血管障害、異常脂質血症および関連疾患の治療用の新規治療標的
本発明は、ＨＤＬレベルの調節および／またはそれを必要とする患者における血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療のための組成物と方法を扱う。本発明はまた、ここでの新規治療標的の同定に基づく前記疾患の治療のための治療物質の同定のための方法を含む。本発明はまた、ここで示された治療標的を用いる診断および薬理ゲノミクスの組成物および方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年６月２７日に出願された合衆国仮出願６０／３９１８７８号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、病気の診断および治療、特に低アルファ蛋白血症（ｈｙｐｏａｌｐｈａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）を含む異常脂質血症および低ＨＤＬ疾患等の心疾患の診断および治療のための新規治療標的である遺伝子９５の発見に関し、また、前記疾患の予防、治療あるいはそうでなければ改善に有用な治療因子およびその治療因子のスクリーニングおよび同定方法の発見に関する。
【背景技術】
【０００３】
疫学研究は、血漿高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）濃度と、血管障害、特に心疾患（ＣＶＤ）および冠動脈疾患（ＣＡＤ）の発生とが反比例の関係にあることを相次いで示してきた。ＨＤＬ−Ｃレベルは大きく等級分けされ、また独立した心血管系危険因子である。増加したＨＤＬ−Ｃの保護効果は、８０歳まで持続する。低ＨＤＬ−Ｃは、正常総血漿コレステロールレベル（＜５．２ｍｍｏｌ／ｌ）であっても、ＣＡＤ危険性の増加に関連する。他の異常脂質血症あるいは二次因子に直面しても、ＨＤＬ−ＣレベルはＣＡＤの重要な予測判断材料である。低ＨＤＬコレステロール（重症例では低アルファ蛋白血症と呼ばれる）はまた、脳血管疾患、冠動脈再狭窄および抹消血管障害に関わる。
【０００４】
低ＨＤＬ−Ｃレベルの薬理学的介入は、今までのところ十分に証明されてはいない。現在、直接的で有効な方法でＨＤＬレベルを調節するＦＤＡの承認した治療物質はない。ＨＤＬの調節に関する現在の研究方法は、ＡｐｏＡ１の産生の増加、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）の速度の促進およびＨＤＬの異化代謝の減少を含む。例えば、ＡｐｏＡ１レベルの増加は、転写の小分子上向き調節を介して、あるいはＡｐｏＡ１タンパク質の注入により可能であろう。あるいは、ＡＢＣＡ１作用薬の作成および抹消組織からのコレステロール流出の増加によりＲＣＴの上向き調節が可能であろう（ＰＣＴ公開ＷＯ００／５５３１８参照、参照としてここに組込まれている）。ＨＤＬの異化代謝は、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を含む多くの酵素により調節され、これはまたＨＤＬ調節のための適切な治療標的であり得る。
【０００５】
ヒトにおいてＨＤＬレベルを調節するように働くさらなる遺伝子と対応するタンパク質の同定は、薬剤開発における追求のための治療方法の合理的な選択を可能にするだろう。本発明は、血管障害および異常脂質血症の治療における治療上の介入のための新規標的の発見と、低ＨＤＬレベルおよび付随する障害の症状の軽減に有用な治療物質を選別し、同定するための前記標的の使用に関する。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の簡単な要約）
本発明は、ヒト由来の完全遺伝子９５ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３）および遺伝子９５アミノ酸配列（配列番号４）を提供する。本発明はさらに、ヒトの遺伝性低ＨＤＬ疾患に関連する遺伝子の突然変異型の同定により、ＨＤＬコレステロールレベルの主要な調節因子としての遺伝子９５の役割と機能を同定する。
【０００７】
一態様において、本発明は遺伝子９５の精製核酸配列と精製および半精製形態を含むその断片を提供し、また遺伝子９５ヌクレオチド成分を含む組換細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）およびウイルスあるいは細胞抽出物を提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、精製遺伝子９５タンパク質と精製および半精製形態を含むその断片を提供し、また遺伝子９５生物学的活性を持つ細胞あるいは細胞抽出物および抗遺伝子９５抗体、そのようなポリペプチドの作成方法を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＨＤＬレベルを調節し、かつ／または血管障害あるいは異常脂質血症を治療する候補化合物か否かを判断するための方法を提供する。この方法は、（ａ）遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性の測定、（ｂ）この生物学的活性を促進する条件下での、この生物学的活性の発生源と候補化合物の接触、および（ｃ）前記接触の結果としての前記遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性における変化の測定を含む。ここで生物学的活性の変化は、前記生物学的活性を調節し、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用である化合物として、候補化合物あるいは候補化合物の類似体を同定する。遺伝子９５活性を分析する他の方法はまた、本発明によって明確に意図されている。
【００１０】
他の態様において、本発明は、ＨＤＬレベルを調節し、かつ／または血管障害あるいは異常脂質血症を治療するための化合物をコンピュータにより同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）（例えば、Ｘ線結晶学あるいはその他の技術を介して）選択された遺伝子９５タンパク質の活性部位を決定し、（ｂ）コンピュータによるモデリングを介した、活性部位と相互作用する化合物の同定、それによるＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用な化合物としての化合物あるいはその類似体の同定を含む。
【００１１】
他の態様において、本発明は、必要とするヒトに、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の活性を調節する化合物を投与することを含む、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療のための方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の突然変異、例えば配列番号６から９あるいは表１中に特定された突然変異の同定を含む、血管障害および異常脂質血症の診断のための手段および／または血管障害および異常脂質血症を治療するための治療物質の薬理ゲノム学を提供する。
【００１３】
（定義）
ここで用いられるように、以下の用語は、別に明示されない限り、指定された意味を持つ。
【００１４】
ここで用いられるように、“遺伝子９５に相当する遺伝子”の意味での“相当”という用語は、遺伝子が指定されたヌクレオチド配列を持つか、あるいは指定された配列によりエンコードされるものと同じＲＮＡを実質的にエンコードすることを意味し、“実質的に”という用語は、遺伝子９５生物学的活性を持つタンパク質をエンコードする配列の全体と最低約５０％同一であることを意味し、より好ましくは最低約６０％、７０％、８０％、９０％あるいはそれ以上同一であり、他で定義されるように、その接合変異体を含む。
【００１５】
“遺伝子９５に相当する”はまた、他の生物由来の遺伝子９５の同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）あるいはオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）および、ヌクレオチドあるいはアミノ酸レベルで最低約５０％の同一性、より好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％あるいはそれ以上の相同性を持つその配列変異体を含む。好ましくは、前記遺伝子は真核生物由来であり、より好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類あるいはヒト由来である。本明細書に記載されているヒト遺伝子およびタンパク質は、他の種から得られる幅広い種類の同族体、オーソログおよび類似体の代表である。これらの同族体、オーソログおよび／または類似体、およびこれらの適当な変異体は、本発明の組成物および方法に用いることができる。例えば、記載されたヒト遺伝子のマウス同族体を用いるスクリーニング分析はまた、ヒトを治療するための潜在的な治療物質を同定するためのスクリーニング分析に用いることができる。
【００１６】
そのようなものとして、本発明は、これらの他の種由来のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）、同族体、および領域基盤により領域上に確認されたように、翻訳されたときに、アイソフォームの生物学的活性を保持する類似配列の使用に関する。前記類似配列は、配列番号３あるいは配列番号４と好ましくは５０％以上の同一性を共有し、より好ましくはここに記されたアイソフォームと６０％、７０％、８０％および最も好ましくは最低約９０％の同一性を共有する。これらの配列の全ては、生物学的活性の調節における試験化合物の効果を測定するために十分な治療標的生物学的活性を保持するのであれば、本発明の方法の実施において有用であり得る。前記理解は、ここに開示された示唆に基づいて、この分野における通常の知識を有する者が利用可能である。
【００１７】
さらに本発明にしたがって、“パーセント同一性”あるいは“パーセント同一性の”という用語は、配列を示す場合には、配列が、比較される配列（“比較配列”）の、開示あるいは請求された配列（“参照配列”）との位置合わせ（アライメント）の後に、請求あるいは開示された配列と比較されることを意味する。その後パーセント同一性は以下の公式にしたがって測定される：
パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
ここでＣは、参照配列と比較配列との間のアライメントの全長にわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、ここで（ｉ）比較配列中に対応するアライメントされた塩基あるいはアミノ酸のない参照配列中の各塩基あるいはアミノ酸および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップおよび（ｉｉｉ）比較配列中のアライメントされた塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列中のアライメントされた各塩基あるいはアミノ酸が差異を構成し、Ｒは、参照配列中に構成されたギャップも塩基あるいはアミノ酸として数に入れた、比較配列とのアライメントの全長の参照配列中の塩基あるいはアミノ酸の数である。
【００１８】
アライメントが比較配列と参照配列との間に存在し、それに対する上記のように計算されたパーセント同一性が規定の最小パーセント同一性と同等あるいはそれ以上である場合には、たとえアライメントが、上記の算出されたパーセント同一性が規定のパーセント同一性以下である場合に存在したとしても、比較配列は参照配列に対して規定の最小パーセント同一性を持つ。
【００１９】
ここで用いられるように、“部位”、“分節”および“断片”という用語は、ポリヌクレオチドに関して用いられた場合、ヌクレオチド残基の連続した配列を示し、この配列はより大きな配列の一部を形成する。前記用語は、前記ポリヌクレオチドの任意の共通エンドヌクレアーゼでの処理により産生された生成物、あるいは合成的に合成することが可能なポリヌクレオチドの伸長を含む。これらは、対応遺伝子のエキソンおよびイントロン配列を含み得る。
【００２０】
ここで用いられる場合の“治療標的生物学的活性”（あるいは“生物学的活性”のみ）は、以下の（ａ）から（ｄ）に示された実施例を含むがこれに限定されない治療標的遺伝子およびタンパク質の直接あるいは間接的に測定可能で同定可能な生物学的活性の全てに関連する非常に広い用語である。
【００２１】
（ａ）精製された治療標的タンパク質に関し、治療標的生物学的活性は、全ての生物学的プロセス、リガンド、タンパク質、膜成分あるいは（小有機化合物等の）その他の化合物の相互作用あるいは結合、結合様式、結合活性関係、ｐＫａ、ｐＤ、酵素反応速度、安定性およびタンパク質の機能評価を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
（ｂ）細胞画分、再構成細胞画分あるいは細胞全体における治療標的生物学的活性に関し、これらの活性は、リガンドあるいは抗体の結合様式、およびシグナル伝達系、細胞成分の流出、流入あるいは蓄積、安定性あるいは劣化、膜構成および様式、細胞増殖、進行あるいは様式および治療標的活性のその他の直接あるいは間接的効果の測定等の、この効果の測定可能な全ての結果を含むがこれらに限定されない。
【００２３】
（ｃ）治療標的遺伝子および転写に関し、治療標的生物学的活性は、治療標的ｍＲＮＡあるいはその代わりの転写産物を産生するＤＮＡの転写の割合、規模あるいは範囲、前記転写の調節タンパク質の影響、前記転写の調節タンパク質の調節因子の影響、加えて、ｍＲＮＡ転写産物、転写後プロセッシング、ｍＲＮＡ量および折り返しの安定性および様式、ｍＲＮＡのポリペプチド配列への翻訳の全ての測定結果を含む。
【００２４】
生物における治療標的生物学的活性に関し、これは、これらの生物における異常な治療標的生物学的活性により引き起こされる疾病過程あるいは障害において、欠如あるいは欠乏により同定される生物学的活性を含むがこれらに限定されない。大まかに言って、治療標的生物学的活性は、この分野において知られているタンパク質および遺伝子の生物学的性質を分析するための全ての方法によって測定することができる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明にしたがって、ヒトのＨＤＬレベルの維持に関連する遺伝子およびタンパク質は、実施例１に示されたポジショナルクローニング法を用いた、低ＨＤＬレベルを持つファミリーにおける遺伝子の突然変異型の同定により、判定される。
【００２６】
ＢＣ−１１Ｍファミリーの系統は図１に示される。連鎖を定義するために用いられるファミリーの表現型は、高い浸透度の常染色体優性種における低ＨＤＬ（低アルファ蛋白血症）形質を分離する。他の脂質条件（トリグリセリド（ＴＧ）および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ））は、このファミリーでは正常であり、他の交絡因子（肥満および糖尿病等）はない。このファミリーでは特に心疾患および冠動脈疾患の強い徴候があり、多数が心事故（心筋梗塞（ＭＩ）、発作および狭心症）を経験し、この疾患の症状についての治療（冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）等）を受けている。このファミリーの一部は（狼瘡および自己免疫疾患に関連する）ベーチェット症候群であり、他の一部はセリアック病（グルテン不耐性）であり、残りは甲状腺に異常を持つ。
【００２７】
このファミリーは、ＡＢＣＡ１のコード領域には野生型配列を持つため、これまでに同定されたＡＢＣＡ１中の低ＨＤＬを引き起こす突然変異により識別する。加えて、ＡＢＣＡ１遺伝子は、このファミリーの遺伝的特徴に基づいて、またこのファミリーの病気の個体由来の培養線維芽細胞における正常コレステロール流出測定結果に基づいて除外される。
【００２８】
ＮＬ−００３ファミリーの系統は図２に示される。発端者（ＩＩ：３５）は５分の１百分率（ｆｉｆｔｈ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）（年齢および性別修正済み）以下のＨＤＬレベルを持つ。体重超過／肥満（ＢＭＩ＞２５＞３０）はほとんどないが、この状態はＨＤＬ条件と十分に共分離しておらず、したがって関連していないこともある。
【００２９】
ＮＬ−１２０ファミリーの系統は図３に示される。この場合もやはり、発端者（ＩＩ：０１）は５分の１百分率（ｆｉｆｔｈ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）（年齢および性別修正済み）以下のＨＤＬレベルを持つ。ＮＬ−００３およびＮＬ−１２０の両方において、多くの低ＨＤＬの個体が観察される。ＮＬ−００３ファミリーにおいて、低ＨＤＬ、心疾患および心事故（ＭＩ）の個体が観察される。
【００３０】
したがって、本発明にしたがって同定された遺伝子は、第９染色体上、９ｑ２２バンド上あるいはその近傍に位置する。この遺伝子座の標識（マーカー）は同定され、以下の通りである：９ｑ２２ｃａ７（配列番号１）および９ｑ２２ｃａ１７（配列番号２）。他のマーカーは共有財産として入手可能である。
【００３１】
遺伝子９５およびその突然変異の説明
遺伝子９５は知られており、ここではＰ１Ｇ９５、遺伝子９５、Ｇ９５あるいはＨＤＬ調節タンパク質として記載されている。遺伝子９５の性状は、公共データベース中の様々な情報源で開示されている。
【００３２】
ゴールデンパス ジーン（Ｇｏｌｄｅｎｐａｔｈ Ｇｅｎｅ）ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１３６９２５、転写産物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００２５９４５２を含む（ヒトゲノムプロジェクトワーキングドラフトのゴールデンパス アセンブリ、ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕあるいはアンサンブルウェブサイトｗｗｗ.ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ、２００１年８月実施版で見られる）。
【００３３】
ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：ＡＫ０５６４５３、ＸＭ＿０８８５７３（ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｑｉで入手可能である）。この分野における通常の知識を有する者は、遺伝子９５の正確な全長ヌクレオチドコード配列を提供せず、また翻訳されたときに遺伝子９５の正確なアミノ酸配列も提供しないことを認識するであろう。
【００３４】
遺伝子９５（Ｐ１Ｇ９５）の全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号３に示され、５′ＵＴＲおよび３′末端を含む４３３３ｂｐ転写産物を含む。遺伝子９５のエキソン／イントロン構造は、図４に示される。前記遺伝子は、エキソン６（“エキソン６ａｌｔ”あるいはＥ６ａ）およびエキソン９（“エキソン９ａｌｔ”あるいはＥ９ａ）に対する可能性のある代替転写産物を伴う１０エキソンを含む。図４は、予想される１０エキソン構成およびＥ６ａあるいはＥ９ａを用いた他の可能性のある転写産物を示す。
【００３５】
遺伝子９５タンパク質は、５１６アミノ酸タンパク質（配列番号４）を含む。代替メチオニン開始部位の使用は、４８９アミノ酸の配列を生成し得る。遺伝子９５のタンパク質配列の分析は、ヒトの血清脂質恒常性の維持に関連する水溶性タンパク質の特徴を持つことを示している。前記タンパク質は、一つあるいはそれ以上の以下の特徴を含むと思われる：Ｎ−グリコシル化部位（ＰＳ００００１）、グリコサミノグリカン結合部位（ＰＳ００００２）、４ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４）、１２タンパク質キナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５）、８カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６）、８Ｎ−ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）部位（ＰＳ００００８）、ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型領域（ドメイン）（ＰＳ５０１５７）、システインに富む（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ；システインリッチ）領域（ＰＳ５０３１１）。
【００３６】
配列番号３について、残基１から４００は５′−ＵＴＲ（非翻訳領域）に相当し、一方３′ＵＴＲは残基１９５２から末端までを含む。配列番号６の突然変異配列について、Ｔ１８０２Ｇ突然変異を示し、５′−ＵＴＲ領域は残基１から４００によって示され、３′−ＵＴＲ領域は残基１９５２から末端までによって示される。配列番号８の突然変異配列について、１７０６Ｃ１７０７突然変異を示し、５′−ＵＴＲ領域は残基１から４００によって示され、３′−ＵＴＲ領域は残基１９５２から末端までによって示される。
【００３７】
遺伝子９５は、仮定的で、まだ特徴が分かっていない細菌タンパク質のグループに最も密接に関連するロダネーゼ様（Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ−ｌｉｋｅ）ドメインを持つ。例示的なロダネーゼ様ドメインはアミノ酸３０４から４０６に見られる。仮定的あるいは“ロダネーゼ様”もしくは“スルフルトランスフェラーゼ関連”タンパク質以外に、この遺伝子と類似する他のヒト遺伝子はない。ロダネーゼドメインは、チオ硫酸スルフルトランスフェラーゼ（例えば、ロダネーゼ；ＩＰＲ００１３０７）中に見られる。公共データベースの検索は、ヒトゲノム中の２１個をロダネーゼドメインと認定した。一つは血小板粘着分子であり、残りはホスファターゼである。ＤｎａＪセントラルドメイン（例えば［ＣＸＸＣＸＧＸＧ］４；アミノ酸４２２から４８０）、ＸＳジンクフィンガードメイン（例えばアミノ酸４５８−４６５）およびインテグラーゼ部位（例えば、アミノ酸４５２−４６５）等の他のドメインもまた示される。
【００３８】
図５は、個々のエキソン、プロモーター（ゲノムの）からのいくつかの配列およびイントロン領域（特にスプライス部位接合部）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。説明：小文字は、成熟ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡの一部を形成しないイントロン領域である。“．．．”は、公共データベースから入手可能なイントロン領域であり、ここでは含まれない。大文字は、ヌクレオチド塩基あるいはアミノ酸（文中で示されるように、標準表記記号が用いられている）である。“＊”は、終止コドンである。＋１、＋２、＋３は、核酸の翻訳のフレームシフトである。正確なアミノ酸配列の前後の短読み取り枠（ショートオープンリーディングフレーム）は完全性のために用いられるが、遺伝子９５タンパク質の一部を形成しないと思われる。ここで、エキソンＥ１は配列番号１８の一部であり、エキソンＥ２は配列番号１９の一部であり、エキソンＥ３は配列番号２０の一部であり、エキソンＥ４は配列番号２１の一部であり、エキソンＥ５は配列番号２２の一部であり、エキソンＥ６は配列番号２３の一部であり、エキソンＥ７は配列番号２４の一部であり、エキソンＥ８は配列番号２５の一部であり、エキソンＥ９は配列番号２６の一部であり、エキソンＥ１０は配列番号２７の一部であり、エキソンＥ６ａは配列番号２８の一部であり、エキソンＥ９ａは配列番号２９の一部である。ここでエキソン６ａは、代替エキソン６（“エキソン６ａｌｔ”）（不完全タンパク質（ｔｒｕｎｃａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ））であり、一方エキソン９ａは、代替エキソン９（“エキソン９ａｌｔ”）（より長いが、不完全である）である。加えて、ｃｔｔｔｇａ（配列番号３０）は、新規イントロン配列の開始点を示す。遺伝子９５配列は、ゲノムＤＮＡの約３４ｋｂにわたる。完全に示されていないイントロンは、公共ヒトゲノム配列データベース、ゴールデンパスから得ることができる。文中で指示されたように、小文字はイントロンおよびプロモーター領域を示し、大文字はｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡ中のヌクレオチドまたはアミノ酸を示す。エキソン１およびエキソン２は一つあるいはそれ以上の星印（“＊”）を持つ。推定上の終止コドンがある。真の開始メチオニンは、星印の後のエキソン２中の最初のメチオニンだと思われる。星印はまたエキソン１０にも見られる。最初の星印は、５１６アミノ酸のポリペプチドを産生する、予想される終結部位である。残りのアミノ酸翻訳物は、完全にすることを目的として示されており、機能性タンパク質にはならないと思われる。エキソン６ａおよびエキソン９ａは終止コドンを含む。これらの代替エキソンが用いられた場合、これらは図のように不完全タンパク質になると思われる。
【００３９】
相同性：全長タンパク質中で、ヒト遺伝子９５に最も近い同族体は、ロダネーゼ関連スルフルトランスフェラーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＢｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）と２９から３４％の同一性を持つ。相同性の最も高い仮定的な細菌タンパク質は、Ｑ９ＲＶＣ９＿ＤＥＩＲＡ／１１９−２１６；Ｑ５５６１３＿ＳＹＮＹ３／１１３−２１０；Ｑ９Ｚ７Ｈ１＿ＣＨＬＰＮ；０８４６３２＿ＣＨＬＰＮ／１１３−２１２；０８４６３２＿ＣＨＬＴＲ／１１３−２１２；０３４１３１＿ＬＡＣＬＡ／１１６−２１３；０３１４５７＿ＢＡＣＳＵ／１１６−２１３（ＹＢＦＱタンパク質）を含む。
【００４０】
本発明はまた、遺伝子９５の最初の非ヒト哺乳類同族体である、マウス遺伝子９５タンパク質（配列番号５）を開示し、請求する。この配列はヒト遺伝子９５と、タンパク質の全長にわたっておおよそ７６％の配列同一性を持つ。ヒトおよびマウスアミノ酸配列は、図６に並べられている。共通するアミノ酸は、保存性および非保存性変換とともに、示されている。
【００４１】
他の哺乳類由来の短核酸配列分節についてのさらなる調査は、哺乳類種がヌクレオチドレベルで、概ね保存された遺伝子９５配列を共有することを示す。特に、
ヒト：ウシは、重複配列に基づいて５１４／５６５（９０％）同一である。ヒト：ラットは、重複配列に基づいて３３８／４０１（８４％）同一である。ヒト：ブタは、重複配列に基づいて２２８／２６５（８６％）同一である。ヒト：マウスは、重複配列に基づいて２６６／３０７（８６％）同一である。
【００４２】
発現パターン：ＥＳＴ検証に基づいて、前記遺伝子は以下の組織および細胞系中に発現することが示されている：奇形癌、脳、胎座、卵巣腫瘍、リンパ腫、メラノーマ、神経芽細胞腫。実施例２および３のデータは、幅広い組織中での発現を確認している。
【００４３】
ＢＣ−１１Ｍファミリー中に見られる突然変異１は、Ｓｅｒ４６８Ａｌａ 突然変異、配列番号７を引き起こす１８０２Ｔ＞Ｇ（配列番号６）として同定された。突然変異は、１３体の病気に冒されたファミリー構成員中に存在し、１０体の病気に冒されなかったファミリー構成員中に存在しなかった。突然変異は、１９８のコントロール染色体中に存在せず、また高ＨＤＬの個体由来の１６４の染色体中にも存在しなかった。両コントロール群は、ＢＣ−１１Ｍファミリーと類似した民族性であった。前記突然変異は、推定上のタンパク質キナーゼＡリン酸化部位（ＰＫＡ−ｂａｓｉｃ−ｂａｓｉｃ−ｎｅｕｔｒａｌ−Ｓｅｒ）の消失をもたらし得る。この突然変異は、マウスタンパク質中に保存されているセリン残基を変換する。
【００４４】
５分の１百分率未満のＨＤＬレベルを持つＮＬ−００３ファミリー中の個体由来の突然変異２は、１７０６Ｃ１７０７挿入配列番号８を含む。この挿入は、Ｑ４３６のコドンの第二塩基中であり、Ｑ４３６Ｐおよび、成熟前終止コドン４７５ａａ全体（配列番号９および残基１４のメチオニンから計数）を産生する３９の追加の特異アミノ酸をもたらす。突然変異２はまた、５分の１百分率未満のＨＤＬを持つＮＬ−１２０ファミリー由来の個体中に観察される。突然変異２は、民族性の類似する２２８のコントロール染色体中には観察されなかった。
【００４５】
突然変異１および突然変異２のアミノ酸配列とヒト遺伝子９５の野生型アミノ酸配列を並べたものが図７に示される。
【００４６】
遺伝子９５のコード領域の一塩基変異多型（ｃＳＮＰｓ）およびその他の多型は同定され、表１に示される。これらのｃＳＮＰｓは、もしあれば、同定されたアミノ酸変換をもたらす。遺伝子９５のエキソンあるいはイントロン領域中のその他のｃＳＮＰｓおよび多型はまた、この分野における通常の知識を有する者が同定することができる。
【００４７】
開始ＲＮＡ転写産物の最終ｍＲＮＡへの変換において行われるプロセッシングのために、ここに開示されたヌクレオチド配列は、完全ゲノム配列未満に相当し得る。前記遺伝子およびｃＤＮＡ配列は、これらが共に類似ＲＮＡ配列をエンコードするため、相当する遺伝子と考えられる。したがって、限定されない実施例のみの目的で、短ｍＲＮＡに変換されるＲＮＡ転写産物をエンコードする遺伝子は、前記ＲＮＡｓの両方をエンコードし、したがってｃＤＮＡに（通常のワトソン−クリック相補性法則を用いて）相補的なＲＮＡ、すなわちｃＤＮＡ（例えば、ここに開示された配列）によってエンコードされているＲＮＡをエンコードしていると見なされる。したがって、ここに開示された配列は、細胞中に含まれる遺伝子に相当し、これらの配列は同一の配列に相当し、あるいはこれらの遺伝子によりエンコードされるＲＮＡｓと相補的であるため、発現の相対的レベルを測定するために用いられる。前記遺伝子はまた、本発明の方法で用いられる細胞中に発現し得る異なる対立遺伝子およびスプライス変異体を含む。
【００４８】
したがって、本発明のスクリーニング分析に用いるための、ここに開示された遺伝子配列等のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが、配列番号３を持つポリヌクレオチドによりエンコードされているか、あるいはハイブリダイゼーション等により相補的なＲＮＡの配列と最低５０％同一、好ましくは最低７０％、８０％、９０％同一、そしてより好ましくは最低９５％あるいは９８％同一、また特にこのＲＮＡの配列を持つＲＮＡ（自然発生スプライス変異体および対立遺伝子を含む変換あるいは未変換）をエンコードする場合には、遺伝子９５に“相当する”。加えて、配列番号３と最低５０％同一、好ましくは前記配列と最低約７０％、８０％、９０％同一、より好ましくは前記配列と最低約９８％同一、また最も好ましくは前記配列を含む配列を含む遺伝子は、これらの配列に相当する遺伝子として、特に本発明の全ての方法により意図されている。加えて、これらの配列のいずれかと同じポリペプチドおよびタンパク質をエンコードする配列はまた、前記配列のパーセント同一性に関わらず、これらがどのように開示あるいは限定されているかに関わらず、前記配列のいずれかあるいは全てに依存する本発明の任意の方法によって特に意図されている。したがって、前記配列は、本発明にしたがって開示された任意の方法の実施において用いることができる。前記配列はまた、遺伝子９５間に存在する、ここに定義されているとおりの読み取り枠を含む。前記配列は、配列番号６および配列番号８の突然変異遺伝子９５配列を含み、また図５に示された代替エキソンを含む配列を含む。
【００４９】
前記にしたがって、本発明は、ポリヌクレオチド配列あるいはこのポリヌクレオチド配列の完全相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と、最低６５％、好ましくは最低７５％、より好ましくは最低８５％、特に最低９０％、最も好ましくは９５％あるいはさらに９８％同一であり、特に好ましくは配列番号３の配列である。本発明はまた、配列番号４に示されたアミノ酸配列を持つポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００５０】
遺伝子９５タンパク質（配列番号４）に関し、本発明は、配列番号４に相当するタンパク質、ポリペプチドおよびアミノ酸配列の全てを含む。配列番号４に相当する前記配列は、全長タンパク質あるいは遺伝子９５タンパク質の生物学的活性を保持するその断片を含む。前記配列は、好ましくは配列番号４と最低約５０％同一であり、より好ましくは配列番号４と約６０％、７０％、８０％および最も好ましくは最低約９０％あるいは９５％同一である。前記配列は、任意の生物、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはげっ歯類あるいはヒト由来の遺伝子９５タンパク質のオーソログあるいは同族体を含み、また前記配列と最低約５０％、６０％、７０％、８０％、また最も好ましくは最低約９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。前記配列は、突然変異配列配列番号７および配列番号９、遺伝子９５ヌクレオチド配列の代替読み取り枠に相当する配列および図５における代替スプライスエキソン中に見られる配列を含む。
【００５１】
前記にしたがって、本発明は、配列番号４に示されたアミノ酸配列と最低６５％、好ましくは最低７５％、より好ましくは最低８５％、特に最低９０％、最も好ましくは９５％あるいはさらに９８％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを含む。ここで、配列番号４の配列を含むポリペプチドは、特に好ましい。
