高分子ミセルクラスタ及びそれらの薬剤への使用
両親媒性炭水化物ポリマ（amphiphilic carbohydrate polymers）から生成した高分子ミセルクラスタ及び薬剤におけるそれらの使用であって、特に、両親媒性炭水化物重合体は、ミセルクラスタを形成するように自己集合可能で、すなわち、炭水化物の両親媒性凝集体が個別凝集体の組織化ミセルクラスタに階層的に凝集することを発見。薬物、特に、水溶解度が低い疎水性薬物によってミセルクラスタを安定ナノ粒子に転換可能で、生物学的障壁を超えて、疎水性薬物の転換を改善できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性炭水化物重合体（amphiphilic carbohydrate polymers）から形成される高分子ミセルクラスタと、それらの薬剤への使用、特に、溶解性の低い薬剤への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１個の分子において極性セグメントと無極性セグメント双方を組み合わせると、環境浄化活動から食品の加工まで、非混和液を多様なプロセスに活用できるようになる。医薬品産業では、賦形剤として認可された両親媒性化合物が利用できるにもかかわらず（文献３）、水と混ざらない薬剤の調製でしばしば不具合（文献１，２）が生じている。しかし、水溶解度の低い薬剤、すなわち、疎水性薬物から十分な生体利用効率を確保するのは医薬品の開発にとって、極めて重要である。英国薬局方によれば、水溶解度の低い薬剤は、"ごく僅かな溶解性"として定義され、こうした薬剤は、１ミリリットルの溶剤につき１mg未満の水溶解度を有する（英国医薬品委員会、英国薬局方、定置省：Medicines Commission, British Pharmacopoeia, The Stationary Office、ロンドン、２００２年）。
【０００３】
従来、ブロック共重合体を添加することで、疎水性薬物の生体利用効率を改善してきた（文献１４−１８）。ブロック共重合体とグラフト高分子両親媒性物質は、両方とも、高分子ミセル（文献５，２２）、小胞（文献２３，２４）、及び濃厚非晶質ナノ粒子（文献２２，２５，２６）に自己集合することが知られている。ブロック共重合体ミセルは、好都合に、直径が１２−３６ｎｍの単一ミセル成分である（文献２９，３０）。
【０００４】
水媒体において薬物の溶解度を高めるのにミセル相を利用してきた。相分離モデルによれば、ミセルコアを溶解する薬物の安定性は、その臨界ミセル濃度関数（CMC、式１）、すなわち、ミセル凝集体の形成が始まる濃度である。
△Ｇ０micelle＝ＲＴｌｎＸｃｍｃ １
式中、△Ｇ０micelleは、ミセル形成の標準自由エネルギーであり、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度であり、Ｘｃｍｃはモル分数単位の臨界ミセル濃度である。従って、臨界ミセル濃度が低いほど、ミセル形成に有利である。
【０００５】
医薬的に認可された低分子量界面活性剤（文献４）とブロック共重合体（文献５−７）は、典型的に、ｍＭ濃度域にあるＣＭＣ値を有し、モル両親媒性物質／薬物の割合は、典型的に、１０：１を超え、しばしば、１０００：１を超えるため、疎水性薬物のデリバリには非効率的である（文献４、８−１０）。ミセルを溶解する固定モルにおけるミセルコア内の薬物の可溶度は、溶解物質（solubilisate）のlog ｐ（文献１１）、溶解物質のモル体積（文献１１）および会合コロイドによって形成される疎水性ナノドメインの相対的なサイズによって決まる（文献１２，１３）。log P／モル体積の割合が高いと、ミセルへの分割を促進し、ミセル内の疎水性体積が大きいと、ミセル内の薬物の不溶化を促進する。
【０００６】
より多くの粒子生成のために、個別モノマーの集合体の数を増やすことで粒子の疎水性体積を増加させるのは、従って、コロイド凝集体の内部で溶解可能な薬物のレベルを上昇させる可能性がある。しかし、過度の凝集は分子と薬物を形成するコロイドの沈殿を生じさせるため、注意が必要である。
【０００７】
先の出願で、炭水化物重合体の可溶化を開示し、これを用いて可溶性炭水化物重合体が存在する水相に添加する疎水性薬物を生成できることを示した（WO2004/026912）。この出願に記載した両親媒性重合体の例では、パルミトイル基のモルの割合は３．０％と８．２％の間で、第四アンモニウム基のモルの割合は７．９％と１９．０％の間であった。
【０００８】
しかし、当該分野では、投与の改善を目指した薬物調製の手法について、特に、疎水性薬物の生体利用効率の増加に関して、さらなる継続的な需要がある。
【発明の概要】
【０００９】
広い意味で、本発明は、両親媒性炭水化物重合体が、自己集合してミセルクラスタを形成することができ、そこでは、炭水化物両親媒性物質(carbohydrate amphiphiles)が、階層的に組織化したミセルクラスタに凝集しているという予期しない発見に基づいている。個別のミセル集合体で形成したこれらのミセルクラスタを、WO2004/026912に記載された重合体および条件を使って生成した個別ミセルと対比させても構わない。本発明は、薬物、特に、水溶解度が低い疎水性薬物によって、これらのミセルクラスタを安定ナノ粒子に転換できることを示す。好ましい実施態様では、これが、プルロニック・ブロック共重合体（pluronic block copolymers）を使用する従来技術で得られる比率よりも、重合体／薬物のモル比を高めることに貢献する。さらに、本発明は、ミセルクラスタから形成した薬剤の生物学的障壁を越える移動が、１０進法で一桁（an order of magnitude）改善できることを明らかにする。
【００１０】
従って、本発明の第１の実施態様によれば、平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍである両親媒性炭水化物重合体から形成される高分子ミセル凝集体が提供され、当該両親媒性炭水化物重合体は、複数個の結合モノマーユニットを含む誘導体化キトサンであり、（i）前記モノマーユニットの第１部分であるアミノ基は、疎水基で誘導体化され、（ii）前記モノマーユニットの第２部分であるアミノ基は、−Ｎ+Ｒ1Ｒ２Ｒ３（ここで、各Ｒは、水素又は以下に記載する官能基である）で示されるような第四アンモニウム基を所有する基を提供するように誘導体化されている。前記の誘導体化キトサン重合体が、モノマーユニットの第３部分を含むことは随意であって、その場合、アミンは、第１部分又は第２部分とは異なる手法で誘導体化されるか、或いは誘導体化されない。付加的に又は二者択一的に、モノマーユニットの第１部分及び／又は第２部分及び／又は第３部分のＣ６原子に存在する−ＣＨ２−ＯＨ基は、例えば、キトサンモノマーユニットのヒドロキシル基の一つ又はそれ以上と反応させて、エーテルのような酸素結合基を形成させることで誘導体化させることもできる。
【００１１】
より具体的には、本発明は、以下の一般式で表される両親媒性炭水化物重合体から形成される平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍの高分子ミセル凝集体を提供する。
式中、ａ＋ｂ＋ｃ＝１．０００であり、ａは０．０１０から０．９９０の値、ｂは０．０００から０．９８０の値、ｃは０．０１０から０．９９０の値であって、置換基Ｒ１からＲ７とＸは、以下に定義する。
【００１２】
上記の一般式において、ａ、ｂ及びｃのユニットは、任意の順番に配置されて差し支えなく、また、特定の順番あるいはランダムな順番に配置されて差し支えない。式中の＊マークは、連続重合鎖を示す。好ましい実施態様では、本発明が採用する誘導体化炭水化物重合体は、従来技術が開示するポリマに比べて、疎水基の割合が高い。本発明の実施例において、ｃユニットのモル比は０．１００より大きく、好ましくは０．１１０より大きく、より好ましくは０．１２０より大きく、さらに好ましくは、少なくとも０．１５０で、より好ましくは少なくとも０．１８０で、さらに好ましくは、少なくとも０．２００で、別の実施例では少なくとも０．２５０である。
一般的に、ｃユニット(単位)のモル比は、０．４００以下で、より好ましくは０．３５０以下である。
【００１３】
ａユニット(単位)のモル比は、好ましくは０．０５０と０．８００の間にあり、より好ましくは、０．１００と０．４００の間にある。
【００１４】
ｂユニットのモル比は、好ましくは０．２００と０．８５０の間にあり、より好ましくは、０．２００と０．７５０の間にある。
【００１５】
上記の式から明らかなように、ｂ単位は任意に欠落させることができる。ｃ単位は疎水基で誘導体化させるモノマーユニット(単位)の第１部分を提供し、ａ単位は第四アンモニウム基で誘導体化させるモノマー単位の第２部分を提供する。ｂ単位が存在する場合、ｂ単位はモノマー単位の第３部分を提供し、そこでのアミノ基は第１部分又は第２部分とは違う方法で誘導体化させるか、さもなければ誘導体化されない。
【００１６】
本発明において、疎水基Ｘは、好ましくは、Ｃ４−３０アルキル基のようなアルキル基、Ｃ４−３０アルケニル基などのアルケニル基、Ｃ４−３０アルキニル基ようなのアルキニル基、Ｃ５−２０アリール基のようなアリール基、ステロール（例えばコレステロール）のような２個以上のＣ４−８リング構造を持つ多環疎水基、２個以上のＣ４−８ヘテロ原子リング構造を持つ多環疎水基、ポリオクサブチレン重合体（polyoxa butylene polymer）のようなポリオクサＣ１−４アルキレン基、又は、ポリ（乳酸）基、ポリ（ラクチド・コ・グリコリド）（poly(lactide‐co‐glycolide）基あるいはポリ（グリコール酸）基のような疎水性ポリマ基又はこれらの置換基から選択される。置換基Ｘは、直鎖状でも、分岐状でも、環状でも構わない。置換基Ｘは、ｃ単位（すなわち、Ｃ３で）に直接結合することができ、また、アミン基、アシル基、又はアミド基のような官能基を介してｃ単位と結合し、Ｘ'−環、Ｘ'−ＣＯ−環、Ｘ'−ＣＯＮＨ−環などで表せる連鎖を形成する。ここで、Ｘ'は上に示す疎水基である。
【００１７】
置換基Ｘの好ましい具体例には、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯ−ＮＨ、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ−あるいはＣＨ３(ＣＨ２)ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ２)ｑ−ＣＯ−ＮＨ−などが包含される。ここで、ｎは４と３０の間の数、より好ましくは、６と２０の間の数であり、ｐとｑは同じでも違っていても構わず、３と１５の間の数、より好ましくは、５と１０の間の数である。置換基Ｘの特に好ましい一群は、例えば、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯ−ＮＨ−で表せるアミド基を介してキトサン・モノマー単位と結合する。ここで、ｎは４と３０の間の数である。アミド基の具体例は、カルボン酸をキトサンのアミン基と結合させて生成される。好ましい具体例は、ラウリン酸（n＝１０）、ミリスチン酸（n＝１２）、パルミチン酸（n＝１４）、ステアリン酸（n＝１６）又はアラキジン酸（n＝１８）などに基づく脂肪酸誘導体である。
【００１８】
上記の式において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、好ましくは個別に、水素又はＣ１−１０アルキル基から選択され、そのアルキル基は置換されていて構わない。Ｒ１、Ｒ２及び／又はＲ３がアルキル基の場合、これらは直鎖状でも分岐鎖状でもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、個別に、水素、メチル基、エチル基又はプロピル基から選ばれる。
【００１９】
上記の式において、糖ユニットのＣ６に存在するＲ４、Ｒ５及びＲ６は、個別に、水素、置換の又は非置換のアルキル基、置換の又は非置換のエーテル基、もしくは置換の又は非置換のアルケン基から選択される。好ましいＲ４、Ｒ５及びＲ６は、１個又はそれ以上のヒドロキシ基もしくは別の非イオン性親水基で置換されている。Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の具体例は、−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ（ｐは１と１０の間の数、より好ましくは、２と４の間の数）、−(ＣＨ２)ｐ−ＣＨｑ(ＣＨ２−ＯＨ)r（ｐは１と１０の間の数、ｑは０と３の間の数、ｒは１と３の間の数、ｑ＋ｒ＝３）、−(ＣＨ２)ｐ−Ｃ(ＣＨ２−ＯＨ)ｒ（ｐは１と１０の間の数、ｒ＝３）、−(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)ｐ（ｐは１と３００の間の数）である。
【００２０】
上記一般式において、置換基Ｒ７は存在しても不在でも構わない。不在の場合、第四アンモニウム官能基がモノマー単位のキトサン環と直かに結合する。Ｒ７が存在する場合、このものは、非置換の又は置換されたアルキル基（例えば、Ｃ１−１０アルキル基）、−ＮＨ−(ＣＨ２)ｎ−で表示されるようなアミン基、−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−で表示されるようなアミド基のいずれかである。ここで、ｎは１から１０、好ましくは、１から４の数である。置換基Ｒ７−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３の好ましい具体例は、例えば、ベタイン(−ＯＯＣ−ＣＨ2−Ｎ＋(ＣＨ3)3をアミン置換基と結合させること得ることができ、これによりベタイン内に−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３のようなアミド基を形成することができる。
【００２１】
上述したように、本明細書に記載した置換基のいくつかは、当業者にとって周知の１個又はそれ以上の付加的置換基で置換されてよく、置換されなくてもよい。そうした付加的置換基には、一般イ、ハロ基；ヒドロキシ基；エーテル基（例えば、Ｃ１−７アルコシキル基）；ホルミル基；アシル基（例えば、Ｃ１−７アルキルアシル基、Ｃ５−２０アリールアシル基）；ハロゲン化アシル基；カルボキシ基；エステル基；アシルオキシ基；アミド基；アシルアミド基；チオアミド基；テトラゾリル基；アミノ基；ニトロ基；ニトロソ基；アジド基；シアノ基；イソシアン基；シアナト基；イソシアナト基；チオシアナト基；イソチオシアナト基；スルフヒドリル基；チオエーテル基（例えば、Ｃ１−７アルキルチオ基）；スルホン酸(sulfonic acid)；スルホン酸エステル；スルホン基；スルホニルオキシ(sulfonyloxy)基；スルフィニルオキシ(sulfinyloxy)基；スルフアミノ(sulfamino)基；スルホンアミノ(sulfonamino)基；スルフィンアミノ(sulfinamino)基；スルファミル(sulfamyl)基；スルホナミド(sulfonamido)基；Ｃ１−７アルキル基（例えば、非置換のＣ１−７アルキル基、Ｃ１−７ハロアルキル基、Ｃ１−７ヒドロキシルアルキル基、Ｃ１−７カルボキシルアルキル基、Ｃ１−７ヒドロキシルアルキル基、Ｃ１−７アミノアルキル基、Ｃ５−２０アリール−Ｃ１−７アルキル基などを含む）；Ｃ３−２０ヘテロアリール基、さらにはＣ５−２０アリール基（例えば、Ｃ５−２０カルボアリール、Ｃ５−２０ヘテロアリール基、Ｃ５−２０アリール−Ｃ１−７アルキル基およびＣ５−２０ハロアリール基などを含む）が含まれる。
【００２２】
本明細書中で使用する用語"リング構造"は、３個から１０個の共有結合した原子の閉環構造に関係し、共有結合原子の数は、好ましくは３個から８個、より好ましくは５個から６個である。リングは、脂環式環、芳香環のいずれでも構わない。本明細書で言う"脂環式環"は、芳香環でないリングを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用する用語"炭素環"は、環原子がすべて炭素原子であるリングを指す。
【００２４】
本明細書中で使用する用語"炭素芳香環"は、環原子がすべて炭素原子である芳香環を指す。
【００２５】
本明細書中で使用する用語"複素環"は、リングを構成する原子の少なくとも一つが、多原子価のへテロ原子であるリングを意味し、へテロ原子は、例えば、窒素、リン、シリコン、酸素、硫黄などであって、典型的には、窒素、酸素または硫黄である。複素環は、１個から４個のヘテロ原子を有することが好ましい。
【００２６】
上記のリングは、"多環基（multicyclic group）"の一部であって構わない。
【００２７】
上述したように、本発明の高分子ミセル凝集体は個別ミセルの集合体から形成され、平均粒径は２０ｎｍから５００ｎｍである。平均粒径は、顕微鏡または光子相関分光法を使って簡単に測定でき、ろ過前の水溶液で好都合に判断できる。好ましくは、高分子ミセル凝集体の最小平均粒径は少なくとも１００ｎｍ、より好ましくは、少なくとも１７５ｎｍで、最大平均粒径は少なくとも４００ｎｍ以下である。ろ過後の平均粒径は、典型的に、約１００ｎｍから２５０ｎｍの範囲に好ましく減少する。詳細は表１の実施例を参照されたい。
【００２８】
実施例の説明で記載するように、使用した炭水化物重合体は、解重合されてポリマを生成するが、このポリマは爾後の誘導体化で、例えば、疎水基と第四アンモニウム基を含有するようなポリマである。好ましくは、炭水化物重合体は、約１．５kDaから２５０kDaの分子量を有し、より好ましくは、約１．５kDaから１００kDa、さらに好ましくは、約２kDaから２５kDaの分子量を有する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明の高分子ミセル凝集体は、約０．５から６の、より好ましくは、約０．８から４．４の疎水性指標（ＨＩ）を有している。この疎水性指標（ＨＩ）は、炭水化物について疎水性置換基のモルレベルと親水性置換基（第四アンモニウム）のモルレベルを、１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析法を使って計測することで測定され、ＨＩ＝Ｑ/Ｌで与えられる。ここで、Ｑは、単量体あたりの第四アンモニウム基のモル分率であり、Ｌは、単量体あたりの疎水基のモル分率である。
【００３０】
当業者であれば、ポリマ合成と誘導体化反応が精密ではないという事実を理解されよう。結果として、ポリマの任意の試料においては、ポリマに存在するa、b、cモノマー単位のモル比と、試料内の各ポリマのa、b、cモノマー単位の配列について、その大きさに変異がある。従って、上述した範囲と数値はポリマ試料全体としての平均を表す。また、ポリマのモノマー単位の異なる型の順位付けは、規則的なパターンでも、ブロック共重合体としての順位でも、ランダムでも構わない。
【００３１】
さらに、変化したポリマは、１個又は複数の対イオンを含む。典型的に、これはポリマに存在する第四アンモニウム基によるもので、対イオンは、塩化物イオン、ヨウ化物イオン、酢酸イオン、グルタミン酸イオンなどの負の電荷を帯びたイオンである。本書に記載するポリマと化合物は、薬剤として許容可能な塩などの形態であっても構わない。
【００３２】
本発明の別の実施例によれば、前述した高分子ミセル凝集体から成る化合物を提供する。好ましい化合物は、本書に記載した高分子ミセル凝集体と薬剤、より好ましくは、疎水性製剤、とから成る医薬組成物を含む。好ましい実施例による医薬組成物においては、高分子ミセル凝集体は、薬物分子と共にナノ粒子を形成し、このナノ粒子は、約２０ｎｍから２μｍの、より好ましくは、約２０ｎｍから２００ｎｍの平均粒径を有する。
