間充織幹細胞による腎疾患及び多臓器不全の治療法と間充織幹細胞馴化培地
間充織幹細胞により馴化した培地を含み、臓器機能不全、急性腎不全、多臓器不全、移植腎の早期機能不全、移植片拒絶反応、慢性腎不全、創傷及び炎症性疾患の治療のための方法と組成が提供される。また、間充織幹細胞、又は間充織幹細胞由来の内皮細胞、又は間充織幹細胞により馴化した培地の治療量を投与することを含む、増殖因子及びサイトカイン発現を調節するための方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概しては臓器機能不全、多臓器不全、腎機能障害、創傷治癒及び炎症性疾患の治療法に関し、より具体的には、間充織幹細胞、事前分化により間充織幹細胞から派生した内皮細胞、間充織幹細胞馴化培地、あるいはそれらの組成物を用いた治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多臓器不全（ＭＯＦ：Ｍｕｌｔｉ−Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ）は未解決のまま残されている大きな医学的問題である。ＭＯＦは、敗血症を伴う重病患者にて（特に大きな手術や外傷を経験した後に）発生する。急性循環不全、急性腎不全（ＡＲＦ：Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、細胞膜漏出、そして肺、肝臓、心臓、血管及び他の臓器における機能不全といった特徴がＭＯＦには見られる。挿管及び換気補助、昇圧剤や抗生物質及びステロイドの投与、血液透析、そして非経口的栄養法などをはじめとする最も積極的な形態の療法を利用してもＭＯＦによる死亡率は１００％に近い。それに加えて、手術創又は外傷による創傷に感染が生じるとそれらの治癒に大きな障害をもたらし、感染の再発やさらなる疾病率及び死亡率[の上昇]に寄与することになる。
【０００３】
ＡＲＦとは、「数時間又は数日間以内の腎機能における急性劣化であり、通常は腎臓で取り除かれるはずの有毒代謝物質が蓄積して生じるもの」、として定義されている。ＡＲＦの最も一般的な要因としては、腎尿細管及び腎糸球体末端部の血管内皮細胞に生じる虚血性傷害が挙げられる。このような虚血性ＡＲＦの主な病因論としては、出血や血栓事象、急性循環不全、ショック（ｓｈｏｃｋ）、敗血、大掛かりな心臓血管外科手術、動脈狭窄などから生じる血管内容積の収縮が挙げられる。一方、腎毒性ＡＲＦは放射線造影剤が原因とされており、例えば化学療法剤、抗生物質、シクロスポリンなどの薬剤が頻繁に使用される。ＡＫＦを伴う危険が最も高い患者としては、糖尿病患者、本来から腎疾患・血管疾患・肝臓病・心疾患を有する患者、高齢者、癌患者、及び様々な原因で低血圧を伴う患者などが挙げられる。
【０００４】
虚血性及び腎毒性のＡＲＦは尿細管細胞の細胞死をもたらす。致死下に損傷を受けた尿細管細胞は脱分化し、極性を失い、そしてビメンチン、間充織細胞マーカー、Ｐａｘ−２、（通常胎生腎中の間充織上皮分化転換の過程においてのみ発現する）転写因子を発現する。
【０００５】
腎臓は、激しい急性発作の後でさえも自己再生成し、それによってほぼ正常な機能を回復できる驚くべき能力を持っている。損傷を受けたネフロン（腎単位）片節の再生成は、残存する尿細管細胞の移動と増殖と再分化及び内皮細胞の並列修復の結果であると考えられている。但し、重症のＡＲＦの場合には、残存する尿細管細胞・内皮細胞の自己再生成能力を超過してしまう。何らかの原因により孤立性ＡＲＦ（即ち、ＭＯＦを伴わずに単独で生じるＡＲＦ）を伴う患者の死亡率は引き続き５０％以上である。集中治療による補助と血液透析、並びに最近使用されている心房性ナトリウム利尿ペプチド、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）、より優れた生物学的適合性を有する透析膜、持続的血液透析などの介入法が存在するにもかかわらず、前記のような惨憺たる予後の改善は見られていない。
【０００６】
別のタイプの急性型腎不全である移植関連急性腎不全（ＴＡ−ＡＲＦ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）は多くの場合腎臓移植によりもたらされる。腎臓の被移植者はきまって早期移植片機能不全（ＥＧＤ：Ｅａｒｌｙ Ｇｒａｆｔ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）を起こし、その結果腎臓機能の損失につながり、移植片機能が回復するまで血液透析による治療が必要になる。臓器提供者が高齢者であったり極めて低年齢であったりする場合、又は欄外の移植片品質が限界レベルの場合、あるいは死体臓器提供者から該提供者の腎臓を採出する時点から及び被移植者の体内へそれを移植するまでの時間（「冷虚血時間」として知られている）が長期間に及ぶ場合には、ＴＡ−ＡＲＦの危険性が高くなる。ＴＡ−ＡＲＦによる早期移植片機能不全は、ＴＡ−ＡＲＦによって生じる進行性且つ不可逆的な腎臓機能の損失による移植片機能損失の加速化や、急性拒絶反応出現率の上昇により移植腎の早期喪失につながるなど、深刻な長期的影響を伴う。したがって、ＴＡ−ＡＲＦによる早期移植片機能不全に対する治療又は予防を提供する必要がある。
【０００７】
慢性腎不全（ＣＲＦ）は、ネフロン（腎単位）の進行性損失とそれに続く腎機能の損失である。腎臓の糸球体損傷、血管損傷及び炎症性損傷は共に最終的なネフロン損失と終末期腎疾患に起因する。本質的にあらゆる形態のＣＲＦにおける最終共通路は、腎間質に最も目立って現われる自己永続可能な繊維化及び硬化過程である。
【０００８】
多くの腎障害の特徴としては、腎外性障害同様に、極めて炎症誘発的な性質を持っている、ということが挙げられる。例えば、終末期腎疾患の患者における感染及び敗血は死亡率の上昇につながる。様々な増殖因子及びサイトカインはこれらの障害の病態生理において中心的な役割を果たす。このような増殖因子やサイトカインのレベルを調節することにより、炎症反応などの疾患を伴う患者に対する治療法を提供できる。
【０００９】
これらをもとに、ＡＲＦの予防や、自然腎に既存するＡＲＦ自体の治療又はＭＯＦの一部としてのＡＲＦの治療、移植腎のＡＲＦの治療、臓器不全一般及び炎症の治療に現在利用されている療法では、多数存在する当該の患者グループにおける疾病率と死亡率を著しく改善することに成功していない。それ故に、ＭＯＦや腎機能障害、臓器不全及び炎症性障害の治療を改善する必要性が差し迫っている。
【００１０】
本発明は、ＭＯＦ、腎機能障害、臓器不全、炎症性及び変形性障害を治療するための、且つ、これらの患者の損傷臓器中の増殖因子とサイトカインの発現をこれらの患者の体内において調節するための、間充織幹細胞と間充織細胞由来の内皮細胞及び間充織幹細胞からの馴化培地を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
先行技術の短所を一つ又は複数緩和するための治療法と組成物をここに提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様は、臓器機能不全、急性腎不全、多臓器不全、移植腎の早期機能不全、移植片拒絶反応、慢性腎不全、創傷及び炎症性障害を治療する方法を提供する。該方法には、間充織幹細胞（ＭＳＣ）にさらすことによって馴化された薬剤として許容される培地の治療量を、それを必要とする患者に導入することが含まれる。
【００１３】
本発明の別の様態では組成物が提供されている。該組成物には、ＭＳＣにさらすことによって馴化された薬剤として許容される培地が含まれる。
【００１４】
本発明の別の様態は、患者の損傷臓器における少なくとも一つの増殖因子の発現を調節する方法を提供する。該方法には、増殖因子の発現を調節するために有効量のＭＳＣ、内皮細胞（ＥＣ）又はＭＳＣ馴化培地を患者に投与することが含まれる。
【００１５】
本発明の別の様態は、患者の損傷臓器における少なくとも一つのサイトカインの発現を調節する方法を提供する。該方法には、サイトカインの発現を調節するために有効量のＭＳＣ、内皮細胞又はＭＳＣ馴化培地を患者に投与することが含まれる。
【００１６】
当業者であれば、以下例証として提示且つ説明される発明の好ましい実施形態の説明から本発明の利点を明確に理解できるはずである。当然のことながら、当該発明にはその他の及び異なる実施形態も適用でき、また、その詳細については種々様々な点で変更態様を適用できる。よって、図面及び明細書の説明は、本質的に例として記載されているに過ぎず本発明を制限するものではない、と見なされるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、間充織幹細胞、間充織幹細胞由来の内皮細胞、間充織幹細胞由来の馴化培地、及びそれらの組合わせを、損傷組織の修復、組織損傷の危険の高い患者における組織と臓器との損傷の回復及び予防、及び損傷臓器内のサイトカインと増殖因子発現レベルの調節に利用する。本発明の一態様では、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を必要とする患者に間充織幹細胞を投与しうる。多臓器不全、ならびに例としてはこれらに限定されないが自然腎の急性腎不全や多臓器不全に伴う自然腎のＡＲＦ及び移植腎臓のＡＲＦをはじめとする腎機能障害、臓器機能不全、創傷治癒、及び炎症性疾患の治療又は予防にＭＳＣの投与を使用しうる。また、炎症性疾患の治療又は予防など、患者の炎症性サイトカイン及び増殖因子の発現を調節するためにもＭＳＣを使用しうる。なお当業者にとっては当然のことながら、前記以外の疾患の治療又は予防のためにもＭＳＣを投与しうる。
【００１８】
本発明の別の様態では、培養中でＭＳＣにさらすことによって馴化された培地（ＭＳＣ馴化培地：ＭＳＣ−ＣＭ）を、それを必要とする患者に投与しうる。一例として、下記のものに限定されないが、多臓器不全、ならびに例としてはこれらに限定されないが自然腎の急性腎不全や、多臓器不全における自然腎のＡＲＦ、移植腎臓のＡＲＦをはじめとする腎機能障害、臓器機能不全、創傷治癒、及び炎症の治療又は予防にＭＳＣ−ＣＭを使用しうる。また、炎症性疾患の治療又は予防など、患者の炎症性サイトカイン及び増殖因子の発現を調節するためにもＭＳＣ−ＣＭを使用しうる。なお当業者にとっては当然のことながら、前記以外の疾患の治療又は予防のためにもＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。
【００１９】
定義
【００２０】
「幹細胞」という用語は、自己再生能を有し様々な細胞型に分化する細胞のいかなるものをも指す。ここで使用される幹細胞は、「成体の」幹細胞である。即ち、該幹細胞は胚芽に由来するものではない。
【００２１】
「培養」又は「細胞培養」という用語は、細胞（複数可）が一般的に細胞増殖との適合性を有する又はその生存可能性を維持するための割当場所及び増殖条件となるように定義される境界内にある一つ又は複数の細胞を指す。なお、「培養」という用語は動詞として使用される場合、細胞の増殖又はそれの生存可能性の維持に適する当該場所及び増殖条件を提供する過程を示す。
【００２２】
「馴化培地」という用語は、開始培地中には存在しなかった細胞によって生成された少なくとも一つの付加的成分を培地に含むのに十分な時間をかけて、培養中で増殖された細胞にさらされた培地を指す。本発明で使用する馴化培地を培養中の細胞から取り除き、０．２２μＭのフィルタを通してろ過することにより、馴化培地が殺菌され、且ついかなる細胞、細胞断片及び微粒子が除去される。開始培地は、例えばＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（メリーランド州ロックヴィル市）やＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス市）又はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（メリーランド州ウォーカーズヴィル市）などの製造供給元から市販される培地を含む、当業者に周知のいかなる培地をも使用しうる。培地を必要とする患者への投与に使用される培地は、薬剤として許容される組成物として（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ＜生体内＞での用途に適切な形態で）準備される。これは一般に、発熱物質並びにその他のヒト又は動物に有害でありうる不純物を本質的に含まない培地組成を準備することを要する。薬剤として許容される培地は、上記のような製造供給元により市販されている。「薬剤として許容される」という語句は、動物又はヒトに投与された時に副作用やアレルギー反応又は他の有害反応をもたらさない分子的実体と組成に関する。また補助的有効成分を組成物に組み入れることも可能である。
【００２３】
「治療有効量」という用語は、毒性をもたらさず、いかなる医学的治療の際にも適度なベネフィットリスク比（対危険便益比）を伴う望ましい結果及び効能を提供するのに十分な幹細胞又は馴化培地の量を指す。
【００２４】
「治療有効時間」という用語は、馴化培地又は幹細胞の治療有効量が投与されるまでの期間であり、且つある状態の症状を一つ又は複数軽減するのに十分な期間を指す。
【００２５】
「治療する」という用語は、ある状態の症状の少なくとも一つを改善させることを指す。
【００２６】
「状態」という用語は、疾病、及び／又は傷害（例えば外傷など）や治療（例えば、手術や臓器提供者からの組織の移植など）に対する反応
を指すために用いられている。
【００２７】
「増殖因子」という用語は、それ自体及び／又は他の様々な隣接の又は遠隔の細胞に作用をもたらすことができる細胞によって生成されるところの、タンパク質、ポリペプチド、又はサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。一般に増殖因子は、発達上又は多数の生理的刺激若しくは環境刺激に反応することのいずれかにおいて、特定の細胞型の増殖及び／又は分化に影響する。代表的な増殖因子の例としては、これらに限定されないが、インシュリン、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、基本的ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦｓ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、変換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β３を含む変換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモンインターロイキン、プロスタグランジン及びその他同等のものが挙げられる。
【００２８】
ここに使用される「サイトカイン」又は「サイトカイン（複）」という用語は、細胞間の相互作用に影響し且つ免疫反応の持続期間と強度を調整する生体分子の一般クラスを指す。また、これらの分子は細胞外環境において生じる過程も調整する。
【００２９】
「炎症誘発サイトカイン」という用語が示すものの例としてはこれらに限定されないが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−１β）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、リポ多糖類結合蛋白質、溶性リポ多糖類受容体（ＣＤ−１４）、ケモカインが挙げられる。ケモカインは、特異的な白血球細胞亜型の活性化因子及び走化性因子として主に作用する４０以上の小さな（約６〜約１４ｋＤａ前後の）誘導型且つ分泌型の炎症誘発ポリペプチド超科に属する。
【００３０】
「抗炎症性サイトカイン」という用語が指すものの例としてはこれに限定されないが、溶性のＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ＲＩ及びＴＮＦ−ＲＩＩ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及び変換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）が挙げられる。
【００３１】
「炎症性（の）」という用語は疾病又は状態に関連して用いられる場合、正規の方法には不適当な及び／又は正規の方法では解消されない炎症が原因で生じた、又はそれによりもたらされた、又はそれをもたらす病理過程を指す。炎症は、物理学的作用物質、化学的作用物質又は生物学的作用物質によってもたらされた傷害又は異常な刺激に反応して生じる。これらの反応としては、局所反応や、その結果として生じる形態学的変化、有害物質の破壊又は除去、及び修復及び治癒につながる反応が挙げられる。炎症性疾患及び炎症状態は全身性でありうるし、若しくは特定の組織又は臓器に局所的に生じうる。
【００３２】
次のものを含む多くの疾患（以下の例示には限定されない）で炎症が生じるということは既知の事実である。全身炎症反応（ＳＩＲＳ）；アルツハイマー病（及び、慢性神経炎症、神経膠活性化、小膠細胞の増加、老人斑の形成、及び療法に対する反応などのそれに関連した状態と症状）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；関節炎（及び、急性関節炎、抗原誘導性の関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎に関連した関節炎、コラーゲン誘導性の関節炎、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、予後の連鎖球菌誘導性の関節炎、脊椎関節症、痛風性関節炎などを含むがこれらに限定されない、それに関連した状態と症状）；喘息（及び、気管支喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息及び職業性喘息などのそれに関連した状態と症状）；心疾患（及び、動脈硬化、自己免疫性心筋炎、慢性心臓低酸素状態、鬱血心不全、冠動脈疾患、心筋症、及び大動脈平滑筋細胞活性化、心臓アポトーシス及び心臓細胞機能の免疫修飾を含む心臓細胞機能不全などのそれに関連した状態と症状）；糖尿病（及び自己免疫の糖尿病、インシュリン依存性（１型）糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症及び糖尿病腎症などのそれに関連した状態と症状）；胃腸の炎症（及び、セリアック病、関連骨減少症、慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸感染、及び潰瘍性大腸炎などのそれに関連した状態と症状）；胃潰瘍；ウイルス性肝炎及びその他のタイプの肝炎などの肝性炎症；コレステロール胆石と肝線維症；ＨＩＶ感染症（及び、変性反応、神経変性反応及びＨＩＶ関連ホジキン病などのそれに関連した状態と症状）；川崎症候グループ（及び、皮膚粘膜リンパ節症候グループ、頚リンパ節腫症、冠動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度の貧血、皮膚剥離、発疹、結膜発赤、血小板増加症などのそれに関連した状態と症状）；多発性硬化症、腎症（及び、糖尿病腎症、末期腎臓疾患、急性・慢性糸球体腎炎、急性・慢性間質性腎炎、狼瘡腎炎、グッドパスチャー症候グループ、血液透析残存物及び腎臓部の虚血再潅流傷害などのそれに関連した状態と症状）；神経変性病（及び、急性神経変性、老化と神経変性病におけるＩＬ−１の誘発、視床下部神経細胞のＩＬ−１誘発塑化、及び慢性ストレス超反応などのそれに関連した状態と症状）；眼障害（及び、糖尿病性網膜症及びグレーブス眼障害、ブドウ膜炎などを含むそれに関連した状態と症状）；骨粗鬆症（及び、歯槽骨、大腿骨、橈骨、椎骨又は手根骨の骨量の減少又は骨折発生率、閉経後の骨量の減少、塊化、骨折の発生率、又は骨量の減少速度などのそれに関連した状態と症状）；中耳炎（成人又は小児）、膵臓炎又は膵臓細葉炎、歯周病（及び、成人、早期発症、及び糖尿病などのそれに関連した状態と症状）；肺疾患（慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎、ヒアリン膜症、ＳＩＤＳにおける低酸素状態及び肺疾患などを含む）；冠動脈又は他の血管移植片の再狭窄；リウマチ（関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ性疾患及びリウマチ性心筋炎などを含む）；慢性リンパ球性甲状腺炎を含む甲状腺炎；尿路感染（慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候グループ及び尿石症などを含む）等。円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス病、グレーブス眼障害、硬化性苔癬、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、甲状腺疾患（例えば、甲状腺腫及びリンパ腫症性甲状腺腫〔橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫〕、睡眠障害や慢性疲労症候グループ及び肥満〔非糖尿病性のものと、糖尿病関連のものの両方を含む〕）などの自己免疫疾患を含む免疫疾患。細菌、ウイルス（例えば、サイトメガロウィルス、脳炎、エプスタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウイルスなど）、又は原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマなど）によってもたらされるリーシュマニア症、らい病、ライム病、ライム病心臓炎、マラリア、大脳マラリア、脳膜炎、マラリア関連の尿細管間質性腎炎）などの感染病に対する抵抗。脳外傷（卒中及び虚血、脳炎、脳症、癲癇、周産期脳外傷、長期にわたる熱性けいれん、ＳＩＤＳ及びクモ膜下出血などを含む）、低出生体重（例えば、脳性麻痺）、肺損傷（急性出血性肺損傷、グッドパスチャー症候グループ、急性虚血性再潅流）、（例えば、毒性オイル症候グループ珪肺症に対する罹病性などの）職業・環境汚染物によってもたらされた心筋機能障害、放射線損傷を含む外傷に対する反応、及び（例えば、火傷又は熱傷、慢性創傷、手術創及び脊椎損傷などの）創傷治癒反応の効率。受精能／生殖能、妊娠可能性、早産、出生前・出生時合併症（早産による低出生体重、脳性麻痺、敗血症、甲状腺機能低下、酸素依存、頭蓋異常、早期発症閉経を含む）などを含むホルモン調節[機能に関連する状態]。移植に対する被験者の反応（拒絶又は受容）、急性期反応（例えば発熱反応）、一般的な炎症反応、急性呼吸窮迫反応、急性全身炎症反応、創傷治癒、癒着、免疫炎症反応、神経内分泌反応、発熱現象及び抵抗、急性期反応、ストレス反応、罹病性、反復運動によるストレス、テニス肘、疼痛管理及び反応。
