血圧降下タンパク質加水分解物
本発明は、トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰならびに／またはその塩を説明する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、新規ペプチドの生成に関する。
【０００２】
［背景技術］
高血圧症は、ヒトにおける比較的一般的な病状であり、心臓血管疾患、腎不全および脳卒中の、流行性の危険因子を引き起こす。カルシウム遮断薬、β遮断薬、利尿薬、α遮断薬、中心的なαアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩアンタゴニストおよびＡＣＥ阻害薬等の多くの医薬品の利用可能性は、高血圧症の基礎にある生理学的機序が多面的であることを示す。
【０００３】
高血圧症の生理学的機序のうち、特にレニン−アンジオテンシン機序は、多くの科学的注目を受けている。この機序において、アンジオテンシンは肝臓によって分泌され、ペプチダーゼであるレニンによって切断されて、生物学的に不活性なデカペプチドであるアンジオテンシンＩを生じる。アンジオテンシンＩが肺毛細血管を通過すると、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと呼ぶ）と呼ばれる別のペプチダーゼが、アンジオテンシンＩの最後の２つの残基（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を除去することによって、アンジオテンシンＩに作用して、オクタペプチドであるアンジオテンシンＩＩを形成する。アンジオテンシンＩＩオクタペプチドは、強力な血管収縮活性を示し、したがって、血圧を上昇させる。より低いレベルのアンジオテンシンＩＩにつながるＡＣＥ阻害は、血管収縮を防ぎ、そのため高血圧を防ぐ。
【０００４】
アンジオテンシンＩを切断する他に、ＡＣＥはまた、同様に血圧調節に関与するノナペプチドであるブラジキニンを加水分解することもできる。後者の機序において、ＡＣＥ阻害は、血管拡張を促進し、同様に血圧を降下させる、ブラジキニンレベルの増大につながる。ＡＣＥを阻害することは、このようにして、少なくとも２つの別々の機序によって、血圧降下効果につながる。
【０００５】
オクタペプチドであるアンジオテンシンＩＩが副腎皮質によるアルドステロンの放出を刺激することもまた、公知である。アルドステロンの標的器官は腎臓であり、ここでアルドステロンは、腎細尿管からのナトリウムの再吸収の増大を促進する。この第三の機序によっても、ＡＣＥ阻害は血圧を減少させるが、この場合はナトリウム再吸収を減少させることによって減少させる。
【０００６】
その多重的な生理学的効果のために、ＡＣＥのタンパク質分解活性を阻害することは、血圧を抑制する有効な方法である。この観察から、カプトプリルおよびエナラプリル等のいくつかの有効な血圧降下医薬品が生じた（オンデッティ（Ｏｎｄｅｔｔｉ），Ｍ．Ａ．ら、１９７７年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）、１９６、４４１〜４４４頁）。
【０００７】
高血圧症は比較的一般的な病状なので、現代の生活様式の、この望ましくない結果を、穏やかに活性のある天然成分で相殺することは、有利である。特に、穏やかに活性のある天然成分は、かかる製品は定期的に消費されるので、食品または飲料に組み込むことができる。あるいは、かかる穏やかに活性のある天然成分は、栄養補助食品に組み込むことができるであろう。過去数十年の間に、発酵乳中に存在する特異的ペプチドがＡＣＥ阻害能力を有し、高血圧症被験者において血圧低下を引き起こすことができることが発見されている。最近では、多くのインビトロおよび少数の動物試験から、種々のタンパク質源から得られた種々のペプチドのＡＣＥ阻害効果が示されている。インビトロＡＣＥ阻害アッセイからは多くの種々のペプチド配列が明らかになっているが、ＡＣＥ阻害ペプチドは、血液中を循環させてインビボ効果を発揮させる必要があることを、強調しなければならない。効果的なＡＣＥ阻害ペプチドは、胃腸内タンパク質分解性消化系による分解に抵抗するべきであり、それに続く腸壁を越える輸送の間にインタクトなままであるべきであるようである。
【０００８】
種々のＡＣＥ阻害ペプチドの構造機能研究から、それらがしばしばそれらのＣ末端配列にＰｒｏ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｌａ−Ｈｙｐを有することが示唆されている（マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ），Ｓ．およびスズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｈ．、１９８２年、Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、４６（５）：１３９３〜１３９４頁）。この発見は、ＡＣＥが、プロリンを伴うペプチド結合を切断することができないペプチジルジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）であることによって、部分的に説明される。したがって、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合は切断することができないので、構造Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するトリペプチドから、ジペプチドＰｒｏ−Ｐｒｏを除去することはできない。したがって、比較的高濃度で存在する場合、Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ構造を有するトリペプチドは、ＡＣＥ活性を阻害するであろうと考えることができる。ＡＣＥのみでなく、ほぼ全てのタンパク質分解酵素はＸａａ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ結合を切断するのが難しいので、ペプチドのカルボキシ末端での（複数の）プロリン残基の存在によって、比較的プロテアーゼ耐性の分子が生じるという考えは、ほとんど自明である。同様に、プロリンの代わりにヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含むペプチドは、比較的プロテアーゼ耐性である。このことから、そのカルボキシ末端に１つ以上の（ヒドロキシ）プロリン残基を保有するペプチドは、胃腸管におけるタンパク質分解を免れるようであると推論することができる。これらの結論は、特異的ＡＣＥ阻害ペプチドの顕著なインビボ血圧降下効果を理解する助けとなるであろう。これらはＡＣＥ阻害の構造上の要件を満たすだけでなく、胃腸内のタンパク質分解性消化系による分解に抵抗し、それに続く腸壁を越える輸送の間、インタクトなままである。
【０００９】
トリペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＪＰ０２３６１２７）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＥＰ０５８３０７４）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７８：７７７〜７８３頁１９９５年））について、強力なＡＣＥ阻害活性が報告されている。最初に、全てのＡＣＥ阻害ペプチドは、ＡＣＥ活性に対するそれらのインビトロ効果に基づいて特徴付けられ、トリペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＩＰＰと呼ぶ）Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＶＰＰと呼ぶ）およびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＬＰＰと呼ぶ）が、比較的低いＩＣ５０値を生じる、それらの強力なＡＣＥ阻害効果のために、抜きん出ていた。後に、トリペプチドＶＰＰならびにＩＰＰの、推定される降圧効果を、自然発症高血圧ラットにおいて確かめることができた（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７８：１２５３１２５７（１９９５年））。これらの実験において、阻害トリペプチドは、乳酸菌発酵乳に由来した。乳発酵の間、望ましいペプチドは、増殖する乳酸菌によって産生されるプロテイナーゼによって生成される。ＡＣＥ阻害ペプチドは、電気透析法、中空線維膜透析またはクロマトグラフィー法の後に発酵乳製品から濃縮されて、錠剤またはロゼンジ等の、濃縮された栄養補助食品の形態での、それらの市場売買を可能にしている。
【００１０】
［発明の概要］
本発明は、新規トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰの塩を含むタンパク質加水分解物に関する。好ましくは、タンパク質加水分解物は、５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％のＤＨ、および最も好ましくは２０〜３５％のＤＨを有する。さらに、本発明は、ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰの塩を含むペプチド混合物に関する。好ましくは、このペプチド混合物は、少なくとも１ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含む。好ましくは、ペプチド混合物はまた、ＬＰＰおよび／またはＩＰＰを含む。したがって、ペプチド混合物はまた、好ましくは、少なくとも１ｍｇのＩＰＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含み、ならびに／またはペプチド混合物はまた、好ましくは少なくとも１ｍｇのＬＰＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含む。
【００１２】
このペプチド混合物は、好ましくは、５００Ｄａ未満の分子量を有する少なくとも３０重量％（乾燥物質）のペプチドを含み、より好ましくは、ペプチド混合物の３５〜７０重量％（乾燥物質）は、５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドである。
【００１３】
さらに、本発明は、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを生成するための、好ましくはタンパク質源の酵素加水分解による、酵素によるプロセスに関する。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本願に記載されているように、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ＡＣＥの阻害において非常に有効である。これらの阻害効果は、本明細書中の実験部分で判定すると、それぞれＭＡＰで０．４およびＩＴＰで１０（μＭで）の、驚くほど低いＩＣ５０値に対応する。さらに、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方のトリペプチドは、胃腸内タンパク質分解に抵抗し、したがって、ヒト腸管において安定であると期待されることがわかる。したがって、トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはトリペプチドＩＴＰならびにそれらの塩は、有効なＡＣＥ阻害に非常に適しており、例えば、栄養補助食品または薬剤として、機能性食品中で使用することができる。用語、栄養補助食品は、本明細書中で使用される場合、栄養および薬学的適用分野の両方における有用性を意味する。したがって、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む新規の栄養補助食品組成物は、食物および飲料への栄養補給物として、ならびにカプセル剤もしくは錠剤等の固体製剤、または溶液もしくは懸濁液等の液体製剤であってもよい経腸または非経口適用のための薬学的製剤または薬剤としての、使用を提供することができる。
【００１５】
トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）は、化学的合成、酵素加水分解およびタンパク質含有溶液の発酵を含む種々の方法によって、作製することができる。
【００１６】
タンパク質加水分解物または発酵に起因する液体等の複雑な混合物中の生物活性ペプチドの同定は、難しい課題である。基本的な疑問、正しいタンパク質基質を使用しているかどうか、正しい酵素を使用しているかどうか、正しい微生物培養物を使用しているかどうか、の他に、いくつかの生物活性ペプチドが、数千ものペプチドを含む複雑な試料中に存在すると期待することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分画の反復サイクルおよび生化学的評価を使用する伝統的な同定アプローチは、一般に、時間がかかり、存在する生物活性ペプチドを失って関連性のある対生物作用の検出を非常に難しくしがちである。本研究において、非常に洗練された装置を使用し、多くの異なるタンパク質加水分解物および発酵ブロスをスクリーニングし、最終的には、ＡＣＥ阻害特性を有する２つの新規のペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定につながった。本発明者らのアプローチにおいて、連続フロー生化学アッセイをオンラインでＨＰＬＣ分画システムに結合させた。ＨＰＬＣカラム流出を連続フローＡＣＥバイオアッセイと化学的分析技術（質量分析）との間で分割した。粗加水分解物および発酵ブロスをＨＰＬＣによって分離し、その後、生物活性化合物の存在を、オンラインの生化学アッセイによって検出した。生化学アッセイでペプチドが陽性のシグナルを示した場合に構造的情報が直ちに利用可能であるように、質量スペクトルを連続的に記録した。
【００１７】
上述のアプローチによって同定されるトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰを、経済的に実現性のある生成経路を含む種々の方法によって生成することができる。化学的合成による生成は、例えばＮ．シューワルト（Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．Ｄ．ヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨによる「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００２年、第４章に記載されているような従来の技術を用いて可能である。大規模生産に適した化学的ペプチド合成の、具体的な費用効果の高い方法は、Ｃ末端保護のためのメチルエステルおよびＮ−保護のためのベンジルオキシカルボニル（Ｚ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用と組み合わされた、カルボキシル基の活性化のためのアルキルクロロホルメートまたは塩化ピバロイルの使用に基づく。例えば、ＭＡＰの場合、Ｌ−プロリンメチルエステルを、イソブチルクロロホルメート活性化Ｚ−Ａｌａと結合させることができる。得られたジペプチドは、Ｃ上で水素およびＰｄを用いた水素化分解によってＺ−脱保護することができ、イソブチルクロロホルメート活性化Ｚ−Ｍｅｔと再度結合させることができる。得られたトリペプチドのうち、ＮａＯＨを用いてメチルエステルを加水分解し、水素化分解によるＺ−脱保護の後、トリペプチドＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏが得られる。同様に、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを合成することができるが、カップリング反応の間、Ｔｈｒのヒドロキシ官能基はベンジル保護を必要とする。最終的な工程において、次いで、Ｚ−脱保護の間にこの基は同時に除去される。
【００１８】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰはまた、アミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む任意のタンパク質基質を用いて、酵素加水分解によって、または発酵アプローチによって作製することができる。有利には、タンパク質基質は、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方の断片を含む。かかる酵素または発酵のアプローチのための好ましいタンパク質基質は、乳、または牛乳のカゼイン画分である。発酵または加水分解条件の最適化によって、生物活性分子ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの生成を最大化することができる。生成を最大化しようとする当業者は、加水分解／発酵時間、加水分解／発酵温度、酵素／微生物種類および濃度等のプロセスパラメータを調節のし方を知るであろう。
【００１９】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰを含む組成物は、有利には、加水分解物であり、好ましくは、以下の工程を伴うプロセスに従って作製される。
（ａ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む加水分解されたタンパク質生成物を生じる、そのアミノ酸配列中にＭＡＰまたはＩＴＰを含む適したタンパク質基質の酵素加水分解
（ｂ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰに富んだ画分の、加水分解されたタンパク質生成物からの分離、ならびに、場合により、
（ｃ）工程ｂ）の画分を濃縮および／または乾燥して、トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰに富んだ、濃縮された液体または固体を得ること。
【００２０】
酵素加水分解工程（ａ）は、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰトリペプチドの遊離を生じるタンパク質の加水分解につながる、適したタンパク質基質の任意の酵素処理であってもよい。いくつかの酵素の組み合わせを用いて、タンパク質基質から所望のトリペプチドを遊離させることができ、本プロセスにおいて使用される好ましい酵素は、プロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリン特異的オリゴペプチダーゼである。適したタンパク質基質は、アミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを包含する任意の基質であってもよい。ＭＡＰを包含することが公知であるタンパク質基質は、例えば、カゼイン、小麦グルテン、ヒマワリタンパク質単離物、米タンパク質、卵タンパク質である。適したタンパク質基質は、好ましくは、ウシβ−カゼイン、小麦グルテンのα−グリアジン画分およびヒマワリタンパク質単離物の２Ｓ画分に存在するようなアミノ酸配列ＡＭＡＰまたはＰＭＡＰを包含する。
【００２１】
カゼイン基質は、相当な量のβ−カゼインおよびα−ｓ２−カゼインを含む任意の物質であってもよい。適した基質の例は、乳ならびにカゼイン、カゼイン粉末、カゼイン粉末濃縮物、カゼイン粉末単離物、またはβ−カゼイン、もしくはα−ｓ２−カゼインである。好ましくは、カゼインタンパク質単離物（ＣＰＩ）等の、高含有量のカゼインを有する基質。
【００２２】
酵素は、β−カゼインおよび／またはα−ｓ２−カゼインなどのタンパク質を加水分解して１つ以上のＭＡＰおよび／またはＩＴＰのトリペプチドの遊離を生じることができる、任意の酵素または酵素の組み合わせであってもよい。
【００２３】
分離工程（ｂ）は、当業者に公知の任意の方法によって、例えば沈殿、ろ過、遠心分離、抽出またはクロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせによって、実行してもよい。好ましくは、分離工程（ｂ）は、精密ろ過または限外ろ過技術を用いて実行される。ろ過工程において使用される膜孔サイズ、ならびに膜の電荷を用いて、トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰの分離を制御してもよい。荷電ＵＦ／ＮＦ膜を用いたカゼインタンパク質加水分解物の分画が、Ｙ．ポワロ（Ｐｏｉｌｏｔ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５８（１９９９年）１０５〜１１４頁に記載されている。
【００２４】
濃縮工程（ｃ）は、工程（ｂ）によって生じた画分をナノろ過または蒸発して、高度に濃縮された液体を生じることを伴ってもよい。例えば低い水分活性（Ａｗ）、低ｐＨおよび好ましくはベンゾエートまたはソルベート等の保存剤で適当に製剤化される場合、かかる濃縮液体組成物は、魅力的な、本発明によるトリペプチドの保存の方法を形成する。場合により、蒸発工程の後に、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥による、乾燥工程が続き、高濃度のＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む固体を生じる。
【００２５】
酵素プロセスは、好ましくは、単一の酵素インキュベーション工程を含む。本発明による酵素プロセスはさらに、好ましくは混入している酵素活性がないプロリン特異的プロテアーゼの使用に関する。プロリン特異的プロテアーゼは、プロリンのカルボキシ末端側のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼとして定義される。好ましいプロリン特異的プロテアーゼは、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼである。プロリン特異的プロテアーゼは、好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質自体等の、大きいタンパク質分子を加水分解することができる。本発明によるプロセスは、一般に、２４時間未満のインキュベーション時間を有し、好ましくはインキュベーション時間は１０時間未満、より好ましくは４時間未満である。インキュベーション温度は、一般に、３０℃より高く、好ましくは４０℃より高く、より好ましくは５０℃より高い。
【００２６】
本発明の別の態様は、加水分解されたタンパク質からのトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの精製および／または分離である。本発明による、加水分解されたタンパク質のほとんどは、好ましくは、選択されたｐＨ条件下で、沈殿することができる。この精製プロセスは、ｐＨを、加水分解された、および加水分解されていないタンパク質のほとんどが沈殿するｐＨに変化させること、ならびに溶液中に残った（対生物作用）トリペプチドから沈殿したタンパク質を分離させることを含む。
【００２７】
プロリン残基をそのカルボキシ末端側に有する本トリペプチドを得るために、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断することができるプロテアーゼの使用によって、好ましい選択肢が提供される。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、プロリン残基のカルボキシ側でペプチドを選択的に切断する、独特の可能性を有する。プロリルオリゴペプチダーゼはまた、アラニン残基のカルボキシ末端でペプチドを切断する可能性を有するが、後者の反応は、プロリン残基を伴うペプチド結合を切断することよりも効率が低い。哺乳動物ならびに微生物供給源から単離された、全ての十分特徴付けられたプロリン特異的プロテアーゼにおいて、酵素の活性部位から大きいペプチドを排除する、独特のペプチダーゼドメインが同定されている。実際は、これらの酵素は、約３０より多いアミノ酸残基を含むペプチドを分解することができないので、これらの酵素は、現在、「プロリルオリゴペプチダーゼ」と呼ばれている（ファロップ（Ｆｕｌｏｐ）ら、セルＣｅｌｌ、第９４巻、１６１〜１７０頁、１９９８年７月２４日）。結果として、これらのプロリルオリゴペプチダーゼは、それらがそれらの加水分解作用を示すことができる前に、他のエンドプロテアーゼでの前加水分解を必要とする。しかしながら、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットに記載されているように、プロリルオリゴペプチダーゼとかかる別のエンドプロテアーゼとの組み合わせであっても、カルボキシ末端プロリン残基を有する有意に増強された割合のペプチドによって特徴付けられる加水分解物を生じる。このために、かかる加水分解物は、インビトロＡＣＥ阻害効果ならびに胃腸内タンパク質分解に対する改善された抵抗性を有するトリペプチドの単離のための、優れた出発点を形成する。
【００２８】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書中で、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖として定義される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、同義（一般に認識されるように）と考えられ、各用語は、文脈によって必要な場合、互換可能に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書中で、３０個より多いアミノ酸残基を含む、鎖として定義される。本明細書中の全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、一般的な慣習に従って、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で記される。本明細書中で使用されるアミノ酸の一文字表記は、当該分野で一般に公知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）に見ることができる。ペプチド混合物は、３５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの測定と組み合わせてケルダール窒素に基づいて測定すると、少なくとも３０重量％（乾燥物質）のペプチドを含む組成物である。
【００２９】
エンドプロテアーゼは、本明細書中で、エンド型でポリペプチド中のペプチド結合を加水分解し、グループＥＣ３．４に属する酵素として定義される。エンドプロテアーゼは、触媒機序に基づいて、サブサブクラスに分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブサブクラスがある。エキソプロテアーゼは、本明細書中で、末端のα−アミノ基に隣接するペプチド結合（「アミノペプチダーゼ」）または末端のカルボキシ基と末端から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合（「カルボキシペプチダーゼ」）を加水分解する酵素として定義される。
【００３０】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットは、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から得ることができる、プロリン特異的プロテアーゼを記載している。黒色アスペルギルス由来酵素は、プロリンのカルボキシ末端で選択的に切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端でも切断することができ、より低い効率ではあっても、アラニンのカルボキシ末端でも切断することができる。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはまた、この黒色アスペルギルス由来酵素と他の微生物または哺乳動物供給源由来の公知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に明らかな相同性がないことを教示している。公知のプロリルオリゴペプチダーゼと対照的に、黒色アスペルギルス酵素は、酸性の最適ｐＨを有する。公知のプロリルオリゴペプチダーゼならびに黒色アスペルギルス由来酵素は、いわゆるセリンプロテアーゼであるが、本発明者らは、本明細書中（実施例１）で、黒色アスペルギルス酵素が、完全に異なるサブファミリーに属することを示す。分泌された黒色アスペルギルス酵素は、ほとんどの細胞質プロリルオリゴペプチダーゼがグループ分けされるＳ９ファミリーよりむしろ、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであるようである（ローリング（Ｒａｗｌｉｎｇ），Ｎ．Ｄ．およびバレ（Ｂａｒｒｅｔ），Ａ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２９８（１９９６年）１〜３頁）。実施例２において、本発明者らは、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的プロテアーゼの最適ｐＨおよび温度を示す。実施例３において、本発明者らは、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端の切断に対する黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの高い選択性を示す。さらに、本発明者らは、実施例において、本発明の方法において使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物が、好ましくは本質的に純粋であることを示し、これは純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンド型タンパク質分解活性以外の有意なエンド型タンパク質分解活性が存在しないことを意味する。本発明者らはまた、好ましくは本発明に従って使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物が、いかなるエキソ型タンパク質分解、より具体的にはアミノペプチド分解副活性も含まないことを示す。好ましくは、エキソ型タンパク質分解活性は、本発明のプロセスにおいて使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物中に存在しない。プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性が非組み換えアスペルギルス株中に本質的に存在しないという考えの実験的証明は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに見ることができ、本願の実施例３にも示されている。本発明のプロセスは、カゼイン基質をプロリン特異的エンドプロテアーゼのみとともにインキュベートすることによって可能なので、温度、ｐＨ等の最適インキュベーション条件は、容易に選択することができ、２つ以上の酵素が適用される場合のように、最適状態に及ばない条件下で固定する必要がない。さらに、例えばさらなる非対生物作用ペプチドまたは肉臭い味につながる遊離アミノ酸等の望ましくない副産物の形成は予防される。反応条件の選択においてより高い自由度を有することによって、他の基準についてのより容易な選択が可能になる。例えば、ここで、微生物感染に対する感受性がより低い条件を選択すること、およびｐＨ条件をその後のタンパク質沈殿工程に関して最適化することが、より容易である。実施例４において、本発明者らは、アスペルギルス酵素がオリゴペプチダーゼでないが、補助的なエンドプロテアーゼを必要とせずにインタクトなタンパク質、大きいペプチドならびにより小さいペプチド分子を加水分解することができる真のエンドペプチダーゼであることを示す。この新しい、驚くべき発見は、補助的なエンドプロテアーゼを必要としないためにカルボキシ末端プロリン残基を有する先例のない高含有量のペプチドを有する加水分解物を調製するために黒色アスペルギルスを使用する可能性を開く。かかる新しい加水分解物は、植物由来であれ動物起源由来であれ、異なるタンパク質性出発物質から調製することができる。かかる出発物質の例は、カゼイン、ゼラチン、魚または卵タンパク質、小麦グルテン、大豆およびエンドウタンパク質ならびに米タンパク質およびヒマワリタンパク質である。ナトリウムは高血圧症において重要な役割を有することが公知であるので、ＡＣＥ阻害ペプチドの生成のための好ましい基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩よりむしろ、カルシウムおよびカリウムである。
