陰イオン性界面活性剤の検出
本明細書に陰イオン性界面活性剤の検出および/または定量化のための方法を開示する。また、本明細書に、環境保護に関して導き出されるサンプルのようなサンプル中の陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために、開示した方法を利用する試験キットも開示する。若干の特定の具体化において、本方法および試験キットを、数ある中でも、陰イオン性界面活性剤が含有される水性膜形成泡を検出するのに用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張 この国際特許出願は、２００７年１０月９日付け出願のオーストラリア国仮特許出願２００７９０５５２９について優先権を主張し、その内容をここに参照することによって組み込む。
【０００２】
技術的分野 本明細書において、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のための方法を開示する。また、環境保護に関して導き出されるサンプル（試料）のようなサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために、開示した方法を利用する試験キットも本明細書において開示する。若干の特定の具体化において、本方法および試験キットは、数ある中でも、陰イオン性界面活性剤を含む水性膜形成泡を検出するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
背景 界面活性剤は、関心を増しつつある一群の有機化合物である。それらは、１年につき９．８６×１０９ｋｇを上回る世界的な生産により世界中で広く使用される一群の化学物質である。界面活性剤は、世界中の家庭において、洗浄剤および洗剤において、殺虫剤、セメントおよびコンクリート産業における可塑剤、鉱業、製薬および他の多くの製品の製造を含む産業上の適用において、日常的に大量に使用されている。
【０００４】
陰イオン性界面活性剤は、洗剤の中に用いられる界面活性剤の主要なクラス（部類）である。直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）は、最も広く用いられている陰イオン性界面活性剤であると発表されている。廃水処理設備は、洗浄目的のための、および他の供給源からの洗剤の大量使用のために、著しい量の陰イオン性界面活性剤を受け取る。大部分の界面活性剤は慣習的な廃水処理によって排除することが可能であるが、生分解性が低い若干の界面活性剤もあり、また他には、望ましくない生分解生成物が形成され、そして流出物と共に表流水に放出される。これらの化学物質を環境中に導入することについてのもう１つのルートには、農業においての汚水スラッジ（汚泥）の肥料としての使用が含まれる。界面活性剤は周囲の土壌に浸出することがあり、そして地下水および表流水にまで運搬される。
【０００５】
特殊な界面活性剤の１つの特定のクラス、フッ素化（フッ素系）界面活性剤は、それらを消防の適用に特に良好に適したものにする特性をもつ。ＰＦＯＳ（ペルフルオロオクタンスルホナートＣ８Ｆ１７ＳＯ３-）およびＰＦＯＡ（ペルフルオロオクタン酸Ｃ７Ｆ１５ＣＯ２Ｈ）は、普通に用いられる２種類のフッ素化界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ヒト血液、水、土壌、堆積物、空気、および生物相のサンプル中において検出されている。これらの化合物は、世界的に分布し、持続性であり、そして生物濃縮性であることが見出された。
【０００６】
環境において陰イオン性界面活性剤汚染が検出できるために、陰イオン性界面活性剤の検出用の様々なアッセイ（検定）が開発されてきた。
【０００７】
メチレンブルー活性物質（ＭＢＡＳ）アッセイは、水中の陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために使用する、現行基準の比色試験である。水サンプルを酸性にし、３ｍＬのクロロホルムおよびメチレンブルー溶液を加え、そしてサンプルをかくはんする。ＭＢＡＳアッセイにおいて、陰イオン性界面活性剤は陽イオン性染料と複合体（錯体）を形成する。陰イオン性界面活性剤の濃度が高いほど、より一層多くの染料が取り込まれ、そしてより大きな比色変化を生ずる。方法の感度のために、ＬＡＳを、陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために用い、そして濃度をＬＡＳ相当物において報告する。ＭＢＡＳアッセイは、０．０２５ｍｇ／Ｌという発表された検出限界をもつ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この方法は広く使用されている一方、アッセイの使用は、それがヒトの発がん性物質として疑われているクロロホルムを抽出溶媒として使用するため、問題を有している。このように、陰イオン性界面活性剤の検出のための改良されたアッセイが必要とされている。そのようなアッセイは、発がん性が疑われている溶媒である、クロロホルムの使用が排除されることが望ましい。また、環境サンプル中の陰イオン性界面活性剤の迅速な検出のために、改良したアッセイがその分野における使用に適していたら望ましいであろう。
【０００９】
本明細書中のいかなる先行技術への言及も、この先行技術がいかなる国においても共通の一般知識の一部を形成するという自認、または何らかの形態の示唆として受けとられることはなく、またそのように解されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の概略 本発明は、一部分において、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のための方法およびキットに基づく。
【００１１】
第１の見地において、この発明はサンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法を提供し、本方法は、すなわち
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択（優先）的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む。
【００１２】
１種の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が包含される。
【００１３】
さらなる具体化において、溶媒には、酢酸エチルが包含される。
【００１４】
少なくとも若干の具体化において、開示した方法は、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために、メチレンブルー活性物質（ＭＢＡＳ）アッセイのような標準的な陰イオン性界面活性剤検出方法を超えた、増大した感度および分解能（解像度）を提供することが確認された。
【００１５】
さらにまた、開示した方法の少なくとも若干の具体化は、特に陰イオン性界面活性剤のためのフィールドベース（現場ベース）のアッセイに適する。
【００１６】
第２の見地では、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するためのキットを提供し、キットは、すなわち
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
本発明の第１の見地に従った方法を実行するための指示
を含む。
【００１７】
本明細書において開示した方法およびキットは、任意の適切な陰イオン性界面活性剤を検出するために用いることができる。しかしながら、若干の特定の具体化において、本方法およびキットは、水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分および／またはフッ素化陰イオン性界面活性剤を検出するために適する。
【００１８】
この明細書の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」といった変形（バリエーション）は、述べられた要素または整数（integer）、または要素または整数の群の包括を暗示するが、任意の他の要素または整数、または要素または整数の群の除外ではないと理解される。
【００１９】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００２０】
模範的な具体化の説明 以下の説明は、特定の具体化を説明する目的のためだけのものであり、上記記載について制限することを意図しないと理解されるべきである。
【００２１】
第１の見地において、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法を提供し、本方法は、すなわち
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む。
【００２２】
上述されるように、本明細書において開示された方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のためのものである。この技術において熟練する者（当業者）によってすぐに理解されるように、「界面活性剤」は疎水性部分および親水性部分を含む両親媒性の分子である。「陰イオン性界面活性剤」の場合、分子の親水性部分は、概して、少なくとも７またはそれよりも高いｐＨにて負電荷を運ぶ。そのようなものとして、用語「陰イオン性界面活性剤」には、カルボン酸のような分子が含まれてよく、それは７またはそれよりも高いｐＨにて陰イオン（すなわち、共役塩基）を形成しうるが、それは必ずしも７未満のｐＨで陰イオンの形でありうるとは限らない。例えば、環境サンプル中のカルボン酸界面活性剤は、必ずしもカルボン酸界面活性剤が塩基性の陽イオン性染料のような塩基の存在下にあるときまで、カルボン酸界面活性剤が陰イオンの形であるとは限らないとしても、陰イオン性界面活性剤とみなすことができる。
【００２３】
開示された方法を用いて検出され、および／または定量化されうる陰イオン性界面活性剤の範囲は、当業者によってすぐに確かめられるであろう。模範的な陰イオン性界面活性剤には、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホナート（ＬＡＳ）、ナトリウムドデシルスルファート（ＳＤＳ）、フッ素化界面活性剤で、ペルフルオロオクタンスルホナート（ＰＦＯＳ）またはペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、等のようなものが含まれる。
【００２４】
本方法はまた、前述のフッ素化界面活性剤のような、水性膜形成泡（ＡＦＦＦ）の構成要素である陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化への特定の適用ももつ。模範的なＡＦＦＦｓには、Ｌｉｇｈｔ ＷａｔｅｒＴＭ（ライト・ウォーター（商品名）、３Ｍ（スリーエム社）、Ｓｔ．Ｐａｕｌ（セントポール）、ＭＮ（米国ミネソタ州）、ＵＳＡ）、およびＡｎｓｕｌｉｔｅ（アンスライト、Ａｎｓｕｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（アンスル・インコーポレイテッド）、Ｍａｒｉｎｅｔｔｅ（マリネット）、ＷＩ（米国ウィスコンシン州）、ＵＳＡ）が包含される。
【００２５】
また上述したように、本方法はサンプル中の陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化を企図する（contemplates）。
【００２６】
一種の具体化において、「サンプル」は、水性または水ベースのサンプルであってよい。若干の具体化では、水性サンプルは、水サンプル、土壌希釈物等のような、環境保護に関して導き出されるサンプルでありうる。サンプルは、例えば、とりわけ多くある中で、工業用地、界面活性剤による汚染が疑われている場所で、ＡＦＦＦｓが使われていた場所のようなところ、産業上の、または家庭的な流出物、処置された水サンプル、雨水サンプル、湖または川の水または堆積物のサンプル、海の水または堆積物のサンプルから導き出すことができる。
【００２７】
認められるように、水性サンプルはまた、固体から導き出しうる。例えば、サンプルを生産するために、土壌を水または別の水性溶媒において希釈してよい。さらに、サンプルを生産するために、植物素材や建築素材等のような他の固形物を、破砕し、または水または別の水性溶媒中に希釈する前に漬けて柔らかくすることができる。
