酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１
【課題】歴史的に安全性が確かめられている酢酸菌により生産される安全かつ安定な新規な酸性ヘテロ多糖類及びその製造方法を開発すること。
【解決手段】アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）の培養液上清からエタノールにより抽出され、グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１であることを特徴とする新規な酸性ヘテロ多糖類とその製造方法を提供する。
【解決手段】アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）の培養液上清からエタノールにより抽出され、グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１であることを特徴とする新規な酸性ヘテロ多糖類とその製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酸性ヘテロ多糖類に関し、さらに詳細には、酢酸菌の一種により生産される新規な酸性ヘテロ多糖類に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は多様な多糖類を生産するが、中でも酢酸菌は多くの多糖類を生産することが知られており、例えば、セルロース、レバン、デキストランなどの単一の構成糖からなるものがある。
【０００３】
一方、ある種の酢酸菌は、異種の構成糖からなり有機酸を含む酸性の水溶性多糖類（以下、酸性ヘテロ多糖類と称する場合もある）を生産することも知られている。
例えば、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌がグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸＝４：０．９〜１．１：０．９〜１．１：０．９〜１．１の構成糖比でアセチル基を４〜８％程度含有するＡＭ−２と称される酸性ヘテロ多糖類を生産することが報告されており（例えば、特許文献１参照）、その後該酸性ヘテロ多糖類はグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸：アセチル基≒４：１：１：１：１の構成糖比であり、その一次構造も明らかにされた（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
また、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＲＲＬ Ｂ４３株がグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸：アセチル基≒４：１：１：１：１〜２の構成糖比を有するアセタン（Ａｃｅｔａｎ）と称される上記ＡＭ−２と構造が類似する酸性ヘテロ多糖類を生産することも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝１０：３〜６：０．５〜２：０．５〜２の構成糖比の酸性ヘテロ多糖類を生産することが報告されており（例えば、特許文献２参照）、その後、該酸性ヘテロ多糖類はＡＭ−１と称されて、構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝６：２：１：１であることが明らかにされ、また、その一次構造が明らかにされている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
これらの酢酸菌が生産する酸性ヘテロ多糖類は、その粘性特性などから飲食品への利用を中心に幅広く応用が検討されており、さらに、最近では腫瘍抑制作用（例えば、特許文献３参照）やアレルギー抑制作用（例えば、特許文献４参照）などの薬理作用に着目した応用も検討されている。
【０００７】
しかし、さらに優れた効果を有する新規な酸性ヘテロ多糖類を開発することが求められていた。
【非特許文献１】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４８巻、１０号、ｐ．２４０５−２４１４、１９８４年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌｏｇｙ）」、１３３巻、ｐ．２１２３−２１３５、１９８７年
【非特許文献３】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４９巻、４号、ｐ．９５９−９６６、１９８５年
【特許文献１】特開昭５９−２０３４９８号公報
【特許文献２】特開昭５８−７８５９６号公報
【特許文献３】特開２００４−５９５４９号公報
【特許文献４】特開２００４−５９５４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、本発明の目的は、新規な酸性ヘテロ多糖類を発見し、かつ、その製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み鋭意検討を重ね、その過程において、食酢製造工程から分離した新規酢酸菌株が新規な酸性ヘテロ多糖類を製造することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明者らは、古くから人類の食用に供されており、歴史的にその安全性が確かめられている各種発酵食品の醸造過程に関与する微生物の多糖類の生産能を広く探索した。
【００１１】
その結果、食酢の発酵槽から分離したアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のの酢酸菌がグルコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸を主要構成成分とする多糖類を生産すること、そしてこの多糖類が従来知られている多糖類とは異なる新規な酸性ヘテロ多糖類であることを見出し、これに基づいて本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、下記の理化学的性質を有する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１に関する。
【００１３】
（１）グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類。
（２）一次構造は、化１に示す通りである。
【００１４】
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【００１５】
また、請求項２に記載の本発明は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌を培養し、培養物より酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１を採取すること、を特徴とする請求項１に記載の酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の製造方法に関する。
【００１６】
更に、請求項３に記載の本発明は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法に関する。
【００１７】
