骨関節炎を処置するための組成物および方法
本発明は、対象において異常な状態を処置するための組成物および方法を提供し、その際、異常な状態はその対象の筋骨格関節に影響を及ぼす。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本発明は、動物において異常な関節状態を処置するための組成物および方法に関するものであり、その際、異常な関節状態は動物の筋骨格関節に関係する。特に、本発明は異常な骨関節炎、リウマチ性関節炎および局所関節炎症を含む異常な筋骨格関節状態の処置、ならびにそのような異常な筋骨格関節状態に関連する症状の軽減に関する。本発明は、動物に差次発現する遺伝子、たとえば関節炎ではない動物と比較して関節炎の動物に差次発現する遺伝子を、本発明組成物の投与により調節することをも包含する。本発明は、それに関係する、イヌおよびネコを含む愛玩動物における新規バイオマーカーの同定、診断方法、組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002] 遺伝子は動物の発達に際して役割を果たすこと、また遺伝子発現の調節は動物の健康状態および健全性に影響を及ぼすある疾患または状態の発症に際して重要な役割を果たすことは、科学分野で一般に受け入れられている。また、遺伝子の差次発現がそのような疾患および状態の発症における一因であり、遺伝子発現パターンの評価はそのような疾患および状態の発症および制御を分子レベルで理解するためにきわめて重要なものとして広く認識されるようになった。遺伝子およびそれらと疾患の関係の理解を進めるために、差次遺伝子発現を研究するための多数の方法が開発された；たとえばＤＮＡマイクロアレイ、発現遺伝子タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＥＳＴ））、遺伝子発現の一連の解析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ））、ｍＲＮＡに関するサブトラクティブハイブリダイゼーション、サブトラクティブクローニングおよびディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）、ＲＮＡ−ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）、Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析、ならびにタンパク質マイクロアレイベースのタンパク質に対する抗体結合。
【０００３】
[0003] 哺乳動物の身体の実質的にすべての関節に軟骨がある。軟骨は身体の支持構造であり、線維状タンパク質（コラーゲン）の厚い束から構成され、これらが織成されて関節表面を形成している。プロテオグリカンは、コラーゲンが占めていない細胞外間隙を充填する。そのようなプロテオグリカンはタンパク質と糖の組合わせから構成される。各プロテオグリカンサブユニットは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られる修飾された糖の長い鎖からなるタンパク質コアを含む。グルコサミンはＧＡＧの最も重要な１成分であり、かつ前駆物質である。身体によるコラーゲンの合成は、ＧＡＧ合成に依存する。軟骨中の軟骨細胞はグルコサミンを利用してＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルクロン酸を生成し、これらは身体によりヒアルロンの形成に利用される。ヒアルロンは動物の身体の関節に潤滑性を与える。
【０００４】
[0004] 軟骨は動物の身体において、関節内における柔軟性、加圧下での圧縮性、クッション性、引張り強さ、動作の範囲、および動きの滑らかさ付与するために重要である。軟骨を含む関節の例には、手指および足指、首、膝、股関節、肩などが含まれる。動物は軟骨が分解する多くの状態に罹患する可能性があり、それにより関節の柔軟性、圧縮性の低下が生じ、その結果しばしば関節および／または関節周囲組織の全体的炎症、ならびに場合により骨関節炎およびリウマチ性関節炎などの状態が発症する。その際、そのような動物は関節機能が著しく損なわれ、かつ痛みを感じる。
【０００５】
[0005] 関節炎は筋骨格障害である。骨関節炎は、動物およびヒトにおいて最も一般的なタイプの関節炎である。骨関節炎はヒトおよび愛玩動物に一般的に起きる変性性の関節疾患であり、この疾患は関節軟骨の変性性変化を特徴とし、プロテオグリカンおよびコラーゲンの損失ならびに軟骨周縁における新生骨の増殖を伴う。これらの変化には、滑膜内の変動性炎症反応が付随する。関節表面のヒアリン軟骨の主な欠損は、マトリックスのグリコサミノグリカンとコラーゲン線維の含量比の変化である。関節の軟骨直下にある骨は軟骨下骨と呼ばれる。これらの軟骨下骨は、それを覆う、それ自体は血管、神経またはリンパ組織をもたない軟骨に栄養を供給する。
【０００６】
[0006] 自然な軟骨侵食は加齢に伴って起きるが、関節に過度の負荷を与えることによっても生じる可能性があり、肥満症、遺伝、外傷、循環低下、骨配列不良および反復ストレスが関節の状態を増悪させる可能性がある。フリーラジカル損傷は骨関節炎の発症に関与する可能性があると推定されている。
【０００７】
[0007] 軟骨細胞として知られるヒアリン軟骨細胞は周囲の細胞外マトリックスを産生および維持する。軟骨マトリックスの恒常性の維持は、マトリックスタンパク質、たとえばＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの異化作用に依存する。これらのタンパク質は消化されて、軟骨細胞により合成される新たなタンパク質で置き換えられる。異化作用は、一部はタンパク質分解酵素、たとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびアグリカナーゼなどのタンパク質により行われる。正常な動物では合成と分解の間にバランスが達成され、これによって健康な軟骨が維持される。このバランスが分解の方へシフトすると、続いて異常発生が起き、結果的に関節の炎症および骨関節炎が生じる可能性がある。
【０００８】
[0008] 軟骨の恒常状態は、軟骨細胞間の細胞間シグナル伝達を介した調節に依存する。したがって、軟骨細胞はシグナル伝達分子を産生し、かつ応答する。そのようなシグナル伝達分子には、細胞の代謝に直接作用することができるサイトカインおよび増殖因子を含めることができる。細胞間シグナル伝達は複雑であり、完全には解明されていない。ＴＧＦ−ベータなどの増殖因子分子が関係しており、それらはＩＩ型コラーゲンの産生を促進しかつコラーゲン開裂を阻害すると考えられる。サイトカイン、たとえばＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１−ベータも役割を果たす。これらのサイトカインは、軟骨を分解することができるプロテアーゼの産生を促進すると考えられる。細胞間シグナル伝達の結果として他の多数の複雑な相互作用が起きていると考えられる。
【０００９】
[0009] 細胞間シグナル伝達プロセスの複雑さのため、起きている相互作用を遺伝子レベルで理解することがきわめて望ましい。前関節炎または関節炎状態における調節異常な遺伝子の検出は、異常な筋骨格関節障害の生態を特にゲノム範囲で理解するのに役立つ。関係する生物学的経路を遺伝子発現プロファイリングよってより詳細に理解することは、保健医薬、栄養医薬（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）および栄養（食事）による疾患経路への介入法を開発するのに役立つであろう。これらの方法は、基礎疾患である異常な筋骨格関節状態の予防、早期検出および治療、ならびにそのような異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎の予後のモニタリングを可能にするであろう。そのような障害の病理に関係する調節異常な遺伝子は、適切な医薬、栄養医薬および栄養（食事）による介入法の選択を最適化するための重要なバイオマーカーとして利用できる。
【００１０】
[0010] さらに、骨関節炎の経過を反転させる薬物を同定すべきである。現在使用できる療法薬は、炎症を軽減し、および／または痛みを緩和するために用いられる。現在の療法は、骨関節炎などの筋骨格関節障害を処置するために非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として知られるクラスの薬物を用いるが、これらの療法は特に消化器障害を含めたさまざまな欠点をもち、またそれらは軟骨形成を阻害する可能性もある。
【００１１】
[0011] 大型犬はそれらの加齢に伴って関節炎を発症する場合がある。大型品種犬はそれらの大きな体格および／または遺伝的素因のため関節炎を発症しやすい。大型犬が関節炎その他の軟骨状態のリスクをもつ唯一の動物ではない。関節炎その他の変性性関節疾患はイヌに普通に認められており、そのような状態がネコに一般にみられることが示されている。ネコ類の骨関節炎は、主に１０歳以上の高齢のネコ類が罹患する疾患である。軟骨を冒す異常な筋骨格関節障害を発症するリスクをもつ動物には、哺乳動物、たとえばイヌ類、ネコ類、ウマ類、ヤギ類、ヒツジ類、ブタ類、ウシ類、ヒトおよび霊長類の種、ならびにシチメンチョウおよびニワトリを含めた鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
[0012] 食事は代謝に根本的に関係するので、疾患の原因および進行において重要な役割を果たす。疾患調節遺伝子は、栄養因子によってある程度調節される。したがって、食物中に栄養素として存在する食事成分は、遺伝子発現を転写および翻訳のレベルで、ならびに特定の翻訳後修飾において調節する可能性がある。それらは分解および酵素活性にも関係する可能性がある。栄養素レベルは代謝経路の平衡に影響を及ぼす可能性がある。代謝経路はしばしば複雑であり、異なる代謝経路間で多くの重複および相互作用を伴う場合がある。１種類の酵素、増殖因子、サイトカインまたは代謝産物の濃度の変化が、疾患関連の生理に関係する多数の代謝経路に影響を及ぼす可能性がある。ホルモンおよび他の細胞シグナル伝達分子が食事により調節されることは十分に理解されており、疾患の発症および進行に関与することも知られている。
【００１３】
[0013] 同じ疾患表現型が異なる代謝経路の障害から生じる場合があり、かつ各動物の遺伝子構成は異なっており、これらにより栄養因子および環境因子を含めた同じ因子に対する応答に変動が生じる。遺伝因子、栄養因子および環境因子の相互関係は、動物の疾患の病因、予防、治療および進行を理解する際に重要である。種々の疾患および障害に関連する栄養素に対する遺伝子発現応答を見いだすことにより、異常な筋骨格関節障害などの疾患に対して罹病性である動物のための食事を処方することができ、さらに基礎疾患の診断、治療および予後モニタリングが可能になる。
【００１４】
[0014] 栄養成分は、ｍＲＮＡ産生（転写）、ｍＲＮＡプロセシング、タンパク質産生（翻訳）および翻訳後修飾を含めた遺伝子発現に影響を及ぼし、これにより動物の代謝状態全体に影響を及ぼす。したがって、疾患の早期検出および疾患進行のモニタリングのためのバイオマーカーの利用、ならびに／あるいは遺伝子型に基づく食事は、動物、特に愛玩動物の疾患の予防または治療および新規療法の開発を可能にするであろう。食事は、議論の余地なく、疾患に対する罹病性を含めた動物の表現型に影響を及ぼす最も重要な環境因子である。
【００１５】
[0015] 遺伝子発現は、遺伝子機能の活性化因子および抑制因子により制御される不安定なプロセスにより調節されている可能性がある。栄養状態は、遺伝子転写速度に著しい変化を引き起こす可能性がある。多量栄養素、たとえばグルコース、脂肪酸およびアミノ酸、ならびに微量栄養素、たとえば鉄、亜鉛およびビタミンが、遺伝子発現を調節することができる。種々の生物活性食物成分、たとえばカロテノイド、フラボノイド、モノテルペンおよびフェノール系の酸は、遺伝子発現に影響を及ぼす転写因子として作用する可能性がある。これらの物質は遺伝子発現に直接的な作用をもつ傾向がある。他の状況では、腸内で細菌により発酵する食物繊維などの物質が短鎖脂肪酸などの栄養素の産生をもたらす可能性がある。そのような物質は、遺伝子発現の間接的な活性化因子または抑制因子として作用する可能性がある。
【００１６】
[0016] 転写および翻訳における栄養素に関係した変化の同定は、本明細書に記載するタイプの実験で検出することができる。本明細書の実施例においてプロファイリングした遺伝子の広範なアレイからみて、遺伝子の発現および量の変化は本明細書に教示する方法で容易に検出される。したがって、食事および代謝による遺伝子発現シグネチャーは、本明細書の実施例に教示する技術を用いて容易に確認できる。本発明のバイオマーカーは、動物に差次発現するタンパク質および／または核酸である。バイオマーカーの発現は、タンパク質または核酸のレベルで、当業者に既知の多様な方法を用いて評価することができる。
【００１７】
[0017] イヌ類およびネコ類のゲノムのスクリーニングに際し、これらの愛玩動物の食事の栄養成分に応答した遺伝子発現プロフィールについては現在までごく限られた研究が行われたにすぎない。癌の領域では、腫瘍のＣＧ分析のためにイヌ類の遺伝子マイクロアレイを用いた研究が行われている。Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260。他の研究が拡張型心筋症の分野で行われた。Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66: 1140-1155。現在のところ、骨関節炎に関するイヌ類のゲノムの研究はごく限られている。１研究において、ＭＩＧ−６遺伝子が骨関節炎の高リスクグループのイヌにおいて増加することが見いだされ、この遺伝子がイヌの軟骨分解および軟骨生成に関与する可能性があるという仮説が立てられた。Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482-486。
【００１８】
[0018] 本明細書に記載するように健康な動物集団を異常な筋骨格関節障害などの疾患を伴う集団と対比した研究は、これまで広範には実施されていない。イヌ類のゲノムに関して入手できるデータはほとんどなく、ネコ類のゲノムに関してはこれよりはるかに少ない。本明細書に含まれる遺伝子発現データにより、イヌおよびネコの軟骨分解に関連する遺伝子が同定される。そのような遺伝子発現データは、そのような遺伝子の発現を好ましい様式で調節することができる栄養組成物の同定を可能にする。これは、炎症に一般に関連する遺伝子に関しても当てはまる。ネコ類における同様なデータをさらに本明細書、図面、および本明細書中の実施例に示す。
【００１９】
[0019] 本明細書および実施例に含まれる遺伝子発現データは、ここに記載する遺伝子発現プロフィールに基づく多様な望ましい発明を可能にする。これらのデータにより、栄養供給のバイオマーカーとしての遺伝子発現生成物を同定および定量し、基礎疾患である異常な筋骨格関節障害を予防、同定および治療することができる。本発明方法の実施の結果として誘導される遺伝子発現データにより、そのような異常な筋骨格関節障害の進行をモニターすることもできる。これらの発明はさらに、基礎疾患および炎症を処置するために、本明細書に示す知見に基づいて、そのような異常な筋骨格関節障害に罹患しやすい罹病性動物亜集団を同定し、そのような障害を予防または治療するのに最適な食事を同定し、かつ医薬、栄養医薬および栄養（食事）介入法を同定するための、遺伝子検査を含む。本発明は、そのような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物からの組織および血液試料を分析するための、早期疾患検出用バイオマーカー、標的療法薬、診断試薬およびキットをも含む。
【００２０】
[0020] 動物、たとえば愛玩動物、たとえばネコおよびイヌのための食物を設計する際には、良好な栄養供給による動物の最適な健康およびウェルネスが重要な目標である。しかし、動物がその食物をおいしくないと知ったため、動物がその食物を食べることを拒絶もしくは拒否し、または動物によるその食物の摂取量が限られるならば、最も栄養のある動物用食物ですらほとんど役立たない。したがって本明細書中に述べる発明はさらに、そのような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物の健康およびウェルネスを増進できる栄養組成物を含む。したがって本発明には、愛玩動物が食べられる食物組成物であって、治療および予防効力をもち、かつ現在市販されている愛玩動物用食品より高い嗜好性をもつ組成物が包含される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260
【非特許文献２】Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66: 1140-1155
【非特許文献３】Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482-486
【発明の概要】
【００２２】
[0021] 本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む組成物に関する。本発明は、動物、特に愛玩動物に投与するための栄養組成物、食事サプリメント、栄養医薬、およびおやつ（ｔｒｅａｔ）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
[0022] 本発明は、異常な筋骨格関節状態を伴う動物を処置する方法であって、その対象に少なくとも１種類の本発明組成物を投与することを含む方法にも関する。
[0023] 本発明はさらに、異常な筋骨格関節状態を伴う動物において発症を遅延させ、または動物の痛みを軽減する方法であって、その対象に少なくとも１種類の本発明組成物を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
[0024] １態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、イヌ用ペットフード組成物を包含する。
【００２５】
[0025] 他の態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、ネコ用ペットフード組成物を包含する。
【００２６】
[0026] 他の態様は、その必要がある動物において、異常な筋骨格関節障害を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0027] さらに他の態様は、その必要がある動物において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される異常な筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２７】
[0028] 本発明のさらに他の態様は、その必要がある愛玩動物において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２８】
[0029] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２９】
[0030] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３０】
[0031] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0032] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３１】
[0033] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、リウマチ性関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0034] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、リウマチ性関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３２】
[0035] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、関節の炎症を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0036] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、関節の炎症を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３３】
[0037] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、１種類以上の遺伝子または遺伝子セグメントを包含する。
【００３４】
[0038] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、２種類以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの組合わせを包含する。
【００３５】
[0039] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な、２種類以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブの組成物を包含する。
【００３６】
[0040] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の差次発現を検出するための、方法および組成物を包含する。
【００３７】
[0041] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の発現プロフィールに対する被験物質の作用を測定するための方法であって、被験物質がそれらの動物においてそのような障害を調節するのに有用な可能性があるかどうかを判定するための被験物質のスクリーニング方法としての方法を包含する。
【００３８】
[0042] 本発明の他の態様は、動物が異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を発症する可能性がある予後を明確にするための方法、または動物がそのような筋骨格関節障害を伴うという診断法を開発する際の方法を包含する。
【００３９】
[0043] 本発明のさらに他の観点は、本発明が、動物、特に愛玩動物における異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎の新規バイオマーカーの同定、およびインビボでのそのようなバイオマーカーの特徴的な遺伝子発現パターンに基づいてそのような動物における異常な筋骨格関節障害を検出する方法に関するということである。具体的には本発明は、身体試料、好ましくは血液試料において、対照発現レベルと比較した少なくとも１種類のバイオマーカーの差次発現を検出することを含み、その際、そのようなバイオマーカーの差次発現の検出により、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎を伴う動物が特異的に同定される。したがってそのような方法は、正常な動物または対照動物からの細胞と比較して異常な筋骨格関節障害において差次発現する少なくとも１種類のバイオマーカーの検出に依存する。
【００４０】
[0044] 異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態に関係する種々のイヌ類バイオマーカーを調節する必要がある動物にバイオマーカーの調節に有効な量の本発明組成物を投与することによりそのバイオマーカーを調節することも本発明の態様である。異常な筋骨格関節障害に関係する調節可能なバイオマーカーの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アネキシンＡｌ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢｌ、ＩＬ−ｌβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、Ｃ０Ｌ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２、Ｃ２Ｃ、Ｃ１，２Ｃ、ＦＬＡＰ、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２ならびにアグリカン。
【００４１】
[0045] 本発明のバイオマーカーは、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態を伴うかまたは発症する可能性のある動物に差次発現するタンパク質および／または核酸である。
【００４２】
[0046] 本発明においてはさらに、変性性筋骨格関節疾患の身体的および形態的特徴を検出できる伝統的な診断法と組み合わせて本発明方法を使用できるものとする。たとえば骨関節炎の診断を裏付けるために、動物の血液試料から得た細胞における骨関節炎バイオマーカーに関する遺伝子の差次発現の解明を一般的な診断（たとえば放射線）技術と組み合わせることができる。
【００４３】
[0047] さらに他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーをコードする核酸またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイズする１種類以上の核酸プローブを含む組成物に関する。
【００４４】
[0048] 他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーを発現する遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物に関する。
[0049] 本発明は、動物において異常な筋骨格関節障害を診断するためのキットであって、本発明のバイオマーカーの発現を検出するのに使用できる構成要素（本明細書に記載する組成物およびマイクロアレイが含まれるが、これらに限定されない）を含むキットにも関する。
【００４５】
[0050] 他の観点において、本発明は動物において変性性筋骨格関節状態を治療または改善するそれらの能力を試験することができる生物活性食事成分または他の天然化合物（以下において“食事成分”または“成分”と呼ぶ）を同定するための下記を含む方法に関するものであることも本発明に含まれるものとする：（ａ）表２および／または表３に開示する１種類以上のバイオマーカーのＲＮＡまたはタンパク質生成物を発現することができる細胞を、被験成分と接触させ；（ｂ）被験成分と接触させた細胞において産生された該ＲＮＡおよび／または生成物の量を測定し；そして（ｃ）被験成分と接触させた細胞内の該ＲＮＡおよび／またはタンパク質生成物の量を、被験成分と接触させなかった対応する対照細胞内に存在する同じＲＮＡまたはタンパク質生成物の量と比較し；その際、対照における量と対比して該ＲＮＡまたはタンパク質生成物の量が変化した場合、その成分は異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態を治療または改善するそれらの能力について試験すべきものであると同定される。
【００４６】
[0051] 本発明の他の観点は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するための方法であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物である。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオマーカーがアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される、前記方法である。
【００４７】
[0052] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するためのキット、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方法を実施するためのキットであり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物でり、場合によりさらにバイオマーカーに連結した検出可能な作用剤を含む。
【００４８】
[0053] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するための試薬、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方法を実施するための試薬であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したこの少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物であり、場合によりさらにバイオマーカーに連結した検出可能な作用剤を含む。
【００４９】
[0054] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後判定するためのバイオマーカーとしての、特に異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後判定するキットの作製のための、表２および／または表３に同定した１種類以上のポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の使用である。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオマーカーが、アネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択されるキットである。さらに他の態様は、そのようなキットであって、試薬および装置がオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ、およびフォーカスト遺伝子チップ、またはその組合わせを含めたＤＮＡマイクロアレイ分析材料を含むものである。
【００５０】
[0055] 本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、この方法は、その動物に由来する組織試料または体液検体を含む試料を用意し；試料または検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物のレベルを検出し；そして試料または検体中のバイオマーカーのレベルを対照試料中のそれらのバイオマーカーのレベルと比較することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５１】
[0056] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、この方法は、前記方法の試料または検体を、前記バイオマーカーに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む第１プライマー、および前記バイオマーカーポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む第２プライマーと接触させ、増幅反応を実施し、そして試料または検体中のバイオマーカーポリヌクレオチドの増幅生成物を定量することを含む。
【００５２】
[0057] 本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管理の経過の有効性を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試料または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レベルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体における該バイオマーカーの第２レベルを、処置経過期間中の第２時点で測定し；そして（ｃ）第１時点および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み；その際、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５３】
[0058] 本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管理の経過の進行を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試料または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レベルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体における該バイオマーカーの第２レベルを、処置経期間中の第２時点で測定し；そして（ｃ）第１および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み；その際、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５４】
[0059] 本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を診断するための分子を同定する方法であり、この方法は、（１）その動物に由来する組織試料または体液検体であって、表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物を含む試料を用意し；（２）試料または検体を被験分子と接触させ；（３）被験分子が該バイオマーカーに結合するかまたはそれにより結合されるかを判定することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の発現差をもつ。
【００５５】
[0060] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするための、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症状を示す動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１種類以上のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と陽性対照の間の差次遺伝子発現を判定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィール間に統計的に有意の差次遺伝子発現がない場合には骨関節炎の存在が指摘される；その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５６】
[0061] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするための、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症状を示さない対照動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１種類以上のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と対照動物の基準試料との間の差次遺伝子発現を判定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィール間に１倍の差次遺伝子発現がある場合には骨関節炎の存在が指摘される；その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５７】
[0062] 本発明の他の態様は、ある作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力をスクリーニングするための、下記の段階を含むアッセイ法である：ｉ）骨関節炎に典型的な差次遺伝子発現プロフィールを示す動物に由来する組織試料から核酸対照試料を単離し、この対照試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｉ）この組織試料を作用剤に付与し；ｉｉｉ）組織試料を作用剤に付与した後の段階ｉｉ）の組織試料から核酸試験試料を単離し、この試験試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｖ）対照試料と試験試料の間で遺伝子発現の生成、安定性、分解および／または活性化を比較して、試験試料と対照試料の間の差次遺伝子発現プロフィールを求め；その際、対照試料と比較した試験試料の差次遺伝子発現プロフィールは、その作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力の指標となる。
【００５８】
[0063] 本発明のさらに他の態様は、インフォーマティブアレイ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ａｒｒａｙ）に使用するために組織試料間で差次発現する複数の遺伝子を同定するための、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プローブを用意し；第２組織試料に由来する第２セットの不均一核酸プローブを用意し；ある生物学的プロセスの遺伝子に由来する複数の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第１発現レベルを測定し；該アレイを第２セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベルを測定し；ハイブリダイズした配列について第１発現レベルを第２発現レベルと比較することにより、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し；そして同定した遺伝子のランキングを、下記からなる段階群から選択される段階により確立する：第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝子をより低い差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差をもつ遺伝子より高くランキングする；その際、遺伝子は表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５９】
[0064] 本発明の他の態様は、核酸アレイをインフォーマティブアレイに変換するための、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プローブを用意し；第２組織試料に由来する異なる第２セットの不均一核酸プローブを用意し；複数の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第１発現レベルを測定し；このアレイを第２セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベルを測定し；同定した遺伝子に関する第１発現レベルと第２発現レベルの差に基づいて、下記からなる段階群から選択される段階により、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し：第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝子をより低い差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差をもつ遺伝子より高くランキングする；そして同定した複数の差次発現遺伝子からインフォーマティブアレイに収容する遺伝子を選択する；その際、遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺伝子から選択される。
【００６０】
[0065] 本発明のさらに他の態様は、骨関節炎をスクリーニングするために遺伝子発現を分析するための、下記の段階を含むコンピューター処理方法である：ｉ）組織試料のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ分析およびフォーカスト遺伝子チップ分析、またはその組合わせからなる群から選択される核酸マイクロアレイ分析から得られる複数の遺伝子発現信号の測定値を含むデータを、コンピューターベースの分析に適切な形態にコンパイルし；そしてｉｉ）コンパイルしたデータを分析し、その際、分析は多数のアップレギュレートされたバイオマーカー遺伝子およびダウンレギュレートされたバイオマーカー遺伝子から遺伝子ネットワークを同定することを含み、その際、バイオマーカー遺伝子は骨関節炎の存在または重症度に関連すると同定された遺伝子であり、それらの遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺伝子を含む。
【００６１】
[0066] 本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、選択した遺伝子の発現または選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補が調節する能力を測定することを含み、その際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物は、表２および／または表３に挙げた遺伝子または遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発現生成物である。
【００６２】
[0067] 本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつをインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、選択した遺伝子の発現または選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補が調節する能力を測定することを含み、その際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物は、表２および／または表３に挙げた遺伝子または遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発現生成物である。