【００３３】
間充織幹細胞
【００３４】
本発明のＭＳＣは、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋肉又は脂肪組織、子宮内膜、血液、臍帯組織又は臍帯血液、及び様々な組織の初代培養から得られうる。
【００３５】
本発明で使用されるＭＳＣを得るためにいかなる供給源をも使用しうるが、骨髄から該ＭＳＣを単離することが好ましい。一例として、骨髄穿刺液を単離して洗浄し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）（ガラス器内などの生体外環境）において培地に再懸濁して無菌培養に入れるようにしても良い。最初に、培地中で血清が単離された細胞に接種（ｐｌａｔｅｄ）される。本質的にＭＳＣ以外の細胞はすべて非癒着性であり洗浄時に除去される間、ＭＳＣは培養皿に付着する（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４：２６７−７４， １９７６）。ＭＳＣは、明確に定義された多分化能性幹細胞グループを産出しながら培養中で培養して増殖する。さらなるＭＳＣ−ＣＭの増殖・生成を続ける前に、又は患者にＭＳＣを投与する前に、残留マクロファージ又はその他の造血細胞系統を除去するためにＦＡＣＳによってＭＳＣのＣＤ４５陽性細胞がさらに枯渇される。本発明のＭＳＣはＣＤ３４及びＣＤ４５陰性であることが好ましいが、該ＭＳＣとしては、ＳＨ２、ＳＨ４、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０ａ陽性及びＣＤ１２４、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５陰性であることがさらに好ましい。ＭＳＣは、癒着分離法以外にも、密度勾配分割法や免疫的選択法、白血球搬出法及びその他同等のものを含む（但しこれらに限定されない）当業者に周知のいかなる技術によっても単離しうる。
【００３６】
また、ＭＳＣは、単離された幹細胞がＭＳＣであることを示すために形態学的及び機能的にテストしうる。Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらによると、例えば、ＭＳＣを骨細胞と脂肪細胞へ分化させるために細胞の一部分を分化培地において培養しうる、と報告している（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８４： １４３−１４７， １９９９）。残りのＭＳＣを培養中で引き続き増殖させて患者への投与や馴化培地の生成に使用しうる、或いは低温保存して後で使用するようにもしうる。
【００３７】
ＭＳＣは、患者から、又は定義された状況下に適合性を有するが同種異系である提供者（ドナー）由来のものでありうる。当業者には周知のＨＬＡ適合性を含む、移植される臓器に対して定義されるような類似した適合性を有する提供者からのドナー幹細胞を使用しうる。ＭＳＣはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において増殖することができるので、ＭＳＣの複数投与が可能となり、ＭＳＣの治療効果をさらに増大することができる。自家幹細胞の使用により免疫寛容の懸念が解消される。
【００３８】
本発明のＭＳＣは、患者への投与前に、又はＭＳＣ−ＣＭの生成前に、遺伝子組み換えを行いうる。ＭＳＣは、抗炎作用を及ぼし、且つ腎臓内血行動態を向上させるために、生成物が細胞の生存を助け細胞の移動と増殖を刺激するとして知られる遺伝子を使用して遺伝子組み換えを行いうる。ＭＳＣに導入された遺伝子の発現は、これらの遺伝子の被制御活性化及び不活性化の両方を可能にする薬剤感受性プロモータを含む（但しこれに限定されるものではない）様々なプロモータの制御下に置かれうる。ＭＳＣを遺伝子組み換えするための発現ベクターのクローニングが当業者に公知の材料と方法を使用して行われる。ＭＳＣの遺伝子組み換えは、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ウイルス・ベクターを含む感染、電気穿孔法及びその他同等のものを含む当業者に公知の方法を使用して達成しうる。
【００３９】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における事前分化による本明細書に記載されるＭＳＣ由来の内皮細胞（ＥＣ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）も本発明において使用しうる。ＥＣは、ＭＳＣに対して、或いはＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭ（及びそれの組合わせ）と組み合わせて、前記のような患者への導入に使用されうる。投与用ＥＣの処方は後述する。
【００４０】
別途指示無き限り、本発明の実施には、本発明が属する技術分野の範囲に含まれる従来のウィルス学的、微生物学的、分子生物学的方式及び組換ＤＮＡ技術が採用されるものとする。これらの技術は、諸文献において詳細に説明されている。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（仮訳：分子クローニング:実験手引き書）」（現行版）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（仮訳：ＤＮＡクローニング:実用的研究方法）』第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（仮訳：オリゴヌクレオチド接合）」（Ｎ．Ｇａｉｔ編、現行版）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（仮訳：核酸雑種形成）』（Ｂ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（仮訳：転写と翻訳）」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）、「ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（仮訳：パルボウィルスのＣＲＣ手引き）」第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（仮訳：基本ウィルス学）第二版』第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００４１】
ＭＳＣ馴化培地
【００４２】
ＭＳＣ馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）は、培地を馴化するのに十分な時間をかけて上記ＭＳＣを培養することにより得られうる。非限定的な一例として、以下のようにＭＳＣ−ＣＭを得ても良い。ＭＳＣは、上記のようにして得ても良く、また培養中に接種された細胞として得ても良い。例えばＦＡＣＳ分類によるＣＤ４５陽性細胞の癒着接種と除去によって他の細胞型が枯渇してしまったＭＳＣは、実質的に各培養物が密集しており、本質的に接触が阻止された培養物へと発達しうる。該培養物が増殖するとともに、ＭＳＣは血清を含んだ培地において増殖しうる。また、ＭＳＣは、ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの被移植者からの自家血清でも増殖しうる。いったん培養物が高サブコンフルエント（すなわち、約３−５×１０６ ＭＳＣ／Ｔ−７５フラスコ）まで増殖すると、無血清ＭＳＣ−ＣＭが望ましい場合には血清を培地から除去しうる。
【００４３】
ＭＳＣは通常の酸素状態、すなわち、室内気＋５％ＣＯ２（ｐＯ２約２１％）にて増殖しうる。その代わりとして、且つ好ましくは、ＭＳＣは低酸素状態（ｐＯ２≦５％）でも増殖しうる。培地は、ＭＳＣ存在下で、ＭＳＣ培養物への培地の添加前には存在しなかった成分を少なくとも一つ培地に加えるのに十分な時間、定温放置にて培養される。培地を馴化する期間としては１〜３日間が好ましく、２日間がより好ましい。ＭＳＣ−ＣＭを収集してから、ＭＳＣ−ＣＭを殺菌し、あらゆる微粒子をも除去するために微細孔フィルター（０．２２μＭフィルターなど）によって濾過するようにしても良い。該ＭＳＣ−ＣＭはそのまま患者に投与しても、後で投与できるように好ましくは−１２０℃で冷凍して保存しても良い。また、例えば遠心分離、透析、濾過、凍結乾燥及びその他同等のものによってＭＳＣ−ＣＭを濃縮してもよい。
【００４４】
ＭＳＣにより培地に加えられた成分が少なくとも一つ存在することは、生物検定としての、ＥＬＩＳＡ、又はＨＰＬＣなどの分離分析を用いて確認しうる。例えば、例として掻爬、ＡＴＰ枯渇、又はこれら両方によって損傷を受けた近位尿細管性細胞を使用することによりインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてＭＳＣ−ＣＭをテストしうる。生存、繁殖及び／又は増殖の刺激に対して細胞を評価するために、煮沸したＭＳＣ−ＣＭ又は無血清培地を単独で対照として使用することによりＭＳＣ−ＣＭを細胞に添加しうる。また、ＭＳＣ−ＣＭはｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においてもテストしうる。ＭＳＣに関連して上記されるように、ＭＳＣ−ＣＭは、単回投与、複数回投与又は連続投与、又はこれらの組合わせにより投与しうる。本発明の馴化培地（ＣＭ）を生成するためのＭＳＣの供給源に対しては、必ずしも直接患者に移植されるＭＳＣと同じレベルの適合性が要求されるとは限らない。ＭＳＣ−ＣＭの生成及び使用については、後述される実施例を参照してさらに詳しく説明する。
【００４５】
治療有効量の投与
【００４６】
ある実施形態では治療有効量のＭＳＣが患者に導入され、別の実施形態では治療有効量のＭＳＣ−ＣＭ又はＥＣが患者に投与される。治療有効量のＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭは、これらのいかなる組合わせとしても投与されうる。治療有効量は、治療を受ける患者の体重によって決定されるが、病状の重症度や、療法開始時における病状の進展段階（例えば、初期、末期、等）、及び合併症の有無によって、さらに変更されうるものである。治療量はまた、患者に導入する際の方法に基づいても決定されうる。治療量は、療法中の投与が一回なのか又は複数回なのかによる。治療量のＭＳＣ−ＣＭの投与は、例えば２４時間（但し、必ずしもこれに限定されない）の持続注入によって行いうる。好ましくは、約０．０１ｍｌ〜約０．２ｍｌ／体重１００ｇのＭＳＣ−ＣＭを含んだ治療投与量が投与されれば良く、さらに好ましくは、約０．０４ｍｌ〜約０．１０ｍｌ／体重１００ｇのＭＳＣ−ＣＭを含んだ治療投与量が導入されるのがよい。ただし、それ以外の投与量も可能である。好ましくは、治療投与量中、被移植者の体重１キログラム当たり約０．０１〜約５×１０６個の細胞を含むＭＳＣ又はＥＣが投与されれば良く、さらに好ましくは、治療投与量中、被移植者の体重１キログラム当たり約０．０２〜約１×１０６個の細胞を含むものが投与されるのが良い。使用される細胞の数は、被移植者の体重と状態、投与数又は頻度、及びその他当業者に周知の変数に依存する。例えば、治療投与量は、療法中の投与が一回なのか又は複数回なのかによる。それに続く治療投与量は、治療量のＭＳＣ、ＥＣ、ＭＳＣ−ＣＭ又はそれらの組成物を含みうる。ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの治療量は、治療の必要性をもたらしている事象の前に（例えば手術、化学療法による治療などの前に）、患者に対して投与しても良い。
【００４７】
好ましくは、注射によって、又は静脈内（すなわち、大静脈などのような太い中心静脈内）に点滴注入するか又は動脈内（すなわち、大腿動脈を介して副腎動脈内）に点滴注入することによって、ＭＳＣとＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを患者に投与すればよい。ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの導入には、本発明の属する技術分野において一般に知られている導入方法のいかなるものをも使用しうる。
【００４８】
ＭＳＣとＥＣがインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において増殖可能であり、且つＭＳＣ−ＣＭが採取・保存可能であるので、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの治療効果をさらに増大するためにＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを複数投与することが可能である。治療抵抗性（血液透析、非経口的栄養法、抗生物質、集中治療）のＡＲＦを単独で又はＭＯＦ又は多臓器機能不全に伴って有する患者や、最も重度な形態の治療抵抗性ＡＲＦが発現する危険が最も高いか又は最も重症度の高い治療抵抗性ＡＲＦが今にも発達しようとしている患者や、大動脈瘤修復などの危険度の高い手術を受ける予定になっている外傷又は外科患者や、感染しており治癒不能な創傷をもつ患者や、術後にＭＯＦを発達中の患者や、移植腎臓に影響を及ぼす重症のＡＲＦを伴う患者、及び治療を必要とする炎症性疾患を伴ういかなる患者をも含む（但し、これらに限定されない）代表的患者集団が、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与により効果を得ることができる場合がある。上述のように、ＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭの治療量投与は、治療を要する状態が発現する前、発現中、もしくは発現後に行いうる。複数の異なる治療量を患者に提供してもよい。腎臓、肺、肝臓、心臓などのあらゆる損傷臓器に関連した状態において、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭによる療法を使用しうる。
【００４９】
治療有効量のＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを投与した結果の評定は、当業者に一般に知られている技術を用いた評定により行いうるものであり、ここに挙げられる実施例に限定されない。例えば、血清クレアチニン、ＢＵＮ、電解質レベル、クレアチニンクリアランス（糸球体ろ過値）の測定、尿排出及び組織像を判断することにより腎臓の治療をモニター監視しうる。実験型を使って、肺中の含水量と浸潤細胞を計測することによって治療有効量の投与による肝臓及び肺の病状軽減状態を評価し、また、肝臓については組織学的に評価しうる。患者及び実験型中の組織及び肝酵素の生検サンプルを計測しても良い。
【００５０】
増殖因子の調節
【００５１】
損傷臓器中の増殖因子及びサイトカインの発現を調節するために、ＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを、それを必要とする患者にも与えうる。例えば、増殖因子及び抗炎症性サイトカインの発現レベルを増やすためにＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。また、増殖因子及び炎症反応促進性サイトカインの発現レベルを下げるためにもＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。
【００５２】
増殖因子発現レベルの調節は、例えば血漿中で、又は、組織又は血球中の増殖因子の発現レベルを計測することによっても計測しうる。血漿中の増殖因子の検出については、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス市）によって販売されているような市販のＥＬＩＳＡキットを使用して計測しうる。組織及び血球中の増殖因子の発現レベルは、例えば、以下の実施例に記載されるマイクロアレイ解析又は実時間ＰＣＲにより決定されうる。増殖因子調節の計測評価を行う方法として当業者に公知のいかなる検定法をも使用できる。
【実施例】
【００５３】
ここで、下記の非制限的な実施例に基づいて本発明を説明する。
【００５４】
実施例１：ＭＳＣの単離
【００５５】
麻酔下に、正常の成体ラット（雄性又は雌性の、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ又はＦｉｓｈｅｒ ３４４系統）の大腿から、２５ゲージ注射針の付いた注射器を使って無菌ＰＢＳにより大腿を洗浄（ｆｌｕｓｈ）することによって、ＭＳＣを集菌した。単離された細胞吸引液を回転させて、吸引液に含有される細胞を沈殿させた。沈殿物を培地（ミズーリ州セントルイス市内Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社；１０−２０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２）の中で再懸濁し、任意に７０μｍメッシュ（カリフォルニア州サンノゼ市Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でろ過してから、培地の入った７５ｃｍ２の一次培養フラスコ内に接種した。非癒着細胞は、培養液中72時間後に培養液で繰り返し洗浄することによって取り除いた。癒着細胞は低密度で新しいフラスコへと移し、約３−５×１０６ ＭＳＣ／フラスコまで増殖させた。細胞の外観は紡錘状であった。ＭＳＣ表現型は、特異性分化培地で骨細胞及び脂肪細胞に分化することによって確認された（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８４：１４３−１４７、１９９９年）。任意的に、あらゆるＣＤ３４及びＣＤ４５陽性細胞を排除するため、癒着細胞をＦＡＣＳによってさらに精製した。ＭＳＣは、被移植者への投与や、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭの生成に使用したり、或いは後で使用するために凍結保存した。
【００５６】
実施例２：ＭＳＣ−ＣＭの調製
【００５７】
ＭＳＣ−ＣＭの生成に、実施例１に記載される方法で単離したＭＳＣを使用した。ＭＳＣが高サブコンフルエント（すなわち、約３−５×１０６ ＭＳＣ／Ｔ−７５フラスコ）になるまで増殖させ、ＭＳＣを無血清培地で繰り返し洗浄することによってウシ胎仔血清を培養物から取り除いた。その後１−３日間、大気下（ｐＯ２〜２１％）
