表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及びそのスクリーニング方法
本発明は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法、前記方法によりスクリーニングされたゾル組成物及び前記ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップに関する。本発明によりスクリーニングされたゾル組成物はプローブと混合して既存のバイオアッセイに広く用いられる９６ウェルプレートに表面処理なしに集積することができ、固定されたプローブの変形が少なくて優れた分析結果が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法、該方法によりスクリーニングされたゾル組成物及び該ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、ナノテクノロジー（ＮＴ）などの物質技術と、その技術のコンテンツ及び応用分野であるバイオテクノロジー（ＢＴ）と、結果を解析し且つ多量の結果を分析する情報テクノロジー（ＩＴ）と、が融合された代表的な技術である。バイオチップは様々な種類の生体物質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列（High-Density Microarraying）したものである。バイオチップの細部技術としては、生体物質を固定化する技術、固体状支持体を生体物質に馴染ませる技術、生体物質を微細配列する技術、製作されたチップ上において種々の生体反応を行うアッセイ技術、反応された結果を感知する技術、固定対象となる生体物質を製作するタンパク質工学、遺伝子組換え技術などが挙げられ、バイオチップはこれらの技術が集積された産物である。
【０００３】
バイオチップのうち代表的なプロテインチップは、種々のタンパク質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列したものである。プロテインチップを用いると、少量の試料により疾病の診断、高効率スクリーニング（ＨＴＳ）、酵素活性測定など様々な目的の実験を大規模で簡単に行うことができる。
【０００４】
既に商用化しているＤＮＡチップと同じ原理と技術要素を導入してプロテインチップを製作しようとする努力がなされている。一般に、商用化しているＤＮＡチップのほとんどは、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にＤＮＡを固定化して製作したものである。ＤＮＡチップの製作とほとんど同様な方法によりプロテインチップを製造する場合、すなわち、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にタンパク質を固定化してプロテインチップを製造する場合、固定される標的タンパク質の物理化学的な特性差により種々の問題が発生している。
【０００５】
初期のプロテインチップは、表面処理されたガラス基板の上にタンパク質をそのまま付着した後、簡単な結合分析を行うものであったが、固定化されたタンパク質の活性によって実際の性能が左右されて、本来の目的を達成するのに多くの難点があった(MacBeath and Schreiber, Science,289:1760, 2000)。このような問題点は、タンパク質が有する固有の物理化学的な特性差により発生するタンパク質の変性、不活性化、及び分解などにより引き起こされるものである。
【０００６】
このような問題点を克服するために、ＤＮＡとは区別されるタンパク質の特性に適するタンパク質付着表面処理技術及びタンパク質固定物質などへの研究がなされている。このような研究は、プロテインチップ表面の上に固定反応を引き起こすと同時に、タンパク質の活性を維持する方法を提供するのに焦点が合わせられている。その例として、パーキンエルマーのヒドロゲルコーティングスライド、プロリンクスのベルサリンクスチップ及びジオミックスのバイオチップであるＰＤＣチップなどが挙げられる。
【０００７】
特に、ヒドロゲルコーティングスライドは、３次元ポリアクリルアミドゲルを用いた技術であり、光学的に平らなシラン処理されたスイスガラスを基本支持物質として用い、その上に表面を変形させたアクリルアミド重合体を載置してタンパク質の結合力及び構造的な安定性を高めたものである。このとき、タンパク質はポリアクリルアミドゲル官能基との共有結合形成によって固定化されている。また、プロリンクスのベルサリンクチップはＴｉＯ３表面上にビオチン誘導体化されたポリ（Ｌ−リシン）−ｇ−ポリ（エチレングリコール）の自己組立単層を形成し、前記形成された単層にタンパク質を固定してタンパク質の活性を増大したものである。これらの方法は３次元微細構造を作って、変形された表面にタンパク質を共有結合などにより固定してスポット上のタンパク質活性を維持するのに有利である。このような方法の他に、微細加工を用いたマイクロウェル状のチップを作って、溶液状態のチップを製作することもある。
【０００８】
一方、ゾル−ゲル工程は、微細加工によって微細構造を作るのに用いられてきた技術であり、特に、無機物質に生体分子を化学的に付着する代わりに、穏やかな工程によって結合網を形成し、この結合網内に生体分子を共有結合以外の方法により固定化する技術である(Gill, I. and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000)。酵素をはじめとする多くの生体分子を塊状ゾル−ゲルマトリックス内に固定して、生体触媒やバイオセンサーの製作に用いられている(Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997)。特に、ゾル−ゲルの透明な光学的な性質のため、光学的な発色検出にも用いられている(Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994)。さらに、生体分子は、ゾル−ゲルに固定化されると、化学的及び熱的に極めて安定化されることが知られている(Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994)。
【０００９】
バイオセンサーの場合、ゾル−ゲル反応は単なる固定だけではなく、固体支持体の上に微細構造を形成してパターン化する方法として用いられている。このとき、パターン化方法は、流体力学を用いて液状であるゾル状態においてモールドにより成形してゲル化した後、モールドを除去してパターンを作ることである。例えば、毛細管内マイクロモジューリング（micro-moduling in-capillaries；ＭＩＭＩＣ）技法(Kim et al., J. Ferment.Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics, 38:5799, 1999)と呼ばれる技術は、メゾスコピックシリカをパターン化する技術であり、微視流体工学の基本的なパターン化に利用可能である。
【００１０】
しかしながら、タンパク質の活性はｐＨなどの種々の因子により影響されるため、ゾル−ゲル過程においてはゾル状態からタンパク質を添加して活性を維持する条件を設定することが重要である。このために、中性ｐＨなど種々の穏やかな条件を用いてタンパク質とゾルを予め混合してタンパク質をパターン化するなどの技術(Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 73:331, 2001)が発表されているが、中性ｐＨにおいてはゾル−ゲル過程が急激に進んでゲルとなるだけではなく、添加剤の選択によって亀裂が生じたり不透明になったりするなどの不都合がある。
【００１１】
本発明者らは上記の如きプロテインチップの短所を補完して、ゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを開発している（大韓民国公開特許１０−２００４−００２４５１０）。すなわち、従来は、タンパク質をはじめとする生体物質入りのゾル−ゲルマトリックスをスポット状にチップ基質の上に固定可能な技術が存在していなかったため、生体物質の固定されたゾル−ゲルマトリックスをスポット状に集積したバイオチップが存在していなかった。前記先行特許においては、チップ基質を特有のコーティング成分により表面処理する技術を開発することにより、チップ基質上におけるゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを最初に製造することができた。前記先行特許によるチップ基質表面処理技術によれば、生体物質入りのゾル混合物をスポット状にチップ基質の上に集積することができ、前記ゾル混合物をゲル化するゾル−ゲル反応がチップ基質上において誘起でき、ゾル−ゲルマトリックスをチップ基質の上に固定化することができる。特に、前記先行技術においては、チップ基質の表面に生体物質が共有結合により固定されている従来のバイオチップと異なり、生体物質が内部の気孔に捕集されてカプセル化されているゲル状のスポットがチップ基質の上に集積及び固定されているバイオチップを開発している。
【００１２】
しかしながら、前記バイオチップは生体物質入りのゲルスポットを基質の上に固定するために、ポリビニールアセテートなどのコーティング剤により基質を表面処理し、前記表面処理された基質の上にゾル混合物をスポッティングしなければならないため、費用面や大量生産の面から不利であり、コーティングできない表面や形状のバイオチップには適用することができないという限界がある。
【００１３】
そこで、本発明者らは、バイオチップの商用化のために従来の技術において必須とされていた表面処理をしていない基質の上にも強く結合可能なゾル−ゲルカプセル化に用いられる物質組成を見出すために鋭意努力した結果、効率よいゾル組成物スクリーニング方法を考案し、基質表面に強く結合してバイオチップの分析過程中の激しい洗浄に耐え、且つ、良好なアッセイ結果が得られるゾル組成物を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
《技術的課題》
従って、本発明の目的は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供するところにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記方法によりスクリーニングされた、ＰＭＭＡ基質、ゴールドまたはシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップを提供することにある。
【技術的解決方法】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップと、を含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００１９】
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００２０】
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００２１】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明による９６ウェルプレート型バイオチップを用いた分析方法を示す図である。
