黒米からのＣ３Ｇを含む組成物およびその製造方法
【課題】黒米からアントシアニンおよびその他の栄養成分を多く含む組成物の製造方法を提供する。
【解決手段】搗精黒米と糠とに分離し、搗精黒米より得た麹糖化液を用いて糠よりシアニジン−３−グルコシドを抽出する工程を含む、黒米からアントシアニンおよびその他の栄養成分を多く含む組成物の製造方法。
【解決手段】搗精黒米と糠とに分離し、搗精黒米より得た麹糖化液を用いて糠よりシアニジン−３−グルコシドを抽出する工程を含む、黒米からアントシアニンおよびその他の栄養成分を多く含む組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒米からシアニジン−３−グルコシドおよびその他の栄養成分を多く含む組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
黒米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）は、赤紫色の色素層を有し、黒色の外観を呈する米をいい、例えば古代米、紫黒米、紫米とも呼ばれる。黒米は、古くからタイ北部、ミャンマー北部、中国等で栽培されてきた。日本では、主に九州や東北地方において栽培されている。黒米玄米の表面は黒くて、中は白く、玄米種皮の部分（表層約１０％いわゆる糠の部分）に赤紫色系色素であるアントシアニンを含んでいる。また、糠の部分にはタンパク質やミネラルも含まれていることが分かっている。
【０００３】
アントシアニンは、「花の青色成分」ともいわれ、植物の花、果実、茎、葉、根などに含まれ、青色のみならず橙黄色から赤色、紫色まで幅広い色調をもつ色素配糖体であり、広義にはフラボノイドに属する。前記アントシアニンはアグリコンをアントシアニジンといい、天然では１８種類見出されており、主に見られるものはシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジンの６種類である。結合糖の種類はＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、ルチノースなどがある。さらに、糖部にはｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸などの有機酸がエステル結合したものがあり、現在では４００種類以上のアントシアニンが報告されている。
【０００４】
黒米はアントシアニンの中でも、シアニジンの配糖体であるシアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（以下、Ｃ３Ｇ）が多く含まれており、その他の赤色系の色を有する植物などよりもＣ３Ｇが含まれる割合が多いことが知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
アントシアニンは赤、青、紫色の植物にはたいてい含まれており、その色の良さから赤紫蘇のように食品の着色料や、紅花や藍のように衣服の染料として使用されてきた。一方、アントシアニンには、視覚機能改善効果や抗酸化、血流改善、肥満抑制、血清脂質の改善、糖尿病予防、肝障害の軽減、抗炎症などの効果が知られており、Ｃ３Ｇでも同様な機能が報告されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００６】
上記のような利点から、黒米を直接使用して、色が良い食品や機能性のある食品などが作られてきた（特許文献２や特許文献３）。しかし、原料から色素や機能性の成分を維持して製造することが重要にもかかわらず、原料中の成分が最終製品まで残る割合はあまり考慮されていなかった。
【０００７】
黒米において色素やＣ３Ｇを多く含む糠から抽出する発明もなされている。例えば、特許文献４が知られており、抽出した色素を食品へ添加するものである。黒米の糠から色素やＣ３Ｇを抽出しているため、色素やＣ３Ｇを使用するためには一見効率良い方法のように見えるが、逆に糠以外の部分を有効に利用できず、原料の全体として有効利用できるものではなかった。
【０００８】
原料から色素を維持して製造するため、抽出しようとする液から色素が吸着されやすい固形分を濾過しておくという技術がある（特許文献５）。しかしながら上記の特許文献４と同様にこの技術は糠以外の部分を有効に利用するものではなく原料の全体として有効利用できるものではなかった。
【０００９】
糠の色素を抽出した色素水溶液を、その他の部分と蒸煮したもち米や麦芽と合わせて糖化した搾汁液に添加し、糖化液を着色するという発明がなされ、原料の全体として有効利用が考慮されているものもある（特許文献６）。しかしながら、この技術は色素にのみ着目しているため、Ｃ３Ｇや糠のその他の成分を考慮しているものではなかった。すなわち、色素成分のＣ３Ｇが徐々に分解してしまう５５℃、ｐＨ３．５、１０時間という抽出条件であるということである。また仮にＣ３Ｇが抽出で残ったとしても、０．２％クエン酸抽出液２００ｍｌと具体的に量は判断できないが白米と麦芽で１．１５ｋｇであることから数Ｌと考えられる糖化液とを混合した時点でｐＨは酸性から中性に近づき、酸性で安定であるＣ３Ｇの分解は免れないということである。
【００１０】
黒米を粉砕し、焼酎用麹菌を接種して培養後、糖化して飲用クエン酸酢とし、原料の全体として有効利用が考慮されているものもある（特許文献７）。しかしながら、この技術はアントシアニンを５１５nmの吸光をもつ色素として捉えているため、Ｃ３Ｇそのものの残存量が考慮されていない。すなわち、水で吸水させてＣ３Ｇが不安定な高温、中性条件下で１時間も蒸きょうしているため、Ｃ３Ｇを大幅に損失していると考えられる。さらに糖化工程ではＣ３Ｇと糖化残渣が共存するため、Ｃ３Ｇの回収率は低くなっていると考えられる。黒米にはＣ３Ｇ以外の色素も存在するため、従来の吸光度のみに着目した検討では、機能性成分であるＣ３Ｇの損失を見落としてしまう。
【００１１】
このように、今まで、原料全体を考慮しつつ、黒米の糠に含まれる他の栄養成分と共にＣ３Ｇを高効率回収し有効に利用する黒米食品、飲料組成物を製造する技術がなかった。この技術を達成するにはＣ３Ｇを分解しないように最適化した抽出の条件や糖化液をつくる麹の調製条件を決定することが重要であった。また、糠のその他の栄養成分アミノ酸やミネラル分として利用するにあたって糖化液に麹の酵素が含まれていることが適当であった。したがって、本発明は、黒米糠から機能性を持つ色素を有機溶媒によって抽出する従来技術とは異なり、黒米全体を原料として色素の損失を抑えながら機能性食品・飲料素材を開発するという新しい技術であり、容易に想到できるものではなかった。
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−２３９６１２号公報
【特許文献２】特開平２−１５０２６８号公報
【特許文献３】特開２０００−０６９９３６号公報
【特許文献４】特表２００５−５２７５３９号公報
【特許文献５】特開平４−５８８７８号公報
【特許文献６】特開平７−２５０６４７号公報
【特許文献７】特開２００６−２６２７９９号公報
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4696-4704
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 7846-7856
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 4457-4462
【非特許文献４】J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 3560-3563
【非特許文献５】Experimental Eye Res. 2005,80,313-322
【非特許文献６】J. Agric. Food Chem. 1994, 42, 2407-2410
【非特許文献７】J. Nutr. 132: 20-26, 2002.
【非特許文献８】J. Nutr. 136: 2220-2225, 2006
【非特許文献９】Arch Biochem Biophys. 1999 368(2):361-6.