【００２８】
さらなる具体化において、サンプルはアッセイにおいて用いる溶媒中に抽出することができる。これらの具体化では、溶媒を、固形物、半固形物または液体であってよいサンプルに加えることができる。このようなサンプルの例には、土壌、植物素材、建築素材等が含まれうる。
【００２９】
一種の具体化においては、溶媒および染料の双方をサンプルに加え、そしてサンプル中の任意の陰イオン性界面活性剤は、陽イオン性染料と複合体を形成し、溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体が形成される。さらなる具体化においては、陰イオン性界面活性剤および染料が使用する溶媒において溶解性であり、陰イオン性界面活性剤および染料が溶媒中に溶けることができ、そして陰イオン性界面活性剤と染料の間の複合体を溶媒相内で形成することができる。さらなる具体化において、アッセイにおける使用のために、溶媒中でサンプルの抽出物を形成するように、溶媒をサンプルに加えることができる。若干の具体化において、サンプルを抽出物から分けることができ、またはそれらを混合物として使用することができる。いずれにしても、染料−界面活性剤複合体の形成を許し、それが次に溶媒において検出されることができるようにするために、陽イオン性染料をそのような抽出物に加えることができる。
【００３０】
上述のように、開示した方法はサンプルと実質非混和性である溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能な陽イオン性染料の使用を企図する。
【００３１】
開示した方法に従って有用である陽イオン性染料には、サンプルと実質非混和性である溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を生産するために、陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能な任意の正電気を帯びた（陽イオン性）染料が含まれる。
【００３２】
さらなる具体化においては、陽イオン性染料はまた、塩基であり、それは、サンプルへ加えた際（ほぼ中性のｐＨにて）、染料によってサンプル中の有機酸の界面活性剤がその陰イオン性共役塩基の形成を引き起こされるようなものであり、そして従ってこの発明の方法を用いる検出に適したものとなる。
【００３３】
適した染料の範囲は、陰イオン性界面活性剤の検出のために用いることができ、例えば、数ある中で、エチルバイオレット、メチレンブルー、アクリジンオレンジ、ブリリアントグリーンおよびマラカイトグリーンが含まれる。
【００３４】
しかしながら、トリアリールメタンのクラスの陽イオン性染料が開示した方法に従った使用に特に適すると定められた。
【００３５】
この発明の若干の具体化において、トリアリールメタンのクラスの陽イオン性染料は構造（Ｉ）を含む。すなわち
【化１】
式中、各々のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、随意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より無関係に選ばれ、そしてｍは０および１からなる群より選ばれる。
【００３６】
一種の特定の具体化では、ｍは１であり、そして、各々のＲ１、Ｒ２およびＲ３はエチル基である。この構造をもつ染料は本明細書においてエチルバイオレットとして言及する。
【００３７】
開示した方法の特定の具体化において、使用する陽イオン性染料は「エチルバイオレットまたはその誘導体」である。本明細書において言及するように、エチルバイオレットの「誘導体」には、構造（Ｉ）を含む他の陽イオン性染料および／またはトリアリールメタンのクラスの他の陽イオン性染料が含まれる。
【００３８】
上述するように、本方法はまた、サンプルと実質非混和性の溶媒で、それに、染料−界面活性剤複合体が選択的に溶解するものの使用を企図する。
【００３９】
本明細書において言及するように、用語「選択的に溶解する」は、溶媒においてサンプルにおけるよりも染料−界面活性剤複合体の溶解性の増大したレベルまたは速度に言及すると理解されるべきである。選択的な溶解性にはまた、サンプルから溶媒への、染料−界面活性剤複合体の分配も包含される。
【００４０】
この開示を何らかの特定の作用機序に制限することなく、開示した方法において、サンプル中の陰イオン性界面活性剤の親水性の（陰イオン性の）頭部は、染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料と複合体を形成する。この複合体を次に選択的に溶解させ、または溶媒相に分配させ、それをいくつかの検出方法（後述する）のうちの１つを使用して検出することができる。
【００４１】
概して、サンプルと実質非混和性の溶媒には、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、ジクロロメタン等のような有機溶媒が含まれる。
【００４２】
前述のように、陰イオン性界面活性剤の検出についての標準的なＭＢＡＳアッセイは溶媒としてクロロホルムを使用する。クロロホルムへの曝露により肝臓および腎臓に毒性を生じさせることが知られている。さらに、クロロホルムは既知の催奇形物質および疑いのある発がん性物質である。クロロホルムの毒性を考慮すると、それは望ましい溶媒ではない。加えて、クロロホルムの使用は、ＭＢＡＳアッセイを、本分野における使用に特に不十分にしか適さないようにし、ユーザーおよび／または環境へのクロロホルム汚染および／または毒性のリスクが増大する。
【００４３】
一方、溶媒の酢酸エチルが特に適すると定められた。酢酸エチルは、標準的なＭＢＡＳアッセイにおいて用いられるようなクロロホルムと比較してより一層低い毒性および発がん性しかもたない。
【００４４】
開示した方法の若干の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれ、そして溶媒には、酢酸エチルが含まれる。染料としてのエチルバイオレットおよび溶媒としての酢酸エチルの組合せを利用する方法は、本明細書において、Ｅｔｈｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（エチルバイオレットエチルアセタート活性物質、ＥＶＥＡ−ＡＳ）方法またはアッセイと言及される。ＥＶＥＡ−ＡＳ分析の１種の特定の具体化を、例において述べる。
【００４５】
ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために、ＭＢＡＳアッセイのような標準的な陰イオン性界面活性剤の検出方法を超えて、増大した感度および分解能を提供することが定められた。
【００４６】
本明細書に言及するように、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの改善された感度は、特にＭＢＡＳアッセイと比較したとき、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのより一層低い検出限界への参照が含まれると理解されるべきである。例において述べるように、ＭＢＡＳアッセイを超えたＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの改良された感度は、陰イオン性界面活性剤が、アッセイの溶媒相において色付きの染料−界面活性剤複合体の視覚的検出によって検出され、および／または分析されるときに、特に明らかである（検出方法の議論については後述を参照）。
【００４７】
ＭＢＡＳアッセイと比較して改良された感度に加えて、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイはまたＭＢＡＳアッセイと比較して改良された分解能をもみせる。本明細書に言及するように、用語「分解能」は、アッセイにおいて生じる検出可能な染料−界面活性剤複合体の量を、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の量と比べた比率として理解されるべきである。例えば、高分解能は、サンプルにおいて所定の量の陰イオン性界面活性剤について生じる比較的大量の検出可能な染料−界面活性剤複合体に言及すると理解されるべきである。逆にいえば、低分解能は、サンプルにおいて同じ量の陰イオン性界面活性剤について生じる比較的小量の検出可能な染料−界面活性剤複合体として理解されるべきである。
【００４８】
前述のものを考慮すると、アッセイの分解能は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の既知量の増加（ｘ軸上）を伴い、溶媒相における検出可能な染料−界面活性剤複合体の量（ｙ軸上）に関連するアッセイのための図式的較正線の傾斜によって表すことができると認められる。この場合、アッセイの増大した分解能は較正線の増大した傾斜によって表される。
【００４９】
サンプルにおける陰イオン性界面活性剤に対する高分解能アッセイの増大した反応のため、アッセイの増大した分解能がまた、異なるサンプル間でのより一層小さな陰イオン性界面活性剤の濃度の差の間を区別することも許容するであろうことは認められる。
【００５０】
上記の定義に基づき、これらの例は、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイが、ＭＢＡＳアッセイおよび一連の他の染料−溶媒の組合せアッセイの双方と比較して、増大した分解能を有することを論証する。
【００５１】
このように、さらなる具体化において、開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、そこでは、本方法は、ＬＡＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．５ｍｇ／Ｌおよび５ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも０．３２、少なくとも０．３５、少なくとも０．４０、少なくとも０．４５または少なくとも０．５の相対分解能を含む。
【００５２】
またさらなる具体化において、この発明の開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、本方法は、ＳＤＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．５ｍｇ／Ｌおよび５ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも０．３５、少なくとも０．４０、少なくとも０．４５または少なくとも０．５の相対分解能を含む。
【００５３】
またさらなる具体化において、この発明の開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、本方法は、ＰＦＯＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．２５ｍｇ／Ｌおよび１ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも１．８、少なくとも２．０、少なくとも２．２または少なくとも２．４の相対分解能を含む。
【００５４】
さらにまた、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、特に陰イオン性界面活性剤のためのフィールドベースのアッセイ用にも適する。このことは部分的には、比較的安全な溶媒である酢酸エチルを使用しているためであり、管理された実験室条件の外における、およびまた潜在的に比較的不慣れな人員によるアッセイが行われることを可能にする。さらに、本アッセイの増大した感度および分解能はまた、特にアッセイの結果の視覚的なアセスメントに良好に適し（後述を参照）、そして従って、分光光度計のような嵩張る機器を用いることなく、フィールドにおける陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために良好に適する。
【００５５】
開示した方法において、サンプルと実質的に混ざらない（非混和性の）溶媒に優先的に溶解性である「検出可能な染料−界面活性剤複合体」を形成するために、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤は陽イオン性染料と複合体を形成する。
【００５６】