【００３１】
黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨは約４．３である（図１参照）。この低い最適ｐＨのために、牛乳カゼインを黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼとともにインキュベートすることは自明ではない。牛乳カゼインはｐＨが６．０未満に低下すると沈殿するが、ｐＨ６．０では、黒色アスペルギルス酵素は、限られた活性しか有さない。しかしながら、本発明者らは、実施例５において、このやや好ましくない条件下でも、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションによってＩＰＰおよびＬＰＰ等のいくつかの公知のＡＣＥ阻害ペプチドを生じることができることを示す。非常に驚くべきことに、これらの条件下で生成されるＶＰＰはない。牛乳カゼインは、β−カゼインおよびκ−カゼインを含むいくつかの異なるタンパク質を組み込む。公知のアミノ酸配列によると、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。κ−カゼインは、ＩＰＰのみを包含する。黒色アスペルギルス由来酵素がいかなる測定可能なアミノペプチダーゼ活性も含まないことから、形成されたＩＰＰが、κ−カゼイン中に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることが、強力に示唆される。おそらく、ＩＰＰのカルボキシ末端のペプチド結合は、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの主な活性によって切断されるが、先行するＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断は、そのＡｌａ特異的副活性によって達成される。同様に、ＶＰＰがないことは、アミノペプチダーゼ副活性がないことに基づいて説明することができる。ＶＰＰは、配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−中で、β−カゼイン中に含まれる。したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ＶＶＶＰＰ配列を切除するが、ＶＰＰを放出させることはできない。
【００３２】
これらの結果は、単純な一工程酵素プロセスにおいてカゼイン塩を黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼとともにインキュベートすると得られる。タンパク質を含む水溶液は、特に何時間も５．０より高いｐＨ値で、５０℃以下の温度で維持された場合、微生物感染に対して高度に感受性がある。特に、かかる長期のインキュベーション工程の間に生成されることがあり、その後の加熱工程の後も残存して食品グレードのプロセスに対する潜在的な脅威を形成する可能性がある微生物毒素。本発明は、好ましくは、５０℃より高いインキュベーション温度を使用する。２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは４時間未満の期間にわたって酵素インキュベーションが行われる一工程酵素プロセスと組み合わせて、本発明によるプロセスによって、向上した微生物学的安定性の利点が提供される。高温条件と組み合わせて本酵素−基質比を使用して、ＩＰＰおよびＬＰＰの切除が３時間のインキュベーション期間以内に完了する。
【００３３】
単一の本質的に純粋なエンドプロテアーゼを用いて、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰをカゼインから切除することができるので、本発明は、従来技術のプロセスより少ない数の水溶性ペプチドを生じる。これらの水溶性ペプチドのうち、ＩＰＰおよびＬＰＰは、多量に存在する。これは、多くの他の、しばしば活性の低い化合物なしで、高濃度のＡＣＥ阻害トリペプチドが必要である場合、特に重要である。
【００３４】
本プロセスによると、タンパク質中に存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＩＰＰまたはＬＰＰに転換される。
【００３５】
実施例６において、本発明者らは、新しい、驚くべき精製工程による、対生物作用ペプチドの５倍精製効果を説明する。この精製プロセスの基礎は、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの独特の特性によって形成される。この酵素とのインキュベーションによって、水溶性トリペプチドの形態で、基質分子の最も対生物作用のある部分が放出される。基質分子の、対生物作用のない、または対生物作用の低い部分は、大部分、切断されないままであり、したがって、基質分子のより大きいペプチドまたはポリペプチド部分のままである。選択されたｐＨ条件での、これらの、より大きいペプチドまたはポリペプチド部分の限定された水溶性のために、これらの、基質分子の、対生物作用のない、または対生物作用の低い部分は、より可溶性の高い対生物作用トリペプチドから容易に分離する。このプロセスにおいて、最初の加水分解物は、５５℃、ｐＨ６．０での短い酵素インキュベーション期間の間に形成され、次いで、場合により、８０℃より高い温度まで加熱され、全ての混入している微生物を死滅させ、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼが不活化される。その後、加水分解物が酸性化されて４．５または少なくとも５．０未満までのｐＨ低下が実現される。酵素の最適条件を表すために黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼ不活化に使用することができない、このｐＨ値において、より小さいペプチドのみが溶液中に残るように、カゼイン塩由来の全ての大きいペプチドが沈殿する。沈殿したカゼイン塩は傾瀉またはろ過工程または低速（すなわち、５０００ｒｐｍ未満）遠心分離によって容易に除去することができるので、水性相は、存在するタンパク質の量に関して、高い割合の対生物作用ペプチドを含む。ケルダールデータによると、８０〜７０％のカゼイン塩タンパク質が、低速遠心分離工程によって除去され、これはＡＣＥ阻害ペプチドの４〜５倍精製を含意する。本発明者らは、この精製原理を有利に適用して、カゼイン以外のタンパク質性物質から得られる生物活性ペプチドも得ることができることを見出した。また、酵素によって生成される加水分解物だけでなく、適した微生物によって発酵されるタンパク質もまた、本プロセスに従って分離および精製することができる。酵素および基質を、基質は沈殿して酵素は依然として活性のあるｐＨに近いｐＨ値でインキュベートすることによって、この精製工程が可能になる。黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの低い最適ｐＨのために、ｐＨ１．５〜６．０の範囲での基質沈殿が考慮される。それらの特定の沈殿性質の観点から、グルテンはｐＨ３．５より上で沈殿し、ヒマワリタンパク質はｐＨ４．０より高くｐＨ６．０未満で沈殿し、卵白はｐＨ３．５より高くｐＨ５．０未満で沈殿し、加水分解されたタンパク質が沈殿し、沈殿したタンパク質を加水分解されたタンパク質またはペプチドから分離することができる条件の例を形成する。
【００３６】
傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後、生物活性ペプチドを含む上清を、精製された状態で回収することができる。その後の蒸発および噴霧乾燥工程によって、高い対生物作用を有する食品グレードのペーストまたは粉末を得るための、経済的な経路を生じる。記載されるようなプロセスに従ってカゼイン塩を摂取すると、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを有する白色で無臭の粉末が得られる。あるいは、蒸発またはナノろ過を用いて、対生物作用ペプチドをさらに濃縮することができる。ｐＨ調節およびベンゾエートまたはソルベート等の食品グレードの保存剤の添加と組み合わせた、水分活性（Ａｗ）を増大させることによる、かかる濃縮物の適した製剤化によって、血圧降下ペプチドの、微生物学的に安定化された食品グレードの液体濃縮物が生じる。正しいトリペプチド濃度に適当に希釈された場合、全ての種類の食品および飲料にＡＣＥ阻害特性を与えるのに適した、用途の広い出発物質が得られる。必要な場合、傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清をさらに処理して、最終産物の嗜好性を向上させることができる。例えば、上清を粉末状活性炭と接触させ、その後ろ過工程で炭を除去することができる。最終産物の苦味を最小限にするために、傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後に得られた上清を、サブチリシン、トリプシン、中性プロテアーゼまたはグルタミン酸特異的エンドプロテアーゼ等の別のプロテアーゼとのインキュベーションに供することもできる。必要な場合、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの特異的親水性／疎水性特性を利用するその後の精製工程によって対生物作用成分ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの濃度をさらに増大させることができる。好ましい精製方法としては、ナノろ過（サイズに基づく分離）、蒸発／沈殿が後に続く、例えばヘキサンもしくはブタノールでの抽出、または得られる酸性化加水分解物をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤ範囲（ローム（Ｒｏｅｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂と接触させることが挙げられる。また、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって供給されるようなブチル−セファロース樹脂を用いてもよい。
【００３７】
実施例７において、本発明者らは、新しいペプチド精製プロセスと組み合わせて黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いて調製されたカゼイン加水分解物中の新しいＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定を説明する。高い割合の非対生物作用ペプチドの除去ならびに高度に洗練された分離および同定装置と組み合わせた、この単一および（本質的に純粋な）エンドプロテアーゼの使用によってのみ、これらの新しいＡＣＥ阻害トリペプチドを追跡および同定することができた。実施例７（沈殿後）に従って調製されたカゼイン由来対生物作用ペプチド（ＣＤＢＡＰ）において、２．９ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ（ＣＤＢＡＰ中４．８ｍｇ ＭＡＰ／ｇタンパク質）および０．９ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ（ＣＤＢＡＰ中１．４ｍｇ ＩＴＰ／ｇタンパク質）に対応する量で、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰが同定された。ＣＤＢＡＰのさらなる特徴は、その、モル基準で２４％の、非常に高いプロリン含有量である。実施例７に記載される試験は、改変マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）試験での２つの新しいトリペプチドの非常に低いＩＣ５０値、すなわちＭＡＰで０．５μｍｏｌ／ｌおよびＩＴＰで１０μｍｏｌ／ｌを示す。この発見は、公知の最も有効な天然のＡＣＥ阻害ペプチドの１つであるＩＰＰがこの改変マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）試験において２．０μｍｏｌ／ｌのＩＣ５０値を有することに気づくと、さらにより驚くべきことである。
【００３８】
本プロセスによると、タンパク質中に存在する−Ｍ−Ａ−Ｐ−または−Ｉ−Ｔ−Ｐ−配列の、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＭＡＰまたはＩＴＰに転換される。
【００３９】
新規に同定されたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの有用性は、実施例８にさらに説明される。後者の実施例において、本発明者らは、両方のペプチドが、胃腸管内で典型的に見られる消化条件をシミュレートするインキュベーション条件で残存することを示す。これらのデータに基づいて、本発明者らは、新規のトリペプチドが哺乳動物（例えばヒト）胃腸管で残存するようであり、高血圧症の治療に使用された場合、相当な経済的潜在性を含意すると結論付ける。
【００４０】
実施例９において、本発明者らは、優れたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰは、酵素加水分解実験において生成することができるだけでなく、適当な食品グレード微生物で発酵させた乳調製物中でも検出可能であることを示す。しかしながら、本発明者らは、かかる発酵製品中でペプチドＩＴＰの存在を示すことができなかった。
【００４１】
さらなる（例えばクロマトグラフィー精製工程の前または後のいずれかに得られるペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを、定期的に広く消費される食品への組み込みのために使用してもよい。かかる製品の例は、マーガリン、スプレッド、バターもしくはヨーグルト等の種々の乳製品または乳もしくはホエー含有飲料である。かかる組成物は、典型的にはヒトに投与されるが、これらはまた、高血圧症を軽減するために、動物、好ましくは哺乳動物に投与されてもよい。さらに、得られる製品中の高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドによって、これらの製品は、丸剤、錠剤または高度に濃縮された溶液もしくはペーストまたは散剤の形態の栄養補助食品への組み込みに非常に有用になる。ＡＣＥ阻害ペプチドの継続的放出を確実にする持続放出性栄養補助食品が、特に重要である。本発明によるＭＡＰおよび／またはＩＴＰペプチドは、例えば丸剤、錠剤、顆粒剤、小袋またはカプセル剤中の乾燥粉末として製剤化されてもよい。あるいは、本発明による酵素は、例えばシロップ剤またはカプセル剤中の液体として製剤化されてもよい。種々の製剤中で使用され、本発明による酵素を含む組成物はまた、生理学的に許容され得る担体、佐剤、賦形剤、安定剤、バッファーおよび希釈剤からなる群の少なくとも１つの化合物を組み込んでもよく、これらの用語は、それらの元来の意味で使用されて、包装、送達、吸収、安定化を補助するか、または佐剤の場合、酵素の生理学的効果を増強する、物質を示す。粉末形態の本発明による酵素と組み合わせて使用することができる種々の化合物に関する関連のあるバックグラウンドは、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に見ることができる。乾燥粉末として製剤化された、本発明によるＡＣＥ阻害ペプチドは、やや長期間保存することができるが、例えばアルミニウムブリスター等の適した包装を選択することによって、湿気または湿った空気への接触は避けるべきである。比較的新しい経口適用形態は、種々の型のゼラチンカプセル剤またはゼラチンベースの錠剤の使用である。
【００４２】
高血圧症に対抗するための天然のＡＣＥ阻害ペプチドの関連性の観点から、本発明の、新しく費用効果の高い経路は、穏やかな降圧性の食事またはさらには動物用製品のための、魅力的な出発点を提供する。本経路はまた、驚くほど単純な精製工程も含むので、血圧降下濃縮栄養補助食品の可能性もまた、拡大される。
【００４３】
本発明による、または本発明に従って使用される、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３で言及されているポリペプチドを意味する。したがって、このプロリン特異的エンドプロテアーゼは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６またはその断片と、少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）６０ヌクレオチドにわたって、好ましくは１００ヌクレオチドにわたって、少なくとも８０％または９０％同一な、より好ましくは２００ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％同一な、配列番号１の核酸配列もしくはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を有するポリペプチドである。配列番号１および配列番号２は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示されている通りである。好ましくは、ポリペプチドは、単離された形態である。
【００４４】
本発明に従って使用される、好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有する、または配列番号２のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を有する。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１の核酸配列もしくはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列と低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４６】
用語「ハイブリダイズすることができる」は、本発明の標的ポリヌクレオチドが、プローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、もしくはその断片、または配列番号１の相補物）に、バックグラウンドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズできることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的なヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡであり、最も好ましくはゲノムＤＮＡ配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物にハイブリダイズすることができる、連続したヌクレオチドの配列を含む。かかるヌクレオチドは、当該分野で周知の方法に従って合成することができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物に、バックグラウンドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡのために、起こる場合がある。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物との間の相互作用によって発生するシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用よりも、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射性同位元素標識することによって、測定してもよい。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、低ストリンジェンシー（約４０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて達成してもよい。
【００４８】
ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性の計算に使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定に基づいて使用される）。
【００４９】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ Ｎアルゴリズムもまた、配列同一性を計算するのに、または（例えばそれらのデフォルト設定に基づいて、同等または対応する配列を同定すること等の）配列を並べるのに使用することができる。
【００５０】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させた場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴに適合するか、または満たすかのいずれかの、クエリー配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近縁ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の近縁ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大できる限りは、各配列に沿って両方向に延長される。各方向へのワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その最大の得られた値から量Ｘだけ低下した場合、１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロ以下になった場合、または配列のいずれかの末端に達した場合に中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を判定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の文字列長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計的解析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される、ある類似性の測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する、最小の合計の確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、配列は、第一の配列と第二の配列との比較における最小の合計の確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列と類似していると見なされる。
【００５２】
アスペルギルス属の株は、食品グレードの状態を有し、これらの微生物由来の酵素は、疑われていない食品グレードの供給源に由来する。別の好ましい実施形態によると、酵素は、分泌されない、いわゆる細胞質酵素よりむしろ、その産生細胞によって分泌される。このようにして、酵素を、高価な精製工程なしに、本質的に純粋な状態で、細胞ブロスから回収することができる。好ましくは、酵素は、一般のｐＨおよび温度条件下で、その基質に対して、高い親和性を有する。
【００５３】
［材料および方法］
［材料］
食用カゼイン酸カリウムスプレー（８８％）を、オランダのＤＭＶインターナショナル（ＤＭＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。合成色素形成ペプチドを、オランダのペップスキャンシステムズ社（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）またはスイスのバッヘム（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。
【００５４】
黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼ
黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの過剰産生を、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されているように達成した。クエン酸塩／二リン酸ナトリウムバッファーｐＨ４．６中、３７℃で、合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに関して、酵素の活性を試験した。反応生成物を、４０５ｎＭで、分光光度計によってモニタリングした。単位を、これらの試験条件下で１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを遊離させる酵素の量として定義する。
【００５５】
［黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼの、クロマトグラフィーによる精製］
過剰産生している黒色アスペルギルス株から得られた培養ブロスを、混入している任意のエンド型およびエキソ型タンパク質分解活性を除去するための、プロテアーゼのクロマトグラフィーによる精製に使用した。そのため、発酵ブロスをまず遠心分離して、真菌の塊の大部分を除去し、次いで上清を、減少していく孔サイズを有するいくつかのフィルターに通過させて、全ての細胞断片を除去した。最後に、得られた限外ろ過液を２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．１中で１０倍希釈し、Ｑ−セファロース（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦカラムにアプライした。２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．１中、０〜０．４ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌのグラジエントでタンパク質を溶出させた。Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１、２０９〜２１２頁（１９９５年）に記載されているプロトコールに従うがわずかに改変したアッセイ条件下で、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの切断に対する活性を示していたピーク画分を収集し、貯蔵した。黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの酸性の最適ｐＨを考慮して、酵素アッセイを、３７℃で、クエン酸塩／二リン酸ナトリウムバッファー中、ｐＨ４．６で行った。活性画分の貯蔵と、それに続く濃縮によって、最終的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの単一のバンドおよびＨＰ−ＳＥＣでの１つのピークのみを示す調製物を生じた。疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる分析によって、得られた酵素調製物の純度を確認した。
【００５６】
［ＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの検出において使用されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析］
本発明の酵素混合物によって生成された、酵素によるタンパク質加水分解物中の、目的のペプチド、中でもトリペプチドＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの定量において、Ｐ４０００ポンプ（サーモクエスト（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）（登録商標）、オランダ、ブレダ（Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に結合させたイオントラップ質量分析計（サーモクエスト（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）（登録商標）、オランダ、ブレダ（Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を用いたＨＰＬＣを使用した。形成されたペプチドを、溶出のためのミリＱ（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）水（ミリポア、米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））中の０．１％ギ酸（溶液Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶液Ｂ）のグラジエントと組み合わせたイナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）３ＯＤＳ３、３μｍ、１５０＊２．１ｍｍ（バリアン・ベルジウム、ベルギー（Ｖａｒｉａｎ Ｂｅｌｇｉｕｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））カラムを用いて分離した。グラジエントは溶液Ａの１００％で開始し、それを５分間維持し、１０分で５％Ｂに線形に増大させ、続いて３０分で溶液Ｂの４５％に線形に増大させ、直ちに開始時の条件にし、それを１５分間安定化のために維持した。使用した注射体積は５０μｌであり、流速は２００μｌ／分であり、カラム温度は５５℃で維持した。注射した試料のタンパク質濃度は、およそ５０μｇ／ｍｌであった。
【００５７】
個々のペプチドに関する詳細な情報は、約３０％の最適衝突エネルギーを用いて、目的のペプチドの専用のＭＳ／ＭＳを用いることによって得た。個々のペプチドの定量は、ＭＳ／ＭＳモードで観察される最も豊富な断片イオンを用いることによって、外部較正を用いて行った。
【００５８】
トリペプチドＬＰＰ（Ｍ＝３２５．２）を用いて、ＭＳモードでの最適感度およびＭＳ／ＭＳモードでの最適断片化を調整し、５μｇ／ｍｌの一定の注入を行い、ＭＳモードでプロトン化分子を生じ、ＭＳ／ＭＳモードで約３０％の最適衝突エネルギーを生じ、Ｂ−およびＹ−イオン系列を生じた。
【００５９】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に、酵素によるタンパク質加水分解物を周囲温度および１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、上清をミリＱ（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）水で１：１００に希釈した。
【００６０】
［ケルダール窒素］
フローインジェクション分析によって、全体的なケルダール窒素を測定した。ＴＫＮ法カセット５０００−０４０を備えたテカター（Ｔｅｃａｔｏｒ）ＦＩＡＳＴＡＲ５０００フローインジェクションシステム、ＳＯＦＩＡソフトウエアを有するペンティアム（Ｐｅｎｔｉｕｍ）４コンピュータ、およびテカター（Ｔｅｃａｔｏｒ）５０２７オートサンプラーを使用して、タンパク質含有溶液から放出されたアンモニアを５９０ｎｍで定量した。方法のダイナミックレンジ（０．５〜２０ｍｇのＮ／ｌ）に対応する試料の量を、９５〜９７％硫酸およびケルダールとともに消化チューブに入れ、２００℃で３０分間と、それに続く３６０℃で９０分間の消化プログラムに供する。ＦＩＡＳＴＡＲ５０００システムへの注入の後、測定されたタンパク質の量を推定することができる窒素ピークを測定する。
【００６１】
［アミノ酸分析］