【非特許文献１０】J. Nutr. 133: 2125-2130, 2003
【非特許文献１１】Biochem. Pharmacol. 2007, 74,1619-1627
【非特許文献１２】J. Nat. Prod. 1999, 62, 294-296
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、黒米の機能性成分であるＣ３Ｇを温存しながら、黒米全体を原料として利用し、有機溶媒を用いることなくそのまま食品・飲料素材を提供する技術を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｃ３Ｇ存在下で蒸きょうのような加熱する工程および水溶液中で糖化残渣等の固形物とＣ３Ｇを共存させる工程が従来技術の最大の問題点であることを見出した。さらに、従来技術では黒米などから色素を高効率で回収するには有機溶媒を用いることが常識であったが、黒米を精米して搗精黒米と黒米糠に分離し、搗精黒米を原料として製麹および糖化させ、固液分離した麹糖化液を用いて黒米糠からＣ３Ｇ抽出すれば、Ｃ３Ｇのみならず、黒米糠の糖やアミノ酸、ミネラル等までも多く含む組成物を製造できることを思いがけず発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下［１］〜［１７］の特徴を包含する。
［１］ 搗精黒米から麹を作製して糖化し、その糖化液に黒米の糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンに富む黒米糖化液を得ることを含む、黒米由来のアントシアニンを含む組成物を製造する方法。
［２］ 以下の工程を包含する、［１］の方法：
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程；
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程；
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程；
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程；および
（５）得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程。
［３］ アントシアニンが、シアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（Ｃ３Ｇ）である、［１］または［２］の方法。
［４］ 工程（１）において、黒米を８０〜９５％の精米歩合で精米する、［２］または［３］の方法。
［５］ 工程（２）において、麹菌が、焼酎用麹菌である、［２］〜［４］のいずれかの方法。
【００１６】
［６］ 麹菌が、クエン酸高生産性、かつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）低活性性である、［５］の方法。
［７］ 工程（２）において、麹菌を接種して、２８〜４０℃にて４０〜７２時間培養を行う、［２］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ 工程（３）において製造される糖化液が、１０〜３０％（Ｗ／Ｖ）のグルコースおよび、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）のクエン酸を含有する、［２］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ 工程（３）において、糖化液を濾過して不水溶性の物質を除去する、［２］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ 不水溶性の物質が、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、またはそれらの混合物を含む、［９］の方法。
［１１］ 工程（４）において、ｐＨ２．０〜５．０、２５〜６０℃にて、１〜１０時間、抽出処理する、［２］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］ 工程（５）にて得られる黒米糖化液がまた、糠由来の糖、アミノ酸、ミネラルを含有する、［２］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ さらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程、を含む、［２］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］ ［１］〜［１３］のいずれかの方法により製造された、アントシアニンに富む黒米糖化液を含む組成物。
【００１７】
［１５］ 組成物が飲食品である、［１４］の組成物。
［１６］ 飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品である、［１５］の組成物。
［１７］ 栄養補助成分をさらに含む、［１４］〜［１６］のいずれかの組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、有機溶剤を使用することなく、黒米全体を利用しつつＣ３Ｇおよびその他の栄養成分を多く含む組成物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る組成物及び製造方法について説明する。
【００２０】
本発明は、以下（１）〜（５）の工程を包含する、黒米からアントシアニンを含む組成物を製造する方法に関する。本発明においては、上記課題を解決するために、Ｃ３Ｇ存在下で蒸きょうのような加熱する工程、および水溶液中で糖化残渣等の固形物とＣ３Ｇを共存させる工程を回避して、黒米より高収率でＣ３Ｇを回収することが可能である。
【００２１】
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程
原料
本発明に使用する原料は、黒米である。さらに好ましく朝紫品種である。黒米はその他の食品素材と比較してアントシアニン含量が高いだけではなく、アントシアニン中のＣ３Ｇの割合が大きいためである。また、黒米の中でも朝紫品種、朝紫品種の中でも東北地方のものの方がＣ３Ｇ含量は高い傾向がある。
【００２２】
精米
本発明の組成物の素材となる黒米は精米により搗精黒米と黒米糠に分離して使用することができる。例えば精米歩合は８０〜９５％、好ましくは８０〜９０％、さらに好ましくは８５〜９０％である。Ｃ３Ｇが黒米の表層約１０％に集中して分布するからである。
【００２３】
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程
蒸きょう
本工程において、搗精黒米を蒸きょうする。以下の実施例にて詳細に記載するように、Ｃ３Ｇ回収率を上げるためには、蒸きょう工程にＣ３Ｇが含まれないことが好ましい。蒸きょうは当業者が行う通常行う方法で実施することが可能であり、９０〜１２０℃、好ましくは１００℃にて、０．５〜２時間、好ましくは５０分間行う。
【００２４】
麹菌
製麹に用いられる麹菌は、クエン酸を生産する焼酎用麹菌であればよく、白麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ、黒麹菌Ａ． ａｗａｍｏｒｉ、黒麹菌Ａ．ｓａｉｔｏｉであれば良く、好ましくはＡ．ｋａｗａｃｈｉである。このＡ． ｋａｗａｃｈｉは（株）樋口松之助商店（ヒグチモヤシ）の白麹菌（本格焼酎菌米用）使用することができる。ヒグチモヤシの白麹（米用）は、他の焼酎用麹菌を用いた麹と比べ、クエン酸生産がよく、Ｃ３Ｇ分解活性をもつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）活性が低く、糖化液へのＣ３Ｇ回収量が高いためである（実施例に示す）。
【００２５】
接種する麹菌の量は、製麹に通常用いられる量であり、蒸きょうした搗精黒米に対して、例えば、０．０１〜０．２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは０．１％（Ｗ／Ｗ）である。
【００２６】
培養
本工程において、培養は当業者が行う通常の温度や時間で行うことができる。例えば搗精黒米の吸水条件は通常の白米と同様、培養温度は２８〜４０℃、好ましくは初発温度が３５〜４０℃で後半は３０〜３５℃、さらに好ましくは初発温度が３５〜３７℃で後半は３０〜３３℃である。また、培養時間は４０〜７２時間、好ましくは４０〜６４時間、さらに好ましくは４２〜４８時間である。培養時間は、麹におけるクエン酸を増加させるなどの目的で最適範囲を６４〜７２時間程度に延長することもできる。人件費やランニングコストがかかるため、必要最低限のクエン酸と糖化酵素が生産されれば３日間程度の培養で止めておくのがよいと考えられる。麹はそのまま糖化に使用することもできるが、保管や輸送のため、麹を乾燥することもできる。出麹後、通風等で水分量を１０％以下にし、低温で貯蔵するのがよい。
【００２７】
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程
麹糖化液の製造
糖化に用いる麹は、搗精黒米麹以外に白米麹をブレンドすることができる。比率は搗精黒米麹：白米麹が１：０〜１：１０、好ましくは１：０〜１：４、さらに好ましくは１：０〜１：２である。必要な糖化液の量や黒米糠の過不足を考慮して適宜決めることができる。
【００２８】
乾燥させた麹に水を加え、糖化を開始することができる。比率は麹：水が１：１〜１：１０、好ましくは１：２〜１：８、さらに好ましくは１：４〜１：６である。糖化温度は２５〜６０℃、好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。保持時間は６〜５０時間、好ましくは６〜２４時間、さらに好ましくは１０〜２０時間である。糖化時間によるＣ３Ｇ回収率、グルコースおよびクエン酸含量の差は小さいため、操作性を重視して一晩保持すればよい。例えば、麹：水が１：５の比率で糖化した場合、グルコースは１０〜１５％（Ｗ／Ｖ）、クエン酸は、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）程度となる。また、麹：水が１：１や１：２．５のように麹の比率を上げれば、グルコースは〜３０％（Ｗ／Ｖ）と高くすることができる。
【００２９】
濾過
麹糖化液は、不水溶性の固形物を含んでいる。以下の実施例に詳細に記載されるように、麹糖化液に含まれる不水溶性の固形物に、Ｃ３Ｇが吸着され、Ｃ３Ｇの回収率を著しく低減させる。そこでＣ３Ｇ回収率を上げるために、濾過を行いこれら固形物を除去する。不水溶性の固形物としては、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。濾過は、当業者が通常行う固液分離の手法を用いることが可能であり、例えば、濾布、振動篩、珪藻土によって行うことができる。好ましくは濾布である。本工程においては、Ｃ３Ｇが吸着されてしまう不水溶性の固形物を取り除けばよく、酵素を取り除く必要はない。
【００３０】
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程
