３施の形態では、参照レーザ光を用いて標本１３上における第１励起レーザ光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００５８】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００５９】
本第３施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｃに配置されている第１ダイクロイックミラー１０５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００６０】
図６において、曲線１０５ａは、第１ダイクロイックミラー１０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４００ｎｍ未満の波長の光をほとんど反射し、これより長波長側の光をほとんど透過する特性を有している。曲線４ａは、波長４８８ｎｍの励起光を選択透過する励起フィルタ４の分光特性を示す。第１ダイクロイックミラー５は励起光を良好に透過する特性を有している。また、ダイクロイックミラー５は、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の数％以下を反射する特性を有している。また、曲線１１ａは、第２ダイクロイックミラー１１の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光および波長４８８ｎｍの励起光を含む略波長５００ｎｍ以下の光をほとんど反射し、波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。
【００６１】
図５において、レーザユニット２１でシャッタ２９が開放され、参照レーザ光が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー１０５で数％以下が反射され、更に第２ダイクロイックミラー１１で数％以下が対物レンズ１２の方向に反射される。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の光となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００６２】
参照レーザ光で標本１３上の第１励起レーザ光の照射位置を決める場合、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００程度まで減衰した標本１３からの参照レーザ光を像面に配置した高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。この際、参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー１０５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良い構成にすることができる。
【００６３】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置が決定された後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は第１ダイクロイックミラー１０５でほとんど反射され、第２ダイクロイックミラー１１でほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００６４】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００６５】
上述のように、本第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｃでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー１０５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー１０５、１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００６６】
（第４実施の形態）
次に、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図を参照しつつ説明する。図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００６７】
本第４実施の形態は、第１実施の形態におけるレーザユニット２１からなる光源を第２アーク光源５１（例えば、水銀ランプ等）に変更し、標本１３に照射する波長を選択するフィルタ交換装置５５を設けている。第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００６８】
図７において、第２アーク光源５１からの光は、コレクタレンズ５２で集光され光軸Ｉに略平行な光となり視野絞り５３に入射し、視野絞り５３で標本１３における光の照射範囲が制限される。視野絞り５３を出射した光は、リレーレンズ５４で光軸Ｉに沿った照明光として対物レンズ１２にリレーされる。なお、視野絞り５３は絞り羽根により開口径を可変とするものでも良いし、開口径の異なる視野絞りを交換可能に配置しても良い。また、視野絞り５３を光軸Ｉに略垂直な平面内で移動可能に配置することで、標本１３を移動することなく照射位置を変更することが可能となる。
【００６９】
リレーレンズ５４を出射した光は、標本１３に照射する波長を選択するフィルタ交換装置５５に入射し、第１励起光（例えば、波長４０５ｎｍ）を選択透過するフィルタ５６または参照光（例えば、波長６３３ｎｍ）を選択透過するフィルタ５７を通過して第１のダイクロイックミラー５に入射し、光軸Ｉに沿って進行し標本１３に照射される。なお、フィルタ交換装置５５は、上記フィルタのほかにも複数のフィルタが交換可能に配置され所望の波長を選択できるように構成されている。
【００７０】
また、コレクタレンズ５２と視野絞り５３の間には、第２アーク光源２からの光を標本１３へ照射、非照射を制御するシャッタ５８が配置され図示しないシャッタ制御装置でシャッタ５８の開閉が制御されている。このようにして、本第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｄが構成されている。
【００７１】
本第４実施の形態では、第２アーク光源５１からの光のうちフィルタ５７で選択された波長６３３ｎｍの参照光を用いて標本１３上における波長４０５ｎｍの第１励起光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００７２】
第１励起光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００７３】
本第４実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｄ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照光を検出可能にしている。
【００７４】
なお、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１のそれぞれの分光特性は第１実施の形態と同様であり説明を省略する。また、その作用も第１実施の形態と同様である。
【００７５】
図７において、シャッタ５２が開放され、フィルタ交換装置５５のフィルタ５７で参照光が透過されて光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー５は参照光を数％以下透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１は数％以下を対物レンズ１２の方向に反射する。この結果、標本１３を照射する参照光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の光となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００７６】
参照光で標本１３の照射位置を決める場合、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００以下にまで減衰した標本１３からの参照光を像面に配置した高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。この際、参照光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良い構成にすることができる。
【００７７】
参照光で標本１３に対する第１励起光の照射位置が決定された後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ５８が閉じられ、第１励起光を選択透過するフィルタ５６に交換される。そしてシャッタ５８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起光が標本１３の選択位置に照射される。第１励起光は第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１ではほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。この際、光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００７８】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００７９】
上述のように、本第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｄでは、参照光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１の分光特性を利用するだけで、参照光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００８０】