で、又は低酸素状態（ｐＯ２≦５％）の下に、ＭＳＣを培養することによって無血清培地を馴化した。無細胞上澄み液（ＭＳＣ−ＣＭ）を採取し、０．２２μＭのフィルタでろ過してから、―１２０℃の無菌条件下にて冷凍した。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてテストする前、又はＡＲＦを伴うラットに投与する前に、ＭＳＣ−ＣＭを解凍し、さらなる調整操作を加えることなくアリコート（一定分量）を使用したり、或いは対照としての投与前に２０分間１００℃にてアリコート（一定分量）を煮沸したりした。無血清ＭＳＣ−ＣＭ中のタンパク質絶対濃度は、ビウレット・タンパク質検定の検出下限にあった。
【００５８】
実施例３：ＭＳＣ投与
【００５９】
虚血性／再潅流型のＡＲＦ（「虚血性ＡＲＦ」）は、麻酔下のラットにおいて、両腎茎の時限クランピングにより誘導され、結果として腎臓への血液供給を阻止することになり、それが原因で「虚血性の」発作が発生して腎臓機能の急な消失（すなわち、ＡＲＦ）につながった。４５分間の両側性腎虚血により重症ＡＲＦの標準モデルが確立された。該４５分間の両側性腎虚血の治療結果は、血流再開後７２時間、糸球体濾過率が基準値の５％未満の場合、死亡率５０％であった。重症ＡＲＦ標準モデルの組織診では、皮髄境界部に広範囲におよぶ腎尿細管壊死と重度な維管束うっ血が認められた。３５分間の両側性腎虚血により中等度ＡＲＦ標準モデルが確立された。中等度ＡＲＦ標準モデルは、血清クレアチニン・レベル約１．５ｍｇ／ｄＬ及び死亡率１０％未満（＜１０％）を示す。これらのＡＲＦ標準モデルは、急性循環不全や敗血や外傷を伴ったり、血管手術後であるなどのＡＲＦ患者を含む最も一般的且つ最も重度のＡＲＦ患者の場合と非常によく似ている。
【００６０】
ＡＲＦ発症直後又は２４時間後に、ＭＳＣを静脈内注入（頚静脈、大腿静脈、又は尾静脈内に注入）、又は動脈内注入（頚動脈又は大腿動脈を介して大動脈内に注入）した。すべての研究において投与された細胞の総数が被実験動物一匹あたり約１×１０５〜１．５×１０６個であった。同数の繊維芽細胞と同量の無血清培地を対照として使用した。
【００６１】
血中クレアチニン及びＢＵＮレベルの測定と、クレアチニン・クリアランス（糸球体ろ過値）及び尿排出の計測によって、実験型における（つまり患者の）腎機能を監視した。全体的な結果は、体重減少、血流動態及び生存を測定することによって評価された。ＭＳＣによる治療を施行したＡＲＦ動物及び対照の動物を屠殺後、腎臓における組織学的損傷（アポトーシス、壊死、維管束のうっ血及び損傷、炎症細胞浸潤巣）及び修復（有糸分裂生起、細胞の再分化、充血除去など）の度合いを検討した。
【００６２】
組織像及び損傷度指標（ｓｃｏｒｅ）は以下のように評価した。固定されている腎臓の冠状断をＨ＆Ｅで染色し、２５個の正方格子からなる目盛付き対物レンズ（倍率２０倍）を使用してランダムな皮質野で尿細管の損傷度を採点評価した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら 「カルパイン抑制剤−１はラットの腎虚血／再潅流傷害を軽減化する。」Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５９： ２０７３−２０８３、２００１）。それぞれの腎臓について、尿細管のプロフィールと該格子間に存在する１００個の交点を検討した。「造血幹細胞動員関連の顆粒球増多症によって急性腎不全が凄まじく悪化する」と題するＴｏｇｅｌらの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：１２６１−１２６７，２００４）に示されるように１ｍｍ当たりの白血球浸潤を採点評価した。
【００６３】
免疫組織化学法は以下のようにして実施された。腎臓のパラフィン切片をキシレンで脱パラフィン化し、アルコール系及び水の中で再水和した。ペルオキシダーゼ遮断試薬で伏培（定温放置）後に、ＤＡＫＯ社製（カリフォルニア州カーピンテリア市）の即時使用可能ＰＣＮＡ染色用製剤中にて、モノクローナルのマウス抗ラットＰＣ−１０抗体でスライドを標識付けした。腎臓皮質及び外部髄質からランダムに選択された４分画中の正電荷の原子核数を倍率２０倍で数えることにより、ＰＣＮＡ陽性細胞（有糸分裂生起のマーカー）の採点評価を行った。ＰＣＮＡの評点を得るために全ての領域及び全ての腎臓からのデータをプール（合併収集）した。アポトーシスの評点は、Ｒｏｃｈｅ社製（ドイツ国マンハイム市）の原位置細胞死検出キット（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用してＴＵＮＥＬ検定により得られた。腎臓切片をプロテイナーゼKで脱パラフィン化、再水和、且つ温浸（ｄｉｇｅｓｔ）して、３７℃で６０分間ＴＵＮＥＬ反応液により標識付けした。切片標本の正電荷の原子核を蛍光顕微鏡でスクリーニングし、また、すべての腎臓に関して皮質及び外部髄質中のランダムに選択された切片10個を倍率４０倍で数えた。アポトーシスの評点を得るために全領域及び全腎臓からのデータをプール（合併収集）した。
【００６４】
図１ａと図１ｂに示されるように、中等度ＡＲＦを伴うラットに対して血流再開直後にＭＳＣを投与した場合（１ａ）又は血流再開後２４時間後に投与した場合（１ｂ）、血清クレアチニンによって決定される腎機能が著しく向上した。重度のＡＲＦを伴うラット（対照動物における２４時間の血清クレアチニン＝４．５±０．５ｍｇ／ｄＬ）についても、血流再開直後にＭＳＣを与えられた動物で同じような向上が認められた。治療執行動物中の血清クレアチニンレベルは、ＭＳＣ注射の２４時間後で２．１±０．５ ｍｇ／ｄＬであった（対照比較：Ｐ＝０．００２）（図２ａ）。また、重度のＡＲＦを伴うラットの腎損傷指標、白血球浸潤指標、ＰＣＮＡ指標及びＴＵＮＥＬ染色指標についても評価した。ＭＳＣにより治療したラットの損傷指標（Ｐ＝０．００４）（図２ｂ）、対照動物と比較したＰＣＮＡ染色指標（Ｐ＝０．０２３）（図２ｃ）、及び皮質中のアポトーシス細胞数の低下（Ｐ＜０．０００１）（図２ｄ）は有意義な好結果であった。治療した動物と対照動物の白血球浸潤指標も類似したものであった。
【００６５】
実施例４：ＭＳＣ−ＣＭによるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）治療
【００６６】
実施例２で説明した方法でＭＳＣ−ＣＭを調製した。ＭＳＣ−ＣＭを損傷尿細管細胞に加えて用いたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における治療を以下のようにテストした。近位尿細管表現型である正常ラット腎臓細胞（メリーランド州ロックヴィル市内ＡＴＴＣ社から購入した「ＮＲＫ」）を、１０ｃｍのペトリ皿の中で、密集状態になるまで、１０％ＦＣＳ（ユタ州ローガン市Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ｐＨ ７．４０、３７℃、５％ＣＯ２及び大気を伴うＤＭＥＭにおける培養液中で増殖させた。いったんＮＲＫが密集状態になった時点で、無血清ＤＭＥＭで細胞を３回洗浄し、且つ細胞培地を無血清ＤＭＥＭと取り替えた。ＮＲＫは、０．１ｍＭのアンチマイシンで３０分及び１ｍＭの２−デオキシグルコースで３０分定温放置することによって約７５−９０％ＡＴＰ枯渇した。その後、無菌メスを使ってＮＲＫ上に擦過傷をつけた（つまり、いくつかの並列する擦過傷を、尿細管細胞単分子層中に生成した。）ＡＴＰ枯渇度はルシフェラーゼ・キット（ミズーリ州セントルイス市シグマ社製）を使用した並行調査にて測定された。
【００６７】
損傷細胞培養を慎重に洗浄して、アンチマイシン及び２−デオキシグルコースを除去し、（大気培養又は低酸素培養の）ＭＳＣ−ＣＭを含む無血清ＤＭＥＭと対照培地を培養に加えた。容量を一定に維持しながら以下のものを添加した。
ＭＳＣ−ＣＭ：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ（２０分、〜１００℃）：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
低酸素ＭＳＣ−ＣＭ：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
ウシ胎仔血清：１０％、陽性対照、総培地量５ｍｌ
無血清培地：０．２、０．５、１．０ｍｌ、陰性対照、総培地量５ｍｌ
【００６８】
治療後２４及び４８時間経過した時点で損傷ＮＲＫを評価した。各グループにおいて少なくとも４〜６件の独立した実験を行った。表１に示されるように、運動性変化生起（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と有糸分裂生起、及びアポトーシスの度合いを計測評価した。運動性変化生起については、創傷治癒の目的で創傷領域への細胞移動量を計測する。半細胞分裂促進投与量であると判明している０．２ｍｌのＭＳＣ−ＣＭで運動性変化生起をテストした。
【００６９】
有糸分裂生起については、細胞の増殖及び生存量を計測する。２４時間と４８時間の時点でＭＴＴ検定法により有糸分裂促進性を計測した。ＭＴＴ検定では、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨなどの還元当量を生成すべく、代謝的に活性な細胞によって（部分的にはデヒドロゲナーゼ酵素の作用によって）、黄色のテトラゾリウムＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）が還元され、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのような還元相当物を生成する。その結果得られた細胞内の紫色ホルマザンは可溶性となり、分光測光手段によって定量化できる。
【００７０】
アポトーシスは、上述のＴＵＮＥＬ検定法（アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）や、市販の抗体を用いたＦＡＣＳ解析によるＰＩを使用）及び免疫細胞化学による細胞形態学を用いて計測された。その結果を表１に示す。
【表１】
表1中のデータは、平均値（％）± 第５グループＳＦＭ（＝１００％）陰性対照のＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第１グループのデータを第２〜第５グループのデータと比較した場合）
※※： 少なくともｐ＜０．０５ （第４グループを第２グループと５グループからのデータと比較した場合、及び第４グループを第１グループと比較した場合）
【００７１】
表１に示されるように、ＭＳＣ−ＣＭは、培養中の損傷細胞における対照培地と比較して、著しく運動性変化生起及び有糸分裂生起を刺激し、アポトーシスによる細胞死を抑制する。また、運動性変化生起と有糸分裂生起及びアポトーシスに対するＭＳＣ−ＣＭ作用は（一回分の）投与量に依存する（図示せず）。低酸素状態で生成されたＭＳＣ−ＣＭは、大気下で馴化されたＭＳＣ−ＣＭよりも著しく強力であった。４８時間の時点で集菌したＭＳＣ−ＣＭは２４時間で採取されものよりも若干強力であった。
【００７２】
実施例５： Ｉｎ ＶｉｖｏにおけるＭＳＣ−ＣＭ投与
【００７３】
実施例２で説明した方法でＭＳＣ−ＣＭを調製した。ＭＳＣ−ＣＭは、下記載されるような単回投与又は持続注入プロトコル（治験実施計画）に則って注入した。
【００７４】
ＭＳＣ−ＣＭ注入の単回投与のために、（４０分間の虚血後に行った腎茎クランプ除去に続く）血流再開直後、そして再び２４時間及び４８時間の時点において、（大気か又は低酸素ｐＯ２の下に馴化された、もしくは対照としてＤＭＥＭ（ＳＦＭ）の下に馴化された培地から得られた煮沸済又は未煮沸の）ＭＳＣ−ＣＭ ０．２ｍＬ（０．０７ｍＬ／１００ｇ）を、虚血／再潅流によるＡＲＦ（Ｉ／Ｒ ＡＲＦ）を伴うラットグループ（成体、雄性ＳＤラット、ｎ＝６〜８／各々）に対して注入した（尾静脈経由のｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．）。３日間の観察期間中に、生存状態や体重の記録、腎機能（血清クレアチニン、ＢＵＮ、腎血流量）の測定及び腎臓損傷の組織学的な指標により結果を評価した。
【００７５】
ＭＳＣ−ＣＭの単回投与を使用したｉｎ ｖｉｖｏにおける治療の結果を表２に示す。
【表２】
表２におけるデータは平均±ＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第Ａ１グループのデータを第Ａ２及び第Ａ４グループのデータと比較した場合、及び第Ａ１グループを第Ａ３グループクレアチニン及びＢＵＮデータと比較した場合）。第Ａ２グループと第Ａ４グループのデータの間に有意差は認められなかった。
【００７６】
表２に示されるように、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ（大気又は低酸素ｐＯ２）とＳＦＭのいずれにも結果の向上は認められなかった。血流再開後２４時間、４８時間及び７２時間の時点にて煮沸してないＭＳＣ−ＣＭで動物を治療した場合には、血清クレアチニン及びＢＵＮの上昇が著しく少なかった。それに加えて、煮沸してないＭＳＣ−ＣＭで治療したラットの腎血流量及び腎臓の損傷度指標は、ＳＦＭ又は煮沸したＭＳＣ−ＣＭで治療した動物におけるものに対して著しく優れたものであった。低酸素ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭの腎臓保護作用は、大気ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭで得られたものよりも優れていた。
【００７７】
持続注入プロトコルのために、ラットグループ（ｎ＝４−６／各々）の腹膜に、Ａｌｚｅｔ社製小型浸透圧ポンプを使用して間断なく培地（上記煮沸済又は未煮沸のＭＳＣ−ＣＭ又はＳＦＭ、２４時間／３００ｇ当たり０．２ ｍＬ）を注入した。上記のように３日間の観察期間を通じて結果を評価した。生存状態の記録、腎機能（血清クレアチニン、ＢＵＮ、クリアランス、腎血流量）の測定及び腎臓損傷の組織学的な指標により該結果の評価を行った。ＭＳＣ−ＣＭで治療したＡＲＦを伴うラットにて測定されたすべての変数を、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ及びＳＦＭで治療した同様の虚血性ＡＲＦを伴うラットにて測定された変数と比較した。結果として得られた計測値はすべて、いずれかのタイプの（すなわち、大気及び低酸素ｐＯ２のいずれかによって得られた）ＭＳＣ−ＣＭにおいて有意義な向上を示した。大気下及び低酸素状態で生成されたＭＳＣ−ＣＭのデータを表３に示す。
【表３】
表３におけるデータは平均±ＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第Ｂ１グループのデータを第Ｂ２、第Ｂ３、第Ｂ４グループのデータと比較した場合）。第Ｂ２グループと第Ｂ４グループのデータの間に有意差は認められなかった。
【００７８】
表３に示されるように、血流再開後２４時間、４８時間及び７２時間の時点に煮沸しなかったＭＳＣ−ＣＭで動物を治療した場合には、血清クレアチニン及びＢＵＮの上昇が著しく少なかった。それに加えて、その腎血流量及び腎臓の損傷度指標については、ＳＦＭ又は煮沸したＭＳＣ−ＣＭで治療した動物におけるものに対して有意義に優れた結果が得られた。表３に示されるように、腹腔内持続注入については、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ及びＳＦＭのいずれにも結果の向上は認められなかった。ＭＳＣ−ＣＭの単回注入により得られた結果と持続注入により得られた結果との間に有意差は認められなかった。低酸素ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭの腎臓保護作用は、大気ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭで得られたものよりも優れていた。
【００７９】
実施例６：ＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節
【００８０】
実施例１と実施例３の説明に記載した方法でＭＳＣを得てＡＲＦを伴うラットに投与した。実時間ＰＣＲを使用して、ＭＳＣ投与を伴う場合と伴わない場合のラットの腎臓における増殖因子及びサイトカイン発現の調節を評価した。
【００８１】
汚染ＤＮＡを除去するためのＤＮａｓｅ温浸（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）段階を含むＱｉａｇｅｎ社製（カリフォルニア州バレンシア市）のＲＮｅａｓｙキットを使用して実時間ＰＣＲ用のＲＮＡを抽出した。４２℃で６０分間、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（カリフォルニア州カールスバード市内Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して逆転写を行った。
【００８２】
以下のプライマーを使用して、β−アクチン転写物に相対した標的遺伝子コピー数の定量化を伴う実時間ＰＣＲを行った。
【００８３】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製（オレゴン州ユージーン市内）のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（非特異性二本鎖ＤＮＡ挿入蛍光染料）を使用して実時間ＰＣＲ増幅作用を監視するために、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製（カリフォルニア州サニーヴェール市内）のＳｍａｒｔ−Ｃｙｃｌｅｒシステムを使用した。タカラバイオ社製（滋賀県）のＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴｍ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎにより総量２５μＬで全反応を行った。反応条件は、熱変性時温態（ｈｏｔ）開始＝１２０秒、９５℃； 融解＝１０秒、９５℃； アニーリング＝１２秒、６３℃； 増幅＝１５秒間、７２℃、であった。蛍光生成物の計測については、非特異性生成物及びプライマ二量体が計測されてしまうことを避けるために特異性生成物の最高融解値より２℃低い値に設定し、各ＳＤＦ−Ｉサイクル後６秒間８５℃で行った。最適なアニーリング温度と融解温度は、サンプルを実行する前にプライマに対して決定される。反応混合物の融解温度解析によって、生成物の典型的な融解温度が単独のシャープなピークである特徴的な融解曲線が見られた。生成物の特異性は融解曲線によって決定され、また、非特異バンドを形成するためにゲルを対照とした。サンプルは重複状態で流し、平均交差点（ＣＰ）値を計算に使用した。該ＣＰは、増幅された遺伝子量が背景蛍光発光異常の閾値に達するサイクルであり、初期のコピー開始量を定量化するために決定されたものである。以下の方式を使用して比較ＣＰ法によりｍＲＮＡ発現の相対定量を計算した。
比率＝（Ｅ標的）ΔＣＰ標的（対照−サンプル）／（Ｅ基準）ΔＣＰ基準（対照−サンプル）
【００８４】
（Ｅは実時間ＰＣＲ能率；ＣＰ、つまり交差点、及びサンプルと対照間の差異）（Ｐｆａｆｆｌら：「相対発現のグループ単位比較と統計分析用の相対発現ソフトウェアツール（ＲＥＳＴ）が実時間ＰＣＲをもたらす」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ３６，２００２）
【００８５】
内在性コントロールβ−アクチン遺伝子を標的遺伝子とした相対定量値は、遺伝子と比較した相対的な発現を示す数値として表記する。汚染ＤＮＡと非特異増幅作用が増幅してしまう可能性を避けるため、次のことに配慮を施した。
（ａ） ＤＮａｓｅの温浸段階をＲＮＡ抽出プロトコルに含む。
（ｂ） 増幅されるべきｃＤＮＡ内部のイントロン配列を含むようにプライマのいくつかを設計した。
（ｃ） 適切な陰性対照（無定型対照）でも反応を行った。
（ｄ） 増幅された生成物の融解曲線（解離グラフ）を分析することによって生成物の均一な増幅を再確認した。
（ｅ） ゲル電気泳動を行って増幅生成物の正確なサイズ及び非特異バンドの不在の両方をめいめい確認した。
【００８６】
ＭＳＣ投与の結果、内部制御として各遺伝子の発現を正規化するためにβ- アクチン発現を使用した実時間ＰＣＲにより、増殖因子遺伝子の発現の変化を示す。実時間ＰＣＲで示された、ＭＳＣ投与後２４時間の時点で炎症反応促進性サイトカインＴＮＦ−αとＩＬ−１β及びＩＦＮ−γをコード化する遺伝子の発現の低下が認められた（図３ａ）。図３ａにさらに示されるように、ＭＳＣにより治療した動物はＩＬ−１０（抗炎症性サイトカイン）の発現の増加を示した。図３ｂに示されるように、ＭＳＣにより治療した動物は、腎臓におけるｂＦＧＦ及びＴＧＦ−αの発現増加を示したが、対照腎臓と比較してＨＧＦ発現の減少を示した。図３ｃは、ＭＳＣにより治療した腎臓が対照腎臓に比較してＢｃｌ−２発現が増加した一方ｉＮＯＳ発現が減少したことを示す。