【００６３】
[0068] 本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ）少なくとも１つの試料または試料混合物を１種類以上の被験薬物候補と接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定した遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる薬物候補を選択し、そのレベルを薬物候補と混合していない試料と比較する。
【００６４】
[0069] 本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつをインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ）少なくとも１つの試料または試料混合物を１種類以上の被験栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつと接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定した遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつを選択し、そのレベルを栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつと混合していない試料と比較する。
【００６５】
[0070] 本発明の他の態様は、骨関節炎に対する動物の感受性をインビトロで判定する方法であり、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物からなる群から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を比較することを含む。
【００６６】
[0071] 本発明の他の態様は、骨関節炎を処置するための組成物を調製する方法であり、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎バイオマーカーの調節剤を含む組成物を調製することを含む。
【００６７】
[0072] 本発明の他の態様は、骨関節炎に対する処置の有効性を判定するための、下記の段階を含む方法である：（ａ）骨関節炎に罹患しておりかつその処置を受けていた動物に由来する生物試料を用意し、（ｂ）その試料における骨関節炎に関する１種類以上のバイオマーカーのレベルを測定して、その動物に関する発現プロフィールを作製し、そして（ｃ）その発現プロフィールを下記のものと比較する：ｉ）その被験動物から処置開始前に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉ）その被験動物から処置のより早い時期に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉｉ）骨関節炎に罹患していない対象に特徴的な比較可能な発現プロフィール；その際、骨関節炎に関する１種類以上のバイオマーカーは表２および／または表３に示す１種類以上の遺伝子の発現生成物を含む。
【００６８】
[0073] 本発明の他の態様は、骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力について動物用食物組成物を選択するための、下記の段階を含む方法である：ｉ）骨関節炎を伴う動物に由来する組織試料または生物体液検体の遺伝子発現プロフィールに関する第１データセットを含む少なくとも１つのデータベースにアクセスし；ｉｉ）生物活性食事成分が前記の遺伝子発現プロフィールに及ぼす影響に関する第２データセットを含む少なくとも１つのデータベースにアクセスし；そしてｉｉｉ）第１および第２データセットを用いる第１アルゴリズムの使用により第１データセットおよび第２データセットを処理して、その動物のための食物組成物を選択および調製するのに有用な栄養処方を導き出し；そしてｉｖ）その栄養処方をユーザー可読フォーマットに保存または使用する。
【００６９】
[0074] 本発明のさらに他の目的、特徴および利点は当業者に容易に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】[0075] 図１は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図２】[0076] 図２は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図３】[0077] 図３は、関節炎ではないネコと比較した関節炎のネコの炎症に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現増大を示す。
【図４】[0078] 図４は、組成物ｊ／ｄとして同定された本発明組成物の１態様を示す。
【図５】[0079] 図５は、正常なイヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図６】[0080] 図６は、関節炎ではない（非関節炎）イヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ１，２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図７】[0081] 図７は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図８】[0082] 図８は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図９】[0083] 図９は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄをそれぞれ１４および１８日間イヌに与えた後のＥＰＡおよびＤＨＡの血清レベルを示す。
【図１０】[0084] 図１０は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ２Ｃの発現調節を示す。
【図１１】[0085] 図１１は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ１，２Ｃの発現調節を示す。
【図１２】[0086] 図１２は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子ＣＸＴ−ＩＩの発現調節を示す。
【図１３】[0087] 図１３は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図１４】[0088] 図１４は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子ＣＸＴ−ＩＩのアップレギュレーションを示す。
【図１５】[0089] 図１５は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける軟骨修復に関連する種々の遺伝子のアップレギュレーションを示す。
【図１６】[0090] 図１６は、ネコ用組成物ｊ／ｄを与えた後のネコの運動性の増大を示す。
【図１７】[0091] 図１７は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌの慰安の改善の指標となる、イヌの夜間活動度低下を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
[0092] 本発明は動物における異常な状態を処置する組成物および方法に関連し、その際、異常な状態は動物の筋骨格関節に影響を及ぼす。本発明組成物は経口投与用として配合することができ、これには動物用飼料が含まれるが、これらに限定されない。動物用飼料は、その組成物をそのために配合したいずれかのタイプの動物に与えることができる。たとえば、飼料は愛玩動物用に配合することができ、これにはイヌまたはネコが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
[0093] 本明細書中で用いる異常な動物は、動物の筋骨格関節に影響を及ぼす状態に罹患していると診断された、もしくは罹患していると思われる動物、または本発明に含まれる遺伝子発現データからそのような状態に対する素因が示唆される動物である。たとえば、骨関節炎に罹患していると診断された、もしくは罹患していると思われるイヌまたはネコは、異常な動物とみなされる。
【００７３】
[0094] 本発明組成物は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸を含む。オメガ−３脂肪酸は当技術分野で周知である。オメガ−３脂肪酸は動物の健康に必須の栄養素であり、動物はそのような脂肪酸を形成できないか、または十分な量では形成できない。そのような脂肪酸は、本発明により教示される組成物および方法において食事成分（単数または複数）として用いられる。本発明に含まれる栄養組成物の配合は、一部はそのような栄養組成物が本明細書に記載するタイプの筋骨格関節障害に罹患している動物の遺伝子発現に及ぼす影響に基づく。オメガ−３脂肪酸の例には、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち１種類を含む。他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡの３種類すべてを含む。
【００７４】
[0095] 本発明組成物は、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をも含む。ＧＡＧは当技術分野で周知であり、反復二糖単位から構成される枝分かれしていない多糖類であるとみなされる。多糖類が枝分かれしておらずかつ反復二糖単位から構成される限り、その分子またはポリマーはＧＡＧとみなされる。ＧＡＧの例には、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはヒアルロナンのうち少なくとも４、５種類またはすべてを含む。
【００７５】
[0096] 本発明組成物は、少なくとも１種類のアミノ糖をも含む。アミノ糖は当技術分野で十分に理解されており、簡単には、糖部分にヒドロキシル基のほかにアミン基が置換または存在するものを意味する。アミノ糖の例には、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンの４種類すべてを含む。
【００７６】
[0097] 本発明組成物は、少なくとも１種類の抗酸化剤をも含む。抗酸化剤は当技術分野で周知である。抗酸化剤の例には、ビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニン、カルニチンおよびベータ−カロテンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも４種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンおよび／またはベータ−カロテンのうち少なくとも５種類またはそれ以上を含む。
【００７７】
[0098] 本発明組成物はカルニチンまたはアセチルカルニチンをも含み、これらは抗酸化作用をもつ第四級アンモニウム化合物である。
[0099] 特定の態様において、本発明組成物はさらに少なくとも１種類の食物無機質および／または少なくとも１種類の天然アミノ酸を含む。食物無機質および天然アミノ酸の例は周知である。食物無機質の例には、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムが含まれるが、これらに限定されない。１態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも１種類を含む。他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも２種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも３種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも４種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも５種類またはそれ以上を含む。
【００７８】
[00100] 天然アミノ酸は当技術分野で周知であり、タンパク質中にみられるアミノ酸である。特定の１態様において、組成物は必須アミノ酸を含み、その際、必須アミノ酸という用語は対象の種に関係する。たとえば、イヌおよびネコにとっての必須アミノ酸には、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン、リジンおよびバリンが含まれる。タウリンもネコにおいては必須アミノ酸であるとみなすことができる。
【００７９】
[00101] １態様において、イヌ用食物組成物ｊ／ｄは、一般に図４に示す組成をもち、コンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミノ糖、ならびにカルニチンおよび少なくとも１種類の抗酸化剤を含有する。この組成物は追加の栄養素源、たとえば下記のものをも含有することができる：粉砕全粒トウモロコシ、チキン副産物ミール、亜麻仁、大豆ミルラン（Ｓｏｙｂｅａｎ Ｍｉｌｌ Ｒｕｎ）、醸造米（Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｒｉｃｅ）、大豆ミール、豚脂（トコフェロールとクエン酸の混合物で保存）、チキンレバーフレーバー、粉末セルロース、魚油、塩化カリウム、Ｌ−リジン、炭酸カルシウム、コリン塩化物、ヨード添加食塩、ＤＬ−メチオニン、ビタミンＥサプリメント、ビタミン類（Ｌ−アスコルビル−２−ポリホスフェート（ビタミンＣ源）、ビタミンＥサプリメント、ナイアシン、一硝酸チアミン、ビタミンＡサプリメント、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＢ１２サプリメント、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、ビタミンＤ３サプリメント）、Ｌ−トレオニン、タウリン、大豆レシチン、塩酸グルコサミン、無機質（硫酸鉄（ＩＩ）、酸化亜鉛、硫酸銅、酸化マンガン、ヨウ素酸カルシウム、亜セレン酸ナトリウム）、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−カルニチン（トコフェロールとクエン酸の混合物で保存）、コンドロイチン硫酸、ベータ−カロテン、ローズマリーエキス。
【００８０】
[00102] 実施例中で用いた本発明のネコ用ｊ／ｋ食物組成物は、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸を含有し、アルファ−リノレン酸をも含有していた。この組成物は、コンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミノ糖を含有していた。さらにこの組成物は、カルニチン、および少なくとも１種類の抗酸化剤、たとえばビタミンＣおよびベータ−カロテンを含有していた。
【００８１】
[00103] 用語“動物”は、ヒトまたはヒト以外の動物を意味し、鳥類、ウシ類、イヌ類、ウマ類、ネコ類、ヤギ類、ネズミ類、ヒツジ類、霊長類、およびブタ類などの動物を含む。
【００８２】
[00104] 用語“抗体”は、特異的抗原に結合するいずれかの免疫グロブリンを意味し、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ポリエピトープ特異性をもつ抗体組成物、キメラ抗体、二重特異性抗体、ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｙ）、一本鎖抗体、および抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ、または他の抗原結合性フラグメントが含まれる。
【００８３】
[00105] 用語“アレイ”は、支持体上における少なくとも２つのプローブの秩序配置を意味する。プローブのうち少なくとも１つは対照または基準品であり、プローブのうち少なくとも１つは診断用プローブである。支持体上における約２から約４０，０００までのプローブの配置によって、プローブと試料のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間に形成された標識複合体それぞれのサイズおよび信号強度を確実に個々に識別できる。
【００８４】
[00106] 用語“差次発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”または“差次発現した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）”は、増大または無調節な遺伝子発現を意味し、あるいは低下またはダウンレギュレートされた遺伝子発現を意味し、試料中の転写されたメッセンジャーＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の存在、不存在、または少なくとも２倍、または少なくとも１．５、１．４、１．３、１．２、１．１もしくは１倍の量の変化により検出される。
【００８５】
[00107] 差次遺伝子発現の尺度として用いる用語“倍”は、ある動物における遺伝子発現量が、比較動物における遺伝子発現量と比較して倍量または部分量の遺伝子発現であることを意味する；たとえば、関節炎の動物を関節炎ではない動物と比較。たとえば、その動物において比較動物より３倍の量で発現する遺伝子は３倍の差次遺伝子発現をもち、その動物において比較動物より１／３の量で発現する遺伝子も３倍の差次遺伝子発現をもつ。
【００８６】
[00108] 用語“フラグメント”は下記のものを意味する：（１）完全配列の一部であって特定の用途について完全ポリヌクレオチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、オリゴヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列、または（２）完全配列の一部であって特定の用途について完全ポリペプチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、ペプチドもしくはポリペプチド配列。そのようなフラグメントは、特定の用途に適切であると思われる任意数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。一般にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのフラグメントは完全配列に由来する少なくとも約１０、５０、１００または１０００個のヌクレオチドを含み、ポリペプチドフラグメントは少なくとも約４、１０、２０または５０個の連続アミノ酸を含む。この用語には、これらのフラグメントのポリヌクレオチドバリアントおよびポリペプチドバリアントが含まれる。
【００８７】
[00109] 用語“遺伝子（単数）”または“遺伝子（複数）”は、ポリペプチドの産生に関係するＤＮＡの完全または部分セグメントを意味し、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。この用語には、遺伝子コード配列の相補体にハイブリダイズするいずれかのＤＮＡ配列が含まれる。
【００８８】
[00110] 用語“ホモログ”は、下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド：同一もしくは異なる動物種に由来するポリヌクレオチドであって、あるポリヌクレオチドに対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似性をもち、かつ完全ポリヌクレオチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしくは実質的に同一の機能を行なうもの、またはあるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする能力をもつものが含まれる、あるいは（２）ポリペプチド：同一もしくは異なる動物種に由来するポリペプチドであって、ポリヌクレオチドの発現により同定されるあるポリペプチドに対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似性をもち、かつ完全ポリペプチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしくは実質的に同一の機能を行なうもの、またはポリヌクレオチドの発現により同定されるあるポリペプチドに特異的に結合する能力をもつものが含まれる。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の配列同一性は、当業者に既知の方法、たとえばKarlin and Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))を用いて決定される。そのアルゴリズムを、Altschul et al. (J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990))のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))に記載のＧａｐｐｅｄ Ｂｌａｓｔを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いる。参照：http://ww.ncbi.nlm.nih.gov。
【００８９】
[00111] 用語“ハイブリダイゼーション複合体”は、１つのポリヌクレオチドのプリン類が相補的ポリヌクレオチドのピリミジン類と水素結合した際に試料ポリヌクレオチド間に形成される複合体を意味する；たとえば、５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’と塩基対合する。相補性の程度およびヌクレオチド類似体の使用がハイブリダイゼーション反応の効率およびストリンジェンシーに影響を及ぼす。
【００９０】
[00112] 用語“併せて（ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）”は、薬物、食物または他の物質を、（１）組成物、特に食物組成物中で一緒に、または（２）個別に、同一もしくは異なる頻度で、同一もしくは異なる投与経路を用いて、ほぼ同時もしくは周期的に、投与することを意味する。“周期的に”は、物質を特定の物質に許容できる投与計画で投与することを意味する。“ほぼ同時に”は、一般に物質（食物または薬物）を同時に、または互いに約７２時間以内に投与することを意味する。“併せて”は、具体的には薬物などの物質を処方期間投与し、本発明組成物を不定に投与する投与計画を含む。
【００９１】
[00113] 用語“ポリヌクレオチド”または“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。この用語には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）分子、ならびに一本鎖の場合にはそれの線状または環状の相補配列が含まれる。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうフラグメント、バリアント、ホモログ、および対立遺伝子（その配列に応じて）も含まれる。これらの配列は、アラインさせた際に完全相補的（不適正塩基対合がない）であってもよく、あるいは約３０％までの配列不適正塩基対合をもつこともできる。好ましくは、ポリヌクレオチドに関して、その鎖は約５０から１０，０００個までのヌクレオチド、より好ましくは約１５０から３，５００個までのヌクレオチドを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドに関して、その鎖は約２から１００個までのヌクレオチド、より好ましくは約６から３０個までのヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、多様な要因、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの個々の用途および使用に依存するであろう。この用語には、合成されたヌクレオチドポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたものが含まれる。用語“ポリヌクレオチド”には“オリゴヌクレオチド”が含まれる。
【００９２】
[00114] 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”または“タンパク質”は、アミノ酸のポリマーを意味する。この用語には、天然ポリマー、および天然に存在しない（合成）ポリマー、および１個以上のアミノ酸が人為的な化学模倣体で置換されたポリマーが含まれる。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうフラグメント、バリアントおよびホモログも含まれる。この用語には、任意長さのポリマー、好ましくは約２から１０００個までのアミノ酸、より好ましくは約５から５００個までのアミノ酸を含むポリマーが含まれる。。この用語には、合成されたアミノ酸ポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたものが含まれる。
【００９３】
[00115] 用語“プローブ”は下記のものを意味する：（１）ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、精製された制限酵素消化物中などに天然に存在するもの、または合成により製造されるものであって、そのプローブに相補的な配列をもつポリヌクレオチドへのアニーリングまたは特異的ハイブリダイゼーションが可能なもの、あるいは（２）実質的に他のタンパク質またはタンパク質フラグメントを排除して特定のタンパク質またはタンパク質フラグメントを特異的に結合することができるペプチドまたはポリペプチド。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、供給源および用途を含めた多数の要因に依存するであろう。たとえば診断用途については、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは一般に約１０〜１００、１５〜５０、または１５〜２５個のヌクレオチドを含む。特定の診断用途においては、ポリヌクレオチドプローブは約１０〜１０００、３００〜６００個のヌクレオチド、好ましくは３００個のヌクレオチドを含む。本発明におけるプローブは、特定の標的配列の種々の鎖に“実質的に”相補的になるように選択される。これは、一組の予め定めた条件下でプローブがそれらの各標的配列と特異的にハイブリダイズまたはアニールするのに十分なほど相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的の厳密な相補配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプローブの５’または３’末端に結合させ、残りのプローブ配列が標的配列に相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列が標的ポリヌクレオチドに特異的にアニールするのに十分なほど標的ポリヌクレオチドの配列との相補性をもつ限り、非相補的な塩基類または比較的長い配列をプローブに挿入することができる。ペプチドプローブまたはポリペプチドプローブは、それにタンパク質またはペプチドが特異的に結合するいかなる分子であってもよく、これにはＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパク質について）、抗体、細胞膜受容体、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、細胞小器官および細胞小器官膜が含まれる。
【００９４】
[00116] 用語“試料”は、たとえばポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、代謝産物などを含有するいずれかの動物組織または体液を意味し、これにはＤＮＡおよびＲＮＡを含有する細胞および他の組織が含まれる。例には、血液、軟骨、結合組織、上皮、リンパ球、筋肉、神経、喀痰などが含まれる。試料は固体または液体であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、体液、たとえば血液または尿、細胞、細胞調製物、またはその可溶性画分もしくは培地の一部、染色体、細胞小器官などであってもよい。
【００９５】
[00117] 用語“単一パッケージ”は、キットの構成要素が１以上の容器内で、または１以上の容器によって物理的に関連づけられており、製造、流通、販売または使用のためのユニットとみなされることを意味する。容器にはバッグ、ボックス、ボトル、収縮ラップパッケージ、ステープラー止めその他の様式で固定した構成要素、またはその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一パッケージは、製造、流通、販売または使用のためのユニットとみなされる状態で物理的に関連づけられた個別の食物組成物の容器であってもよい。
【００９６】
[00118] 用語“有用なバリエーション”は下記のことを意味する：（１）ポリヌクレオチドについては、そのポリヌクレオチドの相補体；そのポリヌクレオチドおよびそれの相補体のホモログ；そのポリヌクレオチド、それの相補体およびそれのホモログのバリアント；ならびにそのポリヌクレオチド、それの相補体、それのホモログおよびそれのバリアントのフラグメント；ならびに（２）ポリペプチドについては、そのポリペプチドのホモログ；そのポリペプチドおよびそれのホモログのバリアント；ならびにそのポリペプチド、それのホモログおよびそれのバリアントのフラグメント。
【００９７】
[00119] 用語“仮想パッケージ”は、キットの構成要素が、ユーザーに他の構成要素の入手方法を指令する１以上の物理的または仮想的なキット構成要素上の指示によって関連づけられていることを意味する；たとえばバッグ内に、１つの構成要素、およびキットの使用方法に関する指示を入手するためにウェブサイトを訪れる、記録されたメッセージとコンタクトをとる、ビジュアルメッセージを見る、または介護者もしくはインストラクターとコンタクトをとるようにユーザーに指令する指示を収容したもの。
【００９８】
[00120] 用語“基準品”は下記のものを意味する：（１）対照試料であって、たとえば関節炎の動物を試験する場合には正常な動物に由来する組織を含むもの、または正常な動物を試験する場合にはたとえば関節炎の動物に由来する組織を含むもの、あるいは（２）対照試料であって、その用途の状況に応じて、被験物質が差次遺伝子発現を引き起こすかどうかを判定するためには、対応する正常動物またはたとえば関節炎の動物において試験すべき被験物質に曝露されていない正常動物またはたとえば関節炎の動物に由来する組織を含むもの。
【００９９】
[00121] 用語“ストリンジェントな条件”は下記のものを意味する：（１）０．１％ウシ血清アルブミンを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、７５ｍＭクエン酸ナトリウム中、４２℃でのハイブリダイゼーション、（２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸中、４２℃でのハイブリダイゼーション；ならびに４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄、または０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４中、５０℃での洗浄、あるいは同様な低いイオン強度および高温の洗浄剤および同様な変性剤を用いる同様な操作。
【０１００】
[00122] 用語“物質”は、元素、化合物、分子、もしくはその混合物、または動物において異常な関節状態の発症もしくは重症度を診断、予後判定もしくは調節するのに有用な可能性がある他のいずれかの物質を意味し、これにはいずれかの薬物、化学物質または生物学的物質が含まれる。
【０１０１】
[00123] 用語“ｓｉＲＮＡ”は、そのｓｉＲＮＡが遺伝子と同一細胞内で発現した場合にその遺伝子の発現を低下させまたは阻害する二本鎖ＲＮＡを形成するポリヌクレオチドを意味する。この用語には、相補鎖により形成された二本鎖ＲＮＡが含まれる。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡ相補部分は、一般に実質的または完全な同一性をもつ。一般にｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０個のヌクレオチドを含み、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０の塩基対、好ましくは約２０〜３０個のヌクレオチドおよび塩基対を含む。
【０１０２】
[00124] 用語“特異的に結合する”は、２分子間の特別かつ厳密な相互作用を意味し、これはそれらの構造、特にそれらの分子側鎖基に依存する。たとえば、ＤＮＡ分子の主溝内への調節タンパク質のインターカレーション、２つの一本鎖核酸間の主鎖に沿った水素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合。
【０１０３】
[00125] 用語“特異的にハイブリダイズする”は、当技術分野で一般に用いられる予め定めた条件下でそのようなハイブリダイゼーションが可能なほど十分に相補的な（時には“実質的に相補的な”と言う）配列の２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の会合を意味する。たとえば、この用語は、本発明の観点に従った、ポリヌクレオチドプローブと一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションであって、そのポリヌクレオチドプローブと相補的ではない配列の一本鎖ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを実質的に除外したものを表わすことができる。
【０１０４】
[00126] 用語“バリアント”は下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオチドのいずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み、かつ元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうポリヌクレオチド配列、および（２）ポリペプチド配列の１個以上のアミノ酸のいずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み、かつ元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうポリペプチド配列。したがってこの用語には、一塩基多型（ＳＮＰ）および対立遺伝子バリアントが含まれ、またポリペプチドにおける保存的および非保存的アミノ酸置換が含まれる。この用語には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの化学的誘導体化、およびそれぞれ自然界には存在しないヌクレオチドまたはアミノ酸によるヌクレオチドまたはアミノ酸の置換も含まれる。
【０１０５】
[00127] 本明細書に記載する特定の方法、プロトコルおよび試薬は変更できるので、本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書中で用いる専門用語は特定の態様を記述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。本明細書および付随する特許請求の範囲で用いる単数形（“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”）には、そうでないことが状況から明らかに示されない限り複数表記が含まれる；たとえば”バリアント”という表記は複数のバリアントを含む。さらに、定義した用語には、適正な文法状況で用いられるそれらの用語の変形が含まれる；たとえば、用語“特異的に結合する”には“特異的結合”およびその用語の他の形態が含まれる。同様に、用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は除外ではなく包括として解釈すべきである。
【０１０６】
[00128] 別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語ならびにいずれかの頭字語は、本発明の技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載したものと類似または均等な組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料をいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料を本明細書に記載する。
【０１０７】
[00129] 本明細書中で引用または参照したすべての特許、特許出願、刊行物および他の参考文献を、法律が許す範囲で本明細書に援用する。それらの参考文献の考察はそれらにおいてなされた主張をまとめるためのものにすぎない。それらの特許、特許出願、刊行物もしくは他の参考文献のいずれか、またはそれらのいずれかの部分が本発明に関係する先行技術であると認めるわけではなく、それらの特許、特許出願、刊行物もしくは他の参考文献の正確さおよび妥当性に意義を唱える権利は明確に保持する。
【０１０８】
[00130] １態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子または遺伝子セグメント（本明細書中で定義する“遺伝子”）を包含する。本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオチドを見いだしたことに基づく。これらの遺伝子は、異常であると診断された動物に由来するリンパ球における遺伝子の発現と、正常であると診断された動物に由来するリンパ球における遺伝子の発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いて比較することにより同定された。
【０１０９】
[00131] 本発明のポリヌクレオチドおよび遺伝子は、異常であると診断されたイヌ類に由来するリンパ球からの遺伝子発現と正常であると診断されたイヌ類に由来するリンパ球における遺伝子発現の差を測定することにより同定された。遺伝子発現の変化は、当業者に既知であるいずれかの方法により判定できる。一般に、遺伝子発現の変化は転写の測定（遺伝子により産生されるｍＲＮＡの量を判定する）、または翻訳の測定（遺伝子により産生されるタンパク質の量を判定する）により判定される。遺伝子により産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量は、当業者に既知であるポリヌクレオチドおよびタンパク質の定量のためのいずれかの方法を用いて判定できる。一般に、ＲＮＡ発現はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（限定ではないが、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が含まれる）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロット法、および他のハイブリダイゼーション法により判定される。測定するＲＮＡは一般にｍＲＮＡまたは逆転写されたｍＲＮＡの形である。タンパク質またはポリペプチドの発現は、種々の比色アッセイおよび分光アッセイ、ならびにローリーアッセイ（ｌｏｗｒｙ ａｓｓａｙ）、ビウレットアッセイ、蛍光アッセイ、比濁法、ビシンコニン酸アッセイ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｓｓａｙ）、プロテインチップ技術、赤外線吸収、ニンヒドリン、ブラッドフォードアッセイ（ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）、および紫外線吸収などの方法を用いて判定される。好ましい方法においては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．から購入できるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃａｎｉｎｅ−１およびＣａｎｉｎｅ−２遺伝子チップ、ならびにそれらのチップを用いて遺伝子発現を判定するための指示を用いて、遺伝子発現の変化を判定する。
【０１１０】
[00132] 一般に、正常な動物と比較した異常な動物における差次遺伝子発現は、少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定することにより判定される。好ましくは、２種類以上の差次発現遺伝子の発現を測定して、遺伝子発現パターンまたは遺伝子発現プロフィールを得る。より好ましくは、複数の差次発現遺伝子の発現を測定して、より有意の遺伝子発現パターンまたはプロフィールのための追加情報を得る。
【０１１１】