正確に計量したタンパク質性物質の試料を希酸中で溶解させ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機による遠心分離によって沈殿を除去した。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（米国マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ，ＵＳＡ））のアミノ酸分析システムの操作手引きで特定されているようなピコタグ（ＰｉｃｏＴａｇ）法に従って、透明な上清でアミノ酸分析を行った。そのため、適した試料を液体から得、次いで、乾燥させ、気相酸加水分解に供し、フェニルイソチオシアネートを用いて誘導体化した。存在する、種々の誘導体化されたアミノ酸を、ＨＰＬＣ法を用いて定量し、合計して、計量された試料中の遊離アミノ酸の総レベルを計算した。アミノ酸ＣｙｓおよびＴｒｐは、この分析で得られるデータに含まれない。
【００６２】
タンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）を、迅速なＯＰＡ試験を用いて測定し、記載されているように計算した（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、ＪＦＳ、第６６巻、５号、６４２〜６４６頁、２００１年）。
【００６３】
［加水分解物中に存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布］
高圧ポンプ、１０〜１００μｌの試料を注入することができる注入装置および２１４ｎｍでカラム流出をモニタリングすることができるＵＶ検出器を備えた自動化ＨＰＬＣシステムで、プロテアーゼ処理タンパク質試料のペプチドサイズ分布の分析を行った。
【００６４】
この分析に使用したカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム／２５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０バッファーで平衡化したスーパーデックスペプチド（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ）ＨＲ １０／３００ ＧＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））であった。試料（典型的には５０μｌ）を注入した後、バッファーで９０分間、０．５ｍｌ／分の流速でカラムから種々の成分を溶出させた。シトクロムＣ（分子量１３５００Ｄａ）、アプロチニン（分子量６５１０Ｄａ）およびテトラグリシン（分子量２４６Ｄａ）の混合物を分子量マーカーとして用いて、システムを較正した。
【００６５】
［実施例］
［実施例１］
黒色アスペルギルスから得られた酵素は、新しいクラスのプロリン特異的酵素を表す。
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに提供されている黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼのコード配列全体から、５２６アミノ酸のタンパク質配列を決定することができる。酵素の新規性は、スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、ＰＩＲおよびｔｒＥＭＢＬ等のデータベースのＢＬＡＳＴサーチによって確認した。本発明者らが驚いたことに、黒色アスペルギルス酵素と公知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に、明らかな相同性は検出できなかった。しかしながら、アミノ酸配列の、より密接な観察から、Ｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、および胸腺特異的セリンプロテアーゼに対する、低いが有意な相同性が明らかになった。これらの酵素の全ては、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８に割り振られている。また、活性部位セリンの周りのＧｘＳＹｘＧ配置は、これらの酵素と黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼとの間で保存されている。また、ファミリーＳ２８のメンバーは、酸性の最適ｐＨを有し、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断する特異性を有し、シグナル配列、およびちょうど黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼ等のプロペプチドとともに、合成される。また、黒色アスペルギルス酵素のサイズは、ファミリーＳ２８のメンバーのものと類似している。したがって、黒色アスペルギルスプロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られる酵素を含むほとんどの細胞性プロリルオリゴペプチダーゼがグループ分けされているＳ９ファミリーよりむしろ、セリンプロテアーゼのファミリーＳ２８のメンバーであるようである。これらの構造的および生理学的特性に基づいて、本発明者らは、黒色アスペルギルス酵素が、セリンプロテアーゼのＳ９ファミリーよりむしろ、Ｓ２８に属すると結論付けた。黒色アスペルギルス由来酵素を、Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼから識別するさらなる特性は、前者のファミリーに属する細胞質プロリルエンドプロテアーゼとは異なり、新しく同定された黒色アスペルギルス酵素は、増殖培地中に分泌されることである。これは、低級真核生物由来の、ファミリーＳ２８のメンバーの単離および特徴付けに関する、最初の報告である。
【００６６】
［実施例２］
［黒色アスペルギルスから得られたプロリン特異的エンドプロテアーゼの最適ｐＨおよび温度］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの最適ｐＨを確立するために、異なるｐＨ値を有するバッファーを調製した。０．０５ｍｏｌ／ｌの酢酸Ｎａおよび０．０２ＭのＣａＣｌ２を用いてｐＨ４．０−４．５−４．８−５．０−５．５および６．０のバッファーを作製し、０．０２ＭのＣａＣｌ２を含む０．０５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファーを用いてｐＨ７．０および８．０のバッファーを作製した。それぞれ酢酸およびＨＣｌを用いてｐＨ値を調節した。色素形成合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質として使用した。バッファー溶液、基質溶液およびプロリルエンドプロテアーゼプレ希釈（０．１Ｕ／ｍＬの活性で）を、水浴中で正確に３７．０℃まで加熱した。混合した後、反応を分光光度計によって４０５ｎｍ、３７℃で３．５分間追跡し、０．５分ごとに測定した。図１に示される結果から、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが約４の最適ｐＨを有することが明らかである。
【００６７】
また、プロリルエンドプロテアーゼの最適温度を確立した。そのため、精製された酵素調製物を、０．０２ｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２を含有する０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸Ｎａ中、ｐＨ５．０で２時間、カゼインレゾルフィン（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）バーション３）を基質として用いて異なる温度でインキュベートし、５７４ｎｍで測定することによって酵素活性を定量した。得られた結果によると、黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、およそ５０℃の最適温度を有する。
【００６８】
［実施例３］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性および純度
複数コピーの発現カセットを含む、黒色アスペルギルス株から得られた、そのまま、ならびにクロマトグラフィーによって精製された酵素試料（国際公開第０２／４５５２４号パンフレット参照）を、色素形成ペプチド基質の組に対して試験して、コードされるエンドプロテアーゼの特異性を確立した。異なる組の色素形成ペプチドを使用して、可能性のある混入している酵素活性の存在を確立した。コードされるエンドプロテアーゼのエンド型タンパク質分解特異性を、異なるＡｌａ−Ａｌａ−ＸｐＮＡ（ＡＡＸｐＮＡ）基質で試験した。この文脈において、「Ｘ」は、異なる天然アミノ酸残基をいい、「ｐＮＡ」はｐ−ニトロアニリドをいう。分子の「Ｘ」残基とｐＮＡ部分との間のペプチド結合の切断は、λ＝４０５または４１０ｎｍでの吸光度の増大によってモニタリングすることができる色の変化を引き起こす。ＡＡＸｐＮＡ基質。そのため、ＡＸＸ−ｐＮＡ基質のストック溶液（１５０ｍｍｏｌ／ｌ）を、２０ ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸塩バッファーｐＨ４．０中で１００倍希釈した。ＴＥＣＡＮ ゲニオス（Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰリーダー（ウィーン、ザルツブルグ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ））において、４０５ｎｍで１０分間の運動測定によって、エクセルでのデータ処理によって図２に示される画像を生じる、光学密度の増大が記録された。結果から、黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼが、アラニル結合に対する副活性ありで、プロリルペプチド結合に対して高度に特異的であることが明らかである。そのまま、およびクロマトグラフィーによって精製された調製物は、同様の活性プロフィールを示した。
【００６９】
黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼの、外来性酵素活性での可能性のある混入は、いくつかの望ましくない副反応につながる。例えば、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ等の等のエキソプロテアーゼの存在は、増大したレベルの遊離アミノ酸を有するペプチド調製物を生じる。これらの余分の遊離アミノ酸は、存在する対生物作用ペプチドの相対的濃度を希釈し、さらに、メイラード反応の増大の結果として肉臭い味を与える。過剰発現されたプロリン特異的エンドプロテアーゼの調製物中に、深刻なレベルの、混入しているエンドプロテアーゼが存在する場合、プロリンまたはアラニン残基のカルボキシ末端以外の切断部位が導入される。かかる余分の切断部位は、余分のペプチドを生じ、また、カルボキシ末端プロリン残基を有する対生物作用ペプチドの濃度を希釈する。これら全ての望ましくない副反応を最小限にするために、本質的に純粋なとは、プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用が好ましい。本質的に純粋な、使用されるインキュベーション条件下での、混入しているエンドプロテアーゼならびに混入しているエキソペプチダーゼの活性が最小限であるか、または好ましくはないことを意味する。以下の試験手順を考案して、かかる混入しているエンドおよびエキソペプチダーゼ活性を定量した。
【００７０】
試験手順のための基礎を、種々の選択的色素形成ペプチドの収集によって形成する。プロリン特異的オリゴおよびエンドプロテアーゼのみが、ペプチドＺ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡからｐＮＡを放出させることができるので、この特定のペプチドを用いて、所望のプロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を定量した。多くのエンドプロテアーゼがペプチドＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡからｐＮＡを放出させることができるので、これらの２つのペプチドを用いて、混入している、非プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を定量した。
【００７１】
多くのアミノペプチダーゼが、ペプチド基質からＰｈｅおよびＧｌｎを効率的に放出させることができるので、色素形成ペプチドＱ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを用いて、混入しているアミノペプチダーゼ活性を定量した。
【００７２】
多くのカルボキシペプチダーゼが、ペプチド基質からＰｈｅおよびＡｒｇ残基を放出させることができるので、これらの残基を含むペプチドを選択して、混入しているカルボキシペプチダーゼ活性を定量した。しかしながら、カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための、適した色素形成基は入手できないので、合成ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲを用いた代替的方法を開発しなければならなかった。この代替的方法を、下記に提供する。使用した全ての合成ペプチドにおいて、「Ｚ」はベンジルオキシカルボニルを表し、「ｐＮＡ」は発色団パラ−ニトロアニリドを表す。全ての色素形成ペプチドは、ペップスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）（オランダ、レリスタット（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から入手した。ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲは、バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）（スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。全てのインキュベーションは、４０℃で行った。希釈した酵素調製物を、商業的製品の濃度に再計算した。
【００７３】
産業上利用可能な酵素調製物中に規則的に存在する種々の酵素活性のレベルを説明するために、この実施例において、本発明者らは、３つの商業的酵素調製物、すなわち、フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）１０００ＬバッチＨＰＮ００２１８（ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ））、スミザイム（Ｓｕｍｉｚｙｍｅ）ＦＰ（新日本、日本（Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ，Ｊａｐａｎ））およびコロラーゼ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ）ＬＡＰ Ｃｈ．：４１２３（ＡＢエンザイムス、英国（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＵＫ））の、それらの種々のタンパク質分解活性についての試験を説明する。フレーバーザイムおよびスミザイムＦＰの両方とも、非特異的エンド型タンパク質分解およびカルボキシペプチド分解活性の他に、いくつかのアミノペプチド分解酵素活性を含む、複雑な酵素調製物として公知である。コロラーゼＬＡＰは、アスペルギルス由来の、比較的純粋な、クローニングおよび過剰発現された、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を表す。
【００７４】
［アミノペプチダーゼ活性の測定］
１００％ＤＭＳＯ中の１５０ｍｍｏｌ／ｌのＦ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡのストック溶液を、０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓバッファーｐＨ６中で８０倍希釈して、Ｆ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡを１：１の比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ Ｆ−ｐＮＡ＋Ｑ−ｐＮＡ基質溶液を作製した。このアミノペプチダーゼ基質溶液の２００μｌのアリコートを、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の別々のウェルにピペットで入れた。ＭＴＰを、マゼラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）４ソフトウエアで稼動しているテカン・ゲニオス（Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰ（ウィーン、ザルツブルグ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ））中、４０℃でプレインキュベートした。３ｍＭの基質濃度でインキュベーションが起こるように、５０μｌの適当な酵素溶液を加えることによって反応を開始させた。典型的には、液体酵素試料、フレーバーザイム、コロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０希釈を使用した。乾燥スミザイムＦＰ製品のうち、１％溶液を使用した。
【００７５】
アミノ酸−ｐＮＡ結合の切断の結果として発生する、テカン・ゲニオスＭＴＰによって４０５ｎｍで測定した黄色を、少なくとも２０運動サイクルの間（約１０分間）追跡した。ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分として得られるデータを生じた。
【００７６】
［プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定］
測定を、アミノペプチダーゼアッセイと本質的に同じように行ったが、この場合は、Ｚ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡを唯一の基質として、３ｍｍｏｌ／ｌの終濃度で使用した。懸濁液をｐＨ６バッファー中５０〜５５℃で加熱することによって、この基質を可溶化させ、室温で透明な溶液を生じた。測定を４０℃で行った。
【００７７】
典型的には、液体酵素試料フレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰの１：５０希釈を使用した。スミザイムＦＰは１％溶液で使用した。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、典型的には、１：５０００希釈で使用した。
【００７８】
ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分としてデータを生じた。
【００７９】
［混入している非プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定］
この測定も、アミノペプチダーゼアッセイについて記載されているのと本質的に同じように行ったが、この試験においては、Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡを１：１の比および３ｍｍｏｌ／ｌの終濃度で基質として使用した。基質Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡは、使用したｐＨ６．０試験条件下で可溶性が乏しいことがわかったが、サブチリシンとの試験インキュベーションは、ｐＮＡ放出と同時の、基質の迅速な可溶化を生じた。測定は、４０℃で行った。しかしながら、この乏しい可溶性を補償するために、ＭＴＰリーダーをプログラムして、運動サイクルの間で振とうさせた。
【００８０】
ここでも、ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分としてデータを生じた。
【００８１】
［混入しているカルボキシペプチダーゼ活性の測定］
カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための感度の高い色素形成ペプチドが入手できないので、カルボキシペプチダーゼＣの定量のためのベーリンガープロトコールに基づき、方法を使用した。
【００８２】
２つの、エタノール中のＺ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒの１５０ｍｍｏｌ／ｌストック溶液を、０．１ｍｏｌ／ｌ ＢｉｓＴｒｉｓバッファーｐＨ６中で８０倍希釈して、Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒを１：１の比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ Ｚ−Ａ−Ｆ＋Ｚ−Ａ−Ｒ基質溶液を作製した。次いで、２００μｌの基質溶液を、ピペットでエッペンドルフバイアルに入れ、４０℃でプレインキュベートした。５０μｌの適当な酵素希釈を加えることによって、反応を開始させた。典型的には、フレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０希釈を使用した。スミザイムＦＰについては、１％溶液を使用した。５分後、２５０μｌのニンヒドリン試薬を加えることによって、反応を停止させた。ニンヒドリン試薬は、１５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた４００ｍｇのニンヒドリン（メルク（Ｍｅｒｃｋ））および６０ｍｇのヒドリンダンチンでできており、そこに５ｍｌの４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウムバッファーｐＨ５．２を加えた。４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウムバッファーは、ＬｉＯＨ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を溶解させ、その後氷酢酸（メルク）を用いて溶液のｐＨをｐＨ５．２に調節することによって、作製した。
【００８３】
反応を停止させた後、各試料を９５℃で１５分間加熱して、色形成を促進し、続いて、純粋なエタノールで１０倍希釈した。形成された色を、ユビコン（Ｕｖｉｋｏｎ）分光光度計において、５７８ｎｍで測定した。活性試料と同様にブランクを作製したが、ニンヒドリン試薬および酵素添加は逆転させた。カルボキシペプチダーゼ活性によって生じた遊離アミノ酸の量を定量するために、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンを用いて、較正曲線を作成した。０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．５および３．０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−フェニルアラニン（シグマ）を含有するバッファーｐＨ６中の溶液を、試料と同様に、すなわち２５０μｌバイアル中で処理した。得られたＯＤ５７８値から、エクセルで曲線を構築した。Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒ基質を含む試料中に存在する遊離アミノ酸の濃度を、この曲線を用いて計算した。得られた値から、試験した酵素の量あたりのμｍｏｌ／分でカルボキシペプチダーゼ活性を計算した。
【００８４】
［活性比の計算］
本発明による方法のための種々の酵素調製物の適合性を確立するために、関連性のある酵素活性の比率を計算した。ＭＴＰリーダーベースのアッセイにおいて、酵素活性は、経時的なｐＮＡ放出によって、すなわちΔＯＤ４０５／分として、特徴付けられる。ＭＴＰリーダーによって得られた酵素活性の比率を、単純に同一の量の酵素で得られたΔＯＤ／分値で割ることによって計算した。
【００８５】
しかしながら、カルボキシペプチダーゼアッセイの場合、ＭＴＰ−ｐＮＡベースのアッセイによって生じるΔＯＤ／分と直接比較できないＯＤが生じる。ここで、測定されたＯＤを、まず、１分間あたりに放出されたμｍｏｌアミノ酸（μｍｏｌ／分）に変換した。次いで、放出されたｐＮＡのΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換した。そのため、純粋なｐＮＡ（シグマ）の希釈０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２および０．０１５ｍｍｏｌ／ｌおよびＭＴＰリーダーで較正曲線を生じ、ウェルあたり２５０μｌを測定した。得られたデータから、エクセルで較正曲線を構築した。ｐＮＡベースの測定値をニンヒドリンベースの測定値と比較できるように、この較正曲線から、ΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換した。
【００８６】
上述の試験で生じたデータに基づいて、使用した種々の酵素調製物を、望ましいプロリン（およびアラニン）特異的活性ならびに混入しているエンドプロテアーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性に関して特徴付けた。各酵素調製物中に存在するプロリン特異的オリゴまたはエンド型タンパク質分解活性に関するデータを、表１中、「プロリン特異的活性」欄に示す。混入しているアミノペプチダーゼ活性（ＡＰ／プロリン特異的活性）、混入しているカルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ／プロリン特異的活性）および混入しているエンド型タンパク質分解活性（エンド／プロリン特異的活性）に関するデータを、存在するプロリン特異的活性に関して示す。各調製物中に存在する、混入しているカルボキシペプチダーゼ活性に関する、混入しているアミノペプチダーゼ活性のレベルを、（ＡＰ／ＣＰＤ）として示す。
【００８７】
試験した商業的酵素調製物のうち、任意のプロリン特異的オリゴまたはエンド型タンパク質分解活性を含むものがないことが明らかである。さらに、試験した全ての商業的酵素調製物は、相当な混入しているエンド型またはエキソ型タンパク質分解活性を含む。
【００８８】
【表１】
【００８９】
［実施例４］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きいタンパク質ならびに小さいペプチドを加水分解することができ、したがって真のエンドプロテアーゼである。
特異的な構造上の特性のために、Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼは、３０アミノ酸より大きいペプチドを消化することができない。この制限は、種々のタンパク質を可能な限り迅速かつ効率的に加水分解しなければならない酵素にとって明らかな不利益である。黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが、基質分子の大きさに関して同じ制限を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、黒色アスペルギルス由来の、クロマトグラフィーによって精製したプロリルエンドペプチダーゼを、小さい合成ペプチドとともに、および大きいオボアルブミン分子とともにインキュベートし、形成された加水分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９０】
使用した合成ペプチドは、配列ＮＨ２−ＦＲＡＳＤＮＤＲＶＩＤＰＧＫＶＥＴＬＴＩＲＲＬＨＩＰＲ−ＣＯＯＨの２７マーであり、ペップスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）社（オランダ、レリスタット（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から贈られた。そのアミノ酸配列によって示されるように、このペプチドは、２つのプロリン残基を、一方を中央に、一方をペプチドの最末端に含む。
【００９１】
インタクトなオボアルブミン分子（ピアス・イムジェクト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｊｅｃｔ）、２０ｍｇの凍結乾燥物質を含むバイアル）は、分子量が４２７５０Ｄａの、３８５アミノ酸からなる。この分子は、１４個のプロリン残基を含み、その一つは分子の最Ｃ末端に位置し、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって切断することができない。
【００９２】
オボアルブミンおよびオリゴペプチドを、精製された黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとともに、５０℃で別々にインキュベートした。いくらかの時間間隔で、試料を採取し、次いでそれをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。
【００９３】
４．５単位／ｍｌの活性を有する、クロマトグラフィーによって精製された黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、２０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸塩バッファーｐＨ４で１００倍希釈した。オボアルブミンを、酢酸塩バッファーｐＨ４中に、１ｍｇ／ｍｌ（２２μＭ）の濃度まで溶解させた。２７マーを、０．４８ｍｇ／ｍｌ（１５２μＭ）の濃度に達するまで、同じバッファー中に溶解させた。オボアルブミンおよび２７マー溶液のモル濃度を、両方の溶液が切断可能なプロリン残基の同じモル濃度を含むように選択した。オボアルブミンは、１３個の潜在的なプロリン切断部位を含むが、２７マーペプチドは、２つしか有さない。両方の基質溶液のうち、０．５ｍｌを、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）サーモミキサー中、５０℃で、１０μｌ（０．４５ミリＵ）の酵素溶液とともにインキュベートした。いくらかの時間間隔で、１０μｌの試料をインキュベーション混合物から採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで２０℃で維持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色に使用した全ての物質を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。製造業者の使用説明書に従ってＬＤＳバッファーを使用して試料を調製し、製造業者の使用説明書に従ってＭＥＳ−ＳＤＳバッファー系を使用して、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。染色は、シンプリー・ブルー・セイフ・ステイン（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ）（コロイド状クマシーＧ２５０）を使用して行った。
【００９４】
図３に見られるように、オボアルブミンは、アスペルギルス由来酵素によって、インキュベーションの最初の４．７５時間で約３５〜３６ｋＤの別個のバンドに切断される（レーン３）。長期のインキュベーション期間によって、種々の分子量の、より小さい生成物への、さらなる分解が生じる（レーン７）。
【００９５】
レーン２と比較して、レーン４、６および８の、よりかすかなバンドによって判断されるように、２７マーペプチドもまた分解する。生成物の、非常に小さい分子量変化（レーン９および８を比較）は、ペプチドのカルボキシ末端でのアルギニン残基の切断による可能性が最も高い。差は約２００Ｄ（アルファイメージャー（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）２０００システムでアルファイメージャー３．３ｄソフトウエアを使用して測定）であり、アルギニンは、１７４の分子量を有する。この小さい分子量変化は、おそらくは、ペプチドの分解における最初の段階である。
