関節炎及びその他の炎症性疾患の薬物標的としてのプロテインキナーゼＣゼータ
本発明は、ζＰＫＣ発現が、正常人と比較した場合、関節炎患者の組織において増加するという発見に基づく。したがって、本発明は、関節炎疾患におけるζＰＫＣ遺伝子発現の増加に基づく患者における関節炎を診断し、予測し、及びその経過を監視する方法を提供する。本発明はさらに、関節炎の治療において治療薬として使用するためのζＰＫＣの発現を阻害する化合物を提供し、限定されないが、阻害性ポリヌクレオチド及びポリペプチド、小分子、及びペプチド阻害剤を含む。加えて、本発明は、医薬製剤及びそのような治療薬を投与する経路、並びにそれらの効率を評価する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、２００３年５月８日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／４６８，９８７号、及び２００３年７月３１日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／４９１，２７４号の利益を主張し、両者はそのまま参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
［０００２］本発明は、関節炎組織で増加したプロテインキナーゼＣゼータ（ζＰＫＣ）遺伝子発現に基づいて、患者における関節炎を診断し、予測し、及びその経過を監視する方法に指向する。本発明はさらに、関節炎の治療における治療薬として使用するための、ζＰＫＣの発現を阻害する化合物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
関連する背景技術
［０００３］プロテインキナーゼＣゼータ（ζＰＫＣ）は、重要なシグナル伝達成分として発生している。ζＰＫＣは、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１経路に関連することを示唆する文献が増加している。例えば、ζＰＫＣのノックアウトマウスは完全に生存するが、ＮＦ−κＢ依存の転写活性の深刻な損傷とともに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体及びリンフォトキシン受容体ノックアウトを想起する表現型を提示する（Ｌｅｉｔｇｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８：７７１−８０）。他の研究者（Ｌａｌｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２１８０−８８）は、ＩκＢを活性化し、それによりＮＦ−κＢを活性化することにおけるζＰＫＣについての役割を示している。
【０００４】
［０００４］ＮＦ−κＢ活性は、無数の炎症性障害に関与し、喘息、炎症性腸疾患、及び関節炎を含む（Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：３１６−２１に示される）。ＮＦ−κＢは、多種の細胞系由来の様々なマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌に本質的な役割を果たすことが示されている（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３５：２９−３４； Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：５６１−６７； Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５０：５５６−６５）。関節炎において、ＴＮＦやインターロイキン−１（ＩＬ−１）のようなサイトカインは、ＭＭＰ、及び自然に制御することができるレベルを超えて、疾患に帰着する他の分解酵素の産生と合成を増加する（Ｓｍｉｔｈ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：Ｄ７０４； Ｍｏｒｔ ａｎｄ Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．３：３３７−４１； Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ａｎｄ Ｃａｗｓｔｏｎ（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：１２−２４に示される）。
【０００５】
［０００５］今日まで、ζＰＫＣと関節炎とを結びつける直接的な証拠はない。しかしながら、ζＰＫＣが影響される組織において発現するとすれば、ＴＮＦ及びＩＬ−１の因子の細胞外受容体の結合がＮＦ−κＢによる分解酵素の合成を細胞内で誘導するよう伝達することによって、ＴＮＦ及びＩＬ−１の分解活動を説明する手助けとなろう。これに関連して、ζＰＫＣの阻害剤は、ＴＮＦ及びＩＬ−１活動を遮断し、関節炎及び他の炎症性疾患の治療として使える。このようなζＰＫＣ阻害剤は、伝統的なサイトカインやＭＭＰ阻害剤よりも効果的であるべきである。これは、丁度１つの標的よりも最終的に効果があべきである（Ｒｏｓｈａｋ，上述； Ｓｍｉｔｈ，上述）。そのようなζＰＫＣ阻害剤はまた、ＮＦ−κＢ阻害剤よりも安全であるべきであり、これは、ζＰＫＣがＮＦ−κＢ経路における多くのエフェクターのうち唯一のものだからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
［０００６］本発明は、ζＰＫＣ発現が正常人と比較して、関節炎の患者の組織において増加しているという発見に基づく。本発明は、限定されるわけではないが、阻害性ポリヌクレオチド及びポリペプチド、小分子、そしてペプチド阻害剤を含む、関節炎組織におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を提供する。本発明はさらに、関節炎組織における異常なζＰＫＣ遺伝子発現に基づく関節炎を診断し、予測し、その経過を監視する方法、並びにそのような異常発現の治療薬としての使用のための療法を提供する。加えて、本発明は、そのような治療薬のための医薬製剤及び投与経路を提供し、並びにそのような治療薬の能力を評価するための方法を提供する。
【０００７】
［０００７］一態様において、本発明は、患者における関節炎の診断において使用する方法を提供し、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出する工程；そして、試験量と、対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する工程を含み、それにより、試験量が正常量よりも大きいという所見が関節炎の診断に陽性の指示を提供する。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【０００８】
［０００８］別の態様において、本発明は、患者における関節炎の予測において使用する方法を提供し、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出する工程；そして、試験量と、対照試料におけるζＰＫＣ遺伝子産物の予測量とを比較する工程を含み、それにより、試験量と予測量との比較が関節炎の予測の指示を提供する。好ましい態様では、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様では、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【０００９】
［０００９］別の態様では、本発明は、患者における関節炎の経過を監視するのに使用する方法を提供し、一回目に患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出する工程；二回目以降に、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出する工程；そして、第一試験量と第二試験量とを比較する工程を含み、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の増加は、関節炎の進行を示し、そして、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が関節炎の鎮静を示す。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【００１０】
［００１０］別の態様において、本発明は、患者における関節炎の治療効果を評価する方法を提供し、治療前の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出する工程；治療後の患者の試料におけるζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出する工程；そして、第一試験量と第二試験量とを比較する工程を含み、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少は、関節炎の治療が効果的であることを示す。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【００１１】
［００１１］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法を提供し、ζＰＫＣの等量を含有する第一試料と第二試料を提供する工程；第一試料を化合物と接触する工程；そして、第一試料におけるζＰＫＣの活性が、化合物と接触していない第二試料におけるζＰＫＣの活性と関連して減少しているかどうかを決定する工程を含み、それにより、第二試料と比較した場合、第一試料におけるζＰＫＣの活性の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す。好ましい態様において、化合物は、軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。他の好ましい態様において、ζＰＫＣの活性は、酵素プロテインキナーゼアッセイ、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、又はＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用により決定する。
【００１２】
［００１２］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法を提供し、ζＰＫＣを発現する細胞を等量含有する第一試料及び第二試料を提供する工程；第一試料を化合物と接触する工程；そして、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現が、化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現と関連して減少しているかどうかを決定する工程を含み、それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す。好ましい態様において、化合物は、軟骨細胞におけるζＰＫＣ遺伝子産物の発現を阻害する。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物の発現は、酵素プロテインキナーゼアッセイ、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、又はＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される。
【００１３】
［００１３］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を治療する方法を提供し、患者におけるζＰＫＣの活性を阻害する化合物を患者に投与することを含む。好ましい態様において、化合物は軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する。別の好ましい態様において、化合物はアンチセンス・ポリヌクレオチドである。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。別の好ましい態様において、化合物はｓｉＲＮＡ分子である。さらに好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【００１４】
［００１４］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を治療する方法を提供し、患者におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を患者に投与することを含む。好ましい態様において、化合物は軟骨細胞におけるζＰＫＣの発現を阻害する。別の好ましい態様において、化合物はアンチセンス・ポリヌクレオチドである。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。別の好ましい態様において、化合物はｓｉＲＮＡ分子である。さらに好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【００１５】
［００１５］別の態様において、本発明は、ζＰＫＣの発現又は活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子を提供する。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
［００２４］本出願人は、正常人と比較した場合、関節炎の患者の組織においてζＰＫＣの発現が上方制御されることを発見している。この酵素が関節炎の組織において上方制御されるという発見は、ζＰＫＣ発現における増加を検出することによって関節炎を診断するための方法、及びζＰＫＣ発現を下方制御することによって関節炎を治療するための方法を可能にする。加えて、この発見は、関節炎の治療に有用な新規なζＰＫＣ阻害剤の同定を可能にする。
【００１７】
関節炎の進行を診断し、予想し、及び監視する方法
導入
［００２５］本発明は、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって関節炎を診断する方法を提供する。「診断」又は「診断すること」は、病理学的な状態の存否を同定することを意味する。診断方法は、患者（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）由来の生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はポリペプチド、その断片を含む）の試験量を決定し、そして、ζＰＫＣ遺伝子産物について正常量又は範囲（即ち、関節炎を患っているとは知らない個人由来の量又は範囲）とその試験量とを比較することによってζＰＫＣの上方制御を検出することを含む。特別な診断方法が関節炎の決定的な診断を提供しないかもしれないが、その方法が診断において手助けとなる陽性の指示を提供するとすれば、それは十分である。
【００１８】
［００２６］本発明はまた、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって関節炎を予想する方法を提供する。「予想」又は「予想すること」は、病理学的な状態の発症及び／又は苦しみを予測することを意味する。予想方法は、患者由来の生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を測定し、そして、ζＰＫＣ遺伝子産物について、試験量と、予想量又は範囲（即ち、関節炎の痛みが変化する個人由来の量と範囲）とを比較することを含む。試験試料中の様々な量のζＰＫＣ遺伝子産物は、関節炎におけるある種の予想と一致する。特定の予想レベルでのζＰＫＣ遺伝子産物の量の検出は、患者についての予想を提供する。
【００１９】
［００２７］本発明はまた、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって、関節炎の経過を監視する方法を提供する。監視方法は、一回目及び二回目の患者から採取した生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し、そして、その量を比較することを含む。一回目と二回目との間のζＰＫＣ遺伝子産物量の変化は、関節炎の経過における変化を示し、量の減少は関節炎の鎮静を示し、そして、量の増加は関節炎の進行を示す。このような監視アッセイはまた、関節炎を治療した患者における特定の治療介入（例えば、疾患の減退対ぶり返し）の効果を評価するために有用である。
【００２０】
生物学的試料の収集
［００２８］ζＰＫＣの発現の増加は、細胞（例えば、細胞全体、細胞分画、及び細胞抽出物）及び組織を含む様々な生物学的試料において検出することができる。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取した生検や凍結切片のような組織切片を含む。好ましい生物学的試料は、関節の軟骨（即ち、軟骨細胞）、滑膜、及び滑液を含む。
【００２１】
正常値、診断値、及び予想値
［００２９］本発明の診断及び予想アッセイにおいて、ζＰＫＣ遺伝子産物を検出及び定量し、試験量を生じる。次いで、試験量は、正常な量又は範囲と比較する。正常な量又は範囲（例えば、３０％又はそれより大きな増加（ｐ＜０．０１である）、又は１００％又はそれより大きな増加（ｐ＜０．０５である））は、関節炎の診断において陽性の兆候である。ζＰＫＣ遺伝子産物の検出及び定量の具体的な方法は、下記に記載される。
【００２２】
［００３０］ζＰＫＣ遺伝子産物の正常な量又は基底レベルは、いずれかの具体的な試料タイプ及び母集団に対して決定することができる。一般的に、ζＰＫＣタンパク質又はｍＲＮＡの基底（正常）レベルは、正常な（即ち、健常な）患者由来の生物学的試料タイプにおけるζＰＫＣタンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することによって決定される。又は、ζＰＫＣ遺伝子産物の正常値は、病的な（又は病的可能性の）試験細胞又は組織を採取した同じ患者から採取した健常な細胞又は組織における量を測定することによって決定することができる。ζＰＫＣ遺伝子産物の量（正常な量又は試験量のいずれか）は、細胞当たり、全タンパク質当たり、又は体積基準当たり、決定することができ、又は発現することができる。試料の細胞量を決定するために、ある者は、構成的に発現した遺伝子産物、又は生物学的試料を採取したタイプの細胞において既知のレベルで発現した他の遺伝子産物を測定することができる。
【００２３】
［００３１］本発明のアッセイ方法がζＰＫＣ遺伝子産物の絶対値の測定を必ずしも要求しないことは賞賛されるであろう。これは、相対値がこれらの方法の多くの適用に十分であるためである。同様に、ζＰＫＣ遺伝子産物の定量又は多量に加えて、変異若しくは異常なζＰＫＣ遺伝子産物又はそれらの発現パターン（例えば、突然変異した転写物、切除されたポリペプチド）は、正常な遺伝子産物及び発現パターンの比較によって同定することができることも賞賛されるであろう。
【００２４】
ζＰＫＣ遺伝子産物のアッセイ
［００３２］本発明の診断アッセイ、予想アッセイ、及び監視アッセイは、生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物を検出し、定量することを含む。ζＰＫＣ遺伝子産物は、例えば、ζＰＫＣ ｍＲＮＡ及びζＰＫＣポリペプチドを含み、両者は、当業者に周知の方法を用いて測定することができる。
【００２５】
［００３３］例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション、インサイチュ・ハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ドット及びスロットブロット、及びオリゴヌクレオチドアレイを用いて、ζＰＫＣ ｍＲＮＡを検出し、定量することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、プローブ核酸が標的の核酸にハイブリダイズするアッセイを意味する。いくつかのフォーマットにおいて、標的、プローブ、及びその両者は、固相化される。固相化した核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は別のオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドであってもよく、そして、天然に又は天然ではなく発生するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又は骨格を含んでもよい。本発明における使用のための核酸プローブ配列を選択する方法は、ζＰＫＣの核酸配列に基づき、当該技術分野において周知である。
【００２６】
［００３４］又は、ζＰＫＣ ｍＲＮＡは、検出及び定量の前に増幅することができる。そのような増幅に基づくアッセイは、当該技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ−酵素連結免疫溶媒アッセイ（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む。増幅したζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を産生し、検出するプライマー及びプローブは、ζＰＫＣの核酸配列に基づいて容易に設計することができ、当業者にとって過度の実験なしに生産することができる。増幅したζＰＫＣ遺伝子産物は、例えば、ゲル電気泳動；プローブ核酸に対するハイブリダイゼーション；シークエンシング；蛍光、燐光、若しくは放射活性シグナルの検出；いずれかの各種周知な方法によって、直接的に解析することができる。加えて、標的核酸配列の増幅によって製造されるシグナルの増加のための方法は、当業者に知られている。当業者は、どの増幅方法を使用したとしても、ζＰＫＣ遺伝子産物の定量が望まれるならば、当該技術分野において知られている各種の定量方法（例えば、定量的ＰＣＲ）が使用され得ることを認識するであろう。
【００２７】