【００３３】
本発明の実施例によれば、従来技術のものと比較して、少なくとも１：１０、好ましくは、１：２０、さらに好ましくは、１：４０のポリマ／薬物のモル比を有利に提供する。超音波処理や混合などのホモジナイズ法または高圧均質化を使ってナノ粒子の形成を行うのに、好都合に薬物を添加しても構わない。
【００３４】
疎水性薬物の例は、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロン、パクリタキセルなどの極性基が欠けた多環リング構造の薬物、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、およびその他の多環化合物などの薬物を含む。
【００３５】
別の実施態様では、本発明は治療で使用するための医薬組成物を提供する。
【００３６】
さらに別の実施態様では、患者に薬物を供給するための薬剤を調製するための高分子ミセル凝集体と薬物の使用を提供する。好ましい具体例では、薬物は水中での溶解度が低い。
【００３７】
図を参照しながら本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンの構造
【図２ａ】メチルオレンジ溶液内の浅色移動を測定することで立証されたポリマ疎水性と分子量の高分子凝集体への影響を示す。無極環境下では、メチルオレンジは浅色移動を起こす。第１変曲点（矢印A1）で高分子CMCを測定する。ポリマの詳細については、表１の疎水性指標（HI）、近似疎水性親油性バランス（HLB）およびCMCの数値を参照
【図２ｂ】水中におけるE5の凍結割断電子顕微鏡写真（５.０mg mL−1）
【図２ｃ】水中におけるC5の負染色透過電子顕微鏡写真（５.０mg mL−1）
【図２ｄ】自己集合高分子ミセルクラスタの略図
【図３ａ】プロポフォールカプセル化へのパルミトイル化レベルの影響。初期薬物濃度＝１０mg mL−1 、初期ポリマ濃度＝５mg mL−1、＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）、データ表示平均±ｓ．ｄ．
【図３ｂ】プロポフォールカプセル化へのパルミトイルの影響（初期ポリマ濃度＝５mg mL−1、初期薬物濃度＝１０mg mL−1 、●＝Ｇ１９＋プロポフォール、◆＝ＧＥ１＋プロポフォール。ＨＩについては、表１の近似ＨＬＢおよびＣＭＣ数値を参照（利用可能な場合）。Ｇ１９の１モルがプロポフォールの４８モルをカプセル化。試料は室温で保存
【図３ｃ】薬物カプセル化へのポリマ分子量の影響。ろ過後にＨＰＬＣで薬物濃度を測定（０．４５μｍ）。■＝Ｇ１９（５mg mL−1）、□＝Ｇ１９（２．５mg mL−1）、●＝Ｇ４（５mg mL−1）、○＝Ｇ４（２．５mg mL−1）、▲＝水中のプロポフォール、＊＝濃度が５mg mL−1のときのポリマ間の統計的有意差、＃＝濃度が２．５mg mL−1（ｐ＜０．０５）のときのポリマ間の統計的有意差
【図４】プレドニゾロン・フォルテ（Prednisolone Forte）（白いバー、酢酸プレドニゾロン懸濁液、１０mg mL−1、３５μＬ、アラガン、米国）またはプレドニゾロンのＧＣＰＱ（第四アンモニウム・パルミトイル・グリコール・キトサン）製剤（黒いバー、Ｇ２−１mg mL−1、ＮａＨＣＯ３−０．０１Ｍ、プレドニゾロン−１mg mL−1、３５μＬ）を投与されたウサギの房水、＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。 プレドニゾロン製剤の負染色透過電子顕微鏡写真
【図５】雄のマウスMF1への尾静脈投薬後のプロポフォール製剤の薬理学的活動（睡眠時間、平均±ｓ．ｄ．、ｎ?４）。マウスへは以下のように投与：（i）０．２mg：リン酸緩衝食塩水（PBS、ｐＨ=７．４）で２mg mL−1に希釈したプロポフォール乳剤（１０mg mL−1、フレゼニウス、ドイツ）あるいはろ過GCPQ製剤（ｐＨ=７．４のPBS中、Ｇ１９−５mg mL−1、プロポフォール１．９mg mL−1）として、容積１００μLに対して０．２mgのプロポフォールをマウスへ投与（ii）０．４mg：４mg mL−1濃度にグリセロール（図５ｂに記載した製剤０．２４Ｍ−ＴＥＭ）で希釈したディプリバンあるいはプロポフォールのろ過GCPQ製剤（図５ｃに記載した製剤０．２４Ｍ−ＴＥＭのグリセロール中、Ｇ４１−５mg mL−1、プロポフォール４．２mg mL−1、レシチン２mg mL−1）として、容積１００μLに対して０．４mgのプロポフォールをマウスへ投与（iii）０．５mg：ディプリバン（１０mg mL−1）あるいはプロポフォール乳剤（フレゼニウス、１０mg mL−1）として、容積５０μLに対して０．５mgのプロポフォールをマウスへ投与。 正向反射の消失時間は低用量の市販乳剤を投与されたマウスにのみ観察された（０．２フレゼニウス、マウスにおいて、０．３７±０．１９分）。ポリマのみを投与されたマウスに睡眠時間は記録されなかった。＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ａ】炭水化物製剤の経口投与後のシクロスポリンA(CsA)の血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝６．７：１。＊＝水中のCsAとの統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ｂ】炭水化物製剤の経口投与後のCsAの血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝１０：１。＊＝水中のCsAとの統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ｃ】炭水化物製剤の経口投与後のCsAの血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝１３．３：１
【図７】GCPQ−CsA製剤からのCsA回復率。平均値に統計的有意差は認められない（ｐ＞０．０５）
【図８】多様なGCPQ−CsA錠剤からのCsA放出特性（ｎ＝３、平均±SD）
【発明を実施するための形態】
【００３９】
[疎水性薬物]
本発明のミセルポリマ凝集体は薬物、特に、疎水性薬物を溶解するのに使用できる。本明細書で使用する用語"疎水性薬物"は、水中でごく僅かにしか溶解しない薬物を含む。英国薬局方が使用する定義によれば、"ごく僅かな溶解性"は、１ｇの物質を溶解するのに１０００ミリリットルを超える溶媒（例えば水）を必要とするか、または、１．０mg ｍL−1未満の水溶解度を有する物質を示す。
【００４０】
疎水性薬物の例としては、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロン、パクリタキセルなどの極性基が欠けた多環リング構造の薬物、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、およびその他の多環化合物などの薬物が挙げられる。好ましい疎水性薬物は、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリンを含む。プレドニゾロンは、合成副腎コルチコステロイドで、例えば、眼の抗炎症薬として使用される。プロポフォールは、成人及び三歳以上の小児患者の全身麻酔の導入；成人及び生後２ヶ月を超えた小児患者の全身麻酔の維持；および集中治療室で挿管された人工呼吸器装着患者の鎮静作用に使用される短時間作用型の静脈麻酔薬である。シクロスポリンは、免疫抑制剤である。これは、同種臓器移植後に患者の免疫システムの活動を抑え、すなわち、臓器拒絶反応のリスクを減少させることが広く知られている。皮膚、心臓、腎臓、肺、膵臓、骨髄及び小腸の移植分野で研究されている。シクロスポリンは、真菌ヒポクラジアム・インフラタムガムス（fungus Hypocladium inflatum gams）から生成される１１個のアミノ酸の環状非リボソームペプチド（１１角形ペプチド）である。
【００４１】
[投与経路と製剤処方]
医薬組成物の投与経路は、経口及び直腸経由を含む胃腸投与；注射、パッチ、クリームなどを含む非経口投与；鼻、吸入、ペッサリー経由を含む粘膜投与を含むが、これに限定されるものではない。好ましい実施例では、非経口投与、経口投与、局所性投与で医薬組成物を投与する。
【００４２】
上述した高分子ミセル凝集体及び薬物に加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液、安定剤、又は、当業者に公知のその他の成分を医薬製組成物に含んでも構わない。こうした成分は毒性がなく、医薬組成物の効果を妨げないものとすべきである。担体およびその他の成分の特徴を非経口、経口または局所性などの投与経路によって決定できる。
【００４３】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液状とすることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバンドなどの固体担体を含んでも構わない。液状の医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成潤滑油などの液体キャリアを含む。生理食塩水、デキストロース又はその他のサッカリド溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレン・グリコールなどのグリコールを含んでも構わない。
【００４４】
静脈注射、皮膚注射、皮下注射や痛みのある場所への注射の有効成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性および安定性を備えた非経口的に許容される水溶液の形態とする。当業者であれば、例えば、注射用塩化ナトリウムなどの等張賦形剤を使って適当な溶液を調製することができよう。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、及び／又はその他の添加剤を含んでも構わない。
【実験】
【００４５】
[序論]
本発明は、炭水化物凝集体が個別凝集体の組織化ミセルクラスタに階層的に凝集し、これらのミセルクラスタがモル重合体／疎水性薬物比が１：６７（薬物／ポリマ重量比は０．８：１）という安定ナノ粒子に転換可能で、この比率は、プルロニック・トリブロック・ブロック共重合体（Pluronic triblock block copolymers）で得られるレベルの２０倍という予期しない発見に基づいている。
【００４６】
また、これらのミセルクラスタは、指標によって、生物学的障壁を超えて、疎水性薬物の転換を１０進法で一桁（an order of magnitude）改善する。
【００４７】
両親媒性炭水化物重合体で形成されたミセルクラスタは、ミセル（文献５，２２）、ベシクル（文献２３，２４）、およびブロック共重合体やグラフト両親媒性高分子のところで記載した濃厚非晶質ナノ粒子（文献２２，２５，２６）とは区別される。これは、例えば、ろ過前のミセルクラスタのサイズが１００−４００ｎｍで、ろ過後（４５μｍ）は１００−３００ｎｍになるという事実から推定できる。対照的に、ブロック共重合体で形成した従来の単一ミセル物質の直径は、例えば、１２−３６ｎｍ（文献２９，３０）であり、直径２５ｎｍの単一ミセルとしてコレステリル・プルランも存在すると考えられている（文献３１）。
【００４８】
より小型の１０−３０ｎｍ程度の凝集体と疎水性ドメインのナノ粒子から成るミセルクラスタと薬物の結合能力は、脂質誘導体化の程度と炭水化物の分子量を変えることで調整できる。
【００４９】
炭水化物プロポフォール製剤の静脈注射では、モデル薬物の薬理作用を、市販の粗い乳剤と比べて１０進法で一桁高めることができる。炭水化物プレドニゾロン製剤の眼球への局所使用では、房水で見つけた薬物の初期レベルが１０倍量のプレドニゾロン懸濁液を使用したときのものと類似していた。従って、これらの新規な高分子ミセルクラスタは疎水性薬物の生体利用効率を高めるのに使用できる。
【００５０】
水溶解度が限られた、または、皆無の薬物は、水溶解度の高い薬物と比べて大量に投与する必要がある。従って、限られた水溶解度または非水溶性の薬物の生体利用効率を高める担体化合物の提供が製薬業界では極めて重要である。こうした担体化合物の利点は、任意の病状治療を目的とする、限られた水溶解度または非水溶性の薬物の動物への投与量を削減できることにある。
【００５１】
[原料と方法]
[第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン]
後述の従来技術による方法（文献２０）を修正して第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（GCPQ）試料を合成した。特に断らない限り、全ての試薬は、英国のシグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Co.）から供給されたものをそのまま使用した。有機溶媒は、ストラスクライド・ユニバーシティ（University of Strathclyde）の純正応用化学学部から提供を受けた。１H NMR（２ppmでシグナル）を用いた検出レベルを下回るアセチル化度を有するグリコール・キトサン（GC−Mw−２５０kDa）を５０℃の塩酸溶液中（４M）で４８時間加熱することで分解し（文献２３）、１０−１５kDaのGC試料を得た。択一的に、従来技術に記載された方法によるGC分解（文献４７）を応用して４kDaのGC試料を調製した。GC（Mw−２５０kDa、１ｇ）は酢酸（２．５％V/V、５０mL）中で分解させた。溶液を介して５分間N2ガスを泡立てることで溶存酸素を溶解した。０−４℃に冷却後、新しく調製したNaNO2（９．５mg mL−１、２mL）溶液を加え、暗闇の中で攪拌せずに、１５時間、４℃で化学反応を進行させた。生成物を濃縮アンモニア水で中和した。こうして得た混合物にNaBH4（２０mg）を加えて分割し、反応混合物を攪拌しながら室温で一晩放置した。その後、アセトン（１５０mL）を加えて、室温で生成物を慎重に沈殿させた。こうして得た沈殿物を遠心分離（９０００ｇ×１０分間）し、メタノール（５０mL）で３回洗浄し、水中で再び溶かし、後述するように完全に透析し、透析物を凍結乾燥させた。収量は４００mgであった。
【００５２】
分解したGC（３００mg）を重炭酸ナトリウム溶液（０．０５７M）中で溶解し、表１に記載したレベルでパルチミン酸N−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）（１２０mL）を添加し、混合物を７２時間攪拌した。減圧下蒸発でエタノールを除去し、反応混合物をジエチルエーテル（３×１００mL）で抽出した。粗製パルミトイル・グリコールキトサン（PGC）をヨウ化ナトリウムのN−メチルピロリドン溶液中（０．０１１M、９０mL）で攪拌しながら一晩溶かし、この溶液に水酸化ナトリウムのエタノール溶液（０．２５M、１８mL）と表１に記載したレベルのヨウ化メチルを加えた。窒素ガス下のもと、３６℃で４時間混合物を攪拌し、ジエチルエーテル中（４００mL）で生成物を沈殿させ、ジエチルエーテル中（２×３００mL）で２回洗浄した。こうして得た生成物を水中（１００mL）で溶かし、含水塩化ナトリウム水溶液（０．１M、５L）で完全に透析し、プロトン化した重合体（キトサンpKa〜７）または重炭酸ナトリウム（０．０１M）と塩化ナトリウム（０．１M）を含む水溶液（５L）を得た。後者から脱プロトン化ポリマが得られる。前記の透析媒質を３回交換し（４．５時間）、水（５L）を６回交換しながら、さらに透析を行った（２４時間）。全ポリマの合成収量は最大１２０mgであった。G19については、プロトン化したものと脱プロトン化したものを調製した。その他の全ポリマを、水（５Lを６回交換、合計２４時間）で透析し、塩化物イオン（IRA９３ Cl−１）で平衡化させたイオン交換カラムを通過させた（文献２０）後に、凍結乾燥した。
【００５３】
分解したGCの分子量をマルチアングル・レーザー光散乱を利用したゲル浸透グラマトグラフィ（文献２３）で測定した。パルミトイルメチルプロトン（０．８ｐｐｍ、パルミトイル）および第四アンモニウムメチルプロトン（３．３５ｐｐｍ、第四アンモニウム・グリコール・キトサン）をそれぞれ糖メチンプロトン（３．１及び３．５−５．５ｐｐｍ）と比較すること（文献２０）で１Ｈ ＮＭＲによりパルミトイル化とメチル化を測定した。式２を使って、疎水性指標を計算した：
ＨＩ=Ｑ/Ｌ ２
式中、Ｑ＝単量体あたりの第四アンモニウム基のモル分率、Ｌ＝単量体あたりのパルミトイル基のモル分率を示し、ＨＬＢ（４，４８）の近似値を式３を使って求めた：
式中、Ｍ1＝第四アンモニウム糖単量体の分子量、Ｍ2＝アミノ糖単量体の分子量、Ｍ3＝ＣＨ２ＣＯ-アミノ糖単量体の分子量、Ｍ4＝テトラデシル部分の分子量をそれぞれ示す。
【００５４】
[ポリマ凝集および薬物カプセル化]
メチル・オレンジは、ポリマ凝集から得るのと同じような（文献２２）、極性領域から無極性領域への長い波長域の浅色移動を経ることでソルバトクロミック・プローブとしての役目を果たす（文献２２，２７）。メチル・オレンジのアルカリ溶液を使用して、ポリマ水溶液濃度を上昇させながら浅色移動の度合いを測定すること（文献２２）により、ポリマ凝集を証明した。最大吸収−濃度曲線のメチル・オレンジ波長における第１変曲点をCMCとした。モルCMCデータを取得するために、ＧＣＰＱ ＮＭＲおよびＧＣ ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳデータを使ってポリマ分子量を計算した。光子相関分光法を使ってろ過（０．４５μｍ）前後の凝集体サイズを記録した（文献２５）。凍結割断電子顕微鏡法（文献４９）と負染色透過電子顕微鏡法（文献２３）を両方使って、凝集体の画像を記録した。
【００５５】
薬物と水媒体中のポリマの混合物を超音波分解（文献２５）するプローブによって、凝集体へ薬物を取り込んだ。凝集体に含まれる薬物レベルを、凝集体のろ過（０．４５
μｍ）後に測定し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した。プレドニゾロンについては、ポリマ／薬物試料をろ過し、移動相（水／アセトニトリル ６４０mL：３６０mL）で希釈し、移動相の流動速度が１mL min−１の３．５μｍC18カラム対称性の逆相（４．６×７５mm、英国、ウォーター・インスツルメンツ：Waters Instruments）を経てクロマトグラフ化した。ウォーター５１５等張ポンプ（waters 515 isocratic pump）とウォーター７１７自動サンプラー（waters 717 autosampler）を使ってクロマトグラフを得、試料検出には、ウォーター４８６可変波長紫外線波長検出器（waters 486 variable wavelength ultraviolet wavelength detector）（λ＝２４３nm）を用いた。内部標準は６α−メチルプレドニゾロン（５０ng mL−１）で、検出限界は５ng mL−１であった。１０−２５０ng mL−１領域の線形ピーク面積における比率−濃度曲線の相関係数は０．９９９１であった。プロポフォールについては、ポリマ／薬物試料をろ過し（０．４５μｍ）、移動相（水／アセトニトリル ２００mL：８００mL）で希釈し、１mL min−１の移動相流動速度を有する５μｍのODS2カラム（ODS2 5μｍ column）（４．６×２５０mm、英国、ウォーター・インスツルメンツ：Waters Instruments）を経てクロマトグラフ化した。波長を２２９ｎｍに設定した以外は前記のものと同じ器具を使用した。検出限界は０．２５μｇ mL−１であった。１−２５０μｇ mL−１領域の線形ピーク面積における比率−濃度曲線の相関係数は０．９９９７であった。