そして、請求項４に記載の本発明は、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）であること、を特徴とする請求項３に記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、新規な酸性ヘテロ多糖類が提供され、さらに該酸性ヘテロ多糖類を効率良く生産可能な生産菌を取得することができ、該生産菌を用いることにより新規な酸性ヘテロ多糖類を効率良く生産する方法を提供することが可能となる。そして、本発明に係る多糖類は、古来から食酢醸造に使用され、歴史的にその安全性が確認されている酢酸菌が生産する多糖類であって、天然由来ということができ、増粘剤、増粘・乳化安定剤等として食品工業のほか、化粧品工業、薬品工業、その他各種工業において広く利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１に関するものであって、アセトバクター属細菌を使用することにより、その製造を可能にしたものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
（１）本発明の生産菌
本発明の新規な酸性ヘテロ多糖類を生産する酢酸菌は、食酢製造工程中に存在するので、食酢原料諸味や食酢発酵液などを分離源として、適切な培地、培養条件を設定して、集積培養を行った後、選択することによって取得可能である。
【００２１】
このようにして選抜される新規な酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌は、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌であり、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）が好ましく、なかでもアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株は最も優れたものとして例示される。
【００２２】
なお、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００２３】
（２）本発明の酸性ヘテロ多糖類の生産
本発明の酸性ヘテロ多糖類は、例えば次のような方法で製造することができる。すなわち、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）を適当な培地に培養し、培養物から上記酸性ヘテロ多糖類を採取することにより製造できる。
【００２４】
また、上記多糖類は酸性物質であるので、菌体を除いた培養液にセチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどを添加して上記多糖類を沈澱させることにより回収することができる。
【００２５】
粗精製の上記多糖類は多糖類の精製法に従って精製することができる。例えば粗精製の上記多糖類を水に再溶解し、熱処理後、遠心分離して不溶物を完全に除去し、アセトンなどの沈殿剤で再沈澱を繰り返すことにより純度の高い白色綿状の精製された上記多糖類が得られる。
【００２６】
また、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドによる沈澱（ＣＴＡＢ処理）、透析、およびイオン交換樹脂などを併用して高純度の精製品を得ることもできる。
【００２７】
（３）本発明の酸性ヘテロ多糖類
本発明の酸性ヘテロ多糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類である。
【００２８】
本発明の多糖類は、２Ｎトリフルオロ酢酸を添加し、１２０℃、５時間処理し加水分解した後、減圧乾固によりトリフルオロ酢酸を除去した後、乾固物を液体クロマトグラフィーで分析すると、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸が主構成糖であることが確認される。
【００２９】
また、本発明の多糖類は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドあるいはセチルピリジニウムクロライドを添加すると白色沈澱が生じるので、酸性である。
【００３０】
すなわち、本発明の多糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とする酸性へテロ多糖類である。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３２】
（実施例１）
生産菌の分離と同定
【００３３】
（１）生産菌の分離
食酢発酵槽からサンプリング後、ＹＰＧ培地を５ｍｌ含む試験管で２４時間、３０℃で培養した。その後ＹＰＧ培地により１／１０に希釈して、さらに２４時間の試験管培養を行った。この培養液を６％グルコース、１％酵母エキス、０．４％ポリペプトン、２％炭酸カルシウムおよび１．５％寒天を含む寒天培地に播種し、３０℃で５日間静置培養を行い、光沢かつ粘性を示すコロニーを得た。この操作を単一コロニーが得られるまで数回繰り返した。
【００３４】
最終的に得られたコロニーを釣菌して上記組成のスラント寒天培地に植え継ぎ、３０℃で３日間培養した後、４℃にて保存した。
【００３５】
（２）生産菌の同定
上記のようにして得られた生産菌の菌学的性質を下記の如くにして調べた。
なお、菌学的性質は各種同定書（例えば、１９７５年６月２０日東京大学出版会発行、長谷川武治編著「微生物の分類と同定」、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第２号、ｐ．９５〜１２６、１９６４年、およびザ・ソサエティー・フォー・アプライド・バクテリオロジー・テクニカル・シリーズ・Ｎｏ．２（Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．２）アイデンティフィケイション・メソッズ・フォー・マイクロバイオロジスツ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ）、ｐ．１〜８、１９６８年参照）に従って実施した。
【００３６】
また、酵母エキス−ブドウ糖寒天培地は酵母エキス５ｇ、ブドウ糖３０ｇ、ポリペプトン３ｇ、寒天１５ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節したもの、酵母エキス−ブドウ糖液体培地は酵母エキス５ｇ、ブドウ糖３０ｇ、ポリペプトン３ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節して滅菌後、エタノールを３％（Ｖ／Ｖ）無菌的に添加したもの、ＭＹ平板培地はブドウ糖１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、モルトエキス３ｇ、寒天１５ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節したもの、肉汁液体培地は肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇを蒸留水１リッターに溶解しｐＨを６．５に調節したもの、加糖肉汁液体培地はブドウ糖１０ｇ、肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇを蒸留水１リッターに溶解しｐＨを６．５に調節したものである。
【００３７】
そして、また、ユビキノンの同定は濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、赤外部および紫外部吸光スペクトラムおよび質量分析法で行った。
【００３８】
Ｉ．形態的所見
形状 短桿状
大きさ ０．５〜０．７×１．０〜１．２μｍ
集団 単独あるいは連鎖状
運動性 なし
胞子形成 形成せず