本工程において、糠より糖化液を用いて、Ｃ３Ｇを抽出する。以下の実施例に詳細に記載するように、麹菌の有するＢｇｌは、Ｃ３Ｇを分解しＣ３Ｇの回収率を低減させる。しかし、Ｂｇｌは麹糖化液中に含まれるグルコースによりその活性が阻害されるために、麹糖化液を用いてＣ３Ｇを抽出することにより、Ｃ３Ｇの回収率を高めることが可能である。
【００３１】
本工程において、糖化液に加える糠の割合は、糖化液に対して１〜１０％（ｗ/ｖ）、好ましくは１〜５％（ｗ/ｖ）、さらに好ましくは１〜２．５％（ｗ/ｖ）、より好ましくは１％（ｗ/ｖ）である。
【００３２】
本工程において、抽出は当業者が行う通常の温度や時間で行うことができる。例えば抽出温度は２５〜６０℃、好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。また、抽出時間は１〜１０時間、好ましくは１〜６時間、さらに好ましくは１〜３時間である。ｐＨは２．０〜５．０、好ましくは２．５〜４．５、さらに好ましくは２．８〜３．８である。Ｃ３Ｇは中性水溶液中では半減期８９分ときわめて不安定（アントシアニン、2000年5月10日、（株）建帛社、大庭理一郎、津久井亜紀夫、五十嵐善治）であるが、酸性では比較的安定である。
【００３３】
（５）工程（４）より得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程
工程（４）より得られた糖化液を上記と同様な条件で濾過を行い、黒米糖化液が得られる。黒米糖化液はアントシアニンに富み、アントシアニンを１０〜８５ｍｇ/１００ｍｌ含む。黒米糖化液は、高濃度のＣ３Ｇを含有するだけでなく、糠に由来するグルコース、アミノ酸、ミネラルなども多量に含有する。ｐＨが高い場合は、必要に応じて食品や飲料に使用可能なクエン酸や乳酸等を用いて調整することもできる。
【００３４】
本発明方法はさらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程を含むことができる。
【００３５】
本工程において、工程（５）にて得られた黒米糖化液を加熱して酵素失活および殺菌をすることができる。例えば加熱温度は８０〜１００℃、好ましくは８０〜９０℃、さらに好ましくは８０〜８５℃である。
【００３６】
本発明は、本発明方法により製造された黒米由来のアントシアニンを含む組成物に関する。当該組成物は、黒米由来のアントシアニン、特にＣ３Ｇ、ならびにグルコース、アミノ酸、ミネラルなども多量に含有する。
【００３７】
一実施形態において、本発明の組成物は、飲食品であり得る。
【００３８】
飲食品の形態は、特に制限されず、本発明における組成物を各種飲料、食品、例えば、これらに限定されるものではないが、健康酢、スポーツドリンク、栄養剤、茶、酒類などの飲料、ヨーグルトなどの乳製品、クッキーなどの焼き菓子類、ジャムなどの加工食品、調味料、香辛料などに加工、添加又は配合することによって製造することが可能である。
【００３９】
また、本発明において、飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品であり得る。
【００４０】
また、本発明の飲食品は、本発明の組成物の他、栄養補助成分などの他の成分を含むことができる。かかる成分には、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸等）、カロチノイド（例えばβカロチン、リコピン、フコキサンチン等）、ミネラル類（例えば海藻成分、ＣＣＭ、ヘム鉄、鉄塩系、乳清カルシウム、発酵乳酸カルシウム、牛骨カルシウム、珊瑚カルシウム、卵殻カルシウム等）、各種植物体並びにその抽出物、精製物及び分画物（例えばオオバコ、クロレラ、スピルリナ、にんにく、いちょう葉、ギムネマ、杜仲の葉、しその葉、ハトムギ、大豆グロブリン、ルチン、緑茶抽出物、テアニン、ポリフェノール類、甘草、ユッカ、大豆サポニン、カフェイン、ホワトルベリーエキス、シャンピニオンエキス、ガルシニア・カンボジアエキス等）、微生物並びにその増殖因子及び微生物生産物（例えば乳酸菌、酵母、乳酸菌増殖因子等）、食物繊維及びその酵素分解物（例えばアップルファイバー、コーンファイバー、澱粉由来の食物繊維、難消化性デキストリン、グアガム酵素分解物、サツマイモ繊維、大豆繊維、海藻繊維、きのこ繊維、茶繊維、酸性多糖類、植物粘質物、小麦フスマ等）、動物体並びにその抽出物、精製物、分解物及び生産物（例えばローヤルゼリー、プロポリス、牡蠣エキス、キチン、キトサン、タウリン、コラーゲン、ゼラチン等）、各種オリゴ糖（例えばガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等）、脂質（例えば不飽和脂肪酸（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、リン脂質、サラトリム等）、各種蛋白質及び蛋白分解物（例えばとうもろこし蛋白、大豆蛋白、ＴＭＰ（トータルミルクプロテイン）、ラクトアルブミン、カゼイン、ホエー、グルタチオン、大豆ペプチド、卵白ペプチド、グルタミンペプチド等）、脱脂胚芽等の小麦胚芽などが挙げられる。
【００４１】
本発明の組成物を飲食品として摂取する場合には、飲食品中の有効成分としての本発明のＣ３Ｇの含有量は、成人1人につき、1日当たり１〜２５０ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇさらに好ましくは５〜５０ｍｇの摂取量となるように摂取すればよい。
【００４２】
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００４３】
黒米のＣ３Ｇは、総アントシアニン量として５２０ｎｍ付近の吸光度で測定される場合もあるが、黒米抽出液の吸光度（５２０ｎｍ）とＣ３Ｇ含量は必ずしも一致しないため、ＨＰＬＣによって分離定量する必要がある。また、発酵により産生するクエン酸またはｐＨはＣ３Ｇの安定性に影響するため、把握する必要がある。各工程におけるＣ３Ｇ回収率の影響は未解明であるため、以下の実施例では課題となる工程を抽出し、その解決法について検討する。さらに、本発明による製法と従来製法の比較検討を行う。
【００４４】
実施例１：黒米エキスからのＣ３Ｇ精製
従来技術では黒米の色素はアントシアニンであり、アントシアニンは５２０ｎｍ付近の吸光度で測定されていたが、黒米の５２０ｎｍの吸光をもつ色素成分のうち、Ｃ３Ｇが主であることを確認するため、以下の検討を実施した。
【００４５】
黒米の含水エタノール抽出物「黒米エキス」（オリザ油化（株））４０ｇを０．２Ｎ ＨＣｌ８００ｍｌにて５５℃で１時間抽出し、遠心分離後の上清をエバポレーターで減圧濃縮し、２４０ｍｌの抽出液を得た。
【００４６】
これを陽イオン交換カラムに供し、ＡＫＴＡ（旧アマシャム社）を用いて精製した。陽イオン交換カラムは、陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００ＣＴ Ｎａ ０．６０−０．８５ ｍｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｏｒｕｇａｎｏ（株））５００ｍｌを、内径５ｃｍ、高さ２０ｃｍのカラムに充填して用いた。洗浄には０．２Ｎ ＨＣｌ、溶出には５０％エタノール（含０．２Ｎ ＨＣｌ）を用い、流速は１５ｍｌ／ｍｉｎとし、約５０ｍｌずつ分取した。全ての操作は４℃冷蔵庫内で行った。
【００４７】
各フラクションについて５２０ｎｍの吸光度およびＣ３Ｇ含量を測定した。Ｃ３ＧはＨＰＬＣ−ＰＤＡ（（株）島津製作所）で分離定量した。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−II；４．６×１５０ｍｍ（ナカライテスク（株））、移動相はＡ：１０％ギ酸、Ｂ：８０％メタノールおよび２０％移動相Ａ（１０％ギ酸）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、０→２０ｍｉｎでＢ濃度５→７０％のリニアグラジェントで、５２０ｎｍの吸光度をモニターして分析した。５２０ｎｍの吸光度のうちＣ３Ｇが占める割合は、ＨＰＬＣで検出されたピークエリアを元に算出し、図１に示す。意外なことに、Ｃ３Ｇ以外にも５２０ｎｍの吸光度をもつ物質がかなり存在することが見出され、黒米のＣ３Ｇを温存するためには常にＨＰＬＣで分離定量する必要があると考えられた。従って、以下の実施例のＣ３Ｇの分析は全てＨＰＬＣ法で行った。
【００４８】
実施例２：各種麹菌と糖化液Ｃ３Ｇ含量
粉砕黒米を１２０℃で２０分間オートレーブにて蒸きょう、菌株保存機関および市販種麹メーカーから入手した焼酎用麹菌１７株（Ａ． ｋａｗａｃｈｉ、Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、湿度８０％以上で４６時間培養した。得られた麹３０ｇに水６０ｍｌを加え、５５℃で６時間糖化し、固液分離後の上清を８５℃で１０分間酵素失活させ、糖化液を得た。
【００４９】
麹については５倍量の１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で菌体外酵素を抽出し、β―グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）活性をｐ−ニトロフェニル‐α‐グルコシド（ｐＮＰＧ）法で測定した。１ｍＭ ｐＮＰＧ基質、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて５０℃で１５分間反応させ、４１０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００５０】
糖化液についてはＣ３Ｇ、グルコースおよびクエン酸含量を測定した。Ｃ３Ｇは実施例１に示す方法で測定した。グルコースはグルコースＣIIテストワコー（和光純薬工業（株））を用いて測定した。クエン酸はＨＰＬＣ−電気伝導度検出器（（株）島津製作所）で分離定量した。カラムはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（（株）島津製作所）、移動相は５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、反応混合物は５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸および８０μＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、カラム温度は４０℃で測定した。結果を図３〜５に示す。
【００５１】
グルコース含量には大きな差は見られなかったため、いずれの株でも糖化反応は問題なく進んだと考えられる。実施例４以下では、Ｃ３Ｇ分解活性を持つＢｇｌ活性が比較的低く、Ｃ３Ｇおよびクエン酸含量が最も高かったＮｏ．１３株、すなわちヒグチモヤシの白麹菌（本格焼酎菌米用）を選抜して用いた。また、Ｎｏ．８株、すなわち（株）秋田今野商店の黒麹菌（マイルド）のＣ３Ｇ含量は中程度であるが、クエン酸含量およびＢｇｌ活性はＮｏ．１３と同程度であり、焼酎用麹菌であれば白麹菌でも黒麹菌でも利用可能であると考えられる。
【００５２】
実施例３：従来の製造工程の課題抽出と改善に向けた検討