【００５２】
本発明はまた、核酸ベクターを含む単離されたポリヌクレオチドおよび組み換え宿主細胞を含む、核酸ベクターに関する。本発明はまた、ポリペプチドの産生を支持する条件下での請求項４９に記載の宿主細胞の培養を含む、配列番号４のポリペプチドを産生するための方法を含む。この方法は全て、ここでの開示を考慮に入れて、この分野における通常の知識を有する者に良く知られている。
【００５３】
遺伝子９５を用いたスクリーニング分析
本発明は、治療物質、特に低ＨＤＬレベルに拮抗する物質の同定に用いるための遺伝子９５遺伝子および／またはタンパク質を用いたスクリーニング分析を提供する。一つのプロトコルは、ヒトを含む動物におけるＨＤＬレベル、特に血漿レベルの増加等によりＨＤＬ活性を増加させるために遺伝子９５の活性を上向きあるいは下向きに調節する能力についての化学物質の分析を含む。遺伝子９５遺伝子、あるいはその活性断片あるいはタンパク質の活性を変換する物質、あるいは遺伝子９５によりエンコードされたポリペプチドの活性を調節し得る物質、あるいは前記遺伝子の活性を調節するための転写因子として働くポリペプチド、あるいは、エンハンサーもしくは、シス型様式あるいはトランス型様式で働く遺伝子９５の活性を調節する他の調節遺伝要素等の他の関連遺伝子分節は、それにより同定され、逆コレステロール輸送あるいは他の脂質関連プロセスの改善等により低ＨＤＬレベル、あるいは低ＨＤＬレベルの影響、あるいは低ＨＤＬレベルに関連する疾患の予防、治療あるいは改善において有用であること、および／または心疾患、アテローム性動脈硬化症および他の疾患等の疾患に有用であることを証明し得る。
【００５４】
ここに開示された本発明にしたがって、生物学的活性あるいは遺伝子９５の発現を調節する化合物の投与により、低ＨＤＬ−Ｃ、血管障害、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症あるいは関連疾患を患う患者の治療のための、もしくは体内の逆コレステロール輸送の改善のための組成物および方法が提供される。
【００５５】
本発明は特にスクリーニング分析を意図し、例えばここで広範な化合物が、治療標的生物学的活性の調節における活性について選別され得る。ここに開示された前記分析の全てに関しては、前記調節は治療標的生物学的活性の増加あるいは減少を含み得る。
【００５６】
この分野における通常の知識を有する者は、ローあるいはハイスループットスクリーニング分析に効果的に組込むことができる治療標的の測定可能な生物学的活性を同定することができる。前記分析の限定されない例が、例示目的でここに開示される。これらの示唆に基づいて、治療標的スクリーニング分析の他の実施例は、そのまま実施できるであろう。
【００５７】
本発明はまた、前記治療化合物およびその類似体の同定のための分析を提供する。遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性を調節する化合物は、本発明において有用であると考えられる。前記化合物の同定のための典型的なスクリーニング分析（試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）あるいは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ））およびコンピュータを利用した分析（コンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ））は、以下に詳述される。本発明のスクリーニング分析は、低ＨＤＬおよび／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療および予防のための治療物質の評価、同定および開発を簡単にする。一般的に、スクリーニング方法は、天然物抽出物あるいは、さらに評価され、いくつかの活性中心構造体に凝縮される大集団（例えば化学ライブラリー）由来の関心のある合成化合物の選択のための容易な方法を提供する。前記中心構造体の多数の類似体は、改善された治療物質としての性質を持つ好ましい類似体を同定するために、開発および試験され得る。
【００５８】
本発明はまた、その活性が高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を変換するポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）前記活性を促進する条件下で、候補化合物を遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの生物学的活性の変化を測定することを含み、
ここで、前記活性の変化は、試験化合物を、前記ポリペプチド生物学的活性を調節する物質として同定する。
【００５９】
このプロセスの一つの実施例において、ステップｂ）における生物学的活性の変化は、ポリペプチドの活性の減少あるいは増加である。好ましい実施例において、前記活性は、酵素の活性を測定することにより測定され、例えばここで、ポリペプチド自体は、直接的あるいは間接的に分析することができる酵素活性を持つ。前記分析はｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。
【００６０】
好ましい実施例において、前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を持ち、別の実施例において、前記ポリヌクレオチドは配列番号３を持つ。
【００６１】
別の実施例において、前記ポリペプチドは、細胞抽出物、リポソームあるいは無傷細胞中に存在する。本発明は特に、細胞が異種遺伝子９５構成を含む組換細胞系である実施例を意図する。他の実施例において、前記細胞あるいは抽出物は、遺伝子組換え技術以外により処理され、例えばここでポリペプチドの活性は、増強されるものであり、細胞は前記ポリペプチドを含むかあるいはその表面に持つように処理され、しかしここで前記ポリペプチドは、前記細胞中に含まれる遺伝子の発現を通してではなく、前記細胞の膜あるいは細胞質中への前記ポリペプチドの物理的な挿入により存在する。
【００６２】
本発明はまた、遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化は、試験化合物を、遺伝子９５活性を調節する物質として同定する。
【００６３】
前記のステップｂ）において測定された活性の変化は、活性の減少あるいは増加であり得る。一つの実施例において、前記活性は、酵素の活性を測定することにより測定される。前記方法の他の実施例において、前記ポリペプチドは資質二重層中に存在し、ここでこの脂質二重層はリポゾームの一部であることを含む。加えて、前記ポリペプチドは無傷細胞の一部であり得る。例えばここで無傷細胞は、前記ポリペプチドを含むように処理された細胞であり、例えばここで無傷細胞は、前記ポリペプチドを発現するように遺伝子組換えが行われている組換細胞であり、好ましくはここで前記細胞は、前記組換えがなければ前記ポリペプチドを発現しない。全ての場合において、無傷細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
【００６４】
本発明はまた、ＨＤＬ増強物質を同定するための方法に関し、前記方法は、動物に、ここに開示された任意の分析を用いて調節活性を持つと分かった物質の有効量を投与し、前記投与の結果としての前記動物中の血漿ＨＤＬ活性の増加を検出し、それによりＨＤＬ活性の増強に有用な物質を同定することを含む。
【００６５】
好ましい実施例において、前記動物は前記物質の投与の前は、低ＨＤＬ活性を示す。他の好ましい実施例において、ＨＤＬ増強活性は、前記動物中のＨＤＬレベルの増加であり、最も好ましくは血漿ＨＤＬレベルの増加であり、また好ましくはここで、前記動物はヒト患者である。
【００６６】
本発明はさらに、低ＨＤＬ関連疾患に苦しむ動物における前記疾患を治療するための方法に関し、ここで前記方法は、前記動物に、本発明の任意の分析を用いてＨＤＬ増強活性を持つと分かった物質の有効量を投与することを含む。好ましい実施例において、治療される動物はヒト患者である。さらなる好ましい実施例において、治療される疾患は、低ＨＤＬ疾患、血管障害および異常脂質血症より成るグループから選択される。
【００６７】
本発明のプロセスにしたがって同定される物質はまた、患者のＨＤＬ状態に関わらず、冠動脈疾患の治療あるいは予防に有用である。例えば、冠動脈疾患の家族暦を持つ正常ＨＤＬレベルの患者であっても、ＨＤＬレベルを増加させ、さらに冠動脈疾患の危険性を減少させるために本発明にしたがった治療物質の服用を勧められるであろう。したがって、前記患者は、本発明にしたがった治療に適するために、異常脂質血症である必要はない。一般的に、本発明のスクリーニング方法は、あらゆるｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ試験システムの適用により治療活性物質のためのあらゆる化合物のスクリーニングを含む。前記化合物の同定に有用な方法の例はここに詳述される。
【００６８】
本発明の方法は、低ＨＤＬレベルならびに心疾患（ＣＶＤ）および異常脂質血症の治療および予防のための活性物質の評価、同定および開発を簡単にする。一般的に、スクリーニング方法は、天然物抽出物あるいは、さらに評価されいくつかの活性および選択材料に凝縮される大集団由来の関心のある化合物の選択のための迅速な方法を提供する。この集団からの陽性の候補者は、続いてそのＨＤＬ−上昇、抗ＣＶＤあるいは抗異常脂質血症活性もしくはその両方を測定するために、本発明の方法において精製され、評価される。陽性の候補者は、治療物質として直接用いられ得る。あるいはこれらは、構造活性相関（ＳＡＲ）分析および好ましい治療物質となるさらなる類似体の開発のための情報を与える構造を提供し得る。
【００６９】
ＨＤＬ調節に関与するスルフルトランスフェラーゼとしての遺伝子９５の評価
ヒトの遺伝的情報が、遺伝子９５の機能がヒトのＨＤＬレベルを維持することを立証した一方で、遺伝子９５の働きの特異的メカニズムはまだ立証されていない。働きのメカニズムについての任意の理論に拘束されることなく、発明者は、遺伝子９５がスルフルトランスフェラーゼあるいは類似の種類の酵素として機能し得ることを示唆する。これは、タンパク質中に見られるロダネーゼドメインの比較に基づく。ロダネーゼドメインは、スルフルトランスフェラーゼ活性については活性的であるとして、またホスファターゼ活性については活性的であるとして、あるいは触媒不活性であるとして分類され得る。ヒトおよびマウスＧ９５は、ロダネーゼドメイン内のスルフルトランスフェラーゼについての一致を含む。ロダネーゼドメイン内のホスファターゼについての陽性一致は、ヒト中には認められるが、マウスＧ９５中には保存されない。加えて、この一致を持つ別のヒト遺伝子は、スルフルトランスフェラーゼ活性として注記される。
【００７０】
いくつかの種類の証拠は、これらの活性をＨＤＬ代謝と関連付ける。例えば、チオレドキシン結合タンパク質Ｔｘｎｉｐは、高脂血症マウス表現型に基づく脂質代謝に関連することが知られている。
【００７１】
遺伝子９５スルフルトランスフェラーゼ生物学的活性を用いたスクリーニング分析は、シアン化合物、チオレドキシンおよびジヒドロリポ酸塩等のスルフルトランスフェラーゼの既知の基質を用いるように設計できることが知られている。あるいは、スクリーニング分析は、前記のスルフルトランスフェラーゼ分析に基づいて設計され得る。チオシアン酸塩生成物についての一つの比色分析において、前記分析はチオ硫酸塩およびシアン化合物の亜硫酸塩およびチオシアン酸塩への変換を測定する。チオレドキシン還元酵素によるＮＡＤＰＨ酸化の分析において、前記分析は、チオ硫酸塩およびチオレドキシンの亜硫酸塩およびチオレドキシン過硫化物への変換を測定する。遺伝子９５の相互作用を介してこれらの変換を作用させあるいは拮抗させる化合物は、本発明の調節因子である。
【００７２】
機能分析は、遺伝子９５に相当するとしてここに開示された一つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドの活性に基づき得る。前記ポリヌクレオチドは、前記遺伝子と最低９０％あるいは９５％同一のポリヌクレオチドあるいは前記遺伝子によりエンコードされたポリペプチドと高い相同性を持つポリペプチド等の、高い相同性を持つ候補を含む。前記分析は、ポリペプチドの活性に起因する分析条件の変化に応じて色を変化させるための種々の色素の能力等（これに限定されない）の薬剤スクリーニング技術を用いることができる。
【００７３】
薬剤スクリーニング分析はまた、他のタンパク質と相互作用する遺伝子９５ポリペプチドの能力に基づくことができる。前記相互作用タンパク質は、例えば、放射性免疫沈降法、共免疫沈降、および酵母ツーハイブリッドスクリーニングを含む、この分野において知られた種々の方法により同定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を作用あるいは拮抗させる試験化合物の能力は、用いることができるスクリーニング分析の標準型である。前記相互作用は、蛍光偏光あるいはシンチレーション近接法を含むがこれらに限定されない方法により分析することができる。薬剤選別は、形質転換あるいはノックアウトマウスの作成上見られる機能あるいは特徴に基づいて、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞中におけるタンパク質あるいはタンパク質断片の過剰発現に基づいて行うことができる。さらに、酵母あるいはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ中の哺乳類（例えばヒト）遺伝子９５ポリペプチドの発現は、野生型および突然変異系における候補化合物のスクリーニングを可能とし、また低ＨＤＬ表現型を増強あるいは抑制する突然変異の選別を可能にする。変更遺伝子選別はまた、形質転換あるいはノックアウトマウスにおいて行うことができる。
【００７４】
この分野における通常の知識を有する者にとって、ここでの開示が遺伝子９５と相互作用し、また／あるいは遺伝子９５を調節する化合物を同定するための標準スクリーニング分析への遺伝子９５の組み込みを容易にすることは明らかであろう。前記分析は、タンパク質／化合物結合分析、遺伝子発現分析および多くのその他の種類を含む。標準分析に加えて、遺伝子９５の既知の特徴が用いることができるより特異的な分析を示唆する。例えば、推定リン酸化反応部位は、遺伝子９５のリン酸化反応の速度、量あるいは時期に影響を及ぼす試験化合物の傾向を測定する分析が、本発明の有用な調節因子であり、またここに示された疾患の潜在的な治療物質あるいはその類似体であり得る。スクリーニングに用いるために利用できる遺伝子９５の特徴は、Ｎ−グリコシル化部位、グリコサミノグリカン結合部位、４ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、１２タンパク質キナーゼＣリン酸化部位、８カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、８Ｎ−ミリストイル化部位、ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型ドメイン、およびシステインリッチ領域を含む。測定に有用だと思われる他の特徴は、ロダネーゼ様ドメイン、ＤｎａＪ中央ドメイン、ＸＳジンクフィンガードメインおよびインテグラーゼ部位を含む。
【００７５】
前記にしたがって、本発明は、その発現がｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を修正するポリヌクレオチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチド発現を促進する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化が、試験化合物を、その発現が高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を修正するポリヌクレオチドの活性を調節する物質として同定する。
【００７６】
前記プロセスの特異的な実施例において、ステップｂ）における発現の変化は、前記ポリヌクレオチドあるいは遺伝子の発現の減少あるいは増加であり得る。
【００７７】
他の態様において、本発明は遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５プロモーターと作動可能に結合するレポーター遺伝子を含む遺伝子構造体と、前記レポーター遺伝子の転写を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の転写の変化を測定することを含み、
ここで前記転写の変化は、試験化合物が遺伝子９５活性を調節する物質であることを示す。
【００７８】
前記の測定された変化は、前記転写の増加あるいは減少であり得る。またここで転写は、前記レポーター遺伝子によりエンコードされた発現産物の量を測定することにより判断され、前記発現産物はＲＮＡあるいはポリペプチドを含む。好ましい実施例において、レポーター遺伝子は、リポゾームあるいは哺乳類細胞等の無傷細胞中に存在し得る。前記方法の好ましい実施例は、ヒトプロモーター、好ましくは配列番号１５に示されるプロモーター、あるいはマウスプロモーター、好ましくは配列番号１４のプロモーター配列を持つプロモーター等の哺乳類遺伝子９５プロモーターの使用を含む。全ての場合において、レポーター遺伝子は、通常その発現が容易に測定される遺伝子であり、また遺伝子９５自体以外のものである。しかしながら後者はレポーター遺伝子として用いるためには除外されない。
【００７９】
前記プロセスは特に、低ＨＤＬレベルおよび疾患およびその徴候に対して有効な物質を同定するために用いられる。前記物質あるいはその化学的類似体はまた、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質を調節するために、そして／または心疾患の治療あるいは予防のために有用である。ヒト遺伝子９５プロモーター配列を含む構造の一つの例は、配列番号１５に示され、ここでプロモーター配列（最初の約１５００塩基）は配列の開始部分にあり、そしてエキソン１（塩基１５０２から始まる）が続き、その後にイントロン１があり、配列の最後にエキソン２がある。一方、マウスプロモーター（約１５００ヌクレオチド残基）を組込んだ配列が配列番号１４に示され、プロモーターを配列の開始位置に持ち、そしてエキソン１（残基１５０１から始まる）が続き、その後にイントロン１があり、配列の最後にエキソン２がある。エキソン配列はｍＲＮＡに認められた。本発明は前記エキソンおよびプロモーター配列を含む。
【００８０】
他の態様において、本発明は、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害あるいは異常脂質血症の治療のための化合物をコンピュータにより同定するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）（例えばＸ線結晶学あるいはその他の技術を介した）遺伝子９５タンパク質の活性部位の決定、および（ｂ）コンピュータによるモデリングを介した、活性部位と相互作用する化合物の同定、それによるＨＤＬレベルの調節および／あるいは血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用な化合物としての化合物あるいはその類似体の同定を含む。
【００８１】
本発明はさらに、治療物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）化学物質を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの発現を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化は、治療物質を同定する。
【００８２】
さらなる実施例において、本発明はｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性に影響を与えるポリペプチドの活性を調節する治療物質を同定するための方法を含み、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化は、試験化合物をＨＤＬ活性に影響を与えるポリペプチドの活性を調節する治療物質として同定する。
【００８３】
これらの好ましい実施例において、前記ポリペプチドは配列番号４に相当し、そして／または前記ポリヌクレオチドは配列番号３に相当する。
【００８４】
好ましくは哺乳類の、最も好ましくはげっ歯類あるいはヒトの遺伝子９５ポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む抗体をもたらす抗原として用いることができる。前記抗体は、遺伝子９５生物学的活性を調節するための治療上の使用、機能性研究、および薬剤スクリーニング分析および診断学の開発を含むがこれらに限定されない幅広い目的に対して有用であり得る。本発明にしたがって同定された遺伝子９５ポリペプチドの発現あるいは生物学的活性への物質（例えば、小有機化合物）の影響の観察は、基礎薬剤スクリーニングだけでなく臨床試験においても適用することができる。例えば、ここに開示されたスクリーニング分析により遺伝子発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性を増加あるいは減少させると認められた物質の有効性は、不適切な遺伝子発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性に起因した低ＨＤＬレベルを示す被験者の臨床試験において観察することができる。または、スクリーニング分析により、遺伝子９５および、構造的および機能的に関連する遺伝子、それらと高い相同性を持つ遺伝子の発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性を調節すると認められた物質の有効性は、減少した修正された遺伝子発現、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性を示す被験者の臨床試験において観察することができる。前記臨床試験において、ここに開示された遺伝子あるいはポリペプチド、好ましくは例えば心疾患に関連する他の遺伝子の発現あるいは活性は、特定の薬剤の有効性を解明するために用いることができる。
【００８５】
例えば、そして限定目的ではなく、遺伝子９５、あるいはその任意の発現産物の活性、もしくは（例えばここに開示されたスクリーニング分析において同定された）前記遺伝子の活性を調節するポリペプチドの活性を調節する物質（例えば、化合物、薬剤あるいは小分子）を用いた治療により細胞中で調節される遺伝子は、同定することができる。したがって、例えば臨床試験においてコレステロールレベルあるいは心疾患への物質の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調整し、遺伝子９５および、類似あるいは関連疾患に関連する他の遺伝子の発現のレベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析あるいはＲＴ−ＰＣＲにより、もしくはこの分野において知られた多くの方法の一つによって生成されたタンパク質の量を測定することにより、あるいは前記遺伝子あるいはその他の遺伝子によりエンコードされたポリペプチドの生物学的活性のレベルを測定することにより、定量することができる。このように、前記遺伝子発現は、前記物質に対する前記細胞の生理学的反応の指標である、標識として働くことができる。したがって、この反応状態は、前記物質を用いた個人の治療の前、およびその間の様々な時点で測定され得る。
【００８６】
好ましい実施例において、物質（例えば、ここに開示されたスクリーニング分析により同定された作用薬、拮抗薬、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、抗遺伝子９５抗体、アンチセンス分子、核酸、小分子、あるいは他の薬剤候補）を用いた被験者の治療の有効性を観察するための方法を提供し、前記方法は、（ｉ）前記物質の投与前に、被験者から投与前サンプルを取得し、（ｉｉ）投与前サンプル中のＨＤＬ活性レベルあるいは、遺伝子９５タンパク質、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、（ｉｉｉ）被験者から一つあるいはそれ以上の投与後サンプルを取得し、（ｉｖ）投与後サンプル中の遺伝子９５タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡもしくはＨＤＬの発現あるいは活性のレベルを検出し、（ｖ）投与前サンプルと対応する投与後サンプル中の前記タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡの発現あるいは活性のレベルを比較し、（ｖｉ）それに応じて被験者への前記物質の投与を修正するステップを含む。例えば、前記物質の投与の増加は、遺伝子９５あるいはそのエンコードされたポリペプチドの発現あるいは活性を増加させること、あるいは血漿ＨＤＬレベル等のＨＤＬ活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増加させること、すなわち前記物質の有効性を増加させることについて望ましいであろう。または、前記物質の投与の減少は、前記ポリペプチドあるいは遺伝子の発現あるいは活性を減少させることに望ましく、ここで過剰発現はＨＤＬ活性あるいはレベルの低減の一因となる。
【００８７】
動物中の低ＨＤＬレベルの誘導等のＨＤＬ調節に関連するとしてここに開示された遺伝子９５遺伝子は用いることができ、あるいはその断片はタンパク質を発現させるための道具として用いることができ、ここで前記遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏでの適当な細胞中でタンパク質をエンコードし（遺伝子治療）、あるいは薬剤スクリーニング用のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析への使用のための十分量のタンパク質を産生するために用いることができる発現ベクター中に複製することができる。用いることができる発現システムは、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、細菌システム、およびＣＨＯ細胞等の真核生物システムを含む。裸のＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）およびＤＮＡ−リポゾーム複合体もまた用いることができる。
【００８８】
前記活性の分析は、細胞内相互作用タンパク質への結合、遺伝子あるいはポリペプチド活性を上向き調節するタンパク質との相互作用、ＨＤＬ粒子あるいは成分との相互作用、ＨＤＬあるいはその成分との相互作用を促進する他のタンパク質との相互作用、およびコレステロール流出の測定を含む。さらに、分析は蛍光−タンパク質バイオセンサーを用いた高分子、代謝産物およびイオンの分子力学に基づき得る。または、発現あるいは活性に対する候補調節因子の効果は、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）あるいは特異的な抗体を用いた免疫沈降等の標準免疫学的検出技術と組合せた同じ一般的な手法を用いて、タンパク質産生のレベルで測定することができる。さらに、有用なコレステロール調節あるいは抗ＣＶＤ治療調節因子は、増加したＨＤＬレベル、特に試験被験者の血漿中での増加したＨＤＬレベルと関連する活性の変化を誘導するものとして同定される。
【００８９】
候補調節因子（すなわち試験化合物）は、精製された（あるいは実質的に精製された）分子であるか、あるいは化合物の混合体（例えば、組合せライブラリー、あるいは細胞から得られた抽出物あるいは上清）の一つの構成要素であり得る。混合化合物分析において、遺伝子発現は、単一化合物あるいは最小化合物集合がＨＤＬレベルに有益な効果を持つ形で遺伝子あるいはタンパク質の活性あるいは発現を調節することが示されるまで、（例えば、標準精製技術、例えばＨＰＬＣあるいはＦＰＬＣ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．により産生された）候補化合物プールの徐々に少なくなる集団に対して試験される。
【００９０】
遺伝子９５の細胞中の遺伝子発現あるいは遺伝子転写レベルを調節するであろう特異的化合物は、アンチセンス核酸、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）および他の核酸組成物を含み、また前記遺伝子（前記遺伝子のエキソンあるいはイントロンを含む）と特異的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）配列特異的結合化合物あるいは遺伝子９５のＲＮＡ転写産物を含む。これらの特定的な化合物は本発明の化合物であり、前記の疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造は、本明細書の開示に基づいて、この分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる。
【００９１】
遺伝子９５ポリペプチドの活性を調節する特異的化合物は、前記ポリペプチドのエピトープに特定的に結合する抗体（ポリクローナルあるいはモノクローナル）を含む。これらの特異的化合物は本発明の化合物であり、前記疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造はこの分野における通常の知識を有する者によく知られている。
【００９２】
一つあるいはそれ以上の遺伝子９５のエピトープ、あるいは遺伝子９５の保存変異体のエピトープ、もしくは遺伝子９５のペプチド断片はまた、本発明により含まれる。前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、ヒト化あるいはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれに限定されない。これらはここに開示された任意の疾患を治療するために用いることができる。
【００９３】
この分野における通常の知識を有する者に周知のように、完全にヒト化された抗体の使用は、これらが一般的に免疫原性が少なく、ヒトに投与された場合により長い半減期を持つため、一般的に好ましい。主要な利用可能な技術は、抗体についてのヒト遺伝子の全組を持つ形質転換マウスを用いるＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）により扱われたＵｌｔｉＭａｂヒト抗体開発システム（ｓｍ）、およびマウス抗体遺伝子発現は抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と機能的に置換さら、マウス免疫システムの残りの部分はそのままであるマウスの遺伝子組換えされた系統を用いるＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）技術を含む。
【００９４】
これらのマウスは、ハイブリドーマ技術を用いて大規模生成物に変換される完全ヒト化ポリクローナル抗体を発生させるように誘導することができる。一つの実施例において、前記方法は、遺伝子９５タンパク質あるいはその断片の精製あるいは濃縮生成を伴う、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを持つ、形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスに免疫性を与えることを含む。前記動物のＢ細胞（例えば脾臓Ｂ細胞）は続いて獲得され、遺伝子９５タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成するために、ミエローマ細胞と融合される。
【００９５】
ヒト化抗体はまた、例えば抗体の免疫原性部位を、対応するが非免疫原性の部位と置換することにより産生できる（すなわちキメラ抗体）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，国際特許公報ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ヨーロッパ特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０；１０４１−１０４３（１９８８）；Ｌｉｕ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６（１９８７）；Ｓｕｎ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５（１９８７）；Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９（１９８５）；Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９（１９８８））。“ヒト化”キメラ抗体の一般的見解は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５））およびＯｉ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）により提供される。または、適切な“ヒト化”抗体は、ＣＤＲあるいはＣＥＡ置換により産生することができる（Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｂｅｉｄｌｅｒ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０（１９８８））。
【００９６】