［００３５］ζＰＫＣポリペプチド（又はその断片）は、多様な周知の酵素的及び免疫学的アッセイを用いて検出し、定量することができる。酵素的アッセイは、プロテインキナーゼアッセイを検出するためにζＰＫＣ基質を利用するアッセイを意味する。ζＰＫＣ活性を検出し、定量するために有用な各種の天然及び人工の基質は既知であり、ミリストイル・アラニンリッチのＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）ペプチド（Ｈｅｒｇｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：４４８−５７）、ｐ４７ｐｈｏｘ（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１２０６−１３），ミエリン塩基性タンパク質（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３０３７５−８１）、硫酸プロタミン（ＭｃＧｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：２３９−５０）、ヌクレオリン（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１１３０−３７）；異種リボヌクレオタンパク質ＡＩ（ｈｎＲＮＰＡ１）（Ｍｕｎｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５８８４−９１）、ζＰＫＣ誘導ペプチド（Ｋｏｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：５９７−６０６、及びζＰＫＣ誘導ペプチド（Ｓｔａｎｄａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４０７４−７８）を含む。ζＰＫＣ活性を検出し、定量するのに適した無数の酵素的アッセイプロトコール（放射活性及び非放射活性）は、文献に記載され、及び／又は、例えば、ＰａｎＶｅｒａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｒａｎｓｂｉｏ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、及びＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂｅｎｉｃｉａ、ＣＡ）からキットの形体で商業的に利用可能である。
【００２８】
［００３６］免疫学的アッセイは、ζＰＫＣポリペプチド（又はその断片）に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ｓｃＦｖ、及びその断片）を利用するアッセイを意味する。本発明の実施に適したいくつかの十分に確立した免疫学的アッセイは既知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、及びウェスタンブロットを含む。
【００２９】
［００３７］本発明の免疫学的アッセイに使用されるべき抗ζＰＫＣ抗体（好ましくは、抗哺乳動物ζＰＫＣ；より好ましくは抗ヒトζＰＫＣ）は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）より商業的に利用可能である。又は、抗ζＰＫＣ抗体は、当業者に周知の方法によって製造することができる。例えば、ζＰＫＣ（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０５５１３；配列番号：２））に対するモノクローナル抗体は、既知の方法に従ってハイブリドーマの発生によって製造することができる。この手法で形成したハイブリドーマは、次いで、例えば、ＥＬＩＳＡのような標準的な方法を用いてスクリーニングし、ζＰＫＣに特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。全長のζＰＫＣは、免疫抗原として使用してもよく、又はその代わりにζＰＫＣの抗原性ペプチド断片を使用してもよい。
【００３０】
［００３８］モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する別の方法として、ζＰＫＣに対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定及び単離することができ、それにより、ζＰＫＣに結合する免疫グロブリンライブらーのメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを発生させスクリーニングするためのキットは、例えば、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＭａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から商業的に利用可能である。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを発生しスクリーニングするのに使用するために具体的に処理できる方法や試薬の例は、文献に見出すことができる。
【００３１】
［００３９］ポリクローナル血清や抗体は、適切な対象、例えば、ウサギをζＰＫＣ（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト）又はその抗原断片で免疫することによって生産することができる。免疫した対象における抗体の力価は、固定化したマーカータンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡのような標準的な手法によって経時的に監視することができる。所望によって、ζＰＫＣに指向する抗体分子は、対象又は培養液から単離することができ、さらに、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知の手法によって精製し、ＩｇＧ分画を得ることができる。
【００３２】
［００４０］ζＰＫＣに対する抗体の断片は、当該技術分野において周知な方法に従って抗体を切断することによって製造することができる。例えば、免疫学的に活性なＦ（ａｂ）’及びＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシンのような酵素を用いて酵素を処理することによって生じさせることができる。加えて、ζＰＫＣに対するキメラの、ヒト化し、及び一本鎖の抗体は、ヒト及びヒト以外の部分の両方を含み、標準的な組換えＤＮＡ手法を用いて製造することができる。ζＰＫＣに対するヒト化した抗体は、内因性の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができないが、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて製造することもできる。
【００３３】
［００４１］本発明の免疫学的アッセイにおいて、ζＰＫＣポリペプチドは、検出可能な標識を用いて、典型的には、直接的に（即ち、抗ζＰＫＣ抗体が標識される）又は間接的に（即ち、抗ζＰＫＣ抗体を認識する二次抗体が標識される）検出される。アッセイに使用される具体的な標識又は検出可能なグループは、アッセイに使用される抗体の特異的結合で顕著に干渉しない限りにおいて、大抵は重要ではない。
【００３４】
［００４２］本発明の免疫学的アッセイは、競合的であってもく、又は非競合的であってもよい。競合的アッセイにおいて、試料中のζＰＫＣの量は、試料中のζＰＫＣによって捕捉試薬（即ち、抗ζＰＫＣ抗体）から置き換わった添加の（外因の）ζＰＫＣの量を測定することによって間接的に測定される。非競合的アッセイにおいては、試料中のζＰＫＣの量は、直接的に測定される。好ましい非競合的「サンドイッチ」アッセイでは、捕捉試薬（例えば、一次の抗ζＰＫＣ抗体）が固定されている固体支持体（例えば、膜、マイクロタイタープレート、試験管、計量棒、ガラス又はプラスチックビーズ）に直接的に結合する。次いで、固定化した試薬は、試料中に存在するいずれのζＰＫＣポリペプチドを捕捉する。固定化したζＰＫＣは、次いで、標識した二次の抗ζＰＫＣ抗体を用いて検出することができる。又は、二次の抗ζＰＫＣ抗体は、二次の抗ζＰＫＣ抗体を認識する標識した二次抗体を用いて検出することができる。
【００３５】
ζＰＫＣ発現及び／又は活性を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法
導入
［００４３］本発明は、関節炎組織のＰＫＣの発現を阻害する新規な化合物（例えば、小分子）を同定するための方法（また、本明細書では「スクリーニングアッセイ」として言及される）を提供する。一態様では、ζＰＫＣ（天然又は組換え的のいずれか）発現する細胞を試験化合物と接触させ、その化合物がζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチド）の発現を阻害するかどうかを決定し、発現（未処理の細胞の試料と比較した場合）の減少は、化合物が関節炎組織中のζＰＫＣを阻害することを示す。ζＰＫＣ遺伝子産物の変化は、当該技術分野において既知のいずれかの方法によって、又は上述した方法によって決定することができる。好ましい態様では、ＮＦ−κＢ結合部位の下流にマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を含むレポーター構築物でトランスフェクトした細胞を試験化合物と接触させ、細胞をサイトカインで処理した場合、化合物がマーカータンパク質の発現を阻害することができるかどうかを決定する。ζＰＫＣ又はマーカータンパク質の発現を阻害すると同定された化合物は、関節炎の予防及び治療処置の薬物としての候補となる。
【００３６】
［００４４］又は、前述したアッセイを用いてインビトロでζＰＫＣのキナーゼ活性を阻害する化合物を同定することができる。精製した（又は部分精製した）ζＰＫＣを試験化合物と接触させ、化合物が（酵素の未処理の試料と比較した場合）ζＰＫＣのキナーゼ活性を阻害するかどうかを決定する。次いで、ζＰＫＣ活性を阻害する同定した化合物は、関節炎のインビトロ及びインビボモデルで試験することができた。いくつかのインビトロモデルは、下記の実施例に記載される。関節炎のインビボモデルは、限定されないが、イヌ及びウサギでの前方十字靭帯切除モデル、並びにウサギ及びマウスでの部分的半月板切除モデルを含む。ζＰＫＣの活性を直接的及び間接的に測定するための代表的な方法、及びζＰＫＣの活性の阻害を決定するための代表的な方法は、限定されないが、酵素プロテインキナーゼ活性アッセイ（上述される）、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、及びＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイを含む。
【００３７】
ζＰＫＣの供給源
［００４５］本発明のスクリーニングアッセイに使用されるべきζＰＫＣ（好ましくは、哺乳動物；より好ましくはヒト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０５５１３；配列番号：２））は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）、ＰｒｏＱｉｎａｓｅ（Ｆｒｅｉｂｒｕｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＰａｎＶｅｒａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から商業的に利用可能である。又は、ζＰＫＣは、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製手法を用いて、脳、胎盤、精巣及び肺を含む多種の組織（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト）から精製し又は部分的に精製することができる。精製はまた、ζＰＫＣに結合する既知の試薬（例えば、抗ζＰＫＣ抗体）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む。これらの精製手法はまた、組換えの供給源からζＰＫＣを精製するために使用することもできる。
【００３８】
［００４６］ζＰＫＣをコードするポリヌクレオチド（又はその酵素的部分）は、ζＰＫＣの組換え産物に対する適切な発現制御配列に操作的に連結してもよい。ζＰＫＣポリヌクレオチドは、好ましくは哺乳動物の起源（例えば、マウスζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ９４６３２）；ラットζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｊ０４５３２）；ウサギζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ７８７６８））であり、そして、より好ましくはヒト起源（例えば、ヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７４４；配列番号：１））である。これらの組換えζＰＫＣポリヌクレオチドを発現する一般的方法は、当該技術分野において周知である。
【００３９】
［００４７］いくつかの細胞株は、ζＰＫＣの組換え発現に適した宿主細胞として演じることができる。哺乳動物の宿主細胞株は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞、並びに、正常の２倍体の細胞、初代組織のインビトロ培養由来の細胞株、及び初代体外培養片を含む。
【００４０】
［００４８］又は、ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）は、酵母のような下等真核生物、又は原核生物において組換え的に製造してもよい。潜在的に適した酵母株は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シーゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｏｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、及びカンジダ株を含む。潜在的に適した細菌株は、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びサルモネラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。本発明のポリペプチドが酵母又は細菌に生産されるとすれば、機能性を獲得するために、それらを、例えば、適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によってそれらを修飾することが必要であるかもしれない。そのような共有結合は周知の化学的又は酵素的方法を用いて達成してもよい。
【００４１】
［００４９］ ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）はまた、バキュロウイルスベクターのような昆虫発現ベクターを用いて組換え的に生産してもよく、及び昆虫細胞発現システムを使用して製造してもよい。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システムのための材料と方法は、キットの形体で商業的に利用可能である（例えば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）。
【００４２】
［００５０］精製を容易にするために、ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はチオレドキン（ＴＲＸ）のようなタンパク質と融合して組換え的に発現してもよい。そのような融合タンパク質の発現と精製のためのキットは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からそれぞれ商業的に利用可能である。ζＰＫＣはまた、小さなエピトープでタグが付けられてもよく、その後、そのエピトープに対する特異的抗体を用いて同定又は精製してもよい。そのようなエピトープの１つはＦＬＡＧエピトープであり、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から商業的に利用可能である。
【００４３】
［００５１］ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）はまた、既知の慣用的な化学合成により製造することができる。ポリペプチドを化学的に合成する方法は、当業者に周知である。そのような化学合成のζＰＫＣは、天然に製造された形態に一致して生物学的性質を所有してなくてはならず、つまり、天然のζＰＫＣに対して生物学的活性又は免疫学的置換体として使用することができる。
【００４４】
試験化合物の供給源及びスクリーニング
［００５２］本発明の試験化合物はいくつかの供給源から入手することができる。例えば、分子のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングのために利用することができる。そのようなライブラリーを用いて、数千の分子を阻害活性についてスクリーニングすることができる。化合物の調製及びスクリーニングは、上述したように又は当業者に周知の他の方法によってスクリーニングされ得る。このように、同定した化合物は、慣用的な「リード化合物」として役立てることができ、又は現在の治療として使用し得る。
【００４５】
処置方法
導入
［００５３］本発明は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性の阻害によって関節炎の治療用の予防及び治療方法の両方を提供する。該方法は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性を阻害するのに有効な量で試薬と細胞（インビトロ、インビボ、又はエクスビボのいずれかで）接触することに関係する。試薬は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性を阻害するいずれかの分子であり得て、限定されないが、阻害性ポリヌクレオチド、小分子、阻害性タンパク質生物工学製品、及びペプチド阻害剤を含む。
【００４６】
阻害性ポリヌクレオチド
［００５４］関節炎に悩まされている（又は危険性がある）生物体において、又は、そのような生物体由来の関連した細胞において、ζＰＫＣの発現の減少は、ζＰＫＣ遺伝子から転写したｍＲＮＡに結合し、及び／又はｍＲＮＡを切断する多種の阻害性ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンス・ポリヌクレオチド及びリボザイムの使用を通じて達成することができる（例えば、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１：２５１−５７；Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：５７５−８８）。
【００４７】
［００５５］本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、ζＰＫＣのコーディング鎖の全体、又はその一部に相補的であり得る。又は、アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、ζＰＫＣのコーディング鎖の非コーディング領域に相補的であり得る。アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、当該技術分野において周知な手法を用いる化学合成及び酵素的連結反応を用いて構築することができる。化学的に合成したポリヌクレオチドのヌクレオシド連結は、ヌクレアーゼを介した分解に抵抗する能力を高め、並びに配列特異性を増加するために修飾することができる。そのような連結修飾は、限定されないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）連結を含む（Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９−１４；Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１５７−７９）。又は、これらの分子は、本発明のポリヌクレオチドがアンチセンス（即ち、リバース）配向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて、生物学的に生産することができる。
【００４８】
［００５６］本発明の阻害性ポリヌクレオチドはまた、二重鎖ＤＮＡの主溝において高い特異性と親和性で結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む（Ｋｎａｕｅｒｔ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２４３−５１）。ζＰＫＣ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するζＰＫＣ遺伝子の制御領域（即ち、プロモーター及び／又はエンハンサー配列）に相補的なＴＦＯを標的にすることによって、ζＰＫＣの発現を阻害することができる。
【００４９】
［００５７］好ましい態様において、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。ｓｉＲＮＡ分子は、短く（好ましくは１９−２５ヌクレオチド；最も好ましくは１９又は２１ヌクレオチド）、二重鎖ＲＮＡ分子であり、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす。この分解は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知れている（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９）。より下等な生物体において元来同定されたＲＮＡｉは、効果的に哺乳動物の細胞に適合し、最近、Ｆａｓ ｍＲＮＡに標的化されたｓｉＲＮＡで処理したマウスにおける急性肝炎を妨げることが示されている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：３４７−５１）。加えて、髄膜に輸送されるｓｉＲＮＡが、ラットにおいて２つのモデル（アゴニスト誘導の痛みモデル及び神経系の痛みモデル）の痛み応答を遮断することが報告されている（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：ｅ４９）。
【００５０】
