酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子
酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、酢酸含有培地で増殖促進機能を有する遺伝子を取得する方法により、グルコンアセトバクター属に属する実用酢酸菌から酢酸発酵を実用レベルで向上させる機能を有する新規な遺伝子をクローニングした。また、該遺伝子を酢酸菌に導入した形質転換株においては、エタノール存在下で培養した場合、増殖誘導期が著しく短縮され、酢酸発酵速度を顕著に向上させることを可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、微生物に由来する増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）及びグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
特に、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向がある。
そのため、酢酸発酵においては、高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短くすることが求められており、その一手段として、発酵液中にＰＱＱ（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸）を添加して増殖を促進し、いわゆる増殖誘導期を短縮する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、ＰＱＱを大量に入手することは難しく、かつ、高価であるため、工業的な規模での実施には障害がつきまとうなどの問題があったことから、酢酸菌の増殖を促進して、いわゆる増殖誘導期を短縮できる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（増殖促進遺伝子）をクローニングし、その増殖促進遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられてきた。
しかし、これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子については、全く分離されたことがなく、このような実情から、酢酸菌の増殖を実用レベルで促進し、増殖誘導期を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖促進遺伝子の分離、及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖機能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【特許文献１】：特開昭６１−５８５８４号広報
【特許文献２】：特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献３】：特開昭６０−９４８９号公報
【特許文献４】：特願２００３−３５０２６５号明細書
【非特許文献１】：
「バイオキミカ・アト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，１０８８巻，ｐ．２９２−３００，１９９１年
【非特許文献２】：
「アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，５５巻，ｐ．１７１−１７６，１９８９年
【非特許文献３】：
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年
【非特許文献４】：
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，４９巻，ｐ．２０９１−２０９７，１９８５年
【非特許文献５】：：
「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），５８巻，ｐ．９７４−９７５，１９９４年
【非特許文献６】：
「ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２５４巻，ｐ．３５６−３６２，１９９８年
【非特許文献７】：
「メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．）」，８９巻，ｐ．４５０−４５７，１９８２年
【非特許文献８】：
「メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．）」，８９巻，ｐ．４９１−４９６，１９８２年
【非特許文献９】：
「セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）」，ｐ．１５３−１５８、１９８９年
【発明の開示】
前述のとおり、これまでに酢酸菌の増殖促進機能を遺伝子レベルで解明し、高い増殖促進機能を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。そこで、本発明者らは、本発明により実用レベルで増殖促進機能を向上させ得るタンパク質をコードする新規なアルコール脱水素酵素遺伝子を分離すること、このアルコール脱水素酵素遺伝子を用いてより優れた増殖促進機能を有する酢酸菌を育種すること、この酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とした。
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な増殖促進遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の増殖促進機能を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢を従来よりも効率的に製造する方法を開発することが可能になるとの新規着想を得、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は次のとおりである。
（１）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
（２）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
（３）下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）（４）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
（７）微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする（６）に記載の微生物。
（８）（６）又は（７）に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（９）（８）に記載の方法により得られる酢酸を高濃度に含む食酢。
（１０）酢酸濃度が１０〜１３％である（９）に記載の食酢。
本発明によれば、微生物に対して、増殖促進機能を付与し増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、増殖誘導期が顕著に短縮し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図等の概略図である。
図２はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来のＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。
図３はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来のＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
図４はプライマー１の塩基配列を示す図である。
図５はプライマー２の塩基配列を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本願は２００３年３月１２日に出願された日本国特許出願２００３−６６６９７の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明者らは、酢酸菌から増殖促進遺伝子を見出す方法について、鋭意研究を行った結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下で生育に４日必要な株を、同培地上で３日での生育を可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって酢酸菌から増殖促進遺伝子を分離する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、増殖促進機能を実用レベルで向上させうる新規なアルコール脱水素酵素遺伝子（以下、ａｄｈ遺伝子ということもある）をクローニングすることに初めて成功した。
得られたａｄｈ遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で見出されているａｄｈＰ遺伝子やシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子などによって生産される一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子（ａｄｈ遺伝子）であると推定された。
但し、本発明のａｄｈ遺伝子は、これまでに報告されている酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓ）のａｄｈ遺伝子（例えば、非特許文献１参照）とは、アミノ酸配列レベルで６．４％の極めて低い相同性であり、また予想される分子量にも大きな違いがあることから、これまでに報告されている膜タンパク質としてのａｄｈ遺伝子とは明らかに異なるものであることが確認された。
また、大腸菌のａｄｈＰ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３９％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５６％の相同性であり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の原核生物のａｄｈ遺伝子とはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＡＤＨということもある）をコードする新規遺伝子であることが確認された。
