走査型電子顕微鏡を用いる生体物質アッセイシステムおよびアッセイ法
【課題】超高密度で高感度なオリゴヌクレオチドプローブチップ、プロテインチップなどのサブマイクロリットルの極微量試料での計測が可能な生体試料解析チップを提供する。
【解決手段】チップ上のプローブにハイブリダイズした試料を走査型電子顕微鏡の電子線でトレースして検出する。ナノ粒子を標識として用いることで高速でのスキャンを可能とする。各種プローブを固定しているエレメントのインデクシングを確実に行うため、各エレメント間にギャップを設けて各エレメントを隔離するとともに、エレメント間に形状の異なる識別標識を設けて、エレメントのインデクシングを行う。
【解決手段】チップ上のプローブにハイブリダイズした試料を走査型電子顕微鏡の電子線でトレースして検出する。ナノ粒子を標識として用いることで高速でのスキャンを可能とする。各種プローブを固定しているエレメントのインデクシングを確実に行うため、各エレメント間にギャップを設けて各エレメントを隔離するとともに、エレメント間に形状の異なる識別標識を設けて、エレメントのインデクシングを行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は種々の検査項目を一度に検査するプローブチップすなわち多項目センサーに関するもので、対象はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質で、とくに、最近注目を集めているＤＮＡ検査用のＤＮＡチップ等を使用した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による生体物質アッセイシステムおよびアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体をプローブ）としてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)），あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) ）などがある。
【０００４】
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面状に多数のプローブを、区画を区切り、アレー状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。
【０００５】
使用方法は、チップ基板上のプローブに蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどの試料ポリヌクレオチド（以下単に試料ポリヌクレオチド）をハイブリダイズさせて、基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接して試料ポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴを連結反応（ライゲーション）で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入する蛍光体を検出するのが主流である。
【０００６】
最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを補足した後、質量分析機で分析する方法、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。
【０００７】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。
【０００８】
高感度で定量的な検出を目的とした検出法としては、通常の顕微鏡検出が可能な７００μｍ程度の粒子を標識に用いて、反応した粒子数をカウンターでカウントして目的物質を定量検出するイムノアッセイの報告がある（非特許文献４：Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）。
【０００９】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)
【非特許文献４】Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現状のチップ技術、特にＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップでは、蛍光検出を用いることから、プローブを固定するエリア（以下、一つのプローブを固定する領域をエレメントと定義する）サイズに限界がある。すなわち、光を利用する限り、一般的に分解能は次の式（１）で表される大きさ（分解能）が限界となる。
【００１１】
【数１】
【００１２】
ここで媒質が空気なら開口数は０．８程度が限界である。したがって５３０ｎｍの光源を使用すると識別サイズとして４００ｎｍくらいが光を用いる検出限界となる。もちろん、蛍光検出であるから、蛍光強度が十分あれば、点光源としてより狭い範囲から発する光を検出することはできるし、ニアフィールド顕微鏡のように特殊な技術を用いればより狭い領域での光検出が可能になる。
【００１３】
しかし、このように狭い範囲からの蛍光を検出しようとすると、実際には光量を十分に取れないなど感度を確保することが難しくなる問題がある。また、あらかじめ決められた位置にプローブが固定されていると言っても、エレメントが小さくなると、検出しているのが、どのエレメントであるかのインデクシングを位置情報のみに頼らざるを得ず、隣接エレメントとの切り分けが難しくなる。たとえば、１００万のエレメントがあるとして、この内のたった１つのエレメントだけに試料ポリヌクレオチドがハイブリダイズしている極限状態を想定すると、あらかじめプローブをスポットした位置情報だけではエレメントの特定が実質困難となる。
【００１４】
このようなことから、従来技術では、エレメントの位置精度１μｍ、エレメントサイズ５μｍ×５μｍ、エレメントとエレメントの隙間５μｍ、エレメント数は１００万エレメント／チップ程度がほぼ限界となる。これは、現状の高分子の生体物質であるＤＮＡプローブをチップ上に作成するリソグラフィーの限界でもある。実用的にはこれよりも悪く、１エレメントのサイズは３０μｍ×３０μｍ程度が実情である。
【００１５】
さらに、光を用いる場合は励起光源と蛍光波長の関係から、多重標識を行う場合の制約が大きい。一般に、励起光源にコヒレントな光を用いても、得られる蛍光波長は数十ｎｍの波長分散になる。このために単一励起波長を用いる場合は４種類程度の蛍光体を励起し蛍光計測するのが限界である。複数の励起波長を用いても、実用的な５００〜７００ｎｍの範囲では６種程度の蛍光体しか利用できない。このため、蛍光法で同一エレメント内の複数の標的ポリヌクレオチドを検出する場合には４種程度が限界と考えられる。
【００１６】
ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレー）ではそもそも定量性が悪いため、一般にディファレンシャルハイブリダイゼーションとか競争ハイブリダイゼーションと呼ばれる技術を用いる場合がある。これは、２系統のサンプルＡとＢがあるときに、ＡとＢそれぞれに異なる波長の蛍光体をラベルし、両サンプルを混合する。混合状態で同一ＤＮＡチップに競争的にハイブリダイズさせると、両者の量比に応じて２種の蛍光体の強度比が検出される。この方法では、定量性が悪く、再現性に乏しいＤＮＡチップにおいても、とりあえずのデータを得ることができる。比較したいサンプルは通常数種類であることが多いが、より多数のサンプルをディファレンシャルハイブリダイゼーションに応用しようとすると、上記した励起光や蛍光の波長分散があるために、難しい。
【００１７】
さらに、一般に、分析デバイスにおいては、定量性、ダイナミックレンジ、再現性の確保が重要な項目となる。これらが一定の基準に達しない方法や装置に関しては、実用にならない。しかし、ＤＮＡチップに関しては、エレメント数が多すぎるのと、濃度の規定できる混合サンプルの入手が困難なため、ほとんど検討すらされていないのが現状である。