［００５８］本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子（標的ｍＲＮＡの部分に適合するもの）を一緒にアニーリングすることによって（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５０６，５５９号）、又は必要な二本鎖部分を生じるためにそれ自身で折り返す一本鎖らせんＮＡ分子の使用を通じて発生させる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６０４７−５２）ことができる。ｓｉＲＮＡ分子は化学的に合成することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８）、又は一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロ転写によって生産することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。又は、ｓｉＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて、一時的に（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述； Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５５１５−２０）又は安定に（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４４３−４８）生物学的に生産することができる。最近、初代ヒト細胞における標的ｍＲＮＡレベルの減少が、効果的であって配列特異的な方法で、らせんＲＮＡを発現し、さらにｓｉＲＮＡ内に処理されるアデノウイルスベクターを用いて示された（Ａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２３２５−３２）。
【００５１】
［００５９］本発明のポリヌクレオチドに標的とされるｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野において周知の基準に基づいて設計され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−８８）。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくは、ＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ、又はＣＡで開始されるべきであり；ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、好ましくは、４５−５５％であるべきであり；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に３つの同じヌクレオチドを含有すべきではなく；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に７つの混在したＧ／Ｃを含有すべきではなく；そして、標的セグメントは、好ましくは、標的ＲＮＡのＯＲＦ領域内に存在し、及び、好ましくは、開始ＡＴＧの後に少なくとも７５ｂｐであり、終止コドンの前に少なくとも７５ｂｐで存在すべきである。
【００５２】
小分子
［００６０］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの発現の減少はまた、ζＰＫＣに結合し、その活性を阻害する小分子（通常、有機的小分子）の使用を介して達成されてもよい。ＰＫＣ（好ましくは、異性体特異的）の活性を阻害するものとして既知の小分子は、本発明の治療方法に使用することができる。ＰＫＣを阻害する無数の小分子は、当該技術分野において既知であり（疾患の治療として承認されたもの、並びに臨床試験の他のものを含む）、そして、天然の化合物（例えば、スタウロスポリン）及び人工の化合物（例えば、ＬＹ３３３５３１）の両方を含む（Ｇｏｅｋｊｉａｎ ａｎｄ Ｊｉｒｏｕｓｅｋ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｎｇ．Ｄｒｕｇｓ １０：２１１７−４０； Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：１８１−８７に概要され、両者は、本明細書中に援用される）。これらの分子は、直接使用することができ、又は、改良されたＰＫＣ阻害剤（好ましくは、異性体特異的）の開発に向けた出発化合物として役立てることができる。又は、上述されるスクリーニング方法によって同定される新規な小分子（好ましくは、異性体特異的）を使用してもよい。
【００５３】
阻害性タンパク質の生物工学製品
［００６１］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの発現の減少はまた、タンパク質の生物工学製品を使用して達成されてもよい。阻害性タンパク質の生物工学製品は、細胞又は生物体における阻害性生物学的活性を有するタンパク質分子に言及される。本発明の治療方法において使用するための好ましい阻害性タンパク質の生物工学製品は、ζＰＫＣのＰａｒ４及びキナーゼ−欠損優性−陰性（ＤＮ）突然変異形体を含む。Ｐａｒ４は、ζＰＫＣに結合する自然発生のタンパク質であり、その酵素的機能を阻害するために役に立つ（Ｄｉａｚ−Ｍｅｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：７７７−８６）。ζＰＫＣのＤＮ突然変異形体、例えば、リジン２８１のトリプロファンの点突然変異であるζＰＫＣ（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５５１−５８）は、基質に対して競合させることによって内因性のζＰＫＣの活性を減少し、周知な部位指向的突然変異手法を用いて調製することができる。キナーゼ活性を欠如しているが、まだζＰＫＣを介したシグナル伝達を阻害するζＰＫＣのいずれの変異体もＤＮ突然変異体として使用してもよい。これらの阻害性タンパク質の生物工学製品は、上述した発現手法を用いてインサイチュで細胞（好ましくは、軟骨細胞）において発生してもよい。
【００５４】
ペプチド阻害剤
［００６２］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの活性の減少はまた、ζＰＫＣに結合し、そしてその活性を阻害するペプチド阻害剤を使用して達成されてもよい。ペプチド阻害剤は、ζＰＫＣの基質との相互作用からζＰＫＣを妨げるペプチド擬似基質、並びにζＰＫＣ又はその基質のいずれかに結合し、そして、ζＰＫＣを介したリン酸化を遮断するペプチドを含む。ζＰＫＣを阻害するペプチド阻害剤は、文献に知られ、そして、ＳＩＹＲＲＧＡＲＲＷＲＫＬ（配列番号：３）、ＳＩＹＲＲＧＡＲＲＷＲＫＬＹＲＡＮ（配列番号：４）、及びＲＲＧＡＲＲＷＲＫ（配列番号：５）を含む（例えば、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。好ましくは、これらのペプチド阻害剤は、ミリストイル化され（それぞれ、配列番号：６、７、及び８）、細胞浸透性を改善する（例えば、Ｓｔａｎｄａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，上述；配列番号：６に対して）。ミリストイル化及び非ミリストイル化ζＰＫＣペプチド阻害剤は、化学的に合成され、商業的に、例えば、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）及びＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手することができる。誰でも、上述した手法を用いて、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでペプチド阻害剤で細胞（好ましくは、軟骨細胞）を提供することができる。
【００５５】
投与
［００６３］本明細書に記載される化合物のいずれも（好ましくは、小分子）は、関節炎の治療のための医薬組成物の形体でインビボで投与することができる。医薬組成物は、限定されないが、経口、鼻腔、直腸、局部、舌下、静脈、筋肉、動脈、骨髄、髄膜、心室、腹膜、又は経皮経路を含むいずれかの複数の経路によって投与してもよい。活性成分に加えて、医薬組成物は、当該技術分野において既知の賦形剤、被服剤、及び補助剤を含む薬学的に許容可能な担体を含有してもよい。
【００５６】
［００６４］いずれの化合物についても、治療的に有効な投与量は、細胞培養又は動物モデルのいずれかにおいて初期に見積もることは可能である。治療的に有効な投与量は、状態やその症状を改善する活性成分の量を意味する。細胞培養又は動物モデルにおける治療的な有効性及び毒性は、標準の医薬手法によって決定することができる（例えば、ＥＤ５０：母集団の５０％において治療的に有効な量；ＬＤ５０：母集団の５０％の致死量）。治療効果と毒性効果との間の投与量の比は、治療指標となり、そして、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表現され得る。大きな治療指標を提示する医薬組成物が好ましい。
【００５７】
［００６５］細胞培養及び動物モデルから得られたデータは、次いで、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおいて使用するための化合物の投与量範囲を明確にするために使用され得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む濃度範囲内である。投与量は、使用される組成物形体及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化することができる。
【実施例】
【００５８】
実施例
［００６６］下記は、本発明の理解を手助けするために説明する実施例は、いずれの方法においてもその範囲を限定するためのものではなく、構築されるべきではない。実施例は、慣用的な方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、そのようなベクター及びプラスミドの宿主細胞への導入、又は宿主細胞においてそのようなベクター及びプラスミドからのポリペプチドの発現において使用される方法の詳細な記載は含まない。そのような方法、及び他の慣用的な方法は、当業者に周知である。
【００５９】
実施例１
ζＰＫＣ発現は関節炎において上方制御される
実施例１．１ 実験設計
［００６７］関節炎の関節軟骨と正常な関節軟骨との間に示差的に発現する転写物を同定するために、最終的に膝関節の置換をしている関節炎の患者及び非関節炎の切断手術を受けたヒトから組織試料を得た。関節炎の有無は組織学によって確かめた。
【００６０】
実施例１．２ オリゴヌクレオチドアレイ・ハイブリダイゼーション
［００６８］発現プロファイリングには、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａｖ２（ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。ヒトゲノム由来のＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップは約１２，０００の本来の全長配列（約１６プローブ対／配列）を表す２５マーのオリゴヌクレオチドプローブを含有する。標的配列に完全に相補的になるように設計した各プローブについては、中心において単一の塩基ミスマッチを除いて同一であるパートナープローブを生じる。これらのプローブ対は、シグナルの定量と非特異的なノイズの控除を可能にする。
【００６１】
［００６９］ＲＮＡは、個人の関節軟骨組織から抽出し、ビオチン化ｃＲＮＡに変換し、そして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールに従って断片化した。断片化したｃＲＮＡを１００μｇ／ｍｌのニシンの精子ＤＮＡ及び５００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡを含有する１×ＭＥＳ緩衝液で希釈し、９９℃で５分間変性し、すぐに５分間、４５℃にした。不溶性の物質を短い遠心によってハイブリダイゼーション混合物から除去し、ハイブリダイゼーション混合物を各アレイに添加し、６０ｒｐｍで連続的な回転で１６時間４５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ハイブリダイゼーション混合物を除去し、６×ＳＳＰＥＴでチップを過剰に洗浄し、そして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールに記載されるようにＳＡＰＥ溶液で染色した。
【００６２】
実施例１．３ オリゴヌクレオチドアレイデータ解析
［００７０］各転写物の生の蛍光強度値をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを用いて６ｍｍの分解度で測定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア３．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は、遺伝子が「存在」又は「不在」であるかを決定するために、並びにアレイ上の各遺伝子の特異的ハイブリダイゼーション強度値又は「平均差」を決定するためにアルゴリズムを使用し、蛍光データを評価するために使用した。各遺伝子の平均差は、Ｈｉｌｌら（（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８０９−１２）の手法に従って、各ハイブリダイゼーション混合物にスパイクした既知存在量の１１個の対照転写物の平均差を参照して頻度値に標準化した。各遺伝子の頻度を計算し、その頻度は、１０６の全転写物あたりの個々の遺伝子転写物の全体数に等しい値を表す。
【００６３】
［００７１］各転写物の頻度を評価し、そして、転写物を以下の３つの基準を満たすかの研究に含めた。第一に、関節炎の軟骨及び正常な軟骨の両方に関する少なくとも１つのアレイにおけるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）によって「存在」と呼ばれる転写物は、解析に含めた。第二に、関節炎の軟骨と正常な軟骨との間の比較のために、ｔ−テストを採用し、頻度値における有意な（ｐ＜０．０５）増加又は減少を有する一組の転写物のを同定した。第三に、統計学的に有意な一組の転写物の全体に渡って頻度値における平均倍率の変化は、２．４倍か又はそれ以上であることが要求された。これらの基準は、アレイ内の再先産性を見積もる複製実験に基づいて確立された。
【００６４】
［００７２］これらの基準に基づいて、関節炎の関節及び正常な関節の軟骨に示差的に発現した６０２個の転写物を同定した。同定されたそのような転写物の１つがζＰＫＣであった。
【００６５】
実施例２
ζＰＫＣ活性の阻害は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の減少を阻害する
実施泳２．１ 初代ウシ軟骨細胞の単離と培養
［００７３］十分に太いウシの関節軟骨スライスを無菌状態で切り出し、ＰＢＳで４回リンスし、そして、プロナーゼ及びコラゲナーゼ消化（血清なしでＤＭＥ中、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）３０分間、及び１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）一晩）に供して、軟骨の細胞外マトリックスに包埋した軟骨細胞を単離した。消化物を７０ミクロンのＦａｌｃｏｎ（商標）細胞ろ過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通してろ過し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥで２回洗浄した。典型的には、２−４×１０８細胞をウシ中手指節関節表面から得た。細胞を単層で６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。ペレット培養については、細胞を１×１０６細胞／ｍｌで増殖培地［ＨＬ−１培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ペニシリン＋ストレプトマイシン、グルタミン、５０μｇ／ｍｌアルコルビン酸、及び１０％ＦＢＳ］中に再懸濁し、そして、細胞１ｍｌのアリコートを１５ｍｌの無菌のＦａｌｃｏｎ遠心管に移した。細胞を４℃で５分間、２００×ｇで遠心し、得られた細胞ペレットを前述したように培養した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３５５７−６５）。細胞培養液を回収し、コラーゲン及びプロテオグリカンアッセイ用に保存し、そして、細胞を３−４日毎に新鮮な培地（３ｍｌ／ウェル、１ｍｌ／管）で再供給した。ペレット培養は、３週間維持し、その時にペレットを集め、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染色アッセイ用に０．５ｍｌの３００μｇ／ｍｌパパインで消化するか、又は組織学のために調製した。
【００６６】
実施例２．２ ＮＦ−κＢのペプチド遮断剤はＴＮＦ−又はＩＬ−２を介したプロテオグリカン分解を阻害することができる
［００７４］ＮＦ−κＢ活性を遮断することが、出願人の培養系においてプロテオグリカン分解を阻害できることを示すために、初代ウシ軟骨細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１の存在若しくは不存在において、３００μｇ／ｍｌの濃度で４日間、ＮＦ−κＢ遮断剤ＳＮ５０とともに培養した。細胞をＴＮＦ又はＩＬ−１のいずれかの添加前に３時間、阻害剤とともにインキュベートした。ＳＮ５０は、脂質二重層を横切る輸送を促進するための一続きの疎水性アミノ酸に結合したＮＦ−κＢの核局在シグナルを含有するペプチドである（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５−５８）。ＳＮ５０Ｍは、陰性対照として使用され、ＮＦ−κＢを遮断する活性を止めるアミノ酸変化を有する同じペプチドである。ＳＮ５０及びＳＮ５０Ｍは、例えば、Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から利用することができる。
【００６７】
［００７５］図２に示すように、ＳＮ５０Ｍは、培養液中へのプロテオグリカン放出及び細胞ペレットにおける回復の減少により測定されるように、ウシ軟骨細胞におけるＴＮＦ及びＩＬ−１を介したプロテオグリカン分解を妨げることに有効ではなかった。対象的に、ＳＮ５０は、プロテオグリカンのサイトカインを介した分解を完全に阻害した。加えて、ＳＮ５０でさえ、ＳＮ５０Ｍと比較した場合、サイトカイン処理がない場合にプロテオグリカン分解を妨げた。これらの結果は、サイトカインを介したコラゲナーゼ及びアグリカナーゼの合成を調節する遮断ＮＦ−κＢは、初代ウシ軟骨細胞におけるプロテオグリカン減少を分解することを示す。
【００６８】
実施例２．３ ζＰＫＣ阻害剤はＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を遮断する
［００７６］ζＰＫＣ阻害剤がＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を阻害することができるかどうかを決定するために、初代ウシ軟骨細胞を、（１）ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質［本明細書では「２０８９」と称する；組織内での合成；配列番号：６に均等；例えば、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）］、又は（２）小分子阻害剤Ｒｏ−３１−８２２０（Ｓｉｇｍａ−ＲＢＩ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）と伴に、又は伴わずに５日間、ＴＮＦの様々な濃度で培養した。阻害剤はＴＮＦを添加する前に３時間添加した。
【００６９】
［００７７］図３に示されるように、１０及び１００ｎｇ／ｍｌＴＮＦは、培養液へのプロテオグリカン放出及び細胞ペレットにおける回復の減少により測定されるように、有意なプロテオグリカン分解を引き起こした。このプロテオグリカン分解は、５０μＭの２０８９及び１０μＭのＲｏ−３１−８２２０（ＲＯ３１）の両方によって有意に阻害した。加えて、これらの化合物は、ＴＮＦの不在でさえもプロテオグリカン分解を阻害し、プロテアーゼの構築レベルの遮断を示唆した。５μＭの濃度のＲｏ−３１−８２２０は、プロテオグリカン減少の妨げで相対的に効果がなかった。これらの結果は、２０８９及びＲｏ−３１−８０２２の両者が初代軟骨細胞の細胞膜を貫通し、ＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を効果的に遮断することを示す。軟骨細胞のトリパンブルー染色及び初代培養でのラクテートアッセイは、結果についての可能な説明として、細胞毒性を排除するために実行した。これらの実験は、化合物がこれらの実験において使用した投与量でかなりの細胞毒性を引き起こさないことを確実にした。加えて、対照のペプチドを合成し、同じアッセイ系で試験して、非特異的な効果が観察された結果を引き起こす可能性を解決するために試験した。擬似基質ペプチドの非ミリストイル化バージョン、並びに、擬似基質ペプチドとして同じアミノ酸成分を含有する「スクランブルした対照」は、スクランブルした配列を有しており、試験され、両者は、プロテオグリカン分解を遮断する点で非効果的であることを見出した。
【００７０】
実施例２．４ ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質２０８９は投与量に依存する方法でＴＮＦ−及びＩＬ−１を介したプロテオグリカン分解を遮断する
［００７８］ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質２０８９が投与量に依存する方法でサイトカインを介したプロテオグリカン分解を阻害するかどうかを決定するために、初代ウシ軟骨細胞を様々な濃度の２０８９を添加した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１のいずれかで４日間培養した。
【００７１】