抗体の産生のために、種々の宿主細胞が、遺伝子９５、遺伝子９５ペプチド（例えばタンパク質の機能ドメインに対応する一つ）、不完全遺伝子９５ポリペプチド（一つあるいはそれ以上のドメインが削除された遺伝子９５）、遺伝子９５の機能的相当物あるいは遺伝子９５の突然変異体の注入により免疫性を与えることができる。前記宿主動物は、いくつか例を挙げると、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットを含むがこれらに限定されない。種々の補助物質（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）は、宿主種に依存して免疫学的応答を増加させるために用いることができ、フロインド（完全および不完全）、アルミニウム水酸化物等のミネラルゲル、リゾレシチン等の表面活性物質、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリア・バルヴム等の潜在的に有用なヒト補助物質を含むがこれらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫性を与えられた動物の血清から得られた抗体分子の異種集団である。
【００９７】
完全抗体および抗体断片の産生のために用いることができる種々の発現システムがある。これらは、細菌あるいは哺乳類細胞培養および形質転換動物あるいは植物を含む。一般に好まれる発現システムは、この分野における通常の知識を有する者に知られているように、対象とする用途および望まれる生産により決定される。例えば、動物細胞培養および遺伝子組換え発現システムは、抗体のグリコシル化が求められる場合に望ましく、一方、細菌発現システムは、非グリコシル化抗体、Ｆａｂ断片およびその他類似のものの産生により有用である。Ｃｈａｄ，ＨＥ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，ＳＭ．２００１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１８８−１９３参照。
【００９８】
遺伝子９５に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、ＨｕＭａｂ抗体は、任意の標準方法にしたがって精製されあるいは濃縮された遺伝子９５あるいはその断片の生成を用いて免疫性を与えることができる。ＨｕＭａｂマウスは、内因性ミューおよびカッパ鎖遺伝子座を不活性にする標的突然変異と共に、再配列されないヒト重鎖（ミューおよびガンマ）およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をエンコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ．３６８（６４７４）：８５６−８５９）。これらのマウスは、マウスＩｇＭあるいはカッパの発現の減少を示し、また免疫付与に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクロナルを生成するために、クラススイッチと体細胞変異を受ける。
【００９９】
好ましくは、マウスは最初の免疫付与のとき、６から１６週齢である。最初の免疫付与は、完全フロインドアジュバント中の抗原を用いて腹腔内（ＩＰ）に行われ、続いて一週間おきに、不完全フロインドアジュバント中の抗原を用いてＩＰ免疫付与（全６回まで）が行われる。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）出血により得られた血漿サンプルを用いた免疫付与プロトコルの経過全体で観察することができる。血漿は、例えばＥＬＩＳＡあるいはフローサイトメトリーにより選別でき、抗遺伝子９５ヒト免疫グロブリンの十分な力価を持つマウスは、融合のために用いることができる。マウスは、解剖および脾臓の摘出の３日前に、静脈内に抗原が高められる。各抗原について２から３の融合が、成功のためには必要である。
【０１００】
遺伝子９５に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成のために、マウス脾細胞は最初に単離され、ＰＥＧを用いて標準プロトコルに基づいたマウスミエローマ細胞系と融合される。その結果生じたハイブリドーマは、続いて抗原特異的抗体の産生について選別される。例えば、免疫付与マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁は、５０％ＰＥＧで６分の１（ｏｎｅ−ｓｉｘｔｈ）のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）と融合される。細胞は、平底マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）におおよそ２×１０５で播種され、続いて２０％ウシ胎仔血清、１８％“６５３”調整培地、５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは、融合後２４時間で添加される）を含む選択培地中で２週間培養される。２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと差し替えられた培地中で培養される。各ウェルはその後、ヒト抗遺伝子９５モノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてのＥＬＩＳＡにより選別される。大規模なハイブリドーマ増殖が起こると、培地は通常１０から１４日後観察される。抗体分泌ハイブリドーマは取り出され、再び選別され、ヒトＩｇＧに対して陽性であれば、抗遺伝子９５抗体は、限界希釈法により最低２倍の下位複製（ｓｕｂｃｌｏｎｅ；サブクローン）ができる。その後安定したサブクローンは、特性化のための組織培養培地中で少量の抗体を産生するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。
【０１０１】
ヒト抗遺伝子９５抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製用の２リッタースピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌａｓｋ）中で増殖させることができる。上清はろ過され、タンパク質Ａ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）の前に濃縮される。溶出されたＩｇＧは、ゲル電気泳動と、純度を確実にするための高速液体クロマトグラフィーにより調べることができる。緩衝液はＰＢＳに変換でき、濃度は１．４３吸光係数を用いてＯＤ２８０により測定できる。モノクローナル抗体は等分され、本発明の方法にしたがって使用するまで、−８０℃で保存される。
【０１０２】
ＨＤＬレベルを増加させ、また／あるいはここに開示された疾患を治療するように働くことができる他の組成物は、遺伝子９５遺伝子を含み、遺伝子治療輸送手段中に組み合わされる核酸構成体である。前記輸送手段は、(裸のＤＮＡ輸送のための)単純水性緩衝液、ウイルス関連輸送手段あるいは非ウイルス（特に脂質関連）輸送手段であり得る。これらの特異的化合物は本発明の化合物であり、前記の疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造は、本明細書に基づいてこの分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる。
【０１０３】
細胞発現あるいは活性のレベルの調節に効果的であると思われる作用薬、拮抗薬あるいはミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）は、動物モデル（例えば、霊長類、マウス、ブタ、イヌ、ウサギあるいはニワトリ）において有用であることが確認され得る。例えば、前記化合物はマウスあるいはニワトリ低アルファ蛋白血症の低ＨＤＬレベルを改善し得る。
【０１０４】
ＨＤＬ産生を促進する機能を持つ遺伝子あるいはポリペプチドの発現もしくは活性の増加を促進する化合物は、本発明において特に有用であると思われる。前記分子は、例えばＨＤＬのレベルあるいは活性を増加し、それにより動物（例えばヒト）の低ＨＤＬ状態を治療するための治療物質として用いることができる。
【０１０５】
本発明は、ＨＤＬ活性調節において役割を果たし、そのためＨＤＬレベルに関連する他の遺伝子の研究においてその突然変異が重要であり得る他のＨＤＬ関連遺伝子の同定を可能にする。したがって例えば、遺伝子９５タンパク質を安定させ、あるいはそうでなければＨＤＬレベルの増加に寄与するように働く突然変異は、価値がある。前記突然変異は、低ＨＤＬ−Ｃレベルの治療のために行われる任意のタンパク質治療あるいは遺伝子治療に組み込むことができる。同様に、野生型遺伝子９５ポリペプチドの安定性を高め、あるいはその異化代謝を低下させる化合物はまた、低ＨＤＬ−Ｃあるいは低ＨＤＬレベルの結果としての任意の他の状態の治療に有用であり得る。ここで同定された遺伝子９５の突然変異型はまた、この目的に有用である。さらなる突然変異および化合物はここに開示された方法を用いて同定することができる。
【０１０６】
一つの実施例において、突然変異を持つ遺伝子９５ポリペプチドを発現する細胞は、翻訳中に一時的代謝的に標識され、前記ポリペプチドの半減期は、標準技術を用いて測定される。ポリペプチドの半減期を増加させる突然変異は、タンパク質安定性を高めるものである。これらの突然変異は、続いてＨＤＬ関連生物学的活性について評価することができる。これらはまた、対応するｍＲＮＡあるいは他のタンパク質の安定性に作用するタンパク質の同定に用いることができる。続いて、前記ポリペプチドを結合させるために、これらの因子あるいはこれらの因子の安定性に作用する化合物の分析ができる。他の実施例において、野生型遺伝子９５ポリペプチドを発現する細胞は、翻訳中に一時的代謝的に標識され、候補化合物と接触させられ、前記ポリペプチドの半減期は、標準技術を用いて測定される。前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物は、本発明において有用な化合物である。
【０１０７】
他の実施例において、本発明の作用薬を用いた治療は、他のＨＤＬ増加あるいは抗ＣＶＤもしくは抗異常脂質血症治療、あるいはＨＤＬ管理を必要とする他の状態と組み合わせることができる。
【０１０８】
本発明の分析は、タンパク質に基づく分析を含む。遺伝子９５遺伝子（精製あるいは未精製）によりエンコードされたポリペプチドは、（ＨＤＬ活性に関連することが知られているタンパク質と特異的に相互作用すると思われるタンパク質を含むがこれに限定されない）他のタンパク質を結合させる能力を測定するための分析に用いることができる。いくつかの例は、ＡＢＣＡ１タンパク質およびアポリポタンパク質を含む。この結合に対する化合物の作用は続いて測定される。
【０１０９】
ここに開示された遺伝子によりエンコードされたポリペプチドについての結合分析の他の種類において、遺伝子９５ポリペプチド（あるいはそのポリペプチド断片、もしくはエピトープ標識型あるいはその断片）は、適切な資料源から（例えば、原核生物発現システム、真核細胞、無細胞システムから、あるいは発現細胞からの免疫沈降により）獲得される。続いてポリペプチドは、適切な支持体（例えば、ニトロセルロースあるいは抗体、もしくは例えば前記ポリペプチドのｈｉｓ標識（ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ）型の場合は金属アガロースカラム）に結合される。支持体への結合は、好ましくは前記ポリペプチドと関連するタンパク質が前記ポリペプチドとの関連を維持できる条件下で行われる。前記条件は、タンパク質−タンパク質相互作用の妨害を最小限にする緩衝液の使用を含み得る。結合ステップは、前記ポリペプチドと他の分子との間の相互作用を妨げる能力について試験された化合物の存在あるいは不在下で行うことができる。必要に応じて、他のタンパク質（例えば細胞溶解物）が添加され、前記ポリペプチドと十分に結び付けられる。続いて固定化したポリペプチドは、前記ポリペプチドあるいは支持体と非特異的に結合できるタンパク質あるいは他の細胞構成体を除去するために洗浄される。続いて固定化したポリペプチドは支持体から解離され、そして結合していたタンパク質は（例えば加熱により）解離され、あるいはまた、結合したタンパク質は、支持体からのポリペプチドの解離なしに、前記ポリペプチドから解離される。解離されたタンパク質および他の細胞構成要素は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ウェスタンブロッティングおよび特異的抗体を用いた検出、ホスホアミノ酸分析、プロテアーゼ消化、タンパク質配列決定あるいは等電点電気泳動により、分析することができる。前記ポリペプチドの正常および突然変異型は、特定の因子が前記ポリペプチドのどの部位に結合するかについてのさらなる情報を得るために、これらの分析に用いることができる。加えて、不完全に精製されたポリペプチドが用いられた場合、前記タンパク質の正常型と突然変異型との比較は、真の結合タンパク質の識別に役立てるために用いることができる。
【０１１０】
前記分析の特定の実施例において、前記分析は、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと相互作用することが知られている精製あるいは半精製タンパク質あるいは他の分子を用いて行われる。この分析は、以下のステップを含み得る。
【０１１１】
１．遺伝子９５ポリペプチドの獲得および前記ポリペプチドへの適切な蛍光標識の結合；
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）の第２の異なる蛍光標識での標識。お互いが密に近接している場合と物理的に離れている場合とで異なる消失パターンを形成する色素（すなわち、互いに近接する場合にはそれぞれ消え、密に近接していない場合には蛍光を発する）の使用；
３．相互作用分子の、前記二つの相互作用を妨げる能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下での、固定化したポリペプチドへの露出；および
４．蛍光読み出し情報の収集。
【０１１２】
別の分析は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析を含む。この分析は、以下のように実施できる。
【０１１３】
１．遺伝子９５タンパク質あるいはその適切なポリペプチド断片の用意、および適切なＦＲＥＴドナー（例えば、ニトロ−ベンゾオキサジアゾール（ｎｉｔｒｏ−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）（ＮＢＤ））の結合；
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）のＦＲＥＴアクセプター（例えばローダミン）での標識；
３．アクセプター−標識相互作用分子の、前記二つの相互作用を妨げる能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下での、ドナー−標識ポリペプチドへの露出；および
４．蛍光共鳴エネルギー移動の測定。
【０１１４】
消失およびＦＲＥＴ分析は関連付けられる。どちらか一つが、どちらの蛍光組が分析において用いられるかに依存して、任意のケースに用いることができる。
【０１１５】
遺伝子９５は、イオンに対する膜の透過性等の膜透過性を変換することにより働くことができる。前記活性は、リポゾームあるいは無傷細胞等の小胞の使用について分析することができる。ここで前記構造体は、本発明の遺伝子９５ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、前記小胞、好ましくは無傷細胞、哺乳類組換え細胞等に発現し、前記細胞の膜の透過性は、前記発現の存在あるいは不在下で測定される。同様に、続いて前記透過性は、遺伝子９５の活性を調節することが知られている化学物質の存在および不在下において分析することができる。したがって、前記膜輸送に作用することが知られているタンパク質の活性の増強におけるこれらの物質の有用性は、容易に測定することができる。同様に、脂質等の他の分子、特にＨＤＬの前記膜を横断する輸送に作用するこれらの物質の能力は、同じく容易に測定される。
【０１１６】
前記分析の実施において、遺伝子９５あるいは前記遺伝子に相当するポリヌクレオチドを発現する前記哺乳類組換え細胞等の試験細胞は、イオンを検出可能なレポーター分子（特定のイオンを結合した場合にその蛍光特性が変化する蛍光イオン指示因子等）を取り付けられ、あるいはまた外部媒体が前記分子に取り付けられる。小胞外にある場合と比べて小胞内にある場合に異なる特性を示す分子は用いられ得る。例えば、高濃度の場合に消失特性を持ち、低濃度の場合に消失特性を持たない分子は、適していると思われる。または、膜を横断するイオン（Ｃａ、Ｋ、Ｎａ、金属その他類似のもの）の輸送の効果は、その効果が培地あるいは細胞中に入れられた色素を消失させあるいは消失させないものであれば、測定することができる。このプロセスに作用する能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下で、帯電した分子の動き（あるいはその動かす能力あるいはその動きの反応速度）は測定することができる。
【０１１７】
また別の分析において、小胞内へ、あるいは小胞からの放射性同位体の吸収は、測定することができる。前記小胞は小胞外培地から分離され、小胞中および培地中の放射能活性は定量され比較される。既に示されたとおり、本発明はまた、ここに開示された一つあるいはそれ以上の遺伝子の転写因子を使用し得る分析に関する。試験されるポリヌクレオチドと結合因子の関係は、タンパク質結合ＤＮＡと非タンパク質結合ＤＮＡとを識別する任意のシステム（例えば、ゲル妨害分析（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ））を用いて判断することができる。前記ＤＮＡへの因子の結合における化合物の効果は、前記分析を用いて判断される。結合分析に加えて、遺伝子の調節領域がレポーター遺伝子に結合するｉｎ ｖｉｔｒｏ分析もまた実施することができる。好ましい実施例において、前記ポリヌクレオチドは、遺伝子９５に相当するものであり、最も好ましくはここで前記ポリヌクレオチドは配列番号３を持つ。
【０１１８】
本発明は、遺伝子９５遺伝子構成体を含む組換え細胞系を含む。対応するタンパク質を発現する組換え細胞系は、試験化合物への露出により調節することができるタンパク質の関連生物学的活性を同定するために試験される。化合物は、それらが同定された生物学的活性を調節するか否かについて評価するために体系的に選別され、有効に働くものは本発明にしたがった治療物質、あるいはその類似体である。
【０１１９】
組換え細胞系はまた、精製タンパク質分析が必要な場合、精製タンパク質の調整に好ましい。この分野における通常の知識を有するものは、組換え細胞系の産生および高精製タンパク質を含むタンパク質画分の抽出が可能である。これらのサンプルは、前記タンパク質と相互作用する化合物を同定するための種々の結合分析に用いることができる。相互作用する化合物は、本発明の治療物質あるいはその類似体である。
【０１２０】
本発明はまた、遺伝子９５の上流非翻訳領域およびプロモーター領域を含む。ポロモーター領域の分節は、図５に含まれる。このプロモーター領域のより広い部分は、本開示を用いて、この分野における通常の知識を有する者により同定することができる。５′ＵＴＲ（非翻訳領域）は配列番号３、６、８および図５に開示される。前記ゲノム領域あるいは非翻訳領域は、同定された遺伝子の発現を調節する化合物を同定するための分析において用いられるプラスミドに含まれ得る。前記分析の一つにおいて、上流ゲノム領域はレポーター遺伝子に結合し、発現プラスミド中に組込まれる。プラスミドは細胞中に入れられ（トランスフェクト）、組換え細胞は試験化合物に露出される。レポーター遺伝子の発現を増加あるいは減少させるこれらの化合物は、その結果、遺伝子／タンパク質の調節因子であり、そして本発明の治療物質であると考えられる。
【０１２１】
ここに開示された遺伝子はまた、コレステロール流出の調節に関連し得る。前記活性についての輸送に基づく分析は、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。例えば前記分析は、コレステロールあるいはリン脂質流出等の、培養液中で容易に再形成される逆コレステロール輸送プロセスの任意の一部に基づき得る。または、前記分析は標識基質（コレステロール等）を用いて判断されるように、生物全体における純量コレステロール輸送に基づき得る。
【０１２２】
ハイスループットスクリーニングに関し、蛍光脂質は脂質流出の測定のために用いることができる。リン脂質について、蛍光前駆体Ｃ６−ＮＢＤ−ホスファチジン酸は用いることができる。この脂質は細胞に取り込まれ、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼにより脱リン酸化される。その産物であるＮＢＤ−ジグリセリドはその結果グリセロリン脂質様ホスファチジルコリンの合成の前駆体である。ＮＢＤ−ホスファチジルコリンの流出は、細胞培養液中の適切なアクセプターへのＮＢＤの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を検出することにより観察することができる。適切なアクセプターは、ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン、細胞に容易に取り込まれないリン脂質を含む。単鎖前駆体の使用は、培養液中でのリン脂質輸送タンパク質の必要性を取り除く。コレステロールに関し、ＮＢＤ−コレステロールエステルはＬＤＬに再構築することができる。前記ＬＤＬはこの脂質を、ＬＤＬ受容体経路を介して細胞に効率よく輸送できる。ＮＢＤ−コレステロールエステルはリソソーム中で加水分解され、その結果、もとの原形質膜へ輸送でき、細胞から流出するＮＢＤ−コレステロールを生じる。前記流出は前記ＦＲＥＴ分析により観察することができ、その中でＮＢＤはその蛍光共鳴エネルギーをローダミン−ホスファチジルエタノールアミンアクセプターへ輸送する。
【０１２３】
動物モデルはまた、本発明の分析に有用である。任意の上記分析において活性を持つと判断された化合物は続いて、ブタ、ウサギまたはニワトリにおおよそ有効量投与された化合物によりＨＤＬレベルが増加するかどうかを調べるために、前記動物を含むがこれらに限定されない使用可能な動物モデルシステム中で選別される。試験化合物は、標準方法にしたがってこれらの動物に投与される。試験化合物はまた、コレステロール輸送を妨げる突然変異を持つマウス中で試験され得る。加えて化合物は、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドとＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩあるいはＡｐｏＥ等のＨＤＬ粒子構成要素との間の相互作用を増強する能力について選別され得る。
【０１２４】
前記コレステロール流出分析は、コレステロールを細胞外アクセプター分子へ輸送する細胞の能力を測定し、通常ＡＢＣＡ１等の輸送分子の存在に依存する。したがって、ここに開示された遺伝子は、ＡＢＣＡ１の活性の調節に関与し得る。例えばここで、ここに開示されたポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドは、ＡＢＣＡ１の活性あるいは他のＨＤＬ関連タンパク質に結合し、調節する。この方法において、細胞は任意の複数の生化学的プロセスにより放射性標識コレステロールを持っている（Ｍａｒｃｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１５９−１６９，１９９９）。続いてコレステロール流出は、ＨＤＬ３あるいは精製ＡｐｏＡＩの存在下で、種々の時間（通常０から２４時間）培養した後、測定される。コレステロール流出は、種々の時間の培養後の培養液中の全コレステロールの割合として測定される。この分析においてコレステロール流出を調節する化合物は、遺伝子９５タンパク質標的に作用し得る。好ましくは、細胞は遺伝子９５構成体を含む組換え細胞系である。
【０１２５】
本発明はまた、（例えば相同組み換えにより）不活化した遺伝子９５の一つあるいは両方の対立遺伝子を持った、マウス等の遺伝子組換え動物、あるいは逆に遺伝子９５の一つあるいはそれ以上のさらなる複製、もしくは遺伝子９５のさらなる突然変異複製を持つマウスを含む。遺伝子組換えマウスを含む前記マウスは、ＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させる化合物を選別するための有用な動物モデルに相当する。前記マウスはまた、生物系での遺伝子９５の役割を判断するための実験的目的に有用である。前記動物は、標準技術を用いて作成することができる。試験化合物の最初の選別に加えて、前記遺伝子の異なる型を持つ動物は、ここに開示された他のスクリーニング法の一つを用いて最初に同定された薬剤あるいは物質の有効性と安全性のさらなる試験に有用である。前記動物から採取され、培養液中に置かれた細胞はまた、試験化合物に露出することができる。ＨＤＬ−Ｃレベルは、ここに開示されたもの等の標準技術を用いて測定することができる。
【０１２６】
本発明の一つあるいはそれ以上の分析を用いてＨＤＬ活性の増加に有用であると最初に同定された化合物は、単一剤形における薬学的許容希釈剤、担体あるいは賦形剤と共に投与され得る。従来の薬務は、前記組成物を患者に投与するための適切な剤形あるいは配合を提供するために用いられ得る。経口投与が好ましいが、任意の適切な投与経路、例えば非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルあるいは経口投与を用いることができる。治療剤形は溶液あるいは懸濁液の形状であり得る。経口投与用には、剤形は錠剤あるいはカプセルの形状であり得る。また鼻腔内投与用には、剤形は粉末、点鼻薬あるいはエアロゾルの形状であり得る。
【０１２７】
通常、成功した遺伝子９５調節治療物質は、以下の基準のいくつかあるいは全てを備える。経口可用性は、２０％かあるいはそれ以上であるべきである（したがって最低２０％が血流中に吸収される）。動物モデル有効性は、約２ｍｇ／ｋｇ未満で、標的ヒト投薬は５０および２５０ｍｇ／７０ｋｇの間であるべきであるが、この範囲外の投薬も受容可能である。治療指数（あるいは薬用量に対する中毒量の比）は１００より大きい。有効性（ＩＣ５０値により示される）は約１０μＭ未満、好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である。前記物質は可逆性結合（すなわち競合的阻害）を示し、関連しない標的あるいは不要な副作用を引き起こす関連標的に適度に選択的である。必須の投薬量は、わずか一日に一回あるいは二回、もしくは食事時である。
【０１２８】
剤形を作成するためのこの分野においてよく知られた方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ．，１９９５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見られる。非経口投与のための剤形は例えば、賦形剤、滅菌水あるいは生理食塩水、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物油もしくは水素化ナフタレンを含む。生体適合性、生体分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）コポリマー、あるいはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン コポリマーは、前記化合物の放出を制御するために用いることができる。本発明の作用薬のための他の潜在的に有用な非経口輸送システムは、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、およびリポソームを含む。吸入用の剤形は、賦形剤、例えばラクトースを含み得る。あるいは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であり得る。もしくは点鼻薬の形状であるいはゲルとして投与するための油性溶液であり得る。
【０１２９】
通常、異常なコレステロールレベルおよび／またはＣＶＤあるいは異常脂質血症の治療のための新規薬剤は、自然物あるいは合成（もしくは半合成）抽出物両方の大ライブラリーから、あるいはこの分野において知られる方法にしたがった、組み合わせ化学ライブラリーを含む化学ライブラリーから同定される。この分野あるいは薬剤の発見および開発の分野における通常の知識を有する者は、試験抽出物あるいは化合物の的確な源が本発明のスクリーニング法に不可欠ではないことを理解するだろう。したがって、事実上あらゆる化学抽出物あるいは化合物を、ここに開示された典型的な方法を用いて選別することができる。前記抽出物あるいは化合物の例は、植物由来、真菌由来、原核生物由来あるいは動物由来の抽出物、発酵培養液および合成化合物、加えて既存の化合物の調整が含まれるがこれらに限定されない。多くの方法はまた、糖類由来、脂質由来、ペプチド由来、おおび核酸由来化合物を含むがこれらに限定されないあらゆる化合物のランダム合成あるいは直接合成（例えば、半合成あるいは完全合成）を起こすために利用できる。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）およびＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形状の自然化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ Ｂｒａｎｃｈ Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，ＦＬ）およびＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む、多くの提供源から市販されている。加えて、自然産生および合成的産生ライブラリーは、必要に応じて、この分野において知られた方法にしたがって、例えば標準抽出および分画法により作成される。さらい必要に応じて、任意のライブラリーあるいは化合物は、標準化学、物理あるいは生化学法を用いて容易に調整される。
【０１３０】
加えて、薬剤の発見および開発の分野における通常の知識を有する者は、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、および化学的脱複製あるいはそれらの任意の組合せ）あるいは、そのＨＤＬ上昇、抗ＣＶＤおよび／または抗異常脂質血症活性について既知の物質の複製あるいは反復の除去についての方法が、可能ならいつでも用いられることを容易に理解する。
【０１３１】
粗抽出物がコレステロール調節活性あるいは抗ＣＶＤ活性もしくはその両方を持つと思われる場合には、観察される効果の原因である化学構成成分を単離するために、陽性優位抽出物のさらなる分画が必要である。したがって、抽出、分画および精製プロセスの目的は、コレステロール調節活性あるいは抗ＣＶＤ活性を持つ粗抽出物中の化学構成要素の入念な特徴づけおよび同定である。化合物の混同における活性の検出のためのここに開示された同じｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、活性成分を精製するために、またその誘導体を試験するために用いることができる。前記異種抽出物の分画および精製方法は、この分野において知られている。必要であれば、病原性の治療に有用な物質であることが示された化合物は、この分野において知られた方法にしたがって化学的に調整される。治療上価値があると判断された化合物は続いて、この分野において知られた標準動物モデルを用いて分析される。
【０１３２】
本発明はさらに、治療物質としての遺伝子９５タンパク質あるいはタンパク質断片の使用を含み、また遺伝子９５の生物学的活性を保持する遺伝子９５の調整型を含む。これらの治療物質は、これを必要とする患者に投与することができ、前記患者は、投与すると局所的、局部的あるいは体全体で遺伝子９５生物学的活性が増加し、それにより恩恵を受ける患者である。前記患者は、低ＨＤＬ、異常脂質血症、心疾患および他の疾患を被る患者を含むがこれらに限定されない。
【０１３３】
機能的遺伝子９５タンパク質およびその溶解性誘導体、例えば遺伝子９５の機能的ドメインに対応するペプチドあるいは遺伝子９５タンパク質の調整型は、この分野において知られた標準方法により産生することができる。患者への投与は、静脈内、経口、腹腔内あるいはこの分野において知られた他の方法により行うことができる。
【０１３４】
遺伝子９５を用いた診断および薬理ゲノミクス
相対的および絶対的遺伝子発現、および生物学的活性、また突然変異分析は、それぞれ低ＨＤＬの診断手段として用いることができる。したがって、遺伝子配列の遺伝的サブタイピングの決定は、低ＨＤＬ表現型が、本発明にしたがって用いられたファミリーと同様に、特定のタンパク質機能に関連するか否かを判断するために低ＨＤＬ個体あるいはファミリーをサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）する場合に用いることができる。この診断プロセスは、ＨＤＬ増加薬の投与による副作用の予測を含む、患者の遺伝子型にしたがった薬剤治療の仕立て（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）（ここでは薬理ゲノミクスと称される）をもたらすことができる。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療あるいは予防処置のための物質（例えば薬剤）の選別を可能にする（例えば、個体の遺伝子型は、特定の物質に反応する個体の能力を判断するために検査される）。