【００５６】
[統計]
スチューデントｔ−検定を使って統計分析を行った。有意差は、ｐ値が０．０５を下回るかどうかで判断した。
【結果】
【００５７】
[炭水化物両親媒性物質の合成]
酸による分解で得た3つの分子量を備えるグリコールキトサン（GC）試料（表1）を使って両親媒性重合体を調製した。第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（GCPQ）試料の合成（図１）は、１H NMR（文献２０）（０．９０ppm＝CH3−パルミトイル、１．２５ppm＝CH2−パルミトイル、１．６０ppm＝CH2−パルミトイルβからカルボニル、２．２５ppm＝CH2−パルミトイルαからカルボニル、３．０２ppm＝CH3−モノメチルおよびジメチルアミノ、３．１２ppm＝CH−C2非置換グリコールキトサン、３．３５ppm＝CH3−トリメチルアミノ、３．５−５．５ppm＝CHグリコールキトサン）で確認した。多様なレベルのパルミトイル化および四級化で１３個の異なる両親媒性物質を調製した（表１）。
【００５８】
ヨウ化メチル／GCの重量比を１４．１４又はそれ以下に保つ限り、メチル第四アンモニウムレベルの大半も同程度に維持する一方、パルミチン酸N−ヒドロキシスクシンイミド（PNS）の供給率を制御することでパルミトイル化レベルを粗調整した。
【００５９】
[自己集合]
メチル・オレンジ（文献２２，２７）を使って、ポリマ凝集を証明した（図２a）。疎水性ポリマ（疎水性指標[HI]＝１−２、疎水性親油性バランス[HLB]＝１７−１８）が増えるほど、安定した凝集が生じることが低ＣＭＣｓで証明された（＜１０μＭ、図２ａ、表１）。疎水性ポリマが増えると、より多数の無極性疎水性コアが生成されることも、ミセル形成後のメチル・オレンジの浅色移動の度合いから明らかである（最大λ＜４３０ｎｍ、表１）。ポリマ凝集体は、直径が１００−３００ｎｍ（表１）で、先のの文献（文献２８）が開示する単分子凝集のサイズとは一致しない。凍結割断および負染色透過電子顕微鏡はいずれも、理論の制限を受けることなく、直径１０−３０ｎｍのより小さな集合体クラスタがより大きな集合体に階層的かつ組織的に凝集（図２ｂ、２ｃ）することを示す。こうした構造は図２ｄで記載するモデルと一致する。このクラスタ配置は、通常の両親媒性重合体の凝集とは異なる。ブロック共重合体ミセルにおいては、例えば、単一ミセルの集合体の直径は、通常、１２−３６ｎｍ（文献２９，３０）で、コレステリルプルランから調製されるミセルも、直径２５ｎｍの単一ミセルとして存在すると考えられている（文献３１）。
【００６０】
より低いＨＬＢｓを備えるその他の両親媒性物質で記録されたＣＭＣ値と比較しても、本発明によるポリマのモルＣＭＣｓは、例えばＦ１２７のように、その他の両親媒性凝集体より本発明の凝集体の方がより安定性が高いことを示す（表１および２）。本発明によるポリマのＣＭＣｓは、プルロニックブロック共重合体Ｆ１２７（ＨＬＢ＝１４、ＣＭＣ＝５５０μ（文献６））およびポリソルベート（ＨＬＢ＝１６．７、ＣＭＣ＝５３μＭ（文献４））で記録されたものと比べて１０進法の指標で１桁から３桁異なる。
【００６１】
理論の制限を受けることなく、発明者は、このより好ましい凝集現象が図２ｄで提案したモデルと一致すると考えた。これは、ミセル形成に伴う水構造の喪失に加えて、多数のポリマ間およびポリマ内の疎水結合及び水素結合を形成するポリマの能力が凝集に関連するエントロピー利得に貢献しているであろうと考えたためである。さらに、分子量の増加が凝集に有利に働く（図２ａ）。改めて、この観察結果は、多数の分子間および分子内の接触がミセルクラスタを安定させるという仮説と矛盾しない。
【００６２】
[薬物の取り込み]
より多くの無極性領域の形成は、疎水性薬物のカプセル化に有利に働く。従って、疎水性ポリマが増えると、より大量の薬物をカプセル化できる（図３ａと３ｂ）。カプセル化のレベルが高い：５mg mL−１Ｇ４２（表１）と、４．４３±０．１２mg mL−１のプロポフォールをカプセル化できる。プロポフォールのようにログＰの高い薬物の結合（incorporation）では、ミセルクラスタをナノ粒子製剤に変換（transformed）した。プロポフォール（ログＰ＝４．１）を用いると、電子顕微鏡写真で密度の高い粒径５０−１５０ｎｍと見られる粒子のミセルクラスタからより粒径の大きい粒子を得た（図５ｃ）。一方、膨張した粒子薬物とミセルクラスタの混合物から成るプレドニゾロン（ログＰ＝１．４）を用いると、粒径が１０−１００ｎｍの等方性液体が得られた。（差し込み図４ｂ）。
【００６３】
我々は、コレステロールなど疎水性分子（文献２２）の存在下では、ポリ（エチレンイミン）両親媒性凝集体の数が上昇することを発見した。我々は、理論の制限を受けることなく、より多くの疎水性薬物が存在すると、ポリマ集合は、ミセルクラスタからより濃度の高いナノ粒子に移行すると仮定した。炭水化物製剤のプロポフォールレベルを少なくとも３０日間、初期値の７５％以上に維持する（図３ｂ）。アルカリ媒体でポリマを透析することでアミン基のイオン化を抑えると、薬物のカプセル化レベルが高まることを表３は示す。凝集工程の初期段階の中心となる静電反発力の克服に伴う作業を除去することで、薬物カプセル化レベルが高まる。
【００６４】
ポリマ疎水性の上昇に伴う薬物カプセル化の上昇は、ブロック共重合体で観察されてきた（文献３２、３３）。しかし、疎水性薬物の存在下で、ブロック共重合体からナノ粒子が形成されることは、我々が知る限り、報告されていない。従って、本発明による両親媒性物質の新規な特長とみなされる。例えば、プロポフォールとＦ１２７（１．７８mg mL−１プロポフォール及び４０mg mL−１Ｆ１２７）は、直径が２０−４０ｎｍのミセルを形成する（文献３３）。
【００６５】
ポリマHLB／HI（表１、図２a）に加えて、ポリマの分子量もミセルの安定性に影響を及ぼす。分子量が増えると、ミセルの安定性が増し（図２a）、この安定性の改善は、薬物カプセル化の分子量の影響力に反映される（図３ｃ）。分子量が２．５倍高まると、薬物／ポリマのモル比が１０倍になる（表２）。従来の理論に囚われることなく、この観察結果は、多数の疎水性分子間および分子内の接触は長いポリマ鎖があって初めて可能になるため、図２ｄで提案するモデルと矛盾がない。
【００６６】
これらの炭水化物薬物ナノ粒子は、ブロック重合体を超える主要な利点がある。すなわち、モル薬物カプセル化レベルは、少なくとも従来のものより１０進法で一桁高い（表２、図３）。従来の理論に囚われることなく、これらの優れた薬物カプセル化レベルは凝集の本質によるものであると我々は提案する。ちなみに、ミセルクラスタの形成は、単一ミセルの形成とは異なる。
【００６７】
疎水性物質を水媒体と結合させるときの両親媒性物質の効率だけでなく、水媒体と結合できる薬物の最大レベル、すなわち、臨床的関連パラメータを検討することも重要である。後者についてもブロック共重合体システムと比較した（表２）。これらの炭水化物両親媒性物質で得た薬物の取り込みは、有利に、４５％ｗ／ｗに達し、疎水性薬物で取り込んだ他のポリマ粒子で得られたものより高かった（文献１９，３４，３５）。
【００６８】
疎水性炭水化物に関する過去の研究は、その粘性強化特性（文献３６−３８）、ゲル形成能力（文献２０，３９）、非水溶性集合（aqueous insoluble aggregates）（２１，２３，３１，４０−４３）に焦点を当ててきた。水溶性炭水化物両親媒性凝集体（文献２０，２１，２８）に関し、超微細構造及び／又は生体利用効率の増強効果という特長は何ら報告されていない。我々は、ここに初めて、動的光散乱を根拠として裏付けられる顕微鏡写真によって、凝集挙動がミセルの階層的組織体への自己忌避コロイドクラスタ化（self repellent colloidal clusters）を伴うことを証明する。
【００６９】
[炭水化物薬物担体による生体利用効率の増強]
図４と５は、新規な炭水化物粒子が生物学的障壁を克服して、薬物をデリバリするデータを示す。これらの炭水化物製剤を使用すると薬物の生体利用効率が極めて有意に高まることが分かる。眼の抗炎症薬プレドニゾロンと静脈麻酔薬プロポフォールの２つのモデル薬物を選択した。眼への局所使用では、炭水化物両親媒性で調整したプレドニゾロン０．３５mgを含む房水と３．５mgのプレドニゾロンを含むプレドニゾロンフォルト(r)（Prednisolone Forte(r)）を使って調製した薬物とでは初期の時点で統計的に区別できない。製剤の安定性を損なわないために、プレドニゾロンフォルトの希釈は行わなかった。硝子体液内のいずれのプレドニゾロン製剤でも薬物を検出しなかった。これらの炭水化物ナノ粒子は、角膜を越えて房水までの薬物吸収を促進するが、眼底への薬物のデリバリはできない。しかし、局所投与であることと薬物の特長を鑑みれば、驚くに当たらない（文献４４）。
【００７０】
炭水化物プロポフォール製剤で得られる睡眠時間は市販のフレゼニウス（Fresenius）またはディプリバン製剤(r)（Diprivan(r)）がもたらす睡眠時間の最大で１０倍である。動物が注射投与時間の終了までに眠ってしまったため、ＧＣＰＱ製剤による復元反射時間の喪失は記録できなかった（図４ｂ参照）。血液脳関門を越えての中枢作用薬のデリバリは迅速で効率的であることを示している。製剤を比較するために、睡眠時間を１分増やすのに必要なプロポフォールの用量を比較した。プロフォール０．２mgの場合、フレゼニウスとＧ１９製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、０．４２６mg mL−１と０．０３２mg mL−１（０．１mL用量当たり）で；プロフォール０．４mgの場合、ディプリバンとＧ４１製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、０．１３４mg mL−１と０．０２３mg mL−１（０．１mL用量当たり）で；プロフォール０．５mgの場合、希釈していない（１０mg mL−１）フレゼニウスとディプリバン製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、１５２mg mL−１と１１１mg mL−１（０．０５mL用量当たり）であった。速やかな導入が望ましいため（文献４５）、この戦略は麻酔誘発のメリットをプロポフォールにもたらす一方、これらの実験は、本質的に、この技術が行動変容療法または特定の脳疾患治療のための中枢神経系デリバリに好都合であることを示す。
【００７１】
目下の研究は、これらの炭水化物両親媒性物質が中枢神経系への、または、角膜を超えての薬物デリバリを改善するメカニズムを完全には解明していない。しかし、中枢神経系については、製剤の物理的特性を分析することで明らかになるかもしれない。ディプリバンを使った（図５ｂ）市販のプロポフォール製剤の粒径および粒度分布は、炭水化物製剤のものと比べて、大きかった（図５ｃ）。図５ｃに記載の製剤はろ過してあるが、市販の乳剤と比較して、ろ過していない炭水化物製剤の生体利用能に効率向上は見られない（データ省略）。高分子凝集体のろ過は粒径を減少させるため（表１）、既知の理論に囚われることなく、我々は、減少した粒径がこれらの炭水化物ナノ粒子の薬物デリバリ活動に多少とも関係があるとの仮説を立てた。
【００７２】
さらに、プロポフォールの遊離脂質製剤が効率の上昇を伴うことが報告されている（文献４６）が、これは、脳への分割に役立つ血中の脂質貯蔵の欠落によるものと見なされる。炭水化物製剤による血中の脂質貯蔵の欠落がここで観察された本製剤の効率上昇をもたらしている可能性がある。
【００７３】
結論として、炭水化物両親媒性物質を合成すると、ミセルクラスタへと自己集合し、これが疎水性薬物分子のデリバリ能力を高め、生物学的障壁を越えて薬物分子をデリバリ、すなわち、生体利用効率を高めることを見出した。本発明の技術は、疎水性薬物の製剤処方の課題を解決する。
【００７４】
[ベタイン基により両親媒性炭水化物の合成]
単位当たりの第四アンモニウム基と置換した四級化ベタイン基で炭水化物両親媒性物質の変異体を合成した。後述する誘導体化炭水化物の一部はａ単位とｃ単位から成り、本発明の実施例の一部に存在するｂ単位は除外した。
【００７５】
[オレイルベタイン・グリコールキトサン及びパルミトイルべタイン・グリコールキトサンの合成と特性解析]
〈グリコールキトサンの分解〉
グリコールキトサン（GC）１．５ｇを１１０mｌ４M HCL中で分解し、振とう水槽内で４８時間、５０℃に保持した。５Lの水で透析（６回交換）し、透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体（５２３mg）を得た。
【００７６】
〈ベタインのグリコールキトサンへの接合〉
０．１２９ｇのベタインを１０ｍｌの水で溶解した。 これに１．０ｇN−エチル−N'−（３−ジエチル・アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDAC）を加え、反応物を１５分間攪拌した。次に、４０ｍｌの蒸留水にGC０．３６g（MW〜１５−２１ｋDa）を加え、反応物をさらに２４時間、２５℃で攪拌した。水溶液にＨＣｌを加え、最終濃度を０．１Mとし、反応物をさらに３０分間攪拌した。 反応液を５Lの水で透析（６回交換）した。透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体を得た。収量は３９１mgであった。
【００７７】
〈オレイル基のベタイン・グリコールキトサンへの接合〉
ベタイン・グリコールキトサン（GCB、１８０mg）を２０ｍｌの水に溶かし、重炭酸ナトリウム液（水２０ｍｌ中、１５０mg）と混合し、無水エタノール（３０ｍｌ）を加えた。オレイン酸N−ヒドロキシ・スクシンイミドのエタノール溶液（ONS、５mg mL−１、３０ｍｌ）をこの水溶液に滴下(added drop wise)し、混合液を７２時間室温で攪拌した。減圧下でエタノールを蒸発させ、ジエチルエーテルで抽出（３回、各６０ｍｌ）し、５Lの水で透析（６回交換）し、凍結乾燥させて、オレイルベタイン・グリコールキトサン（GCBO）を得た。収量は７２mgであった。
【００７８】
〈パルミトイル基のベタイン・グリコールキトサンへの接合〉
GCB（１８０mg）を２０ｍｌの水に溶かし、重炭酸ナトリウム液（水２０ｍｌ中、１５０mg）と混合し、無水エタノール（３０ｍｌ）を加えた。パルミチン酸N−ヒドロキシ・スクシンイミドのエタノール溶液（PNS、５．２８mg mL−１、３０ｍｌ）をこの水溶液に滴下し、混合液を７２時間室温で攪拌した。減圧下でエタノールを蒸発させ、ジエチルエーテルで抽出（３回、各６０ｍｌ）し、５Lの水で透析（６回交換）し、凍結乾燥させて、パルミトイルベタイン・グリコールキトサン（GCBP）を得た。収量は７６mgであった。
【００７９】
[オレイルベタイン・グリコールキトサン及びパルミトイルべタイン・グリコールキトサンの特性解析]
緩衝酢酸溶液を移動相として利用し、マルチアングル・レーザー光散乱およびゲル浸透グラマトグラフィ（GPC/MALLS、MiniDawn、Wyatt、米国）によって分解グリコールキトサンの分子量を測定した（文献２３）。
ブルーカー（Bruker）AMX４００MHｚ分光計を使って１H NMRスペクトルを記録した（Bruker Instruments、英国）。解重合グリコールキトサンの溶剤としてD2Oを用い、誘導体化ポリマとしてCD3ODを使った。
【００８０】
〈UV可視分光光度法〉
メチル・オレンジ溶液（２５μM）をホウ酸塩緩衝剤（０．０２M、ｐH９．４）で調整し、プローブ超音波処理で高濃度GCBOおよびGCBP（１５mg mL−１）を調整するための希釈剤として用いた。これらのGCBOとGCBP製剤を引き続きメチル・オレンジ溶液で希釈し、希釈物を室温で１時間培養した後、UV分光光度計（UNICAM UV３００、Thermo Spectronic、英国）を使って紫外線吸収スペクトルを記録した（３００−６００nm）。
【００８１】
〈等温滴定熱量計〉
水中のGCBO製剤（２mg／ml）とGCBP製剤（１．９２mg／ml）をプローブ超音波処理で調整し、マイクロ等温滴定熱量計（MICROCALTM VP−ITC、英国）を使って非ミセル化エンタルポグラムス（demicellisation enthalpograms）を記録した。
【００８２】
〈動的光散乱〉
粒径と表面電荷を、ゼタサイザー(Zetasizer)3000HS（Malvern Insturments, Worcs., 英国）を使って、２５℃で測定した。散乱光を９０℃の角度で検出した。全ての試料は、ろ過前に薄膜フィルタ（細孔径：４５０ｎｍ、ミリポア）を通過させた。
【００８３】
〈グリコールキトサンの分解〉
４M HClを使って、４８時間、グリコールキトサンを分解した。ゲル浸透クロマトグラフィで測定した分解GCの分子量は１５ｋ−２１ｋDaであった。
【００８４】
〈ベタインのグリコールキトサンへの接合〉
ポリマのベタインレベルを１Ｈ ＮＭＲを使って測定し、四級化ベタインＣＨ３基（?３．1、９Ｈ）の糖類（Ｈ−2からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する比率を計算した。ベタインに接合したモノマー単位のモル比が０．１２２であることを見出した。
【００８５】
〈ベタイン・グリコールキトサンへのオレイル基またはパルミトイル基の接合〉
パルミトイルまたはオレイル鎖ＣＨ３基（?０．８８０、3Ｈ）の糖類（Ｈ−2からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する比率を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使ってベタイン・グリコールキトサンへ接合したオレイルまたはパルミトイル基のレベルを測定した。オレイルベタイン・グリコールキトサンのオレイル基に接合するモノマー単位のモル比が０．１９８であることを見出した。また、パルミトイルべタイン・グリコールキトサンのパルミトイル基に接合するモノマー単位のモル比が０．２９６であることも見出した。
【００８６】
〈ＧＣＢＯ及びＧＣＢＰの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）〉
等温滴定熱量計（ＩＴＣ）およびＵＶ／ＶＩＳ分光光度法｛しがい ぶんこう こうど ほう｝によって、ＧＣＢＯ及びＧＣＢＰの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定した。後者はプローブとしてオレンジ・メチルを使っている。ＩＴＣを使って測定したＧＣＢＯとＧＣＢＰのＣＭＣｓは、それぞれ、２．４mg mL−１と０．７８mg mL−１であった。この差は、異なる方法を使用したことに起因する。全ＣＭＣデータを表５に記載する。
【００８７】
【００８８】
〈ＧＣＢＯとＧＣＢＰ凝集体の大きさの測定〉
ＧＣＢＯとＧＣＢＰ凝集体の粒径と表面電荷を表６に記載する。ＧＣＢＯ試料では２つのピークを検出し、これは、このポリマについて２つのタイプの凝集体が形成されたことを示す。ＧＣＢＰ試料では１つの広範なピークだけを検出した。どちらのポリマ試料も、ホウ酸塩緩衝液より水中の方がより大きな凝集体を形成した。これは、ｐＨ値の低い正電荷ポリマの電荷反発と、全粒子が僅かに正のゼータ電位を有するためと考えられる。
【００８９】
