高脂血症を改善するための組成物および方法
本発明は、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与することによって、高脂血症を治療するための組成物および方法、肝臓脂肪症の発現を防止する方法、高脂血症を治療するために有用な薬剤を同定する方法、ならびに、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。また、ＭＴＰ抑制剤およびＬ−ＦＡＢＰ抑制剤を含む医薬組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して高脂血症および肥満に対する薬および治療に関するものであり、特には、高脂血症を改善するための組成物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症とは上昇した血中脂質濃度を言及するものであり、トリグリセリドおよびコレステロールによって表されるものに留まらない。高脂血症は、リポタンパク代謝の異常な脱着の兆候を表す異常脂質血症としても定義される。人間では、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の血中濃度の増加が、冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の高いリスクと強く関係している。一方、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の血中濃度の増加は、ＣＨＤの低いリスクと関係している。トリグリセリド高含有のリポタンパク質（超低比重リポタンパク：ＶＬＤＬ）の血中濃度は、ＣＨＤ、メタボリック症候群、および２型糖尿病のリスクに応じて変化する。ＣＨＤに関係する疾病率および死亡率の両方を減少させるためには、特別食または薬理療法を介してＬＤＬを低下させることが示されている。ＣＨＤ、膵炎、および２型糖尿病の発現を減少させるためには、特別食または薬理療法を介してプラズマトリグリセリドを減少させることが示されている。
【０００３】
人間の肝臓は、ＶＬＤＬの生産のための主な組織部位である。一部のＬＤＬは肝臓によって直接的に生産されるが、大部分のＬＤＬはＶＬＤＬの代謝作用から生成される。ＶＬＤＬおよびＬＤＬの両方の粒子は、単一のアポリポタンパク質分子（ａｐｏＢ）を含む。ａｐｏＢは、脂質の安定した球状のエマルジョン粒子を形成する能力を介して、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの粒子の基本的な構造組成物となる。ＶＬＤＬのコアは主にトリグリセリドから成り、脂肪酸を介して肝外組織にエネルギーを提供する。肝臓でのＶＬＤＬの分泌に続いて、コアトリグリセリドが脂肪酸に分解され、この脂肪酸は特定の受容体およびタンパク結合脂肪酸（ＦＡＢＰｓ）によって急速に取り込まれる。その後、脂肪酸は、トリグリセリドとして蓄えられるか、または、酸化を介してエネルギーおよび熱を生産するために用いられるかのいずれかとなる。ＬＤＬのコアは、主にコレステリルエステルから成り、主に、特定の細胞表面受容体に結合することによって、肝外組織にコレステロールを提供する。ほとんどの肝外組織は、厳格に調節された受容体（ＬＤＬ受容体）によってＬＤＬを取り込むことができる。正常な状態の下で、ＬＤＬ受容体の発現は細胞コレステロール濃度と逆に変化するため、ＬＤＬの取り込みに介在するＬＤＬ受容体が過剰なコレステロールの吸収をもたすことはない。しかしながら、仮に、ＬＤＬが酸化によって（通常、血中に長期的に存在することの結果として）修飾されると、修飾ＬＤＬは、細胞コレステロール濃度と関係せずに発現する受容体を介して、マクロファージによって取り込まれる。過剰な血漿ＬＤＬ濃度は、血漿中に存在する期間の増加、酸化修飾の増加、および、動脈壁マクロファージによる取り込みの増加と関係する。動脈壁マクロファージによる酸化修飾されたＬＤＬの取り込みは、動脈壁内の炎症およびアテローム性動脈硬化症の発現を引き起こす次の事象を開始する。アテローム性動脈硬化症は主に、熱中症、脳梗塞、および最終的には心臓麻痺の原因となる。
【０００４】
アポリポプロテインＢ含有のリポプロテインの肝臓での生産は、同化およびエネルギーの要求に対して、必須脂質および脂溶性栄養素が周辺組織に運ばれることについての主要経路である。識別できる３つの遺伝子生産物、すなわち、アポリポプロテインＢ（ａｐｏＢ）、ＭＴＰ、および肝臓脂肪酸が結合したタンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰまたはＬＦＡＢＰ）は、「脂肪結合」構造ドメインを分け合う。上記「脂肪結合」構造ドメインは、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）会合／分泌に必須である。
【０００５】
ａｐｏＢは、非常に大きく（＞５００ｋＤａ）、上記会合のために必要な両親媒性タンパク質であり、トリグリセリドを豊富に含有するＶＬＤＬの分泌物である。肝臓および腸が十分なサイズ（〜３５ｋＤａ）のａｐｏＢを生産する能力を喪失することは、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌についての阻害と関係する。通常、肝臓によるａｐｏＢの発現は構造性であり、肝臓におけるａｐｏＢ含有リポタンパク質の分泌の変化は、新規に合成されたａｐｏＢの量の変化による結果である。
【０００６】
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）は、脂質輸送タンパク質、ならびに、ａｐｏＢの折り畳みおよび転移を促進するものの両方として働く。ＭＴＰは、４つの主な脂質の種類（遊離コレステロール、リン脂質、トリグリセリド、およびコレステロールエステル）を、２つの工程のプロセスを介して、新生ａｐｏＢ含有リポタンパク質粒子へ移送することを促進する。多くのこうした協調するＭＴＰ依存プロセスの１つを阻止することは、プロテアソームによる新生ａｐｏＢの同時翻訳の低下を引き起こす。
【０００７】
肝臓でのＶＬＤＬ会合および分泌は、個々の間で高度に可変であり、栄養状態の変化に対して敏感である。ＶＬＤＬ分泌中のこの栄養変化は、主要な脂質合成酵素の発現レベルにおけるステロール調節エレメント結合タンパク質の媒介による変化と関係している。肝臓による新規の脂質合成率が減少するとき（例えば断食）、脂肪組織によって供給される脂肪酸は、グリセロ脂質合成およびＶＬＤＬ会合／分泌に対して十分な基質を提供することができる。肝臓によるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの両方の発現レベルの変化は、グリセロ脂質生合成およびＶＬＤＬ会合／分泌への脂肪酸の流動を制御する。
【０００８】
ＭＴＰの発現はａｐｏＢの分泌を律速するための理想的な目的となり、ＭＴＰの抑制は、高脂血症を治療的に改善するための理想的な目的になると考えられている。いくつかの研究によれば、ＭＴＰ抑制剤を用いたマウスの処理、または、ＭＴＰ遺伝子ノックアウトのいずれかによって、ＭＴＰの機能的な発現を低下させることは、アテローム性動脈硬化症に対して感受性を増加するように遺伝的改造をされたマウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の形成を顕著に減少させることが示されている。ＭＴＰ抑制剤は、肝臓のリポタンパク質分泌を阻害し、血漿脂質濃度を低下させるが、それらはまた、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝の発現）の原因でもある。よって、ＭＴＰ抑制剤は、高脂血症（心臓病の主な原因）に対して効果的であるが、それらは肝臓脂肪症の原因となるため、安全ではなく、または実用的ではない。したがって、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、高脂血症および肥満を治療するために組成物および方法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＭＴＰとＬ−ＦＡＢＰ活性の同時抑制が、肝臓脂肪症（脂肪肝）を引き起こすことなく、高脂血症を改善（例えば紡糸または抑制）するという発見に基づいている。この独創性に富んだ発見は、癌（例えば、肝臓癌細胞）の治療、スクリーニング、リスクアセスメント、予後診断、診断、および治療法の発展のために有用である。
【００１０】
したがって、本発明は、治療を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与することによって、高脂血症を治療する方法を提供する。一実施形態では、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は小分子である。他の実施形態では、ＭＴＰ抑制剤が小分子であって、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤と組み合わせて投与されると、脂質転移によって、肝臓脂肪症を引き起こすことなしに、血漿中トリグリセリド濃度が減少する。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの模範的な小分子抑制剤には、これに制限されないが、それぞれ、８ａＲとして設計されたジアミノインダン、および３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）が挙げられる。
【００１１】
他の実施形態では、ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、または当該ポリヌクレオチドの機能性断片と、ハイブリダイズするｄｓＲＮＡである。他の実施形態では、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、または当該ポリヌクレオチドの機能性断片と、ハイブリダイズするｄｓＲＮＡである。加えて、癌細胞（例えば肝臓癌細胞）においてＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの濃度が上昇しているかどうかを測定する方法、およびそのような癌を治療するために有用な薬剤を同定するための方法を提供する。さらに、高脂血症または肝臓癌をかかえる被験者を治療するための治療規制を観測する方法を提供する。このように、本方法は、肝臓脂肪症の発現を防止したまま高脂血症を改善する方法として用いられてもよい。
【００１２】
本発明は、治療を必要とする被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させ、さらに、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出することによって、高脂血症または肝臓癌を治療するために有用な薬剤を同定する方法と関係する。当該方法では、接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少の検出が、高脂血症を治療するために有益な薬剤を同定する。一実施形態において、上記方法は、ハイスループット法で行われてもよい。他の実施形態では、上記方法は、オーダーメイド医療を実行するための方法を提供する。当該方法における治療は、被験者の肝臓細胞の特徴に基づいて、個別の被験者に合わせられる。本発明の方法は、例えば、被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させることによって行われることができる。当該方法において、接触の後に増加したＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現を検出することが、その薬剤を用いた治療の効果を同定する。
【００１３】
本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰ活性または発現の抑制剤に対するスクリーニングの方法であって、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰを発現している細胞を、少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および、接触に続くＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出する工程を含んでおり、接触に続くＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出することが、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤としての薬剤を同定する方法をも提供する。
【００１４】
本発明は、また、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の抑制剤に対するスクリーニングの方法であって、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰを発現している細胞を、少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出する工程を含んでおり、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出することが、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの抑制剤としての薬剤を同定する方法をも提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いる治療に適している、被験者の肝臓癌細胞を同定する方法と関係する。当該方法は、対応正常細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性と比較して、細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇を検出する工程、それによって、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いた治療に適した肝臓癌細胞を同定する工程を含んでいる。このように、上記方法は、癌（例えば肝臓癌）を有する被験者が、本発明の抑制剤を用いた治療に対して反応が良いかどうかを決定するための手段を提供する。上記方法は、例えば、対応正常細胞と比較して、被験者の細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇を検出することによって行われてもよく、当該方法では、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの上昇した濃度を検出することは、被験者が抑制剤を用いた治療から益を得ることができることを示している。上記方法は、さらに、ＭＴＰもしくはＬ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡと、またはその機能的断片と細胞を接触させる工程、および、接触に続くＭＴＰもしくはＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出する工程、それによって、肝臓癌細胞がこのような治療に適しているかを確かめる工程を含んでいる。
【００１６】
他の態様では、本発明は、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などによるウイルス感染を改善し、肝臓脂肪症、炎症性肝臓疾患、線維症、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌の発現を減少するための方法を提供する。ＭＴＰ抑制剤は、ＨＣＶ生産を減少することが明らかにされているが、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現は、肝硬変および肝細胞癌の形成を実際に促進するだろう。一実施形態において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ脂質転移活性の同時抑制は、肝臓脂肪症ならびにその後の肝硬変および肝細胞癌の形成を引き起こすことなしに、ＨＣＶ感染の進行を低下させるだろう。
【００１７】
本発明の態様において、細胞試料は、例えば、癌を患う被験者の生体から得られた腫瘍試料、外科手術（例えば腫瘍を除去または減量するための外科的処置）によって得られた腫瘍試料、または、被験者の体液の試料などを含む、任意の試料であってもよい。
【００１８】
一般に、必須ではないが、スクリーニング法は、例えば培養液中または固体担体上などの生体外で、細胞試料と接触させることによって行われる。このように、上記方法は、ハイスループット（high-throughput）法に都合よく適用できる。ハイスループット法では、同様のまたは異なる、多く（例えば２つ以上）の細胞試料が並行して調査される。よって、一実施形態では、候補薬は、単独の被験者からのいくつかの細胞試料上で検査されてもよい。これによれば、例えば、被験者に投与される薬剤の特に効果的な濃度を同定すること、または、被験者に投与される特に効果的な薬剤を同定することなどが可能になる。
他の実施形態では、ハイスループット法は、最もよい（最も効果的な）薬剤または薬剤の組み合わせを治療手段に用いることができるように、被験者の癌細胞上で、２つ、３つ、４つ、それ以上の異なる検査薬を、単独または組み合わせて試験することを可能にする。したがって、様々な実施形態では、ハイスループット法は、異なる被験者の異なる細胞試料を、同じ量の候補薬と接触させること；または、単独の被験者の異なる細胞試料を、異なる量の候補薬と接触させること；または、２人以上の異なる被験者の異なる細胞試料を、同量または異なる量の、異なる候補薬と接触させることによって実行される。さらに、スループット法によれば、例えばコントロール試料（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）を、例えば検査された薬剤を用いて効果的に治療される既知の細胞試料などの検査試料と、並行して実施することが可能になる。様々に例示した方法もまた意図したものである。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本発明の組成物を備えるキットを提供する。一実施形態では、上記キットは、さらに、本発明の方法を実施するための説明書を提供する。
【００２０】
よって、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰ脂質転移活性についての遺伝子の不活性化または化学的抑制のいずれかによる、Ｌ−ＦＡＢＰの機能的な発現を阻害することは、ＭＴＰが、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、血漿中脂質を減少できるようにするということを実証する。単独のＭＴＰ抑制剤は、血漿中脂質濃度を減少する効果的な手段であるが、脂肪肝の関連発現によって、単独のＭＴＰ抑制剤は、高脂血症を低下するための安全な治療規制から除外される。したがって、ＭＴＰ抑制剤と組み合わせた、Ｌ−ＦＡＢＰ脂質転移活性の抑制剤は、肝臓脂肪症の発現を引き起こすことなしに、高脂血症を改善する。
【００２１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、上記説明および特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ａは、ＭＴＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびＬ−ＦＡＢＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の両方のプロモーター（ラット）の近位領域内における保存ＤＲ１要素（５’および３’六量体ハーフサイト（half site）には下線を引いている）を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ｂは、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡレベルのサイバーグリーン（sybr green）リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示している。全ての値を、３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、トリプリケート（triplicate）サンプルによる標準偏差を示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ｃは、ＭＴＰ（-135/+66）またはＬ−ＦＡＢＰ（-141/+66）のいずれかのプロモーターに由来するルシフェラーゼ構築体が、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞中に一時的に導入されたことを示している。変異型ＤＲ１要素を含む構築体は、以下に説明するように、各プロモーターの５’六量体ハーフサイトにおけるＡＣからＴＧへの塩基対変化から構成される。ルシフェラーゼ活性は、黒いバー（ＦＡＯ細胞）と白いバー（Ｌ３５細胞）とによって表されている。全てのルシフェラーゼ値を、Ｒｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、トリプリケート（triplicate）サンプルによる標準偏差を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＯＵＰ−ＴＦIIが、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性のレプレッサーとして働く近位ＤＲ１サイトと結合することを示す模式的な図である。図２Ａは、放射性同位体標識されたＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブによるＥＭＳＡを使用して、Ｌ３５細胞とＦＡＯ細胞由来との核抽出物を比べることによって、異なる複合体が得られたことを示している。Ｌ３５−／ＦＡＯ−特異的な複合体におけるＣＯＵＰ−ＴＦIIの存在を評価するために、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブとの培養中、核酸抽出物に、ＣＯＵＰ−ＴＦIIに対して特異的な抗体を加えた。抗体を追加したＬ３５特異的なＣＯＵＰ−ＴＦII複合体、および抗体なしのＬ３５特異的なＣＯＵＰ−ＴＦII複合体を、それぞれ、黒い矢印および白い矢印によって示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＯＵＰ−ＴＦIIが、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性のレプレッサーとして働く近位ＤＲ１サイトと結合することを示す模式的な図である。図２Ｂは、ＦＡＯ細胞中のＣＯＵＰ−ＴＦIIの同時導入がＬ−ＦＡＢＰプロモーター活性を減少させることを示している。ラットＬ−ＦＡＢＰプロモーターの配列-141/+66を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを、図に示された量のＣＯＵＰ−ＴＦII発現プラスミドと共に、ＦＡＯ細胞中に同時導入した。変異型ＤＲ１要素を含む構築体は、図１に示す通りである。全てのルシフェラーゼ値を、Ｒｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ａは、放射性同位体標識されたＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブまたはＭＴＰ−ＤＲ１プローブによるＥＭＳＡを使用して、類似のＦＡＯ特異的複合体が得られたことを示している。ＦＡＯ特異的な複合体におけるＰＰＡＲα／ＲＸＲαの存在を評価するために、核酸抽出物を、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブまたはＭＴＰ−ＤＲ１プローブのいずれかと培養中に、ＰＰＡＲα（Ｐ）、ＲＸＲα（Ｒ）、またはＣＯＵＰ−ＴＦII（Ｃ）に対して特異的な抗体を加えた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ｂは、Ｌ３５細胞とＦＡＯ細胞とを比較したＣｈＩＰ解析による結果を示しており、当該解析は、ＣＯＵＰ−ＴＦIIおよびＰＰＡＲαに特異的な抗体を利用して行われた。図に示すように、領域特異的ＤＮＡの相対的な量は、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１またはＭＴＰ−ＤＲ１のいずれかのプロモーター領域に対して特異的なプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによって測定された（黒いバー）。末端の非翻訳領域の相対的なレベルは、領域特異性を証明するために示される（白いバー）。以下に説明されるように、全ての値を、ＩｇＧを用いた免疫沈降に対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ｃは、Ｌ３５細胞（白いバー）およびＦＡＯ細胞（黒いバー）における、ＣＯＵＰ−ＴＦII、ＲＸＲα、およびＰＰＡＲαのｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ解析による結果を示している。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ａは、図に示すように、リアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＰＡＲα作用薬ＷＹ−１４，６４３（ＷＹ）、ＲＸＲα９−ｃｉｓレチノイン酸（ＲＡ）作用薬、または賦形剤（ＤＭＳＯ）のいずれかと４８時間処理したＬ３５細胞と、未処理Ｌ３５細胞（−）とを比較することによって、相対的なＬ−ＦＡＢＰとＭＴＰとのｍＲＮＡレベルを測定したものを示している。ＷＹ／ＲＡは、両方の作用薬を同時に用いて処理したＬ３５細胞を示している。全ての値を、３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateコントロールによる標準偏差を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ｂは、野生型および変異型の両方のＤＲ１ルシフェラーゼレポーター構築体を利用して、未処理Ｌ３５細胞（−）と、上述のように４８時間処理した細胞とを比較することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方に対する相対的なプロモーター活性レベルを測定したことを示している。プロモーター活性については、野生型を白いバーとして、変異型ＤＲ１構築体を黒いバーとして示している。全てのルシフェラーゼ値をＲｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、triplicateコントロールによる標準偏差を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ｃは、〔３５Ｓ〕−メチオニンで標識する前に、７２時間、１μＭ９−ｃｉｓレチノイン酸および１０μＭ ＷＹ−１４，６４３がない場合（レーン１〜３）、または存在する場合（レーン４〜６）において、Ｌ３５細胞を培養した結果を示している。培養液を、放射能の添加の２４時間後に採集した。分泌されたａｐｏＢを、ポリクローナル抗ａｐｏＢ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％）で分離した。標識化されたタンパク質を、オートラジオグラフィーによって検出した。ａｐｏＢ４８およびａｐｏＢ１００の位置を、分子量マーカーおよびヒトＬＤＬ標準（human LDL standards）によって測定した。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの核内受容体を減少させ、結果的に、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターの近位ＤＲ１領域の占有を、抑制的ＣＯＵＰ−ＴＦII複合体から活性化ＰＰＡＲα／ＲＸＲα複合体に変化させることを示すグラフ図である。図５Ａは、リアルタイムＰＣＲを使用して、図に示すように、４８時間、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸を同時に処理したもの（黒いバー）またはＤＭＳＯで処理したもの（灰色のバー）と、未処理Ｌ３５細胞（白バー）とを比較することによって、ＣＯＵＰ−ＴＦII、ＲＸＲαおよびＰＰＡＲαの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した結果を示している。全ての値を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの核内受容体を減少させ、結果的に、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターの近位ＤＲ１領域の占有を、抑制的ＣＯＵＰ−ＴＦII複合体から活性化ＰＰＡＲα／ＲＸＲα複合体に変化させることを示すグラフ図である。図５Ｂは、未処理のＬ３５細胞およびＦＡＯ細胞と、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸の両方で処理したＬ３５細胞（Ｌ３５Ｗ／Ｒ）とを比較したＣｈＩＰ解析による結果を示しており、当該回折は、図に示すように、ＣＯＵＰ−ＴＦIIおよびＰＰＡＲαに特異的な抗体を利用して行われた。図に示すように、領域特異的ＤＮＡの相対的な量は、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１またはＭＴＰ−ＤＲ１のいずれかのプロモーター領域に対して特異的なプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによって測定された（黒いバー）。末端の非翻訳領域の相対的なレベルは、領域特異性を証明するために示されている（白いバー）。「実験手順」に説明されるように、全ての値を、投入ＤＮＡと、ＩｇＧを用いた免疫沈降とに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦＡＯ細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ発現を持続するために、および、生体内での両遺伝子の誘発に媒介されるＧＷ−７６４７のために、ＰＰＡＲαが必要であることを示すグラフ図である。図６Ａは、ＰＰＡＲαのＲＮＡ干渉ノックダウンの結果を示しており、当該結果は、ＦＡＯ細胞に、ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡ、またはネガティブコントロールである非標的コントロールｓｉＲＮＡのいずれかを７２時間導入することによって得た。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（黒いバー）と、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（白いバー）とを比較することによって、ＰＰＡＲα、ＭＴＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびａｐｏＢの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡを用いて処理したＦＡＯ細胞におけるｍＲＮＡレベルは、ネガティブコントロールの割合を１００％に設定して表されている。全ての値を、１８ＳｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＦＡＯ細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ発現を持続するために、および、生体内での両遺伝子の誘発に媒介されるＧＷ−７６４７のために、ＰＰＡＲαが必要であることを示すグラフ図である。図６Ｂは、コントロールＣ５７ＢＬ／６およびＰＰＡＲα-/-マウス（５マウス／グループ）を、ＰＰＡＲα作用薬ＧＷ−７６４７で７週間処理した結果を示している。リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。相対的なｍＲＮＡレベルは、黒いバー（ＧＷ−７６４７処理）と白いバー（賦形剤処理）として表されている。全ての値を、１８ＳｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ａは、Ｌ３５細胞（白いバー）およびＦＡＯ細胞（黒いバー）におけるＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルについてのリアルタイムＰＣＲ解析の結果を示している。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ｂは、未処理のＬ３５細胞（白いバー）と、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸で同時に４９時間処理したＬ３５細胞（黒いバー）とを比較することによって、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルについて、リアルタイムＲＮＡ解析をした結果を示している。追加して、未処理の野生型マウス（Ｗｔ、白いバー）と、ＰＰＡＲα作用薬ＷＹ−７６４７で７週間処理した野生型マウス（ＷｔＧＷ−７６４７、黒いバー）とを比較して、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルを測定した。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ｃは、ＰＧＣ−１βのＲＮＡ干渉ノックダウンの結果を示しており、当該結果は、ＦＡＯ細胞に、ＰＧＣ−１β特異的ｓｉＲＮＡ、またはネガティブコントロールである非標的コントロールｓｉＲＮＡのいずれかを７２時間導入することによって得た。集菌の４８時間前、細胞をＷＹ（１０μＭ）およびＲＡ（１μＭ）で処理した。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＰＧＣ−１β特異的なｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（黒いバー）と、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（白いバー）とを比較することによって、ＰＧＣ−１β、ＭＴＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＰＧＣ−１αの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＧＣ−１β特異的ｓｉＲＮＡを用いて処理したＦＡＯ細胞におけるｍＲＮＡレベルは、ネガティブコントロールの割合を１００％に設定して表されている。全ての値を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図８】図８は、Ｌ３５細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰについての、ＰＧＣ−１βの媒介による増加が、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα依存性であることを示すグラフ図である。図に示すように、リアルタイムＰＣＲは、アデノウイルス構築体および作用薬で４８時間処理されたＬ３５細胞において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡレベルを解析している。Ｌ３５細胞は、図に示すように、Ａｄ−ＰＧＣ−１βもしくはＡｄ−ＧＦＰで感染されているか、または非感染であった。感染については、同時的な作用薬の処理（ＷＹ−１４，６４３および９−ｓｉｓレチオニン酸）と同時に行った。全ての値（平均値±triplicateサンプルの標準偏差）を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の除去によって、ＭＴＰ抑制剤の誘導する肝臓脂肪症を防止することを示すグラフ図である。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウス（６マウス／グループ）に対し、ＭＴＰ抑制時８ａＲ（５０ｍｇ／日／ｋｇ）を７日間与えた。マウスを解剖し、血漿および肝臓を得て、脂質レベルを測定した。図９Ａは、賦形剤処理（白いバー）と、８ａＲ処理（黒いバー）とを比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウスの両方において、血漿中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度を測定した結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の除去によって、ＭＴＰ抑制剤の誘導する肝臓脂肪症を防止することを示すグラフ図である。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウス（６マウス／グループ）に対し、ＭＴＰ抑制時８ａＲ（５０ｍｇ／日／ｋｇ）を７日間与えた。マウスを解剖し、血漿および肝臓を得て、脂質レベルを測定した。図９Ｂは、未処理（白いバー）と、８ａＲ処理（黒いバー）とを比較して、両系統において、肝臓トリグリセリド濃度を測定した結果を示す。全ての値は、平均値±標準偏差を示している。＊Ｐ＜．００１。
【図１０】図１０は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける血漿中トリグリセリド濃度を減少させることを示すグラフ図である。
【図１１】図１１は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける血漿中コレステロール濃度を減少させることを示すグラフ図である。
【図１２】図１２は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける肝臓脂肪症の発現を防止することを示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔本発明の詳細な説明〕
本発明は、ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）および肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰまたはＬＦＡＢＰ）を同時に抑制することを通じて、高脂血症を改善することに基づいており、また、本発明はそのための方法である。ＭＴＰおよびＬ―ＦＡＢＰの同時抑制によって、本発明の組成物および方法は、肝臓脂肪症（脂肪肝）を引き起こすことなく、高脂血症を改善することができ、ひいては、高脂血症を治療するための効果的かつ安全な方法を提供することができる。
【００２４】