なお、第２アーク光源５２から標本１３への光の照射効率をより良くする為に、視野絞り５３とシャッタ５８との間に集光レンズを配置しても良い。
【００８１】
（第５実施の形態）
次に、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。本第５実施の形態の蛍光顕微鏡装置Ｅは、第３実施の形態の蛍光顕微鏡装置におけるアーク光源１の照明系をコンフォーカル装置に置き換えたため第１および第２ダイクロイックミラーの分光特性が異なっている。第３実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００８２】
図８は、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００８３】
図８において、コンフォーカル装置２０１は、励起光用レーザ光２０１Ｌと励起波長を選択する励起フィルタ２０１Ａと、ダイクロイックミラー２０１Ｂと、バリアフィルタ２０１Ｃと、励起用レーザ光を標本１３に照射、非照射を制御するシャッタ２０１Ｄと、標本１３からの参照レーザ光または標本１３からの蛍光を検出するための高感度撮像装置２０１Ｅが内蔵されている。
【００８４】
図９は、第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００８５】
図９（ａ）の曲線２０５ａは、第１ダイクロイックミラー２０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４５０ｎｍ未満の波長を反射し、波長４８８ｎｍの励起光用レーザ光と波長５０５ｎｍの蛍光を含む波長４５０ｎｍから波長６００ｎｍの間の光をほぼ透過し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の光を含む６００ｎｍを超える光を略５０％透過する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、コンフォーカル装置２０１内に配置されている励起フィルタ２０１Ａ、ダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００８６】
図９（ｂ）の曲線２１１ａは、第２ダイクロイックミラー２１１の分光特性を示し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む波長６００ｎｍを超える波長をほぼ透過し、これ以下の波長をほぼ反射する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、図９（ａ）と同様であり説明を省略する。
【００８７】
図８において、レーザユニット２１からの参照レーザ光（２３）は、シャッタ２９が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー２０５に入射し、第１ダイクロイックミラー２０５で略５０％が反射され、第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて標本１３に照射される。標本１３からの反射光は第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて第１ダイクロイックミラー２０５側に戻り、第１ダイクロイックミラー２０５で略５０％が透過されてコンフォーカル装置２０１に入射し、コンフォーカル装置２０１内に配置されているバリアフィルタ２０１Ｃが光軸Ｉから外され高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。
【００８８】
また、レーザユニット２１からの第１励起レーザ光（２２）は、シャッタ２８が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー２０５に入射し、第１ダイクロイックミラー２０５でほとんど反射され、第２ダイクロイックミラー２１１でほとんど反射されて標本１３に光量のロスが無く照射される。コンフォーカル装置２０１内に設けられたバリアフィルタが光軸にＩに挿入されているため、高感度撮像装置２０１Ｅで検出されることは無い。
【００８９】
コンフォーカル装置２０１内に設けられている励起用レーザ光２０１Ｌからの光が励起フィルタ２０１Ａで波長を選択されコンフォーカル装置２０１から出射し、第１ダイクロイックミラー２０５を透過し、第２ダイクロイックミラー２１１で反射されて対物レンズ１２を介して標本１３に照射される。
【００９０】
標本１３の第１励起レーザ光で照射された部分は、特性が変化しており励起用レーザ光で照射され波長５０５ｎｍの蛍光が発せられる。この蛍光は、対物レンズ１２で集光され第２ダイクロイックミラー２１１で反射されて第１ダイクロイックミラー２０５に至り、第１ダイクロイックミラー２０５を透過してコンフォーカル装置２０１に入射する。
【００９１】
蛍光は、コンフォーカル装置２０１内のダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃを透過して高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。励起用レーザ光はバリアフィルタ２０１Ｂでカットされるために高感度撮像装置２０１Ｅに入射することは無い。
【００９２】
本第５実施の形態では、参照レーザ光は、第１ダイクロイックミラー２０５において往復で略２５％まで減衰され、第２ダイクロイックミラー２１１で１／１０、０００以下まで減衰され、トータルで標本１３から発生する蛍光の強度に同等レベルまで減衰することができ、コンフォーカル装置２０１内に設けられた高感度撮像装置２０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出することが可能となる。
【００９３】
以上述べたように、本第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｅでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置２０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅで検出することが可能となる。このように、第１および第２ダイクロイックミラー２０５、２１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーを用いた光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００９４】
（第６実施の形態）
次に、本発明にかかる第６実施の形態に付いて図面を参照しつつ説明する。本第６実施の形態は第５実施の形態においてレーザユニット２１とコンフォーカル装置２０１の配置を入れ替えた構成であり、これに伴い第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性が第５実施の形態とは異なっている。その他の構成は第５実施の形態と同様であり同じ符号を付し説明を省略する。
【００９５】
なお、第６実施の形態の構成は第５実施の形態と同様であるため詳細な説明を省略し、第５実施の形態とは特性が異なる第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性と作用に付いて説明する。
【００９６】
図１０は、本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図１１は、第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００９７】
図１０において、蛍光顕微鏡装置Ｆは、参照レーザ光（例えば、波長６３３ｎｍ）のレーザ光源２３と第１励起レーザ光（例えば、波長４０５ｎｍ）のレーザ光源２２を有するレーザユニット２１と、励起光用レーザ光（例えば、波長４８８ｎｍ）のレーザ光源２０１Ｌと、ダイクロイックミラー２０１Ｂと励起フィルタ２０１Ａと、バリアフィルタ２０１Ｃと、標本１３からの参照レーザ光または蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅを内蔵するコンフォーカル装置２０１とから構成されている。
【００９８】
図１１（ａ）の曲線３０５ａは、第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４５０ｎｍ以下の波長をほとんど透過し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む波長６００ｎｍ以上の波長の光略５０％透過し、波長４５０ｎｍと波長６００ｎｍの範囲の波長をほとんど反射する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、第５実施の形態と同様のコンフォーカル装置２０１内に配置されている励起フィルタ２０１Ａ、ダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００９９】
図１１（ｂ）の曲線２１１ａは、第５実施の形態の第２ダイクロイックミラー２１１の分光特性と同等であり説明を省略する。
【０１００】
図１０において、レーザユニット２１からの波長６３３ｎｍの参照レーザ光は、シャッタ２９が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー３０５に入射し、第１ダイクロイックミラー３０５で略５０％が透過され、第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて標本１３に照射される。標本１３からの反射光は第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて第１ダイクロイックミラー３０５側に戻り、第１ダイクロイックミラー３０５で略５０％が反射されてコンフォーカル装置２０１に入射し、コンフォーカル装置２０１内に配置されているバリアフィルタ２０１Ｃが光軸Ｉから外され高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。