【００１８】
これらの問題点を解決するために、本発明では、より高密度で定量性と再現性が良好なポリヌクレオチドチップおよびプロテインチップを利用して効果的な検出方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明では、分解能に限界がある光検出に代えて、走査型電子顕微鏡を用いる。一般に、走査型電子顕微鏡は金属蒸着したＤＮＡ分子を１本鎖と２本鎖（直径約３ｎｍ）の状態で識別できる分解能があるが、高速でのスキャンを可能とするために、より検出しやすい導電性のナノ粒子を標識として用いて検出を行う。エレメントのインデクシングを確実に行うため、各エレメント間にギャップを設けてエレメント同士を隔離するとともに、エレメント間に形状の異なる識別標識を設ける。導電性のナノ粒子、例えば、金微粒子は５〜５０ｎｍ程度の範囲で、粒度分布１０％で製造可能なので、このようなナノ粒子をラベルにして走査型電子顕微鏡で１０段程度の粒度分布の粒子群を同時に反応させて識別させる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、走査型電子顕微鏡でのスキャン中に、エレメントを識別しながらプローブに捕捉されたオリゴヌクレオチド断片の検出を逐次できるようになる。したがって、エレメントを高密度に配しても、確実にエレメントのインデクシングと試料標的物質の検出ができるようになる。このため、１エレメントのサイズは７００ｎｍφ程度以下にでき、１００万エレメント程度のチップであれば、１ｍｍ２程度に収めることが可能となる。これは面積比にして従来法の２桁を上回るエレメント密度である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例１）
図１は本発明の実施に好適なＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図である。チップ１００は酸化膜表面を有するシリコン基板１０１に形成される。各エレメント１は７００ｎｍφの円柱の形をしている。各エレメントの間隔２は３００ｎｍである。すなわち、エレメントは１μｍピッチで並んでいる。エレメントは５０×５０の単位で、一転鎖線３で囲って示すように、ひとつのエレメントグループをなしており、各エレメントグループ３は２０×２０個整列して、設けられている。各エレメントグループ３間には幅４０ｎｍ、深さ２０ｎｍの溝５が存在し、エレメントグループ内の各エレメントの４隅にはインデクシング用のピラー４が設けてある。隣接するエレメント間のピラー４はそれぞれのエレメントで共用される。ピラー４は円筒形で径が最低５０ｎｍφから１０ｎｍごとに１７段、高さが５ｎｍから１０ｎｍごとに１７段の組み合わせのものを各エレメントの４隅のピラー４をバーコードのようにインデクシングに用いる。よって１エレメントグループ３内に９回同じピラー４が出現するが、同一サイズのピラー４が連続して出現しない様に、なおかつ、ピラー４のサイズがなるべくランダムになるように配列してある。
【００２２】
図２は図１で説明した基板１０１上の各エレメント１とピラー４とのより詳細な関係と、各エレメント１上に固着されたＤＮＡプローブ２１，２２，---と、これにハイブリダイズしたＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３と、これを検出する走査型電子顕微鏡３００との関係を模式的に示す図である。走査型電子顕微鏡３００は、電子銃３００−１、集束レンズ３００−２、走査コイル３００−３、検出器３００−６などからなる。電子銃から発せられた電子線３００−４の電子は試料検体（ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３に結合されている金微粒子）に衝突し、試料検体は２次電子３００−５を放出する。この２次電子を検出器３００−６が捕える。基板１０１上の各エレメント１は、基板１０１の面より一段高い構造となっている。すなわちエレメント間は溝のように落ち込んでおりエレメント同士の境界をなしている。エレメント１の高さは２０ｎｍである。ＤＮＡプローブ等については、後述する。
【００２３】
各エレメントの４隅に設けられたピラー４は、インデクシングの目的以外にも、プローブハイブリダイゼーションの速度を速めるために使用される。図３（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図であり、図４は、図３による効果の詳細な説明図である。
【００２４】
図３（ａ）示すように、ＤＮＡチップ１００の基板１０１のエレメント１の上面に、矢印１０３に示すように、往復運動が可能な上面プレート１０２を１００μｍのギャップで設置するとともに、上面プレート１０２と基板１０１との間に１μｌの試料溶液を挟み込む。図３（ｂ）示すように、上面プレート１０２を基板１０１に対して、矢印の方に移動させる。次いで、図３（ｃ）示すように、上面プレート１０２を基板１０１に対して、反対の矢印の方に移動させる。上面プレート１０２の往復運動を１Ｈｚで行わせる。一般にこのようなマイクロデバイスでは液が層流になりやすく攪拌効率が落ちるが、基板１０１上面のプレート１０２を往復運動させることで層流が乱されてハイブリダイゼーションが促進される。図４は、隣接するエレメント１の中心位置で見た断面であり、エレメント１の中心位置の向こう側にピラー４が見える状態を示す。基板１０１に対して、上面プレート１０２を矢印１０３のように往復運動させると平面方向の液の移動が１０５，１０６のように、往復運動に応じて強制されるので、ハイブリダイゼーションは溶質（ここではＤＮＡ試料や標識プローブ）の厚み方向の拡散のみが律速になることが判っている（例えば、特開２００４−１４４５２１）。よって各エレメント１の表面で常にサンプル溶液が入れ替わることとなり、反応が促進される。更に本発明では各エレメント１間に実質的にランダムなピラー４が立っているので、平面方向に強制移動させられる液が障害物であるピラー４により、より効果的に攪拌され、更に反応が促進される。このため、ハイブリダイゼーションの速度が実質液層での反応速度に近づく。
【００２５】
再び、図２を参照して、７００ｎｍφ、高さ２０ｎｍの円柱の構造の各エレメント１の上面には、エレメントごとに、それぞれ、異なるＤＮＡプローブ２１，２２……が固定されている。ここで使用するＤＮＡプローブはＰＮＡである。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。このため、ハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。特にＤＮＡチップのようにエレメントの固相表面上にプローブが高密度に固定されているケースで通常のＤＮＡプローブを用いると、マイナス荷電のバリアーを超えて標的ＤＮＡがプローブに接近する必要があり、反応速度論的にも熱力学的に見ても不利になる。また、試料ＤＮＡは必ず１本鎖にする必要がある。ＰＮＡのようにマイナス荷電を持たないプローブを用いることで、エレメント表面の電荷をなくすことができるので、ハイブリダイゼーションの速度と収率が向上する。さらに、ＰＮＡの電荷を持たない特性は、静電的な反発力を生じないので、標的ＤＮＡが２本鎖であっても競争的に２本鎖にもぐりこみ競争的にハイブリダイゼーションすることができる。
【００２６】
実施例１においては、各エレメント１には、ＤＮＡプローブ２１，２２……として、ヒトのｃＤＮＡの第１エキソンと第２キクソンにまたがる領域の配列で長さが４５から６０塩基のものを固定している。これにより、残存ゲノムがハイブリダイズすることによる擬陽性やハイブリダイゼーション席の低下を防いでいる。プローブ固定法は、定法に従いシランカップリング反応で固定する。ここでの実施条件、すなわち緩衝液組成、試料ＤＮＡプローブに関してはNucleic Acids Research (2002) 30, No.16 e87記載のハイブリダイゼーション方法に従う。プローブ固定法に関しては、上記文献に従い、酸化表面を持つシリコン基板１０１を３−アミノプロピルトリメトキシシランで処理し表面にアミノ基を導入する。表面に導入したアミノ基とプローブのＳＨ基の間をＮ−（１１−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｘｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅで架橋する。この方法で５０塩基前後のプローブを固定するとプローブ固定密度がおおよそ１５ｎｍ２に１分子になる。よって、エレメントあたり約２５０００プローブ分子が固定されている。