【０１３５】
本発明はさらに、疾患の存在、特にその初期段階における存在を診断する、あるいは前記疾患の発症の危険性を診断するプロセスに関する。したがって別の態様において、本発明は、疾患に苦しんでいると思われる患者の疾患の存在を診断するためのプロセスに関し、前記プロセスは、前記患者のゲノム中の遺伝子９５遺伝子における突然変異を検出することを含む。好ましい実施例において、本発明は前記診断プロセスに関し、ここで前記突然変異は配列番号６および／または配列番号８および／または表１に示された核酸配列中の突然変異である。
【０１３６】
前記プロセスの特定の実施例において、突然変異は、前記患者から得られたＤＮＡのサンプル中で検出される。前記サンプルは、血液サンプル、生検（バイオプシー）あるいはその他の方法等の前記サンプルを獲得するために通常用いられる方法で獲得することができる。さらに本発明のプロセスにしたがって、前記検出はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができ、例えばここで、ｉｎ ｓｉｔｕ法は、患者の突然変異遺伝子９５遺伝子あるいは核酸配列の存在を検出するために用いられる。検出することができる疾患は、低ＨＤＬ、異常脂質血症、心疾患および既に開示され、含まれている他の疾患に限定されない。
【０１３７】
前記にしたがって、本発明は遺伝子９５関連疾患に苦しんでいると疑われる患者における遺伝子９５関連疾患の存在を診断するためのプロセスに関し、前記プロセスは、前記患者のゲノムあるいはｍＲＮＡ中の遺伝子９５遺伝子における突然変異の検出を含む。
【０１３８】
好ましい実施例において本発明は前記プロセスに関し、ここで前記突然変異は患者から採取されたＤＮＡのサンプル中で検出され、もっとも好ましくはここで、前記突然変異は配列番号６あるいは配列番号８あるいは表１の突然変異である。
【０１３９】
多くの様々な技術が、前記突然変異の存在あるいは不在を検出することで知られている。好ましい実施例において前記検出は、配列番号１の配列の突然変異部位に相補的な最低１５の隣接するヌクレオチドを含む核酸プローブの能力を測定することにより行われる。もっとも好ましくはここで、前記プローブは最低３０の隣接するヌクレオチドを含み、特にここで前記プローブは最低５０の隣接するヌクレオチドを含む。
【０１４０】
ここに開示されたプロセスはまた、患者の前記疾患の一つあるいはそれ以上を発症する危険性の判断に有用である。したがって本発明はまた、患者の疾患の発症の危険性を判断するためのプロセスに関し、ここで前記患者はそれらの危険性があると疑われるものであり、前記患者のゲノムあるいはｍＲＮＡ中の遺伝子９５遺伝子における突然変異の検出を含む。前記検出は、前記に沿って、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ法により行われ得る。好ましい実施例において、前記疾患は低ＨＤＬ、異常脂質血症および／または心疾患である。好ましい実施例において、前記突然変異は配列番号１に相当する遺伝子における突然変異である。
【０１４１】
組織あるいは身体サンプル中の遺伝子９５タンパク質の検出、特に突然変異遺伝子９５タンパク質、あるいは突然変異あるいは正常遺伝子９５タンパク質のレベルの検出を用いて疾患を診断することもまた同様に、本発明の実施例である。前記検出は種々の方法により得ることができるが、通常、標準ＥＬＩＳＡ分析における抗遺伝子９５抗体の使用を含む。本開示に基づいて、この分野における通常の知識を有する者は、種々の疾患の診断のために、患者サンプル中の突然変異あるいは正常遺伝子９５を検出するための診断手段を開発することができる。
【０１４２】
遺伝子９５遺伝子あるいは遺伝子産物に対する促進作用あるいは抑制作用を持つ物質あるいは調節因子は、低ＨＤＬ活性あるいはレベルと関連する疾患の治療のために個体に投与することができる。前記治療とともに、個体の薬理ゲノミクス（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物あるいは薬剤に対する個体の反応との間の関連の研究）が考慮され得る。治療の有効性における差異は、投薬と薬理的活性薬剤の血中濃度との関係の変更により、毒性あるいは治療上の不具合に役立つようにすることができる。したがって個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型を考慮したうえでの予防あるいは治療処置に有効な物質（例えば薬剤）の選択を可能にする。前記薬理ゲノミクスはさらに、適切な投薬量と治療計画を決定するために用いることができる。したがって、ここに開示された遺伝子についての個体の遺伝子相補体は、前記個体の治療あるいは予防処置のための適切な物質を選別するために決定することができる。
【０１４３】
薬理ゲノミクスは、変化した薬剤の性質と病気のヒトにおける異常な作用を引き起こす、薬剤に対する応答における臨床上の重要な遺伝的変異に取り組む（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３−９８５，１９９６；Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４−２６６，１９９７）。通常、二つの型の薬理ゲノミクスの状態に区別することができる。遺伝的条件は、薬剤の身体への働き方を変える（変化した薬剤作用）単一因子として伝達され、あるいは遺伝的条件は、身体の薬剤への働き方を変える（変化した薬剤代謝）単一因子として伝達された。変化した薬剤作用は、遺伝子９５のプロモーター、イントロンあるいはエキソン配列中に多型（例えば、一塩基変異多型あるいはＳＮＰ）を持つ患者に起こり得る。したがって、多型の存在および普及率の測定により、特定の治療物質に対する患者の反応の予測が可能となる。特に、プロモーター領域中の多型は、ＨＤＬ欠乏症およびＣＶＤの危険性の判断に重要であり得る。突然変異に加えて、遺伝子９５の多型は同様に、ここに開示された分析を用いて同定された物質の同定および使用に関連し得る。
【０１４４】
加えて、種々の物質が、特徴となる遺伝子組の遺伝子に作用する種々の能力を持ち得る。例えば、潜在的な治療物質、例えば物質Ａが低ＨＤＬレベルに関連する遺伝子あるいは遺伝子群の発現の減少の原因となる場合、そのような場合にはより低量のｍＲＮＡが前記遺伝子から発現し、あるいはより少ないタンパク質が前記ｍＲＮＡから産生されるが、第二の潜在的な物質、例えば物質Ｂが前記遺伝子と同一あるいは関連する遺伝子の活性を調節しながら前記発現を半分にまで減少させる場合、そのような場合には物質Ａと比べて半分のｍＲＮＡのみが転写され、あるいは半分のタンパク質のみが前記ｍＲＮＡから翻訳される。したがって、物質Ｂは、物質Ａの２倍の治療潜在性を持つと考えられる。
【０１４５】
本発明はまた、試験データの生成を含む産物の産生のための方法を含むプロセスに関し、前記プロセスは、前記物質（すなわちここに開示された分析法にしたがって同定された治療物質）を同定するための開示されたプロセスの一つにしたがって物質を同定することを含み、ここで前記産物は前記同定プロセスあるいは分析の結果としての前記物質に関して集められたデータであり、またここで前記データは、前記物質の化学的特徴および／または構造および／または性質を伝達するのに十分なものである。例えば、本発明は特に、本発明の分析の使用者が希望のポリペプチド、例えば酵素、調節活性あるいは遺伝子発現調節活性を持つ化合物を選別するために前記分析を用い、そして化合物を同定し、続いてその情報（すなわち構造、投薬量その他についての情報）を、本発明にしたがって治療あるいは研究目的で前記物質を再生産し、それを投与するために前記情報を利用する他の使用者に伝達するといった状況を意図する。例えば、前記分析の使用者（使用者１）は、多数の試験化合物を前記化合物の構造あるいは同一性を知らずに選別し（例えばここで多数のコード番号が用いられ、最初の使用者は前記コード番号が付されたサンプルが与えられるだけである）、本発明の一つあるいはそれ以上の分析プロセスを用いてスクリーニングプロセスを実施した後、続いて口頭あるいは文書で、もしくは同等の方法で、特定の調節活性を持つ化合物を同定するのに十分な情報（例えば対応する結果を伴ったコード番号）を次の使用者（使用者２）に伝える。この使用者１から使用者２への情報の伝達は、本発明により特に意図される。
【０１４６】
前記にしたがって、本発明は試験化合物の調節活性に関する試験データを生成するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）試験化合物を、遺伝子９５ポリヌクレオチドあるいは遺伝子９５ポリペプチドもしくは遺伝子９５プロモーターに作動可能に結合するレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチド構成体と、前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子が転写され、あるいは前記ポリペプチドが活性化する条件下で接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性、あるいは前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化を測定し、
（ｃ）測定されたポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化あるいは測定されたポリペプチドの活性の変化に基づく前記試験化合物の調節活性に関する試験データを生成することを含み、ここで前記変化は調節活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４７】
（実施例１）
ヒトにおいて低ＨＤＬを引き起こす遺伝子９５中の突然変異
方法
患者確認とサンプル収集
Ｄｕｔｃｈ ｏｒｉｇｉｎの親族ＢＣ１１Ｍは、ブリティッシュ コロンビア大学の遺伝医学学科とブリティッシュ コロンビア、バンクーバーのセントポール病院との共同制作の一環として特定された。この親族は、他の脂質および臨床的異常（例えば肥満や糖尿病）のない状態で、低アルファ蛋白血症表現型（＜５分の１百分率）に基づいて確認された。冠動脈疾患の病歴は、この親族において確認の段階で明らかであった。さらなるＤｕｔｃｈ親族ＮＬ−００３、ＮＬ−１２０は、異常コレステロールレベルに基づいて、アムステルダムのアカデミッククリニカルセンターで、脂質医療への患者紹介プログラムの一環として確認された。ｎｏｒｍｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃな個体（ＨＤＬが２０分の１百分率より高く、８０分の１百分率より低い）のコントロール集団が、突然変異の原因となる性質を確認するために用いられた。
【０１４８】
標識および遺伝子型特定
遺伝子標識に関する情報は、Ｇｅｎｏｍｅ ＤａｔａｂａｓｅおよびＧｅｎＢａｎｋから得られた。ゲノム走査と精度の高い解読（ｆｉｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ）に用いた全ての標識は、事前にＭａｒｓｈｆｉｅｌｄマップで局所化された。“Ｘ”は内用の標識名の多くに付加された。ゲノムＤＮＡは、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを作動させるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、遺伝子型特定された。対立遺伝子のメンデル遺伝は、ＰｅｄＣｈｅｃｋプログラムを用いて検証された。
【０１４９】
連鎖解析
二点連鎖解析はＦＡＳＴＬＩＮＫソフトウェアパッケージのＭＬＩＮＫプログラムｖ４．１ｐを用いて行われ、多点連鎖解析はＶＩＴＥＳＳＥ ｖ１．０を用いて行われた。常染色体優性遺伝モデルが用いられ、集団中の全低ＨＤＬ（＜５分の１百分率）の１０％が遺伝子の突然変異に起因すると想定された。疾患対立遺伝子頻度は、非保因者において、９８％浸透率と４．５％の表現型複写割合で０．２５％であると思われる。標識対立遺伝子頻度は、アメリカとヨーロッパの膨大なサンプルから推定された。ハプロタイプは手動で再構築され、ＳＩＭＷＡＬＫ ｖ２．８を用いて交差確認された。
【０１５０】
結果
ＢＣ１１Ｍファミリーの連鎖解析
ＢＣ１１Ｍファミリーの２４個体は、優性遺伝子種の単離された低アルファ蛋白血症を隔離した１２の多重化系統の４００マーカーゲノムスキャンに組込まれる。能力分析は、ＢＣ１１Ｍ親族が常染色体優性モデルでの近接に基づく連鎖（ＭａｘＥ（Ｚｍａｘ ５ｃＭ）＝４．７６２）を用いたＨＤＬ遺伝子座の同定に適切であったことを示した。ゲノムスキャンデータの二点連鎖解析は、染色体９に示唆的なＬＯＤスコアを与えた（Ｄ９Ｓ１６７７ ＬＯＤ＝２．２８５）。このＬＯＤスコアについては、広範な系統に対して多点連鎖分析、浸透遺伝子型特定およびさらなる標識を用いたハプロタイプ特定が引き続き行われた。染色体９上の領域は、多点連鎖分析により裏付けられ、多点ＬＯＤは、２０．９１ｃＭの間隔のみの影響を示す８．０に達した（間隔１；Ｄ９Ｓ１７８０から９ｑ２２ｘｃａ１７）（表２）。この間隔はさらに、影響を受けない個体の染色体切断点に基づいて、サブ領域に分けられるであろう（間隔２；９ｑ２２ｘｃａ７から９ｑ２２ｘ−ｃａ１７）（間隔３；Ｄ９Ｓ１８１２からＤ９Ｓ１８０３ｘ）（表２）。間隔２は、最も広範囲の突然変異検出の焦点であった。
【０１５１】
【０１５２】
（実施例２）
オリジーン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）ｃＤＮＡパネルを用いた遺伝子９５の組織区分
マルチウェルＰＣＲプレートに配置された２４連続希釈（直線的な増幅を確実にするための４ログ範囲）ｃＤＮＡ複製は、オリジーン（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得られた。ＰＣＲは、遺伝子９５（ここで時々“Ｇ９５”）の遺伝子特異的プライマーを用いて行われた。反応物は１０μｌ中で、１．０μｌの１０×緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５ｐモルのフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー、および０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）が含まれる。
【０１５３】
【０１５４】
増幅した断片はエキソン４と６の間にあり、２３０ｂｐのサイズを持つ。
【０１５５】
ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ ｃｙｃｌｅｒｓ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）がＰＣＲ増幅のために用いられた。ＰＣＲの条件は、９４℃で３分間の変性ステップ、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３５サイクルであった。７２℃で７分間の最終伸長ステップが行われ、サンプルは１０℃で保存された。ＰＣＲ産物は、１×ＴＢＥ中の２％アガロースゲル上で電気泳動により分析された。１００ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）がサイズ基準として用いられた。
【０１５６】
【０１５７】
Ｇ９５ｃＤＮＡの相対量は表ＸＸに示される。Ｈ＝高、Ｍ＝中間、Ｌ＝低。
【０１５８】
（実施例３）
ノーザンブロットによる組織発現
遺伝子９５転写産物の定量および定寸は、ヒト１２−レーン多組織ノーザンブロット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の使用により分析された。ヒトブロットは、遺伝子９５のエキソン６から９に対する４０１ｂｐプローブでハイブリダイズされた。予想どおり、４．４ｋｂのバンドが同定された。アクチンは、コントロールとして用いられた。
【０１５９】
【０１６０】
結果（図９）は、遺伝子９５が筋肉および心臓中に最高レベルで遍在的に発現することを示す。これらの結果は、マウス組織のノーザンブロット分析により確認された（データは図示せず）。前記実施の一つにおいて、線維芽細胞を用いて、コレステロール治療のおおよそ２４時間前に、２×１０５個の細胞が次の日に５０から７０％の密集度を得るために６ウェルフォーマットの各ウェルに播種された。細胞は最終濃度３０μｇ／ｍｌのコレステロールで２４時間処理され、続いて全ＲＮＡ調整が行われた。コントロールは、影響のない細胞系から得られた遺伝子９５発現であった。
【０１６１】
（実施例４）
患者線維芽細胞中の遺伝子９５発現
遺伝子９５のエキソン１０におけるＳｅｒからＡｌａへの突然変異が、４つの患者線維芽細胞（４００、５５８、５４９および５７５）中に存在した。我々はこれらの線維芽細胞における遺伝子９５の発現を正常コントロール（２２６、４７５および４８５）と比較することにした。この分析は、脂質代謝と遺伝子９５との関係を調査するために、外因性コレステロールの不在下あるいは存在下で行われた。定量リアルタイムＰＣＲ（あるいは“ＴａｑＭａｎ”）分析は、以下のように行われた。ヒト遺伝子９５プライマーとそのプローブは、プライマーエキスプレスソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて設計された。
【０１６２】
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲは、１×ＴａｑｍａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）中に１２０ｎｇのヒト遺伝子９５の全ＲＮＡあるいは５０ｎｇのヒトａｐｏＡ１のＲＮＡ、２００μＭのプライマー、および６００μＭのプローブを含む２５ｕｌの最終量で、ＡＢＩ７９００配列検出システムで実施された。ＧＡＰＤＨあるいは１８ｓ（ヒト）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は内部コントロールとして用いられた。データの定量化と分析は、製造者のプロトコルにしたがって行われた。簡単にいうと、キャリブレータおよびサンプルのΔＣＴは、関連する遺伝子のＦＡＭ ＣＴ値から１８ｓＲＮＡあるいはＧＡＰＤＨのＶＩＣ ＣＴ値を差し引くことにより得られた。ΔΔＣＴは、ΔＣＴ（サンプル）から平均ΔＣＴ（キャリブレータ）値を差し引くことにより算出された。キャリブレータに対するｍＲＮＡ量は１×サンプルとして現され、他の全ての量はキャリブレータに関連した多数の割合変化として表される。各サンプルは３組で分析され、標準誤差（ＳＥ）が算出された。ＲＮＡのないＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＮＡがあるが逆転写酵素のない反応が、ネガティブコントロールとして用いられた。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲルにより確認した。
【０１６４】
全般的にみると、遺伝子９５の極端に低いレベルの発現が、コントロールを含む全ての線維芽細胞に見られた。ＴａｑＭａｎの結果が、二つの患者細胞系（４００と５７５）における遺伝子９５の発現がコレステロール治療を伴うあるいは伴わないコントロールと比較しておおよそ５０％下向き調節されたことを示した。患者５５８における遺伝子９５の発現は、コントロールと大きくは異ならなかった。しかし、５４９における遺伝子９５の発現は、コントロールよりも増加した（データは図示せず）。
【０１６５】
突然変異保因者における遺伝子９５発現の減少傾向が指摘された。メッセンジャーＲＮＡ発現レベルは、細胞培養条件、細胞密度および継代数に左右されやすいであろう。作用メカニズムについての任意の理論に結びつけられることを望まなくとも、この突然変異保因者における遺伝子９５ｍＲＮＡのレベルの減少傾向は、これらの患者における低ＨＤＬ状態の根本的なメカニズムであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ＢＣ−１１Ｍファミリーの系統図
【図２】ＮＬ−００３ファミリーの系統図
【図３】ＮＬ−１２０ファミリーの系統図
【図４】遺伝子９５ｃＤＮＡの予想される１０エキソン構成、およびＥ６ａあるいはＥ９ａを持つ他の可能性のある転写産物を含む、遺伝子９５の既知の断片から組み立てられた不完全構成を示す図。
【図５Ａ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｂ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｃ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｄ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｅ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｆ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｇ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図６】ヒト（配列番号４）およびマウス（配列番号５）の遺伝子９５のアミノ酸配列の位置合わせ（アラインメント）を示す図
【図７】ヒト遺伝子９５の突然変異１（配列番号７）および突然変異２（配列番号１６）のアミノ酸配列の、野生型アミノ酸配列（配列番号４）との位置合わせ（アラインメント）を示す図
【図８】本発明にしたがって同定された突然変異および多型の位置とともに遺伝子９５の予想されるエキソン結合を示す図
【図９】実施例３の結果を示す遺伝子９５プローブを用いたノーザンブロットを示す図
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年６月２７日に出願された合衆国仮出願６０／３９１８７８号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、病気の診断および治療、特に低アルファ蛋白血症（ｈｙｐｏａｌｐｈａｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ）を含む異常脂質血症および低ＨＤＬ疾患等の心疾患の診断および治療のための新規治療標的である遺伝子９５の発見に関し、また、前記疾患の予防、治療あるいはそうでなければ改善に有用な治療因子およびその治療因子のスクリーニングおよび同定方法の発見に関する。
【背景技術】
【０００３】
疫学研究は、血漿高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）濃度と、血管障害、特に心疾患（ＣＶＤ）および冠動脈疾患（ＣＡＤ）の発生とが反比例の関係にあることを相次いで示してきた。ＨＤＬ−Ｃレベルは大きく等級分けされ、また独立した心血管系危険因子である。増加したＨＤＬ−Ｃの保護効果は、８０歳まで持続する。低ＨＤＬ−Ｃは、正常総血漿コレステロールレベル（＜５．２ｍｍｏｌ／ｌ）であっても、ＣＡＤ危険性の増加に関連する。他の異常脂質血症あるいは二次因子に直面しても、ＨＤＬ−ＣレベルはＣＡＤの重要な予測判断材料である。低ＨＤＬコレステロール（重症例では低アルファ蛋白血症と呼ばれる）はまた、脳血管疾患、冠動脈再狭窄および抹消血管障害に関わる。
【０００４】
低ＨＤＬ−Ｃレベルの薬理学的介入は、今までのところ十分に証明されてはいない。現在、直接的で有効な方法でＨＤＬレベルを調節するＦＤＡの承認した治療物質はない。ＨＤＬの調節に関する現在の研究方法は、ＡｐｏＡ１の産生の増加、逆コレステロール輸送（ＲＣＴ）の速度の促進およびＨＤＬの異化代謝の減少を含む。例えば、ＡｐｏＡ１レベルの増加は、転写の小分子上向き調節を介して、あるいはＡｐｏＡ１タンパク質の注入により可能であろう。あるいは、ＡＢＣＡ１作用薬の作成および抹消組織からのコレステロール流出の増加によりＲＣＴの上向き調節が可能であろう（ＰＣＴ公開ＷＯ００／５５３１８参照、参照としてここに組込まれている）。ＨＤＬの異化代謝は、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を含む多くの酵素により調節され、これはまたＨＤＬ調節のための適切な治療標的であり得る。
【０００５】
ヒトにおいてＨＤＬレベルを調節するように働くさらなる遺伝子と対応するタンパク質の同定は、薬剤開発における追求のための治療方法の合理的な選択を可能にするだろう。本発明は、血管障害および異常脂質血症の治療における治療上の介入のための新規標的の発見と、低ＨＤＬレベルおよび付随する障害の症状の軽減に有用な治療物質を選別し、同定するための前記標的の使用に関する。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の簡単な要約）
本発明は、ヒト由来の完全遺伝子９５ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３）および遺伝子９５アミノ酸配列（配列番号４）を提供する。本発明はさらに、ヒトの遺伝性低ＨＤＬ疾患に関連する遺伝子の突然変異型の同定により、ＨＤＬコレステロールレベルの主要な調節因子としての遺伝子９５の役割と機能を同定する。
【０００７】
一態様において、本発明は遺伝子９５の精製核酸配列と精製および半精製形態を含むその断片を提供し、また遺伝子９５ヌクレオチド成分を含む組換細胞系（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）およびウイルスあるいは細胞抽出物を提供する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、精製遺伝子９５タンパク質と精製および半精製形態を含むその断片を提供し、また遺伝子９５生物学的活性を持つ細胞あるいは細胞抽出物および抗遺伝子９５抗体、そのようなポリペプチドの作成方法を提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ＨＤＬレベルを調節し、かつ／または血管障害あるいは異常脂質血症を治療する候補化合物か否かを判断するための方法を提供する。この方法は、（ａ）遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性の測定、（ｂ）この生物学的活性を促進する条件下での、この生物学的活性の発生源と候補化合物の接触、および（ｃ）前記接触の結果としての前記遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性における変化の測定を含む。ここで生物学的活性の変化は、前記生物学的活性を調節し、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用である化合物として、候補化合物あるいは候補化合物の類似体を同定する。遺伝子９５活性を分析する他の方法はまた、本発明によって明確に意図されている。
【００１０】
他の態様において、本発明は、ＨＤＬレベルを調節し、かつ／または血管障害あるいは異常脂質血症を治療するための化合物をコンピュータにより同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）（例えば、Ｘ線結晶学あるいはその他の技術を介して）選択された遺伝子９５タンパク質の活性部位を決定し、（ｂ）コンピュータによるモデリングを介した、活性部位と相互作用する化合物の同定、それによるＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用な化合物としての化合物あるいはその類似体の同定を含む。
【００１１】
他の態様において、本発明は、必要とするヒトに、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の活性を調節する化合物を投与することを含む、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療のための方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の突然変異、例えば配列番号６から９あるいは表１中に特定された突然変異の同定を含む、血管障害および異常脂質血症の診断のための手段および／または血管障害および異常脂質血症を治療するための治療物質の薬理ゲノム学を提供する。
【００１３】
（定義）
ここで用いられるように、以下の用語は、別に明示されない限り、指定された意味を持つ。
【００１４】
ここで用いられるように、“遺伝子９５に相当する遺伝子”の意味での“相当”という用語は、遺伝子が指定されたヌクレオチド配列を持つか、あるいは指定された配列によりエンコードされるものと同じＲＮＡを実質的にエンコードすることを意味し、“実質的に”という用語は、遺伝子９５生物学的活性を持つタンパク質をエンコードする配列の全体と最低約５０％同一であることを意味し、より好ましくは最低約６０％、７０％、８０％、９０％あるいはそれ以上同一であり、他で定義されるように、その接合変異体を含む。
【００１５】
“遺伝子９５に相当する”はまた、他の生物由来の遺伝子９５の同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）あるいはオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）および、ヌクレオチドあるいはアミノ酸レベルで最低約５０％の同一性、より好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％あるいはそれ以上の相同性を持つその配列変異体を含む。好ましくは、前記遺伝子は真核生物由来であり、より好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類あるいはヒト由来である。本明細書に記載されているヒト遺伝子およびタンパク質は、他の種から得られる幅広い種類の同族体、オーソログおよび類似体の代表である。これらの同族体、オーソログおよび／または類似体、およびこれらの適当な変異体は、本発明の組成物および方法に用いることができる。例えば、記載されたヒト遺伝子のマウス同族体を用いるスクリーニング分析はまた、ヒトを治療するための潜在的な治療物質を同定するためのスクリーニング分析に用いることができる。
【００１６】
そのようなものとして、本発明は、これらの他の種由来のアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）、同族体、および領域基盤により領域上に確認されたように、翻訳されたときに、アイソフォームの生物学的活性を保持する類似配列の使用に関する。前記類似配列は、配列番号３あるいは配列番号４と好ましくは５０％以上の同一性を共有し、より好ましくはここに記されたアイソフォームと６０％、７０％、８０％および最も好ましくは最低約９０％の同一性を共有する。これらの配列の全ては、生物学的活性の調節における試験化合物の効果を測定するために十分な治療標的生物学的活性を保持するのであれば、本発明の方法の実施において有用であり得る。前記理解は、ここに開示された示唆に基づいて、この分野における通常の知識を有する者が利用可能である。
【００１７】
さらに本発明にしたがって、“パーセント同一性”あるいは“パーセント同一性の”という用語は、配列を示す場合には、配列が、比較される配列（“比較配列”）の、開示あるいは請求された配列（“参照配列”）との位置合わせ（アライメント）の後に、請求あるいは開示された配列と比較されることを意味する。その後パーセント同一性は以下の公式にしたがって測定される：
パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
ここでＣは、参照配列と比較配列との間のアライメントの全長にわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、ここで（ｉ）比較配列中に対応するアライメントされた塩基あるいはアミノ酸のない参照配列中の各塩基あるいはアミノ酸および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップおよび（ｉｉｉ）比較配列中のアライメントされた塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列中のアライメントされた各塩基あるいはアミノ酸が差異を構成し、Ｒは、参照配列中に構成されたギャップも塩基あるいはアミノ酸として数に入れた、比較配列とのアライメントの全長の参照配列中の塩基あるいはアミノ酸の数である。
【００１８】
アライメントが比較配列と参照配列との間に存在し、それに対する上記のように計算されたパーセント同一性が規定の最小パーセント同一性と同等あるいはそれ以上である場合には、たとえアライメントが、上記の算出されたパーセント同一性が規定のパーセント同一性以下である場合に存在したとしても、比較配列は参照配列に対して規定の最小パーセント同一性を持つ。
【００１９】
ここで用いられるように、“部位”、“分節”および“断片”という用語は、ポリヌクレオチドに関して用いられた場合、ヌクレオチド残基の連続した配列を示し、この配列はより大きな配列の一部を形成する。前記用語は、前記ポリヌクレオチドの任意の共通エンドヌクレアーゼでの処理により産生された生成物、あるいは合成的に合成することが可能なポリヌクレオチドの伸長を含む。これらは、対応遺伝子のエキソンおよびイントロン配列を含み得る。
【００２０】
ここで用いられる場合の“治療標的生物学的活性”（あるいは“生物学的活性”のみ）は、以下の（ａ）から（ｄ）に示された実施例を含むがこれに限定されない治療標的遺伝子およびタンパク質の直接あるいは間接的に測定可能で同定可能な生物学的活性の全てに関連する非常に広い用語である。
【００２１】