グラム染色 陰性
抗酸化 陰性
【００３９】
II．培養的所見
１．酵母エキス−ブドウ糖寒天平板培地培養（３０℃で４日間培養）
形状 円形
辺縁 平滑で全縁
隆起 隆起状（Ｒａｉｓｅｄ）
光沢 有り
表面 平滑
色調 淡黄色で光沢あり
２．炭酸カルシウム含有酵母エキス−ブドウ糖斜面培養（３０℃で３日培養）
生育の良否 良好
隆起 中程度
表面 平滑
辺縁 平滑で全縁
色調 淡黄色で光沢あり
３．エタノール含有酵母エキス−ブドウ糖液体静置培養（３０℃で４日間培養）
よく生育する。湿潤でもろい菌膜を形成する。混濁し、一部は底に沈殿する。セルロースからなる厚膜を形成しない。
４．肉汁液体静置培養（３０℃で７日間培養）
生育乏しい。セルロースからなる厚膜を形成しない。リング状に生育する。
５．ブドウ糖含有肉エキス液体静置培養（３０℃で７日間培養）
生育良好。セルロースからなる厚膜を形成しない。培養液は混濁し、一部は沈殿する。薄い菌膜を形成する。
６．ＭＹゼラチン高層培養（２０℃で７日間培養）
生育良好。液化性無し。
７．リトマスミルク（３０℃で７日間培養）
凝固性なし。
【００４０】
III．生理学的性質
１．硝酸塩の還元 なし
２．脱窒反応 なし
３．ＶＰテスト 陰性
４．インドールの生成 なし
５．硫化水素の生成 なし
６．デンプンの加水分解 なし
７．クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地） なし
８．無機窒素源の利用 なし（硝酸塩） なし（アンモニウム塩）
９．培地中への色素の生成 なし
１０．ウレアーゼ活性 なし
１１．カタラーゼ活性 あり
１２．生育ｐＨ範囲 ３．０〜７．５（最適ｐＨ範囲 ４．０〜５．５）
１３．生育温度範囲 １５〜３５℃ （最適温度範囲 ２０〜２８℃）
１４．酸素に対する態度 好気的
１５．５−ケトグルコン酸の生成 あり
１６．ジヒドロキシアセトンの生成 あり
１７．エタノールの資化性 エタノールを弱く資化し酢酸を生成する
１８．酢酸の資化性 なし
１９．乳酸の資化性 なし
２０．ビタミン要求性 あり
２１．酢酸の分解性 あり
２２．乳酸の分解性 あり
２３．塩化第２鉄反応 陰性（グルコース培地）
【００４１】
IV．炭素源の資化性および酸とガスの生成
表１に示す通りである。なお、表中の記号の意味は以下の通りである。すなわち、＋：資化する又は生成する、＋＋：よく資化する又はよく生成する、＋＋＋：非常によく資化する又は非常によく生成する、−：資化しない又は生成しない、±：わずかに資化する又はわずかに生成する、である。
【００４２】
【表１】
【００４３】
Ｖ．電子伝達系の補酵素の種類
補酵素の主要成分：ユビキノン−１０
【００４４】
以上の結果、本生産菌はグラム陰性の好気性桿菌でエタノールを酸化して酢酸を生成し、またｐＨ３．０でも増殖できることから、一般に酢酸菌と呼ばれるアセトバクター属もしくはグルコノバクター属に属することは明らかである。
【００４５】
また、本生産菌は主たるユビキノンタイプがＱ10でビタミンが生育に必須であり、またジヒドロキシアセトンの生成能を有する点ではグルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）としての性質を有するが、一方酢酸および乳酸の分解性を示す点ではアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）としての性質を示し、アセトバクター属またはグルコノバクター属のいずれとも断定し難いが、酢酸および乳酸の分解性を示すこと、および培地中にグルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とする上記した新規な酸性ヘテロ多糖類を蓄積する能力があることにより、本発明の生産菌はアセトバクター属に属すると認定するのが妥当であると考えられた。
【００４６】
さらに、主要なユビキノンとしてＱ10を有するアセトバクター属としては、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）およびアセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・リケファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。
【００４７】
このうち、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・リケファシエンスとは、グルコース培地でのＦｅＣｌ3反応、エタノール存在下での生育、色素形成などの点で異なっている。
【００４８】
アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）とは、セルロース生成能の有無で異なるが、セルロース生成能は非常に欠落しやすいということを考慮に入れ、本生産菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）のセルロース生成能が欠落した菌であると考えた。
【００４９】
以上の結果から、本生産菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｙｌｉｎｕｍ）に属すると認定するのが妥当であると同定され、その結果、本菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５と命名されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００５０】
（実施例２）
本発明の酸性ヘテロ多糖類の調製
【００５１】
（１）酸性ヘテロ多糖類の調製
使用酢酸菌株として、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）を用い、以下の方法で酸性ヘテロ多糖類を生産した。
【００５２】
まず、３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン、２％炭酸カルシウムおよび１．５％寒天を含む寒天培地に上記菌株を植菌し、３０℃に３日間静置することでコロニーを形成させた。
【００５３】
次に、ＰＰ培地（３％グルコース、３％マンニトール、０．２％酵母エキス、０．００９％リン酸水素２カリウム、０．０１％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム、０．０００９％塩化第二鉄、０．５％クエン酸ナトリウム）を７ｍｌ含む試験管に白金耳で集めた上記コロニーを接種し、３０℃で２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。この前々培養液をＰＰ培地１００ｍｌ含む５００ｍｌ容の坂口フラスコに１ｍｌ接種し、３０℃で４８時間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。
【００５４】
上記前培養液を、ＰＰ培地を２．５Ｌ含む５Ｌ容のジャーファーメンターに２５ｍｌ接種し、３０℃、３５０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで１２０時間、本培養を行うことで酸性ヘテロ多糖類を生産させた。
【００５５】
この培養液から、既報（例えば、非特許文献３参照）に記載の方法によって酸性ヘテロ多糖類の凍結乾燥標品を得た。
【００５６】
すなわち、培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分間）後、上清をセライト濾過によって培養菌体を完全に除去した。これを蒸留水で溶解して５％セチルトリメチルアンモニウムブロマイドを添加し、沈澱する酸性多糖類画分を回収した。