【図２】表面処理していない基質上においてスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートである。
【図３】前記スクリーニング方法により選択された組成と脱落された組成の例を示す図である。
【図４】ＨＩＶ抗原タンパク質ｐ２４を本発明のスクリーニング過程によって得られたゾル組成物に混合した後、９６ウェルプレートに表面処理なしに固定化して、ＨＩＶ患者の診断に用いた結果を示す図である。
【図５】ＨＣＶマーカーを本発明のスクリーニング過程によって得られたゾル組成物に混合した後、９６ウェルプレートに表面処理なしに固定化してＣ型肝炎を診断した結果を示す図である。
【図６】本発明によるゾル混合物が固定されているバイオチップ分析法を用いたＣ型肝炎の診断結果及び前記結果を定量化ソフトウェアを用いて定量分析したグラフである。
【図７】本発明の方法によりスクリーニングされたゾル混合物を金（Ａｕ）基質の上にスポッティングして製作したゴールドチップを示す図である。
【図８】本発明の方法によりスクリーニングされたゾル混合物を半導体基質の上にスポッティングして製作した半導体チップを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、一観点において、次のステップを含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法に関する：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定してプローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
【００２４】
本発明において、プローブは、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とし、前記表面処理されていない基質は、高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴としている。
【００２５】
本発明は、他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２６】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関するものである：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２７】
前記組成物において、前記プローブはタンパク質であることを特徴とし、前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とし、前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴としている。
【００２８】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２９】
前記組成物において、前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とし、前記プローブはタンパク質であることを特徴としている。
【００３０】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；
プローブ溶液 １２．５重量部。
【００３１】
本発明において、「表面処理」とは、本発明者らの先行特許（大韓民国特許公開１０−２００４−００２４５１０）に開示された用語であり、ゾル−ゲルバイオチップに用いられる基質の表面をポリビニールアセテートなどの高分子量の合成コーティング剤を塩化メチレン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒に溶解させたコーティング液によりコーティングすることを言う。
【００３２】
本発明によるバイオチップに固定可能な生体物質は標的物質と特異的に結合することができて、これらの間の結合を分析可能にするあらゆる物質が使用可能である。好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む核酸、タンパク質またはオリゴペプチドなどがある。なお、低分子物質及び天然物など種々の化合物質を固定化することもできる。
【００３３】
本発明を通じてチップ基質の表面に高密度で集積可能な生体物質のうちタンパク質の非制限的な例としては、HIV p24、Combo、RgpIII、HCV core、NS5、NS3、E1/E2、HBV surface antigen、antibody、IgG-Cy3をはじめとして、感染性疾病診断用の抗原若しくは抗体、またはＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１−１、glypecanをはじめとする癌診断用の抗原若しくは抗体、活性測定に用いられる酵素がある。また、タンパク質、抗原、抗体だけではなく、新薬開発に用いられる低分子物質及び自生植物、微生物、カビ、漢方薬などの天然物もゾル組成物に入れて固定化可能である。
【００３４】
本発明はスクリーニングにより選択された組成により製造されたゾル混合物を９６ウェルプレートタイプ基板を用いてコーティングなしにスポットを固定化するものであり、前記固定化されたバイオチップを新たな機器の導入なしに既存の免疫検査自動化機器を用いて診断検査することができ、その過程を図１に示す。９６ウェルプレートの場合にはいかなる製造社製の高分子プレートを用いてもかまわないが、非制限的に、ＮＵＮＣ、ＳＰＬ社の９６ウェルプレートを用いてスポットを固定してチップを製作した。また、自動化機器は、図１に示すように、Ａｂｏｔｔ社製のＡｘｙｍ、Ｒｏｃｈｅ社製の機器などと互換的に使用可能である。
【００３５】
プロテインチップの場合、スポットの直径は約１００〜５００μｍであることが好ましく、ウェル当たりに１〜１０００本のスポットを集積することが好ましい。下記の実施例においては、１００スポット／ｃｍ２のチップを製作しているが、高集積時には１，０００スポット／ｃｍ２まで製作可能である。
【００３６】
本発明においてゾル−ゲル反応により製造されたバイオチップの場合、反応時間が長かった免疫診断方法や既存のバイオチップ診断方法に比べて、３０分から２時間内に反応結果を得ることができる。
【００３７】
本発明により製造されたプロテインチップは、免疫診断方法によるサンドイッチアッセイ方法と同様に抗原を蛍光染色体により標識して診断に用いることができる。このとき、結果を測定するステップにおいて蛍光スキャナーを用い、プログラムによって診断結果を分析して定量化することができる。本発明により製作されたプロテインチップは、非制限的なＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどの酵素免疫診断方法に代えうるものである。
【００３８】
本発明のゾル組成物は溶液状態において生体物質を添加することができるため、タンパク質または低分子物質を高集積することができ、これにより、製造されたバイオチップを用いて高効率のスクリーニング（ＨＴＳ）が行える。また、ゾル混合物にタンパク質活性測定に用いられる酵素の集積が可能であるため、これにより製造されたバイオチップは酵素活性測定に用いることができる。前記活性測定用の酵素には毒性分析、環境分析、食品菌分析に用いられる酵素がある。このため、本発明による９６ウェル型バイオチップは疾病診断に応用することができ、新薬開発の基盤技術だけではなく、環境及び毒性分析に使用可能である。
【００３９】
図１は、本発明による９６ウェルプレート型バイオチップを用いた分析方法を示すものである。本発明においては、用いられる９６ウェルプレートに表面処理なしに安定してゾル組成物を固定化して既存の免疫学的な診断機器を同様に用いて分析することができる。
【００４０】
また、本発明によるゾル組成物は既に開発されているバイオセンサーに適用して感度を高めることができる。高分子だけではなく、金をはじめとする金属表面、シリコンをはじめとする半導体表面、透明な高分子表面、鏡をはじめとするガラス表面などに固定化して感度を高めることができる。検出をし易くするために、標的物質には蛍光染料などの信号誘発物質を付着することが好ましい。生体物質と標的物質との間の結合に対する検出は標的物質に付ける信号誘発物質を付着する基板の性質によって、蛍光検出法、電気化学的検出法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法または光学的な性質差を用いた検出法など種々の方法により行うことができる。
【００４１】
本発明のゲル組成物を用いると、１ウェルの上に最大１０００個以上のスポットに種々のタンパク質、抗原及び抗体だけではなく、低分子物質、バクテリアなどを集積することができる。本発明は代表的に採血時に輸血適合性（感染疾患マーカー、例、ＨＩＶＩ、ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、マラリア、H.pylori、Syphillisなど）をスクリーニングする血液銀行スクリーニングに利用できるだけではなく、通常の癌の診断マーカーと特定癌の診断マーカーを一括して集積して診断することができる。更に、各種の金属、半導体基板を用いて既存の蛍光ラベルなしに疾病及び菌を検出可能なＰＯＣＴなどの製品群を開発することができる。また、環境汚染、特に、水質汚染などに敏感なマーカーを一括して集積して水質汚染を一度に見出すこともできる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００４３】
＜実施例１：基質及び生体物質に特異的であり、且つ、基質上に直接的に固定可能なゾル組成物のスクリーニング＞
表面処理していない基質に直接的に固定しても強い洗浄に耐えながらバイオチップとして製作時に優れた物理的特性を有するゾル−ゲル組成物を本発明のスクリーニング方法（図２）により素早く選別した。図２は、表面処理していない基質上にスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートであり、図３は、前記スクリーニングにおいて選択された組成と脱落された組成の例を示すものである。脱落された組成は表面処理なしではタンパク質などバイオ物質を固定化することができず、洗浄過程において全て脱落していることが分かる。
【００４４】
まず、シリケート単量体をベースとする約１００，０００の組成のゾル組成物のうち前記ゾル組成物を基質にスポッティングしたとき、分析過程の洗浄に耐えうる強い接着性、スポットの形状を一定に維持可能な物性、ゲル化にかかる時間、光学的透明性、低い自己蛍光性を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット直径を有しながら元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する、合計で７００種類のゾル組成物を１次スクリーニングした。
【００４５】
前記７００種類のゾル組成物のうち、生体物質の固定化収率、免疫判読時の感度などを考慮して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上である組成物を選択した。
【００４６】