［００７９］図４に示すように、２０８９は、投与量に依存した方法でＴＮＦ又はＩＬ−１の両方を介したプロテオグリカン分解を阻害し、最大の投与量（１００μＭ）は培養液中へのプロテオグリカン放出を完全に阻害した。また、プロテオグリカンの増加した細胞ペレット保持、及び培養液中へのプロテオグリカンの放出の減少は、サイトカイン不在でさえ２０８９で達成された。累積的に、これらの結果は、軟骨細胞におけるζＰＫＣの阻害がサイトカインを介したプロテオグリカンの酵素分解的な分解を阻害することを示す。これは、ζＰＫＣのノックアウトマウスが非常に良性表現型を有する（Ｌｅｉｔｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，上述）という事実を伴って、ζＰＫＣの阻害は、関節炎並びに他の炎症性疾患の安全で効果的な治療となり得ることを示す。
【００７２】
実施例３
ζＰＫＣ ｍＲＮＡはヒト骨関節炎（ＯＡ）の軟骨において上方制御される
［００８０］骨関節炎（ＯＡ）患者由来のヒト関節の軟骨に関する転写プロファイリングデータが、ヒト非ＯＡ軟骨と比較して、ζＰＫＣ ｍＲＮＡにおいて統計的に有意な増加を示した。図５のパネルＡでは、ＲＮＡは、臨床試料の凍結粉砕した関節軟骨から抽出し、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップを用いてプロファイリング解析を表すようにした。これらのグループを解析した：正常（非ＯＡ）軟骨［１３試料］；重症ＯＡ軟骨（非障害領域）［２９試料］；及び重症ＯＡ軟骨（障害領域）［２６試料］。ζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルは、正常な試料と比較して、重症のＯＡ試料において評価した。図５のパネルＢでは、同じ一連の試料のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｑ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）解析は、正常な試料と比較して、重症のＯＡ試料におけるζＰＫＣ ｍＲＮＡの非常に高いζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示した；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコールは製品取扱説明書に従って行った。
【００７３】
実勢例４
ζＰＫＣタンパク質は軟骨細胞において発現する
［００８１］抗ζＰＫＣ抗体（ｎＰＫＣζ（Ｃ−２０）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用して、軟骨細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞におけるζＰＫＣタンパク質の産生を比較した。ウシ軟骨細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト細胞株）の溶解物を同様の方法によって調製した：細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、すぐにホスファターゼ阻害剤を含有する細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に置いた。細胞を氷上で５分間インキュベートし、次いで、４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心した。試料を還元条件下で１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動におって分析した。ウェスタンブロットは、軟骨細胞が十分量のζＰＫＣタンパク質を発現したことを示した；同じブロットは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるζＰＫＣタンパク質の明確に感知できる発現は示さなかった。
【００７４】
実施例５
アデノウイルスを介したζＰＫＣの発現はプロテオグリカン分解を増加する
［００８２］初代ウシ軟骨細胞を単離して、実施例２．１において上述したように（ペレット形式で）培養した。アデノウイルスの添加前に（１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ管で）２％ＦＢＳを含有する増殖培地（ＨＬ−１）０．５ｍｌ中で細胞を培養した。ζＰＫＣ又はＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）を含有するアデノウイルスベクターを調製し（Ａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２２４５−５３）、そして、軟骨細胞の培養物に単離後ペレットにする前にすぐに感染させた。ＧＦＰ又はζＰＫＣを発現するアデノウイルスは、５０００の感染の多重度（ＭＯＩ）で培養物中に直接加えた。図６のパネルＡに見られるように、培養物（サイトカインを添加していない）中の初代ウシ軟骨細胞における全長のζＰＫＣの過剰発現は、ＧＦＰの過剰発現と比較した場合、プロテオグリカンの分解（軟骨細胞のペレットアッセイにおける培養液中に放出されるプロテオグリカンにより測定されるように）において、中くらいであるが統計学的に有意な増加に帰着した。１０％ＦＢＳを含有する培養液を３７℃で（５％ＣＯ２の湿気雰囲気下で）２時間インキュベーション後に培養物に添加した。血清組成物は、３日毎に徐々に減少させ（軟骨細胞ペレットを毎回供給して連続的に５％、２．５％にし、そして最終的には０％（血清なし）にする）、血清から細胞を遠ざけた。培養液中に放出されたプロテオグリカンは、２５日に渡って放出された全プロテオグリカンを表す。
【００７５】
［００８３］図６のパネルＢでは、細胞を血清から遠ざけた後、サイトカインの添加の有無で、４日間に渡る培養液中のプロテオグリカンを測定した。次善最適のＴＮＦαの添加は、ＧＦＰの過剰発現又はアデノウイルス感染なしと比較した場合、ζＰＫＣの過剰発現に反応して培養液中に放出したプロテオグリカンの量を増大させた（図６、パネルＢ）。
【００７６】
実施例６
ζＰＫＣは軟骨細胞におけるＴＮＦαを介したプロテオグリカン放出に原因する
［００８４］関節炎のウシ軟骨細胞は、ペレットアッセイのために前述したように調製した。図７に示すように、軟骨細胞ペレットアッセイにおける同じ培養物にＴＮＦαを添加した（１００ｎｇ／ｍｌ；＊で標識したバー）。２つの阻害剤は、異なる投与量で添加した。１つの阻害剤、ビスインドリルマレミド（ＢＩＳ）は、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤であり、ζＰＫＣを含む、ＰＫＣの全ての異性体の活性を遮断すると報告されている（例えば、Ｔｏｕｌｌｅｃ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５７７１−８１）。他の阻害剤、塩化ケレリスリン（ＣＣ）は、ホルボールエステル結合部位の競合阻害剤である。ＣＣは、伝統的な及び新規なＰＫＣファミリーのメンバーのホルボールエステル結合ドメインに対して競合し、それらを阻害する；しかしながら、典型的でないＰＫＣ（例えば、ζＰＫＣ；Ｃａ＋＋依存性であり、しかもジアクリルグリセロール非依存性であるＰＫＣ）はこの結合ドメインを欠如しているので、ＣＣによっては阻害されない（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２：９９３−９９）。軟骨細胞ペレットアッセイにおける培養液中へのサイトカイン（ＴＮＦα）を介したプロテオグリカンの放出は、ＢＩＳ（２０−４０μＭで）によって遮断されたが、ＣＣによっては遮断されず（図７）、ζＰＫＣの選択的阻害がサイトカインを介したプロテオグリカン減少を遮断することを示した。
【００７７】
実施例７
ζＰＫＣは軟骨細胞におけるＮＦ−κＢのＴＮＦα誘導の活性の原因となる
［００８５］ＮＦ−κＢ応答エレメントの制御下でルシフェラーゼレポート遺伝子を導入した不死化ヒト軟骨細胞株（Ｃ２８／Ｉ２；例えば、Ｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：３３９５−４０３；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：２３０７−１６）におけるＮＦ−κＢの活性を測定した。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２で細胞を培養した；細胞を９６ウェルに撒き（１×１０５細胞／ウェル）、アッセイ前に２４時間、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ構築物（１００ＭＯＩ）を発現するアデノウイルスで感染した。軟骨細胞をＴＮＦの添加前２時間、無血清培地で阻害剤とともにインキュベートした。図８に示すように、ＴＮＦαを軟骨細胞ペレットアッセイにおけるいくつかの培養物に添加した（１ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌ）。ＢＩＳ（２０μＭ）、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤をいくつかの培養物に添加し、そして、ＣＣ（８μＭ）、ＰＫＣのいくつかの形体でのホルボールエステル結合部位の競合阻害剤（しかし、典型的でないＰＫＣ、例えばζＰＫＣ）を他の培養物に添加した。サイトカイン（ＴＮＦα）を介したＮＦ−κＢの活性はＢＩＳによって遮断されたが、ＣＣによっては遮断されず、ζＰＫＣの選択的阻害がサイトカインを介したＮＦ−κＢの活性を遮断することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１−１】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−２】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−３】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−４】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−５】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−６】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図２】［００１７］図２は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−又はＩＬ−１−仲介のプロテオグリカン分解におけるＮＦ−κＢ遮断剤ＳＮ５０（３００μｇ／ｍｌ）、又はその不活性な類似体ＳＮ５０Ｍ（３００μｇ／ｍｌ）の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図３】［００１８］図３は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−仲介のプロテオグリカン分解におけるミリスチン化ζＰＫＣの擬似基質ペプチド（２０８９）又はＰＫＣ小分子阻害剤Ｒｏ−３１−８２２０（ＲＯ３１）の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図４】［００１９］図４は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−又はＩＬ−１−仲介のプロテオグリカン分解におけるミリスチン化ζＰＫＣの擬似基質ペプチド（２０８９）の投与量依存の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図５】［００２０］図５は、ヒト骨関節炎の関節軟骨において、ζＰＫＣが上方制御されることを示す。パネルＡは、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いたζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示す；パネルＢは、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析を用いたζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示す。
【図６】［００２１］図６は、ζＰＫＣのアデノウイルスを介した発現がプロテオグリカン分解を増加することを示す。パネルＡは、ζＰＫＣ及びＧＦＰの過剰発現に応答した軟骨細胞ペレットアッセイにおいて、培養液中に放出したプロテオグリカンを示す；パネルＢは、サイトカインＴＮＦαの最適下限レベルでの刺激効果を示す。
【図７】［００２２］図７は、ζＰＫＣが関節の軟骨細胞におけるＴＮＦαを介したプロテオグリカンの放出の原因となることを示す。ＴＮＦαを軟骨細胞ペレットアッセイにおけるいくつかの培養系に添加した（１００ｎｇ／ｍｌ；＊で記される）。２つの阻害剤は、様々な投与量で添加した：ビスインドリルマレイミド（ＢＩＳ）、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤；及び塩化ケレリスリン（ＣＣ）、ζＰＫＣを阻害しない部位に結合するホルボールの競合阻害剤。培養液中へのプロテオグリカン放出は、μｇ／ｍｌとしてｙ軸上に示される。
【図８】［００２３］図８は、ＴＮＦα誘導のＮＦ−κＢの活性のおける阻害剤ＢＩＳ及びＣＣの効果を示す。ＮＦ−κＢの活性は、ＮＦ−κＢ応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子が導入された不死化したヒト軟骨細胞株において測定した；活性（即ち、ｙ軸上のユニット）は「相対的ルシフェラーゼ活性」として表現される。
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、２００３年５月８日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／４６８，９８７号、及び２００３年７月３１日出願の米国仮出願シリアルＮｏ．６０／４９１，２７４号の利益を主張し、両者はそのまま参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
［０００２］本発明は、関節炎組織で増加したプロテインキナーゼＣゼータ（ζＰＫＣ）遺伝子発現に基づいて、患者における関節炎を診断し、予測し、及びその経過を監視する方法に指向する。本発明はさらに、関節炎の治療における治療薬として使用するための、ζＰＫＣの発現を阻害する化合物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
関連する背景技術
［０００３］プロテインキナーゼＣゼータ（ζＰＫＣ）は、重要なシグナル伝達成分として発生している。ζＰＫＣは、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１経路に関連することを示唆する文献が増加している。例えば、ζＰＫＣのノックアウトマウスは完全に生存するが、ＮＦ−κＢ依存の転写活性の深刻な損傷とともに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体及びリンフォトキシン受容体ノックアウトを想起する表現型を提示する（Ｌｅｉｔｇｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ８：７７１−８０）。他の研究者（Ｌａｌｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２１８０−８８）は、ＩκＢを活性化し、それによりＮＦ−κＢを活性化することにおけるζＰＫＣについての役割を示している。
【０００４】
［０００４］ＮＦ−κＢ活性は、無数の炎症性障害に関与し、喘息、炎症性腸疾患、及び関節炎を含む（Ｒｏｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２：３１６−２１に示される）。ＮＦ−κＢは、多種の細胞系由来の様々なマトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌に本質的な役割を果たすことが示されている（Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３５：２９−３４； Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：５６１−６７； Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５０：５５６−６５）。関節炎において、ＴＮＦやインターロイキン−１（ＩＬ−１）のようなサイトカインは、ＭＭＰ、及び自然に制御することができるレベルを超えて、疾患に帰着する他の分解酵素の産生と合成を増加する（Ｓｍｉｔｈ（１９９９）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：Ｄ７０４； Ｍｏｒｔ ａｎｄ Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ（２００１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．３：３３７−４１； Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ａｎｄ Ｃａｗｓｔｏｎ（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．５：１２−２４に示される）。
【０００５】
［０００５］今日まで、ζＰＫＣと関節炎とを結びつける直接的な証拠はない。しかしながら、ζＰＫＣが影響される組織において発現するとすれば、ＴＮＦ及びＩＬ−１の因子の細胞外受容体の結合がＮＦ−κＢによる分解酵素の合成を細胞内で誘導するよう伝達することによって、ＴＮＦ及びＩＬ−１の分解活動を説明する手助けとなろう。これに関連して、ζＰＫＣの阻害剤は、ＴＮＦ及びＩＬ−１活動を遮断し、関節炎及び他の炎症性疾患の治療として使える。このようなζＰＫＣ阻害剤は、伝統的なサイトカインやＭＭＰ阻害剤よりも効果的であるべきである。これは、丁度１つの標的よりも最終的に効果があべきである（Ｒｏｓｈａｋ，上述； Ｓｍｉｔｈ，上述）。そのようなζＰＫＣ阻害剤はまた、ＮＦ−κＢ阻害剤よりも安全であるべきであり、これは、ζＰＫＣがＮＦ−κＢ経路における多くのエフェクターのうち唯一のものだからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
［０００６］本発明は、ζＰＫＣ発現が正常人と比較して、関節炎の患者の組織において増加しているという発見に基づく。本発明は、限定されるわけではないが、阻害性ポリヌクレオチド及びポリペプチド、小分子、そしてペプチド阻害剤を含む、関節炎組織におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を提供する。本発明はさらに、関節炎組織における異常なζＰＫＣ遺伝子発現に基づく関節炎を診断し、予測し、その経過を監視する方法、並びにそのような異常発現の治療薬としての使用のための療法を提供する。加えて、本発明は、そのような治療薬のための医薬製剤及び投与経路を提供し、並びにそのような治療薬の能力を評価するための方法を提供する。
【０００７】
［０００７］一態様において、本発明は、患者における関節炎の診断において使用する方法を提供し、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出する工程；そして、試験量と、対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する工程を含み、それにより、試験量が正常量よりも大きいという所見が関節炎の診断に陽性の指示を提供する。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【０００８】
［０００８］別の態様において、本発明は、患者における関節炎の予測において使用する方法を提供し、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出する工程；そして、試験量と、対照試料におけるζＰＫＣ遺伝子産物の予測量とを比較する工程を含み、それにより、試験量と予測量との比較が関節炎の予測の指示を提供する。好ましい態様では、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様では、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【０００９】
［０００９］別の態様では、本発明は、患者における関節炎の経過を監視するのに使用する方法を提供し、一回目に患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出する工程；二回目以降に、患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出する工程；そして、第一試験量と第二試験量とを比較する工程を含み、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の増加は、関節炎の進行を示し、そして、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が関節炎の鎮静を示す。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【００１０】
［００１０］別の態様において、本発明は、患者における関節炎の治療効果を評価する方法を提供し、治療前の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出する工程；治療後の患者の試料におけるζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出する工程；そして、第一試験量と第二試験量とを比較する工程を含み、それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少は、関節炎の治療が効果的であることを示す。好ましい態様において、試料は軟骨細胞を含む。いくつかの他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物は、ＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含み、又はそれはζＰＫＣポリペプチドである。