本発明において、ａｄｈ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株においては、アルコール脱水素酵素活性が約５４倍に増大し、該遺伝子が酢酸菌のアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
さらに、エタノール存在下で通気培養した場合に、酢酸発酵能、特に増殖促進機能が著しく向上し、誘導期が短縮されて、高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、大腸菌などのａｄｈ遺伝子とある程度の相同性を有し、且つ増殖促進機能を向上させうる配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するアルコール脱水素酵素をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１で、１９８４年２月２３日付（原寄託）で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特許文献３参照）により取得する。
次に得られた染色体ＤＮＡからアルコール脱水素酵素遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＰｓｔＩを用いた。
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素ＰｓｔＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＰｓｔＩを温度３７℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。
得られた組換えベクターを用いて、通常は寒天培地上で１％濃度の酢酸の存在下では増殖に４日必要な酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３）株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７で、１９８３年６月２７日付（原寄託）で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）を形質転換し、その後１％酢酸含有寒天培地に塗布し、３日間培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することでａｄｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列はコーディング領域である。
配列表の配列番号１に示す塩基配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：塩基番号３５９〜１３９０に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のａｄｈＰ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３９％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５６％の相同性を示し、タンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも６０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
さらに、酢酸菌アセトバクター・ポリオキソゲネス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓ）からａｄｈ遺伝子を取得したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）が、この場合のａｄｈ遺伝子はそのコードするタンパク質のアミノ酸配列と塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列との相同性はわずか６．４％と非常に低く、既知のａｄｈ遺伝子とは明らかに異なり、酢酸菌の新規なａｄｈ遺伝子であることが明白であった。
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列にに基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
本発明の増殖促進機能を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質ＡＤＨのアルコール脱水素酵素活性や増殖促進機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであればいずれでも良い。
このような増殖促進機能を有するアルコール脱水素酵素と実質的に同一のタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列の塩基配列番号３５９〜１３９０からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列番号３５９〜１３９０からなる塩基配列ＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
アセトバクター属の細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８３）株が挙げられる。
また、グルコンアセトバクター属の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ＤＳＭ６１６０）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、現在特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株が例示される。
増殖促進機能の増強は、例えばａｄｈ遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって行われる。
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても増強することができる。
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
マルチコピーベクター（酢酸菌−大腸菌シャトルベクター）としては、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献２参照）、ｐＧＩ１８（例えば、特許文献４参照）、ｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献９参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献２参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献３参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、非特許文献４参照）やエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）等によって行うことができる。
形質転換体は少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでなる組換えプラスミドであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＭＶ２４にこのＤＮＡ断片を挿入してなるプラスミドｐＡＤＨ１、及び／又は、このプラスミドｐＡＤＨ１をアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）に導入することによりえられる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてそのアルコール脱水素酵素活性を増大させると、増殖促進機能が増強され、誘導期が短縮されて、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く生産することができる。
（３）食酢製造法
上記のようにして、ａｄｈ遺伝子のコピー数が増幅されたことにより、増殖促進機能が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であってアルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、通常は３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調整することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。この方法による食酢の酢酸濃度は１０〜１３％である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有する遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特許文献３参照）により、染色体ＤＮＡを調製した。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を制限酵素ＰｓｔＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株に形質転換し、１％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で３日間培養した。３日で生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約１．７ｋｂｐのＰｓｔＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＰ１と命名した。さらに１％酢酸を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を３日間で生育可能にする断片は、ｐＰ１にクローン化された約１．７ｋｂｐのＰｓｔＩ断片中の約１．２ｋｂｐのＢｇｌＩ断片であることが確認できた。
このようにして通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、１％酢酸含有寒天培地において３日間で増殖を可能にする遺伝子断片を取得した。