【００９６】
生成物のさらなる崩壊はまた、ＳＤＳゲルでのバンドの強度の減少によってのみ見られる。ゲルにおいて、約１０００の分子量を有する成分の染色はクマシーブリリアントブルーでは可能でないので、さらなる崩壊の生成物は目に見えない。
【００９７】
この実験から、Ｓ９ファミリーに属する公知のプロリルオリゴペプチダーゼとは異なり、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、より大きいタンパク質と比べて、小型のペプチドの切断に対して特異的選択性を有さないと結論付けることができる。このように、黒色アスペルギルス由来酵素は真のエンドプロテアーゼを表し、種々の型のタンパク質を加水分解するための好ましい酵素である。この発見は、以下の実施例に示されるような、酵素の驚くべき使用につながる。
【００９８】
［実施例５］
［カゼイン酸カリウムを黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼとともにインキュベートすることによってＩＰＰおよびＬＰＰが迅速に生じるが、ＶＰＰは生じない］
この実験において、黒色アスペルギルス由来の、過剰産生された、本質的に純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼを、カゼイン酸カリウムとともにインキュベートして、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰの遊離を試験した。使用したエンドプロテアーゼは、本質的に純粋であり、純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンド型タンパク質分解活性（すなわち、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端の切断）以外の有意なエンド型タンパク質分解活性が存在しないことを意味する。さらに、酵素調製物は、実施例３に記載されるように、有意なエキソ型タンパク質分解活性が全くない。
【００９９】
ＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウム取り込みを可能な限り限定するために、カゼイン酸カリウムを、このインキュベーションにおいて基質として使用した。
【０１００】
カゼイン塩を、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度で６５℃の水に懸濁し、その後、リン酸を用いてｐＨを６．０に調節した。次いで、懸濁液を５５℃まで冷却し、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、４単位／ｇのタンパク質の濃度で加えた（単位定義については、材料および方法の項参照）。継続的な撹拌下で、この混合物を２４時間インキュベートした。この期間に、さらなるｐＨ調節は行わなかった。１、２、３、４、８および２４時間のインキュベーション後に試料を採取した。各試料について、試料を９０℃まで５分間迅速に加熱することによって、酵素活性を終了させた。冷却後、リン酸を用いて各試料のｐＨを４．５まで迅速に低下させ、その後、ヘレウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）卓上遠心分離機中で懸濁液を５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。完全に透明な上清を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＣ分析に使用して、上清中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦを定量した（材料および方法の項参照）。
【０１０１】
牛乳カゼインは、β−カゼインおよびκ−カゼインを含むいくつかの異なるタンパク質を組み込む。公知のアミノ酸配列によると、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。β−カゼインにおいて、ＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−中に含まれ、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−中に含まれ、ＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−中に含まれる。κ−カゼインは、酸沈殿カゼイン塩調製物中にほとんど５０％のβ−カゼイン濃度のモル濃度で存在し、ＩＰＰのみを包含する。κ−カゼインにおいて、ＩＰＰは、配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−中に含まれる。カゼインの他のタンパク質成分は、ＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含まない。
【０１０２】
表２および３は、インキュベーション混合物に添加したカゼイン酸カリウム１グラムあたりで計算した、酸性化および遠心分離された上清中に存在するペプチドの濃度を示す。表２に示されるように、ＩＰＰは、１時間のインキュベーション後にその最大濃度に達する。その上、ＩＰＰ濃度はさらに増大はしない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成は、ＩＰＰの生成と同じ速度論を示す。理論的に期待されるように、ＶＶＶＰＰのモル収率は、ＬＰＰペプチドのモル収率と同様である。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの両方の収率は、理論的に実行可能なもののほとんど６０％に達する。３時間のインキュベーションの後にのみＬＰＰの最大濃度に達するということから、β−カゼイン分子のその特定の部分の切断が、おそらくは、いくらか、より難しいことが示唆される。ＶＶＶＰＰと対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦは、全く形成されない。この観察から、プロリン特異的エンドプロテアーゼが、−Ｐ−Ｆ−結合を効率的に切断し、それによってＶＶＶＰＰを生じることが示唆される。トリペプチドＩＰＰは、迅速に形成されるが、そのモル収率は、ＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれの最大モル収率の約３分の１も超えない。ＩＰＰトリペプチドは、κ−カゼインのように両方のβ−カゼイン中に含まれるので、この結果は予想外である。この観察についての可能性のある説明は、プロリン特異的プロテアーゼがＩＰＰを生じることができるが、カゼイン塩のκ−カゼイン部分からのみであるということである。κ−カゼインの関連性のあるアミノ酸配列に関して、このことから、−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合が、酵素のアラニン特異的活性によって切断されることが示唆される。これが正しければ、遊離するＩＰＰの量は、κ−カゼイン中に存在する量のおよそ４０％に達するが、β＋κカゼイン中に理論的に存在するＩＰＰの約１０％を超えない。ＩＰＰの切断のためのこの切断機序はまた、なぜＶＰＰがその前駆体分子ＶＶＶＰＰから形成されることができないかを説明する。必要なエンド型タンパク質分解活性が、単純に、使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物中に存在しない。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
［実施例６］
５倍濃度のＡＣＥ阻害ペプチドにおける酸カゼイン沈殿工程結果の組み込み
実施例５に記載されているように、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度のカゼイン酸カリウムを、ｐＨ６．０での黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションに供した。種々のインキュベーション期間の後、試料を加熱してさらなる酵素活性を停止させ、その後、ｐＨを４．５まで低下させて、カゼイン可溶性を最小限にした。低速遠心分離によって不溶性カゼイン分子を除去した。表２および３において、本発明者らは、１０％タンパク質の初期濃度に基づいて計算したＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供している。しかしながら、酸性化およびその後の遠心分離工程の結果として、加えたタンパク質の大部分が除去されている。これらの減少した酸性化上清のタンパク質含有量を考慮して、窒素（ケルダール）分析を行った。後者のデータによると、種々の上清が、表４に示されるタンパク質レベルを含むことが見出された。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、各上清中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算したが、このとき、それらの実際のタンパク質含有量を使用した。これらの再計算したデータを表５に示す。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
表３および５に示されるデータの比較は、単純な酸性化工程、それに続く産業上実行可能な傾瀉、ろ過または低速遠心分離工程によって、特定のＡＣＥ阻害ペプチドの濃度の５倍の増大が生じることを明らかに示す。
【０１１０】
［実施例７］
［濃縮カゼイン加水分解物中の新規および潜在的ＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定］
存在する対生物作用ペプチドのより徹底的な分析を容易にするために、純粋な黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼでの消化によって得られ、酸沈殿によって精製されたカゼイン加水分解物を、調製用規模で調製した。そのため、３０００ｇのカゼイン酸カリウムを２５リットルの７５℃の水に懸濁した。徹底的な均質化の後、稀リン酸を用いてｐＨをゆっくり６．０に調節した。５５℃まで冷却した後、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、４酵素単位／ｇカゼイン塩の濃度で加えた（単位定義については、材料および方法の項参照）。３時間、５５℃でのインキュベーション（撹拌しながら）の後、濃リン酸をゆっくり加えることによって、ｐＨを４．５まで低下させた。このより大規模な調製において、プロセスのこの部分で、プロリン特異的エンドプロテアーゼを不活化するための熱処理工程を省いた。次いで、懸濁液を迅速に４℃まで冷却し、一晩（撹拌せずに）この温度で維持した。翌朝、透明な上層を傾瀉し、４０％乾燥物質のレベルに達するまで蒸発させた。後者の濃縮液を４秒間１４０℃でのＵＨＴ処理に供し、次いで、５０℃で限外ろ過した。微生物ろ過の後、液体を噴霧乾燥した。この物質を、以下、カゼイン由来対生物作用ペプチド（ＣＤＢＡＰ）と呼ぶ。材料および方法の項で概説したＬＣ／ＭＳ手順を用いて、粉末状生成物のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含有量を測定した。窒素含有量によると、粉末状生成物は、約６０％のタンパク質含有量を有する（６．３８の換算係数を使用する）。粉末のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含有量を表６に示す。ＣＤＢＡＰ生成物のアミノ酸組成を表７に示す。酸沈殿の後得られた噴霧乾燥物質のモルプロリン含有量の増大が極めて顕著である：最初の１２％からおよそ２４％まで。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
同定のために、アットラインＡＣＥ阻害アッセイおよび質量分析と組み合わせた２次元クロマトグラフィー分離を用いることによって、ＣＤＢＡＰ中の新規のＡＣＥ阻害ペプチドの存在を調査した。第一の分析において、ペプチド混合物をＯＤＳ３液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムで分離し、得られた種々の画分からＡＣＥ阻害プロフィールを生成した。第二の分析において、高いＡＣＥ阻害を示す第一のカラムからの画分を、異なるグラジエントプロフィールを用いてバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）ＬＣカラムでさらに分離した。この第二のカラムから収集した画分を２つの部分に分けた。一方の部分をアットラインＡＣＥ阻害測定に使用し、他方の部分をＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析に供して、存在するペプチドを同定した。
【０１１４】
全ての分析は、二重追跡ＵＶ検出器を備えたアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９５ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ、オランダ、エテン・ルール（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を用いて行った。ペプチドの同定のために、ＨＰＬＣシステムを、同じ供給業者からのＱ−ＴＯＦ質量分析計に結合させた。試験において、ミリＱ水中のＣＤＢＡＰの２０μｌの１０％（ｗ／ｖ）溶液を、５μｍの粒子径の１５０×２．１イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）５ ＯＤＳ３カラム（バリアン、オランダ、ミデルビュルフ（Ｖａｒｉａｎ，Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））上で注入した。移動相Ａは、ミリＱ水中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡ溶液からなった。最初の溶離剤組成は１００％Ａであった。溶離剤は、５分間１００％Ａであり続けた。次いで、１０分で５％Ｂへの線状のグラジエント、続いて１０分間で３０％Ｂへの線状のグラジエントが開始した。Ｂの濃度を５分間で７０％に上げることによってカラムを洗い流し、さらに５分間７０％Ｂで維持した。この後、溶離剤を１分間で１００％Ａに変化させ、９分間平衡化させた。総実行時間は５０分であった。溶離剤流出は０．２ｍｌ分−１であり、カラム温度は６０℃に設定した。ＵＶクロマトグラムを２１５ｎｍで記録した。１分の間隔を用いて溶出液画分を９６ウェルプレートに収集し、２００μｌの画分体積を生じた。ウェル中の溶離剤を、８０μｌの、水酸化アンモニウムの０．０５％水溶液（２５％）を加えることによって中和した。乾燥するまで溶媒を窒素下５０℃で蒸発させた。この後、残渣を４０μｌのミリＱ水中で再構成させ、１分間混合した。
【０１１５】
アットラインＡＣＥ阻害アッセイのために、２７μｌの、２６０ｍＭの塩素濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の３３．４ｍＵ ｍｌ−１ＡＣＥ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得られた酵素）を加え、混合物を９６ウェルプレートミキサーで５分間、７００ＲＰＭでインキュベートした。インキュベーション期間の後、１３μｌの、ＰＢＳバッファー中の０．３５ｍＭ馬尿酸−ヒスチジン−ロイシン（ＨＨＬ）溶液を加え、７００ＲＰＭで１分間混合した。混合物を、ＧＣオーブン中５０℃で６０分間反応させた。反応の後、融解する氷中でプレートを冷却した。
【０１１６】
次いで、９６ウェルプレートをフラッシュＨＰＬＣカラムで分析した。各ウェルの反応混合物のうち、３０μｌを、同じ供給業者からの１０×４．６ｍｍ ＲＰ１８ｅガードカラムを備えたクロムリスフラッシュ（Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ）ＲＰ１８ｅ ２５×４．６ｍｍ ＨＰＬＣカラム（メルク、ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））上で注入した。アイソクラチック移動相は、水／アセトニトリル７９／２１中のＴＦＡの０．１％溶液からなった。溶離剤流出は２ｍｌ 分−１であり、カラム温度は２５℃であった。１分の間隔で注入を行った。馬尿酸（Ｈ）およびＨＨＬを、２８０ｎｍでモニタリングした。ＨおよびＨＨＬのピークの高さを測定し、各画分のＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）を、等式：
【数１】
に従って計算した。
被分析物のＡＣＥＩαパーセンテージ阻害
Ｄｃｗ 水中の、ＡＣＥによる、ＨＨＬのＨおよびＨＬへの切断の程度
Ｄｃａ 被分析物についてのＨＨＬのＨおよびＨＬへの切断の程度
【０１１７】
Ｈのピークの高さをＨおよびＨＨＬのピークの高さの合計の分数として表すことによって、切断の程度を計算した。
【０１１８】
１８〜２６分の間に溶出している画分中で最も高いＡＣＥ阻害を測定した。この領域を収集し、３μｍの粒子径の１５０×２．１ｍｍバイオスイートカラム（ウォーターズ、オランダ、エテン・ルール（Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））上で再注入した。移動相Ａは、ここでは、ミリＱ水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂは、メタノール中の０．１％ＦＡ溶液からなった。最初の溶離剤組成は１００％Ａであった。溶離剤は５分間１００％Ａであり続けた。この後、１５分間で５％Ｂへの線状グラジエントが、続いて３０分間で６０％Ｂへの線形グラジエントが開始した。溶離剤は、さらに５分間６０％Ｂであり続けた。最終的に、溶離剤は１分間で移動相Ａの１００％に減少し、１０分間平衡化させた。総実行時間は６５分であった。溶離剤流出は０．２ｍｌ 分−１であり、カラム温度は６０℃に設定した。
【０１１９】
ＵＶ追跡を２１５ｎｍで記録した。バイオスイートカラムから１０秒の間隔で画分を収集した。画分を再び２つの部分に分け、一方の部分を用いて、先に記載したアットラインＡＣＥ阻害方法を用いて活性を測定し、他方の部分を用いて、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳを用いて活性ペプチドを同定した。
【０１２０】
３２６．２０８０Ｄａの分子イオンのクロマトグラフィーピークならびに３３０．２０２９Ｄａおよび３１８．１４８８Ｄａの分子イオンの２つの他のピークは、１８〜２６分の間の面積で測定した、増大したＡＣＥ阻害に対応した。ＭＳ−ＭＳを用いて、これらのペプチドを、それぞれ構造異性体ＩＰＰおよびＬＰＰ（−０．６ｐｐｍ）、ＩＴＰ（−４．８ｐｐｍ）ならびにＭＡＰ（＋２．８ｐｐｍ）として同定した。ペプチドのタンパク質源は、κ−カゼインｆ１０８−１１０（ＩＰＰ）、β−カゼインｆ１５１−１５３（ＬＰＰ）、α−ｓ２−カゼインｆ１１９−１２１（ＩＴＰ）およびβ−カゼインｆ１０２−１０４（ＭＡＰ）である。ＩＰＰおよびＬＰＰは、以前に、それぞれ５および９．６μＭのＩＣ５０値を有するＡＣＥ阻害ペプチドとして報告されている（Ｙ．ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）、Ｍ．ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）、Ｋ．サカイ（Ｓａｋａｉ）、Ａ．オオクボ（Ｏｋｕｂｏ）、Ｓ．ヤマザキ（Ｙａｍａｚａｋｉ）、Ｔ．タカノ（Ｔａｋａｎｏ）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８（１９９５年）７７７〜７８３頁、Ｙ．アリョシ（Ａｒｙｏｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（１９９３年）１３９〜１４４頁）。しかしながら、トリペプチドＩＴＰおよびＭＡＰは、本発明者らの知る限りでは、能力のあるＡＣＥ阻害ペプチドとして、これまでに報告されていない。
【０１２１】
ＭＡＰ、ＩＴＰおよびＩＰＰを、化学的に合成し、各ペプチドの活性を、本明細書中で後述する改変マツイアッセイを用いて測定した。
【０１２２】
正イオンエレクトロスプレー、多重反応モニタリングモードで稼働するマイクロマスクアトロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ）ＩＩ ＭＳ装置で、種々の試料中のＭＡＰおよびＩＴＰの定量を行った。使用したＨＰＬＣ方法は、上述したものと同様であった。ＭＳ設定（ＥＳＩ＋）は以下の通りであった。コーン電圧３７Ｖ、キャピラリー電圧４ｋＶ、３００ｌ／時間の乾燥気体窒素。供給源および噴霧器温度：それぞれ１００℃および２５０℃。合成ペプチドを使用し、ＭＡＰについては前駆体イオン３１８．１ならびに合計生成物イオン２２７．２および３４７．２を用いて、ＩＴＰについては前駆体イオン３２０．２ならびに合計生成物イオン２８２．２および５０１．２を使用して、較正線を準備した。これらの分析によると、新規のＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ＣＤＢＡＰ生成物中に、２．９ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰまたは４．８ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ中のタンパク質および０．９ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ、１．４ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ中のタンパク質で存在する。
【０１２３】
ＭＡＰおよびＩＴＰのＡＣＥ阻害活性を測定するために、化学的に合成したトリペプチドを、いくらかの小さな改変とともに、マツイら（マツイ（Ｍａｔｓｕｉ），Ｔ．ら（１９９２年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：５１７〜５１８頁）の方法に従ってアッセイした。種々のインキュベーションを表８に示す。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
４つの試料のそれぞれは、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２５０ｍＭのホウ酸塩溶液、ｐＨ８．３に溶解した７５μｌの３ｍＭ馬尿酸ヒスチジンロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、シグマケミカル）を含んだ。ＡＣＥをシグマケミカルから得た。混合物を３７℃でインキュベートし、３０分後に、１２５μｌの０．５Ｍ ＨＣｌを加えることによって停止させた。続いて、２２５μｌのビシン／ＮａＯＨ溶液（１Ｍ ＮａＯＨ：０．２５Ｍビシン（４：６））を加え、その後２５μｌの０．１Ｍ ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、フルカ、スイス（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４中）を加えた。３７℃で２０分間のインキュベーション後、０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４中の４ｍｌの４ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３を加え、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＣＰＳコントローラを有する、シマヅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＶ−１６０１、オランダ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で４１６ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１２６】
ＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）活性の量を、以下の式に従って、阻害薬なしでのＡＣＥの転換速度と比較した阻害のパーセンテージとして計算した。
ＡＣＥＩ（％）＝（（対照１−対照２）−（試料１−試料２））／（対照１−対照２））＊１００
式中、
対照１＝ＡＣＥ阻害成分なしでの吸光度（＝最高ＡＣＥ活性）［ＡＵ］
対照２＝ＡＣＥ阻害成分なしおよびＡＣＥなしでの吸光度（バックグラウンド）［ＡＵ］
試料１＝ＡＣＥおよびＡＣＥ阻害成分ありでの吸光度［ＡＵ］
試料２＝ＡＣＥ阻害成分ありだがＡＣＥなしの吸光度［ＡＵ］
【０１２７】
得られた、化学的に合成されたＭＡＰおよびＩＴＰトリペプチドのＩＣ５０を、実験のスクリーニング期に使用されるアットライン測定において得られたＩＣ５０値とともに表９に示す。種々の測定のための内部標準として、化学的に合成されたＩＰＰの測定が含まれた。
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
［実施例８］
新規のＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ヒト胃腸管内で残存するようである。
消費後、食物タンパク質およびペプチドは、胃腸管内で種々の消化酵素処理に曝露される。ヒト胃腸管内での、新しく同定された対生物作用ペプチドの安定性を評価するために、ＣＤＢＡＰ調製物（実施例７に記載されているように調製した）を、人体で典型的に見られる消化条件をシミュレートする胃腸処理（ＧＩＴ）に供した。ＧＩＴモデルシステムにおいて種々のインキュベーション時間の後に得られた試料を、オンラインＨＰＬＣ−バイオアッセイ−ＭＳまたはＨＲＳ−ＭＳシステムを用いて分析して、任意の残ったＭＡＰおよびＩＴＰペプチドを定量した。１００ｍｌフラスコを組み込んだ標準化された混合装置（バンケル、米国（Ｖａｎｋｅｌ，ＵＳ）によって供給されるような）においてＧＩＴ手順を行った。水浴の温度を３７．５℃に設定し、撹拌棒速度を、試料が懸濁液で維持されるように選択した（１００ｒｐｍ）。
【０１３０】
約３．４ｇのＣＤＢＡＰ（およそ６０％のタンパク質レベル）を、１００ｍｌのミリＱ水に溶解／懸濁した。胃のシミュレーションの間、５Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを低下させた。胃のシミュレーションの終わりおよび十二指腸期の間に、５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを上昇させた。
【０１３１】
ＣＤＢＡＰ懸濁液を３７．５℃まで予熱し、５ｍｌの懸濁液を除去して、０．３１ｇのペプシン（フルカ 注文番号７７１６１）を溶解させた。ｔ＝０分で、ここで溶解されたペプシンを含む５ｍｌを懸濁液に戻し加えた。次いで、以下の概要に従って、別々のｐＨメーターを用いて、手作業でＣＤＢＡＰ懸濁液のｐＨをゆっくり調節した。
ｔ＝２０分 ｐＨを３．５まで低下させる
ｔ＝４０分 ｐＨを３．０に
ｔ＝５０分 ｐＨを２．３に
ｔ＝６０分 ｐＨを１．８に
ｔ＝６５分 ｐＨを２．７に上昇させる
ｔ＝７５分 ｐＨを３．７に
ｔ＝８０分 ｐＨを５．３に
ｔ＝９０分で、別の５ｍｌのＣＤＢＡＰ懸濁液中で０．１３９ｇの８倍ＵＳＰパンクレアチン（シグマ 注文番号Ｐ７５４５）を注意深く混合し、直ちに戻し加えた。インキュベーションを、以下の概要に従って継続した。
ｔ＝９３分 ｐＨを５．５に
ｔ＝９５分 ｐＨを６．３に
ｔ＝１００分 ｐＨを７．１に
ｔ＝１２５分で実験を停止し、ｐＨを調べた（依然としてｐＨ７であった）。
【０１３２】
次いで、試料をビーカーに移し、沸騰するまでマイクロ波中に置いた。続いて、試料をガラスチューブに移し、９５℃で６０分間インキュベートして、全てのプロテアーゼ活性を不活化した。冷却後、試料をファルコンチューブに移し、３０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を凍結乾燥した。得られた粉末の総Ｎ濃度を測定し、カゼインのケルダール係数（６．３８）を用いてタンパク質レベルに変換した。これらのデータによると、ＧＩＴ手順の後のＣＤＢＡＰ調製物のタンパク質レベルは４８．４％であった。ＧＩＴ手順によるタンパク質分解処理にもかかわらず残存するＭＡＰおよびＩＴＰのレベルを、実施例７に記載されているように測定し、得られたデータを表１０に示す。
【０１３３】
実験の結果によると、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方が、ＧＩＴ消化に対して高い抵抗性を示す。これらのトリペプチドの低いＩＣ５０値と組み合わせて（実施例７においても測定されるように）、データから、２つの新規のＡＣＥ阻害ペプチドの、血圧降下ペプチドとしての相当な可能性が示唆される。
【０１３４】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨのグラフ表示。
【図２】黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの特異性プロフィール。
【図３】クロマトグラフィーによって精製した黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションの後の、インタクトなオボアルブミンおよび合成２７マーペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、新規ペプチドの生成に関する。
【０００２】
［背景技術］
高血圧症は、ヒトにおける比較的一般的な病状であり、心臓血管疾患、腎不全および脳卒中の、流行性の危険因子を引き起こす。カルシウム遮断薬、β遮断薬、利尿薬、α遮断薬、中心的なαアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩアンタゴニストおよびＡＣＥ阻害薬等の多くの医薬品の利用可能性は、高血圧症の基礎にある生理学的機序が多面的であることを示す。
【０００３】
高血圧症の生理学的機序のうち、特にレニン−アンジオテンシン機序は、多くの科学的注目を受けている。この機序において、アンジオテンシンは肝臓によって分泌され、ペプチダーゼであるレニンによって切断されて、生物学的に不活性なデカペプチドであるアンジオテンシンＩを生じる。アンジオテンシンＩが肺毛細血管を通過すると、アンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと呼ぶ）と呼ばれる別のペプチダーゼが、アンジオテンシンＩの最後の２つの残基（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を除去することによって、アンジオテンシンＩに作用して、オクタペプチドであるアンジオテンシンＩＩを形成する。アンジオテンシンＩＩオクタペプチドは、強力な血管収縮活性を示し、したがって、血圧を上昇させる。より低いレベルのアンジオテンシンＩＩにつながるＡＣＥ阻害は、血管収縮を防ぎ、そのため高血圧を防ぐ。
【０００４】
アンジオテンシンＩを切断する他に、ＡＣＥはまた、同様に血圧調節に関与するノナペプチドであるブラジキニンを加水分解することもできる。後者の機序において、ＡＣＥ阻害は、血管拡張を促進し、同様に血圧を降下させる、ブラジキニンレベルの増大につながる。ＡＣＥを阻害することは、このようにして、少なくとも２つの別々の機序によって、血圧降下効果につながる。
【０００５】
オクタペプチドであるアンジオテンシンＩＩが副腎皮質によるアルドステロンの放出を刺激することもまた、公知である。アルドステロンの標的器官は腎臓であり、ここでアルドステロンは、腎細尿管からのナトリウムの再吸収の増大を促進する。この第三の機序によっても、ＡＣＥ阻害は血圧を減少させるが、この場合はナトリウム再吸収を減少させることによって減少させる。
【０００６】