最終的に、生体物質が低分子物質、タンパク質及び抗体である場合、それぞれ組成２種類、組成７種類の及び組成８種類の組成物を得た。
【００４７】
本発明によるゾル組成物のスクリーニング方法をより具体的に説明する。
【００４８】
ゾル組成物の１次スクリーニング
シリケート単量体（ＴＭＯＳ、ＭＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、ＴｒＥＯＳ、ＴＭＳ、ＭＴＭＳ及び３−ＡＴＭＳ）、中間体（ＰＧＳ及びＤＧＳ）及び添加剤（ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵ、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００及びＰＥＧ８０００）を１０ｍＭＨＣｌ溶液に種々の組成により添加した。最終的に、各組成に他のｐＨ（４−９）、濃度（０−５００ｍＭ）及び塩（カリウム及びアンモニウム）を有するバッファを添加した。その結果、１００，０００個以上の組成が得られ、これらの組成を市販中のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）プレートに集積し、接着性、スポットの外観、ゲル化時間、透過度及びバックグラウンドなどを試験した。
【００４９】
接着性は、洗浄後のスポットの激しいスクラッチにより試験し、激しい洗浄（１０％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍにおいて５分間３回洗浄）後、チップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落しない組成を選択した。スポットの外観は光学顕微鏡により直接的に観察して円形を維持し、スポット直径が１００〜８００μｍであるものを選択した。ゲル化にかかる時間はチューブ及びスポット上の両方において測定し、チューブ内において４時間以上、スポットにおいて１時間以上のゲル化時間を示す組成を選択した。光学透過率はレーザースキャナーを用いてバックグラウンドよりも低い自己蛍光性を有すると認められた組成を選択した（GenePix 4100, Axon Instrument）。
【００５０】
最適組成の選択
前記１次スクリーニング組成物を用いて、洗浄過程の前後に各組成のスポット固定化率をＣｙ−３により標識された固定化されたペプチド、ＢＳＡタンパク質及び抗体の信号を比較して測定した。活性分析のために、前記１次スクリーニング組成物にＢＳＡタンパク質（５００ｎｇ／μＬ）を添加し、最終混合液をタンパク質と共にＰＭＭＡスライド型プレートに集積した。前記スライドをＣｙ−３により標識されたＢＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）と３０分間反応させた後、反応の終わったスライドを洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ））により激しく洗浄した後に乾燥した。シグナルの感度を分析するために、前記スライドのスポットをスキャンし、GenePix Pro４．０ソフトウェア（Axon Instrument）を用いてシグナル値に対するバックグラウンド値を定量してシグナルの感度を分析した。
【００５１】
その結果、表１に示すように、前記１次スクリーニングゾル組成物のうち２つの組成物において混合された低分子物質に対して７０％以上の固定化率を示し、７個の組成物において混合されたタンパク質に対して８０％以上の固定化率を示し、８個の組成物において抗体に対して約９０％の固定化率を示している。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表面分析
スポットの表面はＳＥＭ（Ｓ−４８００ＳＥＭ、Hitachi Co.）を用いて観察した。ＳＥＭ観察のために伝導性コーティングはスポットが完全にゲル化された後、イリジウムターゲット（〜２０ｎｍの厚さ）によりイオンビームスパッターコーターを用いて行った。気孔の孔径はイメージ分析ソフトウェア（Image-Pro Plus, MediaCybernetics）を用いて測定した。気孔の数は９個の異なるエリア（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）を測定し、平均気孔密度は［Σ気孔面積］／［全体の面積（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）］として計算した。
【００５４】
溶液内における内部スポットの分析
内部スポットイメージはTappingModeTM AFM(MultiMode SPM, Nanoscope IIIa, Vecco Instrument)を用いて大気中において測定した。スポットの切断は垂直マイクロトームを用いて行った。
【００５５】
スポットスキャンプロファイルの分析
スポットイメージは共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）を用いて標準反射形態を通じて測定した。スポットの中央に対するスキャンプロファイルは厚さが６３μｍ以下、直径が３８０μｍ以下と測定された。
【００５６】
免疫分析後のスポット内部のタンパク質と抗体の分布を測定するために、ＣＬＳＭ（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）により内部スポットの垂直断層撮影イメージを撮影した。ステッピングモーターを用いたｚ軸の最大解像度は５０ｎｍであり、スキャンモジュールを用いたｘｙ軸の最大解像度は×１００及び×４０であった。ＣＬＳＭを撮影するために、まず、ｐ２４タンパク質を含むマイクロスポットをガラススライドに集積し、前記ｐ２４タンパク質を含むスポットが集積されたスライドをｐ２４抗体と１時間かけて反応させた後、激しく洗浄した。その後、Ｃｙ３により標識された２次抗体と３０分かけて反応させた後、洗浄し且つ乾燥して、ＣＬＳＭイメージを撮影した。
【００５７】
プローブと目的物質との間の特異性及び活性測定
ゾル−ゲル基質上においてタンパク質−タンパク質相互作用の特異性と活性を測定するために、ＨＩＶ抗原タンパク質であるｐ２４タンパク質を表２の組成ＩＶのゾル組成物と混合して固定化した。ｐ２４タンパク質に対応するＨＩＶ抗体を含む血清の順次的希釈液により免疫分析を行った。同時に、ＨＩＶ抗体の非特異吸着を確認するために、ＢＳＡタンパク質はゾル−ゲル基質内において同じチップに固定した。タンパク質が添加されていないゾル組成物のスポットと関連性のないタンパク質（４−１ＢＢ）を反応させたときに発生する非特異的な相互作用は極めて低く現れた。しかしながら、ＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗原に対するＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗体とは正確なスポットにおいて特異的な相互作用を示した。
【００５８】
表２には、本発明によりスクリーニングされた７種類のタンパク質固定化用のゾル組成物の性質を示す。組成０はＴＭＯＳとＭＴＭＳのみよりなる比較組成物である。
【００５９】
【表２】
【００６０】
タンパク質固定化に用いられる前記７種類の組成のうち、組成ＩＶがシグナル及びシグナル／バックグラウンドの割合において最も良好な結果を示した。前記組成ＩＶは他の組成と比較したとき、低いＴＭＯＳ比を有し、高い分子量のＰＥＧが添加された組成であり、高い気孔密度と非特異的な抗体含有率が低かった。
【００６１】
＜実施例２：９６ウェルプレート上に固定されたゾル−ゲルプロテインチップスポットの固定化を通じての酵素免疫学的疾病の診断＞
この実施例においては実施例１において選定されたゾル組成物を肝炎診断に用いて現在用いられている肝炎診断用のＥＬＩＳＡ自動診断プロセスを用いて測定した。前記自動診断プロセスは激しい洗浄過程を含んでいるため、前記スクリーニングされた組成のうちスポットが強い接着性を示し、洗浄後にもスポット特有の円形を維持可能な組成を用いた。この実施例において用いたゾル組成は形成されたスポットがAbbott Axsym及びRoche Elecsys機構を用いた物理的なスクラッチにも耐えうるように最適化した。
【００６２】
この実施例においては、このような過程によって選択された組成のうち、９６ウェルプレートの材質がプラズマ処理されたＰＭＭＡである場合に、固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合はＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００６３】
１７．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。５〜１５重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜１５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００６４】
タンパク質溶液としては、ＨＩＶ抗原であるＰ２４タンパク質を用いて９６ウェルプレート上にゾル−ゲルスポットを集積した。その結果、図４に示すように、ＨＩＶｐ２４タンパク質にのみ特異的に反応することが分かり、図示の４個のサンプルは全てＨＩＶ陽性であった。前記ゾル−ゲル混合物を用いて前記プラズマ処理されたＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレート上にタンパク質を強く３次元的に固定化することができ、前記バイオチップを用いて既存の診断の自動化機器及びアッセイ方法を活用して抗原−抗体反応の結果を確認することができた。
【００６５】
また、プラズマ処理していない市販中のＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合は全体の混合物のうちＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００６６】
２２．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。７．５〜１０重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００６７】
前記最適化された組成物とＨＣＶ抗原を混合してプラズマ処理していないＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに集積させたバイオチップを用いてＲｏｃｈｅ ＨＣＶ ＥＩＡキットにより７９名の患者（陰性２５名、陽性５４名）を対象として試験した。図５は、患者１２名の血液分析結果を示すものである。その結果、既存のＥＬＩＳＡ方法を用いた結果と１００％一致し、本発明のバイオチップが高い結果の再生性を有することが分かった。本発明によるバイオチップは高い遂行能力、高い感度、多い処理量及び高い正確性を有し、安価で測定可能であるために既存のＥＬＩＳＡ診断方法に代えうるものであることが分かった。また、既存の免疫診断よりも多量のタンパク質を固定化することにより既存の診断法よりも偽陽性を低減することができ、正確な肝炎診断を行うことができた。
【００６８】