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号３５９から塩基番号１３９０にかけて、配列番号２に記載したような３４４個のアミノ酸（図３）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での誘導期の短縮効果
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献２参照）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＤＨ１を作製した。ｐＡＤＨ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。図１はＰｓｔＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＤＨ１への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＡＤＨ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で３日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）形質転換株の増殖促進機能
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
その結果、第２図に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地において、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株よりも形質転換株の方が早く増殖することが確認でき、該遺伝子の増殖促進機能の増強効果が確認できた。
（３）形質転換株と元株の各種酵素活性
プラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株と、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株でＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素活性をバクテリアの方法（例えば、非特許文献６参照）を変法して測定した。具体的には、１ｍｌの反応系に２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭエタノール、１．５ｍＭ ＮＡＤ＋を含み、適当量の細胞破砕液を添加し、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を測定した。活性は１分あたりの１μｍｏｌＮＡＤＨ生成量を１Ｕとした。また、膜結合型アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法（例えば、非特許文献７参照）、膜結合型アルデヒド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法（例えば、非特許文献８参照）にそれぞれ準じて測定した。その結果を表１に示した。
表１の結果より、形質転換株は膜結合型のアルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素の活性は元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と同レベルであったが、ＮＡＤ依存型のアルコール脱水素酵素活性については形質転換株が約５４倍高く、クローニングされた遺伝子はＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素をコードしているａｄｈ遺伝子であることが確認された。
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例２で得られたプラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して酢酸、エタノール、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％、エタノール４％の濃度に調整し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表２にまとめた。
表２の結果から、形質転換株の方が、増殖誘導期が顕著に短縮され、効率的に酢酸発酵を行えることが確認できた。
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
（１）アセトバクター・アルトアセチゲネスへの形質転換
アセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８（例えば、特許文献４参照）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を挿入してプラスミドｐＡＤＨ２を作製した。ｐＡＤＨ２に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。図１はＰｓｔＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＤＨ２への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＡＤＨ２をアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４％の酢酸、３％のエタノールを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ａｄｈ遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）形質転換株の酢酸発酵試験
（１）で得られたプラスミドｐＡＤＨ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを有する元株アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５Ｌの原料培地（酢酸７％、エタノール３％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行なった。菌体の明らかな増殖が認められ、残留エタノール濃度が２％になった段階で、エタノール含有液（酢酸１％、エタノール５０％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）を流加し、発酵液のエタノール濃度が２％になるように制御した。この酢酸発酵をさせる方法で、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表３にまとめた。
表３の結果から、形質転換株の方が、最終到達酸度において顕著にすぐれていることが確認できた。
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
（１）アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムへの形質転換
実施例４で得られたプラスミドｐＡＤＨ２をアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ）の１株であるアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ３２８８）株にエレクトロポレーション法（非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）酢酸発酵試験
（１）で得られたプラスミドｐＡＤＨ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、米糖化液を１７．９％、発酵諸味を３．２％、醸造用アルコールを７．８％、水を７１．１％の割合で混合して作成した原料培地（アルコール濃度７．８％、酢酸濃度０．２６％）を用いて、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）において、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度７．３％での連続発酵を行なった。酢酸濃度７．２％の連続発酵での原料培地の添加速度を比較し、その結果を表４に示した。また、形質転換株の原料培地添加速度を元株の酢酸濃度７．３％での連続発酵時の原料培地添加速度に合わせた場合の酢酸発酵能を比較し、その結果を表４に示した。
表４、及び表５の結果から、形質転換株の方が、連続酢酸発酵においても、生産性（原料培地添加速度）と生産酢酸濃度においても顕著にすぐれていることが確認できた。
本発明で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、微生物に由来する増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）及びグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
特に、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向がある。
そのため、酢酸発酵においては、高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短くすることが求められており、その一手段として、発酵液中にＰＱＱ（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸）を添加して増殖を促進し、いわゆる増殖誘導期を短縮する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、ＰＱＱを大量に入手することは難しく、かつ、高価であるため、工業的な規模での実施には障害がつきまとうなどの問題があったことから、酢酸菌の増殖を促進して、いわゆる増殖誘導期を短縮できる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（増殖促進遺伝子）をクローニングし、その増殖促進遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられてきた。