[00133] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に固定された本発明の複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブの固定化バージョンである。このデバイスは、遺伝子およびポリヌクレオチドならびにそれらの発現パターンおよびプロフィールを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に、そのようなプローブを支持体またはそれに類する固体担体に結合させ、そして１種類以上のポリヌクレオチド（たとえば遺伝子、ＰＣＲ生成物、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）生成物、増幅技術を用いて合成したＤＮＡ配列、またはその混合物）を含有する試料を、試料ポリヌクレオチド（単数または複数）がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露する。プローブ、試料ポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を、一般に蛍光体、または他のタグ、たとえばストレプトアビジンで標識し、そして当業者に既知の方法を用いて検出する。試料ポリヌクレオチド（単数または複数）を標識する場合、結合した蛍光の検出によりハイブリダイゼーションを検出することができる。プローブを標識する場合、一般に標識の消失によりハイブリダイゼーションを検出する。プローブと試料ポリヌクレオチド（単数または複数）の両方を標識する場合、一般に２種類の標識の接近から生じる色ずれをモニターすることによりハイブリダイゼーションを検出する。特に蛍光標識については、多様な標識方法および標識が当業者に知られている。好ましくは、当技術分野で既知のものに匹敵するアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ、遺伝子チップ、バイオチップ、ＤＮＡチップおよび遺伝子アレイを含めた幾つかの名称で知られている）の形成に適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１２】
[00134] ポリペプチドプローブは、一般的な方法に従って、たとえば本発明のポリヌクレオチドについて提示したヌクレオチド配列データおよび当技術分野で既知の方法を用いて作製できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリペプチドを細胞から直接単離する、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを単離または合成し、それらのＤＮＡまたはＲＮＡを用いて組換え生成物を調製する、個々のアミノ酸からポリペプチドを化学合成する、および既存のポリペプチドの化学的開裂によりポリペプチドフラグメントを調製する。
【０１１３】
[00135] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に固定された本発明の複数のペプチドプローブまたはポリペプチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したペプチドプローブまたはポリペプチドプローブの固定化バージョンである。このデバイスは、タンパク質およびそれらの発現パターンを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に、そのようなプローブを支持体に結合させ、そして１種類以上のタンパク質を含有する試料を、試料タンパク質がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露する。特定の態様において、プローブ、試料タンパク質、または両方を、一般に蛍光体、または当業者に既知の他の試薬で標識し、検出する。一般に、ポリヌクレオチドマイクロアレイの読取りに用いるものと同じ方法および計測器をタンパク質アレイに適用できる。好ましくは、アレイの形成に適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１４】
[00136] 試料中のタンパク質の量または濃度を測定するための方法は当業者に既知である。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。抗体を使用する方法には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が適切である。そのような抗体は、タンパク質、タンパク質エピトープまたはタンパク質フラグメントに対して免疫学的に特異性であってよい。
【０１１５】
[00137] 本発明のある態様は、本発明のポリヌクレオチドの発現により生成したタンパク質の検出および定量のために抗体を使用する。タンパク質は免疫沈降法、アフィニティー分離、ウェスタンブロット分析、タンパク質アレイなどにより検出できるが、好ましい方法はＥＬＩＳＡ技術を利用する；この場合、抗体を固体支持体上に固定化し、標的であるタンパク質またはペプチドをこの固定化抗体に曝露する。プローブもしくは標的のいずれかまたは両方を、既知の方法で標識することができる。
【０１１６】
[00138] ある態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現パターンまたはプロフィールは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出のためのプローブのアレイを用いて観察される。１態様においてはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアレイを使用でき、一方、他の態様には本発明の差次発現した遺伝子生成物に特異的に結合する抗体または他のタンパク質のアレイを使用できる。そのようなアレイは市販されており、あるいはそれらを当業者に既知の方法、たとえば固体支持体上でのインサイチュー合成により、または予め合成したプローブをマイクロプリンティング技術で固体支持体に付着させることにより、特注作製することができる。多様な態様において、本発明の差次発現遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。
【０１１７】
[00139] １態様において、表２および／または表３に同定した２種類以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。これらのプローブは、動物において脂質およびグルコースの代謝経路に関連する遺伝子を検出するために設計される。他の態様において、表３に同定した２種類以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。これらのプローブは、正常な動物と比較して異常な動物に特に関連する遺伝子を検出するために設計される。
【０１１８】
[00140] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子の差次発現を試料中で検出する方法を提供する。この方法は、下記を含む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｂ）場合により、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、基準品中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｃ）試料に由来する、および場合により段階（ｂ）からの基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして（ｄ）試料に由来するハイブリダイゼーション複合体を基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体と比較し、その際、基準品と試料の間のハイブリダイゼーション複合体の量の差は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１１９】
[00141] 段階（ｂ）、および段階（ｃ）の一部は任意であり、２以上の試験系の比較を比較的同時に実施すべき場合に採用される。しかし、好ましい態様において、比較のために用いる基準品はそれ以前にこの方法を用いて得られたデータに基づく。
【０１２０】
[00142] これらのプローブを試料に曝露してハイブリダイゼーション複合体を形成し、これらを検出して基準品のものと比較する。試料と基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体間の差は、試料中のポリヌクレオチドの差次発現、したがって正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の指標となる。好ましい態様において、プローブは、本発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより提示されるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。ハイブリダイゼーション複合体を検出するための方法は、当業者に既知である。
【０１２１】
[00143] １態様において、この方法はさらに、ハイブリダイゼーションの前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中で被験物質が変化させたかどうかの指標となる。
【０１２２】
[00144] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の差次発現を試料中で検出するための方法を提供する。この方法は、下記を含む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと試料中のタンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的結合が生じうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するものであり；（ｂ）場合により、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと基準品中のタンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的結合が生じうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するものであり；（ｃ）試料および場合により段階（ｂ）からの基準品における特異的結合を検出し；そして（ｄ）試料における特異的結合を基準品におけるものと比較し、その際、基準品と試料における特異的結合間の差は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１２３】
[00145] これらのプローブを試料に曝露して特異的結合を形成させ、これを検出し、基準品のものと比較する。試料と基準品からの特異的結合間の差は、その試料における正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するタンパク質の差次発現、したがって遺伝子、特に異常関連遺伝子の差次発現の指標となる。好ましい態様において、プローブは、本発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより産生されるタンパク質またはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。
【０１２４】
[00146] １態様において、この方法はさらに、ポリペプチドをタンパク質と反応させる前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中で被験物質が変化させたかどうかの指標となる。
【０１２５】
[00147] 他の態様においては、動物のたとえば関節炎の組織の量を調節することを試みる際に、軟骨組織調節プログラムに応答した動物の進行状況をモニターするために、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の発現を試料中で検出する前記方法を用いる。この方法は、調節プログラム期間中、間隔をおいて、好ましくは設定した間隔をおいて実施され、調節プログラム期間中の２以上の時点でのこの方法の結果を比較することにより、動物の進行状況をモニターする。比較により得られた、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現もしくは遺伝子発現パターンの変化、または無変化は、その調節プログラムの有効性の指標となる。
【０１２６】
[00148] 被験物質は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオチドまたは遺伝子、特に異常関連遺伝子に影響を及ぼす可能性のあるいかなる物質であってもよい。被験物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸；タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子、高分子、ビタミン、無機質、単純な糖類；複雑な糖類；多糖類；炭水化物；中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）；トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）；下記を含むｎ−３（オメガ−３）脂肪酸：ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＬＡ；下記を含むｎ−６（オメガ−６）脂肪酸：ＬＡ、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびＡＲＡ；ＳＡ、共役型リノール酸（ＣＬＡ）；コリン源、たとえばレシチン；下記を含む脂溶性ビタミン：ビタミンＡおよびその前駆物質、たとえばカロテノイド（たとえばβ−カロテン）、ビタミンＤ源、たとえばビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＥ源、たとえばトコフェロール（たとえばα−トコフェロール）およびトコトリエノール、ならびにビタミンＫ源、たとえばビタミンＫｌ（フィロキノン）およびビタミンＫ２（メナジオン）；下記を含む水溶性ビタミン：Ｂ系列ビタミン、たとえばリボフラビン、ナイアシン（ニコチンアミドおよびニコチン酸を含む）、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよびコバラミン；ならびにビタミンＣ（アスコルビン酸）；下記を含む抗酸化剤：前記ビタミンのうちのあるもの、特にビタミンＥおよびＣ；ならびにビオフラボノイド、たとえばカテキン、ケルセチンおよびテアフラビン；キノン類、たとえばユビキノン；カロテノイド、たとえばリコペンおよびリコキサンチン；レスベラトロール；ならびにα−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン；ならびにキトサン。好ましい態様において、被験物質は栄養素であり、これらを食物に添加するか、あるいはサプリメントとして摂取することができる。例には、脂肪酸、たとえばオメガ−３脂肪酸（たとえばＤＨＡおよびＥＰＡ）およびオメガ−６脂肪酸（たとえばＡＲＡ）、カルニチン、メチオニン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびビタミンＤが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
[00149] 好ましい態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現に影響を及ぼすのに有用な物質は、出願中の米国仮特許出願Ｎｏ．６０／６５７９８０、２００５年３月２日出願、およびそれに基づく優先権を主張する後続の米国特許出願または外国特許出願に開示された方法を用いて同定することができる。
【０１２８】
[00150] 比較に際して用いる正常な動物に関する発現プロフィールは、被験動物に関する発現プロフィールと同時に１匹以上の正常な動物から、または正常な動物の発現プロフィールのデータベースから、得ることができる。好ましくは、長年蓄積された正常な動物に関する発現プロフィールのデータベースを、基準として使用するために入手できる。
【０１２９】
[00151] ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが差次発現するかどうかの判定は、当業者に既知の方法を用いてそれらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより達成でき、それらの方法のうち若干を本明細書に記載する。
【０１３０】
[00152] 他の観点において、本発明は動物のゲノムを操作するのに適切な組成物を提供する。この組成物は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現に干渉する１種類以上の物質を含む。
【０１３１】
[00153] 他の態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の発現を調節する方法を包含する。好ましい態様において、本発明組成物は下記のものを含む：ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）：ＤＨＡを、約１から約３０まで、好ましくは約３から約１５までの量；ＥＰＡを、約１から約３０まで、好ましくは約３から約１５までの量；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、約４／２から約３０／４５まで、好ましくは約９／６から約１８／１２までの量；ＡＬＡを、約１０から約１００まで、好ましくは約３０から約６０までの量；ＬＡを、約３０から約６００まで、好ましくは約６０から約３００までの量；ＡＲＡを、約５から約５０まで、好ましくは約１５から約３０までの量；ＳＡを、約３から約６０まで、好ましくは約６から約３０までの量；およびＣＬＡ（対照として）を、約６から約１２０まで、好ましくは約１２から約６０までの量。組成物をその組成物に適切ないずれかの方式または形態で動物に投与することができる。好ましくは、組成物を食物組成物またはサプリメントの形態で動物に経口投与する。食物組成物はいかなる形態であってもよい：たとえば、動物、特に愛玩動物、たとえばネコ類およびイヌ類のための当技術分野で既知である栄養バランスのとれた食物組成物、たとえば乾燥食物、半湿潤食物、および湿潤食物。サプリメントには、錠剤、カプセル剤などの剤形、およびこれらに類する形態が含まれる。さらに他の観点において、動物の軟骨組織の量を調節する１種類以上の他の物質と組み合わせて本発明組成物を投与することができる。
【０１３２】
[00154] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の発現を調節するのに適切な、または動物の軟骨組織の量を調節するのに適切な、組成物を提供する。この組成物は、遺伝子発現または組織を調節する量の、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ、ＡＬＡ、ＬＡ、ＡＲＡ、ならびにＳＡのうち１種類以上を含む。多様な態様において、この組成物は下記のものを含む：ｍｇ／ｋｇ／日：ＤＨＡを、動物に約１から約３０まで投与するのに十分な量；ＥＰＡを、動物に約１から約３０まで投与するのに十分な量；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、動物に約４／２から約３０／４５まで投与するのに十分な量；ＡＬＡを、動物に約１０から約１００まで投与するのに十分な量；ＬＡを、動物に約３０から約６００まで投与するのに十分な量；ＡＲＡを、動物に約５から約５０まで投与するのに十分な量；ＳＡを、動物に約３から約６０まで投与するのに十分な量；およびＣＬＡ（対照として）を、動物に約６から約１２０まで投与するのに十分な量。そのような物質は、動物の軟骨組織の量を調節するために有用となることができる。好ましくは、これらの物質は複数のそれらの遺伝子の発現に影響を及ぼす。１態様において、組成物はさらに、動物の軟骨組織の量を調節する１種類以上の薬物または他の物質を含む。
【０１３３】
[00155] さらに他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の差次発現を被験系において判定するのに適切なキットを提供する。
【実施例】
【０１３４】
[00156] 実施例１：種々の物質または成分がイヌ類の細胞系における遺伝子発現に及ぼす影響の判定
[00157] Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘイヌ類遺伝子チップＣａｎｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ−１およびＣａｎｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ−２を用いて、種々の被験物質または成分、たとえば下記のものが、４種類のイヌ細胞系および適切な対照における遺伝子発現に及ぼす影響を判定する：ＭＣＴ類；ＴＡＧ類；ＡＬＡ；ＥＰＡ；ＤＨＡ；リノール酸；ステアリン酸（ＳＡ）、共役型リノール酸（ＣＬＡ）、ＧＬＡ；アラキドン酸；レシチン；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチン、ビタミンＣ、カテキン、ケルセチン、テアフラビン；ユビキノン；リコペン、リコキサンチン；レスベラトロール；α−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン；キトサン、これらの化合物を１種類以上含有する種々の材料、およびその多様な組合わせ。各成分を、表１に示す選択した試料成分について指示した２種類の濃度で試験する。２種類のうち高い方の濃度の溶媒を対照として用いる。４種類のイヌ細胞系を用いる：ＣＣＬ３４（腎臓）、ＣＲＬ１４３０（胸腺）、ＣＣＬ１８３（骨）（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）およびＣＴＡＣ（甲状腺）(参照：Measurement of NK Activity in Effector Cells Purified from Canine Peripheral Lymphocytes, Veterinary Immunology and Immunopathology, 35 (1993) 239-251)。特定濃度のある成分で処理した細胞系を“処理”と表記し、非処理試料を“対照”と表記する。“遺伝子”および“プローブ”という語をこの方法においては同義に使用する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップに備えられた指示を用いて、遺伝子発現を処理細胞系と対照細胞について測定する。各ユニークプローブ識別番号についての詳細な情報は製造業者から入手できる。
【０１３５】
[00158] 遺伝子発現データを前記のいずれかの処理について“アップ（ｕｐ）”または“ダウン（ｄｏｗｎ）”レギュレートされたと判定する。遺伝子が“アップ”または“ダウン”のいずれであるかの決定は変化倍率に基づき、これは各プローブについて、処理における強度／対照における強度として計算される。その数値が＜１／１．５（４種類の細胞系すべてにわたる分析について）または＜１／２（細胞系内の分析について）である場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなし、その数値が＞１．５（４種類の細胞系すべてにわたる分析について）または＞２（細胞系内の分析について）である場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなす。また、使用したソフトウェアに従って、あるプローブが比較される条件（処理または対照）のうち一方においてのみ存在と呼出され、他方においては“不存在”または“境界”であり、かつ変化倍率が有意である場合、それを以後の精査のために有意とみなす。２つの処理において反対方向に調節されると思われるプローブを以後の分析から除外する。
【０１３６】
[00159] 生データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０（ＧＳ）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により分析し、Ｒ−Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ＲＢ）フリーウェアにより確認する。両方のソフトウェアパッケージを用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにより作製されたＣＥＬファイルからプローブ強度を計算する。プローブ毎の存在／不存在／境界の呼出、およびＰ−値は、Ｒ−ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒおよびＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを個別に用いて計算される。
【０１３７】
[00160] ２つのスキームをデータ解析に用いる。第１；“細胞系間”、および“個々の細胞系内”。第１スキームでは、遺伝子がすべての細胞系にわたって有意かつ共通であると認められた場合、それらを採点のために選択する。この“細胞系間”は、最小のノイズで最高の信頼データを与え、どの遺伝子が個々の成分により影響を受けるかについて可能な最良の手掛かりを提供することができる。第２スキームでは、２つの処理において個々の細胞系内で両方のソフトウェアパッケージに従って有意倍率の変化を示す遺伝子のみを採点する。これらの実験から得られたデータのサンプルを表２に示す。表２は、処理物質（Ｃｏｌｕｍｎ １）、プローブ（データリンク）（Ｃｏｌｕｍｎ ２）、方向（Ｃｏｌｕｍｎ ３）、最良ＢＬＡＳＴ標記（統計的に判定）（Ｃｏｌｕｍｎ ４）、およびヒト寄託番号（Ｃｏｌｕｍｎ ５）を示す。すべての被験成分の情報を参考のためにデータベースに保存する。
【０１３８】
[00161] イヌ類の生理的状態（異常としての診断）および表１〜２からの情報の比較に基づいて、すなわち被験物質または被験成分により影響を受けかつ正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子に注目して、異常なイヌ類のための食物組成物の選択および調製に有用な栄養処方は、下記の成分のうち１種類以上を下記の量で含有すると考えられる（インビボ量ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）はインビトロで用いた量からの外挿に基づく）：たとえばＤＨＡ−約１から約３０まで；ＥＰＡ−約１から約３０まで；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）−約４／２から約３０／４５まで；ＡＬＡ−約１０から約１００まで；ＬＡ−約３０から約６００まで；ＡＲＡ−約５から約５０まで；およびＳＡ−約３から約６０まで。これらのデータに基づいて、これらの成分のうち１種類以上を含有する食物組成物および関連の食事を調製し、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子を調節するために用いることができる。そのような成分は、動物において異常な筋骨格関節障害の調節を生じ、したがって１態様においては望ましい状態または正常な状態への移行を促進し、動物のより良好な健康およびウェルネスを促進するであろう。
【０１３９】
[00162] 実施例２：ＲＮＡ単離操作
[00163] 材料および方法：本明細書の実施例にさらに記載するように、下記の一般法を用い、遺伝子チップを利用して、イヌおよびネコの組織試料から遺伝子発現プロファイリング用のＲＮＡを単離することができる。これらの方法または当技術分野で認識されているその変法を適用して、当業者が利用できる種々の分析法、特にマイクロアレイ技術を用いてさらに遺伝子発現を分析するためのＲＮＡを組織または体液試料から単離することができるのは、当業者に明らかであろう。
【０１４０】
組織からのリボ核酸（ＲＮＡ）の単離
[00164] 組織試料を採集し、液体窒素中で凍結させ、融解し、次いでホモジナイズし、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ抽出法を用いて処理して、良質のＲＮＡを調製することができ、次いでこれをさらにゲノム分析する。
【０１４１】
[00165] 材料：氷、液体窒素、イヌ類またはネコ類の凍結組織、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）細胞溶解試薬、最低９９％のクロロホルム、イソプロピルアルコール、７０％エタノール（無水エタノールおよび脱イオン無ＲＮａｓｅ水を用いて調製）、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）、脱イオン水、ＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）：Ａｍｂｉｏｎから。
【０１４２】
[00166] 装置：Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５パワーホモジナイザー、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ２５Ｒ遠心機、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機、鉗子、メス、硬質カッティング面、すなわちカッティングボード、１．５ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポーザブルポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびに糸屑を含まない拭布。
【０１４３】
[00167] 調製：４ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れた５０ｍＬポリプロピレン試験管を用意する（ＲＮＡ単離のために選択した各組織につき１本の試験管）。
[00168] 組織ホモジナイゼーション：液体窒素を保持できる容器に３〜４匙の液体窒素を装入する。一片の凍結組織を直ちに上記の容器に入れ（組織はほぼ豆の大きさとすべきである）、この組織を適宜ラベルを付けた５０ｍＬポリプロピレン試験管（既に４ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れたもの）に入れる。直ちにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５パワーホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションを開始する。最高設定（６）で１０〜１５秒間ホモジナイズする。試料を氷上でさらに１０〜１５秒間冷却し、次いで繰り返す。組織が完全にホモジナイズされて溶液が混濁するまで続ける。完全にホモジナイズされると、５０ｍＬ試験管に蓋をして氷へ戻す。ホモジナイズされた組織を室温で５分間インキュベートした後、単離操作を進める。
【０１４４】
[00169] 実施例３：ＲＮＡ調製操作
[00170] ＲＮＡの単離：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬に備えられたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示に示された操作法に全般的に従う。ホモジナイズした試料を４つの１ｍＬ部分試料に分けて４本の１．５ｍＬミクロ遠心管に入れる。１ｍＬ部分試料それぞれに２００ｕＬのクロロホルムを添加する。遠心管に蓋をし、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで上下に振とうする。桃色の乳濁液になるはずである。遠心管を室温で２〜３分間インキュベートする。遠心管を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心する。水相（上層）を無菌の１．５ｍＬミクロ遠心管へ移す。新たな遠心管へ移すべき水相の一般的な体積は約５００ｕＬである。中間相または下相を移さないことを確認する。水層を入れた各ミクロ遠心管に５００ｕＬのイソプロピルアルコールを添加することにより、溶液からＲＮＡを沈殿させる。遠心管を少なくとも２０秒間、上下に振とうする。試料を室温で１０分間インキュベートする。試料を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心する。ペレットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清を慎重に除去する。１ｍＬの７０％エタノールを添加してペレットを洗浄する。遠心管を揺らす（または遠心管を台上で軽く叩く）ことによりペレットを剥離させ、振とう混合する。８，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する。ペレットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清を慎重に除去する。糸屑を含まない拭布を用いて過剰のエタノールを慎重に吸い上げて、ペレットを確実に乾燥させる。各ペレットを３０ｕＬのＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁する。ＲＮＡが再び溶解するまで穏やかにピペッティングにより混合し、次いで−８０℃で保存する。ＲＮＡの再懸濁を容易にするために試料を数秒間、低速でボルテックス撹拌することが必要な場合がある。必要であれば、凍結前に試料をミクロ遠心機により遠心沈殿させる。
【０１４５】
[00171] ＲＮＡの清浄処理：ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｈａｎｄｂｏｏｋに示された操作に従う。
ＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバー内で培養した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いたＲＮＡの単離
[00172] 哺乳動物細胞系由来の培養細胞を用いて良質のＲＮＡを単離し、次いでこれを以後のゲノム分析に用いる。細胞の培養に関係するすべての作業を厳密な無菌条件下で実施すべきである。
【０１４６】
[00173] 試薬：１０×ＰＢＳ、脱イオンＨ２Ｏ、無水エタノール、ＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、β−メルカプトエタノール、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）、緩衝液ＲＬＴおよび緩衝液ＲＷ ｌおよび緩衝液ＲＰＥ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ中に備えられている）。
【０１４７】
[00174] 装填／材料：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム、ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフ、２０ｍＬ無菌注射器、ＯｐｔｉＣｅｌｌティップ、細胞スクレーパー、Ｐｌ０００ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、Ｐ２００ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、１００〜ｌ００ｕＬフィルター付きピペットティップ、１〜２００ｕＬフィルター付きピペットティップ、無菌トランスファーピペット、５５ｍＬ無菌溶液皿、１．５ｍＬ無菌ミクロ遠心管、およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心機。
【０１４８】
[00175] 溶液：緩衝液ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに備えられた原液）；−プロトコルを開始する前に、１０ｍＬの緩衝液ＲＴＬにつきｌ００ｕＬのβ−メルカプトエタノールを添加する。７０％エタノール：３５ｍＬの無水エタノールを１５ｍＬの脱イオン無ＲＮａｓｅ水に添加することにより５０ｍＬの７０％エタノールを調製する。１×ＰＢＳ：−無ＲＮａｓｅ水。この溶液を．２２ｕｍのフィルターにより濾過する。
【０１４９】
[00176] 操作：細胞をＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバーから取り出す（一度に１つのＯｐｔｉＣｅｌｌを処理する）。細胞を顕微鏡下で検査して、細胞がＲＮＡ単離前に生存していることを確認する。細胞培養培地を分離し、廃棄する。ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフを用いて上側の膜を切り取り、下側の膜上の細胞を露出させる。細胞が付着している膜を１×ＰＢＳで３回洗浄する。６００ｕＬの緩衝液ＲＬＴ（β−メルカプトエタノールを含有する）を、細胞が付着している膜の中央にピペットで添加する。細胞スクレーパーを用いて、緩衝液ＲＬＴを穏やかに膜の全面に広げ、次いで液体を１隅に集める。緩衝液ＲＬＴの全体積をピペットで吸い取り、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに入れる。
【０１５０】
[00177] ＲＮＡの単離：ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心する。スピンカラムを廃棄し、ただし採集管とその内容物は残しておく。６００ｕＬの７０％エタノールを採集管に添加し、ピペッティングによって十分に混合する（この時点での全体積＝１．２ｍＬ）。６００ｕＬの細胞溶解物をＲＮｅａｓｙミニカラムへ移し、１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集管およびスピンカラムは残しておく。残りの体積の細胞溶解物（約６００ｕＬ）をスピンカラムへ移し、遠心を繰り返す。フロースルーを廃棄し、ただし採集管およびスピンカラムは残しておく。７００ｕＬの緩衝液ＲＷｌをスピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心してカラムを洗浄する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集管／カラムを残しておく。さらに５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心する。スピンカラムを１．５ｍＬ採集管へ移す。３０ｕＬのＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎをシリカゲル膜に直接添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心してＲＮＡを溶離する。最終ＲＮＡを−７０℃で保存する。
【０１５１】
ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイ
[00178] Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒおよびＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイを用いて、哺乳動物の培養細胞、リンパ球または組織から単離したＲＮＡを定量のために分析する。
【０１５２】
[00179] 試薬：ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏゲルマトリックス、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ濃縮色素、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカー（以上の試薬はすべてＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイキットに収容されている，Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＲＮＡ ６０００ラダー（ｌａｄｄｅｒ）、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ、および無ＲＮａｓｅ水：Ａｍｂｉｏｎから。
【０１５３】
[00180] 装置／他の材料：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｉｐ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ａｇｉｌｅｎｔ、ＲＮＡ ６０００チップ，Ａｇｉｌｅｎｔ、電極クリーナー、Ｐ２、Ｐｌ０、Ｐ２００およびＰｌ０００ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無菌無ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフィルター付きピペットティップ、無菌１．５ｍＬミクロ遠心管、ボルテックス、ＩＫＡボルテックスミキサー、ミクロ遠心機、および加熱ブロック。
【０１５４】
[00181] 操作：操作法は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｇｕｉｄｅ，ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ，Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００３に示されている。この説明書に示された操作法に従い、ただし下記の変更を伴う：１７頁のゲル調製−濾過したゲルをそれぞれ６５ｕＬの部分に分けるのではなく、濾過したゲルの原液を元のミクロ遠心管内に保持しておき、必要に応じて６５ｕＬを分取する。２２頁のＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカーの装填−試料を入れない予定の各試料ウェルに１ｕＬの無ＲＮａｓｅ水を（ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカーの代わりに）添加する。これはマーカーの使用量を節約するだけでなく、無ＲＮａｓｅ水を含めていずれの試薬も汚染されていないことを知るための陰性対照としても役立つ。２３頁のラダーおよび試料の装填−試料およびＲＮＡ ６０００ラダーを、さらに３０秒間（合計２．５分間）、７１℃で熱変性させる。２６頁−チップ操作の開始−アッセイメニューから“Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｎａｎｏ”オプションを選択する。
【０１５５】
実施例４：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析