本明細書において使用するように、用語「検出可能な染料−界面活性剤複合体」は、陽イオン性染料および陰イオン性染料界面活性剤の間で形成される任意の複合体に言及し、それはアッセイの溶媒相において後に検出可能である。染料−界面活性剤複合体を任意の適切な方法を使用して検出し、および／または定量化することができる。
【００５７】
本方法の若干の具体化において、光学的検出方法を用いて染料−界面活性剤複合体を溶媒相において検出する。本明細書において言及するように、「光学的検出方法」には、１種またはそれよりも多くの波長における光の吸収、反射または屈折に基づいて染料−界面活性剤複合体を検出する任意の方法をも包含される。
【００５８】
若干の具体化では、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性染料によって形成される染料−界面活性剤複合体を色付けることができる。これらの具体化では、染料−界面活性剤複合体をアッセイの溶媒相における色変化の検出および／または定量化によって溶媒相において検出することができる。
【００５９】
一種の具体化において、アッセイの溶媒相における色変化を、外観検査によって検出し、および／または定量化することができる。溶媒相中の染料−界面活性剤複合体の量を定量化するために、外観検査には１種またはそれよりも多くの視覚的基本色（参照色）を有する溶媒の色の比較を含めることができる。アッセイに従って用いるための「視覚的基本色」は、アッセイをサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の既知の濃度と共に用いるとき、溶媒相の色を含む前もって決めた色であることができる。未知サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の定量化を、次に未知サンプルのアッセイからの溶媒相の色を最も近い基本色と適合させ、そして次にその最も近い基本色と関係する既知濃度を読み取ることによって行う。
【００６０】
代わりの具体化において、光学的検出方法には、分光測定が含まれる。分光測定法はこの技術においてよく知られており、本明細書において詳細には説明しない。典型的に、分光測定は、検出する生成物のピーク吸光度と同じ、またはそれに近い波長にて行う。それとして、生成物の分光光度法による検出は、例えば、可視光、紫外線または赤外線スペクトルを含め、任意の光の適切なスペクトルにおいて起こすことができる。エチルバイオレットの場合、この染料のピーク吸光度の波長は５９６ｎｍである。このように、エチルバイオレットを含有する複合体の分光光度法による検出を、典型的に約５９６ｎｍの波長にて行う。未知の吸光度のピークを有する生成物の場合、これらを一連の波長にわたり生成物の吸光度スペクトルを得ることによって実験的に定めることができる。
【００６１】
若干の具体化において、サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるのに先立ち、サンプルにおける１種またはそれよりも多くの陰イオン性界面活性剤の濃度を高めるために、本方法はさらに濃縮のステップ（工程）を含む。
【００６２】
濃縮ステップは、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を高める任意の濃縮ステップも含むことができる。模範的な濃縮ステップには、例えば、固相抽出（ＳＰＥ）、溶媒蒸発、溶媒昇華（例は、凍結乾燥）、調製的クロマトグラフィー（例は、分取ＴＬＣ、分取ＨＰＬＣまたは分取ＧＣ）等が含まれる。
【００６３】
濃縮ステップは、例えば、環境サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度をこの発明によるアッセイの検出範囲内にまで高めるために用いることができる。認められるように、濃縮ステップを定量アッセイにおいて用いる場合、アッセイから得られる濃縮の結果は、濃縮ステップの濃縮因子を考慮に入れなければならない。
【００６４】
若干の具体化において、濃縮ステップには、固相抽出（ＳＰＥ）を含むことができる。サンプルからの陰イオン性界面活性剤の濃縮のための適切なＳＰＥ方法の範囲は、当業者によってすぐに確かめられるであろう。この点について、固相抽出（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）に関して参照する：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（原理、技術、および応用）， Ｓｉｍｐｓｏｎ（シンプスン）， Ｎ． Ｋ．編 （Ｅｄ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（CRCプレス社）， ２０００年。また、模範的なＳＰＥ法を開示する例３にも参照する。
【００６５】
認められるように、高い界面活性剤濃度を有するサンプルについて、アッセイされるサンプルの濃度を本方法の検出範囲に入れるために希釈ステップを用いることもできる。
【００６６】
第２の見地において、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出および／または定量化するために、キットを提供し、本キットは、すなわち
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
本発明の第１の見地に従った方法を実行するための指示
を含む。
【００６７】
キットにおいて用いる陽イオン性染料には、開示した方法に関して以上に記載するような陽イオン性染料を包含することができる。そのようなものとして、若干の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる。
【００６８】
若干の具体化では、キットはさらに、開示した方法に関して以上に記載するように、サンプルと実質非混和性である溶媒を含むことができる。そのようなものとして、若干の具体化においては、溶媒には、酢酸エチルが含まれる。
【００６９】
さらなる具体化において、この発明のキットはまた、サンプルを、陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるための反応容器をさらに含むことができる。
【００７０】
キットにおいて含まれる反応容器は、試験管、ねじぶたキャップチューブまたは容器、フラスコ等のような、この発明によるアッセイのための任意の適切な反応容器であることができる。
【００７１】
またさらなる具体化において、キットは、１種またはそれよりも多くの参照物体を含むことができ、それぞれには、溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化するために、１種またはそれよりも多くの基本色が含まれる。
【００７２】
既知濃度の陰イオン性界面活性剤を有するサンプルについてアッセイを行うとき、１種またはそれよりも多くの基本色が溶媒相の色と対応する。一連の適切な基本色を、サンプルにおける既知の陰イオン性界面活性剤濃度の範囲に対応させ、キットにおいて含めることができる。このようにして、アッセイを陰イオン界面活性剤の未知濃度を有するサンプルについて行うとき、アッセイを行った後の溶媒相の色を１種またはそれよりも多くの基本色と比較し、未知濃度を有するサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度の評価を提供することができる。
【００７３】
１種またはそれよりも多くの基本色を含む１種またはそれよりも多くの「参照物体」は、カラーチャートのような任意の適したカラー対象物を含むことができる。代わりに、１つまたはそれよりも多くの基本色は、反応容器上に印刷され、またはキットの包装中に組み込まれるような、キットの他の構成要素の１つまたはそれよりも多くに組み込むことができる。
【００７４】
上述するように、この発明のキットは、任意の適した陰イオン性界面活性剤を検出するために用いることができる。しかしながら、若干の特定の具体化において、この発明のキットは水性膜形成泡および／またはフッ素化陰イオン性界面活性剤の陰イオン性界面活性剤成分を検出するのに適する。
【００７５】
本発明を、以下の非制限的例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＬＡＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＬＡＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相での吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＬＡＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図２】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＳＤＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＳＤＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＳＤＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図３】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＰＦＯＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＰＦＯＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＰＦＯＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図４Ａ】図４は、様々な染料／溶媒の組合せを使用した陰イオン性界面活性剤の検出方法の比較を示す。いずれの場合においても、検出される陰イオン性界面活性剤は様々な濃度のＳＤＳであった。パネルＡは、メチレンブルー／ジクロロメタンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｂ】パネルＢは、アクリジンオレンジ／トルエンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｃ】パネルＣは、ブリリアントグリーン／トルエンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｄ】パネルＤは、マラカイトグリーン／酢酸エチルに基づく方法についての結果を示す。
【図５】０．５グラムのシリカＳＰＥカラム上における濃縮後、ＬＡＳ標準の増大する容量（ｍＬ）の吸光度を示す。
【実施例】
【００７７】
例１
エチルバイオレットエチルアセタート活性物質（ＥＶＥＡ−ＡＳ）アッセイ
【００７８】
この発明の１種の具体化による陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提示する。この方法は染料エチルバイオレットと溶媒として酢酸エチルとの組合せを用い、そしてこうした前述したようなＥＶＥＡ−ＡＳ方法の具体化である。
【００７９】
以下に述べるように、標準的なＭＢＡＳ方法と比較するとき、この方法は陰イオン性界面活性剤のより一層低い濃度に対してより一層高い感度があり、有毒な溶媒であるクロロホルムへの曝露を伴わずに本分野において用いることができる。
材料および方法
【００８０】
本方法において用いるためのすべてのガラス製品を、アセトンで３回およびメタノールで３回により洗浄した。ガラス製品は洗剤によって洗浄しなかった。
【００８１】
２００ｍＬのミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水において０．００６４ｇのエチルバイオレットを含むエチルバイオレット溶液（１Ｌにつき３２ｍｇ）を調製した。
【００８２】
本アッセイを実行するために、１ｍＬのエチルバイオレット溶液（上述）を８ｍＬの水サンプルに加えた。その後、３ｍＬの酢酸エチルを水サンプルに加えた。次に、安定にし、そして二つの相を形成されるのを許す前に、サンプル−染料−溶媒混合物を激しく振動させた。
【００８３】
次に、着色した染料−界面活性剤複合体の存在を酢酸エチル溶媒相において算定した。非酸性化した検量線（ＬＡＳ）または非酸性の標準的な呈色チャート（カラーレーション・チャート）を、サンプル中の陰イオン性界面活性剤濃度を評価するために用いた。
【００８４】