【００５７】
回収された酸性ヘテロ多糖類画分を２０％ＮａＣｌに溶解後、流水中で一晩透析した。透析終了後、エタノールを添加して得られた沈澱を回収した後、蒸留水に対してさらに一晩透析し、その後、凍結乾燥して多糖類標品を調製し、ＡＸ−１と命名した。
【００５８】
（実施例３）
ＡＸ−１の分析
【００５９】
（１）物理学的性質
物理学的性質を既報（例えば、特許文献１参照）に従って調査し、下記の結果を得た。
１．呈色反応
アンスロン反応：陽性、カルバゾール反応：陽性、エルソン−モルガン反応：陰性、ヨード反応：陽性
２．溶剤に対する溶解度
水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトン等に不溶である。
３．色及び形状
精製品は白色綿状又は繊維状である。
４．粘度
水溶液は無色透明で粘性を有し、その１％水溶液の粘度は１２００〜２０００（２５℃，３０ｒｐｍ）である。
５．元素分析値
Ｃ＝３４．３±１％：Ｈ＝４．８±１％：Ｎ＝０％：灰分＝３．０±１．０％
６．比旋光度
ナトリウムＤ線に対する２７℃における本物質の比旋光度［α］：０〜＋２０°（Ｃ＝０．３３、水溶液）
７．融点
１００℃で褐色変化、１８０℃で黒褐変化が始まり、２５０℃で分解する。
８．赤外吸収スペクトル
図１に示す通りである。
【００６０】
（２）構成糖の決定
以上の方法で調製したＡＸ−１の糖組成を既報（例えば、非特許文献３参照）に記載の方法を参考にして分析した。
【００６１】
すなわち、凍結乾燥したＡＸ−１の１ｍｇに対して、１００μｌの２Ｎトリフルオロ酢酸を添加し、１２０℃で５時間加熱して、加水分解した。得られた加水分解物を、減圧乾燥してトリフルオロ酢酸を除去した後に、糖分析を行った。糖分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（島津製作所製）を用いて実施した。糖分析のクロマトグラムは、図２に示す通りである。
【００６２】
その結果得られたクロマトグラムのピーク保持時間から糖の種類を同定した。以上の分析の結果から、ＡＸ−１の主構成成分がグルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸であることがわかった。
【００６３】
（３）分子量分析
ＡＸ−１の分子量を以下のＧＰＣ（Ｇｅｌ ｐｅｒｍｉａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析法により分析した。ＧＰＣ分析条件は以下の通りであった。
【００６４】
〔ＧＰＣ分析条件〕
・装置；ＨＬＣ−８２２０（東ソー社製）
・カラム；ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈ（６ｍｍ×１５ｃｍ）×２本（東ソー社製）
・溶離液；５ｍＭ臭化リチウム／ジメチルスルホキサイド
・流速；０．６ ｍｌ／ｍｉｎ
・試料濃度；１ ｍｇ／ｍｌ
・注入量；１０μｌ
・カラム温度；４０℃
・標準物質；プルラン
【００６５】
以上の方法で分析したＡＸ−１の分子量は、約２５０万であった。
【００６６】
（４）構造解析
ＡＸ−１の構造解析を1Ｈ−ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法およびメチル化分析法により解析した。
【００６７】
ＮＭＲ測定条件は以下の通りであった。
・装置；ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子株式会社製）
・波長；５００ＭＨｚ
・溶媒；Ｄ2Ｏ
・試料濃度；１０ｍｇ／ｍｌ（Ｄ2Ｏ置換×２）
・測定温度；８０℃
【００６８】
以上の方法で得られた1Ｈ−ＮＭＲは図３に示す通りである。アノメリック領域のメインピークは次の様にアサイメントされた。すなわち、５．２５ｐｐｍ：→３）−α−Ｍａｎ−（１→、４．５２ｐｐｍ：→３，４）−β−Ｇｌｕ−（１→、４．４７ｐｐｍ：→４）−β−Ｇｌｕ−（１→、４．４４ｐｐｍ：β−ＧｌｕｃＡ−（１→であった。以上から、主鎖としてアセタン（Ａｃｅｔａｎ）に類似した構造をもつことがわかった（例えば、「カーボハイドレイト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２６９巻、２号、ｐ．３１９−３３１、１９９５年参照）。
【００６９】
側鎖構造を解析するため、メチル化分析を行った（例えば、非特許文献１参照）。その結果、メインピークとしてリテンションタイム（ＲＴ）９．１３の部位にβ−Ｇｌｕ（１→、ＲＴ１３．５の部位に→６）−β−Ｇｌｕ（１→、そしてＲＴ１４．９の部位に→６）−β−Ｇａｌ（１→がおおよそ１．６：２．０：１の割合で認められた。
【００７０】
この結果、側鎖末端にグルコースが存在し、グルクロン酸との間にはグルコースとガラクトースが２：１の比で存在していることがわかった。以上の結果から明らかになったＡＸ−１の１次構造は化１に示す通りである。
【００７１】
なお、化１において、Ｇｌｕはグルコースを、Ｍａｎはマンノースを、Ｇａｌはガラクトースを、さらにＧｌｕｃはグルクロン酸を示している。
【００７２】
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【００７３】
なお、この結果、ＡＸ−１の構成糖比は、グルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１であることが確認できたが、このような構成糖比の酸性ヘテロ多糖類は従来報告がなく、構成糖比の面から本発明の酸性ヘテロ多糖類は新規なものであることが確認された。
【００７４】
さらに、上記1Ｈ−ＮＭＲにより解析されたＡＸ−１の構造（化１）についても全く既報はなく、ＡＸ−１は新規な酸性ヘテロ多糖類であることが確認できた。
【００７５】
以上の新規な酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１は、飲食品への利用や薬理作用に着目した応用などにおいて、優れた効果が発揮されることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の構成糖を検出したイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の構造解析をした1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酸性ヘテロ多糖類に関し、さらに詳細には、酢酸菌の一種により生産される新規な酸性ヘテロ多糖類に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は多様な多糖類を生産するが、中でも酢酸菌は多くの多糖類を生産することが知られており、例えば、セルロース、レバン、デキストランなどの単一の構成糖からなるものがある。
【０００３】
一方、ある種の酢酸菌は、異種の構成糖からなり有機酸を含む酸性の水溶性多糖類（以下、酸性ヘテロ多糖類と称する場合もある）を生産することも知られている。
例えば、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌がグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸＝４：０．９〜１．１：０．９〜１．１：０．９〜１．１の構成糖比でアセチル基を４〜８％程度含有するＡＭ−２と称される酸性ヘテロ多糖類を生産することが報告されており（例えば、特許文献１参照）、その後該酸性ヘテロ多糖類はグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸：アセチル基≒４：１：１：１：１の構成糖比であり、その一次構造も明らかにされた（例えば、非特許文献３参照）。