【００８７】
実施例７：ＭＳＣの遺伝子組み換え
【００８８】
実施例1の項に記載されるような方法で単離したＭＳＣは、患者への投与前に、又はＭＳＣ−ＣＭの生成前に遺伝子組み換えを行いうる。
【００８９】
単離されたＭＳＣは、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）を含むＲｅｔｒｏＴｅｔ−ＡＲＴシステム（Ｒｏｓｓｉら．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０：３８９−３９３、１９９８）のレトロウイルスのベクターにより形質導入された。Ｐｈｏｅｎｉｘ両種性細胞系統は、ＦＵＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬（インディアナ州インディアナポリス市Ｒｏｃｈｅ社製）により３つのレトロウイルスプラスミドで別々にトランスフェクト（核酸導入）した。トランスフェクトされたレトロウイルスプラスミドは以下の通りである。
１） 発現プラスミドＨＲＳｐ−ＥＰＯ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ．ＨＲＳｐｈＫＧＦのＨＲＳｐｕｒｏＧＵＳプラスミドではＧＵＳがｍＥＰＯに代わった（Ｂｅｒｕ Ｎら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，５５４： ２９−３５，１９８９）。ｍＣＭＶがｍＥＰＯの発現の駆動源となり、ＳＶ４０プロモータがピューロマイシンの駆動源となっている。ＩＲＥＳは、遺伝子２つの転写を助ける。
２） ＴＣＮ−転写活性化因子プラスミド。ＴＣＮ−トランス活性化因子は、ｔｅｔ−０７を結合し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）存在下で転写を活性化する。
３） ＴＣＮ−転写抑制因子プラスミド。ＴＣＮ−転写抑制因子プラスミドは、ｔｅｔ−０７を結合し、Ｄｏｘ不在下で転写を抑制する。ヒヒの間充織幹細胞における調節不能ＥＰＯ発現については、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ，Ａらにより実証されている（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １２，１５２７−１５４１，２００１．）。
【００９０】
トランスフェクション（核酸導入）後４８時間経過した時点で０．４５μＭフィルタを使ってろ過することにより、３つのプラスミドでトランスフェクトされたレトロウイルス生成細胞系統からのＭＳＣ形質導入用の上澄みを得た。標的ＭＳＣ細胞は、１×１０５細胞／ｍｌの密度で接種した。形質導入に向けて、８μｇ／ｍｌポリブレンをレトロウイルス培地に加えた。ＭＳＣを培養中で増殖し、形質導入されたＭＳＣの一部分をｍＥＰＯ遺伝子発現の定量化のために使用した。
【００９１】
まず、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲキット（テキサス州オースティン市内Ａｍｂｉｏｎ社製）を使用して、形質導入されたＭＳＣから全ＲＮＡを抽出し、１００ナノグラムの全ＲＮＡを一段階式ＲＴ−ＰＣＲ（カリフォルニア州カールスバード市内Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に使用した。
【００９２】
次に、実時間ＰＣＲを行った。オリゴｄＴをもつＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製逆転写酵素）を使って、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを１００ナノグラムの全ＲＮＡに合成した。ｍＥＰＯ遺伝子発現を定量化するために、実時間ＰＣＲの標準プロトコルをＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州サニーヴェール市内Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）に使用した。
【００９３】
Ｄｏｘを使用せずに治療したＭＳＣ ｍＥＰＯ形質導入サンプルとＤｏｘにより治療したＭＳＣ ｍＥＰＯ形質導入サンプルとの間の相違に関する定量化は、ｍＥＰＯ ｃＤＮＡのコード配列の領域に隣接するｍＥＰＯプライマを使用して一段階式ＲＴ−ＰＣＲと実時間ＰＣＲにより実施した。
【００９４】
ｍＥＰＯフォワード： ５’−ＧＧＣ ＣＡＴ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＧ −３’ （配列ＩＤ ＮＯ：３５）
【００９５】
ｍＥＰＯリバース： ５’−ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＴ −３’（配列ＩＤ ＮＯ：３６）
【００９６】
図４に示されるように、形質導入され他ＭＳＣ ｍＥＰＯ細胞のｍＥＰＯ遺伝子発現はＤｏｘ治療により調節可能である。
【００９７】
一段階式ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＥＰＯプライマにより期待通り２００ｂｐのＰＣＲ生成物を得ることができた。これは配列決定法により確認した。１μｇ／ｍｌでのＤｏｘ治療では、２４時間の時点でＥＰＯ遺伝子発現がピークに達した。実時間ＰＣＲでの結果によると、Ｄｏｘにより治療したサンプルにおけるＥＰＯ発現が〜４倍増加したことが示されている。
【００９８】
実施例８： ＭＳＣ−ＣMによる増殖因子遺伝子発現の調節
【００９９】
実施例５の項にて上述されるＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節の場合と同様に、増殖因子遺伝子発現の調節を検討する際にはＭＳＣ−ＣＭを使用することになる。実施例2及び実施例４の項に記載されている方法でＭＳＣ−ＣＭを生成・投与する。ラットの腎臓中の増殖因子及びサイトカインの発現レベルの調節に関して（ＭＳＣ投与に関する記述において説明されている方法で）ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合と投与しない場合とを評価するために実時間ＰＣＲを使用する。同じプライマ及び状態を実施例５の項に記載されている方法で使用する。増殖因子遺伝子発現の調節におけるＭＳＣ−ＣＭ投与の結果を、実施例５の項に記載されている方法で評価する。また、ＭＳＣ−ＣＭによる増殖因子遺伝子発現の調節に使用するために、例えば実施例６の項に記載されている方法で遺伝子を組み換えたＭＳＣからＭＳＣ−ＣＭを生成する。
【０１００】
実施例９： ＭＳＣ、ＥＣ、又はＭＳＣ−ＣＭ、及びそれらの組成物
【０１０１】
静脈内注入（頚静脈、大腿部または尾静脈内注入）により、又は動脈内注入により（頚動脈又は大腿動脈経由で副腎大動脈に注入することによって）、あるいはＭＳＣを単独で、又はＥＣを単独で（調製法については後述）、又はＭＳＣ−ＣＭを単独で、あるいはMSCをＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて、もしくはＥＣをＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて、腹腔内に注入することによって、様々な治療プロトコルの相対的な腎臓保護効力と臓器保護効力をテストする。同時投与及び連続投与ならびに投与の時期（前記症状の発症後と、何らか危険度の高い状況が発生する前の両方）に関して投与をテストする。
【０１０２】
実験型中の腎機能、組織学的研究及びその結果を上述のように監視する。
【０１０３】
実施例１０：多臓器不全に対するＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与
【０１０４】
多臓器不全に起因する多くの悪影響に対抗できるように身体能力を促進することと、複数臓器の修復及びそれらの機能回復を目的として、ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与に関する調査を行う。この調査に使用される多臓器不全モデルは、老齢ラットの敗血症モデルである。該老齢ラットの敗血症モデルにはグラム陰性菌（ＬＰＳ）からの内毒素が注入され、且つ盲腸せん孔が認められ、結果として細菌性腹膜炎や臨床的多臓器不全のあらゆる症状（ＡＲＦを含む）が発現している。ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭ投与の後の臓器機能における向上を検討する。ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭ投与により好結果をもたらすことに成功した場合、実験対象の多臓器不全に一般に認められる１００％という死亡率を低下させ、且つ該当する場合は、創傷の修復を著しく高めるという効果が期待できる。ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの治療有効投与量を、それぞれ別々に、又は両者を組み合わせて、あるいは連続投与にて投与する。また、下記される方法で調整したＥＣは、多臓器不全において、ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭと併用して、もしくは単独で投与しうる。
【０１０５】
実施例１１：インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化によるＭＳＣからのＥＣ調製
【０１０６】
患者に対する治療有効量投与のためのＥＣは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化によってＭＳＣから生成される。当業者に公知の技術を用いＭａｒｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にＭＳＣを接種する。（Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ニュージャージー州フランクリンレイクス市内にあるＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されている。）１〜３日間、血清又は増殖因子のない培地においてＭａｒｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上でＭＳＣを培養する。あるいは、ヒトＶＥＧＦをもつヒト・フィブロネクチンの上で、７日間又は所定の密集度が達成されるまでＭＳＣを増殖する。当プロトコルに従って、ＭＳＣをＥＣ表現型に分化する。ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、フォンビルブラント因子、ｅＮＯＳ、及びＶＥＧＦレセプタ２の発現、ｄｉｌ−ａｃ−ＬＤＬ取込み、並びにその他当業者に公知の適切なマーカーを示すことによって、前記いずれかの方法によって生成された細胞のＥＣ表現型を確認する。その後、ＥＣを患者に投与するか、又はＭＳＣに関連して上述されるように将来的に投与するために凍結保存する。いくつかの実施形態では、実施例７の項に記載されているようにＥＣの遺伝子を組み換える。ＥＣは、単独で、又はＭＳＣやＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて投与する。ＥＣの治療効能は、ＭＳＣに関連して上述される方法により監視且つ評価を行う。
【０１０７】
実施例１２：ＥＣによる増殖因子遺伝子発現の調節
【０１０８】
上記実施例５の項に記載されるＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節の場合と同様に、ＭＳＣ−ＣＭを使用して増殖因子遺伝子発現の調節を検討する。上記実施例１１の項に記載される方法で、ＥＣを生成して投与する。ＭＳＣ投与に関連して上述されるように、実時間ＰＣＲを使って、ＥＣを投与したラットの腎臓とＥＣを投与していないラットの腎臓における増殖因子及びサイトカインの発現レベルの調節作用を評価する。実施例５の項に記載されるものと同じプライマ及び条件を使用する。増殖因子遺伝子発現の調節に対するEC投与の結果を、実施例５の項で説明されている方法で評価する。
【０１０９】
本明細書においては、本発明の好ましい実施形態に関してのみ記載されているが、当業者であれば、特許請求の範囲により定義される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、特に本稿にて記載されていない追加・変形・代用及び削除などを行いうることと、文言上又は均等論により特許請求の範囲の意味するところである実施形態のすべてがそこに包含されるべきものであることが容易に理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】血流再開直後のＭＳＣ注入用血清クレアチニン・レベルのグラフを示す図である。同一の中等度急性腎不全を伴い賦形剤で治療を受けた対照動物と比較した場合、血流再開直後のＭＳＣの投与が腎機能における有意な向上を示している。
【図１ｂ】血流再開後２４時間のＭＳＣ注入に続く血清クレアチニン・レベルのグラフを示す図である。同一の中等度急性腎不全を伴い賦形剤で治療を受けた対照動物と比較した場合、血流再開後２４時間のＭＳＣの投与が腎機能における有意な向上を示している。
【図２ａ】血流再開（ｒｅｆｌｏｗ）直後の細胞注入に関する血清クレアチニン・レベルを示すグラフであり、ＭＳＣ投与により重症のＡＲＦを伴ったラットの腎機能向上（賦形剤又は繊維芽細胞を注入した対照動物では得られなかった有益な効果）を示す図である。
【図２ｂ】ＭＳＣ投与に伴う損傷度指標の向上を示す損傷度指標のグラフを示す図である。
【図２ｃ】ＭＳＣ投与により増殖する細胞数の増加を示すＰＣＮＡ染色のグラフを示す図である。
【図２ｄ】ＭＳＣ投与によるアポトーシス細胞数の減少を示すアポトーシス指標のグラフを示す図である。
【図３ａ】腎臓全体におけるサイトカイン発現を示す図である。
【図３ｂ】腎臓全体における増殖因子発現を示す図である。
【図３ｃ】腎臓全体におけるアポトーシスとＮＯＳ遺伝子の発現を示す図である。
【図４】ＭＳＣにおけるＤｏｘ調節可能Ｅｐｏ発現を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概しては臓器機能不全、多臓器不全、腎機能障害、創傷治癒及び炎症性疾患の治療法に関し、より具体的には、間充織幹細胞、事前分化により間充織幹細胞から派生した内皮細胞、間充織幹細胞馴化培地、あるいはそれらの組成物を用いた治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多臓器不全（ＭＯＦ：Ｍｕｌｔｉ−Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ）は未解決のまま残されている大きな医学的問題である。ＭＯＦは、敗血症を伴う重病患者にて（特に大きな手術や外傷を経験した後に）発生する。急性循環不全、急性腎不全（ＡＲＦ：Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、細胞膜漏出、そして肺、肝臓、心臓、血管及び他の臓器における機能不全といった特徴がＭＯＦには見られる。挿管及び換気補助、昇圧剤や抗生物質及びステロイドの投与、血液透析、そして非経口的栄養法などをはじめとする最も積極的な形態の療法を利用してもＭＯＦによる死亡率は１００％に近い。それに加えて、手術創又は外傷による創傷に感染が生じるとそれらの治癒に大きな障害をもたらし、感染の再発やさらなる疾病率及び死亡率[の上昇]に寄与することになる。
【０００３】
ＡＲＦとは、「数時間又は数日間以内の腎機能における急性劣化であり、通常は腎臓で取り除かれるはずの有毒代謝物質が蓄積して生じるもの」、として定義されている。ＡＲＦの最も一般的な要因としては、腎尿細管及び腎糸球体末端部の血管内皮細胞に生じる虚血性傷害が挙げられる。このような虚血性ＡＲＦの主な病因論としては、出血や血栓事象、急性循環不全、ショック（ｓｈｏｃｋ）、敗血、大掛かりな心臓血管外科手術、動脈狭窄などから生じる血管内容積の収縮が挙げられる。一方、腎毒性ＡＲＦは放射線造影剤が原因とされており、例えば化学療法剤、抗生物質、シクロスポリンなどの薬剤が頻繁に使用される。ＡＫＦを伴う危険が最も高い患者としては、糖尿病患者、本来から腎疾患・血管疾患・肝臓病・心疾患を有する患者、高齢者、癌患者、及び様々な原因で低血圧を伴う患者などが挙げられる。
【０００４】
虚血性及び腎毒性のＡＲＦは尿細管細胞の細胞死をもたらす。致死下に損傷を受けた尿細管細胞は脱分化し、極性を失い、そしてビメンチン、間充織細胞マーカー、Ｐａｘ−２、（通常胎生腎中の間充織上皮分化転換の過程においてのみ発現する）転写因子を発現する。
【０００５】
腎臓は、激しい急性発作の後でさえも自己再生成し、それによってほぼ正常な機能を回復できる驚くべき能力を持っている。損傷を受けたネフロン（腎単位）片節の再生成は、残存する尿細管細胞の移動と増殖と再分化及び内皮細胞の並列修復の結果であると考えられている。但し、重症のＡＲＦの場合には、残存する尿細管細胞・内皮細胞の自己再生成能力を超過してしまう。何らかの原因により孤立性ＡＲＦ（即ち、ＭＯＦを伴わずに単独で生じるＡＲＦ）を伴う患者の死亡率は引き続き５０％以上である。集中治療による補助と血液透析、並びに最近使用されている心房性ナトリウム利尿ペプチド、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ）、より優れた生物学的適合性を有する透析膜、持続的血液透析などの介入法が存在するにもかかわらず、前記のような惨憺たる予後の改善は見られていない。
【０００６】
別のタイプの急性型腎不全である移植関連急性腎不全（ＴＡ−ＡＲＦ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）は多くの場合腎臓移植によりもたらされる。腎臓の被移植者はきまって早期移植片機能不全（ＥＧＤ：Ｅａｒｌｙ Ｇｒａｆｔ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）を起こし、その結果腎臓機能の損失につながり、移植片機能が回復するまで血液透析による治療が必要になる。臓器提供者が高齢者であったり極めて低年齢であったりする場合、又は欄外の移植片品質が限界レベルの場合、あるいは死体臓器提供者から該提供者の腎臓を採出する時点から及び被移植者の体内へそれを移植するまでの時間（「冷虚血時間」として知られている）が長期間に及ぶ場合には、ＴＡ−ＡＲＦの危険性が高くなる。ＴＡ−ＡＲＦによる早期移植片機能不全は、ＴＡ−ＡＲＦによって生じる進行性且つ不可逆的な腎臓機能の損失による移植片機能損失の加速化や、急性拒絶反応出現率の上昇により移植腎の早期喪失につながるなど、深刻な長期的影響を伴う。したがって、ＴＡ−ＡＲＦによる早期移植片機能不全に対する治療又は予防を提供する必要がある。
【０００７】
慢性腎不全（ＣＲＦ）は、ネフロン（腎単位）の進行性損失とそれに続く腎機能の損失である。腎臓の糸球体損傷、血管損傷及び炎症性損傷は共に最終的なネフロン損失と終末期腎疾患に起因する。本質的にあらゆる形態のＣＲＦにおける最終共通路は、腎間質に最も目立って現われる自己永続可能な繊維化及び硬化過程である。
【０００８】
多くの腎障害の特徴としては、腎外性障害同様に、極めて炎症誘発的な性質を持っている、ということが挙げられる。例えば、終末期腎疾患の患者における感染及び敗血は死亡率の上昇につながる。様々な増殖因子及びサイトカインはこれらの障害の病態生理において中心的な役割を果たす。このような増殖因子やサイトカインのレベルを調節することにより、炎症反応などの疾患を伴う患者に対する治療法を提供できる。
【０００９】
これらをもとに、ＡＲＦの予防や、自然腎に既存するＡＲＦ自体の治療又はＭＯＦの一部としてのＡＲＦの治療、移植腎のＡＲＦの治療、臓器不全一般及び炎症の治療に現在利用されている療法では、多数存在する当該の患者グループにおける疾病率と死亡率を著しく改善することに成功していない。それ故に、ＭＯＦや腎機能障害、臓器不全及び炎症性障害の治療を改善する必要性が差し迫っている。
【００１０】
本発明は、ＭＯＦ、腎機能障害、臓器不全、炎症性及び変形性障害を治療するための、且つ、これらの患者の損傷臓器中の増殖因子とサイトカインの発現をこれらの患者の体内において調節するための、間充織幹細胞と間充織細胞由来の内皮細胞及び間充織幹細胞からの馴化培地を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