代わりの具体化においては、溶媒相において着色した染料−界面活性剤複合体の存在を検出するために分光光度計を用いた。この具体化において、溶媒相の吸光度は５９５ｎｍにて測定された。
データおよび結果
【００８５】
図１、２および３は、ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、陰イオン性界面活性剤の３つの較正標準を用いて示す。
【００８６】
図１、２および３に示すように、各々の陰イオン性界面活性剤標準を用いたＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのための較正線のより一層大きな傾斜は、ＥＶＥＡ−ＡＳ法がＭＢＡＳアッセイよりも高い分解能をもたらすことを指し示した。すなわち、ＥＶＥＡ−ＡＳ法は、吸光度、そしてその後、相当する各々の標準の濃度について、溶媒相における色変化において、ＭＢＡＳアッセイよりも高い増大をもたらす。
【００８７】
５９５ｎｍでの分光光度法によるプレートリーダーを使用するＥＶＥＡ−ＡＳの検出限界は、０．０２ｍｇ／ＬのＬＡＳであり、それに対して、６５２ｎｍでのＭＢＡＳでは０．０２５ｍｇ／ＬのＬＡＳである。
【００８８】
検出の視覚的限界、すなわち、ＥＶＥＡ−ＡＳ方法の、色の参照を用いる視覚的比較による染料−界面活性剤複合体の検出および／または定量化は、０．０７５ｍｇ／ＬのＬＡＳであり、それに対し、ＭＢＡＳアッセイでは０．１７５ｍｇ／ＬのＬＡＳである。
【００８９】
ＥＶＥＡ−ＡＳ抽出方法の分光光度計に基づく検出方法について示唆される較正範囲は、０．０２ｍｇ／Ｌから３．２５ｍｇ／Ｌまでである。ＭＢＡＳアッセイの検出限界は０．０２５ｍｇ／Ｌにて発表されている。
【００９０】
例２
ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの染料／溶媒の組合せを用いる比較
【００９１】
図４は、陰イオン性界面活性剤の検出のためのアッセイにおいて様々な代わりの染料／溶媒の組合せを使用して得られる結果の比較を示す。これらのアッセイにおいて用いた構成要素および結果を以下の表２に提示する。
【００９２】
比較アッセイのための各々の染料を、アクリジンオレンジ以外、同じ様に、そして例１におけるエチルバイオレットについて記載したのと同じ濃度で調製した。アクリジンオレンジを、ミリＱ水における０．００５Ｍの濃度に調製した。
【００９３】
各々の場合において、本アッセイは、１ｍＬの適正な染料溶液を、既知濃度の陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ含有の８ｍＬの水サンプルに加えることによって行った。
【００９４】
その後、３ｍＬの適正な溶媒を水サンプルに加えた。サンプル−染料−溶媒混合物を次に、安定化し、そして二つの相が形成されるのを許す前に、激しく振動させた。
【００９５】
溶媒相における着色した染料−界面活性剤複合体の形成を、次に分光測定を用いて決定した。
【００９６】
【表２】
１ＳＤＳを用いた較正線の傾斜により表される相対分解能
２例１から採取されたデータ
【００９７】
加えて、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、試験された各々の他の染料／溶媒の組合せよりも陰イオン性界面活性剤ＳＤＳについての分解能を増大させた（較正線の傾斜によって測定されるように）。
【００９８】
例３
固相抽出
【００９９】
若干の環境サンプルのような、若干のサンプルについて、陰イオン性界面活性剤を検出するのに先立ち、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤を濃縮することが望ましいことがある。例えば、原サンプルにおける界面活性剤の濃度が低く、そしてアッセイの検出限界より潜在的に低いとき、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を初めに濃縮するのが望ましい場合がある。
【０１００】
サンプルの濃縮が必要なとき、陰イオン性界面活性剤を、固相抽出（ＳＰＥ）を用いてサンプルにおいて濃縮することができる。開示した方法とともに用いるのに適する模範的なＳＰＥのプロトコルを以下に説明する。
【０１０１】
水サンプルを、あらゆる８ｍＬの水サンプルに１滴の１Ｍ塩酸を、またはあらゆる８ｍＬの水サンプルに３−４滴の１Ｍ硝酸（ＨＮＯ３）を加えることにより、酸性化した。
【０１０２】
０．５グラムのシリカＳＰＥ媒体を、２００℃において４−６時間シリカを活性化した後に使用した。ＳＰＥ媒体を次に〜（約）５ｍＬのアセトンと共に充填した。充填後、次にＳＰＥ媒体を〜５ｍＬのＭＱ水を用いて２−３回すすいだ。
【０１０３】
すすいだ後に、サンプルを〜５−６ｍＬ／分の速度において最小限の真空の下で媒体上に負荷（ロード）した。サンプルにおける陰イオン性界面活性剤はＳＰＥ媒体に結合した。
【０１０４】
ＳＰＥ媒体に結合した陰イオン性界面活性剤を、次に〜１−２ｍＬ／分の速度で、ＳＰＥ媒体から２ｍＬのアセトンにおいて溶出した。
【０１０５】
ＳＰＥ媒体からの溶出物（陰イオン性界面活性剤を含む）を、次にＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのために上述のように８ｍＬのＭＱ水、３ｍＬの酢酸エチルおよび１ｍＬのエチルバイオレット溶液と混合した。次に、２ｍＬのアセトン呈色チャートを用いた較正曲線（検量線）（ＬＡＳ）を、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために用いた（サンプルの濃度を考慮する）。
【０１０６】
平均して、ＭＢＡＳアッセイにおいて使用する中間レベルのＬＡＳ標準（ほぼ０．３７５ｍｇ／Ｌ）の回収率は、サンプルを濃縮するためのＳＰＥ方法において１００％であったが、以下に示す表３を参照。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
０．５グラムの活性化したシリカＳＰＥの使用により、ＳＤＳおよびＰＦＯＳの双方についても＞８５％の回収率が実現された。
【０１０９】
この方法を、興味のある化合物の損失を伴わずに、サンプルのより一層高い容量についての試験を検証するために、ＳＰＥカートリッジ（図５）上のＬＡＳの標準の容量を増やして試験した。
【０１１０】
これらの結果は、ＳＰＥが、ＥＶＥＡ−ＡＳ方法の線形範囲内にまで、希薄サンプルにおける陰イオン性界面活性剤を濃縮するために使用できることを指し示す。
【０１１１】
本明細書において説明する発明が、特に記載しているもの以外の変形および修飾を受けやすいことは、この技術における熟練者には認められることである。本発明が、すべてのこのような変形および修飾を含むことは理解されるべきである。本発明はまた、この明細書において個々にまたは集合的に述べ、または指し示すすべてのステップ、特長、組成物および化合物、および任意の２つまたはそれよりも多くのステップまたは特長の任意の、およびすべての組合せをも含む。
【０１１２】
また、本明細書において用いるように、単数形「ａ（１つ）」、「ａｎ」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈上既に他に指定しない限り、複数の形態も含むことに注目されなければならない。このように、例えば、「陰イオン性界面活性剤」の言及は、ある種の表面活性剤ならびに２つまたはそれよりも多くの界面活性剤の種類、その他を含む。
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張 この国際特許出願は、２００７年１０月９日付け出願のオーストラリア国仮特許出願２００７９０５５２９について優先権を主張し、その内容をここに参照することによって組み込む。
【０００２】
技術的分野 本明細書において、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のための方法を開示する。また、環境保護に関して導き出されるサンプル（試料）のようなサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために、開示した方法を利用する試験キットも本明細書において開示する。若干の特定の具体化において、本方法および試験キットは、数ある中でも、陰イオン性界面活性剤を含む水性膜形成泡を検出するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
背景 界面活性剤は、関心を増しつつある一群の有機化合物である。それらは、１年につき９．８６×１０９ｋｇを上回る世界的な生産により世界中で広く使用される一群の化学物質である。界面活性剤は、世界中の家庭において、洗浄剤および洗剤において、殺虫剤、セメントおよびコンクリート産業における可塑剤、鉱業、製薬および他の多くの製品の製造を含む産業上の適用において、日常的に大量に使用されている。
【０００４】
陰イオン性界面活性剤は、洗剤の中に用いられる界面活性剤の主要なクラス（部類）である。直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）は、最も広く用いられている陰イオン性界面活性剤であると発表されている。廃水処理設備は、洗浄目的のための、および他の供給源からの洗剤の大量使用のために、著しい量の陰イオン性界面活性剤を受け取る。大部分の界面活性剤は慣習的な廃水処理によって排除することが可能であるが、生分解性が低い若干の界面活性剤もあり、また他には、望ましくない生分解生成物が形成され、そして流出物と共に表流水に放出される。これらの化学物質を環境中に導入することについてのもう１つのルートには、農業においての汚水スラッジ（汚泥）の肥料としての使用が含まれる。界面活性剤は周囲の土壌に浸出することがあり、そして地下水および表流水にまで運搬される。
【０００５】
特殊な界面活性剤の１つの特定のクラス、フッ素化（フッ素系）界面活性剤は、それらを消防の適用に特に良好に適したものにする特性をもつ。ＰＦＯＳ（ペルフルオロオクタンスルホナートＣ８Ｆ１７ＳＯ３-）およびＰＦＯＡ（ペルフルオロオクタン酸Ｃ７Ｆ１５ＣＯ２Ｈ）は、普通に用いられる２種類のフッ素化界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ヒト血液、水、土壌、堆積物、空気、および生物相のサンプル中において検出されている。これらの化合物は、世界的に分布し、持続性であり、そして生物濃縮性であることが見出された。
【０００６】
環境において陰イオン性界面活性剤汚染が検出できるために、陰イオン性界面活性剤の検出用の様々なアッセイ（検定）が開発されてきた。
【０００７】
メチレンブルー活性物質（ＭＢＡＳ）アッセイは、水中の陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために使用する、現行基準の比色試験である。水サンプルを酸性にし、３ｍＬのクロロホルムおよびメチレンブルー溶液を加え、そしてサンプルをかくはんする。ＭＢＡＳアッセイにおいて、陰イオン性界面活性剤は陽イオン性染料と複合体（錯体）を形成する。陰イオン性界面活性剤の濃度が高いほど、より一層多くの染料が取り込まれ、そしてより大きな比色変化を生ずる。方法の感度のために、ＬＡＳを、陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために用い、そして濃度をＬＡＳ相当物において報告する。ＭＢＡＳアッセイは、０．０２５ｍｇ／Ｌという発表された検出限界をもつ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この方法は広く使用されている一方、アッセイの使用は、それがヒトの発がん性物質として疑われているクロロホルムを抽出溶媒として使用するため、問題を有している。このように、陰イオン性界面活性剤の検出のための改良されたアッセイが必要とされている。そのようなアッセイは、発がん性が疑われている溶媒である、クロロホルムの使用が排除されることが望ましい。また、環境サンプル中の陰イオン性界面活性剤の迅速な検出のために、改良したアッセイがその分野における使用に適していたら望ましいであろう。
【０００９】
本明細書中のいかなる先行技術への言及も、この先行技術がいかなる国においても共通の一般知識の一部を形成するという自認、または何らかの形態の示唆として受けとられることはなく、またそのように解されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の概略 本発明は、一部分において、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のための方法およびキットに基づく。