【００１１】
［００１１］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法を提供し、ζＰＫＣの等量を含有する第一試料と第二試料を提供する工程；第一試料を化合物と接触する工程；そして、第一試料におけるζＰＫＣの活性が、化合物と接触していない第二試料におけるζＰＫＣの活性と関連して減少しているかどうかを決定する工程を含み、それにより、第二試料と比較した場合、第一試料におけるζＰＫＣの活性の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す。好ましい態様において、化合物は、軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。他の好ましい態様において、ζＰＫＣの活性は、酵素プロテインキナーゼアッセイ、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、又はＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用により決定する。
【００１２】
［００１２］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法を提供し、ζＰＫＣを発現する細胞を等量含有する第一試料及び第二試料を提供する工程；第一試料を化合物と接触する工程；そして、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現が、化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現と関連して減少しているかどうかを決定する工程を含み、それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す。好ましい態様において、化合物は、軟骨細胞におけるζＰＫＣ遺伝子産物の発現を阻害する。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。他の好ましい態様において、ζＰＫＣ遺伝子産物の発現は、酵素プロテインキナーゼアッセイ、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、又はＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される。
【００１３】
［００１３］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を治療する方法を提供し、患者におけるζＰＫＣの活性を阻害する化合物を患者に投与することを含む。好ましい態様において、化合物は軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する。別の好ましい態様において、化合物はアンチセンス・ポリヌクレオチドである。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。別の好ましい態様において、化合物はｓｉＲＮＡ分子である。さらに好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【００１４】
［００１４］別の態様において、本発明は、患者における関節炎を治療する方法を提供し、患者におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を患者に投与することを含む。好ましい態様において、化合物は軟骨細胞におけるζＰＫＣの発現を阻害する。別の好ましい態様において、化合物はアンチセンス・ポリヌクレオチドである。別の好ましい態様において、化合物は小分子である。別の好ましい態様において、化合物はｓｉＲＮＡ分子である。さらに好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【００１５】
［００１５］別の態様において、本発明は、ζＰＫＣの発現又は活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子を提供する。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の詳細な説明
［００２４］本出願人は、正常人と比較した場合、関節炎の患者の組織においてζＰＫＣの発現が上方制御されることを発見している。この酵素が関節炎の組織において上方制御されるという発見は、ζＰＫＣ発現における増加を検出することによって関節炎を診断するための方法、及びζＰＫＣ発現を下方制御することによって関節炎を治療するための方法を可能にする。加えて、この発見は、関節炎の治療に有用な新規なζＰＫＣ阻害剤の同定を可能にする。
【００１７】
関節炎の進行を診断し、予想し、及び監視する方法
導入
［００２５］本発明は、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって関節炎を診断する方法を提供する。「診断」又は「診断すること」は、病理学的な状態の存否を同定することを意味する。診断方法は、患者（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）由来の生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はポリペプチド、その断片を含む）の試験量を決定し、そして、ζＰＫＣ遺伝子産物について正常量又は範囲（即ち、関節炎を患っているとは知らない個人由来の量又は範囲）とその試験量とを比較することによってζＰＫＣの上方制御を検出することを含む。特別な診断方法が関節炎の決定的な診断を提供しないかもしれないが、その方法が診断において手助けとなる陽性の指示を提供するとすれば、それは十分である。
【００１８】
［００２６］本発明はまた、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって関節炎を予想する方法を提供する。「予想」又は「予想すること」は、病理学的な状態の発症及び／又は苦しみを予測することを意味する。予想方法は、患者由来の生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を測定し、そして、ζＰＫＣ遺伝子産物について、試験量と、予想量又は範囲（即ち、関節炎の痛みが変化する個人由来の量と範囲）とを比較することを含む。試験試料中の様々な量のζＰＫＣ遺伝子産物は、関節炎におけるある種の予想と一致する。特定の予想レベルでのζＰＫＣ遺伝子産物の量の検出は、患者についての予想を提供する。
【００１９】
［００２７］本発明はまた、ζＰＫＣの上方制御を検出することによって、関節炎の経過を監視する方法を提供する。監視方法は、一回目及び二回目の患者から採取した生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し、そして、その量を比較することを含む。一回目と二回目との間のζＰＫＣ遺伝子産物量の変化は、関節炎の経過における変化を示し、量の減少は関節炎の鎮静を示し、そして、量の増加は関節炎の進行を示す。このような監視アッセイはまた、関節炎を治療した患者における特定の治療介入（例えば、疾患の減退対ぶり返し）の効果を評価するために有用である。
【００２０】
生物学的試料の収集
［００２８］ζＰＫＣの発現の増加は、細胞（例えば、細胞全体、細胞分画、及び細胞抽出物）及び組織を含む様々な生物学的試料において検出することができる。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取した生検や凍結切片のような組織切片を含む。好ましい生物学的試料は、関節の軟骨（即ち、軟骨細胞）、滑膜、及び滑液を含む。
【００２１】
正常値、診断値、及び予想値
［００２９］本発明の診断及び予想アッセイにおいて、ζＰＫＣ遺伝子産物を検出及び定量し、試験量を生じる。次いで、試験量は、正常な量又は範囲と比較する。正常な量又は範囲（例えば、３０％又はそれより大きな増加（ｐ＜０．０１である）、又は１００％又はそれより大きな増加（ｐ＜０．０５である））は、関節炎の診断において陽性の兆候である。ζＰＫＣ遺伝子産物の検出及び定量の具体的な方法は、下記に記載される。
【００２２】
［００３０］ζＰＫＣ遺伝子産物の正常な量又は基底レベルは、いずれかの具体的な試料タイプ及び母集団に対して決定することができる。一般的に、ζＰＫＣタンパク質又はｍＲＮＡの基底（正常）レベルは、正常な（即ち、健常な）患者由来の生物学的試料タイプにおけるζＰＫＣタンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することによって決定される。又は、ζＰＫＣ遺伝子産物の正常値は、病的な（又は病的可能性の）試験細胞又は組織を採取した同じ患者から採取した健常な細胞又は組織における量を測定することによって決定することができる。ζＰＫＣ遺伝子産物の量（正常な量又は試験量のいずれか）は、細胞当たり、全タンパク質当たり、又は体積基準当たり、決定することができ、又は発現することができる。試料の細胞量を決定するために、ある者は、構成的に発現した遺伝子産物、又は生物学的試料を採取したタイプの細胞において既知のレベルで発現した他の遺伝子産物を測定することができる。
【００２３】
［００３１］本発明のアッセイ方法がζＰＫＣ遺伝子産物の絶対値の測定を必ずしも要求しないことは賞賛されるであろう。これは、相対値がこれらの方法の多くの適用に十分であるためである。同様に、ζＰＫＣ遺伝子産物の定量又は多量に加えて、変異若しくは異常なζＰＫＣ遺伝子産物又はそれらの発現パターン（例えば、突然変異した転写物、切除されたポリペプチド）は、正常な遺伝子産物及び発現パターンの比較によって同定することができることも賞賛されるであろう。
【００２４】
ζＰＫＣ遺伝子産物のアッセイ
［００３２］本発明の診断アッセイ、予想アッセイ、及び監視アッセイは、生物学的試料中のζＰＫＣ遺伝子産物を検出し、定量することを含む。ζＰＫＣ遺伝子産物は、例えば、ζＰＫＣ ｍＲＮＡ及びζＰＫＣポリペプチドを含み、両者は、当業者に周知の方法を用いて測定することができる。
【００２５】
［００３３］例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション、インサイチュ・ハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、ドット及びスロットブロット、及びオリゴヌクレオチドアレイを用いて、ζＰＫＣ ｍＲＮＡを検出し、定量することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、プローブ核酸が標的の核酸にハイブリダイズするアッセイを意味する。いくつかのフォーマットにおいて、標的、プローブ、及びその両者は、固相化される。固相化した核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は別のオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドであってもよく、そして、天然に又は天然ではなく発生するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又は骨格を含んでもよい。本発明における使用のための核酸プローブ配列を選択する方法は、ζＰＫＣの核酸配列に基づき、当該技術分野において周知である。
【００２６】
［００３４］又は、ζＰＫＣ ｍＲＮＡは、検出及び定量の前に増幅することができる。そのような増幅に基づくアッセイは、当該技術分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ−酵素連結免疫溶媒アッセイ（ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む。増幅したζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を産生し、検出するプライマー及びプローブは、ζＰＫＣの核酸配列に基づいて容易に設計することができ、当業者にとって過度の実験なしに生産することができる。増幅したζＰＫＣ遺伝子産物は、例えば、ゲル電気泳動；プローブ核酸に対するハイブリダイゼーション；シークエンシング；蛍光、燐光、若しくは放射活性シグナルの検出；いずれかの各種周知な方法によって、直接的に解析することができる。加えて、標的核酸配列の増幅によって製造されるシグナルの増加のための方法は、当業者に知られている。当業者は、どの増幅方法を使用したとしても、ζＰＫＣ遺伝子産物の定量が望まれるならば、当該技術分野において知られている各種の定量方法（例えば、定量的ＰＣＲ）が使用され得ることを認識するであろう。
【００２７】
［００３５］ζＰＫＣポリペプチド（又はその断片）は、多様な周知の酵素的及び免疫学的アッセイを用いて検出し、定量することができる。酵素的アッセイは、プロテインキナーゼアッセイを検出するためにζＰＫＣ基質を利用するアッセイを意味する。ζＰＫＣ活性を検出し、定量するために有用な各種の天然及び人工の基質は既知であり、ミリストイル・アラニンリッチのＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）ペプチド（Ｈｅｒｇｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３：４４８−５７）、ｐ４７ｐｈｏｘ（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１２０６−１３），ミエリン塩基性タンパク質（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３０３７５−８１）、硫酸プロタミン（ＭｃＧｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：２３９−５０）、ヌクレオリン（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１１３０−３７）；異種リボヌクレオタンパク質ＡＩ（ｈｎＲＮＰＡ１）（Ｍｕｎｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５８８４−９１）、ζＰＫＣ誘導ペプチド（Ｋｏｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：５９７−６０６、及びζＰＫＣ誘導ペプチド（Ｓｔａｎｄａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４０７４−７８）を含む。ζＰＫＣ活性を検出し、定量するのに適した無数の酵素的アッセイプロトコール（放射活性及び非放射活性）は、文献に記載され、及び／又は、例えば、ＰａｎＶｅｒａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｒａｎｓｂｉｏ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、及びＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂｅｎｉｃｉａ、ＣＡ）からキットの形体で商業的に利用可能である。
【００２８】
［００３６］免疫学的アッセイは、ζＰＫＣポリペプチド（又はその断片）に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ｓｃＦｖ、及びその断片）を利用するアッセイを意味する。本発明の実施に適したいくつかの十分に確立した免疫学的アッセイは既知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、及びウェスタンブロットを含む。
【００２９】
［００３７］本発明の免疫学的アッセイに使用されるべき抗ζＰＫＣ抗体（好ましくは、抗哺乳動物ζＰＫＣ；より好ましくは抗ヒトζＰＫＣ）は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）より商業的に利用可能である。又は、抗ζＰＫＣ抗体は、当業者に周知の方法によって製造することができる。例えば、ζＰＫＣ（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０５５１３；配列番号：２））に対するモノクローナル抗体は、既知の方法に従ってハイブリドーマの発生によって製造することができる。この手法で形成したハイブリドーマは、次いで、例えば、ＥＬＩＳＡのような標準的な方法を用いてスクリーニングし、ζＰＫＣに特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。全長のζＰＫＣは、免疫抗原として使用してもよく、又はその代わりにζＰＫＣの抗原性ペプチド断片を使用してもよい。
【００３０】
［００３８］モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する別の方法として、ζＰＫＣに対するモノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定及び単離することができ、それにより、ζＰＫＣに結合する免疫グロブリンライブらーのメンバーを単離する。ファージディスプレイライブラリーを発生させスクリーニングするためのキットは、例えば、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）及びＭａｘｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から商業的に利用可能である。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを発生しスクリーニングするのに使用するために具体的に処理できる方法や試薬の例は、文献に見出すことができる。
【００３１】
［００３９］ポリクローナル血清や抗体は、適切な対象、例えば、ウサギをζＰＫＣ（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト）又はその抗原断片で免疫することによって生産することができる。免疫した対象における抗体の力価は、固定化したマーカータンパク質を用いて、ＥＬＩＳＡのような標準的な手法によって経時的に監視することができる。所望によって、ζＰＫＣに指向する抗体分子は、対象又は培養液から単離することができ、さらに、プロテインＡクロマトグラフィーのような周知の手法によって精製し、ＩｇＧ分画を得ることができる。
【００３２】
［００４０］ζＰＫＣに対する抗体の断片は、当該技術分野において周知な方法に従って抗体を切断することによって製造することができる。例えば、免疫学的に活性なＦ（ａｂ）’及びＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシンのような酵素を用いて酵素を処理することによって生じさせることができる。加えて、ζＰＫＣに対するキメラの、ヒト化し、及び一本鎖の抗体は、ヒト及びヒト以外の部分の両方を含み、標準的な組換えＤＮＡ手法を用いて製造することができる。ζＰＫＣに対するヒト化した抗体は、内因性の免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子を発現することができないが、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて製造することもできる。
【００３３】
［００４１］本発明の免疫学的アッセイにおいて、ζＰＫＣポリペプチドは、検出可能な標識を用いて、典型的には、直接的に（即ち、抗ζＰＫＣ抗体が標識される）又は間接的に（即ち、抗ζＰＫＣ抗体を認識する二次抗体が標識される）検出される。アッセイに使用される具体的な標識又は検出可能なグループは、アッセイに使用される抗体の特異的結合で顕著に干渉しない限りにおいて、大抵は重要ではない。
【００３４】
［００４２］本発明の免疫学的アッセイは、競合的であってもく、又は非競合的であってもよい。競合的アッセイにおいて、試料中のζＰＫＣの量は、試料中のζＰＫＣによって捕捉試薬（即ち、抗ζＰＫＣ抗体）から置き換わった添加の（外因の）ζＰＫＣの量を測定することによって間接的に測定される。非競合的アッセイにおいては、試料中のζＰＫＣの量は、直接的に測定される。好ましい非競合的「サンドイッチ」アッセイでは、捕捉試薬（例えば、一次の抗ζＰＫＣ抗体）が固定されている固体支持体（例えば、膜、マイクロタイタープレート、試験管、計量棒、ガラス又はプラスチックビーズ）に直接的に結合する。次いで、固定化した試薬は、試料中に存在するいずれのζＰＫＣポリペプチドを捕捉する。固定化したζＰＫＣは、次いで、標識した二次の抗ζＰＫＣ抗体を用いて検出することができる。又は、二次の抗ζＰＫＣ抗体は、二次の抗ζＰＫＣ抗体を認識する標識した二次抗体を用いて検出することができる。
【００３５】
ζＰＫＣ発現及び／又は活性を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法
導入
［００４３］本発明は、関節炎組織のＰＫＣの発現を阻害する新規な化合物（例えば、小分子）を同定するための方法（また、本明細書では「スクリーニングアッセイ」として言及される）を提供する。一態様では、ζＰＫＣ（天然又は組換え的のいずれか）発現する細胞を試験化合物と接触させ、その化合物がζＰＫＣ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチド）の発現を阻害するかどうかを決定し、発現（未処理の細胞の試料と比較した場合）の減少は、化合物が関節炎組織中のζＰＫＣを阻害することを示す。ζＰＫＣ遺伝子産物の変化は、当該技術分野において既知のいずれかの方法によって、又は上述した方法によって決定することができる。好ましい態様では、ＮＦ−κＢ結合部位の下流にマーカー遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ又はグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を含むレポーター構築物でトランスフェクトした細胞を試験化合物と接触させ、細胞をサイトカインで処理した場合、化合物がマーカータンパク質の発現を阻害することができるかどうかを決定する。ζＰＫＣ又はマーカータンパク質の発現を阻害すると同定された化合物は、関節炎の予防及び治療処置の薬物としての候補となる。
【００３６】