本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されるものではないことを理解されたい。例えば、組成物、方法、および実験条件は変更されてもよい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲だけに限定されるため、本明細書における専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的として用されており、それに限定されることを意図してはいない。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているような単数形の表現は、文脈が明らかに別なように指示しているのでない限り、複数形への言及を含んでいる。したがって、例えば、「方法」への言及は、ここで説明される種類についての１つ以上の方法および／または工程を含んでいることは、この公開その他を読む当業者にとって明らかであるだろう。
【００２６】
他に定義されていない限り、本明細書における全ての技術用語および科学用語は、本発明が所属する技術分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または均等である任意の方法および物質は、本発明の実施または実験において用いることができるが、好ましい方法および物質は、これから説明されるものである。
【００２７】
脂肪はリポタンパク質の形で血液を介して腸および肝臓から移送される。肝臓および腸の両方によるリポタンパク質の生産は、非常に大きな両親媒性タンパク質であるアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）を要求する。ａｐｏＢは、トリグリセリド高含有の超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中の構造タンパクとして、肝臓によって分泌される。血漿中、ＶＬＤＬ中に運ばれたトリグリセリドは、脂肪酸として取り除かれ、エネルギー生産および同化作用に用いるために肝外組織に供給される。粒子を含むａｐｏＢは、ＬＤＬに変換される。コレステロール高含有の低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の血漿中濃度の増加は、アテローム性動脈硬化の発現と関係しており、米国および他の先進工業国において、循環器疾患および死亡の主な原因となっている。肝臓は、ＬＤＬの生産および分解の両方に関与する主な臓器である。無βリポタンパク血症の劣勢遺伝性疾患を有する患者は、血漿中にＬＤＬをほぼ有しておらず、アテローム性動脈硬化症に対する感受性の減少を示すため、ＬＤＬの血漿中濃度を減少させる治療法の発展に対して、多大な努力がされてきた。この提案は、肝臓のＬＤＬ摂取および分解の増加の結果として、血漿中のＬＤＬ濃度を減少させることによって、循環器疾患から疾患率および死亡率の両方を顕著に減少することが示されている薬（例えばスタチン）の発達によって実現されていた。全ての人が安全にスタチンを摂取できるとは限らず、これが、血漿中のＬＤＬ濃度を減少するためのさらなる薬の発展に対する推進力を与えている。
【００２８】
無βリポタンパク血症が機能的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）の突然変異欠損によって引き起こされるという発見によって、ＭＴＰ−脂質転移がａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌のために必要となることが提案された。本明細書における「無βリポタンパク血症」とは、ＭＴＰ機能の機能的な欠損を引き起こす、ＭＴＰ遺伝子における変異の原因となる異常な脂肪代謝という遺伝性疾患に言及している。ＭＴＰは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を有する複合体として、小胞体（ＥＲ）中に存在しているタンパク質である。ＭＴＰは、最初は、細胞膜からリポタンパク質へ向けた脂質（トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、およびコレステロールエステル）の転移を促進したタンパク質として認識された。ＭＴＰは、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合において、２つの役割を果たす。すなわち、ＭＴＰは、（１）ａｐｏＢへの脂質の転移を促進することによって、ａｐｏＢを小胞体の内腔中に転位させ、（２）ａｐｏＢの折り畳みを促進する。ＭＴＰ活性を欠くときは、ａｐｏＢは小胞体中で効果的に分解される。ＭＴＰが機能的に不活性である結果、無βリポタンパク血症を有する患者の肝臓は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を合成することもできず、また、分泌することもできず、ＬＤＬ（これまではβリポタンパク質と表している）の血漿中濃度がほぼ検出できないレベル（例えば無βリポタンパク血症）まで減少することが引き起こされる。したがって、ＭＴＰ活性を阻害する薬は血漿中のＬＤＬ濃度を減少させるために有用であるだろうことが推論された。
【００２９】
一般に、無βリポタンパク血症は、ＭＴＰの欠損に起因して肝臓のａｐｏＢ含有リポタンパク質を生産せず、また、脂肪肝を示すことはないため、無βリポタンパク血症の肝臓における脂肪症の発現を妨げる代償的プロセスがあるに違いないことが推測された。この問題を解明するために、ＭＴＰの存在が欠損しているが、脂肪を蓄積した肝細胞培養モデル（Ｌ３５細胞）が調べられた。したがって、本発明は、ＭＴＰ遺伝子の転写が、転写の類似ＤＲ１プロモーター因子の存在を介して、肝臓（Ｌ−ＦＡＢＰ）によって、脂肪酸の取り込みを調節する他の遺伝子と協調的に調節されたことを明らかにしている。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰは共通の先祖遺伝子から派生していると考えられるため、類似ＤＲ１プロモーター因子の保有は、相関転写形質発現が生理学的に重要であることを提案している。後述の実験は、なぜＬ３５細胞はＭＴＰ−促進リポタンパク質分泌の無いときに脂肪を蓄積しないのかについてＭＴＰとＬ−ＦＡＢＰとの相関阻害が説明し得るということを示している。Ｌ−ＦＡＢＰがないとき、ＭＴＰの抑制は、脂肪の蓄積（脂肪症）を引き起こすことなく、肝臓のＶＬＤＬ分泌を減少させる。なぜならば、Ｌ−ＦＡＢＰが促進する脂肪酸の取り込みが欠失しているためである。
【００３０】
本発明に一態様では、主題の方法は、高脂血症のための治療計画の一環として用いられ得る。Ｌ−ＦＡＢＰとＭＴＰとは協調して、グリセロ脂質合成、および超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）分泌の中に脂肪酸を入れ替える。高脂血症は、血中に、上昇した濃度または異常な濃度の脂質および／またはリポタンパク質が存在することである。脂質（脂肪分子）は、タンパク質カプセル中に輸送され、脂質の比重およびタンパク質の種類は、上記粒子の最終結果、および代謝に対するその影響を決定する。したがって、本発明は、高脂血症を改善（例えば、阻害または抑制）のための組成物および方法を提供する。一実施形態において、ここで提供される高脂血症の治療のための方法は、Ｌ−ＦＡＢＰの抑制剤と組み合わせたＭＴＰの抑制剤とを、被験者または細胞に対する投与することを含む。
【００３１】
ここで定義されるＭＴＰ活性の抑制剤は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の肝臓による生産および血漿中ＬＤＬ濃度を減少させ、または抑制する。典型的なＭＴＰ抑制剤は、修飾されたジアミノインダン８ａＲ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｓｕｍｍｉｔ ＮＪ）である。肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、肝臓の実質細胞の細胞質ゾル中における非常に豊富な脂質が結合したタンパク質は、脂肪酸の輸送および利用を促進する。Ｌ−ＦＡＢＰ発現の遺伝子破壊は、グリセロ脂質生合成およびミトコンドリア酸化を含むいくつかの代謝経路中に、効率的に脂肪酸を運び込んで移動させるための、肝臓の能力を低下させる。
Ｌ−ＦＡＢＰの欠失は、肝外細胞用に脂肪酸を転用する。脂肪酸は直ちに取り込まれ、さらに、エネルギーおよび熱の生産のために骨格筋および心臓によって利用される。脂肪酸は脂肪組織によっても取り込まれ、脂肪組織ではトリグリセリドとして蓄えられ得る。したがって、ここで定義されたＬ−ＦＡＢＰ活性の抑制剤は、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現を減少または抑制する。模範的なＬ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−〔２−（４−メチルフェニル）−１−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である。
【００３２】
ＭＴＰの抑制剤と組み合わせて投与するときのＬ−ＦＡＢＰの抑制剤の能力は、肝臓脂肪症の発現を引き起こすことなく血漿中脂質を減少させるような血漿中脂質および肝臓脂質に対する併用治療の効果と、ＭＴＰ抑制剤を単独で用いた治療による効果とを、比較することによって決定され得る。
【００３３】
本明細書における「被験者」という用語は、主題の方法が実行された任意の個人または患者を言及している。大抵、被験者は人間であるが、当業者にとって明らかなように、被験者は動物であってもよい。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、猫、犬、ウサギ、家畜（牛、馬、ヤギ、羊、豚などを含む）、ならびに、霊長類（モンキー、チンパンジー、オラウータン、およびゴリラを含む）などの哺乳類を含む他の動物は、被験者の定義の内に含まれる。
【００３４】
「治療効果のある量」または「効果的な量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって求められる、組織、組織系、動物、または人間の生物学的反応または医学的反応を引き出すであろう、化合物または医薬組成物の量である。
【００３５】
「薬学的に許容可能な」という用語は、キャリアに関して用いられるとき、キャリア、希釈剤、または賦形剤が、剤形の成分と適合し、かつ、その受容者に対して有害にならないことを意味する。
【００３６】
「投与」または「投与すること」という用語は、治療を必要とする被験者に対して、本発明に係る化合物または医薬組成物を提供することの実行を含むように定義される。本明細書における「非経口的投与」および「静脈投与」という表現は、腸内投与および局所性投与以外の投与の形態であり、通常、注射による投与であり、制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内の注射および注入を含む。本明細書における「全身投与」「全身投与された」「末梢投与」および「抹消血管から投与された」という表現は、中枢神経系に対する直接的な投与以外の、被験者の系に入るような、化合物、薬剤、または他の物質の投与を意味しており、このため、例えば皮下投与など、代謝および他の類似のプロセスの影響下にある。
【００３７】
「アゴニスト（作用薬）」という用語は、受容体に対して生産的に結合し、その生物活性を模倣する作用物質または類似体を言及している。「アンタゴニスト（拮抗薬）」という用語は、受容体に結合はするが、正常な生物的反応を引き起こすことはない作用物質を言及している。アゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または正常な生物的反応を減少させる他の分子を含んでもよい。
【００３８】
本発明で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体について、その断片のみならず無傷分子を備えることを意味し、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、エピトープ決定基に結合することができるＦｖおよびＳＣＡ断片がある。
【００３９】
本明細書における「対応正常細胞」とは、同じ臓器由来の細胞であり、かつ、その細胞が調べられるときに同一性を有する細胞を意味する。一態様において、対応正常細胞は、健常人から得られた細胞試料から成る。このような対応正常細胞は、個人が検査される細胞を提供するとき、年齢を適合させたり、同じ性別であったりする必要はない。他の態様では、対応正常細胞は、高脂血症を有する被験者の組織のうち、その他の健康な部位から得られる細胞試料から成る。
【００４０】
本明細書では、「試料」および「生物試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を言及している。一実施形態において、本発明に係る生物試料は、例えば針生検からの試料である生検標本などの組織試料である。他の実施形態では、本発明に係る生物試料は、例えば血清、血漿、尿、精液などの体液試料である。
【００４１】
本明細書では、「低減」および「抑制」という用語は一緒に使用される。例えばＭＴＰ活性が特定の分析の検出レベルより下まで減少し得る場合など、場合によっては減少が認められるためである。それ自体は、上記活性が分析の検出レベルより下まで「低減」されるか、または、完全に「抑制」される否かについて、常に明らかにならない可能性がある。それでもなお、本発明の方法に係る治療を受けて、ＭＴＰ活性レベルは治療前のレベルから少なくとも低減されることが明確に決定できるだろう。
【００４２】
一実施形態において、高脂血症を治療するための方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ならびに、サイレンスＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰ活性を誘発するために、例えば二重差ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸について治療効果のある量を被験者に投与することを含む。ＲＮＡｉは、さまざま種類の有機体および細胞中へのｄｓＲＮＡの導入が、完全なｍＲＮＡの分解を引き起こすという現象である。細胞中、長いｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼによって、短い（例えば２１〜２５ヌクレオチド）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になるよう切り裂かれる。その後、ｓｉＲＮＡは、上記プロセスに巻き込まれて、タンパク質成分と共にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体内に会合する。次に、活性化ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡｔの間の塩基対合相互作用によって、転写物に対して完全に結合する。次に、結合ｍＲＮＡは切断され、ｍＲＮＡの配列特異的な分解は遺伝子サイレンシングをもたらす。本明細書において、「サイレンシング」とは、大部分の染色体ＤＮＡを中断するメカニズムであり、このメカニズムは特定遺伝子の発現の抑制をもたらす。ＲＮＡｉ機構は、内因性転移因子（トランスポゾン）およびウイルス感染から、遺伝子を守るために進化していることが明らかである。したがって、ＲＮＡｉは、以下の実施例に記載されているように、分解されるターゲットＲＮＡと相補的な核酸分子を取り込むことによって誘発されることができる。
【００４３】
他の実施例では、主題の抑制剤を用いて、被験者の高脂血症を改善または治療する方法を提供する。本明細書では、「改善」または「治療」という用語は、臨床的症状および／または高脂血症と関連した徴候が、行われた行為の結果として減少することを意味する。モニターされる上記症状または上記徴候は、高脂血症の特徴であり、かつ、上記症状および状態をモニターするための方法として、技術のある臨床医学者によく知られているだろう。例えば、脂質濃度の化学的測定は、昔から最も用いられる臨床的測定である。それが個々の結果との最良の相関関係を有しているためだけではなく、この実験方法が安上がりであり、さらに広範囲に利用できるためである。しかしながら、数値がより高性能な方法についての証拠および認識が増加している。具体的には、ＬＤＬ粒子数（濃度）は、より小さなサイズであるほど、上記粒子の中に含まれるＬＤＬの全濃度の科学的な測定法を用いて得られるよりも、アテローム性動脈硬化および心血管系イベントの発現とのより密接な相関関係を示す。ＬＤＬコレステロール濃度は低くなり得るが、それにもかかわらずＬＤＬ粒子数が高いと心血管系イベントの確率は高い。
【００４４】
本発明の他の態様では、主題の方法は、肝臓脂肪症を引き起こすであろう任意の兆候のための治療計画の一部として用いられ得る。本明細書における「癌」という用語は、これに限定されないが、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍などの、任意の悪性腫瘍などを含む。例えば、本発明に係る組成物および方法は、肝癌など、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇によって特徴付けられる任意の癌の治療のために用いられてもよい。本明細書では、「肝癌」は肝臓の上皮性悪性腫瘍を言及している。癌は、ひいては周囲の組織へ侵入して破壊を行うことになる、抑制されていない細胞分裂／または異常な細胞分裂によって生じる。本明細書では、「増殖型の」および「増殖」は細部が有糸分裂を起こすことを言及している。本明細書では、「転移」は、元の光景からの悪性腫瘍の遠位の広がりを言及している。癌細胞は、血流を介して、リンパ系を介して、体腔を超えて、またはそれらの複合によって、転移する可能性がある。場合によっては、癌の治療は、固形癌の治療または転移の治療を含んでいるだろう。転移は、形質転換細胞または悪性細胞が移動して、ある場所から他の場所へ癌を広げるような癌の形式である。
【００４５】
本明細書における「癌性細胞」という用語は、本明細書における任意の１つの癌状態にかかった細胞を含んでいる。したがって、本発明に係る方法は、メラニン細胞、グリア細胞、前立腺肥大、および多発性嚢胞腎の良性肥大の治療を含む。「上皮性悪性腫瘍」という用語は、周囲の細胞に侵入する傾向がある上皮細胞で構成されており、かつ、転移を引き起こす悪性新腫瘍を言及している。
【００４６】
ある実施形態では、本発明の化合物については、このような治療を必要とする被験者に対して、抗炎症剤、抗菌剤、抗ヒスタミン剤、化学療法薬、血管新生阻害剤、免疫賦活剤、治療抗体、または例えばチロシンキナーゼ阻害剤などのプロテインキナーゼ阻害薬と組み合わせて投与する。本発明の化合物と組み合わせて投与してよい他の薬剤は、サイトカインなどの治療薬、免疫調節薬、および、抗体を含む。限定される必要はないが、抗菌剤は、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、および駆虫薬を含む。他の治療薬が本発明の化合物と組み合わせて採用される場合、例えば米医薬品便覧（ＰＤＲ）に記載されたような量で用いてもよいし、または、当業者によって決定された別の方法で用いられてもよい。
【００４７】
本明細書において「サイトカイン」は、ケモカイン、インターロイキン、リンフォカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、および受容体関連プロテイン、ならびに、それらの機能的な断片を含む。模範的なサイトカインは、これに限定されないが、内皮単球活性ポリメラーゼII（ＥＭＡＰ−II）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３、インターフェロンなどを含んでおり、これらは、細胞または細胞メカニズムにおける特定の生物学的変化、形態学的変化、表現型の変化と関与する。
【００４８】
ＦＡＯラットの肝臓細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰを発現し、かつ、ＶＬＤＬを集めて分泌する一方、ＦＡＯ細胞からの単細胞クローンに由来するＬ３５細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰを発現もせず、また、ＶＬＤＬを集めて分泌もしない。それについて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのプロモーター中に存在する保存ＤＲ１プロモーター要素が転写、発現、およびＶＬＤＬ生産に対してどのように影響を与えるのかを解明するために、肝臓細胞が用いられた。ＦＡＯ細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターおよびＭＴＰプロモーターの両方のＤＲ１要素は、ＰＰＡＲαＲＸＲαによって占められる。ＰＰＡＲαＲＸＲαは、ＰＧＣ−１βと共に転写を活性化する。その一方、Ｌ３５細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターおよびＭＴＰプロモーターの両方のＤＲ１要素はＣＯＵＰ−ＴＦIIによって占められ、転写は減少される。これらの結果を組み合わせると、ＰＰＡＲαＲＸＲαおよびＰＧＣ−１βは、協調的に、各遺伝子の近位プロモーターにおけるＤＲ１サイトを目指してＣＯＵＰ−ＴＦIIと競争することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を上昇させることが示される。さらなる研究では、Ｌ−ＦＡＢＰの除去は、ＭＴＰ抑制剤を用いて治療されたマウスにもたらされる肝臓脂肪症を防止することが示される。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの調整された転写の変化は、肝臓脂肪症を引き起こすことなく、ＶＬＤＬ分泌へ脂肪酸が入ることに合わせて変化する。
【００４９】
本明細書において、「脂肪症」という用語は、細胞内の脂質の異常な保有を説明するプロセスを言及している。脂質（通常はトリグリセリドおよびコレステロールエステル）の合成、移動、および分解の正常なプロセスの機能障害を反映する。過剰な脂質は、細胞質と置き換えられて、細胞内膜中および小胞中に蓄積する。小胞が細胞核をゆがめるのに十分な程度に大きいとき、この状態は、大血管脂肪症として、あるいは微小空胞変性として知られている。軽症の細胞にとって特に有害ではないが、膜構造を変化させたり、膜機能や細胞の生存能力を害したりすることがある。これに関して、「脂肪症」は、臓器の間質組織中における脂肪の蓄積を含む。脂肪症に関連する危険因子は多様であり、炎症性の脂質およびサイトカインの生産を含む。炎症反応を促進する（炎症性の）脂質およびサイトカインは、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、悪性腫瘍、高血圧、細胞毒性、肥満、および酸素欠乏症を引き起こす。肝臓が脂質代謝の主要臓器であるように、肝臓は脂肪症と最も深く関係するが、脂肪症は、腎臓、心臓、および筋肉に共通して、任意の臓器に起こり得る。肝臓脂肪症は、肝硬変および肝細胞癌など、重度の肝臓病の発現を増進する。
【００５０】
本発明の方法における有用な抑制剤は、任意の遺伝子導入法によって細胞中に導入されてもよい。本明細書で示唆されるように、遺伝子治療のために利用できる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。多くの既知のレトロウイルスは、形質導入細胞を同定して生成することができるように、選択マーカーのための遺伝子を導入する、または組み込むことができる。例えば、特定の標的細胞における受容体のためのリガンドをコードする他の遺伝子と共に、目的対象のポリヌクレオチド配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは標的特異性となる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするヌクレオチドを挿入することによって、標的特異性の状態になる。好ましい標的は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって得られる。アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な転移を可能にするために、レトロウイルス遺伝子中に挿入することができる特異的なポリヌクレオチド配列について、当業者は知っているか、または実験を行うことなく容易に解明できるだろう。
【００５１】
本発明は、また、本発明に係る治療に適している癌細胞（例えば肝細胞）を同定するための方法を提供する。上記方法は、例えば、治療する細胞試料中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルを測定すること、ならびに、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現または活性が対応正常細胞中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルと比較して上昇することを測定することによって、実行されてもよい。上記対応正常細胞は、正常（例えば癌でない）細胞の試料としてもよい。対応正常細胞と比較して、癌細胞中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルが上昇したことを測定することは、細胞が治療によって良い影響を受けているということを示している。本発明において用いられる細胞試料は、被験者からの組織試料または体液、あるいは、生検処置（例えば針生検）または腫瘍の切除および／または減量のための外科的処置によって得られた組織から得られる。
【００５２】
一実施形態において、治療に適している癌細胞を同定するための方法は、さらに、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせたＭＴＰ抑制剤と細胞を接触させること、ならびに、接触の後におけるＭＴＰ活性およびＬ−ＦＡＢＰ活性の減少を測定することを含んでもよい。このような方法は、癌細胞が上記治療に適していることを確かめるという意味を提供する。
【００５３】
他の実施形態において、治療の影響を受けやすい癌細胞を同定する方法は、細胞を、ＭＴＰコードするまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能性断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡなどの核酸分子と接触させること、および、接触後の細胞において、ＭＴＰの発現または活性についての減少を検出することを、さらに含んでもよい。このような方法は、癌細胞がこの治療の影響を受けやすいことを確かめるための手段を提供する。さらに、上記方法は、単独または組み合わせによる抑制剤の影響のために、１つ以上の異なる核酸分子を検査することを含んでもよく、それ故、試験される特定の癌を治療するために有用な１つ以上の核酸分子を同定するための手段が提供される。
【００５４】
それに応じて、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写がどのように協調して調節されるかについて明らかにするために、ＶＬＤＬの会合および分泌について別個の能力を示す、肝細胞の２つの別個の系統（Hui et al., 2002; Kang et al., 2003）の利用を説明する。ＦＡＯ細胞、すなわち、肝臓リポタンパク質の合成および分泌を研究するために用いられているラットの肝臓細胞系（Scarino and Howell, 1987a; Scarino and Howell, 1987b）は、Ｌ−ＦＡＢＰとＭＴＰとの両方を発現し、かつ、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌する能力を示す。一方、ＦＡＯ細胞からの単細胞クローンとして得られたＬ３５細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰもＭＴＰも発現せず、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌する能力を欠いている。これらを組み合わせたデータは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰが共通の祖先の脂質結合タンパク質から派生したという提議（Phelps et al., 2006）を支持する。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現の同時的変動、および脂肪酸基質の供給に適応できるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的機能とを保証する共通の構造が保存され、一方、プロモーターにおけるＤＲ１サイトの保有は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰについての別個の脂質輸送機能を進化させた。
【００５５】
したがって、本明細書で提供されるデータは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写が、脂肪酸リガンドにより活性化する転写因子（ＰＰＡＲα−ＲＸＲα）またはＣＯＵＰ−ＴＦIIのいずれかによる類似ＤＲ１要素との競合的結合に基づいて調節されることを示している。このように、２つの脂質輸送タンパク質、すなわち、互いに協調して機能するＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現は、脂肪酸の利用可能性に応えて協調的に調節され得る。肝臓による脂肪酸の利用をめぐって競争する、機能的に異なる多くの経路が存在する。これらは、細胞取り込み、他の脂質（例えばグリセロ脂質、およびコレステロールエステル）の生産におけるエステル化、β酸化、主にＶＬＤＬ脂質の形成における蓄積および輸出を含む。これらの経路の１つ以上に向けての脂肪酸の輸送は、エネルギーおよび基質恒常性を保つために、迅速かつ選択的に変化しなくてはならない。基質主導の「フィードフォワード（正方向送り）」の転写調節は、恒常性と効率の良さとの両方を可能にする共通のメカニズムであり、同時的に存在する利用に適している（Wall et al., 2005）。脂肪酸は、Ｌ−ＦＡＢＰ（Poirier et al., 2001）およびＭＴＰ（Ameen et al., 2005）についてのＰＰＡＲα依存遺伝子の転写を活性化することもできるため、肝臓への脂肪酸流動は、脂質合成基質を提供するのと同様に、ＶＬＤＬ会合／分泌を調節する酵素を誘導する。
【００５６】
証拠となる複数の系は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰプロモーターに存在する類似ＤＲ１要素が、ＶＬＤＬ会合／分泌の経路に向かって脂肪酸を輸送するとき、これら２つの脂質輸送タンパク質の相互依存的な役割に必要な協調転写制御を提供することを示している。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ両方のプロモーターのレポーター構築における、ＤＲ１要素の突然変異欠損は、（１）ＦＡＯ細胞により提示される比較的高い活性レベルが、Ｌ３５細胞によって提示される低いレベルへ還元されること（図１Ｃ）、および（２）転写を抑制または活性化するＣＯＵＰ−ＴＦII（図２Ｂ）またはＰＰＡＲα−ＲＸＲα（図４Ａ）の作用薬の能力が無効にさせる。これらのＤＲ１要素が、ＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）またはＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）による競争的な占有に関与する、機能的に意味のある同起源の結合部位であるということを示すためのさらなる証拠は、ＥＭＳＡスーパーシフト解析（図２のＬ−ＦＡＢＰおよびKang et al.,2003のＭＴＰ）ならびにＣｈＩＰ解析（図３）によって提供される。ＤＲ１要素についての相補的なＥＭＳＡスーパーシフトとＣｈＩＰとの実験から得られる複合解析は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαによる占有が両方の遺伝子の転写活性と関係いる（ＦＡＯ細胞）と同時に、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによる占有が抑制に関係している（Ｌ３５細胞）ということを協調的に示す。
【００５７】
ＦＡＯ細胞およびＬ３５細胞により示されるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現における表現型の違いに関与する主要な決定要因は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）とＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）との相対的な細胞の中身である。３つの独立的な実験は、ＦＡＯ細胞およびＬ３５細胞の細胞表現型における可塑性が、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）と比較したＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）の細胞内容物に依存することを実証する：（１）ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬を有するＬ３５細胞の治療は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）の発現を増加させる一方、ＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）の発現を減少させ（図５Ａ）；（２）ＰＰＡＲα−ＲＸＲα／ＣＯＵＰ−ＴＦIIについての細胞内容物におけるこれらの変化は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターに存在するＤＲ１の占有における類似変化に反映され（図５Ｂ）；（３）その結果、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築体の転写活性おいて、ＤＲ１サイト依存性が増加し（図４Ｂ）；ならびに、（４）Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの発現増強がもたらされる（図４Ａ）。さらに、Ｌ３５細胞における作用薬が媒介する変化は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌するための回復能力と関係している。
【００５８】
ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、近位プロモーター領域におけるＤＲ１サイトへの結合によって、Ｌ−ＦＡＢＰの転写を活性化することが見られている（Poirier et al., 1997）。ＰＰＡＲα作用薬を用いた野生型（ただしＰＰＡＲαノックアウトではない）マウスの治療は、ＭＴＰの肝臓での発現を増加させた（Ameen et al., 2005）。これらの事項および脂肪酸代謝に関連した遺伝子の翻訳調節を調べる研究から得られた追加所見（Cabrero et al., 2003; Carter et al., 1994; Miyata et al., 1993; Palmer et al., 1994）は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαおよびＣＯＵＰ−ＴＦIIがＤＲ１プロモーター要素に結合するために互いに競争するという提言を支持している。これらの遺伝子との関連において、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαによるこの要素の占有は転写の活性化と関連し、一方、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによる占有は転写抑制と関連する。
【００５９】
本明細書に開示される発見は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬が媒介する誘導のために、ＰＧＣ−１βが必要とされることを示す（図７Ｃ）。ＰＰＡＲα−／−マウスのＰＰＡＲα作用薬は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を誘導しなかったが（図４）、ＰＧＣ−１βｍＲＮＡの肝臓発現は２倍に増加した。このデータは、ＰＰＡＲαの欠損状態において、ＰＧＣ−１βは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を増加させるのに十分ではないということを示唆する。アデノウイルスが媒介するＰＧＣ−１βの発現を用いた追加実験は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写を増進するために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαが必要となることを示す。この複合的な所見は、ＰＧＣ−１βがＭＴＰの転写活性化に関与するという提言（Lin et al., 2005; Wolfrum and Stoffel, 2006）を支持する。ｏｂ／ｏｂ糖尿病性マウスにおいて、アデノウイルスが媒介するＰＧＣ−１βおよびＦｏｘａ２の発現は、ＭＴＰ発現を誘導し、インシュリンがＶＬＤＬ会合／分泌を阻害するメカニズムを提案する（Wolfum and Stoffel, 2006）。Ｆｏｘａ２はｏｂ／ｏｂマウスの核から完全に除かれる（Wolfrum et al., 2004）が、しかし一方、ＭＴＰ発現とＶＬＤＬ会合／分泌との両方は増加する（Bartels et al., 2002）ということが実証されている。さらに、ｏｂ／ｏｂマウスには、ＰＧＣ−１βが媒介するＭＴＰ発現の増加が保存されており、ＭＴＰ転写の誘導がＦｏｘａ２非依存性メカニズムを介して生じ得るということが示される（Wolfrum and Stoffel, 2006）。脂肪肥育された高脂血症のマウスにおいて、ＳＲＥＢＰおよびＬＸＲαのＰＧＣ−１β活性化は、ＭＴＰ発現およびＶＬＤＬ会合／分泌の増進に関係する（Lin et al., 2005）。ＰＧＣ−１βは、ＰＰＡＲαと相互作用することができ（Lin et al., 2002b）、かつ、ＰＰＡＲα標的遺伝子の転写を活性化する（Lin et al., 2003）。したがって、所見は、ラットの肝臓癌細胞との関連において、ＰＧＣ−１βはＰＰＡＲα−ＲＸＲαを活性化するということを示す（図８）。
【００６０】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのプロモーターにおける類似ＤＲ１要素の保有は、それらの発現がエネルギーの十分な転用を脂肪酸の形でＶＬＤＬ会合／分泌経路に提供するために十分に誘導されるだろうことを確実にすることを、複合データは示している。Ｌ−ＦＡＢＰの除去は、ＭＴＰ抑制剤を用いて治療されたマウスの肝臓において、トリグリセリドの蓄積を阻害することを示す追加研究（図９）によって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現が協調的に減少されることの重要性が明確に示された。これらの発見は、高脂血症を改善することを目的としたときのＭＴＰ抑制剤の有効性に関して、重要な意味合いを備えている。
【００６１】