【００１１】
第１の見地において、この発明はサンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法を提供し、本方法は、すなわち
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択（優先）的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む。
【００１２】
１種の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が包含される。
【００１３】
さらなる具体化において、溶媒には、酢酸エチルが包含される。
【００１４】
少なくとも若干の具体化において、開示した方法は、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために、メチレンブルー活性物質（ＭＢＡＳ）アッセイのような標準的な陰イオン性界面活性剤検出方法を超えた、増大した感度および分解能（解像度）を提供することが確認された。
【００１５】
さらにまた、開示した方法の少なくとも若干の具体化は、特に陰イオン性界面活性剤のためのフィールドベース（現場ベース）のアッセイに適する。
【００１６】
第２の見地では、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するためのキットを提供し、キットは、すなわち
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
本発明の第１の見地に従った方法を実行するための指示
を含む。
【００１７】
本明細書において開示した方法およびキットは、任意の適切な陰イオン性界面活性剤を検出するために用いることができる。しかしながら、若干の特定の具体化において、本方法およびキットは、水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分および／またはフッ素化陰イオン性界面活性剤を検出するために適する。
【００１８】
この明細書の全体にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」といった変形（バリエーション）は、述べられた要素または整数（integer）、または要素または整数の群の包括を暗示するが、任意の他の要素または整数、または要素または整数の群の除外ではないと理解される。
【００１９】
【表１】
【発明を実施するための形態】
【００２０】
模範的な具体化の説明 以下の説明は、特定の具体化を説明する目的のためだけのものであり、上記記載について制限することを意図しないと理解されるべきである。
【００２１】
第１の見地において、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法を提供し、本方法は、すなわち
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む。
【００２２】
上述されるように、本明細書において開示された方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のためのものである。この技術において熟練する者（当業者）によってすぐに理解されるように、「界面活性剤」は疎水性部分および親水性部分を含む両親媒性の分子である。「陰イオン性界面活性剤」の場合、分子の親水性部分は、概して、少なくとも７またはそれよりも高いｐＨにて負電荷を運ぶ。そのようなものとして、用語「陰イオン性界面活性剤」には、カルボン酸のような分子が含まれてよく、それは７またはそれよりも高いｐＨにて陰イオン（すなわち、共役塩基）を形成しうるが、それは必ずしも７未満のｐＨで陰イオンの形でありうるとは限らない。例えば、環境サンプル中のカルボン酸界面活性剤は、必ずしもカルボン酸界面活性剤が塩基性の陽イオン性染料のような塩基の存在下にあるときまで、カルボン酸界面活性剤が陰イオンの形であるとは限らないとしても、陰イオン性界面活性剤とみなすことができる。
【００２３】
開示された方法を用いて検出され、および／または定量化されうる陰イオン性界面活性剤の範囲は、当業者によってすぐに確かめられるであろう。模範的な陰イオン性界面活性剤には、例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホナート（ＬＡＳ）、ナトリウムドデシルスルファート（ＳＤＳ）、フッ素化界面活性剤で、ペルフルオロオクタンスルホナート（ＰＦＯＳ）またはペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、等のようなものが含まれる。
【００２４】
本方法はまた、前述のフッ素化界面活性剤のような、水性膜形成泡（ＡＦＦＦ）の構成要素である陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化への特定の適用ももつ。模範的なＡＦＦＦｓには、Ｌｉｇｈｔ ＷａｔｅｒＴＭ（ライト・ウォーター（商品名）、３Ｍ（スリーエム社）、Ｓｔ．Ｐａｕｌ（セントポール）、ＭＮ（米国ミネソタ州）、ＵＳＡ）、およびＡｎｓｕｌｉｔｅ（アンスライト、Ａｎｓｕｌ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（アンスル・インコーポレイテッド）、Ｍａｒｉｎｅｔｔｅ（マリネット）、ＷＩ（米国ウィスコンシン州）、ＵＳＡ）が包含される。
【００２５】
また上述したように、本方法はサンプル中の陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化を企図する（contemplates）。
【００２６】
一種の具体化において、「サンプル」は、水性または水ベースのサンプルであってよい。若干の具体化では、水性サンプルは、水サンプル、土壌希釈物等のような、環境保護に関して導き出されるサンプルでありうる。サンプルは、例えば、とりわけ多くある中で、工業用地、界面活性剤による汚染が疑われている場所で、ＡＦＦＦｓが使われていた場所のようなところ、産業上の、または家庭的な流出物、処置された水サンプル、雨水サンプル、湖または川の水または堆積物のサンプル、海の水または堆積物のサンプルから導き出すことができる。
【００２７】
認められるように、水性サンプルはまた、固体から導き出しうる。例えば、サンプルを生産するために、土壌を水または別の水性溶媒において希釈してよい。さらに、サンプルを生産するために、植物素材や建築素材等のような他の固形物を、破砕し、または水または別の水性溶媒中に希釈する前に漬けて柔らかくすることができる。
【００２８】
さらなる具体化において、サンプルはアッセイにおいて用いる溶媒中に抽出することができる。これらの具体化では、溶媒を、固形物、半固形物または液体であってよいサンプルに加えることができる。このようなサンプルの例には、土壌、植物素材、建築素材等が含まれうる。
【００２９】
一種の具体化においては、溶媒および染料の双方をサンプルに加え、そしてサンプル中の任意の陰イオン性界面活性剤は、陽イオン性染料と複合体を形成し、溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体が形成される。さらなる具体化においては、陰イオン性界面活性剤および染料が使用する溶媒において溶解性であり、陰イオン性界面活性剤および染料が溶媒中に溶けることができ、そして陰イオン性界面活性剤と染料の間の複合体を溶媒相内で形成することができる。さらなる具体化において、アッセイにおける使用のために、溶媒中でサンプルの抽出物を形成するように、溶媒をサンプルに加えることができる。若干の具体化において、サンプルを抽出物から分けることができ、またはそれらを混合物として使用することができる。いずれにしても、染料−界面活性剤複合体の形成を許し、それが次に溶媒において検出されることができるようにするために、陽イオン性染料をそのような抽出物に加えることができる。
【００３０】
上述のように、開示した方法はサンプルと実質非混和性である溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能な陽イオン性染料の使用を企図する。
【００３１】
開示した方法に従って有用である陽イオン性染料には、サンプルと実質非混和性である溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を生産するために、陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能な任意の正電気を帯びた（陽イオン性）染料が含まれる。
【００３２】
さらなる具体化においては、陽イオン性染料はまた、塩基であり、それは、サンプルへ加えた際（ほぼ中性のｐＨにて）、染料によってサンプル中の有機酸の界面活性剤がその陰イオン性共役塩基の形成を引き起こされるようなものであり、そして従ってこの発明の方法を用いる検出に適したものとなる。
【００３３】
適した染料の範囲は、陰イオン性界面活性剤の検出のために用いることができ、例えば、数ある中で、エチルバイオレット、メチレンブルー、アクリジンオレンジ、ブリリアントグリーンおよびマラカイトグリーンが含まれる。
【００３４】
しかしながら、トリアリールメタンのクラスの陽イオン性染料が開示した方法に従った使用に特に適すると定められた。
【００３５】
この発明の若干の具体化において、トリアリールメタンのクラスの陽イオン性染料は構造（Ｉ）を含む。すなわち
【化１】
式中、各々のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、随意に置換されたＣ１−Ｃ６アルキルからなる群より無関係に選ばれ、そしてｍは０および１からなる群より選ばれる。
【００３６】
一種の特定の具体化では、ｍは１であり、そして、各々のＲ１、Ｒ２およびＲ３はエチル基である。この構造をもつ染料は本明細書においてエチルバイオレットとして言及する。
【００３７】
開示した方法の特定の具体化において、使用する陽イオン性染料は「エチルバイオレットまたはその誘導体」である。本明細書において言及するように、エチルバイオレットの「誘導体」には、構造（Ｉ）を含む他の陽イオン性染料および／またはトリアリールメタンのクラスの他の陽イオン性染料が含まれる。
【００３８】
上述するように、本方法はまた、サンプルと実質非混和性の溶媒で、それに、染料−界面活性剤複合体が選択的に溶解するものの使用を企図する。
【００３９】
本明細書において言及するように、用語「選択的に溶解する」は、溶媒においてサンプルにおけるよりも染料−界面活性剤複合体の溶解性の増大したレベルまたは速度に言及すると理解されるべきである。選択的な溶解性にはまた、サンプルから溶媒への、染料−界面活性剤複合体の分配も包含される。
【００４０】
この開示を何らかの特定の作用機序に制限することなく、開示した方法において、サンプル中の陰イオン性界面活性剤の親水性の（陰イオン性の）頭部は、染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料と複合体を形成する。この複合体を次に選択的に溶解させ、または溶媒相に分配させ、それをいくつかの検出方法（後述する）のうちの１つを使用して検出することができる。
【００４１】
概して、サンプルと実質非混和性の溶媒には、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、ジクロロメタン等のような有機溶媒が含まれる。
【００４２】
前述のように、陰イオン性界面活性剤の検出についての標準的なＭＢＡＳアッセイは溶媒としてクロロホルムを使用する。クロロホルムへの曝露により肝臓および腎臓に毒性を生じさせることが知られている。さらに、クロロホルムは既知の催奇形物質および疑いのある発がん性物質である。クロロホルムの毒性を考慮すると、それは望ましい溶媒ではない。加えて、クロロホルムの使用は、ＭＢＡＳアッセイを、本分野における使用に特に不十分にしか適さないようにし、ユーザーおよび／または環境へのクロロホルム汚染および／または毒性のリスクが増大する。
【００４３】
一方、溶媒の酢酸エチルが特に適すると定められた。酢酸エチルは、標準的なＭＢＡＳアッセイにおいて用いられるようなクロロホルムと比較してより一層低い毒性および発がん性しかもたない。