【００２７】
試料としては、ヒト白血球由来のｍＲＮＡを一回逆転写して得られる１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを用いる。一般に完全長ｃＤＮＡをとるときにはオリゴキャップ法などを用いるが、ここでは細胞内のあるがままのｍＲＮＡ量を知りたいので、細胞を少量ずつ液体ヘリウムに滴下して得る瞬間凍結細胞を液体ヘリウムごと超音波攪拌しているフェノールに滴下懸濁し、瞬時に細胞破壊する方法をとる。定法に従いトータルＲＮＡを精製する。おおよそ１０細胞に含まれるＲＮＡに対して逆転写酵素を働かせ１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る。
【００２８】
このようにして得る１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ を１μｌの２×ＳＳＣに溶解してＤＮＡチップに滴下する。この状態では、レアーな１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡは１０２分子程度、アバンダントなもので１０５分子程度含まれるので、チップ表面のプローブ数とオーダー的にはマッチする。
【００２９】
４５℃で１時間、図３，４に示す方法に従い攪拌し、ハイブリダイゼーションを完了させる。この後、図３、図４で説明した攪拌用の上面プレート１０２は取り除き、乾燥させる。実施例１ではＰＮＡプローブを用いるため、通常のＤＮＡチップ反応条件のように高塩濃度の条件にする必要は必ずしも無い。塩によるＤＮＡプローブと試料ＤＮＡのマイナス電荷を遮蔽する必要が無いからである。むしろ、低めのイオン強度のほうが良い結果が得られる。
【００３０】
実施例１では１本鎖状態の１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを用いているが、２本鎖ＤＮＡのままでもハイブリダイゼーションを行うことができる。この場合はあまりイオン強度をあげないほうが試料２本鎖ＤＮＡ自身のマイナス荷電による反発力で解離しやすくなるし、プローブはマイナス荷電を持たないので問題なくハイブリできる。ただし、基本的に２本鎖ＤＮＡ同士のまき戻しとプローブのハイブリダイゼーションの競争反応になるので１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションのときに比べるとハイブリダイゼーションの収率は低下する。
【００３１】
実施例１では、ＰＮＡプローブを用いているのと、攪拌を十分行うことにより、固相表面でも高速にハイブリダイゼーションが完了する。従来技術である通常のＤＮＡプローブを用いると、主に静電的反発力のために、上述したサンプル濃度とプローブ量では２４時間反応させても反応効率が悪く、反応が完結しない。
【００３２】
図２に、エレメント１上のプローブ２１に、試料ＤＮＡ断片２０１が、ハイブリダイズした状態を示す。
【００３３】
次に、プローブ２１にハイブリダイズした試料ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３のＤＮＡ断片に相補で異なる配列部分を識別するために、試料ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３に、金ナノ粒子２３’、２４’、２５’で標識した第２のプローブをハイブリダイズさせる。このときの第２のプローブには、エレメント１上の捕捉用プローブ２１に用いるエキソンとは異なるエキソンを用いる。たとえば、エキソン３とエキソン４とエキソン５の配列に対応するＰＮＡプローブを準備する。各プローブ長は３０〜５０塩基からなる。各プローブは合成時に５’末端にスルフィッド基（ＳＨ基）を導入しておく。エキソン３とエキソン４とエキソン５のプローブに対応してそれぞれ８．３ｎｍ、１１ｎｍ、１７ｎｍの金ナノ粒子を混合し、それぞれ粒径の異なる金ナノ粒子で標識されたＰＮＡプローブを得る。上記３種類の金ナノ粒子標識プローブ（２３’、２４’、２５’）を１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で混合し、試料ＤＮＡがハイブリダイズしたＤＮＡチップに滴下し、再度、図３、図４の方法で１５分間攪拌する。
【００３４】
２×ＳＳＣで洗浄後、図３、図４で説明した攪拌用の上面プレート１０２は取り除き、乾燥させる。この後、走査型電子顕微鏡３００の電子線３００−４でチップ１００表面を２次元スキャンする。
【００３５】
図５は、図１に示すチップ１００を走査型電子顕微鏡３００の電子線３００−４で２次元的にスキャンしながら得られた電子顕微鏡像を模式的に示す図である。１１，１２は、図１で説明したエレメント１に対応するエレメントである。４１，４２，---，４６はエレメント１１，１２の４隅に配置された、図１で説明したピラー４に対応する、サイズの異なるピラーである。５１，５２および５３は、８．３ｎｍ、１１ｎｍおよび１７ｎｍの金ナノ粒子である。金ナノ粒子は、参照符号を付したもの以外にも存在するが、図に示すに留める。電子顕微鏡像は、電子線が照射された時に二次電子を放出するもの以外は、像として表れない。従って、本発明による電子顕微鏡像は、プローブとこれにハイブリダイズしたＤＮＡ断片やハイブリダイゼーションバッファーに含まれる高分子や塩は、電子顕微鏡像に表れず、ピラー、エレメントおよび金ナノ粒子の像のみが得られる。
【００３６】
（実施例２）
図６（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果の他の例について説明する全体図であり、図７は、図６による効果の詳細な説明図である。
【００３７】
図６（ａ），（ｂ），（ｃ）と図３（ａ），（ｂ），（ｃ）とを対比して明らかなように、実施例２では、ＤＮＡチップ１００の基板１０１上の上面プレート１０２に代えて、上面に直径１００μｍの回転するロッド１２０が設けられる点において異なるのみである。ロッド１２０は基板１０１上のサンプル溶液１２２と接した状態で、２００ｒｐｍで回転することができる。ロッド１２０とチップエレメントのギャップは１００μｍである。ロッドの回転はスピンドルモーター、左右の移動はステージに乗せたチップを左右に１０秒間に１回の割合で移動させる。サンプル溶液或いは、ナノ粒子標識プローブ溶液１μｌを基板１０１上に滴下して、ロッド１２０を回転運動させながら、図６（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、左から右に移動させ、さらに、必要なら、右から左に移動させる（矢印１２９）。ロッド１２０を回転させることで平面方向の液の移動が、太線１１５，１２５に示すように、強制されるので、基板１０１上で溶質が十分攪拌される。よって、各エレメント１の表面で常にサンプル溶液が入れ替わることとなり、ハイブリダイゼーションが促進される。さらに、実施例２でも、エレメント１間に実質的にサイズがランダムなピラー４が立っているので、平面方向に強制移動させられる溶液が、障害物であるピラー４により、液流に乱れが生じて攪拌され、更に反応が促進される。実施例２では、ロッド１２０の回転と移動の相互作用により、ハイブリダイゼーション用の反応液がチップのエレメント上で十分攪拌される。
【００３８】
本発明のチップの大きさについて説明する。一般に光を用いて物体を認識しようとすると、上述した式（１）、開口数０．８の例では、４００〜５００ｎｍ以下のものは検出できない。これ以下では、物体を認識すらできない。実際に物体の生きまで規定しようとすると実用的には７００ｎｍ程度が限界となる。