【０１０１】
本第６実施の形態では、参照レーザ光は、第１ダイクロイックミラー３０５において往復で略２５％程度まで減衰され、第２ダイクロイックミラー２１１で１／１０、０００以下まで減衰され、トータルで標本１３から発生する蛍光の強度に同等レベルまで減衰することができ、コンフォーカル装置２０１内に設けられた高感度撮像装置２０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出することが可能となる。
【０１０２】
上述のように、本第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｆでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置２０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅで検出することが可能となる。このように、第１および第２ダイクロイックミラー３０５、２１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーを用いた光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【０１０３】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図３】本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図４】第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図５】本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図６】第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。
【図７】図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図８】本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図９】第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図１０】本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図１１】第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【符号の説明】
【０１０５】
１ アーク光源
２ コレクタレンズ
３ リレーレンズ
４ 励起フィルタ
５ 第１ダイクロイックミラー
６ 開口絞り
７ シャッタ
８ リレーレンズ
９ 視野絞り
１０ フィールドレンズ
１１ 第２ダイクロイックミラー
１２ 対物レンズ
１３ 標本
１４ バリアフィルタ
１５ 結像レンズ
１６ 高感度撮像装置
２１ レーザユニット
２２ 励起レーザ光源
２３ 参照レーザ光源
２４ ダイクロイックミラー
２５ 光ファイバー
２６ 入射端面
２７ ミラー
２８、２９ シャッタ
３０ 出射端面
３１ コレクタレンズ
５１ 第２アーク光源
５２ コレクタレンズ
５３ 視野絞り
５４ リレーレンズ
５５ フィルタ交換装置
５６ 第１励起光選択フィルタ
５７ 参照光選択フィルタ
５８ シャッタ
１０１、２０１ コンフォーカル装置
１０３ 全反射ミラー
１０５、２０５、３０５ 第１ダイクロイックミラー
１１１、２１１ 第２ダイクロイックミラー
Ｉ 照明光学系の光軸
Ｊ 対物光学系の光軸
Ｋ レーザユニットの光軸
Ａ〜Ｆ 蛍光顕微鏡装置
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡装置に関し、特にフォトアクティベート付き蛍光顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光顕微鏡装置は、参照光で標本を目視で観察し励起光を照射する位置を決め、標本に励起光を照射し標本から発生する蛍光を高感度テレビカメラ等の撮像素子を用いて検出している。近年、蛍光の発する位置を標本上の位置関係から同定するために、標本と蛍光とを撮像装置を用いて検出し、両者を重ねて観察することが行われている。この際、標本からの参照光の光強度と蛍光の光強度とが極端に違っているために（約一万倍以上異なる）、同じ高感度テレビカメラを用いて両者を検出することが困難であった。このため、顕微鏡の光学系中に光量センサーを配置して、参照光の光量を調節することも提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平１１−２５８５１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１の開示例は、顕微鏡の光学系中に光量センサーを配置して光量を検出すると共に、参照光の光量を制御するための制御装置等が必要となり、蛍光顕微鏡装置の構成が複雑となると共に高価になると言う問題がある。
【０００４】
本発明は、上記問題にかんがみて行われたものであり、簡単な構成で蛍光と標本の両方の光を検出可能にする安価な蛍光顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は、標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、前記標本を励起する励起光を発生する光源と、前記標本を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源と、前記参照光を前記標本に導く照明光学系と、前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置を提供する。
【０００６】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記励起光は、前記標本を第１励起状態にする第１励起光と、前記第１励起状態から蛍光を発生させる第２励起光を有する構成が好ましい。
【０００７】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記参照光は、前記蛍光の波長より長い波長であることが好ましい。
【０００８】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記光学素子は、少なくとも２枚のダイクロイックミラーからなり、第１ダイクロイックミラーは前記照明光学系に配置され、第２ダイクロイックミラーは前記対物光学系に配置されている構成が好ましい。
【０００９】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を透過し、前記参照光を反射し、前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過する構成が好ましい。
【００１０】
また、本発明にかかる蛍光顕微鏡装置では、前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過し、前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過する構成が好ましい。
【００１１】
また、本発明は、標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、標本を第１の励起状態に励起する第１の励起光を発生する第１の励起光源と、前記第１の励起状態から前記蛍光を発生させる第２の励起光を発生する第２の励起光源と、前記標本に前記第１の励起光の照射位置を位置付けする為に用いる参照光を発生する参照光源と、前記第１の励起光と、前記第２の励起光と、前記参照光とを前記標本に導く照明光学系と、前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、前記照明光学系と前記対物光学系の少なくとも一方に、前記参照光の光強度を減衰させる光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、簡単な構成で蛍光と標本の両方の光を検出可能にする安価な蛍光顕微鏡装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態に関し図面を参照しつつ説明する。
【００１４】
図１は、本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図２は、第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図３は、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図４は、第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図５は、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図６は、第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図８は、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図９は、第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。図１０は、本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図１１は、第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００１５】