（ａ）精製された治療標的タンパク質に関し、治療標的生物学的活性は、全ての生物学的プロセス、リガンド、タンパク質、膜成分あるいは（小有機化合物等の）その他の化合物の相互作用あるいは結合、結合様式、結合活性関係、ｐＫａ、ｐＤ、酵素反応速度、安定性およびタンパク質の機能評価を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
（ｂ）細胞画分、再構成細胞画分あるいは細胞全体における治療標的生物学的活性に関し、これらの活性は、リガンドあるいは抗体の結合様式、およびシグナル伝達系、細胞成分の流出、流入あるいは蓄積、安定性あるいは劣化、膜構成および様式、細胞増殖、進行あるいは様式および治療標的活性のその他の直接あるいは間接的効果の測定等の、この効果の測定可能な全ての結果を含むがこれらに限定されない。
【００２３】
（ｃ）治療標的遺伝子および転写に関し、治療標的生物学的活性は、治療標的ｍＲＮＡあるいはその代わりの転写産物を産生するＤＮＡの転写の割合、規模あるいは範囲、前記転写の調節タンパク質の影響、前記転写の調節タンパク質の調節因子の影響、加えて、ｍＲＮＡ転写産物、転写後プロセッシング、ｍＲＮＡ量および折り返しの安定性および様式、ｍＲＮＡのポリペプチド配列への翻訳の全ての測定結果を含む。
【００２４】
生物における治療標的生物学的活性に関し、これは、これらの生物における異常な治療標的生物学的活性により引き起こされる疾病過程あるいは障害において、欠如あるいは欠乏により同定される生物学的活性を含むがこれらに限定されない。大まかに言って、治療標的生物学的活性は、この分野において知られているタンパク質および遺伝子の生物学的性質を分析するための全ての方法によって測定することができる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明にしたがって、ヒトのＨＤＬレベルの維持に関連する遺伝子およびタンパク質は、実施例１に示されたポジショナルクローニング法を用いた、低ＨＤＬレベルを持つファミリーにおける遺伝子の突然変異型の同定により、判定される。
【００２６】
ＢＣ−１１Ｍファミリーの系統は図１に示される。連鎖を定義するために用いられるファミリーの表現型は、高い浸透度の常染色体優性種における低ＨＤＬ（低アルファ蛋白血症）形質を分離する。他の脂質条件（トリグリセリド（ＴＧ）および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ））は、このファミリーでは正常であり、他の交絡因子（肥満および糖尿病等）はない。このファミリーでは特に心疾患および冠動脈疾患の強い徴候があり、多数が心事故（心筋梗塞（ＭＩ）、発作および狭心症）を経験し、この疾患の症状についての治療（冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）等）を受けている。このファミリーの一部は（狼瘡および自己免疫疾患に関連する）ベーチェット症候群であり、他の一部はセリアック病（グルテン不耐性）であり、残りは甲状腺に異常を持つ。
【００２７】
このファミリーは、ＡＢＣＡ１のコード領域には野生型配列を持つため、これまでに同定されたＡＢＣＡ１中の低ＨＤＬを引き起こす突然変異により識別する。加えて、ＡＢＣＡ１遺伝子は、このファミリーの遺伝的特徴に基づいて、またこのファミリーの病気の個体由来の培養線維芽細胞における正常コレステロール流出測定結果に基づいて除外される。
【００２８】
ＮＬ−００３ファミリーの系統は図２に示される。発端者（ＩＩ：３５）は５分の１百分率（ｆｉｆｔｈ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）（年齢および性別修正済み）以下のＨＤＬレベルを持つ。体重超過／肥満（ＢＭＩ＞２５＞３０）はほとんどないが、この状態はＨＤＬ条件と十分に共分離しておらず、したがって関連していないこともある。
【００２９】
ＮＬ−１２０ファミリーの系統は図３に示される。この場合もやはり、発端者（ＩＩ：０１）は５分の１百分率（ｆｉｆｔｈ ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ）（年齢および性別修正済み）以下のＨＤＬレベルを持つ。ＮＬ−００３およびＮＬ−１２０の両方において、多くの低ＨＤＬの個体が観察される。ＮＬ−００３ファミリーにおいて、低ＨＤＬ、心疾患および心事故（ＭＩ）の個体が観察される。
【００３０】
したがって、本発明にしたがって同定された遺伝子は、第９染色体上、９ｑ２２バンド上あるいはその近傍に位置する。この遺伝子座の標識（マーカー）は同定され、以下の通りである：９ｑ２２ｃａ７（配列番号１）および９ｑ２２ｃａ１７（配列番号２）。他のマーカーは共有財産として入手可能である。
【００３１】
遺伝子９５およびその突然変異の説明
遺伝子９５は知られており、ここではＰ１Ｇ９５、遺伝子９５、Ｇ９５あるいはＨＤＬ調節タンパク質として記載されている。遺伝子９５の性状は、公共データベース中の様々な情報源で開示されている。
【００３２】
ゴールデンパス ジーン（Ｇｏｌｄｅｎｐａｔｈ Ｇｅｎｅ）ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００１３６９２５、転写産物ＩＤ：ＥＮＳＴ０００００２５９４５２を含む（ヒトゲノムプロジェクトワーキングドラフトのゴールデンパス アセンブリ、ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕあるいはアンサンブルウェブサイトｗｗｗ.ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ、２００１年８月実施版で見られる）。
【００３３】
ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ 番号：ＡＫ０５６４５３、ＸＭ＿０８８５７３（ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｑｉで入手可能である）。この分野における通常の知識を有する者は、遺伝子９５の正確な全長ヌクレオチドコード配列を提供せず、また翻訳されたときに遺伝子９５の正確なアミノ酸配列も提供しないことを認識するであろう。
【００３４】
遺伝子９５（Ｐ１Ｇ９５）の全長ｃＤＮＡ配列は、配列番号３に示され、５′ＵＴＲおよび３′末端を含む４３３３ｂｐ転写産物を含む。遺伝子９５のエキソン／イントロン構造は、図４に示される。前記遺伝子は、エキソン６（“エキソン６ａｌｔ”あるいはＥ６ａ）およびエキソン９（“エキソン９ａｌｔ”あるいはＥ９ａ）に対する可能性のある代替転写産物を伴う１０エキソンを含む。図４は、予想される１０エキソン構成およびＥ６ａあるいはＥ９ａを用いた他の可能性のある転写産物を示す。
【００３５】
遺伝子９５タンパク質は、５１６アミノ酸タンパク質（配列番号４）を含む。代替メチオニン開始部位の使用は、４８９アミノ酸の配列を生成し得る。遺伝子９５のタンパク質配列の分析は、ヒトの血清脂質恒常性の維持に関連する水溶性タンパク質の特徴を持つことを示している。前記タンパク質は、一つあるいはそれ以上の以下の特徴を含むと思われる：Ｎ−グリコシル化部位（ＰＳ００００１）、グリコサミノグリカン結合部位（ＰＳ００００２）、４ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４）、１２タンパク質キナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５）、８カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６）、８Ｎ−ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ）部位（ＰＳ００００８）、ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型領域（ドメイン）（ＰＳ５０１５７）、システインに富む（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ；システインリッチ）領域（ＰＳ５０３１１）。
【００３６】
配列番号３について、残基１から４００は５′−ＵＴＲ（非翻訳領域）に相当し、一方３′ＵＴＲは残基１９５２から末端までを含む。配列番号６の突然変異配列について、Ｔ１８０２Ｇ突然変異を示し、５′−ＵＴＲ領域は残基１から４００によって示され、３′−ＵＴＲ領域は残基１９５２から末端までによって示される。配列番号８の突然変異配列について、１７０６Ｃ１７０７突然変異を示し、５′−ＵＴＲ領域は残基１から４００によって示され、３′−ＵＴＲ領域は残基１９５２から末端までによって示される。
【００３７】
遺伝子９５は、仮定的で、まだ特徴が分かっていない細菌タンパク質のグループに最も密接に関連するロダネーゼ様（Ｒｈｏｄａｎｅｓｅ−ｌｉｋｅ）ドメインを持つ。例示的なロダネーゼ様ドメインはアミノ酸３０４から４０６に見られる。仮定的あるいは“ロダネーゼ様”もしくは“スルフルトランスフェラーゼ関連”タンパク質以外に、この遺伝子と類似する他のヒト遺伝子はない。ロダネーゼドメインは、チオ硫酸スルフルトランスフェラーゼ（例えば、ロダネーゼ；ＩＰＲ００１３０７）中に見られる。公共データベースの検索は、ヒトゲノム中の２１個をロダネーゼドメインと認定した。一つは血小板粘着分子であり、残りはホスファターゼである。ＤｎａＪセントラルドメイン（例えば［ＣＸＸＣＸＧＸＧ］４；アミノ酸４２２から４８０）、ＸＳジンクフィンガードメイン（例えばアミノ酸４５８−４６５）およびインテグラーゼ部位（例えば、アミノ酸４５２−４６５）等の他のドメインもまた示される。
【００３８】
図５は、個々のエキソン、プロモーター（ゲノムの）からのいくつかの配列およびイントロン領域（特にスプライス部位接合部）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。説明：小文字は、成熟ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡの一部を形成しないイントロン領域である。“．．．”は、公共データベースから入手可能なイントロン領域であり、ここでは含まれない。大文字は、ヌクレオチド塩基あるいはアミノ酸（文中で示されるように、標準表記記号が用いられている）である。“＊”は、終止コドンである。＋１、＋２、＋３は、核酸の翻訳のフレームシフトである。正確なアミノ酸配列の前後の短読み取り枠（ショートオープンリーディングフレーム）は完全性のために用いられるが、遺伝子９５タンパク質の一部を形成しないと思われる。ここで、エキソンＥ１は配列番号１８の一部であり、エキソンＥ２は配列番号１９の一部であり、エキソンＥ３は配列番号２０の一部であり、エキソンＥ４は配列番号２１の一部であり、エキソンＥ５は配列番号２２の一部であり、エキソンＥ６は配列番号２３の一部であり、エキソンＥ７は配列番号２４の一部であり、エキソンＥ８は配列番号２５の一部であり、エキソンＥ９は配列番号２６の一部であり、エキソンＥ１０は配列番号２７の一部であり、エキソンＥ６ａは配列番号２８の一部であり、エキソンＥ９ａは配列番号２９の一部である。ここでエキソン６ａは、代替エキソン６（“エキソン６ａｌｔ”）（不完全タンパク質（ｔｒｕｎｃａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ））であり、一方エキソン９ａは、代替エキソン９（“エキソン９ａｌｔ”）（より長いが、不完全である）である。加えて、ｃｔｔｔｇａ（配列番号３０）は、新規イントロン配列の開始点を示す。遺伝子９５配列は、ゲノムＤＮＡの約３４ｋｂにわたる。完全に示されていないイントロンは、公共ヒトゲノム配列データベース、ゴールデンパスから得ることができる。文中で指示されたように、小文字はイントロンおよびプロモーター領域を示し、大文字はｃＤＮＡあるいはｍＲＮＡ中のヌクレオチドまたはアミノ酸を示す。エキソン１およびエキソン２は一つあるいはそれ以上の星印（“＊”）を持つ。推定上の終止コドンがある。真の開始メチオニンは、星印の後のエキソン２中の最初のメチオニンだと思われる。星印はまたエキソン１０にも見られる。最初の星印は、５１６アミノ酸のポリペプチドを産生する、予想される終結部位である。残りのアミノ酸翻訳物は、完全にすることを目的として示されており、機能性タンパク質にはならないと思われる。エキソン６ａおよびエキソン９ａは終止コドンを含む。これらの代替エキソンが用いられた場合、これらは図のように不完全タンパク質になると思われる。
【００３９】
相同性：全長タンパク質中で、ヒト遺伝子９５に最も近い同族体は、ロダネーゼ関連スルフルトランスフェラーゼ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＢｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）と２９から３４％の同一性を持つ。相同性の最も高い仮定的な細菌タンパク質は、Ｑ９ＲＶＣ９＿ＤＥＩＲＡ／１１９−２１６；Ｑ５５６１３＿ＳＹＮＹ３／１１３−２１０；Ｑ９Ｚ７Ｈ１＿ＣＨＬＰＮ；０８４６３２＿ＣＨＬＰＮ／１１３−２１２；０８４６３２＿ＣＨＬＴＲ／１１３−２１２；０３４１３１＿ＬＡＣＬＡ／１１６−２１３；０３１４５７＿ＢＡＣＳＵ／１１６−２１３（ＹＢＦＱタンパク質）を含む。
【００４０】
本発明はまた、遺伝子９５の最初の非ヒト哺乳類同族体である、マウス遺伝子９５タンパク質（配列番号５）を開示し、請求する。この配列はヒト遺伝子９５と、タンパク質の全長にわたっておおよそ７６％の配列同一性を持つ。ヒトおよびマウスアミノ酸配列は、図６に並べられている。共通するアミノ酸は、保存性および非保存性変換とともに、示されている。
【００４１】
他の哺乳類由来の短核酸配列分節についてのさらなる調査は、哺乳類種がヌクレオチドレベルで、概ね保存された遺伝子９５配列を共有することを示す。特に、
ヒト：ウシは、重複配列に基づいて５１４／５６５（９０％）同一である。ヒト：ラットは、重複配列に基づいて３３８／４０１（８４％）同一である。ヒト：ブタは、重複配列に基づいて２２８／２６５（８６％）同一である。ヒト：マウスは、重複配列に基づいて２６６／３０７（８６％）同一である。
【００４２】
発現パターン：ＥＳＴ検証に基づいて、前記遺伝子は以下の組織および細胞系中に発現することが示されている：奇形癌、脳、胎座、卵巣腫瘍、リンパ腫、メラノーマ、神経芽細胞腫。実施例２および３のデータは、幅広い組織中での発現を確認している。
【００４３】
ＢＣ−１１Ｍファミリー中に見られる突然変異１は、Ｓｅｒ４６８Ａｌａ 突然変異、配列番号７を引き起こす１８０２Ｔ＞Ｇ（配列番号６）として同定された。突然変異は、１３体の病気に冒されたファミリー構成員中に存在し、１０体の病気に冒されなかったファミリー構成員中に存在しなかった。突然変異は、１９８のコントロール染色体中に存在せず、また高ＨＤＬの個体由来の１６４の染色体中にも存在しなかった。両コントロール群は、ＢＣ−１１Ｍファミリーと類似した民族性であった。前記突然変異は、推定上のタンパク質キナーゼＡリン酸化部位（ＰＫＡ−ｂａｓｉｃ−ｂａｓｉｃ−ｎｅｕｔｒａｌ−Ｓｅｒ）の消失をもたらし得る。この突然変異は、マウスタンパク質中に保存されているセリン残基を変換する。
【００４４】
５分の１百分率未満のＨＤＬレベルを持つＮＬ−００３ファミリー中の個体由来の突然変異２は、１７０６Ｃ１７０７挿入配列番号８を含む。この挿入は、Ｑ４３６のコドンの第二塩基中であり、Ｑ４３６Ｐおよび、成熟前終止コドン４７５ａａ全体（配列番号９および残基１４のメチオニンから計数）を産生する３９の追加の特異アミノ酸をもたらす。突然変異２はまた、５分の１百分率未満のＨＤＬを持つＮＬ−１２０ファミリー由来の個体中に観察される。突然変異２は、民族性の類似する２２８のコントロール染色体中には観察されなかった。
【００４５】
突然変異１および突然変異２のアミノ酸配列とヒト遺伝子９５の野生型アミノ酸配列を並べたものが図７に示される。
【００４６】
遺伝子９５のコード領域の一塩基変異多型（ｃＳＮＰｓ）およびその他の多型は同定され、表１に示される。これらのｃＳＮＰｓは、もしあれば、同定されたアミノ酸変換をもたらす。遺伝子９５のエキソンあるいはイントロン領域中のその他のｃＳＮＰｓおよび多型はまた、この分野における通常の知識を有する者が同定することができる。
【００４７】
開始ＲＮＡ転写産物の最終ｍＲＮＡへの変換において行われるプロセッシングのために、ここに開示されたヌクレオチド配列は、完全ゲノム配列未満に相当し得る。前記遺伝子およびｃＤＮＡ配列は、これらが共に類似ＲＮＡ配列をエンコードするため、相当する遺伝子と考えられる。したがって、限定されない実施例のみの目的で、短ｍＲＮＡに変換されるＲＮＡ転写産物をエンコードする遺伝子は、前記ＲＮＡｓの両方をエンコードし、したがってｃＤＮＡに（通常のワトソン−クリック相補性法則を用いて）相補的なＲＮＡ、すなわちｃＤＮＡ（例えば、ここに開示された配列）によってエンコードされているＲＮＡをエンコードしていると見なされる。したがって、ここに開示された配列は、細胞中に含まれる遺伝子に相当し、これらの配列は同一の配列に相当し、あるいはこれらの遺伝子によりエンコードされるＲＮＡｓと相補的であるため、発現の相対的レベルを測定するために用いられる。前記遺伝子はまた、本発明の方法で用いられる細胞中に発現し得る異なる対立遺伝子およびスプライス変異体を含む。
【００４８】
したがって、本発明のスクリーニング分析に用いるための、ここに開示された遺伝子配列等のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが、配列番号３を持つポリヌクレオチドによりエンコードされているか、あるいはハイブリダイゼーション等により相補的なＲＮＡの配列と最低５０％同一、好ましくは最低７０％、８０％、９０％同一、そしてより好ましくは最低９５％あるいは９８％同一、また特にこのＲＮＡの配列を持つＲＮＡ（自然発生スプライス変異体および対立遺伝子を含む変換あるいは未変換）をエンコードする場合には、遺伝子９５に“相当する”。加えて、配列番号３と最低５０％同一、好ましくは前記配列と最低約７０％、８０％、９０％同一、より好ましくは前記配列と最低約９８％同一、また最も好ましくは前記配列を含む配列を含む遺伝子は、これらの配列に相当する遺伝子として、特に本発明の全ての方法により意図されている。加えて、これらの配列のいずれかと同じポリペプチドおよびタンパク質をエンコードする配列はまた、前記配列のパーセント同一性に関わらず、これらがどのように開示あるいは限定されているかに関わらず、前記配列のいずれかあるいは全てに依存する本発明の任意の方法によって特に意図されている。したがって、前記配列は、本発明にしたがって開示された任意の方法の実施において用いることができる。前記配列はまた、遺伝子９５間に存在する、ここに定義されているとおりの読み取り枠を含む。前記配列は、配列番号６および配列番号８の突然変異遺伝子９５配列を含み、また図５に示された代替エキソンを含む配列を含む。
【００４９】
前記にしたがって、本発明は、ポリヌクレオチド配列あるいはこのポリヌクレオチド配列の完全相補体を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。ここで、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と、最低６５％、好ましくは最低７５％、より好ましくは最低８５％、特に最低９０％、最も好ましくは９５％あるいはさらに９８％同一であり、特に好ましくは配列番号３の配列である。本発明はまた、配列番号４に示されたアミノ酸配列を持つポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００５０】
遺伝子９５タンパク質（配列番号４）に関し、本発明は、配列番号４に相当するタンパク質、ポリペプチドおよびアミノ酸配列の全てを含む。配列番号４に相当する前記配列は、全長タンパク質あるいは遺伝子９５タンパク質の生物学的活性を保持するその断片を含む。前記配列は、好ましくは配列番号４と最低約５０％同一であり、より好ましくは配列番号４と約６０％、７０％、８０％および最も好ましくは最低約９０％あるいは９５％同一である。前記配列は、任意の生物、好ましくは真核生物、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはげっ歯類あるいはヒト由来の遺伝子９５タンパク質のオーソログあるいは同族体を含み、また前記配列と最低約５０％、６０％、７０％、８０％、また最も好ましくは最低約９０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。前記配列は、突然変異配列配列番号７および配列番号９、遺伝子９５ヌクレオチド配列の代替読み取り枠に相当する配列および図５における代替スプライスエキソン中に見られる配列を含む。
【００５１】
前記にしたがって、本発明は、配列番号４に示されたアミノ酸配列と最低６５％、好ましくは最低７５％、より好ましくは最低８５％、特に最低９０％、最も好ましくは９５％あるいはさらに９８％の同一性を持つアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを含む。ここで、配列番号４の配列を含むポリペプチドは、特に好ましい。
【００５２】
本発明はまた、核酸ベクターを含む単離されたポリヌクレオチドおよび組み換え宿主細胞を含む、核酸ベクターに関する。本発明はまた、ポリペプチドの産生を支持する条件下での請求項４９に記載の宿主細胞の培養を含む、配列番号４のポリペプチドを産生するための方法を含む。この方法は全て、ここでの開示を考慮に入れて、この分野における通常の知識を有する者に良く知られている。
【００５３】
遺伝子９５を用いたスクリーニング分析
本発明は、治療物質、特に低ＨＤＬレベルに拮抗する物質の同定に用いるための遺伝子９５遺伝子および／またはタンパク質を用いたスクリーニング分析を提供する。一つのプロトコルは、ヒトを含む動物におけるＨＤＬレベル、特に血漿レベルの増加等によりＨＤＬ活性を増加させるために遺伝子９５の活性を上向きあるいは下向きに調節する能力についての化学物質の分析を含む。遺伝子９５遺伝子、あるいはその活性断片あるいはタンパク質の活性を変換する物質、あるいは遺伝子９５によりエンコードされたポリペプチドの活性を調節し得る物質、あるいは前記遺伝子の活性を調節するための転写因子として働くポリペプチド、あるいは、エンハンサーもしくは、シス型様式あるいはトランス型様式で働く遺伝子９５の活性を調節する他の調節遺伝要素等の他の関連遺伝子分節は、それにより同定され、逆コレステロール輸送あるいは他の脂質関連プロセスの改善等により低ＨＤＬレベル、あるいは低ＨＤＬレベルの影響、あるいは低ＨＤＬレベルに関連する疾患の予防、治療あるいは改善において有用であること、および／または心疾患、アテローム性動脈硬化症および他の疾患等の疾患に有用であることを証明し得る。
【００５４】
ここに開示された本発明にしたがって、生物学的活性あるいは遺伝子９５の発現を調節する化合物の投与により、低ＨＤＬ−Ｃ、血管障害、異常脂質血症、アテローム性動脈硬化症あるいは関連疾患を患う患者の治療のための、もしくは体内の逆コレステロール輸送の改善のための組成物および方法が提供される。
【００５５】
本発明は特にスクリーニング分析を意図し、例えばここで広範な化合物が、治療標的生物学的活性の調節における活性について選別され得る。ここに開示された前記分析の全てに関しては、前記調節は治療標的生物学的活性の増加あるいは減少を含み得る。
【００５６】
この分野における通常の知識を有する者は、ローあるいはハイスループットスクリーニング分析に効果的に組込むことができる治療標的の測定可能な生物学的活性を同定することができる。前記分析の限定されない例が、例示目的でここに開示される。これらの示唆に基づいて、治療標的スクリーニング分析の他の実施例は、そのまま実施できるであろう。
【００５７】
本発明はまた、前記治療化合物およびその類似体の同定のための分析を提供する。遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質の生物学的活性を調節する化合物は、本発明において有用であると考えられる。前記化合物の同定のための典型的なスクリーニング分析（試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）あるいは生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ））およびコンピュータを利用した分析（コンピュータ内（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ））は、以下に詳述される。本発明のスクリーニング分析は、低ＨＤＬおよび／または血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療および予防のための治療物質の評価、同定および開発を簡単にする。一般的に、スクリーニング方法は、天然物抽出物あるいは、さらに評価され、いくつかの活性中心構造体に凝縮される大集団（例えば化学ライブラリー）由来の関心のある合成化合物の選択のための容易な方法を提供する。前記中心構造体の多数の類似体は、改善された治療物質としての性質を持つ好ましい類似体を同定するために、開発および試験され得る。
【００５８】
本発明はまた、その活性が高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を変換するポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）前記活性を促進する条件下で、候補化合物を遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの生物学的活性の変化を測定することを含み、
ここで、前記活性の変化は、試験化合物を、前記ポリペプチド生物学的活性を調節する物質として同定する。
【００５９】
このプロセスの一つの実施例において、ステップｂ）における生物学的活性の変化は、ポリペプチドの活性の減少あるいは増加である。好ましい実施例において、前記活性は、酵素の活性を測定することにより測定され、例えばここで、ポリペプチド自体は、直接的あるいは間接的に分析することができる酵素活性を持つ。前記分析はｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。
【００６０】
好ましい実施例において、前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を持ち、別の実施例において、前記ポリヌクレオチドは配列番号３を持つ。
【００６１】
別の実施例において、前記ポリペプチドは、細胞抽出物、リポソームあるいは無傷細胞中に存在する。本発明は特に、細胞が異種遺伝子９５構成を含む組換細胞系である実施例を意図する。他の実施例において、前記細胞あるいは抽出物は、遺伝子組換え技術以外により処理され、例えばここでポリペプチドの活性は、増強されるものであり、細胞は前記ポリペプチドを含むかあるいはその表面に持つように処理され、しかしここで前記ポリペプチドは、前記細胞中に含まれる遺伝子の発現を通してではなく、前記細胞の膜あるいは細胞質中への前記ポリペプチドの物理的な挿入により存在する。
【００６２】
本発明はまた、遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法に関し、ここで前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化は、試験化合物を、遺伝子９５活性を調節する物質として同定する。
【００６３】
前記のステップｂ）において測定された活性の変化は、活性の減少あるいは増加であり得る。一つの実施例において、前記活性は、酵素の活性を測定することにより測定される。前記方法の他の実施例において、前記ポリペプチドは資質二重層中に存在し、ここでこの脂質二重層はリポゾームの一部であることを含む。加えて、前記ポリペプチドは無傷細胞の一部であり得る。例えばここで無傷細胞は、前記ポリペプチドを含むように処理された細胞であり、例えばここで無傷細胞は、前記ポリペプチドを発現するように遺伝子組換えが行われている組換細胞であり、好ましくはここで前記細胞は、前記組換えがなければ前記ポリペプチドを発現しない。全ての場合において、無傷細胞は好ましくは哺乳類細胞である。
【００６４】
本発明はまた、ＨＤＬ増強物質を同定するための方法に関し、前記方法は、動物に、ここに開示された任意の分析を用いて調節活性を持つと分かった物質の有効量を投与し、前記投与の結果としての前記動物中の血漿ＨＤＬ活性の増加を検出し、それによりＨＤＬ活性の増強に有用な物質を同定することを含む。
【００６５】
好ましい実施例において、前記動物は前記物質の投与の前は、低ＨＤＬ活性を示す。他の好ましい実施例において、ＨＤＬ増強活性は、前記動物中のＨＤＬレベルの増加であり、最も好ましくは血漿ＨＤＬレベルの増加であり、また好ましくはここで、前記動物はヒト患者である。
【００６６】
本発明はさらに、低ＨＤＬ関連疾患に苦しむ動物における前記疾患を治療するための方法に関し、ここで前記方法は、前記動物に、本発明の任意の分析を用いてＨＤＬ増強活性を持つと分かった物質の有効量を投与することを含む。好ましい実施例において、治療される動物はヒト患者である。さらなる好ましい実施例において、治療される疾患は、低ＨＤＬ疾患、血管障害および異常脂質血症より成るグループから選択される。
【００６７】
本発明のプロセスにしたがって同定される物質はまた、患者のＨＤＬ状態に関わらず、冠動脈疾患の治療あるいは予防に有用である。例えば、冠動脈疾患の家族暦を持つ正常ＨＤＬレベルの患者であっても、ＨＤＬレベルを増加させ、さらに冠動脈疾患の危険性を減少させるために本発明にしたがった治療物質の服用を勧められるであろう。したがって、前記患者は、本発明にしたがった治療に適するために、異常脂質血症である必要はない。一般的に、本発明のスクリーニング方法は、あらゆるｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ試験システムの適用により治療活性物質のためのあらゆる化合物のスクリーニングを含む。前記化合物の同定に有用な方法の例はここに詳述される。
【００６８】
本発明の方法は、低ＨＤＬレベルならびに心疾患（ＣＶＤ）および異常脂質血症の治療および予防のための活性物質の評価、同定および開発を簡単にする。一般的に、スクリーニング方法は、天然物抽出物あるいは、さらに評価されいくつかの活性および選択材料に凝縮される大集団由来の関心のある化合物の選択のための迅速な方法を提供する。この集団からの陽性の候補者は、続いてそのＨＤＬ−上昇、抗ＣＶＤあるいは抗異常脂質血症活性もしくはその両方を測定するために、本発明の方法において精製され、評価される。陽性の候補者は、治療物質として直接用いられ得る。あるいはこれらは、構造活性相関（ＳＡＲ）分析および好ましい治療物質となるさらなる類似体の開発のための情報を与える構造を提供し得る。
【００６９】
ＨＤＬ調節に関与するスルフルトランスフェラーゼとしての遺伝子９５の評価
ヒトの遺伝的情報が、遺伝子９５の機能がヒトのＨＤＬレベルを維持することを立証した一方で、遺伝子９５の働きの特異的メカニズムはまだ立証されていない。働きのメカニズムについての任意の理論に拘束されることなく、発明者は、遺伝子９５がスルフルトランスフェラーゼあるいは類似の種類の酵素として機能し得ることを示唆する。これは、タンパク質中に見られるロダネーゼドメインの比較に基づく。ロダネーゼドメインは、スルフルトランスフェラーゼ活性については活性的であるとして、またホスファターゼ活性については活性的であるとして、あるいは触媒不活性であるとして分類され得る。ヒトおよびマウスＧ９５は、ロダネーゼドメイン内のスルフルトランスフェラーゼについての一致を含む。ロダネーゼドメイン内のホスファターゼについての陽性一致は、ヒト中には認められるが、マウスＧ９５中には保存されない。加えて、この一致を持つ別のヒト遺伝子は、スルフルトランスフェラーゼ活性として注記される。
【００７０】
いくつかの種類の証拠は、これらの活性をＨＤＬ代謝と関連付ける。例えば、チオレドキシン結合タンパク質Ｔｘｎｉｐは、高脂血症マウス表現型に基づく脂質代謝に関連することが知られている。
【００７１】
遺伝子９５スルフルトランスフェラーゼ生物学的活性を用いたスクリーニング分析は、シアン化合物、チオレドキシンおよびジヒドロリポ酸塩等のスルフルトランスフェラーゼの既知の基質を用いるように設計できることが知られている。あるいは、スクリーニング分析は、前記のスルフルトランスフェラーゼ分析に基づいて設計され得る。チオシアン酸塩生成物についての一つの比色分析において、前記分析はチオ硫酸塩およびシアン化合物の亜硫酸塩およびチオシアン酸塩への変換を測定する。チオレドキシン還元酵素によるＮＡＤＰＨ酸化の分析において、前記分析は、チオ硫酸塩およびチオレドキシンの亜硫酸塩およびチオレドキシン過硫化物への変換を測定する。遺伝子９５の相互作用を介してこれらの変換を作用させあるいは拮抗させる化合物は、本発明の調節因子である。
【００７２】
機能分析は、遺伝子９５に相当するとしてここに開示された一つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドの活性に基づき得る。前記ポリヌクレオチドは、前記遺伝子と最低９０％あるいは９５％同一のポリヌクレオチドあるいは前記遺伝子によりエンコードされたポリペプチドと高い相同性を持つポリペプチド等の、高い相同性を持つ候補を含む。前記分析は、ポリペプチドの活性に起因する分析条件の変化に応じて色を変化させるための種々の色素の能力等（これに限定されない）の薬剤スクリーニング技術を用いることができる。
【００７３】