しかし、これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子については、全く分離されたことがなく、このような実情から、酢酸菌の増殖を実用レベルで促進し、増殖誘導期を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖促進遺伝子の分離、及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖機能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【特許文献１】：特開昭６１−５８５８４号広報
【特許文献２】：特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献３】：特開昭６０−９４８９号公報
【特許文献４】：特願２００３−３５０２６５号明細書
【非特許文献１】：
「バイオキミカ・アト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）」，１０８８巻，ｐ．２９２−３００，１９９１年
【非特許文献２】：
「アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，５５巻，ｐ．１７１−１７６，１９８９年
【非特許文献３】：
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年
【非特許文献４】：
「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，４９巻，ｐ．２０９１−２０９７，１９８５年
【非特許文献５】：：
「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），５８巻，ｐ．９７４−９７５，１９９４年
【非特許文献６】：
「ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，２５４巻，ｐ．３５６−３６２，１９９８年
【非特許文献７】：
「メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．）」，８９巻，ｐ．４５０−４５７，１９８２年
【非特許文献８】：
「メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．）」，８９巻，ｐ．４９１−４９６，１９８２年
【非特許文献９】：
「セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）」，ｐ．１５３−１５８、１９８９年
【発明の開示】
前述のとおり、これまでに酢酸菌の増殖促進機能を遺伝子レベルで解明し、高い増殖促進機能を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。そこで、本発明者らは、本発明により実用レベルで増殖促進機能を向上させ得るタンパク質をコードする新規なアルコール脱水素酵素遺伝子を分離すること、このアルコール脱水素酵素遺伝子を用いてより優れた増殖促進機能を有する酢酸菌を育種すること、この酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とした。
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な増殖促進遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の増殖促進機能を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢を従来よりも効率的に製造する方法を開発することが可能になるとの新規着想を得、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は次のとおりである。
（１）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
（２）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
（３）下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）（４）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）（２）又は（３）に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
（７）微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする（６）に記載の微生物。
（８）（６）又は（７）に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（９）（８）に記載の方法により得られる酢酸を高濃度に含む食酢。
（１０）酢酸濃度が１０〜１３％である（９）に記載の食酢。
本発明によれば、微生物に対して、増殖促進機能を付与し増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、増殖誘導期が顕著に短縮し、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図等の概略図である。
図２はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来のＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。
図３はグルコンアセトバクター・エンタニイ由来のＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
図４はプライマー１の塩基配列を示す図である。
図５はプライマー２の塩基配列を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本願は２００３年３月１２日に出願された日本国特許出願２００３−６６６９７の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明者らは、酢酸菌から増殖促進遺伝子を見出す方法について、鋭意研究を行った結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下で生育に４日必要な株を、同培地上で３日での生育を可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって酢酸菌から増殖促進遺伝子を分離する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、増殖促進機能を実用レベルで向上させうる新規なアルコール脱水素酵素遺伝子（以下、ａｄｈ遺伝子ということもある）をクローニングすることに初めて成功した。
得られたａｄｈ遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で見出されているａｄｈＰ遺伝子やシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子などによって生産される一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のアルコール脱水素酵素遺伝子（ａｄｈ遺伝子）であると推定された。
但し、本発明のａｄｈ遺伝子は、これまでに報告されている酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓ）のａｄｈ遺伝子（例えば、非特許文献１参照）とは、アミノ酸配列レベルで６．４％の極めて低い相同性であり、また予想される分子量にも大きな違いがあることから、これまでに報告されている膜タンパク質としてのａｄｈ遺伝子とは明らかに異なるものであることが確認された。
また、大腸菌のａｄｈＰ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３９％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５６％の相同性であり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の原核生物のａｄｈ遺伝子とはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＡＤＨということもある）をコードする新規遺伝子であることが確認された。
本発明において、ａｄｈ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株においては、アルコール脱水素酵素活性が約５４倍に増大し、該遺伝子が酢酸菌のアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
さらに、エタノール存在下で通気培養した場合に、酢酸発酵能、特に増殖促進機能が著しく向上し、誘導期が短縮されて、高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、大腸菌などのａｄｈ遺伝子とある程度の相同性を有し、且つ増殖促進機能を向上させうる配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するアルコール脱水素酵素をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１で、１９８４年２月２３日付（原寄託）で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特許文献３参照）により取得する。
次に得られた染色体ＤＮＡからアルコール脱水素酵素遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＰｓｔＩを用いた。
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素ＰｓｔＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＰｓｔＩを温度３７℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。