【００４４】
開示した方法の若干の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれ、そして溶媒には、酢酸エチルが含まれる。染料としてのエチルバイオレットおよび溶媒としての酢酸エチルの組合せを利用する方法は、本明細書において、Ｅｔｈｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（エチルバイオレットエチルアセタート活性物質、ＥＶＥＡ−ＡＳ）方法またはアッセイと言及される。ＥＶＥＡ−ＡＳ分析の１種の特定の具体化を、例において述べる。
【００４５】
ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために、ＭＢＡＳアッセイのような標準的な陰イオン性界面活性剤の検出方法を超えて、増大した感度および分解能を提供することが定められた。
【００４６】
本明細書に言及するように、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの改善された感度は、特にＭＢＡＳアッセイと比較したとき、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのより一層低い検出限界への参照が含まれると理解されるべきである。例において述べるように、ＭＢＡＳアッセイを超えたＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの改良された感度は、陰イオン性界面活性剤が、アッセイの溶媒相において色付きの染料−界面活性剤複合体の視覚的検出によって検出され、および／または分析されるときに、特に明らかである（検出方法の議論については後述を参照）。
【００４７】
ＭＢＡＳアッセイと比較して改良された感度に加えて、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイはまたＭＢＡＳアッセイと比較して改良された分解能をもみせる。本明細書に言及するように、用語「分解能」は、アッセイにおいて生じる検出可能な染料−界面活性剤複合体の量を、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の量と比べた比率として理解されるべきである。例えば、高分解能は、サンプルにおいて所定の量の陰イオン性界面活性剤について生じる比較的大量の検出可能な染料−界面活性剤複合体に言及すると理解されるべきである。逆にいえば、低分解能は、サンプルにおいて同じ量の陰イオン性界面活性剤について生じる比較的小量の検出可能な染料−界面活性剤複合体として理解されるべきである。
【００４８】
前述のものを考慮すると、アッセイの分解能は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の既知量の増加（ｘ軸上）を伴い、溶媒相における検出可能な染料−界面活性剤複合体の量（ｙ軸上）に関連するアッセイのための図式的較正線の傾斜によって表すことができると認められる。この場合、アッセイの増大した分解能は較正線の増大した傾斜によって表される。
【００４９】
サンプルにおける陰イオン性界面活性剤に対する高分解能アッセイの増大した反応のため、アッセイの増大した分解能がまた、異なるサンプル間でのより一層小さな陰イオン性界面活性剤の濃度の差の間を区別することも許容するであろうことは認められる。
【００５０】
上記の定義に基づき、これらの例は、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイが、ＭＢＡＳアッセイおよび一連の他の染料−溶媒の組合せアッセイの双方と比較して、増大した分解能を有することを論証する。
【００５１】
このように、さらなる具体化において、開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、そこでは、本方法は、ＬＡＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．５ｍｇ／Ｌおよび５ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも０．３２、少なくとも０．３５、少なくとも０．４０、少なくとも０．４５または少なくとも０．５の相対分解能を含む。
【００５２】
またさらなる具体化において、この発明の開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、本方法は、ＳＤＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．５ｍｇ／Ｌおよび５ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも０．３５、少なくとも０．４０、少なくとも０．４５または少なくとも０．５の相対分解能を含む。
【００５３】
またさらなる具体化において、この発明の開示した方法は、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提供し、本方法は、ＰＦＯＳ標準のための較正線の傾斜によって測定されるように、０．２５ｍｇ／Ｌおよび１ｍｇ／Ｌの間の濃度にて、少なくとも１．８、少なくとも２．０、少なくとも２．２または少なくとも２．４の相対分解能を含む。
【００５４】
さらにまた、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、特に陰イオン性界面活性剤のためのフィールドベースのアッセイ用にも適する。このことは部分的には、比較的安全な溶媒である酢酸エチルを使用しているためであり、管理された実験室条件の外における、およびまた潜在的に比較的不慣れな人員によるアッセイが行われることを可能にする。さらに、本アッセイの増大した感度および分解能はまた、特にアッセイの結果の視覚的なアセスメントに良好に適し（後述を参照）、そして従って、分光光度計のような嵩張る機器を用いることなく、フィールドにおける陰イオン性界面活性剤の検出および／または定量化のために良好に適する。
【００５５】
開示した方法において、サンプルと実質的に混ざらない（非混和性の）溶媒に優先的に溶解性である「検出可能な染料−界面活性剤複合体」を形成するために、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤は陽イオン性染料と複合体を形成する。
【００５６】
本明細書において使用するように、用語「検出可能な染料−界面活性剤複合体」は、陽イオン性染料および陰イオン性染料界面活性剤の間で形成される任意の複合体に言及し、それはアッセイの溶媒相において後に検出可能である。染料−界面活性剤複合体を任意の適切な方法を使用して検出し、および／または定量化することができる。
【００５７】
本方法の若干の具体化において、光学的検出方法を用いて染料−界面活性剤複合体を溶媒相において検出する。本明細書において言及するように、「光学的検出方法」には、１種またはそれよりも多くの波長における光の吸収、反射または屈折に基づいて染料−界面活性剤複合体を検出する任意の方法をも包含される。
【００５８】
若干の具体化では、陰イオン性界面活性剤および陽イオン性染料によって形成される染料−界面活性剤複合体を色付けることができる。これらの具体化では、染料−界面活性剤複合体をアッセイの溶媒相における色変化の検出および／または定量化によって溶媒相において検出することができる。
【００５９】
一種の具体化において、アッセイの溶媒相における色変化を、外観検査によって検出し、および／または定量化することができる。溶媒相中の染料−界面活性剤複合体の量を定量化するために、外観検査には１種またはそれよりも多くの視覚的基本色（参照色）を有する溶媒の色の比較を含めることができる。アッセイに従って用いるための「視覚的基本色」は、アッセイをサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の既知の濃度と共に用いるとき、溶媒相の色を含む前もって決めた色であることができる。未知サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の定量化を、次に未知サンプルのアッセイからの溶媒相の色を最も近い基本色と適合させ、そして次にその最も近い基本色と関係する既知濃度を読み取ることによって行う。
【００６０】
代わりの具体化において、光学的検出方法には、分光測定が含まれる。分光測定法はこの技術においてよく知られており、本明細書において詳細には説明しない。典型的に、分光測定は、検出する生成物のピーク吸光度と同じ、またはそれに近い波長にて行う。それとして、生成物の分光光度法による検出は、例えば、可視光、紫外線または赤外線スペクトルを含め、任意の光の適切なスペクトルにおいて起こすことができる。エチルバイオレットの場合、この染料のピーク吸光度の波長は５９６ｎｍである。このように、エチルバイオレットを含有する複合体の分光光度法による検出を、典型的に約５９６ｎｍの波長にて行う。未知の吸光度のピークを有する生成物の場合、これらを一連の波長にわたり生成物の吸光度スペクトルを得ることによって実験的に定めることができる。
【００６１】
若干の具体化において、サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるのに先立ち、サンプルにおける１種またはそれよりも多くの陰イオン性界面活性剤の濃度を高めるために、本方法はさらに濃縮のステップ（工程）を含む。
【００６２】
濃縮ステップは、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を高める任意の濃縮ステップも含むことができる。模範的な濃縮ステップには、例えば、固相抽出（ＳＰＥ）、溶媒蒸発、溶媒昇華（例は、凍結乾燥）、調製的クロマトグラフィー（例は、分取ＴＬＣ、分取ＨＰＬＣまたは分取ＧＣ）等が含まれる。
【００６３】
濃縮ステップは、例えば、環境サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度をこの発明によるアッセイの検出範囲内にまで高めるために用いることができる。認められるように、濃縮ステップを定量アッセイにおいて用いる場合、アッセイから得られる濃縮の結果は、濃縮ステップの濃縮因子を考慮に入れなければならない。
【００６４】
若干の具体化において、濃縮ステップには、固相抽出（ＳＰＥ）を含むことができる。サンプルからの陰イオン性界面活性剤の濃縮のための適切なＳＰＥ方法の範囲は、当業者によってすぐに確かめられるであろう。この点について、固相抽出（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）に関して参照する：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（原理、技術、および応用）， Ｓｉｍｐｓｏｎ（シンプスン）， Ｎ． Ｋ．編 （Ｅｄ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（CRCプレス社）， ２０００年。また、模範的なＳＰＥ法を開示する例３にも参照する。
【００６５】
認められるように、高い界面活性剤濃度を有するサンプルについて、アッセイされるサンプルの濃度を本方法の検出範囲に入れるために希釈ステップを用いることもできる。
【００６６】
第２の見地において、この発明は、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出および／または定量化するために、キットを提供し、本キットは、すなわち
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料は、サンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
本発明の第１の見地に従った方法を実行するための指示
を含む。
【００６７】
キットにおいて用いる陽イオン性染料には、開示した方法に関して以上に記載するような陽イオン性染料を包含することができる。そのようなものとして、若干の具体化において、陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる。
【００６８】
若干の具体化では、キットはさらに、開示した方法に関して以上に記載するように、サンプルと実質非混和性である溶媒を含むことができる。そのようなものとして、若干の具体化においては、溶媒には、酢酸エチルが含まれる。