また、本発明のバイオチップを用いて定量的な分析を行うことができるかどうかを調べるために、患者検体の連続した希釈によって検出限界及び定量範囲実験を行った（図６）。その結果、定量的な分布を示すことを確認した。この結果から、本発明によるバイオチップを用いる場合、既存の免疫診断法において測定できなかった定量的な分析も行うことができるということを確認することができた。
【００６９】
＜実施例３：ゴールドチップ基質を用いたバイオチップの製作及び分析＞
この実施例においてはＳＰＲｉシステムに用いられるゴールド（Ａｕ）チップを用いて実施例１の方法と同様にしてゴールドチップ基質に固定化されるゾル組成を見出した。ゴールドチップの場合、固定化されるゾル組成に添加剤として粘着剤（１０１０、１０２０；ＬＧ化学、大韓民国）を添加した。ゾル混合物はスポッティングされた後、ガラスのように透明で且つ気孔を有する物質から変形されるが、Ａｕにより表面がコーティングされたゴールドチップの上には固定化が起こらなかった。この実施例においては、ゴールドチップの表面にゾルスポットを固定するために添加剤を用い、用いたゾル混合物の組成はＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤（１０１０、１０２０など）、０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００７０】
１６．２〜１８．７重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。３．７〜６．２重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。１３．７〜１６．２重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００７１】
前記混合物をゴールドチップの上に実施例２及び３の方法と同様にしてスポッティングした後、ｐ２４タンパク質に対するアッセイを行った。ゴールドチップアッセイと前記９６ウェルプレートに固定されたバイオチップのアッセイとの相違点は、抗体反応時に１次抗体反応を行い、蛍光標識された２次反応なしに結果を検出することができるということである。１次反応させたゴールドチップの結果はＳＰＲシステムを用いて反応時に発生する共鳴変化により測定してイメージ化することにより判読することができた（図７）。前記ゴールドチップは多量のタンパク質を固定化することができ、化学標識なしに直接的にタンパク質−タンパク質の結合を検出することができて高い感度を有する。
【００７２】
＜実施例４：半導体チップ上におけるスポットの固定化及び電気化学的検出＞
この実施例は電気化学的測定に用いられる半導体チップの両極の間に伝導性を有するゾル混合物を固定化してその間にできた反応前後の電気的な抵抗差を測定して反応をモニターリングするシステムに関する。用いた金属表面はシリコンウェーハであって電極に最も多用されるものであるが、表面が極めて均一で且つ平滑であるために従来は、表面処理なしに高分子物質を付着することが困難であった。しかしながら、実施例１の方法により電極に固定化されるゾル組成物をスクリーニングし、前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４を混合して半導体ウェーハの上に固定化した。
【００７３】
この実施例において用いられた半導体チップ用のゾル組成物の組成は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部であった。
【００７４】
前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４が固定されている半導体チップを用いて反応前後の電気的な抵抗差を電気化学的な測定法により測定した結果、図８に示すように、感度がかなり向上しただけではなく、バックグラウンドのノイズの割合を低減できることを確認することができた。このため、この実施例による半導体チップは安価で且つ小型のバイオチップ分析システムの製作に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上述べたように、本発明は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する効果がある。また、本発明は、前記方法によりスクリーニングされたＰＭＭＡ基質、ゴールド及びシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物を用いて製造されたゾル−ゲルバイオチップを提供する効果がある。本発明によるバイオチップはバイオアッセイに広く用いられる９６ウェルプレートに生体物質が含有されたゲル状のスポットを直接的に固定して既存の反応システム及び分析システムを利用することができ、便利で且つ経済的であり、固定された生体物質の変形が少なくて優れた分析結果が得られる。特に、蛍光分析の他にプローブのない分析方法を用いる場合、既存の分析方法の問題であった感度問題を３次元ゾル−ゲルスポットを強く結合することにより解決することができ、ＰＯＣＴなどの技術開発に有用であることが期待される。
【００７６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法、該方法によりスクリーニングされたゾル組成物及び該ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオチップは、ナノテクノロジー（ＮＴ）などの物質技術と、その技術のコンテンツ及び応用分野であるバイオテクノロジー（ＢＴ）と、結果を解析し且つ多量の結果を分析する情報テクノロジー（ＩＴ）と、が融合された代表的な技術である。バイオチップは様々な種類の生体物質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列（High-Density Microarraying）したものである。バイオチップの細部技術としては、生体物質を固定化する技術、固体状支持体を生体物質に馴染ませる技術、生体物質を微細配列する技術、製作されたチップ上において種々の生体反応を行うアッセイ技術、反応された結果を感知する技術、固定対象となる生体物質を製作するタンパク質工学、遺伝子組換え技術などが挙げられ、バイオチップはこれらの技術が集積された産物である。
【０００３】
バイオチップのうち代表的なプロテインチップは、種々のタンパク質を単位面積の固体状支持体の表面に高密度に微細配列したものである。プロテインチップを用いると、少量の試料により疾病の診断、高効率スクリーニング（ＨＴＳ）、酵素活性測定など様々な目的の実験を大規模で簡単に行うことができる。
【０００４】
既に商用化しているＤＮＡチップと同じ原理と技術要素を導入してプロテインチップを製作しようとする努力がなされている。一般に、商用化しているＤＮＡチップのほとんどは、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にＤＮＡを固定化して製作したものである。ＤＮＡチップの製作とほとんど同様な方法によりプロテインチップを製造する場合、すなわち、コーティング物質により表面を前処理したガラス基板の上にタンパク質を固定化してプロテインチップを製造する場合、固定される標的タンパク質の物理化学的な特性差により種々の問題が発生している。
【０００５】
初期のプロテインチップは、表面処理されたガラス基板の上にタンパク質をそのまま付着した後、簡単な結合分析を行うものであったが、固定化されたタンパク質の活性によって実際の性能が左右されて、本来の目的を達成するのに多くの難点があった(MacBeath and Schreiber, Science,289:1760, 2000)。このような問題点は、タンパク質が有する固有の物理化学的な特性差により発生するタンパク質の変性、不活性化、及び分解などにより引き起こされるものである。
【０００６】
このような問題点を克服するために、ＤＮＡとは区別されるタンパク質の特性に適するタンパク質付着表面処理技術及びタンパク質固定物質などへの研究がなされている。このような研究は、プロテインチップ表面の上に固定反応を引き起こすと同時に、タンパク質の活性を維持する方法を提供するのに焦点が合わせられている。その例として、パーキンエルマーのヒドロゲルコーティングスライド、プロリンクスのベルサリンクスチップ及びジオミックスのバイオチップであるＰＤＣチップなどが挙げられる。
【０００７】
特に、ヒドロゲルコーティングスライドは、３次元ポリアクリルアミドゲルを用いた技術であり、光学的に平らなシラン処理されたスイスガラスを基本支持物質として用い、その上に表面を変形させたアクリルアミド重合体を載置してタンパク質の結合力及び構造的な安定性を高めたものである。このとき、タンパク質はポリアクリルアミドゲル官能基との共有結合形成によって固定化されている。また、プロリンクスのベルサリンクチップはＴｉＯ３表面上にビオチン誘導体化されたポリ（Ｌ−リシン）−ｇ−ポリ（エチレングリコール）の自己組立単層を形成し、前記形成された単層にタンパク質を固定してタンパク質の活性を増大したものである。これらの方法は３次元微細構造を作って、変形された表面にタンパク質を共有結合などにより固定してスポット上のタンパク質活性を維持するのに有利である。このような方法の他に、微細加工を用いたマイクロウェル状のチップを作って、溶液状態のチップを製作することもある。
【０００８】
一方、ゾル−ゲル工程は、微細加工によって微細構造を作るのに用いられてきた技術であり、特に、無機物質に生体分子を化学的に付着する代わりに、穏やかな工程によって結合網を形成し、この結合網内に生体分子を共有結合以外の方法により固定化する技術である(Gill, I. and Ballesteros, A., Trends Biotechnol., 18:282, 2000)。酵素をはじめとする多くの生体分子を塊状ゾル−ゲルマトリックス内に固定して、生体触媒やバイオセンサーの製作に用いられている(Reetz et al., Adv. Mater., 9:943, 1997)。特に、ゾル−ゲルの透明な光学的な性質のため、光学的な発色検出にも用いられている(Edminston et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994)。さらに、生体分子は、ゾル−ゲルに固定化されると、化学的及び熱的に極めて安定化されることが知られている(Dave et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994)。
【０００９】
バイオセンサーの場合、ゾル−ゲル反応は単なる固定だけではなく、固体支持体の上に微細構造を形成してパターン化する方法として用いられている。このとき、パターン化方法は、流体力学を用いて液状であるゾル状態においてモールドにより成形してゲル化した後、モールドを除去してパターンを作ることである。例えば、毛細管内マイクロモジューリング（micro-moduling in-capillaries；ＭＩＭＩＣ）技法(Kim et al., J. Ferment.Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin et al., Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller et al., Appl. Optics, 38:5799, 1999)と呼ばれる技術は、メゾスコピックシリカをパターン化する技術であり、微視流体工学の基本的なパターン化に利用可能である。