【００９０】
[第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサンと第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン合成の代替方法]
〈ＧＣの四級化〉
４Ｍ ＨＣＬ（４８時間の代わりに１５時間とした以外は上記と同じ）で分解したＧＣ０．７５ｇを２mg mL−１のヨウ化ナトリウムを含むＮ−メチルピロリドン２２５ｍｌ中で２時間攪拌した。エタノール水酸化ナトリウム４５ｍＬ（１０mg mL−１）と、ヨウ化メチル４．６ｍＬを加えた。３６℃の窒素下で混合液を４時間攪拌した後、過剰ジエチルエーテルを使って沈殿させた。ジエチルエーテルで沈殿物を洗浄し、続けて、エタノールで洗浄し、水で再溶解し、５Ｌ 0.1M NaCl（３回交換）と水５Ｌ（６回交換）で透析した。透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体としてＧＣＱを得た。収量は２８２ｍｇであった。
【００９１】
〈オレイル基またはパルミトイル基の第四アンモニウム・グリコールキトサンへの接合〉
ＧＣＱへのオレイル及びパルミトイル接合を調製するのに、ＧＣＱ（１３４ｍｇ）を使用した。ベタイン・グリコールキトサンのオレイル及びパルミトイル誘導体の調製に利用した方法と類似の手法を用いた。第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサン（ＧＣＱＯ）の収量は１６５ｍｇで、第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（ＧＣＱＰ）の収量は８７ｍｇであった。
【００９２】
〈ＧＣＱＯとＧＣＱＰの特性解析〉
グリコールキトサンの分子量と置換レベルを測定するのに、マルチアングル・レーザー光散乱と１Ｈ ＮＭＲ分光分析をそれぞれ利用したゲル浸透グラマトグラフィを使って、前記と同様にＧＣＱＯ及びＧＣＱＰの特性解析を行った。
【００９３】
[結果]
〈グリコールキトサンの分解〉
グリコールキトサンの分子量は、１７−２１ｋＤａであった。
【００９４】
〈グリコールキトサンの四級化〉
第四アンモニウムメチルプロトン（ＣＨ３、δ３．３１、３Ｈ）と糖メチンプロトン（Ｈ２からＨ１１、δ３．５−４．５、１０Ｈ）レベルとの比率を計算するために、１HNMRを使ってポリマの四級化レベルを測定した。モノマー単位当たりの第四アンモニウム基のモル比は０．０９７であった。
【００９５】
〈第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサン及び第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン中のオレイルレベルとパルミトイルレベル〉
オレイル置換基のＣＨ＝ＣＨ基（?５．３、２Ｈ）の糖類（Ｈ−２からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する割合を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使ってポリマのオレイルレベルを決定した。第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサンにおけるモノマー当たりのオレイル基のモル比は０．３１９であった。
パルミトイル鎖のメチルプロトン基（?０．８８、３Ｈ）の糖類（Ｈ−２からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）のメチン／メチレンプロトンに対する割合を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使って第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン中のパルミトイルレベルを決定した。第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンにおけるモノマー当たりのパルミトイル基のモル比は０．３８１であった。
【００９６】
[生物的評価]
〈プレドニゾロンの眼への局所投与〉
排気ピペットを使って、オスのニュージーランド白ウサギ（ｎ＝４、Harlan、英国）の両眼の下方盲管（lower cul de sac）にプレドニゾロン製剤（３５μＬ）を投与した。投与後１時間、２時間、４時間後に被験体を殺し、注射器で房水の標本採取を行った。硝子体液を採取し、すべての生体試料を液体窒素で直ちに凍結させた。房水試料を解凍し、５０μＬの房水を内部標準を含む１５０μＬの移動相で希釈し、分析を行った。これらの希釈試料は上述のＨＰＬＣで分析した。硝子体液（０．５ｍＬ）も解凍し、分析前に酢酸エチル（文献５０）で抽出した。
【００９７】
〈プロポフォールの静脈中枢神経系デリバリ〉
生後６週間のオスＭＦＩマウスに尾静脈から各種のプロポフォールを静脈注射し、正向反射を消失するまでの時間と睡眠時間を記録した。正向反射の喪失は投与後、背中を下にして置かれた被験体が立ち直りに失敗したことで、即座に確認された。眠らなかった被験体は睡眠時間ゼロと記録した。｛せいこう はんしゃ｝
【００９８】
〈炭水化物両親媒性物質の経口吸収の可能性〉
炭水化物両親媒性物質の経口吸収ポテンシャルを評価した。分子量が１５−３０ｋＤａでモノマー当たりの第四アンモニウム基のモル比が０．１６９、モノマー当たりのパルミトイル基のモル比が０．１５５の炭水化物両親媒性物質を使って、炭水化物ミセル製剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を上記と同様に調製した。
【００９９】
成熟オスウイスターラット（Harlan Olac 英国、体重２４０−２８０ｇ、ｎ＝４）を１２時間絶食させた後、ＣｓＡ（２mg mL−1、−１mL、７．５mg kg−1）を胃内投与し、さらに４時間絶食させた。薬剤を水に分散させるか（超音波処理プローブにより分散）、ポリマ製剤または市販の液体製剤Neoral(r)（１００mg mL−1）を蒸留水で希釈し２mg mL−1の水溶液を調製して、ＣｓＡを投与した。様々な時間間隔で麻酔状態のラットの尾静脈から血液を標本採取し、製造者の指示に従いながら、モノクローナル抗体ラジオイムノアッセイ｛こうたい｝（Cyclo-Trac SP-Whole Blood Radioimmunoassay Kit, Diasorin、英国）を使用してＣｓＡの血中レベルを分析した。
【０１００】
これらの実験の結果を図６aから６ｃにまとめた。実験結果は、１００から３５０％血中レベルが上昇したことから、第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンが、ＣｓＡの経口吸収を高めることを示す。
【０１０１】
〈GCPQ製剤の安定性と溶出試験〉
GCPQを上記と同様に合成し、ポリマ特性を表４に記載した。
【０１０２】
【０１０３】
GCPQ（２０mg mL−1）とシクロスポリンA（CsA、５mg mL−1）を超音波処理プローブ（器具を最大出力の７５％にセットして、１０分間、氷上で超音波処理）によって分散させて製剤を調製した。液体製剤および凍結乾燥製剤をどちらも８−１０℃で６ヶ月間保存した。１ヶ月の時間間隔をおいて、凍結乾燥試料を再構成（蒸留水で復元）し、液体試料をろ過（０．４５μｍ）してHPLCで分析した。
【０１０４】
〈HPLC分析〉
Waters５１５HPLCポンプ、Waters７１７プラス自動サンプラ、及びWaters４６８回転式吸光度検出器を使って、高速液体クロマトグラフ分析を行った。ジョーンズクロマトグラフィカラムヒーターモデル７９７１（Jones Chromatography Column Heater model 7971）で８０℃に維持した逆相カラム（Waters Assymetry Spherisorb ODS2、粒径５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で試料をクロマトグラフ分析した。移動相は、水、tert-ブチル・メチル・エーテルおよびリン酸（６００：３５０：５０：１）で、流量は１．２mL min−1であった。CsAピークは２１０ｎｍで検出された。Waters Empowerソフトウエアを使ってデータを分析した。結果は図７に記載する。｛こうそく えきたい｝
【０１０５】
〈錠剤調製〉
直接圧縮で様々なGCPQ−CsA錠剤を調製した。粉末はすべて、篩過（３５メッシュ）して、直径５ｍｍの錠剤に圧縮した（EKOモデル、シングル・パンチ錠剤機、Erweka、ドイツ）。各薬剤ごとに個別に圧縮力を調整したため、錠剤の破砕強度は最大レベルであった。｛しか｝
【０１０６】
〈溶出試験〉
上記の各錠剤それぞれ３個づつについて、修正USP24−NF19法を使って溶出試験を行った。USP装置２（Erweka DT6R Dissolution Tester）、攪拌速度３０ｒｐｍ、溶出溶媒として１０００ｍLの蒸留水を用いた。ろ過（０．４５μｍ）後、５分、１０分、２０分、４０分、６０分、８０分、１２０分後に試料を採取し、上記と同様に、HPLCで分析した。結果を図８に記載する。
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【参考文献一覧】
【０１１１】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性炭水化物重合体（amphiphilic carbohydrate polymers）から形成される高分子ミセルクラスタと、それらの薬剤への使用、特に、溶解性の低い薬剤への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１個の分子において極性セグメントと無極性セグメント双方を組み合わせると、環境浄化活動から食品の加工まで、非混和液を多様なプロセスに活用できるようになる。医薬品産業では、賦形剤として認可された両親媒性化合物が利用できるにもかかわらず（文献３）、水と混ざらない薬剤の調製でしばしば不具合（文献１，２）が生じている。しかし、水溶解度の低い薬剤、すなわち、疎水性薬物から十分な生体利用効率を確保するのは医薬品の開発にとって、極めて重要である。英国薬局方によれば、水溶解度の低い薬剤は、"ごく僅かな溶解性"として定義され、こうした薬剤は、１ミリリットルの溶剤につき１mg未満の水溶解度を有する（英国医薬品委員会、英国薬局方、定置省：Medicines Commission, British Pharmacopoeia, The Stationary Office、ロンドン、２００２年）。
【０００３】
従来、ブロック共重合体を添加することで、疎水性薬物の生体利用効率を改善してきた（文献１４−１８）。ブロック共重合体とグラフト高分子両親媒性物質は、両方とも、高分子ミセル（文献５，２２）、小胞（文献２３，２４）、及び濃厚非晶質ナノ粒子（文献２２，２５，２６）に自己集合することが知られている。ブロック共重合体ミセルは、好都合に、直径が１２−３６ｎｍの単一ミセル成分である（文献２９，３０）。
【０００４】
水媒体において薬物の溶解度を高めるのにミセル相を利用してきた。相分離モデルによれば、ミセルコアを溶解する薬物の安定性は、その臨界ミセル濃度関数（CMC、式１）、すなわち、ミセル凝集体の形成が始まる濃度である。
△Ｇ０micelle＝ＲＴｌｎＸｃｍｃ １
式中、△Ｇ０micelleは、ミセル形成の標準自由エネルギーであり、Ｒは気体定数であり、Ｔは温度であり、Ｘｃｍｃはモル分数単位の臨界ミセル濃度である。従って、臨界ミセル濃度が低いほど、ミセル形成に有利である。
【０００５】
医薬的に認可された低分子量界面活性剤（文献４）とブロック共重合体（文献５−７）は、典型的に、ｍＭ濃度域にあるＣＭＣ値を有し、モル両親媒性物質／薬物の割合は、典型的に、１０：１を超え、しばしば、１０００：１を超えるため、疎水性薬物のデリバリには非効率的である（文献４、８−１０）。ミセルを溶解する固定モルにおけるミセルコア内の薬物の可溶度は、溶解物質（solubilisate）のlog ｐ（文献１１）、溶解物質のモル体積（文献１１）および会合コロイドによって形成される疎水性ナノドメインの相対的なサイズによって決まる（文献１２，１３）。log P／モル体積の割合が高いと、ミセルへの分割を促進し、ミセル内の疎水性体積が大きいと、ミセル内の薬物の不溶化を促進する。
【０００６】
より多くの粒子生成のために、個別モノマーの集合体の数を増やすことで粒子の疎水性体積を増加させるのは、従って、コロイド凝集体の内部で溶解可能な薬物のレベルを上昇させる可能性がある。しかし、過度の凝集は分子と薬物を形成するコロイドの沈殿を生じさせるため、注意が必要である。
【０００７】
先の出願で、炭水化物重合体の可溶化を開示し、これを用いて可溶性炭水化物重合体が存在する水相に添加する疎水性薬物を生成できることを示した（WO2004/026912）。この出願に記載した両親媒性重合体の例では、パルミトイル基のモルの割合は３．０％と８．２％の間で、第四アンモニウム基のモルの割合は７．９％と１９．０％の間であった。
【０００８】
しかし、当該分野では、投与の改善を目指した薬物調製の手法について、特に、疎水性薬物の生体利用効率の増加に関して、さらなる継続的な需要がある。
【発明の概要】
【０００９】
広い意味で、本発明は、両親媒性炭水化物重合体が、自己集合してミセルクラスタを形成することができ、そこでは、炭水化物両親媒性物質(carbohydrate amphiphiles)が、階層的に組織化したミセルクラスタに凝集しているという予期しない発見に基づいている。個別のミセル集合体で形成したこれらのミセルクラスタを、WO2004/026912に記載された重合体および条件を使って生成した個別ミセルと対比させても構わない。本発明は、薬物、特に、水溶解度が低い疎水性薬物によって、これらのミセルクラスタを安定ナノ粒子に転換できることを示す。好ましい実施態様では、これが、プルロニック・ブロック共重合体（pluronic block copolymers）を使用する従来技術で得られる比率よりも、重合体／薬物のモル比を高めることに貢献する。さらに、本発明は、ミセルクラスタから形成した薬剤の生物学的障壁を越える移動が、１０進法で一桁（an order of magnitude）改善できることを明らかにする。
【００１０】
従って、本発明の第１の実施態様によれば、平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍである両親媒性炭水化物重合体から形成される高分子ミセル凝集体が提供され、当該両親媒性炭水化物重合体は、複数個の結合モノマーユニットを含む誘導体化キトサンであり、（i）前記モノマーユニットの第１部分であるアミノ基は、疎水基で誘導体化され、（ii）前記モノマーユニットの第２部分であるアミノ基は、−Ｎ+Ｒ1Ｒ２Ｒ３（ここで、各Ｒは、水素又は以下に記載する官能基である）で示されるような第四アンモニウム基を所有する基を提供するように誘導体化されている。前記の誘導体化キトサン重合体が、モノマーユニットの第３部分を含むことは随意であって、その場合、アミンは、第１部分又は第２部分とは異なる手法で誘導体化されるか、或いは誘導体化されない。付加的に又は二者択一的に、モノマーユニットの第１部分及び／又は第２部分及び／又は第３部分のＣ６原子に存在する−ＣＨ２−ＯＨ基は、例えば、キトサンモノマーユニットのヒドロキシル基の一つ又はそれ以上と反応させて、エーテルのような酸素結合基を形成させることで誘導体化させることもできる。
【００１１】
より具体的には、本発明は、以下の一般式で表される両親媒性炭水化物重合体から形成される平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍの高分子ミセル凝集体を提供する。
式中、ａ＋ｂ＋ｃ＝１．０００であり、ａは０．０１０から０．９９０の値、ｂは０．０００から０．９８０の値、ｃは０．０１０から０．９９０の値であって、置換基Ｒ１からＲ７とＸは、以下に定義する。
【００１２】
上記の一般式において、ａ、ｂ及びｃのユニットは、任意の順番に配置されて差し支えなく、また、特定の順番あるいはランダムな順番に配置されて差し支えない。式中の＊マークは、連続重合鎖を示す。好ましい実施態様では、本発明が採用する誘導体化炭水化物重合体は、従来技術が開示するポリマに比べて、疎水基の割合が高い。本発明の実施例において、ｃユニットのモル比は０．１００より大きく、好ましくは０．１１０より大きく、より好ましくは０．１２０より大きく、さらに好ましくは、少なくとも０．１５０で、より好ましくは少なくとも０．１８０で、さらに好ましくは、少なくとも０．２００で、別の実施例では少なくとも０．２５０である。
一般的に、ｃユニット(単位)のモル比は、０．４００以下で、より好ましくは０．３５０以下である。
【００１３】
ａユニット(単位)のモル比は、好ましくは０．０５０と０．８００の間にあり、より好ましくは、０．１００と０．４００の間にある。
【００１４】
ｂユニットのモル比は、好ましくは０．２００と０．８５０の間にあり、より好ましくは、０．２００と０．７５０の間にある。
【００１５】
上記の式から明らかなように、ｂ単位は任意に欠落させることができる。ｃ単位は疎水基で誘導体化させるモノマーユニット(単位)の第１部分を提供し、ａ単位は第四アンモニウム基で誘導体化させるモノマー単位の第２部分を提供する。ｂ単位が存在する場合、ｂ単位はモノマー単位の第３部分を提供し、そこでのアミノ基は第１部分又は第２部分とは違う方法で誘導体化させるか、さもなければ誘導体化されない。
【００１６】
本発明において、疎水基Ｘは、好ましくは、Ｃ４−３０アルキル基のようなアルキル基、Ｃ４−３０アルケニル基などのアルケニル基、Ｃ４−３０アルキニル基ようなのアルキニル基、Ｃ５−２０アリール基のようなアリール基、ステロール（例えばコレステロール）のような２個以上のＣ４−８リング構造を持つ多環疎水基、２個以上のＣ４−８ヘテロ原子リング構造を持つ多環疎水基、ポリオクサブチレン重合体（polyoxa butylene polymer）のようなポリオクサＣ１−４アルキレン基、又は、ポリ（乳酸）基、ポリ（ラクチド・コ・グリコリド）（poly(lactide‐co‐glycolide）基あるいはポリ（グリコール酸）基のような疎水性ポリマ基又はこれらの置換基から選択される。置換基Ｘは、直鎖状でも、分岐状でも、環状でも構わない。置換基Ｘは、ｃ単位（すなわち、Ｃ３で）に直接結合することができ、また、アミン基、アシル基、又はアミド基のような官能基を介してｃ単位と結合し、Ｘ'−環、Ｘ'−ＣＯ−環、Ｘ'−ＣＯＮＨ−環などで表せる連鎖を形成する。ここで、Ｘ'は上に示す疎水基である。
【００１７】
置換基Ｘの好ましい具体例には、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯ−ＮＨ、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＮＨ−あるいはＣＨ３(ＣＨ２)ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ２)ｑ−ＣＯ−ＮＨ−などが包含される。ここで、ｎは４と３０の間の数、より好ましくは、６と２０の間の数であり、ｐとｑは同じでも違っていても構わず、３と１５の間の数、より好ましくは、５と１０の間の数である。置換基Ｘの特に好ましい一群は、例えば、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎＣＯ−ＮＨ−で表せるアミド基を介してキトサン・モノマー単位と結合する。ここで、ｎは４と３０の間の数である。アミド基の具体例は、カルボン酸をキトサンのアミン基と結合させて生成される。好ましい具体例は、ラウリン酸（n＝１０）、ミリスチン酸（n＝１２）、パルミチン酸（n＝１４）、ステアリン酸（n＝１６）又はアラキジン酸（n＝１８）などに基づく脂肪酸誘導体である。