従来の製造工程は、粉砕黒米の吸水工程、蒸きょう工程、製麹工程、糖化工程に分けることができる。黒米１００ｇに３６ｍｌの水を添加し、４時間吸水させ、１２０℃で２０分間蒸きょう、黒麹菌（Ｎｏ．８）を０．１％接種し、３５℃で４６時間培養した。麹に２倍量の水を添加し、５５℃で６時間糖化、固液分離後、９０℃で２０分間酵素失活させ、糖化液を得た。粉砕黒米、蒸きょう黒米および黒米麹のＣ３Ｇは、２０倍量の１Ｎ 塩酸を含む６０％含水エタノールで抽出してからＨＰＬＣで分離定量した。結果を図６に示す。吸水工程ではＣ３Ｇの損失は見られなかったが、蒸きょう工程では約９割、製麹工程では約１割のＣ３Ｇの損失が見られた。また、糖化工程では麹中のＣ３Ｇのうち、約３割しか回収できていないことが判明した。従って、蒸きょう工程および糖化工程が改善すべき重要な工程であると考えられる。
【００５３】
蒸きょう工程の問題点として、Ｃ３Ｇを中性ｐＨ条件化において高温で長時間保持していることが考えられる。「最良の形態」でも述べたとおり、Ｃ３Ｇは中性水溶液中では不安定であるが、酸性水溶液中では比較的安定であることが知られている。そこで、本検討では蒸きょうの際、通常は水を吸水させる替わりにクエン酸水溶液を吸水させたところ、Ｃ３Ｇ残存率を大幅に上げられることを見出した。すなわち、黒米糠１ｇに対し、１％量（Ｖ／Ｗ）の０，１，５，２０％クエン酸水溶液を吸水後、１００℃で２０分間オートクレーブ内にて保持した結果、Ｃ３Ｇ残存率は、クエン酸濃度０％では０．７８％であったが、クエン酸濃度依存的に増加し、クエン酸濃度２０％では３５．０％のＣ３Ｇが残存し、約４５倍も向上した（図７）。しかしながら、さらにＣ３Ｇ回収率を上げるには、蒸きょう工程にＣ３Ｇが存在することは不利であると考えられる。
【００５４】
従来の糖化工程における問題点として、一つ目に、特開平４−５８８７８からも推定されるように、Ｃ３Ｇを含有する黒米糠以外に麹由来の固形物が多量に共存し、糖化残渣にＣ３Ｇが吸着してしまうことが考えられる。まず、麹に含まれる主な固形物としては、米由来のデンプン、麹菌の菌体および胞子が挙げられる。そこで、黒米２．４ｇに対し、２％クエン酸水溶液３２ｍｌ加え、デンプン、胞子および菌体の有無によるＣ３Ｇ回収量の変化について検討した。その結果、デンプン、胞子および菌体いずれもＣ３Ｇの回収率を低下させた（図８〜１０）。一方、可溶性のデンプンではＣ３Ｇの回収率は低下しなかったため、Ｃ３Ｇは麹の固形物に吸着してしまうことが推測され、固液分離の有効性が示唆された。次に、実際の麹に含まれると推定される量のデンプン、胞子および菌体のうち、どれが最もＣ３Ｇ回収の妨げになっているか検討した。黒米４ｇ、デンプン源の粉砕搗精黒米７．２ｇ、胞子源の種麹１１１ｍｇおよび菌体４０ｍｇに対し、黒米麹から調製した水麹（菌体外酵素抽出液）９６ｍｌを加え、５５℃で６時間保持した。このとき、粉砕搗精黒米を除いたもの、種麹を除いたもの、菌体を除いたものを比較した。対照として、黒米４ｇに対して２％クエン酸水溶液９６ｍｌを加えて５５℃、６時間保持したものを用いた。その結果、粉砕搗精黒米を除いたものでＣ３Ｇ回収率の低下が大幅に改善された（図１１）。したがって、実際の糖化では菌体および胞子の影響が小さいこと、麹に多量に存在するデンプンを十分に分解するため、糖化力が高い麹が必要であることが考えられた。さらに、それでも残存する糖化残渣とＣ３Ｇが存在することは不利であると考えられた。
【００５５】
従来の糖化工程における問題点として、二つ目に、麹菌が生産するＢｇｌによりＣ３Ｇが酵素分解を受けていることが考えられる。まず、Ａ． ｎｉｇｅｒ由来のＢｇｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）のＣ３Ｇ分解活性を確認した（図１２）。続いて、ｐＮＰＧ基質を用い、グルコースによるＢｇｌ活性の阻害効果を調べた。その結果、グルコース濃度依存的にＢｇｌ活性は減少し、グルコース濃度５．４％では、Ｂｇｌ活性は２％以下に減少した（図１３）。従って、グルコース濃度が１０％以上に達する糖化液において、Ｂｇｌはほとんど活性がなく、ＢｇｌによるＣ３Ｇ分解の影響はきわめて小さくなると考えられる。
【００５６】
以上のことから、糖化工程において、糖化残渣を固液分離により除いてからＣ３Ｇ添加することが有効と考えられた。また、このときのＣ３Ｇ供給源は、蒸きょう工程の前に黒米を精米し、その黒米糠を固液分離後の糖化液に添加することで、黒米全体を利用しつつもＣ３Ｇを最も効率良く回収可能と考えられた。
【００５７】
実施例４：搗精黒米麹糖化液による黒米糠Ｃ３Ｇ抽出と糖化
実施例３の結果を踏まえ、本発明では原料黒米の精米工程、搗精黒米の製麹工程、糖化工程、固液分離後の糖化液による黒米糠の抽出工程から成り、Ｃ３Ｇおよび黒米のその他栄養成分を効率回収する製造方法を提供する。
【００５８】
まず、黒米（朝紫品種）９．４６ｋｇを精米機で精米し、搗精黒米８．２６ｋｇと黒米糠１．１７ｋｇを得た。精米歩合は８７．３１％であった。得られた搗精黒米を水に３０分間浸漬、１００℃で５０分間蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、白麹菌（Ｎｏ．１３）を接種して、２４時間３７℃、さらに１９時間３３℃で培養して搗精黒米麹を製造した。搗精黒米麹はクエン酸と糖化酵素を多量に含んでいた。麹は乾燥させてから保存した。
【００５９】
次に、この搗精黒米麹に５．７倍量の水を加え、５５℃で６時間糖化した。その後遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して糖化液を得た。
【００６０】
糖化液に精米工程で得た黒米糠を１．６７％（Ｗ／Ｖ）添加し、５５℃で２時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して黒米のＣ３Ｇ（アントシアニン）を多量に含む黒米糖化液を得た。このとき、Ｃ３Ｇの回収率は６７．３３％であった。さらに、糖化液中の酵素活性が残存しているため、従来技術の有機溶媒による抽出と異なり、黒米糠のデンプンやタンパク質が分解され、グルコースおよびアミノ酸含量が増加した（図１４，１５）。ｐＨは３．６であった。
【００６１】
続いて、糖化液に対する黒米糠の添加量（Ｗ／Ｖ）とＣ３Ｇ回収率の関係を調べた。添加量を１，２．５，５，１０％として５５℃で１時間抽出したところ、添加量依存的にＣ３Ｇ回収率は減少したが、添加量１％のときは約７１％のＣ３Ｇを回収することができた（図１６）。
【００６２】
さらに、黒米糠の抽出時間とＣ３Ｇ回収率の関係を調べたところ、Ｃ３Ｇ回収率は1時間抽出で６０％程度、２時間抽出で６５％程度となった。２時間以降は徐々に減少していき、４時間抽出で６０％程度になった（図１７）。したがって、抽出時間が長すぎるとＣ３Ｇが損失する可能性が示唆された。また、アミノ態窒素は３時間程度まで増加したが、２時間までの増加に比べるとわずかであった（図１８）。グルコースおよびクエン酸濃度はほとんど変わらなかった。以上より、黒米糠からの抽出は５５℃で２時間程度が最良と考えられた。
【００６３】
酵素反応の停止および殺菌目的で得られた黒米糖化液を加熱することができる。Ｃ３Ｇ濃度５．９７ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ３．８の黒米糖化液を用い、７０，８０，９０，９９．９℃で１０，２０，３０，６０分間加熱後、Ｃ３Ｇ濃度を再度測定した。その結果、７０℃で３０分間、８０℃で２０分間、９０℃で１０分間の加熱では、Ｃ３Ｇの損失は１０％未満であった（図１９）。本黒米糖化液においてＣ３Ｇは比較的安定であると考えられる。また、ｐＨが４．０以下であるため、本発明ではＣ３Ｇを損失することなく必要な加熱殺菌が可能であると考えられる。
【００６４】
比較例１：本発明と従来製法の比較
精米歩合が８７．３１％の搗精黒米５００ｇを洗米し、１５分間浸漬、水分測定後、不足した水を添加して２時間吸水させ、水分量を約３３％に調整した。精米を行っていない同じロットの黒米２００ｇを粗粉砕し、水を６６ｍｌ添加して２時間吸水させた。搗精黒米および粉砕黒米を１２１℃で１５分間オートクレーブにて蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、白麹菌（Ｎｏ．１３）を接種して３７℃で２４時間、３３℃で１９時間、シャーレ内で培養した。手入れは３回行い、乾燥させて保存した。
【００６５】
乾燥させた搗精黒米麹および粉砕黒米麹それぞれ２５ｇに対し、５倍量（Ｖ／Ｗ）加え、５５℃で６時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して糖化液を得た。
【００６６】
搗精黒米糖化液には精米工程で生じた４．４％（Ｗ／Ｖ）の黒米糠を添加し、５５℃で２時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して搗精黒米黒米糖化液を得た。ｐＨは３．５であった。
【００６７】
搗精黒米および粉砕黒米糖化液を８０℃で２０分間保持して酵素失活後、０．２２μｍフィルター濾過後、成分分析に供した。
【００６８】
本発明（搗精黒米糖化液）と従来製法（粉砕黒米糖化液）を比較すると、グルコース、アミノ酸、クエン酸ついては大きな差は見られなかったが、Ｃ３Ｇ回収率については、本発明の方が、従来製法に比べて１０．４倍高く、本発明の有効性が確認された（以下の表１および図２０）。
【００６９】
【表１】
【００７０】
本比較例では糠添加率が４．４％（Ｗ／Ｖ）と高いためＣ３Ｇ回収率は４５％に止まったが、実施例４に示したように、黒米糠を添加する糖化液量を増やすことで、さらなるＣ３Ｇ回収率の向上が可能である。糖化液量を増やすには、搗精黒米麹に市販の白米麹をブレンドして糖化のスケールを大きくしても良いし、単純に食品、飲料用のクエン酸水溶液等を加水して用いても良い。
【００７１】
実施例５：３０Ｌパイロットプラントスケールでの製造
黒米（朝紫品種）１９．６８ｋｇを精米し、搗精黒米１６．７８ｋｇと糠２．５３ｋｇとが得た。精米歩合は８５．２６％であった。得られた搗精黒米を水に６０分間浸漬、無圧で５０分間蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、小型円形自動製麹機に盛り込み、焼酎用白麹菌（本格焼酎米用）を接種して、２４時間３７℃、さらに１９時間３３℃で培養して搗精黒米麹を製造した。搗精黒米麹のクエン酸と糖化酵素は若干少なかった。麹は乾燥させてから保存した。
【００７２】
乾燥させた搗精黒米麹６ｋｇに対し、３０Ｌの水を加え、５０Ｌジャーファーメンターにて５５℃で１８時間保持した。
【００７３】
糖化液の約半分を振動篩法により濾過を行ったところ、液量回収率は９３．５％であった。残りの約半分を濾布法により濾過を行ったところ、液量回収率は９３．８％であった。合計で３１．１Ｌの糖化液を回収した。いずれの方法でも濾過は可能であった。
【００７４】
３１．１Ｌの糖化液に対し、黒米糠を６００ｇ（１．９３％、Ｗ／Ｖ）添加、５５℃で２時間保持後、糖化液と同様に濾過を行った。振動篩法および濾布法の液量回収率は、それぞれ９４．０％および９５．７％であり、合計２９．６Ｌの黒米糖化液を回収した。黒米糠の濾過についても、いずれの方法でも濾過は可能であった。
【００７５】
黒米糖化液を５０Ｌジャーファーメンターにて８０℃で２０分間保持した。その後成分分析を行うまで凍結保存した。