先行技術の短所を一つ又は複数緩和するための治療法と組成物をここに提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様は、臓器機能不全、急性腎不全、多臓器不全、移植腎の早期機能不全、移植片拒絶反応、慢性腎不全、創傷及び炎症性障害を治療する方法を提供する。該方法には、間充織幹細胞（ＭＳＣ）にさらすことによって馴化された薬剤として許容される培地の治療量を、それを必要とする患者に導入することが含まれる。
【００１３】
本発明の別の様態では組成物が提供されている。該組成物には、ＭＳＣにさらすことによって馴化された薬剤として許容される培地が含まれる。
【００１４】
本発明の別の様態は、患者の損傷臓器における少なくとも一つの増殖因子の発現を調節する方法を提供する。該方法には、増殖因子の発現を調節するために有効量のＭＳＣ、内皮細胞（ＥＣ）又はＭＳＣ馴化培地を患者に投与することが含まれる。
【００１５】
本発明の別の様態は、患者の損傷臓器における少なくとも一つのサイトカインの発現を調節する方法を提供する。該方法には、サイトカインの発現を調節するために有効量のＭＳＣ、内皮細胞又はＭＳＣ馴化培地を患者に投与することが含まれる。
【００１６】
当業者であれば、以下例証として提示且つ説明される発明の好ましい実施形態の説明から本発明の利点を明確に理解できるはずである。当然のことながら、当該発明にはその他の及び異なる実施形態も適用でき、また、その詳細については種々様々な点で変更態様を適用できる。よって、図面及び明細書の説明は、本質的に例として記載されているに過ぎず本発明を制限するものではない、と見なされるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、間充織幹細胞、間充織幹細胞由来の内皮細胞、間充織幹細胞由来の馴化培地、及びそれらの組合わせを、損傷組織の修復、組織損傷の危険の高い患者における組織と臓器との損傷の回復及び予防、及び損傷臓器内のサイトカインと増殖因子発現レベルの調節に利用する。本発明の一態様では、間充織幹細胞（ＭＳＣ）を必要とする患者に間充織幹細胞を投与しうる。多臓器不全、ならびに例としてはこれらに限定されないが自然腎の急性腎不全や多臓器不全に伴う自然腎のＡＲＦ及び移植腎臓のＡＲＦをはじめとする腎機能障害、臓器機能不全、創傷治癒、及び炎症性疾患の治療又は予防にＭＳＣの投与を使用しうる。また、炎症性疾患の治療又は予防など、患者の炎症性サイトカイン及び増殖因子の発現を調節するためにもＭＳＣを使用しうる。なお当業者にとっては当然のことながら、前記以外の疾患の治療又は予防のためにもＭＳＣを投与しうる。
【００１８】
本発明の別の様態では、培養中でＭＳＣにさらすことによって馴化された培地（ＭＳＣ馴化培地：ＭＳＣ−ＣＭ）を、それを必要とする患者に投与しうる。一例として、下記のものに限定されないが、多臓器不全、ならびに例としてはこれらに限定されないが自然腎の急性腎不全や、多臓器不全における自然腎のＡＲＦ、移植腎臓のＡＲＦをはじめとする腎機能障害、臓器機能不全、創傷治癒、及び炎症の治療又は予防にＭＳＣ−ＣＭを使用しうる。また、炎症性疾患の治療又は予防など、患者の炎症性サイトカイン及び増殖因子の発現を調節するためにもＭＳＣ−ＣＭを使用しうる。なお当業者にとっては当然のことながら、前記以外の疾患の治療又は予防のためにもＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。
【００１９】
定義
【００２０】
「幹細胞」という用語は、自己再生能を有し様々な細胞型に分化する細胞のいかなるものをも指す。ここで使用される幹細胞は、「成体の」幹細胞である。即ち、該幹細胞は胚芽に由来するものではない。
【００２１】
「培養」又は「細胞培養」という用語は、細胞（複数可）が一般的に細胞増殖との適合性を有する又はその生存可能性を維持するための割当場所及び増殖条件となるように定義される境界内にある一つ又は複数の細胞を指す。なお、「培養」という用語は動詞として使用される場合、細胞の増殖又はそれの生存可能性の維持に適する当該場所及び増殖条件を提供する過程を示す。
【００２２】
「馴化培地」という用語は、開始培地中には存在しなかった細胞によって生成された少なくとも一つの付加的成分を培地に含むのに十分な時間をかけて、培養中で増殖された細胞にさらされた培地を指す。本発明で使用する馴化培地を培養中の細胞から取り除き、０．２２μＭのフィルタを通してろ過することにより、馴化培地が殺菌され、且ついかなる細胞、細胞断片及び微粒子が除去される。開始培地は、例えばＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＧｉｂｃｏＢＲＬ社（メリーランド州ロックヴィル市）やＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス市）又はＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（メリーランド州ウォーカーズヴィル市）などの製造供給元から市販される培地を含む、当業者に周知のいかなる培地をも使用しうる。培地を必要とする患者への投与に使用される培地は、薬剤として許容される組成物として（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ＜生体内＞での用途に適切な形態で）準備される。これは一般に、発熱物質並びにその他のヒト又は動物に有害でありうる不純物を本質的に含まない培地組成を準備することを要する。薬剤として許容される培地は、上記のような製造供給元により市販されている。「薬剤として許容される」という語句は、動物又はヒトに投与された時に副作用やアレルギー反応又は他の有害反応をもたらさない分子的実体と組成に関する。また補助的有効成分を組成物に組み入れることも可能である。
【００２３】
「治療有効量」という用語は、毒性をもたらさず、いかなる医学的治療の際にも適度なベネフィットリスク比（対危険便益比）を伴う望ましい結果及び効能を提供するのに十分な幹細胞又は馴化培地の量を指す。
【００２４】
「治療有効時間」という用語は、馴化培地又は幹細胞の治療有効量が投与されるまでの期間であり、且つある状態の症状を一つ又は複数軽減するのに十分な期間を指す。
【００２５】
「治療する」という用語は、ある状態の症状の少なくとも一つを改善させることを指す。
【００２６】
「状態」という用語は、疾病、及び／又は傷害（例えば外傷など）や治療（例えば、手術や臓器提供者からの組織の移植など）に対する反応
を指すために用いられている。
【００２７】
「増殖因子」という用語は、それ自体及び／又は他の様々な隣接の又は遠隔の細胞に作用をもたらすことができる細胞によって生成されるところの、タンパク質、ポリペプチド、又はサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。一般に増殖因子は、発達上又は多数の生理的刺激若しくは環境刺激に反応することのいずれかにおいて、特定の細胞型の増殖及び／又は分化に影響する。代表的な増殖因子の例としては、これらに限定されないが、インシュリン、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、基本的ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦｓ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、変換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β３を含む変換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモンインターロイキン、プロスタグランジン及びその他同等のものが挙げられる。
【００２８】
ここに使用される「サイトカイン」又は「サイトカイン（複）」という用語は、細胞間の相互作用に影響し且つ免疫反応の持続期間と強度を調整する生体分子の一般クラスを指す。また、これらの分子は細胞外環境において生じる過程も調整する。
【００２９】
「炎症誘発サイトカイン」という用語が示すものの例としてはこれらに限定されないが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−ベータ（ＩＬ−１β）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、リポ多糖類結合蛋白質、溶性リポ多糖類受容体（ＣＤ−１４）、ケモカインが挙げられる。ケモカインは、特異的な白血球細胞亜型の活性化因子及び走化性因子として主に作用する４０以上の小さな（約６〜約１４ｋＤａ前後の）誘導型且つ分泌型の炎症誘発ポリペプチド超科に属する。
【００３０】
「抗炎症性サイトカイン」という用語が指すものの例としてはこれに限定されないが、溶性のＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ＲＩ及びＴＮＦ−ＲＩＩ）、インターロイキン受容体拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、及び変換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）が挙げられる。
【００３１】
「炎症性（の）」という用語は疾病又は状態に関連して用いられる場合、正規の方法には不適当な及び／又は正規の方法では解消されない炎症が原因で生じた、又はそれによりもたらされた、又はそれをもたらす病理過程を指す。炎症は、物理学的作用物質、化学的作用物質又は生物学的作用物質によってもたらされた傷害又は異常な刺激に反応して生じる。これらの反応としては、局所反応や、その結果として生じる形態学的変化、有害物質の破壊又は除去、及び修復及び治癒につながる反応が挙げられる。炎症性疾患及び炎症状態は全身性でありうるし、若しくは特定の組織又は臓器に局所的に生じうる。
【００３２】
次のものを含む多くの疾患（以下の例示には限定されない）で炎症が生じるということは既知の事実である。全身炎症反応（ＳＩＲＳ）；アルツハイマー病（及び、慢性神経炎症、神経膠活性化、小膠細胞の増加、老人斑の形成、及び療法に対する反応などのそれに関連した状態と症状）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；関節炎（及び、急性関節炎、抗原誘導性の関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎に関連した関節炎、コラーゲン誘導性の関節炎、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、予後の連鎖球菌誘導性の関節炎、脊椎関節症、痛風性関節炎などを含むがこれらに限定されない、それに関連した状態と症状）；喘息（及び、気管支喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息及び職業性喘息などのそれに関連した状態と症状）；心疾患（及び、動脈硬化、自己免疫性心筋炎、慢性心臓低酸素状態、鬱血心不全、冠動脈疾患、心筋症、及び大動脈平滑筋細胞活性化、心臓アポトーシス及び心臓細胞機能の免疫修飾を含む心臓細胞機能不全などのそれに関連した状態と症状）；糖尿病（及び自己免疫の糖尿病、インシュリン依存性（１型）糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症及び糖尿病腎症などのそれに関連した状態と症状）；胃腸の炎症（及び、セリアック病、関連骨減少症、慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸感染、及び潰瘍性大腸炎などのそれに関連した状態と症状）；胃潰瘍；ウイルス性肝炎及びその他のタイプの肝炎などの肝性炎症；コレステロール胆石と肝線維症；ＨＩＶ感染症（及び、変性反応、神経変性反応及びＨＩＶ関連ホジキン病などのそれに関連した状態と症状）；川崎症候グループ（及び、皮膚粘膜リンパ節症候グループ、頚リンパ節腫症、冠動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度の貧血、皮膚剥離、発疹、結膜発赤、血小板増加症などのそれに関連した状態と症状）；多発性硬化症、腎症（及び、糖尿病腎症、末期腎臓疾患、急性・慢性糸球体腎炎、急性・慢性間質性腎炎、狼瘡腎炎、グッドパスチャー症候グループ、血液透析残存物及び腎臓部の虚血再潅流傷害などのそれに関連した状態と症状）；神経変性病（及び、急性神経変性、老化と神経変性病におけるＩＬ−１の誘発、視床下部神経細胞のＩＬ−１誘発塑化、及び慢性ストレス超反応などのそれに関連した状態と症状）；眼障害（及び、糖尿病性網膜症及びグレーブス眼障害、ブドウ膜炎などを含むそれに関連した状態と症状）；骨粗鬆症（及び、歯槽骨、大腿骨、橈骨、椎骨又は手根骨の骨量の減少又は骨折発生率、閉経後の骨量の減少、塊化、骨折の発生率、又は骨量の減少速度などのそれに関連した状態と症状）；中耳炎（成人又は小児）、膵臓炎又は膵臓細葉炎、歯周病（及び、成人、早期発症、及び糖尿病などのそれに関連した状態と症状）；肺疾患（慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎、ヒアリン膜症、ＳＩＤＳにおける低酸素状態及び肺疾患などを含む）；冠動脈又は他の血管移植片の再狭窄；リウマチ（関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ性疾患及びリウマチ性心筋炎などを含む）；慢性リンパ球性甲状腺炎を含む甲状腺炎；尿路感染（慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候グループ及び尿石症などを含む）等。円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス病、グレーブス眼障害、硬化性苔癬、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、甲状腺疾患（例えば、甲状腺腫及びリンパ腫症性甲状腺腫〔橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫〕、睡眠障害や慢性疲労症候グループ及び肥満〔非糖尿病性のものと、糖尿病関連のものの両方を含む〕）などの自己免疫疾患を含む免疫疾患。細菌、ウイルス（例えば、サイトメガロウィルス、脳炎、エプスタイン-バーウイルス、ヒト免疫不全ウィルス、インフルエンザウイルスなど）、又は原虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫、トリパノソーマなど）によってもたらされるリーシュマニア症、らい病、ライム病、ライム病心臓炎、マラリア、大脳マラリア、脳膜炎、マラリア関連の尿細管間質性腎炎）などの感染病に対する抵抗。脳外傷（卒中及び虚血、脳炎、脳症、癲癇、周産期脳外傷、長期にわたる熱性けいれん、ＳＩＤＳ及びクモ膜下出血などを含む）、低出生体重（例えば、脳性麻痺）、肺損傷（急性出血性肺損傷、グッドパスチャー症候グループ、急性虚血性再潅流）、（例えば、毒性オイル症候グループ珪肺症に対する罹病性などの）職業・環境汚染物によってもたらされた心筋機能障害、放射線損傷を含む外傷に対する反応、及び（例えば、火傷又は熱傷、慢性創傷、手術創及び脊椎損傷などの）創傷治癒反応の効率。受精能／生殖能、妊娠可能性、早産、出生前・出生時合併症（早産による低出生体重、脳性麻痺、敗血症、甲状腺機能低下、酸素依存、頭蓋異常、早期発症閉経を含む）などを含むホルモン調節[機能に関連する状態]。移植に対する被験者の反応（拒絶又は受容）、急性期反応（例えば発熱反応）、一般的な炎症反応、急性呼吸窮迫反応、急性全身炎症反応、創傷治癒、癒着、免疫炎症反応、神経内分泌反応、発熱現象及び抵抗、急性期反応、ストレス反応、罹病性、反復運動によるストレス、テニス肘、疼痛管理及び反応。
【００３３】
間充織幹細胞
【００３４】
本発明のＭＳＣは、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋肉又は脂肪組織、子宮内膜、血液、臍帯組織又は臍帯血液、及び様々な組織の初代培養から得られうる。
【００３５】
本発明で使用されるＭＳＣを得るためにいかなる供給源をも使用しうるが、骨髄から該ＭＳＣを単離することが好ましい。一例として、骨髄穿刺液を単離して洗浄し、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）（ガラス器内などの生体外環境）において培地に再懸濁して無菌培養に入れるようにしても良い。最初に、培地中で血清が単離された細胞に接種（ｐｌａｔｅｄ）される。本質的にＭＳＣ以外の細胞はすべて非癒着性であり洗浄時に除去される間、ＭＳＣは培養皿に付着する（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４：２６７−７４， １９７６）。ＭＳＣは、明確に定義された多分化能性幹細胞グループを産出しながら培養中で培養して増殖する。さらなるＭＳＣ−ＣＭの増殖・生成を続ける前に、又は患者にＭＳＣを投与する前に、残留マクロファージ又はその他の造血細胞系統を除去するためにＦＡＣＳによってＭＳＣのＣＤ４５陽性細胞がさらに枯渇される。本発明のＭＳＣはＣＤ３４及びＣＤ４５陰性であることが好ましいが、該ＭＳＣとしては、ＳＨ２、ＳＨ４、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０６、ＣＤ１２０ａ陽性及びＣＤ１２４、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５陰性であることがさらに好ましい。ＭＳＣは、癒着分離法以外にも、密度勾配分割法や免疫的選択法、白血球搬出法及びその他同等のものを含む（但しこれらに限定されない）当業者に周知のいかなる技術によっても単離しうる。
【００３６】
また、ＭＳＣは、単離された幹細胞がＭＳＣであることを示すために形態学的及び機能的にテストしうる。Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらによると、例えば、ＭＳＣを骨細胞と脂肪細胞へ分化させるために細胞の一部分を分化培地において培養しうる、と報告している（Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２８４： １４３−１４７， １９９９）。残りのＭＳＣを培養中で引き続き増殖させて患者への投与や馴化培地の生成に使用しうる、或いは低温保存して後で使用するようにもしうる。
【００３７】
ＭＳＣは、患者から、又は定義された状況下に適合性を有するが同種異系である提供者（ドナー）由来のものでありうる。当業者には周知のＨＬＡ適合性を含む、移植される臓器に対して定義されるような類似した適合性を有する提供者からのドナー幹細胞を使用しうる。ＭＳＣはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において増殖することができるので、ＭＳＣの複数投与が可能となり、ＭＳＣの治療効果をさらに増大することができる。自家幹細胞の使用により免疫寛容の懸念が解消される。
【００３８】
本発明のＭＳＣは、患者への投与前に、又はＭＳＣ−ＣＭの生成前に、遺伝子組み換えを行いうる。ＭＳＣは、抗炎作用を及ぼし、且つ腎臓内血行動態を向上させるために、生成物が細胞の生存を助け細胞の移動と増殖を刺激するとして知られる遺伝子を使用して遺伝子組み換えを行いうる。ＭＳＣに導入された遺伝子の発現は、これらの遺伝子の被制御活性化及び不活性化の両方を可能にする薬剤感受性プロモータを含む（但しこれに限定されるものではない）様々なプロモータの制御下に置かれうる。ＭＳＣを遺伝子組み換えするための発現ベクターのクローニングが当業者に公知の材料と方法を使用して行われる。ＭＳＣの遺伝子組み換えは、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ウイルス・ベクターを含む感染、電気穿孔法及びその他同等のものを含む当業者に公知の方法を使用して達成しうる。
【００３９】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における事前分化による本明細書に記載されるＭＳＣ由来の内皮細胞（ＥＣ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）も本発明において使用しうる。ＥＣは、ＭＳＣに対して、或いはＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭ（及びそれの組合わせ）と組み合わせて、前記のような患者への導入に使用されうる。投与用ＥＣの処方は後述する。