薬剤スクリーニング分析はまた、他のタンパク質と相互作用する遺伝子９５ポリペプチドの能力に基づくことができる。前記相互作用タンパク質は、例えば、放射性免疫沈降法、共免疫沈降、および酵母ツーハイブリッドスクリーニングを含む、この分野において知られた種々の方法により同定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を作用あるいは拮抗させる試験化合物の能力は、用いることができるスクリーニング分析の標準型である。前記相互作用は、蛍光偏光あるいはシンチレーション近接法を含むがこれらに限定されない方法により分析することができる。薬剤選別は、形質転換あるいはノックアウトマウスの作成上見られる機能あるいは特徴に基づいて、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞中におけるタンパク質あるいはタンパク質断片の過剰発現に基づいて行うことができる。さらに、酵母あるいはＣ．ｅｌｅｇａｎｓ中の哺乳類（例えばヒト）遺伝子９５ポリペプチドの発現は、野生型および突然変異系における候補化合物のスクリーニングを可能とし、また低ＨＤＬ表現型を増強あるいは抑制する突然変異の選別を可能にする。変更遺伝子選別はまた、形質転換あるいはノックアウトマウスにおいて行うことができる。
【００７４】
この分野における通常の知識を有する者にとって、ここでの開示が遺伝子９５と相互作用し、また／あるいは遺伝子９５を調節する化合物を同定するための標準スクリーニング分析への遺伝子９５の組み込みを容易にすることは明らかであろう。前記分析は、タンパク質／化合物結合分析、遺伝子発現分析および多くのその他の種類を含む。標準分析に加えて、遺伝子９５の既知の特徴が用いることができるより特異的な分析を示唆する。例えば、推定リン酸化反応部位は、遺伝子９５のリン酸化反応の速度、量あるいは時期に影響を及ぼす試験化合物の傾向を測定する分析が、本発明の有用な調節因子であり、またここに示された疾患の潜在的な治療物質あるいはその類似体であり得る。スクリーニングに用いるために利用できる遺伝子９５の特徴は、Ｎ−グリコシル化部位、グリコサミノグリカン結合部位、４ｃＡＭＰ−およびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、１２タンパク質キナーゼＣリン酸化部位、８カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、８Ｎ−ミリストイル化部位、ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型ドメイン、およびシステインリッチ領域を含む。測定に有用だと思われる他の特徴は、ロダネーゼ様ドメイン、ＤｎａＪ中央ドメイン、ＸＳジンクフィンガードメインおよびインテグラーゼ部位を含む。
【００７５】
前記にしたがって、本発明は、その発現がｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を修正するポリヌクレオチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチド発現を促進する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化が、試験化合物を、その発現が高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性を修正するポリヌクレオチドの活性を調節する物質として同定する。
【００７６】
前記プロセスの特異的な実施例において、ステップｂ）における発現の変化は、前記ポリヌクレオチドあるいは遺伝子の発現の減少あるいは増加であり得る。
【００７７】
他の態様において、本発明は遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５プロモーターと作動可能に結合するレポーター遺伝子を含む遺伝子構造体と、前記レポーター遺伝子の転写を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の転写の変化を測定することを含み、
ここで前記転写の変化は、試験化合物が遺伝子９５活性を調節する物質であることを示す。
【００７８】
前記の測定された変化は、前記転写の増加あるいは減少であり得る。またここで転写は、前記レポーター遺伝子によりエンコードされた発現産物の量を測定することにより判断され、前記発現産物はＲＮＡあるいはポリペプチドを含む。好ましい実施例において、レポーター遺伝子は、リポゾームあるいは哺乳類細胞等の無傷細胞中に存在し得る。前記方法の好ましい実施例は、ヒトプロモーター、好ましくは配列番号１５に示されるプロモーター、あるいはマウスプロモーター、好ましくは配列番号１４のプロモーター配列を持つプロモーター等の哺乳類遺伝子９５プロモーターの使用を含む。全ての場合において、レポーター遺伝子は、通常その発現が容易に測定される遺伝子であり、また遺伝子９５自体以外のものである。しかしながら後者はレポーター遺伝子として用いるためには除外されない。
【００７９】
前記プロセスは特に、低ＨＤＬレベルおよび疾患およびその徴候に対して有効な物質を同定するために用いられる。前記物質あるいはその化学的類似体はまた、遺伝子９５遺伝子あるいはタンパク質を調節するために、そして／または心疾患の治療あるいは予防のために有用である。ヒト遺伝子９５プロモーター配列を含む構造の一つの例は、配列番号１５に示され、ここでプロモーター配列（最初の約１５００塩基）は配列の開始部分にあり、そしてエキソン１（塩基１５０２から始まる）が続き、その後にイントロン１があり、配列の最後にエキソン２がある。一方、マウスプロモーター（約１５００ヌクレオチド残基）を組込んだ配列が配列番号１４に示され、プロモーターを配列の開始位置に持ち、そしてエキソン１（残基１５０１から始まる）が続き、その後にイントロン１があり、配列の最後にエキソン２がある。エキソン配列はｍＲＮＡに認められた。本発明は前記エキソンおよびプロモーター配列を含む。
【００８０】
他の態様において、本発明は、ＨＤＬレベルの調節および／または血管障害あるいは異常脂質血症の治療のための化合物をコンピュータにより同定するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）（例えばＸ線結晶学あるいはその他の技術を介した）遺伝子９５タンパク質の活性部位の決定、および（ｂ）コンピュータによるモデリングを介した、活性部位と相互作用する化合物の同定、それによるＨＤＬレベルの調節および／あるいは血管障害、異常脂質血症あるいは関連疾患の治療に有用な化合物としての化合物あるいはその類似体の同定を含む。
【００８１】
本発明はさらに、治療物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）化学物質を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの発現を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化は、治療物質を同定する。
【００８２】
さらなる実施例において、本発明はｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性に影響を与えるポリペプチドの活性を調節する治療物質を同定するための方法を含み、前記方法は、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化は、試験化合物をＨＤＬ活性に影響を与えるポリペプチドの活性を調節する治療物質として同定する。
【００８３】
これらの好ましい実施例において、前記ポリペプチドは配列番号４に相当し、そして／または前記ポリヌクレオチドは配列番号３に相当する。
【００８４】
好ましくは哺乳類の、最も好ましくはげっ歯類あるいはヒトの遺伝子９５ポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む抗体をもたらす抗原として用いることができる。前記抗体は、遺伝子９５生物学的活性を調節するための治療上の使用、機能性研究、および薬剤スクリーニング分析および診断学の開発を含むがこれらに限定されない幅広い目的に対して有用であり得る。本発明にしたがって同定された遺伝子９５ポリペプチドの発現あるいは生物学的活性への物質（例えば、小有機化合物）の影響の観察は、基礎薬剤スクリーニングだけでなく臨床試験においても適用することができる。例えば、ここに開示されたスクリーニング分析により遺伝子発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性を増加あるいは減少させると認められた物質の有効性は、不適切な遺伝子発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性に起因した低ＨＤＬレベルを示す被験者の臨床試験において観察することができる。または、スクリーニング分析により、遺伝子９５および、構造的および機能的に関連する遺伝子、それらと高い相同性を持つ遺伝子の発現、タンパク質レベルあるいは生物学的活性を調節すると認められた物質の有効性は、減少した修正された遺伝子発現、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性を示す被験者の臨床試験において観察することができる。前記臨床試験において、ここに開示された遺伝子あるいはポリペプチド、好ましくは例えば心疾患に関連する他の遺伝子の発現あるいは活性は、特定の薬剤の有効性を解明するために用いることができる。
【００８５】
例えば、そして限定目的ではなく、遺伝子９５、あるいはその任意の発現産物の活性、もしくは（例えばここに開示されたスクリーニング分析において同定された）前記遺伝子の活性を調節するポリペプチドの活性を調節する物質（例えば、化合物、薬剤あるいは小分子）を用いた治療により細胞中で調節される遺伝子は、同定することができる。したがって、例えば臨床試験においてコレステロールレベルあるいは心疾患への物質の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調整し、遺伝子９５および、類似あるいは関連疾患に関連する他の遺伝子の発現のレベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析あるいはＲＴ−ＰＣＲにより、もしくはこの分野において知られた多くの方法の一つによって生成されたタンパク質の量を測定することにより、あるいは前記遺伝子あるいはその他の遺伝子によりエンコードされたポリペプチドの生物学的活性のレベルを測定することにより、定量することができる。このように、前記遺伝子発現は、前記物質に対する前記細胞の生理学的反応の指標である、標識として働くことができる。したがって、この反応状態は、前記物質を用いた個人の治療の前、およびその間の様々な時点で測定され得る。
【００８６】
好ましい実施例において、物質（例えば、ここに開示されたスクリーニング分析により同定された作用薬、拮抗薬、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、抗遺伝子９５抗体、アンチセンス分子、核酸、小分子、あるいは他の薬剤候補）を用いた被験者の治療の有効性を観察するための方法を提供し、前記方法は、（ｉ）前記物質の投与前に、被験者から投与前サンプルを取得し、（ｉｉ）投与前サンプル中のＨＤＬ活性レベルあるいは、遺伝子９５タンパク質、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、（ｉｉｉ）被験者から一つあるいはそれ以上の投与後サンプルを取得し、（ｉｖ）投与後サンプル中の遺伝子９５タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡもしくはＨＤＬの発現あるいは活性のレベルを検出し、（ｖ）投与前サンプルと対応する投与後サンプル中の前記タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡの発現あるいは活性のレベルを比較し、（ｖｉ）それに応じて被験者への前記物質の投与を修正するステップを含む。例えば、前記物質の投与の増加は、遺伝子９５あるいはそのエンコードされたポリペプチドの発現あるいは活性を増加させること、あるいは血漿ＨＤＬレベル等のＨＤＬ活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増加させること、すなわち前記物質の有効性を増加させることについて望ましいであろう。または、前記物質の投与の減少は、前記ポリペプチドあるいは遺伝子の発現あるいは活性を減少させることに望ましく、ここで過剰発現はＨＤＬ活性あるいはレベルの低減の一因となる。
【００８７】
動物中の低ＨＤＬレベルの誘導等のＨＤＬ調節に関連するとしてここに開示された遺伝子９５遺伝子は用いることができ、あるいはその断片はタンパク質を発現させるための道具として用いることができ、ここで前記遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏでの適当な細胞中でタンパク質をエンコードし（遺伝子治療）、あるいは薬剤スクリーニング用のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析への使用のための十分量のタンパク質を産生するために用いることができる発現ベクター中に複製することができる。用いることができる発現システムは、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、細菌システム、およびＣＨＯ細胞等の真核生物システムを含む。裸のＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ＤＮＡ）およびＤＮＡ−リポゾーム複合体もまた用いることができる。
【００８８】
前記活性の分析は、細胞内相互作用タンパク質への結合、遺伝子あるいはポリペプチド活性を上向き調節するタンパク質との相互作用、ＨＤＬ粒子あるいは成分との相互作用、ＨＤＬあるいはその成分との相互作用を促進する他のタンパク質との相互作用、およびコレステロール流出の測定を含む。さらに、分析は蛍光−タンパク質バイオセンサーを用いた高分子、代謝産物およびイオンの分子力学に基づき得る。または、発現あるいは活性に対する候補調節因子の効果は、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）あるいは特異的な抗体を用いた免疫沈降等の標準免疫学的検出技術と組合せた同じ一般的な手法を用いて、タンパク質産生のレベルで測定することができる。さらに、有用なコレステロール調節あるいは抗ＣＶＤ治療調節因子は、増加したＨＤＬレベル、特に試験被験者の血漿中での増加したＨＤＬレベルと関連する活性の変化を誘導するものとして同定される。
【００８９】
候補調節因子（すなわち試験化合物）は、精製された（あるいは実質的に精製された）分子であるか、あるいは化合物の混合体（例えば、組合せライブラリー、あるいは細胞から得られた抽出物あるいは上清）の一つの構成要素であり得る。混合化合物分析において、遺伝子発現は、単一化合物あるいは最小化合物集合がＨＤＬレベルに有益な効果を持つ形で遺伝子あるいはタンパク質の活性あるいは発現を調節することが示されるまで、（例えば、標準精製技術、例えばＨＰＬＣあるいはＦＰＬＣ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．により産生された）候補化合物プールの徐々に少なくなる集団に対して試験される。
【００９０】
遺伝子９５の細胞中の遺伝子発現あるいは遺伝子転写レベルを調節するであろう特異的化合物は、アンチセンス核酸、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）および他の核酸組成物を含み、また前記遺伝子（前記遺伝子のエキソンあるいはイントロンを含む）と特異的にハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）配列特異的結合化合物あるいは遺伝子９５のＲＮＡ転写産物を含む。これらの特定的な化合物は本発明の化合物であり、前記の疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造は、本明細書の開示に基づいて、この分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる。
【００９１】
遺伝子９５ポリペプチドの活性を調節する特異的化合物は、前記ポリペプチドのエピトープに特定的に結合する抗体（ポリクローナルあるいはモノクローナル）を含む。これらの特異的化合物は本発明の化合物であり、前記疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造はこの分野における通常の知識を有する者によく知られている。
【００９２】
一つあるいはそれ以上の遺伝子９５のエピトープ、あるいは遺伝子９５の保存変異体のエピトープ、もしくは遺伝子９５のペプチド断片はまた、本発明により含まれる。前記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、ヒト化あるいはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれに限定されない。これらはここに開示された任意の疾患を治療するために用いることができる。
【００９３】
この分野における通常の知識を有する者に周知のように、完全にヒト化された抗体の使用は、これらが一般的に免疫原性が少なく、ヒトに投与された場合により長い半減期を持つため、一般的に好ましい。主要な利用可能な技術は、抗体についてのヒト遺伝子の全組を持つ形質転換マウスを用いるＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）により扱われたＵｌｔｉＭａｂヒト抗体開発システム（ｓｍ）、およびマウス抗体遺伝子発現は抑制され、ヒト抗体遺伝子発現と機能的に置換さら、マウス免疫システムの残りの部分はそのままであるマウスの遺伝子組換えされた系統を用いるＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）技術を含む。
【００９４】
これらのマウスは、ハイブリドーマ技術を用いて大規模生成物に変換される完全ヒト化ポリクローナル抗体を発生させるように誘導することができる。一つの実施例において、前記方法は、遺伝子９５タンパク質あるいはその断片の精製あるいは濃縮生成を伴う、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを持つ、形質転換非ヒト動物、例えば形質転換マウスに免疫性を与えることを含む。前記動物のＢ細胞（例えば脾臓Ｂ細胞）は続いて獲得され、遺伝子９５タンパク質に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成するために、ミエローマ細胞と融合される。
【００９５】
ヒト化抗体はまた、例えば抗体の免疫原性部位を、対応するが非免疫原性の部位と置換することにより産生できる（すなわちキメラ抗体）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，国際特許公報ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ヨーロッパ特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ヨーロッパ特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０；１０４１−１０４３（１９８８）；Ｌｉｕ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６（１９８７）；Ｓｕｎ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５（１９８７）；Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９（１９８５）；Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９（１９８８））。“ヒト化”キメラ抗体の一般的見解は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−１２０７（１９８５））およびＯｉ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４（１９８６）により提供される。または、適切な“ヒト化”抗体は、ＣＤＲあるいはＣＥＡ置換により産生することができる（Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）；Ｂｅｉｄｌｅｒ，Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０（１９８８））。
【００９６】
抗体の産生のために、種々の宿主細胞が、遺伝子９５、遺伝子９５ペプチド（例えばタンパク質の機能ドメインに対応する一つ）、不完全遺伝子９５ポリペプチド（一つあるいはそれ以上のドメインが削除された遺伝子９５）、遺伝子９５の機能的相当物あるいは遺伝子９５の突然変異体の注入により免疫性を与えることができる。前記宿主動物は、いくつか例を挙げると、ウサギ、マウス、ヤギおよびラットを含むがこれらに限定されない。種々の補助物質（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）は、宿主種に依存して免疫学的応答を増加させるために用いることができ、フロインド（完全および不完全）、アルミニウム水酸化物等のミネラルゲル、リゾレシチン等の表面活性物質、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリア・バルヴム等の潜在的に有用なヒト補助物質を含むがこれらに限定されない。ポリクローナル抗体は、免疫性を与えられた動物の血清から得られた抗体分子の異種集団である。
【００９７】
完全抗体および抗体断片の産生のために用いることができる種々の発現システムがある。これらは、細菌あるいは哺乳類細胞培養および形質転換動物あるいは植物を含む。一般に好まれる発現システムは、この分野における通常の知識を有する者に知られているように、対象とする用途および望まれる生産により決定される。例えば、動物細胞培養および遺伝子組換え発現システムは、抗体のグリコシル化が求められる場合に望ましく、一方、細菌発現システムは、非グリコシル化抗体、Ｆａｂ断片およびその他類似のものの産生により有用である。Ｃｈａｄ，ＨＥ ａｎｄ Ｃｈａｍｏｗ，ＳＭ．２００１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１８８−１９３参照。
【００９８】
遺伝子９５に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、ＨｕＭａｂ抗体は、任意の標準方法にしたがって精製されあるいは濃縮された遺伝子９５あるいはその断片の生成を用いて免疫性を与えることができる。ＨｕＭａｂマウスは、内因性ミューおよびカッパ鎖遺伝子座を不活性にする標的突然変異と共に、再配列されないヒト重鎖（ミューおよびガンマ）およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をエンコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ．３６８（６４７４）：８５６−８５９）。これらのマウスは、マウスＩｇＭあるいはカッパの発現の減少を示し、また免疫付与に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクロナルを生成するために、クラススイッチと体細胞変異を受ける。
【００９９】
好ましくは、マウスは最初の免疫付与のとき、６から１６週齢である。最初の免疫付与は、完全フロインドアジュバント中の抗原を用いて腹腔内（ＩＰ）に行われ、続いて一週間おきに、不完全フロインドアジュバント中の抗原を用いてＩＰ免疫付与（全６回まで）が行われる。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）出血により得られた血漿サンプルを用いた免疫付与プロトコルの経過全体で観察することができる。血漿は、例えばＥＬＩＳＡあるいはフローサイトメトリーにより選別でき、抗遺伝子９５ヒト免疫グロブリンの十分な力価を持つマウスは、融合のために用いることができる。マウスは、解剖および脾臓の摘出の３日前に、静脈内に抗原が高められる。各抗原について２から３の融合が、成功のためには必要である。
【０１００】
遺伝子９５に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成のために、マウス脾細胞は最初に単離され、ＰＥＧを用いて標準プロトコルに基づいたマウスミエローマ細胞系と融合される。その結果生じたハイブリドーマは、続いて抗原特異的抗体の産生について選別される。例えば、免疫付与マウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁は、５０％ＰＥＧで６分の１（ｏｎｅ−ｓｉｘｔｈ）のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ １５８０）と融合される。細胞は、平底マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）におおよそ２×１０５で播種され、続いて２０％ウシ胎仔血清、１８％“６５３”調整培地、５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）および１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは、融合後２４時間で添加される）を含む選択培地中で２週間培養される。２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと差し替えられた培地中で培養される。各ウェルはその後、ヒト抗遺伝子９５モノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてのＥＬＩＳＡにより選別される。大規模なハイブリドーマ増殖が起こると、培地は通常１０から１４日後観察される。抗体分泌ハイブリドーマは取り出され、再び選別され、ヒトＩｇＧに対して陽性であれば、抗遺伝子９５抗体は、限界希釈法により最低２倍の下位複製（ｓｕｂｃｌｏｎｅ；サブクローン）ができる。その後安定したサブクローンは、特性化のための組織培養培地中で少量の抗体を産生するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。
【０１０１】
ヒト抗遺伝子９５抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製用の２リッタースピナーフラスコ（ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌａｓｋ）中で増殖させることができる。上清はろ過され、タンパク質Ａ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ．）の前に濃縮される。溶出されたＩｇＧは、ゲル電気泳動と、純度を確実にするための高速液体クロマトグラフィーにより調べることができる。緩衝液はＰＢＳに変換でき、濃度は１．４３吸光係数を用いてＯＤ２８０により測定できる。モノクローナル抗体は等分され、本発明の方法にしたがって使用するまで、−８０℃で保存される。
【０１０２】
ＨＤＬレベルを増加させ、また／あるいはここに開示された疾患を治療するように働くことができる他の組成物は、遺伝子９５遺伝子を含み、遺伝子治療輸送手段中に組み合わされる核酸構成体である。前記輸送手段は、(裸のＤＮＡ輸送のための)単純水性緩衝液、ウイルス関連輸送手段あるいは非ウイルス（特に脂質関連）輸送手段であり得る。これらの特異的化合物は本発明の化合物であり、前記の疾患の治療に有用である。前記化合物の設計および製造は、本明細書に基づいてこの分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる。
【０１０３】
細胞発現あるいは活性のレベルの調節に効果的であると思われる作用薬、拮抗薬あるいはミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）は、動物モデル（例えば、霊長類、マウス、ブタ、イヌ、ウサギあるいはニワトリ）において有用であることが確認され得る。例えば、前記化合物はマウスあるいはニワトリ低アルファ蛋白血症の低ＨＤＬレベルを改善し得る。
【０１０４】
ＨＤＬ産生を促進する機能を持つ遺伝子あるいはポリペプチドの発現もしくは活性の増加を促進する化合物は、本発明において特に有用であると思われる。前記分子は、例えばＨＤＬのレベルあるいは活性を増加し、それにより動物（例えばヒト）の低ＨＤＬ状態を治療するための治療物質として用いることができる。
【０１０５】
本発明は、ＨＤＬ活性調節において役割を果たし、そのためＨＤＬレベルに関連する他の遺伝子の研究においてその突然変異が重要であり得る他のＨＤＬ関連遺伝子の同定を可能にする。したがって例えば、遺伝子９５タンパク質を安定させ、あるいはそうでなければＨＤＬレベルの増加に寄与するように働く突然変異は、価値がある。前記突然変異は、低ＨＤＬ−Ｃレベルの治療のために行われる任意のタンパク質治療あるいは遺伝子治療に組み込むことができる。同様に、野生型遺伝子９５ポリペプチドの安定性を高め、あるいはその異化代謝を低下させる化合物はまた、低ＨＤＬ−Ｃあるいは低ＨＤＬレベルの結果としての任意の他の状態の治療に有用であり得る。ここで同定された遺伝子９５の突然変異型はまた、この目的に有用である。さらなる突然変異および化合物はここに開示された方法を用いて同定することができる。
【０１０６】
一つの実施例において、突然変異を持つ遺伝子９５ポリペプチドを発現する細胞は、翻訳中に一時的代謝的に標識され、前記ポリペプチドの半減期は、標準技術を用いて測定される。ポリペプチドの半減期を増加させる突然変異は、タンパク質安定性を高めるものである。これらの突然変異は、続いてＨＤＬ関連生物学的活性について評価することができる。これらはまた、対応するｍＲＮＡあるいは他のタンパク質の安定性に作用するタンパク質の同定に用いることができる。続いて、前記ポリペプチドを結合させるために、これらの因子あるいはこれらの因子の安定性に作用する化合物の分析ができる。他の実施例において、野生型遺伝子９５ポリペプチドを発現する細胞は、翻訳中に一時的代謝的に標識され、候補化合物と接触させられ、前記ポリペプチドの半減期は、標準技術を用いて測定される。前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物は、本発明において有用な化合物である。
【０１０７】
他の実施例において、本発明の作用薬を用いた治療は、他のＨＤＬ増加あるいは抗ＣＶＤもしくは抗異常脂質血症治療、あるいはＨＤＬ管理を必要とする他の状態と組み合わせることができる。
【０１０８】
本発明の分析は、タンパク質に基づく分析を含む。遺伝子９５遺伝子（精製あるいは未精製）によりエンコードされたポリペプチドは、（ＨＤＬ活性に関連することが知られているタンパク質と特異的に相互作用すると思われるタンパク質を含むがこれに限定されない）他のタンパク質を結合させる能力を測定するための分析に用いることができる。いくつかの例は、ＡＢＣＡ１タンパク質およびアポリポタンパク質を含む。この結合に対する化合物の作用は続いて測定される。
【０１０９】
ここに開示された遺伝子によりエンコードされたポリペプチドについての結合分析の他の種類において、遺伝子９５ポリペプチド（あるいはそのポリペプチド断片、もしくはエピトープ標識型あるいはその断片）は、適切な資料源から（例えば、原核生物発現システム、真核細胞、無細胞システムから、あるいは発現細胞からの免疫沈降により）獲得される。続いてポリペプチドは、適切な支持体（例えば、ニトロセルロースあるいは抗体、もしくは例えば前記ポリペプチドのｈｉｓ標識（ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ）型の場合は金属アガロースカラム）に結合される。支持体への結合は、好ましくは前記ポリペプチドと関連するタンパク質が前記ポリペプチドとの関連を維持できる条件下で行われる。前記条件は、タンパク質−タンパク質相互作用の妨害を最小限にする緩衝液の使用を含み得る。結合ステップは、前記ポリペプチドと他の分子との間の相互作用を妨げる能力について試験された化合物の存在あるいは不在下で行うことができる。必要に応じて、他のタンパク質（例えば細胞溶解物）が添加され、前記ポリペプチドと十分に結び付けられる。続いて固定化したポリペプチドは、前記ポリペプチドあるいは支持体と非特異的に結合できるタンパク質あるいは他の細胞構成体を除去するために洗浄される。続いて固定化したポリペプチドは支持体から解離され、そして結合していたタンパク質は（例えば加熱により）解離され、あるいはまた、結合したタンパク質は、支持体からのポリペプチドの解離なしに、前記ポリペプチドから解離される。解離されたタンパク質および他の細胞構成要素は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ウェスタンブロッティングおよび特異的抗体を用いた検出、ホスホアミノ酸分析、プロテアーゼ消化、タンパク質配列決定あるいは等電点電気泳動により、分析することができる。前記ポリペプチドの正常および突然変異型は、特定の因子が前記ポリペプチドのどの部位に結合するかについてのさらなる情報を得るために、これらの分析に用いることができる。加えて、不完全に精製されたポリペプチドが用いられた場合、前記タンパク質の正常型と突然変異型との比較は、真の結合タンパク質の識別に役立てるために用いることができる。
【０１１０】
前記分析の特定の実施例において、前記分析は、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと相互作用することが知られている精製あるいは半精製タンパク質あるいは他の分子を用いて行われる。この分析は、以下のステップを含み得る。