【００７６】
濾過前の黒米糖化液のＣ３Ｇ濃度は１４．６５ｍｇ／１００ｍｌであった。振動篩濾過後は１４．４２ｍｇ／１００ｍｌ、濾布濾過後は１５．２４ｍｇ／１００ｍｌであり、濾過による損失はみられなかった。このとき、黒米糠からのＣ３Ｇ回収率は６４．１％であった。殺菌工程においては８．３％のＣ３Ｇの損失がみられた。グルコース濃度は１４．２１ｇ／１００ｍｌ、クエン酸濃度は０．４１ｇ／１００ｍｌ、アミノ酸含量は４７０ｍｇ／１００ｍｌであった。
【００７７】
以上より、本発明は３０Ｌパイロットプラントスケールでも有効な製造方法であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明方法により、黒米に由来するアントシアニン、特にＣ３Ｇ、ならびにその他の栄養成分を多く含む組成物を製造することが可能であり、機能性食品・飲料素材の製造に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、Amberlite 200CT(陽イオン交換)を用いて精製した,各フラクションについて520nmの吸光度およびＣ３Ｇ含量の測定結果を示す。
【図２】図２は、各焼酎用麹菌株におけるBgl活性の測定結果を示す。
【図３】図３は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のＣ３Ｇ含量の測定結果を示す。
【図４】図４は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のグルコース含量の測定結果を示す。
【図５】図５は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のクエン酸含量の測定結果を示す。
【図６】図６は、従来技術の各工程におけるＣ３Ｇ残存率の測定結果を示す。
【図７】図７は、蒸きょう工程における、クエン酸の存在によるＣ３Ｇ残存率への影響を測定した結果を示す。
【図８】図８は、糖化工程における、デンプンの存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図９】図９は、糖化工程における、胞子の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、糖化工程における、菌体の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、糖化工程における、各麹構成物の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、糖化工程における、BglによるＣ３Ｇ分解による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、糖化工程における、グルコースの存在によるBgl活性への影響を測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、黒米糠の添加の前後における、糖化液中のグルコース含量の測定結果を示す。
【図１５】図１５は、黒米糠の添加の前後における、糖化液中のアミノ酸含量の測定結果を示す。
【図１６】図１６は、糖化液に対する黒米糠の添加量による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１７】図１７は、黒米糠の抽出時間による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１８】図１８は、黒米糠の抽出時間による、糖化液中のアミノ態窒素含量への影響を測定した結果を示す。
【図１９】図１９は、黒米糖化液の加熱温度による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図２０】図２０は、本発明方法と従来法による、Ｃ３Ｇ回収率の比較結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、黒米からシアニジン−３−グルコシドおよびその他の栄養成分を多く含む組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
黒米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）は、赤紫色の色素層を有し、黒色の外観を呈する米をいい、例えば古代米、紫黒米、紫米とも呼ばれる。黒米は、古くからタイ北部、ミャンマー北部、中国等で栽培されてきた。日本では、主に九州や東北地方において栽培されている。黒米玄米の表面は黒くて、中は白く、玄米種皮の部分（表層約１０％いわゆる糠の部分）に赤紫色系色素であるアントシアニンを含んでいる。また、糠の部分にはタンパク質やミネラルも含まれていることが分かっている。
【０００３】
アントシアニンは、「花の青色成分」ともいわれ、植物の花、果実、茎、葉、根などに含まれ、青色のみならず橙黄色から赤色、紫色まで幅広い色調をもつ色素配糖体であり、広義にはフラボノイドに属する。前記アントシアニンはアグリコンをアントシアニジンといい、天然では１８種類見出されており、主に見られるものはシアニジン、ペラルゴニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペチュニジンの６種類である。結合糖の種類はＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、ルチノースなどがある。さらに、糖部にはｐ−クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸などの有機酸がエステル結合したものがあり、現在では４００種類以上のアントシアニンが報告されている。
【０００４】
黒米はアントシアニンの中でも、シアニジンの配糖体であるシアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（以下、Ｃ３Ｇ）が多く含まれており、その他の赤色系の色を有する植物などよりもＣ３Ｇが含まれる割合が多いことが知られている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００５】
アントシアニンは赤、青、紫色の植物にはたいてい含まれており、その色の良さから赤紫蘇のように食品の着色料や、紅花や藍のように衣服の染料として使用されてきた。一方、アントシアニンには、視覚機能改善効果や抗酸化、血流改善、肥満抑制、血清脂質の改善、糖尿病予防、肝障害の軽減、抗炎症などの効果が知られており、Ｃ３Ｇでも同様な機能が報告されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００６】
上記のような利点から、黒米を直接使用して、色が良い食品や機能性のある食品などが作られてきた（特許文献２や特許文献３）。しかし、原料から色素や機能性の成分を維持して製造することが重要にもかかわらず、原料中の成分が最終製品まで残る割合はあまり考慮されていなかった。
【０００７】
黒米において色素やＣ３Ｇを多く含む糠から抽出する発明もなされている。例えば、特許文献４が知られており、抽出した色素を食品へ添加するものである。黒米の糠から色素やＣ３Ｇを抽出しているため、色素やＣ３Ｇを使用するためには一見効率良い方法のように見えるが、逆に糠以外の部分を有効に利用できず、原料の全体として有効利用できるものではなかった。
【０００８】
原料から色素を維持して製造するため、抽出しようとする液から色素が吸着されやすい固形分を濾過しておくという技術がある（特許文献５）。しかしながら上記の特許文献４と同様にこの技術は糠以外の部分を有効に利用するものではなく原料の全体として有効利用できるものではなかった。
【０００９】
糠の色素を抽出した色素水溶液を、その他の部分と蒸煮したもち米や麦芽と合わせて糖化した搾汁液に添加し、糖化液を着色するという発明がなされ、原料の全体として有効利用が考慮されているものもある（特許文献６）。しかしながら、この技術は色素にのみ着目しているため、Ｃ３Ｇや糠のその他の成分を考慮しているものではなかった。すなわち、色素成分のＣ３Ｇが徐々に分解してしまう５５℃、ｐＨ３．５、１０時間という抽出条件であるということである。また仮にＣ３Ｇが抽出で残ったとしても、０．２％クエン酸抽出液２００ｍｌと具体的に量は判断できないが白米と麦芽で１．１５ｋｇであることから数Ｌと考えられる糖化液とを混合した時点でｐＨは酸性から中性に近づき、酸性で安定であるＣ３Ｇの分解は免れないということである。
【００１０】
黒米を粉砕し、焼酎用麹菌を接種して培養後、糖化して飲用クエン酸酢とし、原料の全体として有効利用が考慮されているものもある（特許文献７）。しかしながら、この技術はアントシアニンを５１５nmの吸光をもつ色素として捉えているため、Ｃ３Ｇそのものの残存量が考慮されていない。すなわち、水で吸水させてＣ３Ｇが不安定な高温、中性条件下で１時間も蒸きょうしているため、Ｃ３Ｇを大幅に損失していると考えられる。さらに糖化工程ではＣ３Ｇと糖化残渣が共存するため、Ｃ３Ｇの回収率は低くなっていると考えられる。黒米にはＣ３Ｇ以外の色素も存在するため、従来の吸光度のみに着目した検討では、機能性成分であるＣ３Ｇの損失を見落としてしまう。
【００１１】
このように、今まで、原料全体を考慮しつつ、黒米の糠に含まれる他の栄養成分と共にＣ３Ｇを高効率回収し有効に利用する黒米食品、飲料組成物を製造する技術がなかった。この技術を達成するにはＣ３Ｇを分解しないように最適化した抽出の条件や糖化液をつくる麹の調製条件を決定することが重要であった。また、糠のその他の栄養成分アミノ酸やミネラル分として利用するにあたって糖化液に麹の酵素が含まれていることが適当であった。したがって、本発明は、黒米糠から機能性を持つ色素を有機溶媒によって抽出する従来技術とは異なり、黒米全体を原料として色素の損失を抑えながら機能性食品・飲料素材を開発するという新しい技術であり、容易に想到できるものではなかった。
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−２３９６１２号公報
【特許文献２】特開平２−１５０２６８号公報
【特許文献３】特開２０００−０６９９３６号公報
【特許文献４】特表２００５−５２７５３９号公報
【特許文献５】特開平４−５８８７８号公報
【特許文献６】特開平７−２５０６４７号公報
【特許文献７】特開２００６−２６２７９９号公報
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4696-4704
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 7846-7856
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 4457-4462
【非特許文献４】J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 3560-3563
【非特許文献５】Experimental Eye Res. 2005,80,313-322
【非特許文献６】J. Agric. Food Chem. 1994, 42, 2407-2410
【非特許文献７】J. Nutr. 132: 20-26, 2002.