【００６９】
さらなる具体化において、この発明のキットはまた、サンプルを、陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるための反応容器をさらに含むことができる。
【００７０】
キットにおいて含まれる反応容器は、試験管、ねじぶたキャップチューブまたは容器、フラスコ等のような、この発明によるアッセイのための任意の適切な反応容器であることができる。
【００７１】
またさらなる具体化において、キットは、１種またはそれよりも多くの参照物体を含むことができ、それぞれには、溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化するために、１種またはそれよりも多くの基本色が含まれる。
【００７２】
既知濃度の陰イオン性界面活性剤を有するサンプルについてアッセイを行うとき、１種またはそれよりも多くの基本色が溶媒相の色と対応する。一連の適切な基本色を、サンプルにおける既知の陰イオン性界面活性剤濃度の範囲に対応させ、キットにおいて含めることができる。このようにして、アッセイを陰イオン界面活性剤の未知濃度を有するサンプルについて行うとき、アッセイを行った後の溶媒相の色を１種またはそれよりも多くの基本色と比較し、未知濃度を有するサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度の評価を提供することができる。
【００７３】
１種またはそれよりも多くの基本色を含む１種またはそれよりも多くの「参照物体」は、カラーチャートのような任意の適したカラー対象物を含むことができる。代わりに、１つまたはそれよりも多くの基本色は、反応容器上に印刷され、またはキットの包装中に組み込まれるような、キットの他の構成要素の１つまたはそれよりも多くに組み込むことができる。
【００７４】
上述するように、この発明のキットは、任意の適した陰イオン性界面活性剤を検出するために用いることができる。しかしながら、若干の特定の具体化において、この発明のキットは水性膜形成泡および／またはフッ素化陰イオン性界面活性剤の陰イオン性界面活性剤成分を検出するのに適する。
【００７５】
本発明を、以下の非制限的例によってさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＬＡＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＬＡＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相での吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＬＡＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図２】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＳＤＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＳＤＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＳＤＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図３】ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、較正標準としてＰＦＯＳを使用して示す。パネルＡは、ＭＢＡＳアッセイを、サンプルにおいてＰＦＯＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。パネルＢは、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイを、サンプルにおいてＰＦＯＳの濃度を変動させて用いた後の溶媒相の吸光度を示す。
【図４Ａ】図４は、様々な染料／溶媒の組合せを使用した陰イオン性界面活性剤の検出方法の比較を示す。いずれの場合においても、検出される陰イオン性界面活性剤は様々な濃度のＳＤＳであった。パネルＡは、メチレンブルー／ジクロロメタンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｂ】パネルＢは、アクリジンオレンジ／トルエンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｃ】パネルＣは、ブリリアントグリーン／トルエンに基づく方法についての結果を示す。
【図４Ｄ】パネルＤは、マラカイトグリーン／酢酸エチルに基づく方法についての結果を示す。
【図５】０．５グラムのシリカＳＰＥカラム上における濃縮後、ＬＡＳ標準の増大する容量（ｍＬ）の吸光度を示す。
【実施例】
【００７７】
例１
エチルバイオレットエチルアセタート活性物質（ＥＶＥＡ−ＡＳ）アッセイ
【００７８】
この発明の１種の具体化による陰イオン性界面活性剤の検出のための方法を提示する。この方法は染料エチルバイオレットと溶媒として酢酸エチルとの組合せを用い、そしてこうした前述したようなＥＶＥＡ−ＡＳ方法の具体化である。
【００７９】
以下に述べるように、標準的なＭＢＡＳ方法と比較するとき、この方法は陰イオン性界面活性剤のより一層低い濃度に対してより一層高い感度があり、有毒な溶媒であるクロロホルムへの曝露を伴わずに本分野において用いることができる。
材料および方法
【００８０】
本方法において用いるためのすべてのガラス製品を、アセトンで３回およびメタノールで３回により洗浄した。ガラス製品は洗剤によって洗浄しなかった。
【００８１】
２００ｍＬのミリＱ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水において０．００６４ｇのエチルバイオレットを含むエチルバイオレット溶液（１Ｌにつき３２ｍｇ）を調製した。
【００８２】
本アッセイを実行するために、１ｍＬのエチルバイオレット溶液（上述）を８ｍＬの水サンプルに加えた。その後、３ｍＬの酢酸エチルを水サンプルに加えた。次に、安定にし、そして二つの相を形成されるのを許す前に、サンプル−染料−溶媒混合物を激しく振動させた。
【００８３】
次に、着色した染料−界面活性剤複合体の存在を酢酸エチル溶媒相において算定した。非酸性化した検量線（ＬＡＳ）または非酸性の標準的な呈色チャート（カラーレーション・チャート）を、サンプル中の陰イオン性界面活性剤濃度を評価するために用いた。
【００８４】
代わりの具体化においては、溶媒相において着色した染料−界面活性剤複合体の存在を検出するために分光光度計を用いた。この具体化において、溶媒相の吸光度は５９５ｎｍにて測定された。
データおよび結果
【００８５】
図１、２および３は、ＭＢＡＳアッセイとＥＶＥＡ−ＡＳアッセイとの比較を、陰イオン性界面活性剤の３つの較正標準を用いて示す。
【００８６】
図１、２および３に示すように、各々の陰イオン性界面活性剤標準を用いたＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのための較正線のより一層大きな傾斜は、ＥＶＥＡ−ＡＳ法がＭＢＡＳアッセイよりも高い分解能をもたらすことを指し示した。すなわち、ＥＶＥＡ−ＡＳ法は、吸光度、そしてその後、相当する各々の標準の濃度について、溶媒相における色変化において、ＭＢＡＳアッセイよりも高い増大をもたらす。
【００８７】
５９５ｎｍでの分光光度法によるプレートリーダーを使用するＥＶＥＡ−ＡＳの検出限界は、０．０２ｍｇ／ＬのＬＡＳであり、それに対して、６５２ｎｍでのＭＢＡＳでは０．０２５ｍｇ／ＬのＬＡＳである。
【００８８】
検出の視覚的限界、すなわち、ＥＶＥＡ−ＡＳ方法の、色の参照を用いる視覚的比較による染料−界面活性剤複合体の検出および／または定量化は、０．０７５ｍｇ／ＬのＬＡＳであり、それに対し、ＭＢＡＳアッセイでは０．１７５ｍｇ／ＬのＬＡＳである。
【００８９】
ＥＶＥＡ−ＡＳ抽出方法の分光光度計に基づく検出方法について示唆される較正範囲は、０．０２ｍｇ／Ｌから３．２５ｍｇ／Ｌまでである。ＭＢＡＳアッセイの検出限界は０．０２５ｍｇ／Ｌにて発表されている。
【００９０】
例２
ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイの染料／溶媒の組合せを用いる比較
【００９１】
図４は、陰イオン性界面活性剤の検出のためのアッセイにおいて様々な代わりの染料／溶媒の組合せを使用して得られる結果の比較を示す。これらのアッセイにおいて用いた構成要素および結果を以下の表２に提示する。
【００９２】
比較アッセイのための各々の染料を、アクリジンオレンジ以外、同じ様に、そして例１におけるエチルバイオレットについて記載したのと同じ濃度で調製した。アクリジンオレンジを、ミリＱ水における０．００５Ｍの濃度に調製した。
【００９３】
各々の場合において、本アッセイは、１ｍＬの適正な染料溶液を、既知濃度の陰イオン性界面活性剤ＳＤＳ含有の８ｍＬの水サンプルに加えることによって行った。
【００９４】
その後、３ｍＬの適正な溶媒を水サンプルに加えた。サンプル−染料−溶媒混合物を次に、安定化し、そして二つの相が形成されるのを許す前に、激しく振動させた。
【００９５】
溶媒相における着色した染料−界面活性剤複合体の形成を、次に分光測定を用いて決定した。
【００９６】
【表２】
１ＳＤＳを用いた較正線の傾斜により表される相対分解能
２例１から採取されたデータ
【００９７】
加えて、ＥＶＥＡ−ＡＳアッセイは、試験された各々の他の染料／溶媒の組合せよりも陰イオン性界面活性剤ＳＤＳについての分解能を増大させた（較正線の傾斜によって測定されるように）。
【００９８】
例３
固相抽出
【００９９】
若干の環境サンプルのような、若干のサンプルについて、陰イオン性界面活性剤を検出するのに先立ち、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤を濃縮することが望ましいことがある。例えば、原サンプルにおける界面活性剤の濃度が低く、そしてアッセイの検出限界より潜在的に低いとき、サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を初めに濃縮するのが望ましい場合がある。
【０１００】
サンプルの濃縮が必要なとき、陰イオン性界面活性剤を、固相抽出（ＳＰＥ）を用いてサンプルにおいて濃縮することができる。開示した方法とともに用いるのに適する模範的なＳＰＥのプロトコルを以下に説明する。
【０１０１】
水サンプルを、あらゆる８ｍＬの水サンプルに１滴の１Ｍ塩酸を、またはあらゆる８ｍＬの水サンプルに３−４滴の１Ｍ硝酸（ＨＮＯ３）を加えることにより、酸性化した。
【０１０２】
０．５グラムのシリカＳＰＥ媒体を、２００℃において４−６時間シリカを活性化した後に使用した。ＳＰＥ媒体を次に〜（約）５ｍＬのアセトンと共に充填した。充填後、次にＳＰＥ媒体を〜５ｍＬのＭＱ水を用いて２−３回すすいだ。
【０１０３】
すすいだ後に、サンプルを〜５−６ｍＬ／分の速度において最小限の真空の下で媒体上に負荷（ロード）した。サンプルにおける陰イオン性界面活性剤はＳＰＥ媒体に結合した。
【０１０４】
ＳＰＥ媒体に結合した陰イオン性界面活性剤を、次に〜１−２ｍＬ／分の速度で、ＳＰＥ媒体から２ｍＬのアセトンにおいて溶出した。
【０１０５】
ＳＰＥ媒体からの溶出物（陰イオン性界面活性剤を含む）を、次にＥＶＥＡ−ＡＳアッセイのために上述のように８ｍＬのＭＱ水、３ｍＬの酢酸エチルおよび１ｍＬのエチルバイオレット溶液と混合した。次に、２ｍＬのアセトン呈色チャートを用いた較正曲線（検量線）（ＬＡＳ）を、サンプルにおける陰イオン性界面活性剤の濃度を評価するために用いた（サンプルの濃度を考慮する）。
【０１０６】
平均して、ＭＢＡＳアッセイにおいて使用する中間レベルのＬＡＳ標準（ほぼ０．３７５ｍｇ／Ｌ）の回収率は、サンプルを濃縮するためのＳＰＥ方法において１００％であったが、以下に示す表３を参照。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
０．５グラムの活性化したシリカＳＰＥの使用により、ＳＤＳおよびＰＦＯＳの双方についても＞８５％の回収率が実現された。
【０１０９】
この方法を、興味のある化合物の損失を伴わずに、サンプルのより一層高い容量についての試験を検証するために、ＳＰＥカートリッジ（図５）上のＬＡＳの標準の容量を増やして試験した。
【０１１０】