得られた組換えベクターを用いて、通常は寒天培地上で１％濃度の酢酸の存在下では増殖に４日必要な酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３）株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７で、１９８３年６月２７日付（原寄託）で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている）を形質転換し、その後１％酢酸含有寒天培地に塗布し、３日間培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することでａｄｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列はコーディング領域である。
配列表の配列番号１に示す塩基配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：塩基番号３５９〜１３９０に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｉｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のａｄｈＰ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３９％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｌｉｌｏｔｉ）のａｄｈＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５６％の相同性を示し、タンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも６０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
さらに、酢酸菌アセトバクター・ポリオキソゲネス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓ）からａｄｈ遺伝子を取得したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）が、この場合のａｄｈ遺伝子はそのコードするタンパク質のアミノ酸配列と塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列との相同性はわずか６．４％と非常に低く、既知のａｄｈ遺伝子とは明らかに異なり、酢酸菌の新規なａｄｈ遺伝子であることが明白であった。
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列にに基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
本発明の増殖促進機能を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質ＡＤＨのアルコール脱水素酵素活性や増殖促進機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであればいずれでも良い。
このような増殖促進機能を有するアルコール脱水素酵素と実質的に同一のタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列の塩基配列番号３５９〜１３９０からなる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又は塩基配列番号３５９〜１３９０からなる塩基配列ＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、酢酸耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、酢酸耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
アセトバクター属の細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ Ｎｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｏｒ ａｃｅｔｉ ＩＦＯ３２８３）株が挙げられる。
また、グルコンアセトバクター属の細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ＤＳＭ６１６０）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、現在特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株が例示される。
増殖促進機能の増強は、例えばａｄｈ遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって行われる。
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても増強することができる。
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
マルチコピーベクター（酢酸菌−大腸菌シャトルベクター）としては、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献２参照）、ｐＧＩ１８（例えば、特許文献４参照）、ｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献９参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献２参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献３参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、非特許文献４参照）やエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）等によって行うことができる。
形質転換体は少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでなる組換えプラスミドであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＭＶ２４にこのＤＮＡ断片を挿入してなるプラスミドｐＡＤＨ１、及び／又は、このプラスミドｐＡＤＨ１をアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）に導入することによりえられる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてそのアルコール脱水素酵素活性を増大させると、増殖促進機能が増強され、誘導期が短縮されて、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率良く生産することができる。
（３）食酢製造法
上記のようにして、ａｄｈ遺伝子のコピー数が増幅されたことにより、増殖促進機能が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であってアルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、通常は３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調整することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。この方法による食酢の酢酸濃度は１０〜１３％である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有する遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特許文献３参照）により、染色体ＤＮＡを調製した。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を制限酵素ＰｓｔＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株に形質転換し、１％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で３日間培養した。３日で生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約１．７ｋｂｐのＰｓｔＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＰ１と命名した。さらに１％酢酸を含有するＹＰＧ寒天培地でアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を３日間で生育可能にする断片は、ｐＰ１にクローン化された約１．７ｋｂｐのＰｓｔＩ断片中の約１．２ｋｂｐのＢｇｌＩ断片であることが確認できた。
このようにして通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、１％酢酸含有寒天培地において３日間で増殖を可能にする遺伝子断片を取得した。
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号３５９から塩基番号１３９０にかけて、配列番号２に記載したような３４４個のアミノ酸（図３）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での誘導期の短縮効果
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献２参照）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＡＤＨ１を作製した。ｐＡＤＨ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。図１はＰｓｔＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＤＨ１への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＡＤＨ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で３日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）形質転換株の増殖促進機能
上記のようにして得られたプラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