【００１０】
しかしながら、タンパク質の活性はｐＨなどの種々の因子により影響されるため、ゾル−ゲル過程においてはゾル状態からタンパク質を添加して活性を維持する条件を設定することが重要である。このために、中性ｐＨなど種々の穏やかな条件を用いてタンパク質とゾルを予め混合してタンパク質をパターン化するなどの技術(Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 73:331, 2001)が発表されているが、中性ｐＨにおいてはゾル−ゲル過程が急激に進んでゲルとなるだけではなく、添加剤の選択によって亀裂が生じたり不透明になったりするなどの不都合がある。
【００１１】
本発明者らは上記の如きプロテインチップの短所を補完して、ゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを開発している（大韓民国公開特許１０−２００４−００２４５１０）。すなわち、従来は、タンパク質をはじめとする生体物質入りのゾル−ゲルマトリックスをスポット状にチップ基質の上に固定可能な技術が存在していなかったため、生体物質の固定されたゾル−ゲルマトリックスをスポット状に集積したバイオチップが存在していなかった。前記先行特許においては、チップ基質を特有のコーティング成分により表面処理する技術を開発することにより、チップ基質上におけるゾル−ゲル反応を用いたバイオチップを最初に製造することができた。前記先行特許によるチップ基質表面処理技術によれば、生体物質入りのゾル混合物をスポット状にチップ基質の上に集積することができ、前記ゾル混合物をゲル化するゾル−ゲル反応がチップ基質上において誘起でき、ゾル−ゲルマトリックスをチップ基質の上に固定化することができる。特に、前記先行技術においては、チップ基質の表面に生体物質が共有結合により固定されている従来のバイオチップと異なり、生体物質が内部の気孔に捕集されてカプセル化されているゲル状のスポットがチップ基質の上に集積及び固定されているバイオチップを開発している。
【００１２】
しかしながら、前記バイオチップは生体物質入りのゲルスポットを基質の上に固定するために、ポリビニールアセテートなどのコーティング剤により基質を表面処理し、前記表面処理された基質の上にゾル混合物をスポッティングしなければならないため、費用面や大量生産の面から不利であり、コーティングできない表面や形状のバイオチップには適用することができないという限界がある。
【００１３】
そこで、本発明者らは、バイオチップの商用化のために従来の技術において必須とされていた表面処理をしていない基質の上にも強く結合可能なゾル−ゲルカプセル化に用いられる物質組成を見出すために鋭意努力した結果、効率よいゾル組成物スクリーニング方法を考案し、基質表面に強く結合してバイオチップの分析過程中の激しい洗浄に耐え、且つ、良好なアッセイ結果が得られるゾル組成物を見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
《技術的課題》
従って、本発明の目的は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供するところにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記方法によりスクリーニングされた、ＰＭＭＡ基質、ゴールドまたはシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物が固定されているゾル−ゲルバイオチップを提供することにある。
【技術的解決方法】
【００１６】
前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップと、を含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００１９】
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１１〜１３重量部、及びプローブ溶液１０〜１５重量部を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００２０】
さらにまた、本発明は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップを提供する。
【００２１】
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明による９６ウェルプレート型バイオチップを用いた分析方法を示す図である。
【図２】表面処理していない基質上においてスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートである。
【図３】前記スクリーニング方法により選択された組成と脱落された組成の例を示す図である。
【図４】ＨＩＶ抗原タンパク質ｐ２４を本発明のスクリーニング過程によって得られたゾル組成物に混合した後、９６ウェルプレートに表面処理なしに固定化して、ＨＩＶ患者の診断に用いた結果を示す図である。
【図５】ＨＣＶマーカーを本発明のスクリーニング過程によって得られたゾル組成物に混合した後、９６ウェルプレートに表面処理なしに固定化してＣ型肝炎を診断した結果を示す図である。
【図６】本発明によるゾル混合物が固定されているバイオチップ分析法を用いたＣ型肝炎の診断結果及び前記結果を定量化ソフトウェアを用いて定量分析したグラフである。
【図７】本発明の方法によりスクリーニングされたゾル混合物を金（Ａｕ）基質の上にスポッティングして製作したゴールドチップを示す図である。
【図８】本発明の方法によりスクリーニングされたゾル混合物を半導体基質の上にスポッティングして製作した半導体チップを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、一観点において、次のステップを含む、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法に関する：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップと、
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップと、
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップと、
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップと、
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定してプローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
【００２４】
本発明において、プローブは、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とし、前記表面処理されていない基質は、高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴としている。
【００２５】
本発明は、他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないプラズマ処理ＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２６】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないＰＭＭＡ基質に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関するものである：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２７】
前記組成物において、前記プローブはタンパク質であることを特徴とし、前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とし、前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴としている。
【００２８】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【００２９】
前記組成物において、前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とし、前記プローブはタンパク質であることを特徴としている。
【００３０】
本発明は、さらに他の観点において、次の組成を含有する、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物及び表面処理されていないシリコンウェーハに前記ゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップに関する：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；
プローブ溶液 １２．５重量部。
【００３１】
本発明において、「表面処理」とは、本発明者らの先行特許（大韓民国特許公開１０−２００４−００２４５１０）に開示された用語であり、ゾル−ゲルバイオチップに用いられる基質の表面をポリビニールアセテートなどの高分子量の合成コーティング剤を塩化メチレン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒に溶解させたコーティング液によりコーティングすることを言う。
【００３２】
本発明によるバイオチップに固定可能な生体物質は標的物質と特異的に結合することができて、これらの間の結合を分析可能にするあらゆる物質が使用可能である。好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む核酸、タンパク質またはオリゴペプチドなどがある。なお、低分子物質及び天然物など種々の化合物質を固定化することもできる。
【００３３】
本発明を通じてチップ基質の表面に高密度で集積可能な生体物質のうちタンパク質の非制限的な例としては、HIV p24、Combo、RgpIII、HCV core、NS5、NS3、E1/E2、HBV surface antigen、antibody、IgG-Cy3をはじめとして、感染性疾病診断用の抗原若しくは抗体、またはＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ１−１、glypecanをはじめとする癌診断用の抗原若しくは抗体、活性測定に用いられる酵素がある。また、タンパク質、抗原、抗体だけではなく、新薬開発に用いられる低分子物質及び自生植物、微生物、カビ、漢方薬などの天然物もゾル組成物に入れて固定化可能である。
【００３４】