【非特許文献８】J. Nutr. 136: 2220-2225, 2006
【非特許文献９】Arch Biochem Biophys. 1999 368(2):361-6.
【非特許文献１０】J. Nutr. 133: 2125-2130, 2003
【非特許文献１１】Biochem. Pharmacol. 2007, 74,1619-1627
【非特許文献１２】J. Nat. Prod. 1999, 62, 294-296
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、黒米の機能性成分であるＣ３Ｇを温存しながら、黒米全体を原料として利用し、有機溶媒を用いることなくそのまま食品・飲料素材を提供する技術を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ｃ３Ｇ存在下で蒸きょうのような加熱する工程および水溶液中で糖化残渣等の固形物とＣ３Ｇを共存させる工程が従来技術の最大の問題点であることを見出した。さらに、従来技術では黒米などから色素を高効率で回収するには有機溶媒を用いることが常識であったが、黒米を精米して搗精黒米と黒米糠に分離し、搗精黒米を原料として製麹および糖化させ、固液分離した麹糖化液を用いて黒米糠からＣ３Ｇ抽出すれば、Ｃ３Ｇのみならず、黒米糠の糖やアミノ酸、ミネラル等までも多く含む組成物を製造できることを思いがけず発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下［１］〜［１７］の特徴を包含する。
［１］ 搗精黒米から麹を作製して糖化し、その糖化液に黒米の糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンに富む黒米糖化液を得ることを含む、黒米由来のアントシアニンを含む組成物を製造する方法。
［２］ 以下の工程を包含する、［１］の方法：
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程；
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程；
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程；
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程；および
（５）得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程。
［３］ アントシアニンが、シアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（Ｃ３Ｇ）である、［１］または［２］の方法。
［４］ 工程（１）において、黒米を８０〜９５％の精米歩合で精米する、［２］または［３］の方法。
［５］ 工程（２）において、麹菌が、焼酎用麹菌である、［２］〜［４］のいずれかの方法。
【００１６】
［６］ 麹菌が、クエン酸高生産性、かつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）低活性性である、［５］の方法。
［７］ 工程（２）において、麹菌を接種して、２８〜４０℃にて４０〜７２時間培養を行う、［２］〜［６］のいずれかの方法。
［８］ 工程（３）において製造される糖化液が、１０〜３０％（Ｗ／Ｖ）のグルコースおよび、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）のクエン酸を含有する、［２］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ 工程（３）において、糖化液を濾過して不水溶性の物質を除去する、［２］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ 不水溶性の物質が、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、またはそれらの混合物を含む、［９］の方法。
［１１］ 工程（４）において、ｐＨ２．０〜５．０、２５〜６０℃にて、１〜１０時間、抽出処理する、［２］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］ 工程（５）にて得られる黒米糖化液がまた、糠由来の糖、アミノ酸、ミネラルを含有する、［２］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］ さらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程、を含む、［２］〜［１２］のいずれかの方法。
［１４］ ［１］〜［１３］のいずれかの方法により製造された、アントシアニンに富む黒米糖化液を含む組成物。
【００１７】
［１５］ 組成物が飲食品である、［１４］の組成物。
［１６］ 飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品である、［１５］の組成物。
［１７］ 栄養補助成分をさらに含む、［１４］〜［１６］のいずれかの組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、有機溶剤を使用することなく、黒米全体を利用しつつＣ３Ｇおよびその他の栄養成分を多く含む組成物を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る組成物及び製造方法について説明する。
【００２０】
本発明は、以下（１）〜（５）の工程を包含する、黒米からアントシアニンを含む組成物を製造する方法に関する。本発明においては、上記課題を解決するために、Ｃ３Ｇ存在下で蒸きょうのような加熱する工程、および水溶液中で糖化残渣等の固形物とＣ３Ｇを共存させる工程を回避して、黒米より高収率でＣ３Ｇを回収することが可能である。
【００２１】
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程
原料
本発明に使用する原料は、黒米である。さらに好ましく朝紫品種である。黒米はその他の食品素材と比較してアントシアニン含量が高いだけではなく、アントシアニン中のＣ３Ｇの割合が大きいためである。また、黒米の中でも朝紫品種、朝紫品種の中でも東北地方のものの方がＣ３Ｇ含量は高い傾向がある。
【００２２】
精米
本発明の組成物の素材となる黒米は精米により搗精黒米と黒米糠に分離して使用することができる。例えば精米歩合は８０〜９５％、好ましくは８０〜９０％、さらに好ましくは８５〜９０％である。Ｃ３Ｇが黒米の表層約１０％に集中して分布するからである。
【００２３】
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程
蒸きょう
本工程において、搗精黒米を蒸きょうする。以下の実施例にて詳細に記載するように、Ｃ３Ｇ回収率を上げるためには、蒸きょう工程にＣ３Ｇが含まれないことが好ましい。蒸きょうは当業者が行う通常行う方法で実施することが可能であり、９０〜１２０℃、好ましくは１００℃にて、０．５〜２時間、好ましくは５０分間行う。
【００２４】
麹菌
製麹に用いられる麹菌は、クエン酸を生産する焼酎用麹菌であればよく、白麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ、黒麹菌Ａ． ａｗａｍｏｒｉ、黒麹菌Ａ．ｓａｉｔｏｉであれば良く、好ましくはＡ．ｋａｗａｃｈｉである。このＡ． ｋａｗａｃｈｉは（株）樋口松之助商店（ヒグチモヤシ）の白麹菌（本格焼酎菌米用）使用することができる。ヒグチモヤシの白麹（米用）は、他の焼酎用麹菌を用いた麹と比べ、クエン酸生産がよく、Ｃ３Ｇ分解活性をもつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）活性が低く、糖化液へのＣ３Ｇ回収量が高いためである（実施例に示す）。
【００２５】
接種する麹菌の量は、製麹に通常用いられる量であり、蒸きょうした搗精黒米に対して、例えば、０．０１〜０．２％（Ｗ／Ｗ）、好ましくは０．１％（Ｗ／Ｗ）である。
【００２６】
培養
本工程において、培養は当業者が行う通常の温度や時間で行うことができる。例えば搗精黒米の吸水条件は通常の白米と同様、培養温度は２８〜４０℃、好ましくは初発温度が３５〜４０℃で後半は３０〜３５℃、さらに好ましくは初発温度が３５〜３７℃で後半は３０〜３３℃である。また、培養時間は４０〜７２時間、好ましくは４０〜６４時間、さらに好ましくは４２〜４８時間である。培養時間は、麹におけるクエン酸を増加させるなどの目的で最適範囲を６４〜７２時間程度に延長することもできる。人件費やランニングコストがかかるため、必要最低限のクエン酸と糖化酵素が生産されれば３日間程度の培養で止めておくのがよいと考えられる。麹はそのまま糖化に使用することもできるが、保管や輸送のため、麹を乾燥することもできる。出麹後、通風等で水分量を１０％以下にし、低温で貯蔵するのがよい。