先に示したとおり、ＭＴＰ抑制剤は高脂血症を減少させるために効果的な治療法であるように思われるが、その使用は脂肪肝の発現に関連する（Bjorkegren et al., 2002; Liao et al., 2003）。本明細書の提供するデータは、Ｌ−ＦＡＢＰの除去がＭＴＰ抑制剤８ａＲを用いて治療したマウスの肝臓におけるトリグリセリドの蓄積を完全に阻害することを示す（図９Ｂ）。したがって、これらの研究は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方の機能および／または発現のいずれかを阻害する薬剤が、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、高脂血症を減少することを示す。
【００６２】
別の態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス感染を改善するための方法、および、炎症性肝疾患、線維症、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌の発現を減少するための方法を提供する。ＨＣＶ粒子の生産および輸送に関与するプロセスは、血漿リポタンパクの生産および輸送と関連する多くの態様を共有する。ＨＣＶはリポタンパク複合体を形成し、かつ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの両方の構成要素として血漿中に輸送される（Andre et al., 2005, Hepatitis C virus particles and lipoprotein metabolism. Semin liver Dis 25:93-104）。ＨＣＶの肝臓での生産は、ＶＬＤＬの分泌と同様に、ＭＴＰの発現および活性を低下させる（Domitrovich, et al., 2005, Hepatitis C virus nonstructural proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion. J BiolChem 280:39802-39808）。ＭＴＰの抑制は、ＨＣＶに感染した被験者が血漿脂質濃度の変化を示し（Siagris, et al., 2006, Serum lipid pattern in chronic hepatitis C: histological and virological correlations. J Viral Hepat 13:56-61）、さらに、その被験者の肝臓が脂肪症を発現する（Mirandola, et al, 2006, Liver microsomal triglyceride transfer protein is involved in hepatitis C liver steatosis. Gastroenterology 130:1661-1669）ことの理由について説明するだろう。逆に言えば、ＭＴＰ抑制剤は、肝臓癌細胞によるＨＣＶの生産を阻害する（Huang, et al., 2007, Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lopoproteins. Proc Natl Acad Sci USA 104:5848-5853）。本発明は、脂肪症の発現を引き起こすことなく、ＭＴＰ（ひいてはＨＣＶの生産）を抑制する方法を説明する。したがって、ＨＣＶに感染した被験者に対してＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤とを同時に投与することは、ＨＣＶの生産を減少し、かつ、慢性ＨＣＶ感染、脂肪症の発現、肝硬変、および肝不全と関連する病状を改善するだろう（Hwang, et al., 2001, Hepatic steatosis in chronic hepatitis C virus infection: prevalence and clinical correlation. J Gastroenterol Hepatol 16:190-195）。
【００６３】
本発明の別の態様では、癌（例えば肝臓癌）および／または高脂血症を治療するために有用な薬剤を同定するための方法が提供される。本発明の任意の方法において有用な薬剤は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、ビニル性ペプトイドなどのペプチド、有機小分子など、任意の種類の分子であってもよく、また、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少または抑制を促進する任意の様々な過程に作用してもよい。薬剤については、特定の種類の癌／高脂血症を治療するために用いられる典型的な薬剤の何らかの方法で投与してもよく、または、標的癌細胞と薬剤の接触（また適切な場合、細胞中への侵入）を容易にする条件の下で投与してもよい。例えば、細胞中へのポリヌクレオチド薬剤の導入は、細胞に感染し得るウイルスベクター中にポリヌクレオチドを組み込むことによって容易にされてもよい。細胞の種類に特異的なウイルスベクターが入手できない場合、ベクターは、標的細胞上で発現されたリガンド（または受容体）に対して特異的な受容体（またはリガンド）を発現するために修飾されてもよく、または、リポソーム内に封入されてもよい。また、上記リポソームも、このようなリガンド（または受容体）を含むために修飾されてもよい。ペプチド薬剤は、様々な方法によって細胞中に導入されてもよい。例えば、細胞中へのペプチドの転位を容易にすることにできる、人免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質導入ドメインなどのタンパク質導入ドメインを含むように、ペプチドを設計する方法などによってもよい。概して、薬剤は、被験者へ投与するのに適切な組成物（例えば医薬組成物）に処方される。このように処方された薬剤は、高脂血症、または一部分においてＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての活性または発現の上昇によって特性を示す癌を患う被験者を治療するための薬剤として有用である。
【００６４】
典型的には、候補薬剤は有機分子であり、１００ダルトンよりも大きく、約２５００ダルトンよりも小さい重さの分子を有する有機小化合物（例えば小分子）であることが好ましいとはいえ、候補薬剤は多数の化学的分類を包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特には水素結合のために必要な官能基を含んでおり、典型的には、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含んでおり、少なくとも２つの化学官能基を含んでいることが好ましい。候補薬剤は、多くの場合、１つ以上の上記官能基と置換された、炭素環構造もしくは複素環構造、および／または、芳香族構造若しくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの複合体を含む生分子の間にも検出される。
【００６５】
候補薬は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様の源から得られるだろう。例えば、任意抽出されたオリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様の有機化合物および生分子についての、無作為または指向性のある合成のために、多数の手段が利用できる。あるいは、バクテリア、真菌、植物、および動物の抽出物の形である天然化合物のライブラリーが利用できる、または、容易に生産される。さらには、天然または合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段、および生物学的手段を介して容易に修飾される。既知の薬理作用のある薬剤が、構造的類似体を生産するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など、無作為または指向性のある化学的修飾を受けてもよい。
【００６６】
別の態様では、本発明の方法は、オーダーメイド医療を実施する方法を提供することのために有用である。オーダーメイド医療では、被験者の高脂血症または癌細胞の個別の特性に基づいて、治療が被験者に合わせられる。例えば、少なくとも１つの検査薬、またはＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ抑制剤と、被験者由来の細胞試料とを接触させることによって、本方法を実施してもよい。ここで、検査薬または抑制剤を欠くときのＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現と比較して、検査薬または抑制剤存在下におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現が減少すると、その減少は、上記薬剤または抑制剤を、疾患を治療するために有益であると同定する。本発明の方法に従って検査する細胞試料は、治療する予定の被験者から得られてもよく、または、確立された癌細胞系の細胞、もしくは被験者のものと同じ種類である既知の高脂血症の細胞であってもよい。一態様では、確立された細胞系は、このような細胞系の一団の１つであってもよい。ここで、上記一団は、同じ種類の疾患の異なる細胞系、ならびに／または、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現の上昇値と関係する、異なる疾患の異なる細胞系を含んでもよい。このような細胞系の一団は、例えば、治療する被験者から少数の細胞しか得られないときに、被験者の細胞の代用試料を提供するため、本発明の方法を実施するために有用であり、また、本発明の方法を実施するときのコントロール試料として有用となるだろう。
【００６７】
いったん、疾患が明らかとなり、治療プロトコルを開始すれば、被験者におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現の値が、健常被験者に観察される値に近似し始めるかどうかを評価するために、本発明の方法を定期的に繰り返してもよい。数日間から数ヶ月間の測量期間にわたる治療の効果を示すために、連続的な分析から得られる結果を用いてもよい。よって、本発明は、高脂血症を有する被験者を治療するために、治療規制をモニタリングする方法も指示している。治療前と治療中とにおけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現のレベルを比較すれば、治療の効果が示される。これによって、当業者は、必要に応じて治療的なアプローチを認識し、かつ調節することができるだろう。
【００６８】
全ての方法は、さらに、１つ以上の補助的な成分を構成する、薬学的に受容可能なキャリアと、有効成分とを関連させる工程を含んでもよい。被験者に投与するための薬剤を処方するために有用である、薬学的に受容可能なキャリアには、当技術分野で周知のように、例えば、水もしくは緩衝生理食塩水などの水溶液もしくは他の溶媒、グリコールもしくはグリセロールなどの賦形剤、オリーブオイルなどの油、または注射用有機エステルが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアには、例えば、複合体の吸収を安定するまたは増加する役割を果たす、生理学的に許容可能な化合物が挙げられる。このような生理学的に許容可能な化合物には、例えば、グルコース、サクロース、もしくはデキシトリンなどの糖質、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤などが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアの選択は、例えば、治療薬の物理化学的な特性、および化合物の投与経路に基づくことについて、当業者は分かるだろう。ここで、投与経路には、例えば、経口、または、静脈注射などの非経口、および、注射、挿管、または従来知られている他の方法によるものがあるだろう。医薬組成物は、例えば癌の化学的療法薬および／またはビタミンなど、診断用薬、栄養物質、トキシン、または治療薬などの、第２（またはそれ以上）の化合物を含んでもよい。
【００６９】
本発明の抑制剤を含む組成物の投与経路は、ある程度、分子の化学的構造に依存するだろう。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、経口で投与されると、消化管で分解されるため、特に有用ではない。しかしながら、例えば、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれを、内因性ヌクレアーゼまたは内因性プロテアーゼによる分解の影響され難くする、あるいは、消化管を介してより吸収されるようにするために、それらを化学的に修飾する方法がよく知られている（例えば、Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92, 1995; Ecker and Crook, Bio Technology, 13:351-360,1995参照）。例えば、ペプチド剤は、Ｄ−アミノ酸を用いて調製されてもよいし、または、ペプチド模倣薬に基づいた１つ以上のドメインを含んでいてもよい。ここで、ペプチド模倣薬は、ペプチドドメインの構造を模倣しているか、または、ビニル性ペプトイドなどのペプチドに基づいている有機分子である。抑制剤がステロイドアルカロイドなどの有機小分子である場合、その抑制剤については、体内（例えば肝臓内）の所望の位置で活性薬剤を開放する形状で投与してもよく、または、抑制剤が標的細胞（例えば肝臓癌細胞）を循環するように血管中に注射することによって投与してもよい。
【００７０】
例となる投与経路には、これに限定されないが、経口または静脈内、膣内、皮下、腹腔内、直腸内、もしくは嚢内などの非経口、または適切な場合、例えば皮膚用パッチ剤もしくは経皮イオン導入などの皮膚利用を介した受動的吸収もしくは促進的吸収のそれぞれが挙げられる。さらには、医薬組成物は、注射、挿管、もしくは経口によって、または局所的に投与してもよい。その局所的な投与とは、例えば軟膏の直接的な塗布による受動的なものであってもよく、または、その組成物の１つ成分が適切な高圧ガスである場合には、鼻内噴霧もしくは鼻孔吸入を用いた能動的なものであってもよい。上述したように、医薬組成物については、例えば、癌を供給する血管中への静脈内投与または動脈内投与など、癌部位に投与してもよい。
【００７１】
本発明の方法の実施において投与する化合物または組成物の総量については、単回投与として、ボーラスまたは輸液によって、比較的短い期間にわたって投与してもよいし、あるいは、長期間わたって複数回投与するための分割治療プロトコルを用いて投与してもよい。被験者の高脂血症または肝臓癌を治療するための、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現の抑制剤の量が、投与経路および投与が行われる治療の回数と同様に、被験者の年齢および総体的な健康を含む多くの要因に基づくことは、当業者は分かるだろう。これらの要因を考慮して、当業者は、必要に応じて特定の量を調節するだろう。概して、医薬組成物の処方ならびに投与経路および投与回数は、第１相および第２相臨床試験を用いて、始めに決定される。
【００７２】
本発明の方法については、例えば培養液中または固形担体上などの生体外で、細胞試料と接触することによって実施してもよい。あるいは、それに加えて、上記方法は、例えば実験動物（例えばヌードマウス）中に癌細胞試料を導入すること、または、実験動物中に検査薬または組成物を投与することによって生体内で実施してもよい。生体内分析の利点は、生きた動物で、ひいては臨床状態をより厳密に模倣して、検査薬の効果を評価し得ることにある。一般に、生体内分析はよりコストが高いため、生体外方法を用いて「先導（リード）」薬剤の同定の後に、二次スクリーニングとして用いることが特に有用であるだろう。
【００７３】
本方法は、生体外分析として実施されるとき、スループット法（高速大量処理法）に適応する。よって、独立的に、並行して同じものである、または異なるものである、複数個（すなわち、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の細胞試料および／または検査薬の試験が可能になる。スループット法は、検査薬が単一の被験者に由来するいくつかの細胞試料を検査できるなど、多数の利点を提供する。ひいては、例えば、被験者に投与する薬剤の特定の効果的な濃度を同定したり、被験者に投与する特定の効果的な薬剤を同定したりすることが可能になる。このように、スループット法は、最もよい（最も効果的な）薬剤または薬剤の組み合わせを治療手段に用いることができるように、被験者の癌細胞上で、２つ、３つ、４つ、それ以上の異なる検査薬を、単独または組み合わせて試験することを可能にする。さらには、スループット法によれば、例えばコントロール試料（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）を、検査された薬剤を用いて効果的に治療されるだろう既知の細胞試料などの検査試料と並行して実施することが可能になる。
【００７４】
本発明のスループット法は、任意の様々な手段で実行され得る。例えば、異なる被験者から得られた、異なる細胞試料を、同一または異なる量の、１つまたは複数の検査薬を用いて並行に試験してもよい。あるいは、一人の被験者から得られた２つ以上の細胞試料を、１つまたは複数の検査薬についての、同じまたは異なる量を用いて試験してもよい。加えて、同じまたは異なる被験者の細胞試料を、検査薬および／または既知の効果的な薬剤の組み合わせを用いて試験してもよい。これらの例示された様々は形態は、癌の治療のために有用な薬剤または薬剤の組み合わせを同定するために用いられてもよい。
【００７５】
本方法をスループット法（または超スループット法）により実行するときは、固形担体（例えばマイクロタイタープレート、シリコンウエア、またはスライドガラス）の上で実行してもよい。ここで、検査薬と接触させる試料については、各々が互いに線引きされるように（例えば、ウエル中にあるように）配置する。任意の数の試料（例えば、９６、１０２４、１０，０００、１００，０００、またはそれ以上）については、特定の使用された単体に基づいて、このような方法を用いて並行に検査してもよい。試料をアレイ状（すなわち規定されたパターン）に配置する場合、アレイ状の各試料は、その位置によって（例えばＸＹ軸を用いて）定義され得る。よって、各試料のための「アドレス」が提供される。アドレス可能なアレイ形式を用いることの利点は、細胞試料、薬剤、および検査薬などを、所望の時間に、特定の位置に施す（または特定の位置から取り除く）ことができ、かつ、試料（または資料の分割単位）における、例えばＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現の減少をモニターすることができるように、本方法を、全体的にまたは部分的に、自動化することができることである。
【００７６】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、本発明の解析において用いられてもよい。全てのコントロールおよび検査試料については、統計学的に顕著な結果を得るために、少なくとも３倍、実行することが好ましい。全ての試料の培養については、薬剤がタンパク質に結合するために十分な時間行う。培養後、全ての試料を、非特異的に結合した物質がないように洗浄し、概して、ラベル標識された薬剤の結合量を決定する。例えば、放射性標識を採用する場合、結合した化合物の量を決定するために、シンチレーションカウンタによって試料を計測してもよい。
【００７７】
スクリーニング検定中に、他の様々な薬剤を用いてもよい。これらには、塩、アルブミンなどの天然タンパク質、洗剤などの試薬が挙げられる。これらを、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進したり、非特異的またはバックグラウンドの相互作用を減少させたりするために用いてもよい。プロテアーゼ抑制剤、ヌクレアーゼ抑制剤、抗菌剤など、分析の効率を向上させる他の試薬もまた同様に用いてもよい。成分の混合体を、結合に必要な条件を与える任意の順序で加えてもよい。
【００７８】
全ての条件が各測定に対して同様の状態において、もしくは様々な条件下で、検査薬を用いて、もしくは検査薬を用いずに、または癌などの病状の異なるステージにおいて、測定が行われ得る。例えば、検査薬が存在する状態で、および検査薬が欠失した状態で、細胞中、または細胞集団中において、測定が行われ得る。他の例では、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法薬などの薬剤、放射線、発癌物質、または他の細胞（例えば細胞−細胞接触）など、生理学体信号の暴露が存在するもしくは欠失した状態で、またはその暴露の前もしくは後で、細胞が評価されてもよい。さらにもう１つの例では、同じ条件において、および、１つの細胞もしくは細胞集団と、他の細胞もしくは他の細胞集団との間で変更された条件で、Ｄｋｋ活性の測定が行われる。
【００７９】
他の態様では、本発明は、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現についての１つ以上の抑制剤を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現についての１つ以上の抑制剤から構成される医薬組成物を含むキットを提供する。含まれる抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能的断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡであってもよく、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能的断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡであってもよい。他の実施形態では、上記キットは、本発明の方法を実施するための説明書を含む。
【００８０】
以下の例は、本発明の利点および特徴をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲がこれに限定されることを意図していない。それらは典型的な使用例であるが、当業者に知られた手順、方法論、または技術が代わりに用いられてもよい。
【実施例１】
【００８１】
（Ｌ−ＦＡＢＰ発現の除去による肝臓脂肪症の発現の防止）
この例は、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現を防止するための方法として、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤を使用することを実証している。
【００８２】
細胞培養：細胞は、（Kang et al., 2003）に記述されているように培養し、形質転換した。ＦＡＯ細胞はコロラド大学から無料で得られた。Ｌ３５細胞は（Leighton et al., 1990）に記載されているように得られた。
【００８３】
細胞は、マイナー変更（Kang et al., 2003）と共に、LipofectAMINE薬剤（Invitrogen）を用いて、メーカーの手順にしたがって形質転換した。形質転換の１日前に、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞（２×１０５）を１２ウエルのプレートに蒔いた。形質転換の当日、０．８μｇのプロモーター／ルシフェラーゼレポーター構築、および、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの正常化のための内部調整として、６ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドを細胞に導入した。並行実験から、空ベクターの活性と比較して、規格化したｐＲＬ−ＣＭＶ活性を記録した。図の説明文に示すように、様々な量のＣＯＵＰ−ＴＦII発現ベクターを加えた。空ベクターｐＣＲ３．１（Invitrogen）の追加によって、各分析に対する全ＤＮＡ濃度を一定に保った。形質転換後、細胞を４８時間培養し、パッシブ溶解バッファー（Promega）を用いて集菌した。デュアル−ルシフェラーゼレポーター分析システム（Promega）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８４】
ＰＰＡＲαおよびＲＸＲ作用薬、ＷＹ−１４，６４３（ＷＹ）、ならびに、９−シスレチノイン酸（ｃＲＡ）の各々を用いて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰプロモーターレポーター分析（A. G. Scientific, Inc.）を、図の説明文に示すように実施した。ＷＹ−１４，６４３および９−シスレチノイン酸の両方を、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ、０．１５％ｖ／ｖ）中に溶かし、１０μＭ（ＷＹ）および１μＭ（ｃＲＡ）の作用濃度で用いた。簡潔に言えば、形質転換後、細胞を、図のように作用薬またはＤＭＳＯ単独で４８時間処理した。細胞を集菌し、プロモーター活性を図のように分析した。
【００８５】
（レポーター遺伝子構築およびベクターの発現）
野生型および変異型のラットＭＴＰレポーターベクター（-135/+66）は、前述の（Kang et al., 2003）のとおりである。野生型ラットＬ−ＦＡＢＰレポーターベクター（-141/+66）を作り出すために、DNeasy tissue kit（Qiagen）を用いて、ＦＡＯ細胞からゲノムＤＮＡを単離および抽出した。指定された制限酵素サイトを有するプライマーを用いて、ＰＣＲによって、プロモーター断片を作り出した。フォワード５’（ＫｐｎＩ）−ＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および、リバース５’（ＢｇｌII）−ＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。次いで、プロモーター断片を、空ルシフェラーゼレポーターベクターＰＧＬ３Ｂａｓｉｃ（Promega）のＫｐｎＩサイトおよびＢｇｌIIサイトにクローニングした。
【００８６】
変異Ｌ−ＦＡＢＰレポーターベクターを作り出すために、QuikChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて、近位ＤＲ１シークエンスにおける特異的な変異を作り出した。インビトロにおいて、テンプレートとして、ラットＬ−ＦＡＢＰ（-141/+66）−ルシフェラーゼレポーターベクターおよびベクターの逆鎖とそれぞれ相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（突然変異基には下線を付す）（フォワード ５’―ＡＡＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；リバース ５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））の突然変異生成を行った。ＤＮＡシークエンスによって部位特異的変異構築を検証した。ＣＯＵＰ−ＴＦIIのための発現プラスミドはベイラー医科大学から贈呈された。
【００８７】
（核抽出物の調製）
前述の（Kang, 2003）にしたがって、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞からの核抽出物を調製した。簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって集菌し、１×リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、さらに、低張緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁した。氷上で１０分間の低温放置後、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して細胞を溶解した。細胞核を遠心分離によってペレット化し、低塩緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁した。その後、高塩濃度緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）を、攪拌しながら滴下して加えた。核タンパク質の抽出をするために、得られた懸濁液を３０分間、静かに振蕩した。細胞核を、３０分間、再び遠心分離し、得られた上澄みを、１時間、透析緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）に対して透析した。
【００８８】
（電気泳動移動度シフトアッセイ）
ＩＤＴによって、ＥＭＳＡに用いる全てのオリゴヌクレオチドを合成した。ゲル移動度シフトアッセイでは、以下のオリゴヌクレオチド（センス鎖）を用いた：ＭＴＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＡＣＣＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；変異ＭＴＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＡＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；変異Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
【００８９】
相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）を用いて〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ（３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（PerkinElmer Life Sciences）で末端標識し、続いて、Ｇ５０カラムに精製することによって、プローブを調製した。結合反応のために、総量１５μｌの溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ））中に、２０分間、氷上で、３×１０４ｃｐｍプローブとともに核抽出物１５μｇを低温放置した。スーパーシフトアッセイ（supershift experiments）のために、氷上でさらに２０分間、前もって低温放置したＤＮＡ−タンパク質複合体に特異的抗体１μｌを加えた。ＣＯＵＰ−ＴＦII（sc-6576X）、ＲＸＲα（sc-553X）、およびＰＰＡＲα（sc-9000x）に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.から得られた。０．５×ＴＢＥ緩衝液を含む４％天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＤＮＡ−タンパク質複合体を分離した。
【００９０】
（ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ）
製品使用説明書により、オンカラムＤＮＡ除去と共に、Versagene RNA Tissue Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて凍結肝臓から、または、Versagene Cell Culture Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて細胞から、全ＲＮＡを単離した。分光光度計によって、２６０ｎｍで、ＲＮＡ濃度を測定した。逆転写のためのBio Rad iScript（Biorad）を用いて、０．５μｇの全ＲＮＡから、一本鎖ｃＤＮＡ鎖を合成した。GenBankTMが提供している遺伝子配列を用いて、各遺伝子（補足表１）に対して特異的なプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡの増幅を避けるため、上記プライマーをエクソン接合部にまたがるように配置した。ＩＤＴによって全てのプライマーを合成した。
【００９１】
製品使用説明書に従ってBioRad SyBr Green supermixを用いたBioRad iCyclerによって、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。溶解−曲線分析を用いた特定産物モニターによって、三通りに、反応を分析した。内在性コントロール、すなわち、１８ＳリボソームＲＮＡ、または酸性リボソーム燐タンパクＰ０（３６Ｂ４）に対して、発現データを規格化した。１８ＳＲＮＡおよび３６Ｂ４の両方の濃度は、全ての実験サンプルの間で不変であった。式２−ΔＣｔに従って、相対的発現濃度を計算した。ここで、ΔＣｔは、標的と、１８Ｓまたは３６Ｂ４の内在性コントロールとの、閾値サイクル（Ｃｔ）濃度における差分である。
【００９２】
（クロマチン免疫沈降分析および相対定量）
１５０ｍｍシャーレ中の完全培地で、約７０〜８０％程度の密集状態まで、細胞を培養した。ここで、集菌の４８時間前、細胞培地に、指定の作用薬であるＷＹ（１０μ）およびｃＲＡ（１μＭ）を加えた。その後、３７％ホルムアルデヒド（Sigma）２８μｌを培地１０ｍｌに加えることによって、３７℃で１０分間、細胞を固定し、集菌し、そして、クロマチン免疫沈降のためのChIP-IT Shearing Kit（Active Motif）およびChIP-IT Chromatin Immunoprecipitation Kit（Active Motif）を用いて、製品使用説明書に従って、免疫沈降の処理を行った。免疫複合体を、６５℃で５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出、すなわち脱架橋し、プロテアーゼＫで処理し、ChIP-IT kitに提供されるミニカラムを用いて精製した。
【００９３】
上述に示すように、BioRad SyBr Green Supermixを用いたリアルタイムＰＣＲによって、免疫沈降した試料からの特異的ゲノムＤＮＡ断片および投入量を定量した。免疫沈降−特異的濃縮差の領域選択性のためのコントロールとして、サンプル毎に、非コード遠位非翻訳領域の量を決定した。使用した抗体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII（Wyeth-Ayerst Research, PA）、ＰＰＡＲα（sc-9000X, Santa Cruz Biotechnology, Inc.）およびコントロールIgG（Active Motif）に対するものであった。以下のラットゲノムＤＮＡ領域を増幅するために、プライマーセットを設計した：ＭＴＰ−ＤＲ１（フォワード−５’−ＴＡＧＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；リバース−5’−ＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡＣＡＧＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１（フォワード−５’−ＧＡＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；リバース−５’−ＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、および、Ｌ−ＦＡＢＰ−３’−非翻訳領域（フォワード−５’−ＧＴＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＡＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；リバース−５’−ＣＴＧＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。ΔΔＣｔ法を用いて、投入ＤＮＡとＩｇＧによる免疫沈降との両方からの値に対して、全ての値を規格化した。簡単に述べると、調査したプロモーター毎に、免疫沈降した試料により得られたＣｔ値から、投入ＤＮＡによるＣｔ値を引くことによって、各試料のΔＣｔを計算した。その後、正常型ラビット血清（ＩｇＧ）により免疫沈降された対応試料に対するΔＣｔから、特異的抗体（ＰＰＡＲαまたはＣｏｕｐ−ＴＦII）により免疫沈降された試料に対するΔＣｔを引くことによって、ΔΔＣｔを計算した。その後、２をΔΔＣｔ乗することによって、倍数差分（Fold difference）（コントロールＩｇＧ ＣｈＩＰと比較した因子特異的ＣｈＩＰ）を決定した。
【００９４】
（ＲＮＡ干渉）
ラットＰＰＡＲαに対して特異的なSmartpool siRNA（Dharmacon）を用いることによって、ＦＡＯ細胞におけるＰＰＡＲαノックダウンを実現した。前述に記載のように（Lin et al., 2005）、ラットＰＧＣ−１βに対して指向性のあるｓｉＲＮＡのための配列を選択した。３’ジヌクレオチド（ＴＴ）突出部と共に、オプションＡ４を用いて、２１−ヌクレオチドニ本鎖として、ラットＰＧＣ−１βｓｉＲＮＡ（センス配列；５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）をDharmaconによって合成した。非特異的な標的をモニターするために、ネガティブコントロール配列として、種に特異なｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡ＃１を利用した。実験の２４時間前、５×１０４／ウエルの濃度で、１２−ウエルプレートに細胞をまいた。形質転換前、１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Dharmacon）中に、２０μＭの濃度になるまでｓｉＲＮＡを再懸濁した。製品使用説明書に従って、DharmaFECTTM4 transfection reagent（Dharmacon）用いて、ＦＡＯ細胞中に、全てのｓｉＲＮＡを導入した。図の説明文に示されるように、１００ｎＭの作用濃度で、４８〜７２時間、示されたｓｉＲＮＡをＦＡＯ細胞に導入した。ＰＧＣ−１βのノックダウンのために、７２時間、示されたｓｉＲＮＡを細胞に導入した；形質転換の２４時間後、作用薬であるＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）に細胞を暴露し、集菌の４８時間前に処理した。上述のように、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９５】
（動物実験）
雄のＰＰＡＲα−／−マウス、および同年齢のＷＴ型同腹子（ＳＶ／１２９バックグラウンド）に、ＰＰＡＴα作用薬ＧＷ−７６４７（２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）または等量の溶解性賦形剤（ＤＭＳＯ）のいずれかを添加された標準ダイエット食を、７週間与えた。全ての動物には水を適宜に摂取させた。２週間ごとにマウスの体重を量り、その平均体重に従って薬物摂取を調節した。処理後、動物を解剖し、肝臓を単離し、そして、Versagene RNA Tissue Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上述したように、一本鎖ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９６】