【００４０】
別途指示無き限り、本発明の実施には、本発明が属する技術分野の範囲に含まれる従来のウィルス学的、微生物学的、分子生物学的方式及び組換ＤＮＡ技術が採用されるものとする。これらの技術は、諸文献において詳細に説明されている。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（仮訳：分子クローニング:実験手引き書）」（現行版）、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（仮訳：ＤＮＡクローニング:実用的研究方法）』第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（仮訳：オリゴヌクレオチド接合）」（Ｎ．Ｇａｉｔ編、現行版）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（仮訳：核酸雑種形成）』（Ｂ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（仮訳：転写と翻訳）」（Ｂ．Ｈａｍｅｓ，Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）、「ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（仮訳：パルボウィルスのＣＲＣ手引き）」第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（仮訳：基本ウィルス学）第二版』第Ｉ巻・第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ． Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００４１】
ＭＳＣ馴化培地
【００４２】
ＭＳＣ馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）は、培地を馴化するのに十分な時間をかけて上記ＭＳＣを培養することにより得られうる。非限定的な一例として、以下のようにＭＳＣ−ＣＭを得ても良い。ＭＳＣは、上記のようにして得ても良く、また培養中に接種された細胞として得ても良い。例えばＦＡＣＳ分類によるＣＤ４５陽性細胞の癒着接種と除去によって他の細胞型が枯渇してしまったＭＳＣは、実質的に各培養物が密集しており、本質的に接触が阻止された培養物へと発達しうる。該培養物が増殖するとともに、ＭＳＣは血清を含んだ培地において増殖しうる。また、ＭＳＣは、ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの被移植者からの自家血清でも増殖しうる。いったん培養物が高サブコンフルエント（すなわち、約３−５×１０６ ＭＳＣ／Ｔ−７５フラスコ）まで増殖すると、無血清ＭＳＣ−ＣＭが望ましい場合には血清を培地から除去しうる。
【００４３】
ＭＳＣは通常の酸素状態、すなわち、室内気＋５％ＣＯ２（ｐＯ２約２１％）にて増殖しうる。その代わりとして、且つ好ましくは、ＭＳＣは低酸素状態（ｐＯ２≦５％）でも増殖しうる。培地は、ＭＳＣ存在下で、ＭＳＣ培養物への培地の添加前には存在しなかった成分を少なくとも一つ培地に加えるのに十分な時間、定温放置にて培養される。培地を馴化する期間としては１〜３日間が好ましく、２日間がより好ましい。ＭＳＣ−ＣＭを収集してから、ＭＳＣ−ＣＭを殺菌し、あらゆる微粒子をも除去するために微細孔フィルター（０．２２μＭフィルターなど）によって濾過するようにしても良い。該ＭＳＣ−ＣＭはそのまま患者に投与しても、後で投与できるように好ましくは−１２０℃で冷凍して保存しても良い。また、例えば遠心分離、透析、濾過、凍結乾燥及びその他同等のものによってＭＳＣ−ＣＭを濃縮してもよい。
【００４４】
ＭＳＣにより培地に加えられた成分が少なくとも一つ存在することは、生物検定としての、ＥＬＩＳＡ、又はＨＰＬＣなどの分離分析を用いて確認しうる。例えば、例として掻爬、ＡＴＰ枯渇、又はこれら両方によって損傷を受けた近位尿細管性細胞を使用することによりインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてＭＳＣ−ＣＭをテストしうる。生存、繁殖及び／又は増殖の刺激に対して細胞を評価するために、煮沸したＭＳＣ−ＣＭ又は無血清培地を単独で対照として使用することによりＭＳＣ−ＣＭを細胞に添加しうる。また、ＭＳＣ−ＣＭはｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）においてもテストしうる。ＭＳＣに関連して上記されるように、ＭＳＣ−ＣＭは、単回投与、複数回投与又は連続投与、又はこれらの組合わせにより投与しうる。本発明の馴化培地（ＣＭ）を生成するためのＭＳＣの供給源に対しては、必ずしも直接患者に移植されるＭＳＣと同じレベルの適合性が要求されるとは限らない。ＭＳＣ−ＣＭの生成及び使用については、後述される実施例を参照してさらに詳しく説明する。
【００４５】
治療有効量の投与
【００４６】
ある実施形態では治療有効量のＭＳＣが患者に導入され、別の実施形態では治療有効量のＭＳＣ−ＣＭ又はＥＣが患者に投与される。治療有効量のＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭは、これらのいかなる組合わせとしても投与されうる。治療有効量は、治療を受ける患者の体重によって決定されるが、病状の重症度や、療法開始時における病状の進展段階（例えば、初期、末期、等）、及び合併症の有無によって、さらに変更されうるものである。治療量はまた、患者に導入する際の方法に基づいても決定されうる。治療量は、療法中の投与が一回なのか又は複数回なのかによる。治療量のＭＳＣ−ＣＭの投与は、例えば２４時間（但し、必ずしもこれに限定されない）の持続注入によって行いうる。好ましくは、約０．０１ｍｌ〜約０．２ｍｌ／体重１００ｇのＭＳＣ−ＣＭを含んだ治療投与量が投与されれば良く、さらに好ましくは、約０．０４ｍｌ〜約０．１０ｍｌ／体重１００ｇのＭＳＣ−ＣＭを含んだ治療投与量が導入されるのがよい。ただし、それ以外の投与量も可能である。好ましくは、治療投与量中、被移植者の体重１キログラム当たり約０．０１〜約５×１０６個の細胞を含むＭＳＣ又はＥＣが投与されれば良く、さらに好ましくは、治療投与量中、被移植者の体重１キログラム当たり約０．０２〜約１×１０６個の細胞を含むものが投与されるのが良い。使用される細胞の数は、被移植者の体重と状態、投与数又は頻度、及びその他当業者に周知の変数に依存する。例えば、治療投与量は、療法中の投与が一回なのか又は複数回なのかによる。それに続く治療投与量は、治療量のＭＳＣ、ＥＣ、ＭＳＣ−ＣＭ又はそれらの組成物を含みうる。ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭの治療量は、治療の必要性をもたらしている事象の前に（例えば手術、化学療法による治療などの前に）、患者に対して投与しても良い。
【００４７】
好ましくは、注射によって、又は静脈内（すなわち、大静脈などのような太い中心静脈内）に点滴注入するか又は動脈内（すなわち、大腿動脈を介して副腎動脈内）に点滴注入することによって、ＭＳＣとＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを患者に投与すればよい。ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの導入には、本発明の属する技術分野において一般に知られている導入方法のいかなるものをも使用しうる。
【００４８】
ＭＳＣとＥＣがインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において増殖可能であり、且つＭＳＣ−ＣＭが採取・保存可能であるので、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの治療効果をさらに増大するためにＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを複数投与することが可能である。治療抵抗性（血液透析、非経口的栄養法、抗生物質、集中治療）のＡＲＦを単独で又はＭＯＦ又は多臓器機能不全に伴って有する患者や、最も重度な形態の治療抵抗性ＡＲＦが発現する危険が最も高いか又は最も重症度の高い治療抵抗性ＡＲＦが今にも発達しようとしている患者や、大動脈瘤修復などの危険度の高い手術を受ける予定になっている外傷又は外科患者や、感染しており治癒不能な創傷をもつ患者や、術後にＭＯＦを発達中の患者や、移植腎臓に影響を及ぼす重症のＡＲＦを伴う患者、及び治療を必要とする炎症性疾患を伴ういかなる患者をも含む（但し、これらに限定されない）代表的患者集団が、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与により効果を得ることができる場合がある。上述のように、ＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭの治療量投与は、治療を要する状態が発現する前、発現中、もしくは発現後に行いうる。複数の異なる治療量を患者に提供してもよい。腎臓、肺、肝臓、心臓などのあらゆる損傷臓器に関連した状態において、ＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭによる療法を使用しうる。
【００４９】
治療有効量のＭＳＣ、ＥＣ及びＭＳＣ−ＣＭを投与した結果の評定は、当業者に一般に知られている技術を用いた評定により行いうるものであり、ここに挙げられる実施例に限定されない。例えば、血清クレアチニン、ＢＵＮ、電解質レベル、クレアチニンクリアランス（糸球体ろ過値）の測定、尿排出及び組織像を判断することにより腎臓の治療をモニター監視しうる。実験型を使って、肺中の含水量と浸潤細胞を計測することによって治療有効量の投与による肝臓及び肺の病状軽減状態を評価し、また、肝臓については組織学的に評価しうる。患者及び実験型中の組織及び肝酵素の生検サンプルを計測しても良い。
【００５０】
増殖因子の調節
【００５１】
損傷臓器中の増殖因子及びサイトカインの発現を調節するために、ＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを、それを必要とする患者にも与えうる。例えば、増殖因子及び抗炎症性サイトカインの発現レベルを増やすためにＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。また、増殖因子及び炎症反応促進性サイトカインの発現レベルを下げるためにもＭＳＣ、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭを投与しうる。
【００５２】
増殖因子発現レベルの調節は、例えば血漿中で、又は、組織又は血球中の増殖因子の発現レベルを計測することによっても計測しうる。血漿中の増殖因子の検出については、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス市）によって販売されているような市販のＥＬＩＳＡキットを使用して計測しうる。組織及び血球中の増殖因子の発現レベルは、例えば、以下の実施例に記載されるマイクロアレイ解析又は実時間ＰＣＲにより決定されうる。増殖因子調節の計測評価を行う方法として当業者に公知のいかなる検定法をも使用できる。
【実施例】
【００５３】
ここで、下記の非制限的な実施例に基づいて本発明を説明する。
【００５４】
実施例１：ＭＳＣの単離
【００５５】
麻酔下に、正常の成体ラット（雄性又は雌性の、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ又はＦｉｓｈｅｒ ３４４系統）の大腿から、２５ゲージ注射針の付いた注射器を使って無菌ＰＢＳにより大腿を洗浄（ｆｌｕｓｈ）することによって、ＭＳＣを集菌した。単離された細胞吸引液を回転させて、吸引液に含有される細胞を沈殿させた。沈殿物を培地（ミズーリ州セントルイス市内Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社；１０−２０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２）の中で再懸濁し、任意に７０μｍメッシュ（カリフォルニア州サンノゼ市Ｂｅｃｔｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でろ過してから、培地の入った７５ｃｍ２の一次培養フラスコ内に接種した。非癒着細胞は、培養液中72時間後に培養液で繰り返し洗浄することによって取り除いた。癒着細胞は低密度で新しいフラスコへと移し、約３−５×１０６ ＭＳＣ／フラスコまで増殖させた。細胞の外観は紡錘状であった。ＭＳＣ表現型は、特異性分化培地で骨細胞及び脂肪細胞に分化することによって確認された（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２８４：１４３−１４７、１９９９年）。任意的に、あらゆるＣＤ３４及びＣＤ４５陽性細胞を排除するため、癒着細胞をＦＡＣＳによってさらに精製した。ＭＳＣは、被移植者への投与や、ＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭの生成に使用したり、或いは後で使用するために凍結保存した。
【００５６】
実施例２：ＭＳＣ−ＣＭの調製
【００５７】
ＭＳＣ−ＣＭの生成に、実施例１に記載される方法で単離したＭＳＣを使用した。ＭＳＣが高サブコンフルエント（すなわち、約３−５×１０６ ＭＳＣ／Ｔ−７５フラスコ）になるまで増殖させ、ＭＳＣを無血清培地で繰り返し洗浄することによってウシ胎仔血清を培養物から取り除いた。その後１−３日間、大気下（ｐＯ２〜２１％）
で、又は低酸素状態（ｐＯ２≦５％）の下に、ＭＳＣを培養することによって無血清培地を馴化した。無細胞上澄み液（ＭＳＣ−ＣＭ）を採取し、０．２２μＭのフィルタでろ過してから、―１２０℃の無菌条件下にて冷凍した。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてテストする前、又はＡＲＦを伴うラットに投与する前に、ＭＳＣ−ＣＭを解凍し、さらなる調整操作を加えることなくアリコート（一定分量）を使用したり、或いは対照としての投与前に２０分間１００℃にてアリコート（一定分量）を煮沸したりした。無血清ＭＳＣ−ＣＭ中のタンパク質絶対濃度は、ビウレット・タンパク質検定の検出下限にあった。
【００５８】
実施例３：ＭＳＣ投与
【００５９】
虚血性／再潅流型のＡＲＦ（「虚血性ＡＲＦ」）は、麻酔下のラットにおいて、両腎茎の時限クランピングにより誘導され、結果として腎臓への血液供給を阻止することになり、それが原因で「虚血性の」発作が発生して腎臓機能の急な消失（すなわち、ＡＲＦ）につながった。４５分間の両側性腎虚血により重症ＡＲＦの標準モデルが確立された。該４５分間の両側性腎虚血の治療結果は、血流再開後７２時間、糸球体濾過率が基準値の５％未満の場合、死亡率５０％であった。重症ＡＲＦ標準モデルの組織診では、皮髄境界部に広範囲におよぶ腎尿細管壊死と重度な維管束うっ血が認められた。３５分間の両側性腎虚血により中等度ＡＲＦ標準モデルが確立された。中等度ＡＲＦ標準モデルは、血清クレアチニン・レベル約１．５ｍｇ／ｄＬ及び死亡率１０％未満（＜１０％）を示す。これらのＡＲＦ標準モデルは、急性循環不全や敗血や外傷を伴ったり、血管手術後であるなどのＡＲＦ患者を含む最も一般的且つ最も重度のＡＲＦ患者の場合と非常によく似ている。
【００６０】
ＡＲＦ発症直後又は２４時間後に、ＭＳＣを静脈内注入（頚静脈、大腿静脈、又は尾静脈内に注入）、又は動脈内注入（頚動脈又は大腿動脈を介して大動脈内に注入）した。すべての研究において投与された細胞の総数が被実験動物一匹あたり約１×１０５〜１．５×１０６個であった。同数の繊維芽細胞と同量の無血清培地を対照として使用した。
【００６１】
血中クレアチニン及びＢＵＮレベルの測定と、クレアチニン・クリアランス（糸球体ろ過値）及び尿排出の計測によって、実験型における（つまり患者の）腎機能を監視した。全体的な結果は、体重減少、血流動態及び生存を測定することによって評価された。ＭＳＣによる治療を施行したＡＲＦ動物及び対照の動物を屠殺後、腎臓における組織学的損傷（アポトーシス、壊死、維管束のうっ血及び損傷、炎症細胞浸潤巣）及び修復（有糸分裂生起、細胞の再分化、充血除去など）の度合いを検討した。
【００６２】
組織像及び損傷度指標（ｓｃｏｒｅ）は以下のように評価した。固定されている腎臓の冠状断をＨ＆Ｅで染色し、２５個の正方格子からなる目盛付き対物レンズ（倍率２０倍）を使用してランダムな皮質野で尿細管の損傷度を採点評価した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら 「カルパイン抑制剤−１はラットの腎虚血／再潅流傷害を軽減化する。」Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５９： ２０７３−２０８３、２００１）。それぞれの腎臓について、尿細管のプロフィールと該格子間に存在する１００個の交点を検討した。「造血幹細胞動員関連の顆粒球増多症によって急性腎不全が凄まじく悪化する」と題するＴｏｇｅｌらの報告（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１５：１２６１−１２６７，２００４）に示されるように１ｍｍ当たりの白血球浸潤を採点評価した。
【００６３】
免疫組織化学法は以下のようにして実施された。腎臓のパラフィン切片をキシレンで脱パラフィン化し、アルコール系及び水の中で再水和した。ペルオキシダーゼ遮断試薬で伏培（定温放置）後に、ＤＡＫＯ社製（カリフォルニア州カーピンテリア市）の即時使用可能ＰＣＮＡ染色用製剤中にて、モノクローナルのマウス抗ラットＰＣ−１０抗体でスライドを標識付けした。腎臓皮質及び外部髄質からランダムに選択された４分画中の正電荷の原子核数を倍率２０倍で数えることにより、ＰＣＮＡ陽性細胞（有糸分裂生起のマーカー）の採点評価を行った。ＰＣＮＡの評点を得るために全ての領域及び全ての腎臓からのデータをプール（合併収集）した。アポトーシスの評点は、Ｒｏｃｈｅ社製（ドイツ国マンハイム市）の原位置細胞死検出キット（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用してＴＵＮＥＬ検定により得られた。腎臓切片をプロテイナーゼKで脱パラフィン化、再水和、且つ温浸（ｄｉｇｅｓｔ）して、３７℃で６０分間ＴＵＮＥＬ反応液により標識付けした。切片標本の正電荷の原子核を蛍光顕微鏡でスクリーニングし、また、すべての腎臓に関して皮質及び外部髄質中のランダムに選択された切片10個を倍率４０倍で数えた。アポトーシスの評点を得るために全領域及び全腎臓からのデータをプール（合併収集）した。
【００６４】
図１ａと図１ｂに示されるように、中等度ＡＲＦを伴うラットに対して血流再開直後にＭＳＣを投与した場合（１ａ）又は血流再開後２４時間後に投与した場合（１ｂ）、血清クレアチニンによって決定される腎機能が著しく向上した。重度のＡＲＦを伴うラット（対照動物における２４時間の血清クレアチニン＝４．５±０．５ｍｇ／ｄＬ）についても、血流再開直後にＭＳＣを与えられた動物で同じような向上が認められた。治療執行動物中の血清クレアチニンレベルは、ＭＳＣ注射の２４時間後で２．１±０．５ ｍｇ／ｄＬであった（対照比較：Ｐ＝０．００２）（図２ａ）。また、重度のＡＲＦを伴うラットの腎損傷指標、白血球浸潤指標、ＰＣＮＡ指標及びＴＵＮＥＬ染色指標についても評価した。ＭＳＣにより治療したラットの損傷指標（Ｐ＝０．００４）（図２ｂ）、対照動物と比較したＰＣＮＡ染色指標（Ｐ＝０．０２３）（図２ｃ）、及び皮質中のアポトーシス細胞数の低下（Ｐ＜０．０００１）（図２ｄ）は有意義な好結果であった。治療した動物と対照動物の白血球浸潤指標も類似したものであった。
【００６５】
実施例４：ＭＳＣ−ＣＭによるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）治療
【００６６】