【００２７】
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程
麹糖化液の製造
糖化に用いる麹は、搗精黒米麹以外に白米麹をブレンドすることができる。比率は搗精黒米麹：白米麹が１：０〜１：１０、好ましくは１：０〜１：４、さらに好ましくは１：０〜１：２である。必要な糖化液の量や黒米糠の過不足を考慮して適宜決めることができる。
【００２８】
乾燥させた麹に水を加え、糖化を開始することができる。比率は麹：水が１：１〜１：１０、好ましくは１：２〜１：８、さらに好ましくは１：４〜１：６である。糖化温度は２５〜６０℃、好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。保持時間は６〜５０時間、好ましくは６〜２４時間、さらに好ましくは１０〜２０時間である。糖化時間によるＣ３Ｇ回収率、グルコースおよびクエン酸含量の差は小さいため、操作性を重視して一晩保持すればよい。例えば、麹：水が１：５の比率で糖化した場合、グルコースは１０〜１５％（Ｗ／Ｖ）、クエン酸は、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）程度となる。また、麹：水が１：１や１：２．５のように麹の比率を上げれば、グルコースは〜３０％（Ｗ／Ｖ）と高くすることができる。
【００２９】
濾過
麹糖化液は、不水溶性の固形物を含んでいる。以下の実施例に詳細に記載されるように、麹糖化液に含まれる不水溶性の固形物に、Ｃ３Ｇが吸着され、Ｃ３Ｇの回収率を著しく低減させる。そこでＣ３Ｇ回収率を上げるために、濾過を行いこれら固形物を除去する。不水溶性の固形物としては、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。濾過は、当業者が通常行う固液分離の手法を用いることが可能であり、例えば、濾布、振動篩、珪藻土によって行うことができる。好ましくは濾布である。本工程においては、Ｃ３Ｇが吸着されてしまう不水溶性の固形物を取り除けばよく、酵素を取り除く必要はない。
【００３０】
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程
本工程において、糠より糖化液を用いて、Ｃ３Ｇを抽出する。以下の実施例に詳細に記載するように、麹菌の有するＢｇｌは、Ｃ３Ｇを分解しＣ３Ｇの回収率を低減させる。しかし、Ｂｇｌは麹糖化液中に含まれるグルコースによりその活性が阻害されるために、麹糖化液を用いてＣ３Ｇを抽出することにより、Ｃ３Ｇの回収率を高めることが可能である。
【００３１】
本工程において、糖化液に加える糠の割合は、糖化液に対して１〜１０％（ｗ/ｖ）、好ましくは１〜５％（ｗ/ｖ）、さらに好ましくは１〜２．５％（ｗ/ｖ）、より好ましくは１％（ｗ/ｖ）である。
【００３２】
本工程において、抽出は当業者が行う通常の温度や時間で行うことができる。例えば抽出温度は２５〜６０℃、好ましくは４５〜６０℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。また、抽出時間は１〜１０時間、好ましくは１〜６時間、さらに好ましくは１〜３時間である。ｐＨは２．０〜５．０、好ましくは２．５〜４．５、さらに好ましくは２．８〜３．８である。Ｃ３Ｇは中性水溶液中では半減期８９分ときわめて不安定（アントシアニン、2000年5月10日、（株）建帛社、大庭理一郎、津久井亜紀夫、五十嵐善治）であるが、酸性では比較的安定である。
【００３３】
（５）工程（４）より得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程
工程（４）より得られた糖化液を上記と同様な条件で濾過を行い、黒米糖化液が得られる。黒米糖化液はアントシアニンに富み、アントシアニンを１０〜８５ｍｇ/１００ｍｌ含む。黒米糖化液は、高濃度のＣ３Ｇを含有するだけでなく、糠に由来するグルコース、アミノ酸、ミネラルなども多量に含有する。ｐＨが高い場合は、必要に応じて食品や飲料に使用可能なクエン酸や乳酸等を用いて調整することもできる。
【００３４】
本発明方法はさらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程を含むことができる。
【００３５】
本工程において、工程（５）にて得られた黒米糖化液を加熱して酵素失活および殺菌をすることができる。例えば加熱温度は８０〜１００℃、好ましくは８０〜９０℃、さらに好ましくは８０〜８５℃である。
【００３６】
本発明は、本発明方法により製造された黒米由来のアントシアニンを含む組成物に関する。当該組成物は、黒米由来のアントシアニン、特にＣ３Ｇ、ならびにグルコース、アミノ酸、ミネラルなども多量に含有する。
【００３７】
一実施形態において、本発明の組成物は、飲食品であり得る。
【００３８】
飲食品の形態は、特に制限されず、本発明における組成物を各種飲料、食品、例えば、これらに限定されるものではないが、健康酢、スポーツドリンク、栄養剤、茶、酒類などの飲料、ヨーグルトなどの乳製品、クッキーなどの焼き菓子類、ジャムなどの加工食品、調味料、香辛料などに加工、添加又は配合することによって製造することが可能である。
【００３９】
また、本発明において、飲食品は、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品であり得る。
【００４０】
また、本発明の飲食品は、本発明の組成物の他、栄養補助成分などの他の成分を含むことができる。かかる成分には、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＫ、ナイアシン、パントテン酸、葉酸等）、カロチノイド（例えばβカロチン、リコピン、フコキサンチン等）、ミネラル類（例えば海藻成分、ＣＣＭ、ヘム鉄、鉄塩系、乳清カルシウム、発酵乳酸カルシウム、牛骨カルシウム、珊瑚カルシウム、卵殻カルシウム等）、各種植物体並びにその抽出物、精製物及び分画物（例えばオオバコ、クロレラ、スピルリナ、にんにく、いちょう葉、ギムネマ、杜仲の葉、しその葉、ハトムギ、大豆グロブリン、ルチン、緑茶抽出物、テアニン、ポリフェノール類、甘草、ユッカ、大豆サポニン、カフェイン、ホワトルベリーエキス、シャンピニオンエキス、ガルシニア・カンボジアエキス等）、微生物並びにその増殖因子及び微生物生産物（例えば乳酸菌、酵母、乳酸菌増殖因子等）、食物繊維及びその酵素分解物（例えばアップルファイバー、コーンファイバー、澱粉由来の食物繊維、難消化性デキストリン、グアガム酵素分解物、サツマイモ繊維、大豆繊維、海藻繊維、きのこ繊維、茶繊維、酸性多糖類、植物粘質物、小麦フスマ等）、動物体並びにその抽出物、精製物、分解物及び生産物（例えばローヤルゼリー、プロポリス、牡蠣エキス、キチン、キトサン、タウリン、コラーゲン、ゼラチン等）、各種オリゴ糖（例えばガラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、大豆オリゴ糖、フラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖等）、脂質（例えば不飽和脂肪酸（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、リン脂質、サラトリム等）、各種蛋白質及び蛋白分解物（例えばとうもろこし蛋白、大豆蛋白、ＴＭＰ（トータルミルクプロテイン）、ラクトアルブミン、カゼイン、ホエー、グルタチオン、大豆ペプチド、卵白ペプチド、グルタミンペプチド等）、脱脂胚芽等の小麦胚芽などが挙げられる。
【００４１】
本発明の組成物を飲食品として摂取する場合には、飲食品中の有効成分としての本発明のＣ３Ｇの含有量は、成人1人につき、1日当たり１〜２５０ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇさらに好ましくは５〜５０ｍｇの摂取量となるように摂取すればよい。
【００４２】
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００４３】
黒米のＣ３Ｇは、総アントシアニン量として５２０ｎｍ付近の吸光度で測定される場合もあるが、黒米抽出液の吸光度（５２０ｎｍ）とＣ３Ｇ含量は必ずしも一致しないため、ＨＰＬＣによって分離定量する必要がある。また、発酵により産生するクエン酸またはｐＨはＣ３Ｇの安定性に影響するため、把握する必要がある。各工程におけるＣ３Ｇ回収率の影響は未解明であるため、以下の実施例では課題となる工程を抽出し、その解決法について検討する。さらに、本発明による製法と従来製法の比較検討を行う。