【００３９】
本発明では電子線照射による二次電子を検出することで物質を検出するので、波長に依存せずに物質を測定できる。このため、エレメント１或いはエレメント間隔が７００ｎｍ以下のサイズであっても、エレメント１そのものとエレメント１の区切りを検出することができる。実施例１ではエレメント１のサイズをエレメントが７００ｎｍφとし、エレメント間隔を３００ｎｍの例を示しているが、より微細な構造のエレメント１あるいはエレメント間隔であっても良い。例えば、エレメント１が５００ｎｍ以下、或いはエレメント間隔が３００ｎｍ以下でも、エレメント１の上にハイブリダイゼーション反応で捕捉した８．３ｎｍの金ナノ粒子は走査型電子顕微鏡で定量検出できる。
【００４０】
エレメント１やエレメント間隔の下限について検討すると、以下の理由により７０ｎｍが下限である。即ち、５０塩基前後のプローブを固定するとプローブ固定密度がおおよそ１５ｎｍ２に１分子になることは上述したとおりである。一方、検出に用いるナノ粒子サイズの下限は、現状技術で一般的に入手可能なものとして５ｎｍであるので、プローブ固定密度とほぼ等しい値となり、これが下限を表わす一つの判断基準になる。実際には、エレメント１上に粒子が最低１０００粒子無いと定量検出の観点からは問題となる。即ちエレメント１のサイズ下限は１５×１０００ｎｍ２とになる。よって円形のエレメント１のサイズの直径下限は７０ｎｍとなる。もちろん定量性を問題にしないのであれば、より小さいエレメントでも利用可能で、この場合はプローブを固定したときのプローブ１分子が閉める領域が限界となる。すなわち、３ｎｍがエレメントの最小単位である。
【００４１】
（実施例３）
アフィニティー精製ポリクローナル抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体を、異なるエレメントに固定したプロテインチップを得る。これとは別に、同じ抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）２断片にＳＨ基を導入する。挿入されるＳＨ基はＦ（ａｂ’）２１分子あたり３〜４分子である。２０ｎｍの金ナノ粒子と混合し、表面にＦ（ａｂ’）２が結合した粒子を得る。試料として１ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＡＦＰ単独、５ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＣＥＡ単独、何も入っていないコントロールを用意する。溶媒は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）である。プロテインチップに各溶液を反応させ、さらに金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）２を反応させる。反応時間は最初の試料反応が５分間、金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）２の反応が５分間である。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含む緩衝液で洗浄し、ＳＥＭで検出する。
【００４２】
ＡＦＰを反応させたチップでは抗ＡＦＰ抗体の結合しているエレメントに１２０粒子／エレメント、抗ＣＥＡ抗体を固定しているエレメントでは６粒子／エレメントが検出される。ＣＥＡを反応させたチップでは抗ＡＦＰ抗体の結合しているエレメントに７粒子／エレメント、抗ＣＥＡ抗体を固定しているエレメントでは１３４０粒子／エレメントが検出される。
【００４３】
コントロール溶液ではチップ上のいずれのエレメントにも２〜４粒子／エレメントの金ナノ粒子しか検出されない。
【００４４】
本発明は、上述したように、いくつかの実施例の形で実施できるが、いずれの場合でも、ハイブリダイズした試料ＤＮＡなどを実質的に１分子ごとに検出することになるので、感度的には従来法を凌駕する感度が得られる。極微量体積で極微量ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となるので、従来は不可能であったＰＣＲによる前処理増幅無しでの標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となる。検出に標識粒子の大きさや形状を変えることができるので、６種以上１０種程度の異なるサンプルを同一エレメントでマルチ解析できるようになる。この技術により従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションへの利用のほか、同一プローブでエレメントにサンプルポリヌクレオチドを捕捉し、異なる標識プローブで検出する使い方ができるようになる。本発明のマルチ解析技術により、オルターナティブスプライシングの検出や、複数ＳＮＰのタイピングがひとつのエレメントで行えるようになるメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例１のＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図。
【図２】図１で説明した基板１０１上の各エレメント１とピラー４とのより詳細な関係と、各エレメント１上に固着されたＤＮＡプローブ２１，２２，---と、これにハイブリダイズしたＤＮＡ断片２０１と、これを検出する走査型電子顕微鏡３００との関係を模式的に示す図。
【図３】（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図。
【図４】図３による効果の詳細な説明図。
【図５】図１に示すチップ１００を走査型電子顕微鏡で２次元的にスキャンしながら得られた走査型電子顕微鏡像を模式的に示す図。
【図６】（ａ），（ｂ），（ｃ）は実施例２のピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図。
【図７】図６による効果の詳細な説明図。
【符号の説明】
【００４６】
１…エレメント、２…エレメントの間隔、３…エレメントグループ、４…ピラー、５…溝、６…、２１，２２…ＤＮＡプローブ、２３’，２４’，２５’…金ナノ粒子、５０…細胞分離用チップ、５１…試料導入部、６０…走査型電子顕微鏡、１００…チップ、１０１…シリコン基板、１０２…上面プレート、１２１…ロッド、２０１…ＤＮＡ断片。
【技術分野】
【０００１】
本発明は種々の検査項目を一度に検査するプローブチップすなわち多項目センサーに関するもので、対象はＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質で、とくに、最近注目を集めているＤＮＡ検査用のＤＮＡチップ等を使用した走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による生体物質アッセイシステムおよびアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。あるいは、最近では種々のタンパク質（一般的には抗体をプローブ）としてアレー状に固定したプロテインチップが用いられるようになっている。
【０００３】
ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに設計された配列のオリゴマーを一塩基づつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)），あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) ）などがある。
【０００４】
これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面状に多数のプローブを、区画を区切り、アレー状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。