【０００４】
また、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＲＲＬ Ｂ４３株がグルコース：ラムノース：マンノース：グルクロン酸：アセチル基≒４：１：１：１：１〜２の構成糖比を有するアセタン（Ａｃｅｔａｎ）と称される上記ＡＭ−２と構造が類似する酸性ヘテロ多糖類を生産することも報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝１０：３〜６：０．５〜２：０．５〜２の構成糖比の酸性ヘテロ多糖類を生産することが報告されており（例えば、特許文献２参照）、その後、該酸性ヘテロ多糖類はＡＭ−１と称されて、構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝６：２：１：１であることが明らかにされ、また、その一次構造が明らかにされている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
これらの酢酸菌が生産する酸性ヘテロ多糖類は、その粘性特性などから飲食品への利用を中心に幅広く応用が検討されており、さらに、最近では腫瘍抑制作用（例えば、特許文献３参照）やアレルギー抑制作用（例えば、特許文献４参照）などの薬理作用に着目した応用も検討されている。
【０００７】
しかし、さらに優れた効果を有する新規な酸性ヘテロ多糖類を開発することが求められていた。
【非特許文献１】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４８巻、１０号、ｐ．２４０５−２４１４、１９８４年
【非特許文献２】「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌｏｇｙ）」、１３３巻、ｐ．２１２３−２１３５、１９８７年
【非特許文献３】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４９巻、４号、ｐ．９５９−９６６、１９８５年
【特許文献１】特開昭５９−２０３４９８号公報
【特許文献２】特開昭５８−７８５９６号公報
【特許文献３】特開２００４−５９５４９号公報
【特許文献４】特開２００４−５９５４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のように、本発明の目的は、新規な酸性ヘテロ多糖類を発見し、かつ、その製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題に鑑み鋭意検討を重ね、その過程において、食酢製造工程から分離した新規酢酸菌株が新規な酸性ヘテロ多糖類を製造することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明者らは、古くから人類の食用に供されており、歴史的にその安全性が確かめられている各種発酵食品の醸造過程に関与する微生物の多糖類の生産能を広く探索した。
【００１１】
その結果、食酢の発酵槽から分離したアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のの酢酸菌がグルコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸を主要構成成分とする多糖類を生産すること、そしてこの多糖類が従来知られている多糖類とは異なる新規な酸性ヘテロ多糖類であることを見出し、これに基づいて本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、下記の理化学的性質を有する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１に関する。
【００１３】
（１）グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類。
（２）一次構造は、化１に示す通りである。
【００１４】
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【００１５】
また、請求項２に記載の本発明は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌を培養し、培養物より酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１を採取すること、を特徴とする請求項１に記載の酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の製造方法に関する。
【００１６】
更に、請求項３に記載の本発明は、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法に関する。
【００１７】
そして、請求項４に記載の本発明は、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）であること、を特徴とする請求項３に記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、新規な酸性ヘテロ多糖類が提供され、さらに該酸性ヘテロ多糖類を効率良く生産可能な生産菌を取得することができ、該生産菌を用いることにより新規な酸性ヘテロ多糖類を効率良く生産する方法を提供することが可能となる。そして、本発明に係る多糖類は、古来から食酢醸造に使用され、歴史的にその安全性が確認されている酢酸菌が生産する多糖類であって、天然由来ということができ、増粘剤、増粘・乳化安定剤等として食品工業のほか、化粧品工業、薬品工業、その他各種工業において広く利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１に関するものであって、アセトバクター属細菌を使用することにより、その製造を可能にしたものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
（１）本発明の生産菌
本発明の新規な酸性ヘテロ多糖類を生産する酢酸菌は、食酢製造工程中に存在するので、食酢原料諸味や食酢発酵液などを分離源として、適切な培地、培養条件を設定して、集積培養を行った後、選択することによって取得可能である。
【００２１】
このようにして選抜される新規な酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌は、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌であり、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）が好ましく、なかでもアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株は最も優れたものとして例示される。
【００２２】
なお、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００２３】
（２）本発明の酸性ヘテロ多糖類の生産
本発明の酸性ヘテロ多糖類は、例えば次のような方法で製造することができる。すなわち、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）を適当な培地に培養し、培養物から上記酸性ヘテロ多糖類を採取することにより製造できる。
【００２４】