本発明の実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置は、光感受性蛍光タンパク（Ｐｈｏｔｏ Ａｃｔｉｖｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：略称ＰＡＧＦＰ）と呼ばれる物質の蛍光を観察するのに好適であるフォトアクティベート付き蛍光顕微鏡装置に相当する。このＰＡＧＦＰは、人工的に細胞内で生成されるタンパク質の一種で、生成された状態では光を当てても蛍光を発しないが、特定の波長のレーザ光（例えば、波長４０５ｎｍ）を照射するとレーザ光を照射された部分が変化し（以後、第１励起状態と記す）、別の波長の光を照射（例えば、波長４８８ｎｍ）すると、蛍光（例えば、波長５０５ｎｍ）を発する、所謂ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）としての特性を示すものである。これ以外にも別の特性を持つ光感受性蛍光タンパク質があり、異なる波長のレーザ照射によって特性を変化させることができる。なお、本発明の実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置はレーザ光の波長を変えることによって種々のＰＡＧＦＰの蛍光検出に用いることが可能である。
【００１６】
以下、それぞれの実施の形態に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００１７】
（第１実施の形態）
図１および図２を参照しつつ本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて説明する。
【００１８】
図１において、アーク光源１（例えば、水銀ランプ等）からの光は、コレクタレンズ２で集光され、リレーレンズ３を通過した後、励起フィルタ４で選択された波長の励起光（例えば、波長４８８ｎｍ）が第１ダイクロイックミラー５で反射されて、開口絞り６の位置に集光される。コレクタレンズ２とリレーレンズ３の間にはアーク光源１からの光を通過または遮断するシャッタ７が配置され、不図示のシャッタ制御装置でシャッタ７の開閉が制御される。
【００１９】
開口絞り６の位置に集光された励起光は、リレーレンズ８、視野絞り９、フィールドレンズ１０を介して第２ダイクロイックミラー１１に入射し、対物レンズ１２の方向に反射され、対物レンズ１２を介して図示しないステージに載置された標本１３に照射される。
【００２０】
照射された励起光によって標本１３から発生した蛍光は、対物レンズ１２で集光され、第２ダイクロイックミラー１１を通過してバリアフィルタ１４で検出する波長が選択透過され結像レンズ１５を介して、像面に載置された高感度撮像装置１６（例えば、高感度テレビカメラ等）で撮像され図示しない画像処理装置を介して不図示のモニタ等で観察される。なお、符号Ｉは、照明光学系の光軸を、符号Ｊは、対物光学系の光軸をそれぞれ示している。
【００２１】
また、アーク光源１とは別の場所に設けられたレーザユニット２１には、レーザ光源２２（例えば、波長４０５ｎｍ）とレーザ光源２３（例えば、波長６３３ｎｍ）が配置されている。レーザ光源２２からのレーザ光（以後、第１励起レーザ光と記す）はダイクロイックミラー２４でレーザユニット２１に接続された光ファイバ２５の入射端面２６方向に反射され、入射端面２６に入射する。レーザ光源２３からのレーザ光（以後、参照レーザ光と記す）はミラー２７で反射され、ダイクロイックミラー２４を透過して入射端面２６に入射する。第１励起レーザ光と参照レーザ光とは、その光軸Ｋが一致するように調整されており、標本１３に対して両方のレーザ光が同じ位置に照射されるように構成されている。
【００２２】
レーザ光源２２とダイクロイックミラー２４の間にはシャッタ２８が、レーザ光源２３とミラー２７の間にはシャッタ２９がそれぞれ配置され、不図示のシャッタ制御装置によりシャッタの開閉が制御され第１励起レーザ光と参照レーザ光の出射が選択される。なお、ダイクロイックミラー２４は、第１励起レーザ光は効率よく反射し、参照レーザ光は効率よく透過する特性を有している。
【００２３】
光ファイバ２５の入射端面２６に入射したレーザ光は、ファイバ２５を通じて照明光学系の光軸Ｉに沿って配置された出射端面３０に導かれる。射出端面３０から出射したレーザ光は、コレクタレンズ３１で集光され、照明光学系の光軸Ｉおよび対物光学系の光軸Ｊに沿って進行し対物レンズ１２を介して標本１３に照射される。なお、出射端面３０の位置を光軸Ｉに略垂直な平面内で移動させることによって、標本１３を移動させることなく標本１３に対するレーザ光の照射位置を変更することができる。このようにして、蛍光顕微鏡装置Ａが構成されている。
【００２４】
本第１実施の形態では、参照レーザ光を用いて標本１３上における第１励起レーザ光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００２５】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の参照光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００２６】
本第１実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ａ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００２７】
図２は、第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラー１１の分光特性をそれぞれ示す。
【００２８】
図２（ａ）において、曲線５ａは第１ダイクロイックミラー５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４５０ｎｍ未満の波長の光をほとんど透過し、これより長波長側の光をほとんど反射する特性を有している。曲線４ａはアーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を選択透過する励起フィルタ４の分光特性を示す。第１ダイクロイックミラー５は励起光を良好に反射する特性を有している。また、波長６３３ｎｍの参照レーザ光は、ほとんどが反射され数％以下が透過する分光特性を有している。
【００２９】
図２（ｂ）において、曲線１１ａは第２ダイクロイックミラー１１の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光および波長４８８ｎｍの励起光を含む波長５００ｎｍ未満の光をほとんど反射し、波長５０５ｎｍの蛍光を含む波長５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。曲線１４ａは、バリアフィルタ１４の分光特性を示す。
【００３０】
図１において、レーザユニット２１のシャッタ２９が開放され、参照レーザ光（２３）が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入された場合、第１ダイクロイックミラー５は、参照レーザ光の数％以下を透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１は、第１ダイクロイックミラー５で減光された参照レーザ光の数％以下を対物レンズ１２の方向に反射する。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の強度となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００３１】
この際、参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良いように構成することも可能である。
【００３２】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置を決定した後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光（２２）のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は、第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１でほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００３３】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００３４】
上述のように、本第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ａでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００３５】
（第２実施の形態）
次に、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００３６】
図３は、本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００３７】
本第２実施の形態は、第１実施の形態の結像部にコンフォーカル装置を配置するため、第２ダイクロイックミラーの分光特性を変更している。その他、第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００３８】
図３において、標本１３からの参照レーザ光または蛍光は、第２ダイクロイックミラー１１１を通過し、結像レンズ１５によってコンフォーカル装置１０１に内蔵される高感度撮像装置１０１Ｅに全反射ミラー１０３を介して結像される。
【００３９】