ＭＴＰ抑制剤（８ａＲ）実験では、雄のＬ−ＦＡＢＰ−／−マウスおよび同年齢のＷＴ型コントロール（Ｃ５７ＢＬ／６）に標準ダイエット食を与え、そのとき、８ａＲ化合物を体重に対して５０ｍｇ／ｋｇの量で経口により７日間毎日投与した。処理後、動物を解剖し、血漿および肝臓を単離し、そして、上述したように（Newberry et At., 2003）、市販のキットを用いて、各種の肝臓と血漿の脂質レベルを測定した。
【００９７】
（脂質抽出）
ＰＢＳ中で肝臓をホモジナイズし、タンパク質濃度を測定した。５ｍｌのクロロフォルムメタノール（２：１）および０．５ｍｌの０．１％硫酸によって３００μｌのホモジェネートを抽出した。器官活動相の部分標本を採集し、窒素下で乾燥し、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁した。上述したように（Newberry et At., 2003）、市販のキットを用いて、肝臓中のＦＦＡ、ＴＧ、およびコレステロール含量を測定した。タンパク質濃度の違いに対して、データを規格化した。
【００９８】
（アデノウイルス実験）
ＰＧＣ−１β（Ａｄ−ＰＧＣ−１β）またはＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）のいずれかを発現するアデノウイルスベクターは、Dana-Farver Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MAから贈られた。２時間、無血清培地でＡｄ−ＰＧＣ−１βまたはＡｄ−ＧＦＰのいずれかをＬ３５細胞に感染させ、その後、４８時間、完全培地で、作用薬ＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）で処理した。ＧＦＰ発現によって測定されるように、７５〜８５％程度の細胞が感染した。上述したように、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９９】
（分泌ａｐｏＢの免疫沈降）
上述したように（Borchardt and Davis, 1987; Hui et al., 2002）、分泌ａｐｏＢを免疫沈降した。簡単に述べると、ＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）の欠乏下で、または、それらの存在下で、Ｌ３５細胞を６０ｍｍシャーレ中で７２時間培養した。その後、細胞を、メチオニン−フリーＤＭＥＭに、２時間、切り替え、次に、ＤＭＥＭ中で、３ｍｌ〔３５Ｓ〕−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）によった２４時間標識した。培地を採取し、そして、４℃で一晩、ポリクローナル抗ａｐｏＢ抗体と培養した。次いで、タンパク質Ａ−セファローズを加え、さらに、４℃で２時間培養した。免疫沈降複合体を、ＴＥＴＮ緩衝液（ｐＨ７．５で２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。ペレットを、SDS-PAGEローディングバッファー中に再懸濁し、５分間沸騰させ、さらに、電気泳動によって４〜１２％トリス−グリシン ゲルで分離した。オートラジオグラフィーによって放射性タンパク質を検出した。
【０１００】
ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのプロモーター−レポーターの転写活性は、ｍＲＮＡ発現における細胞型特異的な違いを反映する。近位ＭＴＰプロモーター領域内に配置されたＤＲ１要素は、Ｌ３５細胞における発現の欠損とＦＡＯ細胞により示された高レベル発現との原因であることが、以前から明らかであった（Kang et al., 2003）ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるこのＤＲ１の占有は、Ｌ３５細胞により示された、抑制されたＭＴＰ遺伝子転写を引き起こすことが明らかであった（Kang et al., 2003）。Ｌ−ＦＡＢＰの生産物はＶＬＤＬ会合／分泌の調節に関与しており（Newverry et al., 2003）、このＬ−ＦＡＢＰが類似メカニズムによって調節されるかどうかを判断するために調査した。Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターの配列分析（図１Ａ）によれば、それがＭＴＰ遺伝子の転写調節を担うＤＲ１要素（Kang et al., 2003）と類似するＤＲ１を含むことが示された。さらに、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞によるＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡ発現は、ＭＴＰのｍＲＮＡ発現と並行であり（図１Ｂ）、これは、両者の遺伝子の転写が協調的に調節されているだろうことを示唆している。
【０１０１】
Ｌ−ＦＡＢＰの、またはＭＴＰの近位プロモーター領域のいずれかを含むルシフェラーゼレポーター構築体は、類似の細胞型特異的な違いを表した；プロモーター活性は、Ｌ３５細胞中のレベルと比較して、ＦＡＯ細胞中で約８倍高い（図１Ｃ）。Ｌ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰのプロモーター構築対における、ＤＲ１サイトの突然変異欠損は、ＦＡＯ細胞中のプロモーター活性レベルを、Ｌ３５細胞に見られるものに類似するレベルまで減少させた（図１Ｂ）。したがって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ遺伝子のプロモーター領域内に存在する近位ＤＲ１要素は、Ｌ３５細胞系およびＦＡＯ細胞系に示される両者の遺伝子の内在性ｍＲＮＡレベルと関連する相対プロモーター活性を与えるのに十分である。
【０１０２】
近位ＤＲ１サイトへのＣＯＵＰ−ＴＦIIの結合は、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の転写抑制を媒介する。Ｌ３５およびＦＡＯの肝臓細胞系から得られた核抽出物は、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターのＤＲ１要素を含むオリゴヌクレオチドプローブと、明確なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した（図２Ａ）。Ｌ３５細胞からの核抽出物を用いて形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦIIに対して特異的な抗体とのスーパーシフトを示した（図２Ａ）。対照的に、ＦＡＯからの核抽出物を用いて形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII抗体とのスーパーシフトを表さなかった（図２Ａ）。ＤＲ１サイトの変異が、細胞型特異的ＤＮＡタンパク質複合体の形成を阻害したため、その形成には、正常なＤＲ１サイトを必要した。
【０１０３】
ＣＯＵＰ−ＴＦII発現プラスミドを導入されたＦＡＯ細胞におけるＣＯＵＰ−ＴＦIIの異所性発現は、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性における用量依存的抑制をもたらした（図２Ｂ）。ＣＯＵＰ−ＴＦII発現の増加は、ＤＲ１配列の突然変異欠損をかかえるＬ−ＦＡＢＰプロモーター構築体の活性を変化させないため（図２Ｂ）、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるＬ−ＦＡＢＰプロモーターの抑制は、機能性ＤＲ１要素に依存する。ＣＯＵＰ−ＴＦIIを発現するプラスミドを導入されたＦＡＯ細胞によって示される、転写の最大限の減少は、Ｌ３５細胞によって示される低レベルを、部分的（５０〜７０％）にのみ再現した。これは、発現における細胞型特異的な違いに対して、追加的な因子が寄与している可能性を示唆する。これらの発見は、ＭＴＰ ＤＲ１要素を用いて得られたもの（Kang et al., 2003）に類似する発見であり、Ｌ３５細胞中で、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるＤＲ１要素の占有が、両者の遺伝子の転写不活性化に関与するという結論を支持している（図２Ａ）。
【０１０４】
ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ遺伝子の両者のＤＲ１プロモーター要素と結合するために、ＣＯＵＰ−ＴＦIIと競争する。ＭＴＰ−ＤＲ１サイトと共に形成された複合体についてのＥＭＳＡ−スーパーシフト解析によれば、ＲＸＲαを含んでいるＦＡＯ細胞特異的複合体が明らかになった（Kang et al., 2003）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、近位プロモーター領域におけるＤＲ１サイトを介して、Ｌ−ＦＡＢＰの転写を活性化することが示されているため（Poirie et al., 1997）、ＭＴＰ遺伝子が同じように調節されたかどうかを評価した。ＦＡＯ細胞からの核酸を用いたＥＭＳＡスーパーシフト解析によれば、Ｌ−ＦＡＢＰ−またはＭＴＰ−ＤＲ１サイトのいずれかを含むＤＮＡプローブが、類似ＦＡＯ特異的複合体を形成したこと（図３Ａ；レーン１）が明らかにされた。なお、上記複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII特異的抗血清とスーパーシフトしなかったが（図３Ａ；レーン２）、ＲＸＲα（図３；レーン３）またはＰＰＡＲα（図３；レーン４）のいずれかを認識する抗血清とスーパーシフトした。対照的に、Ｌ３５細胞から得られた核抽出物とのＰＰＡＲα−ＲＸＲαスーパーシフトは、検出されなった（Kang et al., 2003）。これらの発見は、ＦＡＯ細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターのＤＲ１サイトがＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーによって占有される一方、Ｌ３５細胞中では、これら同様のサイトはＣＯＵＰ−ＴＦII複合体によって占有されるということを示す。
【０１０５】
ＣＯＵＰ−ＴＦII特異的抗血清を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）解析によれば、Ｌ３５細胞の含有クロマチンは、ＦＡＯ細胞のクロマチン細胞と比較して、４倍の濃縮度のＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を示すことが明らかにされた（図３Ｂ）。対照的に、ＰＰＡＲα特異的抗血清を用いて、ＦＡＯ細胞から得られたクロマチンは、Ｌ３５細胞からのクロマチンと比較して、１〜４倍の濃縮度の近位Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を示した（図３Ｂ）。両方の細胞系から免疫沈降された末端非翻訳領域のレベルは類似しているため（図３Ｂ）、約４倍の濃縮度の近位Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を含むＤＮＡ配列は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターに対する、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（ＦＡＯ細胞）またはＣＯＵＰ−ＴＦII（Ｌ３５細胞）の結合に関する細胞型特異的な違いを反映する。したがって、ＣｈＩＰ解析から得られたデータ（図３Ｂ）は、ＥＭＳＡスーパーシフト解析から得られたデータ（図２Ａおよび図３Ａ）と調和している。
【０１０６】
Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬処理は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現の転写誘導と、ａｐｏＢを分泌する能力の回復とをもたらす。ＰＰＡＲαおよび／またはＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理は、ＭＴＰ（約５５〜６５倍）およびＬ−ＦＡＢＰ（約６０〜７５倍）の両方のｍＲＮＡの発現を顕著に増加させた（図４Ａ）。両方の作用薬による処理は、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡ発現を相乗的に３００倍近くまで増加させた（図４Ａ）。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのプロモータールシフェラーゼレポーター構築体は、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬に対して、同様の反応を示した（図４Ｂ）。したがって、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬（各単独で、および組み合わせで）によるＬ３５細胞の処理は、ＭＴＰ−ＤＲ１およびＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１の両方のプロモーターレポーター構築体の転写活性を、１０倍に至るまで増幅する（図４Ｂ）。各プロモーターの活性における無有意変化は、ＤＲ１サイトをかかえるレポーター構築体を用いて検出された（図４Ｂ）。これらの発見は、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬の効果がＤＲ１要素を介して媒介されるということを示している。
【０１０７】
賦形剤ＤＭＳＯによる単独処理は、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの両方のｍＲＮＡの発現における比較的少量であるが有意な増加と、それらのプロモーター−レポーターの活性とを引き起こした（各図４Ａおよび図４Ｂ）。賦形剤としてＤＭＳＯを用いつつ、細胞にＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬を加えると、ＤＭＳＯ賦形剤を単独で加えたときよりも、より多くのＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの誘導が示された（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＤＭＳＯによるＰＰＡＲα活性化遺伝子の誘導は（Pauley et al., 2002）に説明されている。
【０１０８】
Ｌ３５細胞は、ＭＴＰ遺伝子の転写不活性化によって、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌するための能力が欠けている（Hui et al., 2002; Kang et al., 2003）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理は、デノボ合成された３５Ｓ−標識ａｐｏＢの分泌を顕著に増幅した（図４Ｃ）。したがって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を回復し、それによって、Ｌ３５細胞におけるａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌の活性化が引き起こされる。
【０１０９】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの作用薬誘導は、ＤＲ１関連因子の相対的な細胞内含有量の変化によって引き起こされ、両方の遺伝子の近位要素の複合体占有を変化させる。さらなる解析によれば、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理が、その核内受容体のレベルを、ＦＡＯ細胞によって示されるレベルと類似するように変更したということが明らかとなった（図５Ａ）。したがって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理を受けて、ＰＰＡＲα（５倍）およびＲＸＲα（２．３倍）の両方のｍＲＮＡの発現は増加し、一方、ＣＯＵＰ−ＲＦIIのレベルは減少（−６０％）した（図５Ａ）。ＤＭＳＯ単独によって処理されたＬ３５細胞もまた、ＣＯＵＰ−ＲＦIIレベルにおける大幅な減少を示したが、ＰＰＡＲαまたはＲＸＲαにいずれかのレベルでは変化がなかった（図５Ａ）。ＣＯＵＰ−ＲＦIIにおけるＤＭＳＯの媒介による減少は、なぜＤＭＳＯが、単独で、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写および発現についての増加と関係していたのか（図４）について、説明するだろう。
【０１１０】
転写因子の発現において作用薬が媒介する変化が、内在性プロモーター中のＤＲ１サイトの複合体占有における変化と一致するかどうかを判断するために、作用薬により処理したＬ３５細胞のＣｈＩＰ解析を、未処理のＬ３５およびＦＡＯ細胞のものと比較した。Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬処理は、ＣＯＵＰ−ＲＦII特異的抗血清と免疫沈降した、Ｌ−ＦＡＢＰ−およびＭＴＰ−ＤＲ１領域含有クロマチンの量を（約３倍に）減少させ（図５Ｂ）、同時に、ＰＰＡＲα特異的抗血清によるその結合量を（約３倍に）増加させた（図５Ｂ）。よって、ＣｈＩｐ解析による結果は、核内受容体の発現レベルにおける変化（図５Ａ）と一致した。データの組み合わせによれば、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαリガンド活性化は、リプレッサーＣＯＵＰ−ＲＦIIと比較して、活性化複合体ＰＰＡＲα−ＲＸＲαの細胞内含有量を増加させることによって、Ｌ３５細胞型の表現型を、ＦＡＯ細胞型の表現型に変換することが示される。これらの変化は、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子のＤＲ１要素と結びつく複合体において並行的な変化をもたらし、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα複合体の活性化によるＤＲ１の占有を助ける。
【０１１１】
肝臓細胞および生体内において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの高レベル発現のためには、ＰＰＡＲαが必要である。そのようなものとして、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調した発現のために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα活性化複合体が必須であることを予測する。この仮説を検証するために、ＦＡＯ細胞中のＰＰＡＲαの発現レベルをノックダウンするＲＮＡ干渉を利用した。ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡを導入したＦＡＯ細胞では、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、ＰＰＡＲαのｍＲＮＡにおける７５％の減少が実証された（図６Ａ）。ＰＰＡＲαのｍＲＮＡにおけるこの減少は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡの細胞内含有量がコントロールの５０％近くまで減少したことと関係があった（図６Ａ）。ＰＰＡＲα特異的ＲＮＡｉは、ＰＰＡＲα非依存性ａｐｏＢのｍＴＮＡレベルと変化させておらず、これは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰにおける減少がＰＰＡＲαの低減に特異的であったこと（図６Ａ）を示唆している。これらの発見によれば、ＦＡＯ細胞に見られる比較的高度な発現レベルのＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのためには、ＰＰＡＲαが必要であることが示される。
【０１１２】
また、ＰＰＡＲα作用薬が、生体内におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの肝臓での発現を協調的に誘発するかどうかについて、そうだとしたら、上記作用薬が媒介する増加はＰＰＡＲα依存性であるかどうかについて検討した。コントロールＣ５７／ＢＬ６マウス、およびＰＰＡＲα-/-マウスを、ＰＰＡＲα作用薬ＧＷ−７６４７（Fu et al., 2005）で処理した。コントロールマウスは、ＰＰＡＲα作用薬による処理の後、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡのレベル増加を示したが（図６Ｂ）、機能性ＰＰＡＲα欠損マウスは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのいずれの発現レベルにおいても顕著な変化を示さなかった（図６Ｂ）。これらの生体内データは、ＦＡＯ／Ｌ３５肝臓細胞を用いて得られた発見を裏付ける。本明細書で提供される発見は、共に、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子の両方の転写調節において、ＰＰＡＲαが重要な役割を果たすことを実証している。
【０１１３】
Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子を協調的に誘導するために、ＰＰＡＲαと協調してＰＧＣ−１βが作用する。転写コアクチベータであるＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１β（kressler et al., 2002）には、明確な遺伝子標的が示される（Lin et al., 2003; Lin et al., 2005）。ＰＧＣ−１α活性化遺伝子は、グルコース新生およびミトコンドリア生物発生／脂肪酸酸化に関与し（Lin et al., 2003）、また、ＰＧＣ−１β活性化遺伝子は、ミトコンドリア生物発生／脂肪酸酸化、および肝臓脂質輸送（例えばＭＴＰ）に関与する（Lin et al., 2005）。Ｌ３５細胞は、高いレベルのＰＧＣ−１αと、ほぼ検出できないレベルのＰＧＣ−１βとを発現するのに対して、ＦＡＯ細胞は、高いレベルのＰＧＣ−１βと、ほぼ検出できないレベルのＰＧＣ−１αとを発現する（図７Ａ）という観察結果は、ＰＧＣ−１βがＭＴＰ遺伝子発現を活性化させるという提言（Lin et al., 2005）と一致する。この提言は、ＰＰＡＲα作用薬で処理されたＬ３５細胞およびマウスの両方が、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡについての１〜３倍に誘発を引き起こしたという発見（図７Ｂ）によって、さらに裏付けされる。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの誘発におけるＰＧＣ−１βの役割を調べるために、ＦＡＯ細胞をＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬で処理し、かつ、ＰＧＣ−１βをノックダウンするｓｉＲＮＡの効果を測定した。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によって、ＰＧＣ−１βに対して特異的なｓｉＲＮＡを与えられたＦＡＯ細胞を処理すると、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルは、Ｌ−ＦＡＢＰ（−３８％）とＭＴＰ（−４８％）との両方のｍＲＮＡレベルの協調的な減少と関係して、６５％減少した。その一方、ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡレベルは変化せずに保たれた（図７Ｃ）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によって、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを与えられたＦＡＯ細胞を処理すると、いずれのｍＲＮＡレベルにおいても変化が示されなかった（図７Ｃ）。よって、ｓｉＲＮＡは標的特異性を実証しており、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡ発現における協調的な低下は、ＰＧＣ−１β濃度の低下に起因していた。
【０１１４】
未処理のＬ３５細胞、および、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬により処理されたＬ３５細胞において、ＰＧＣ−１βを発現するアデノウイルス（Lin et al., 2002a; Lin et al., 2005）の導入を介して、ＰＧＣ−１βの発現を増強することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの遺伝子転写におけるＰＧＣ−１βの役割をさらに検討した。ＰＧＣ−１βアデノウイルスは、未処理のＬ３５細胞におけるＬ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰのｍＲＮＡレベルに作用しなかった（図８）。対照的に、ＰＧＣ−１βアデノウイルスによってＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬に刺激されたＬ３５を処理すると、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡは、作用薬により処理したコントロール（ＧＦＰ導入したコントロールおよび導入していないコントロール）のレベルと比較して、顕著に増加された（〜３倍）（図８）。ＧＦＰを発現するアデノウイルスによって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬に刺激されたＬ３５を処理することは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの発現に対して作用しなかった（図８）。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な転写を増幅するために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαとＰＧＣ−１βとの両方が必要であるという提言に対して、これらのデータは追加的な根拠を提供する。
【０１１５】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な不活性化は、生体内で、肝臓脂肪症を防止する。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターにおける機能的ＤＲ１サイトの保有は、発現および機能（例えばＶＬＤＬ会合／分泌）における協調的な変動を可能にするだろう。ＭＴＰの化学的な抑制、すなわち、高脂血症を治療的に改善するために発達した戦略（Chandler et al., 2003; Ksander et al., 2001; Shiomi and Ito, 2001; Wetterau et al., 1998）は、肝臓脂肪症の発現と関係するせいで、あまり役に立たない（Bjorkegren et al., 2002; Liao et al., 2003）。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な抑制が、肝臓脂肪症を引き起こすことなしに、肝臓でのＶＬＤＬ会合／分泌を阻害するか否かを調べるために、コントロールマウスおよびＬ−ＦＡＢＰ欠損マウス（Ｌ−ＦＡＢＰ-/-）を、ＭＴＰ抑制剤（８ａＲ）（Liao et al., 2003）で処理した。８ａＲ処理の７日後、トリグリセリドおよびコレステロールの血漿中濃度は、両グループのマウスにおいて同様のレベルまで顕著に減少された（図９Ａ）。ＭＴＰ抑制剤によってコントロールＣ５７ＢＬ／６マウスを処理したところ、肝臓中のトリグリセリド濃度が４倍に増加したが、肝臓中のトリグリセリド蓄積は、Ｌ−ＦＡＢＰの除去によって完全に防止された（図９Ｂ）。これらのデータによれば、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子の協調的な転写調節は、肝臓脂肪症を除外して、ＶＬＤＬ会合／分泌の変動を可能にすることが示された。
【実施例２】
【０１１６】
（Ｌ−ＦＡＢＰの化学的抑制による肝臓脂肪症の発現の防止）
本実施例は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与が血漿中トリグリセリド濃度を減少させることを説明する。
【０１１７】
３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）（lot # fr. 09061988）は、Ｌ−ＦＡＢＰを抑制することが明らかにされている。したがって、ＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）とSandoz compound 58-035との同時投与が、野生型マウスにおいて、肝臓脂肪症の発現を防止するか否かを調べた。処理の前、マウスを出血させ、トリグリセリド（図１０）およびコレステロール（図１１）の血清中濃度を測定した。その後、０．１５０ｍｌのコーンオイル（賦形剤のみ）、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035（１００ｍｇ／ｋｇ）を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）を含むコーンオイルを用いて、マウスを強制飼養した。７日間の処理後、マウスを出血させて解剖した。Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤と共に投与したとき、および投与しなかったときにおいて、ＭＴＰ抑制剤は、血清中トリグリセリド濃度（図１０）および血清中コレステロール濃度（図１１）の両方を減少させた。予想通りに、ＭＴＰ抑制剤のみで処理したマウスは、肝臓脂肪症を示した（肝臓トリグリセリド濃度は、５倍にまで増加した；図１２）。際立って対照的に、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との両方で処理したマウスからの肝臓は、肝臓トリグリセリド濃度の増加を示さなかった（図１２）。ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与は、肝臓脂肪症の発現を防止すると示すこれらのデータは、標的遺伝子の不活性化に起因してマウスのＬ−ＦＡＢＰ発現が欠損するという、発明者らの以前の発見を拡張する。
さらに、これらの発見は、Ｌ−ＦＡＢＰを抑制する能力のある薬剤（例えばSandoz compound 58-035）の同時投与は、肝臓脂肪症を引き起こすことなく（図１２）、ＭＴＰ抑制剤が血漿中のリポタンパク質を減少させることができるようにする（図１０および図１１）。
【０１１８】
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）には、水を飲むことを自由にさせ、餌として、コーンオイル（０．１５ｍｌ）のみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）（Novartis, Summit, NJ）（Ksander, et al., 2001, Diaminoindanes as microsomal triglyceride transfer protein inhibitors. J Med Chem 44:4677-4687）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035（１００ｍｇ／ｋｇ）を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、７日間、毎日強制摂取させた。試験を始める前および試験を始めてから７日後に、マウスを出血させた。１２時間の光サイクルを有している（午前６：００から午後６：００まで照明を照らした）空間にマウスを収容した。午前１０：００にマウスを眼窩後から出血させ、その後、解剖した。
【０１１９】
肝臓中のトリグリセリド濃度、ならびに血漿中のコレステロール濃度およびトリグリセリド濃度を（Liao, et al., 2003, Blocking microsomal triglyceride transfer protein interferes with apoB secretion without causing retention or stress in the ER. J Lipid Res 44:978-985）に記載のように測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。＊処理前のマウスと処理後のマウスとの顕著な違い、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定（Student's t test）を示す（図１０）。
【０１２０】
図１１は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおいて血漿中のコレステロール濃度を減少させることを示している。上述にように、Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）に対し、コーンオイルのみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、毎日、強制摂取させた。試験を始める前および試験を始めてから７日後に、マウスを出血させた。血漿中のコレステロール濃度を上述のように測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。
【０１２１】
図１２は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与が、マウスにおける肝臓脂肪症の発現を防止することを示している。上述のように、Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）に対し、コーンオイルのみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、毎日、強制摂取させた。７日後にマウスを解剖した。肝臓トリグリセリド濃度を測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。
【０１２２】
本発明は、上述の実施例を参照して説明されているが、本発明の精神および範囲内で、いろいろと変更したものを含むことは理解されるだろう。したがって、本発明は、以下の特許請求事項の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して高脂血症および肥満に対する薬および治療に関するものであり、特には、高脂血症を改善するための組成物および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症とは上昇した血中脂質濃度を言及するものであり、トリグリセリドおよびコレステロールによって表されるものに留まらない。高脂血症は、リポタンパク代謝の異常な脱着の兆候を表す異常脂質血症としても定義される。人間では、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の血中濃度の増加が、冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の高いリスクと強く関係している。一方、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）の血中濃度の増加は、ＣＨＤの低いリスクと関係している。トリグリセリド高含有のリポタンパク質（超低比重リポタンパク：ＶＬＤＬ）の血中濃度は、ＣＨＤ、メタボリック症候群、および２型糖尿病のリスクに応じて変化する。ＣＨＤに関係する疾病率および死亡率の両方を減少させるためには、特別食または薬理療法を介してＬＤＬを低下させることが示されている。ＣＨＤ、膵炎、および２型糖尿病の発現を減少させるためには、特別食または薬理療法を介してプラズマトリグリセリドを減少させることが示されている。
【０００３】
人間の肝臓は、ＶＬＤＬの生産のための主な組織部位である。一部のＬＤＬは肝臓によって直接的に生産されるが、大部分のＬＤＬはＶＬＤＬの代謝作用から生成される。ＶＬＤＬおよびＬＤＬの両方の粒子は、単一のアポリポタンパク質分子（ａｐｏＢ）を含む。ａｐｏＢは、脂質の安定した球状のエマルジョン粒子を形成する能力を介して、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの粒子の基本的な構造組成物となる。ＶＬＤＬのコアは主にトリグリセリドから成り、脂肪酸を介して肝外組織にエネルギーを提供する。肝臓でのＶＬＤＬの分泌に続いて、コアトリグリセリドが脂肪酸に分解され、この脂肪酸は特定の受容体およびタンパク結合脂肪酸（ＦＡＢＰｓ）によって急速に取り込まれる。その後、脂肪酸は、トリグリセリドとして蓄えられるか、または、酸化を介してエネルギーおよび熱を生産するために用いられるかのいずれかとなる。ＬＤＬのコアは、主にコレステリルエステルから成り、主に、特定の細胞表面受容体に結合することによって、肝外組織にコレステロールを提供する。ほとんどの肝外組織は、厳格に調節された受容体（ＬＤＬ受容体）によってＬＤＬを取り込むことができる。正常な状態の下で、ＬＤＬ受容体の発現は細胞コレステロール濃度と逆に変化するため、ＬＤＬの取り込みに介在するＬＤＬ受容体が過剰なコレステロールの吸収をもたすことはない。しかしながら、仮に、ＬＤＬが酸化によって（通常、血中に長期的に存在することの結果として）修飾されると、修飾ＬＤＬは、細胞コレステロール濃度と関係せずに発現する受容体を介して、マクロファージによって取り込まれる。過剰な血漿ＬＤＬ濃度は、血漿中に存在する期間の増加、酸化修飾の増加、および、動脈壁マクロファージによる取り込みの増加と関係する。動脈壁マクロファージによる酸化修飾されたＬＤＬの取り込みは、動脈壁内の炎症およびアテローム性動脈硬化症の発現を引き起こす次の事象を開始する。アテローム性動脈硬化症は主に、熱中症、脳梗塞、および最終的には心臓麻痺の原因となる。
【０００４】
アポリポプロテインＢ含有のリポプロテインの肝臓での生産は、同化およびエネルギーの要求に対して、必須脂質および脂溶性栄養素が周辺組織に運ばれることについての主要経路である。識別できる３つの遺伝子生産物、すなわち、アポリポプロテインＢ（ａｐｏＢ）、ＭＴＰ、および肝臓脂肪酸が結合したタンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰまたはＬＦＡＢＰ）は、「脂肪結合」構造ドメインを分け合う。上記「脂肪結合」構造ドメインは、超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）会合／分泌に必須である。
【０００５】