また、上記多糖類は酸性物質であるので、菌体を除いた培養液にセチルトリメチルアンモニウムブロマイドなどを添加して上記多糖類を沈澱させることにより回収することができる。
【００２５】
粗精製の上記多糖類は多糖類の精製法に従って精製することができる。例えば粗精製の上記多糖類を水に再溶解し、熱処理後、遠心分離して不溶物を完全に除去し、アセトンなどの沈殿剤で再沈澱を繰り返すことにより純度の高い白色綿状の精製された上記多糖類が得られる。
【００２６】
また、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドによる沈澱（ＣＴＡＢ処理）、透析、およびイオン交換樹脂などを併用して高純度の精製品を得ることもできる。
【００２７】
（３）本発明の酸性ヘテロ多糖類
本発明の酸性ヘテロ多糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類である。
【００２８】
本発明の多糖類は、２Ｎトリフルオロ酢酸を添加し、１２０℃、５時間処理し加水分解した後、減圧乾固によりトリフルオロ酢酸を除去した後、乾固物を液体クロマトグラフィーで分析すると、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸が主構成糖であることが確認される。
【００２９】
また、本発明の多糖類は、セチルトリメチルアンモニウムブロマイドあるいはセチルピリジニウムクロライドを添加すると白色沈澱が生じるので、酸性である。
【００３０】
すなわち、本発明の多糖類は、グルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とする酸性へテロ多糖類である。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３２】
（実施例１）
生産菌の分離と同定
【００３３】
（１）生産菌の分離
食酢発酵槽からサンプリング後、ＹＰＧ培地を５ｍｌ含む試験管で２４時間、３０℃で培養した。その後ＹＰＧ培地により１／１０に希釈して、さらに２４時間の試験管培養を行った。この培養液を６％グルコース、１％酵母エキス、０．４％ポリペプトン、２％炭酸カルシウムおよび１．５％寒天を含む寒天培地に播種し、３０℃で５日間静置培養を行い、光沢かつ粘性を示すコロニーを得た。この操作を単一コロニーが得られるまで数回繰り返した。
【００３４】
最終的に得られたコロニーを釣菌して上記組成のスラント寒天培地に植え継ぎ、３０℃で３日間培養した後、４℃にて保存した。
【００３５】
（２）生産菌の同定
上記のようにして得られた生産菌の菌学的性質を下記の如くにして調べた。
なお、菌学的性質は各種同定書（例えば、１９７５年６月２０日東京大学出版会発行、長谷川武治編著「微生物の分類と同定」、ザ・ジャーナル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１０巻、第２号、ｐ．９５〜１２６、１９６４年、およびザ・ソサエティー・フォー・アプライド・バクテリオロジー・テクニカル・シリーズ・Ｎｏ．２（Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．２）アイデンティフィケイション・メソッズ・フォー・マイクロバイオロジスツ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ）、ｐ．１〜８、１９６８年参照）に従って実施した。
【００３６】
また、酵母エキス−ブドウ糖寒天培地は酵母エキス５ｇ、ブドウ糖３０ｇ、ポリペプトン３ｇ、寒天１５ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節したもの、酵母エキス−ブドウ糖液体培地は酵母エキス５ｇ、ブドウ糖３０ｇ、ポリペプトン３ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節して滅菌後、エタノールを３％（Ｖ／Ｖ）無菌的に添加したもの、ＭＹ平板培地はブドウ糖１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、モルトエキス３ｇ、寒天１５ｇを蒸留水１リッターに溶解し、ｐＨを６．５に調節したもの、肉汁液体培地は肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇを蒸留水１リッターに溶解しｐＨを６．５に調節したもの、加糖肉汁液体培地はブドウ糖１０ｇ、肉エキス１０ｇ、ポリペプトン１０ｇを蒸留水１リッターに溶解しｐＨを６．５に調節したものである。
【００３７】
そして、また、ユビキノンの同定は濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、赤外部および紫外部吸光スペクトラムおよび質量分析法で行った。
【００３８】
Ｉ．形態的所見
形状 短桿状
大きさ ０．５〜０．７×１．０〜１．２μｍ
集団 単独あるいは連鎖状
運動性 なし
胞子形成 形成せず
グラム染色 陰性
抗酸化 陰性
【００３９】
II．培養的所見
１．酵母エキス−ブドウ糖寒天平板培地培養（３０℃で４日間培養）
形状 円形
辺縁 平滑で全縁
隆起 隆起状（Ｒａｉｓｅｄ）
光沢 有り
表面 平滑
色調 淡黄色で光沢あり
２．炭酸カルシウム含有酵母エキス−ブドウ糖斜面培養（３０℃で３日培養）
生育の良否 良好
隆起 中程度
表面 平滑
辺縁 平滑で全縁
色調 淡黄色で光沢あり
３．エタノール含有酵母エキス−ブドウ糖液体静置培養（３０℃で４日間培養）
よく生育する。湿潤でもろい菌膜を形成する。混濁し、一部は底に沈殿する。セルロースからなる厚膜を形成しない。
４．肉汁液体静置培養（３０℃で７日間培養）
生育乏しい。セルロースからなる厚膜を形成しない。リング状に生育する。
５．ブドウ糖含有肉エキス液体静置培養（３０℃で７日間培養）
生育良好。セルロースからなる厚膜を形成しない。培養液は混濁し、一部は沈殿する。薄い菌膜を形成する。
６．ＭＹゼラチン高層培養（２０℃で７日間培養）
生育良好。液化性無し。
７．リトマスミルク（３０℃で７日間培養）
凝固性なし。
【００４０】
III．生理学的性質
１．硝酸塩の還元 なし
２．脱窒反応 なし
３．ＶＰテスト 陰性
４．インドールの生成 なし
５．硫化水素の生成 なし
６．デンプンの加水分解 なし
７．クエン酸の利用（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地） なし
８．無機窒素源の利用 なし（硝酸塩） なし（アンモニウム塩）
９．培地中への色素の生成 なし
１０．ウレアーゼ活性 なし
１１．カタラーゼ活性 あり
１２．生育ｐＨ範囲 ３．０〜７．５（最適ｐＨ範囲 ４．０〜５．５）
１３．生育温度範囲 １５〜３５℃ （最適温度範囲 ２０〜２８℃）
１４．酸素に対する態度 好気的
１５．５−ケトグルコン酸の生成 あり
１６．ジヒドロキシアセトンの生成 あり
１７．エタノールの資化性 エタノールを弱く資化し酢酸を生成する
１８．酢酸の資化性 なし
１９．乳酸の資化性 なし
２０．ビタミン要求性 あり
２１．酢酸の分解性 あり
２２．乳酸の分解性 あり
２３．塩化第２鉄反応 陰性（グルコース培地）
【００４１】
IV．炭素源の資化性および酸とガスの生成
表１に示す通りである。なお、表中の記号の意味は以下の通りである。すなわち、＋：資化する又は生成する、＋＋：よく資化する又はよく生成する、＋＋＋：非常によく資化する又は非常によく生成する、−：資化しない又は生成しない、±：わずかに資化する又はわずかに生成する、である。
【００４２】
【表１】
【００４３】
Ｖ．電子伝達系の補酵素の種類
補酵素の主要成分：ユビキノン−１０
【００４４】