【０１１１】
１．遺伝子９５ポリペプチドの獲得および前記ポリペプチドへの適切な蛍光標識の結合；
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）の第２の異なる蛍光標識での標識。お互いが密に近接している場合と物理的に離れている場合とで異なる消失パターンを形成する色素（すなわち、互いに近接する場合にはそれぞれ消え、密に近接していない場合には蛍光を発する）の使用；
３．相互作用分子の、前記二つの相互作用を妨げる能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下での、固定化したポリペプチドへの露出；および
４．蛍光読み出し情報の収集。
【０１１２】
別の分析は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析を含む。この分析は、以下のように実施できる。
【０１１３】
１．遺伝子９５タンパク質あるいはその適切なポリペプチド断片の用意、および適切なＦＲＥＴドナー（例えば、ニトロ−ベンゾオキサジアゾール（ｎｉｔｒｏ−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）（ＮＢＤ））の結合；
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）のＦＲＥＴアクセプター（例えばローダミン）での標識；
３．アクセプター−標識相互作用分子の、前記二つの相互作用を妨げる能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下での、ドナー−標識ポリペプチドへの露出；および
４．蛍光共鳴エネルギー移動の測定。
【０１１４】
消失およびＦＲＥＴ分析は関連付けられる。どちらか一つが、どちらの蛍光組が分析において用いられるかに依存して、任意のケースに用いることができる。
【０１１５】
遺伝子９５は、イオンに対する膜の透過性等の膜透過性を変換することにより働くことができる。前記活性は、リポゾームあるいは無傷細胞等の小胞の使用について分析することができる。ここで前記構造体は、本発明の遺伝子９５ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドは、前記小胞、好ましくは無傷細胞、哺乳類組換え細胞等に発現し、前記細胞の膜の透過性は、前記発現の存在あるいは不在下で測定される。同様に、続いて前記透過性は、遺伝子９５の活性を調節することが知られている化学物質の存在および不在下において分析することができる。したがって、前記膜輸送に作用することが知られているタンパク質の活性の増強におけるこれらの物質の有用性は、容易に測定することができる。同様に、脂質等の他の分子、特にＨＤＬの前記膜を横断する輸送に作用するこれらの物質の能力は、同じく容易に測定される。
【０１１６】
前記分析の実施において、遺伝子９５あるいは前記遺伝子に相当するポリヌクレオチドを発現する前記哺乳類組換え細胞等の試験細胞は、イオンを検出可能なレポーター分子（特定のイオンを結合した場合にその蛍光特性が変化する蛍光イオン指示因子等）を取り付けられ、あるいはまた外部媒体が前記分子に取り付けられる。小胞外にある場合と比べて小胞内にある場合に異なる特性を示す分子は用いられ得る。例えば、高濃度の場合に消失特性を持ち、低濃度の場合に消失特性を持たない分子は、適していると思われる。または、膜を横断するイオン（Ｃａ、Ｋ、Ｎａ、金属その他類似のもの）の輸送の効果は、その効果が培地あるいは細胞中に入れられた色素を消失させあるいは消失させないものであれば、測定することができる。このプロセスに作用する能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下で、帯電した分子の動き（あるいはその動かす能力あるいはその動きの反応速度）は測定することができる。
【０１１７】
また別の分析において、小胞内へ、あるいは小胞からの放射性同位体の吸収は、測定することができる。前記小胞は小胞外培地から分離され、小胞中および培地中の放射能活性は定量され比較される。既に示されたとおり、本発明はまた、ここに開示された一つあるいはそれ以上の遺伝子の転写因子を使用し得る分析に関する。試験されるポリヌクレオチドと結合因子の関係は、タンパク質結合ＤＮＡと非タンパク質結合ＤＮＡとを識別する任意のシステム（例えば、ゲル妨害分析（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ））を用いて判断することができる。前記ＤＮＡへの因子の結合における化合物の効果は、前記分析を用いて判断される。結合分析に加えて、遺伝子の調節領域がレポーター遺伝子に結合するｉｎ ｖｉｔｒｏ分析もまた実施することができる。好ましい実施例において、前記ポリヌクレオチドは、遺伝子９５に相当するものであり、最も好ましくはここで前記ポリヌクレオチドは配列番号３を持つ。
【０１１８】
本発明は、遺伝子９５遺伝子構成体を含む組換え細胞系を含む。対応するタンパク質を発現する組換え細胞系は、試験化合物への露出により調節することができるタンパク質の関連生物学的活性を同定するために試験される。化合物は、それらが同定された生物学的活性を調節するか否かについて評価するために体系的に選別され、有効に働くものは本発明にしたがった治療物質、あるいはその類似体である。
【０１１９】
組換え細胞系はまた、精製タンパク質分析が必要な場合、精製タンパク質の調整に好ましい。この分野における通常の知識を有するものは、組換え細胞系の産生および高精製タンパク質を含むタンパク質画分の抽出が可能である。これらのサンプルは、前記タンパク質と相互作用する化合物を同定するための種々の結合分析に用いることができる。相互作用する化合物は、本発明の治療物質あるいはその類似体である。
【０１２０】
本発明はまた、遺伝子９５の上流非翻訳領域およびプロモーター領域を含む。ポロモーター領域の分節は、図５に含まれる。このプロモーター領域のより広い部分は、本開示を用いて、この分野における通常の知識を有する者により同定することができる。５′ＵＴＲ（非翻訳領域）は配列番号３、６、８および図５に開示される。前記ゲノム領域あるいは非翻訳領域は、同定された遺伝子の発現を調節する化合物を同定するための分析において用いられるプラスミドに含まれ得る。前記分析の一つにおいて、上流ゲノム領域はレポーター遺伝子に結合し、発現プラスミド中に組込まれる。プラスミドは細胞中に入れられ（トランスフェクト）、組換え細胞は試験化合物に露出される。レポーター遺伝子の発現を増加あるいは減少させるこれらの化合物は、その結果、遺伝子／タンパク質の調節因子であり、そして本発明の治療物質であると考えられる。
【０１２１】
ここに開示された遺伝子はまた、コレステロール流出の調節に関連し得る。前記活性についての輸送に基づく分析は、ｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。例えば前記分析は、コレステロールあるいはリン脂質流出等の、培養液中で容易に再形成される逆コレステロール輸送プロセスの任意の一部に基づき得る。または、前記分析は標識基質（コレステロール等）を用いて判断されるように、生物全体における純量コレステロール輸送に基づき得る。
【０１２２】
ハイスループットスクリーニングに関し、蛍光脂質は脂質流出の測定のために用いることができる。リン脂質について、蛍光前駆体Ｃ６−ＮＢＤ−ホスファチジン酸は用いることができる。この脂質は細胞に取り込まれ、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼにより脱リン酸化される。その産物であるＮＢＤ−ジグリセリドはその結果グリセロリン脂質様ホスファチジルコリンの合成の前駆体である。ＮＢＤ−ホスファチジルコリンの流出は、細胞培養液中の適切なアクセプターへのＮＢＤの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を検出することにより観察することができる。適切なアクセプターは、ローダミン標識ホスファチジルエタノールアミン、細胞に容易に取り込まれないリン脂質を含む。単鎖前駆体の使用は、培養液中でのリン脂質輸送タンパク質の必要性を取り除く。コレステロールに関し、ＮＢＤ−コレステロールエステルはＬＤＬに再構築することができる。前記ＬＤＬはこの脂質を、ＬＤＬ受容体経路を介して細胞に効率よく輸送できる。ＮＢＤ−コレステロールエステルはリソソーム中で加水分解され、その結果、もとの原形質膜へ輸送でき、細胞から流出するＮＢＤ−コレステロールを生じる。前記流出は前記ＦＲＥＴ分析により観察することができ、その中でＮＢＤはその蛍光共鳴エネルギーをローダミン−ホスファチジルエタノールアミンアクセプターへ輸送する。
【０１２３】
動物モデルはまた、本発明の分析に有用である。任意の上記分析において活性を持つと判断された化合物は続いて、ブタ、ウサギまたはニワトリにおおよそ有効量投与された化合物によりＨＤＬレベルが増加するかどうかを調べるために、前記動物を含むがこれらに限定されない使用可能な動物モデルシステム中で選別される。試験化合物は、標準方法にしたがってこれらの動物に投与される。試験化合物はまた、コレステロール輸送を妨げる突然変異を持つマウス中で試験され得る。加えて化合物は、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドとＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＩあるいはＡｐｏＥ等のＨＤＬ粒子構成要素との間の相互作用を増強する能力について選別され得る。
【０１２４】
前記コレステロール流出分析は、コレステロールを細胞外アクセプター分子へ輸送する細胞の能力を測定し、通常ＡＢＣＡ１等の輸送分子の存在に依存する。したがって、ここに開示された遺伝子は、ＡＢＣＡ１の活性の調節に関与し得る。例えばここで、ここに開示されたポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドは、ＡＢＣＡ１の活性あるいは他のＨＤＬ関連タンパク質に結合し、調節する。この方法において、細胞は任意の複数の生化学的プロセスにより放射性標識コレステロールを持っている（Ｍａｒｃｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９：１５９−１６９，１９９９）。続いてコレステロール流出は、ＨＤＬ３あるいは精製ＡｐｏＡＩの存在下で、種々の時間（通常０から２４時間）培養した後、測定される。コレステロール流出は、種々の時間の培養後の培養液中の全コレステロールの割合として測定される。この分析においてコレステロール流出を調節する化合物は、遺伝子９５タンパク質標的に作用し得る。好ましくは、細胞は遺伝子９５構成体を含む組換え細胞系である。
【０１２５】
本発明はまた、（例えば相同組み換えにより）不活化した遺伝子９５の一つあるいは両方の対立遺伝子を持った、マウス等の遺伝子組換え動物、あるいは逆に遺伝子９５の一つあるいはそれ以上のさらなる複製、もしくは遺伝子９５のさらなる突然変異複製を持つマウスを含む。遺伝子組換えマウスを含む前記マウスは、ＨＤＬ−Ｃレベルを上昇させる化合物を選別するための有用な動物モデルに相当する。前記マウスはまた、生物系での遺伝子９５の役割を判断するための実験的目的に有用である。前記動物は、標準技術を用いて作成することができる。試験化合物の最初の選別に加えて、前記遺伝子の異なる型を持つ動物は、ここに開示された他のスクリーニング法の一つを用いて最初に同定された薬剤あるいは物質の有効性と安全性のさらなる試験に有用である。前記動物から採取され、培養液中に置かれた細胞はまた、試験化合物に露出することができる。ＨＤＬ−Ｃレベルは、ここに開示されたもの等の標準技術を用いて測定することができる。
【０１２６】
本発明の一つあるいはそれ以上の分析を用いてＨＤＬ活性の増加に有用であると最初に同定された化合物は、単一剤形における薬学的許容希釈剤、担体あるいは賦形剤と共に投与され得る。従来の薬務は、前記組成物を患者に投与するための適切な剤形あるいは配合を提供するために用いられ得る。経口投与が好ましいが、任意の適切な投与経路、例えば非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルあるいは経口投与を用いることができる。治療剤形は溶液あるいは懸濁液の形状であり得る。経口投与用には、剤形は錠剤あるいはカプセルの形状であり得る。また鼻腔内投与用には、剤形は粉末、点鼻薬あるいはエアロゾルの形状であり得る。
【０１２７】
通常、成功した遺伝子９５調節治療物質は、以下の基準のいくつかあるいは全てを備える。経口可用性は、２０％かあるいはそれ以上であるべきである（したがって最低２０％が血流中に吸収される）。動物モデル有効性は、約２ｍｇ／ｋｇ未満で、標的ヒト投薬は５０および２５０ｍｇ／７０ｋｇの間であるべきであるが、この範囲外の投薬も受容可能である。治療指数（あるいは薬用量に対する中毒量の比）は１００より大きい。有効性（ＩＣ５０値により示される）は約１０μＭ未満、好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である。前記物質は可逆性結合（すなわち競合的阻害）を示し、関連しない標的あるいは不要な副作用を引き起こす関連標的に適度に選択的である。必須の投薬量は、わずか一日に一回あるいは二回、もしくは食事時である。
【０１２８】
剤形を作成するためのこの分野においてよく知られた方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ．，１９９５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見られる。非経口投与のための剤形は例えば、賦形剤、滅菌水あるいは生理食塩水、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物油もしくは水素化ナフタレンを含む。生体適合性、生体分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）コポリマー、あるいはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン コポリマーは、前記化合物の放出を制御するために用いることができる。本発明の作用薬のための他の潜在的に有用な非経口輸送システムは、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、およびリポソームを含む。吸入用の剤形は、賦形剤、例えばラクトースを含み得る。あるいは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であり得る。もしくは点鼻薬の形状であるいはゲルとして投与するための油性溶液であり得る。
【０１２９】
通常、異常なコレステロールレベルおよび／またはＣＶＤあるいは異常脂質血症の治療のための新規薬剤は、自然物あるいは合成（もしくは半合成）抽出物両方の大ライブラリーから、あるいはこの分野において知られる方法にしたがった、組み合わせ化学ライブラリーを含む化学ライブラリーから同定される。この分野あるいは薬剤の発見および開発の分野における通常の知識を有する者は、試験抽出物あるいは化合物の的確な源が本発明のスクリーニング法に不可欠ではないことを理解するだろう。したがって、事実上あらゆる化学抽出物あるいは化合物を、ここに開示された典型的な方法を用いて選別することができる。前記抽出物あるいは化合物の例は、植物由来、真菌由来、原核生物由来あるいは動物由来の抽出物、発酵培養液および合成化合物、加えて既存の化合物の調整が含まれるがこれらに限定されない。多くの方法はまた、糖類由来、脂質由来、ペプチド由来、おおび核酸由来化合物を含むがこれらに限定されないあらゆる化合物のランダム合成あるいは直接合成（例えば、半合成あるいは完全合成）を起こすために利用できる。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）およびＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形状の自然化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ Ｂｒａｎｃｈ Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，ＦＬ）およびＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む、多くの提供源から市販されている。加えて、自然産生および合成的産生ライブラリーは、必要に応じて、この分野において知られた方法にしたがって、例えば標準抽出および分画法により作成される。さらい必要に応じて、任意のライブラリーあるいは化合物は、標準化学、物理あるいは生化学法を用いて容易に調整される。
【０１３０】
加えて、薬剤の発見および開発の分野における通常の知識を有する者は、脱複製（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、および化学的脱複製あるいはそれらの任意の組合せ）あるいは、そのＨＤＬ上昇、抗ＣＶＤおよび／または抗異常脂質血症活性について既知の物質の複製あるいは反復の除去についての方法が、可能ならいつでも用いられることを容易に理解する。
【０１３１】
粗抽出物がコレステロール調節活性あるいは抗ＣＶＤ活性もしくはその両方を持つと思われる場合には、観察される効果の原因である化学構成成分を単離するために、陽性優位抽出物のさらなる分画が必要である。したがって、抽出、分画および精製プロセスの目的は、コレステロール調節活性あるいは抗ＣＶＤ活性を持つ粗抽出物中の化学構成要素の入念な特徴づけおよび同定である。化合物の混同における活性の検出のためのここに開示された同じｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、活性成分を精製するために、またその誘導体を試験するために用いることができる。前記異種抽出物の分画および精製方法は、この分野において知られている。必要であれば、病原性の治療に有用な物質であることが示された化合物は、この分野において知られた方法にしたがって化学的に調整される。治療上価値があると判断された化合物は続いて、この分野において知られた標準動物モデルを用いて分析される。
【０１３２】
本発明はさらに、治療物質としての遺伝子９５タンパク質あるいはタンパク質断片の使用を含み、また遺伝子９５の生物学的活性を保持する遺伝子９５の調整型を含む。これらの治療物質は、これを必要とする患者に投与することができ、前記患者は、投与すると局所的、局部的あるいは体全体で遺伝子９５生物学的活性が増加し、それにより恩恵を受ける患者である。前記患者は、低ＨＤＬ、異常脂質血症、心疾患および他の疾患を被る患者を含むがこれらに限定されない。
【０１３３】
機能的遺伝子９５タンパク質およびその溶解性誘導体、例えば遺伝子９５の機能的ドメインに対応するペプチドあるいは遺伝子９５タンパク質の調整型は、この分野において知られた標準方法により産生することができる。患者への投与は、静脈内、経口、腹腔内あるいはこの分野において知られた他の方法により行うことができる。
【０１３４】
遺伝子９５を用いた診断および薬理ゲノミクス
相対的および絶対的遺伝子発現、および生物学的活性、また突然変異分析は、それぞれ低ＨＤＬの診断手段として用いることができる。したがって、遺伝子配列の遺伝的サブタイピングの決定は、低ＨＤＬ表現型が、本発明にしたがって用いられたファミリーと同様に、特定のタンパク質機能に関連するか否かを判断するために低ＨＤＬ個体あるいはファミリーをサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）する場合に用いることができる。この診断プロセスは、ＨＤＬ増加薬の投与による副作用の予測を含む、患者の遺伝子型にしたがった薬剤治療の仕立て（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）（ここでは薬理ゲノミクスと称される）をもたらすことができる。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療あるいは予防処置のための物質（例えば薬剤）の選別を可能にする（例えば、個体の遺伝子型は、特定の物質に反応する個体の能力を判断するために検査される）。
【０１３５】
本発明はさらに、疾患の存在、特にその初期段階における存在を診断する、あるいは前記疾患の発症の危険性を診断するプロセスに関する。したがって別の態様において、本発明は、疾患に苦しんでいると思われる患者の疾患の存在を診断するためのプロセスに関し、前記プロセスは、前記患者のゲノム中の遺伝子９５遺伝子における突然変異を検出することを含む。好ましい実施例において、本発明は前記診断プロセスに関し、ここで前記突然変異は配列番号６および／または配列番号８および／または表１に示された核酸配列中の突然変異である。
【０１３６】
前記プロセスの特定の実施例において、突然変異は、前記患者から得られたＤＮＡのサンプル中で検出される。前記サンプルは、血液サンプル、生検（バイオプシー）あるいはその他の方法等の前記サンプルを獲得するために通常用いられる方法で獲得することができる。さらに本発明のプロセスにしたがって、前記検出はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができ、例えばここで、ｉｎ ｓｉｔｕ法は、患者の突然変異遺伝子９５遺伝子あるいは核酸配列の存在を検出するために用いられる。検出することができる疾患は、低ＨＤＬ、異常脂質血症、心疾患および既に開示され、含まれている他の疾患に限定されない。
【０１３７】
前記にしたがって、本発明は遺伝子９５関連疾患に苦しんでいると疑われる患者における遺伝子９５関連疾患の存在を診断するためのプロセスに関し、前記プロセスは、前記患者のゲノムあるいはｍＲＮＡ中の遺伝子９５遺伝子における突然変異の検出を含む。
【０１３８】
好ましい実施例において本発明は前記プロセスに関し、ここで前記突然変異は患者から採取されたＤＮＡのサンプル中で検出され、もっとも好ましくはここで、前記突然変異は配列番号６あるいは配列番号８あるいは表１の突然変異である。
【０１３９】
多くの様々な技術が、前記突然変異の存在あるいは不在を検出することで知られている。好ましい実施例において前記検出は、配列番号１の配列の突然変異部位に相補的な最低１５の隣接するヌクレオチドを含む核酸プローブの能力を測定することにより行われる。もっとも好ましくはここで、前記プローブは最低３０の隣接するヌクレオチドを含み、特にここで前記プローブは最低５０の隣接するヌクレオチドを含む。
【０１４０】
ここに開示されたプロセスはまた、患者の前記疾患の一つあるいはそれ以上を発症する危険性の判断に有用である。したがって本発明はまた、患者の疾患の発症の危険性を判断するためのプロセスに関し、ここで前記患者はそれらの危険性があると疑われるものであり、前記患者のゲノムあるいはｍＲＮＡ中の遺伝子９５遺伝子における突然変異の検出を含む。前記検出は、前記に沿って、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｉｎ ｖｉｖｏ法により行われ得る。好ましい実施例において、前記疾患は低ＨＤＬ、異常脂質血症および／または心疾患である。好ましい実施例において、前記突然変異は配列番号１に相当する遺伝子における突然変異である。
【０１４１】
組織あるいは身体サンプル中の遺伝子９５タンパク質の検出、特に突然変異遺伝子９５タンパク質、あるいは突然変異あるいは正常遺伝子９５タンパク質のレベルの検出を用いて疾患を診断することもまた同様に、本発明の実施例である。前記検出は種々の方法により得ることができるが、通常、標準ＥＬＩＳＡ分析における抗遺伝子９５抗体の使用を含む。本開示に基づいて、この分野における通常の知識を有する者は、種々の疾患の診断のために、患者サンプル中の突然変異あるいは正常遺伝子９５を検出するための診断手段を開発することができる。
【０１４２】
遺伝子９５遺伝子あるいは遺伝子産物に対する促進作用あるいは抑制作用を持つ物質あるいは調節因子は、低ＨＤＬ活性あるいはレベルと関連する疾患の治療のために個体に投与することができる。前記治療とともに、個体の薬理ゲノミクス（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物あるいは薬剤に対する個体の反応との間の関連の研究）が考慮され得る。治療の有効性における差異は、投薬と薬理的活性薬剤の血中濃度との関係の変更により、毒性あるいは治療上の不具合に役立つようにすることができる。したがって個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型を考慮したうえでの予防あるいは治療処置に有効な物質（例えば薬剤）の選択を可能にする。前記薬理ゲノミクスはさらに、適切な投薬量と治療計画を決定するために用いることができる。したがって、ここに開示された遺伝子についての個体の遺伝子相補体は、前記個体の治療あるいは予防処置のための適切な物質を選別するために決定することができる。
【０１４３】
薬理ゲノミクスは、変化した薬剤の性質と病気のヒトにおける異常な作用を引き起こす、薬剤に対する応答における臨床上の重要な遺伝的変異に取り組む（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３−９８５，１９９６；Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４−２６６，１９９７）。通常、二つの型の薬理ゲノミクスの状態に区別することができる。遺伝的条件は、薬剤の身体への働き方を変える（変化した薬剤作用）単一因子として伝達され、あるいは遺伝的条件は、身体の薬剤への働き方を変える（変化した薬剤代謝）単一因子として伝達された。変化した薬剤作用は、遺伝子９５のプロモーター、イントロンあるいはエキソン配列中に多型（例えば、一塩基変異多型あるいはＳＮＰ）を持つ患者に起こり得る。したがって、多型の存在および普及率の測定により、特定の治療物質に対する患者の反応の予測が可能となる。特に、プロモーター領域中の多型は、ＨＤＬ欠乏症およびＣＶＤの危険性の判断に重要であり得る。突然変異に加えて、遺伝子９５の多型は同様に、ここに開示された分析を用いて同定された物質の同定および使用に関連し得る。
【０１４４】
加えて、種々の物質が、特徴となる遺伝子組の遺伝子に作用する種々の能力を持ち得る。例えば、潜在的な治療物質、例えば物質Ａが低ＨＤＬレベルに関連する遺伝子あるいは遺伝子群の発現の減少の原因となる場合、そのような場合にはより低量のｍＲＮＡが前記遺伝子から発現し、あるいはより少ないタンパク質が前記ｍＲＮＡから産生されるが、第二の潜在的な物質、例えば物質Ｂが前記遺伝子と同一あるいは関連する遺伝子の活性を調節しながら前記発現を半分にまで減少させる場合、そのような場合には物質Ａと比べて半分のｍＲＮＡのみが転写され、あるいは半分のタンパク質のみが前記ｍＲＮＡから翻訳される。したがって、物質Ｂは、物質Ａの２倍の治療潜在性を持つと考えられる。
【０１４５】
本発明はまた、試験データの生成を含む産物の産生のための方法を含むプロセスに関し、前記プロセスは、前記物質（すなわちここに開示された分析法にしたがって同定された治療物質）を同定するための開示されたプロセスの一つにしたがって物質を同定することを含み、ここで前記産物は前記同定プロセスあるいは分析の結果としての前記物質に関して集められたデータであり、またここで前記データは、前記物質の化学的特徴および／または構造および／または性質を伝達するのに十分なものである。例えば、本発明は特に、本発明の分析の使用者が希望のポリペプチド、例えば酵素、調節活性あるいは遺伝子発現調節活性を持つ化合物を選別するために前記分析を用い、そして化合物を同定し、続いてその情報（すなわち構造、投薬量その他についての情報）を、本発明にしたがって治療あるいは研究目的で前記物質を再生産し、それを投与するために前記情報を利用する他の使用者に伝達するといった状況を意図する。例えば、前記分析の使用者（使用者１）は、多数の試験化合物を前記化合物の構造あるいは同一性を知らずに選別し（例えばここで多数のコード番号が用いられ、最初の使用者は前記コード番号が付されたサンプルが与えられるだけである）、本発明の一つあるいはそれ以上の分析プロセスを用いてスクリーニングプロセスを実施した後、続いて口頭あるいは文書で、もしくは同等の方法で、特定の調節活性を持つ化合物を同定するのに十分な情報（例えば対応する結果を伴ったコード番号）を次の使用者（使用者２）に伝える。この使用者１から使用者２への情報の伝達は、本発明により特に意図される。
【０１４６】
前記にしたがって、本発明は試験化合物の調節活性に関する試験データを生成するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）試験化合物を、遺伝子９５ポリヌクレオチドあるいは遺伝子９５ポリペプチドもしくは遺伝子９５プロモーターに作動可能に結合するレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチド構成体と、前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子が転写され、あるいは前記ポリペプチドが活性化する条件下で接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性、あるいは前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化を測定し、
（ｃ）測定されたポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化あるいは測定されたポリペプチドの活性の変化に基づく前記試験化合物の調節活性に関する試験データを生成することを含み、ここで前記変化は調節活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１４７】
（実施例１）
ヒトにおいて低ＨＤＬを引き起こす遺伝子９５中の突然変異
方法
患者確認とサンプル収集
Ｄｕｔｃｈ ｏｒｉｇｉｎの親族ＢＣ１１Ｍは、ブリティッシュ コロンビア大学の遺伝医学学科とブリティッシュ コロンビア、バンクーバーのセントポール病院との共同制作の一環として特定された。この親族は、他の脂質および臨床的異常（例えば肥満や糖尿病）のない状態で、低アルファ蛋白血症表現型（＜５分の１百分率）に基づいて確認された。冠動脈疾患の病歴は、この親族において確認の段階で明らかであった。さらなるＤｕｔｃｈ親族ＮＬ−００３、ＮＬ−１２０は、異常コレステロールレベルに基づいて、アムステルダムのアカデミッククリニカルセンターで、脂質医療への患者紹介プログラムの一環として確認された。ｎｏｒｍｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃな個体（ＨＤＬが２０分の１百分率より高く、８０分の１百分率より低い）のコントロール集団が、突然変異の原因となる性質を確認するために用いられた。
【０１４８】
標識および遺伝子型特定
遺伝子標識に関する情報は、Ｇｅｎｏｍｅ ＤａｔａｂａｓｅおよびＧｅｎＢａｎｋから得られた。ゲノム走査と精度の高い解読（ｆｉｎｅ ｍａｐｐｉｎｇ）に用いた全ての標識は、事前にＭａｒｓｈｆｉｅｌｄマップで局所化された。“Ｘ”は内用の標識名の多くに付加された。ゲノムＤＮＡは、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアを作動させるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ３１００ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、遺伝子型特定された。対立遺伝子のメンデル遺伝は、ＰｅｄＣｈｅｃｋプログラムを用いて検証された。
【０１４９】
連鎖解析
二点連鎖解析はＦＡＳＴＬＩＮＫソフトウェアパッケージのＭＬＩＮＫプログラムｖ４．１ｐを用いて行われ、多点連鎖解析はＶＩＴＥＳＳＥ ｖ１．０を用いて行われた。常染色体優性遺伝モデルが用いられ、集団中の全低ＨＤＬ（＜５分の１百分率）の１０％が遺伝子の突然変異に起因すると想定された。疾患対立遺伝子頻度は、非保因者において、９８％浸透率と４．５％の表現型複写割合で０．２５％であると思われる。標識対立遺伝子頻度は、アメリカとヨーロッパの膨大なサンプルから推定された。ハプロタイプは手動で再構築され、ＳＩＭＷＡＬＫ ｖ２．８を用いて交差確認された。
【０１５０】
結果
ＢＣ１１Ｍファミリーの連鎖解析
ＢＣ１１Ｍファミリーの２４個体は、優性遺伝子種の単離された低アルファ蛋白血症を隔離した１２の多重化系統の４００マーカーゲノムスキャンに組込まれる。能力分析は、ＢＣ１１Ｍ親族が常染色体優性モデルでの近接に基づく連鎖（ＭａｘＥ（Ｚｍａｘ ５ｃＭ）＝４．７６２）を用いたＨＤＬ遺伝子座の同定に適切であったことを示した。ゲノムスキャンデータの二点連鎖解析は、染色体９に示唆的なＬＯＤスコアを与えた（Ｄ９Ｓ１６７７ ＬＯＤ＝２．２８５）。このＬＯＤスコアについては、広範な系統に対して多点連鎖分析、浸透遺伝子型特定およびさらなる標識を用いたハプロタイプ特定が引き続き行われた。染色体９上の領域は、多点連鎖分析により裏付けられ、多点ＬＯＤは、２０．９１ｃＭの間隔のみの影響を示す８．０に達した（間隔１；Ｄ９Ｓ１７８０から９ｑ２２ｘｃａ１７）（表２）。この間隔はさらに、影響を受けない個体の染色体切断点に基づいて、サブ領域に分けられるであろう（間隔２；９ｑ２２ｘｃａ７から９ｑ２２ｘ−ｃａ１７）（間隔３；Ｄ９Ｓ１８１２からＤ９Ｓ１８０３ｘ）（表２）。間隔２は、最も広範囲の突然変異検出の焦点であった。
【０１５１】
【０１５２】
（実施例２）
オリジーン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）ｃＤＮＡパネルを用いた遺伝子９５の組織区分