本発明はスクリーニングにより選択された組成により製造されたゾル混合物を９６ウェルプレートタイプ基板を用いてコーティングなしにスポットを固定化するものであり、前記固定化されたバイオチップを新たな機器の導入なしに既存の免疫検査自動化機器を用いて診断検査することができ、その過程を図１に示す。９６ウェルプレートの場合にはいかなる製造社製の高分子プレートを用いてもかまわないが、非制限的に、ＮＵＮＣ、ＳＰＬ社の９６ウェルプレートを用いてスポットを固定してチップを製作した。また、自動化機器は、図１に示すように、Ａｂｏｔｔ社製のＡｘｙｍ、Ｒｏｃｈｅ社製の機器などと互換的に使用可能である。
【００３５】
プロテインチップの場合、スポットの直径は約１００〜５００μｍであることが好ましく、ウェル当たりに１〜１０００本のスポットを集積することが好ましい。下記の実施例においては、１００スポット／ｃｍ２のチップを製作しているが、高集積時には１，０００スポット／ｃｍ２まで製作可能である。
【００３６】
本発明においてゾル−ゲル反応により製造されたバイオチップの場合、反応時間が長かった免疫診断方法や既存のバイオチップ診断方法に比べて、３０分から２時間内に反応結果を得ることができる。
【００３７】
本発明により製造されたプロテインチップは、免疫診断方法によるサンドイッチアッセイ方法と同様に抗原を蛍光染色体により標識して診断に用いることができる。このとき、結果を測定するステップにおいて蛍光スキャナーを用い、プログラムによって診断結果を分析して定量化することができる。本発明により製作されたプロテインチップは、非制限的なＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどの酵素免疫診断方法に代えうるものである。
【００３８】
本発明のゾル組成物は溶液状態において生体物質を添加することができるため、タンパク質または低分子物質を高集積することができ、これにより、製造されたバイオチップを用いて高効率のスクリーニング（ＨＴＳ）が行える。また、ゾル混合物にタンパク質活性測定に用いられる酵素の集積が可能であるため、これにより製造されたバイオチップは酵素活性測定に用いることができる。前記活性測定用の酵素には毒性分析、環境分析、食品菌分析に用いられる酵素がある。このため、本発明による９６ウェル型バイオチップは疾病診断に応用することができ、新薬開発の基盤技術だけではなく、環境及び毒性分析に使用可能である。
【００３９】
図１は、本発明による９６ウェルプレート型バイオチップを用いた分析方法を示すものである。本発明においては、用いられる９６ウェルプレートに表面処理なしに安定してゾル組成物を固定化して既存の免疫学的な診断機器を同様に用いて分析することができる。
【００４０】
また、本発明によるゾル組成物は既に開発されているバイオセンサーに適用して感度を高めることができる。高分子だけではなく、金をはじめとする金属表面、シリコンをはじめとする半導体表面、透明な高分子表面、鏡をはじめとするガラス表面などに固定化して感度を高めることができる。検出をし易くするために、標的物質には蛍光染料などの信号誘発物質を付着することが好ましい。生体物質と標的物質との間の結合に対する検出は標的物質に付ける信号誘発物質を付着する基板の性質によって、蛍光検出法、電気化学的検出法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法または光学的な性質差を用いた検出法など種々の方法により行うことができる。
【００４１】
本発明のゲル組成物を用いると、１ウェルの上に最大１０００個以上のスポットに種々のタンパク質、抗原及び抗体だけではなく、低分子物質、バクテリアなどを集積することができる。本発明は代表的に採血時に輸血適合性（感染疾患マーカー、例、ＨＩＶＩ、ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、マラリア、H.pylori、Syphillisなど）をスクリーニングする血液銀行スクリーニングに利用できるだけではなく、通常の癌の診断マーカーと特定癌の診断マーカーを一括して集積して診断することができる。更に、各種の金属、半導体基板を用いて既存の蛍光ラベルなしに疾病及び菌を検出可能なＰＯＣＴなどの製品群を開発することができる。また、環境汚染、特に、水質汚染などに敏感なマーカーを一括して集積して水質汚染を一度に見出すこともできる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００４３】
＜実施例１：基質及び生体物質に特異的であり、且つ、基質上に直接的に固定可能なゾル組成物のスクリーニング＞
表面処理していない基質に直接的に固定しても強い洗浄に耐えながらバイオチップとして製作時に優れた物理的特性を有するゾル−ゲル組成物を本発明のスクリーニング方法（図２）により素早く選別した。図２は、表面処理していない基質上にスポットを形成するゾル組成物をスクリーニングする方法を示すフローチャートであり、図３は、前記スクリーニングにおいて選択された組成と脱落された組成の例を示すものである。脱落された組成は表面処理なしではタンパク質などバイオ物質を固定化することができず、洗浄過程において全て脱落していることが分かる。
【００４４】
まず、シリケート単量体をベースとする約１００，０００の組成のゾル組成物のうち前記ゾル組成物を基質にスポッティングしたとき、分析過程の洗浄に耐えうる強い接着性、スポットの形状を一定に維持可能な物性、ゲル化にかかる時間、光学的透明性、低い自己蛍光性を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット直径を有しながら元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する、合計で７００種類のゾル組成物を１次スクリーニングした。
【００４５】
前記７００種類のゾル組成物のうち、生体物質の固定化収率、免疫判読時の感度などを考慮して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの割合が３倍以上である組成物を選択した。
【００４６】
最終的に、生体物質が低分子物質、タンパク質及び抗体である場合、それぞれ組成２種類、組成７種類の及び組成８種類の組成物を得た。
【００４７】
本発明によるゾル組成物のスクリーニング方法をより具体的に説明する。
【００４８】
ゾル組成物の１次スクリーニング
シリケート単量体（ＴＭＯＳ、ＭＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、ＴｒＥＯＳ、ＴＭＳ、ＭＴＭＳ及び３−ＡＴＭＳ）、中間体（ＰＧＳ及びＤＧＳ）及び添加剤（ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵ、グリセロール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００及びＰＥＧ８０００）を１０ｍＭＨＣｌ溶液に種々の組成により添加した。最終的に、各組成に他のｐＨ（４−９）、濃度（０−５００ｍＭ）及び塩（カリウム及びアンモニウム）を有するバッファを添加した。その結果、１００，０００個以上の組成が得られ、これらの組成を市販中のＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）プレートに集積し、接着性、スポットの外観、ゲル化時間、透過度及びバックグラウンドなどを試験した。
【００４９】
接着性は、洗浄後のスポットの激しいスクラッチにより試験し、激しい洗浄（１０％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍにおいて５分間３回洗浄）後、チップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落しない組成を選択した。スポットの外観は光学顕微鏡により直接的に観察して円形を維持し、スポット直径が１００〜８００μｍであるものを選択した。ゲル化にかかる時間はチューブ及びスポット上の両方において測定し、チューブ内において４時間以上、スポットにおいて１時間以上のゲル化時間を示す組成を選択した。光学透過率はレーザースキャナーを用いてバックグラウンドよりも低い自己蛍光性を有すると認められた組成を選択した（GenePix 4100, Axon Instrument）。
【００５０】
最適組成の選択
前記１次スクリーニング組成物を用いて、洗浄過程の前後に各組成のスポット固定化率をＣｙ−３により標識された固定化されたペプチド、ＢＳＡタンパク質及び抗体の信号を比較して測定した。活性分析のために、前記１次スクリーニング組成物にＢＳＡタンパク質（５００ｎｇ／μＬ）を添加し、最終混合液をタンパク質と共にＰＭＭＡスライド型プレートに集積した。前記スライドをＣｙ−３により標識されたＢＳＡ抗体（Ｓｉｇｍａ）と３０分間反応させた後、反応の終わったスライドを洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ））により激しく洗浄した後に乾燥した。シグナルの感度を分析するために、前記スライドのスポットをスキャンし、GenePix Pro４．０ソフトウェア（Axon Instrument）を用いてシグナル値に対するバックグラウンド値を定量してシグナルの感度を分析した。
【００５１】
その結果、表１に示すように、前記１次スクリーニングゾル組成物のうち２つの組成物において混合された低分子物質に対して７０％以上の固定化率を示し、７個の組成物において混合されたタンパク質に対して８０％以上の固定化率を示し、８個の組成物において抗体に対して約９０％の固定化率を示している。
【００５２】
【表１】
【００５３】
表面分析
スポットの表面はＳＥＭ（Ｓ−４８００ＳＥＭ、Hitachi Co.）を用いて観察した。ＳＥＭ観察のために伝導性コーティングはスポットが完全にゲル化された後、イリジウムターゲット（〜２０ｎｍの厚さ）によりイオンビームスパッターコーターを用いて行った。気孔の孔径はイメージ分析ソフトウェア（Image-Pro Plus, MediaCybernetics）を用いて測定した。気孔の数は９個の異なるエリア（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）を測定し、平均気孔密度は［Σ気孔面積］／［全体の面積（５７６ｎｍ×４３０ｎｍ）］として計算した。
【００５４】
溶液内における内部スポットの分析
内部スポットイメージはTappingModeTM AFM(MultiMode SPM, Nanoscope IIIa, Vecco Instrument)を用いて大気中において測定した。スポットの切断は垂直マイクロトームを用いて行った。
【００５５】
スポットスキャンプロファイルの分析
スポットイメージは共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）を用いて標準反射形態を通じて測定した。スポットの中央に対するスキャンプロファイルは厚さが６３μｍ以下、直径が３８０μｍ以下と測定された。
【００５６】
免疫分析後のスポット内部のタンパク質と抗体の分布を測定するために、ＣＬＳＭ（LSM 5 pascal, Carl Zeiss Inc.）により内部スポットの垂直断層撮影イメージを撮影した。ステッピングモーターを用いたｚ軸の最大解像度は５０ｎｍであり、スキャンモジュールを用いたｘｙ軸の最大解像度は×１００及び×４０であった。ＣＬＳＭを撮影するために、まず、ｐ２４タンパク質を含むマイクロスポットをガラススライドに集積し、前記ｐ２４タンパク質を含むスポットが集積されたスライドをｐ２４抗体と１時間かけて反応させた後、激しく洗浄した。その後、Ｃｙ３により標識された２次抗体と３０分かけて反応させた後、洗浄し且つ乾燥して、ＣＬＳＭイメージを撮影した。