［００４４］又は、前述したアッセイを用いてインビトロでζＰＫＣのキナーゼ活性を阻害する化合物を同定することができる。精製した（又は部分精製した）ζＰＫＣを試験化合物と接触させ、化合物が（酵素の未処理の試料と比較した場合）ζＰＫＣのキナーゼ活性を阻害するかどうかを決定する。次いで、ζＰＫＣ活性を阻害する同定した化合物は、関節炎のインビトロ及びインビボモデルで試験することができた。いくつかのインビトロモデルは、下記の実施例に記載される。関節炎のインビボモデルは、限定されないが、イヌ及びウサギでの前方十字靭帯切除モデル、並びにウサギ及びマウスでの部分的半月板切除モデルを含む。ζＰＫＣの活性を直接的及び間接的に測定するための代表的な方法、及びζＰＫＣの活性の阻害を決定するための代表的な方法は、限定されないが、酵素プロテインキナーゼ活性アッセイ（上述される）、軟骨細胞ペレットアッセイ、プロテオグリカン分解を測定するアッセイ、及びＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイを含む。
【００３７】
ζＰＫＣの供給源
［００４５］本発明のスクリーニングアッセイに使用されるべきζＰＫＣ（好ましくは、哺乳動物；より好ましくはヒト（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｑ０５５１３；配列番号：２））は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）、ＰｒｏＱｉｎａｓｅ（Ｆｒｅｉｂｒｕｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＰａｎＶｅｒａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から商業的に利用可能である。又は、ζＰＫＣは、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーのような既知の精製手法を用いて、脳、胎盤、精巣及び肺を含む多種の組織（好ましくは哺乳動物；より好ましくはヒト）から精製し又は部分的に精製することができる。精製はまた、ζＰＫＣに結合する既知の試薬（例えば、抗ζＰＫＣ抗体）を用いたアフィニティークロマトグラフィーを含む。これらの精製手法はまた、組換えの供給源からζＰＫＣを精製するために使用することもできる。
【００３８】
［００４６］ζＰＫＣをコードするポリヌクレオチド（又はその酵素的部分）は、ζＰＫＣの組換え産物に対する適切な発現制御配列に操作的に連結してもよい。ζＰＫＣポリヌクレオチドは、好ましくは哺乳動物の起源（例えば、マウスζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ９４６３２）；ラットζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｊ０４５３２）；ウサギζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ７８７６８））であり、そして、より好ましくはヒト起源（例えば、ヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２７４４；配列番号：１））である。これらの組換えζＰＫＣポリヌクレオチドを発現する一般的方法は、当該技術分野において周知である。
【００３９】
［００４７］いくつかの細胞株は、ζＰＫＣの組換え発現に適した宿主細胞として演じることができる。哺乳動物の宿主細胞株は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、及びＪｕｒｋａｔ細胞、並びに、正常の２倍体の細胞、初代組織のインビトロ培養由来の細胞株、及び初代体外培養片を含む。
【００４０】
［００４８］又は、ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）は、酵母のような下等真核生物、又は原核生物において組換え的に製造してもよい。潜在的に適した酵母株は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シーゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス（Ｋｏｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、及びカンジダ株を含む。潜在的に適した細菌株は、大腸菌、ネズミチフス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びサルモネラ ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。本発明のポリペプチドが酵母又は細菌に生産されるとすれば、機能性を獲得するために、それらを、例えば、適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によってそれらを修飾することが必要であるかもしれない。そのような共有結合は周知の化学的又は酵素的方法を用いて達成してもよい。
【００４１】
［００４９］ ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）はまた、バキュロウイルスベクターのような昆虫発現ベクターを用いて組換え的に生産してもよく、及び昆虫細胞発現システムを使用して製造してもよい。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現システムのための材料と方法は、キットの形体で商業的に利用可能である（例えば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）。
【００４２】
［００５０］精製を容易にするために、ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又はチオレドキン（ＴＲＸ）のようなタンパク質と融合して組換え的に発現してもよい。そのような融合タンパク質の発現と精製のためのキットは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からそれぞれ商業的に利用可能である。ζＰＫＣはまた、小さなエピトープでタグが付けられてもよく、その後、そのエピトープに対する特異的抗体を用いて同定又は精製してもよい。そのようなエピトープの１つはＦＬＡＧエピトープであり、Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から商業的に利用可能である。
【００４３】
［００５１］ζＰＫＣ（又はその酵素的部分）はまた、既知の慣用的な化学合成により製造することができる。ポリペプチドを化学的に合成する方法は、当業者に周知である。そのような化学合成のζＰＫＣは、天然に製造された形態に一致して生物学的性質を所有してなくてはならず、つまり、天然のζＰＫＣに対して生物学的活性又は免疫学的置換体として使用することができる。
【００４４】
試験化合物の供給源及びスクリーニング
［００５２］本発明の試験化合物はいくつかの供給源から入手することができる。例えば、分子のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングのために利用することができる。そのようなライブラリーを用いて、数千の分子を阻害活性についてスクリーニングすることができる。化合物の調製及びスクリーニングは、上述したように又は当業者に周知の他の方法によってスクリーニングされ得る。このように、同定した化合物は、慣用的な「リード化合物」として役立てることができ、又は現在の治療として使用し得る。
【００４５】
処置方法
導入
［００５３］本発明は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性の阻害によって関節炎の治療用の予防及び治療方法の両方を提供する。該方法は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性を阻害するのに有効な量で試薬と細胞（インビトロ、インビボ、又はエクスビボのいずれかで）接触することに関係する。試薬は、ζＰＫＣの発現及び／又は活性を阻害するいずれかの分子であり得て、限定されないが、阻害性ポリヌクレオチド、小分子、阻害性タンパク質生物工学製品、及びペプチド阻害剤を含む。
【００４６】
阻害性ポリヌクレオチド
［００５４］関節炎に悩まされている（又は危険性がある）生物体において、又は、そのような生物体由来の関連した細胞において、ζＰＫＣの発現の減少は、ζＰＫＣ遺伝子から転写したｍＲＮＡに結合し、及び／又はｍＲＮＡを切断する多種の阻害性ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンス・ポリヌクレオチド及びリボザイムの使用を通じて達成することができる（例えば、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１：２５１−５７；Ｓｉｏｕｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：５７５−８８）。
【００４７】
［００５５］本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、ζＰＫＣのコーディング鎖の全体、又はその一部に相補的であり得る。又は、アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、ζＰＫＣのコーディング鎖の非コーディング領域に相補的であり得る。アンチセンス・ポリヌクレオチド又はリボザイムは、当該技術分野において周知な手法を用いる化学合成及び酵素的連結反応を用いて構築することができる。化学的に合成したポリヌクレオチドのヌクレオシド連結は、ヌクレアーゼを介した分解に抵抗する能力を高め、並びに配列特異性を増加するために修飾することができる。そのような連結修飾は、限定されないが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）連結を含む（Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９−１４；Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１５７−７９）。又は、これらの分子は、本発明のポリヌクレオチドがアンチセンス（即ち、リバース）配向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて、生物学的に生産することができる。
【００４８】
［００５６］本発明の阻害性ポリヌクレオチドはまた、二重鎖ＤＮＡの主溝において高い特異性と親和性で結合する三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を含む（Ｋｎａｕｅｒｔ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２４３−５１）。ζＰＫＣ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するζＰＫＣ遺伝子の制御領域（即ち、プロモーター及び／又はエンハンサー配列）に相補的なＴＦＯを標的にすることによって、ζＰＫＣの発現を阻害することができる。
【００４９】
［００５７］好ましい態様において、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。ｓｉＲＮＡ分子は、短く（好ましくは１９−２５ヌクレオチド；最も好ましくは１９又は２１ヌクレオチド）、二重鎖ＲＮＡ分子であり、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を引き起こす。この分解は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知れている（例えば、Ｂａｓｓ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９）。より下等な生物体において元来同定されたＲＮＡｉは、効果的に哺乳動物の細胞に適合し、最近、Ｆａｓ ｍＲＮＡに標的化されたｓｉＲＮＡで処理したマウスにおける急性肝炎を妨げることが示されている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：３４７−５１）。加えて、髄膜に輸送されるｓｉＲＮＡが、ラットにおいて２つのモデル（アゴニスト誘導の痛みモデル及び神経系の痛みモデル）の痛み応答を遮断することが報告されている（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：ｅ４９）。
【００５０】
［００５８］本発明のｓｉＲＮＡ分子は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子（標的ｍＲＮＡの部分に適合するもの）を一緒にアニーリングすることによって（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，５０６，５５９号）、又は必要な二本鎖部分を生じるためにそれ自身で折り返す一本鎖らせんＮＡ分子の使用を通じて発生させる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：６０４７−５２）ことができる。ｓｉＲＮＡ分子は化学的に合成することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８）、又は一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロ転写によって生産することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。又は、ｓｉＲＮＡ分子は、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて、一時的に（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上述； Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５５１５−２０）又は安定に（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１４４３−４８）生物学的に生産することができる。最近、初代ヒト細胞における標的ｍＲＮＡレベルの減少が、効果的であって配列特異的な方法で、らせんＲＮＡを発現し、さらにｓｉＲＮＡ内に処理されるアデノウイルスベクターを用いて示された（Ａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１３：２３２５−３２）。
【００５１】
［００５９］本発明のポリヌクレオチドに標的とされるｓｉＲＮＡ分子は、当該技術分野において周知の基準に基づいて設計され得る（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．２０：６８７７−８８）。例えば、標的ｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくは、ＡＡ（最も好ましい）、ＴＡ、ＧＡ、又はＣＡで開始されるべきであり；ｓｉＲＮＡ分子のＧＣ比は、好ましくは、４５−５５％であるべきであり；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に３つの同じヌクレオチドを含有すべきではなく；ｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、一列に７つの混在したＧ／Ｃを含有すべきではなく；そして、標的セグメントは、好ましくは、標的ＲＮＡのＯＲＦ領域内に存在し、及び、好ましくは、開始ＡＴＧの後に少なくとも７５ｂｐであり、終止コドンの前に少なくとも７５ｂｐで存在すべきである。
【００５２】
小分子
［００６０］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの発現の減少はまた、ζＰＫＣに結合し、その活性を阻害する小分子（通常、有機的小分子）の使用を介して達成されてもよい。ＰＫＣ（好ましくは、異性体特異的）の活性を阻害するものとして既知の小分子は、本発明の治療方法に使用することができる。ＰＫＣを阻害する無数の小分子は、当該技術分野において既知であり（疾患の治療として承認されたもの、並びに臨床試験の他のものを含む）、そして、天然の化合物（例えば、スタウロスポリン）及び人工の化合物（例えば、ＬＹ３３３５３１）の両方を含む（Ｇｏｅｋｊｉａｎ ａｎｄ Ｊｉｒｏｕｓｅｋ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｎｇ．Ｄｒｕｇｓ １０：２１１７−４０； Ｗａｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：１８１−８７に概要され、両者は、本明細書中に援用される）。これらの分子は、直接使用することができ、又は、改良されたＰＫＣ阻害剤（好ましくは、異性体特異的）の開発に向けた出発化合物として役立てることができる。又は、上述されるスクリーニング方法によって同定される新規な小分子（好ましくは、異性体特異的）を使用してもよい。
【００５３】
阻害性タンパク質の生物工学製品
［００６１］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの発現の減少はまた、タンパク質の生物工学製品を使用して達成されてもよい。阻害性タンパク質の生物工学製品は、細胞又は生物体における阻害性生物学的活性を有するタンパク質分子に言及される。本発明の治療方法において使用するための好ましい阻害性タンパク質の生物工学製品は、ζＰＫＣのＰａｒ４及びキナーゼ−欠損優性−陰性（ＤＮ）突然変異形体を含む。Ｐａｒ４は、ζＰＫＣに結合する自然発生のタンパク質であり、その酵素的機能を阻害するために役に立つ（Ｄｉａｚ−Ｍｅｃｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６：７７７−８６）。ζＰＫＣのＤＮ突然変異形体、例えば、リジン２８１のトリプロファンの点突然変異であるζＰＫＣ（Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５５１−５８）は、基質に対して競合させることによって内因性のζＰＫＣの活性を減少し、周知な部位指向的突然変異手法を用いて調製することができる。キナーゼ活性を欠如しているが、まだζＰＫＣを介したシグナル伝達を阻害するζＰＫＣのいずれの変異体もＤＮ突然変異体として使用してもよい。これらの阻害性タンパク質の生物工学製品は、上述した発現手法を用いてインサイチュで細胞（好ましくは、軟骨細胞）において発生してもよい。
【００５４】
ペプチド阻害剤
［００６２］関節炎を患っている（又はその危険性にある）生物体における、又はそのような生物体由来の関連する細胞におけるζＰＫＣの活性の減少はまた、ζＰＫＣに結合し、そしてその活性を阻害するペプチド阻害剤を使用して達成されてもよい。ペプチド阻害剤は、ζＰＫＣの基質との相互作用からζＰＫＣを妨げるペプチド擬似基質、並びにζＰＫＣ又はその基質のいずれかに結合し、そして、ζＰＫＣを介したリン酸化を遮断するペプチドを含む。ζＰＫＣを阻害するペプチド阻害剤は、文献に知られ、そして、ＳＩＹＲＲＧＡＲＲＷＲＫＬ（配列番号：３）、ＳＩＹＲＲＧＡＲＲＷＲＫＬＹＲＡＮ（配列番号：４）、及びＲＲＧＡＲＲＷＲＫ（配列番号：５）を含む（例えば、Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上述；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，上述）。好ましくは、これらのペプチド阻害剤は、ミリストイル化され（それぞれ、配列番号：６、７、及び８）、細胞浸透性を改善する（例えば、Ｓｔａｎｄａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，上述；配列番号：６に対して）。ミリストイル化及び非ミリストイル化ζＰＫＣペプチド阻害剤は、化学的に合成され、商業的に、例えば、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）及びＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）から入手することができる。誰でも、上述した手法を用いて、インビトロ、インビボ、又はエクスビボでペプチド阻害剤で細胞（好ましくは、軟骨細胞）を提供することができる。
【００５５】
投与
［００６３］本明細書に記載される化合物のいずれも（好ましくは、小分子）は、関節炎の治療のための医薬組成物の形体でインビボで投与することができる。医薬組成物は、限定されないが、経口、鼻腔、直腸、局部、舌下、静脈、筋肉、動脈、骨髄、髄膜、心室、腹膜、又は経皮経路を含むいずれかの複数の経路によって投与してもよい。活性成分に加えて、医薬組成物は、当該技術分野において既知の賦形剤、被服剤、及び補助剤を含む薬学的に許容可能な担体を含有してもよい。
【００５６】
［００６４］いずれの化合物についても、治療的に有効な投与量は、細胞培養又は動物モデルのいずれかにおいて初期に見積もることは可能である。治療的に有効な投与量は、状態やその症状を改善する活性成分の量を意味する。細胞培養又は動物モデルにおける治療的な有効性及び毒性は、標準の医薬手法によって決定することができる（例えば、ＥＤ５０：母集団の５０％において治療的に有効な量；ＬＤ５０：母集団の５０％の致死量）。治療効果と毒性効果との間の投与量の比は、治療指標となり、そして、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表現され得る。大きな治療指標を提示する医薬組成物が好ましい。
【００５７】
［００６５］細胞培養及び動物モデルから得られたデータは、次いで、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおいて使用するための化合物の投与量範囲を明確にするために使用され得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む濃度範囲内である。投与量は、使用される組成物形体及び利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化することができる。
【実施例】
【００５８】
実施例