コンフォーカル装置１０１は、励起光用レーザ光１０１Ｌと励起波長を選択する励起フィルタ１０１Ａ（例えば、波長４８８ｎｍ）と、ダイクロイックミラー１０１Ｂと、バリアフィルタ１０１Ｃと、励起用レーザ光を標本１３に照射、非照射を制御するシャッタ１０１Ｄと、標本１３からの参照レーザ光または標本１３からの蛍光を検出するための高感度撮像装置１０１Ｅが内蔵されている。このようにして、本第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｂが構成されている。
【００４０】
本第２実施の形態では、波長６３３ｎｍの参照レーザ光（２３）を用いて標本１３上における波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光（２２）の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００４１】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、コンフォーカル装置１０１の像面に載置されている高感度撮像装置１０１Ｅで検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１０１Ｅで検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１０１Ｅで検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００４２】
本第２実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｂ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性によって、コンフォーカル装置１０１に設けられた高感度撮像装置１０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００４３】
図４は、第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性をそれぞれ示す。
【００４４】
図４（ａ）の曲線５ａは、第１ダイクロイックミラー５の分光特性を示し、その分光特性は第１実施の形態とほぼ同様である。
【００４５】
図４（ａ）において、曲線５ａは、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４５０ｎｍ未満の波長の光をほとんど透過し、これより長波長側の光をほとんど反射し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の数％以下を透過する分光特性を有している。
【００４６】
図４（ｂ）の曲線１１１ａは、第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性を示している。また、曲線１０１ａはコンフォーカル装置１０１内に配置されている励起フィルタ１０１Ａの特性を、曲線１０１ｂはコンフォーカル装置１０１内に配置されているダイクロイックミラー１０１Ｂの特性を、曲線１０１ｃはコンフォーカル装置１０１内に配置されているバリアフィルタ１０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００４７】
図４（ｂ）において、曲線１１１ａは、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４００ｎｍ未満の光をほとんど反射し、波長４８８ｎｍの励起用レーザ光および波長５０５ｎｍの蛍光を含む４００ｎｍ以上の波長の光をほとんど透過する特性を有している。曲線１０１ｂは、波長５０５ｎｍの蛍光を含む５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。
【００４８】
図３において、レーザユニット２１でシャッタ２９が開放され、参照レーザ光が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー５を数％以下が透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１１で数％以下が対物レンズ１２の方向に反射される。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の強度となりコンフォーカル装置１０１内に配置された高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。
【００４９】
この際、コンフォーカル装置１０１内に設けられているバリアフィルタ１０１Ｃを光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００以下に減衰した標本１３からの参照レーザ光を像面に配置した高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１１で減衰されているため、高感度撮像装置１０１Ｅの感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタの分光特性１０１Ｃを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１０１Ｃを光軸Ｊから外さなくても良いように構成することができる。
【００５０】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置を決定した後、バリアフィルタ１０１Ｃが光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光（２２）のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１ではほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはコンフォーカル装置１０１内においてバリアフィルタ１０１Ｃが挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光がコンフォーカル装置１０１内の高感度撮像装置１０１Ｅに入射することはない。
【００５１】
続いて、コンフォーカル装置１０１内に設けられている励起フィルタ１０１Ａによって選択された波長４８８ｎｍの励起用レーザ光を、シャッタ１０１Ｄを開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１０１Ｃを介して像面に配置された高感度撮像装置１０１Ｅで検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００５２】
上述のように、本第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｂでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置１０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置１０１Ｅで検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、参照光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００５３】
（第３実施の形態）
次に、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。
【００５４】
図５は、本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図であり、図６は、第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。
【００５５】
本第３実施の形態は、第１実施の形態のアーク光源１系とレーザユニット２１から光ファイバ２５を介してレーザ光を導入するレーザ光系との配置を入れ替えた構成であり、第１実施の形態の一変形例である。光源の配置を入れ替えたため第１ダイクロイックミラー１０５の分光特性が変更されている。その他、第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００５６】
図５において、第１ダイクロイックミラー１０５は、アーク光源１からの励起光（例えば、波長４８８ｎｍ）を透過し、レーザユニット２１からの第１励起レーザ光（２２）（例えば、波長４０５ｎｍ）を反射し、参照レーザ光（２３）（例えば、波長６３３ｎｍ）を透過する構成としている。このようにして、本第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｃが構成されている。
【００５７】
本第３施の形態では、参照レーザ光を用いて標本１３上における第１励起レーザ光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照レーザ光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００５８】
第１励起レーザ光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照レーザ光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照レーザ光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００５９】
本第３施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｃに配置されている第１ダイクロイックミラー１０５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照レーザ光を検出可能にしている。
【００６０】