その結果、第２図に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地において、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株よりも形質転換株の方が早く増殖することが確認でき、該遺伝子の増殖促進機能の増強効果が確認できた。
（３）形質転換株と元株の各種酵素活性
プラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株と、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株でＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素活性をバクテリアの方法（例えば、非特許文献６参照）を変法して測定した。具体的には、１ｍｌの反応系に２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭエタノール、１．５ｍＭ ＮＡＤ＋を含み、適当量の細胞破砕液を添加し、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を測定した。活性は１分あたりの１μｍｏｌＮＡＤＨ生成量を１Ｕとした。また、膜結合型アルコール脱水素酵素を酢酸菌の方法（例えば、非特許文献７参照）、膜結合型アルデヒド脱水素酵素活性を酢酸菌の方法（例えば、非特許文献８参照）にそれぞれ準じて測定した。その結果を表１に示した。
表１の結果より、形質転換株は膜結合型のアルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素の活性は元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と同レベルであったが、ＮＡＤ依存型のアルコール脱水素酵素活性については形質転換株が約５４倍高く、クローニングされた遺伝子はＮＡＤ依存型アルコール脱水素酵素をコードしているａｄｈ遺伝子であることが確認された。
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例２で得られたプラスミドｐＡＤＨ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して酢酸、エタノール、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％、エタノール４％の濃度に調整し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表２にまとめた。
表２の結果から、形質転換株の方が、増殖誘導期が顕著に短縮され、効率的に酢酸発酵を行えることが確認できた。
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
（１）アセトバクター・アルトアセチゲネスへの形質転換
アセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８（例えば、特許文献４参照）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を挿入してプラスミドｐＡＤＨ２を作製した。ｐＡＤＨ２に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。図１はＰｓｔＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＰ１）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＤＨ２への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図４）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図５）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＡＤＨ２をアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４％の酢酸、３％のエタノールを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ａｄｈ遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）形質転換株の酢酸発酵試験
（１）で得られたプラスミドｐＡＤＨ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを有する元株アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５Ｌの原料培地（酢酸７％、エタノール３％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行なった。菌体の明らかな増殖が認められ、残留エタノール濃度が２％になった段階で、エタノール含有液（酢酸１％、エタノール５０％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）を流加し、発酵液のエタノール濃度が２％になるように制御した。この酢酸発酵をさせる方法で、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表３にまとめた。
表３の結果から、形質転換株の方が、最終到達酸度において顕著にすぐれていることが確認できた。
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のａｄｈ遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
（１）アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムへの形質転換
実施例４で得られたプラスミドｐＡＤＨ２をアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ）の１株であるアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ ＩＦＯ３２８８）株にエレクトロポレーション法（非特許文献５参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）酢酸発酵試験
（１）で得られたプラスミドｐＡＤＨ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、米糖化液を１７．９％、発酵諸味を３．２％、醸造用アルコールを７．８％、水を７１．１％の割合で混合して作成した原料培地（アルコール濃度７．８％、酢酸濃度０．２６％）を用いて、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）において、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度７．３％での連続発酵を行なった。酢酸濃度７．２％の連続発酵での原料培地の添加速度を比較し、その結果を表４に示した。また、形質転換株の原料培地添加速度を元株の酢酸濃度７．３％での連続発酵時の原料培地添加速度に合わせた場合の酢酸発酵能を比較し、その結果を表４に示した。
表４、及び表５の結果から、形質転換株の方が、連続酢酸発酵においても、生産性（原料培地添加速度）と生産酢酸濃度においても顕著にすぐれていることが確認できた。
本発明で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、酢酸耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【配列表フリーテキスト】
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
【請求項２】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
【請求項３】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる酢酸を高濃度に含む食酢。
【請求項１０】
酢酸濃度が１０〜１３％である請求項９に記載の食酢。
【請求項１】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
【請求項２】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＡＤＨをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質ＡＤＨ。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨ。
【請求項３】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号３５９〜１３９０の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質ＡＤＨをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、アルコール脱水素酵素活性が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は請求項７に記載の微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる酢酸を高濃度に含む食酢。
【請求項１０】
酢酸濃度が１０〜１３％である請求項９に記載の食酢。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１２１６
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３４６７（Ｐ２００５−５０３４６７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１７３２
【国際出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１７３２
【国際出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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