【０００５】
使用方法は、チップ基板上のプローブに蛍光標識したＤＮＡ断片やｍＲＮＡやこれを逆転写したｃＤＮＡなどの試料ポリヌクレオチド（以下単に試料ポリヌクレオチド）をハイブリダイズさせて、基板上に導入される蛍光体を蛍光スキャナーで検出する。あるいは、試料ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせた後に、プローブと隣接して試料ポリヌクレオチドに相補な蛍光標識オリゴを連結反応（ライゲーション）で連結したり、ＤＮＡポリメラーゼを用いて蛍光標識ｄＮＴＰ基質を反応させたりして、基板上に導入する蛍光体を検出するのが主流である。
【０００６】
最近では、酸化還元反応を利用した電気化学的な検出を行う方法も実用になっている。タンパク質の場合は抗原抗体反応のようなアフィニティー反応を利用して、基板上に特定タンパク質などを補足した後、質量分析機で分析する方法、蛍光標識抗体や酵素標識抗体でサンドイッチ反応をおこない、基板上に残る蛍光体や酵素活性を検出する方法、電気化学発光を用いる検出法がある。
【０００７】
電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。
【０００８】
高感度で定量的な検出を目的とした検出法としては、通常の顕微鏡検出が可能な７００μｍ程度の粒子を標識に用いて、反応した粒子数をカウンターでカウントして目的物質を定量検出するイムノアッセイの報告がある（非特許文献４：Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）。
【０００９】
【非特許文献１】Science 251, 767-773(1991)
【非特許文献２】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)
【非特許文献３】Clin. Chem., 37, 1534-1539 (19991)
【非特許文献４】Anal. Biochem. 202, 120-125 (1992)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
現状のチップ技術、特にＤＮＡプローブアレーあるいはＤＮＡチップでは、蛍光検出を用いることから、プローブを固定するエリア（以下、一つのプローブを固定する領域をエレメントと定義する）サイズに限界がある。すなわち、光を利用する限り、一般的に分解能は次の式（１）で表される大きさ（分解能）が限界となる。
【００１１】
【数１】
【００１２】
ここで媒質が空気なら開口数は０．８程度が限界である。したがって５３０ｎｍの光源を使用すると識別サイズとして４００ｎｍくらいが光を用いる検出限界となる。もちろん、蛍光検出であるから、蛍光強度が十分あれば、点光源としてより狭い範囲から発する光を検出することはできるし、ニアフィールド顕微鏡のように特殊な技術を用いればより狭い領域での光検出が可能になる。
【００１３】
しかし、このように狭い範囲からの蛍光を検出しようとすると、実際には光量を十分に取れないなど感度を確保することが難しくなる問題がある。また、あらかじめ決められた位置にプローブが固定されていると言っても、エレメントが小さくなると、検出しているのが、どのエレメントであるかのインデクシングを位置情報のみに頼らざるを得ず、隣接エレメントとの切り分けが難しくなる。たとえば、１００万のエレメントがあるとして、この内のたった１つのエレメントだけに試料ポリヌクレオチドがハイブリダイズしている極限状態を想定すると、あらかじめプローブをスポットした位置情報だけではエレメントの特定が実質困難となる。
【００１４】
このようなことから、従来技術では、エレメントの位置精度１μｍ、エレメントサイズ５μｍ×５μｍ、エレメントとエレメントの隙間５μｍ、エレメント数は１００万エレメント／チップ程度がほぼ限界となる。これは、現状の高分子の生体物質であるＤＮＡプローブをチップ上に作成するリソグラフィーの限界でもある。実用的にはこれよりも悪く、１エレメントのサイズは３０μｍ×３０μｍ程度が実情である。
【００１５】
さらに、光を用いる場合は励起光源と蛍光波長の関係から、多重標識を行う場合の制約が大きい。一般に、励起光源にコヒレントな光を用いても、得られる蛍光波長は数十ｎｍの波長分散になる。このために単一励起波長を用いる場合は４種類程度の蛍光体を励起し蛍光計測するのが限界である。複数の励起波長を用いても、実用的な５００〜７００ｎｍの範囲では６種程度の蛍光体しか利用できない。このため、蛍光法で同一エレメント内の複数の標的ポリヌクレオチドを検出する場合には４種程度が限界と考えられる。
【００１６】
ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレー）ではそもそも定量性が悪いため、一般にディファレンシャルハイブリダイゼーションとか競争ハイブリダイゼーションと呼ばれる技術を用いる場合がある。これは、２系統のサンプルＡとＢがあるときに、ＡとＢそれぞれに異なる波長の蛍光体をラベルし、両サンプルを混合する。混合状態で同一ＤＮＡチップに競争的にハイブリダイズさせると、両者の量比に応じて２種の蛍光体の強度比が検出される。この方法では、定量性が悪く、再現性に乏しいＤＮＡチップにおいても、とりあえずのデータを得ることができる。比較したいサンプルは通常数種類であることが多いが、より多数のサンプルをディファレンシャルハイブリダイゼーションに応用しようとすると、上記した励起光や蛍光の波長分散があるために、難しい。
【００１７】
さらに、一般に、分析デバイスにおいては、定量性、ダイナミックレンジ、再現性の確保が重要な項目となる。これらが一定の基準に達しない方法や装置に関しては、実用にならない。しかし、ＤＮＡチップに関しては、エレメント数が多すぎるのと、濃度の規定できる混合サンプルの入手が困難なため、ほとんど検討すらされていないのが現状である。
【００１８】
これらの問題点を解決するために、本発明では、より高密度で定量性と再現性が良好なポリヌクレオチドチップおよびプロテインチップを利用して効果的な検出方法を提案する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明では、分解能に限界がある光検出に代えて、走査型電子顕微鏡を用いる。一般に、走査型電子顕微鏡は金属蒸着したＤＮＡ分子を１本鎖と２本鎖（直径約３ｎｍ）の状態で識別できる分解能があるが、高速でのスキャンを可能とするために、より検出しやすい導電性のナノ粒子を標識として用いて検出を行う。エレメントのインデクシングを確実に行うため、各エレメント間にギャップを設けてエレメント同士を隔離するとともに、エレメント間に形状の異なる識別標識を設ける。導電性のナノ粒子、例えば、金微粒子は５〜５０ｎｍ程度の範囲で、粒度分布１０％で製造可能なので、このようなナノ粒子をラベルにして走査型電子顕微鏡で１０段程度の粒度分布の粒子群を同時に反応させて識別させる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、走査型電子顕微鏡でのスキャン中に、エレメントを識別しながらプローブに捕捉されたオリゴヌクレオチド断片の検出を逐次できるようになる。したがって、エレメントを高密度に配しても、確実にエレメントのインデクシングと試料標的物質の検出ができるようになる。このため、１エレメントのサイズは７００ｎｍφ程度以下にでき、１００万エレメント程度のチップであれば、１ｍｍ２程度に収めることが可能となる。これは面積比にして従来法の２桁を上回るエレメント密度である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（実施例１）