[00182] Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃａｎｉｎｅ １およびＣａｎｉｎｅ ２ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いて遺伝子発現を分析する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（９５０５１カリフォルニア州サンタクララ）から市販されているアレイ。全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。このｃＤＮＡを用いてｃＲＮＡを生成させ、これをフラグメント化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いる。遺伝子チップを洗浄し、ハイブリダイゼーション信号をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘレーザースキャナーで測定する。次いでハイブリダイゼーションデータを確認し、以後の分析のために規準化する。
【０１５６】
[00183] 材料：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが大部分の試薬およびキットを提供する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのマニュアルに挙げてあるがキット中に供給されていない他の試薬は、別個に入手できる（詳細についてはＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（７０１０２１ Ｒｅｖ．４）を参照）。ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）および脱イオン水。
【０１５７】
[00184] 装置：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心機、１．５ｍＬ無ＤＮａｓｅ無菌ＲＮａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポーザブルポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびにＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００。
【０１５８】
[00185] 操作法：すべての操作をＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９９−２００３）に記載されたものに厳密に従う。５マイクログラムの全ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００または加熱ブロックを、反応およびプローブ変性に際しての温度制御に用いる。ＲＮＡ ＮａｎｏＤｒｏｐチップをＢｉｏＡｎａｌｙｅｒ ２１００と共に用いて品質管理を行なう。イヌ類の遺伝子チップには１００ Ｆｏｒｍａｔ（Ｍｉｄｉ Ａｒｒａｙ）を用いる。
【０１５９】
[00186] 実施例５：ネコにおけるアッセイ操作
[00187] ここに示す試験においては、以下に詳述する方法に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡ試験管を用いてネコから全血を採取し、全血試料からＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡ単離キットを用いて全ＲＮＡを単離する。
【０１６０】
[00188] ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）による血液ＲＮＡの単離：以下に示すように、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管およびＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を一緒に用いて、ネコ類から得た全血から細胞内ＲＮＡを単離および精製する（ＰＡＸｇｅｎｅ（商標） Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｊｕｎｅ ２００５も参照）。要約すると、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）注射針を用いて血液をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管内へ直接採集し、次いで遠心、洗浄および精製の工程を数ラウンド行なうと、最終的に高品質のＲＮＡが得られる。次いでこのＲＮＡは品質管理工程を経由し、次いでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム上に特注作製された専売ネコ遺伝子チップを用いて実施するその後の定量リアルタイムＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析に使用される。
【０１６１】
[00189] アッセイ調製物：アッセイ開始前に、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液を入れたもの）を室温で最低２時間インキュベートする。試験管が凍結されており、凍結前に２時間インキュベートされていない場合、それらを室温にさらに２時間放置して融解させる必要があろう。１回目の遠心前に、各ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管を８〜１０回反転させる。最初に緩衝液ＢＲ４を用いる場合（緩衝液はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキットに含まれる）、４体積の９６〜１００％エタノールを濃縮緩衝液に添加して作業溶液を得る。アッセイ開始前に２つの加熱ブロックを予熱する―６５℃および５５℃。ＤＮａｓｅ Ｉ原液を調製する（ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ ＳｅｔはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキットに含まれる）。固体ＤＮａｓｅ Ｉ酵素を、キットに備えられた５５０μＬの無ＲＮａｓｅ水に溶解する。蓋をとる際にＤＮａｓｅ Ｉを失わないことを確認する。試験管を反転させることにより穏やかに混合する。ボルテックスまたは遠心機を使用しない。ＤＮａｓｅ Ｉ酵素と緩衝液ＲＤＤ（キット構成要素）の混合物を調製する（バッチ当たり処理する試料の数に十分な体積）。各試料に７０μＬの緩衝液ＲＤＤおよびｌ０μＬのＤＮａｓｅ Ｉが必要である（すなわち、２０個の試料には１．４ｍＬの緩衝液ＲＤＤと２００μＬのＤＮａｓｅ Ｉとのカクテルが必要であろう）。このカクテルは必要になるまで２〜８℃で保存すべきである。再構成した酵素は２〜８℃で最高６週間は品質良好である。
【０１６２】
[00190] 試料の保存：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液を入れたもの）は、処理前に室温で最高３日間保存できる。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管に備えられた製品挿入説明書によれば、細胞ＲＮＡプロフィールはこれらの条件下で最高３日間安定である。しかし、これは種間で異なる可能性がある。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管は４℃で最高５日間保存することもできる。長期保存が必要な場合、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管を−２０℃または−７０℃で最高６カ月間保存することができる。試験管をゆるいワイヤリックに入れて垂直位置で凍結すべきである。試験管を−７０℃で保存する場合、まず−２０℃で凍結させ、次いで−７０℃へ移ことを推奨する。試験管をフリーザーから取り出す際には、それらを室温（２２℃を超えない温度）で融解すべきである。アッセイを進める前に、各試験管を１０回反転させるべきである。
【０１６３】
[00191] 全血からのＲＮＡの単離：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管を４０００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離して廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。４ｍＬの無ＲＮａｓｅ水をペレットに添加し、新たなＨｅｍｏｇａｒｄクロージャーで蓋をする。ボルテックス撹拌によりペレットを再懸濁し、次いで４０００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離して廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。３６０μＬの緩衝液ＢＲｌ（キット構成要素）をペレットに添加し、ペレットが完全に再懸濁するまで穏やかにピペッティングする。試料を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管へ移し、３００μＬの緩衝液ＢＲ２（キット構成要素）および４０μＬのプロテイナーゼＫを添加する（試料に添加する前に緩衝液ＢＲ２とプロテイナーゼＫを混合してはならない）。各試験管をボルテックス撹拌によって十分に混合し、５５℃に予熱したサーモミキサーに入れる。試験管を１４００ｒｐｍで１０分間、インキュベート／振とうする。細胞溶解物を、２ｍＬの採集管に入れたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム内へピペットで装入する。１４，０００ｒｐｍで３分間遠心する。フロースルー画分の上清を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管へ移す。３５０μＬの９６〜１００％エタノールを添加し、ピペッティングによって穏やかに混合する。７００μＬの試料を、２ｍＬ採集管に入れたＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、フロースルーおよび古い採集管を廃棄する。残りの体積の試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【０１６４】
[00192] 上記のスピンカラムの遠心からの古い採集管およびフロースルーを廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。３５０μＬの緩衝液ＢＲ３（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。カラムを新たな２ｍＬ採集管に入れ、８０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ／緩衝液ＲＤＤカクテル（参照：“アッセイ調製物”）をカラム膜に直接添加し、室温で１５分間インキュベートする。さらに３５０μＬの緩衝液ＢＲ３をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。
【０１６５】
[00193] ５００μＬの緩衝液ＢＲ４（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れ、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。さらに５００μＬの緩衝液ＢＲ４をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで３分間遠心して、スピンカラム膜を乾燥させる。採集管およびフロースルーを廃棄し、カラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。試料を再び１４，０００ｒｐｍでさらに１分間遠心して、カラム膜をさらに乾燥させる。フロースルーおよび採集管を廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを１．５ｍＬ溶離管へ移す。４０μＬの緩衝液ＢＲ５（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム膜に直接添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを取り出し、１．５ｍＬ溶離管内の溶出液を同じＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム上へピペットで移す。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを同じ溶離管へ戻し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。最終溶出液を６５℃で５分間インキュベートし、直ちに氷上で冷却する。最終ＲＮＡ試料を、その後の使用のために−８０℃で保存する。
【０１６６】
実施例６：対照ネコと比較した骨関節炎を伴うネコにおける遺伝子発現
[00194] 実施例５に従って関節炎ではないネコおよび骨関節炎を伴うネコを用いて試験を実施して、関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する。第１試験においては、２グループのネコ間のベースライン比較を行なって、関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する。組織および体液の試料を調製するために、本明細書中の実施例に全般的に記載した操作法を使用できる。
【０１６７】
[00195] ここに示す試験に関して、骨関節炎を伴うネコにこれまでに公開されている方法に従ってグレードを付ける；すなわち、関節炎ではないすべてのネコを“グレード０”とし、これは関節が正常と思われることを示す；骨関節炎を伴うネコは１（小さな腱（靭帯）増殖体（ｅｎｔｈｅｓｏｐｈｙｔｅ）または小さな骨増殖体（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ））または２（より顕著な腱（靭帯）増殖体または骨増殖体）のいずれかのグレードをもつ。重篤な骨関節炎（グレード３）をもつネコはこの試験には含まれない。
【０１６８】
[00196] 専売の特注ネコ遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、骨関節炎を伴うネコおよび伴わないネコ（正常な動物１０匹、関節炎の動物１０匹）においてベースライン遺伝子発現を評価する。前記に示したように、２グループ間のベースライン比較を行なって関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定するために、常法を用い、製造業者の指示に従って、遺伝子チップ分析を実施する。
【０１６９】
[00197] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ）（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。ＯＡバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７０】
[00198] 関節炎の動物および関節炎ではない動物において遺伝子発現プロファイリングを決定し、図３および１５に報告する。関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレギュレートされることが見いだされた遺伝子は下記のものである：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子生成物は炎症プロセスに関連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとみなされるであろう。さらに、下記の遺伝子が関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレギュレートされることが見いだされた：ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１およびアグリカン。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子生成物は軟骨分解に関連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとして役立つであろう。
【０１７１】
[00199] 実施例６に従って実施した試験の結果は、遺伝子発現を利用して正常なネコと骨関節炎を伴うネコを識別できることを指摘する。関節炎のネコにおいて炎症に関連して差次発現する遺伝子を図３および１５に示す。したがって、これらの同定した遺伝子はネコにおいて本明細書に記載する発明のためのバイオマーカーとして使用でき、下記の遺伝子を含む：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１およびアグリカン。
【０１７２】
[00200] 実施例７：ネコ用食物組成物ｊ／ｄ投与後の関節炎のネコの平均活動度
[00201] 実施例６に記載した関節炎のネコおよび関節炎ではないネコに関する栄養試験から得られた臨床データは、食事介入が関節炎のネコに影響を及ぼし、その運動性を向上させることをを指摘する。本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたネコは、対照食を与えたネコを上回る統計的に有意の活動度向上を証明した。臨床試験の結果を図１６に報告する。観察データに基づけば、本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄを与えたネコは、３０％を超える運動性向上を示した；これは、本発明の被験食の投与により、基礎疾患である骨関節炎の総体的症状の改善が達成されたことを証明する。図１６に示したデータから、当業者は、被験食である食物組成物ｊ／ｄの投与の結果として、ネコがより大きい運動性をもち、痛みおよび炎症がより少ないことを推測できる。
【０１７３】
[00202] 実施例８：組成物ｊ／ｄ投与後のイヌの夜間活動度
[00203] 本発明のイヌ用食物組成物ｊ／ｄの投与を伴う臨床試験をイヌにおいて実施した。食物組成物ｊ／ｄを与えた関節炎のイヌの夜間活動の観察を実施し、対照食を与えたイヌおよび投薬を受けなかったイヌと対比して記録した。測定はＡＣＴＩＷＡＴＣＨ（登録商標）装置で行なわれた。これらの装置は、肉眼的運動活動度のディジタル積分測定値を記録するアクチグラフィー（ａｃｔｉｇｒａｐｈｙ）ベースのデータロガー（ｄａｔａ ｌｏｇｇｅｒ）である。各装置はアクチグラフィー原理を用いて、睡眠スケジュール変動度、睡眠の量および質の統計値、ならびに昼間活動パターンを提供する。これらの装置は、動物の移動環境に関する客観的データを収集する。この臨床試験の結果により関節炎のイヌの夜間活動度の有意の低下が証明され、これにより、食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌは、関節の硬直および痛みを含めた基礎関節炎の総体的症状のより大幅な軽減および慰安を受けたことが証明される。この臨床試験からのデータを図１７に報告する。
【０１７４】
[00204] 実施例９：イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えた後のイヌにおけるタンパク質マーカーレベル
[00205] 関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌにおいて、イヌの軟骨分解に関連する２種類のタンパク質マーカーＣ２ＣおよびＣ１，Ｃ２のベースラインレベルを求めた。動物の血液試料を採取し、本明細書に記載する常法により検査した。この検査結果により、これらのマーカーの遺伝子生成物は関節炎のイヌにおいて増加し、遺伝子発現に対する食事成分の有効性を判定するためのマーカーとして使用できることが証明された。ベースラインデータを図５および６に示す。
【０１７５】
[00206] 関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌに関する栄養試験から臨床データを求めた。この実施例に記載する被験イヌに、図４の食物組成物として同定される本発明の食事を与えた。Ｃ２ＣおよびＣ１，Ｃ２関節炎マーカーのレベル、ならびに異常な筋骨格関節障害に関係することが知られている他のタンパク質マーカー、すなわち、コラーゲンＣＴＸ−ＩＩのレベルの評価を行なった。図１０、１１および１２に示すデータは、被験動物および対照動物の血液において測定したタンパク質マーカーレベルを表わす。図４に示すイヌ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたイヌは、図１０、１１および１２に示すように統計的に有意の血漿Ｃ２Ｃ、Ｃ１，Ｃ２およびＣＴＸ−ＩＩレベル低下を証明した。このバイオマーカーデータが、本発明の食事組成物、特にこの実施例に示した食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌが基礎疾患プロセス（この場合は骨関節炎）の総体的臨床症状の改善を示すという臨床所見を支持することは、当業者に認識されるであろう；これは、骨関節炎を含めた軟骨分解および局所関節炎症状態に関連する特定の遺伝子のダウンレギュレーションおよび特定の遺伝子生成物の発現低下と相関する。
【０１７６】
[00207] 実施例１０：関節炎のイヌ類および関節炎ではないイヌ類においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝子の遺伝子チップ分析
[00208] 市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、当技術分野で知られている標準臨床診断基準に従って判定された関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、ベースライン遺伝子発現を評価した。遺伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施し、２グループ間のベースライン比較を求めて、関節炎ではないイヌ類とイヌ類との基礎遺伝子発現差を判定した。
【０１７７】
[00209] 当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１７８】
[00210] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。関節炎バイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７９】
[00211] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。ＯＡバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８０】
[00212] これらの試験の結果により、遺伝子発現を利用して正常なイヌと関節炎を伴うイヌを識別できることが指摘される。関節炎のイヌにおける炎症に関連する差次発現遺伝子を、図１、２、７および８に示す。本明細書に述べる開示内容の一般原理を限定するものではなく、図１、２、７および８に示す遺伝子は本明細書に記載する発明のバイオマーカーとして使用でき、これにはアネキシンＡｌ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１５、１Ｌ−１７受容体、ＴＬＲ４、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２、ＦＬＡＰ、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２が含まれる。
【０１８１】
[00213] 実施例１１：食物組成物ｊ／ｄの食事を与えた関節炎のイヌ類および関節炎ではないイヌ類においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝子の遺伝子チップ分析
[00214] 市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、骨関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、遺伝子発現を評価した。合計３０匹の関節炎のイヌおよび３１匹の関節炎ではないイヌを試験した。遺伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施した。第１グループ３０匹の被験動物は、当技術分野で周知の臨床診断法に従って関節炎と判定された。第２グループのイヌ類は、同じ臨床診断基準に従って関節炎ではないとみなされた。当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８２】
[00215] 当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８３】
[00216] ｑＲＴ−ＰＣＲに関して、Ｔａｑｍａｎプローブ技術を用い、すべての分析をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲ機器により実施する。製造業者が提供する配列検出ソフトウェアパッケージ、バージョン１．２．２．を用いてデータを分析する。
【０１８４】
[00217] 前記の実施例の記載に従って調製した組織試料を用い、市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌにおいて遺伝子発現を評価した。生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。関節炎および炎症のバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８５】
[00218] この実施例からのデータを表３に示す。それらのデータは、変化倍率カットオフ１．１、ｐ値カットオフ０．０５、およびＱ値カットオフ０．３を採用した場合の２３８３の記録を含む。これらの分析基準を用いると、１を超える変化倍率は、関節炎のイヌグループから採取した試料においてそれらのプローブがアップレギュレートされていることの指標となる。表３に示すデータは、第１カラムにユニークＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ識別番号、以下それぞれｐ値、ｑ値、変化倍率、１／変化倍率の値、Ｔｏｐ ＢＬＡＳＴ注釈、一致率パーセント、ヒト寄託番号、トップヒット寄託番号、遺伝子記号、および遺伝子の説明を記載する。当業者はこのデータから、通常の実験分析のみを用いて下記の情報を演繹するであろう：変化倍率カットオフ基準、アップまたはダウンレギュレートされた目的遺伝子、およびＢＬＡＳＴ注釈によるそのような遺伝子の同定、関係するヒト寄託番号、および同定されたそのような各遺伝子の配列、ならびに対応する遺伝子生成物、およびそのような遺伝子生成物の配列；これらは、製造業者から入手できる情報、および当業者が容易に入手できる遺伝子配列データベースから入手できる情報に基づく。さらに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに用いられたユニークプローブに関する配列は、製造業者の公開情報源を参照することにより一般に入手できる。同様に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのバージョン１および２に用いられた各プローブの公開された配列情報および同定は、製造業者から、およびプローブセット相互の比較により、容易かつ一般に入手できる。本発明の組成物および製品の製造および使用を実施する際に、ならびに本明細書に教示される発明の製造方法および使用方法を実施する際に、当業者はそのような遺伝子発現データ、同定した調節異常な遺伝子、およびそれらに対応する遺伝子生成物を、このデータから同定して利用することができる。本明細書および特許請求の範囲に開示した本発明の範囲を限定することなく、特定の当該遺伝子および遺伝子生成物がイヌおよびネコの関節炎状態に高度に関係すると同定することができる。表３に述べたデータ中に教示されるこれらおよび他の遺伝子および遺伝子生成物は、表３に述べた当該遺伝子を調節する本発明組成物、特にｊ／ｄと表記する食物組成物を動物に与えた場合、イヌおよびネコが罹患する、基礎疾患である異常な筋骨格関節障害、特に関節炎状態に対して有益な作用をもつと推測することができる。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】
【表２−１】
【０１８８】
【表２−２】
【０１８９】
【表２−３】
【０１９０】
【表２−４】
【０１９１】
【表２−５】
【０１９２】
【表２−６】
【０１９３】
【表２−７】
【０１９４】
【表２−８】
【０１９５】
【表２−９】
【０１９６】
【表２−１０】
【０１９７】
【表２−１１】
【０１９８】
【表２−１２】
【０１９９】
【表２−１３】
【０２００】
【表２−１４】
【０２０１】
【表２−１５】
【０２０２】
【表２−１６】
【０２０３】
【表２−１７】
【０２０４】
【表２−１８】
【０２０５】
【表２−１９】
【０２０６】
【表２−２０】
【０２０７】
【表２−２１】
【０２０８】
【表２−２２】
【０２０９】
【表２−２３】
【０２１０】
【表２−２４】
【０２１１】
【表２−２５】
【０２１２】
【表２−２６】
【０２１３】
【表２−２７】
【０２１４】
【表２−２８】
【０２１５】
【表２−２９】
【０２１６】
【表２−３０】
【０２１７】
【表２−３１】
【０２１８】
【表２−３２】
【０２１９】
【表２−３３】
【０２２０】
【表２−３４】
【０２２１】
【表２−３５】
【０２２２】
【表２−３６】
【０２２３】
【表２−３７】
【０２２４】
【表２−３８】
【０２２５】
【表３−１】
【０２２６】
【表３−２】
【０２２７】
【表３−３】
【０２２８】
【表３−４】
【０２２９】
【表３−５】
【０２３０】
【表３−６】
【０２３１】
【表３−７】
【０２３２】
【表３−８】
【０２３３】
【表３−９】
【０２３４】
【表３−１０】
【０２３５】
【表３−１１】
【０２３６】
【表３−１２】
【０２３７】
【表３−１３】
【０２３８】
【表３−１４】
【０２３９】
【表３−１５】
【０２４０】
【表３−１６】
【０２４１】
【表３−１７】
【０２４２】
【表３−１８】
【０２４３】
【表３−１９】
【０２４４】
【表３−２０】
【０２４５】
【表３−２１】
【０２４６】
【表３−２２】
【０２４７】
【表３−２３】
【０２４８】
【表３−２４】
【０２４９】
【表３−２５】
【０２５０】
【表３−２６】
【０２５１】
【表３−２７】
【０２５２】
【表３−２８】
【０２５３】
【表３−２９】
【０２５４】
【表３−３０】
【０２５５】
【表３−３１】
【０２５６】
【表３−３２】
【０２５７】
【表３−３３】
【０２５８】
【表３−３４】
【０２５９】
【表３−３５】
【０２６０】
【表３−３６】
【０２６１】
【表３−３７】
【０２６２】
【表３−３８】
【０２６３】
【表３−３９】
【０２６４】
【表３−４０】
【０２６５】
【表３−４１】
【０２６６】
【表３−４２】
【０２６７】
【表３−４３】
【０２６８】
【表３−４４】
【０２６９】
【表３−４５】
【０２７０】
【表３−４６】
【０２７１】
【表３−４７】
【０２７２】
【表３−４８】
【０２７３】
【表３−４９】
【０２７４】
【表３−５０】
【０２７５】
【表３−５１】
【０２７６】
【表３−５２】
【０２７７】
【表３−５３】
【０２７８】
【表３−５４】
【０２７９】
【表３−５５】
【０２８０】
【表３−５６】
【０２８１】
【表３−５７】
【０２８２】
【表３−５８】
【０２８３】
【表３−５９】
【０２８４】
【表３−６０】
【０２８５】
【表３−６１】
【０２８６】
【表３−６２】
【０２８７】
【表３−６３】
【０２８８】
【表３−６４】
【０２８９】
【表３−６５】
【０２９０】
【表３−６６】
【０２９１】
【表３−６７】
【０２９２】
【表３−６８】
【０２９３】
【表３−６９】
【０２９４】
【表３−７０】
【０２９５】
【表３−７１】
【０２９６】
【表３−７２】
【０２９７】
【表３−７３】
【０２９８】
【表３−７４】
【０２９９】
【表３−７５】
【０３００】
【表３−７６】
【０３０１】
【表３−７７】
【０３０２】
【表３−７８】
【０３０３】
【表３−７９】
【０３０４】
【表３−８０】
【０３０５】
【表３−８１】
【０３０６】
【表３−８２】
【０３０７】
【表３−８３】
【０３０８】
【表３−８４】
【０３０９】
【表３−８５】
【０３１０】
【表３−８６】
【０３１１】
【表３−８７】
【０３１２】
【表３−８８】
【０３１３】
【表３−８９】
【０３１４】
【表３−９０】
【０３１５】
【表３−９１】
【０３１６】
【表３−９２】
【０３１７】
【表３−９３】
【０３１８】
【表３−９４】
【０３１９】
【表３−９５】
【０３２０】
【表３−９６】
【０３２１】
【表３−９７】
【０３２２】
【表３−９８】
【０３２３】
【表３−９９】
【０３２４】
【表３−１００】
【０３２５】
【表３−１０１】
【０３２６】
【表３−１０２】
【０３２７】
【表３−１０３】
【０３２８】
【表３−１０４】
【０３２９】
【表３−１０５】
【０３３０】
【表３−１０６】
【０３３１】
【表３−１０７】
【０３３２】
【表３−１０８】
【０３３３】
【表３−１０９】
【０３３４】
【表３−１１０】
【０３３５】
【表３−１１１】
【０３３６】
【表３−１１２】
【０３３７】
【表３−１１３】
【０３３８】
【表３−１１４】
【０３３９】
【表３−１１５】
【０３４０】
【表３−１１６】
【０３４１】
【表３−１１７】
【０３４２】
【表３−１１８】
【０３４３】
【表３−１１９】
【０３４４】
【表３−１２０】
【０３４５】
【表３−１２１】
【０３４６】
【表３−１２２】
【０３４７】
【表３−１２３】
【０３４８】
【表３−１２４】
【０３４９】
【表３−１２５】
【０３５０】
【表３−１２６】
【０３５１】
【表３−１２７】
【０３５２】
【表３−１２８】
【０３５３】
【表３−１２９】
【０３５４】
【表３−１３０】
【０３５５】
【表３−１３１】
【０３５６】
【表３−１３２】
【０３５７】
【表３−１３３】
【０３５８】
【表３−１３４】
【０３５９】
【表３−１３５】
【０３６０】
【表３−１３６】
【０３６１】
【表３−１３７】
【０３６２】
【表３−１３８】
【０３６３】
【表３−１３９】
【０３６４】
【表３−１４０】
【０３６５】
【表３−１４１】
【０３６６】
【表３−１４２】
【０３６７】
【表３−１４３】
【０３６８】
【表３−１４４】
【０３６９】
【表３−１４５】
【０３７０】
【表３−１４６】
【０３７１】
【表３−１４７】
【０３７２】
【表３−１４８】
【０３７３】
【表３−１４９】
【０３７４】
【表３−１５０】
【０３７５】
【表３−１５１】
【０３７６】
【表３−１５２】
【０３７７】
【表３−１５３】
【０３７８】
【表３−１５４】
【０３７９】
【表３−１５５】
【０３８０】
【表３−１５６】
【０３８１】
【表３−１５７】
【０３８２】
【表３−１５８】
【０３８３】
【表３−１５９】
【０３８４】
【表３−１６０】
【０３８５】
【表３−１６１】
【０３８６】
【表３−１６２】
【０３８７】
【表３−１６３】
【０３８８】
【表３−１６４】
【０３８９】
【表３−１６５】
【０３９０】
【表３−１６６】
【０３９１】
【表３−１６７】
【０３９２】
【表３−１６８】
【０３９３】
【表３−１６９】
【０３９４】
【表３−１７０】
【０３９５】
【表３−１７１】
【０３９６】
【表３−１７２】
【０３９７】
【表３−１７３】
【０３９８】
【表３−１７４】
【０３９９】
【表３−１７５】
【０４００】
【表３−１７６】
【０４０１】
【表３−１７７】
【０４０２】
【表３−１７８】
【０４０３】
【表３−１７９】
【０４０４】
【表３−１８０】
【０４０５】
【表３−１８１】
【０４０６】
【表３−１８２】
【０４０７】
【表３−１８３】
【０４０８】
【表３−１８４】
【０４０９】
【表３−１８５】
【０４１０】
【表３−１８６】
【０４１１】
【表３−１８７】
【０４１２】
【表３−１８８】
【０４１３】
【表３−１８９】
【０４１４】
【表３−１９０】
【０４１５】
【表３−１９１】
【０４１６】
【表３−１９２】
【０４１７】
【表３−１９３】
【０４１８】
【表３−１９４】
【０４１９】
【表３−１９５】
【０４２０】
【表３−１９６】
【０４２１】
【表３−１９７】
【０４２２】
【表３−１９８】
【０４２３】
【表３−１９９】
【０４２４】
【表３−２００】
【０４２５】
【表３−２０１】
【０４２６】
【表３−２０２】
【０４２７】
【表３−２０３】
【０４２８】
【表３−２０４】
【０４２９】
【表３−２０５】
【０４３０】
【表３−２０６】
【０４３１】
【表３−２０７】
【０４３２】
【表３−２０８】
【０４３３】
【表３−２０９】
【０４３４】
【表３−２１０】
【０４３５】
【表３−２１１】
【０４３６】
【表３−２１２】
【０４３７】
【表３−２１３】
【０４３８】
【表３−２１４】
【０４３９】
【表３−２１５】
【０４４０】
【表３−２１６】
【０４４１】
【表３−２１７】
【０４４２】
【表３−２１８】
【０４４３】
【表３−２１９】
【０４４４】
【表３−２２０】
【０４４５】
【表３−２２１】
【０４４６】
【表３−２２２】
【技術分野】
【０００１】
[0001] 本発明は、動物において異常な関節状態を処置するための組成物および方法に関するものであり、その際、異常な関節状態は動物の筋骨格関節に関係する。特に、本発明は異常な骨関節炎、リウマチ性関節炎および局所関節炎症を含む異常な筋骨格関節状態の処置、ならびにそのような異常な筋骨格関節状態に関連する症状の軽減に関する。本発明は、動物に差次発現する遺伝子、たとえば関節炎ではない動物と比較して関節炎の動物に差次発現する遺伝子を、本発明組成物の投与により調節することをも包含する。本発明は、それに関係する、イヌおよびネコを含む愛玩動物における新規バイオマーカーの同定、診断方法、組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002] 遺伝子は動物の発達に際して役割を果たすこと、また遺伝子発現の調節は動物の健康状態および健全性に影響を及ぼすある疾患または状態の発症に際して重要な役割を果たすことは、科学分野で一般に受け入れられている。また、遺伝子の差次発現がそのような疾患および状態の発症における一因であり、遺伝子発現パターンの評価はそのような疾患および状態の発症および制御を分子レベルで理解するためにきわめて重要なものとして広く認識されるようになった。遺伝子およびそれらと疾患の関係の理解を進めるために、差次遺伝子発現を研究するための多数の方法が開発された；たとえばＤＮＡマイクロアレイ、発現遺伝子タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔａｇ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＥＳＴ））、遺伝子発現の一連の解析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ））、ｍＲＮＡに関するサブトラクティブハイブリダイゼーション、サブトラクティブクローニングおよびディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）、ＲＮＡ−ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ（ＲＡＰ−ＰＣＲ）、Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析、ならびにタンパク質マイクロアレイベースのタンパク質に対する抗体結合。
【０００３】
[0003] 哺乳動物の身体の実質的にすべての関節に軟骨がある。軟骨は身体の支持構造であり、線維状タンパク質（コラーゲン）の厚い束から構成され、これらが織成されて関節表面を形成している。プロテオグリカンは、コラーゲンが占めていない細胞外間隙を充填する。そのようなプロテオグリカンはタンパク質と糖の組合わせから構成される。各プロテオグリカンサブユニットは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として知られる修飾された糖の長い鎖からなるタンパク質コアを含む。グルコサミンはＧＡＧの最も重要な１成分であり、かつ前駆物質である。身体によるコラーゲンの合成は、ＧＡＧ合成に依存する。軟骨中の軟骨細胞はグルコサミンを利用してＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびグルクロン酸を生成し、これらは身体によりヒアルロンの形成に利用される。ヒアルロンは動物の身体の関節に潤滑性を与える。
【０００４】
[0004] 軟骨は動物の身体において、関節内における柔軟性、加圧下での圧縮性、クッション性、引張り強さ、動作の範囲、および動きの滑らかさ付与するために重要である。軟骨を含む関節の例には、手指および足指、首、膝、股関節、肩などが含まれる。動物は軟骨が分解する多くの状態に罹患する可能性があり、それにより関節の柔軟性、圧縮性の低下が生じ、その結果しばしば関節および／または関節周囲組織の全体的炎症、ならびに場合により骨関節炎およびリウマチ性関節炎などの状態が発症する。その際、そのような動物は関節機能が著しく損なわれ、かつ痛みを感じる。
【０００５】
[0005] 関節炎は筋骨格障害である。骨関節炎は、動物およびヒトにおいて最も一般的なタイプの関節炎である。骨関節炎はヒトおよび愛玩動物に一般的に起きる変性性の関節疾患であり、この疾患は関節軟骨の変性性変化を特徴とし、プロテオグリカンおよびコラーゲンの損失ならびに軟骨周縁における新生骨の増殖を伴う。これらの変化には、滑膜内の変動性炎症反応が付随する。関節表面のヒアリン軟骨の主な欠損は、マトリックスのグリコサミノグリカンとコラーゲン線維の含量比の変化である。関節の軟骨直下にある骨は軟骨下骨と呼ばれる。これらの軟骨下骨は、それを覆う、それ自体は血管、神経またはリンパ組織をもたない軟骨に栄養を供給する。
【０００６】