【００１８】
上記の式において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、好ましくは個別に、水素又はＣ１−１０アルキル基から選択され、そのアルキル基は置換されていて構わない。Ｒ１、Ｒ２及び／又はＲ３がアルキル基の場合、これらは直鎖状でも分岐鎖状でもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、個別に、水素、メチル基、エチル基又はプロピル基から選ばれる。
【００１９】
上記の式において、糖ユニットのＣ６に存在するＲ４、Ｒ５及びＲ６は、個別に、水素、置換の又は非置換のアルキル基、置換の又は非置換のエーテル基、もしくは置換の又は非置換のアルケン基から選択される。好ましいＲ４、Ｒ５及びＲ６は、１個又はそれ以上のヒドロキシ基もしくは別の非イオン性親水基で置換されている。Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の具体例は、−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ（ｐは１と１０の間の数、より好ましくは、２と４の間の数）、−(ＣＨ２)ｐ−ＣＨｑ(ＣＨ２−ＯＨ)r（ｐは１と１０の間の数、ｑは０と３の間の数、ｒは１と３の間の数、ｑ＋ｒ＝３）、−(ＣＨ２)ｐ−Ｃ(ＣＨ２−ＯＨ)ｒ（ｐは１と１０の間の数、ｒ＝３）、−(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)ｐ（ｐは１と３００の間の数）である。
【００２０】
上記一般式において、置換基Ｒ７は存在しても不在でも構わない。不在の場合、第四アンモニウム官能基がモノマー単位のキトサン環と直かに結合する。Ｒ７が存在する場合、このものは、非置換の又は置換されたアルキル基（例えば、Ｃ１−１０アルキル基）、−ＮＨ−(ＣＨ２)ｎ−で表示されるようなアミン基、−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−で表示されるようなアミド基のいずれかである。ここで、ｎは１から１０、好ましくは、１から４の数である。置換基Ｒ７−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３の好ましい具体例は、例えば、ベタイン(−ＯＯＣ−ＣＨ2−Ｎ＋(ＣＨ3)3をアミン置換基と結合させること得ることができ、これによりベタイン内に−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３のようなアミド基を形成することができる。
【００２１】
上述したように、本明細書に記載した置換基のいくつかは、当業者にとって周知の１個又はそれ以上の付加的置換基で置換されてよく、置換されなくてもよい。そうした付加的置換基には、一般イ、ハロ基；ヒドロキシ基；エーテル基（例えば、Ｃ１−７アルコシキル基）；ホルミル基；アシル基（例えば、Ｃ１−７アルキルアシル基、Ｃ５−２０アリールアシル基）；ハロゲン化アシル基；カルボキシ基；エステル基；アシルオキシ基；アミド基；アシルアミド基；チオアミド基；テトラゾリル基；アミノ基；ニトロ基；ニトロソ基；アジド基；シアノ基；イソシアン基；シアナト基；イソシアナト基；チオシアナト基；イソチオシアナト基；スルフヒドリル基；チオエーテル基（例えば、Ｃ１−７アルキルチオ基）；スルホン酸(sulfonic acid)；スルホン酸エステル；スルホン基；スルホニルオキシ(sulfonyloxy)基；スルフィニルオキシ(sulfinyloxy)基；スルフアミノ(sulfamino)基；スルホンアミノ(sulfonamino)基；スルフィンアミノ(sulfinamino)基；スルファミル(sulfamyl)基；スルホナミド(sulfonamido)基；Ｃ１−７アルキル基（例えば、非置換のＣ１−７アルキル基、Ｃ１−７ハロアルキル基、Ｃ１−７ヒドロキシルアルキル基、Ｃ１−７カルボキシルアルキル基、Ｃ１−７ヒドロキシルアルキル基、Ｃ１−７アミノアルキル基、Ｃ５−２０アリール−Ｃ１−７アルキル基などを含む）；Ｃ３−２０ヘテロアリール基、さらにはＣ５−２０アリール基（例えば、Ｃ５−２０カルボアリール、Ｃ５−２０ヘテロアリール基、Ｃ５−２０アリール−Ｃ１−７アルキル基およびＣ５−２０ハロアリール基などを含む）が含まれる。
【００２２】
本明細書中で使用する用語"リング構造"は、３個から１０個の共有結合した原子の閉環構造に関係し、共有結合原子の数は、好ましくは３個から８個、より好ましくは５個から６個である。リングは、脂環式環、芳香環のいずれでも構わない。本明細書で言う"脂環式環"は、芳香環でないリングを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用する用語"炭素環"は、環原子がすべて炭素原子であるリングを指す。
【００２４】
本明細書中で使用する用語"炭素芳香環"は、環原子がすべて炭素原子である芳香環を指す。
【００２５】
本明細書中で使用する用語"複素環"は、リングを構成する原子の少なくとも一つが、多原子価のへテロ原子であるリングを意味し、へテロ原子は、例えば、窒素、リン、シリコン、酸素、硫黄などであって、典型的には、窒素、酸素または硫黄である。複素環は、１個から４個のヘテロ原子を有することが好ましい。
【００２６】
上記のリングは、"多環基（multicyclic group）"の一部であって構わない。
【００２７】
上述したように、本発明の高分子ミセル凝集体は個別ミセルの集合体から形成され、平均粒径は２０ｎｍから５００ｎｍである。平均粒径は、顕微鏡または光子相関分光法を使って簡単に測定でき、ろ過前の水溶液で好都合に判断できる。好ましくは、高分子ミセル凝集体の最小平均粒径は少なくとも１００ｎｍ、より好ましくは、少なくとも１７５ｎｍで、最大平均粒径は少なくとも４００ｎｍ以下である。ろ過後の平均粒径は、典型的に、約１００ｎｍから２５０ｎｍの範囲に好ましく減少する。詳細は表１の実施例を参照されたい。
【００２８】
実施例の説明で記載するように、使用した炭水化物重合体は、解重合されてポリマを生成するが、このポリマは爾後の誘導体化で、例えば、疎水基と第四アンモニウム基を含有するようなポリマである。好ましくは、炭水化物重合体は、約１．５kDaから２５０kDaの分子量を有し、より好ましくは、約１．５kDaから１００kDa、さらに好ましくは、約２kDaから２５kDaの分子量を有する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明の高分子ミセル凝集体は、約０．５から６の、より好ましくは、約０．８から４．４の疎水性指標（ＨＩ）を有している。この疎水性指標（ＨＩ）は、炭水化物について疎水性置換基のモルレベルと親水性置換基（第四アンモニウム）のモルレベルを、１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析法を使って計測することで測定され、ＨＩ＝Ｑ/Ｌで与えられる。ここで、Ｑは、単量体あたりの第四アンモニウム基のモル分率であり、Ｌは、単量体あたりの疎水基のモル分率である。
【００３０】
当業者であれば、ポリマ合成と誘導体化反応が精密ではないという事実を理解されよう。結果として、ポリマの任意の試料においては、ポリマに存在するa、b、cモノマー単位のモル比と、試料内の各ポリマのa、b、cモノマー単位の配列について、その大きさに変異がある。従って、上述した範囲と数値はポリマ試料全体としての平均を表す。また、ポリマのモノマー単位の異なる型の順位付けは、規則的なパターンでも、ブロック共重合体としての順位でも、ランダムでも構わない。
【００３１】
さらに、変化したポリマは、１個又は複数の対イオンを含む。典型的に、これはポリマに存在する第四アンモニウム基によるもので、対イオンは、塩化物イオン、ヨウ化物イオン、酢酸イオン、グルタミン酸イオンなどの負の電荷を帯びたイオンである。本書に記載するポリマと化合物は、薬剤として許容可能な塩などの形態であっても構わない。
【００３２】
本発明の別の実施例によれば、前述した高分子ミセル凝集体から成る化合物を提供する。好ましい化合物は、本書に記載した高分子ミセル凝集体と薬剤、より好ましくは、疎水性製剤、とから成る医薬組成物を含む。好ましい実施例による医薬組成物においては、高分子ミセル凝集体は、薬物分子と共にナノ粒子を形成し、このナノ粒子は、約２０ｎｍから２μｍの、より好ましくは、約２０ｎｍから２００ｎｍの平均粒径を有する。
【００３３】
本発明の実施例によれば、従来技術のものと比較して、少なくとも１：１０、好ましくは、１：２０、さらに好ましくは、１：４０のポリマ／薬物のモル比を有利に提供する。超音波処理や混合などのホモジナイズ法または高圧均質化を使ってナノ粒子の形成を行うのに、好都合に薬物を添加しても構わない。
【００３４】
疎水性薬物の例は、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロン、パクリタキセルなどの極性基が欠けた多環リング構造の薬物、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、およびその他の多環化合物などの薬物を含む。
【００３５】
別の実施態様では、本発明は治療で使用するための医薬組成物を提供する。
【００３６】
さらに別の実施態様では、患者に薬物を供給するための薬剤を調製するための高分子ミセル凝集体と薬物の使用を提供する。好ましい具体例では、薬物は水中での溶解度が低い。
【００３７】
図を参照しながら本発明の実施例を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンの構造
【図２ａ】メチルオレンジ溶液内の浅色移動を測定することで立証されたポリマ疎水性と分子量の高分子凝集体への影響を示す。無極環境下では、メチルオレンジは浅色移動を起こす。第１変曲点（矢印A1）で高分子CMCを測定する。ポリマの詳細については、表１の疎水性指標（HI）、近似疎水性親油性バランス（HLB）およびCMCの数値を参照
【図２ｂ】水中におけるE5の凍結割断電子顕微鏡写真（５.０mg mL−1）
【図２ｃ】水中におけるC5の負染色透過電子顕微鏡写真（５.０mg mL−1）
【図２ｄ】自己集合高分子ミセルクラスタの略図
【図３ａ】プロポフォールカプセル化へのパルミトイル化レベルの影響。初期薬物濃度＝１０mg mL−1 、初期ポリマ濃度＝５mg mL−1、＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）、データ表示平均±ｓ．ｄ．
【図３ｂ】プロポフォールカプセル化へのパルミトイルの影響（初期ポリマ濃度＝５mg mL−1、初期薬物濃度＝１０mg mL−1 、●＝Ｇ１９＋プロポフォール、◆＝ＧＥ１＋プロポフォール。ＨＩについては、表１の近似ＨＬＢおよびＣＭＣ数値を参照（利用可能な場合）。Ｇ１９の１モルがプロポフォールの４８モルをカプセル化。試料は室温で保存
【図３ｃ】薬物カプセル化へのポリマ分子量の影響。ろ過後にＨＰＬＣで薬物濃度を測定（０．４５μｍ）。■＝Ｇ１９（５mg mL−1）、□＝Ｇ１９（２．５mg mL−1）、●＝Ｇ４（５mg mL−1）、○＝Ｇ４（２．５mg mL−1）、▲＝水中のプロポフォール、＊＝濃度が５mg mL−1のときのポリマ間の統計的有意差、＃＝濃度が２．５mg mL−1（ｐ＜０．０５）のときのポリマ間の統計的有意差
【図４】プレドニゾロン・フォルテ（Prednisolone Forte）（白いバー、酢酸プレドニゾロン懸濁液、１０mg mL−1、３５μＬ、アラガン、米国）またはプレドニゾロンのＧＣＰＱ（第四アンモニウム・パルミトイル・グリコール・キトサン）製剤（黒いバー、Ｇ２−１mg mL−1、ＮａＨＣＯ３−０．０１Ｍ、プレドニゾロン−１mg mL−1、３５μＬ）を投与されたウサギの房水、＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。 プレドニゾロン製剤の負染色透過電子顕微鏡写真
【図５】雄のマウスMF1への尾静脈投薬後のプロポフォール製剤の薬理学的活動（睡眠時間、平均±ｓ．ｄ．、ｎ?４）。マウスへは以下のように投与：（i）０．２mg：リン酸緩衝食塩水（PBS、ｐＨ=７．４）で２mg mL−1に希釈したプロポフォール乳剤（１０mg mL−1、フレゼニウス、ドイツ）あるいはろ過GCPQ製剤（ｐＨ=７．４のPBS中、Ｇ１９−５mg mL−1、プロポフォール１．９mg mL−1）として、容積１００μLに対して０．２mgのプロポフォールをマウスへ投与（ii）０．４mg：４mg mL−1濃度にグリセロール（図５ｂに記載した製剤０．２４Ｍ−ＴＥＭ）で希釈したディプリバンあるいはプロポフォールのろ過GCPQ製剤（図５ｃに記載した製剤０．２４Ｍ−ＴＥＭのグリセロール中、Ｇ４１−５mg mL−1、プロポフォール４．２mg mL−1、レシチン２mg mL−1）として、容積１００μLに対して０．４mgのプロポフォールをマウスへ投与（iii）０．５mg：ディプリバン（１０mg mL−1）あるいはプロポフォール乳剤（フレゼニウス、１０mg mL−1）として、容積５０μLに対して０．５mgのプロポフォールをマウスへ投与。 正向反射の消失時間は低用量の市販乳剤を投与されたマウスにのみ観察された（０．２フレゼニウス、マウスにおいて、０．３７±０．１９分）。ポリマのみを投与されたマウスに睡眠時間は記録されなかった。＊＝統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ａ】炭水化物製剤の経口投与後のシクロスポリンA(CsA)の血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝６．７：１。＊＝水中のCsAとの統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ｂ】炭水化物製剤の経口投与後のCsAの血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝１０：１。＊＝水中のCsAとの統計的有意差（ｐ＜０．０５）
【図６ｃ】炭水化物製剤の経口投与後のCsAの血中濃度。マウスに７．５mg ｋg−1のCsAと薬物を投与。ポリマ比＝１３．３：１
【図７】GCPQ−CsA製剤からのCsA回復率。平均値に統計的有意差は認められない（ｐ＞０．０５）
【図８】多様なGCPQ−CsA錠剤からのCsA放出特性（ｎ＝３、平均±SD）
【発明を実施するための形態】
【００３９】
[疎水性薬物]
本発明のミセルポリマ凝集体は薬物、特に、疎水性薬物を溶解するのに使用できる。本明細書で使用する用語"疎水性薬物"は、水中でごく僅かにしか溶解しない薬物を含む。英国薬局方が使用する定義によれば、"ごく僅かな溶解性"は、１ｇの物質を溶解するのに１０００ミリリットルを超える溶媒（例えば水）を必要とするか、または、１．０mg ｍL−1未満の水溶解度を有する物質を示す。
【００４０】
疎水性薬物の例としては、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロン、パクリタキセルなどの極性基が欠けた多環リング構造の薬物、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、およびその他の多環化合物などの薬物が挙げられる。好ましい疎水性薬物は、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリンを含む。プレドニゾロンは、合成副腎コルチコステロイドで、例えば、眼の抗炎症薬として使用される。プロポフォールは、成人及び三歳以上の小児患者の全身麻酔の導入；成人及び生後２ヶ月を超えた小児患者の全身麻酔の維持；および集中治療室で挿管された人工呼吸器装着患者の鎮静作用に使用される短時間作用型の静脈麻酔薬である。シクロスポリンは、免疫抑制剤である。これは、同種臓器移植後に患者の免疫システムの活動を抑え、すなわち、臓器拒絶反応のリスクを減少させることが広く知られている。皮膚、心臓、腎臓、肺、膵臓、骨髄及び小腸の移植分野で研究されている。シクロスポリンは、真菌ヒポクラジアム・インフラタムガムス（fungus Hypocladium inflatum gams）から生成される１１個のアミノ酸の環状非リボソームペプチド（１１角形ペプチド）である。
【００４１】
[投与経路と製剤処方]
医薬組成物の投与経路は、経口及び直腸経由を含む胃腸投与；注射、パッチ、クリームなどを含む非経口投与；鼻、吸入、ペッサリー経由を含む粘膜投与を含むが、これに限定されるものではない。好ましい実施例では、非経口投与、経口投与、局所性投与で医薬組成物を投与する。
【００４２】
上述した高分子ミセル凝集体及び薬物に加えて、医薬的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液、安定剤、又は、当業者に公知のその他の成分を医薬製組成物に含んでも構わない。こうした成分は毒性がなく、医薬組成物の効果を妨げないものとすべきである。担体およびその他の成分の特徴を非経口、経口または局所性などの投与経路によって決定できる。
【００４３】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液状とすることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバンドなどの固体担体を含んでも構わない。液状の医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物油、植物油、鉱油、合成潤滑油などの液体キャリアを含む。生理食塩水、デキストロース又はその他のサッカリド溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレン・グリコールなどのグリコールを含んでも構わない。
【００４４】
静脈注射、皮膚注射、皮下注射や痛みのある場所への注射の有効成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性および安定性を備えた非経口的に許容される水溶液の形態とする。当業者であれば、例えば、注射用塩化ナトリウムなどの等張賦形剤を使って適当な溶液を調製することができよう。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、及び／又はその他の添加剤を含んでも構わない。
【実験】
【００４５】
[序論]
本発明は、炭水化物凝集体が個別凝集体の組織化ミセルクラスタに階層的に凝集し、これらのミセルクラスタがモル重合体／疎水性薬物比が１：６７（薬物／ポリマ重量比は０．８：１）という安定ナノ粒子に転換可能で、この比率は、プルロニック・トリブロック・ブロック共重合体（Pluronic triblock block copolymers）で得られるレベルの２０倍という予期しない発見に基づいている。
【００４６】
また、これらのミセルクラスタは、指標によって、生物学的障壁を超えて、疎水性薬物の転換を１０進法で一桁（an order of magnitude）改善する。
【００４７】