マルチウェルＰＣＲプレートに配置された２４連続希釈（直線的な増幅を確実にするための４ログ範囲）ｃＤＮＡ複製は、オリジーン（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得られた。ＰＣＲは、遺伝子９５（ここで時々“Ｇ９５”）の遺伝子特異的プライマーを用いて行われた。反応物は１０μｌ中で、１．０μｌの１０×緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５ｐモルのフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマーとリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー、および０．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）が含まれる。
【０１５３】
【０１５４】
増幅した断片はエキソン４と６の間にあり、２３０ｂｐのサイズを持つ。
【０１５５】
ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ ｃｙｃｌｅｒｓ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）がＰＣＲ増幅のために用いられた。ＰＣＲの条件は、９４℃で３分間の変性ステップ、続いて９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そして７２℃で１分間の３５サイクルであった。７２℃で７分間の最終伸長ステップが行われ、サンプルは１０℃で保存された。ＰＣＲ産物は、１×ＴＢＥ中の２％アガロースゲル上で電気泳動により分析された。１００ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）がサイズ基準として用いられた。
【０１５６】
【０１５７】
Ｇ９５ｃＤＮＡの相対量は表ＸＸに示される。Ｈ＝高、Ｍ＝中間、Ｌ＝低。
【０１５８】
（実施例３）
ノーザンブロットによる組織発現
遺伝子９５転写産物の定量および定寸は、ヒト１２−レーン多組織ノーザンブロット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の使用により分析された。ヒトブロットは、遺伝子９５のエキソン６から９に対する４０１ｂｐプローブでハイブリダイズされた。予想どおり、４．４ｋｂのバンドが同定された。アクチンは、コントロールとして用いられた。
【０１５９】
【０１６０】
結果（図９）は、遺伝子９５が筋肉および心臓中に最高レベルで遍在的に発現することを示す。これらの結果は、マウス組織のノーザンブロット分析により確認された（データは図示せず）。前記実施の一つにおいて、線維芽細胞を用いて、コレステロール治療のおおよそ２４時間前に、２×１０５個の細胞が次の日に５０から７０％の密集度を得るために６ウェルフォーマットの各ウェルに播種された。細胞は最終濃度３０μｇ／ｍｌのコレステロールで２４時間処理され、続いて全ＲＮＡ調整が行われた。コントロールは、影響のない細胞系から得られた遺伝子９５発現であった。
【０１６１】
（実施例４）
患者線維芽細胞中の遺伝子９５発現
遺伝子９５のエキソン１０におけるＳｅｒからＡｌａへの突然変異が、４つの患者線維芽細胞（４００、５５８、５４９および５７５）中に存在した。我々はこれらの線維芽細胞における遺伝子９５の発現を正常コントロール（２２６、４７５および４８５）と比較することにした。この分析は、脂質代謝と遺伝子９５との関係を調査するために、外因性コレステロールの不在下あるいは存在下で行われた。定量リアルタイムＰＣＲ（あるいは“ＴａｑＭａｎ”）分析は、以下のように行われた。ヒト遺伝子９５プライマーとそのプローブは、プライマーエキスプレスソフトウェア（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて設計された。
【０１６２】
【０１６３】
ＲＴ−ＰＣＲは、１×ＴａｑｍａｎワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ）中に１２０ｎｇのヒト遺伝子９５の全ＲＮＡあるいは５０ｎｇのヒトａｐｏＡ１のＲＮＡ、２００μＭのプライマー、および６００μＭのプローブを含む２５ｕｌの最終量で、ＡＢＩ７９００配列検出システムで実施された。ＧＡＰＤＨあるいは１８ｓ（ヒト）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は内部コントロールとして用いられた。データの定量化と分析は、製造者のプロトコルにしたがって行われた。簡単にいうと、キャリブレータおよびサンプルのΔＣＴは、関連する遺伝子のＦＡＭ ＣＴ値から１８ｓＲＮＡあるいはＧＡＰＤＨのＶＩＣ ＣＴ値を差し引くことにより得られた。ΔΔＣＴは、ΔＣＴ（サンプル）から平均ΔＣＴ（キャリブレータ）値を差し引くことにより算出された。キャリブレータに対するｍＲＮＡ量は１×サンプルとして現され、他の全ての量はキャリブレータに関連した多数の割合変化として表される。各サンプルは３組で分析され、標準誤差（ＳＥ）が算出された。ＲＮＡのないＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＮＡがあるが逆転写酵素のない反応が、ネガティブコントロールとして用いられた。ＰＣＲ産物のサイズは、アガロースゲルにより確認した。
【０１６４】
全般的にみると、遺伝子９５の極端に低いレベルの発現が、コントロールを含む全ての線維芽細胞に見られた。ＴａｑＭａｎの結果が、二つの患者細胞系（４００と５７５）における遺伝子９５の発現がコレステロール治療を伴うあるいは伴わないコントロールと比較しておおよそ５０％下向き調節されたことを示した。患者５５８における遺伝子９５の発現は、コントロールと大きくは異ならなかった。しかし、５４９における遺伝子９５の発現は、コントロールよりも増加した（データは図示せず）。
【０１６５】
突然変異保因者における遺伝子９５発現の減少傾向が指摘された。メッセンジャーＲＮＡ発現レベルは、細胞培養条件、細胞密度および継代数に左右されやすいであろう。作用メカニズムについての任意の理論に結びつけられることを望まなくとも、この突然変異保因者における遺伝子９５ｍＲＮＡのレベルの減少傾向は、これらの患者における低ＨＤＬ状態の根本的なメカニズムであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】ＢＣ−１１Ｍファミリーの系統図
【図２】ＮＬ−００３ファミリーの系統図
【図３】ＮＬ−１２０ファミリーの系統図
【図４】遺伝子９５ｃＤＮＡの予想される１０エキソン構成、およびＥ６ａあるいはＥ９ａを持つ他の可能性のある転写産物を含む、遺伝子９５の既知の断片から組み立てられた不完全構成を示す図。
【図５Ａ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｂ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｃ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｄ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｅ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｆ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図５Ｇ】遺伝子９５のエキソンとイントロンおよびアミノ酸翻訳を示す図
【図６】ヒト（配列番号４）およびマウス（配列番号５）の遺伝子９５のアミノ酸配列の位置合わせ（アラインメント）を示す図
【図７】ヒト遺伝子９５の突然変異１（配列番号７）および突然変異２（配列番号１６）のアミノ酸配列の、野生型アミノ酸配列（配列番号４）との位置合わせ（アラインメント）を示す図
【図８】本発明にしたがって同定された突然変異および多型の位置とともに遺伝子９５の予想されるエキソン結合を示す図
【図９】実施例３の結果を示す遺伝子９５プローブを用いたノーザンブロットを示す図
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５プロモーターと作動可能に結合するレポーター遺伝子を含む遺伝子構造体と、前記レポーター遺伝子の転写を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の転写の変化を測定することを含み、
ここで前記転写の変化は、試験化合物が遺伝子９５活性を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、ステップｂ）の測定された転写の変化が、転写の減少であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、ステップｂ）の測定された転写の変化が、転写の増加であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、転写が前記レポーター遺伝子によってエンコードされた発現産物の量を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記発現産物がＲＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記発現産物がポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子がリポソーム中にあることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子が無傷細胞中にあることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記無傷細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記プロモーターが哺乳類遺伝子９５プロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記遺伝子９５プロモーターがヒトプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、前記ヒトプロモーターが配列番号１５のプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法において、前記遺伝子９５プロモーターがマウスプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記マウスプロモーターが配列番号１４のプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子が遺伝子９５でないことを特徴とする方法。
【請求項１６】
遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化が、試験化合物を遺伝子９５活性を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、ステップｂ）の測定された活性の変化が、活性の減少であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法において、ステップｂ）の測定された活性の変化が、活性の増加であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の方法において、前記活性が酵素の活性を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６記載の方法において、前記ポリペプチドが脂質二重層中に存在することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記脂質二重層がリポソームの一部であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１６記載の方法において、前記ポリペプチドが無傷細胞の一部であることを特徴する方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記無傷細胞が前記ポリペプチドを含むように処理された細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、前記無傷細胞が前記ポリペプチドを発現するように遺伝子組換えが行われた組換え細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記細胞が前記組換え処理がないときは前記ポリペプチドを発現しないことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２２記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
ＨＤＬ増強物質を同定するための方法であって、前記方法が、動物に、請求項１、１３、２４あるいは４９のいずれか一項に記載の分析を用いて調節活性を持つと分かった物質の有効量を投与し、前記投与の結果としての前記動物中の血漿ＨＤＬ活性の増加を検出し、それによりＨＤＬ活性の増強に有用な物質を同定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法において、前記動物が前記物質の投与前に低ＨＤＬ活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７記載の方法において、前記ＨＤＬ増強活性が前記動物におけるＨＤＬレベルの増加であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記ＨＤＬレベルの増加が血漿ＨＤＬレベルの増加であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９記載の方法において、前記動物がヒト患者であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
低ＨＤＬ関連疾患に苦しむ動物における前記疾患を治療するための方法であって、前記方法が、前記動物に、請求項２７記載の分析方法を用いてＨＤＬ増強活性を持つと分かった物質の有効量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において、前記動物がヒト患者であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法において、前記疾患が低ＨＤＬ疾患、血管障害および異常脂質血症より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
試験化合物の調節活性に関する試験データを生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、遺伝子９５ポリヌクレオチドあるいは遺伝子９５ポリペプチド、もしくは遺伝子９５プロモーターに作動可能に結合するレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチド構成体と、前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子が転写され、あるいは前記ポリペプチドが活性化する条件下で接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性、あるいは前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化を測定し、
（ｃ）測定されたポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化あるいは測定されたポリペプチドの活性の変化に基づく前記試験化合物の調節活性に関する試験データを生成することを含み、
ここで前記変化が調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項３６】
心疾患の治療あるいは予防のための方法であって、前記方法が、心疾患の治療あるいは予防を必要とする患者に遺伝子９５タンパク質生物学的活性あるいは発現を調節する化合物の治療線量あるいは予防線量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
治療物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）化学物質を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの発現を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化が、治療物質を同定することを特徴とする方法。
【請求項３８】
ｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性に作用するポリペプチドの活性を調節する治療物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化が、前記試験化合物を、ＨＤＬ活性に作用するポリペプチドの活性を調節する治療物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８記載の方法において、前記ポリペプチドが配列番号４に相当することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８記載の方法において、前記ポリヌクレオチドが配列番号３に相当することを特徴とする方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド配列あるいはポリヌクレオチド配列の完全相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチド配列が配列番号３と最低９５％同一であることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号４に示されたアミノ酸配列を持つポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号３に示された配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列番号４に示されたアミノ酸配列との最低９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４４記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記単離されたポリペプチドが、配列番号４に示されたアミノ酸配列との最低９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号４に示されたアミノ酸配列より成る単離されたポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４１記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸ベクター。
【請求項４９】
請求項４８記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項５０】
配列番号４のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、請求項４９記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生を支持する条件下で培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５プロモーターと作動可能に結合するレポーター遺伝子を含む遺伝子構造体と、前記レポーター遺伝子の転写を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の転写の変化を測定することを含み、
ここで前記転写の変化は、試験化合物が遺伝子９５活性を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、ステップｂ）の測定された転写の変化が、転写の減少であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、ステップｂ）の測定された転写の変化が、転写の増加であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、転写が前記レポーター遺伝子によってエンコードされた発現産物の量を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記発現産物がＲＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記発現産物がポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子がリポソーム中にあることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子が無傷細胞中にあることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記無傷細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記プロモーターが哺乳類遺伝子９５プロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記遺伝子９５プロモーターがヒトプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、前記ヒトプロモーターが配列番号１５のプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法において、前記遺伝子９５プロモーターがマウスプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、前記マウスプロモーターが配列番号１４のプロモーター配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法において、前記レポーター遺伝子が遺伝子９５でないことを特徴とする方法。
【請求項１６】
遺伝子９５活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化が、試験化合物を遺伝子９５活性を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、ステップｂ）の測定された活性の変化が、活性の減少であることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法において、ステップｂ）の測定された活性の変化が、活性の増加であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の方法において、前記活性が酵素の活性を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６記載の方法において、前記ポリペプチドが脂質二重層中に存在することを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記脂質二重層がリポソームの一部であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１６記載の方法において、前記ポリペプチドが無傷細胞の一部であることを特徴する方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記無傷細胞が前記ポリペプチドを含むように処理された細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、前記無傷細胞が前記ポリペプチドを発現するように遺伝子組換えが行われた組換え細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、前記細胞が前記組換え処理がないときは前記ポリペプチドを発現しないことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２２記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
ＨＤＬ増強物質を同定するための方法であって、前記方法が、動物に、請求項１、１３、２４あるいは４９のいずれか一項に記載の分析を用いて調節活性を持つと分かった物質の有効量を投与し、前記投与の結果としての前記動物中の血漿ＨＤＬ活性の増加を検出し、それによりＨＤＬ活性の増強に有用な物質を同定することを含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７記載の方法において、前記動物が前記物質の投与前に低ＨＤＬ活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２７記載の方法において、前記ＨＤＬ増強活性が前記動物におけるＨＤＬレベルの増加であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記ＨＤＬレベルの増加が血漿ＨＤＬレベルの増加であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項２９記載の方法において、前記動物がヒト患者であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
低ＨＤＬ関連疾患に苦しむ動物における前記疾患を治療するための方法であって、前記方法が、前記動物に、請求項２７記載の分析方法を用いてＨＤＬ増強活性を持つと分かった物質の有効量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２記載の方法において、前記動物がヒト患者であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２記載の方法において、前記疾患が低ＨＤＬ疾患、血管障害および異常脂質血症より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
【請求項３５】
試験化合物の調節活性に関する試験データを生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、遺伝子９５ポリヌクレオチドあるいは遺伝子９５ポリペプチド、もしくは遺伝子９５プロモーターに作動可能に結合するレポーター遺伝子を含むポリヌクレオチド構成体と、前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子が転写され、あるいは前記ポリペプチドが活性化する条件下で接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性、あるいは前記ポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化を測定し、
（ｃ）測定されたポリヌクレオチドあるいはレポーター遺伝子の転写の変化あるいは測定されたポリペプチドの活性の変化に基づく前記試験化合物の調節活性に関する試験データを生成することを含み、
ここで前記変化が調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項３６】
心疾患の治療あるいは予防のための方法であって、前記方法が、心疾患の治療あるいは予防を必要とする患者に遺伝子９５タンパク質生物学的活性あるいは発現を調節する化合物の治療線量あるいは予防線量を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
治療物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）化学物質を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの発現を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの発現の変化を測定することを含み、
ここで前記発現の変化が、治療物質を同定することを特徴とする方法。
【請求項３８】
ｉｎ ｖｉｖｏで高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）活性に作用するポリペプチドの活性を調節する治療物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、遺伝子９５に相当するポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと、前記ポリペプチドの活性を支持する条件下で接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定することを含み、
ここで前記活性の変化が、前記試験化合物を、ＨＤＬ活性に作用するポリペプチドの活性を調節する治療物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３８記載の方法において、前記ポリペプチドが配列番号４に相当することを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３８記載の方法において、前記ポリヌクレオチドが配列番号３に相当することを特徴とする方法。
【請求項４１】
ポリヌクレオチド配列あるいはポリヌクレオチド配列の完全相補体を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチド配列が配列番号３と最低９５％同一であることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号４に示されたアミノ酸配列を持つポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
配列番号３に示された配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４４】
配列番号４に示されたアミノ酸配列との最低９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
請求項４４記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記単離されたポリペプチドが、配列番号４に示されたアミノ酸配列との最低９５％の同一性を持つアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号４に示されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号４に示されたアミノ酸配列より成る単離されたポリペプチド。
【請求項４８】
請求項４１記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸ベクター。
【請求項４９】
請求項４８記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項５０】
配列番号４のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、請求項４９記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドの産生を支持する条件下で培養することを含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図７】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図７】
【図４】
【図６】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００６−５０４４０７（Ｐ２００６−５０４４０７Ａ）
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１８０２６（Ｐ２００４−５１８０２６）
【出願日】平成１５年６月２７日（２００３．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００３１５９
【国際公開日】平成１６年１月８日（２００４．１．８）
【出願人】（５０３４４９８０１）ゼノン ファーマスーティカルス，インコーポレイテッド (1)
【出願人】（３９１０１１３０８）ワーナー−ランバート・カンパニー、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー (37)
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＲＮＥＲ−ＬＡＭＢＥＲＴ ＣＯＭＰＡＮＹＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月２７日（２００３．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０４１０
【国際公開番号】ＷＯ２００４／００３１５９
【国際公開日】平成１６年１月８日（２００４．１．８）
【出願人】（５０３４４９８０１）ゼノン ファーマスーティカルス，インコーポレイテッド (1)
【出願人】（３９１０１１３０８）ワーナー−ランバート・カンパニー、リミテッド、ライアビリティ、カンパニー (37)
【氏名又は名称原語表記】ＷＡＲＮＥＲ−ＬＡＭＢＥＲＴ ＣＯＭＰＡＮＹＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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