[0006] 自然な軟骨侵食は加齢に伴って起きるが、関節に過度の負荷を与えることによっても生じる可能性があり、肥満症、遺伝、外傷、循環低下、骨配列不良および反復ストレスが関節の状態を増悪させる可能性がある。フリーラジカル損傷は骨関節炎の発症に関与する可能性があると推定されている。
【０００７】
[0007] 軟骨細胞として知られるヒアリン軟骨細胞は周囲の細胞外マトリックスを産生および維持する。軟骨マトリックスの恒常性の維持は、マトリックスタンパク質、たとえばＩＩ型コラーゲンおよびアグリカンの異化作用に依存する。これらのタンパク質は消化されて、軟骨細胞により合成される新たなタンパク質で置き換えられる。異化作用は、一部はタンパク質分解酵素、たとえばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびアグリカナーゼなどのタンパク質により行われる。正常な動物では合成と分解の間にバランスが達成され、これによって健康な軟骨が維持される。このバランスが分解の方へシフトすると、続いて異常発生が起き、結果的に関節の炎症および骨関節炎が生じる可能性がある。
【０００８】
[0008] 軟骨の恒常状態は、軟骨細胞間の細胞間シグナル伝達を介した調節に依存する。したがって、軟骨細胞はシグナル伝達分子を産生し、かつ応答する。そのようなシグナル伝達分子には、細胞の代謝に直接作用することができるサイトカインおよび増殖因子を含めることができる。細胞間シグナル伝達は複雑であり、完全には解明されていない。ＴＧＦ−ベータなどの増殖因子分子が関係しており、それらはＩＩ型コラーゲンの産生を促進しかつコラーゲン開裂を阻害すると考えられる。サイトカイン、たとえばＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−１−ベータも役割を果たす。これらのサイトカインは、軟骨を分解することができるプロテアーゼの産生を促進すると考えられる。細胞間シグナル伝達の結果として他の多数の複雑な相互作用が起きていると考えられる。
【０００９】
[0009] 細胞間シグナル伝達プロセスの複雑さのため、起きている相互作用を遺伝子レベルで理解することがきわめて望ましい。前関節炎または関節炎状態における調節異常な遺伝子の検出は、異常な筋骨格関節障害の生態を特にゲノム範囲で理解するのに役立つ。関係する生物学的経路を遺伝子発現プロファイリングよってより詳細に理解することは、保健医薬、栄養医薬（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）および栄養（食事）による疾患経路への介入法を開発するのに役立つであろう。これらの方法は、基礎疾患である異常な筋骨格関節状態の予防、早期検出および治療、ならびにそのような異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎の予後のモニタリングを可能にするであろう。そのような障害の病理に関係する調節異常な遺伝子は、適切な医薬、栄養医薬および栄養（食事）による介入法の選択を最適化するための重要なバイオマーカーとして利用できる。
【００１０】
[0010] さらに、骨関節炎の経過を反転させる薬物を同定すべきである。現在使用できる療法薬は、炎症を軽減し、および／または痛みを緩和するために用いられる。現在の療法は、骨関節炎などの筋骨格関節障害を処置するために非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として知られるクラスの薬物を用いるが、これらの療法は特に消化器障害を含めたさまざまな欠点をもち、またそれらは軟骨形成を阻害する可能性もある。
【００１１】
[0011] 大型犬はそれらの加齢に伴って関節炎を発症する場合がある。大型品種犬はそれらの大きな体格および／または遺伝的素因のため関節炎を発症しやすい。大型犬が関節炎その他の軟骨状態のリスクをもつ唯一の動物ではない。関節炎その他の変性性関節疾患はイヌに普通に認められており、そのような状態がネコに一般にみられることが示されている。ネコ類の骨関節炎は、主に１０歳以上の高齢のネコ類が罹患する疾患である。軟骨を冒す異常な筋骨格関節障害を発症するリスクをもつ動物には、哺乳動物、たとえばイヌ類、ネコ類、ウマ類、ヤギ類、ヒツジ類、ブタ類、ウシ類、ヒトおよび霊長類の種、ならびにシチメンチョウおよびニワトリを含めた鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
[0012] 食事は代謝に根本的に関係するので、疾患の原因および進行において重要な役割を果たす。疾患調節遺伝子は、栄養因子によってある程度調節される。したがって、食物中に栄養素として存在する食事成分は、遺伝子発現を転写および翻訳のレベルで、ならびに特定の翻訳後修飾において調節する可能性がある。それらは分解および酵素活性にも関係する可能性がある。栄養素レベルは代謝経路の平衡に影響を及ぼす可能性がある。代謝経路はしばしば複雑であり、異なる代謝経路間で多くの重複および相互作用を伴う場合がある。１種類の酵素、増殖因子、サイトカインまたは代謝産物の濃度の変化が、疾患関連の生理に関係する多数の代謝経路に影響を及ぼす可能性がある。ホルモンおよび他の細胞シグナル伝達分子が食事により調節されることは十分に理解されており、疾患の発症および進行に関与することも知られている。
【００１３】
[0013] 同じ疾患表現型が異なる代謝経路の障害から生じる場合があり、かつ各動物の遺伝子構成は異なっており、これらにより栄養因子および環境因子を含めた同じ因子に対する応答に変動が生じる。遺伝因子、栄養因子および環境因子の相互関係は、動物の疾患の病因、予防、治療および進行を理解する際に重要である。種々の疾患および障害に関連する栄養素に対する遺伝子発現応答を見いだすことにより、異常な筋骨格関節障害などの疾患に対して罹病性である動物のための食事を処方することができ、さらに基礎疾患の診断、治療および予後モニタリングが可能になる。
【００１４】
[0014] 栄養成分は、ｍＲＮＡ産生（転写）、ｍＲＮＡプロセシング、タンパク質産生（翻訳）および翻訳後修飾を含めた遺伝子発現に影響を及ぼし、これにより動物の代謝状態全体に影響を及ぼす。したがって、疾患の早期検出および疾患進行のモニタリングのためのバイオマーカーの利用、ならびに／あるいは遺伝子型に基づく食事は、動物、特に愛玩動物の疾患の予防または治療および新規療法の開発を可能にするであろう。食事は、議論の余地なく、疾患に対する罹病性を含めた動物の表現型に影響を及ぼす最も重要な環境因子である。
【００１５】
[0015] 遺伝子発現は、遺伝子機能の活性化因子および抑制因子により制御される不安定なプロセスにより調節されている可能性がある。栄養状態は、遺伝子転写速度に著しい変化を引き起こす可能性がある。多量栄養素、たとえばグルコース、脂肪酸およびアミノ酸、ならびに微量栄養素、たとえば鉄、亜鉛およびビタミンが、遺伝子発現を調節することができる。種々の生物活性食物成分、たとえばカロテノイド、フラボノイド、モノテルペンおよびフェノール系の酸は、遺伝子発現に影響を及ぼす転写因子として作用する可能性がある。これらの物質は遺伝子発現に直接的な作用をもつ傾向がある。他の状況では、腸内で細菌により発酵する食物繊維などの物質が短鎖脂肪酸などの栄養素の産生をもたらす可能性がある。そのような物質は、遺伝子発現の間接的な活性化因子または抑制因子として作用する可能性がある。
【００１６】
[0016] 転写および翻訳における栄養素に関係した変化の同定は、本明細書に記載するタイプの実験で検出することができる。本明細書の実施例においてプロファイリングした遺伝子の広範なアレイからみて、遺伝子の発現および量の変化は本明細書に教示する方法で容易に検出される。したがって、食事および代謝による遺伝子発現シグネチャーは、本明細書の実施例に教示する技術を用いて容易に確認できる。本発明のバイオマーカーは、動物に差次発現するタンパク質および／または核酸である。バイオマーカーの発現は、タンパク質または核酸のレベルで、当業者に既知の多様な方法を用いて評価することができる。
【００１７】
[0017] イヌ類およびネコ類のゲノムのスクリーニングに際し、これらの愛玩動物の食事の栄養成分に応答した遺伝子発現プロフィールについては現在までごく限られた研究が行われたにすぎない。癌の領域では、腫瘍のＣＧ分析のためにイヌ類の遺伝子マイクロアレイを用いた研究が行われている。Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260。他の研究が拡張型心筋症の分野で行われた。Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66: 1140-1155。現在のところ、骨関節炎に関するイヌ類のゲノムの研究はごく限られている。１研究において、ＭＩＧ−６遺伝子が骨関節炎の高リスクグループのイヌにおいて増加することが見いだされ、この遺伝子がイヌの軟骨分解および軟骨生成に関与する可能性があるという仮説が立てられた。Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482-486。
【００１８】
[0018] 本明細書に記載するように健康な動物集団を異常な筋骨格関節障害などの疾患を伴う集団と対比した研究は、これまで広範には実施されていない。イヌ類のゲノムに関して入手できるデータはほとんどなく、ネコ類のゲノムに関してはこれよりはるかに少ない。本明細書に含まれる遺伝子発現データにより、イヌおよびネコの軟骨分解に関連する遺伝子が同定される。そのような遺伝子発現データは、そのような遺伝子の発現を好ましい様式で調節することができる栄養組成物の同定を可能にする。これは、炎症に一般に関連する遺伝子に関しても当てはまる。ネコ類における同様なデータをさらに本明細書、図面、および本明細書中の実施例に示す。
【００１９】
[0019] 本明細書および実施例に含まれる遺伝子発現データは、ここに記載する遺伝子発現プロフィールに基づく多様な望ましい発明を可能にする。これらのデータにより、栄養供給のバイオマーカーとしての遺伝子発現生成物を同定および定量し、基礎疾患である異常な筋骨格関節障害を予防、同定および治療することができる。本発明方法の実施の結果として誘導される遺伝子発現データにより、そのような異常な筋骨格関節障害の進行をモニターすることもできる。これらの発明はさらに、基礎疾患および炎症を処置するために、本明細書に示す知見に基づいて、そのような異常な筋骨格関節障害に罹患しやすい罹病性動物亜集団を同定し、そのような障害を予防または治療するのに最適な食事を同定し、かつ医薬、栄養医薬および栄養（食事）介入法を同定するための、遺伝子検査を含む。本発明は、そのような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物からの組織および血液試料を分析するための、早期疾患検出用バイオマーカー、標的療法薬、診断試薬およびキットをも含む。
【００２０】
[0020] 動物、たとえば愛玩動物、たとえばネコおよびイヌのための食物を設計する際には、良好な栄養供給による動物の最適な健康およびウェルネスが重要な目標である。しかし、動物がその食物をおいしくないと知ったため、動物がその食物を食べることを拒絶もしくは拒否し、または動物によるその食物の摂取量が限られるならば、最も栄養のある動物用食物ですらほとんど役立たない。したがって本明細書中に述べる発明はさらに、そのような異常な筋骨格関節障害に罹病性であるかまたはそれらを伴う動物の健康およびウェルネスを増進できる栄養組成物を含む。したがって本発明には、愛玩動物が食べられる食物組成物であって、治療および予防効力をもち、かつ現在市販されている愛玩動物用食品より高い嗜好性をもつ組成物が包含される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Thomas R. et al. A canine cancer gene microarray for CGH analysis tumors, Cyrogenet. Genome Res., 2003; 102: 254-260
【非特許文献２】Oyayma, M. A. et al., Genomic expression patterns of cardiac tissue from dogs with dilated cardiomyopathy, Am. J. Vet. Res. 2005; 66: 1140-1155
【非特許文献３】Mateescu, R.G. et al., Increased MIG-6 mRNA transcipts in osteoarthritic cartilage. Biochem. Biophy. Res. Commun. 2005; 332: 482-486
【発明の概要】
【００２２】
[0021] 本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む組成物に関する。本発明は、動物、特に愛玩動物に投与するための栄養組成物、食事サプリメント、栄養医薬、およびおやつ（ｔｒｅａｔ）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
[0022] 本発明は、異常な筋骨格関節状態を伴う動物を処置する方法であって、その対象に少なくとも１種類の本発明組成物を投与することを含む方法にも関する。
[0023] 本発明はさらに、異常な筋骨格関節状態を伴う動物において発症を遅延させ、または動物の痛みを軽減する方法であって、その対象に少なくとも１種類の本発明組成物を投与することを含む方法に関する。
【００２４】
[0024] １態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、イヌ用ペットフード組成物を包含する。
【００２５】
[0025] 他の態様において本発明は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、少なくとも１種類のアミノ糖、少なくとも１種類の抗酸化剤、およびカルニチンまたはアセチルカルニチンを含む、ネコ用ペットフード組成物を包含する。
【００２６】
[0026] 他の態様は、その必要がある動物において、異常な筋骨格関節障害を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0027] さらに他の態様は、その必要がある動物において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される異常な筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２７】
[0028] 本発明のさらに他の態様は、その必要がある愛玩動物において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２８】
[0029] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００２９】
[0030] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症からなる群から選択される筋骨格関節障害を、本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３０】
[0031] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、骨関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0032] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、骨関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３１】
[0033] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、リウマチ性関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0034] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、リウマチ性関節炎を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３２】
[0035] 本発明の他の態様は、その必要があるイヌ類において、関節の炎症を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
[0036] 本発明の他の態様は、その必要があるネコ類において、関節の炎症を本発明組成物により治療または予防する方法を包含する。
【００３３】
[0037] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、１種類以上の遺伝子または遺伝子セグメントを包含する。
【００３４】
[0038] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する、２種類以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの組合わせを包含する。
【００３５】
[0039] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する遺伝子の発現を検出するのに適切な、２種類以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブの組成物を包含する。
【００３６】
[0040] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の差次発現を検出するための、方法および組成物を包含する。
【００３７】
[0041] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を伴う動物においてそのような異常な筋骨格関節障害を伴わない動物と比較して差次発現する１種類以上の遺伝子の発現プロフィールに対する被験物質の作用を測定するための方法であって、被験物質がそれらの動物においてそのような障害を調節するのに有用な可能性があるかどうかを判定するための被験物質のスクリーニング方法としての方法を包含する。
【００３８】
[0042] 本発明の他の態様は、動物が異常な筋骨格関節障害（たとえば骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症を含めることができる）を発症する可能性がある予後を明確にするための方法、または動物がそのような筋骨格関節障害を伴うという診断法を開発する際の方法を包含する。
【００３９】
[0043] 本発明のさらに他の観点は、本発明が、動物、特に愛玩動物における異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎の新規バイオマーカーの同定、およびインビボでのそのようなバイオマーカーの特徴的な遺伝子発現パターンに基づいてそのような動物における異常な筋骨格関節障害を検出する方法に関するということである。具体的には本発明は、身体試料、好ましくは血液試料において、対照発現レベルと比較した少なくとも１種類のバイオマーカーの差次発現を検出することを含み、その際、そのようなバイオマーカーの差次発現の検出により、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎を伴う動物が特異的に同定される。したがってそのような方法は、正常な動物または対照動物からの細胞と比較して異常な筋骨格関節障害において差次発現する少なくとも１種類のバイオマーカーの検出に依存する。
【００４０】
[0044] 異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態に関係する種々のイヌ類バイオマーカーを調節する必要がある動物にバイオマーカーの調節に有効な量の本発明組成物を投与することによりそのバイオマーカーを調節することも本発明の態様である。異常な筋骨格関節障害に関係する調節可能なバイオマーカーの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アネキシンＡｌ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢｌ、ＩＬ−ｌβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、Ｃ０Ｌ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２、Ｃ２Ｃ、Ｃ１，２Ｃ、ＦＬＡＰ、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２ならびにアグリカン。
【００４１】
[0045] 本発明のバイオマーカーは、異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態を伴うかまたは発症する可能性のある動物に差次発現するタンパク質および／または核酸である。
【００４２】
[0046] 本発明においてはさらに、変性性筋骨格関節疾患の身体的および形態的特徴を検出できる伝統的な診断法と組み合わせて本発明方法を使用できるものとする。たとえば骨関節炎の診断を裏付けるために、動物の血液試料から得た細胞における骨関節炎バイオマーカーに関する遺伝子の差次発現の解明を一般的な診断（たとえば放射線）技術と組み合わせることができる。
【００４３】
[0047] さらに他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーをコードする核酸またはそのフラグメントに特異的にハイブリダイズする１種類以上の核酸プローブを含む組成物に関する。
【００４４】
[0048] 他の観点において、本発明は、本発明のバイオマーカーを発現する遺伝子によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物に関する。
[0049] 本発明は、動物において異常な筋骨格関節障害を診断するためのキットであって、本発明のバイオマーカーの発現を検出するのに使用できる構成要素（本明細書に記載する組成物およびマイクロアレイが含まれるが、これらに限定されない）を含むキットにも関する。
【００４５】
[0050] 他の観点において、本発明は動物において変性性筋骨格関節状態を治療または改善するそれらの能力を試験することができる生物活性食事成分または他の天然化合物（以下において“食事成分”または“成分”と呼ぶ）を同定するための下記を含む方法に関するものであることも本発明に含まれるものとする：（ａ）表２および／または表３に開示する１種類以上のバイオマーカーのＲＮＡまたはタンパク質生成物を発現することができる細胞を、被験成分と接触させ；（ｂ）被験成分と接触させた細胞において産生された該ＲＮＡおよび／または生成物の量を測定し；そして（ｃ）被験成分と接触させた細胞内の該ＲＮＡおよび／またはタンパク質生成物の量を、被験成分と接触させなかった対応する対照細胞内に存在する同じＲＮＡまたはタンパク質生成物の量と比較し；その際、対照における量と対比して該ＲＮＡまたはタンパク質生成物の量が変化した場合、その成分は異常な筋骨格関節障害、特に骨関節炎、リウマチ性関節炎、または局所関節炎症状態を治療または改善するそれらの能力について試験すべきものであると同定される。
【００４６】
[0051] 本発明の他の観点は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するための方法であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物である。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオマーカーがアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される、前記方法である。
【００４７】
[0052] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するためのキット、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方法を実施するためのキットであり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したその少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物でり、場合によりさらにバイオマーカーに連結した検出可能な作用剤を含む。
【００４８】
[0053] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を診断および／または予後判定するための試薬、特に動物において骨関節炎を診断および／または予後判定する方法を実施するための試薬であり、その際、この方法は下記の段階を含む：少なくとも１つの組織試料または体液検体を動物から採取し；動物から採取したこの少なくとも１つの試料または検体における表２および／または表３から選択される１種類以上のバイオマーカーの量を測定し、その際、バイオマーカーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物であり、場合によりさらにバイオマーカーに連結した検出可能な作用剤を含む。
【００４９】
[0054] 本発明の他の態様は、異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後判定するためのバイオマーカーとしての、特に異常な筋骨格関節障害を診断および／または予後判定するキットの作製のための、表２および／または表３に同定した１種類以上のポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の使用である。さらに他の態様は、そのような１種類以上のバイオマーカーが、アネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択されるキットである。さらに他の態様は、そのようなキットであって、試薬および装置がオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ、およびフォーカスト遺伝子チップ、またはその組合わせを含めたＤＮＡマイクロアレイ分析材料を含むものである。
【００５０】
[0055] 本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、この方法は、その動物に由来する組織試料または体液検体を含む試料を用意し；試料または検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物のレベルを検出し；そして試料または検体中のバイオマーカーのレベルを対照試料中のそれらのバイオマーカーのレベルと比較することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５１】
[0056] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎を検出する方法であり、この方法は、前記方法の試料または検体を、前記バイオマーカーに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む第１プライマー、および前記バイオマーカーポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む第２プライマーと接触させ、増幅反応を実施し、そして試料または検体中のバイオマーカーポリヌクレオチドの増幅生成物を定量することを含む。
【００５２】
[0057] 本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管理の経過の有効性を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試料または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レベルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体における該バイオマーカーの第２レベルを、処置経過期間中の第２時点で測定し；そして（ｃ）第１時点および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み；その際、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５３】
[0058] 本発明の他の態様は、骨関節炎に罹患している動物に対する処置または栄養管理の経過の進行を評価する方法であり、この方法は、（ａ）その動物に由来する組織試料または体液検体における表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の第１レベルを、処置経過期間中の第１時点で測定し；（ｂ）その動物に由来する試料または検体における該バイオマーカーの第２レベルを、処置経期間中の第２時点で測定し；そして（ｃ）第１および第２時点における該バイオマーカーの測定値を比較することを含み；その際、該バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の遺伝子発現差をもつ。
【００５４】
[0059] 本発明の他の態様は、動物において骨関節炎を診断するための分子を同定する方法であり、この方法は、（１）その動物に由来する組織試料または体液検体であって、表２および／または表３に同定したバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物を含む試料を用意し；（２）試料または検体を被験分子と接触させ；（３）被験分子が該バイオマーカーに結合するかまたはそれにより結合されるかを判定することを含み；その際、バイオマーカーの発現が対照動物の細胞における発現と比較して少なくとも１倍以上の発現差をもつ。
【００５５】
[0060] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするための、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症状を示す動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１種類以上のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と陽性対照の間の差次遺伝子発現を判定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィール間に統計的に有意の差次遺伝子発現がない場合には骨関節炎の存在が指摘される；その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５６】
[0061] 本発明のさらに他の態様は、動物において骨関節炎をスクリーニングするための、下記の段階を含む方法である：ｉ）組織試料または体液検体を動物から採取し、試料における１種類以上のバイオマーカーであるポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリヌクレオチドまたはその代謝産物の遺伝子発現プロフィールを決定し；そしてｉｉ）試料における１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィールを、骨関節炎の症状を示さない対照動物に由来する複数の基準試料における平均的な遺伝子発現レベルの１種類以上のバイオマーカーを含む陽性対照と比較して、試料と対照動物の基準試料との間の差次遺伝子発現を判定し、その際、試料と陽性対照において１種類以上のバイオマーカーの遺伝子発現プロフィール間に１倍の差次遺伝子発現がある場合には骨関節炎の存在が指摘される；その際、バイオマーカーは表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５７】
[0062] 本発明の他の態様は、ある作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力をスクリーニングするための、下記の段階を含むアッセイ法である：ｉ）骨関節炎に典型的な差次遺伝子発現プロフィールを示す動物に由来する組織試料から核酸対照試料を単離し、この対照試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｉ）この組織試料を作用剤に付与し；ｉｉｉ）組織試料を作用剤に付与した後の段階ｉｉ）の組織試料から核酸試験試料を単離し、この試験試料における遺伝子発現レベルを測定し；ｉｖ）対照試料と試験試料の間で遺伝子発現の生成、安定性、分解および／または活性化を比較して、試験試料と対照試料の間の差次遺伝子発現プロフィールを求め；その際、対照試料と比較した試験試料の差次遺伝子発現プロフィールは、その作用剤が骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力の指標となる。
【００５８】
[0063] 本発明のさらに他の態様は、インフォーマティブアレイ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ａｒｒａｙ）に使用するために組織試料間で差次発現する複数の遺伝子を同定するための、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プローブを用意し；第２組織試料に由来する第２セットの不均一核酸プローブを用意し；ある生物学的プロセスの遺伝子に由来する複数の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第１発現レベルを測定し；該アレイを第２セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベルを測定し；ハイブリダイズした配列について第１発現レベルを第２発現レベルと比較することにより、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し；そして同定した遺伝子のランキングを、下記からなる段階群から選択される段階により確立する：第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝子をより低い差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差をもつ遺伝子より高くランキングする；その際、遺伝子は表２および／または表３の１種類以上の遺伝子を含む。
【００５９】
[0064] 本発明の他の態様は、核酸アレイをインフォーマティブアレイに変換するための、下記を含む方法である：第１組織試料に由来する第１セットの不均一核酸プローブを用意し；第２組織試料に由来する異なる第２セットの不均一核酸プローブを用意し；複数の配列を含む核酸アレイを第１セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第１発現レベルを測定し；このアレイを第２セットのプローブとハイブリダイズさせ、そのアレイの配列について第２発現レベルを測定し；同定した遺伝子に関する第１発現レベルと第２発現レベルの差に基づいて、下記からなる段階群から選択される段階により、前記の生物学的プロセスにおいて差次発現する複数の遺伝子を同定し：第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の絶対値を判定し、より高い差をもつ遺伝子をより低い差をもつ遺伝子より高くランキングし；そして第１発現レベルと第２発現レベルの間の差の標準偏差を決定し、より高い標準偏差をもつ遺伝子をより低い標準偏差をもつ遺伝子より高くランキングする；そして同定した複数の差次発現遺伝子からインフォーマティブアレイに収容する遺伝子を選択する；その際、遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺伝子から選択される。
【００６０】
[0065] 本発明のさらに他の態様は、骨関節炎をスクリーニングするために遺伝子発現を分析するための、下記の段階を含むコンピューター処理方法である：ｉ）組織試料のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ分析およびフォーカスト遺伝子チップ分析、またはその組合わせからなる群から選択される核酸マイクロアレイ分析から得られる複数の遺伝子発現信号の測定値を含むデータを、コンピューターベースの分析に適切な形態にコンパイルし；そしてｉｉ）コンパイルしたデータを分析し、その際、分析は多数のアップレギュレートされたバイオマーカー遺伝子およびダウンレギュレートされたバイオマーカー遺伝子から遺伝子ネットワークを同定することを含み、その際、バイオマーカー遺伝子は骨関節炎の存在または重症度に関連すると同定された遺伝子であり、それらの遺伝子は表２および／または表３に挙げた遺伝子を含む。
【００６１】
[0066] 本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、選択した遺伝子の発現または選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補が調節する能力を測定することを含み、その際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物は、表２および／または表３に挙げた遺伝子または遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発現生成物である。
【００６２】
[0067] 本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつをインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、選択した遺伝子の発現または選択した遺伝子発現生成物の活性をその候補が調節する能力を測定することを含み、その際、選択した遺伝子または遺伝子発現生成物は、表２および／または表３に挙げた遺伝子または遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎のバイオマーカーまたは遺伝子発現生成物である。
【００６３】
[0068] 本発明の他の態様は、薬物候補をインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ）少なくとも１つの試料または試料混合物を１種類以上の被験薬物候補と接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定した遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる薬物候補を選択し、そのレベルを薬物候補と混合していない試料と比較する。
【００６４】
[0069] 本発明の他の態様は、栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつをインビトロでスクリーニングする方法であり、この方法は、ａ）少なくとも２つの生物試料を採集し；その際、第１試料は骨関節炎を模倣し、第２試料は健康な状態を模倣し；ｂ）少なくとも１つの試料または試料混合物を１種類以上の被験栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつと接触させ；ｃ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において、表２および／または表３に挙げた遺伝子の遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を測定し；そしてｄ）ｂ）で得た生物試料または試料混合物において測定した遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を調節することができる栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつを選択し、そのレベルを栄養食物、食事サプリメント、栄養医薬またはおやつと混合していない試料と比較する。
【００６５】
[0070] 本発明の他の態様は、骨関節炎に対する動物の感受性をインビトロで判定する方法であり、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物からなる群から選択されるバイオマーカーの遺伝子発現または遺伝子発現生成物のレベルまたは活性を比較することを含む。
【００６６】
[0071] 本発明の他の態様は、骨関節炎を処置するための組成物を調製する方法であり、この方法は、表２および／または表３に挙げた遺伝子および遺伝子生成物からなる群から選択される骨関節炎バイオマーカーの調節剤を含む組成物を調製することを含む。
【００６７】
[0072] 本発明の他の態様は、骨関節炎に対する処置の有効性を判定するための、下記の段階を含む方法である：（ａ）骨関節炎に罹患しておりかつその処置を受けていた動物に由来する生物試料を用意し、（ｂ）その試料における骨関節炎に関する１種類以上のバイオマーカーのレベルを測定して、その動物に関する発現プロフィールを作製し、そして（ｃ）その発現プロフィールを下記のものと比較する：ｉ）その被験動物から処置開始前に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉ）その被験動物から処置のより早い時期に得た比較可能な発現プロフィール、および／またはｉｉｉ）骨関節炎に罹患していない対象に特徴的な比較可能な発現プロフィール；その際、骨関節炎に関する１種類以上のバイオマーカーは表２および／または表３に示す１種類以上の遺伝子の発現生成物を含む。
【００６８】
[0073] 本発明の他の態様は、骨関節炎の１以上の症状を治療または予防する能力について動物用食物組成物を選択するための、下記の段階を含む方法である：ｉ）骨関節炎を伴う動物に由来する組織試料または生物体液検体の遺伝子発現プロフィールに関する第１データセットを含む少なくとも１つのデータベースにアクセスし；ｉｉ）生物活性食事成分が前記の遺伝子発現プロフィールに及ぼす影響に関する第２データセットを含む少なくとも１つのデータベースにアクセスし；そしてｉｉｉ）第１および第２データセットを用いる第１アルゴリズムの使用により第１データセットおよび第２データセットを処理して、その動物のための食物組成物を選択および調製するのに有用な栄養処方を導き出し；そしてｉｖ）その栄養処方をユーザー可読フォーマットに保存または使用する。