これらの結果は、ＳＰＥが、ＥＶＥＡ−ＡＳ方法の線形範囲内にまで、希薄サンプルにおける陰イオン性界面活性剤を濃縮するために使用できることを指し示す。
【０１１１】
本明細書において説明する発明が、特に記載しているもの以外の変形および修飾を受けやすいことは、この技術における熟練者には認められることである。本発明が、すべてのこのような変形および修飾を含むことは理解されるべきである。本発明はまた、この明細書において個々にまたは集合的に述べ、または指し示すすべてのステップ、特長、組成物および化合物、および任意の２つまたはそれよりも多くのステップまたは特長の任意の、およびすべての組合せをも含む。
【０１１２】
また、本明細書において用いるように、単数形「ａ（１つ）」、「ａｎ」および「ｔｈｅ（その）」は、文脈上既に他に指定しない限り、複数の形態も含むことに注目されなければならない。このように、例えば、「陰イオン性界面活性剤」の言及は、ある種の表面活性剤ならびに２つまたはそれよりも多くの界面活性剤の種類、その他を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法であって、
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料はサンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む、方法。
【請求項２】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれ、および溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルは水サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルは土壌サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるのに先立ち、サンプルにおける１種またはそれよりも多くの陰イオン性界面活性剤の濃度を高めるために、方法はさらに濃縮ステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
濃縮ステップには、固相抽出が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
染料−界面活性剤複合体は、溶媒において光学的検出方法を用いて検出され、および／または定量化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
光学的検出方法には、溶媒の外観検査が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
外観検査には、溶媒の色と１種またはそれよりも多くの視覚的基本色との比較が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光学的検出方法には、分光測定が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
陰イオン性界面活性剤には、水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分が含まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
陰イオン性界面活性剤には、フッ素化陰イオン性界面活性剤が含まれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するためのキットであって、
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料はサンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実行するための指示
を含む、キット。
【請求項１６】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
キットはさらに、サンプルと実質非混和性である溶媒を含む、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
キットはさらに、サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるための反応容器を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
キットはさらに１種またはそれよりも多くの参照物体を含み、各々は、溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化するために、１種またはそれよりも多くの基本色を含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
キットは水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分を検出するためのものである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
キットはフッ素化陰イオン性界面活性剤を検出するためのものである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
図および／または例のいずれかに関して、本明細書において実質説明されたような、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
図および／または例のいずれかに関して、本明細書において実質説明されたような、請求項１５に記載のキット。
【請求項１】
サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するための方法であって、
陽イオン性染料を提供することであり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料はサンプル由来の陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であること、
サンプルと実質非混和性である溶媒を提供すること、
溶媒において選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、サンプルまたは抽出物における陰イオン性界面活性剤が陽イオン性染料と複合体を形成するように、陽イオン性染料を、サンプルおよび溶媒または溶媒におけるサンプルの抽出物のいずれかと接触させること、
溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化することであり、溶媒における染料−界面活性剤複合体の存在はサンプルにおける陰イオン性界面活性剤の存在を指し示すこと
を含む、方法。
【請求項２】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれ、および溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルは水サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルは土壌サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるのに先立ち、サンプルにおける１種またはそれよりも多くの陰イオン性界面活性剤の濃度を高めるために、方法はさらに濃縮ステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
濃縮ステップには、固相抽出が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
染料−界面活性剤複合体は、溶媒において光学的検出方法を用いて検出され、および／または定量化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
光学的検出方法には、溶媒の外観検査が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
外観検査には、溶媒の色と１種またはそれよりも多くの視覚的基本色との比較が含まれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
光学的検出方法には、分光測定が含まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
陰イオン性界面活性剤には、水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分が含まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
陰イオン性界面活性剤には、フッ素化陰イオン性界面活性剤が含まれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおいて陰イオン性界面活性剤を検出し、および／または定量化するためのキットであって、
陽イオン性染料であり、サンプルと実質非混和性である溶媒に選択的に溶解する検出可能な染料−界面活性剤複合体を形成するために、陽イオン性染料はサンプルからの陰イオン性界面活性剤と複合体を形成することが可能であるもの、および
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実行するための指示
を含む、キット。
【請求項１６】
陽イオン性染料には、エチルバイオレットまたはその誘導体が含まれる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
キットはさらに、サンプルと実質非混和性である溶媒を含む、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
溶媒には、酢酸エチルが含まれる、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
キットはさらに、サンプルを陽イオン性染料および／または溶媒と接触させるための反応容器を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
キットはさらに１種またはそれよりも多くの参照物体を含み、各々は、溶媒において染料−界面活性剤複合体を検出し、および／または定量化するために、１種またはそれよりも多くの基本色を含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
キットは水性膜形成泡の陰イオン性界面活性剤成分を検出するためのものである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
キットはフッ素化陰イオン性界面活性剤を検出するためのものである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
図および／または例のいずれかに関して、本明細書において実質説明されたような、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
図および／または例のいずれかに関して、本明細書において実質説明されたような、請求項１５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５４０９７４（Ｐ２０１０−５４０９７４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２８２４１（Ｐ２０１０−５２８２４１）
【出願日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６４９１
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１００９８２３８）シーアールシー ケア プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月９日（２００８．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４６４９１
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５１００９８２３８）シーアールシー ケア プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]