［００６６］下記は、本発明の理解を手助けするために説明する実施例は、いずれの方法においてもその範囲を限定するためのものではなく、構築されるべきではない。実施例は、慣用的な方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、そのようなベクター及びプラスミドの宿主細胞への導入、又は宿主細胞においてそのようなベクター及びプラスミドからのポリペプチドの発現において使用される方法の詳細な記載は含まない。そのような方法、及び他の慣用的な方法は、当業者に周知である。
【００５９】
実施例１
ζＰＫＣ発現は関節炎において上方制御される
実施例１．１ 実験設計
［００６７］関節炎の関節軟骨と正常な関節軟骨との間に示差的に発現する転写物を同定するために、最終的に膝関節の置換をしている関節炎の患者及び非関節炎の切断手術を受けたヒトから組織試料を得た。関節炎の有無は組織学によって確かめた。
【００６０】
実施例１．２ オリゴヌクレオチドアレイ・ハイブリダイゼーション
［００６８］発現プロファイリングには、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ９５Ａｖ２（ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を使用した。ヒトゲノム由来のＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップは約１２，０００の本来の全長配列（約１６プローブ対／配列）を表す２５マーのオリゴヌクレオチドプローブを含有する。標的配列に完全に相補的になるように設計した各プローブについては、中心において単一の塩基ミスマッチを除いて同一であるパートナープローブを生じる。これらのプローブ対は、シグナルの定量と非特異的なノイズの控除を可能にする。
【００６１】
［００６９］ＲＮＡは、個人の関節軟骨組織から抽出し、ビオチン化ｃＲＮＡに変換し、そして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールに従って断片化した。断片化したｃＲＮＡを１００μｇ／ｍｌのニシンの精子ＤＮＡ及び５００μｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡを含有する１×ＭＥＳ緩衝液で希釈し、９９℃で５分間変性し、すぐに５分間、４５℃にした。不溶性の物質を短い遠心によってハイブリダイゼーション混合物から除去し、ハイブリダイゼーション混合物を各アレイに添加し、６０ｒｐｍで連続的な回転で１６時間４５℃でインキュベートした。インキュベーション後、ハイブリダイゼーション混合物を除去し、６×ＳＳＰＥＴでチップを過剰に洗浄し、そして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコールに記載されるようにＳＡＰＥ溶液で染色した。
【００６２】
実施例１．３ オリゴヌクレオチドアレイデータ解析
［００７０］各転写物の生の蛍光強度値をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒを用いて６ｍｍの分解度で測定した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア３．２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は、遺伝子が「存在」又は「不在」であるかを決定するために、並びにアレイ上の各遺伝子の特異的ハイブリダイゼーション強度値又は「平均差」を決定するためにアルゴリズムを使用し、蛍光データを評価するために使用した。各遺伝子の平均差は、Ｈｉｌｌら（（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：８０９−１２）の手法に従って、各ハイブリダイゼーション混合物にスパイクした既知存在量の１１個の対照転写物の平均差を参照して頻度値に標準化した。各遺伝子の頻度を計算し、その頻度は、１０６の全転写物あたりの個々の遺伝子転写物の全体数に等しい値を表す。
【００６３】
［００７１］各転写物の頻度を評価し、そして、転写物を以下の３つの基準を満たすかの研究に含めた。第一に、関節炎の軟骨及び正常な軟骨の両方に関する少なくとも１つのアレイにおけるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）によって「存在」と呼ばれる転写物は、解析に含めた。第二に、関節炎の軟骨と正常な軟骨との間の比較のために、ｔ−テストを採用し、頻度値における有意な（ｐ＜０．０５）増加又は減少を有する一組の転写物のを同定した。第三に、統計学的に有意な一組の転写物の全体に渡って頻度値における平均倍率の変化は、２．４倍か又はそれ以上であることが要求された。これらの基準は、アレイ内の再先産性を見積もる複製実験に基づいて確立された。
【００６４】
［００７２］これらの基準に基づいて、関節炎の関節及び正常な関節の軟骨に示差的に発現した６０２個の転写物を同定した。同定されたそのような転写物の１つがζＰＫＣであった。
【００６５】
実施例２
ζＰＫＣ活性の阻害は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の減少を阻害する
実施泳２．１ 初代ウシ軟骨細胞の単離と培養
［００７３］十分に太いウシの関節軟骨スライスを無菌状態で切り出し、ＰＢＳで４回リンスし、そして、プロナーゼ及びコラゲナーゼ消化（血清なしでＤＭＥ中、３７℃で、１ｍｇ／ｍｌプロナーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）３０分間、及び１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）一晩）に供して、軟骨の細胞外マトリックスに包埋した軟骨細胞を単離した。消化物を７０ミクロンのＦａｌｃｏｎ（商標）細胞ろ過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通してろ過し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥで２回洗浄した。典型的には、２−４×１０８細胞をウシ中手指節関節表面から得た。細胞を単層で６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。ペレット培養については、細胞を１×１０６細胞／ｍｌで増殖培地［ＨＬ−１培地（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ペニシリン＋ストレプトマイシン、グルタミン、５０μｇ／ｍｌアルコルビン酸、及び１０％ＦＢＳ］中に再懸濁し、そして、細胞１ｍｌのアリコートを１５ｍｌの無菌のＦａｌｃｏｎ遠心管に移した。細胞を４℃で５分間、２００×ｇで遠心し、得られた細胞ペレットを前述したように培養した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３５５７−６５）。細胞培養液を回収し、コラーゲン及びプロテオグリカンアッセイ用に保存し、そして、細胞を３−４日毎に新鮮な培地（３ｍｌ／ウェル、１ｍｌ／管）で再供給した。ペレット培養は、３週間維持し、その時にペレットを集め、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）染色アッセイ用に０．５ｍｌの３００μｇ／ｍｌパパインで消化するか、又は組織学のために調製した。
【００６６】
実施例２．２ ＮＦ−κＢのペプチド遮断剤はＴＮＦ−又はＩＬ−２を介したプロテオグリカン分解を阻害することができる
［００７４］ＮＦ−κＢ活性を遮断することが、出願人の培養系においてプロテオグリカン分解を阻害できることを示すために、初代ウシ軟骨細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１の存在若しくは不存在において、３００μｇ／ｍｌの濃度で４日間、ＮＦ−κＢ遮断剤ＳＮ５０とともに培養した。細胞をＴＮＦ又はＩＬ−１のいずれかの添加前に３時間、阻害剤とともにインキュベートした。ＳＮ５０は、脂質二重層を横切る輸送を促進するための一続きの疎水性アミノ酸に結合したＮＦ−κＢの核局在シグナルを含有するペプチドである（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５−５８）。ＳＮ５０Ｍは、陰性対照として使用され、ＮＦ−κＢを遮断する活性を止めるアミノ酸変化を有する同じペプチドである。ＳＮ５０及びＳＮ５０Ｍは、例えば、Ｂｉｏｍｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から利用することができる。
【００６７】
［００７５］図２に示すように、ＳＮ５０Ｍは、培養液中へのプロテオグリカン放出及び細胞ペレットにおける回復の減少により測定されるように、ウシ軟骨細胞におけるＴＮＦ及びＩＬ−１を介したプロテオグリカン分解を妨げることに有効ではなかった。対象的に、ＳＮ５０は、プロテオグリカンのサイトカインを介した分解を完全に阻害した。加えて、ＳＮ５０でさえ、ＳＮ５０Ｍと比較した場合、サイトカイン処理がない場合にプロテオグリカン分解を妨げた。これらの結果は、サイトカインを介したコラゲナーゼ及びアグリカナーゼの合成を調節する遮断ＮＦ−κＢは、初代ウシ軟骨細胞におけるプロテオグリカン減少を分解することを示す。
【００６８】
実施例２．３ ζＰＫＣ阻害剤はＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を遮断する
［００７６］ζＰＫＣ阻害剤がＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を阻害することができるかどうかを決定するために、初代ウシ軟骨細胞を、（１）ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質［本明細書では「２０８９」と称する；組織内での合成；配列番号：６に均等；例えば、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）］、又は（２）小分子阻害剤Ｒｏ−３１−８２２０（Ｓｉｇｍａ−ＲＢＩ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）と伴に、又は伴わずに５日間、ＴＮＦの様々な濃度で培養した。阻害剤はＴＮＦを添加する前に３時間添加した。
【００６９】
［００７７］図３に示されるように、１０及び１００ｎｇ／ｍｌＴＮＦは、培養液へのプロテオグリカン放出及び細胞ペレットにおける回復の減少により測定されるように、有意なプロテオグリカン分解を引き起こした。このプロテオグリカン分解は、５０μＭの２０８９及び１０μＭのＲｏ−３１−８２２０（ＲＯ３１）の両方によって有意に阻害した。加えて、これらの化合物は、ＴＮＦの不在でさえもプロテオグリカン分解を阻害し、プロテアーゼの構築レベルの遮断を示唆した。５μＭの濃度のＲｏ−３１−８２２０は、プロテオグリカン減少の妨げで相対的に効果がなかった。これらの結果は、２０８９及びＲｏ−３１−８０２２の両者が初代軟骨細胞の細胞膜を貫通し、ＴＮＦを介したプロテオグリカン分解を効果的に遮断することを示す。軟骨細胞のトリパンブルー染色及び初代培養でのラクテートアッセイは、結果についての可能な説明として、細胞毒性を排除するために実行した。これらの実験は、化合物がこれらの実験において使用した投与量でかなりの細胞毒性を引き起こさないことを確実にした。加えて、対照のペプチドを合成し、同じアッセイ系で試験して、非特異的な効果が観察された結果を引き起こす可能性を解決するために試験した。擬似基質ペプチドの非ミリストイル化バージョン、並びに、擬似基質ペプチドとして同じアミノ酸成分を含有する「スクランブルした対照」は、スクランブルした配列を有しており、試験され、両者は、プロテオグリカン分解を遮断する点で非効果的であることを見出した。
【００７０】
実施例２．４ ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質２０８９は投与量に依存する方法でＴＮＦ−及びＩＬ−１を介したプロテオグリカン分解を遮断する
［００７８］ミリストイル化ζＰＫＣペプチド擬似基質２０８９が投与量に依存する方法でサイトカインを介したプロテオグリカン分解を阻害するかどうかを決定するために、初代ウシ軟骨細胞を様々な濃度の２０８９を添加した後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１のいずれかで４日間培養した。
【００７１】
［００７９］図４に示すように、２０８９は、投与量に依存した方法でＴＮＦ又はＩＬ−１の両方を介したプロテオグリカン分解を阻害し、最大の投与量（１００μＭ）は培養液中へのプロテオグリカン放出を完全に阻害した。また、プロテオグリカンの増加した細胞ペレット保持、及び培養液中へのプロテオグリカンの放出の減少は、サイトカイン不在でさえ２０８９で達成された。累積的に、これらの結果は、軟骨細胞におけるζＰＫＣの阻害がサイトカインを介したプロテオグリカンの酵素分解的な分解を阻害することを示す。これは、ζＰＫＣのノックアウトマウスが非常に良性表現型を有する（Ｌｅｉｔｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，上述）という事実を伴って、ζＰＫＣの阻害は、関節炎並びに他の炎症性疾患の安全で効果的な治療となり得ることを示す。
【００７２】
実施例３
ζＰＫＣ ｍＲＮＡはヒト骨関節炎（ＯＡ）の軟骨において上方制御される
［００８０］骨関節炎（ＯＡ）患者由来のヒト関節の軟骨に関する転写プロファイリングデータが、ヒト非ＯＡ軟骨と比較して、ζＰＫＣ ｍＲＮＡにおいて統計的に有意な増加を示した。図５のパネルＡでは、ＲＮＡは、臨床試料の凍結粉砕した関節軟骨から抽出し、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２チップを用いてプロファイリング解析を表すようにした。これらのグループを解析した：正常（非ＯＡ）軟骨［１３試料］；重症ＯＡ軟骨（非障害領域）［２９試料］；及び重症ＯＡ軟骨（障害領域）［２６試料］。ζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルは、正常な試料と比較して、重症のＯＡ試料において評価した。図５のパネルＢでは、同じ一連の試料のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｑ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）解析は、正常な試料と比較して、重症のＯＡ試料におけるζＰＫＣ ｍＲＮＡの非常に高いζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示した；ＴａｑＭａｎ（登録商標）プロトコールは製品取扱説明書に従って行った。
【００７３】
実勢例４
ζＰＫＣタンパク質は軟骨細胞において発現する
［００８１］抗ζＰＫＣ抗体（ｎＰＫＣζ（Ｃ−２０）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用して、軟骨細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞におけるζＰＫＣタンパク質の産生を比較した。ウシ軟骨細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（ヒト細胞株）の溶解物を同様の方法によって調製した：細胞を冷却したリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、すぐにホスファターゼ阻害剤を含有する細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に置いた。細胞を氷上で５分間インキュベートし、次いで、４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心した。試料を還元条件下で１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動におって分析した。ウェスタンブロットは、軟骨細胞が十分量のζＰＫＣタンパク質を発現したことを示した；同じブロットは、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるζＰＫＣタンパク質の明確に感知できる発現は示さなかった。
【００７４】
実施例５
アデノウイルスを介したζＰＫＣの発現はプロテオグリカン分解を増加する
［００８２］初代ウシ軟骨細胞を単離して、実施例２．１において上述したように（ペレット形式で）培養した。アデノウイルスの添加前に（１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ管で）２％ＦＢＳを含有する増殖培地（ＨＬ−１）０．５ｍｌ中で細胞を培養した。ζＰＫＣ又はＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）を含有するアデノウイルスベクターを調製し（Ａｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：２２４５−５３）、そして、軟骨細胞の培養物に単離後ペレットにする前にすぐに感染させた。ＧＦＰ又はζＰＫＣを発現するアデノウイルスは、５０００の感染の多重度（ＭＯＩ）で培養物中に直接加えた。図６のパネルＡに見られるように、培養物（サイトカインを添加していない）中の初代ウシ軟骨細胞における全長のζＰＫＣの過剰発現は、ＧＦＰの過剰発現と比較した場合、プロテオグリカンの分解（軟骨細胞のペレットアッセイにおける培養液中に放出されるプロテオグリカンにより測定されるように）において、中くらいであるが統計学的に有意な増加に帰着した。１０％ＦＢＳを含有する培養液を３７℃で（５％ＣＯ２の湿気雰囲気下で）２時間インキュベーション後に培養物に添加した。血清組成物は、３日毎に徐々に減少させ（軟骨細胞ペレットを毎回供給して連続的に５％、２．５％にし、そして最終的には０％（血清なし）にする）、血清から細胞を遠ざけた。培養液中に放出されたプロテオグリカンは、２５日に渡って放出された全プロテオグリカンを表す。
【００７５】
［００８３］図６のパネルＢでは、細胞を血清から遠ざけた後、サイトカインの添加の有無で、４日間に渡る培養液中のプロテオグリカンを測定した。次善最適のＴＮＦαの添加は、ＧＦＰの過剰発現又はアデノウイルス感染なしと比較した場合、ζＰＫＣの過剰発現に反応して培養液中に放出したプロテオグリカンの量を増大させた（図６、パネルＢ）。
【００７６】
実施例６
ζＰＫＣは軟骨細胞におけるＴＮＦαを介したプロテオグリカン放出に原因する
［００８４］関節炎のウシ軟骨細胞は、ペレットアッセイのために前述したように調製した。図７に示すように、軟骨細胞ペレットアッセイにおける同じ培養物にＴＮＦαを添加した（１００ｎｇ／ｍｌ；＊で標識したバー）。２つの阻害剤は、異なる投与量で添加した。１つの阻害剤、ビスインドリルマレミド（ＢＩＳ）は、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤であり、ζＰＫＣを含む、ＰＫＣの全ての異性体の活性を遮断すると報告されている（例えば、Ｔｏｕｌｌｅｃ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１５７７１−８１）。他の阻害剤、塩化ケレリスリン（ＣＣ）は、ホルボールエステル結合部位の競合阻害剤である。ＣＣは、伝統的な及び新規なＰＫＣファミリーのメンバーのホルボールエステル結合ドメインに対して競合し、それらを阻害する；しかしながら、典型的でないＰＫＣ（例えば、ζＰＫＣ；Ｃａ＋＋依存性であり、しかもジアクリルグリセロール非依存性であるＰＫＣ）はこの結合ドメインを欠如しているので、ＣＣによっては阻害されない（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２：９９３−９９）。軟骨細胞ペレットアッセイにおける培養液中へのサイトカイン（ＴＮＦα）を介したプロテオグリカンの放出は、ＢＩＳ（２０−４０μＭで）によって遮断されたが、ＣＣによっては遮断されず（図７）、ζＰＫＣの選択的阻害がサイトカインを介したプロテオグリカン減少を遮断することを示した。
【００７７】
実施例７
ζＰＫＣは軟骨細胞におけるＮＦ−κＢのＴＮＦα誘導の活性の原因となる
［００８５］ＮＦ−κＢ応答エレメントの制御下でルシフェラーゼレポート遺伝子を導入した不死化ヒト軟骨細胞株（Ｃ２８／Ｉ２；例えば、Ｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：３３９５−４０３；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：２３０７−１６）におけるＮＦ−κＢの活性を測定した。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２で細胞を培養した；細胞を９６ウェルに撒き（１×１０５細胞／ウェル）、アッセイ前に２４時間、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ構築物（１００ＭＯＩ）を発現するアデノウイルスで感染した。軟骨細胞をＴＮＦの添加前２時間、無血清培地で阻害剤とともにインキュベートした。図８に示すように、ＴＮＦαを軟骨細胞ペレットアッセイにおけるいくつかの培養物に添加した（１ｎｇ／ｍｌ又は１０ｎｇ／ｍｌ）。ＢＩＳ（２０μＭ）、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤をいくつかの培養物に添加し、そして、ＣＣ（８μＭ）、ＰＫＣのいくつかの形体でのホルボールエステル結合部位の競合阻害剤（しかし、典型的でないＰＫＣ、例えばζＰＫＣ）を他の培養物に添加した。サイトカイン（ＴＮＦα）を介したＮＦ−κＢの活性はＢＩＳによって遮断されたが、ＣＣによっては遮断されず、ζＰＫＣの選択的阻害がサイトカインを介したＮＦ−κＢの活性を遮断することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１−１】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−２】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−３】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−４】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−５】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図１−６】［００１６］図１は、ＲＮＡｉにおいて使用するためのヒトζＰＫＣ ｍＲＮＡに標的とされる好ましいｓｉＲＮＡ分子群を示す。ζＰＫＣ転写物の標的セグメント［配列番号：９−２０；４５−５９；９０−１０９；及び１５０−１５４］は、それらの最初の２つのヌクレオチド（ＡＡ、ＣＡ、ＧＡ、又はＴＡ）に従ってグループ化され、５’→３’配向に示される。「ＧＣ比」は各標的セグメントにおける全体のＧ＋Ｃヌクレオチドのパーセントを意味する；「位置」は、各標的セグメントの始まりを即座に先導するヒトζＰＫＣ ｃＤＮＡ（配列番号：１）におけるヌクレオチド位置を意味する。好ましいｓｉＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ二重鎖）は、図の右側に示される。各ｓｉＲＮＡ二重鎖に対するセンス鎖［配列番号：２１−３２；６０−７４；１１０−１２９；及び１５５−１５９］は、５’→３’配向で示される；対応するアンチセンス鎖［配列番号：３３−４４；７５−８９；１３０−１４９；及び１６０−１６４］は、３’→５’配向で示される。例えば、図に表示される第一の標的セグメントに指向するｓｉＲＮＡ分子は、同定されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（即ち、それぞれ、配列番号：２１及び配列番号：３３）のｓｉＲＮＡ二重鎖である。