図１は本発明の実施に好適なＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図である。チップ１００は酸化膜表面を有するシリコン基板１０１に形成される。各エレメント１は７００ｎｍφの円柱の形をしている。各エレメントの間隔２は３００ｎｍである。すなわち、エレメントは１μｍピッチで並んでいる。エレメントは５０×５０の単位で、一転鎖線３で囲って示すように、ひとつのエレメントグループをなしており、各エレメントグループ３は２０×２０個整列して、設けられている。各エレメントグループ３間には幅４０ｎｍ、深さ２０ｎｍの溝５が存在し、エレメントグループ内の各エレメントの４隅にはインデクシング用のピラー４が設けてある。隣接するエレメント間のピラー４はそれぞれのエレメントで共用される。ピラー４は円筒形で径が最低５０ｎｍφから１０ｎｍごとに１７段、高さが５ｎｍから１０ｎｍごとに１７段の組み合わせのものを各エレメントの４隅のピラー４をバーコードのようにインデクシングに用いる。よって１エレメントグループ３内に９回同じピラー４が出現するが、同一サイズのピラー４が連続して出現しない様に、なおかつ、ピラー４のサイズがなるべくランダムになるように配列してある。
【００２２】
図２は図１で説明した基板１０１上の各エレメント１とピラー４とのより詳細な関係と、各エレメント１上に固着されたＤＮＡプローブ２１，２２，---と、これにハイブリダイズしたＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３と、これを検出する走査型電子顕微鏡３００との関係を模式的に示す図である。走査型電子顕微鏡３００は、電子銃３００−１、集束レンズ３００−２、走査コイル３００−３、検出器３００−６などからなる。電子銃から発せられた電子線３００−４の電子は試料検体（ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３に結合されている金微粒子）に衝突し、試料検体は２次電子３００−５を放出する。この２次電子を検出器３００−６が捕える。基板１０１上の各エレメント１は、基板１０１の面より一段高い構造となっている。すなわちエレメント間は溝のように落ち込んでおりエレメント同士の境界をなしている。エレメント１の高さは２０ｎｍである。ＤＮＡプローブ等については、後述する。
【００２３】
各エレメントの４隅に設けられたピラー４は、インデクシングの目的以外にも、プローブハイブリダイゼーションの速度を速めるために使用される。図３（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図であり、図４は、図３による効果の詳細な説明図である。
【００２４】
図３（ａ）示すように、ＤＮＡチップ１００の基板１０１のエレメント１の上面に、矢印１０３に示すように、往復運動が可能な上面プレート１０２を１００μｍのギャップで設置するとともに、上面プレート１０２と基板１０１との間に１μｌの試料溶液を挟み込む。図３（ｂ）示すように、上面プレート１０２を基板１０１に対して、矢印の方に移動させる。次いで、図３（ｃ）示すように、上面プレート１０２を基板１０１に対して、反対の矢印の方に移動させる。上面プレート１０２の往復運動を１Ｈｚで行わせる。一般にこのようなマイクロデバイスでは液が層流になりやすく攪拌効率が落ちるが、基板１０１上面のプレート１０２を往復運動させることで層流が乱されてハイブリダイゼーションが促進される。図４は、隣接するエレメント１の中心位置で見た断面であり、エレメント１の中心位置の向こう側にピラー４が見える状態を示す。基板１０１に対して、上面プレート１０２を矢印１０３のように往復運動させると平面方向の液の移動が１０５，１０６のように、往復運動に応じて強制されるので、ハイブリダイゼーションは溶質（ここではＤＮＡ試料や標識プローブ）の厚み方向の拡散のみが律速になることが判っている（例えば、特開２００４−１４４５２１）。よって各エレメント１の表面で常にサンプル溶液が入れ替わることとなり、反応が促進される。更に本発明では各エレメント１間に実質的にランダムなピラー４が立っているので、平面方向に強制移動させられる液が障害物であるピラー４により、より効果的に攪拌され、更に反応が促進される。このため、ハイブリダイゼーションの速度が実質液層での反応速度に近づく。
【００２５】
再び、図２を参照して、７００ｎｍφ、高さ２０ｎｍの円柱の構造の各エレメント１の上面には、エレメントごとに、それぞれ、異なるＤＮＡプローブ２１，２２……が固定されている。ここで使用するＤＮＡプローブはＰＮＡである。ＰＮＡは通常のＤＮＡのようにリン酸ジエステル結合に由来するマイナス荷電を持たないので、標的となるＤＮＡとの間に静電的反発力が働かない。このため、ハイブリダイゼーションの効率が高くなる効果がある。特にＤＮＡチップのようにエレメントの固相表面上にプローブが高密度に固定されているケースで通常のＤＮＡプローブを用いると、マイナス荷電のバリアーを超えて標的ＤＮＡがプローブに接近する必要があり、反応速度論的にも熱力学的に見ても不利になる。また、試料ＤＮＡは必ず１本鎖にする必要がある。ＰＮＡのようにマイナス荷電を持たないプローブを用いることで、エレメント表面の電荷をなくすことができるので、ハイブリダイゼーションの速度と収率が向上する。さらに、ＰＮＡの電荷を持たない特性は、静電的な反発力を生じないので、標的ＤＮＡが２本鎖であっても競争的に２本鎖にもぐりこみ競争的にハイブリダイゼーションすることができる。
【００２６】
実施例１においては、各エレメント１には、ＤＮＡプローブ２１，２２……として、ヒトのｃＤＮＡの第１エキソンと第２キクソンにまたがる領域の配列で長さが４５から６０塩基のものを固定している。これにより、残存ゲノムがハイブリダイズすることによる擬陽性やハイブリダイゼーション席の低下を防いでいる。プローブ固定法は、定法に従いシランカップリング反応で固定する。ここでの実施条件、すなわち緩衝液組成、試料ＤＮＡプローブに関してはNucleic Acids Research (2002) 30, No.16 e87記載のハイブリダイゼーション方法に従う。プローブ固定法に関しては、上記文献に従い、酸化表面を持つシリコン基板１０１を３−アミノプロピルトリメトキシシランで処理し表面にアミノ基を導入する。表面に導入したアミノ基とプローブのＳＨ基の間をＮ−（１１−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｘｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅで架橋する。この方法で５０塩基前後のプローブを固定するとプローブ固定密度がおおよそ１５ｎｍ２に１分子になる。よって、エレメントあたり約２５０００プローブ分子が固定されている。
【００２７】
試料としては、ヒト白血球由来のｍＲＮＡを一回逆転写して得られる１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを用いる。一般に完全長ｃＤＮＡをとるときにはオリゴキャップ法などを用いるが、ここでは細胞内のあるがままのｍＲＮＡ量を知りたいので、細胞を少量ずつ液体ヘリウムに滴下して得る瞬間凍結細胞を液体ヘリウムごと超音波攪拌しているフェノールに滴下懸濁し、瞬時に細胞破壊する方法をとる。定法に従いトータルＲＮＡを精製する。おおよそ１０細胞に含まれるＲＮＡに対して逆転写酵素を働かせ１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを得る。
【００２８】
このようにして得る１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ を１μｌの２×ＳＳＣに溶解してＤＮＡチップに滴下する。この状態では、レアーな１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡは１０２分子程度、アバンダントなもので１０５分子程度含まれるので、チップ表面のプローブ数とオーダー的にはマッチする。
【００２９】
４５℃で１時間、図３，４に示す方法に従い攪拌し、ハイブリダイゼーションを完了させる。この後、図３、図４で説明した攪拌用の上面プレート１０２は取り除き、乾燥させる。実施例１ではＰＮＡプローブを用いるため、通常のＤＮＡチップ反応条件のように高塩濃度の条件にする必要は必ずしも無い。塩によるＤＮＡプローブと試料ＤＮＡのマイナス電荷を遮蔽する必要が無いからである。むしろ、低めのイオン強度のほうが良い結果が得られる。