両親媒性炭水化物重合体で形成されたミセルクラスタは、ミセル（文献５，２２）、ベシクル（文献２３，２４）、およびブロック共重合体やグラフト両親媒性高分子のところで記載した濃厚非晶質ナノ粒子（文献２２，２５，２６）とは区別される。これは、例えば、ろ過前のミセルクラスタのサイズが１００−４００ｎｍで、ろ過後（４５μｍ）は１００−３００ｎｍになるという事実から推定できる。対照的に、ブロック共重合体で形成した従来の単一ミセル物質の直径は、例えば、１２−３６ｎｍ（文献２９，３０）であり、直径２５ｎｍの単一ミセルとしてコレステリル・プルランも存在すると考えられている（文献３１）。
【００４８】
より小型の１０−３０ｎｍ程度の凝集体と疎水性ドメインのナノ粒子から成るミセルクラスタと薬物の結合能力は、脂質誘導体化の程度と炭水化物の分子量を変えることで調整できる。
【００４９】
炭水化物プロポフォール製剤の静脈注射では、モデル薬物の薬理作用を、市販の粗い乳剤と比べて１０進法で一桁高めることができる。炭水化物プレドニゾロン製剤の眼球への局所使用では、房水で見つけた薬物の初期レベルが１０倍量のプレドニゾロン懸濁液を使用したときのものと類似していた。従って、これらの新規な高分子ミセルクラスタは疎水性薬物の生体利用効率を高めるのに使用できる。
【００５０】
水溶解度が限られた、または、皆無の薬物は、水溶解度の高い薬物と比べて大量に投与する必要がある。従って、限られた水溶解度または非水溶性の薬物の生体利用効率を高める担体化合物の提供が製薬業界では極めて重要である。こうした担体化合物の利点は、任意の病状治療を目的とする、限られた水溶解度または非水溶性の薬物の動物への投与量を削減できることにある。
【００５１】
[原料と方法]
[第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン]
後述の従来技術による方法（文献２０）を修正して第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（GCPQ）試料を合成した。特に断らない限り、全ての試薬は、英国のシグマアルドリッチ社（Sigma Aldrich Co.）から供給されたものをそのまま使用した。有機溶媒は、ストラスクライド・ユニバーシティ（University of Strathclyde）の純正応用化学学部から提供を受けた。１H NMR（２ppmでシグナル）を用いた検出レベルを下回るアセチル化度を有するグリコール・キトサン（GC−Mw−２５０kDa）を５０℃の塩酸溶液中（４M）で４８時間加熱することで分解し（文献２３）、１０−１５kDaのGC試料を得た。択一的に、従来技術に記載された方法によるGC分解（文献４７）を応用して４kDaのGC試料を調製した。GC（Mw−２５０kDa、１ｇ）は酢酸（２．５％V/V、５０mL）中で分解させた。溶液を介して５分間N2ガスを泡立てることで溶存酸素を溶解した。０−４℃に冷却後、新しく調製したNaNO2（９．５mg mL−１、２mL）溶液を加え、暗闇の中で攪拌せずに、１５時間、４℃で化学反応を進行させた。生成物を濃縮アンモニア水で中和した。こうして得た混合物にNaBH4（２０mg）を加えて分割し、反応混合物を攪拌しながら室温で一晩放置した。その後、アセトン（１５０mL）を加えて、室温で生成物を慎重に沈殿させた。こうして得た沈殿物を遠心分離（９０００ｇ×１０分間）し、メタノール（５０mL）で３回洗浄し、水中で再び溶かし、後述するように完全に透析し、透析物を凍結乾燥させた。収量は４００mgであった。
【００５２】
分解したGC（３００mg）を重炭酸ナトリウム溶液（０．０５７M）中で溶解し、表１に記載したレベルでパルチミン酸N−ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccinimide）（１２０mL）を添加し、混合物を７２時間攪拌した。減圧下蒸発でエタノールを除去し、反応混合物をジエチルエーテル（３×１００mL）で抽出した。粗製パルミトイル・グリコールキトサン（PGC）をヨウ化ナトリウムのN−メチルピロリドン溶液中（０．０１１M、９０mL）で攪拌しながら一晩溶かし、この溶液に水酸化ナトリウムのエタノール溶液（０．２５M、１８mL）と表１に記載したレベルのヨウ化メチルを加えた。窒素ガス下のもと、３６℃で４時間混合物を攪拌し、ジエチルエーテル中（４００mL）で生成物を沈殿させ、ジエチルエーテル中（２×３００mL）で２回洗浄した。こうして得た生成物を水中（１００mL）で溶かし、含水塩化ナトリウム水溶液（０．１M、５L）で完全に透析し、プロトン化した重合体（キトサンpKa〜７）または重炭酸ナトリウム（０．０１M）と塩化ナトリウム（０．１M）を含む水溶液（５L）を得た。後者から脱プロトン化ポリマが得られる。前記の透析媒質を３回交換し（４．５時間）、水（５L）を６回交換しながら、さらに透析を行った（２４時間）。全ポリマの合成収量は最大１２０mgであった。G19については、プロトン化したものと脱プロトン化したものを調製した。その他の全ポリマを、水（５Lを６回交換、合計２４時間）で透析し、塩化物イオン（IRA９３ Cl−１）で平衡化させたイオン交換カラムを通過させた（文献２０）後に、凍結乾燥した。
【００５３】
分解したGCの分子量をマルチアングル・レーザー光散乱を利用したゲル浸透グラマトグラフィ（文献２３）で測定した。パルミトイルメチルプロトン（０．８ｐｐｍ、パルミトイル）および第四アンモニウムメチルプロトン（３．３５ｐｐｍ、第四アンモニウム・グリコール・キトサン）をそれぞれ糖メチンプロトン（３．１及び３．５−５．５ｐｐｍ）と比較すること（文献２０）で１Ｈ ＮＭＲによりパルミトイル化とメチル化を測定した。式２を使って、疎水性指標を計算した：
ＨＩ=Ｑ/Ｌ ２
式中、Ｑ＝単量体あたりの第四アンモニウム基のモル分率、Ｌ＝単量体あたりのパルミトイル基のモル分率を示し、ＨＬＢ（４，４８）の近似値を式３を使って求めた：
式中、Ｍ1＝第四アンモニウム糖単量体の分子量、Ｍ2＝アミノ糖単量体の分子量、Ｍ3＝ＣＨ２ＣＯ-アミノ糖単量体の分子量、Ｍ4＝テトラデシル部分の分子量をそれぞれ示す。
【００５４】
[ポリマ凝集および薬物カプセル化]
メチル・オレンジは、ポリマ凝集から得るのと同じような（文献２２）、極性領域から無極性領域への長い波長域の浅色移動を経ることでソルバトクロミック・プローブとしての役目を果たす（文献２２，２７）。メチル・オレンジのアルカリ溶液を使用して、ポリマ水溶液濃度を上昇させながら浅色移動の度合いを測定すること（文献２２）により、ポリマ凝集を証明した。最大吸収−濃度曲線のメチル・オレンジ波長における第１変曲点をCMCとした。モルCMCデータを取得するために、ＧＣＰＱ ＮＭＲおよびＧＣ ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳデータを使ってポリマ分子量を計算した。光子相関分光法を使ってろ過（０．４５μｍ）前後の凝集体サイズを記録した（文献２５）。凍結割断電子顕微鏡法（文献４９）と負染色透過電子顕微鏡法（文献２３）を両方使って、凝集体の画像を記録した。
【００５５】
薬物と水媒体中のポリマの混合物を超音波分解（文献２５）するプローブによって、凝集体へ薬物を取り込んだ。凝集体に含まれる薬物レベルを、凝集体のろ過（０．４５
μｍ）後に測定し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分析した。プレドニゾロンについては、ポリマ／薬物試料をろ過し、移動相（水／アセトニトリル ６４０mL：３６０mL）で希釈し、移動相の流動速度が１mL min−１の３．５μｍC18カラム対称性の逆相（４．６×７５mm、英国、ウォーター・インスツルメンツ：Waters Instruments）を経てクロマトグラフ化した。ウォーター５１５等張ポンプ（waters 515 isocratic pump）とウォーター７１７自動サンプラー（waters 717 autosampler）を使ってクロマトグラフを得、試料検出には、ウォーター４８６可変波長紫外線波長検出器（waters 486 variable wavelength ultraviolet wavelength detector）（λ＝２４３nm）を用いた。内部標準は６α−メチルプレドニゾロン（５０ng mL−１）で、検出限界は５ng mL−１であった。１０−２５０ng mL−１領域の線形ピーク面積における比率−濃度曲線の相関係数は０．９９９１であった。プロポフォールについては、ポリマ／薬物試料をろ過し（０．４５μｍ）、移動相（水／アセトニトリル ２００mL：８００mL）で希釈し、１mL min−１の移動相流動速度を有する５μｍのODS2カラム（ODS2 5μｍ column）（４．６×２５０mm、英国、ウォーター・インスツルメンツ：Waters Instruments）を経てクロマトグラフ化した。波長を２２９ｎｍに設定した以外は前記のものと同じ器具を使用した。検出限界は０．２５μｇ mL−１であった。１−２５０μｇ mL−１領域の線形ピーク面積における比率−濃度曲線の相関係数は０．９９９７であった。
【００５６】
[統計]
スチューデントｔ−検定を使って統計分析を行った。有意差は、ｐ値が０．０５を下回るかどうかで判断した。
【結果】
【００５７】
[炭水化物両親媒性物質の合成]
酸による分解で得た3つの分子量を備えるグリコールキトサン（GC）試料（表1）を使って両親媒性重合体を調製した。第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（GCPQ）試料の合成（図１）は、１H NMR（文献２０）（０．９０ppm＝CH3−パルミトイル、１．２５ppm＝CH2−パルミトイル、１．６０ppm＝CH2−パルミトイルβからカルボニル、２．２５ppm＝CH2−パルミトイルαからカルボニル、３．０２ppm＝CH3−モノメチルおよびジメチルアミノ、３．１２ppm＝CH−C2非置換グリコールキトサン、３．３５ppm＝CH3−トリメチルアミノ、３．５−５．５ppm＝CHグリコールキトサン）で確認した。多様なレベルのパルミトイル化および四級化で１３個の異なる両親媒性物質を調製した（表１）。
【００５８】
ヨウ化メチル／GCの重量比を１４．１４又はそれ以下に保つ限り、メチル第四アンモニウムレベルの大半も同程度に維持する一方、パルミチン酸N−ヒドロキシスクシンイミド（PNS）の供給率を制御することでパルミトイル化レベルを粗調整した。
【００５９】
[自己集合]
メチル・オレンジ（文献２２，２７）を使って、ポリマ凝集を証明した（図２a）。疎水性ポリマ（疎水性指標[HI]＝１−２、疎水性親油性バランス[HLB]＝１７−１８）が増えるほど、安定した凝集が生じることが低ＣＭＣｓで証明された（＜１０μＭ、図２ａ、表１）。疎水性ポリマが増えると、より多数の無極性疎水性コアが生成されることも、ミセル形成後のメチル・オレンジの浅色移動の度合いから明らかである（最大λ＜４３０ｎｍ、表１）。ポリマ凝集体は、直径が１００−３００ｎｍ（表１）で、先のの文献（文献２８）が開示する単分子凝集のサイズとは一致しない。凍結割断および負染色透過電子顕微鏡はいずれも、理論の制限を受けることなく、直径１０−３０ｎｍのより小さな集合体クラスタがより大きな集合体に階層的かつ組織的に凝集（図２ｂ、２ｃ）することを示す。こうした構造は図２ｄで記載するモデルと一致する。このクラスタ配置は、通常の両親媒性重合体の凝集とは異なる。ブロック共重合体ミセルにおいては、例えば、単一ミセルの集合体の直径は、通常、１２−３６ｎｍ（文献２９，３０）で、コレステリルプルランから調製されるミセルも、直径２５ｎｍの単一ミセルとして存在すると考えられている（文献３１）。
【００６０】
より低いＨＬＢｓを備えるその他の両親媒性物質で記録されたＣＭＣ値と比較しても、本発明によるポリマのモルＣＭＣｓは、例えばＦ１２７のように、その他の両親媒性凝集体より本発明の凝集体の方がより安定性が高いことを示す（表１および２）。本発明によるポリマのＣＭＣｓは、プルロニックブロック共重合体Ｆ１２７（ＨＬＢ＝１４、ＣＭＣ＝５５０μ（文献６））およびポリソルベート（ＨＬＢ＝１６．７、ＣＭＣ＝５３μＭ（文献４））で記録されたものと比べて１０進法の指標で１桁から３桁異なる。
【００６１】
理論の制限を受けることなく、発明者は、このより好ましい凝集現象が図２ｄで提案したモデルと一致すると考えた。これは、ミセル形成に伴う水構造の喪失に加えて、多数のポリマ間およびポリマ内の疎水結合及び水素結合を形成するポリマの能力が凝集に関連するエントロピー利得に貢献しているであろうと考えたためである。さらに、分子量の増加が凝集に有利に働く（図２ａ）。改めて、この観察結果は、多数の分子間および分子内の接触がミセルクラスタを安定させるという仮説と矛盾しない。
【００６２】
[薬物の取り込み]
より多くの無極性領域の形成は、疎水性薬物のカプセル化に有利に働く。従って、疎水性ポリマが増えると、より大量の薬物をカプセル化できる（図３ａと３ｂ）。カプセル化のレベルが高い：５mg mL−１Ｇ４２（表１）と、４．４３±０．１２mg mL−１のプロポフォールをカプセル化できる。プロポフォールのようにログＰの高い薬物の結合（incorporation）では、ミセルクラスタをナノ粒子製剤に変換（transformed）した。プロポフォール（ログＰ＝４．１）を用いると、電子顕微鏡写真で密度の高い粒径５０−１５０ｎｍと見られる粒子のミセルクラスタからより粒径の大きい粒子を得た（図５ｃ）。一方、膨張した粒子薬物とミセルクラスタの混合物から成るプレドニゾロン（ログＰ＝１．４）を用いると、粒径が１０−１００ｎｍの等方性液体が得られた。（差し込み図４ｂ）。
【００６３】
我々は、コレステロールなど疎水性分子（文献２２）の存在下では、ポリ（エチレンイミン）両親媒性凝集体の数が上昇することを発見した。我々は、理論の制限を受けることなく、より多くの疎水性薬物が存在すると、ポリマ集合は、ミセルクラスタからより濃度の高いナノ粒子に移行すると仮定した。炭水化物製剤のプロポフォールレベルを少なくとも３０日間、初期値の７５％以上に維持する（図３ｂ）。アルカリ媒体でポリマを透析することでアミン基のイオン化を抑えると、薬物のカプセル化レベルが高まることを表３は示す。凝集工程の初期段階の中心となる静電反発力の克服に伴う作業を除去することで、薬物カプセル化レベルが高まる。
【００６４】
ポリマ疎水性の上昇に伴う薬物カプセル化の上昇は、ブロック共重合体で観察されてきた（文献３２、３３）。しかし、疎水性薬物の存在下で、ブロック共重合体からナノ粒子が形成されることは、我々が知る限り、報告されていない。従って、本発明による両親媒性物質の新規な特長とみなされる。例えば、プロポフォールとＦ１２７（１．７８mg mL−１プロポフォール及び４０mg mL−１Ｆ１２７）は、直径が２０−４０ｎｍのミセルを形成する（文献３３）。
【００６５】
ポリマHLB／HI（表１、図２a）に加えて、ポリマの分子量もミセルの安定性に影響を及ぼす。分子量が増えると、ミセルの安定性が増し（図２a）、この安定性の改善は、薬物カプセル化の分子量の影響力に反映される（図３ｃ）。分子量が２．５倍高まると、薬物／ポリマのモル比が１０倍になる（表２）。従来の理論に囚われることなく、この観察結果は、多数の疎水性分子間および分子内の接触は長いポリマ鎖があって初めて可能になるため、図２ｄで提案するモデルと矛盾がない。
【００６６】
これらの炭水化物薬物ナノ粒子は、ブロック重合体を超える主要な利点がある。すなわち、モル薬物カプセル化レベルは、少なくとも従来のものより１０進法で一桁高い（表２、図３）。従来の理論に囚われることなく、これらの優れた薬物カプセル化レベルは凝集の本質によるものであると我々は提案する。ちなみに、ミセルクラスタの形成は、単一ミセルの形成とは異なる。
【００６７】
疎水性物質を水媒体と結合させるときの両親媒性物質の効率だけでなく、水媒体と結合できる薬物の最大レベル、すなわち、臨床的関連パラメータを検討することも重要である。後者についてもブロック共重合体システムと比較した（表２）。これらの炭水化物両親媒性物質で得た薬物の取り込みは、有利に、４５％ｗ／ｗに達し、疎水性薬物で取り込んだ他のポリマ粒子で得られたものより高かった（文献１９，３４，３５）。
【００６８】
疎水性炭水化物に関する過去の研究は、その粘性強化特性（文献３６−３８）、ゲル形成能力（文献２０，３９）、非水溶性集合（aqueous insoluble aggregates）（２１，２３，３１，４０−４３）に焦点を当ててきた。水溶性炭水化物両親媒性凝集体（文献２０，２１，２８）に関し、超微細構造及び／又は生体利用効率の増強効果という特長は何ら報告されていない。我々は、ここに初めて、動的光散乱を根拠として裏付けられる顕微鏡写真によって、凝集挙動がミセルの階層的組織体への自己忌避コロイドクラスタ化（self repellent colloidal clusters）を伴うことを証明する。
【００６９】
[炭水化物薬物担体による生体利用効率の増強]
図４と５は、新規な炭水化物粒子が生物学的障壁を克服して、薬物をデリバリするデータを示す。これらの炭水化物製剤を使用すると薬物の生体利用効率が極めて有意に高まることが分かる。眼の抗炎症薬プレドニゾロンと静脈麻酔薬プロポフォールの２つのモデル薬物を選択した。眼への局所使用では、炭水化物両親媒性で調整したプレドニゾロン０．３５mgを含む房水と３．５mgのプレドニゾロンを含むプレドニゾロンフォルト(r)（Prednisolone Forte(r)）を使って調製した薬物とでは初期の時点で統計的に区別できない。製剤の安定性を損なわないために、プレドニゾロンフォルトの希釈は行わなかった。硝子体液内のいずれのプレドニゾロン製剤でも薬物を検出しなかった。これらの炭水化物ナノ粒子は、角膜を越えて房水までの薬物吸収を促進するが、眼底への薬物のデリバリはできない。しかし、局所投与であることと薬物の特長を鑑みれば、驚くに当たらない（文献４４）。
【００７０】
炭水化物プロポフォール製剤で得られる睡眠時間は市販のフレゼニウス（Fresenius）またはディプリバン製剤(r)（Diprivan(r)）がもたらす睡眠時間の最大で１０倍である。動物が注射投与時間の終了までに眠ってしまったため、ＧＣＰＱ製剤による復元反射時間の喪失は記録できなかった（図４ｂ参照）。血液脳関門を越えての中枢作用薬のデリバリは迅速で効率的であることを示している。製剤を比較するために、睡眠時間を１分増やすのに必要なプロポフォールの用量を比較した。プロフォール０．２mgの場合、フレゼニウスとＧ１９製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、０．４２６mg mL−１と０．０３２mg mL−１（０．１mL用量当たり）で；プロフォール０．４mgの場合、ディプリバンとＧ４１製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、０．１３４mg mL−１と０．０２３mg mL−１（０．１mL用量当たり）で；プロフォール０．５mgの場合、希釈していない（１０mg mL−１）フレゼニウスとディプリバン製剤を使ったときのマウス当たりの数値は、それぞれ、１５２mg mL−１と１１１mg mL−１（０．０５mL用量当たり）であった。速やかな導入が望ましいため（文献４５）、この戦略は麻酔誘発のメリットをプロポフォールにもたらす一方、これらの実験は、本質的に、この技術が行動変容療法または特定の脳疾患治療のための中枢神経系デリバリに好都合であることを示す。
【００７１】
目下の研究は、これらの炭水化物両親媒性物質が中枢神経系への、または、角膜を超えての薬物デリバリを改善するメカニズムを完全には解明していない。しかし、中枢神経系については、製剤の物理的特性を分析することで明らかになるかもしれない。ディプリバンを使った（図５ｂ）市販のプロポフォール製剤の粒径および粒度分布は、炭水化物製剤のものと比べて、大きかった（図５ｃ）。図５ｃに記載の製剤はろ過してあるが、市販の乳剤と比較して、ろ過していない炭水化物製剤の生体利用能に効率向上は見られない（データ省略）。高分子凝集体のろ過は粒径を減少させるため（表１）、既知の理論に囚われることなく、我々は、減少した粒径がこれらの炭水化物ナノ粒子の薬物デリバリ活動に多少とも関係があるとの仮説を立てた。