【００６９】
[0074] 本発明のさらに他の目的、特徴および利点は当業者に容易に認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】[0075] 図１は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図２】[0076] 図２は、イヌ用組成物ｊ／ｄとして同定された少なくとも１種類の本発明組成物を与えた後のイヌにおける軟骨分解に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現低下を示す。
【図３】[0077] 図３は、関節炎ではないネコと比較した関節炎のネコの炎症に関連する種々の遺伝子の遺伝子発現増大を示す。
【図４】[0078] 図４は、組成物ｊ／ｄとして同定された本発明組成物の１態様を示す。
【図５】[0079] 図５は、正常なイヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図６】[0080] 図６は、関節炎ではない（非関節炎）イヌと比較した関節炎のイヌにおける遺伝子Ｃ１，２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図７】[0081] 図７は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図８】[0082] 図８は、イヌにおける関節炎ではない軟骨と対比して関節炎の軟骨に関連するタンパク質を発現する特定の遺伝子を示す。
【図９】[0083] 図９は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄをそれぞれ１４および１８日間イヌに与えた後のＥＰＡおよびＤＨＡの血清レベルを示す。
【図１０】[0084] 図１０は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ２Ｃの発現調節を示す。
【図１１】[0085] 図１１は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子Ｃ１，２Ｃの発現調節を示す。
【図１２】[0086] 図１２は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを１４日間イヌに与えた後の遺伝子ＣＸＴ−ＩＩの発現調節を示す。
【図１３】[0087] 図１３は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子Ｃ２Ｃのアップレギュレーションを示す。
【図１４】[0088] 図１４は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける遺伝子ＣＸＴ−ＩＩのアップレギュレーションを示す。
【図１５】[0089] 図１５は、関節炎ではないネコと対比した関節炎のネコにおける軟骨修復に関連する種々の遺伝子のアップレギュレーションを示す。
【図１６】[0090] 図１６は、ネコ用組成物ｊ／ｄを与えた後のネコの運動性の増大を示す。
【図１７】[0091] 図１７は、イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌの慰安の改善の指標となる、イヌの夜間活動度低下を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
[0092] 本発明は動物における異常な状態を処置する組成物および方法に関連し、その際、異常な状態は動物の筋骨格関節に影響を及ぼす。本発明組成物は経口投与用として配合することができ、これには動物用飼料が含まれるが、これらに限定されない。動物用飼料は、その組成物をそのために配合したいずれかのタイプの動物に与えることができる。たとえば、飼料は愛玩動物用に配合することができ、これにはイヌまたはネコが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
[0093] 本明細書中で用いる異常な動物は、動物の筋骨格関節に影響を及ぼす状態に罹患していると診断された、もしくは罹患していると思われる動物、または本発明に含まれる遺伝子発現データからそのような状態に対する素因が示唆される動物である。たとえば、骨関節炎に罹患していると診断された、もしくは罹患していると思われるイヌまたはネコは、異常な動物とみなされる。
【００７３】
[0094] 本発明組成物は、少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸を含む。オメガ−３脂肪酸は当技術分野で周知である。オメガ−３脂肪酸は動物の健康に必須の栄養素であり、動物はそのような脂肪酸を形成できないか、または十分な量では形成できない。そのような脂肪酸は、本発明により教示される組成物および方法において食事成分（単数または複数）として用いられる。本発明に含まれる栄養組成物の配合は、一部はそのような栄養組成物が本明細書に記載するタイプの筋骨格関節障害に罹患している動物の遺伝子発現に及ぼす影響に基づく。オメガ−３脂肪酸の例には、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち１種類を含む。他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はＡＬＡ、ＤＨＡまたはＥＰＡの３種類すべてを含む。
【００７４】
[0095] 本発明組成物は、少なくとも１種類のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をも含む。ＧＡＧは当技術分野で周知であり、反復二糖単位から構成される枝分かれしていない多糖類であるとみなされる。多糖類が枝分かれしておらずかつ反復二糖単位から構成される限り、その分子またはポリマーはＧＡＧとみなされる。ＧＡＧの例には、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸またはヒアルロナンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはヒアルロナンのうち少なくとも４、５種類またはすべてを含む。
【００７５】
[0096] 本発明組成物は、少なくとも１種類のアミノ糖をも含む。アミノ糖は当技術分野で十分に理解されており、簡単には、糖部分にヒドロキシル基のほかにアミン基が置換または存在するものを意味する。アミノ糖の例には、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸またはＮ−アセチルグルコサミンの４種類すべてを含む。
【００７６】
[0097] 本発明組成物は、少なくとも１種類の抗酸化剤をも含む。抗酸化剤は当技術分野で周知である。抗酸化剤の例には、ビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニン、カルニチンおよびベータ−カロテンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の１態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも１種類を含む。本発明の他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも２種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも３種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンまたはベータ−カロテンのうち少なくとも４種類を含む。本発明のさらに他の態様において、組成物はビタミンＣ、ビタミンＥ（トコフェロール類および／またはトコトリエノール類）、グルタチオン、リポ酸、メラトニンおよび／またはベータ−カロテンのうち少なくとも５種類またはそれ以上を含む。
【００７７】
[0098] 本発明組成物はカルニチンまたはアセチルカルニチンをも含み、これらは抗酸化作用をもつ第四級アンモニウム化合物である。
[0099] 特定の態様において、本発明組成物はさらに少なくとも１種類の食物無機質および／または少なくとも１種類の天然アミノ酸を含む。食物無機質および天然アミノ酸の例は周知である。食物無機質の例には、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムが含まれるが、これらに限定されない。１態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも１種類を含む。他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも２種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも３種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも４種類を含む。さらに他の態様において、組成物はカルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛またはバナジウムのうち少なくとも５種類またはそれ以上を含む。
【００７８】
[00100] 天然アミノ酸は当技術分野で周知であり、タンパク質中にみられるアミノ酸である。特定の１態様において、組成物は必須アミノ酸を含み、その際、必須アミノ酸という用語は対象の種に関係する。たとえば、イヌおよびネコにとっての必須アミノ酸には、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、イソロイシン、トレオニン、ロイシン、トリプトファン、リジンおよびバリンが含まれる。タウリンもネコにおいては必須アミノ酸であるとみなすことができる。
【００７９】
[00101] １態様において、イヌ用食物組成物ｊ／ｄは、一般に図４に示す組成をもち、コンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミノ糖、ならびにカルニチンおよび少なくとも１種類の抗酸化剤を含有する。この組成物は追加の栄養素源、たとえば下記のものをも含有することができる：粉砕全粒トウモロコシ、チキン副産物ミール、亜麻仁、大豆ミルラン（Ｓｏｙｂｅａｎ Ｍｉｌｌ Ｒｕｎ）、醸造米（Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｒｉｃｅ）、大豆ミール、豚脂（トコフェロールとクエン酸の混合物で保存）、チキンレバーフレーバー、粉末セルロース、魚油、塩化カリウム、Ｌ−リジン、炭酸カルシウム、コリン塩化物、ヨード添加食塩、ＤＬ−メチオニン、ビタミンＥサプリメント、ビタミン類（Ｌ−アスコルビル−２−ポリホスフェート（ビタミンＣ源）、ビタミンＥサプリメント、ナイアシン、一硝酸チアミン、ビタミンＡサプリメント、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ビタミンＢ１２サプリメント、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、ビタミンＤ３サプリメント）、Ｌ−トレオニン、タウリン、大豆レシチン、塩酸グルコサミン、無機質（硫酸鉄（ＩＩ）、酸化亜鉛、硫酸銅、酸化マンガン、ヨウ素酸カルシウム、亜セレン酸ナトリウム）、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−カルニチン（トコフェロールとクエン酸の混合物で保存）、コンドロイチン硫酸、ベータ−カロテン、ローズマリーエキス。
【００８０】
[00102] 実施例中で用いた本発明のネコ用ｊ／ｋ食物組成物は、オメガ−３脂肪酸、オメガ−６脂肪酸を含有し、アルファ−リノレン酸をも含有していた。この組成物は、コンドロイチン硫酸の形のグリコサミノグリカン、および塩酸グルコサミンの形のアミノ糖を含有していた。さらにこの組成物は、カルニチン、および少なくとも１種類の抗酸化剤、たとえばビタミンＣおよびベータ−カロテンを含有していた。
【００８１】
[00103] 用語“動物”は、ヒトまたはヒト以外の動物を意味し、鳥類、ウシ類、イヌ類、ウマ類、ネコ類、ヤギ類、ネズミ類、ヒツジ類、霊長類、およびブタ類などの動物を含む。
【００８２】
[00104] 用語“抗体”は、特異的抗原に結合するいずれかの免疫グロブリンを意味し、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体を含む。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、ポリエピトープ特異性をもつ抗体組成物、キメラ抗体、二重特異性抗体、ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｙ）、一本鎖抗体、および抗体フラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ、または他の抗原結合性フラグメントが含まれる。
【００８３】
[00105] 用語“アレイ”は、支持体上における少なくとも２つのプローブの秩序配置を意味する。プローブのうち少なくとも１つは対照または基準品であり、プローブのうち少なくとも１つは診断用プローブである。支持体上における約２から約４０，０００までのプローブの配置によって、プローブと試料のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間に形成された標識複合体それぞれのサイズおよび信号強度を確実に個々に識別できる。
【００８４】
[00106] 用語“差次発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”または“差次発現した（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）”は、増大または無調節な遺伝子発現を意味し、あるいは低下またはダウンレギュレートされた遺伝子発現を意味し、試料中の転写されたメッセンジャーＲＮＡまたは翻訳されたタンパク質の存在、不存在、または少なくとも２倍、または少なくとも１．５、１．４、１．３、１．２、１．１もしくは１倍の量の変化により検出される。
【００８５】
[00107] 差次遺伝子発現の尺度として用いる用語“倍”は、ある動物における遺伝子発現量が、比較動物における遺伝子発現量と比較して倍量または部分量の遺伝子発現であることを意味する；たとえば、関節炎の動物を関節炎ではない動物と比較。たとえば、その動物において比較動物より３倍の量で発現する遺伝子は３倍の差次遺伝子発現をもち、その動物において比較動物より１／３の量で発現する遺伝子も３倍の差次遺伝子発現をもつ。
【００８６】
[00108] 用語“フラグメント”は下記のものを意味する：（１）完全配列の一部であって特定の用途について完全ポリヌクレオチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、オリゴヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列、または（２）完全配列の一部であって特定の用途について完全ポリペプチド配列と同一もしくは類似の活性をもつ、ペプチドもしくはポリペプチド配列。そのようなフラグメントは、特定の用途に適切であると思われる任意数のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことができる。一般にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのフラグメントは完全配列に由来する少なくとも約１０、５０、１００または１０００個のヌクレオチドを含み、ポリペプチドフラグメントは少なくとも約４、１０、２０または５０個の連続アミノ酸を含む。この用語には、これらのフラグメントのポリヌクレオチドバリアントおよびポリペプチドバリアントが含まれる。
【００８７】
[00109] 用語“遺伝子（単数）”または“遺伝子（複数）”は、ポリペプチドの産生に関係するＤＮＡの完全または部分セグメントを意味し、コード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。この用語には、遺伝子コード配列の相補体にハイブリダイズするいずれかのＤＮＡ配列が含まれる。
【００８８】
[00110] 用語“ホモログ”は、下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド：同一もしくは異なる動物種に由来するポリヌクレオチドであって、あるポリヌクレオチドに対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似性をもち、かつ完全ポリヌクレオチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしくは実質的に同一の機能を行なうもの、またはあるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする能力をもつものが含まれる、あるいは（２）ポリペプチド：同一もしくは異なる動物種に由来するポリペプチドであって、ポリヌクレオチドの発現により同定されるあるポリペプチドに対して３０％、５０％、７０％もしくは９０％を超える配列類似性をもち、かつ完全ポリペプチドと同一もしくは実質的に同一の特性をもち、同一もしくは実質的に同一の機能を行なうもの、またはポリヌクレオチドの発現により同定されるあるポリペプチドに特異的に結合する能力をもつものが含まれる。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の配列同一性は、当業者に既知の方法、たとえばKarlin and Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))を用いて決定される。そのアルゴリズムを、Altschul et al. (J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990))のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))に記載のＧａｐｐｅｄ Ｂｌａｓｔを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いる。参照：http://ww.ncbi.nlm.nih.gov。
【００８９】
[00111] 用語“ハイブリダイゼーション複合体”は、１つのポリヌクレオチドのプリン類が相補的ポリヌクレオチドのピリミジン類と水素結合した際に試料ポリヌクレオチド間に形成される複合体を意味する；たとえば、５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’は３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−５’と塩基対合する。相補性の程度およびヌクレオチド類似体の使用がハイブリダイゼーション反応の効率およびストリンジェンシーに影響を及ぼす。
【００９０】
[00112] 用語“併せて（ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）”は、薬物、食物または他の物質を、（１）組成物、特に食物組成物中で一緒に、または（２）個別に、同一もしくは異なる頻度で、同一もしくは異なる投与経路を用いて、ほぼ同時もしくは周期的に、投与することを意味する。“周期的に”は、物質を特定の物質に許容できる投与計画で投与することを意味する。“ほぼ同時に”は、一般に物質（食物または薬物）を同時に、または互いに約７２時間以内に投与することを意味する。“併せて”は、具体的には薬物などの物質を処方期間投与し、本発明組成物を不定に投与する投与計画を含む。
【００９１】
[00113] 用語“ポリヌクレオチド”または“オリゴヌクレオチド”は、ヌクレオチドのポリマーを意味する。この用語には、一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ（ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）分子、ならびに一本鎖の場合にはそれの線状または環状の相補配列が含まれる。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうフラグメント、バリアント、ホモログ、および対立遺伝子（その配列に応じて）も含まれる。これらの配列は、アラインさせた際に完全相補的（不適正塩基対合がない）であってもよく、あるいは約３０％までの配列不適正塩基対合をもつこともできる。好ましくは、ポリヌクレオチドに関して、その鎖は約５０から１０，０００個までのヌクレオチド、より好ましくは約１５０から３，５００個までのヌクレオチドを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドに関して、その鎖は約２から１００個までのヌクレオチド、より好ましくは約６から３０個までのヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの厳密なサイズは、多様な要因、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの個々の用途および使用に依存するであろう。この用語には、合成されたヌクレオチドポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたものが含まれる。用語“ポリヌクレオチド”には“オリゴヌクレオチド”が含まれる。
【００９２】
[00114] 用語“ポリペプチド”、“ペプチド”または“タンパク質”は、アミノ酸のポリマーを意味する。この用語には、天然ポリマー、および天然に存在しない（合成）ポリマー、および１個以上のアミノ酸が人為的な化学模倣体で置換されたポリマーが含まれる。この用語には、元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうフラグメント、バリアントおよびホモログも含まれる。この用語には、任意長さのポリマー、好ましくは約２から１０００個までのアミノ酸、より好ましくは約５から５００個までのアミノ酸を含むポリマーが含まれる。。この用語には、合成されたアミノ酸ポリマー、ならびに天然源から単離および精製されたものが含まれる。
【００９３】
[00115] 用語“プローブ”は下記のものを意味する：（１）ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり、精製された制限酵素消化物中などに天然に存在するもの、または合成により製造されるものであって、そのプローブに相補的な配列をもつポリヌクレオチドへのアニーリングまたは特異的ハイブリダイゼーションが可能なもの、あるいは（２）実質的に他のタンパク質またはタンパク質フラグメントを排除して特定のタンパク質またはタンパク質フラグメントを特異的に結合することができるペプチドまたはポリペプチド。オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。プローブの厳密な長さは、温度、供給源および用途を含めた多数の要因に依存するであろう。たとえば診断用途については、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプローブは一般に約１０〜１００、１５〜５０、または１５〜２５個のヌクレオチドを含む。特定の診断用途においては、ポリヌクレオチドプローブは約１０〜１０００、３００〜６００個のヌクレオチド、好ましくは３００個のヌクレオチドを含む。本発明におけるプローブは、特定の標的配列の種々の鎖に“実質的に”相補的になるように選択される。これは、一組の予め定めた条件下でプローブがそれらの各標的配列と特異的にハイブリダイズまたはアニールするのに十分なほど相補的でなければならないことを意味する。したがって、プローブ配列は標的の厳密な相補配列を反映する必要はない。たとえば、非相補的なヌクレオチドフラグメントをプローブの５’または３’末端に結合させ、残りのプローブ配列が標的配列に相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列が標的ポリヌクレオチドに特異的にアニールするのに十分なほど標的ポリヌクレオチドの配列との相補性をもつ限り、非相補的な塩基類または比較的長い配列をプローブに挿入することができる。ペプチドプローブまたはポリペプチドプローブは、それにタンパク質またはペプチドが特異的に結合するいかなる分子であってもよく、これにはＤＮＡ（ＤＮＡ結合タンパク質について）、抗体、細胞膜受容体、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、細胞小器官および細胞小器官膜が含まれる。
【００９４】
[00116] 用語“試料”は、たとえばポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、代謝産物などを含有するいずれかの動物組織または体液を意味し、これにはＤＮＡおよびＲＮＡを含有する細胞および他の組織が含まれる。例には、血液、軟骨、結合組織、上皮、リンパ球、筋肉、神経、喀痰などが含まれる。試料は固体または液体であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、体液、たとえば血液または尿、細胞、細胞調製物、またはその可溶性画分もしくは培地の一部、染色体、細胞小器官などであってもよい。
【００９５】
[00117] 用語“単一パッケージ”は、キットの構成要素が１以上の容器内で、または１以上の容器によって物理的に関連づけられており、製造、流通、販売または使用のためのユニットとみなされることを意味する。容器にはバッグ、ボックス、ボトル、収縮ラップパッケージ、ステープラー止めその他の様式で固定した構成要素、またはその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一パッケージは、製造、流通、販売または使用のためのユニットとみなされる状態で物理的に関連づけられた個別の食物組成物の容器であってもよい。
【００９６】
[00118] 用語“有用なバリエーション”は下記のことを意味する：（１）ポリヌクレオチドについては、そのポリヌクレオチドの相補体；そのポリヌクレオチドおよびそれの相補体のホモログ；そのポリヌクレオチド、それの相補体およびそれのホモログのバリアント；ならびにそのポリヌクレオチド、それの相補体、それのホモログおよびそれのバリアントのフラグメント；ならびに（２）ポリペプチドについては、そのポリペプチドのホモログ；そのポリペプチドおよびそれのホモログのバリアント；ならびにそのポリペプチド、それのホモログおよびそれのバリアントのフラグメント。
【００９７】
[00119] 用語“仮想パッケージ”は、キットの構成要素が、ユーザーに他の構成要素の入手方法を指令する１以上の物理的または仮想的なキット構成要素上の指示によって関連づけられていることを意味する；たとえばバッグ内に、１つの構成要素、およびキットの使用方法に関する指示を入手するためにウェブサイトを訪れる、記録されたメッセージとコンタクトをとる、ビジュアルメッセージを見る、または介護者もしくはインストラクターとコンタクトをとるようにユーザーに指令する指示を収容したもの。
【００９８】
[00120] 用語“基準品”は下記のものを意味する：（１）対照試料であって、たとえば関節炎の動物を試験する場合には正常な動物に由来する組織を含むもの、または正常な動物を試験する場合にはたとえば関節炎の動物に由来する組織を含むもの、あるいは（２）対照試料であって、その用途の状況に応じて、被験物質が差次遺伝子発現を引き起こすかどうかを判定するためには、対応する正常動物またはたとえば関節炎の動物において試験すべき被験物質に曝露されていない正常動物またはたとえば関節炎の動物に由来する組織を含むもの。
【００９９】
[00121] 用語“ストリンジェントな条件”は下記のものを意味する：（１）０．１％ウシ血清アルブミンを有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭ ＮａＣｌを有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、７５ｍＭクエン酸ナトリウム中、４２℃でのハイブリダイゼーション、（２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸中、４２℃でのハイブリダイゼーション；ならびに４２℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄、または０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４中、５０℃での洗浄、あるいは同様な低いイオン強度および高温の洗浄剤および同様な変性剤を用いる同様な操作。
【０１００】
[00122] 用語“物質”は、元素、化合物、分子、もしくはその混合物、または動物において異常な関節状態の発症もしくは重症度を診断、予後判定もしくは調節するのに有用な可能性がある他のいずれかの物質を意味し、これにはいずれかの薬物、化学物質または生物学的物質が含まれる。
【０１０１】
[00123] 用語“ｓｉＲＮＡ”は、そのｓｉＲＮＡが遺伝子と同一細胞内で発現した場合にその遺伝子の発現を低下させまたは阻害する二本鎖ＲＮＡを形成するポリヌクレオチドを意味する。この用語には、相補鎖により形成された二本鎖ＲＮＡが含まれる。ハイブリダイズして二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡ相補部分は、一般に実質的または完全な同一性をもつ。一般にｓｉＲＮＡは少なくとも約１５〜５０個のヌクレオチドを含み、二本鎖ｓｉＲＮＡは約１５〜５０の塩基対、好ましくは約２０〜３０個のヌクレオチドおよび塩基対を含む。
【０１０２】
[00124] 用語“特異的に結合する”は、２分子間の特別かつ厳密な相互作用を意味し、これはそれらの構造、特にそれらの分子側鎖基に依存する。たとえば、ＤＮＡ分子の主溝内への調節タンパク質のインターカレーション、２つの一本鎖核酸間の主鎖に沿った水素結合、またはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合。
【０１０３】
[00125] 用語“特異的にハイブリダイズする”は、当技術分野で一般に用いられる予め定めた条件下でそのようなハイブリダイゼーションが可能なほど十分に相補的な（時には“実質的に相補的な”と言う）配列の２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の会合を意味する。たとえば、この用語は、本発明の観点に従った、ポリヌクレオチドプローブと一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれる実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションであって、そのポリヌクレオチドプローブと相補的ではない配列の一本鎖ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを実質的に除外したものを表わすことができる。
【０１０４】
[00126] 用語“バリアント”は下記のものを意味する：（１）ポリヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオチドのいずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み、かつ元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうポリヌクレオチド配列、および（２）ポリペプチド配列の１個以上のアミノ酸のいずれかの置換、変更、修飾、交換、欠失または付加を含み、かつ元の配列と同一または実質的に同一の特性をもち、同一または実質的に同一の機能を行なうポリペプチド配列。したがってこの用語には、一塩基多型（ＳＮＰ）および対立遺伝子バリアントが含まれ、またポリペプチドにおける保存的および非保存的アミノ酸置換が含まれる。この用語には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの化学的誘導体化、およびそれぞれ自然界には存在しないヌクレオチドまたはアミノ酸によるヌクレオチドまたはアミノ酸の置換も含まれる。
【０１０５】
[00127] 本明細書に記載する特定の方法、プロトコルおよび試薬は変更できるので、本発明はそれらに限定されない。さらに、本明細書中で用いる専門用語は特定の態様を記述するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。本明細書および付随する特許請求の範囲で用いる単数形（“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”）には、そうでないことが状況から明らかに示されない限り複数表記が含まれる；たとえば”バリアント”という表記は複数のバリアントを含む。さらに、定義した用語には、適正な文法状況で用いられるそれらの用語の変形が含まれる；たとえば、用語“特異的に結合する”には“特異的結合”およびその用語の他の形態が含まれる。同様に、用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”は除外ではなく包括として解釈すべきである。
【０１０６】
[00128] 別途定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語ならびにいずれかの頭字語は、本発明の技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味をもつ。本明細書に記載したものと類似または均等な組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料をいずれも本発明の実施に使用できるが、好ましい組成物、方法、製品、または他の手段もしくは材料を本明細書に記載する。
【０１０７】
[00129] 本明細書中で引用または参照したすべての特許、特許出願、刊行物および他の参考文献を、法律が許す範囲で本明細書に援用する。それらの参考文献の考察はそれらにおいてなされた主張をまとめるためのものにすぎない。それらの特許、特許出願、刊行物もしくは他の参考文献のいずれか、またはそれらのいずれかの部分が本発明に関係する先行技術であると認めるわけではなく、それらの特許、特許出願、刊行物もしくは他の参考文献の正確さおよび妥当性に意義を唱える権利は明確に保持する。
【０１０８】
[00130] １態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子または遺伝子セグメント（本明細書中で定義する“遺伝子”）を包含する。本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオチドを見いだしたことに基づく。これらの遺伝子は、異常であると診断された動物に由来するリンパ球における遺伝子の発現と、正常であると診断された動物に由来するリンパ球における遺伝子の発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いて比較することにより同定された。
【０１０９】
[00131] 本発明のポリヌクレオチドおよび遺伝子は、異常であると診断されたイヌ類に由来するリンパ球からの遺伝子発現と正常であると診断されたイヌ類に由来するリンパ球における遺伝子発現の差を測定することにより同定された。遺伝子発現の変化は、当業者に既知であるいずれかの方法により判定できる。一般に、遺伝子発現の変化は転写の測定（遺伝子により産生されるｍＲＮＡの量を判定する）、または翻訳の測定（遺伝子により産生されるタンパク質の量を判定する）により判定される。遺伝子により産生されるＲＮＡまたはタンパク質の量は、当業者に既知であるポリヌクレオチドおよびタンパク質の定量のためのいずれかの方法を用いて判定できる。一般に、ＲＮＡ発現はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（限定ではないが、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が含まれる）、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロット法、および他のハイブリダイゼーション法により判定される。測定するＲＮＡは一般にｍＲＮＡまたは逆転写されたｍＲＮＡの形である。タンパク質またはポリペプチドの発現は、種々の比色アッセイおよび分光アッセイ、ならびにローリーアッセイ（ｌｏｗｒｙ ａｓｓａｙ）、ビウレットアッセイ、蛍光アッセイ、比濁法、ビシンコニン酸アッセイ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｓｓａｙ）、プロテインチップ技術、赤外線吸収、ニンヒドリン、ブラッドフォードアッセイ（ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）、および紫外線吸収などの方法を用いて判定される。好ましい方法においては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．から購入できるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃａｎｉｎｅ−１およびＣａｎｉｎｅ−２遺伝子チップ、ならびにそれらのチップを用いて遺伝子発現を判定するための指示を用いて、遺伝子発現の変化を判定する。
【０１１０】
[00132] 一般に、正常な動物と比較した異常な動物における差次遺伝子発現は、少なくとも１種類の遺伝子の発現を測定することにより判定される。好ましくは、２種類以上の差次発現遺伝子の発現を測定して、遺伝子発現パターンまたは遺伝子発現プロフィールを得る。より好ましくは、複数の差次発現遺伝子の発現を測定して、より有意の遺伝子発現パターンまたはプロフィールのための追加情報を得る。
【０１１１】
[00133] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に固定された本発明の複数のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したオリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブの固定化バージョンである。このデバイスは、遺伝子およびポリヌクレオチドならびにそれらの発現パターンおよびプロフィールを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に、そのようなプローブを支持体またはそれに類する固体担体に結合させ、そして１種類以上のポリヌクレオチド（たとえば遺伝子、ＰＣＲ生成物、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）生成物、増幅技術を用いて合成したＤＮＡ配列、またはその混合物）を含有する試料を、試料ポリヌクレオチド（単数または複数）がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露する。プローブ、試料ポリヌクレオチド（単数または複数）のいずれかまたは両方を、一般に蛍光体、または他のタグ、たとえばストレプトアビジンで標識し、そして当業者に既知の方法を用いて検出する。試料ポリヌクレオチド（単数または複数）を標識する場合、結合した蛍光の検出によりハイブリダイゼーションを検出することができる。プローブを標識する場合、一般に標識の消失によりハイブリダイゼーションを検出する。プローブと試料ポリヌクレオチド（単数または複数）の両方を標識する場合、一般に２種類の標識の接近から生じる色ずれをモニターすることによりハイブリダイゼーションを検出する。特に蛍光標識については、多様な標識方法および標識が当業者に知られている。好ましくは、当技術分野で既知のものに匹敵するアレイ（ＤＮＡマイクロアレイ、遺伝子チップ、バイオチップ、ＤＮＡチップおよび遺伝子アレイを含めた幾つかの名称で知られている）の形成に適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１２】
[00134] ポリペプチドプローブは、一般的な方法に従って、たとえば本発明のポリヌクレオチドについて提示したヌクレオチド配列データおよび当技術分野で既知の方法を用いて作製できる。そのような方法には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリペプチドを細胞から直接単離する、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを単離または合成し、それらのＤＮＡまたはＲＮＡを用いて組換え生成物を調製する、個々のアミノ酸からポリペプチドを化学合成する、および既存のポリペプチドの化学的開裂によりポリペプチドフラグメントを調製する。
【０１１３】
[00135] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現を検出するのに適切なデバイスを提供する。このデバイスは、支持体の既知の位置に固定された本発明の複数のペプチドプローブまたはポリペプチドプローブを備えた支持体を含む。このデバイスは、本質的に、本明細書に記載したペプチドプローブまたはポリペプチドプローブの固定化バージョンである。このデバイスは、タンパク質およびそれらの発現パターンを迅速かつ特異的に検出するために有用である。一般に、そのようなプローブを支持体に結合させ、そして１種類以上のタンパク質を含有する試料を、試料タンパク質がプローブにハイブリダイズできる状態でそれらのプローブに曝露する。特定の態様において、プローブ、試料タンパク質、または両方を、一般に蛍光体、または当業者に既知の他の試薬で標識し、検出する。一般に、ポリヌクレオチドマイクロアレイの読取りに用いるものと同じ方法および計測器をタンパク質アレイに適用できる。好ましくは、アレイの形成に適切な支持体上にプローブを固定化する。
【０１１４】
[00136] 試料中のタンパク質の量または濃度を測定するための方法は当業者に既知である。そのような方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。抗体を使用する方法には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が適切である。そのような抗体は、タンパク質、タンパク質エピトープまたはタンパク質フラグメントに対して免疫学的に特異性であってよい。