【００５７】
プローブと目的物質との間の特異性及び活性測定
ゾル−ゲル基質上においてタンパク質−タンパク質相互作用の特異性と活性を測定するために、ＨＩＶ抗原タンパク質であるｐ２４タンパク質を表２の組成ＩＶのゾル組成物と混合して固定化した。ｐ２４タンパク質に対応するＨＩＶ抗体を含む血清の順次的希釈液により免疫分析を行った。同時に、ＨＩＶ抗体の非特異吸着を確認するために、ＢＳＡタンパク質はゾル−ゲル基質内において同じチップに固定した。タンパク質が添加されていないゾル組成物のスポットと関連性のないタンパク質（４−１ＢＢ）を反応させたときに発生する非特異的な相互作用は極めて低く現れた。しかしながら、ＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗原に対するＢＳＡまたは４−１ＢＢ抗体とは正確なスポットにおいて特異的な相互作用を示した。
【００５８】
表２には、本発明によりスクリーニングされた７種類のタンパク質固定化用のゾル組成物の性質を示す。組成０はＴＭＯＳとＭＴＭＳのみよりなる比較組成物である。
【００５９】
【表２】
【００６０】
タンパク質固定化に用いられる前記７種類の組成のうち、組成ＩＶがシグナル及びシグナル／バックグラウンドの割合において最も良好な結果を示した。前記組成ＩＶは他の組成と比較したとき、低いＴＭＯＳ比を有し、高い分子量のＰＥＧが添加された組成であり、高い気孔密度と非特異的な抗体含有率が低かった。
【００６１】
＜実施例２：９６ウェルプレート上に固定されたゾル−ゲルプロテインチップスポットの固定化を通じての酵素免疫学的疾病の診断＞
この実施例においては実施例１において選定されたゾル組成物を肝炎診断に用いて現在用いられている肝炎診断用のＥＬＩＳＡ自動診断プロセスを用いて測定した。前記自動診断プロセスは激しい洗浄過程を含んでいるため、前記スクリーニングされた組成のうちスポットが強い接着性を示し、洗浄後にもスポット特有の円形を維持可能な組成を用いた。この実施例において用いたゾル組成は形成されたスポットがAbbott Axsym及びRoche Elecsys機構を用いた物理的なスクラッチにも耐えうるように最適化した。
【００６２】
この実施例においては、このような過程によって選択された組成のうち、９６ウェルプレートの材質がプラズマ処理されたＰＭＭＡである場合に、固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合はＴＭＯＳ１７．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ５〜１５重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜１５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００６３】
１７．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。５〜１５重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜１５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００６４】
タンパク質溶液としては、ＨＩＶ抗原であるＰ２４タンパク質を用いて９６ウェルプレート上にゾル−ゲルスポットを集積した。その結果、図４に示すように、ＨＩＶｐ２４タンパク質にのみ特異的に反応することが分かり、図示の４個のサンプルは全てＨＩＶ陽性であった。前記ゾル−ゲル混合物を用いて前記プラズマ処理されたＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレート上にタンパク質を強く３次元的に固定化することができ、前記バイオチップを用いて既存の診断の自動化機器及びアッセイ方法を活用して抗原−抗体反応の結果を確認することができた。
【００６５】
また、プラズマ処理していない市販中のＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに固定化されるゾル組成物とタンパク質溶液の混合物の割合は全体の混合物のうちＴＭＯＳ２２．５〜２５重量部、ＭＴＭＳ７．５〜１０重量部、ＧＰＴＭＯＳ２．５〜５重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００６６】
２２．５〜２５重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。７．５〜１０重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。２．５〜５重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００６７】
前記最適化された組成物とＨＣＶ抗原を混合してプラズマ処理していないＰＭＭＡ材質の９６ウェルプレートに集積させたバイオチップを用いてＲｏｃｈｅ ＨＣＶ ＥＩＡキットにより７９名の患者（陰性２５名、陽性５４名）を対象として試験した。図５は、患者１２名の血液分析結果を示すものである。その結果、既存のＥＬＩＳＡ方法を用いた結果と１００％一致し、本発明のバイオチップが高い結果の再生性を有することが分かった。本発明によるバイオチップは高い遂行能力、高い感度、多い処理量及び高い正確性を有し、安価で測定可能であるために既存のＥＬＩＳＡ診断方法に代えうるものであることが分かった。また、既存の免疫診断よりも多量のタンパク質を固定化することにより既存の診断法よりも偽陽性を低減することができ、正確な肝炎診断を行うことができた。
【００６８】
また、本発明のバイオチップを用いて定量的な分析を行うことができるかどうかを調べるために、患者検体の連続した希釈によって検出限界及び定量範囲実験を行った（図６）。その結果、定量的な分布を示すことを確認した。この結果から、本発明によるバイオチップを用いる場合、既存の免疫診断法において測定できなかった定量的な分析も行うことができるということを確認することができた。
【００６９】
＜実施例３：ゴールドチップ基質を用いたバイオチップの製作及び分析＞
この実施例においてはＳＰＲｉシステムに用いられるゴールド（Ａｕ）チップを用いて実施例１の方法と同様にしてゴールドチップ基質に固定化されるゾル組成を見出した。ゴールドチップの場合、固定化されるゾル組成に添加剤として粘着剤（１０１０、１０２０；ＬＧ化学、大韓民国）を添加した。ゾル混合物はスポッティングされた後、ガラスのように透明で且つ気孔を有する物質から変形されるが、Ａｕにより表面がコーティングされたゴールドチップの上には固定化が起こらなかった。この実施例においては、ゴールドチップの表面にゾルスポットを固定するために添加剤を用い、用いたゾル混合物の組成はＴＭＯＳ１６．２〜１８．７重量部、ＭＴＭＳ３．７〜６．２重量部、ＧＰＴＭＯＳ１３．７〜１６．２重量部、粘着剤（１０１０、１０２０など）、０．０１〜２０重量部、１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びタンパク質溶液１２．５重量部であった。
【００７０】
１６．２〜１８．７重量部範囲を超えるＴＭＯＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＴＭＯＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。３．７〜６．２重量部範囲を超えるＭＴＭＳを含有する組成物の場合には気孔密度が低すぎ、気孔の孔径が小さくて標的物質の固定化率が低く、前記範囲未満のＭＴＭＳを含有する場合には気孔密度が高すぎ、孔径が大きくて標的物質が固定化できなかった。１３．７〜１６．２重量部を超えるＧＰＴＭＯＳを含有する組成物の場合にはスポットの吸着力が高くて非特異的な反応が頻繁に起こり、前記範囲未満のＧＰＴＭＯＳを含有する場合には気孔の孔径が大きくて標的物質の固定化が容易ではなかった。
【００７１】
前記混合物をゴールドチップの上に実施例２及び３の方法と同様にしてスポッティングした後、ｐ２４タンパク質に対するアッセイを行った。ゴールドチップアッセイと前記９６ウェルプレートに固定されたバイオチップのアッセイとの相違点は、抗体反応時に１次抗体反応を行い、蛍光標識された２次反応なしに結果を検出することができるということである。１次反応させたゴールドチップの結果はＳＰＲシステムを用いて反応時に発生する共鳴変化により測定してイメージ化することにより判読することができた（図７）。前記ゴールドチップは多量のタンパク質を固定化することができ、化学標識なしに直接的にタンパク質−タンパク質の結合を検出することができて高い感度を有する。
【００７２】
＜実施例４：半導体チップ上におけるスポットの固定化及び電気化学的検出＞
この実施例は電気化学的測定に用いられる半導体チップの両極の間に伝導性を有するゾル混合物を固定化してその間にできた反応前後の電気的な抵抗差を測定して反応をモニターリングするシステムに関する。用いた金属表面はシリコンウェーハであって電極に最も多用されるものであるが、表面が極めて均一で且つ平滑であるために従来は、表面処理なしに高分子物質を付着することが困難であった。しかしながら、実施例１の方法により電極に固定化されるゾル組成物をスクリーニングし、前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４を混合して半導体ウェーハの上に固定化した。
【００７３】
この実施例において用いられた半導体チップ用のゾル組成物の組成は、ＴＭＯＳ５〜３０重量部、ＭＴＭＳ２〜３５重量部、ＧＰＴＭＯＳ１〜１５重量部、粘着剤０．０１〜２０重量部１０ｍＭＨＣｌ１２．５重量部、蒸留水２３．７〜２４．５重量部、１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８）１２．５重量部、及びプローブ溶液１２．５重量部であった。
【００７４】
前記ゾル組成物とタンパク質ｐ２４が固定されている半導体チップを用いて反応前後の電気的な抵抗差を電気化学的な測定法により測定した結果、図８に示すように、感度がかなり向上しただけではなく、バックグラウンドのノイズの割合を低減できることを確認することができた。このため、この実施例による半導体チップは安価で且つ小型のバイオチップ分析システムの製作に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
以上述べたように、本発明は、表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法を提供する効果がある。また、本発明は、前記方法によりスクリーニングされたＰＭＭＡ基質、ゴールド及びシリコンウェーハ基質用のゾル組成物及び前記ゾル組成物を用いて製造されたゾル−ゲルバイオチップを提供する効果がある。本発明によるバイオチップはバイオアッセイに広く用いられる９６ウェルプレートに生体物質が含有されたゲル状のスポットを直接的に固定して既存の反応システム及び分析システムを利用することができ、便利で且つ経済的であり、固定された生体物質の変形が少なくて優れた分析結果が得られる。特に、蛍光分析の他にプローブのない分析方法を用いる場合、既存の分析方法の問題であった感度問題を３次元ゾル−ゲルスポットを強く結合することにより解決することができ、ＰＯＣＴなどの技術開発に有用であることが期待される。