その多重的な生理学的効果のために、ＡＣＥのタンパク質分解活性を阻害することは、血圧を抑制する有効な方法である。この観察から、カプトプリルおよびエナラプリル等のいくつかの有効な血圧降下医薬品が生じた（オンデッティ（Ｏｎｄｅｔｔｉ），Ｍ．Ａ．ら、１９７７年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）、１９６、４４１〜４４４頁）。
【０００７】
高血圧症は比較的一般的な病状なので、現代の生活様式の、この望ましくない結果を、穏やかに活性のある天然成分で相殺することは、有利である。特に、穏やかに活性のある天然成分は、かかる製品は定期的に消費されるので、食品または飲料に組み込むことができる。あるいは、かかる穏やかに活性のある天然成分は、栄養補助食品に組み込むことができるであろう。過去数十年の間に、発酵乳中に存在する特異的ペプチドがＡＣＥ阻害能力を有し、高血圧症被験者において血圧低下を引き起こすことができることが発見されている。最近では、多くのインビトロおよび少数の動物試験から、種々のタンパク質源から得られた種々のペプチドのＡＣＥ阻害効果が示されている。インビトロＡＣＥ阻害アッセイからは多くの種々のペプチド配列が明らかになっているが、ＡＣＥ阻害ペプチドは、血液中を循環させてインビボ効果を発揮させる必要があることを、強調しなければならない。効果的なＡＣＥ阻害ペプチドは、胃腸内タンパク質分解性消化系による分解に抵抗するべきであり、それに続く腸壁を越える輸送の間にインタクトなままであるべきであるようである。
【０００８】
種々のＡＣＥ阻害ペプチドの構造機能研究から、それらがしばしばそれらのＣ末端配列にＰｒｏ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｌａ−Ｈｙｐを有することが示唆されている（マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ），Ｓ．およびスズキ（Ｓｕｚｕｋｉ），Ｈ．、１９８２年、Ａｇｒｉｃ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、４６（５）：１３９３〜１３９４頁）。この発見は、ＡＣＥが、プロリンを伴うペプチド結合を切断することができないペプチジルジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）であることによって、部分的に説明される。したがって、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合は切断することができないので、構造Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するトリペプチドから、ジペプチドＰｒｏ−Ｐｒｏを除去することはできない。したがって、比較的高濃度で存在する場合、Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ構造を有するトリペプチドは、ＡＣＥ活性を阻害するであろうと考えることができる。ＡＣＥのみでなく、ほぼ全てのタンパク質分解酵素はＸａａ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ結合を切断するのが難しいので、ペプチドのカルボキシ末端での（複数の）プロリン残基の存在によって、比較的プロテアーゼ耐性の分子が生じるという考えは、ほとんど自明である。同様に、プロリンの代わりにヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含むペプチドは、比較的プロテアーゼ耐性である。このことから、そのカルボキシ末端に１つ以上の（ヒドロキシ）プロリン残基を保有するペプチドは、胃腸管におけるタンパク質分解を免れるようであると推論することができる。これらの結論は、特異的ＡＣＥ阻害ペプチドの顕著なインビボ血圧降下効果を理解する助けとなるであろう。これらはＡＣＥ阻害の構造上の要件を満たすだけでなく、胃腸内のタンパク質分解性消化系による分解に抵抗し、それに続く腸壁を越える輸送の間、インタクトなままである。
【０００９】
トリペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＪＰ０２３６１２７）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＥＰ０５８３０７４）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７８：７７７〜７８３頁１９９５年））について、強力なＡＣＥ阻害活性が報告されている。最初に、全てのＡＣＥ阻害ペプチドは、ＡＣＥ活性に対するそれらのインビトロ効果に基づいて特徴付けられ、トリペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＩＰＰと呼ぶ）Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＶＰＰと呼ぶ）およびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以下ＬＰＰと呼ぶ）が、比較的低いＩＣ５０値を生じる、それらの強力なＡＣＥ阻害効果のために、抜きん出ていた。後に、トリペプチドＶＰＰならびにＩＰＰの、推定される降圧効果を、自然発症高血圧ラットにおいて確かめることができた（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．、７８：１２５３１２５７（１９９５年））。これらの実験において、阻害トリペプチドは、乳酸菌発酵乳に由来した。乳発酵の間、望ましいペプチドは、増殖する乳酸菌によって産生されるプロテイナーゼによって生成される。ＡＣＥ阻害ペプチドは、電気透析法、中空線維膜透析またはクロマトグラフィー法の後に発酵乳製品から濃縮されて、錠剤またはロゼンジ等の、濃縮された栄養補助食品の形態での、それらの市場売買を可能にしている。
【００１０】
［発明の概要］
本発明は、新規トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰの塩を含むタンパク質加水分解物に関する。好ましくは、タンパク質加水分解物は、５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％のＤＨ、および最も好ましくは２０〜３５％のＤＨを有する。さらに、本発明は、ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰの塩を含むペプチド混合物に関する。好ましくは、このペプチド混合物は、少なくとも１ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含む。好ましくは、ペプチド混合物はまた、ＬＰＰおよび／またはＩＰＰを含む。したがって、ペプチド混合物はまた、好ましくは、少なくとも１ｍｇのＩＰＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含み、ならびに／またはペプチド混合物はまた、好ましくは少なくとも１ｍｇのＬＰＰ／ｇタンパク質、より好ましくは少なくとも２ｍｇ／ｇおよび最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｇタンパク質を含む。
【００１２】
このペプチド混合物は、好ましくは、５００Ｄａ未満の分子量を有する少なくとも３０重量％（乾燥物質）のペプチドを含み、より好ましくは、ペプチド混合物の３５〜７０重量％（乾燥物質）は、５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドである。
【００１３】
さらに、本発明は、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを生成するための、好ましくはタンパク質源の酵素加水分解による、酵素によるプロセスに関する。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本願に記載されているように、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ＡＣＥの阻害において非常に有効である。これらの阻害効果は、本明細書中の実験部分で判定すると、それぞれＭＡＰで０．４およびＩＴＰで１０（μＭで）の、驚くほど低いＩＣ５０値に対応する。さらに、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方のトリペプチドは、胃腸内タンパク質分解に抵抗し、したがって、ヒト腸管において安定であると期待されることがわかる。したがって、トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはトリペプチドＩＴＰならびにそれらの塩は、有効なＡＣＥ阻害に非常に適しており、例えば、栄養補助食品または薬剤として、機能性食品中で使用することができる。用語、栄養補助食品は、本明細書中で使用される場合、栄養および薬学的適用分野の両方における有用性を意味する。したがって、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む新規の栄養補助食品組成物は、食物および飲料への栄養補給物として、ならびにカプセル剤もしくは錠剤等の固体製剤、または溶液もしくは懸濁液等の液体製剤であってもよい経腸または非経口適用のための薬学的製剤または薬剤としての、使用を提供することができる。
【００１５】
トリペプチドＭＡＰ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）およびＩＴＰ（Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）は、化学的合成、酵素加水分解およびタンパク質含有溶液の発酵を含む種々の方法によって、作製することができる。
【００１６】
タンパク質加水分解物または発酵に起因する液体等の複雑な混合物中の生物活性ペプチドの同定は、難しい課題である。基本的な疑問、正しいタンパク質基質を使用しているかどうか、正しい酵素を使用しているかどうか、正しい微生物培養物を使用しているかどうか、の他に、いくつかの生物活性ペプチドが、数千ものペプチドを含む複雑な試料中に存在すると期待することができる。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分画の反復サイクルおよび生化学的評価を使用する伝統的な同定アプローチは、一般に、時間がかかり、存在する生物活性ペプチドを失って関連性のある対生物作用の検出を非常に難しくしがちである。本研究において、非常に洗練された装置を使用し、多くの異なるタンパク質加水分解物および発酵ブロスをスクリーニングし、最終的には、ＡＣＥ阻害特性を有する２つの新規のペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定につながった。本発明者らのアプローチにおいて、連続フロー生化学アッセイをオンラインでＨＰＬＣ分画システムに結合させた。ＨＰＬＣカラム流出を連続フローＡＣＥバイオアッセイと化学的分析技術（質量分析）との間で分割した。粗加水分解物および発酵ブロスをＨＰＬＣによって分離し、その後、生物活性化合物の存在を、オンラインの生化学アッセイによって検出した。生化学アッセイでペプチドが陽性のシグナルを示した場合に構造的情報が直ちに利用可能であるように、質量スペクトルを連続的に記録した。
【００１７】
上述のアプローチによって同定されるトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰを、経済的に実現性のある生成経路を含む種々の方法によって生成することができる。化学的合成による生成は、例えばＮ．シューワルト（Ｓｅｗａｌｄ）およびＨ．Ｄ．ヤクブケ（Ｊａｋｕｂｋｅ）編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨによる「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２００２年、第４章に記載されているような従来の技術を用いて可能である。大規模生産に適した化学的ペプチド合成の、具体的な費用効果の高い方法は、Ｃ末端保護のためのメチルエステルおよびＮ−保護のためのベンジルオキシカルボニル（Ｚ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用と組み合わされた、カルボキシル基の活性化のためのアルキルクロロホルメートまたは塩化ピバロイルの使用に基づく。例えば、ＭＡＰの場合、Ｌ−プロリンメチルエステルを、イソブチルクロロホルメート活性化Ｚ−Ａｌａと結合させることができる。得られたジペプチドは、Ｃ上で水素およびＰｄを用いた水素化分解によってＺ−脱保護することができ、イソブチルクロロホルメート活性化Ｚ−Ｍｅｔと再度結合させることができる。得られたトリペプチドのうち、ＮａＯＨを用いてメチルエステルを加水分解し、水素化分解によるＺ−脱保護の後、トリペプチドＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏが得られる。同様に、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏを合成することができるが、カップリング反応の間、Ｔｈｒのヒドロキシ官能基はベンジル保護を必要とする。最終的な工程において、次いで、Ｚ−脱保護の間にこの基は同時に除去される。
【００１８】
ＭＡＰおよび／またはＩＴＰはまた、アミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む任意のタンパク質基質を用いて、酵素加水分解によって、または発酵アプローチによって作製することができる。有利には、タンパク質基質は、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方の断片を含む。かかる酵素または発酵のアプローチのための好ましいタンパク質基質は、乳、または牛乳のカゼイン画分である。発酵または加水分解条件の最適化によって、生物活性分子ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの生成を最大化することができる。生成を最大化しようとする当業者は、加水分解／発酵時間、加水分解／発酵温度、酵素／微生物種類および濃度等のプロセスパラメータを調節のし方を知るであろう。
【００１９】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰを含む組成物は、有利には、加水分解物であり、好ましくは、以下の工程を伴うプロセスに従って作製される。
（ａ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む加水分解されたタンパク質生成物を生じる、そのアミノ酸配列中にＭＡＰまたはＩＴＰを含む適したタンパク質基質の酵素加水分解
（ｂ）トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰに富んだ画分の、加水分解されたタンパク質生成物からの分離、ならびに、場合により、
（ｃ）工程ｂ）の画分を濃縮および／または乾燥して、トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰに富んだ、濃縮された液体または固体を得ること。
【００２０】
酵素加水分解工程（ａ）は、ＭＡＰおよび／またはＩＴＰトリペプチドの遊離を生じるタンパク質の加水分解につながる、適したタンパク質基質の任意の酵素処理であってもよい。いくつかの酵素の組み合わせを用いて、タンパク質基質から所望のトリペプチドを遊離させることができ、本プロセスにおいて使用される好ましい酵素は、プロリン特異的エンドプロテアーゼまたはプロリン特異的オリゴペプチダーゼである。適したタンパク質基質は、アミノ酸配列ＭＡＰおよび／またはＩＴＰを包含する任意の基質であってもよい。ＭＡＰを包含することが公知であるタンパク質基質は、例えば、カゼイン、小麦グルテン、ヒマワリタンパク質単離物、米タンパク質、卵タンパク質である。適したタンパク質基質は、好ましくは、ウシβ−カゼイン、小麦グルテンのα−グリアジン画分およびヒマワリタンパク質単離物の２Ｓ画分に存在するようなアミノ酸配列ＡＭＡＰまたはＰＭＡＰを包含する。
【００２１】
カゼイン基質は、相当な量のβ−カゼインおよびα−ｓ２−カゼインを含む任意の物質であってもよい。適した基質の例は、乳ならびにカゼイン、カゼイン粉末、カゼイン粉末濃縮物、カゼイン粉末単離物、またはβ−カゼイン、もしくはα−ｓ２−カゼインである。好ましくは、カゼインタンパク質単離物（ＣＰＩ）等の、高含有量のカゼインを有する基質。
【００２２】
酵素は、β−カゼインおよび／またはα−ｓ２−カゼインなどのタンパク質を加水分解して１つ以上のＭＡＰおよび／またはＩＴＰのトリペプチドの遊離を生じることができる、任意の酵素または酵素の組み合わせであってもよい。
【００２３】
分離工程（ｂ）は、当業者に公知の任意の方法によって、例えば沈殿、ろ過、遠心分離、抽出またはクロマトグラフィーおよびそれらの組み合わせによって、実行してもよい。好ましくは、分離工程（ｂ）は、精密ろ過または限外ろ過技術を用いて実行される。ろ過工程において使用される膜孔サイズ、ならびに膜の電荷を用いて、トリペプチドＭＡＰおよび／またはトリペプチドＩＴＰの分離を制御してもよい。荷電ＵＦ／ＮＦ膜を用いたカゼインタンパク質加水分解物の分画が、Ｙ．ポワロ（Ｐｏｉｌｏｔ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ １５８（１９９９年）１０５〜１１４頁に記載されている。
【００２４】
濃縮工程（ｃ）は、工程（ｂ）によって生じた画分をナノろ過または蒸発して、高度に濃縮された液体を生じることを伴ってもよい。例えば低い水分活性（Ａｗ）、低ｐＨおよび好ましくはベンゾエートまたはソルベート等の保存剤で適当に製剤化される場合、かかる濃縮液体組成物は、魅力的な、本発明によるトリペプチドの保存の方法を形成する。場合により、蒸発工程の後に、例えば噴霧乾燥または凍結乾燥による、乾燥工程が続き、高濃度のＭＡＰおよび／またはＩＴＰを含む固体を生じる。
【００２５】
酵素プロセスは、好ましくは、単一の酵素インキュベーション工程を含む。本発明による酵素プロセスはさらに、好ましくは混入している酵素活性がないプロリン特異的プロテアーゼの使用に関する。プロリン特異的プロテアーゼは、プロリンのカルボキシ末端側のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼとして定義される。好ましいプロリン特異的プロテアーゼは、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端側でペプチド結合を加水分解するプロテアーゼである。プロリン特異的プロテアーゼは、好ましくは、ポリペプチドまたはタンパク質自体等の、大きいタンパク質分子を加水分解することができる。本発明によるプロセスは、一般に、２４時間未満のインキュベーション時間を有し、好ましくはインキュベーション時間は１０時間未満、より好ましくは４時間未満である。インキュベーション温度は、一般に、３０℃より高く、好ましくは４０℃より高く、より好ましくは５０℃より高い。
【００２６】
本発明の別の態様は、加水分解されたタンパク質からのトリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの精製および／または分離である。本発明による、加水分解されたタンパク質のほとんどは、好ましくは、選択されたｐＨ条件下で、沈殿することができる。この精製プロセスは、ｐＨを、加水分解された、および加水分解されていないタンパク質のほとんどが沈殿するｐＨに変化させること、ならびに溶液中に残った（対生物作用）トリペプチドから沈殿したタンパク質を分離させることを含む。
【００２７】
プロリン残基をそのカルボキシ末端側に有する本トリペプチドを得るために、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断することができるプロテアーゼの使用によって、好ましい選択肢が提供される。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、プロリン残基のカルボキシ側でペプチドを選択的に切断する、独特の可能性を有する。プロリルオリゴペプチダーゼはまた、アラニン残基のカルボキシ末端でペプチドを切断する可能性を有するが、後者の反応は、プロリン残基を伴うペプチド結合を切断することよりも効率が低い。哺乳動物ならびに微生物供給源から単離された、全ての十分特徴付けられたプロリン特異的プロテアーゼにおいて、酵素の活性部位から大きいペプチドを排除する、独特のペプチダーゼドメインが同定されている。実際は、これらの酵素は、約３０より多いアミノ酸残基を含むペプチドを分解することができないので、これらの酵素は、現在、「プロリルオリゴペプチダーゼ」と呼ばれている（ファロップ（Ｆｕｌｏｐ）ら、セルＣｅｌｌ、第９４巻、１６１〜１７０頁、１９９８年７月２４日）。結果として、これらのプロリルオリゴペプチダーゼは、それらがそれらの加水分解作用を示すことができる前に、他のエンドプロテアーゼでの前加水分解を必要とする。しかしながら、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットに記載されているように、プロリルオリゴペプチダーゼとかかる別のエンドプロテアーゼとの組み合わせであっても、カルボキシ末端プロリン残基を有する有意に増強された割合のペプチドによって特徴付けられる加水分解物を生じる。このために、かかる加水分解物は、インビトロＡＣＥ阻害効果ならびに胃腸内タンパク質分解に対する改善された抵抗性を有するトリペプチドの単離のための、優れた出発点を形成する。
【００２８】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書中で、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖として定義される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、同義（一般に認識されるように）と考えられ、各用語は、文脈によって必要な場合、互換可能に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書中で、３０個より多いアミノ酸残基を含む、鎖として定義される。本明細書中の全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、一般的な慣習に従って、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で記される。本明細書中で使用されるアミノ酸の一文字表記は、当該分野で一般に公知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９年）に見ることができる。ペプチド混合物は、３５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの測定と組み合わせてケルダール窒素に基づいて測定すると、少なくとも３０重量％（乾燥物質）のペプチドを含む組成物である。
【００２９】
エンドプロテアーゼは、本明細書中で、エンド型でポリペプチド中のペプチド結合を加水分解し、グループＥＣ３．４に属する酵素として定義される。エンドプロテアーゼは、触媒機序に基づいて、サブサブクラスに分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブサブクラスがある。エキソプロテアーゼは、本明細書中で、末端のα−アミノ基に隣接するペプチド結合（「アミノペプチダーゼ」）または末端のカルボキシ基と末端から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合（「カルボキシペプチダーゼ」）を加水分解する酵素として定義される。
【００３０】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットは、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）から得ることができる、プロリン特異的プロテアーゼを記載している。黒色アスペルギルス由来酵素は、プロリンのカルボキシ末端で選択的に切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端でも切断することができ、より低い効率ではあっても、アラニンのカルボキシ末端でも切断することができる。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはまた、この黒色アスペルギルス由来酵素と他の微生物または哺乳動物供給源由来の公知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に明らかな相同性がないことを教示している。公知のプロリルオリゴペプチダーゼと対照的に、黒色アスペルギルス酵素は、酸性の最適ｐＨを有する。公知のプロリルオリゴペプチダーゼならびに黒色アスペルギルス由来酵素は、いわゆるセリンプロテアーゼであるが、本発明者らは、本明細書中（実施例１）で、黒色アスペルギルス酵素が、完全に異なるサブファミリーに属することを示す。分泌された黒色アスペルギルス酵素は、ほとんどの細胞質プロリルオリゴペプチダーゼがグループ分けされるＳ９ファミリーよりむしろ、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであるようである（ローリング（Ｒａｗｌｉｎｇ），Ｎ．Ｄ．およびバレ（Ｂａｒｒｅｔ），Ａ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２９８（１９９６年）１〜３頁）。実施例２において、本発明者らは、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的プロテアーゼの最適ｐＨおよび温度を示す。実施例３において、本発明者らは、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端の切断に対する黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの高い選択性を示す。さらに、本発明者らは、実施例において、本発明の方法において使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物が、好ましくは本質的に純粋であることを示し、これは純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンド型タンパク質分解活性以外の有意なエンド型タンパク質分解活性が存在しないことを意味する。本発明者らはまた、好ましくは本発明に従って使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物が、いかなるエキソ型タンパク質分解、より具体的にはアミノペプチド分解副活性も含まないことを示す。好ましくは、エキソ型タンパク質分解活性は、本発明のプロセスにおいて使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物中に存在しない。プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性が非組み換えアスペルギルス株中に本質的に存在しないという考えの実験的証明は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに見ることができ、本願の実施例３にも示されている。本発明のプロセスは、カゼイン基質をプロリン特異的エンドプロテアーゼのみとともにインキュベートすることによって可能なので、温度、ｐＨ等の最適インキュベーション条件は、容易に選択することができ、２つ以上の酵素が適用される場合のように、最適状態に及ばない条件下で固定する必要がない。さらに、例えばさらなる非対生物作用ペプチドまたは肉臭い味につながる遊離アミノ酸等の望ましくない副産物の形成は予防される。反応条件の選択においてより高い自由度を有することによって、他の基準についてのより容易な選択が可能になる。例えば、ここで、微生物感染に対する感受性がより低い条件を選択すること、およびｐＨ条件をその後のタンパク質沈殿工程に関して最適化することが、より容易である。実施例４において、本発明者らは、アスペルギルス酵素がオリゴペプチダーゼでないが、補助的なエンドプロテアーゼを必要とせずにインタクトなタンパク質、大きいペプチドならびにより小さいペプチド分子を加水分解することができる真のエンドペプチダーゼであることを示す。この新しい、驚くべき発見は、補助的なエンドプロテアーゼを必要としないためにカルボキシ末端プロリン残基を有する先例のない高含有量のペプチドを有する加水分解物を調製するために黒色アスペルギルスを使用する可能性を開く。かかる新しい加水分解物は、植物由来であれ動物起源由来であれ、異なるタンパク質性出発物質から調製することができる。かかる出発物質の例は、カゼイン、ゼラチン、魚または卵タンパク質、小麦グルテン、大豆およびエンドウタンパク質ならびに米タンパク質およびヒマワリタンパク質である。ナトリウムは高血圧症において重要な役割を有することが公知であるので、ＡＣＥ阻害ペプチドの生成のための好ましい基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩よりむしろ、カルシウムおよびカリウムである。
【００３１】
黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨは約４．３である（図１参照）。この低い最適ｐＨのために、牛乳カゼインを黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼとともにインキュベートすることは自明ではない。牛乳カゼインはｐＨが６．０未満に低下すると沈殿するが、ｐＨ６．０では、黒色アスペルギルス酵素は、限られた活性しか有さない。しかしながら、本発明者らは、実施例５において、このやや好ましくない条件下でも、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションによってＩＰＰおよびＬＰＰ等のいくつかの公知のＡＣＥ阻害ペプチドを生じることができることを示す。非常に驚くべきことに、これらの条件下で生成されるＶＰＰはない。牛乳カゼインは、β−カゼインおよびκ−カゼインを含むいくつかの異なるタンパク質を組み込む。公知のアミノ酸配列によると、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。κ−カゼインは、ＩＰＰのみを包含する。黒色アスペルギルス由来酵素がいかなる測定可能なアミノペプチダーゼ活性も含まないことから、形成されたＩＰＰが、κ−カゼイン中に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることが、強力に示唆される。おそらく、ＩＰＰのカルボキシ末端のペプチド結合は、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの主な活性によって切断されるが、先行するＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断は、そのＡｌａ特異的副活性によって達成される。同様に、ＶＰＰがないことは、アミノペプチダーゼ副活性がないことに基づいて説明することができる。ＶＰＰは、配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−中で、β−カゼイン中に含まれる。したがって、プロリン特異的エンドプロテアーゼは、ＶＶＶＰＰ配列を切除するが、ＶＰＰを放出させることはできない。
【００３２】