以上の結果、本生産菌はグラム陰性の好気性桿菌でエタノールを酸化して酢酸を生成し、またｐＨ３．０でも増殖できることから、一般に酢酸菌と呼ばれるアセトバクター属もしくはグルコノバクター属に属することは明らかである。
【００４５】
また、本生産菌は主たるユビキノンタイプがＱ10でビタミンが生育に必須であり、またジヒドロキシアセトンの生成能を有する点ではグルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）としての性質を有するが、一方酢酸および乳酸の分解性を示す点ではアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）としての性質を示し、アセトバクター属またはグルコノバクター属のいずれとも断定し難いが、酢酸および乳酸の分解性を示すこと、および培地中にグルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸を主構成成分とする上記した新規な酸性ヘテロ多糖類を蓄積する能力があることにより、本発明の生産菌はアセトバクター属に属すると認定するのが妥当であると考えられた。
【００４６】
さらに、主要なユビキノンとしてＱ10を有するアセトバクター属としては、アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）およびアセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・リケファシエンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）が挙げられる。
【００４７】
このうち、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・リケファシエンスとは、グルコース培地でのＦｅＣｌ3反応、エタノール存在下での生育、色素形成などの点で異なっている。
【００４８】
アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）とは、セルロース生成能の有無で異なるが、セルロース生成能は非常に欠落しやすいということを考慮に入れ、本生産菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）のセルロース生成能が欠落した菌であると考えた。
【００４９】
以上の結果から、本生産菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｙｌｉｎｕｍ）に属すると認定するのが妥当であると同定され、その結果、本菌はアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５と命名されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。
【００５０】
（実施例２）
本発明の酸性ヘテロ多糖類の調製
【００５１】
（１）酸性ヘテロ多糖類の調製
使用酢酸菌株として、アセトバクター・ザイリナムＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）を用い、以下の方法で酸性ヘテロ多糖類を生産した。
【００５２】
まず、３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％ポリペプトン、２％炭酸カルシウムおよび１．５％寒天を含む寒天培地に上記菌株を植菌し、３０℃に３日間静置することでコロニーを形成させた。
【００５３】
次に、ＰＰ培地（３％グルコース、３％マンニトール、０．２％酵母エキス、０．００９％リン酸水素２カリウム、０．０１％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム、０．０００９％塩化第二鉄、０．５％クエン酸ナトリウム）を７ｍｌ含む試験管に白金耳で集めた上記コロニーを接種し、３０℃で２４時間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。この前々培養液をＰＰ培地１００ｍｌ含む５００ｍｌ容の坂口フラスコに１ｍｌ接種し、３０℃で４８時間、１２０ｒｐｍで振とう培養した。
【００５４】
上記前培養液を、ＰＰ培地を２．５Ｌ含む５Ｌ容のジャーファーメンターに２５ｍｌ接種し、３０℃、３５０ｒｐｍ、０．５ｖｖｍで１２０時間、本培養を行うことで酸性ヘテロ多糖類を生産させた。
【００５５】
この培養液から、既報（例えば、非特許文献３参照）に記載の方法によって酸性ヘテロ多糖類の凍結乾燥標品を得た。
【００５６】
すなわち、培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、３０分間）後、上清をセライト濾過によって培養菌体を完全に除去した。これを蒸留水で溶解して５％セチルトリメチルアンモニウムブロマイドを添加し、沈澱する酸性多糖類画分を回収した。
【００５７】
回収された酸性ヘテロ多糖類画分を２０％ＮａＣｌに溶解後、流水中で一晩透析した。透析終了後、エタノールを添加して得られた沈澱を回収した後、蒸留水に対してさらに一晩透析し、その後、凍結乾燥して多糖類標品を調製し、ＡＸ−１と命名した。
【００５８】
（実施例３）
ＡＸ−１の分析
【００５９】
（１）物理学的性質
物理学的性質を既報（例えば、特許文献１参照）に従って調査し、下記の結果を得た。
１．呈色反応
アンスロン反応：陽性、カルバゾール反応：陽性、エルソン−モルガン反応：陰性、ヨード反応：陽性
２．溶剤に対する溶解度
水に可溶で、エタノール、エーテル、アセトン等に不溶である。
３．色及び形状
精製品は白色綿状又は繊維状である。
４．粘度
水溶液は無色透明で粘性を有し、その１％水溶液の粘度は１２００〜２０００（２５℃，３０ｒｐｍ）である。
５．元素分析値
Ｃ＝３４．３±１％：Ｈ＝４．８±１％：Ｎ＝０％：灰分＝３．０±１．０％
６．比旋光度
ナトリウムＤ線に対する２７℃における本物質の比旋光度［α］：０〜＋２０°（Ｃ＝０．３３、水溶液）
７．融点
１００℃で褐色変化、１８０℃で黒褐変化が始まり、２５０℃で分解する。
８．赤外吸収スペクトル
図１に示す通りである。
【００６０】
（２）構成糖の決定
以上の方法で調製したＡＸ−１の糖組成を既報（例えば、非特許文献３参照）に記載の方法を参考にして分析した。
【００６１】
すなわち、凍結乾燥したＡＸ−１の１ｍｇに対して、１００μｌの２Ｎトリフルオロ酢酸を添加し、１２０℃で５時間加熱して、加水分解した。得られた加水分解物を、減圧乾燥してトリフルオロ酢酸を除去した後に、糖分析を行った。糖分析は、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（島津製作所製）を用いて実施した。糖分析のクロマトグラムは、図２に示す通りである。
【００６２】
その結果得られたクロマトグラムのピーク保持時間から糖の種類を同定した。以上の分析の結果から、ＡＸ−１の主構成成分がグルコース、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸であることがわかった。
【００６３】
（３）分子量分析
ＡＸ−１の分子量を以下のＧＰＣ（Ｇｅｌ ｐｅｒｍｉａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析法により分析した。ＧＰＣ分析条件は以下の通りであった。
【００６４】
〔ＧＰＣ分析条件〕
・装置；ＨＬＣ−８２２０（東ソー社製）
・カラム；ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷＭ−Ｈ（６ｍｍ×１５ｃｍ）×２本（東ソー社製）