図６において、曲線１０５ａは、第１ダイクロイックミラー１０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む約４００ｎｍ未満の波長の光をほとんど反射し、これより長波長側の光をほとんど透過する特性を有している。曲線４ａは、波長４８８ｎｍの励起光を選択透過する励起フィルタ４の分光特性を示す。第１ダイクロイックミラー５は励起光を良好に透過する特性を有している。また、ダイクロイックミラー５は、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の数％以下を反射する特性を有している。また、曲線１１ａは、第２ダイクロイックミラー１１の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光および波長４８８ｎｍの励起光を含む略波長５００ｎｍ以下の光をほとんど反射し、波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む５００ｎｍを超える波長の光をほとんど透過する特性を有している。
【００６１】
図５において、レーザユニット２１でシャッタ２９が開放され、参照レーザ光が光ファイバ２５を介して光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー１０５で数％以下が反射され、更に第２ダイクロイックミラー１１で数％以下が対物レンズ１２の方向に反射される。この結果、標本１３を照射する参照レーザ光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の光となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００６２】
参照レーザ光で標本１３上の第１励起レーザ光の照射位置を決める場合、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００程度まで減衰した標本１３からの参照レーザ光を像面に配置した高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。この際、参照レーザ光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー１０５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照レーザ光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良い構成にすることができる。
【００６３】
参照レーザ光で標本１３に対する第１励起レーザ光の照射位置が決定された後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ２９が閉じられ、第１励起レーザ光のシャッタ２８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光が標本１３の所定位置に照射される。第１励起レーザ光は第１ダイクロイックミラー１０５でほとんど反射され、第２ダイクロイックミラー１１でほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起レーザ光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００６４】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起レーザ光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００６５】
上述のように、本第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｃでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー１０５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー１０５、１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００６６】
（第４実施の形態）
次に、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図を参照しつつ説明する。図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００６７】
本第４実施の形態は、第１実施の形態におけるレーザユニット２１からなる光源を第２アーク光源５１（例えば、水銀ランプ等）に変更し、標本１３に照射する波長を選択するフィルタ交換装置５５を設けている。第１実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００６８】
図７において、第２アーク光源５１からの光は、コレクタレンズ５２で集光され光軸Ｉに略平行な光となり視野絞り５３に入射し、視野絞り５３で標本１３における光の照射範囲が制限される。視野絞り５３を出射した光は、リレーレンズ５４で光軸Ｉに沿った照明光として対物レンズ１２にリレーされる。なお、視野絞り５３は絞り羽根により開口径を可変とするものでも良いし、開口径の異なる視野絞りを交換可能に配置しても良い。また、視野絞り５３を光軸Ｉに略垂直な平面内で移動可能に配置することで、標本１３を移動することなく照射位置を変更することが可能となる。
【００６９】
リレーレンズ５４を出射した光は、標本１３に照射する波長を選択するフィルタ交換装置５５に入射し、第１励起光（例えば、波長４０５ｎｍ）を選択透過するフィルタ５６または参照光（例えば、波長６３３ｎｍ）を選択透過するフィルタ５７を通過して第１のダイクロイックミラー５に入射し、光軸Ｉに沿って進行し標本１３に照射される。なお、フィルタ交換装置５５は、上記フィルタのほかにも複数のフィルタが交換可能に配置され所望の波長を選択できるように構成されている。
【００７０】
また、コレクタレンズ５２と視野絞り５３の間には、第２アーク光源２からの光を標本１３へ照射、非照射を制御するシャッタ５８が配置され図示しないシャッタ制御装置でシャッタ５８の開閉が制御されている。このようにして、本第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｄが構成されている。
【００７１】
本第４実施の形態では、第２アーク光源５１からの光のうちフィルタ５７で選択された波長６３３ｎｍの参照光を用いて標本１３上における波長４０５ｎｍの第１励起光の照射位置が決められる。ＰＡＧＦＰに対して参照光は何ら変化を及ぼすことがない波長が用いられる。
【００７２】
第１励起光が照射される位置を不図示のモニタ上で確認するために、像面に載置されている高感度撮像装置１６で検出する必要がある。しかし、高感度撮像装置１６で検出する蛍光の強度は通常の光に対して１／１０，０００以下であり、標本１３からの参照光を高感度撮像装置１６で検出する場合、参照光の光量の調整や高感度撮像装置１６の検出感度の切り替えが必要となる。このような光量調整や感度切り替えは煩雑であると共に蛍光顕微鏡装置の構成を複雑にし、結果として蛍光顕微鏡装置が高価になる。
【００７３】
本第４実施の形態では、蛍光顕微鏡装置Ｄ内に配置されている第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって、高感度撮像装置１６で標本１３からの参照光を検出可能にしている。
【００７４】
なお、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１のそれぞれの分光特性は第１実施の形態と同様であり説明を省略する。また、その作用も第１実施の形態と同様である。
【００７５】
図７において、シャッタ５２が開放され、フィルタ交換装置５５のフィルタ５７で参照光が透過されて光軸Ｉに沿って導入され、第１ダイクロイックミラー５は参照光を数％以下透過し、更に第２ダイクロイックミラー１１は数％以下を対物レンズ１２の方向に反射する。この結果、標本１３を照射する参照光の強度は、蛍光と同等の１／１０，０００以下の光となり高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。
【００７６】
参照光で標本１３の照射位置を決める場合、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外すことによって、１／１０，０００以下にまで減衰した標本１３からの参照光を像面に配置した高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。この際、参照光の強度が蛍光の強度と同等程度まで第１および第２ダイクロイックミラー５、１１で減衰されているため、高感度撮像装置１６の感度の切り替え等は不要である。なお、バリアフィルタ１４の分光特性１４ａを波長５０５ｎｍの蛍光と波長６３３ｎｍの参照光の両方の波長を透過するように設定することによって、バリアフィルタ１４を光軸Ｊから外さなくても良い構成にすることができる。
【００７７】
参照光で標本１３に対する第１励起光の照射位置が決定された後、バリアフィルタ１４が光軸Ｊに挿入され、シャッタ５８が閉じられ、第１励起光を選択透過するフィルタ５６に交換される。そしてシャッタ５８が所定時間開放されて、波長４０５ｎｍの第１励起光が標本１３の選択位置に照射される。第１励起光は第１ダイクロイックミラー５をほとんど透過し、第２ダイクロイックミラー１１ではほとんど反射されて対物レンズ１２の方向に進行し、対物レンズ１２を介して標本１３に光量のロスなく照射される。この際、光軸Ｊにはバリアフィルタ１４が挿入されているため、第１励起光の反射光が高感度撮像装置１６に入射することはない。
【００７８】
続いて、アーク光源１からの波長４８８ｎｍの励起光を、シャッタ７を開放することによって標本１３に照射し、第１励起光で第１励起状態にされた場所で発生する波長５０５ｎｍの蛍光を、バリアフィルタ１４を介して像面に配置された高感度撮像装置１６で検出し、不図示の画像処理装置を介してモニタで観察する。
【００７９】