ａｐｏＢは、非常に大きく（＞５００ｋＤａ）、上記会合のために必要な両親媒性タンパク質であり、トリグリセリドを豊富に含有するＶＬＤＬの分泌物である。肝臓および腸が十分なサイズ（〜３５ｋＤａ）のａｐｏＢを生産する能力を喪失することは、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌についての阻害と関係する。通常、肝臓によるａｐｏＢの発現は構造性であり、肝臓におけるａｐｏＢ含有リポタンパク質の分泌の変化は、新規に合成されたａｐｏＢの量の変化による結果である。
【０００６】
ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）は、脂質輸送タンパク質、ならびに、ａｐｏＢの折り畳みおよび転移を促進するものの両方として働く。ＭＴＰは、４つの主な脂質の種類（遊離コレステロール、リン脂質、トリグリセリド、およびコレステロールエステル）を、２つの工程のプロセスを介して、新生ａｐｏＢ含有リポタンパク質粒子へ移送することを促進する。多くのこうした協調するＭＴＰ依存プロセスの１つを阻止することは、プロテアソームによる新生ａｐｏＢの同時翻訳の低下を引き起こす。
【０００７】
肝臓でのＶＬＤＬ会合および分泌は、個々の間で高度に可変であり、栄養状態の変化に対して敏感である。ＶＬＤＬ分泌中のこの栄養変化は、主要な脂質合成酵素の発現レベルにおけるステロール調節エレメント結合タンパク質の媒介による変化と関係している。肝臓による新規の脂質合成率が減少するとき（例えば断食）、脂肪組織によって供給される脂肪酸は、グリセロ脂質合成およびＶＬＤＬ会合／分泌に対して十分な基質を提供することができる。肝臓によるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの両方の発現レベルの変化は、グリセロ脂質生合成およびＶＬＤＬ会合／分泌への脂肪酸の流動を制御する。
【０００８】
ＭＴＰの発現はａｐｏＢの分泌を律速するための理想的な目的となり、ＭＴＰの抑制は、高脂血症を治療的に改善するための理想的な目的になると考えられている。いくつかの研究によれば、ＭＴＰ抑制剤を用いたマウスの処理、または、ＭＴＰ遺伝子ノックアウトのいずれかによって、ＭＴＰの機能的な発現を低下させることは、アテローム性動脈硬化症に対して感受性を増加するように遺伝的改造をされたマウスにおいて、アテローム性動脈硬化症の形成を顕著に減少させることが示されている。ＭＴＰ抑制剤は、肝臓のリポタンパク質分泌を阻害し、血漿脂質濃度を低下させるが、それらはまた、肝臓脂肪症（例えば脂肪肝の発現）の原因でもある。よって、ＭＴＰ抑制剤は、高脂血症（心臓病の主な原因）に対して効果的であるが、それらは肝臓脂肪症の原因となるため、安全ではなく、または実用的ではない。したがって、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、高脂血症および肥満を治療するために組成物および方法が求められている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＭＴＰとＬ−ＦＡＢＰ活性の同時抑制が、肝臓脂肪症（脂肪肝）を引き起こすことなく、高脂血症を改善（例えば紡糸または抑制）するという発見に基づいている。この独創性に富んだ発見は、癌（例えば、肝臓癌細胞）の治療、スクリーニング、リスクアセスメント、予後診断、診断、および治療法の発展のために有用である。
【００１０】
したがって、本発明は、治療を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与することによって、高脂血症を治療する方法を提供する。一実施形態では、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は小分子である。他の実施形態では、ＭＴＰ抑制剤が小分子であって、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤と組み合わせて投与されると、脂質転移によって、肝臓脂肪症を引き起こすことなしに、血漿中トリグリセリド濃度が減少する。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの模範的な小分子抑制剤には、これに制限されないが、それぞれ、８ａＲとして設計されたジアミノインダン、および３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）が挙げられる。
【００１１】
他の実施形態では、ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、または当該ポリヌクレオチドの機能性断片と、ハイブリダイズするｄｓＲＮＡである。他の実施形態では、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、または当該ポリヌクレオチドの機能性断片と、ハイブリダイズするｄｓＲＮＡである。加えて、癌細胞（例えば肝臓癌細胞）においてＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの濃度が上昇しているかどうかを測定する方法、およびそのような癌を治療するために有用な薬剤を同定するための方法を提供する。さらに、高脂血症または肝臓癌をかかえる被験者を治療するための治療規制を観測する方法を提供する。このように、本方法は、肝臓脂肪症の発現を防止したまま高脂血症を改善する方法として用いられてもよい。
【００１２】
本発明は、治療を必要とする被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させ、さらに、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出することによって、高脂血症または肝臓癌を治療するために有用な薬剤を同定する方法と関係する。当該方法では、接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少の検出が、高脂血症を治療するために有益な薬剤を同定する。一実施形態において、上記方法は、ハイスループット法で行われてもよい。他の実施形態では、上記方法は、オーダーメイド医療を実行するための方法を提供する。当該方法における治療は、被験者の肝臓細胞の特徴に基づいて、個別の被験者に合わせられる。本発明の方法は、例えば、被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させることによって行われることができる。当該方法において、接触の後に増加したＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現を検出することが、その薬剤を用いた治療の効果を同定する。
【００１３】
本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰ活性または発現の抑制剤に対するスクリーニングの方法であって、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰを発現している細胞を、少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および、接触に続くＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出する工程を含んでおり、接触に続くＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出することが、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤としての薬剤を同定する方法をも提供する。
【００１４】
本発明は、また、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の抑制剤に対するスクリーニングの方法であって、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰを発現している細胞を、少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出する工程を含んでおり、接触に続くＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現の減少を検出することが、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの抑制剤としての薬剤を同定する方法をも提供する。
【００１５】
本発明は、さらに、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いる治療に適している、被験者の肝臓癌細胞を同定する方法と関係する。当該方法は、対応正常細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性と比較して、細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇を検出する工程、それによって、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いた治療に適した肝臓癌細胞を同定する工程を含んでいる。このように、上記方法は、癌（例えば肝臓癌）を有する被験者が、本発明の抑制剤を用いた治療に対して反応が良いかどうかを決定するための手段を提供する。上記方法は、例えば、対応正常細胞と比較して、被験者の細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇を検出することによって行われてもよく、当該方法では、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの上昇した濃度を検出することは、被験者が抑制剤を用いた治療から益を得ることができることを示している。上記方法は、さらに、ＭＴＰもしくはＬ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡと、またはその機能的断片と細胞を接触させる工程、および、接触に続くＭＴＰもしくはＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少を検出する工程、それによって、肝臓癌細胞がこのような治療に適しているかを確かめる工程を含んでいる。
【００１６】
他の態様では、本発明は、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などによるウイルス感染を改善し、肝臓脂肪症、炎症性肝臓疾患、線維症、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌の発現を減少するための方法を提供する。ＭＴＰ抑制剤は、ＨＣＶ生産を減少することが明らかにされているが、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現は、肝硬変および肝細胞癌の形成を実際に促進するだろう。一実施形態において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ脂質転移活性の同時抑制は、肝臓脂肪症ならびにその後の肝硬変および肝細胞癌の形成を引き起こすことなしに、ＨＣＶ感染の進行を低下させるだろう。
【００１７】
本発明の態様において、細胞試料は、例えば、癌を患う被験者の生体から得られた腫瘍試料、外科手術（例えば腫瘍を除去または減量するための外科的処置）によって得られた腫瘍試料、または、被験者の体液の試料などを含む、任意の試料であってもよい。
【００１８】
一般に、必須ではないが、スクリーニング法は、例えば培養液中または固体担体上などの生体外で、細胞試料と接触させることによって行われる。このように、上記方法は、ハイスループット（high-throughput）法に都合よく適用できる。ハイスループット法では、同様のまたは異なる、多く（例えば２つ以上）の細胞試料が並行して調査される。よって、一実施形態では、候補薬は、単独の被験者からのいくつかの細胞試料上で検査されてもよい。これによれば、例えば、被験者に投与される薬剤の特に効果的な濃度を同定すること、または、被験者に投与される特に効果的な薬剤を同定することなどが可能になる。
他の実施形態では、ハイスループット法は、最もよい（最も効果的な）薬剤または薬剤の組み合わせを治療手段に用いることができるように、被験者の癌細胞上で、２つ、３つ、４つ、それ以上の異なる検査薬を、単独または組み合わせて試験することを可能にする。したがって、様々な実施形態では、ハイスループット法は、異なる被験者の異なる細胞試料を、同じ量の候補薬と接触させること；または、単独の被験者の異なる細胞試料を、異なる量の候補薬と接触させること；または、２人以上の異なる被験者の異なる細胞試料を、同量または異なる量の、異なる候補薬と接触させることによって実行される。さらに、スループット法によれば、例えばコントロール試料（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）を、例えば検査された薬剤を用いて効果的に治療される既知の細胞試料などの検査試料と、並行して実施することが可能になる。様々に例示した方法もまた意図したものである。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本発明の組成物を備えるキットを提供する。一実施形態では、上記キットは、さらに、本発明の方法を実施するための説明書を提供する。
【００２０】
よって、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰ脂質転移活性についての遺伝子の不活性化または化学的抑制のいずれかによる、Ｌ−ＦＡＢＰの機能的な発現を阻害することは、ＭＴＰが、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、血漿中脂質を減少できるようにするということを実証する。単独のＭＴＰ抑制剤は、血漿中脂質濃度を減少する効果的な手段であるが、脂肪肝の関連発現によって、単独のＭＴＰ抑制剤は、高脂血症を低下するための安全な治療規制から除外される。したがって、ＭＴＰ抑制剤と組み合わせた、Ｌ−ＦＡＢＰ脂質転移活性の抑制剤は、肝臓脂肪症の発現を引き起こすことなしに、高脂血症を改善する。
【００２１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、上記説明および特許請求の範囲から明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ａは、ＭＴＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）およびＬ−ＦＡＢＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）の両方のプロモーター（ラット）の近位領域内における保存ＤＲ１要素（５’および３’六量体ハーフサイト（half site）には下線を引いている）を示している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ｂは、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡレベルのサイバーグリーン（sybr green）リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示している。全ての値を、３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、トリプリケート（triplicate）サンプルによる標準偏差を示している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰが、ｍＲＮＡおよびプロモーター活性レベルの両方において、類似の細胞型特異性の違いを明らかにすることを示すグラフ図である。図１Ｃは、ＭＴＰ（-135/+66）またはＬ−ＦＡＢＰ（-141/+66）のいずれかのプロモーターに由来するルシフェラーゼ構築体が、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞中に一時的に導入されたことを示している。変異型ＤＲ１要素を含む構築体は、以下に説明するように、各プロモーターの５’六量体ハーフサイトにおけるＡＣからＴＧへの塩基対変化から構成される。ルシフェラーゼ活性は、黒いバー（ＦＡＯ細胞）と白いバー（Ｌ３５細胞）とによって表されている。全てのルシフェラーゼ値を、Ｒｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、トリプリケート（triplicate）サンプルによる標準偏差を示している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＯＵＰ−ＴＦIIが、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性のレプレッサーとして働く近位ＤＲ１サイトと結合することを示す模式的な図である。図２Ａは、放射性同位体標識されたＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブによるＥＭＳＡを使用して、Ｌ３５細胞とＦＡＯ細胞由来との核抽出物を比べることによって、異なる複合体が得られたことを示している。Ｌ３５−／ＦＡＯ−特異的な複合体におけるＣＯＵＰ−ＴＦIIの存在を評価するために、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブとの培養中、核酸抽出物に、ＣＯＵＰ−ＴＦIIに対して特異的な抗体を加えた。抗体を追加したＬ３５特異的なＣＯＵＰ−ＴＦII複合体、および抗体なしのＬ３５特異的なＣＯＵＰ−ＴＦII複合体を、それぞれ、黒い矢印および白い矢印によって示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＯＵＰ−ＴＦIIが、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性のレプレッサーとして働く近位ＤＲ１サイトと結合することを示す模式的な図である。図２Ｂは、ＦＡＯ細胞中のＣＯＵＰ−ＴＦIIの同時導入がＬ−ＦＡＢＰプロモーター活性を減少させることを示している。ラットＬ−ＦＡＢＰプロモーターの配列-141/+66を含むルシフェラーゼレポータープラスミドを、図に示された量のＣＯＵＰ−ＴＦII発現プラスミドと共に、ＦＡＯ細胞中に同時導入した。変異型ＤＲ１要素を含む構築体は、図１に示す通りである。全てのルシフェラーゼ値を、Ｒｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ａは、放射性同位体標識されたＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブまたはＭＴＰ−ＤＲ１プローブによるＥＭＳＡを使用して、類似のＦＡＯ特異的複合体が得られたことを示している。ＦＡＯ特異的な複合体におけるＰＰＡＲα／ＲＸＲαの存在を評価するために、核酸抽出物を、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１プローブまたはＭＴＰ−ＤＲ１プローブのいずれかと培養中に、ＰＰＡＲα（Ｐ）、ＲＸＲα（Ｒ）、またはＣＯＵＰ−ＴＦII（Ｃ）に対して特異的な抗体を加えた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ｂは、Ｌ３５細胞とＦＡＯ細胞とを比較したＣｈＩＰ解析による結果を示しており、当該解析は、ＣＯＵＰ−ＴＦIIおよびＰＰＡＲαに特異的な抗体を利用して行われた。図に示すように、領域特異的ＤＮＡの相対的な量は、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１またはＭＴＰ−ＤＲ１のいずれかのプロモーター領域に対して特異的なプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによって測定された（黒いバー）。末端の非翻訳領域の相対的なレベルは、領域特異性を証明するために示される（白いバー）。以下に説明されるように、全ての値を、ＩｇＧを用いた免疫沈降に対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｌ３５（ＣＯＵＰ−ＴＦII）細胞およびＦＡＯ（ＰＰＡＲα／ＲＸＲα）細胞におけるＤＲ１要素との細胞型特異的な複合体形成が、核内受容体ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの相対的発現率を反映することを示す模式的なグラフ図である。図３Ｃは、Ｌ３５細胞（白いバー）およびＦＡＯ細胞（黒いバー）における、ＣＯＵＰ−ＴＦII、ＲＸＲα、およびＰＰＡＲαのｍＲＮＡレベルのリアルタイムＰＣＲ解析による結果を示している。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ａは、図に示すように、リアルタイムＰＣＲを使用して、ＰＰＡＲα作用薬ＷＹ−１４，６４３（ＷＹ）、ＲＸＲα９−ｃｉｓレチノイン酸（ＲＡ）作用薬、または賦形剤（ＤＭＳＯ）のいずれかと４８時間処理したＬ３５細胞と、未処理Ｌ３５細胞（−）とを比較することによって、相対的なＬ−ＦＡＢＰとＭＴＰとのｍＲＮＡレベルを測定したものを示している。ＷＹ／ＲＡは、両方の作用薬を同時に用いて処理したＬ３５細胞を示している。全ての値を、３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateコントロールによる標準偏差を示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ｂは、野生型および変異型の両方のＤＲ１ルシフェラーゼレポーター構築体を利用して、未処理Ｌ３５細胞（−）と、上述のように４８時間処理した細胞とを比較することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方に対する相対的なプロモーター活性レベルを測定したことを示している。プロモーター活性については、野生型を白いバーとして、変異型ＤＲ１構築体を黒いバーとして示している。全てのルシフェラーゼ値をＲｅｎｉｌｌａコントロールに対して規格化した。誤差バーは、triplicateコントロールによる標準偏差を示している。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの協調的な誘発、ＤＲ１サイト依存的なプロモーター活性レベルの増加、ならびにａｐｏＢ分泌能力の回復を可能にすることを示す模式的なグラフ図である。図４Ｃは、〔３５Ｓ〕−メチオニンで標識する前に、７２時間、１μＭ９−ｃｉｓレチノイン酸および１０μＭ ＷＹ−１４，６４３がない場合（レーン１〜３）、または存在する場合（レーン４〜６）において、Ｌ３５細胞を培養した結果を示している。培養液を、放射能の添加の２４時間後に採集した。分泌されたａｐｏＢを、ポリクローナル抗ａｐｏＢ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％）で分離した。標識化されたタンパク質を、オートラジオグラフィーによって検出した。ａｐｏＢ４８およびａｐｏＢ１００の位置を、分子量マーカーおよびヒトＬＤＬ標準（human LDL standards）によって測定した。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの核内受容体を減少させ、結果的に、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターの近位ＤＲ１領域の占有を、抑制的ＣＯＵＰ−ＴＦII複合体から活性化ＰＰＡＲα／ＲＸＲα複合体に変化させることを示すグラフ図である。図５Ａは、リアルタイムＰＣＲを使用して、図に示すように、４８時間、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸を同時に処理したもの（黒いバー）またはＤＭＳＯで処理したもの（灰色のバー）と、未処理Ｌ３５細胞（白バー）とを比較することによって、ＣＯＵＰ−ＴＦII、ＲＸＲαおよびＰＰＡＲαの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した結果を示している。全ての値を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα／ＲＸＲα作用薬処理が、ＣＯＵＰ−ＴＦII：ＰＰＡＲα／ＲＸＲαの核内受容体を減少させ、結果的に、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターの近位ＤＲ１領域の占有を、抑制的ＣＯＵＰ−ＴＦII複合体から活性化ＰＰＡＲα／ＲＸＲα複合体に変化させることを示すグラフ図である。図５Ｂは、未処理のＬ３５細胞およびＦＡＯ細胞と、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸の両方で処理したＬ３５細胞（Ｌ３５Ｗ／Ｒ）とを比較したＣｈＩＰ解析による結果を示しており、当該回折は、図に示すように、ＣＯＵＰ−ＴＦIIおよびＰＰＡＲαに特異的な抗体を利用して行われた。図に示すように、領域特異的ＤＮＡの相対的な量は、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１またはＭＴＰ−ＤＲ１のいずれかのプロモーター領域に対して特異的なプライマーを用いて、リアルタイムＰＣＲによって測定された（黒いバー）。末端の非翻訳領域の相対的なレベルは、領域特異性を証明するために示されている（白いバー）。「実験手順」に説明されるように、全ての値を、投入ＤＮＡと、ＩｇＧを用いた免疫沈降とに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦＡＯ細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ発現を持続するために、および、生体内での両遺伝子の誘発に媒介されるＧＷ−７６４７のために、ＰＰＡＲαが必要であることを示すグラフ図である。図６Ａは、ＰＰＡＲαのＲＮＡ干渉ノックダウンの結果を示しており、当該結果は、ＦＡＯ細胞に、ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡ、またはネガティブコントロールである非標的コントロールｓｉＲＮＡのいずれかを７２時間導入することによって得た。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（黒いバー）と、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（白いバー）とを比較することによって、ＰＰＡＲα、ＭＴＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびａｐｏＢの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡを用いて処理したＦＡＯ細胞におけるｍＲＮＡレベルは、ネガティブコントロールの割合を１００％に設定して表されている。全ての値を、１８ＳｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＦＡＯ細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ発現を持続するために、および、生体内での両遺伝子の誘発に媒介されるＧＷ−７６４７のために、ＰＰＡＲαが必要であることを示すグラフ図である。図６Ｂは、コントロールＣ５７ＢＬ／６およびＰＰＡＲα-/-マウス（５マウス／グループ）を、ＰＰＡＲα作用薬ＧＷ−７６４７で７週間処理した結果を示している。リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。相対的なｍＲＮＡレベルは、黒いバー（ＧＷ−７６４７処理）と白いバー（賦形剤処理）として表されている。全ての値を、１８ＳｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ａは、Ｌ３５細胞（白いバー）およびＦＡＯ細胞（黒いバー）におけるＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルについてのリアルタイムＰＣＲ解析の結果を示している。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ｂは、未処理のＬ３５細胞（白いバー）と、ＷＹ−１４，６４３および９−ｃｉｓレチノイン酸で同時に４９時間処理したＬ３５細胞（黒いバー）とを比較することによって、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルについて、リアルタイムＲＮＡ解析をした結果を示している。追加して、未処理の野生型マウス（Ｗｔ、白いバー）と、ＰＰＡＲα作用薬ＷＹ−７６４７で７週間処理した野生型マウス（ＷｔＧＷ−７６４７、黒いバー）とを比較して、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルを測定した。全ての値を３６Ｂ４のｍＲＮＡレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＰＧＣ−１β発現が、肝臓細胞中および生体内の両方において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰと相互に関係しており、かつ、ＦＡＯ細胞中の両方の遺伝子発現に誘発されるＰＰＡＲα／ＲＸＲαのために必要であることを示すグラフ図である。図７Ｃは、ＰＧＣ−１βのＲＮＡ干渉ノックダウンの結果を示しており、当該結果は、ＦＡＯ細胞に、ＰＧＣ−１β特異的ｓｉＲＮＡ、またはネガティブコントロールである非標的コントロールｓｉＲＮＡのいずれかを７２時間導入することによって得た。集菌の４８時間前、細胞をＷＹ（１０μＭ）およびＲＡ（１μＭ）で処理した。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＰＧＣ−１β特異的なｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（黒いバー）と、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡで処理したＦＡＯ細胞（白いバー）とを比較することによって、ＰＧＣ−１β、ＭＴＰ、Ｌ−ＦＡＢＰ、およびＰＧＣ−１αの相対的なｍＲＮＡレベルを測定した。ＰＧＣ−１β特異的ｓｉＲＮＡを用いて処理したＦＡＯ細胞におけるｍＲＮＡレベルは、ネガティブコントロールの割合を１００％に設定して表されている。全ての値を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。誤差バーは、triplicateサンプルによる標準偏差を示している。
【図８】図８は、Ｌ３５細胞におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰについての、ＰＧＣ−１βの媒介による増加が、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα依存性であることを示すグラフ図である。図に示すように、リアルタイムＰＣＲは、アデノウイルス構築体および作用薬で４８時間処理されたＬ３５細胞において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡレベルを解析している。Ｌ３５細胞は、図に示すように、Ａｄ−ＰＧＣ−１βもしくはＡｄ−ＧＦＰで感染されているか、または非感染であった。感染については、同時的な作用薬の処理（ＷＹ−１４，６４３および９−ｓｉｓレチオニン酸）と同時に行った。全ての値（平均値±triplicateサンプルの標準偏差）を、３６Ｂ４ｍＲＮＡのレベルに対して規格化した。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の除去によって、ＭＴＰ抑制剤の誘導する肝臓脂肪症を防止することを示すグラフ図である。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウス（６マウス／グループ）に対し、ＭＴＰ抑制時８ａＲ（５０ｍｇ／日／ｋｇ）を７日間与えた。マウスを解剖し、血漿および肝臓を得て、脂質レベルを測定した。図９Ａは、賦形剤処理（白いバー）と、８ａＲ処理（黒いバー）とを比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウスの両方において、血漿中のトリグリセリド濃度およびコレステロール濃度を測定した結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の除去によって、ＭＴＰ抑制剤の誘導する肝臓脂肪症を防止することを示すグラフ図である。雄のＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＬ−ＦＡＢＰ-/-マウス（６マウス／グループ）に対し、ＭＴＰ抑制時８ａＲ（５０ｍｇ／日／ｋｇ）を７日間与えた。マウスを解剖し、血漿および肝臓を得て、脂質レベルを測定した。図９Ｂは、未処理（白いバー）と、８ａＲ処理（黒いバー）とを比較して、両系統において、肝臓トリグリセリド濃度を測定した結果を示す。全ての値は、平均値±標準偏差を示している。＊Ｐ＜．００１。
【図１０】図１０は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける血漿中トリグリセリド濃度を減少させることを示すグラフ図である。
【図１１】図１１は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける血漿中コレステロール濃度を減少させることを示すグラフ図である。
【図１２】図１２は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおける肝臓脂肪症の発現を防止することを示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔本発明の詳細な説明〕
本発明は、ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）および肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰまたはＬＦＡＢＰ）を同時に抑制することを通じて、高脂血症を改善することに基づいており、また、本発明はそのための方法である。ＭＴＰおよびＬ―ＦＡＢＰの同時抑制によって、本発明の組成物および方法は、肝臓脂肪症（脂肪肝）を引き起こすことなく、高脂血症を改善することができ、ひいては、高脂血症を治療するための効果的かつ安全な方法を提供することができる。
【００２４】
本発明の組成物および方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の組成物、方法、および実験条件に限定されるものではないことを理解されたい。例えば、組成物、方法、および実験条件は変更されてもよい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲だけに限定されるため、本明細書における専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的として用されており、それに限定されることを意図してはいない。
【００２５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられているような単数形の表現は、文脈が明らかに別なように指示しているのでない限り、複数形への言及を含んでいる。したがって、例えば、「方法」への言及は、ここで説明される種類についての１つ以上の方法および／または工程を含んでいることは、この公開その他を読む当業者にとって明らかであるだろう。
【００２６】
他に定義されていない限り、本明細書における全ての技術用語および科学用語は、本発明が所属する技術分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または均等である任意の方法および物質は、本発明の実施または実験において用いることができるが、好ましい方法および物質は、これから説明されるものである。
【００２７】
脂肪はリポタンパク質の形で血液を介して腸および肝臓から移送される。肝臓および腸の両方によるリポタンパク質の生産は、非常に大きな両親媒性タンパク質であるアポリポタンパク質（ａｐｏＢ）を要求する。ａｐｏＢは、トリグリセリド高含有の超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）中の構造タンパクとして、肝臓によって分泌される。血漿中、ＶＬＤＬ中に運ばれたトリグリセリドは、脂肪酸として取り除かれ、エネルギー生産および同化作用に用いるために肝外組織に供給される。粒子を含むａｐｏＢは、ＬＤＬに変換される。コレステロール高含有の低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）の血漿中濃度の増加は、アテローム性動脈硬化の発現と関係しており、米国および他の先進工業国において、循環器疾患および死亡の主な原因となっている。肝臓は、ＬＤＬの生産および分解の両方に関与する主な臓器である。無βリポタンパク血症の劣勢遺伝性疾患を有する患者は、血漿中にＬＤＬをほぼ有しておらず、アテローム性動脈硬化症に対する感受性の減少を示すため、ＬＤＬの血漿中濃度を減少させる治療法の発展に対して、多大な努力がされてきた。この提案は、肝臓のＬＤＬ摂取および分解の増加の結果として、血漿中のＬＤＬ濃度を減少させることによって、循環器疾患から疾患率および死亡率の両方を顕著に減少することが示されている薬（例えばスタチン）の発達によって実現されていた。全ての人が安全にスタチンを摂取できるとは限らず、これが、血漿中のＬＤＬ濃度を減少するためのさらなる薬の発展に対する推進力を与えている。
【００２８】
無βリポタンパク血症が機能的なミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）の突然変異欠損によって引き起こされるという発見によって、ＭＴＰ−脂質転移がａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌のために必要となることが提案された。本明細書における「無βリポタンパク血症」とは、ＭＴＰ機能の機能的な欠損を引き起こす、ＭＴＰ遺伝子における変異の原因となる異常な脂肪代謝という遺伝性疾患に言及している。ＭＴＰは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を有する複合体として、小胞体（ＥＲ）中に存在しているタンパク質である。ＭＴＰは、最初は、細胞膜からリポタンパク質へ向けた脂質（トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、およびコレステロールエステル）の転移を促進したタンパク質として認識された。ＭＴＰは、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合において、２つの役割を果たす。すなわち、ＭＴＰは、（１）ａｐｏＢへの脂質の転移を促進することによって、ａｐｏＢを小胞体の内腔中に転位させ、（２）ａｐｏＢの折り畳みを促進する。ＭＴＰ活性を欠くときは、ａｐｏＢは小胞体中で効果的に分解される。ＭＴＰが機能的に不活性である結果、無βリポタンパク血症を有する患者の肝臓は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を合成することもできず、また、分泌することもできず、ＬＤＬ（これまではβリポタンパク質と表している）の血漿中濃度がほぼ検出できないレベル（例えば無βリポタンパク血症）まで減少することが引き起こされる。したがって、ＭＴＰ活性を阻害する薬は血漿中のＬＤＬ濃度を減少させるために有用であるだろうことが推論された。