【０１１５】
[00137] 本発明のある態様は、本発明のポリヌクレオチドの発現により生成したタンパク質の検出および定量のために抗体を使用する。タンパク質は免疫沈降法、アフィニティー分離、ウェスタンブロット分析、タンパク質アレイなどにより検出できるが、好ましい方法はＥＬＩＳＡ技術を利用する；この場合、抗体を固体支持体上に固定化し、標的であるタンパク質またはペプチドをこの固定化抗体に曝露する。プローブもしくは標的のいずれかまたは両方を、既知の方法で標識することができる。
【０１１６】
[00138] ある態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数の遺伝子の発現パターンまたはプロフィールは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出のためのプローブのアレイを用いて観察される。１態様においてはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのアレイを使用でき、一方、他の態様には本発明の差次発現した遺伝子生成物に特異的に結合する抗体または他のタンパク質のアレイを使用できる。そのようなアレイは市販されており、あるいはそれらを当業者に既知の方法、たとえば固体支持体上でのインサイチュー合成により、または予め合成したプローブをマイクロプリンティング技術で固体支持体に付着させることにより、特注作製することができる。多様な態様において、本発明の差次発現遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。
【０１１７】
[00139] １態様において、表２および／または表３に同定した２種類以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。これらのプローブは、動物において脂質およびグルコースの代謝経路に関連する遺伝子を検出するために設計される。他の態様において、表３に同定した２種類以上のポリヌクレオチドまたは遺伝子により産生される転写体またはタンパク質を特異的に検出するために、ポリヌクレオチドプローブまたはポリペプチドプローブのアレイを特注作製する。これらのプローブは、正常な動物と比較して異常な動物に特に関連する遺伝子を検出するために設計される。
【０１１８】
[00140] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子の差次発現を試料中で検出する方法を提供する。この方法は、下記を含む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、試料中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｂ）場合により、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリヌクレオチドプローブを含む組合わせを、基準品中のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて、１以上のハイブリダイゼーション複合体を形成し；（ｃ）試料に由来する、および場合により段階（ｂ）からの基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体を検出し；そして（ｄ）試料に由来するハイブリダイゼーション複合体を基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体と比較し、その際、基準品と試料の間のハイブリダイゼーション複合体の量の差は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１１９】
[00141] 段階（ｂ）、および段階（ｃ）の一部は任意であり、２以上の試験系の比較を比較的同時に実施すべき場合に採用される。しかし、好ましい態様において、比較のために用いる基準品はそれ以前にこの方法を用いて得られたデータに基づく。
【０１２０】
[00142] これらのプローブを試料に曝露してハイブリダイゼーション複合体を形成し、これらを検出して基準品のものと比較する。試料と基準品に由来するハイブリダイゼーション複合体間の差は、試料中のポリヌクレオチドの差次発現、したがって正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の指標となる。好ましい態様において、プローブは、本発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより提示されるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。ハイブリダイゼーション複合体を検出するための方法は、当業者に既知である。
【０１２１】
[00143] １態様において、この方法はさらに、ハイブリダイゼーションの前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中で被験物質が変化させたかどうかの指標となる。
【０１２２】
[00144] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の差次発現を試料中で検出するための方法を提供する。この方法は、下記を含む：（ａ）正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと試料中のタンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的結合が生じうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するものであり；（ｂ）場合により、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する複数のポリペプチドプローブを含む組合わせと基準品中のタンパク質とを、これらのプローブとタンパク質の間に特異的結合が生じうる条件下で反応させ、その際、プローブが結合したタンパク質は正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するものであり；（ｃ）試料および場合により段階（ｂ）からの基準品における特異的結合を検出し；そして（ｄ）試料における特異的結合を基準品におけるものと比較し、その際、基準品と試料における特異的結合間の差は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子がその試料中で差次発現したことの指標となる。
【０１２３】
[00145] これらのプローブを試料に曝露して特異的結合を形成させ、これを検出し、基準品のものと比較する。試料と基準品からの特異的結合間の差は、その試料における正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するタンパク質の差次発現、したがって遺伝子、特に異常関連遺伝子の差次発現の指標となる。好ましい態様において、プローブは、本発明により同定された１種類以上の遺伝子または遺伝子フラグメントにより産生されるタンパク質またはそのフラグメントを特異的に検出するように作製される。
【０１２４】
[00146] １態様において、この方法はさらに、ポリペプチドをタンパク質と反応させる前に動物または試料を被験物質に曝露することを含む。その場合、この比較は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現を、試料中で被験物質が変化させたかどうかの指標となる。
【０１２５】
[00147] 他の態様においては、動物のたとえば関節炎の組織の量を調節することを試みる際に、軟骨組織調節プログラムに応答した動物の進行状況をモニターするために、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子の発現を試料中で検出する前記方法を用いる。この方法は、調節プログラム期間中、間隔をおいて、好ましくは設定した間隔をおいて実施され、調節プログラム期間中の２以上の時点でのこの方法の結果を比較することにより、動物の進行状況をモニターする。比較により得られた、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現もしくは遺伝子発現パターンの変化、または無変化は、その調節プログラムの有効性の指標となる。
【０１２６】
[00148] 被験物質は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現するポリヌクレオチドまたは遺伝子、特に異常関連遺伝子に影響を及ぼす可能性のあるいかなる物質であってもよい。被験物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸；タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子、高分子、ビタミン、無機質、単純な糖類；複雑な糖類；多糖類；炭水化物；中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）；トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）；下記を含むｎ−３（オメガ−３）脂肪酸：ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＬＡ；下記を含むｎ−６（オメガ−６）脂肪酸：ＬＡ、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびＡＲＡ；ＳＡ、共役型リノール酸（ＣＬＡ）；コリン源、たとえばレシチン；下記を含む脂溶性ビタミン：ビタミンＡおよびその前駆物質、たとえばカロテノイド（たとえばβ−カロテン）、ビタミンＤ源、たとえばビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）およびビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＥ源、たとえばトコフェロール（たとえばα−トコフェロール）およびトコトリエノール、ならびにビタミンＫ源、たとえばビタミンＫｌ（フィロキノン）およびビタミンＫ２（メナジオン）；下記を含む水溶性ビタミン：Ｂ系列ビタミン、たとえばリボフラビン、ナイアシン（ニコチンアミドおよびニコチン酸を含む）、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチンおよびコバラミン；ならびにビタミンＣ（アスコルビン酸）；下記を含む抗酸化剤：前記ビタミンのうちのあるもの、特にビタミンＥおよびＣ；ならびにビオフラボノイド、たとえばカテキン、ケルセチンおよびテアフラビン；キノン類、たとえばユビキノン；カロテノイド、たとえばリコペンおよびリコキサンチン；レスベラトロール；ならびにα−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン；ならびにキトサン。好ましい態様において、被験物質は栄養素であり、これらを食物に添加するか、あるいはサプリメントとして摂取することができる。例には、脂肪酸、たとえばオメガ−３脂肪酸（たとえばＤＨＡおよびＥＰＡ）およびオメガ−６脂肪酸（たとえばＡＲＡ）、カルニチン、メチオニン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびビタミンＤが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
[00149] 好ましい態様において、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現に影響を及ぼすのに有用な物質は、出願中の米国仮特許出願Ｎｏ．６０／６５７９８０、２００５年３月２日出願、およびそれに基づく優先権を主張する後続の米国特許出願または外国特許出願に開示された方法を用いて同定することができる。
【０１２８】
[00150] 比較に際して用いる正常な動物に関する発現プロフィールは、被験動物に関する発現プロフィールと同時に１匹以上の正常な動物から、または正常な動物の発現プロフィールのデータベースから、得ることができる。好ましくは、長年蓄積された正常な動物に関する発現プロフィールのデータベースを、基準として使用するために入手できる。
【０１２９】
[00151] ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが差次発現するかどうかの判定は、当業者に既知の方法を用いてそれらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出することにより達成でき、それらの方法のうち若干を本明細書に記載する。
【０１３０】
[00152] 他の観点において、本発明は動物のゲノムを操作するのに適切な組成物を提供する。この組成物は、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常関連遺伝子の発現に干渉する１種類以上の物質を含む。
【０１３１】
[00153] 他の態様において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の発現を調節する方法を包含する。好ましい態様において、本発明組成物は下記のものを含む：ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）：ＤＨＡを、約１から約３０まで、好ましくは約３から約１５までの量；ＥＰＡを、約１から約３０まで、好ましくは約３から約１５までの量；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、約４／２から約３０／４５まで、好ましくは約９／６から約１８／１２までの量；ＡＬＡを、約１０から約１００まで、好ましくは約３０から約６０までの量；ＬＡを、約３０から約６００まで、好ましくは約６０から約３００までの量；ＡＲＡを、約５から約５０まで、好ましくは約１５から約３０までの量；ＳＡを、約３から約６０まで、好ましくは約６から約３０までの量；およびＣＬＡ（対照として）を、約６から約１２０まで、好ましくは約１２から約６０までの量。組成物をその組成物に適切ないずれかの方式または形態で動物に投与することができる。好ましくは、組成物を食物組成物またはサプリメントの形態で動物に経口投与する。食物組成物はいかなる形態であってもよい：たとえば、動物、特に愛玩動物、たとえばネコ類およびイヌ類のための当技術分野で既知である栄養バランスのとれた食物組成物、たとえば乾燥食物、半湿潤食物、および湿潤食物。サプリメントには、錠剤、カプセル剤などの剤形、およびこれらに類する形態が含まれる。さらに他の観点において、動物の軟骨組織の量を調節する１種類以上の他の物質と組み合わせて本発明組成物を投与することができる。
【０１３２】
[00154] 他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の発現を調節するのに適切な、または動物の軟骨組織の量を調節するのに適切な、組成物を提供する。この組成物は、遺伝子発現または組織を調節する量の、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ、ＡＬＡ、ＬＡ、ＡＲＡ、ならびにＳＡのうち１種類以上を含む。多様な態様において、この組成物は下記のものを含む：ｍｇ／ｋｇ／日：ＤＨＡを、動物に約１から約３０まで投与するのに十分な量；ＥＰＡを、動物に約１から約３０まで投与するのに十分な量；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）を、動物に約４／２から約３０／４５まで投与するのに十分な量；ＡＬＡを、動物に約１０から約１００まで投与するのに十分な量；ＬＡを、動物に約３０から約６００まで投与するのに十分な量；ＡＲＡを、動物に約５から約５０まで投与するのに十分な量；ＳＡを、動物に約３から約６０まで投与するのに十分な量；およびＣＬＡ（対照として）を、動物に約６から約１２０まで投与するのに十分な量。そのような物質は、動物の軟骨組織の量を調節するために有用となることができる。好ましくは、これらの物質は複数のそれらの遺伝子の発現に影響を及ぼす。１態様において、組成物はさらに、動物の軟骨組織の量を調節する１種類以上の薬物または他の物質を含む。
【０１３３】
[00155] さらに他の観点において、本発明は、正常な動物と比較して異常な筋骨格関節障害を伴う動物に差次発現する１種類以上の遺伝子、特に異常な筋骨格関節障害に関連する遺伝子の差次発現を被験系において判定するのに適切なキットを提供する。
【実施例】
【０１３４】
[00156] 実施例１：種々の物質または成分がイヌ類の細胞系における遺伝子発現に及ぼす影響の判定
[00157] Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘイヌ類遺伝子チップＣａｎｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ−１およびＣａｎｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｅ−２を用いて、種々の被験物質または成分、たとえば下記のものが、４種類のイヌ細胞系および適切な対照における遺伝子発現に及ぼす影響を判定する：ＭＣＴ類；ＴＡＧ類；ＡＬＡ；ＥＰＡ；ＤＨＡ；リノール酸；ステアリン酸（ＳＡ）、共役型リノール酸（ＣＬＡ）、ＧＬＡ；アラキドン酸；レシチン；ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン、パントテン酸、葉酸、ビオチン、ビタミンＣ、カテキン、ケルセチン、テアフラビン；ユビキノン；リコペン、リコキサンチン；レスベラトロール；α−リポ酸；Ｌ−カルニチン；Ｄ−リモネン；グルコサミン；Ｓ−アデノシルメチオニン；キトサン、これらの化合物を１種類以上含有する種々の材料、およびその多様な組合わせ。各成分を、表１に示す選択した試料成分について指示した２種類の濃度で試験する。２種類のうち高い方の濃度の溶媒を対照として用いる。４種類のイヌ細胞系を用いる：ＣＣＬ３４（腎臓）、ＣＲＬ１４３０（胸腺）、ＣＣＬ１８３（骨）（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）およびＣＴＡＣ（甲状腺）(参照：Measurement of NK Activity in Effector Cells Purified from Canine Peripheral Lymphocytes, Veterinary Immunology and Immunopathology, 35 (1993) 239-251)。特定濃度のある成分で処理した細胞系を“処理”と表記し、非処理試料を“対照”と表記する。“遺伝子”および“プローブ”という語をこの方法においては同義に使用する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップに備えられた指示を用いて、遺伝子発現を処理細胞系と対照細胞について測定する。各ユニークプローブ識別番号についての詳細な情報は製造業者から入手できる。
【０１３５】
[00158] 遺伝子発現データを前記のいずれかの処理について“アップ（ｕｐ）”または“ダウン（ｄｏｗｎ）”レギュレートされたと判定する。遺伝子が“アップ”または“ダウン”のいずれであるかの決定は変化倍率に基づき、これは各プローブについて、処理における強度／対照における強度として計算される。その数値が＜１／１．５（４種類の細胞系すべてにわたる分析について）または＜１／２（細胞系内の分析について）である場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなし、その数値が＞１．５（４種類の細胞系すべてにわたる分析について）または＞２（細胞系内の分析について）である場合にはその変化倍率をダウンレギュレートされたとみなす。また、使用したソフトウェアに従って、あるプローブが比較される条件（処理または対照）のうち一方においてのみ存在と呼出され、他方においては“不存在”または“境界”であり、かつ変化倍率が有意である場合、それを以後の精査のために有意とみなす。２つの処理において反対方向に調節されると思われるプローブを以後の分析から除外する。
【０１３６】
[00159] 生データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０（ＧＳ）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により分析し、Ｒ−Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（ＲＢ）フリーウェアにより確認する。両方のソフトウェアパッケージを用いて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにより作製されたＣＥＬファイルからプローブ強度を計算する。プローブ毎の存在／不存在／境界の呼出、およびＰ−値は、Ｒ−ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒおよびＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェアを個別に用いて計算される。
【０１３７】
[00160] ２つのスキームをデータ解析に用いる。第１；“細胞系間”、および“個々の細胞系内”。第１スキームでは、遺伝子がすべての細胞系にわたって有意かつ共通であると認められた場合、それらを採点のために選択する。この“細胞系間”は、最小のノイズで最高の信頼データを与え、どの遺伝子が個々の成分により影響を受けるかについて可能な最良の手掛かりを提供することができる。第２スキームでは、２つの処理において個々の細胞系内で両方のソフトウェアパッケージに従って有意倍率の変化を示す遺伝子のみを採点する。これらの実験から得られたデータのサンプルを表２に示す。表２は、処理物質（Ｃｏｌｕｍｎ １）、プローブ（データリンク）（Ｃｏｌｕｍｎ ２）、方向（Ｃｏｌｕｍｎ ３）、最良ＢＬＡＳＴ標記（統計的に判定）（Ｃｏｌｕｍｎ ４）、およびヒト寄託番号（Ｃｏｌｕｍｎ ５）を示す。すべての被験成分の情報を参考のためにデータベースに保存する。
【０１３８】
[00161] イヌ類の生理的状態（異常としての診断）および表１〜２からの情報の比較に基づいて、すなわち被験物質または被験成分により影響を受けかつ正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子に注目して、異常なイヌ類のための食物組成物の選択および調製に有用な栄養処方は、下記の成分のうち１種類以上を下記の量で含有すると考えられる（インビボ量ミリグラム／キログラム／日（ｍｇ／ｋｇ／日）はインビトロで用いた量からの外挿に基づく）：たとえばＤＨＡ−約１から約３０まで；ＥＰＡ−約１から約３０まで；ＥＰＡ／ＤＨＡ Ｃｏｍｂｏ（１．５：１の比率）−約４／２から約３０／４５まで；ＡＬＡ−約１０から約１００まで；ＬＡ−約３０から約６００まで；ＡＲＡ−約５から約５０まで；およびＳＡ−約３から約６０まで。これらのデータに基づいて、これらの成分のうち１種類以上を含有する食物組成物および関連の食事を調製し、正常な動物と比較して異常な動物に差次発現する遺伝子を調節するために用いることができる。そのような成分は、動物において異常な筋骨格関節障害の調節を生じ、したがって１態様においては望ましい状態または正常な状態への移行を促進し、動物のより良好な健康およびウェルネスを促進するであろう。
【０１３９】
[00162] 実施例２：ＲＮＡ単離操作
[00163] 材料および方法：本明細書の実施例にさらに記載するように、下記の一般法を用い、遺伝子チップを利用して、イヌおよびネコの組織試料から遺伝子発現プロファイリング用のＲＮＡを単離することができる。これらの方法または当技術分野で認識されているその変法を適用して、当業者が利用できる種々の分析法、特にマイクロアレイ技術を用いてさらに遺伝子発現を分析するためのＲＮＡを組織または体液試料から単離することができるのは、当業者に明らかであろう。
【０１４０】
組織からのリボ核酸（ＲＮＡ）の単離
[00164] 組織試料を採集し、液体窒素中で凍結させ、融解し、次いでホモジナイズし、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ抽出法を用いて処理して、良質のＲＮＡを調製することができ、次いでこれをさらにゲノム分析する。
【０１４１】
[00165] 材料：氷、液体窒素、イヌ類またはネコ類の凍結組織、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）細胞溶解試薬、最低９９％のクロロホルム、イソプロピルアルコール、７０％エタノール（無水エタノールおよび脱イオン無ＲＮａｓｅ水を用いて調製）、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）、脱イオン水、ＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）：Ａｍｂｉｏｎから。
【０１４２】
[00166] 装置：Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５パワーホモジナイザー、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ２５Ｒ遠心機、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機、鉗子、メス、硬質カッティング面、すなわちカッティングボード、１．５ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポーザブルポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびに糸屑を含まない拭布。
【０１４３】
[00167] 調製：４ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れた５０ｍＬポリプロピレン試験管を用意する（ＲＮＡ単離のために選択した各組織につき１本の試験管）。
[00168] 組織ホモジナイゼーション：液体窒素を保持できる容器に３〜４匙の液体窒素を装入する。一片の凍結組織を直ちに上記の容器に入れ（組織はほぼ豆の大きさとすべきである）、この組織を適宜ラベルを付けた５０ｍＬポリプロピレン試験管（既に４ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）を入れたもの）に入れる。直ちにＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５パワーホモジナイザーを用いてホモジナイゼーションを開始する。最高設定（６）で１０〜１５秒間ホモジナイズする。試料を氷上でさらに１０〜１５秒間冷却し、次いで繰り返す。組織が完全にホモジナイズされて溶液が混濁するまで続ける。完全にホモジナイズされると、５０ｍＬ試験管に蓋をして氷へ戻す。ホモジナイズされた組織を室温で５分間インキュベートした後、単離操作を進める。
【０１４４】
[00169] 実施例３：ＲＮＡ調製操作
[00170] ＲＮＡの単離：ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬に備えられたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示に示された操作法に全般的に従う。ホモジナイズした試料を４つの１ｍＬ部分試料に分けて４本の１．５ｍＬミクロ遠心管に入れる。１ｍＬ部分試料それぞれに２００ｕＬのクロロホルムを添加する。遠心管に蓋をし、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで上下に振とうする。桃色の乳濁液になるはずである。遠心管を室温で２〜３分間インキュベートする。遠心管を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心する。水相（上層）を無菌の１．５ｍＬミクロ遠心管へ移す。新たな遠心管へ移すべき水相の一般的な体積は約５００ｕＬである。中間相または下相を移さないことを確認する。水層を入れた各ミクロ遠心管に５００ｕＬのイソプロピルアルコールを添加することにより、溶液からＲＮＡを沈殿させる。遠心管を少なくとも２０秒間、上下に振とうする。試料を室温で１０分間インキュベートする。試料を１４，０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心する。ペレットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清を慎重に除去する。１ｍＬの７０％エタノールを添加してペレットを洗浄する。遠心管を揺らす（または遠心管を台上で軽く叩く）ことによりペレットを剥離させ、振とう混合する。８，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心する。ペレットを失わないことを確認しつつ、液体の吸引除去により上清を慎重に除去する。糸屑を含まない拭布を用いて過剰のエタノールを慎重に吸い上げて、ペレットを確実に乾燥させる。各ペレットを３０ｕＬのＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに再懸濁する。ＲＮＡが再び溶解するまで穏やかにピペッティングにより混合し、次いで−８０℃で保存する。ＲＮＡの再懸濁を容易にするために試料を数秒間、低速でボルテックス撹拌することが必要な場合がある。必要であれば、凍結前に試料をミクロ遠心機により遠心沈殿させる。
【０１４５】
[00171] ＲＮＡの清浄処理：ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｈａｎｄｂｏｏｋに示された操作に従う。
ＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバー内で培養した細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いたＲＮＡの単離
[00172] 哺乳動物細胞系由来の培養細胞を用いて良質のＲＮＡを単離し、次いでこれを以後のゲノム分析に用いる。細胞の培養に関係するすべての作業を厳密な無菌条件下で実施すべきである。
【０１４６】
[00173] 試薬：１０×ＰＢＳ、脱イオンＨ２Ｏ、無水エタノール、ＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、β−メルカプトエタノール、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）、緩衝液ＲＬＴおよび緩衝液ＲＷ ｌおよび緩衝液ＲＰＥ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ中に備えられている）。
【０１４７】
[00174] 装填／材料：ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム、ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフ、２０ｍＬ無菌注射器、ＯｐｔｉＣｅｌｌティップ、細胞スクレーパー、Ｐｌ０００ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、Ｐ２００ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット，Ｒａｉｎｉｎ、１００〜ｌ００ｕＬフィルター付きピペットティップ、１〜２００ｕＬフィルター付きピペットティップ、無菌トランスファーピペット、５５ｍＬ無菌溶液皿、１．５ｍＬ無菌ミクロ遠心管、およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心機。
【０１４８】
[00175] 溶液：緩衝液ＲＬＴ（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔに備えられた原液）；−プロトコルを開始する前に、１０ｍＬの緩衝液ＲＴＬにつきｌ００ｕＬのβ−メルカプトエタノールを添加する。７０％エタノール：３５ｍＬの無水エタノールを１５ｍＬの脱イオン無ＲＮａｓｅ水に添加することにより５０ｍＬの７０％エタノールを調製する。１×ＰＢＳ：−無ＲＮａｓｅ水。この溶液を．２２ｕｍのフィルターにより濾過する。
【０１４９】
[00176] 操作：細胞をＯｐｔｉＣｅｌｌチャンバーから取り出す（一度に１つのＯｐｔｉＣｅｌｌを処理する）。細胞を顕微鏡下で検査して、細胞がＲＮＡ単離前に生存していることを確認する。細胞培養培地を分離し、廃棄する。ＯｐｔｉＣｅｌｌナイフを用いて上側の膜を切り取り、下側の膜上の細胞を露出させる。細胞が付着している膜を１×ＰＢＳで３回洗浄する。６００ｕＬの緩衝液ＲＬＴ（β−メルカプトエタノールを含有する）を、細胞が付着している膜の中央にピペットで添加する。細胞スクレーパーを用いて、緩衝液ＲＬＴを穏やかに膜の全面に広げ、次いで液体を１隅に集める。緩衝液ＲＬＴの全体積をピペットで吸い取り、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに入れる。
【０１５０】
[00177] ＲＮＡの単離：ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムを１４，０００ｒｐｍで２分間遠心する。スピンカラムを廃棄し、ただし採集管とその内容物は残しておく。６００ｕＬの７０％エタノールを採集管に添加し、ピペッティングによって十分に混合する（この時点での全体積＝１．２ｍＬ）。６００ｕＬの細胞溶解物をＲＮｅａｓｙミニカラムへ移し、１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集管およびスピンカラムは残しておく。残りの体積の細胞溶解物（約６００ｕＬ）をスピンカラムへ移し、遠心を繰り返す。フロースルーを廃棄し、ただし採集管およびスピンカラムは残しておく。７００ｕＬの緩衝液ＲＷｌをスピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心してカラムを洗浄する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１５秒間遠心する。フロースルーを廃棄し、ただし採集管／カラムを残しておく。さらに５００ｕＬの緩衝液ＲＰＥをカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心する。スピンカラムを１．５ｍＬ採集管へ移す。３０ｕＬのＲＮＡ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎをシリカゲル膜に直接添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心してＲＮＡを溶離する。最終ＲＮＡを−７０℃で保存する。
【０１５１】
ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイ
[00178] Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒおよびＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイを用いて、哺乳動物の培養細胞、リンパ球または組織から単離したＲＮＡを定量のために分析する。
【０１５２】
[00179] 試薬：ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏゲルマトリックス、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ濃縮色素、ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカー（以上の試薬はすべてＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏアッセイキットに収容されている，Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＲＮＡ ６０００ラダー（ｌａｄｄｅｒ）、ＲＮａｓｅ Ｚａｐ、および無ＲＮａｓｅ水：Ａｍｂｉｏｎから。
【０１５３】
[00180] 装置／他の材料：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｉｐ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ａｇｉｌｅｎｔ、ＲＮＡ ６０００チップ，Ａｇｉｌｅｎｔ、電極クリーナー、Ｐ２、Ｐｌ０、Ｐ２００およびＰｌ０００ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無菌無ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフィルター付きピペットティップ、無菌１．５ｍＬミクロ遠心管、ボルテックス、ＩＫＡボルテックスミキサー、ミクロ遠心機、および加熱ブロック。
【０１５４】
[00181] 操作：操作法は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＲｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｇｕｉｄｅ，ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ａｓｓａｙ，Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００３に示されている。この説明書に示された操作法に従い、ただし下記の変更を伴う：１７頁のゲル調製−濾過したゲルをそれぞれ６５ｕＬの部分に分けるのではなく、濾過したゲルの原液を元のミクロ遠心管内に保持しておき、必要に応じて６５ｕＬを分取する。２２頁のＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカーの装填−試料を入れない予定の各試料ウェルに１ｕＬの無ＲＮａｓｅ水を（ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏマーカーの代わりに）添加する。これはマーカーの使用量を節約するだけでなく、無ＲＮａｓｅ水を含めていずれの試薬も汚染されていないことを知るための陰性対照としても役立つ。２３頁のラダーおよび試料の装填−試料およびＲＮＡ ６０００ラダーを、さらに３０秒間（合計２．５分間）、７１℃で熱変性させる。２６頁−チップ操作の開始−アッセイメニューから“Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｎａｎｏ”オプションを選択する。
【０１５５】
実施例４：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析
[00182] Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃａｎｉｎｅ １およびＣａｎｉｎｅ ２ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いて遺伝子発現を分析する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（９５０５１カリフォルニア州サンタクララ）から市販されているアレイ。全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。このｃＤＮＡを用いてｃＲＮＡを生成させ、これをフラグメント化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いる。遺伝子チップを洗浄し、ハイブリダイゼーション信号をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘレーザースキャナーで測定する。次いでハイブリダイゼーションデータを確認し、以後の分析のために規準化する。
【０１５６】
[00183] 材料：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが大部分の試薬およびキットを提供する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのマニュアルに挙げてあるがキット中に供給されていない他の試薬は、別個に入手できる（詳細についてはＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（７０１０２１ Ｒｅｖ．４）を参照）。ＲＮａｓｅ Ｚａｐ（登録商標）および脱イオン水。
【０１５７】
[00184] 装置：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆミクロ遠心機、１．５ｍＬ無ＤＮａｓｅ無菌ＲＮａｓｅ／無菌ミクロ遠心管、５０ｍＬ無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌ディスポーザブルポリプロピレン試験管、Ｐｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ Ｒａｉｎｉｎ Ｐｉｐｅｔｍａｎピペット、無ＤＮａｓｅ無ＲＮａｓｅ／無菌のＰｌ０００、Ｐ２００、Ｐ２０、Ｐｌ０およびＰ２ピペット用フィルター付きピペットティップ、ならびにＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００。
【０１５８】
[00185] 操作法：すべての操作をＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９９−２００３）に記載されたものに厳密に従う。５マイクログラムの全ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡ合成に用いる。Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＴＣ−２００または加熱ブロックを、反応およびプローブ変性に際しての温度制御に用いる。ＲＮＡ ＮａｎｏＤｒｏｐチップをＢｉｏＡｎａｌｙｅｒ ２１００と共に用いて品質管理を行なう。イヌ類の遺伝子チップには１００ Ｆｏｒｍａｔ（Ｍｉｄｉ Ａｒｒａｙ）を用いる。