これらの結果は、単純な一工程酵素プロセスにおいてカゼイン塩を黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼとともにインキュベートすると得られる。タンパク質を含む水溶液は、特に何時間も５．０より高いｐＨ値で、５０℃以下の温度で維持された場合、微生物感染に対して高度に感受性がある。特に、かかる長期のインキュベーション工程の間に生成されることがあり、その後の加熱工程の後も残存して食品グレードのプロセスに対する潜在的な脅威を形成する可能性がある微生物毒素。本発明は、好ましくは、５０℃より高いインキュベーション温度を使用する。２４時間未満、好ましくは８時間未満、より好ましくは４時間未満の期間にわたって酵素インキュベーションが行われる一工程酵素プロセスと組み合わせて、本発明によるプロセスによって、向上した微生物学的安定性の利点が提供される。高温条件と組み合わせて本酵素−基質比を使用して、ＩＰＰおよびＬＰＰの切除が３時間のインキュベーション期間以内に完了する。
【００３３】
単一の本質的に純粋なエンドプロテアーゼを用いて、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰおよびＬＰＰをカゼインから切除することができるので、本発明は、従来技術のプロセスより少ない数の水溶性ペプチドを生じる。これらの水溶性ペプチドのうち、ＩＰＰおよびＬＰＰは、多量に存在する。これは、多くの他の、しばしば活性の低い化合物なしで、高濃度のＡＣＥ阻害トリペプチドが必要である場合、特に重要である。
【００３４】
本プロセスによると、タンパク質中に存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＩＰＰまたはＬＰＰに転換される。
【００３５】
実施例６において、本発明者らは、新しい、驚くべき精製工程による、対生物作用ペプチドの５倍精製効果を説明する。この精製プロセスの基礎は、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの独特の特性によって形成される。この酵素とのインキュベーションによって、水溶性トリペプチドの形態で、基質分子の最も対生物作用のある部分が放出される。基質分子の、対生物作用のない、または対生物作用の低い部分は、大部分、切断されないままであり、したがって、基質分子のより大きいペプチドまたはポリペプチド部分のままである。選択されたｐＨ条件での、これらの、より大きいペプチドまたはポリペプチド部分の限定された水溶性のために、これらの、基質分子の、対生物作用のない、または対生物作用の低い部分は、より可溶性の高い対生物作用トリペプチドから容易に分離する。このプロセスにおいて、最初の加水分解物は、５５℃、ｐＨ６．０での短い酵素インキュベーション期間の間に形成され、次いで、場合により、８０℃より高い温度まで加熱され、全ての混入している微生物を死滅させ、黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼが不活化される。その後、加水分解物が酸性化されて４．５または少なくとも５．０未満までのｐＨ低下が実現される。酵素の最適条件を表すために黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼ不活化に使用することができない、このｐＨ値において、より小さいペプチドのみが溶液中に残るように、カゼイン塩由来の全ての大きいペプチドが沈殿する。沈殿したカゼイン塩は傾瀉またはろ過工程または低速（すなわち、５０００ｒｐｍ未満）遠心分離によって容易に除去することができるので、水性相は、存在するタンパク質の量に関して、高い割合の対生物作用ペプチドを含む。ケルダールデータによると、８０〜７０％のカゼイン塩タンパク質が、低速遠心分離工程によって除去され、これはＡＣＥ阻害ペプチドの４〜５倍精製を含意する。本発明者らは、この精製原理を有利に適用して、カゼイン以外のタンパク質性物質から得られる生物活性ペプチドも得ることができることを見出した。また、酵素によって生成される加水分解物だけでなく、適した微生物によって発酵されるタンパク質もまた、本プロセスに従って分離および精製することができる。酵素および基質を、基質は沈殿して酵素は依然として活性のあるｐＨに近いｐＨ値でインキュベートすることによって、この精製工程が可能になる。黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの低い最適ｐＨのために、ｐＨ１．５〜６．０の範囲での基質沈殿が考慮される。それらの特定の沈殿性質の観点から、グルテンはｐＨ３．５より上で沈殿し、ヒマワリタンパク質はｐＨ４．０より高くｐＨ６．０未満で沈殿し、卵白はｐＨ３．５より高くｐＨ５．０未満で沈殿し、加水分解されたタンパク質が沈殿し、沈殿したタンパク質を加水分解されたタンパク質またはペプチドから分離することができる条件の例を形成する。
【００３６】
傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後、生物活性ペプチドを含む上清を、精製された状態で回収することができる。その後の蒸発および噴霧乾燥工程によって、高い対生物作用を有する食品グレードのペーストまたは粉末を得るための、経済的な経路を生じる。記載されるようなプロセスに従ってカゼイン塩を摂取すると、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを有する白色で無臭の粉末が得られる。あるいは、蒸発またはナノろ過を用いて、対生物作用ペプチドをさらに濃縮することができる。ｐＨ調節およびベンゾエートまたはソルベート等の食品グレードの保存剤の添加と組み合わせた、水分活性（Ａｗ）を増大させることによる、かかる濃縮物の適した製剤化によって、血圧降下ペプチドの、微生物学的に安定化された食品グレードの液体濃縮物が生じる。正しいトリペプチド濃度に適当に希釈された場合、全ての種類の食品および飲料にＡＣＥ阻害特性を与えるのに適した、用途の広い出発物質が得られる。必要な場合、傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後に得られる上清をさらに処理して、最終産物の嗜好性を向上させることができる。例えば、上清を粉末状活性炭と接触させ、その後ろ過工程で炭を除去することができる。最終産物の苦味を最小限にするために、傾瀉、ろ過または低速遠心分離の後に得られた上清を、サブチリシン、トリプシン、中性プロテアーゼまたはグルタミン酸特異的エンドプロテアーゼ等の別のプロテアーゼとのインキュベーションに供することもできる。必要な場合、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの特異的親水性／疎水性特性を利用するその後の精製工程によって対生物作用成分ＭＡＰおよび／またはＩＴＰの濃度をさらに増大させることができる。好ましい精製方法としては、ナノろ過（サイズに基づく分離）、蒸発／沈殿が後に続く、例えばヘキサンもしくはブタノールでの抽出、または得られる酸性化加水分解物をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤ範囲（ローム（Ｒｏｅｈｍ））からのクロマトグラフィー樹脂と接触させることが挙げられる。また、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって供給されるようなブチル−セファロース樹脂を用いてもよい。
【００３７】
実施例７において、本発明者らは、新しいペプチド精製プロセスと組み合わせて黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを用いて調製されたカゼイン加水分解物中の新しいＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定を説明する。高い割合の非対生物作用ペプチドの除去ならびに高度に洗練された分離および同定装置と組み合わせた、この単一および（本質的に純粋な）エンドプロテアーゼの使用によってのみ、これらの新しいＡＣＥ阻害トリペプチドを追跡および同定することができた。実施例７（沈殿後）に従って調製されたカゼイン由来対生物作用ペプチド（ＣＤＢＡＰ）において、２．９ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ（ＣＤＢＡＰ中４．８ｍｇ ＭＡＰ／ｇタンパク質）および０．９ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ（ＣＤＢＡＰ中１．４ｍｇ ＩＴＰ／ｇタンパク質）に対応する量で、トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰが同定された。ＣＤＢＡＰのさらなる特徴は、その、モル基準で２４％の、非常に高いプロリン含有量である。実施例７に記載される試験は、改変マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）試験での２つの新しいトリペプチドの非常に低いＩＣ５０値、すなわちＭＡＰで０．５μｍｏｌ／ｌおよびＩＴＰで１０μｍｏｌ／ｌを示す。この発見は、公知の最も有効な天然のＡＣＥ阻害ペプチドの１つであるＩＰＰがこの改変マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）試験において２．０μｍｏｌ／ｌのＩＣ５０値を有することに気づくと、さらにより驚くべきことである。
【００３８】
本プロセスによると、タンパク質中に存在する−Ｍ−Ａ−Ｐ−または−Ｉ−Ｔ−Ｐ−配列の、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、それぞれトリペプチドＭＡＰまたはＩＴＰに転換される。
【００３９】
新規に同定されたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの有用性は、実施例８にさらに説明される。後者の実施例において、本発明者らは、両方のペプチドが、胃腸管内で典型的に見られる消化条件をシミュレートするインキュベーション条件で残存することを示す。これらのデータに基づいて、本発明者らは、新規のトリペプチドが哺乳動物（例えばヒト）胃腸管で残存するようであり、高血圧症の治療に使用された場合、相当な経済的潜在性を含意すると結論付ける。
【００４０】
実施例９において、本発明者らは、優れたＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰは、酵素加水分解実験において生成することができるだけでなく、適当な食品グレード微生物で発酵させた乳調製物中でも検出可能であることを示す。しかしながら、本発明者らは、かかる発酵製品中でペプチドＩＴＰの存在を示すことができなかった。
【００４１】
さらなる（例えばクロマトグラフィー精製工程の前または後のいずれかに得られるペプチドＭＡＰおよび／またはＩＴＰを、定期的に広く消費される食品への組み込みのために使用してもよい。かかる製品の例は、マーガリン、スプレッド、バターもしくはヨーグルト等の種々の乳製品または乳もしくはホエー含有飲料である。かかる組成物は、典型的にはヒトに投与されるが、これらはまた、高血圧症を軽減するために、動物、好ましくは哺乳動物に投与されてもよい。さらに、得られる製品中の高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドによって、これらの製品は、丸剤、錠剤または高度に濃縮された溶液もしくはペーストまたは散剤の形態の栄養補助食品への組み込みに非常に有用になる。ＡＣＥ阻害ペプチドの継続的放出を確実にする持続放出性栄養補助食品が、特に重要である。本発明によるＭＡＰおよび／またはＩＴＰペプチドは、例えば丸剤、錠剤、顆粒剤、小袋またはカプセル剤中の乾燥粉末として製剤化されてもよい。あるいは、本発明による酵素は、例えばシロップ剤またはカプセル剤中の液体として製剤化されてもよい。種々の製剤中で使用され、本発明による酵素を含む組成物はまた、生理学的に許容され得る担体、佐剤、賦形剤、安定剤、バッファーおよび希釈剤からなる群の少なくとも１つの化合物を組み込んでもよく、これらの用語は、それらの元来の意味で使用されて、包装、送達、吸収、安定化を補助するか、または佐剤の場合、酵素の生理学的効果を増強する、物質を示す。粉末形態の本発明による酵素と組み合わせて使用することができる種々の化合物に関する関連のあるバックグラウンドは、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）に見ることができる。乾燥粉末として製剤化された、本発明によるＡＣＥ阻害ペプチドは、やや長期間保存することができるが、例えばアルミニウムブリスター等の適した包装を選択することによって、湿気または湿った空気への接触は避けるべきである。比較的新しい経口適用形態は、種々の型のゼラチンカプセル剤またはゼラチンベースの錠剤の使用である。
【００４２】
高血圧症に対抗するための天然のＡＣＥ阻害ペプチドの関連性の観点から、本発明の、新しく費用効果の高い経路は、穏やかな降圧性の食事またはさらには動物用製品のための、魅力的な出発点を提供する。本経路はまた、驚くほど単純な精製工程も含むので、血圧降下濃縮栄養補助食品の可能性もまた、拡大される。
【００４３】
本発明による、または本発明に従って使用される、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３で言及されているポリペプチドを意味する。したがって、このプロリン特異的エンドプロテアーゼは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６またはその断片と、少なくとも４０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）６０ヌクレオチドにわたって、好ましくは１００ヌクレオチドにわたって、少なくとも８０％または９０％同一な、より好ましくは２００ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％同一な、配列番号１の核酸配列もしくはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列と低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
からなる群より選択される、プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を有するポリペプチドである。配列番号１および配列番号２は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示されている通りである。好ましくは、ポリペプチドは、単離された形態である。
【００４４】
本発明に従って使用される、好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、さらに最も好ましくは少なくとも約９７％の同一性を有する、または配列番号２のアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を有する。
【００４５】
好ましくは、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１の核酸配列もしくはその断片、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列と低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４６】
用語「ハイブリダイズすることができる」は、本発明の標的ポリヌクレオチドが、プローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、もしくはその断片、または配列番号１の相補物）に、バックグラウンドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズできることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的なヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡであり、最も好ましくはゲノムＤＮＡ配列である。典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物にハイブリダイズすることができる、連続したヌクレオチドの配列を含む。かかるヌクレオチドは、当該分野で周知の方法に従って合成することができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物に、バックグラウンドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡのために、起こる場合がある。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列またはコード配列の相補物との間の相互作用によって発生するシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用よりも、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、さらにより好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば３２Ｐで放射性同位元素標識することによって、測定してもよい。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、低ストリンジェンシー（約４０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃で、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件を用いて達成してもよい。
【００４８】
ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性の計算に使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定に基づいて使用される）。
【００４９】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ Ｎアルゴリズムもまた、配列同一性を計算するのに、または（例えばそれらのデフォルト設定に基づいて、同等または対応する配列を同定すること等の）配列を並べるのに使用することができる。
【００５０】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって、公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さの文字列と整列させた場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴに適合するか、または満たすかのいずれかの、クエリー配列中の長さＷの短い文字列を同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近縁ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの最初の近縁ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大できる限りは、各配列に沿って両方向に延長される。各方向へのワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その最大の得られた値から量Ｘだけ低下した場合、１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロ以下になった場合、または配列のいずれかの末端に達した場合に中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を判定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の文字列長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００５１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計的解析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される、ある類似性の測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の適合が偶然生じる確率の指標を提供する、最小の合計の確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、配列は、第一の配列と第二の配列との比較における最小の合計の確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列と類似していると見なされる。
【００５２】
アスペルギルス属の株は、食品グレードの状態を有し、これらの微生物由来の酵素は、疑われていない食品グレードの供給源に由来する。別の好ましい実施形態によると、酵素は、分泌されない、いわゆる細胞質酵素よりむしろ、その産生細胞によって分泌される。このようにして、酵素を、高価な精製工程なしに、本質的に純粋な状態で、細胞ブロスから回収することができる。好ましくは、酵素は、一般のｐＨおよび温度条件下で、その基質に対して、高い親和性を有する。
【００５３】
［材料および方法］
［材料］
食用カゼイン酸カリウムスプレー（８８％）を、オランダのＤＭＶインターナショナル（ＤＭＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。合成色素形成ペプチドを、オランダのペップスキャンシステムズ社（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）またはスイスのバッヘム（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。
【００５４】
黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼ
黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの過剰産生を、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載されているように達成した。クエン酸塩／二リン酸ナトリウムバッファーｐＨ４．６中、３７℃で、合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに関して、酵素の活性を試験した。反応生成物を、４０５ｎＭで、分光光度計によってモニタリングした。単位を、これらの試験条件下で１分あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを遊離させる酵素の量として定義する。
【００５５】
［黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼの、クロマトグラフィーによる精製］
過剰産生している黒色アスペルギルス株から得られた培養ブロスを、混入している任意のエンド型およびエキソ型タンパク質分解活性を除去するための、プロテアーゼのクロマトグラフィーによる精製に使用した。そのため、発酵ブロスをまず遠心分離して、真菌の塊の大部分を除去し、次いで上清を、減少していく孔サイズを有するいくつかのフィルターに通過させて、全ての細胞断片を除去した。最後に、得られた限外ろ過液を２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．１中で１０倍希釈し、Ｑ−セファロース（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦカラムにアプライした。２０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムｐＨ５．１中、０〜０．４ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌのグラジエントでタンパク質を溶出させた。Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１、２０９〜２１２頁（１９９５年）に記載されているプロトコールに従うがわずかに改変したアッセイ条件下で、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの切断に対する活性を示していたピーク画分を収集し、貯蔵した。黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの酸性の最適ｐＨを考慮して、酵素アッセイを、３７℃で、クエン酸塩／二リン酸ナトリウムバッファー中、ｐＨ４．６で行った。活性画分の貯蔵と、それに続く濃縮によって、最終的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの単一のバンドおよびＨＰ−ＳＥＣでの１つのピークのみを示す調製物を生じた。疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる分析によって、得られた酵素調製物の純度を確認した。
【００５６】
［ＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの検出において使用されるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析］
本発明の酵素混合物によって生成された、酵素によるタンパク質加水分解物中の、目的のペプチド、中でもトリペプチドＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの定量において、Ｐ４０００ポンプ（サーモクエスト（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）（登録商標）、オランダ、ブレダ（Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））に結合させたイオントラップ質量分析計（サーモクエスト（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ）（登録商標）、オランダ、ブレダ（Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を用いたＨＰＬＣを使用した。形成されたペプチドを、溶出のためのミリＱ（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）水（ミリポア、米国マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））中の０．１％ギ酸（溶液Ａ）およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶液Ｂ）のグラジエントと組み合わせたイナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）３ＯＤＳ３、３μｍ、１５０＊２．１ｍｍ（バリアン・ベルジウム、ベルギー（Ｖａｒｉａｎ Ｂｅｌｇｉｕｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））カラムを用いて分離した。グラジエントは溶液Ａの１００％で開始し、それを５分間維持し、１０分で５％Ｂに線形に増大させ、続いて３０分で溶液Ｂの４５％に線形に増大させ、直ちに開始時の条件にし、それを１５分間安定化のために維持した。使用した注射体積は５０μｌであり、流速は２００μｌ／分であり、カラム温度は５５℃で維持した。注射した試料のタンパク質濃度は、およそ５０μｇ／ｍｌであった。
【００５７】
個々のペプチドに関する詳細な情報は、約３０％の最適衝突エネルギーを用いて、目的のペプチドの専用のＭＳ／ＭＳを用いることによって得た。個々のペプチドの定量は、ＭＳ／ＭＳモードで観察される最も豊富な断片イオンを用いることによって、外部較正を用いて行った。
【００５８】
トリペプチドＬＰＰ（Ｍ＝３２５．２）を用いて、ＭＳモードでの最適感度およびＭＳ／ＭＳモードでの最適断片化を調整し、５μｇ／ｍｌの一定の注入を行い、ＭＳモードでプロトン化分子を生じ、ＭＳ／ＭＳモードで約３０％の最適衝突エネルギーを生じ、Ｂ−およびＹ−イオン系列を生じた。
【００５９】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に、酵素によるタンパク質加水分解物を周囲温度および１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、上清をミリＱ（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）水で１：１００に希釈した。
【００６０】
［ケルダール窒素］
フローインジェクション分析によって、全体的なケルダール窒素を測定した。ＴＫＮ法カセット５０００−０４０を備えたテカター（Ｔｅｃａｔｏｒ）ＦＩＡＳＴＡＲ５０００フローインジェクションシステム、ＳＯＦＩＡソフトウエアを有するペンティアム（Ｐｅｎｔｉｕｍ）４コンピュータ、およびテカター（Ｔｅｃａｔｏｒ）５０２７オートサンプラーを使用して、タンパク質含有溶液から放出されたアンモニアを５９０ｎｍで定量した。方法のダイナミックレンジ（０．５〜２０ｍｇのＮ／ｌ）に対応する試料の量を、９５〜９７％硫酸およびケルダールとともに消化チューブに入れ、２００℃で３０分間と、それに続く３６０℃で９０分間の消化プログラムに供する。ＦＩＡＳＴＡＲ５０００システムへの注入の後、測定されたタンパク質の量を推定することができる窒素ピークを測定する。
【００６１】
［アミノ酸分析］
正確に計量したタンパク質性物質の試料を希酸中で溶解させ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機による遠心分離によって沈殿を除去した。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（米国マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ，ＵＳＡ））のアミノ酸分析システムの操作手引きで特定されているようなピコタグ（ＰｉｃｏＴａｇ）法に従って、透明な上清でアミノ酸分析を行った。そのため、適した試料を液体から得、次いで、乾燥させ、気相酸加水分解に供し、フェニルイソチオシアネートを用いて誘導体化した。存在する、種々の誘導体化されたアミノ酸を、ＨＰＬＣ法を用いて定量し、合計して、計量された試料中の遊離アミノ酸の総レベルを計算した。アミノ酸ＣｙｓおよびＴｒｐは、この分析で得られるデータに含まれない。
【００６２】
タンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）を、迅速なＯＰＡ試験を用いて測定し、記載されているように計算した（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、ＪＦＳ、第６６巻、５号、６４２〜６４６頁、２００１年）。
【００６３】
［加水分解物中に存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布］
高圧ポンプ、１０〜１００μｌの試料を注入することができる注入装置および２１４ｎｍでカラム流出をモニタリングすることができるＵＶ検出器を備えた自動化ＨＰＬＣシステムで、プロテアーゼ処理タンパク質試料のペプチドサイズ分布の分析を行った。
【００６４】
この分析に使用したカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム／２５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．０バッファーで平衡化したスーパーデックスペプチド（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ）ＨＲ １０／３００ ＧＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））であった。試料（典型的には５０μｌ）を注入した後、バッファーで９０分間、０．５ｍｌ／分の流速でカラムから種々の成分を溶出させた。シトクロムＣ（分子量１３５００Ｄａ）、アプロチニン（分子量６５１０Ｄａ）およびテトラグリシン（分子量２４６Ｄａ）の混合物を分子量マーカーとして用いて、システムを較正した。
【００６５】
［実施例］
［実施例１］