【００７２】
さらに、プロポフォールの遊離脂質製剤が効率の上昇を伴うことが報告されている（文献４６）が、これは、脳への分割に役立つ血中の脂質貯蔵の欠落によるものと見なされる。炭水化物製剤による血中の脂質貯蔵の欠落がここで観察された本製剤の効率上昇をもたらしている可能性がある。
【００７３】
結論として、炭水化物両親媒性物質を合成すると、ミセルクラスタへと自己集合し、これが疎水性薬物分子のデリバリ能力を高め、生物学的障壁を越えて薬物分子をデリバリ、すなわち、生体利用効率を高めることを見出した。本発明の技術は、疎水性薬物の製剤処方の課題を解決する。
【００７４】
[ベタイン基により両親媒性炭水化物の合成]
単位当たりの第四アンモニウム基と置換した四級化ベタイン基で炭水化物両親媒性物質の変異体を合成した。後述する誘導体化炭水化物の一部はａ単位とｃ単位から成り、本発明の実施例の一部に存在するｂ単位は除外した。
【００７５】
[オレイルベタイン・グリコールキトサン及びパルミトイルべタイン・グリコールキトサンの合成と特性解析]
〈グリコールキトサンの分解〉
グリコールキトサン（GC）１．５ｇを１１０mｌ４M HCL中で分解し、振とう水槽内で４８時間、５０℃に保持した。５Lの水で透析（６回交換）し、透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体（５２３mg）を得た。
【００７６】
〈ベタインのグリコールキトサンへの接合〉
０．１２９ｇのベタインを１０ｍｌの水で溶解した。 これに１．０ｇN−エチル−N'−（３−ジエチル・アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDAC）を加え、反応物を１５分間攪拌した。次に、４０ｍｌの蒸留水にGC０．３６g（MW〜１５−２１ｋDa）を加え、反応物をさらに２４時間、２５℃で攪拌した。水溶液にＨＣｌを加え、最終濃度を０．１Mとし、反応物をさらに３０分間攪拌した。 反応液を５Lの水で透析（６回交換）した。透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体を得た。収量は３９１mgであった。
【００７７】
〈オレイル基のベタイン・グリコールキトサンへの接合〉
ベタイン・グリコールキトサン（GCB、１８０mg）を２０ｍｌの水に溶かし、重炭酸ナトリウム液（水２０ｍｌ中、１５０mg）と混合し、無水エタノール（３０ｍｌ）を加えた。オレイン酸N−ヒドロキシ・スクシンイミドのエタノール溶液（ONS、５mg mL−１、３０ｍｌ）をこの水溶液に滴下(added drop wise)し、混合液を７２時間室温で攪拌した。減圧下でエタノールを蒸発させ、ジエチルエーテルで抽出（３回、各６０ｍｌ）し、５Lの水で透析（６回交換）し、凍結乾燥させて、オレイルベタイン・グリコールキトサン（GCBO）を得た。収量は７２mgであった。
【００７８】
〈パルミトイル基のベタイン・グリコールキトサンへの接合〉
GCB（１８０mg）を２０ｍｌの水に溶かし、重炭酸ナトリウム液（水２０ｍｌ中、１５０mg）と混合し、無水エタノール（３０ｍｌ）を加えた。パルミチン酸N−ヒドロキシ・スクシンイミドのエタノール溶液（PNS、５．２８mg mL−１、３０ｍｌ）をこの水溶液に滴下し、混合液を７２時間室温で攪拌した。減圧下でエタノールを蒸発させ、ジエチルエーテルで抽出（３回、各６０ｍｌ）し、５Lの水で透析（６回交換）し、凍結乾燥させて、パルミトイルベタイン・グリコールキトサン（GCBP）を得た。収量は７６mgであった。
【００７９】
[オレイルベタイン・グリコールキトサン及びパルミトイルべタイン・グリコールキトサンの特性解析]
緩衝酢酸溶液を移動相として利用し、マルチアングル・レーザー光散乱およびゲル浸透グラマトグラフィ（GPC/MALLS、MiniDawn、Wyatt、米国）によって分解グリコールキトサンの分子量を測定した（文献２３）。
ブルーカー（Bruker）AMX４００MHｚ分光計を使って１H NMRスペクトルを記録した（Bruker Instruments、英国）。解重合グリコールキトサンの溶剤としてD2Oを用い、誘導体化ポリマとしてCD3ODを使った。
【００８０】
〈UV可視分光光度法〉
メチル・オレンジ溶液（２５μM）をホウ酸塩緩衝剤（０．０２M、ｐH９．４）で調整し、プローブ超音波処理で高濃度GCBOおよびGCBP（１５mg mL−１）を調整するための希釈剤として用いた。これらのGCBOとGCBP製剤を引き続きメチル・オレンジ溶液で希釈し、希釈物を室温で１時間培養した後、UV分光光度計（UNICAM UV３００、Thermo Spectronic、英国）を使って紫外線吸収スペクトルを記録した（３００−６００nm）。
【００８１】
〈等温滴定熱量計〉
水中のGCBO製剤（２mg／ml）とGCBP製剤（１．９２mg／ml）をプローブ超音波処理で調整し、マイクロ等温滴定熱量計（MICROCALTM VP−ITC、英国）を使って非ミセル化エンタルポグラムス（demicellisation enthalpograms）を記録した。
【００８２】
〈動的光散乱〉
粒径と表面電荷を、ゼタサイザー(Zetasizer)3000HS（Malvern Insturments, Worcs., 英国）を使って、２５℃で測定した。散乱光を９０℃の角度で検出した。全ての試料は、ろ過前に薄膜フィルタ（細孔径：４５０ｎｍ、ミリポア）を通過させた。
【００８３】
〈グリコールキトサンの分解〉
４M HClを使って、４８時間、グリコールキトサンを分解した。ゲル浸透クロマトグラフィで測定した分解GCの分子量は１５ｋ−２１ｋDaであった。
【００８４】
〈ベタインのグリコールキトサンへの接合〉
ポリマのベタインレベルを１Ｈ ＮＭＲを使って測定し、四級化ベタインＣＨ３基（?３．1、９Ｈ）の糖類（Ｈ−2からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する比率を計算した。ベタインに接合したモノマー単位のモル比が０．１２２であることを見出した。
【００８５】
〈ベタイン・グリコールキトサンへのオレイル基またはパルミトイル基の接合〉
パルミトイルまたはオレイル鎖ＣＨ３基（?０．８８０、3Ｈ）の糖類（Ｈ−2からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する比率を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使ってベタイン・グリコールキトサンへ接合したオレイルまたはパルミトイル基のレベルを測定した。オレイルベタイン・グリコールキトサンのオレイル基に接合するモノマー単位のモル比が０．１９８であることを見出した。また、パルミトイルべタイン・グリコールキトサンのパルミトイル基に接合するモノマー単位のモル比が０．２９６であることも見出した。
【００８６】
〈ＧＣＢＯ及びＧＣＢＰの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）〉
等温滴定熱量計（ＩＴＣ）およびＵＶ／ＶＩＳ分光光度法｛しがい ぶんこう こうど ほう｝によって、ＧＣＢＯ及びＧＣＢＰの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を測定した。後者はプローブとしてオレンジ・メチルを使っている。ＩＴＣを使って測定したＧＣＢＯとＧＣＢＰのＣＭＣｓは、それぞれ、２．４mg mL−１と０．７８mg mL−１であった。この差は、異なる方法を使用したことに起因する。全ＣＭＣデータを表５に記載する。
【００８７】
【００８８】
〈ＧＣＢＯとＧＣＢＰ凝集体の大きさの測定〉
ＧＣＢＯとＧＣＢＰ凝集体の粒径と表面電荷を表６に記載する。ＧＣＢＯ試料では２つのピークを検出し、これは、このポリマについて２つのタイプの凝集体が形成されたことを示す。ＧＣＢＰ試料では１つの広範なピークだけを検出した。どちらのポリマ試料も、ホウ酸塩緩衝液より水中の方がより大きな凝集体を形成した。これは、ｐＨ値の低い正電荷ポリマの電荷反発と、全粒子が僅かに正のゼータ電位を有するためと考えられる。
【００８９】
【００９０】
[第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサンと第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン合成の代替方法]
〈ＧＣの四級化〉
４Ｍ ＨＣＬ（４８時間の代わりに１５時間とした以外は上記と同じ）で分解したＧＣ０．７５ｇを２mg mL−１のヨウ化ナトリウムを含むＮ−メチルピロリドン２２５ｍｌ中で２時間攪拌した。エタノール水酸化ナトリウム４５ｍＬ（１０mg mL−１）と、ヨウ化メチル４．６ｍＬを加えた。３６℃の窒素下で混合液を４時間攪拌した後、過剰ジエチルエーテルを使って沈殿させた。ジエチルエーテルで沈殿物を洗浄し、続けて、エタノールで洗浄し、水で再溶解し、５Ｌ 0.1M NaCl（３回交換）と水５Ｌ（６回交換）で透析した。透析物を凍結乾燥させて、白色の繊維状固体としてＧＣＱを得た。収量は２８２ｍｇであった。
【００９１】
〈オレイル基またはパルミトイル基の第四アンモニウム・グリコールキトサンへの接合〉
ＧＣＱへのオレイル及びパルミトイル接合を調製するのに、ＧＣＱ（１３４ｍｇ）を使用した。ベタイン・グリコールキトサンのオレイル及びパルミトイル誘導体の調製に利用した方法と類似の手法を用いた。第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサン（ＧＣＱＯ）の収量は１６５ｍｇで、第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン（ＧＣＱＰ）の収量は８７ｍｇであった。
【００９２】
〈ＧＣＱＯとＧＣＱＰの特性解析〉
グリコールキトサンの分子量と置換レベルを測定するのに、マルチアングル・レーザー光散乱と１Ｈ ＮＭＲ分光分析をそれぞれ利用したゲル浸透グラマトグラフィを使って、前記と同様にＧＣＱＯ及びＧＣＱＰの特性解析を行った。
【００９３】
[結果]
〈グリコールキトサンの分解〉
グリコールキトサンの分子量は、１７−２１ｋＤａであった。
【００９４】
〈グリコールキトサンの四級化〉
第四アンモニウムメチルプロトン（ＣＨ３、δ３．３１、３Ｈ）と糖メチンプロトン（Ｈ２からＨ１１、δ３．５−４．５、１０Ｈ）レベルとの比率を計算するために、１HNMRを使ってポリマの四級化レベルを測定した。モノマー単位当たりの第四アンモニウム基のモル比は０．０９７であった。
【００９５】
〈第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサン及び第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン中のオレイルレベルとパルミトイルレベル〉
オレイル置換基のＣＨ＝ＣＨ基（?５．３、２Ｈ）の糖類（Ｈ−２からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）に対する割合を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使ってポリマのオレイルレベルを決定した。第四アンモニウム・オレイル・グリコールキトサンにおけるモノマー当たりのオレイル基のモル比は０．３１９であった。
パルミトイル鎖のメチルプロトン基（?０．８８、３Ｈ）の糖類（Ｈ−２からＨ−１１、?３．５−４．５、１０Ｈ）のメチン／メチレンプロトンに対する割合を計算することにより、１Ｈ ＮＭＲを使って第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサン中のパルミトイルレベルを決定した。第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンにおけるモノマー当たりのパルミトイル基のモル比は０．３８１であった。
【００９６】
[生物的評価]
〈プレドニゾロンの眼への局所投与〉
排気ピペットを使って、オスのニュージーランド白ウサギ（ｎ＝４、Harlan、英国）の両眼の下方盲管（lower cul de sac）にプレドニゾロン製剤（３５μＬ）を投与した。投与後１時間、２時間、４時間後に被験体を殺し、注射器で房水の標本採取を行った。硝子体液を採取し、すべての生体試料を液体窒素で直ちに凍結させた。房水試料を解凍し、５０μＬの房水を内部標準を含む１５０μＬの移動相で希釈し、分析を行った。これらの希釈試料は上述のＨＰＬＣで分析した。硝子体液（０．５ｍＬ）も解凍し、分析前に酢酸エチル（文献５０）で抽出した。
【００９７】
〈プロポフォールの静脈中枢神経系デリバリ〉
生後６週間のオスＭＦＩマウスに尾静脈から各種のプロポフォールを静脈注射し、正向反射を消失するまでの時間と睡眠時間を記録した。正向反射の喪失は投与後、背中を下にして置かれた被験体が立ち直りに失敗したことで、即座に確認された。眠らなかった被験体は睡眠時間ゼロと記録した。｛せいこう はんしゃ｝
【００９８】
〈炭水化物両親媒性物質の経口吸収の可能性〉
炭水化物両親媒性物質の経口吸収ポテンシャルを評価した。分子量が１５−３０ｋＤａでモノマー当たりの第四アンモニウム基のモル比が０．１６９、モノマー当たりのパルミトイル基のモル比が０．１５５の炭水化物両親媒性物質を使って、炭水化物ミセル製剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）を上記と同様に調製した。
【００９９】
成熟オスウイスターラット（Harlan Olac 英国、体重２４０−２８０ｇ、ｎ＝４）を１２時間絶食させた後、ＣｓＡ（２mg mL−1、−１mL、７．５mg kg−1）を胃内投与し、さらに４時間絶食させた。薬剤を水に分散させるか（超音波処理プローブにより分散）、ポリマ製剤または市販の液体製剤Neoral(r)（１００mg mL−1）を蒸留水で希釈し２mg mL−1の水溶液を調製して、ＣｓＡを投与した。様々な時間間隔で麻酔状態のラットの尾静脈から血液を標本採取し、製造者の指示に従いながら、モノクローナル抗体ラジオイムノアッセイ｛こうたい｝（Cyclo-Trac SP-Whole Blood Radioimmunoassay Kit, Diasorin、英国）を使用してＣｓＡの血中レベルを分析した。
【０１００】
これらの実験の結果を図６aから６ｃにまとめた。実験結果は、１００から３５０％血中レベルが上昇したことから、第四アンモニウム・パルミトイル・グリコールキトサンが、ＣｓＡの経口吸収を高めることを示す。
【０１０１】
〈GCPQ製剤の安定性と溶出試験〉
GCPQを上記と同様に合成し、ポリマ特性を表４に記載した。
【０１０２】
【０１０３】
GCPQ（２０mg mL−1）とシクロスポリンA（CsA、５mg mL−1）を超音波処理プローブ（器具を最大出力の７５％にセットして、１０分間、氷上で超音波処理）によって分散させて製剤を調製した。液体製剤および凍結乾燥製剤をどちらも８−１０℃で６ヶ月間保存した。１ヶ月の時間間隔をおいて、凍結乾燥試料を再構成（蒸留水で復元）し、液体試料をろ過（０．４５μｍ）してHPLCで分析した。
【０１０４】
〈HPLC分析〉
Waters５１５HPLCポンプ、Waters７１７プラス自動サンプラ、及びWaters４６８回転式吸光度検出器を使って、高速液体クロマトグラフ分析を行った。ジョーンズクロマトグラフィカラムヒーターモデル７９７１（Jones Chromatography Column Heater model 7971）で８０℃に維持した逆相カラム（Waters Assymetry Spherisorb ODS2、粒径５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）で試料をクロマトグラフ分析した。移動相は、水、tert-ブチル・メチル・エーテルおよびリン酸（６００：３５０：５０：１）で、流量は１．２mL min−1であった。CsAピークは２１０ｎｍで検出された。Waters Empowerソフトウエアを使ってデータを分析した。結果は図７に記載する。｛こうそく えきたい｝
【０１０５】
〈錠剤調製〉
直接圧縮で様々なGCPQ−CsA錠剤を調製した。粉末はすべて、篩過（３５メッシュ）して、直径５ｍｍの錠剤に圧縮した（EKOモデル、シングル・パンチ錠剤機、Erweka、ドイツ）。各薬剤ごとに個別に圧縮力を調整したため、錠剤の破砕強度は最大レベルであった。｛しか｝
【０１０６】
〈溶出試験〉
上記の各錠剤それぞれ３個づつについて、修正USP24−NF19法を使って溶出試験を行った。USP装置２（Erweka DT6R Dissolution Tester）、攪拌速度３０ｒｐｍ、溶出溶媒として１０００ｍLの蒸留水を用いた。ろ過（０．４５μｍ）後、５分、１０分、２０分、４０分、６０分、８０分、１２０分後に試料を採取し、上記と同様に、HPLCで分析した。結果を図８に記載する。
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【参考文献一覧】
【０１１１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式で表される両親媒性炭水化物重合体又はその塩から生成される平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍの高分子ミセル凝集体。
式中、ａ＋ｂ＋ｃ＝１．０００であり、ａは０．０１０から０．９９０の値、ｂは０．０００から０．９８０の値、ｃは０．０１０から０．９９０の値であり、
Ｘは疎水基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、個別に水素、置換アルキル基又は非置換アルキル基から選ばれ、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、個別に水素、置換アルキル基又は非置換アルキル基、置換エーテル基又は非置換エーテル基、置換アルケン基又は非置換アルケン基から選ばれ、Ｒ７は存在しても不在でも構わず、存在する場合、Ｒ７は、非置換アルキル基又は置換アルキル基、非置換アミン基又は置換アミン基、アミド基である。
【請求項２】
炭水化物重合体のｃユニットのモル比が０．１００より大きく、０．４００より小さい請求項１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項３】
炭水化物重合体のａユニットのモル比が０．０５０と０．８００の間である請求項１または２に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項４】
炭水化物重合体のｂユニットのモル比が０．２００と０．８５０の間である請求項１から３の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項５】
炭水化物重合体のｂユニットが存在しない請求項１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項６】
疎水基Ｘが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ポリオクサ(polyoxa)Ｃ１−４アルキレン基又は疎水性ポリマ置換基から選ばれる請求項1〜５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項７】