【００７６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップ；
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップ；
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップ；及び
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップ；及び
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
【請求項２】
前記標識物質は抗原、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面処理されていない基質は高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項５】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載のゾル組成物。
【請求項６】
ＰＭＭＡ基質に請求項４又は５に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項７】
次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項８】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載のゾル組成物。
【請求項９】
前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とする請求項８に記載のゾル組成物。
【請求項１０】
ＰＭＭＡ基質に請求項７又は８に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１１】
前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴とする請求項１０に記載のゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１２】
次の成分を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項１３】
前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
【請求項１４】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
【請求項１５】
表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１６】
次の成分を含む、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；及び
プローブ溶液 １２．５重量部。
【請求項１７】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載のゾル組成物。
【請求項１８】
表面処理されていないシリコンウェーハに請求項１６又は１７に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１】
次のステップを含む表面処理されていない基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物のスクリーニング方法：
（ａ）テトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）及び３−アミノプロピールトリメトキシシリケート（３−ＡＴＭＳ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上のシリケート単量体、及びポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、ジグリセリルシラン（ＤＧＳ）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ−トリエトキシシリルプロピル）−Ｏ−ポリエチレンオキシドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール及び分子量１００〜１０，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれるいずれか１種以上の添加剤をバッファに種々の割合にて混合したゾル組成物の第１のライブラリーを得るステップ；
（ｂ）前記ゾル組成物の第１のライブラリーを表面処理されていない目的基質にスポッティングするステップ；
（ｃ）前記（ｂ）ステップにおいて形成されたスポットの接着性、外観、透過度及びゲル化にかかる時間を測定して、洗浄後にチップにより直接的に引っ掻いてもスポットが脱落することなく、１００〜８００μｍのスポット径を有しながらも元の形状を維持し、バックグラウンド未満の低い自己蛍光性を有し、チューブ内における４〜４８時間及び基質のスポットにおける１〜４時間のゲル化所要時間を有する組成物を選択してゾル組成物の第２のライブラリーを得るステップ；及び
（ｄ）前記得られたゾル組成物の第２のライブラリーにプローブを混合した後、表面処理されていない基質にスポッティングするステップ；及び
（ｅ）前記プローブに対するスポットの固定化率及びプローブと目的物質との間の特異性を測定して、プローブの固定化率が７０％以上であり、プローブと目的物質の特異シグナル／非特異シグナルの比が３倍以上であるゾル組成物を選択するステップ。
【請求項２】
前記標識物質は抗原、タンパク質、オリゴペプチド、核酸及び低分子物質、微生物、カビ及び漢方薬よりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記表面処理されていない基質は高分子プレート、金属、シリコンウェーハ、ガラス及びＬＣＤよりなる群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １７．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ５〜１５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜１５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項５】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項４に記載のゾル組成物。
【請求項６】
ＰＭＭＡ基質に請求項４又は５に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項７】
次の成分を含有する、ＰＭＭＡ基質にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ２２．５〜２５重量部；
ＭＴＭＳ ７．５〜１０重量部；
ＧＰＴＭＯＳ ２．５〜５重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項８】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載のゾル組成物。
【請求項９】
前記プローブはＨＣＶ抗原であることを特徴とする請求項８に記載のゾル組成物。
【請求項１０】
ＰＭＭＡ基質に請求項７又は８に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１１】
前記基質は９６ウェルプレートであることを特徴とする請求項１０に記載のゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１２】
次の成分を含有する、表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）にプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ １６．２〜１８．７重量部；
ＭＴＭＳ ３．７〜６．２重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １３．７〜１６．２重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １１〜１３重量部；及び
プローブ溶液 １０〜１５重量部。
【請求項１３】
前記粘着剤は１０１０及び／または１０２０であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
【請求項１４】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載のゾル組成物。
【請求項１５】
表面処理されていないゴールドチップ（Ａｕ）に請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【請求項１６】
次の成分を含む、表面処理されていないシリコンウェーハにプローブを固定するためのゾル−ゲルバイオチップ用のゾル組成物：
ＴＭＯＳ ５〜３０重量部；
ＭＴＭＳ ２〜３５重量部；
ＧＰＴＭＯＳ １〜１５重量部；
粘着剤 ０．０１〜２０重量部；
１０ｍＭＨＣｌ １２．５重量部；
蒸留水 ２３．７〜２４．５重量部；
１０ｍＭナトリウムフォスフェートバッファ（ｐＨ５．８） １２．５重量部；及び
プローブ溶液 １２．５重量部。
【請求項１７】
前記プローブはタンパク質であることを特徴とする請求項１６に記載のゾル組成物。
【請求項１８】
表面処理されていないシリコンウェーハに請求項１６又は１７に記載のゾル組成物が固定されていることを特徴とするゾル−ゲルバイオチップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５２４８１９（Ｐ２００９−５２４８１９Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５２２２３（Ｐ２００８−５５２２２３）
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８６６７１
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０８２２６２１８）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２３日（２００７．１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／０００３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８６６７１
【国際公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【出願人】（５０８２２６２１８）
【Ｆターム（参考）】
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