【００３０】
実施例１では１本鎖状態の１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを用いているが、２本鎖ＤＮＡのままでもハイブリダイゼーションを行うことができる。この場合はあまりイオン強度をあげないほうが試料２本鎖ＤＮＡ自身のマイナス荷電による反発力で解離しやすくなるし、プローブはマイナス荷電を持たないので問題なくハイブリできる。ただし、基本的に２本鎖ＤＮＡ同士のまき戻しとプローブのハイブリダイゼーションの競争反応になるので１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションのときに比べるとハイブリダイゼーションの収率は低下する。
【００３１】
実施例１では、ＰＮＡプローブを用いているのと、攪拌を十分行うことにより、固相表面でも高速にハイブリダイゼーションが完了する。従来技術である通常のＤＮＡプローブを用いると、主に静電的反発力のために、上述したサンプル濃度とプローブ量では２４時間反応させても反応効率が悪く、反応が完結しない。
【００３２】
図２に、エレメント１上のプローブ２１に、試料ＤＮＡ断片２０１が、ハイブリダイズした状態を示す。
【００３３】
次に、プローブ２１にハイブリダイズした試料ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３のＤＮＡ断片に相補で異なる配列部分を識別するために、試料ＤＮＡ断片２０１，２０２，２０３に、金ナノ粒子２３’、２４’、２５’で標識した第２のプローブをハイブリダイズさせる。このときの第２のプローブには、エレメント１上の捕捉用プローブ２１に用いるエキソンとは異なるエキソンを用いる。たとえば、エキソン３とエキソン４とエキソン５の配列に対応するＰＮＡプローブを準備する。各プローブ長は３０〜５０塩基からなる。各プローブは合成時に５’末端にスルフィッド基（ＳＨ基）を導入しておく。エキソン３とエキソン４とエキソン５のプローブに対応してそれぞれ８．３ｎｍ、１１ｎｍ、１７ｎｍの金ナノ粒子を混合し、それぞれ粒径の異なる金ナノ粒子で標識されたＰＮＡプローブを得る。上記３種類の金ナノ粒子標識プローブ（２３’、２４’、２５’）を１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で混合し、試料ＤＮＡがハイブリダイズしたＤＮＡチップに滴下し、再度、図３、図４の方法で１５分間攪拌する。
【００３４】
２×ＳＳＣで洗浄後、図３、図４で説明した攪拌用の上面プレート１０２は取り除き、乾燥させる。この後、走査型電子顕微鏡３００の電子線３００−４でチップ１００表面を２次元スキャンする。
【００３５】
図５は、図１に示すチップ１００を走査型電子顕微鏡３００の電子線３００−４で２次元的にスキャンしながら得られた電子顕微鏡像を模式的に示す図である。１１，１２は、図１で説明したエレメント１に対応するエレメントである。４１，４２，---，４６はエレメント１１，１２の４隅に配置された、図１で説明したピラー４に対応する、サイズの異なるピラーである。５１，５２および５３は、８．３ｎｍ、１１ｎｍおよび１７ｎｍの金ナノ粒子である。金ナノ粒子は、参照符号を付したもの以外にも存在するが、図に示すに留める。電子顕微鏡像は、電子線が照射された時に二次電子を放出するもの以外は、像として表れない。従って、本発明による電子顕微鏡像は、プローブとこれにハイブリダイズしたＤＮＡ断片やハイブリダイゼーションバッファーに含まれる高分子や塩は、電子顕微鏡像に表れず、ピラー、エレメントおよび金ナノ粒子の像のみが得られる。
【００３６】
（実施例２）
図６（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果の他の例について説明する全体図であり、図７は、図６による効果の詳細な説明図である。
【００３７】
図６（ａ），（ｂ），（ｃ）と図３（ａ），（ｂ），（ｃ）とを対比して明らかなように、実施例２では、ＤＮＡチップ１００の基板１０１上の上面プレート１０２に代えて、上面に直径１００μｍの回転するロッド１２０が設けられる点において異なるのみである。ロッド１２０は基板１０１上のサンプル溶液１２２と接した状態で、２００ｒｐｍで回転することができる。ロッド１２０とチップエレメントのギャップは１００μｍである。ロッドの回転はスピンドルモーター、左右の移動はステージに乗せたチップを左右に１０秒間に１回の割合で移動させる。サンプル溶液或いは、ナノ粒子標識プローブ溶液１μｌを基板１０１上に滴下して、ロッド１２０を回転運動させながら、図６（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すように、左から右に移動させ、さらに、必要なら、右から左に移動させる（矢印１２９）。ロッド１２０を回転させることで平面方向の液の移動が、太線１１５，１２５に示すように、強制されるので、基板１０１上で溶質が十分攪拌される。よって、各エレメント１の表面で常にサンプル溶液が入れ替わることとなり、ハイブリダイゼーションが促進される。さらに、実施例２でも、エレメント１間に実質的にサイズがランダムなピラー４が立っているので、平面方向に強制移動させられる溶液が、障害物であるピラー４により、液流に乱れが生じて攪拌され、更に反応が促進される。実施例２では、ロッド１２０の回転と移動の相互作用により、ハイブリダイゼーション用の反応液がチップのエレメント上で十分攪拌される。
【００３８】
本発明のチップの大きさについて説明する。一般に光を用いて物体を認識しようとすると、上述した式（１）、開口数０．８の例では、４００〜５００ｎｍ以下のものは検出できない。これ以下では、物体を認識すらできない。実際に物体の生きまで規定しようとすると実用的には７００ｎｍ程度が限界となる。
【００３９】
本発明では電子線照射による二次電子を検出することで物質を検出するので、波長に依存せずに物質を測定できる。このため、エレメント１或いはエレメント間隔が７００ｎｍ以下のサイズであっても、エレメント１そのものとエレメント１の区切りを検出することができる。実施例１ではエレメント１のサイズをエレメントが７００ｎｍφとし、エレメント間隔を３００ｎｍの例を示しているが、より微細な構造のエレメント１あるいはエレメント間隔であっても良い。例えば、エレメント１が５００ｎｍ以下、或いはエレメント間隔が３００ｎｍ以下でも、エレメント１の上にハイブリダイゼーション反応で捕捉した８．３ｎｍの金ナノ粒子は走査型電子顕微鏡で定量検出できる。
【００４０】
エレメント１やエレメント間隔の下限について検討すると、以下の理由により７０ｎｍが下限である。即ち、５０塩基前後のプローブを固定するとプローブ固定密度がおおよそ１５ｎｍ２に１分子になることは上述したとおりである。一方、検出に用いるナノ粒子サイズの下限は、現状技術で一般的に入手可能なものとして５ｎｍであるので、プローブ固定密度とほぼ等しい値となり、これが下限を表わす一つの判断基準になる。実際には、エレメント１上に粒子が最低１０００粒子無いと定量検出の観点からは問題となる。即ちエレメント１のサイズ下限は１５×１０００ｎｍ２とになる。よって円形のエレメント１のサイズの直径下限は７０ｎｍとなる。もちろん定量性を問題にしないのであれば、より小さいエレメントでも利用可能で、この場合はプローブを固定したときのプローブ１分子が閉める領域が限界となる。すなわち、３ｎｍがエレメントの最小単位である。
【００４１】
（実施例３）