実施例２で説明した方法でＭＳＣ−ＣＭを調製した。ＭＳＣ−ＣＭを損傷尿細管細胞に加えて用いたインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における治療を以下のようにテストした。近位尿細管表現型である正常ラット腎臓細胞（メリーランド州ロックヴィル市内ＡＴＴＣ社から購入した「ＮＲＫ」）を、１０ｃｍのペトリ皿の中で、密集状態になるまで、１０％ＦＣＳ（ユタ州ローガン市Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、ｐＨ ７．４０、３７℃、５％ＣＯ２及び大気を伴うＤＭＥＭにおける培養液中で増殖させた。いったんＮＲＫが密集状態になった時点で、無血清ＤＭＥＭで細胞を３回洗浄し、且つ細胞培地を無血清ＤＭＥＭと取り替えた。ＮＲＫは、０．１ｍＭのアンチマイシンで３０分及び１ｍＭの２−デオキシグルコースで３０分定温放置することによって約７５−９０％ＡＴＰ枯渇した。その後、無菌メスを使ってＮＲＫ上に擦過傷をつけた（つまり、いくつかの並列する擦過傷を、尿細管細胞単分子層中に生成した。）ＡＴＰ枯渇度はルシフェラーゼ・キット（ミズーリ州セントルイス市シグマ社製）を使用した並行調査にて測定された。
【００６７】
損傷細胞培養を慎重に洗浄して、アンチマイシン及び２−デオキシグルコースを除去し、（大気培養又は低酸素培養の）ＭＳＣ−ＣＭを含む無血清ＤＭＥＭと対照培地を培養に加えた。容量を一定に維持しながら以下のものを添加した。
ＭＳＣ−ＣＭ：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ（２０分、〜１００℃）：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
低酸素ＭＳＣ−ＣＭ：０．２、０．５、１．０ｍｌ、総培地量５ｍｌ
ウシ胎仔血清：１０％、陽性対照、総培地量５ｍｌ
無血清培地：０．２、０．５、１．０ｍｌ、陰性対照、総培地量５ｍｌ
【００６８】
治療後２４及び４８時間経過した時点で損傷ＮＲＫを評価した。各グループにおいて少なくとも４〜６件の独立した実験を行った。表１に示されるように、運動性変化生起（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）と有糸分裂生起、及びアポトーシスの度合いを計測評価した。運動性変化生起については、創傷治癒の目的で創傷領域への細胞移動量を計測する。半細胞分裂促進投与量であると判明している０．２ｍｌのＭＳＣ−ＣＭで運動性変化生起をテストした。
【００６９】
有糸分裂生起については、細胞の増殖及び生存量を計測する。２４時間と４８時間の時点でＭＴＴ検定法により有糸分裂促進性を計測した。ＭＴＴ検定では、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨなどの還元当量を生成すべく、代謝的に活性な細胞によって（部分的にはデヒドロゲナーゼ酵素の作用によって）、黄色のテトラゾリウムＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）が還元され、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨのような還元相当物を生成する。その結果得られた細胞内の紫色ホルマザンは可溶性となり、分光測光手段によって定量化できる。
【００７０】
アポトーシスは、上述のＴＵＮＥＬ検定法（アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）や、市販の抗体を用いたＦＡＣＳ解析によるＰＩを使用）及び免疫細胞化学による細胞形態学を用いて計測された。その結果を表１に示す。
【表１】
表1中のデータは、平均値（％）± 第５グループＳＦＭ（＝１００％）陰性対照のＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第１グループのデータを第２〜第５グループのデータと比較した場合）
※※： 少なくともｐ＜０．０５ （第４グループを第２グループと５グループからのデータと比較した場合、及び第４グループを第１グループと比較した場合）
【００７１】
表１に示されるように、ＭＳＣ−ＣＭは、培養中の損傷細胞における対照培地と比較して、著しく運動性変化生起及び有糸分裂生起を刺激し、アポトーシスによる細胞死を抑制する。また、運動性変化生起と有糸分裂生起及びアポトーシスに対するＭＳＣ−ＣＭ作用は（一回分の）投与量に依存する（図示せず）。低酸素状態で生成されたＭＳＣ−ＣＭは、大気下で馴化されたＭＳＣ−ＣＭよりも著しく強力であった。４８時間の時点で集菌したＭＳＣ−ＣＭは２４時間で採取されものよりも若干強力であった。
【００７２】
実施例５： Ｉｎ ＶｉｖｏにおけるＭＳＣ−ＣＭ投与
【００７３】
実施例２で説明した方法でＭＳＣ−ＣＭを調製した。ＭＳＣ−ＣＭは、下記載されるような単回投与又は持続注入プロトコル（治験実施計画）に則って注入した。
【００７４】
ＭＳＣ−ＣＭ注入の単回投与のために、（４０分間の虚血後に行った腎茎クランプ除去に続く）血流再開直後、そして再び２４時間及び４８時間の時点において、（大気か又は低酸素ｐＯ２の下に馴化された、もしくは対照としてＤＭＥＭ（ＳＦＭ）の下に馴化された培地から得られた煮沸済又は未煮沸の）ＭＳＣ−ＣＭ ０．２ｍＬ（０．０７ｍＬ／１００ｇ）を、虚血／再潅流によるＡＲＦ（Ｉ／Ｒ ＡＲＦ）を伴うラットグループ（成体、雄性ＳＤラット、ｎ＝６〜８／各々）に対して注入した（尾静脈経由のｓ．ｃ．又はｉ．ｖ．）。３日間の観察期間中に、生存状態や体重の記録、腎機能（血清クレアチニン、ＢＵＮ、腎血流量）の測定及び腎臓損傷の組織学的な指標により結果を評価した。
【００７５】
ＭＳＣ−ＣＭの単回投与を使用したｉｎ ｖｉｖｏにおける治療の結果を表２に示す。
【表２】
表２におけるデータは平均±ＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第Ａ１グループのデータを第Ａ２及び第Ａ４グループのデータと比較した場合、及び第Ａ１グループを第Ａ３グループクレアチニン及びＢＵＮデータと比較した場合）。第Ａ２グループと第Ａ４グループのデータの間に有意差は認められなかった。
【００７６】
表２に示されるように、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ（大気又は低酸素ｐＯ２）とＳＦＭのいずれにも結果の向上は認められなかった。血流再開後２４時間、４８時間及び７２時間の時点にて煮沸してないＭＳＣ−ＣＭで動物を治療した場合には、血清クレアチニン及びＢＵＮの上昇が著しく少なかった。それに加えて、煮沸してないＭＳＣ−ＣＭで治療したラットの腎血流量及び腎臓の損傷度指標は、ＳＦＭ又は煮沸したＭＳＣ−ＣＭで治療した動物におけるものに対して著しく優れたものであった。低酸素ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭの腎臓保護作用は、大気ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭで得られたものよりも優れていた。
【００７７】
持続注入プロトコルのために、ラットグループ（ｎ＝４−６／各々）の腹膜に、Ａｌｚｅｔ社製小型浸透圧ポンプを使用して間断なく培地（上記煮沸済又は未煮沸のＭＳＣ−ＣＭ又はＳＦＭ、２４時間／３００ｇ当たり０．２ ｍＬ）を注入した。上記のように３日間の観察期間を通じて結果を評価した。生存状態の記録、腎機能（血清クレアチニン、ＢＵＮ、クリアランス、腎血流量）の測定及び腎臓損傷の組織学的な指標により該結果の評価を行った。ＭＳＣ−ＣＭで治療したＡＲＦを伴うラットにて測定されたすべての変数を、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ及びＳＦＭで治療した同様の虚血性ＡＲＦを伴うラットにて測定された変数と比較した。結果として得られた計測値はすべて、いずれかのタイプの（すなわち、大気及び低酸素ｐＯ２のいずれかによって得られた）ＭＳＣ−ＣＭにおいて有意義な向上を示した。大気下及び低酸素状態で生成されたＭＳＣ−ＣＭのデータを表３に示す。
【表３】
表３におけるデータは平均±ＳＤとして表記。
※： 少なくともｐ＜０．０５ （第Ｂ１グループのデータを第Ｂ２、第Ｂ３、第Ｂ４グループのデータと比較した場合）。第Ｂ２グループと第Ｂ４グループのデータの間に有意差は認められなかった。
【００７８】
表３に示されるように、血流再開後２４時間、４８時間及び７２時間の時点に煮沸しなかったＭＳＣ−ＣＭで動物を治療した場合には、血清クレアチニン及びＢＵＮの上昇が著しく少なかった。それに加えて、その腎血流量及び腎臓の損傷度指標については、ＳＦＭ又は煮沸したＭＳＣ−ＣＭで治療した動物におけるものに対して有意義に優れた結果が得られた。表３に示されるように、腹腔内持続注入については、煮沸済ＭＳＣ−ＣＭ及びＳＦＭのいずれにも結果の向上は認められなかった。ＭＳＣ−ＣＭの単回注入により得られた結果と持続注入により得られた結果との間に有意差は認められなかった。低酸素ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭの腎臓保護作用は、大気ｐＯ２下で得た未煮沸のＭＳＣ−ＣＭで得られたものよりも優れていた。
【００７９】
実施例６：ＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節
【００８０】
実施例１と実施例３の説明に記載した方法でＭＳＣを得てＡＲＦを伴うラットに投与した。実時間ＰＣＲを使用して、ＭＳＣ投与を伴う場合と伴わない場合のラットの腎臓における増殖因子及びサイトカイン発現の調節を評価した。
【００８１】
汚染ＤＮＡを除去するためのＤＮａｓｅ温浸（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）段階を含むＱｉａｇｅｎ社製（カリフォルニア州バレンシア市）のＲＮｅａｓｙキットを使用して実時間ＰＣＲ用のＲＮＡを抽出した。４２℃で６０分間、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（カリフォルニア州カールスバード市内Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して逆転写を行った。
【００８２】
以下のプライマーを使用して、β−アクチン転写物に相対した標的遺伝子コピー数の定量化を伴う実時間ＰＣＲを行った。
【００８３】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製（オレゴン州ユージーン市内）のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（非特異性二本鎖ＤＮＡ挿入蛍光染料）を使用して実時間ＰＣＲ増幅作用を監視するために、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製（カリフォルニア州サニーヴェール市内）のＳｍａｒｔ−Ｃｙｃｌｅｒシステムを使用した。タカラバイオ社製（滋賀県）のＴａＫａＲａ Ｅｘ ＴａｑＴｍ Ｒ−ＰＣＲ Ｖｅｒｓｉｏｎにより総量２５μＬで全反応を行った。反応条件は、熱変性時温態（ｈｏｔ）開始＝１２０秒、９５℃； 融解＝１０秒、９５℃； アニーリング＝１２秒、６３℃； 増幅＝１５秒間、７２℃、であった。蛍光生成物の計測については、非特異性生成物及びプライマ二量体が計測されてしまうことを避けるために特異性生成物の最高融解値より２℃低い値に設定し、各ＳＤＦ−Ｉサイクル後６秒間８５℃で行った。最適なアニーリング温度と融解温度は、サンプルを実行する前にプライマに対して決定される。反応混合物の融解温度解析によって、生成物の典型的な融解温度が単独のシャープなピークである特徴的な融解曲線が見られた。生成物の特異性は融解曲線によって決定され、また、非特異バンドを形成するためにゲルを対照とした。サンプルは重複状態で流し、平均交差点（ＣＰ）値を計算に使用した。該ＣＰは、増幅された遺伝子量が背景蛍光発光異常の閾値に達するサイクルであり、初期のコピー開始量を定量化するために決定されたものである。以下の方式を使用して比較ＣＰ法によりｍＲＮＡ発現の相対定量を計算した。
比率＝（Ｅ標的）ΔＣＰ標的（対照−サンプル）／（Ｅ基準）ΔＣＰ基準（対照−サンプル）
【００８４】
（Ｅは実時間ＰＣＲ能率；ＣＰ、つまり交差点、及びサンプルと対照間の差異）（Ｐｆａｆｆｌら：「相対発現のグループ単位比較と統計分析用の相対発現ソフトウェアツール（ＲＥＳＴ）が実時間ＰＣＲをもたらす」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ３６，２００２）
【００８５】
内在性コントロールβ−アクチン遺伝子を標的遺伝子とした相対定量値は、遺伝子と比較した相対的な発現を示す数値として表記する。汚染ＤＮＡと非特異増幅作用が増幅してしまう可能性を避けるため、次のことに配慮を施した。
（ａ） ＤＮａｓｅの温浸段階をＲＮＡ抽出プロトコルに含む。
（ｂ） 増幅されるべきｃＤＮＡ内部のイントロン配列を含むようにプライマのいくつかを設計した。
（ｃ） 適切な陰性対照（無定型対照）でも反応を行った。
（ｄ） 増幅された生成物の融解曲線（解離グラフ）を分析することによって生成物の均一な増幅を再確認した。
（ｅ） ゲル電気泳動を行って増幅生成物の正確なサイズ及び非特異バンドの不在の両方をめいめい確認した。
【００８６】
ＭＳＣ投与の結果、内部制御として各遺伝子の発現を正規化するためにβ- アクチン発現を使用した実時間ＰＣＲにより、増殖因子遺伝子の発現の変化を示す。実時間ＰＣＲで示された、ＭＳＣ投与後２４時間の時点で炎症反応促進性サイトカインＴＮＦ−αとＩＬ−１β及びＩＦＮ−γをコード化する遺伝子の発現の低下が認められた（図３ａ）。図３ａにさらに示されるように、ＭＳＣにより治療した動物はＩＬ−１０（抗炎症性サイトカイン）の発現の増加を示した。図３ｂに示されるように、ＭＳＣにより治療した動物は、腎臓におけるｂＦＧＦ及びＴＧＦ−αの発現増加を示したが、対照腎臓と比較してＨＧＦ発現の減少を示した。図３ｃは、ＭＳＣにより治療した腎臓が対照腎臓に比較してＢｃｌ−２発現が増加した一方ｉＮＯＳ発現が減少したことを示す。
【００８７】
実施例７：ＭＳＣの遺伝子組み換え
【００８８】
実施例1の項に記載されるような方法で単離したＭＳＣは、患者への投与前に、又はＭＳＣ−ＣＭの生成前に遺伝子組み換えを行いうる。
【００８９】
単離されたＭＳＣは、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ：Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）を含むＲｅｔｒｏＴｅｔ−ＡＲＴシステム（Ｒｏｓｓｉら．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０：３８９−３９３、１９９８）のレトロウイルスのベクターにより形質導入された。Ｐｈｏｅｎｉｘ両種性細胞系統は、ＦＵＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬（インディアナ州インディアナポリス市Ｒｏｃｈｅ社製）により３つのレトロウイルスプラスミドで別々にトランスフェクト（核酸導入）した。トランスフェクトされたレトロウイルスプラスミドは以下の通りである。
１） 発現プラスミドＨＲＳｐ−ＥＰＯ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ．ＨＲＳｐｈＫＧＦのＨＲＳｐｕｒｏＧＵＳプラスミドではＧＵＳがｍＥＰＯに代わった（Ｂｅｒｕ Ｎら、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，５５４： ２９−３５，１９８９）。ｍＣＭＶがｍＥＰＯの発現の駆動源となり、ＳＶ４０プロモータがピューロマイシンの駆動源となっている。ＩＲＥＳは、遺伝子２つの転写を助ける。
２） ＴＣＮ−転写活性化因子プラスミド。ＴＣＮ−トランス活性化因子は、ｔｅｔ−０７を結合し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）存在下で転写を活性化する。
３） ＴＣＮ−転写抑制因子プラスミド。ＴＣＮ−転写抑制因子プラスミドは、ｔｅｔ−０７を結合し、Ｄｏｘ不在下で転写を抑制する。ヒヒの間充織幹細胞における調節不能ＥＰＯ発現については、Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ，Ａらにより実証されている（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １２，１５２７−１５４１，２００１．）。
【００９０】
トランスフェクション（核酸導入）後４８時間経過した時点で０．４５μＭフィルタを使ってろ過することにより、３つのプラスミドでトランスフェクトされたレトロウイルス生成細胞系統からのＭＳＣ形質導入用の上澄みを得た。標的ＭＳＣ細胞は、１×１０５細胞／ｍｌの密度で接種した。形質導入に向けて、８μｇ／ｍｌポリブレンをレトロウイルス培地に加えた。ＭＳＣを培養中で増殖し、形質導入されたＭＳＣの一部分をｍＥＰＯ遺伝子発現の定量化のために使用した。
【００９１】
まず、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲキット（テキサス州オースティン市内Ａｍｂｉｏｎ社製）を使用して、形質導入されたＭＳＣから全ＲＮＡを抽出し、１００ナノグラムの全ＲＮＡを一段階式ＲＴ−ＰＣＲ（カリフォルニア州カールスバード市内Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に使用した。
【００９２】
次に、実時間ＰＣＲを行った。オリゴｄＴをもつＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製逆転写酵素）を使って、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを１００ナノグラムの全ＲＮＡに合成した。ｍＥＰＯ遺伝子発現を定量化するために、実時間ＰＣＲの標準プロトコルをＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（カリフォルニア州サニーヴェール市内Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）に使用した。
【００９３】
Ｄｏｘを使用せずに治療したＭＳＣ ｍＥＰＯ形質導入サンプルとＤｏｘにより治療したＭＳＣ ｍＥＰＯ形質導入サンプルとの間の相違に関する定量化は、ｍＥＰＯ ｃＤＮＡのコード配列の領域に隣接するｍＥＰＯプライマを使用して一段階式ＲＴ−ＰＣＲと実時間ＰＣＲにより実施した。
【００９４】
ｍＥＰＯフォワード： ５’−ＧＧＣ ＣＡＴ ＡＧＡ ＡＧＴ ＴＴＧ ＧＣＡ ＡＧ −３’ （配列ＩＤ ＮＯ：３５）
【００９５】
ｍＥＰＯリバース： ５’−ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＡＣ ＡＴ −３’（配列ＩＤ ＮＯ：３６）
【００９６】
図４に示されるように、形質導入され他ＭＳＣ ｍＥＰＯ細胞のｍＥＰＯ遺伝子発現はＤｏｘ治療により調節可能である。
【００９７】
一段階式ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＥＰＯプライマにより期待通り２００ｂｐのＰＣＲ生成物を得ることができた。これは配列決定法により確認した。１μｇ／ｍｌでのＤｏｘ治療では、２４時間の時点でＥＰＯ遺伝子発現がピークに達した。実時間ＰＣＲでの結果によると、Ｄｏｘにより治療したサンプルにおけるＥＰＯ発現が〜４倍増加したことが示されている。
【００９８】
実施例８： ＭＳＣ−ＣMによる増殖因子遺伝子発現の調節
【００９９】
実施例５の項にて上述されるＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節の場合と同様に、増殖因子遺伝子発現の調節を検討する際にはＭＳＣ−ＣＭを使用することになる。実施例2及び実施例４の項に記載されている方法でＭＳＣ−ＣＭを生成・投与する。ラットの腎臓中の増殖因子及びサイトカインの発現レベルの調節に関して（ＭＳＣ投与に関する記述において説明されている方法で）ＭＳＣ−ＣＭを投与した場合と投与しない場合とを評価するために実時間ＰＣＲを使用する。同じプライマ及び状態を実施例５の項に記載されている方法で使用する。増殖因子遺伝子発現の調節におけるＭＳＣ−ＣＭ投与の結果を、実施例５の項に記載されている方法で評価する。また、ＭＳＣ−ＣＭによる増殖因子遺伝子発現の調節に使用するために、例えば実施例６の項に記載されている方法で遺伝子を組み換えたＭＳＣからＭＳＣ−ＣＭを生成する。
【０１００】
実施例９： ＭＳＣ、ＥＣ、又はＭＳＣ−ＣＭ、及びそれらの組成物
【０１０１】