【００２９】
一般に、無βリポタンパク血症は、ＭＴＰの欠損に起因して肝臓のａｐｏＢ含有リポタンパク質を生産せず、また、脂肪肝を示すことはないため、無βリポタンパク血症の肝臓における脂肪症の発現を妨げる代償的プロセスがあるに違いないことが推測された。この問題を解明するために、ＭＴＰの存在が欠損しているが、脂肪を蓄積した肝細胞培養モデル（Ｌ３５細胞）が調べられた。したがって、本発明は、ＭＴＰ遺伝子の転写が、転写の類似ＤＲ１プロモーター因子の存在を介して、肝臓（Ｌ−ＦＡＢＰ）によって、脂肪酸の取り込みを調節する他の遺伝子と協調的に調節されたことを明らかにしている。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰは共通の先祖遺伝子から派生していると考えられるため、類似ＤＲ１プロモーター因子の保有は、相関転写形質発現が生理学的に重要であることを提案している。後述の実験は、なぜＬ３５細胞はＭＴＰ−促進リポタンパク質分泌の無いときに脂肪を蓄積しないのかについてＭＴＰとＬ−ＦＡＢＰとの相関阻害が説明し得るということを示している。Ｌ−ＦＡＢＰがないとき、ＭＴＰの抑制は、脂肪の蓄積（脂肪症）を引き起こすことなく、肝臓のＶＬＤＬ分泌を減少させる。なぜならば、Ｌ−ＦＡＢＰが促進する脂肪酸の取り込みが欠失しているためである。
【００３０】
本発明に一態様では、主題の方法は、高脂血症のための治療計画の一環として用いられ得る。Ｌ−ＦＡＢＰとＭＴＰとは協調して、グリセロ脂質合成、および超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）分泌の中に脂肪酸を入れ替える。高脂血症は、血中に、上昇した濃度または異常な濃度の脂質および／またはリポタンパク質が存在することである。脂質（脂肪分子）は、タンパク質カプセル中に輸送され、脂質の比重およびタンパク質の種類は、上記粒子の最終結果、および代謝に対するその影響を決定する。したがって、本発明は、高脂血症を改善（例えば、阻害または抑制）のための組成物および方法を提供する。一実施形態において、ここで提供される高脂血症の治療のための方法は、Ｌ−ＦＡＢＰの抑制剤と組み合わせたＭＴＰの抑制剤とを、被験者または細胞に対する投与することを含む。
【００３１】
ここで定義されるＭＴＰ活性の抑制剤は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質の肝臓による生産および血漿中ＬＤＬ濃度を減少させ、または抑制する。典型的なＭＴＰ抑制剤は、修飾されたジアミノインダン８ａＲ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｓｕｍｍｉｔ ＮＪ）である。肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）、肝臓の実質細胞の細胞質ゾル中における非常に豊富な脂質が結合したタンパク質は、脂肪酸の輸送および利用を促進する。Ｌ−ＦＡＢＰ発現の遺伝子破壊は、グリセロ脂質生合成およびミトコンドリア酸化を含むいくつかの代謝経路中に、効率的に脂肪酸を運び込んで移動させるための、肝臓の能力を低下させる。
Ｌ−ＦＡＢＰの欠失は、肝外細胞用に脂肪酸を転用する。脂肪酸は直ちに取り込まれ、さらに、エネルギーおよび熱の生産のために骨格筋および心臓によって利用される。脂肪酸は脂肪組織によっても取り込まれ、脂肪組織ではトリグリセリドとして蓄えられ得る。したがって、ここで定義されたＬ−ＦＡＢＰ活性の抑制剤は、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現を減少または抑制する。模範的なＬ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−〔２−（４−メチルフェニル）−１−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である。
【００３２】
ＭＴＰの抑制剤と組み合わせて投与するときのＬ−ＦＡＢＰの抑制剤の能力は、肝臓脂肪症の発現を引き起こすことなく血漿中脂質を減少させるような血漿中脂質および肝臓脂質に対する併用治療の効果と、ＭＴＰ抑制剤を単独で用いた治療による効果とを、比較することによって決定され得る。
【００３３】
本明細書における「被験者」という用語は、主題の方法が実行された任意の個人または患者を言及している。大抵、被験者は人間であるが、当業者にとって明らかなように、被験者は動物であってもよい。したがって、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、猫、犬、ウサギ、家畜（牛、馬、ヤギ、羊、豚などを含む）、ならびに、霊長類（モンキー、チンパンジー、オラウータン、およびゴリラを含む）などの哺乳類を含む他の動物は、被験者の定義の内に含まれる。
【００３４】
「治療効果のある量」または「効果的な量」という用語は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医学者によって求められる、組織、組織系、動物、または人間の生物学的反応または医学的反応を引き出すであろう、化合物または医薬組成物の量である。
【００３５】
「薬学的に許容可能な」という用語は、キャリアに関して用いられるとき、キャリア、希釈剤、または賦形剤が、剤形の成分と適合し、かつ、その受容者に対して有害にならないことを意味する。
【００３６】
「投与」または「投与すること」という用語は、治療を必要とする被験者に対して、本発明に係る化合物または医薬組成物を提供することの実行を含むように定義される。本明細書における「非経口的投与」および「静脈投与」という表現は、腸内投与および局所性投与以外の投与の形態であり、通常、注射による投与であり、制限されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、および胸骨内の注射および注入を含む。本明細書における「全身投与」「全身投与された」「末梢投与」および「抹消血管から投与された」という表現は、中枢神経系に対する直接的な投与以外の、被験者の系に入るような、化合物、薬剤、または他の物質の投与を意味しており、このため、例えば皮下投与など、代謝および他の類似のプロセスの影響下にある。
【００３７】
「アゴニスト（作用薬）」という用語は、受容体に対して生産的に結合し、その生物活性を模倣する作用物質または類似体を言及している。「アンタゴニスト（拮抗薬）」という用語は、受容体に結合はするが、正常な生物的反応を引き起こすことはない作用物質を言及している。アゴニストまたはアンタゴニストは、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または正常な生物的反応を減少させる他の分子を含んでもよい。
【００３８】
本発明で用いられる「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体について、その断片のみならず無傷分子を備えることを意味し、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、エピトープ決定基に結合することができるＦｖおよびＳＣＡ断片がある。
【００３９】
本明細書における「対応正常細胞」とは、同じ臓器由来の細胞であり、かつ、その細胞が調べられるときに同一性を有する細胞を意味する。一態様において、対応正常細胞は、健常人から得られた細胞試料から成る。このような対応正常細胞は、個人が検査される細胞を提供するとき、年齢を適合させたり、同じ性別であったりする必要はない。他の態様では、対応正常細胞は、高脂血症を有する被験者の組織のうち、その他の健康な部位から得られる細胞試料から成る。
【００４０】
本明細書では、「試料」および「生物試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を言及している。一実施形態において、本発明に係る生物試料は、例えば針生検からの試料である生検標本などの組織試料である。他の実施形態では、本発明に係る生物試料は、例えば血清、血漿、尿、精液などの体液試料である。
【００４１】
本明細書では、「低減」および「抑制」という用語は一緒に使用される。例えばＭＴＰ活性が特定の分析の検出レベルより下まで減少し得る場合など、場合によっては減少が認められるためである。それ自体は、上記活性が分析の検出レベルより下まで「低減」されるか、または、完全に「抑制」される否かについて、常に明らかにならない可能性がある。それでもなお、本発明の方法に係る治療を受けて、ＭＴＰ活性レベルは治療前のレベルから少なくとも低減されることが明確に決定できるだろう。
【００４２】
一実施形態において、高脂血症を治療するための方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ならびに、サイレンスＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰ活性を誘発するために、例えば二重差ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸について治療効果のある量を被験者に投与することを含む。ＲＮＡｉは、さまざま種類の有機体および細胞中へのｄｓＲＮＡの導入が、完全なｍＲＮＡの分解を引き起こすという現象である。細胞中、長いｄｓＲＮＡは、リボヌクレアーゼによって、短い（例えば２１〜２５ヌクレオチド）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になるよう切り裂かれる。その後、ｓｉＲＮＡは、上記プロセスに巻き込まれて、タンパク質成分と共にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体内に会合する。次に、活性化ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖とｍＲＮＡｔの間の塩基対合相互作用によって、転写物に対して完全に結合する。次に、結合ｍＲＮＡは切断され、ｍＲＮＡの配列特異的な分解は遺伝子サイレンシングをもたらす。本明細書において、「サイレンシング」とは、大部分の染色体ＤＮＡを中断するメカニズムであり、このメカニズムは特定遺伝子の発現の抑制をもたらす。ＲＮＡｉ機構は、内因性転移因子（トランスポゾン）およびウイルス感染から、遺伝子を守るために進化していることが明らかである。したがって、ＲＮＡｉは、以下の実施例に記載されているように、分解されるターゲットＲＮＡと相補的な核酸分子を取り込むことによって誘発されることができる。
【００４３】
他の実施例では、主題の抑制剤を用いて、被験者の高脂血症を改善または治療する方法を提供する。本明細書では、「改善」または「治療」という用語は、臨床的症状および／または高脂血症と関連した徴候が、行われた行為の結果として減少することを意味する。モニターされる上記症状または上記徴候は、高脂血症の特徴であり、かつ、上記症状および状態をモニターするための方法として、技術のある臨床医学者によく知られているだろう。例えば、脂質濃度の化学的測定は、昔から最も用いられる臨床的測定である。それが個々の結果との最良の相関関係を有しているためだけではなく、この実験方法が安上がりであり、さらに広範囲に利用できるためである。しかしながら、数値がより高性能な方法についての証拠および認識が増加している。具体的には、ＬＤＬ粒子数（濃度）は、より小さなサイズであるほど、上記粒子の中に含まれるＬＤＬの全濃度の科学的な測定法を用いて得られるよりも、アテローム性動脈硬化および心血管系イベントの発現とのより密接な相関関係を示す。ＬＤＬコレステロール濃度は低くなり得るが、それにもかかわらずＬＤＬ粒子数が高いと心血管系イベントの確率は高い。
【００４４】
本発明の他の態様では、主題の方法は、肝臓脂肪症を引き起こすであろう任意の兆候のための治療計画の一部として用いられ得る。本明細書における「癌」という用語は、これに限定されないが、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍などの、任意の悪性腫瘍などを含む。例えば、本発明に係る組成物および方法は、肝癌など、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性の上昇によって特徴付けられる任意の癌の治療のために用いられてもよい。本明細書では、「肝癌」は肝臓の上皮性悪性腫瘍を言及している。癌は、ひいては周囲の組織へ侵入して破壊を行うことになる、抑制されていない細胞分裂／または異常な細胞分裂によって生じる。本明細書では、「増殖型の」および「増殖」は細部が有糸分裂を起こすことを言及している。本明細書では、「転移」は、元の光景からの悪性腫瘍の遠位の広がりを言及している。癌細胞は、血流を介して、リンパ系を介して、体腔を超えて、またはそれらの複合によって、転移する可能性がある。場合によっては、癌の治療は、固形癌の治療または転移の治療を含んでいるだろう。転移は、形質転換細胞または悪性細胞が移動して、ある場所から他の場所へ癌を広げるような癌の形式である。
【００４５】
本明細書における「癌性細胞」という用語は、本明細書における任意の１つの癌状態にかかった細胞を含んでいる。したがって、本発明に係る方法は、メラニン細胞、グリア細胞、前立腺肥大、および多発性嚢胞腎の良性肥大の治療を含む。「上皮性悪性腫瘍」という用語は、周囲の細胞に侵入する傾向がある上皮細胞で構成されており、かつ、転移を引き起こす悪性新腫瘍を言及している。
【００４６】
ある実施形態では、本発明の化合物については、このような治療を必要とする被験者に対して、抗炎症剤、抗菌剤、抗ヒスタミン剤、化学療法薬、血管新生阻害剤、免疫賦活剤、治療抗体、または例えばチロシンキナーゼ阻害剤などのプロテインキナーゼ阻害薬と組み合わせて投与する。本発明の化合物と組み合わせて投与してよい他の薬剤は、サイトカインなどの治療薬、免疫調節薬、および、抗体を含む。限定される必要はないが、抗菌剤は、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、および駆虫薬を含む。他の治療薬が本発明の化合物と組み合わせて採用される場合、例えば米医薬品便覧（ＰＤＲ）に記載されたような量で用いてもよいし、または、当業者によって決定された別の方法で用いられてもよい。
【００４７】
本明細書において「サイトカイン」は、ケモカイン、インターロイキン、リンフォカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、および受容体関連プロテイン、ならびに、それらの機能的な断片を含む。模範的なサイトカインは、これに限定されないが、内皮単球活性ポリメラーゼII（ＥＭＡＰ−II）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３、インターフェロンなどを含んでおり、これらは、細胞または細胞メカニズムにおける特定の生物学的変化、形態学的変化、表現型の変化と関与する。
【００４８】
ＦＡＯラットの肝臓細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰを発現し、かつ、ＶＬＤＬを集めて分泌する一方、ＦＡＯ細胞からの単細胞クローンに由来するＬ３５細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰを発現もせず、また、ＶＬＤＬを集めて分泌もしない。それについて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのプロモーター中に存在する保存ＤＲ１プロモーター要素が転写、発現、およびＶＬＤＬ生産に対してどのように影響を与えるのかを解明するために、肝臓細胞が用いられた。ＦＡＯ細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターおよびＭＴＰプロモーターの両方のＤＲ１要素は、ＰＰＡＲαＲＸＲαによって占められる。ＰＰＡＲαＲＸＲαは、ＰＧＣ−１βと共に転写を活性化する。その一方、Ｌ３５細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターおよびＭＴＰプロモーターの両方のＤＲ１要素はＣＯＵＰ−ＴＦIIによって占められ、転写は減少される。これらの結果を組み合わせると、ＰＰＡＲαＲＸＲαおよびＰＧＣ−１βは、協調的に、各遺伝子の近位プロモーターにおけるＤＲ１サイトを目指してＣＯＵＰ−ＴＦIIと競争することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を上昇させることが示される。さらなる研究では、Ｌ−ＦＡＢＰの除去は、ＭＴＰ抑制剤を用いて治療されたマウスにもたらされる肝臓脂肪症を防止することが示される。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの調整された転写の変化は、肝臓脂肪症を引き起こすことなく、ＶＬＤＬ分泌へ脂肪酸が入ることに合わせて変化する。
【００４９】
本明細書において、「脂肪症」という用語は、細胞内の脂質の異常な保有を説明するプロセスを言及している。脂質（通常はトリグリセリドおよびコレステロールエステル）の合成、移動、および分解の正常なプロセスの機能障害を反映する。過剰な脂質は、細胞質と置き換えられて、細胞内膜中および小胞中に蓄積する。小胞が細胞核をゆがめるのに十分な程度に大きいとき、この状態は、大血管脂肪症として、あるいは微小空胞変性として知られている。軽症の細胞にとって特に有害ではないが、膜構造を変化させたり、膜機能や細胞の生存能力を害したりすることがある。これに関して、「脂肪症」は、臓器の間質組織中における脂肪の蓄積を含む。脂肪症に関連する危険因子は多様であり、炎症性の脂質およびサイトカインの生産を含む。炎症反応を促進する（炎症性の）脂質およびサイトカインは、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、悪性腫瘍、高血圧、細胞毒性、肥満、および酸素欠乏症を引き起こす。肝臓が脂質代謝の主要臓器であるように、肝臓は脂肪症と最も深く関係するが、脂肪症は、腎臓、心臓、および筋肉に共通して、任意の臓器に起こり得る。肝臓脂肪症は、肝硬変および肝細胞癌など、重度の肝臓病の発現を増進する。
【００５０】
本発明の方法における有用な抑制剤は、任意の遺伝子導入法によって細胞中に導入されてもよい。本明細書で示唆されるように、遺伝子治療のために利用できる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。多くの既知のレトロウイルスは、形質導入細胞を同定して生成することができるように、選択マーカーのための遺伝子を導入する、または組み込むことができる。例えば、特定の標的細胞における受容体のためのリガンドをコードする他の遺伝子と共に、目的対象のポリヌクレオチド配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターは標的特異性となる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードするヌクレオチドを挿入することによって、標的特異性の状態になる。好ましい標的は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって得られる。アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な転移を可能にするために、レトロウイルス遺伝子中に挿入することができる特異的なポリヌクレオチド配列について、当業者は知っているか、または実験を行うことなく容易に解明できるだろう。
【００５１】
本発明は、また、本発明に係る治療に適している癌細胞（例えば肝細胞）を同定するための方法を提供する。上記方法は、例えば、治療する細胞試料中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルを測定すること、ならびに、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現または活性が対応正常細胞中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルと比較して上昇することを測定することによって、実行されてもよい。上記対応正常細胞は、正常（例えば癌でない）細胞の試料としてもよい。対応正常細胞と比較して、癌細胞中のＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての発現レベルまたは活性レベルが上昇したことを測定することは、細胞が治療によって良い影響を受けているということを示している。本発明において用いられる細胞試料は、被験者からの組織試料または体液、あるいは、生検処置（例えば針生検）または腫瘍の切除および／または減量のための外科的処置によって得られた組織から得られる。
【００５２】
一実施形態において、治療に適している癌細胞を同定するための方法は、さらに、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせたＭＴＰ抑制剤と細胞を接触させること、ならびに、接触の後におけるＭＴＰ活性およびＬ−ＦＡＢＰ活性の減少を測定することを含んでもよい。このような方法は、癌細胞が上記治療に適していることを確かめるという意味を提供する。
【００５３】
他の実施形態において、治療の影響を受けやすい癌細胞を同定する方法は、細胞を、ＭＴＰコードするまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能性断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡなどの核酸分子と接触させること、および、接触後の細胞において、ＭＴＰの発現または活性についての減少を検出することを、さらに含んでもよい。このような方法は、癌細胞がこの治療の影響を受けやすいことを確かめるための手段を提供する。さらに、上記方法は、単独または組み合わせによる抑制剤の影響のために、１つ以上の異なる核酸分子を検査することを含んでもよく、それ故、試験される特定の癌を治療するために有用な１つ以上の核酸分子を同定するための手段が提供される。
【００５４】
それに応じて、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写がどのように協調して調節されるかについて明らかにするために、ＶＬＤＬの会合および分泌について別個の能力を示す、肝細胞の２つの別個の系統（Hui et al., 2002; Kang et al., 2003）の利用を説明する。ＦＡＯ細胞、すなわち、肝臓リポタンパク質の合成および分泌を研究するために用いられているラットの肝臓細胞系（Scarino and Howell, 1987a; Scarino and Howell, 1987b）は、Ｌ−ＦＡＢＰとＭＴＰとの両方を発現し、かつ、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌する能力を示す。一方、ＦＡＯ細胞からの単細胞クローンとして得られたＬ３５細胞は、Ｌ−ＦＡＢＰもＭＴＰも発現せず、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌する能力を欠いている。これらを組み合わせたデータは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰが共通の祖先の脂質結合タンパク質から派生したという提議（Phelps et al., 2006）を支持する。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現の同時的変動、および脂肪酸基質の供給に適応できるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的機能とを保証する共通の構造が保存され、一方、プロモーターにおけるＤＲ１サイトの保有は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰについての別個の脂質輸送機能を進化させた。
【００５５】
したがって、本明細書で提供されるデータは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写が、脂肪酸リガンドにより活性化する転写因子（ＰＰＡＲα−ＲＸＲα）またはＣＯＵＰ−ＴＦIIのいずれかによる類似ＤＲ１要素との競合的結合に基づいて調節されることを示している。このように、２つの脂質輸送タンパク質、すなわち、互いに協調して機能するＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現は、脂肪酸の利用可能性に応えて協調的に調節され得る。肝臓による脂肪酸の利用をめぐって競争する、機能的に異なる多くの経路が存在する。これらは、細胞取り込み、他の脂質（例えばグリセロ脂質、およびコレステロールエステル）の生産におけるエステル化、β酸化、主にＶＬＤＬ脂質の形成における蓄積および輸出を含む。これらの経路の１つ以上に向けての脂肪酸の輸送は、エネルギーおよび基質恒常性を保つために、迅速かつ選択的に変化しなくてはならない。基質主導の「フィードフォワード（正方向送り）」の転写調節は、恒常性と効率の良さとの両方を可能にする共通のメカニズムであり、同時的に存在する利用に適している（Wall et al., 2005）。脂肪酸は、Ｌ−ＦＡＢＰ（Poirier et al., 2001）およびＭＴＰ（Ameen et al., 2005）についてのＰＰＡＲα依存遺伝子の転写を活性化することもできるため、肝臓への脂肪酸流動は、脂質合成基質を提供するのと同様に、ＶＬＤＬ会合／分泌を調節する酵素を誘導する。
【００５６】
証拠となる複数の系は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰプロモーターに存在する類似ＤＲ１要素が、ＶＬＤＬ会合／分泌の経路に向かって脂肪酸を輸送するとき、これら２つの脂質輸送タンパク質の相互依存的な役割に必要な協調転写制御を提供することを示している。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ両方のプロモーターのレポーター構築における、ＤＲ１要素の突然変異欠損は、（１）ＦＡＯ細胞により提示される比較的高い活性レベルが、Ｌ３５細胞によって提示される低いレベルへ還元されること（図１Ｃ）、および（２）転写を抑制または活性化するＣＯＵＰ−ＴＦII（図２Ｂ）またはＰＰＡＲα−ＲＸＲα（図４Ａ）の作用薬の能力が無効にさせる。これらのＤＲ１要素が、ＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）またはＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）による競争的な占有に関与する、機能的に意味のある同起源の結合部位であるということを示すためのさらなる証拠は、ＥＭＳＡスーパーシフト解析（図２のＬ−ＦＡＢＰおよびKang et al.,2003のＭＴＰ）ならびにＣｈＩＰ解析（図３）によって提供される。ＤＲ１要素についての相補的なＥＭＳＡスーパーシフトとＣｈＩＰとの実験から得られる複合解析は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαによる占有が両方の遺伝子の転写活性と関係いる（ＦＡＯ細胞）と同時に、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによる占有が抑制に関係している（Ｌ３５細胞）ということを協調的に示す。
【００５７】
ＦＡＯ細胞およびＬ３５細胞により示されるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現における表現型の違いに関与する主要な決定要因は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）とＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）との相対的な細胞の中身である。３つの独立的な実験は、ＦＡＯ細胞およびＬ３５細胞の細胞表現型における可塑性が、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）と比較したＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）の細胞内容物に依存することを実証する：（１）ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬を有するＬ３５細胞の治療は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（活性体）の発現を増加させる一方、ＣＯＵＰ−ＴＦII（抑制体）の発現を減少させ（図５Ａ）；（２）ＰＰＡＲα−ＲＸＲα／ＣＯＵＰ−ＴＦIIについての細胞内容物におけるこれらの変化は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターに存在するＤＲ１の占有における類似変化に反映され（図５Ｂ）；（３）その結果、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築体の転写活性おいて、ＤＲ１サイト依存性が増加し（図４Ｂ）；ならびに、（４）Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの発現増強がもたらされる（図４Ａ）。さらに、Ｌ３５細胞における作用薬が媒介する変化は、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌するための回復能力と関係している。
【００５８】
ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、近位プロモーター領域におけるＤＲ１サイトへの結合によって、Ｌ−ＦＡＢＰの転写を活性化することが見られている（Poirier et al., 1997）。ＰＰＡＲα作用薬を用いた野生型（ただしＰＰＡＲαノックアウトではない）マウスの治療は、ＭＴＰの肝臓での発現を増加させた（Ameen et al., 2005）。これらの事項および脂肪酸代謝に関連した遺伝子の翻訳調節を調べる研究から得られた追加所見（Cabrero et al., 2003; Carter et al., 1994; Miyata et al., 1993; Palmer et al., 1994）は、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαおよびＣＯＵＰ−ＴＦIIがＤＲ１プロモーター要素に結合するために互いに競争するという提言を支持している。これらの遺伝子との関連において、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαによるこの要素の占有は転写の活性化と関連し、一方、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによる占有は転写抑制と関連する。
【００５９】
本明細書に開示される発見は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬が媒介する誘導のために、ＰＧＣ−１βが必要とされることを示す（図７Ｃ）。ＰＰＡＲα−／−マウスのＰＰＡＲα作用薬は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を誘導しなかったが（図４）、ＰＧＣ−１βｍＲＮＡの肝臓発現は２倍に増加した。このデータは、ＰＰＡＲαの欠損状態において、ＰＧＣ−１βは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を増加させるのに十分ではないということを示唆する。アデノウイルスが媒介するＰＧＣ−１βの発現を用いた追加実験は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写を増進するために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαが必要となることを示す。この複合的な所見は、ＰＧＣ−１βがＭＴＰの転写活性化に関与するという提言（Lin et al., 2005; Wolfrum and Stoffel, 2006）を支持する。ｏｂ／ｏｂ糖尿病性マウスにおいて、アデノウイルスが媒介するＰＧＣ−１βおよびＦｏｘａ２の発現は、ＭＴＰ発現を誘導し、インシュリンがＶＬＤＬ会合／分泌を阻害するメカニズムを提案する（Wolfum and Stoffel, 2006）。Ｆｏｘａ２はｏｂ／ｏｂマウスの核から完全に除かれる（Wolfrum et al., 2004）が、しかし一方、ＭＴＰ発現とＶＬＤＬ会合／分泌との両方は増加する（Bartels et al., 2002）ということが実証されている。さらに、ｏｂ／ｏｂマウスには、ＰＧＣ−１βが媒介するＭＴＰ発現の増加が保存されており、ＭＴＰ転写の誘導がＦｏｘａ２非依存性メカニズムを介して生じ得るということが示される（Wolfrum and Stoffel, 2006）。脂肪肥育された高脂血症のマウスにおいて、ＳＲＥＢＰおよびＬＸＲαのＰＧＣ−１β活性化は、ＭＴＰ発現およびＶＬＤＬ会合／分泌の増進に関係する（Lin et al., 2005）。ＰＧＣ−１βは、ＰＰＡＲαと相互作用することができ（Lin et al., 2002b）、かつ、ＰＰＡＲα標的遺伝子の転写を活性化する（Lin et al., 2003）。したがって、所見は、ラットの肝臓癌細胞との関連において、ＰＧＣ−１βはＰＰＡＲα−ＲＸＲαを活性化するということを示す（図８）。
【００６０】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのプロモーターにおける類似ＤＲ１要素の保有は、それらの発現がエネルギーの十分な転用を脂肪酸の形でＶＬＤＬ会合／分泌経路に提供するために十分に誘導されるだろうことを確実にすることを、複合データは示している。Ｌ−ＦＡＢＰの除去は、ＭＴＰ抑制剤を用いて治療されたマウスの肝臓において、トリグリセリドの蓄積を阻害することを示す追加研究（図９）によって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現が協調的に減少されることの重要性が明確に示された。これらの発見は、高脂血症を改善することを目的としたときのＭＴＰ抑制剤の有効性に関して、重要な意味合いを備えている。
【００６１】
先に示したとおり、ＭＴＰ抑制剤は高脂血症を減少させるために効果的な治療法であるように思われるが、その使用は脂肪肝の発現に関連する（Bjorkegren et al., 2002; Liao et al., 2003）。本明細書の提供するデータは、Ｌ−ＦＡＢＰの除去がＭＴＰ抑制剤８ａＲを用いて治療したマウスの肝臓におけるトリグリセリドの蓄積を完全に阻害することを示す（図９Ｂ）。したがって、これらの研究は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方の機能および／または発現のいずれかを阻害する薬剤が、脂肪肝の発現を引き起こすことなく、高脂血症を減少することを示す。
【００６２】
別の態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルス感染を改善するための方法、および、炎症性肝疾患、線維症、肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌の発現を減少するための方法を提供する。ＨＣＶ粒子の生産および輸送に関与するプロセスは、血漿リポタンパクの生産および輸送と関連する多くの態様を共有する。ＨＣＶはリポタンパク複合体を形成し、かつ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬの両方の構成要素として血漿中に輸送される（Andre et al., 2005, Hepatitis C virus particles and lipoprotein metabolism. Semin liver Dis 25:93-104）。ＨＣＶの肝臓での生産は、ＶＬＤＬの分泌と同様に、ＭＴＰの発現および活性を低下させる（Domitrovich, et al., 2005, Hepatitis C virus nonstructural proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion. J BiolChem 280:39802-39808）。ＭＴＰの抑制は、ＨＣＶに感染した被験者が血漿脂質濃度の変化を示し（Siagris, et al., 2006, Serum lipid pattern in chronic hepatitis C: histological and virological correlations. J Viral Hepat 13:56-61）、さらに、その被験者の肝臓が脂肪症を発現する（Mirandola, et al, 2006, Liver microsomal triglyceride transfer protein is involved in hepatitis C liver steatosis. Gastroenterology 130:1661-1669）ことの理由について説明するだろう。逆に言えば、ＭＴＰ抑制剤は、肝臓癌細胞によるＨＣＶの生産を阻害する（Huang, et al., 2007, Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lopoproteins. Proc Natl Acad Sci USA 104:5848-5853）。本発明は、脂肪症の発現を引き起こすことなく、ＭＴＰ（ひいてはＨＣＶの生産）を抑制する方法を説明する。したがって、ＨＣＶに感染した被験者に対してＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤とを同時に投与することは、ＨＣＶの生産を減少し、かつ、慢性ＨＣＶ感染、脂肪症の発現、肝硬変、および肝不全と関連する病状を改善するだろう（Hwang, et al., 2001, Hepatic steatosis in chronic hepatitis C virus infection: prevalence and clinical correlation. J Gastroenterol Hepatol 16:190-195）。
【００６３】