・溶離液；５ｍＭ臭化リチウム／ジメチルスルホキサイド
・流速；０．６ ｍｌ／ｍｉｎ
・試料濃度；１ ｍｇ／ｍｌ
・注入量；１０μｌ
・カラム温度；４０℃
・標準物質；プルラン
【００６５】
以上の方法で分析したＡＸ−１の分子量は、約２５０万であった。
【００６６】
（４）構造解析
ＡＸ−１の構造解析を1Ｈ−ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法およびメチル化分析法により解析した。
【００６７】
ＮＭＲ測定条件は以下の通りであった。
・装置；ＪＮＭ−Ａ５００（日本電子株式会社製）
・波長；５００ＭＨｚ
・溶媒；Ｄ2Ｏ
・試料濃度；１０ｍｇ／ｍｌ（Ｄ2Ｏ置換×２）
・測定温度；８０℃
【００６８】
以上の方法で得られた1Ｈ−ＮＭＲは図３に示す通りである。アノメリック領域のメインピークは次の様にアサイメントされた。すなわち、５．２５ｐｐｍ：→３）−α−Ｍａｎ−（１→、４．５２ｐｐｍ：→３，４）−β−Ｇｌｕ−（１→、４．４７ｐｐｍ：→４）−β−Ｇｌｕ−（１→、４．４４ｐｐｍ：β−ＧｌｕｃＡ−（１→であった。以上から、主鎖としてアセタン（Ａｃｅｔａｎ）に類似した構造をもつことがわかった（例えば、「カーボハイドレイト・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２６９巻、２号、ｐ．３１９−３３１、１９９５年参照）。
【００６９】
側鎖構造を解析するため、メチル化分析を行った（例えば、非特許文献１参照）。その結果、メインピークとしてリテンションタイム（ＲＴ）９．１３の部位にβ−Ｇｌｕ（１→、ＲＴ１３．５の部位に→６）−β−Ｇｌｕ（１→、そしてＲＴ１４．９の部位に→６）−β−Ｇａｌ（１→がおおよそ１．６：２．０：１の割合で認められた。
【００７０】
この結果、側鎖末端にグルコースが存在し、グルクロン酸との間にはグルコースとガラクトースが２：１の比で存在していることがわかった。以上の結果から明らかになったＡＸ−１の１次構造は化１に示す通りである。
【００７１】
なお、化１において、Ｇｌｕはグルコースを、Ｍａｎはマンノースを、Ｇａｌはガラクトースを、さらにＧｌｕｃはグルクロン酸を示している。
【００７２】
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【００７３】
なお、この結果、ＡＸ−１の構成糖比は、グルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１であることが確認できたが、このような構成糖比の酸性ヘテロ多糖類は従来報告がなく、構成糖比の面から本発明の酸性ヘテロ多糖類は新規なものであることが確認された。
【００７４】
さらに、上記1Ｈ−ＮＭＲにより解析されたＡＸ−１の構造（化１）についても全く既報はなく、ＡＸ−１は新規な酸性ヘテロ多糖類であることが確認できた。
【００７５】
以上の新規な酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１は、飲食品への利用や薬理作用に着目した応用などにおいて、優れた効果が発揮されることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の赤外吸収スペクトルを示す図である。
【図２】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の構成糖を検出したイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明の新規酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の構造解析をした1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１。
（１）グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類。
（２）一次構造は、化１に示す通りである。
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【請求項２】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌を培養し、培養物より酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１を採取すること、を特徴とする請求項１に記載の酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の製造方法。
【請求項３】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）であること、を特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）であること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１。
（１）グルコース、ガラクトース、マンノース及びグルクロン酸を主構成成分とし、その構成糖比がグルコース：ガラクトース：マンノース：グルクロン酸＝５：１：１：１である酸性ヘテロ多糖類。
（２）一次構造は、化１に示す通りである。
（化１）
→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｕ−（１→
３
↑
１
α―Ｄ−Ｍａｎ
２
↑
１
β−Ｄ−ＧｌｕｃＡ
４
↑
１
α−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇａｌ
６
↑
１
β−Ｄ−Ｇｌｕ
【請求項２】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌を培養し、培養物より酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１を採取すること、を特徴とする請求項１に記載の酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１の製造方法。
【請求項３】
アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酸性ヘテロ多糖類ＡＸ−１生産菌がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）であること、を特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）がアセトバクター・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ）ＮＣＩ１００５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４１５）であること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１３８０６１（Ｐ２００７−１３８０６１Ａ）
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３３５４５３（Ｐ２００５−３３５４５３）
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２１日（２００５．１１．２１）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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