静脈内注入（頚静脈、大腿部または尾静脈内注入）により、又は動脈内注入により（頚動脈又は大腿動脈経由で副腎大動脈に注入することによって）、あるいはＭＳＣを単独で、又はＥＣを単独で（調製法については後述）、又はＭＳＣ−ＣＭを単独で、あるいはMSCをＥＣ又はＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて、もしくはＥＣをＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて、腹腔内に注入することによって、様々な治療プロトコルの相対的な腎臓保護効力と臓器保護効力をテストする。同時投与及び連続投与ならびに投与の時期（前記症状の発症後と、何らか危険度の高い状況が発生する前の両方）に関して投与をテストする。
【０１０２】
実験型中の腎機能、組織学的研究及びその結果を上述のように監視する。
【０１０３】
実施例１０：多臓器不全に対するＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与
【０１０４】
多臓器不全に起因する多くの悪影響に対抗できるように身体能力を促進することと、複数臓器の修復及びそれらの機能回復を目的として、ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの投与に関する調査を行う。この調査に使用される多臓器不全モデルは、老齢ラットの敗血症モデルである。該老齢ラットの敗血症モデルにはグラム陰性菌（ＬＰＳ）からの内毒素が注入され、且つ盲腸せん孔が認められ、結果として細菌性腹膜炎や臨床的多臓器不全のあらゆる症状（ＡＲＦを含む）が発現している。ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭ投与の後の臓器機能における向上を検討する。ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭ投与により好結果をもたらすことに成功した場合、実験対象の多臓器不全に一般に認められる１００％という死亡率を低下させ、且つ該当する場合は、創傷の修復を著しく高めるという効果が期待できる。ＭＳＣ及びＭＳＣ−ＣＭの治療有効投与量を、それぞれ別々に、又は両者を組み合わせて、あるいは連続投与にて投与する。また、下記される方法で調整したＥＣは、多臓器不全において、ＭＳＣ又はＭＳＣ−ＣＭと併用して、もしくは単独で投与しうる。
【０１０５】
実施例１１：インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化によるＭＳＣからのＥＣ調製
【０１０６】
患者に対する治療有効量投与のためのＥＣは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における分化によってＭＳＣから生成される。当業者に公知の技術を用いＭａｒｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にＭＳＣを接種する。（Ｍａｔｒｉｇｅｌは、ニュージャージー州フランクリンレイクス市内にあるＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されている。）１〜３日間、血清又は増殖因子のない培地においてＭａｒｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上でＭＳＣを培養する。あるいは、ヒトＶＥＧＦをもつヒト・フィブロネクチンの上で、７日間又は所定の密集度が達成されるまでＭＳＣを増殖する。当プロトコルに従って、ＭＳＣをＥＣ表現型に分化する。ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、フォンビルブラント因子、ｅＮＯＳ、及びＶＥＧＦレセプタ２の発現、ｄｉｌ−ａｃ−ＬＤＬ取込み、並びにその他当業者に公知の適切なマーカーを示すことによって、前記いずれかの方法によって生成された細胞のＥＣ表現型を確認する。その後、ＥＣを患者に投与するか、又はＭＳＣに関連して上述されるように将来的に投与するために凍結保存する。いくつかの実施形態では、実施例７の項に記載されているようにＥＣの遺伝子を組み換える。ＥＣは、単独で、又はＭＳＣやＭＳＣ−ＣＭと組み合わせて投与する。ＥＣの治療効能は、ＭＳＣに関連して上述される方法により監視且つ評価を行う。
【０１０７】
実施例１２：ＥＣによる増殖因子遺伝子発現の調節
【０１０８】
上記実施例５の項に記載されるＭＳＣによる増殖因子遺伝子発現の調節の場合と同様に、ＭＳＣ−ＣＭを使用して増殖因子遺伝子発現の調節を検討する。上記実施例１１の項に記載される方法で、ＥＣを生成して投与する。ＭＳＣ投与に関連して上述されるように、実時間ＰＣＲを使って、ＥＣを投与したラットの腎臓とＥＣを投与していないラットの腎臓における増殖因子及びサイトカインの発現レベルの調節作用を評価する。実施例５の項に記載されるものと同じプライマ及び条件を使用する。増殖因子遺伝子発現の調節に対するEC投与の結果を、実施例５の項で説明されている方法で評価する。
【０１０９】
本明細書においては、本発明の好ましい実施形態に関してのみ記載されているが、当業者であれば、特許請求の範囲により定義される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、特に本稿にて記載されていない追加・変形・代用及び削除などを行いうることと、文言上又は均等論により特許請求の範囲の意味するところである実施形態のすべてがそこに包含されるべきものであることが容易に理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】血流再開直後のＭＳＣ注入用血清クレアチニン・レベルのグラフを示す図である。同一の中等度急性腎不全を伴い賦形剤で治療を受けた対照動物と比較した場合、血流再開直後のＭＳＣの投与が腎機能における有意な向上を示している。
【図１ｂ】血流再開後２４時間のＭＳＣ注入に続く血清クレアチニン・レベルのグラフを示す図である。同一の中等度急性腎不全を伴い賦形剤で治療を受けた対照動物と比較した場合、血流再開後２４時間のＭＳＣの投与が腎機能における有意な向上を示している。
【図２ａ】血流再開（ｒｅｆｌｏｗ）直後の細胞注入に関する血清クレアチニン・レベルを示すグラフであり、ＭＳＣ投与により重症のＡＲＦを伴ったラットの腎機能向上（賦形剤又は繊維芽細胞を注入した対照動物では得られなかった有益な効果）を示す図である。
【図２ｂ】ＭＳＣ投与に伴う損傷度指標の向上を示す損傷度指標のグラフを示す図である。
【図２ｃ】ＭＳＣ投与により増殖する細胞数の増加を示すＰＣＮＡ染色のグラフを示す図である。
【図２ｄ】ＭＳＣ投与によるアポトーシス細胞数の減少を示すアポトーシス指標のグラフを示す図である。
【図３ａ】腎臓全体におけるサイトカイン発現を示す図である。
【図３ｂ】腎臓全体における増殖因子発現を示す図である。
【図３ｃ】腎臓全体におけるアポトーシスとＮＯＳ遺伝子の発現を示す図である。
【図４】ＭＳＣにおけるＤｏｘ調節可能Ｅｐｏ発現を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臓器機能不全、急性腎不全、多臓器不全、早期移植腎機能不全、移植片拒絶反応、慢性腎不全、創傷及び炎症性疾患を治療する方法であり、培養中の間充織幹細胞（ＭＳＣ）にさらすことによって馴化した、薬剤として許容される培地の治療量を、それを必要とする患者に導入することを含む方法。
【請求項２】
酸素圧力が５％以下である培養条件下で増殖したＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大気酸素条件下の培養中で増殖したＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養中で該ＭＳＣに２４時間より長時間さらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高サブコンフルエントのＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該培地を全身投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該培地を動脈内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該培地を静脈内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該培地を腹腔内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子組換えＭＳＣによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該培地を約２４時間の持続注入によって投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該培地を０．０７ｍｌ／１００ｇの投与量で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療量のＭＳＣを該患者に導入することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）におけるＭＳＣの分化によって生成された内皮細胞（ＥＣ）の治療量を該患者に導入することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
培養中のＭＳＣにさらすことによって馴化された、薬剤として許容される培地を含む組成物。
【請求項１６】
該培地が無血清であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
酸素圧力が５％以下である培養中でＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
大気酸素条件下にて培養中のＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
高サブコンフルエントのＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
該ＭＳＣの遺伝子が組み換えられていることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
該培地が、培養中のＭＳＣにさらすことによって得られた該培地と比較して濃縮した培地であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
該ＭＳＣがヒト細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
該培地を２４時間以上該ＭＳＣにさらすことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
患者の損傷臓器における少なくとも一つの増殖因子の発現を調節する方法であり、該増殖因子の発現を調節するためにＭＳＣ又はＥＣ又はＭＳＣ馴化培地の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２５】
該患者の腎臓の細胞内における該発現を調節することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ及びそれの組み合わせから該増殖因子が選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
患者の損傷臓器における少なくとも一つのサイトカインの発現を調節する方法であり、該サイトカインの発現を調節するためにＭＳＣ又はＥＣ又はＭＳＣ馴化培地の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
該炎症性サイトカインが炎症反応促進性サイトカインであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該炎症反応促進性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リポ多糖結合蛋白質、ＭＣＰ−１、ＣＤ−１４、ＩＦＮ−γ、ケモカイン、及びそれらの混合物からなるグループより選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該炎症性サイトカインが反炎症性サイトカインであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
該抗炎症性サイトカインがＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＬ−ＩＲＡ、ＩＬ−４、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、及びそれらの混合物からなるグループより選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項１】
臓器機能不全、急性腎不全、多臓器不全、早期移植腎機能不全、移植片拒絶反応、慢性腎不全、創傷及び炎症性疾患を治療する方法であり、培養中の間充織幹細胞（ＭＳＣ）にさらすことによって馴化した、薬剤として許容される培地の治療量を、それを必要とする患者に導入することを含む方法。
【請求項２】
酸素圧力が５％以下である培養条件下で増殖したＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大気酸素条件下の培養中で増殖したＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養中で該ＭＳＣに２４時間より長時間さらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高サブコンフルエントのＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該培地を全身投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該培地を動脈内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該培地を静脈内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該培地を腹腔内投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子組換えＭＳＣによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該培地を約２４時間の持続注入によって投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該培地を０．０７ｍｌ／１００ｇの投与量で投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療量のＭＳＣを該患者に導入することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）におけるＭＳＣの分化によって生成された内皮細胞（ＥＣ）の治療量を該患者に導入することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
培養中のＭＳＣにさらすことによって馴化された、薬剤として許容される培地を含む組成物。
【請求項１６】
該培地が無血清であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
酸素圧力が５％以下である培養中でＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
大気酸素条件下にて培養中のＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
高サブコンフルエントのＭＳＣにさらすことによって該培地を馴化することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
該ＭＳＣの遺伝子が組み換えられていることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
該培地が、培養中のＭＳＣにさらすことによって得られた該培地と比較して濃縮した培地であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
該ＭＳＣがヒト細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
該培地を２４時間以上該ＭＳＣにさらすことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
患者の損傷臓器における少なくとも一つの増殖因子の発現を調節する方法であり、該増殖因子の発現を調節するためにＭＳＣ又はＥＣ又はＭＳＣ馴化培地の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２５】
該患者の腎臓の細胞内における該発現を調節することを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦ及びそれの組み合わせから該増殖因子が選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
患者の損傷臓器における少なくとも一つのサイトカインの発現を調節する方法であり、該サイトカインの発現を調節するためにＭＳＣ又はＥＣ又はＭＳＣ馴化培地の有効量を患者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
該炎症性サイトカインが炎症反応促進性サイトカインであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該炎症反応促進性サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リポ多糖結合蛋白質、ＭＣＰ−１、ＣＤ−１４、ＩＦＮ−γ、ケモカイン、及びそれらの混合物からなるグループより選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該炎症性サイトカインが反炎症性サイトカインであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
該抗炎症性サイトカインがＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＬ−ＩＲＡ、ＩＬ−４、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、及びそれらの混合物からなるグループより選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５４４９５７（Ｐ２００８−５４４９５７Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１１０９２（Ｐ２００８−５１１０９２）
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１６４８９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２１４４５
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（５０７３７３７８２）
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＶＥＴＥＲＡＮ’Ｓ ＡＦＦＡＩＲＳ
【出願人】（５０５１９１９０６）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファンデーション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１０日（２００５．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１６４８９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２１４４５
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（５０７３７３７８２）
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ ＯＦ ＶＥＴＥＲＡＮ’Ｓ ＡＦＦＡＩＲＳ
【出願人】（５０５１９１９０６）ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファンデーション (5)
【Ｆターム（参考）】
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