アフィニティー精製ポリクローナル抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体を、異なるエレメントに固定したプロテインチップを得る。これとは別に、同じ抗ＡＦＰ抗体と抗ＣＥＡ抗体をパパイン分解して得られるＦ（ａｂ’）２断片にＳＨ基を導入する。挿入されるＳＨ基はＦ（ａｂ’）２１分子あたり３〜４分子である。２０ｎｍの金ナノ粒子と混合し、表面にＦ（ａｂ’）２が結合した粒子を得る。試料として１ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＡＦＰ単独、５ｚｍｏｌ／μｌの濃度のＣＥＡ単独、何も入っていないコントロールを用意する。溶媒は０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）である。プロテインチップに各溶液を反応させ、さらに金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）２を反応させる。反応時間は最初の試料反応が５分間、金ナノ粒子標識Ｆ（ａｂ’）２の反応が５分間である。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と０．５％ＢＡＳを含む緩衝液で洗浄し、ＳＥＭで検出する。
【００４２】
ＡＦＰを反応させたチップでは抗ＡＦＰ抗体の結合しているエレメントに１２０粒子／エレメント、抗ＣＥＡ抗体を固定しているエレメントでは６粒子／エレメントが検出される。ＣＥＡを反応させたチップでは抗ＡＦＰ抗体の結合しているエレメントに７粒子／エレメント、抗ＣＥＡ抗体を固定しているエレメントでは１３４０粒子／エレメントが検出される。
【００４３】
コントロール溶液ではチップ上のいずれのエレメントにも２〜４粒子／エレメントの金ナノ粒子しか検出されない。
【００４４】
本発明は、上述したように、いくつかの実施例の形で実施できるが、いずれの場合でも、ハイブリダイズした試料ＤＮＡなどを実質的に１分子ごとに検出することになるので、感度的には従来法を凌駕する感度が得られる。極微量体積で極微量ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となるので、従来は不可能であったＰＣＲによる前処理増幅無しでの標的ＤＮＡ（ＲＮＡ）の検出が可能となる。検出に標識粒子の大きさや形状を変えることができるので、６種以上１０種程度の異なるサンプルを同一エレメントでマルチ解析できるようになる。この技術により従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションへの利用のほか、同一プローブでエレメントにサンプルポリヌクレオチドを捕捉し、異なる標識プローブで検出する使い方ができるようになる。本発明のマルチ解析技術により、オルターナティブスプライシングの検出や、複数ＳＮＰのタイピングがひとつのエレメントで行えるようになるメリットがある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施例１のＤＮＡチップの一部を斜視図で示す概念図。
【図２】図１で説明した基板１０１上の各エレメント１とピラー４とのより詳細な関係と、各エレメント１上に固着されたＤＮＡプローブ２１，２２，---と、これにハイブリダイズしたＤＮＡ断片２０１と、これを検出する走査型電子顕微鏡３００との関係を模式的に示す図。
【図３】（ａ），（ｂ），（ｃ）はピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図。
【図４】図３による効果の詳細な説明図。
【図５】図１に示すチップ１００を走査型電子顕微鏡で２次元的にスキャンしながら得られた走査型電子顕微鏡像を模式的に示す図。
【図６】（ａ），（ｂ），（ｃ）は実施例２のピラー４のプローブハイブリダイゼーションの速度を速める効果について説明する全体図。
【図７】図６による効果の詳細な説明図。
【符号の説明】
【００４６】
１…エレメント、２…エレメントの間隔、３…エレメントグループ、４…ピラー、５…溝、６…、２１，２２…ＤＮＡプローブ、２３’，２４’，２５’…金ナノ粒子、５０…細胞分離用チップ、５１…試料導入部、６０…走査型電子顕微鏡、１００…チップ、１０１…シリコン基板、１０２…上面プレート、１２１…ロッド、２０１…ＤＮＡ断片。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の４隅に特定の形を持つ構造体を配置するとともに、これらの４隅に配置された特定の形を持つ構造体を前記独立した複数の領域ごとに異なったものとし、且つ、前記独立した複数の領域の所定数を単位とする領域が領域間に形成された溝を介して配置されている生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【請求項２】
前記生体試料解析チップ上に試料溶液を滴下してその上面に薄いプレートまたは所定の速度で回転するロッドを配置し、これを基板上で左右に移動させて前記プローブと試料溶液中の試料とのハイブリダイズを促進する請求項１記載の生体試料解析チップによる解析法。
【請求項３】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の個々の大きさが、７００ｎｍφの円形の面積以下、３ｎｍφの円形の面積以上である生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【請求項４】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の４隅に特定の形を持つ構造体を配置するとともに、これらの４隅に配置された特定の形を持つ構造体を前記独立した複数の領域ごとに異なったものとした生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【請求項１】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の４隅に特定の形を持つ構造体を配置するとともに、これらの４隅に配置された特定の形を持つ構造体を前記独立した複数の領域ごとに異なったものとし、且つ、前記独立した複数の領域の所定数を単位とする領域が領域間に形成された溝を介して配置されている生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【請求項２】
前記生体試料解析チップ上に試料溶液を滴下してその上面に薄いプレートまたは所定の速度で回転するロッドを配置し、これを基板上で左右に移動させて前記プローブと試料溶液中の試料とのハイブリダイズを促進する請求項１記載の生体試料解析チップによる解析法。
【請求項３】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の個々の大きさが、７００ｎｍφの円形の面積以下、３ｎｍφの円形の面積以上である生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【請求項４】
基板上に独立した複数の領域が設けられ、それぞれの領域に異なったプローブが固定された生体試料解析チップの、前記独立した複数の領域の４隅に特定の形を持つ構造体を配置するとともに、これらの４隅に配置された特定の形を持つ構造体を前記独立した複数の領域ごとに異なったものとした生体試料解析チップの、前記プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が導電性の微粒子により標識されたものであり、前記導電性の微粒子を走査型電子顕微鏡で検出する生体試料解析チップによる解析法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１１２７９２（Ｐ２００６−１１２７９２Ａ）
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９７１９４（Ｐ２００４−２９７１９４）
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１２日（２００４．１０．１２）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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