本発明の別の態様では、癌（例えば肝臓癌）および／または高脂血症を治療するために有用な薬剤を同定するための方法が提供される。本発明の任意の方法において有用な薬剤は、例えば、ポリヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣薬、ビニル性ペプトイドなどのペプチド、有機小分子など、任意の種類の分子であってもよく、また、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの発現または活性の減少または抑制を促進する任意の様々な過程に作用してもよい。薬剤については、特定の種類の癌／高脂血症を治療するために用いられる典型的な薬剤の何らかの方法で投与してもよく、または、標的癌細胞と薬剤の接触（また適切な場合、細胞中への侵入）を容易にする条件の下で投与してもよい。例えば、細胞中へのポリヌクレオチド薬剤の導入は、細胞に感染し得るウイルスベクター中にポリヌクレオチドを組み込むことによって容易にされてもよい。細胞の種類に特異的なウイルスベクターが入手できない場合、ベクターは、標的細胞上で発現されたリガンド（または受容体）に対して特異的な受容体（またはリガンド）を発現するために修飾されてもよく、または、リポソーム内に封入されてもよい。また、上記リポソームも、このようなリガンド（または受容体）を含むために修飾されてもよい。ペプチド薬剤は、様々な方法によって細胞中に導入されてもよい。例えば、細胞中へのペプチドの転位を容易にすることにできる、人免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質導入ドメインなどのタンパク質導入ドメインを含むように、ペプチドを設計する方法などによってもよい。概して、薬剤は、被験者へ投与するのに適切な組成物（例えば医薬組成物）に処方される。このように処方された薬剤は、高脂血症、または一部分においてＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰについての活性または発現の上昇によって特性を示す癌を患う被験者を治療するための薬剤として有用である。
【００６４】
典型的には、候補薬剤は有機分子であり、１００ダルトンよりも大きく、約２５００ダルトンよりも小さい重さの分子を有する有機小化合物（例えば小分子）であることが好ましいとはいえ、候補薬剤は多数の化学的分類を包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特には水素結合のために必要な官能基を含んでおり、典型的には、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含んでおり、少なくとも２つの化学官能基を含んでいることが好ましい。候補薬剤は、多くの場合、１つ以上の上記官能基と置換された、炭素環構造もしくは複素環構造、および／または、芳香族構造若しくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの複合体を含む生分子の間にも検出される。
【００６５】
候補薬は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む多種多様の源から得られるだろう。例えば、任意抽出されたオリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様の有機化合物および生分子についての、無作為または指向性のある合成のために、多数の手段が利用できる。あるいは、バクテリア、真菌、植物、および動物の抽出物の形である天然化合物のライブラリーが利用できる、または、容易に生産される。さらには、天然または合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的手段、物理的手段、および生物学的手段を介して容易に修飾される。既知の薬理作用のある薬剤が、構造的類似体を生産するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など、無作為または指向性のある化学的修飾を受けてもよい。
【００６６】
別の態様では、本発明の方法は、オーダーメイド医療を実施する方法を提供することのために有用である。オーダーメイド医療では、被験者の高脂血症または癌細胞の個別の特性に基づいて、治療が被験者に合わせられる。例えば、少なくとも１つの検査薬、またはＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ抑制剤と、被験者由来の細胞試料とを接触させることによって、本方法を実施してもよい。ここで、検査薬または抑制剤を欠くときのＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現と比較して、検査薬または抑制剤存在下におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現が減少すると、その減少は、上記薬剤または抑制剤を、疾患を治療するために有益であると同定する。本発明の方法に従って検査する細胞試料は、治療する予定の被験者から得られてもよく、または、確立された癌細胞系の細胞、もしくは被験者のものと同じ種類である既知の高脂血症の細胞であってもよい。一態様では、確立された細胞系は、このような細胞系の一団の１つであってもよい。ここで、上記一団は、同じ種類の疾患の異なる細胞系、ならびに／または、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現の上昇値と関係する、異なる疾患の異なる細胞系を含んでもよい。このような細胞系の一団は、例えば、治療する被験者から少数の細胞しか得られないときに、被験者の細胞の代用試料を提供するため、本発明の方法を実施するために有用であり、また、本発明の方法を実施するときのコントロール試料として有用となるだろう。
【００６７】
いったん、疾患が明らかとなり、治療プロトコルを開始すれば、被験者におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現の値が、健常被験者に観察される値に近似し始めるかどうかを評価するために、本発明の方法を定期的に繰り返してもよい。数日間から数ヶ月間の測量期間にわたる治療の効果を示すために、連続的な分析から得られる結果を用いてもよい。よって、本発明は、高脂血症を有する被験者を治療するために、治療規制をモニタリングする方法も指示している。治療前と治療中とにおけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの活性または発現のレベルを比較すれば、治療の効果が示される。これによって、当業者は、必要に応じて治療的なアプローチを認識し、かつ調節することができるだろう。
【００６８】
全ての方法は、さらに、１つ以上の補助的な成分を構成する、薬学的に受容可能なキャリアと、有効成分とを関連させる工程を含んでもよい。被験者に投与するための薬剤を処方するために有用である、薬学的に受容可能なキャリアには、当技術分野で周知のように、例えば、水もしくは緩衝生理食塩水などの水溶液もしくは他の溶媒、グリコールもしくはグリセロールなどの賦形剤、オリーブオイルなどの油、または注射用有機エステルが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアには、例えば、複合体の吸収を安定するまたは増加する役割を果たす、生理学的に許容可能な化合物が挙げられる。このような生理学的に許容可能な化合物には、例えば、グルコース、サクロース、もしくはデキシトリンなどの糖質、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化物質、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤などが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアの選択は、例えば、治療薬の物理化学的な特性、および化合物の投与経路に基づくことについて、当業者は分かるだろう。ここで、投与経路には、例えば、経口、または、静脈注射などの非経口、および、注射、挿管、または従来知られている他の方法によるものがあるだろう。医薬組成物は、例えば癌の化学的療法薬および／またはビタミンなど、診断用薬、栄養物質、トキシン、または治療薬などの、第２（またはそれ以上）の化合物を含んでもよい。
【００６９】
本発明の抑制剤を含む組成物の投与経路は、ある程度、分子の化学的構造に依存するだろう。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、経口で投与されると、消化管で分解されるため、特に有用ではない。しかしながら、例えば、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれを、内因性ヌクレアーゼまたは内因性プロテアーゼによる分解の影響され難くする、あるいは、消化管を介してより吸収されるようにするために、それらを化学的に修飾する方法がよく知られている（例えば、Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92, 1995; Ecker and Crook, Bio Technology, 13:351-360,1995参照）。例えば、ペプチド剤は、Ｄ−アミノ酸を用いて調製されてもよいし、または、ペプチド模倣薬に基づいた１つ以上のドメインを含んでいてもよい。ここで、ペプチド模倣薬は、ペプチドドメインの構造を模倣しているか、または、ビニル性ペプトイドなどのペプチドに基づいている有機分子である。抑制剤がステロイドアルカロイドなどの有機小分子である場合、その抑制剤については、体内（例えば肝臓内）の所望の位置で活性薬剤を開放する形状で投与してもよく、または、抑制剤が標的細胞（例えば肝臓癌細胞）を循環するように血管中に注射することによって投与してもよい。
【００７０】
例となる投与経路には、これに限定されないが、経口または静脈内、膣内、皮下、腹腔内、直腸内、もしくは嚢内などの非経口、または適切な場合、例えば皮膚用パッチ剤もしくは経皮イオン導入などの皮膚利用を介した受動的吸収もしくは促進的吸収のそれぞれが挙げられる。さらには、医薬組成物は、注射、挿管、もしくは経口によって、または局所的に投与してもよい。その局所的な投与とは、例えば軟膏の直接的な塗布による受動的なものであってもよく、または、その組成物の１つ成分が適切な高圧ガスである場合には、鼻内噴霧もしくは鼻孔吸入を用いた能動的なものであってもよい。上述したように、医薬組成物については、例えば、癌を供給する血管中への静脈内投与または動脈内投与など、癌部位に投与してもよい。
【００７１】
本発明の方法の実施において投与する化合物または組成物の総量については、単回投与として、ボーラスまたは輸液によって、比較的短い期間にわたって投与してもよいし、あるいは、長期間わたって複数回投与するための分割治療プロトコルを用いて投与してもよい。被験者の高脂血症または肝臓癌を治療するための、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現の抑制剤の量が、投与経路および投与が行われる治療の回数と同様に、被験者の年齢および総体的な健康を含む多くの要因に基づくことは、当業者は分かるだろう。これらの要因を考慮して、当業者は、必要に応じて特定の量を調節するだろう。概して、医薬組成物の処方ならびに投与経路および投与回数は、第１相および第２相臨床試験を用いて、始めに決定される。
【００７２】
本発明の方法については、例えば培養液中または固形担体上などの生体外で、細胞試料と接触することによって実施してもよい。あるいは、それに加えて、上記方法は、例えば実験動物（例えばヌードマウス）中に癌細胞試料を導入すること、または、実験動物中に検査薬または組成物を投与することによって生体内で実施してもよい。生体内分析の利点は、生きた動物で、ひいては臨床状態をより厳密に模倣して、検査薬の効果を評価し得ることにある。一般に、生体内分析はよりコストが高いため、生体外方法を用いて「先導（リード）」薬剤の同定の後に、二次スクリーニングとして用いることが特に有用であるだろう。
【００７３】
本方法は、生体外分析として実施されるとき、スループット法（高速大量処理法）に適応する。よって、独立的に、並行して同じものである、または異なるものである、複数個（すなわち、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の細胞試料および／または検査薬の試験が可能になる。スループット法は、検査薬が単一の被験者に由来するいくつかの細胞試料を検査できるなど、多数の利点を提供する。ひいては、例えば、被験者に投与する薬剤の特定の効果的な濃度を同定したり、被験者に投与する特定の効果的な薬剤を同定したりすることが可能になる。このように、スループット法は、最もよい（最も効果的な）薬剤または薬剤の組み合わせを治療手段に用いることができるように、被験者の癌細胞上で、２つ、３つ、４つ、それ以上の異なる検査薬を、単独または組み合わせて試験することを可能にする。さらには、スループット法によれば、例えばコントロール試料（ポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロール）を、検査された薬剤を用いて効果的に治療されるだろう既知の細胞試料などの検査試料と並行して実施することが可能になる。
【００７４】
本発明のスループット法は、任意の様々な手段で実行され得る。例えば、異なる被験者から得られた、異なる細胞試料を、同一または異なる量の、１つまたは複数の検査薬を用いて並行に試験してもよい。あるいは、一人の被験者から得られた２つ以上の細胞試料を、１つまたは複数の検査薬についての、同じまたは異なる量を用いて試験してもよい。加えて、同じまたは異なる被験者の細胞試料を、検査薬および／または既知の効果的な薬剤の組み合わせを用いて試験してもよい。これらの例示された様々は形態は、癌の治療のために有用な薬剤または薬剤の組み合わせを同定するために用いられてもよい。
【００７５】
本方法をスループット法（または超スループット法）により実行するときは、固形担体（例えばマイクロタイタープレート、シリコンウエア、またはスライドガラス）の上で実行してもよい。ここで、検査薬と接触させる試料については、各々が互いに線引きされるように（例えば、ウエル中にあるように）配置する。任意の数の試料（例えば、９６、１０２４、１０，０００、１００，０００、またはそれ以上）については、特定の使用された単体に基づいて、このような方法を用いて並行に検査してもよい。試料をアレイ状（すなわち規定されたパターン）に配置する場合、アレイ状の各試料は、その位置によって（例えばＸＹ軸を用いて）定義され得る。よって、各試料のための「アドレス」が提供される。アドレス可能なアレイ形式を用いることの利点は、細胞試料、薬剤、および検査薬などを、所望の時間に、特定の位置に施す（または特定の位置から取り除く）ことができ、かつ、試料（または資料の分割単位）における、例えばＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性または発現の減少をモニターすることができるように、本方法を、全体的にまたは部分的に、自動化することができることである。
【００７６】
ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、本発明の解析において用いられてもよい。全てのコントロールおよび検査試料については、統計学的に顕著な結果を得るために、少なくとも３倍、実行することが好ましい。全ての試料の培養については、薬剤がタンパク質に結合するために十分な時間行う。培養後、全ての試料を、非特異的に結合した物質がないように洗浄し、概して、ラベル標識された薬剤の結合量を決定する。例えば、放射性標識を採用する場合、結合した化合物の量を決定するために、シンチレーションカウンタによって試料を計測してもよい。
【００７７】
スクリーニング検定中に、他の様々な薬剤を用いてもよい。これらには、塩、アルブミンなどの天然タンパク質、洗剤などの試薬が挙げられる。これらを、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進したり、非特異的またはバックグラウンドの相互作用を減少させたりするために用いてもよい。プロテアーゼ抑制剤、ヌクレアーゼ抑制剤、抗菌剤など、分析の効率を向上させる他の試薬もまた同様に用いてもよい。成分の混合体を、結合に必要な条件を与える任意の順序で加えてもよい。
【００７８】
全ての条件が各測定に対して同様の状態において、もしくは様々な条件下で、検査薬を用いて、もしくは検査薬を用いずに、または癌などの病状の異なるステージにおいて、測定が行われ得る。例えば、検査薬が存在する状態で、および検査薬が欠失した状態で、細胞中、または細胞集団中において、測定が行われ得る。他の例では、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学療法薬などの薬剤、放射線、発癌物質、または他の細胞（例えば細胞−細胞接触）など、生理学体信号の暴露が存在するもしくは欠失した状態で、またはその暴露の前もしくは後で、細胞が評価されてもよい。さらにもう１つの例では、同じ条件において、および、１つの細胞もしくは細胞集団と、他の細胞もしくは他の細胞集団との間で変更された条件で、Ｄｋｋ活性の測定が行われる。
【００７９】
他の態様では、本発明は、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現についての１つ以上の抑制剤を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態において、本発明は、ＭＴＰおよび／またはＬ−ＦＡＢＰの活性もしくは発現についての１つ以上の抑制剤から構成される医薬組成物を含むキットを提供する。含まれる抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能的断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡであってもよく、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドと、またはその機能的断片とハイブリダイズするｄｓＲＮＡであってもよい。他の実施形態では、上記キットは、本発明の方法を実施するための説明書を含む。
【００８０】
以下の例は、本発明の利点および特徴をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲がこれに限定されることを意図していない。それらは典型的な使用例であるが、当業者に知られた手順、方法論、または技術が代わりに用いられてもよい。
【実施例１】
【００８１】
（Ｌ−ＦＡＢＰ発現の除去による肝臓脂肪症の発現の防止）
この例は、ＭＴＰ抑制剤によって引き起こされる肝臓脂肪症の発現を防止するための方法として、Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤を使用することを実証している。
【００８２】
細胞培養：細胞は、（Kang et al., 2003）に記述されているように培養し、形質転換した。ＦＡＯ細胞はコロラド大学から無料で得られた。Ｌ３５細胞は（Leighton et al., 1990）に記載されているように得られた。
【００８３】
細胞は、マイナー変更（Kang et al., 2003）と共に、LipofectAMINE薬剤（Invitrogen）を用いて、メーカーの手順にしたがって形質転換した。形質転換の１日前に、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞（２×１０５）を１２ウエルのプレートに蒔いた。形質転換の当日、０．８μｇのプロモーター／ルシフェラーゼレポーター構築、および、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの正常化のための内部調整として、６ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドを細胞に導入した。並行実験から、空ベクターの活性と比較して、規格化したｐＲＬ−ＣＭＶ活性を記録した。図の説明文に示すように、様々な量のＣＯＵＰ−ＴＦII発現ベクターを加えた。空ベクターｐＣＲ３．１（Invitrogen）の追加によって、各分析に対する全ＤＮＡ濃度を一定に保った。形質転換後、細胞を４８時間培養し、パッシブ溶解バッファー（Promega）を用いて集菌した。デュアル−ルシフェラーゼレポーター分析システム（Promega）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８４】
ＰＰＡＲαおよびＲＸＲ作用薬、ＷＹ−１４，６４３（ＷＹ）、ならびに、９−シスレチノイン酸（ｃＲＡ）の各々を用いて、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰプロモーターレポーター分析（A. G. Scientific, Inc.）を、図の説明文に示すように実施した。ＷＹ−１４，６４３および９−シスレチノイン酸の両方を、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ、０．１５％ｖ／ｖ）中に溶かし、１０μＭ（ＷＹ）および１μＭ（ｃＲＡ）の作用濃度で用いた。簡潔に言えば、形質転換後、細胞を、図のように作用薬またはＤＭＳＯ単独で４８時間処理した。細胞を集菌し、プロモーター活性を図のように分析した。
【００８５】
（レポーター遺伝子構築およびベクターの発現）
野生型および変異型のラットＭＴＰレポーターベクター（-135/+66）は、前述の（Kang et al., 2003）のとおりである。野生型ラットＬ−ＦＡＢＰレポーターベクター（-141/+66）を作り出すために、DNeasy tissue kit（Qiagen）を用いて、ＦＡＯ細胞からゲノムＤＮＡを単離および抽出した。指定された制限酵素サイトを有するプライマーを用いて、ＰＣＲによって、プロモーター断片を作り出した。フォワード５’（ＫｐｎＩ）−ＧＡＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および、リバース５’（ＢｇｌII）−ＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。次いで、プロモーター断片を、空ルシフェラーゼレポーターベクターＰＧＬ３Ｂａｓｉｃ（Promega）のＫｐｎＩサイトおよびＢｇｌIIサイトにクローニングした。
【００８６】
変異Ｌ−ＦＡＢＰレポーターベクターを作り出すために、QuikChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて、近位ＤＲ１シークエンスにおける特異的な変異を作り出した。インビトロにおいて、テンプレートとして、ラットＬ−ＦＡＢＰ（-141/+66）−ルシフェラーゼレポーターベクターおよびベクターの逆鎖とそれぞれ相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマー（突然変異基には下線を付す）（フォワード ５’―ＡＡＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；リバース ５’−ＡＡＡＴＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４））の突然変異生成を行った。ＤＮＡシークエンスによって部位特異的変異構築を検証した。ＣＯＵＰ−ＴＦIIのための発現プラスミドはベイラー医科大学から贈呈された。
【００８７】
（核抽出物の調製）
前述の（Kang, 2003）にしたがって、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞からの核抽出物を調製した。簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって集菌し、１×リン酸塩緩衝食塩水で洗浄し、さらに、低張緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁した。氷上で１０分間の低温放置後、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して細胞を溶解した。細胞核を遠心分離によってペレット化し、低塩緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）中に再懸濁した。その後、高塩濃度緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２５％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）を、攪拌しながら滴下して加えた。核タンパク質の抽出をするために、得られた懸濁液を３０分間、静かに振蕩した。細胞核を、３０分間、再び遠心分離し、得られた上澄みを、１時間、透析緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニル、０．５ｍＭジチオスレイトール）に対して透析した。
【００８８】
（電気泳動移動度シフトアッセイ）
ＩＤＴによって、ＥＭＳＡに用いる全てのオリゴヌクレオチドを合成した。ゲル移動度シフトアッセイでは、以下のオリゴヌクレオチド（センス鎖）を用いた：ＭＴＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＡＣＣＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；変異ＭＴＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＧＴＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＡＣＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；変異Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１ ５’−ＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）。
【００８９】
相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）を用いて〔γ‐３２Ｐ〕ＡＴＰ（３００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）（PerkinElmer Life Sciences）で末端標識し、続いて、Ｇ５０カラムに精製することによって、プローブを調製した。結合反応のために、総量１５μｌの溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９（４℃）、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および、２μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ））中に、２０分間、氷上で、３×１０４ｃｐｍプローブとともに核抽出物１５μｇを低温放置した。スーパーシフトアッセイ（supershift experiments）のために、氷上でさらに２０分間、前もって低温放置したＤＮＡ−タンパク質複合体に特異的抗体１μｌを加えた。ＣＯＵＰ−ＴＦII（sc-6576X）、ＲＸＲα（sc-553X）、およびＰＰＡＲα（sc-9000x）に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology, Inc.から得られた。０．５×ＴＢＥ緩衝液を含む４％天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＤＮＡ−タンパク質複合体を分離した。
【００９０】
（ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ）
製品使用説明書により、オンカラムＤＮＡ除去と共に、Versagene RNA Tissue Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて凍結肝臓から、または、Versagene Cell Culture Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて細胞から、全ＲＮＡを単離した。分光光度計によって、２６０ｎｍで、ＲＮＡ濃度を測定した。逆転写のためのBio Rad iScript（Biorad）を用いて、０．５μｇの全ＲＮＡから、一本鎖ｃＤＮＡ鎖を合成した。GenBankTMが提供している遺伝子配列を用いて、各遺伝子（補足表１）に対して特異的なプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡの増幅を避けるため、上記プライマーをエクソン接合部にまたがるように配置した。ＩＤＴによって全てのプライマーを合成した。
【００９１】
製品使用説明書に従ってBioRad SyBr Green supermixを用いたBioRad iCyclerによって、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。溶解−曲線分析を用いた特定産物モニターによって、三通りに、反応を分析した。内在性コントロール、すなわち、１８ＳリボソームＲＮＡ、または酸性リボソーム燐タンパクＰ０（３６Ｂ４）に対して、発現データを規格化した。１８ＳＲＮＡおよび３６Ｂ４の両方の濃度は、全ての実験サンプルの間で不変であった。式２−ΔＣｔに従って、相対的発現濃度を計算した。ここで、ΔＣｔは、標的と、１８Ｓまたは３６Ｂ４の内在性コントロールとの、閾値サイクル（Ｃｔ）濃度における差分である。
【００９２】
（クロマチン免疫沈降分析および相対定量）
１５０ｍｍシャーレ中の完全培地で、約７０〜８０％程度の密集状態まで、細胞を培養した。ここで、集菌の４８時間前、細胞培地に、指定の作用薬であるＷＹ（１０μ）およびｃＲＡ（１μＭ）を加えた。その後、３７％ホルムアルデヒド（Sigma）２８μｌを培地１０ｍｌに加えることによって、３７℃で１０分間、細胞を固定し、集菌し、そして、クロマチン免疫沈降のためのChIP-IT Shearing Kit（Active Motif）およびChIP-IT Chromatin Immunoprecipitation Kit（Active Motif）を用いて、製品使用説明書に従って、免疫沈降の処理を行った。免疫複合体を、６５℃で５Ｍ ＮａＣｌを用いて溶出、すなわち脱架橋し、プロテアーゼＫで処理し、ChIP-IT kitに提供されるミニカラムを用いて精製した。
【００９３】
上述に示すように、BioRad SyBr Green Supermixを用いたリアルタイムＰＣＲによって、免疫沈降した試料からの特異的ゲノムＤＮＡ断片および投入量を定量した。免疫沈降−特異的濃縮差の領域選択性のためのコントロールとして、サンプル毎に、非コード遠位非翻訳領域の量を決定した。使用した抗体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII（Wyeth-Ayerst Research, PA）、ＰＰＡＲα（sc-9000X, Santa Cruz Biotechnology, Inc.）およびコントロールIgG（Active Motif）に対するものであった。以下のラットゲノムＤＮＡ領域を増幅するために、プライマーセットを設計した：ＭＴＰ−ＤＲ１（フォワード−５’−ＴＡＧＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；リバース−5’−ＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡＣＡＧＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１（フォワード−５’−ＧＡＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；リバース−５’−ＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＡＴＴＴＴ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、および、Ｌ−ＦＡＢＰ−３’−非翻訳領域（フォワード−５’−ＧＴＣＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＴＡＡＧＡＧＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）；リバース−５’−ＣＴＧＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。ΔΔＣｔ法を用いて、投入ＤＮＡとＩｇＧによる免疫沈降との両方からの値に対して、全ての値を規格化した。簡単に述べると、調査したプロモーター毎に、免疫沈降した試料により得られたＣｔ値から、投入ＤＮＡによるＣｔ値を引くことによって、各試料のΔＣｔを計算した。その後、正常型ラビット血清（ＩｇＧ）により免疫沈降された対応試料に対するΔＣｔから、特異的抗体（ＰＰＡＲαまたはＣｏｕｐ−ＴＦII）により免疫沈降された試料に対するΔＣｔを引くことによって、ΔΔＣｔを計算した。その後、２をΔΔＣｔ乗することによって、倍数差分（Fold difference）（コントロールＩｇＧ ＣｈＩＰと比較した因子特異的ＣｈＩＰ）を決定した。
【００９４】
（ＲＮＡ干渉）
ラットＰＰＡＲαに対して特異的なSmartpool siRNA（Dharmacon）を用いることによって、ＦＡＯ細胞におけるＰＰＡＲαノックダウンを実現した。前述に記載のように（Lin et al., 2005）、ラットＰＧＣ−１βに対して指向性のあるｓｉＲＮＡのための配列を選択した。３’ジヌクレオチド（ＴＴ）突出部と共に、オプションＡ４を用いて、２１−ヌクレオチドニ本鎖として、ラットＰＧＣ−１βｓｉＲＮＡ（センス配列；５’−ＧＡＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）をDharmaconによって合成した。非特異的な標的をモニターするために、ネガティブコントロール配列として、種に特異なｓｉＣＯＮＴＲＯＬ非標的ｓｉＲＮＡ＃１を利用した。実験の２４時間前、５×１０４／ウエルの濃度で、１２−ウエルプレートに細胞をまいた。形質転換前、１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Dharmacon）中に、２０μＭの濃度になるまでｓｉＲＮＡを再懸濁した。製品使用説明書に従って、DharmaFECTTM4 transfection reagent（Dharmacon）用いて、ＦＡＯ細胞中に、全てのｓｉＲＮＡを導入した。図の説明文に示されるように、１００ｎＭの作用濃度で、４８〜７２時間、示されたｓｉＲＮＡをＦＡＯ細胞に導入した。ＰＧＣ−１βのノックダウンのために、７２時間、示されたｓｉＲＮＡを細胞に導入した；形質転換の２４時間後、作用薬であるＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）に細胞を暴露し、集菌の４８時間前に処理した。上述のように、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９５】
（動物実験）
雄のＰＰＡＲα−／−マウス、および同年齢のＷＴ型同腹子（ＳＶ／１２９バックグラウンド）に、ＰＰＡＴα作用薬ＧＷ−７６４７（２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ）または等量の溶解性賦形剤（ＤＭＳＯ）のいずれかを添加された標準ダイエット食を、７週間与えた。全ての動物には水を適宜に摂取させた。２週間ごとにマウスの体重を量り、その平均体重に従って薬物摂取を調節した。処理後、動物を解剖し、肝臓を単離し、そして、Versagene RNA Tissue Kit（Gentra Systems, Inc.）を用いて全ＲＮＡを抽出した。上述したように、一本鎖ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９６】
ＭＴＰ抑制剤（８ａＲ）実験では、雄のＬ−ＦＡＢＰ−／−マウスおよび同年齢のＷＴ型コントロール（Ｃ５７ＢＬ／６）に標準ダイエット食を与え、そのとき、８ａＲ化合物を体重に対して５０ｍｇ／ｋｇの量で経口により７日間毎日投与した。処理後、動物を解剖し、血漿および肝臓を単離し、そして、上述したように（Newberry et At., 2003）、市販のキットを用いて、各種の肝臓と血漿の脂質レベルを測定した。
【００９７】
（脂質抽出）
ＰＢＳ中で肝臓をホモジナイズし、タンパク質濃度を測定した。５ｍｌのクロロフォルムメタノール（２：１）および０．５ｍｌの０．１％硫酸によって３００μｌのホモジェネートを抽出した。器官活動相の部分標本を採集し、窒素下で乾燥し、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中に再懸濁した。上述したように（Newberry et At., 2003）、市販のキットを用いて、肝臓中のＦＦＡ、ＴＧ、およびコレステロール含量を測定した。タンパク質濃度の違いに対して、データを規格化した。
【００９８】
（アデノウイルス実験）
ＰＧＣ−１β（Ａｄ−ＰＧＣ−１β）またはＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）のいずれかを発現するアデノウイルスベクターは、Dana-Farver Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MAから贈られた。２時間、無血清培地でＡｄ−ＰＧＣ−１βまたはＡｄ−ＧＦＰのいずれかをＬ３５細胞に感染させ、その後、４８時間、完全培地で、作用薬ＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）で処理した。ＧＦＰ発現によって測定されるように、７５〜８５％程度の細胞が感染した。上述したように、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびリアルタイムＰＣＲ発現分析を行った。
【００９９】
（分泌ａｐｏＢの免疫沈降）
上述したように（Borchardt and Davis, 1987; Hui et al., 2002）、分泌ａｐｏＢを免疫沈降した。簡単に述べると、ＷＹ−１４，６４３（１０μＭ）および９−ｃｉｓＲＡ（１μＭ）の欠乏下で、または、それらの存在下で、Ｌ３５細胞を６０ｍｍシャーレ中で７２時間培養した。その後、細胞を、メチオニン−フリーＤＭＥＭに、２時間、切り替え、次に、ＤＭＥＭ中で、３ｍｌ〔３５Ｓ〕−メチオニン（１００μＣｉ／ｍｌ）によった２４時間標識した。培地を採取し、そして、４℃で一晩、ポリクローナル抗ａｐｏＢ抗体と培養した。次いで、タンパク質Ａ−セファローズを加え、さらに、４℃で２時間培養した。免疫沈降複合体を、ＴＥＴＮ緩衝液（ｐＨ７．５で２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。ペレットを、SDS-PAGEローディングバッファー中に再懸濁し、５分間沸騰させ、さらに、電気泳動によって４〜１２％トリス−グリシン ゲルで分離した。オートラジオグラフィーによって放射性タンパク質を検出した。
【０１００】
ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのプロモーター−レポーターの転写活性は、ｍＲＮＡ発現における細胞型特異的な違いを反映する。近位ＭＴＰプロモーター領域内に配置されたＤＲ１要素は、Ｌ３５細胞における発現の欠損とＦＡＯ細胞により示された高レベル発現との原因であることが、以前から明らかであった（Kang et al., 2003）ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるこのＤＲ１の占有は、Ｌ３５細胞により示された、抑制されたＭＴＰ遺伝子転写を引き起こすことが明らかであった（Kang et al., 2003）。Ｌ−ＦＡＢＰの生産物はＶＬＤＬ会合／分泌の調節に関与しており（Newverry et al., 2003）、このＬ−ＦＡＢＰが類似メカニズムによって調節されるかどうかを判断するために調査した。Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターの配列分析（図１Ａ）によれば、それがＭＴＰ遺伝子の転写調節を担うＤＲ１要素（Kang et al., 2003）と類似するＤＲ１を含むことが示された。さらに、Ｌ３５細胞およびＦＡＯ細胞によるＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡ発現は、ＭＴＰのｍＲＮＡ発現と並行であり（図１Ｂ）、これは、両者の遺伝子の転写が協調的に調節されているだろうことを示唆している。
【０１０１】
Ｌ−ＦＡＢＰの、またはＭＴＰの近位プロモーター領域のいずれかを含むルシフェラーゼレポーター構築体は、類似の細胞型特異的な違いを表した；プロモーター活性は、Ｌ３５細胞中のレベルと比較して、ＦＡＯ細胞中で約８倍高い（図１Ｃ）。Ｌ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰのプロモーター構築対における、ＤＲ１サイトの突然変異欠損は、ＦＡＯ細胞中のプロモーター活性レベルを、Ｌ３５細胞に見られるものに類似するレベルまで減少させた（図１Ｂ）。したがって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰ遺伝子のプロモーター領域内に存在する近位ＤＲ１要素は、Ｌ３５細胞系およびＦＡＯ細胞系に示される両者の遺伝子の内在性ｍＲＮＡレベルと関連する相対プロモーター活性を与えるのに十分である。
【０１０２】
近位ＤＲ１サイトへのＣＯＵＰ−ＴＦIIの結合は、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子の転写抑制を媒介する。Ｌ３５およびＦＡＯの肝臓細胞系から得られた核抽出物は、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーターのＤＲ１要素を含むオリゴヌクレオチドプローブと、明確なＤＮＡ−タンパク質複合体を形成した（図２Ａ）。Ｌ３５細胞からの核抽出物を用いて形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦIIに対して特異的な抗体とのスーパーシフトを示した（図２Ａ）。対照的に、ＦＡＯからの核抽出物を用いて形成されたＤＮＡ−タンパク質複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII抗体とのスーパーシフトを表さなかった（図２Ａ）。ＤＲ１サイトの変異が、細胞型特異的ＤＮＡタンパク質複合体の形成を阻害したため、その形成には、正常なＤＲ１サイトを必要した。
【０１０３】
ＣＯＵＰ−ＴＦII発現プラスミドを導入されたＦＡＯ細胞におけるＣＯＵＰ−ＴＦIIの異所性発現は、Ｌ−ＦＡＢＰプロモーター活性における用量依存的抑制をもたらした（図２Ｂ）。ＣＯＵＰ−ＴＦII発現の増加は、ＤＲ１配列の突然変異欠損をかかえるＬ−ＦＡＢＰプロモーター構築体の活性を変化させないため（図２Ｂ）、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるＬ−ＦＡＢＰプロモーターの抑制は、機能性ＤＲ１要素に依存する。ＣＯＵＰ−ＴＦIIを発現するプラスミドを導入されたＦＡＯ細胞によって示される、転写の最大限の減少は、Ｌ３５細胞によって示される低レベルを、部分的（５０〜７０％）にのみ再現した。これは、発現における細胞型特異的な違いに対して、追加的な因子が寄与している可能性を示唆する。これらの発見は、ＭＴＰ ＤＲ１要素を用いて得られたもの（Kang et al., 2003）に類似する発見であり、Ｌ３５細胞中で、ＣＯＵＰ−ＴＦIIによるＤＲ１要素の占有が、両者の遺伝子の転写不活性化に関与するという結論を支持している（図２Ａ）。
【０１０４】
ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ遺伝子の両者のＤＲ１プロモーター要素と結合するために、ＣＯＵＰ−ＴＦIIと競争する。ＭＴＰ−ＤＲ１サイトと共に形成された複合体についてのＥＭＳＡ−スーパーシフト解析によれば、ＲＸＲαを含んでいるＦＡＯ細胞特異的複合体が明らかになった（Kang et al., 2003）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーは、近位プロモーター領域におけるＤＲ１サイトを介して、Ｌ−ＦＡＢＰの転写を活性化することが示されているため（Poirie et al., 1997）、ＭＴＰ遺伝子が同じように調節されたかどうかを評価した。ＦＡＯ細胞からの核酸を用いたＥＭＳＡスーパーシフト解析によれば、Ｌ−ＦＡＢＰ−またはＭＴＰ−ＤＲ１サイトのいずれかを含むＤＮＡプローブが、類似ＦＡＯ特異的複合体を形成したこと（図３Ａ；レーン１）が明らかにされた。なお、上記複合体は、ＣＯＵＰ−ＴＦII特異的抗血清とスーパーシフトしなかったが（図３Ａ；レーン２）、ＲＸＲα（図３；レーン３）またはＰＰＡＲα（図３；レーン４）のいずれかを認識する抗血清とスーパーシフトした。対照的に、Ｌ３５細胞から得られた核抽出物とのＰＰＡＲα−ＲＸＲαスーパーシフトは、検出されなった（Kang et al., 2003）。これらの発見は、ＦＡＯ細胞中では、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターのＤＲ１サイトがＰＰＡＲα−ＲＸＲαヘテロダイマーによって占有される一方、Ｌ３５細胞中では、これら同様のサイトはＣＯＵＰ−ＴＦII複合体によって占有されるということを示す。
【０１０５】
ＣＯＵＰ−ＴＦII特異的抗血清を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）解析によれば、Ｌ３５細胞の含有クロマチンは、ＦＡＯ細胞のクロマチン細胞と比較して、４倍の濃縮度のＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を示すことが明らかにされた（図３Ｂ）。対照的に、ＰＰＡＲα特異的抗血清を用いて、ＦＡＯ細胞から得られたクロマチンは、Ｌ３５細胞からのクロマチンと比較して、１〜４倍の濃縮度の近位Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を示した（図３Ｂ）。両方の細胞系から免疫沈降された末端非翻訳領域のレベルは類似しているため（図３Ｂ）、約４倍の濃縮度の近位Ｌ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１およびＭＴＰ−ＤＲ１領域を含むＤＮＡ配列は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターに対する、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα（ＦＡＯ細胞）またはＣＯＵＰ−ＴＦII（Ｌ３５細胞）の結合に関する細胞型特異的な違いを反映する。したがって、ＣｈＩＰ解析から得られたデータ（図３Ｂ）は、ＥＭＳＡスーパーシフト解析から得られたデータ（図２Ａおよび図３Ａ）と調和している。
【０１０６】
Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬処理は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現の転写誘導と、ａｐｏＢを分泌する能力の回復とをもたらす。ＰＰＡＲαおよび／またはＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理は、ＭＴＰ（約５５〜６５倍）およびＬ−ＦＡＢＰ（約６０〜７５倍）の両方のｍＲＮＡの発現を顕著に増加させた（図４Ａ）。両方の作用薬による処理は、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのｍＲＮＡ発現を相乗的に３００倍近くまで増加させた（図４Ａ）。ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰのプロモータールシフェラーゼレポーター構築体は、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬に対して、同様の反応を示した（図４Ｂ）。したがって、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬（各単独で、および組み合わせで）によるＬ３５細胞の処理は、ＭＴＰ−ＤＲ１およびＬ−ＦＡＢＰ−ＤＲ１の両方のプロモーターレポーター構築体の転写活性を、１０倍に至るまで増幅する（図４Ｂ）。各プロモーターの活性における無有意変化は、ＤＲ１サイトをかかえるレポーター構築体を用いて検出された（図４Ｂ）。これらの発見は、ＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬の効果がＤＲ１要素を介して媒介されるということを示している。
【０１０７】
賦形剤ＤＭＳＯによる単独処理は、ＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰの両方のｍＲＮＡの発現における比較的少量であるが有意な増加と、それらのプロモーター−レポーターの活性とを引き起こした（各図４Ａおよび図４Ｂ）。賦形剤としてＤＭＳＯを用いつつ、細胞にＰＰＡＲαおよびＲＸＲα作用薬を加えると、ＤＭＳＯ賦形剤を単独で加えたときよりも、より多くのＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの誘導が示された（図４Ａおよび図４Ｂ）。ＤＭＳＯによるＰＰＡＲα活性化遺伝子の誘導は（Pauley et al., 2002）に説明されている。
【０１０８】
Ｌ３５細胞は、ＭＴＰ遺伝子の転写不活性化によって、ａｐｏＢ含有リポタンパク質を会合および分泌するための能力が欠けている（Hui et al., 2002; Kang et al., 2003）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理は、デノボ合成された３５Ｓ−標識ａｐｏＢの分泌を顕著に増幅した（図４Ｃ）。したがって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの発現を回復し、それによって、Ｌ３５細胞におけるａｐｏＢ含有リポタンパク質の会合および分泌の活性化が引き起こされる。
【０１０９】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの作用薬誘導は、ＤＲ１関連因子の相対的な細胞内含有量の変化によって引き起こされ、両方の遺伝子の近位要素の複合体占有を変化させる。さらなる解析によれば、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理が、その核内受容体のレベルを、ＦＡＯ細胞によって示されるレベルと類似するように変更したということが明らかとなった（図５Ａ）。したがって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によるＬ３５細胞の処理を受けて、ＰＰＡＲα（５倍）およびＲＸＲα（２．３倍）の両方のｍＲＮＡの発現は増加し、一方、ＣＯＵＰ−ＲＦIIのレベルは減少（−６０％）した（図５Ａ）。ＤＭＳＯ単独によって処理されたＬ３５細胞もまた、ＣＯＵＰ−ＲＦIIレベルにおける大幅な減少を示したが、ＰＰＡＲαまたはＲＸＲαにいずれかのレベルでは変化がなかった（図５Ａ）。ＣＯＵＰ−ＲＦIIにおけるＤＭＳＯの媒介による減少は、なぜＤＭＳＯが、単独で、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの転写および発現についての増加と関係していたのか（図４）について、説明するだろう。
【０１１０】
転写因子の発現において作用薬が媒介する変化が、内在性プロモーター中のＤＲ１サイトの複合体占有における変化と一致するかどうかを判断するために、作用薬により処理したＬ３５細胞のＣｈＩＰ解析を、未処理のＬ３５およびＦＡＯ細胞のものと比較した。Ｌ３５細胞のＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬処理は、ＣＯＵＰ−ＲＦII特異的抗血清と免疫沈降した、Ｌ−ＦＡＢＰ−およびＭＴＰ−ＤＲ１領域含有クロマチンの量を（約３倍に）減少させ（図５Ｂ）、同時に、ＰＰＡＲα特異的抗血清によるその結合量を（約３倍に）増加させた（図５Ｂ）。よって、ＣｈＩｐ解析による結果は、核内受容体の発現レベルにおける変化（図５Ａ）と一致した。データの組み合わせによれば、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαリガンド活性化は、リプレッサーＣＯＵＰ−ＲＦIIと比較して、活性化複合体ＰＰＡＲα−ＲＸＲαの細胞内含有量を増加させることによって、Ｌ３５細胞型の表現型を、ＦＡＯ細胞型の表現型に変換することが示される。これらの変化は、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子のＤＲ１要素と結びつく複合体において並行的な変化をもたらし、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα複合体の活性化によるＤＲ１の占有を助ける。
【０１１１】
肝臓細胞および生体内において、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの高レベル発現のためには、ＰＰＡＲαが必要である。そのようなものとして、本発明は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調した発現のために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα活性化複合体が必須であることを予測する。この仮説を検証するために、ＦＡＯ細胞中のＰＰＡＲαの発現レベルをノックダウンするＲＮＡ干渉を利用した。ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡを導入したＦＡＯ細胞では、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、ＰＰＡＲαのｍＲＮＡにおける７５％の減少が実証された（図６Ａ）。ＰＰＡＲαのｍＲＮＡにおけるこの減少は、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡの細胞内含有量がコントロールの５０％近くまで減少したことと関係があった（図６Ａ）。ＰＰＡＲα特異的ＲＮＡｉは、ＰＰＡＲα非依存性ａｐｏＢのｍＴＮＡレベルと変化させておらず、これは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰにおける減少がＰＰＡＲαの低減に特異的であったこと（図６Ａ）を示唆している。これらの発見によれば、ＦＡＯ細胞に見られる比較的高度な発現レベルのＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのためには、ＰＰＡＲαが必要であることが示される。
【０１１２】
また、ＰＰＡＲα作用薬が、生体内におけるＬ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの肝臓での発現を協調的に誘発するかどうかについて、そうだとしたら、上記作用薬が媒介する増加はＰＰＡＲα依存性であるかどうかについて検討した。コントロールＣ５７／ＢＬ６マウス、およびＰＰＡＲα-/-マウスを、ＰＰＡＲα作用薬ＧＷ−７６４７（Fu et al., 2005）で処理した。コントロールマウスは、ＰＰＡＲα作用薬による処理の後、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡのレベル増加を示したが（図６Ｂ）、機能性ＰＰＡＲα欠損マウスは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのいずれの発現レベルにおいても顕著な変化を示さなかった（図６Ｂ）。これらの生体内データは、ＦＡＯ／Ｌ３５肝臓細胞を用いて得られた発見を裏付ける。本明細書で提供される発見は、共に、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子の両方の転写調節において、ＰＰＡＲαが重要な役割を果たすことを実証している。
【０１１３】
Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子を協調的に誘導するために、ＰＰＡＲαと協調してＰＧＣ−１βが作用する。転写コアクチベータであるＰＧＣ−１αおよびＰＧＣ−１β（kressler et al., 2002）には、明確な遺伝子標的が示される（Lin et al., 2003; Lin et al., 2005）。ＰＧＣ−１α活性化遺伝子は、グルコース新生およびミトコンドリア生物発生／脂肪酸酸化に関与し（Lin et al., 2003）、また、ＰＧＣ−１β活性化遺伝子は、ミトコンドリア生物発生／脂肪酸酸化、および肝臓脂質輸送（例えばＭＴＰ）に関与する（Lin et al., 2005）。Ｌ３５細胞は、高いレベルのＰＧＣ−１αと、ほぼ検出できないレベルのＰＧＣ−１βとを発現するのに対して、ＦＡＯ細胞は、高いレベルのＰＧＣ−１βと、ほぼ検出できないレベルのＰＧＣ−１αとを発現する（図７Ａ）という観察結果は、ＰＧＣ−１βがＭＴＰ遺伝子発現を活性化させるという提言（Lin et al., 2005）と一致する。この提言は、ＰＰＡＲα作用薬で処理されたＬ３５細胞およびマウスの両方が、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡについての１〜３倍に誘発を引き起こしたという発見（図７Ｂ）によって、さらに裏付けされる。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの誘発におけるＰＧＣ−１βの役割を調べるために、ＦＡＯ細胞をＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬で処理し、かつ、ＰＧＣ−１βをノックダウンするｓｉＲＮＡの効果を測定した。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によって、ＰＧＣ−１βに対して特異的なｓｉＲＮＡを与えられたＦＡＯ細胞を処理すると、ＰＧＣ−１βのｍＲＮＡレベルは、Ｌ−ＦＡＢＰ（−３８％）とＭＴＰ（−４８％）との両方のｍＲＮＡレベルの協調的な減少と関係して、６５％減少した。その一方、ＰＧＣ−１αのｍＲＮＡレベルは変化せずに保たれた（図７Ｃ）。ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬によって、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを与えられたＦＡＯ細胞を処理すると、いずれのｍＲＮＡレベルにおいても変化が示されなかった（図７Ｃ）。よって、ｓｉＲＮＡは標的特異性を実証しており、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡ発現における協調的な低下は、ＰＧＣ−１β濃度の低下に起因していた。
【０１１４】
未処理のＬ３５細胞、および、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬により処理されたＬ３５細胞において、ＰＧＣ−１βを発現するアデノウイルス（Lin et al., 2002a; Lin et al., 2005）の導入を介して、ＰＧＣ−１βの発現を増強することによって、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの遺伝子転写におけるＰＧＣ−１βの役割をさらに検討した。ＰＧＣ−１βアデノウイルスは、未処理のＬ３５細胞におけるＬ−ＦＡＢＰまたはＭＴＰのｍＲＮＡレベルに作用しなかった（図８）。対照的に、ＰＧＣ−１βアデノウイルスによってＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬に刺激されたＬ３５を処理すると、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のｍＲＮＡは、作用薬により処理したコントロール（ＧＦＰ導入したコントロールおよび導入していないコントロール）のレベルと比較して、顕著に増加された（〜３倍）（図８）。ＧＦＰを発現するアデノウイルスによって、ＰＰＡＲα−ＲＸＲα作用薬に刺激されたＬ３５を処理することは、Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰのｍＲＮＡの発現に対して作用しなかった（図８）。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な転写を増幅するために、ＰＰＡＲα−ＲＸＲαとＰＧＣ−１βとの両方が必要であるという提言に対して、これらのデータは追加的な根拠を提供する。
【０１１５】
Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な不活性化は、生体内で、肝臓脂肪症を防止する。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの両方のプロモーターにおける機能的ＤＲ１サイトの保有は、発現および機能（例えばＶＬＤＬ会合／分泌）における協調的な変動を可能にするだろう。ＭＴＰの化学的な抑制、すなわち、高脂血症を治療的に改善するために発達した戦略（Chandler et al., 2003; Ksander et al., 2001; Shiomi and Ito, 2001; Wetterau et al., 1998）は、肝臓脂肪症の発現と関係するせいで、あまり役に立たない（Bjorkegren et al., 2002; Liao et al., 2003）。Ｌ−ＦＡＢＰおよびＭＴＰの協調的な抑制が、肝臓脂肪症を引き起こすことなしに、肝臓でのＶＬＤＬ会合／分泌を阻害するか否かを調べるために、コントロールマウスおよびＬ−ＦＡＢＰ欠損マウス（Ｌ−ＦＡＢＰ-/-）を、ＭＴＰ抑制剤（８ａＲ）（Liao et al., 2003）で処理した。８ａＲ処理の７日後、トリグリセリドおよびコレステロールの血漿中濃度は、両グループのマウスにおいて同様のレベルまで顕著に減少された（図９Ａ）。ＭＴＰ抑制剤によってコントロールＣ５７ＢＬ／６マウスを処理したところ、肝臓中のトリグリセリド濃度が４倍に増加したが、肝臓中のトリグリセリド蓄積は、Ｌ−ＦＡＢＰの除去によって完全に防止された（図９Ｂ）。これらのデータによれば、Ｌ−ＦＡＢＰ遺伝子およびＭＴＰ遺伝子の協調的な転写調節は、肝臓脂肪症を除外して、ＶＬＤＬ会合／分泌の変動を可能にすることが示された。
【実施例２】
【０１１６】
（Ｌ−ＦＡＢＰの化学的抑制による肝臓脂肪症の発現の防止）
本実施例は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与が血漿中トリグリセリド濃度を減少させることを説明する。
【０１１７】
３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）（lot # fr. 09061988）は、Ｌ−ＦＡＢＰを抑制することが明らかにされている。したがって、ＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）とSandoz compound 58-035との同時投与が、野生型マウスにおいて、肝臓脂肪症の発現を防止するか否かを調べた。処理の前、マウスを出血させ、トリグリセリド（図１０）およびコレステロール（図１１）の血清中濃度を測定した。その後、０．１５０ｍｌのコーンオイル（賦形剤のみ）、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035（１００ｍｇ／ｋｇ）を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）を含むコーンオイルを用いて、マウスを強制飼養した。７日間の処理後、マウスを出血させて解剖した。Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤と共に投与したとき、および投与しなかったときにおいて、ＭＴＰ抑制剤は、血清中トリグリセリド濃度（図１０）および血清中コレステロール濃度（図１１）の両方を減少させた。予想通りに、ＭＴＰ抑制剤のみで処理したマウスは、肝臓脂肪症を示した（肝臓トリグリセリド濃度は、５倍にまで増加した；図１２）。際立って対照的に、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との両方で処理したマウスからの肝臓は、肝臓トリグリセリド濃度の増加を示さなかった（図１２）。ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与は、肝臓脂肪症の発現を防止すると示すこれらのデータは、標的遺伝子の不活性化に起因してマウスのＬ−ＦＡＢＰ発現が欠損するという、発明者らの以前の発見を拡張する。
さらに、これらの発見は、Ｌ−ＦＡＢＰを抑制する能力のある薬剤（例えばSandoz compound 58-035）の同時投与は、肝臓脂肪症を引き起こすことなく（図１２）、ＭＴＰ抑制剤が血漿中のリポタンパク質を減少させることができるようにする（図１０および図１１）。
【０１１８】
Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）には、水を飲むことを自由にさせ、餌として、コーンオイル（０．１５ｍｌ）のみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（５０ｍｇ／ｋｇ）（Novartis, Summit, NJ）（Ksander, et al., 2001, Diaminoindanes as microsomal triglyceride transfer protein inhibitors. J Med Chem 44:4677-4687）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035（１００ｍｇ／ｋｇ）を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、７日間、毎日強制摂取させた。試験を始める前および試験を始めてから７日後に、マウスを出血させた。１２時間の光サイクルを有している（午前６：００から午後６：００まで照明を照らした）空間にマウスを収容した。午前１０：００にマウスを眼窩後から出血させ、その後、解剖した。
【０１１９】
肝臓中のトリグリセリド濃度、ならびに血漿中のコレステロール濃度およびトリグリセリド濃度を（Liao, et al., 2003, Blocking microsomal triglyceride transfer protein interferes with apoB secretion without causing retention or stress in the ER. J Lipid Res 44:978-985）に記載のように測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。＊処理前のマウスと処理後のマウスとの顕著な違い、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定（Student's t test）を示す（図１０）。
【０１２０】
図１１は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与がマウスにおいて血漿中のコレステロール濃度を減少させることを示している。上述にように、Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）に対し、コーンオイルのみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、毎日、強制摂取させた。試験を始める前および試験を始めてから７日後に、マウスを出血させた。血漿中のコレステロール濃度を上述のように測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。
【０１２１】
図１２は、ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤との同時投与が、マウスにおける肝臓脂肪症の発現を防止することを示している。上述のように、Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（８〜１０週齢）（ｎ＝各グループ中５）に対し、コーンオイルのみ、またはＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイル、もしくはＬ−ＦＡＢＰ抑制剤Sandoz compound 58-035を加えたＭＴＰ抑制剤８ａＲ（Novartis, Summit, NJ）を含むコーンオイルを用いて、毎日、強制摂取させた。７日後にマウスを解剖した。肝臓トリグリセリド濃度を測定した。値は、各グループの５匹のマウスについての平均値±標準偏差を表している。
【０１２２】
本発明は、上述の実施例を参照して説明されているが、本発明の精神および範囲内で、いろいろと変更したものを含むことは理解されるだろう。したがって、本発明は、以下の特許請求事項の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤とを含む医薬組成物。
【請求項２】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
肝臓脂肪症の発現を防止する方法であって、上記防止を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程、それによって高脂血症を治療する工程を含んでいる方法。
【請求項７】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲであり、かつ、上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
高脂血症を治療する方法であって、上記治療を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程、それによって高脂血症を治療する工程を含んでいる方法。
【請求項１３】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
被験者のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を改善する方法であって、上記改善を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程を含んでおり、それによって上記被験者におけるＨＣＶを改善する方法。
【請求項１８】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲであり、かつ、上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
高脂血症を治療するために有用な薬剤を同定する方法であって、治療を必要とする被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少を検出する工程を含んでおり、当該工程において、接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少の検出が、高脂血症を治療するために有益な薬剤を同定する方法。
【請求項２４】
ハイスループット法で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
接触に続くＭＴＰ発現の減少を検出する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いる治療に適する癌細胞を同定する方法であって、対応正常細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性と比較して上昇した、癌細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性を検出する工程、それによって、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いた治療に適する癌細胞を同定する工程を含んでいる方法。
【請求項２７】
上記癌細胞は肝臓癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
ＭＴＰ抑制剤とＬ−ＦＡＢＰ抑制剤とを含む医薬組成物。
【請求項２】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
肝臓脂肪症の発現を防止する方法であって、上記防止を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程、それによって高脂血症を治療する工程を含んでいる方法。
【請求項７】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲであり、かつ、上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
高脂血症を治療する方法であって、上記治療を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程、それによって高脂血症を治療する工程を含んでいる方法。
【請求項１３】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
被験者のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を改善する方法であって、上記改善を必要とする被験者に、治療効果のある量のミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）抑制剤を、治療効果のある量の肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｌ−ＦＡＢＰ）抑制剤と組み合わせて投与する工程を含んでおり、それによって上記被験者におけるＨＣＶを改善する方法。
【請求項１８】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲであり、かつ、上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
高脂血症を治療するために有用な薬剤を同定する方法であって、治療を必要とする被験者からの細胞試料を少なくとも１つの検査薬と接触させる工程、および接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少を検出する工程を含んでおり、当該工程において、接触に続くＬ−ＦＡＢＰ発現の減少の検出が、高脂血症を治療するために有益な薬剤を同定する方法。
【請求項２４】
ハイスループット法で行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
接触に続くＭＴＰ発現の減少を検出する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いる治療に適する癌細胞を同定する方法であって、対応正常細胞におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性と比較して上昇した、癌細胞試料におけるＭＴＰおよびＬ−ＦＡＢＰ活性を検出する工程、それによって、Ｌ−ＦＡＢＰ活性抑制剤と組み合わせてＭＴＰ抑制剤を用いた治療に適する癌細胞を同定する工程を含んでいる方法。
【請求項２７】
上記癌細胞は肝臓癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記ＭＴＰ抑制剤は、ＭＴＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、Ｌ−ＦＡＢＰをコードまたは調節するポリヌクレオチドとハイブリダイズするｄｓＲＮＡ、または当該ｄｓＲＮＡの機能性断片である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
上記ＭＴＰ抑制剤は、８ａＲである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
上記Ｌ−ＦＡＢＰ抑制剤は、３−（デシルジメチルシリル）−Ｎ−［２−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニルエチル〕プロパンアミド（Sandoz compound 58-035）である、請求項２６に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００９−５４１２１３（Ｐ２００９−５４１２１３Ａ）
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３３２３（Ｐ２００９−５１３３２３）
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４３１６４
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３５４７９５）サン ディエゴ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮ ＤＩＥＧＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｅｎｔｅｒ，５２５０ Ｃａｍｐａｎｉｌｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１８２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３０５７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４３１６４
【国際公開日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【出願人】（５０８３５４７９５）サン ディエゴ ステート ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮ ＤＩＥＧＯ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｅｎｔｅｒ，５２５０ Ｃａｍｐａｎｉｌｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１８２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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