【図２】［００１７］図２は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−又はＩＬ−１−仲介のプロテオグリカン分解におけるＮＦ−κＢ遮断剤ＳＮ５０（３００μｇ／ｍｌ）、又はその不活性な類似体ＳＮ５０Ｍ（３００μｇ／ｍｌ）の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図３】［００１８］図３は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−仲介のプロテオグリカン分解におけるミリスチン化ζＰＫＣの擬似基質ペプチド（２０８９）又はＰＫＣ小分子阻害剤Ｒｏ−３１−８２２０（ＲＯ３１）の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図４】［００１９］図４は、初代ウシ軟骨細胞培養において、ＴＮＦ−又はＩＬ−１−仲介のプロテオグリカン分解におけるミリスチン化ζＰＫＣの擬似基質ペプチド（２０８９）の投与量依存の効果を描写したグラフである。上段のパネルは、培養液中に放出されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／０．５ｍｌ）；下段のパネルは、細胞ペレットに保持されたプロテオグリカン成分を示す（μｇ／ｍｌ）。
【図５】［００２０］図５は、ヒト骨関節炎の関節軟骨において、ζＰＫＣが上方制御されることを示す。パネルＡは、ＨＧ−Ｕ９５Ａｖ２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いたζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示す；パネルＢは、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析を用いたζＰＫＣ ｍＲＮＡレベルを示す。
【図６】［００２１］図６は、ζＰＫＣのアデノウイルスを介した発現がプロテオグリカン分解を増加することを示す。パネルＡは、ζＰＫＣ及びＧＦＰの過剰発現に応答した軟骨細胞ペレットアッセイにおいて、培養液中に放出したプロテオグリカンを示す；パネルＢは、サイトカインＴＮＦαの最適下限レベルでの刺激効果を示す。
【図７】［００２２］図７は、ζＰＫＣが関節の軟骨細胞におけるＴＮＦαを介したプロテオグリカンの放出の原因となることを示す。ＴＮＦαを軟骨細胞ペレットアッセイにおけるいくつかの培養系に添加した（１００ｎｇ／ｍｌ；＊で記される）。２つの阻害剤は、様々な投与量で添加した：ビスインドリルマレイミド（ＢＩＳ）、ｐａｎ−ＰＫＣ阻害剤；及び塩化ケレリスリン（ＣＣ）、ζＰＫＣを阻害しない部位に結合するホルボールの競合阻害剤。培養液中へのプロテオグリカン放出は、μｇ／ｍｌとしてｙ軸上に示される。
【図８】［００２３］図８は、ＴＮＦα誘導のＮＦ−κＢの活性のおける阻害剤ＢＩＳ及びＣＣの効果を示す。ＮＦ−κＢの活性は、ＮＦ−κＢ応答要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子が導入された不死化したヒト軟骨細胞株において測定した；活性（即ち、ｙ軸上のユニット）は「相対的ルシフェラーゼ活性」として表現される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における関節炎の診断に使用する方法であって、下記の工程：
患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
前記試験量と対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する
ことを含み、
それにより、試験量が正常量よりも大きいという所見が、関節炎の診断に陽性の指示を与える、前記方法。
【請求項２】
試料が軟骨細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者における関節炎の予測に使用する方法であって、下記の工程：
患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
前記試験量と対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する
ことを含み、
それにより、試験量と予測量との比較が関節炎の予測の指示を与える、前記方法。
【請求項６】
試料が軟骨細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
患者における関節炎の経過の監視に使用する方法であって、下記の工程：
一回目に患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出し；
二回目以降に、患者からの試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出し；そして
第一試験量と第二試験量とを比較する
ことを含み、
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の増加が関節炎の進行を指示し、及び
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が関節炎の鎮静を指示する、前記方法。
【請求項１０】
試料が軟骨細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
患者における関節炎の治療の効果を評価する方法であって、下記の工程：
治療前の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出し；
治療後の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出し；そして
第一試験量と第二試験量とを比較する
ことを含み、
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が、関節炎の治療に効果的であることを示す、前記方法。
【請求項１４】
試料が軟骨細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
等量のζＰＫＣを含有する第一試料及び第二試料を提供し；
第一試料と該化合物を接触させ；そして
第一試料中のζＰＫＣの活性が化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣの活性に関連して減少するかどうかを決定する
ことを含み、
それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣの活性の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す、前記方法。
【請求項１８】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が小分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ζＰＫＣの活性が酵素プロテインキナーゼアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ζＰＫＣの活性が軟骨細胞ペレットアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ζＰＫＣの活性がプロテオグリカンの分解を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ζＰＫＣの活性がＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
ζＰＫＣを発現する細胞を等量含有する第一試料及び第二試料を提供し；
第一試料を化合物と接触し；そして
第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現が、化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現に関連して減少するかを決定する
ことを含み、
それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子の発現の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す、前記方法。
【請求項２５】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣ遺伝子産物の発現を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が小分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現が酵素プロテインキナーゼアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現が軟骨細胞ペレットアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現がプロテオグリカンの分解を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現がＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
患者におけるζＰＫＣの活性を阻害する化合物を患者に投与することを含む、患者における関節炎を治療する方法。
【請求項３２】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物がアンチセンス・ポリヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
化合物が小分子量である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物がｓｉＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を患者に投与することを含む、患者における関節炎を治療する方法。
【請求項３８】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの発現を阻害する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
化合物がアンチセンス・ポリヌクレオチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
化合物が小分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
化合物がｓｉＲＮＡ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ζＰＫＣの発現又は活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４４】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項４３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１】
患者における関節炎の診断に使用する方法であって、下記の工程：
患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
前記試験量と対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する
ことを含み、
それにより、試験量が正常量よりも大きいという所見が、関節炎の診断に陽性の指示を与える、前記方法。
【請求項２】
試料が軟骨細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者における関節炎の予測に使用する方法であって、下記の工程：
患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の試験量を検出し；そして
前記試験量と対照試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の正常量とを比較する
ことを含み、
それにより、試験量と予測量との比較が関節炎の予測の指示を与える、前記方法。
【請求項６】
試料が軟骨細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
患者における関節炎の経過の監視に使用する方法であって、下記の工程：
一回目に患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出し；
二回目以降に、患者からの試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出し；そして
第一試験量と第二試験量とを比較する
ことを含み、
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の増加が関節炎の進行を指示し、及び
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が関節炎の鎮静を指示する、前記方法。
【請求項１０】
試料が軟骨細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
患者における関節炎の治療の効果を評価する方法であって、下記の工程：
治療前の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第一試験量を検出し；
治療後の患者の試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の第二試験量を検出し；そして
第一試験量と第二試験量とを比較する
ことを含み、
それにより、第一試験量と比較した場合、第二試験量におけるζＰＫＣ遺伝子産物量の減少が、関節炎の治療に効果的であることを示す、前記方法。
【請求項１４】
試料が軟骨細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ζＰＫＣ遺伝子産物がＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ζＰＫＣ遺伝子産物がζＰＫＣポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
等量のζＰＫＣを含有する第一試料及び第二試料を提供し；
第一試料と該化合物を接触させ；そして
第一試料中のζＰＫＣの活性が化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣの活性に関連して減少するかどうかを決定する
ことを含み、
それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣの活性の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す、前記方法。
【請求項１８】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が小分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ζＰＫＣの活性が酵素プロテインキナーゼアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
ζＰＫＣの活性が軟骨細胞ペレットアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ζＰＫＣの活性がプロテオグリカンの分解を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ζＰＫＣの活性がＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
患者における関節炎を阻害することができる化合物をスクリーニングする方法であって、下記の工程：
ζＰＫＣを発現する細胞を等量含有する第一試料及び第二試料を提供し；
第一試料を化合物と接触し；そして
第一試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現が、化合物と接触していない第二試料中のζＰＫＣ遺伝子産物の発現に関連して減少するかを決定する
ことを含み、
それにより、第二試料と比較した場合、第一試料中のζＰＫＣ遺伝子の発現の減少が、化合物が患者における関節炎を阻害することを示す、前記方法。
【請求項２５】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣ遺伝子産物の発現を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が小分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現が酵素プロテインキナーゼアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現が軟骨細胞ペレットアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現がプロテオグリカンの分解を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ζＰＫＣ遺伝子産物の発現がＮＦ−κＢ活性を測定するアッセイの使用によって決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
患者におけるζＰＫＣの活性を阻害する化合物を患者に投与することを含む、患者における関節炎を治療する方法。
【請求項３２】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの活性を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
化合物がアンチセンス・ポリヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
化合物が小分子量である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化合物がｓｉＲＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者におけるζＰＫＣの発現を阻害する化合物を患者に投与することを含む、患者における関節炎を治療する方法。
【請求項３８】
化合物が軟骨細胞におけるζＰＫＣの発現を阻害する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
化合物がアンチセンス・ポリヌクレオチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
化合物が小分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
化合物がｓｉＲＮＡ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ζＰＫＣの発現又は活性を阻害するｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４４】
ｓｉＲＮＡ分子が図１に示されるｓｉＲＮＡ分子群からなる群から選択される、請求項４３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１−２】
【図１−３】
【図１−４】
【図１−５】
【図１−６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５１５９４０（Ｐ２００７−５１５９４０Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２９６３（Ｐ２００６−５３２９６３）
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４７５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４２１７
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（３０２０４２２０９）ワイス (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４７５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４２１７
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（３０２０４２２０９）ワイス (7)
【Ｆターム（参考）】
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