黒色アスペルギルスから得られた酵素は、新しいクラスのプロリン特異的酵素を表す。
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに提供されている黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼのコード配列全体から、５２６アミノ酸のタンパク質配列を決定することができる。酵素の新規性は、スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、ＰＩＲおよびｔｒＥＭＢＬ等のデータベースのＢＬＡＳＴサーチによって確認した。本発明者らが驚いたことに、黒色アスペルギルス酵素と公知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に、明らかな相同性は検出できなかった。しかしながら、アミノ酸配列の、より密接な観察から、Ｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、および胸腺特異的セリンプロテアーゼに対する、低いが有意な相同性が明らかになった。これらの酵素の全ては、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８に割り振られている。また、活性部位セリンの周りのＧｘＳＹｘＧ配置は、これらの酵素と黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼとの間で保存されている。また、ファミリーＳ２８のメンバーは、酸性の最適ｐＨを有し、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断する特異性を有し、シグナル配列、およびちょうど黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼ等のプロペプチドとともに、合成される。また、黒色アスペルギルス酵素のサイズは、ファミリーＳ２８のメンバーのものと類似している。したがって、黒色アスペルギルスプロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られる酵素を含むほとんどの細胞性プロリルオリゴペプチダーゼがグループ分けされているＳ９ファミリーよりむしろ、セリンプロテアーゼのファミリーＳ２８のメンバーであるようである。これらの構造的および生理学的特性に基づいて、本発明者らは、黒色アスペルギルス酵素が、セリンプロテアーゼのＳ９ファミリーよりむしろ、Ｓ２８に属すると結論付けた。黒色アスペルギルス由来酵素を、Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼから識別するさらなる特性は、前者のファミリーに属する細胞質プロリルエンドプロテアーゼとは異なり、新しく同定された黒色アスペルギルス酵素は、増殖培地中に分泌されることである。これは、低級真核生物由来の、ファミリーＳ２８のメンバーの単離および特徴付けに関する、最初の報告である。
【００６６】
［実施例２］
［黒色アスペルギルスから得られたプロリン特異的エンドプロテアーゼの最適ｐＨおよび温度］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの最適ｐＨを確立するために、異なるｐＨ値を有するバッファーを調製した。０．０５ｍｏｌ／ｌの酢酸Ｎａおよび０．０２ＭのＣａＣｌ２を用いてｐＨ４．０−４．５−４．８−５．０−５．５および６．０のバッファーを作製し、０．０２ＭのＣａＣｌ２を含む０．０５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌバッファーを用いてｐＨ７．０および８．０のバッファーを作製した。それぞれ酢酸およびＨＣｌを用いてｐＨ値を調節した。色素形成合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質として使用した。バッファー溶液、基質溶液およびプロリルエンドプロテアーゼプレ希釈（０．１Ｕ／ｍＬの活性で）を、水浴中で正確に３７．０℃まで加熱した。混合した後、反応を分光光度計によって４０５ｎｍ、３７℃で３．５分間追跡し、０．５分ごとに測定した。図１に示される結果から、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが約４の最適ｐＨを有することが明らかである。
【００６７】
また、プロリルエンドプロテアーゼの最適温度を確立した。そのため、精製された酵素調製物を、０．０２ｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２を含有する０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸Ｎａ中、ｐＨ５．０で２時間、カゼインレゾルフィン（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）バーション３）を基質として用いて異なる温度でインキュベートし、５７４ｎｍで測定することによって酵素活性を定量した。得られた結果によると、黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは、およそ５０℃の最適温度を有する。
【００６８】
［実施例３］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性および純度
複数コピーの発現カセットを含む、黒色アスペルギルス株から得られた、そのまま、ならびにクロマトグラフィーによって精製された酵素試料（国際公開第０２／４５５２４号パンフレット参照）を、色素形成ペプチド基質の組に対して試験して、コードされるエンドプロテアーゼの特異性を確立した。異なる組の色素形成ペプチドを使用して、可能性のある混入している酵素活性の存在を確立した。コードされるエンドプロテアーゼのエンド型タンパク質分解特異性を、異なるＡｌａ−Ａｌａ−ＸｐＮＡ（ＡＡＸｐＮＡ）基質で試験した。この文脈において、「Ｘ」は、異なる天然アミノ酸残基をいい、「ｐＮＡ」はｐ−ニトロアニリドをいう。分子の「Ｘ」残基とｐＮＡ部分との間のペプチド結合の切断は、λ＝４０５または４１０ｎｍでの吸光度の増大によってモニタリングすることができる色の変化を引き起こす。ＡＡＸｐＮＡ基質。そのため、ＡＸＸ−ｐＮＡ基質のストック溶液（１５０ｍｍｏｌ／ｌ）を、２０ ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸塩バッファーｐＨ４．０中で１００倍希釈した。ＴＥＣＡＮ ゲニオス（Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰリーダー（ウィーン、ザルツブルグ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ））において、４０５ｎｍで１０分間の運動測定によって、エクセルでのデータ処理によって図２に示される画像を生じる、光学密度の増大が記録された。結果から、黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼが、アラニル結合に対する副活性ありで、プロリルペプチド結合に対して高度に特異的であることが明らかである。そのまま、およびクロマトグラフィーによって精製された調製物は、同様の活性プロフィールを示した。
【００６９】
黒色アスペルギルス由来エンドプロテアーゼの、外来性酵素活性での可能性のある混入は、いくつかの望ましくない副反応につながる。例えば、カルボキシペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ等の等のエキソプロテアーゼの存在は、増大したレベルの遊離アミノ酸を有するペプチド調製物を生じる。これらの余分の遊離アミノ酸は、存在する対生物作用ペプチドの相対的濃度を希釈し、さらに、メイラード反応の増大の結果として肉臭い味を与える。過剰発現されたプロリン特異的エンドプロテアーゼの調製物中に、深刻なレベルの、混入しているエンドプロテアーゼが存在する場合、プロリンまたはアラニン残基のカルボキシ末端以外の切断部位が導入される。かかる余分の切断部位は、余分のペプチドを生じ、また、カルボキシ末端プロリン残基を有する対生物作用ペプチドの濃度を希釈する。これら全ての望ましくない副反応を最小限にするために、本質的に純粋なとは、プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用が好ましい。本質的に純粋な、使用されるインキュベーション条件下での、混入しているエンドプロテアーゼならびに混入しているエキソペプチダーゼの活性が最小限であるか、または好ましくはないことを意味する。以下の試験手順を考案して、かかる混入しているエンドおよびエキソペプチダーゼ活性を定量した。
【００７０】
試験手順のための基礎を、種々の選択的色素形成ペプチドの収集によって形成する。プロリン特異的オリゴおよびエンドプロテアーゼのみが、ペプチドＺ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡからｐＮＡを放出させることができるので、この特定のペプチドを用いて、所望のプロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を定量した。多くのエンドプロテアーゼがペプチドＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡからｐＮＡを放出させることができるので、これらの２つのペプチドを用いて、混入している、非プロリン特異的エンド型タンパク質分解活性を定量した。
【００７１】
多くのアミノペプチダーゼが、ペプチド基質からＰｈｅおよびＧｌｎを効率的に放出させることができるので、色素形成ペプチドＱ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを用いて、混入しているアミノペプチダーゼ活性を定量した。
【００７２】
多くのカルボキシペプチダーゼが、ペプチド基質からＰｈｅおよびＡｒｇ残基を放出させることができるので、これらの残基を含むペプチドを選択して、混入しているカルボキシペプチダーゼ活性を定量した。しかしながら、カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための、適した色素形成基は入手できないので、合成ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲを用いた代替的方法を開発しなければならなかった。この代替的方法を、下記に提供する。使用した全ての合成ペプチドにおいて、「Ｚ」はベンジルオキシカルボニルを表し、「ｐＮＡ」は発色団パラ−ニトロアニリドを表す。全ての色素形成ペプチドは、ペップスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）（オランダ、レリスタット（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から入手した。ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲは、バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）（スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から購入した。全てのインキュベーションは、４０℃で行った。希釈した酵素調製物を、商業的製品の濃度に再計算した。
【００７３】
産業上利用可能な酵素調製物中に規則的に存在する種々の酵素活性のレベルを説明するために、この実施例において、本発明者らは、３つの商業的酵素調製物、すなわち、フレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）１０００ＬバッチＨＰＮ００２１８（ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ））、スミザイム（Ｓｕｍｉｚｙｍｅ）ＦＰ（新日本、日本（Ｓｈｉｎ Ｎｉｈｏｎ，Ｊａｐａｎ））およびコロラーゼ（Ｃｏｒｏｌａｓｅ）ＬＡＰ Ｃｈ．：４１２３（ＡＢエンザイムス、英国（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＵＫ））の、それらの種々のタンパク質分解活性についての試験を説明する。フレーバーザイムおよびスミザイムＦＰの両方とも、非特異的エンド型タンパク質分解およびカルボキシペプチド分解活性の他に、いくつかのアミノペプチド分解酵素活性を含む、複雑な酵素調製物として公知である。コロラーゼＬＡＰは、アスペルギルス由来の、比較的純粋な、クローニングおよび過剰発現された、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を表す。
【００７４】
［アミノペプチダーゼ活性の測定］
１００％ＤＭＳＯ中の１５０ｍｍｏｌ／ｌのＦ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡのストック溶液を、０．１Ｍ ＢｉｓＴｒｉｓバッファーｐＨ６中で８０倍希釈して、Ｆ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡを１：１の比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ Ｆ−ｐＮＡ＋Ｑ−ｐＮＡ基質溶液を作製した。このアミノペプチダーゼ基質溶液の２００μｌのアリコートを、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の別々のウェルにピペットで入れた。ＭＴＰを、マゼラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）４ソフトウエアで稼動しているテカン・ゲニオス（Ｔｅｃａｎ Ｇｅｎｉｏｓ）ＭＴＰ（ウィーン、ザルツブルグ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ））中、４０℃でプレインキュベートした。３ｍＭの基質濃度でインキュベーションが起こるように、５０μｌの適当な酵素溶液を加えることによって反応を開始させた。典型的には、液体酵素試料、フレーバーザイム、コロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０希釈を使用した。乾燥スミザイムＦＰ製品のうち、１％溶液を使用した。
【００７５】
アミノ酸−ｐＮＡ結合の切断の結果として発生する、テカン・ゲニオスＭＴＰによって４０５ｎｍで測定した黄色を、少なくとも２０運動サイクルの間（約１０分間）追跡した。ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分として得られるデータを生じた。
【００７６】
［プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定］
測定を、アミノペプチダーゼアッセイと本質的に同じように行ったが、この場合は、Ｚ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡを唯一の基質として、３ｍｍｏｌ／ｌの終濃度で使用した。懸濁液をｐＨ６バッファー中５０〜５５℃で加熱することによって、この基質を可溶化させ、室温で透明な溶液を生じた。測定を４０℃で行った。
【００７７】
典型的には、液体酵素試料フレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰの１：５０希釈を使用した。スミザイムＦＰは１％溶液で使用した。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、典型的には、１：５０００希釈で使用した。
【００７８】
ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分としてデータを生じた。
【００７９】
［混入している非プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定］
この測定も、アミノペプチダーゼアッセイについて記載されているのと本質的に同じように行ったが、この試験においては、Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡを１：１の比および３ｍｍｏｌ／ｌの終濃度で基質として使用した。基質Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡは、使用したｐＨ６．０試験条件下で可溶性が乏しいことがわかったが、サブチリシンとの試験インキュベーションは、ｐＮＡ放出と同時の、基質の迅速な可溶化を生じた。測定は、４０℃で行った。しかしながら、この乏しい可溶性を補償するために、ＭＴＰリーダーをプログラムして、運動サイクルの間で振とうさせた。
【００８０】
ここでも、ソフトウエアから、ＯＤ４０５／分としてデータを生じた。
【００８１】
［混入しているカルボキシペプチダーゼ活性の測定］
カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための感度の高い色素形成ペプチドが入手できないので、カルボキシペプチダーゼＣの定量のためのベーリンガープロトコールに基づき、方法を使用した。
【００８２】
２つの、エタノール中のＺ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒの１５０ｍｍｏｌ／ｌストック溶液を、０．１ｍｏｌ／ｌ ＢｉｓＴｒｉｓバッファーｐＨ６中で８０倍希釈して、Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒを１：１の比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ Ｚ−Ａ−Ｆ＋Ｚ−Ａ−Ｒ基質溶液を作製した。次いで、２００μｌの基質溶液を、ピペットでエッペンドルフバイアルに入れ、４０℃でプレインキュベートした。５０μｌの適当な酵素希釈を加えることによって、反応を開始させた。典型的には、フレーバーザイムおよびコロラーゼＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０希釈を使用した。スミザイムＦＰについては、１％溶液を使用した。５分後、２５０μｌのニンヒドリン試薬を加えることによって、反応を停止させた。ニンヒドリン試薬は、１５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた４００ｍｇのニンヒドリン（メルク（Ｍｅｒｃｋ））および６０ｍｇのヒドリンダンチンでできており、そこに５ｍｌの４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウムバッファーｐＨ５．２を加えた。４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウムバッファーは、ＬｉＯＨ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を溶解させ、その後氷酢酸（メルク）を用いて溶液のｐＨをｐＨ５．２に調節することによって、作製した。
【００８３】
反応を停止させた後、各試料を９５℃で１５分間加熱して、色形成を促進し、続いて、純粋なエタノールで１０倍希釈した。形成された色を、ユビコン（Ｕｖｉｋｏｎ）分光光度計において、５７８ｎｍで測定した。活性試料と同様にブランクを作製したが、ニンヒドリン試薬および酵素添加は逆転させた。カルボキシペプチダーゼ活性によって生じた遊離アミノ酸の量を定量するために、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンを用いて、較正曲線を作成した。０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．５および３．０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−フェニルアラニン（シグマ）を含有するバッファーｐＨ６中の溶液を、試料と同様に、すなわち２５０μｌバイアル中で処理した。得られたＯＤ５７８値から、エクセルで曲線を構築した。Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒ基質を含む試料中に存在する遊離アミノ酸の濃度を、この曲線を用いて計算した。得られた値から、試験した酵素の量あたりのμｍｏｌ／分でカルボキシペプチダーゼ活性を計算した。
【００８４】
［活性比の計算］
本発明による方法のための種々の酵素調製物の適合性を確立するために、関連性のある酵素活性の比率を計算した。ＭＴＰリーダーベースのアッセイにおいて、酵素活性は、経時的なｐＮＡ放出によって、すなわちΔＯＤ４０５／分として、特徴付けられる。ＭＴＰリーダーによって得られた酵素活性の比率を、単純に同一の量の酵素で得られたΔＯＤ／分値で割ることによって計算した。
【００８５】
しかしながら、カルボキシペプチダーゼアッセイの場合、ＭＴＰ−ｐＮＡベースのアッセイによって生じるΔＯＤ／分と直接比較できないＯＤが生じる。ここで、測定されたＯＤを、まず、１分間あたりに放出されたμｍｏｌアミノ酸（μｍｏｌ／分）に変換した。次いで、放出されたｐＮＡのΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換した。そのため、純粋なｐＮＡ（シグマ）の希釈０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２および０．０１５ｍｍｏｌ／ｌおよびＭＴＰリーダーで較正曲線を生じ、ウェルあたり２５０μｌを測定した。得られたデータから、エクセルで較正曲線を構築した。ｐＮＡベースの測定値をニンヒドリンベースの測定値と比較できるように、この較正曲線から、ΔＯＤ／分をμｍｏｌ／分に変換した。
【００８６】
上述の試験で生じたデータに基づいて、使用した種々の酵素調製物を、望ましいプロリン（およびアラニン）特異的活性ならびに混入しているエンドプロテアーゼ、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性に関して特徴付けた。各酵素調製物中に存在するプロリン特異的オリゴまたはエンド型タンパク質分解活性に関するデータを、表１中、「プロリン特異的活性」欄に示す。混入しているアミノペプチダーゼ活性（ＡＰ／プロリン特異的活性）、混入しているカルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ／プロリン特異的活性）および混入しているエンド型タンパク質分解活性（エンド／プロリン特異的活性）に関するデータを、存在するプロリン特異的活性に関して示す。各調製物中に存在する、混入しているカルボキシペプチダーゼ活性に関する、混入しているアミノペプチダーゼ活性のレベルを、（ＡＰ／ＣＰＤ）として示す。
【００８７】
試験した商業的酵素調製物のうち、任意のプロリン特異的オリゴまたはエンド型タンパク質分解活性を含むものがないことが明らかである。さらに、試験した全ての商業的酵素調製物は、相当な混入しているエンド型またはエキソ型タンパク質分解活性を含む。
【００８８】
【表１】
【００８９】
［実施例４］
黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きいタンパク質ならびに小さいペプチドを加水分解することができ、したがって真のエンドプロテアーゼである。
特異的な構造上の特性のために、Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼは、３０アミノ酸より大きいペプチドを消化することができない。この制限は、種々のタンパク質を可能な限り迅速かつ効率的に加水分解しなければならない酵素にとって明らかな不利益である。黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが、基質分子の大きさに関して同じ制限を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、黒色アスペルギルス由来の、クロマトグラフィーによって精製したプロリルエンドペプチダーゼを、小さい合成ペプチドとともに、および大きいオボアルブミン分子とともにインキュベートし、形成された加水分解産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００９０】
使用した合成ペプチドは、配列ＮＨ２−ＦＲＡＳＤＮＤＲＶＩＤＰＧＫＶＥＴＬＴＩＲＲＬＨＩＰＲ−ＣＯＯＨの２７マーであり、ペップスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）社（オランダ、レリスタット（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から贈られた。そのアミノ酸配列によって示されるように、このペプチドは、２つのプロリン残基を、一方を中央に、一方をペプチドの最末端に含む。
【００９１】
インタクトなオボアルブミン分子（ピアス・イムジェクト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｊｅｃｔ）、２０ｍｇの凍結乾燥物質を含むバイアル）は、分子量が４２７５０Ｄａの、３８５アミノ酸からなる。この分子は、１４個のプロリン残基を含み、その一つは分子の最Ｃ末端に位置し、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって切断することができない。
【００９２】
オボアルブミンおよびオリゴペプチドを、精製された黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとともに、５０℃で別々にインキュベートした。いくらかの時間間隔で、試料を採取し、次いでそれをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。
【００９３】
４．５単位／ｍｌの活性を有する、クロマトグラフィーによって精製された黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、２０ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸塩バッファーｐＨ４で１００倍希釈した。オボアルブミンを、酢酸塩バッファーｐＨ４中に、１ｍｇ／ｍｌ（２２μＭ）の濃度まで溶解させた。２７マーを、０．４８ｍｇ／ｍｌ（１５２μＭ）の濃度に達するまで、同じバッファー中に溶解させた。オボアルブミンおよび２７マー溶液のモル濃度を、両方の溶液が切断可能なプロリン残基の同じモル濃度を含むように選択した。オボアルブミンは、１３個の潜在的なプロリン切断部位を含むが、２７マーペプチドは、２つしか有さない。両方の基質溶液のうち、０．５ｍｌを、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）サーモミキサー中、５０℃で、１０μｌ（０．４５ミリＵ）の酵素溶液とともにインキュベートした。いくらかの時間間隔で、１０μｌの試料をインキュベーション混合物から採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで２０℃で維持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色に使用した全ての物質を、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。製造業者の使用説明書に従ってＬＤＳバッファーを使用して試料を調製し、製造業者の使用説明書に従ってＭＥＳ−ＳＤＳバッファー系を使用して、１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離した。染色は、シンプリー・ブルー・セイフ・ステイン（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ）（コロイド状クマシーＧ２５０）を使用して行った。
【００９４】
図３に見られるように、オボアルブミンは、アスペルギルス由来酵素によって、インキュベーションの最初の４．７５時間で約３５〜３６ｋＤの別個のバンドに切断される（レーン３）。長期のインキュベーション期間によって、種々の分子量の、より小さい生成物への、さらなる分解が生じる（レーン７）。
【００９５】
レーン２と比較して、レーン４、６および８の、よりかすかなバンドによって判断されるように、２７マーペプチドもまた分解する。生成物の、非常に小さい分子量変化（レーン９および８を比較）は、ペプチドのカルボキシ末端でのアルギニン残基の切断による可能性が最も高い。差は約２００Ｄ（アルファイメージャー（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ）２０００システムでアルファイメージャー３．３ｄソフトウエアを使用して測定）であり、アルギニンは、１７４の分子量を有する。この小さい分子量変化は、おそらくは、ペプチドの分解における最初の段階である。
【００９６】
生成物のさらなる崩壊はまた、ＳＤＳゲルでのバンドの強度の減少によってのみ見られる。ゲルにおいて、約１０００の分子量を有する成分の染色はクマシーブリリアントブルーでは可能でないので、さらなる崩壊の生成物は目に見えない。
【００９７】
この実験から、Ｓ９ファミリーに属する公知のプロリルオリゴペプチダーゼとは異なり、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、より大きいタンパク質と比べて、小型のペプチドの切断に対して特異的選択性を有さないと結論付けることができる。このように、黒色アスペルギルス由来酵素は真のエンドプロテアーゼを表し、種々の型のタンパク質を加水分解するための好ましい酵素である。この発見は、以下の実施例に示されるような、酵素の驚くべき使用につながる。
【００９８】
［実施例５］
［カゼイン酸カリウムを黒色アスペルギルス由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼとともにインキュベートすることによってＩＰＰおよびＬＰＰが迅速に生じるが、ＶＰＰは生じない］
この実験において、黒色アスペルギルス由来の、過剰産生された、本質的に純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼを、カゼイン酸カリウムとともにインキュベートして、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰの遊離を試験した。使用したエンドプロテアーゼは、本質的に純粋であり、純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンド型タンパク質分解活性（すなわち、プロリンおよびアラニン残基のカルボキシ末端の切断）以外の有意なエンド型タンパク質分解活性が存在しないことを意味する。さらに、酵素調製物は、実施例３に記載されるように、有意なエキソ型タンパク質分解活性が全くない。
【００９９】
ＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウム取り込みを可能な限り限定するために、カゼイン酸カリウムを、このインキュベーションにおいて基質として使用した。
【０１００】
カゼイン塩を、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度で６５℃の水に懸濁し、その後、リン酸を用いてｐＨを６．０に調節した。次いで、懸濁液を５５℃まで冷却し、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、４単位／ｇのタンパク質の濃度で加えた（単位定義については、材料および方法の項参照）。継続的な撹拌下で、この混合物を２４時間インキュベートした。この期間に、さらなるｐＨ調節は行わなかった。１、２、３、４、８および２４時間のインキュベーション後に試料を採取した。各試料について、試料を９０℃まで５分間迅速に加熱することによって、酵素活性を終了させた。冷却後、リン酸を用いて各試料のｐＨを４．５まで迅速に低下させ、その後、ヘレウス（Ｈｅｒｅａｕｓ）卓上遠心分離機中で懸濁液を５分間３０００ｒｐｍで遠心分離した。完全に透明な上清を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＣ分析に使用して、上清中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦを定量した（材料および方法の項参照）。