疎水性ポリマ置換基が、ポリ(乳酸)基、ポリ(ラクチド・コ・グリコリド)[poly(lactide‐co‐glycolide]基又はポリ(グリコール酸）基から選ばれる請求項６に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項８】
疎水基Ｘが、炭水化物重合体のｃユニットと直接結合している請求項６または７に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項９】
疎水基Ｘが、アミン基、アシル基又はアミド基を介して炭水化物重合体のｃユニットと結合している請求項６に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１０】
疎水基Ｘが、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯ−、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−、ＣＨ３−
(ＣＨ２)ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ２)ｑ−ＣＯＮＨ−、又はＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＮＨ−(但し、ｎは４と３０の間の値、ｐとｑは同一でも異なってもよく、３と１５の間の値である)である前記請求項１〜９の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１１】
疎水基Ｘが、カルボン酸をキトサンのアミン基に結合させることで形成されている請求項１〜６の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１２】
カルボン酸が脂肪酸である請求項１１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１３】
疎水基Ｘが、ラウリン酸（n＝１０）、ミリスチン酸（n＝１２）、パルミチン酸（n＝１４）、ステアリン酸（n＝１６）又はアラキジン酸（n＝１８）を、炭水化物重合体に結合させることで形成されている請求項１１又は１２に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１４】
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、一つ又はそれ以上のヒドロキシ基又は別の非イオン性親水置換基で置換されている前記請求項１〜１３の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１５】
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が個別に、−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ（但し、ｐは１から１０の値である)又は−(ＣＨ２)ｐ−ＣＨｑ(ＣＨ２−ＯＨ)ｒ（但し、ｐは１から１０の値、ｑは０から３の値、ｒは１から３の値であって、ｑ＋ｒ＝３である）から選ばれる請求項１〜１４の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１６】
Ｒ７が存在しない請求項１〜１５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１７】
Ｒ７が存在し、且つそのＲ７が、−(ＣＨ２)ｎ−で表せるアルキル基、−ＮＨ−(ＣＨ2)ｎ−で表せるアミン基、又は−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−で表せるアミド基（式中、ｎは１から１０の値である）から選ばれる請求項１〜１５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１８】
Ｒ７がベタイン基（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３）の一部であり、Ｒ７は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−である請求項１〜１５又は請求項１７の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１９】
最小平均粒径が少なくとも１００ｎｍであり、最大平均粒径が４００ｎｍ以下である前記請求項１〜１８の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２０】
炭水化物重合体の分子量が、約１．５ｋＤａから２５０ｋＤａである請求項１〜１９の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２１】
凝集体が塩である請求項１〜２０の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２２】
塩が、塩化物アニオン、ヨウ化物アニオン、酢酸アニオン、グルタミン酸アニオンから選ばれたイオンで形成されている請求項２１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れかに記載した高分子ミセル凝集体を含有する組成物。
【請求項２４】
高分子ミセル凝集体と薬物とで調製された請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
薬物が疎水性薬物である請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
疎水性薬物が、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロンのいずれかであるか、パクリタキセルのような極性基を欠く多環リング構造の薬物であるか、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、又は多環化合物である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
高分子ミセル凝集体が、薬物と共にナノ粒子を形成し、そのナノ粒子の平均粒径が、約２０ｎｍから２μｍである請求項２４から２６の何れかに記載の組成物。
【請求項２８】
高分子ミセル凝集体／薬物の比が、少なくとも１：１０である請求項２４から２６の何れかに記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２２の何れかに記載された高分子ミセル凝集体と薬物を混合して均質化することを包含するナノ粒子製剤の製造方法。
【請求項３０】
治療に用いる請求項２４〜２８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２２の何れかに記載した高分子ミセル凝集体と、患者投与用薬物との薬剤調製への使用。
【請求項３２】
薬物が疎水性薬物である請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
疎水性薬物が、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロンのいずれかであるか、パクリタキセルの如き極性基を欠く多環リング構造の薬物であるか、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド又は他の多環化合物である請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
薬物がプロポフォール、プレドニゾロン又はシクロスポリンである請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
薬剤が経口投与用の薬剤である請求項３１から３４の何れかに記載の使用。
【請求項３６】
高分子ミセル凝集体が薬物のバイオアベイラビリティーを高める請求項３５に記載の使用。
【請求項１】
下記の一般式で表される両親媒性炭水化物重合体又はその塩から生成される平均粒径が２０ｎｍから５００ｎｍの高分子ミセル凝集体。
式中、ａ＋ｂ＋ｃ＝１．０００であり、ａは０．０１０から０．９９０の値、ｂは０．０００から０．９８０の値、ｃは０．０１０から０．９９０の値であり、
Ｘは疎水基であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、個別に水素、置換アルキル基又は非置換アルキル基から選ばれ、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、個別に水素、置換アルキル基又は非置換アルキル基、置換エーテル基又は非置換エーテル基、置換アルケン基又は非置換アルケン基から選ばれ、Ｒ７は存在しても不在でも構わず、存在する場合、Ｒ７は、非置換アルキル基又は置換アルキル基、非置換アミン基又は置換アミン基、アミド基である。
【請求項２】
炭水化物重合体のｃユニットのモル比が０．１００より大きく、０．４００より小さい請求項１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項３】
炭水化物重合体のａユニットのモル比が０．０５０と０．８００の間である請求項１または２に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項４】
炭水化物重合体のｂユニットのモル比が０．２００と０．８５０の間である請求項１から３の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項５】
炭水化物重合体のｂユニットが存在しない請求項１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項６】
疎水基Ｘが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ポリオクサ(polyoxa)Ｃ１−４アルキレン基又は疎水性ポリマ置換基から選ばれる請求項1〜５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項７】
疎水性ポリマ置換基が、ポリ(乳酸)基、ポリ(ラクチド・コ・グリコリド)[poly(lactide‐co‐glycolide]基又はポリ(グリコール酸）基から選ばれる請求項６に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項８】
疎水基Ｘが、炭水化物重合体のｃユニットと直接結合している請求項６または７に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項９】
疎水基Ｘが、アミン基、アシル基又はアミド基を介して炭水化物重合体のｃユニットと結合している請求項６に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１０】
疎水基Ｘが、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯ−、ＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−、ＣＨ３−
(ＣＨ２)ｐ−ＣＨ＝ＣＨ−(ＣＨ２)ｑ−ＣＯＮＨ−、又はＣＨ３(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＮＨ−(但し、ｎは４と３０の間の値、ｐとｑは同一でも異なってもよく、３と１５の間の値である)である前記請求項１〜９の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１１】
疎水基Ｘが、カルボン酸をキトサンのアミン基に結合させることで形成されている請求項１〜６の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１２】
カルボン酸が脂肪酸である請求項１１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１３】
疎水基Ｘが、ラウリン酸（n＝１０）、ミリスチン酸（n＝１２）、パルミチン酸（n＝１４）、ステアリン酸（n＝１６）又はアラキジン酸（n＝１８）を、炭水化物重合体に結合させることで形成されている請求項１１又は１２に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１４】
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、一つ又はそれ以上のヒドロキシ基又は別の非イオン性親水置換基で置換されている前記請求項１〜１３の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１５】
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が個別に、−(ＣＨ２)ｐ−ＯＨ（但し、ｐは１から１０の値である)又は−(ＣＨ２)ｐ−ＣＨｑ(ＣＨ２−ＯＨ)ｒ（但し、ｐは１から１０の値、ｑは０から３の値、ｒは１から３の値であって、ｑ＋ｒ＝３である）から選ばれる請求項１〜１４の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１６】
Ｒ７が存在しない請求項１〜１５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１７】
Ｒ７が存在し、且つそのＲ７が、−(ＣＨ２)ｎ−で表せるアルキル基、−ＮＨ−(ＣＨ2)ｎ−で表せるアミン基、又は−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ２)ｎ−で表せるアミド基（式中、ｎは１から１０の値である）から選ばれる請求項１〜１５の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１８】
Ｒ７がベタイン基（−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｎ＋Ｒ１Ｒ２Ｒ３）の一部であり、Ｒ７は−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−である請求項１〜１５又は請求項１７の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項１９】
最小平均粒径が少なくとも１００ｎｍであり、最大平均粒径が４００ｎｍ以下である前記請求項１〜１８の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２０】
炭水化物重合体の分子量が、約１．５ｋＤａから２５０ｋＤａである請求項１〜１９の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２１】
凝集体が塩である請求項１〜２０の何れかに記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２２】
塩が、塩化物アニオン、ヨウ化物アニオン、酢酸アニオン、グルタミン酸アニオンから選ばれたイオンで形成されている請求項２１に記載の高分子ミセル凝集体。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れかに記載した高分子ミセル凝集体を含有する組成物。
【請求項２４】
高分子ミセル凝集体と薬物とで調製された請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
薬物が疎水性薬物である請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
疎水性薬物が、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロンのいずれかであるか、パクリタキセルのような極性基を欠く多環リング構造の薬物であるか、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド、又は多環化合物である請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
高分子ミセル凝集体が、薬物と共にナノ粒子を形成し、そのナノ粒子の平均粒径が、約２０ｎｍから２μｍである請求項２４から２６の何れかに記載の組成物。
【請求項２８】
高分子ミセル凝集体／薬物の比が、少なくとも１：１０である請求項２４から２６の何れかに記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２２の何れかに記載された高分子ミセル凝集体と薬物を混合して均質化することを包含するナノ粒子製剤の製造方法。
【請求項３０】
治療に用いる請求項２４〜２８の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２２の何れかに記載した高分子ミセル凝集体と、患者投与用薬物との薬剤調製への使用。
【請求項３２】
薬物が疎水性薬物である請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
疎水性薬物が、プレドニゾロン、プロポフォール、シクロスポリン、エストラジオール、テストステロンのいずれかであるか、パクリタキセルの如き極性基を欠く多環リング構造の薬物であるか、エトポシド、アンフォテリシンＢ、ステロイド又は他の多環化合物である請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
薬物がプロポフォール、プレドニゾロン又はシクロスポリンである請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
薬剤が経口投与用の薬剤である請求項３１から３４の何れかに記載の使用。
【請求項３６】
高分子ミセル凝集体が薬物のバイオアベイラビリティーを高める請求項３５に記載の使用。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５０６８２７（Ｐ２０１０−５０６８２７Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２３３４２（Ｐ２００９−５２３３４２）
【出願日】平成１９年８月８日（２００７．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１７８３９
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０９０４２１７４）ザ スクール オブ ファーマシー，ユニバーシティ オブ ロンドン (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月８日（２００７．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００３０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１７８３９
【国際公開日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（３０９０４２１７４）ザ スクール オブ ファーマシー，ユニバーシティ オブ ロンドン (1)
【Ｆターム（参考）】
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