上述のように、本第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｄでは、参照光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、蛍光を検出する高感度撮像装置１６で検出することが可能となる。また、第１および第２ダイクロイックミラー５、１１の分光特性を利用するだけで、参照光の光量センサーによる光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００８０】
なお、第２アーク光源５２から標本１３への光の照射効率をより良くする為に、視野絞り５３とシャッタ５８との間に集光レンズを配置しても良い。
【００８１】
（第５実施の形態）
次に、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置に付いて図面を参照しつつ説明する。本第５実施の形態の蛍光顕微鏡装置Ｅは、第３実施の形態の蛍光顕微鏡装置におけるアーク光源１の照明系をコンフォーカル装置に置き換えたため第１および第２ダイクロイックミラーの分光特性が異なっている。第３実施の形態と同様の構成には同じ符号を付し説明を省略する。
【００８２】
図８は、本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【００８３】
図８において、コンフォーカル装置２０１は、励起光用レーザ光２０１Ｌと励起波長を選択する励起フィルタ２０１Ａと、ダイクロイックミラー２０１Ｂと、バリアフィルタ２０１Ｃと、励起用レーザ光を標本１３に照射、非照射を制御するシャッタ２０１Ｄと、標本１３からの参照レーザ光または標本１３からの蛍光を検出するための高感度撮像装置２０１Ｅが内蔵されている。
【００８４】
図９は、第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００８５】
図９（ａ）の曲線２０５ａは、第１ダイクロイックミラー２０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４５０ｎｍ未満の波長を反射し、波長４８８ｎｍの励起光用レーザ光と波長５０５ｎｍの蛍光を含む波長４５０ｎｍから波長６００ｎｍの間の光をほぼ透過し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光の光を含む６００ｎｍを超える光を略５０％透過する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、コンフォーカル装置２０１内に配置されている励起フィルタ２０１Ａ、ダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００８６】
図９（ｂ）の曲線２１１ａは、第２ダイクロイックミラー２１１の分光特性を示し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む波長６００ｎｍを超える波長をほぼ透過し、これ以下の波長をほぼ反射する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、図９（ａ）と同様であり説明を省略する。
【００８７】
図８において、レーザユニット２１からの参照レーザ光（２３）は、シャッタ２９が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー２０５に入射し、第１ダイクロイックミラー２０５で略５０％が反射され、第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて標本１３に照射される。標本１３からの反射光は第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて第１ダイクロイックミラー２０５側に戻り、第１ダイクロイックミラー２０５で略５０％が透過されてコンフォーカル装置２０１に入射し、コンフォーカル装置２０１内に配置されているバリアフィルタ２０１Ｃが光軸Ｉから外され高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。
【００８８】
また、レーザユニット２１からの第１励起レーザ光（２２）は、シャッタ２８が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー２０５に入射し、第１ダイクロイックミラー２０５でほとんど反射され、第２ダイクロイックミラー２１１でほとんど反射されて標本１３に光量のロスが無く照射される。コンフォーカル装置２０１内に設けられたバリアフィルタが光軸にＩに挿入されているため、高感度撮像装置２０１Ｅで検出されることは無い。
【００８９】
コンフォーカル装置２０１内に設けられている励起用レーザ光２０１Ｌからの光が励起フィルタ２０１Ａで波長を選択されコンフォーカル装置２０１から出射し、第１ダイクロイックミラー２０５を透過し、第２ダイクロイックミラー２１１で反射されて対物レンズ１２を介して標本１３に照射される。
【００９０】
標本１３の第１励起レーザ光で照射された部分は、特性が変化しており励起用レーザ光で照射され波長５０５ｎｍの蛍光が発せられる。この蛍光は、対物レンズ１２で集光され第２ダイクロイックミラー２１１で反射されて第１ダイクロイックミラー２０５に至り、第１ダイクロイックミラー２０５を透過してコンフォーカル装置２０１に入射する。
【００９１】
蛍光は、コンフォーカル装置２０１内のダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃを透過して高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。励起用レーザ光はバリアフィルタ２０１Ｂでカットされるために高感度撮像装置２０１Ｅに入射することは無い。
【００９２】
本第５実施の形態では、参照レーザ光は、第１ダイクロイックミラー２０５において往復で略２５％まで減衰され、第２ダイクロイックミラー２１１で１／１０、０００以下まで減衰され、トータルで標本１３から発生する蛍光の強度に同等レベルまで減衰することができ、コンフォーカル装置２０１内に設けられた高感度撮像装置２０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出することが可能となる。
【００９３】
以上述べたように、本第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｅでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置２０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅで検出することが可能となる。このように、第１および第２ダイクロイックミラー２０５、２１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーを用いた光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【００９４】
（第６実施の形態）
次に、本発明にかかる第６実施の形態に付いて図面を参照しつつ説明する。本第６実施の形態は第５実施の形態においてレーザユニット２１とコンフォーカル装置２０１の配置を入れ替えた構成であり、これに伴い第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性が第５実施の形態とは異なっている。その他の構成は第５実施の形態と同様であり同じ符号を付し説明を省略する。
【００９５】
なお、第６実施の形態の構成は第５実施の形態と同様であるため詳細な説明を省略し、第５実施の形態とは特性が異なる第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性と作用に付いて説明する。
【００９６】
図１０は、本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。図１１は、第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【００９７】
図１０において、蛍光顕微鏡装置Ｆは、参照レーザ光（例えば、波長６３３ｎｍ）のレーザ光源２３と第１励起レーザ光（例えば、波長４０５ｎｍ）のレーザ光源２２を有するレーザユニット２１と、励起光用レーザ光（例えば、波長４８８ｎｍ）のレーザ光源２０１Ｌと、ダイクロイックミラー２０１Ｂと励起フィルタ２０１Ａと、バリアフィルタ２０１Ｃと、標本１３からの参照レーザ光または蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅを内蔵するコンフォーカル装置２０１とから構成されている。
【００９８】
図１１（ａ）の曲線３０５ａは、第１ダイクロイックミラー３０５の分光特性を示し、波長４０５ｎｍの第１励起レーザ光を含む波長４５０ｎｍ以下の波長をほとんど透過し、波長６３３ｎｍの参照レーザ光を含む波長６００ｎｍ以上の波長の光略５０％透過し、波長４５０ｎｍと波長６００ｎｍの範囲の波長をほとんど反射する特性を有している。図中曲線２０１ａ、２０１ｂ、２０１ｃは、第５実施の形態と同様のコンフォーカル装置２０１内に配置されている励起フィルタ２０１Ａ、ダイクロイックミラー２０１Ｂ、バリアフィルタ２０１Ｃの特性をそれぞれ示している。
【００９９】
図１１（ｂ）の曲線２１１ａは、第５実施の形態の第２ダイクロイックミラー２１１の分光特性と同等であり説明を省略する。
【０１００】
図１０において、レーザユニット２１からの波長６３３ｎｍの参照レーザ光は、シャッタ２９が開放されている間、光ファイバ２５で入射端面３０に導かれ集光レンズ３１を介して第１ダイクロイックミラー３０５に入射し、第１ダイクロイックミラー３０５で略５０％が透過され、第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて標本１３に照射される。標本１３からの反射光は第２ダイクロイックミラー２１１で数％以下が反射されて第１ダイクロイックミラー３０５側に戻り、第１ダイクロイックミラー３０５で略５０％が反射されてコンフォーカル装置２０１に入射し、コンフォーカル装置２０１内に配置されているバリアフィルタ２０１Ｃが光軸Ｉから外され高感度撮像装置２０１Ｅで検出される。