【０１５９】
[00186] 実施例５：ネコにおけるアッセイ操作
[00187] ここに示す試験においては、以下に詳述する方法に従って、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡ試験管を用いてネコから全血を採取し、全血試料からＰＡＸｇｅｎｅ（商標）ＲＮＡ単離キットを用いて全ＲＮＡを単離する。
【０１６０】
[00188] ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）による血液ＲＮＡの単離：以下に示すように、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管およびＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を一緒に用いて、ネコ類から得た全血から細胞内ＲＮＡを単離および精製する（ＰＡＸｇｅｎｅ（商標） Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｊｕｎｅ ２００５も参照）。要約すると、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）注射針を用いて血液をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管内へ直接採集し、次いで遠心、洗浄および精製の工程を数ラウンド行なうと、最終的に高品質のＲＮＡが得られる。次いでこのＲＮＡは品質管理工程を経由し、次いでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム上に特注作製された専売ネコ遺伝子チップを用いて実施するその後の定量リアルタイムＰＣＲおよび／またはマイクロアレイ分析に使用される。
【０１６１】
[00189] アッセイ調製物：アッセイ開始前に、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液を入れたもの）を室温で最低２時間インキュベートする。試験管が凍結されており、凍結前に２時間インキュベートされていない場合、それらを室温にさらに２時間放置して融解させる必要があろう。１回目の遠心前に、各ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管を８〜１０回反転させる。最初に緩衝液ＢＲ４を用いる場合（緩衝液はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキットに含まれる）、４体積の９６〜１００％エタノールを濃縮緩衝液に添加して作業溶液を得る。アッセイ開始前に２つの加熱ブロックを予熱する―６５℃および５５℃。ＤＮａｓｅ Ｉ原液を調製する（ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅ ＳｅｔはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡキットに含まれる）。固体ＤＮａｓｅ Ｉ酵素を、キットに備えられた５５０μＬの無ＲＮａｓｅ水に溶解する。蓋をとる際にＤＮａｓｅ Ｉを失わないことを確認する。試験管を反転させることにより穏やかに混合する。ボルテックスまたは遠心機を使用しない。ＤＮａｓｅ Ｉ酵素と緩衝液ＲＤＤ（キット構成要素）の混合物を調製する（バッチ当たり処理する試料の数に十分な体積）。各試料に７０μＬの緩衝液ＲＤＤおよびｌ０μＬのＤＮａｓｅ Ｉが必要である（すなわち、２０個の試料には１．４ｍＬの緩衝液ＲＤＤと２００μＬのＤＮａｓｅ Ｉとのカクテルが必要であろう）。このカクテルは必要になるまで２〜８℃で保存すべきである。再構成した酵素は２〜８℃で最高６週間は品質良好である。
【０１６２】
[00190] 試料の保存：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管（血液を入れたもの）は、処理前に室温で最高３日間保存できる。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管に備えられた製品挿入説明書によれば、細胞ＲＮＡプロフィールはこれらの条件下で最高３日間安定である。しかし、これは種間で異なる可能性がある。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管は４℃で最高５日間保存することもできる。長期保存が必要な場合、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）試験管を−２０℃または−７０℃で最高６カ月間保存することができる。試験管をゆるいワイヤリックに入れて垂直位置で凍結すべきである。試験管を−７０℃で保存する場合、まず−２０℃で凍結させ、次いで−７０℃へ移ことを推奨する。試験管をフリーザーから取り出す際には、それらを室温（２２℃を超えない温度）で融解すべきである。アッセイを進める前に、各試験管を１０回反転させるべきである。
【０１６３】
[00191] 全血からのＲＮＡの単離：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ試験管を４０００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離して廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。４ｍＬの無ＲＮａｓｅ水をペレットに添加し、新たなＨｅｍｏｇａｒｄクロージャーで蓋をする。ボルテックス撹拌によりペレットを再懸濁し、次いで４０００×ｇで１０分間遠心する。デカントにより上清を分離して廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）の縁に残っている過剰の上清を吸い取る。３６０μＬの緩衝液ＢＲｌ（キット構成要素）をペレットに添加し、ペレットが完全に再懸濁するまで穏やかにピペッティングする。試料を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管へ移し、３００μＬの緩衝液ＢＲ２（キット構成要素）および４０μＬのプロテイナーゼＫを添加する（試料に添加する前に緩衝液ＢＲ２とプロテイナーゼＫを混合してはならない）。各試験管をボルテックス撹拌によって十分に混合し、５５℃に予熱したサーモミキサーに入れる。試験管を１４００ｒｐｍで１０分間、インキュベート／振とうする。細胞溶解物を、２ｍＬの採集管に入れたＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラム内へピペットで装入する。１４，０００ｒｐｍで３分間遠心する。フロースルー画分の上清を無菌１．５ｍＬミクロ遠心管へ移す。３５０μＬの９６〜１００％エタノールを添加し、ピペッティングによって穏やかに混合する。７００μＬの試料を、２ｍＬ採集管に入れたＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、フロースルーおよび古い採集管を廃棄する。残りの体積の試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。
【０１６４】
[00192] 上記のスピンカラムの遠心からの古い採集管およびフロースルーを廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。３５０μＬの緩衝液ＢＲ３（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。フロースルーおよび採集管を廃棄する。カラムを新たな２ｍＬ採集管に入れ、８０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ／緩衝液ＲＤＤカクテル（参照：“アッセイ調製物”）をカラム膜に直接添加し、室温で１５分間インキュベートする。さらに３５０μＬの緩衝液ＢＲ３をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管へ移し、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。
【０１６５】
[00193] ５００μＬの緩衝液ＢＲ４（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを新たな２ｍＬ採集管に入れ、古い採集管およびフロースルーを廃棄する。さらに５００μＬの緩衝液ＢＲ４をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムに添加する。１４，０００ｒｐｍで３分間遠心して、スピンカラム膜を乾燥させる。採集管およびフロースルーを廃棄し、カラムを新たな２ｍＬ採集管に入れる。試料を再び１４，０００ｒｐｍでさらに１分間遠心して、カラム膜をさらに乾燥させる。フロースルーおよび採集管を廃棄する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを１．５ｍＬ溶離管へ移す。４０μＬの緩衝液ＢＲ５（キット構成要素）をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム膜に直接添加する。１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを取り出し、１．５ｍＬ溶離管内の溶出液を同じＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラム上へピペットで移す。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）スピンカラムを同じ溶離管へ戻し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心する。最終溶出液を６５℃で５分間インキュベートし、直ちに氷上で冷却する。最終ＲＮＡ試料を、その後の使用のために−８０℃で保存する。
【０１６６】
実施例６：対照ネコと比較した骨関節炎を伴うネコにおける遺伝子発現
[00194] 実施例５に従って関節炎ではないネコおよび骨関節炎を伴うネコを用いて試験を実施して、関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する。第１試験においては、２グループのネコ間のベースライン比較を行なって、関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定する。組織および体液の試料を調製するために、本明細書中の実施例に全般的に記載した操作法を使用できる。
【０１６７】
[00195] ここに示す試験に関して、骨関節炎を伴うネコにこれまでに公開されている方法に従ってグレードを付ける；すなわち、関節炎ではないすべてのネコを“グレード０”とし、これは関節が正常と思われることを示す；骨関節炎を伴うネコは１（小さな腱（靭帯）増殖体（ｅｎｔｈｅｓｏｐｈｙｔｅ）または小さな骨増殖体（ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ））または２（より顕著な腱（靭帯）増殖体または骨増殖体）のいずれかのグレードをもつ。重篤な骨関節炎（グレード３）をもつネコはこの試験には含まれない。
【０１６８】
[00196] 専売の特注ネコ遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、骨関節炎を伴うネコおよび伴わないネコ（正常な動物１０匹、関節炎の動物１０匹）においてベースライン遺伝子発現を評価する。前記に示したように、２グループ間のベースライン比較を行なって関節炎ではないネコと骨関節炎を伴うネコの間の基礎遺伝子発現差を判定するために、常法を用い、製造業者の指示に従って、遺伝子チップ分析を実施する。
【０１６９】
[00197] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ Ａｖｅｒａｇｅ）（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。ＯＡバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７０】
[00198] 関節炎の動物および関節炎ではない動物において遺伝子発現プロファイリングを決定し、図３および１５に報告する。関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレギュレートされることが見いだされた遺伝子は下記のものである：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子生成物は炎症プロセスに関連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとみなされるであろう。さらに、下記の遺伝子が関節炎のネコにおいて１倍より大きくアップレギュレートされることが見いだされた：ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１およびアグリカン。これらの遺伝子およびそれらの遺伝子生成物は軟骨分解に関連し、異常な筋骨格障害、特に骨関節炎のマーカーとして役立つであろう。
【０１７１】
[00199] 実施例６に従って実施した試験の結果は、遺伝子発現を利用して正常なネコと骨関節炎を伴うネコを識別できることを指摘する。関節炎のネコにおいて炎症に関連して差次発現する遺伝子を図３および１５に示す。したがって、これらの同定した遺伝子はネコにおいて本明細書に記載する発明のためのバイオマーカーとして使用でき、下記の遺伝子を含む：ＩＬ−ｌベータ、ＴＮＦ、ＨＭＧＢｌ、ｐ３８、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１およびアグリカン。
【０１７２】
[00200] 実施例７：ネコ用食物組成物ｊ／ｄ投与後の関節炎のネコの平均活動度
[00201] 実施例６に記載した関節炎のネコおよび関節炎ではないネコに関する栄養試験から得られた臨床データは、食事介入が関節炎のネコに影響を及ぼし、その運動性を向上させることをを指摘する。本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたネコは、対照食を与えたネコを上回る統計的に有意の活動度向上を証明した。臨床試験の結果を図１６に報告する。観察データに基づけば、本発明のネコ用食物組成物ｊ／ｄを与えたネコは、３０％を超える運動性向上を示した；これは、本発明の被験食の投与により、基礎疾患である骨関節炎の総体的症状の改善が達成されたことを証明する。図１６に示したデータから、当業者は、被験食である食物組成物ｊ／ｄの投与の結果として、ネコがより大きい運動性をもち、痛みおよび炎症がより少ないことを推測できる。
【０１７３】
[00202] 実施例８：組成物ｊ／ｄ投与後のイヌの夜間活動度
[00203] 本発明のイヌ用食物組成物ｊ／ｄの投与を伴う臨床試験をイヌにおいて実施した。食物組成物ｊ／ｄを与えた関節炎のイヌの夜間活動の観察を実施し、対照食を与えたイヌおよび投薬を受けなかったイヌと対比して記録した。測定はＡＣＴＩＷＡＴＣＨ（登録商標）装置で行なわれた。これらの装置は、肉眼的運動活動度のディジタル積分測定値を記録するアクチグラフィー（ａｃｔｉｇｒａｐｈｙ）ベースのデータロガー（ｄａｔａ ｌｏｇｇｅｒ）である。各装置はアクチグラフィー原理を用いて、睡眠スケジュール変動度、睡眠の量および質の統計値、ならびに昼間活動パターンを提供する。これらの装置は、動物の移動環境に関する客観的データを収集する。この臨床試験の結果により関節炎のイヌの夜間活動度の有意の低下が証明され、これにより、食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌは、関節の硬直および痛みを含めた基礎関節炎の総体的症状のより大幅な軽減および慰安を受けたことが証明される。この臨床試験からのデータを図１７に報告する。
【０１７４】
[00204] 実施例９：イヌ用食物組成物ｊ／ｄを与えた後のイヌにおけるタンパク質マーカーレベル
[00205] 関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌにおいて、イヌの軟骨分解に関連する２種類のタンパク質マーカーＣ２ＣおよびＣ１，Ｃ２のベースラインレベルを求めた。動物の血液試料を採取し、本明細書に記載する常法により検査した。この検査結果により、これらのマーカーの遺伝子生成物は関節炎のイヌにおいて増加し、遺伝子発現に対する食事成分の有効性を判定するためのマーカーとして使用できることが証明された。ベースラインデータを図５および６に示す。
【０１７５】
[00206] 関節炎のイヌおよび関節炎ではないイヌに関する栄養試験から臨床データを求めた。この実施例に記載する被験イヌに、図４の食物組成物として同定される本発明の食事を与えた。Ｃ２ＣおよびＣ１，Ｃ２関節炎マーカーのレベル、ならびに異常な筋骨格関節障害に関係することが知られている他のタンパク質マーカー、すなわち、コラーゲンＣＴＸ−ＩＩのレベルの評価を行なった。図１０、１１および１２に示すデータは、被験動物および対照動物の血液において測定したタンパク質マーカーレベルを表わす。図４に示すイヌ用食物組成物ｊ／ｄの食事を与えたイヌは、図１０、１１および１２に示すように統計的に有意の血漿Ｃ２Ｃ、Ｃ１，Ｃ２およびＣＴＸ−ＩＩレベル低下を証明した。このバイオマーカーデータが、本発明の食事組成物、特にこの実施例に示した食物組成物ｊ／ｄを与えたイヌが基礎疾患プロセス（この場合は骨関節炎）の総体的臨床症状の改善を示すという臨床所見を支持することは、当業者に認識されるであろう；これは、骨関節炎を含めた軟骨分解および局所関節炎症状態に関連する特定の遺伝子のダウンレギュレーションおよび特定の遺伝子生成物の発現低下と相関する。
【０１７６】
[00207] 実施例１０：関節炎のイヌ類および関節炎ではないイヌ類においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝子の遺伝子チップ分析
[00208] 市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、当技術分野で知られている標準臨床診断基準に従って判定された関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、ベースライン遺伝子発現を評価した。遺伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施し、２グループ間のベースライン比較を求めて、関節炎ではないイヌ類とイヌ類との基礎遺伝子発現差を判定した。
【０１７７】
[00209] 当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１７８】
[00210] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。関節炎バイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１７９】
[00211] 生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。ＯＡバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８０】
[00212] これらの試験の結果により、遺伝子発現を利用して正常なイヌと関節炎を伴うイヌを識別できることが指摘される。関節炎のイヌにおける炎症に関連する差次発現遺伝子を、図１、２、７および８に示す。本明細書に述べる開示内容の一般原理を限定するものではなく、図１、２、７および８に示す遺伝子は本明細書に記載する発明のバイオマーカーとして使用でき、これにはアネキシンＡｌ、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１５、１Ｌ−１７受容体、ＴＬＲ４、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬｌＡｌ、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ−１３、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−２、ＦＬＡＰ、ＰＬＡ２、ＭＡＰＫｌ、ＭＡＰＫ２が含まれる。
【０１８１】
[00213] 実施例１１：食物組成物ｊ／ｄの食事を与えた関節炎のイヌ類および関節炎ではないイヌ類においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるイヌ類遺伝子の遺伝子チップ分析
[00214] 市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、骨関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌの２グループにおいて、遺伝子発現を評価した。合計３０匹の関節炎のイヌおよび３１匹の関節炎ではないイヌを試験した。遺伝子チップ分析は、常法を用い、製造業者の指示に従って実施された。実施例１の一般的なプロファイリング法および本明細書に述べる他の実施例に概説した分析技術を用いて遺伝子発現プロファイリングを実施した。第１グループ３０匹の被験動物は、当技術分野で周知の臨床診断法に従って関節炎と判定された。第２グループのイヌ類は、同じ臨床診断基準に従って関節炎ではないとみなされた。当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される食物組成物を含む被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８２】
[00215] 当業者に慣用される標準的な動物栄養試験法に従って、関節炎のイヌおよび正常なイヌに、ｊ／ｄと表記される被験食を与え、次いでｑＲＴ−ＰＣＲを用いて動物の遺伝子発現の変化を分析した。
【０１８３】
[00216] ｑＲＴ−ＰＣＲに関して、Ｔａｑｍａｎプローブ技術を用い、すべての分析をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲ機器により実施する。製造業者が提供する配列検出ソフトウェアパッケージ、バージョン１．２．２．を用いてデータを分析する。
【０１８４】
[00217] 前記の実施例の記載に従って調製した組織試料を用い、市販のイヌ類遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ２）を用いて、関節炎を伴うイヌおよび伴わないイヌにおいて遺伝子発現を評価した。生の遺伝子チップデータを、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）基準化アルゴリズム(Irizarry, et al., Biostatistics 2003 Vol 4, Page 249-264)を用いて基準化し、次いでサポートベクターマシーン（ＳＶＭ）アルゴリズム（Ｐａｒｔｅｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｕｉｔｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ６）を用いる統計分析を行なって、関節炎の動物と関節炎ではない動物を識別できる遺伝子発現差を判定する。関節炎および炎症のバイオマーカーとして同定される遺伝子を、ｐ値カットオフおよび変化倍率（ＦＣ）に基づいて選択する。
【０１８５】
[00218] この実施例からのデータを表３に示す。それらのデータは、変化倍率カットオフ１．１、ｐ値カットオフ０．０５、およびＱ値カットオフ０．３を採用した場合の２３８３の記録を含む。これらの分析基準を用いると、１を超える変化倍率は、関節炎のイヌグループから採取した試料においてそれらのプローブがアップレギュレートされていることの指標となる。表３に示すデータは、第１カラムにユニークＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ識別番号、以下それぞれｐ値、ｑ値、変化倍率、１／変化倍率の値、Ｔｏｐ ＢＬＡＳＴ注釈、一致率パーセント、ヒト寄託番号、トップヒット寄託番号、遺伝子記号、および遺伝子の説明を記載する。当業者はこのデータから、通常の実験分析のみを用いて下記の情報を演繹するであろう：変化倍率カットオフ基準、アップまたはダウンレギュレートされた目的遺伝子、およびＢＬＡＳＴ注釈によるそのような遺伝子の同定、関係するヒト寄託番号、および同定されたそのような各遺伝子の配列、ならびに対応する遺伝子生成物、およびそのような遺伝子生成物の配列；これらは、製造業者から入手できる情報、および当業者が容易に入手できる遺伝子配列データベースから入手できる情報に基づく。さらに、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイに用いられたユニークプローブに関する配列は、製造業者の公開情報源を参照することにより一般に入手できる。同様に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップのバージョン１および２に用いられた各プローブの公開された配列情報および同定は、製造業者から、およびプローブセット相互の比較により、容易かつ一般に入手できる。本発明の組成物および製品の製造および使用を実施する際に、ならびに本明細書に教示される発明の製造方法および使用方法を実施する際に、当業者はそのような遺伝子発現データ、同定した調節異常な遺伝子、およびそれらに対応する遺伝子生成物を、このデータから同定して利用することができる。本明細書および特許請求の範囲に開示した本発明の範囲を限定することなく、特定の当該遺伝子および遺伝子生成物がイヌおよびネコの関節炎状態に高度に関係すると同定することができる。表３に述べたデータ中に教示されるこれらおよび他の遺伝子および遺伝子生成物は、表３に述べた当該遺伝子を調節する本発明組成物、特にｊ／ｄと表記する食物組成物を動物に与えた場合、イヌおよびネコが罹患する、基礎疾患である異常な筋骨格関節障害、特に関節炎状態に対して有益な作用をもつと推測することができる。
【０１８６】
【表１】
【０１８７】
【表２−１】
【０１８８】
【表２−２】
【０１８９】
【表２−３】
【０１９０】
【表２−４】
【０１９１】
【表２−５】
【０１９２】
【表２−６】
【０１９３】
【表２−７】
【０１９４】
【表２−８】
【０１９５】
【表２−９】
【０１９６】
【表２−１０】
【０１９７】
【表２−１１】
【０１９８】
【表２−１２】
【０１９９】
【表２−１３】
【０２００】
【表２−１４】
【０２０１】
【表２−１５】
【０２０２】
【表２−１６】
【０２０３】
【表２−１７】
【０２０４】
【表２−１８】
【０２０５】
【表２−１９】
【０２０６】
【表２−２０】
【０２０７】
【表２−２１】
【０２０８】
【表２−２２】
【０２０９】
【表２−２３】
【０２１０】
【表２−２４】
【０２１１】
【表２−２５】
【０２１２】
【表２−２６】
【０２１３】
【表２−２７】
【０２１４】
【表２−２８】
【０２１５】
【表２−２９】
【０２１６】
【表２−３０】
【０２１７】
【表２−３１】
【０２１８】
【表２−３２】
【０２１９】
【表２−３３】
【０２２０】
【表２−３４】
【０２２１】
【表２−３５】
【０２２２】
【表２−３６】
【０２２３】
【表２−３７】
【０２２４】
【表２−３８】
【０２２５】
【表３−１】
【０２２６】
【表３−２】
【０２２７】
【表３−３】
【０２２８】
【表３−４】
【０２２９】
【表３−５】
【０２３０】
【表３−６】
【０２３１】
【表３−７】
【０２３２】
【表３−８】
【０２３３】
【表３−９】
【０２３４】
【表３−１０】
【０２３５】
【表３−１１】
【０２３６】
【表３−１２】
【０２３７】
【表３−１３】
【０２３８】
【表３−１４】
【０２３９】
【表３−１５】
【０２４０】
【表３−１６】
【０２４１】
【表３−１７】
【０２４２】
【表３−１８】
【０２４３】
【表３−１９】
【０２４４】
【表３−２０】
【０２４５】
【表３−２１】
【０２４６】
【表３−２２】
【０２４７】
【表３−２３】
【０２４８】
【表３−２４】
【０２４９】
【表３−２５】
【０２５０】
【表３−２６】
【０２５１】
【表３−２７】
【０２５２】
【表３−２８】
【０２５３】
【表３−２９】
【０２５４】
【表３−３０】
【０２５５】
【表３−３１】
【０２５６】
【表３−３２】
【０２５７】
【表３−３３】
【０２５８】
【表３−３４】
【０２５９】
【表３−３５】
【０２６０】
【表３−３６】
【０２６１】
【表３−３７】
【０２６２】
【表３−３８】
【０２６３】
【表３−３９】
【０２６４】
【表３−４０】
【０２６５】
【表３−４１】
【０２６６】
【表３−４２】
【０２６７】
【表３−４３】
【０２６８】
【表３−４４】
【０２６９】
【表３−４５】
【０２７０】
【表３−４６】
【０２７１】
【表３−４７】
【０２７２】
【表３−４８】
【０２７３】
【表３−４９】
【０２７４】
【表３−５０】
【０２７５】
【表３−５１】
【０２７６】
【表３−５２】
【０２７７】
【表３−５３】
【０２７８】
【表３−５４】
【０２７９】
【表３−５５】
【０２８０】
【表３−５６】
【０２８１】
【表３−５７】
【０２８２】
【表３−５８】
【０２８３】
【表３−５９】
【０２８４】
【表３−６０】
【０２８５】
【表３−６１】
【０２８６】
【表３−６２】
【０２８７】
【表３−６３】
【０２８８】
【表３−６４】
【０２８９】
【表３−６５】
【０２９０】
【表３−６６】
【０２９１】
【表３−６７】
【０２９２】
【表３−６８】
【０２９３】
【表３−６９】
【０２９４】
【表３−７０】
【０２９５】
【表３−７１】
【０２９６】
【表３−７２】
【０２９７】
【表３−７３】
【０２９８】
【表３−７４】
【０２９９】
【表３−７５】
【０３００】
【表３−７６】
【０３０１】
【表３−７７】
【０３０２】
【表３−７８】
【０３０３】
【表３−７９】
【０３０４】
【表３−８０】
【０３０５】
【表３−８１】
【０３０６】
【表３−８２】
【０３０７】
【表３−８３】
【０３０８】
【表３−８４】
【０３０９】
【表３−８５】
【０３１０】
【表３−８６】
【０３１１】
【表３−８７】
【０３１２】
【表３−８８】
【０３１３】
【表３−８９】
【０３１４】
【表３−９０】
【０３１５】
【表３−９１】
【０３１６】
【表３−９２】
【０３１７】
【表３−９３】
【０３１８】
【表３−９４】
【０３１９】
【表３−９５】
【０３２０】
【表３−９６】
【０３２１】
【表３−９７】
【０３２２】
【表３−９８】
【０３２３】
【表３−９９】
【０３２４】
【表３−１００】
【０３２５】
【表３−１０１】
【０３２６】
【表３−１０２】
【０３２７】
【表３−１０３】
【０３２８】
【表３−１０４】
【０３２９】
【表３−１０５】
【０３３０】
【表３−１０６】
【０３３１】
【表３−１０７】
【０３３２】
【表３−１０８】
【０３３３】
【表３−１０９】
【０３３４】
【表３−１１０】
【０３３５】
【表３−１１１】
【０３３６】
【表３−１１２】
【０３３７】
【表３−１１３】
【０３３８】
【表３−１１４】
【０３３９】
【表３−１１５】
【０３４０】
【表３−１１６】
【０３４１】
【表３−１１７】
【０３４２】
【表３−１１８】
【０３４３】
【表３−１１９】
【０３４４】
【表３−１２０】
【０３４５】
【表３−１２１】
【０３４６】
【表３−１２２】
【０３４７】
【表３−１２３】
【０３４８】
【表３−１２４】
【０３４９】
【表３−１２５】
【０３５０】
【表３−１２６】
【０３５１】
【表３−１２７】
【０３５２】
【表３−１２８】
【０３５３】
【表３−１２９】
【０３５４】
【表３−１３０】
【０３５５】
【表３−１３１】
【０３５６】
【表３−１３２】
【０３５７】
【表３−１３３】
【０３５８】
【表３−１３４】
【０３５９】
【表３−１３５】
【０３６０】
【表３−１３６】
【０３６１】
【表３−１３７】
【０３６２】
【表３−１３８】
【０３６３】
【表３−１３９】
【０３６４】
【表３−１４０】
【０３６５】
【表３−１４１】
【０３６６】
【表３−１４２】
【０３６７】
【表３−１４３】
【０３６８】
【表３−１４４】
【０３６９】
【表３−１４５】
【０３７０】
【表３−１４６】
【０３７１】
【表３−１４７】
【０３７２】
【表３−１４８】
【０３７３】
【表３−１４９】
【０３７４】
【表３−１５０】
【０３７５】
【表３−１５１】
【０３７６】
【表３−１５２】
【０３７７】
【表３−１５３】
【０３７８】
【表３−１５４】
【０３７９】
【表３−１５５】
【０３８０】
【表３−１５６】
【０３８１】
【表３−１５７】
【０３８２】
【表３−１５８】
【０３８３】
【表３−１５９】
【０３８４】
【表３−１６０】
【０３８５】
【表３−１６１】
【０３８６】
【表３−１６２】
【０３８７】
【表３−１６３】
【０３８８】
【表３−１６４】
【０３８９】
【表３−１６５】
【０３９０】
【表３−１６６】
【０３９１】
【表３−１６７】
【０３９２】
【表３−１６８】
【０３９３】
【表３−１６９】
【０３９４】
【表３−１７０】
【０３９５】
【表３−１７１】
【０３９６】
【表３−１７２】
【０３９７】
【表３−１７３】
【０３９８】
【表３−１７４】
【０３９９】
【表３−１７５】
【０４００】
【表３−１７６】
【０４０１】
【表３−１７７】
【０４０２】
【表３−１７８】
【０４０３】
【表３−１７９】
【０４０４】
【表３−１８０】
【０４０５】
【表３−１８１】
【０４０６】
【表３−１８２】
【０４０７】
【表３−１８３】
【０４０８】
【表３−１８４】
【０４０９】
【表３−１８５】
【０４１０】
【表３−１８６】
【０４１１】
【表３−１８７】
【０４１２】
【表３−１８８】
【０４１３】
【表３−１８９】
【０４１４】
【表３−１９０】
【０４１５】
【表３−１９１】
【０４１６】
【表３−１９２】
【０４１７】
【表３−１９３】
【０４１８】
【表３−１９４】
【０４１９】
【表３−１９５】
【０４２０】
【表３−１９６】
【０４２１】
【表３−１９７】
【０４２２】
【表３−１９８】
【０４２３】
【表３−１９９】
【０４２４】
【表３−２００】
【０４２５】
【表３−２０１】
【０４２６】
【表３−２０２】
【０４２７】
【表３−２０３】
【０４２８】
【表３−２０４】
【０４２９】
【表３−２０５】
【０４３０】
【表３−２０６】
【０４３１】
【表３−２０７】
【０４３２】
【表３−２０８】
【０４３３】
【表３−２０９】
【０４３４】
【表３−２１０】
【０４３５】
【表３−２１１】
【０４３６】
【表３−２１２】
【０４３７】
【表３−２１３】
【０４３８】
【表３−２１４】
【０４３９】
【表３−２１５】
【０４４０】
【表３−２１６】
【０４４１】
【表３−２１７】
【０４４２】
【表３−２１８】
【０４４３】
【表３−２１９】
【０４４４】
【表３−２２０】
【０４４５】
【表３−２２１】
【０４４６】
【表３−２２２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む組成物：
ａ）少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、
ｂ）少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、
ｃ）少なくとも１種類のアミノ糖、
ｄ）少なくとも１種類の抗酸化剤、および
ｅ）カルニチンまたはアセチルカルニチン。
【請求項２】
オメガ−３脂肪酸が、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アミノ糖が、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗酸化剤が、ビタミンＣ、トコフェロール類、トコトリエノール類、グルタチオン、リポ酸、メラトニンおよびベータ−カロテンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
さらに、少なくとも１種類の食物無機質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
食物無機質が、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、少なくとも１種類の必須アミノ酸を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象において異常な関節状態を処置する方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１０】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象において異常な関節状態の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象において対象が異常な関節状態に罹患するリスクを低下させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において１種類以上の遺伝子の発現を変化させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含み、１種類以上の遺伝子がアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される方法。
【請求項１】
下記のものを含む組成物：
ａ）少なくとも１種類のオメガ−３脂肪酸、
ｂ）少なくとも１種類のグリコサミノグリカン、
ｃ）少なくとも１種類のアミノ糖、
ｄ）少なくとも１種類の抗酸化剤、および
ｅ）カルニチンまたはアセチルカルニチン。
【請求項２】
オメガ−３脂肪酸が、アルファ−リノール酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
グリコサミノグリカンが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびヒアルロナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アミノ糖が、ガラクトサミン、グルコサミン、シアル酸およびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗酸化剤が、ビタミンＣ、トコフェロール類、トコトリエノール類、グルタチオン、リポ酸、メラトニンおよびベータ−カロテンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
さらに、少なくとも１種類の食物無機質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
食物無機質が、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、セレン、硫黄、亜鉛およびバナジウムからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
さらに、少なくとも１種類の必須アミノ酸を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
対象において異常な関節状態を処置する方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１０】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象において異常な関節状態の発症を遅延させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象において対象が異常な関節状態に罹患するリスクを低下させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
異常な関節状態が、骨関節炎、リウマチ性関節炎、および局所関節炎症である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象において１種類以上の遺伝子の発現を変化させる方法であって、その必要がある対象に請求項１に記載のいずれかの組成物を投与することを含み、１種類以上の遺伝子がアネキシンＡ１、カテプシンＤ、カテプシンＦ、カテプシンＳ、ＲＥＬＡ、ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−４、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＩＬ−１５およびＩＬ−１７受容体からなる群から選択される方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１１−５２８６６８（Ｐ２０１１−５２８６６８Ａ）
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１８９６０（Ｐ２０１１−５１８９６０）
【出願日】平成２１年７月２０日（２００９．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１１６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００９４７４
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０２３２９２２３）ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド (138)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２０日（２００９．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１１６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００９４７４
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０２３２９２２３）ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド (138)
【Ｆターム（参考）】
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