【０１０１】
牛乳カゼインは、β−カゼインおよびκ−カゼインを含むいくつかの異なるタンパク質を組み込む。公知のアミノ酸配列によると、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。β−カゼインにおいて、ＩＰＰは配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−中に含まれ、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−中に含まれ、ＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−中に含まれる。κ−カゼインは、酸沈殿カゼイン塩調製物中にほとんど５０％のβ−カゼイン濃度のモル濃度で存在し、ＩＰＰのみを包含する。κ−カゼインにおいて、ＩＰＰは、配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−中に含まれる。カゼインの他のタンパク質成分は、ＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含まない。
【０１０２】
表２および３は、インキュベーション混合物に添加したカゼイン酸カリウム１グラムあたりで計算した、酸性化および遠心分離された上清中に存在するペプチドの濃度を示す。表２に示されるように、ＩＰＰは、１時間のインキュベーション後にその最大濃度に達する。その上、ＩＰＰ濃度はさらに増大はしない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成は、ＩＰＰの生成と同じ速度論を示す。理論的に期待されるように、ＶＶＶＰＰのモル収率は、ＬＰＰペプチドのモル収率と同様である。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの両方の収率は、理論的に実行可能なもののほとんど６０％に達する。３時間のインキュベーションの後にのみＬＰＰの最大濃度に達するということから、β−カゼイン分子のその特定の部分の切断が、おそらくは、いくらか、より難しいことが示唆される。ＶＶＶＰＰと対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦは、全く形成されない。この観察から、プロリン特異的エンドプロテアーゼが、−Ｐ−Ｆ−結合を効率的に切断し、それによってＶＶＶＰＰを生じることが示唆される。トリペプチドＩＰＰは、迅速に形成されるが、そのモル収率は、ＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれの最大モル収率の約３分の１も超えない。ＩＰＰトリペプチドは、κ−カゼインのように両方のβ−カゼイン中に含まれるので、この結果は予想外である。この観察についての可能性のある説明は、プロリン特異的プロテアーゼがＩＰＰを生じることができるが、カゼイン塩のκ−カゼイン部分からのみであるということである。κ−カゼインの関連性のあるアミノ酸配列に関して、このことから、−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合が、酵素のアラニン特異的活性によって切断されることが示唆される。これが正しければ、遊離するＩＰＰの量は、κ−カゼイン中に存在する量のおよそ４０％に達するが、β＋κカゼイン中に理論的に存在するＩＰＰの約１０％を超えない。ＩＰＰの切断のためのこの切断機序はまた、なぜＶＰＰがその前駆体分子ＶＶＶＰＰから形成されることができないかを説明する。必要なエンド型タンパク質分解活性が、単純に、使用される黒色アスペルギルス由来酵素調製物中に存在しない。
【０１０３】
【表２】
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
［実施例６］
５倍濃度のＡＣＥ阻害ペプチドにおける酸カゼイン沈殿工程結果の組み込み
実施例５に記載されているように、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度のカゼイン酸カリウムを、ｐＨ６．０での黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションに供した。種々のインキュベーション期間の後、試料を加熱してさらなる酵素活性を停止させ、その後、ｐＨを４．５まで低下させて、カゼイン可溶性を最小限にした。低速遠心分離によって不溶性カゼイン分子を除去した。表２および３において、本発明者らは、１０％タンパク質の初期濃度に基づいて計算したＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供している。しかしながら、酸性化およびその後の遠心分離工程の結果として、加えたタンパク質の大部分が除去されている。これらの減少した酸性化上清のタンパク質含有量を考慮して、窒素（ケルダール）分析を行った。後者のデータによると、種々の上清が、表４に示されるタンパク質レベルを含むことが見出された。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
これらのデータを考慮して、本発明者らは、各上清中に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算したが、このとき、それらの実際のタンパク質含有量を使用した。これらの再計算したデータを表５に示す。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
表３および５に示されるデータの比較は、単純な酸性化工程、それに続く産業上実行可能な傾瀉、ろ過または低速遠心分離工程によって、特定のＡＣＥ阻害ペプチドの濃度の５倍の増大が生じることを明らかに示す。
【０１１０】
［実施例７］
［濃縮カゼイン加水分解物中の新規および潜在的ＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰの同定］
存在する対生物作用ペプチドのより徹底的な分析を容易にするために、純粋な黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼでの消化によって得られ、酸沈殿によって精製されたカゼイン加水分解物を、調製用規模で調製した。そのため、３０００ｇのカゼイン酸カリウムを２５リットルの７５℃の水に懸濁した。徹底的な均質化の後、稀リン酸を用いてｐＨをゆっくり６．０に調節した。５５℃まで冷却した後、黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、４酵素単位／ｇカゼイン塩の濃度で加えた（単位定義については、材料および方法の項参照）。３時間、５５℃でのインキュベーション（撹拌しながら）の後、濃リン酸をゆっくり加えることによって、ｐＨを４．５まで低下させた。このより大規模な調製において、プロセスのこの部分で、プロリン特異的エンドプロテアーゼを不活化するための熱処理工程を省いた。次いで、懸濁液を迅速に４℃まで冷却し、一晩（撹拌せずに）この温度で維持した。翌朝、透明な上層を傾瀉し、４０％乾燥物質のレベルに達するまで蒸発させた。後者の濃縮液を４秒間１４０℃でのＵＨＴ処理に供し、次いで、５０℃で限外ろ過した。微生物ろ過の後、液体を噴霧乾燥した。この物質を、以下、カゼイン由来対生物作用ペプチド（ＣＤＢＡＰ）と呼ぶ。材料および方法の項で概説したＬＣ／ＭＳ手順を用いて、粉末状生成物のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含有量を測定した。窒素含有量によると、粉末状生成物は、約６０％のタンパク質含有量を有する（６．３８の換算係数を使用する）。粉末のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰ含有量を表６に示す。ＣＤＢＡＰ生成物のアミノ酸組成を表７に示す。酸沈殿の後得られた噴霧乾燥物質のモルプロリン含有量の増大が極めて顕著である：最初の１２％からおよそ２４％まで。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
同定のために、アットラインＡＣＥ阻害アッセイおよび質量分析と組み合わせた２次元クロマトグラフィー分離を用いることによって、ＣＤＢＡＰ中の新規のＡＣＥ阻害ペプチドの存在を調査した。第一の分析において、ペプチド混合物をＯＤＳ３液体クロマトグラフィー（ＬＣ）カラムで分離し、得られた種々の画分からＡＣＥ阻害プロフィールを生成した。第二の分析において、高いＡＣＥ阻害を示す第一のカラムからの画分を、異なるグラジエントプロフィールを用いてバイオスイート（Ｂｉｏｓｕｉｔｅ）ＬＣカラムでさらに分離した。この第二のカラムから収集した画分を２つの部分に分けた。一方の部分をアットラインＡＣＥ阻害測定に使用し、他方の部分をＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析に供して、存在するペプチドを同定した。
【０１１４】
全ての分析は、二重追跡ＵＶ検出器を備えたアライアンス（Ａｌｌｉａｎｃｅ）２７９５ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ、オランダ、エテン・ルール（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））を用いて行った。ペプチドの同定のために、ＨＰＬＣシステムを、同じ供給業者からのＱ−ＴＯＦ質量分析計に結合させた。試験において、ミリＱ水中のＣＤＢＡＰの２０μｌの１０％（ｗ／ｖ）溶液を、５μｍの粒子径の１５０×２．１イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）５ ＯＤＳ３カラム（バリアン、オランダ、ミデルビュルフ（Ｖａｒｉａｎ，Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））上で注入した。移動相Ａは、ミリＱ水中の０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％のＴＦＡ溶液からなった。最初の溶離剤組成は１００％Ａであった。溶離剤は、５分間１００％Ａであり続けた。次いで、１０分で５％Ｂへの線状のグラジエント、続いて１０分間で３０％Ｂへの線状のグラジエントが開始した。Ｂの濃度を５分間で７０％に上げることによってカラムを洗い流し、さらに５分間７０％Ｂで維持した。この後、溶離剤を１分間で１００％Ａに変化させ、９分間平衡化させた。総実行時間は５０分であった。溶離剤流出は０．２ｍｌ分−１であり、カラム温度は６０℃に設定した。ＵＶクロマトグラムを２１５ｎｍで記録した。１分の間隔を用いて溶出液画分を９６ウェルプレートに収集し、２００μｌの画分体積を生じた。ウェル中の溶離剤を、８０μｌの、水酸化アンモニウムの０．０５％水溶液（２５％）を加えることによって中和した。乾燥するまで溶媒を窒素下５０℃で蒸発させた。この後、残渣を４０μｌのミリＱ水中で再構成させ、１分間混合した。
【０１１５】
アットラインＡＣＥ阻害アッセイのために、２７μｌの、２６０ｍＭの塩素濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の３３．４ｍＵ ｍｌ−１ＡＣＥ（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得られた酵素）を加え、混合物を９６ウェルプレートミキサーで５分間、７００ＲＰＭでインキュベートした。インキュベーション期間の後、１３μｌの、ＰＢＳバッファー中の０．３５ｍＭ馬尿酸−ヒスチジン−ロイシン（ＨＨＬ）溶液を加え、７００ＲＰＭで１分間混合した。混合物を、ＧＣオーブン中５０℃で６０分間反応させた。反応の後、融解する氷中でプレートを冷却した。
【０１１６】
次いで、９６ウェルプレートをフラッシュＨＰＬＣカラムで分析した。各ウェルの反応混合物のうち、３０μｌを、同じ供給業者からの１０×４．６ｍｍ ＲＰ１８ｅガードカラムを備えたクロムリスフラッシュ（Ｃｈｒｏｍｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ）ＲＰ１８ｅ ２５×４．６ｍｍ ＨＰＬＣカラム（メルク、ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））上で注入した。アイソクラチック移動相は、水／アセトニトリル７９／２１中のＴＦＡの０．１％溶液からなった。溶離剤流出は２ｍｌ 分−１であり、カラム温度は２５℃であった。１分の間隔で注入を行った。馬尿酸（Ｈ）およびＨＨＬを、２８０ｎｍでモニタリングした。ＨおよびＨＨＬのピークの高さを測定し、各画分のＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）を、等式：
【数１】
に従って計算した。
被分析物のＡＣＥＩαパーセンテージ阻害
Ｄｃｗ 水中の、ＡＣＥによる、ＨＨＬのＨおよびＨＬへの切断の程度
Ｄｃａ 被分析物についてのＨＨＬのＨおよびＨＬへの切断の程度
【０１１７】
Ｈのピークの高さをＨおよびＨＨＬのピークの高さの合計の分数として表すことによって、切断の程度を計算した。
【０１１８】
１８〜２６分の間に溶出している画分中で最も高いＡＣＥ阻害を測定した。この領域を収集し、３μｍの粒子径の１５０×２．１ｍｍバイオスイートカラム（ウォーターズ、オランダ、エテン・ルール（Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））上で再注入した。移動相Ａは、ここでは、ミリＱ水中の０．１％ギ酸（ＦＡ）溶液からなった。移動相Ｂは、メタノール中の０．１％ＦＡ溶液からなった。最初の溶離剤組成は１００％Ａであった。溶離剤は５分間１００％Ａであり続けた。この後、１５分間で５％Ｂへの線状グラジエントが、続いて３０分間で６０％Ｂへの線形グラジエントが開始した。溶離剤は、さらに５分間６０％Ｂであり続けた。最終的に、溶離剤は１分間で移動相Ａの１００％に減少し、１０分間平衡化させた。総実行時間は６５分であった。溶離剤流出は０．２ｍｌ 分−１であり、カラム温度は６０℃に設定した。
【０１１９】
ＵＶ追跡を２１５ｎｍで記録した。バイオスイートカラムから１０秒の間隔で画分を収集した。画分を再び２つの部分に分け、一方の部分を用いて、先に記載したアットラインＡＣＥ阻害方法を用いて活性を測定し、他方の部分を用いて、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳを用いて活性ペプチドを同定した。
【０１２０】
３２６．２０８０Ｄａの分子イオンのクロマトグラフィーピークならびに３３０．２０２９Ｄａおよび３１８．１４８８Ｄａの分子イオンの２つの他のピークは、１８〜２６分の間の面積で測定した、増大したＡＣＥ阻害に対応した。ＭＳ−ＭＳを用いて、これらのペプチドを、それぞれ構造異性体ＩＰＰおよびＬＰＰ（−０．６ｐｐｍ）、ＩＴＰ（−４．８ｐｐｍ）ならびにＭＡＰ（＋２．８ｐｐｍ）として同定した。ペプチドのタンパク質源は、κ−カゼインｆ１０８−１１０（ＩＰＰ）、β−カゼインｆ１５１−１５３（ＬＰＰ）、α−ｓ２−カゼインｆ１１９−１２１（ＩＴＰ）およびβ−カゼインｆ１０２−１０４（ＭＡＰ）である。ＩＰＰおよびＬＰＰは、以前に、それぞれ５および９．６μＭのＩＣ５０値を有するＡＣＥ阻害ペプチドとして報告されている（Ｙ．ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）、Ｍ．ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）、Ｋ．サカイ（Ｓａｋａｉ）、Ａ．オオクボ（Ｏｋｕｂｏ）、Ｓ．ヤマザキ（Ｙａｍａｚａｋｉ）、Ｔ．タカノ（Ｔａｋａｎｏ）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７８（１９９５年）７７７〜７８３頁、Ｙ．アリョシ（Ａｒｙｏｓｈｉ）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ．４（１９９３年）１３９〜１４４頁）。しかしながら、トリペプチドＩＴＰおよびＭＡＰは、本発明者らの知る限りでは、能力のあるＡＣＥ阻害ペプチドとして、これまでに報告されていない。
【０１２１】
ＭＡＰ、ＩＴＰおよびＩＰＰを、化学的に合成し、各ペプチドの活性を、本明細書中で後述する改変マツイアッセイを用いて測定した。
【０１２２】
正イオンエレクトロスプレー、多重反応モニタリングモードで稼働するマイクロマスクアトロ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ）ＩＩ ＭＳ装置で、種々の試料中のＭＡＰおよびＩＴＰの定量を行った。使用したＨＰＬＣ方法は、上述したものと同様であった。ＭＳ設定（ＥＳＩ＋）は以下の通りであった。コーン電圧３７Ｖ、キャピラリー電圧４ｋＶ、３００ｌ／時間の乾燥気体窒素。供給源および噴霧器温度：それぞれ１００℃および２５０℃。合成ペプチドを使用し、ＭＡＰについては前駆体イオン３１８．１ならびに合計生成物イオン２２７．２および３４７．２を用いて、ＩＴＰについては前駆体イオン３２０．２ならびに合計生成物イオン２８２．２および５０１．２を使用して、較正線を準備した。これらの分析によると、新規のＡＣＥ阻害トリペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ＣＤＢＡＰ生成物中に、２．９ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰまたは４．８ｍｇ ＭＡＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ中のタンパク質および０．９ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ、１．４ｍｇ ＩＴＰ／ｇ ＣＤＢＡＰ中のタンパク質で存在する。
【０１２３】
ＭＡＰおよびＩＴＰのＡＣＥ阻害活性を測定するために、化学的に合成したトリペプチドを、いくらかの小さな改変とともに、マツイら（マツイ（Ｍａｔｓｕｉ），Ｔ．ら（１９９２年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：５１７〜５１８頁）の方法に従ってアッセイした。種々のインキュベーションを表８に示す。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
４つの試料のそれぞれは、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２５０ｍＭのホウ酸塩溶液、ｐＨ８．３に溶解した７５μｌの３ｍＭ馬尿酸ヒスチジンロイシン（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、シグマケミカル）を含んだ。ＡＣＥをシグマケミカルから得た。混合物を３７℃でインキュベートし、３０分後に、１２５μｌの０．５Ｍ ＨＣｌを加えることによって停止させた。続いて、２２５μｌのビシン／ＮａＯＨ溶液（１Ｍ ＮａＯＨ：０．２５Ｍビシン（４：６））を加え、その後２５μｌの０．１Ｍ ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、フルカ、スイス（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４中）を加えた。３７℃で２０分間のインキュベーション後、０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４中の４ｍｌの４ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３を加え、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（ＣＰＳコントローラを有する、シマヅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＵＶ−１６０１、オランダ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））で４１６ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１２６】
ＡＣＥ阻害（ＡＣＥＩ）活性の量を、以下の式に従って、阻害薬なしでのＡＣＥの転換速度と比較した阻害のパーセンテージとして計算した。
ＡＣＥＩ（％）＝（（対照１−対照２）−（試料１−試料２））／（対照１−対照２））＊１００
式中、
対照１＝ＡＣＥ阻害成分なしでの吸光度（＝最高ＡＣＥ活性）［ＡＵ］
対照２＝ＡＣＥ阻害成分なしおよびＡＣＥなしでの吸光度（バックグラウンド）［ＡＵ］
試料１＝ＡＣＥおよびＡＣＥ阻害成分ありでの吸光度［ＡＵ］
試料２＝ＡＣＥ阻害成分ありだがＡＣＥなしの吸光度［ＡＵ］
【０１２７】
得られた、化学的に合成されたＭＡＰおよびＩＴＰトリペプチドのＩＣ５０を、実験のスクリーニング期に使用されるアットライン測定において得られたＩＣ５０値とともに表９に示す。種々の測定のための内部標準として、化学的に合成されたＩＰＰの測定が含まれた。
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
［実施例８］
新規のＡＣＥ阻害ペプチドＭＡＰおよびＩＴＰは、ヒト胃腸管内で残存するようである。
消費後、食物タンパク質およびペプチドは、胃腸管内で種々の消化酵素処理に曝露される。ヒト胃腸管内での、新しく同定された対生物作用ペプチドの安定性を評価するために、ＣＤＢＡＰ調製物（実施例７に記載されているように調製した）を、人体で典型的に見られる消化条件をシミュレートする胃腸処理（ＧＩＴ）に供した。ＧＩＴモデルシステムにおいて種々のインキュベーション時間の後に得られた試料を、オンラインＨＰＬＣ−バイオアッセイ−ＭＳまたはＨＲＳ−ＭＳシステムを用いて分析して、任意の残ったＭＡＰおよびＩＴＰペプチドを定量した。１００ｍｌフラスコを組み込んだ標準化された混合装置（バンケル、米国（Ｖａｎｋｅｌ，ＵＳ）によって供給されるような）においてＧＩＴ手順を行った。水浴の温度を３７．５℃に設定し、撹拌棒速度を、試料が懸濁液で維持されるように選択した（１００ｒｐｍ）。
【０１３０】
約３．４ｇのＣＤＢＡＰ（およそ６０％のタンパク質レベル）を、１００ｍｌのミリＱ水に溶解／懸濁した。胃のシミュレーションの間、５Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨを低下させた。胃のシミュレーションの終わりおよび十二指腸期の間に、５Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを上昇させた。
【０１３１】
ＣＤＢＡＰ懸濁液を３７．５℃まで予熱し、５ｍｌの懸濁液を除去して、０．３１ｇのペプシン（フルカ 注文番号７７１６１）を溶解させた。ｔ＝０分で、ここで溶解されたペプシンを含む５ｍｌを懸濁液に戻し加えた。次いで、以下の概要に従って、別々のｐＨメーターを用いて、手作業でＣＤＢＡＰ懸濁液のｐＨをゆっくり調節した。
ｔ＝２０分 ｐＨを３．５まで低下させる
ｔ＝４０分 ｐＨを３．０に
ｔ＝５０分 ｐＨを２．３に
ｔ＝６０分 ｐＨを１．８に
ｔ＝６５分 ｐＨを２．７に上昇させる
ｔ＝７５分 ｐＨを３．７に
ｔ＝８０分 ｐＨを５．３に
ｔ＝９０分で、別の５ｍｌのＣＤＢＡＰ懸濁液中で０．１３９ｇの８倍ＵＳＰパンクレアチン（シグマ 注文番号Ｐ７５４５）を注意深く混合し、直ちに戻し加えた。インキュベーションを、以下の概要に従って継続した。
ｔ＝９３分 ｐＨを５．５に
ｔ＝９５分 ｐＨを６．３に
ｔ＝１００分 ｐＨを７．１に
ｔ＝１２５分で実験を停止し、ｐＨを調べた（依然としてｐＨ７であった）。
【０１３２】
次いで、試料をビーカーに移し、沸騰するまでマイクロ波中に置いた。続いて、試料をガラスチューブに移し、９５℃で６０分間インキュベートして、全てのプロテアーゼ活性を不活化した。冷却後、試料をファルコンチューブに移し、３０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を凍結乾燥した。得られた粉末の総Ｎ濃度を測定し、カゼインのケルダール係数（６．３８）を用いてタンパク質レベルに変換した。これらのデータによると、ＧＩＴ手順の後のＣＤＢＡＰ調製物のタンパク質レベルは４８．４％であった。ＧＩＴ手順によるタンパク質分解処理にもかかわらず残存するＭＡＰおよびＩＴＰのレベルを、実施例７に記載されているように測定し、得られたデータを表１０に示す。
【０１３３】
実験の結果によると、ＭＡＰおよびＩＴＰの両方が、ＧＩＴ消化に対して高い抵抗性を示す。これらのトリペプチドの低いＩＣ５０値と組み合わせて（実施例７においても測定されるように）、データから、２つの新規のＡＣＥ阻害ペプチドの、血圧降下ペプチドとしての相当な可能性が示唆される。
【０１３４】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの最適ｐＨのグラフ表示。
【図２】黒色アスペルギルス由来プロリルエンドプロテアーゼの特異性プロフィール。
【図３】クロマトグラフィーによって精製した黒色アスペルギルス由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションの後の、インタクトなオボアルブミンおよび合成２７マーペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはトリペプチドＩＴＰならびに／またはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩。
【請求項２】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩を含むタンパク質加水分解物。
【請求項３】
５〜５０％、好ましくは１０〜４０％のＤＨ、より好ましくは２０〜３５％のＤＨを有する、請求項２に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項４】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩を含むペプチド混合物。
【請求項５】
少なくとも１ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、好ましくは
少なくとも２ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、より好ましくは
少なくとも４ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質
を含む、請求項４に記載のペプチド混合物。
【請求項６】
５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの量がペプチド混合物の少なくとも３０重量％（乾燥物質）、好ましくはペプチド混合物の３５〜７０重量％（乾燥物質）の間である、請求項４または５に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
ＩＰＰまたはＬＰＰをさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物または請求項２もしくは３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項８】
１〜９０％の水、好ましくは１〜３０％の水、より好ましくは１〜１５％の水を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物または請求項２もしくは３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項９】
タンパク質の酵素加水分解、ならびに場合によりＭＡＰおよび／またはＩＴＰをその塩に転換することを含む、トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰならびに／またはその塩を生成する方法。
【請求項１０】
プロテアーゼ、好ましくはプロリン特異的プロテアーゼを使用して、適したタンパク質を加水分解することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはトリペプチドＩＴＰならびに／またはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩。
【請求項２】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩を含むタンパク質加水分解物。
【請求項３】
５〜５０％、好ましくは１０〜４０％のＤＨ、より好ましくは２０〜３５％のＤＨを有する、請求項２に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項４】
ＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰまたはＭＡＰの塩および／もしくはＩＴＰの塩を含むペプチド混合物。
【請求項５】
少なくとも１ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、好ましくは
少なくとも２ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質、より好ましくは
少なくとも４ｍｇのＭＡＰ／ｇタンパク質
を含む、請求項４に記載のペプチド混合物。
【請求項６】
５００Ｄａ未満の分子量を有するペプチドの量がペプチド混合物の少なくとも３０重量％（乾燥物質）、好ましくはペプチド混合物の３５〜７０重量％（乾燥物質）の間である、請求項４または５に記載のペプチド混合物。
【請求項７】
ＩＰＰまたはＬＰＰをさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物または請求項２もしくは３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項８】
１〜９０％の水、好ましくは１〜３０％の水、より好ましくは１〜１５％の水を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のペプチド混合物または請求項２もしくは３に記載のタンパク質加水分解物。
【請求項９】
タンパク質の酵素加水分解、ならびに場合によりＭＡＰおよび／またはＩＴＰをその塩に転換することを含む、トリペプチドＭＡＰおよび／もしくはＩＴＰならびに／またはその塩を生成する方法。
【請求項１０】
プロテアーゼ、好ましくはプロリン特異的プロテアーゼを使用して、適したタンパク質を加水分解することを含む、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５３９２０４（Ｐ２００８−５３９２０４Ａ）
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０８２２６（Ｐ２００８−５０８２２６）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１８８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４４４１
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ペンティアム
２．ＰＥＮＴＩＵＭ
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６１８８３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１４４４１
【国際公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ペンティアム
２．ＰＥＮＴＩＵＭ
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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