【０１０１】
本第６実施の形態では、参照レーザ光は、第１ダイクロイックミラー３０５において往復で略２５％程度まで減衰され、第２ダイクロイックミラー２１１で１／１０、０００以下まで減衰され、トータルで標本１３から発生する蛍光の強度に同等レベルまで減衰することができ、コンフォーカル装置２０１内に設けられた高感度撮像装置２０１Ｅで標本１３からの参照レーザ光を検出することが可能となる。
【０１０２】
上述のように、本第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置Ｆでは、参照レーザ光による標本からの光を、第１ダイクロイックミラー５と第２ダイクロイックミラー１１の分光特性によって減衰するため、コンフォーカル装置２０１内に設けられた蛍光を検出する高感度撮像装置２０１Ｅで検出することが可能となる。このように、第１および第２ダイクロイックミラー３０５、２１１の分光特性を利用するだけで、レーザ光の光量センサーを用いた光量調整や、照明光による標本像を撮像する撮像装置が不要となり、簡単で低価格の蛍光顕微鏡装置を提供することが可能となる。
【０１０３】
なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の第１実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図２】第１実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図３】本発明の第２実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図４】第２実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図５】本発明の第３実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図６】第３実施の形態に用いられる第１、および第２ダイクロイックミラーの分光特性を示す。
【図７】図７は、本発明の第４実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図８】本発明の第５実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図９】第５実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【図１０】本発明の第６実施の形態にかかる蛍光顕微鏡装置の概略構成図である。
【図１１】第６実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの分光特性を示し、（ａ）は、第１ダイクロイックミラーの分光特性を、（ｂ）は、第２ダイクロイックミラーの分光特性をそれぞれ示す。
【符号の説明】
【０１０５】
１ アーク光源
２ コレクタレンズ
３ リレーレンズ
４ 励起フィルタ
５ 第１ダイクロイックミラー
６ 開口絞り
７ シャッタ
８ リレーレンズ
９ 視野絞り
１０ フィールドレンズ
１１ 第２ダイクロイックミラー
１２ 対物レンズ
１３ 標本
１４ バリアフィルタ
１５ 結像レンズ
１６ 高感度撮像装置
２１ レーザユニット
２２ 励起レーザ光源
２３ 参照レーザ光源
２４ ダイクロイックミラー
２５ 光ファイバー
２６ 入射端面
２７ ミラー
２８、２９ シャッタ
３０ 出射端面
３１ コレクタレンズ
５１ 第２アーク光源
５２ コレクタレンズ
５３ 視野絞り
５４ リレーレンズ
５５ フィルタ交換装置
５６ 第１励起光選択フィルタ
５７ 参照光選択フィルタ
５８ シャッタ
１０１、２０１ コンフォーカル装置
１０３ 全反射ミラー
１０５、２０５、３０５ 第１ダイクロイックミラー
１１１、２１１ 第２ダイクロイックミラー
Ｉ 照明光学系の光軸
Ｊ 対物光学系の光軸
Ｋ レーザユニットの光軸
Ａ〜Ｆ 蛍光顕微鏡装置
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、
前記標本を励起する励起光を発生する光源と、
前記標本を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源と、
前記参照光を前記標本に導く照明光学系と、
前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、
前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記励起光は、前記標本を第１励起状態にする第１励起光と、
前記第１励起状態から蛍光を発生させる第２励起光を有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記参照光は、前記蛍光の波長より長い波長であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記光学素子は、少なくとも２枚のダイクロイックミラーからなり、第１ダイクロイックミラーは前記照明光学系に配置され、第２ダイクロイックミラーは前記対物光学系に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を透過し、前記参照光を反射し、
前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過し、
前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】
標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、
標本を第１の励起状態に励起する第１の励起光を発生する第１の励起光源と、
前記第１の励起状態から前記蛍光を発生させる第２の励起光を発生する第２の励起光源と、
前記標本に前記第１の励起光の照射位置を位置付けする為に用いる参照光を発生する参照光源と、
前記第１の励起光と、前記第２の励起光と、前記参照光とを前記標本に導く照明光学系と、
前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、
前記照明光学系と前記対物光学系の少なくとも一方に、前記参照光の光強度を減衰させる光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項１】
標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、
前記標本を励起する励起光を発生する光源と、
前記標本を観察するための前記励起光とは異なる波長の参照光を発生する光源と、
前記参照光を前記標本に導く照明光学系と、
前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、
前記対物光学系と前記照明光学系の少なくとも一方に、前記標本からの前記参照光の光強度を減衰する波長分離型の光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【請求項２】
前記励起光は、前記標本を第１励起状態にする第１励起光と、
前記第１励起状態から蛍光を発生させる第２励起光を有することを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項３】
前記参照光は、前記蛍光の波長より長い波長であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項４】
前記光学素子は、少なくとも２枚のダイクロイックミラーからなり、第１ダイクロイックミラーは前記照明光学系に配置され、第２ダイクロイックミラーは前記対物光学系に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項５】
前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を透過し、前記参照光を反射し、
前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項６】
前記第１ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過し、
前記第２ダイクロイックミラーは、前記第１励起光を反射し、前記参照光を透過することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡装置。
【請求項７】
標本からの蛍光を検出する蛍光顕微鏡装置において、
標本を第１の励起状態に励起する第１の励起光を発生する第１の励起光源と、
前記第１の励起状態から前記蛍光を発生させる第２の励起光を発生する第２の励起光源と、
前記標本に前記第１の励起光の照射位置を位置付けする為に用いる参照光を発生する参照光源と、
前記第１の励起光と、前記第２の励起光と、前記参照光とを前記標本に導く照明光学系と、
前記標本からの光束を撮像装置に導く対物光学系と、
前記照明光学系と前記対物光学系の少なくとも一方に、前記参照光の光強度を減衰させる光学素子を具備してなることを特徴とする蛍光顕微鏡装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−３６６２（Ｐ２００６−３６６２Ａ）
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１８０２０９（Ｐ２００４−１８０２０９）
【出願日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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