【００４４】
実施例１：黒米エキスからのＣ３Ｇ精製
従来技術では黒米の色素はアントシアニンであり、アントシアニンは５２０ｎｍ付近の吸光度で測定されていたが、黒米の５２０ｎｍの吸光をもつ色素成分のうち、Ｃ３Ｇが主であることを確認するため、以下の検討を実施した。
【００４５】
黒米の含水エタノール抽出物「黒米エキス」（オリザ油化（株））４０ｇを０．２Ｎ ＨＣｌ８００ｍｌにて５５℃で１時間抽出し、遠心分離後の上清をエバポレーターで減圧濃縮し、２４０ｍｌの抽出液を得た。
【００４６】
これを陽イオン交換カラムに供し、ＡＫＴＡ（旧アマシャム社）を用いて精製した。陽イオン交換カラムは、陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００ＣＴ Ｎａ ０．６０−０．８５ ｍｍ（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｏｒｕｇａｎｏ（株））５００ｍｌを、内径５ｃｍ、高さ２０ｃｍのカラムに充填して用いた。洗浄には０．２Ｎ ＨＣｌ、溶出には５０％エタノール（含０．２Ｎ ＨＣｌ）を用い、流速は１５ｍｌ／ｍｉｎとし、約５０ｍｌずつ分取した。全ての操作は４℃冷蔵庫内で行った。
【００４７】
各フラクションについて５２０ｎｍの吸光度およびＣ３Ｇ含量を測定した。Ｃ３ＧはＨＰＬＣ−ＰＤＡ（（株）島津製作所）で分離定量した。カラムはＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−II；４．６×１５０ｍｍ（ナカライテスク（株））、移動相はＡ：１０％ギ酸、Ｂ：８０％メタノールおよび２０％移動相Ａ（１０％ギ酸）を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、０→２０ｍｉｎでＢ濃度５→７０％のリニアグラジェントで、５２０ｎｍの吸光度をモニターして分析した。５２０ｎｍの吸光度のうちＣ３Ｇが占める割合は、ＨＰＬＣで検出されたピークエリアを元に算出し、図１に示す。意外なことに、Ｃ３Ｇ以外にも５２０ｎｍの吸光度をもつ物質がかなり存在することが見出され、黒米のＣ３Ｇを温存するためには常にＨＰＬＣで分離定量する必要があると考えられた。従って、以下の実施例のＣ３Ｇの分析は全てＨＰＬＣ法で行った。
【００４８】
実施例２：各種麹菌と糖化液Ｃ３Ｇ含量
粉砕黒米を１２０℃で２０分間オートレーブにて蒸きょう、菌株保存機関および市販種麹メーカーから入手した焼酎用麹菌１７株（Ａ． ｋａｗａｃｈｉ、Ａ． ａｗａｍｏｒｉ）を０．１％の割合で接種し、品温３５℃、湿度８０％以上で４６時間培養した。得られた麹３０ｇに水６０ｍｌを加え、５５℃で６時間糖化し、固液分離後の上清を８５℃で１０分間酵素失活させ、糖化液を得た。
【００４９】
麹については５倍量の１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で菌体外酵素を抽出し、β―グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）活性をｐ−ニトロフェニル‐α‐グルコシド（ｐＮＰＧ）法で測定した。１ｍＭ ｐＮＰＧ基質、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて５０℃で１５分間反応させ、４１０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００５０】
糖化液についてはＣ３Ｇ、グルコースおよびクエン酸含量を測定した。Ｃ３Ｇは実施例１に示す方法で測定した。グルコースはグルコースＣIIテストワコー（和光純薬工業（株））を用いて測定した。クエン酸はＨＰＬＣ−電気伝導度検出器（（株）島津製作所）で分離定量した。カラムはＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＳＰＲ−Ｈ（（株）島津製作所）、移動相は５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、反応混合物は５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸および８０μＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、カラム温度は４０℃で測定した。結果を図３〜５に示す。
【００５１】
グルコース含量には大きな差は見られなかったため、いずれの株でも糖化反応は問題なく進んだと考えられる。実施例４以下では、Ｃ３Ｇ分解活性を持つＢｇｌ活性が比較的低く、Ｃ３Ｇおよびクエン酸含量が最も高かったＮｏ．１３株、すなわちヒグチモヤシの白麹菌（本格焼酎菌米用）を選抜して用いた。また、Ｎｏ．８株、すなわち（株）秋田今野商店の黒麹菌（マイルド）のＣ３Ｇ含量は中程度であるが、クエン酸含量およびＢｇｌ活性はＮｏ．１３と同程度であり、焼酎用麹菌であれば白麹菌でも黒麹菌でも利用可能であると考えられる。
【００５２】
実施例３：従来の製造工程の課題抽出と改善に向けた検討
従来の製造工程は、粉砕黒米の吸水工程、蒸きょう工程、製麹工程、糖化工程に分けることができる。黒米１００ｇに３６ｍｌの水を添加し、４時間吸水させ、１２０℃で２０分間蒸きょう、黒麹菌（Ｎｏ．８）を０．１％接種し、３５℃で４６時間培養した。麹に２倍量の水を添加し、５５℃で６時間糖化、固液分離後、９０℃で２０分間酵素失活させ、糖化液を得た。粉砕黒米、蒸きょう黒米および黒米麹のＣ３Ｇは、２０倍量の１Ｎ 塩酸を含む６０％含水エタノールで抽出してからＨＰＬＣで分離定量した。結果を図６に示す。吸水工程ではＣ３Ｇの損失は見られなかったが、蒸きょう工程では約９割、製麹工程では約１割のＣ３Ｇの損失が見られた。また、糖化工程では麹中のＣ３Ｇのうち、約３割しか回収できていないことが判明した。従って、蒸きょう工程および糖化工程が改善すべき重要な工程であると考えられる。
【００５３】
蒸きょう工程の問題点として、Ｃ３Ｇを中性ｐＨ条件化において高温で長時間保持していることが考えられる。「最良の形態」でも述べたとおり、Ｃ３Ｇは中性水溶液中では不安定であるが、酸性水溶液中では比較的安定であることが知られている。そこで、本検討では蒸きょうの際、通常は水を吸水させる替わりにクエン酸水溶液を吸水させたところ、Ｃ３Ｇ残存率を大幅に上げられることを見出した。すなわち、黒米糠１ｇに対し、１％量（Ｖ／Ｗ）の０，１，５，２０％クエン酸水溶液を吸水後、１００℃で２０分間オートクレーブ内にて保持した結果、Ｃ３Ｇ残存率は、クエン酸濃度０％では０．７８％であったが、クエン酸濃度依存的に増加し、クエン酸濃度２０％では３５．０％のＣ３Ｇが残存し、約４５倍も向上した（図７）。しかしながら、さらにＣ３Ｇ回収率を上げるには、蒸きょう工程にＣ３Ｇが存在することは不利であると考えられる。
【００５４】
従来の糖化工程における問題点として、一つ目に、特開平４−５８８７８からも推定されるように、Ｃ３Ｇを含有する黒米糠以外に麹由来の固形物が多量に共存し、糖化残渣にＣ３Ｇが吸着してしまうことが考えられる。まず、麹に含まれる主な固形物としては、米由来のデンプン、麹菌の菌体および胞子が挙げられる。そこで、黒米２．４ｇに対し、２％クエン酸水溶液３２ｍｌ加え、デンプン、胞子および菌体の有無によるＣ３Ｇ回収量の変化について検討した。その結果、デンプン、胞子および菌体いずれもＣ３Ｇの回収率を低下させた（図８〜１０）。一方、可溶性のデンプンではＣ３Ｇの回収率は低下しなかったため、Ｃ３Ｇは麹の固形物に吸着してしまうことが推測され、固液分離の有効性が示唆された。次に、実際の麹に含まれると推定される量のデンプン、胞子および菌体のうち、どれが最もＣ３Ｇ回収の妨げになっているか検討した。黒米４ｇ、デンプン源の粉砕搗精黒米７．２ｇ、胞子源の種麹１１１ｍｇおよび菌体４０ｍｇに対し、黒米麹から調製した水麹（菌体外酵素抽出液）９６ｍｌを加え、５５℃で６時間保持した。このとき、粉砕搗精黒米を除いたもの、種麹を除いたもの、菌体を除いたものを比較した。対照として、黒米４ｇに対して２％クエン酸水溶液９６ｍｌを加えて５５℃、６時間保持したものを用いた。その結果、粉砕搗精黒米を除いたものでＣ３Ｇ回収率の低下が大幅に改善された（図１１）。したがって、実際の糖化では菌体および胞子の影響が小さいこと、麹に多量に存在するデンプンを十分に分解するため、糖化力が高い麹が必要であることが考えられた。さらに、それでも残存する糖化残渣とＣ３Ｇが存在することは不利であると考えられた。
【００５５】
従来の糖化工程における問題点として、二つ目に、麹菌が生産するＢｇｌによりＣ３Ｇが酵素分解を受けていることが考えられる。まず、Ａ． ｎｉｇｅｒ由来のＢｇｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）のＣ３Ｇ分解活性を確認した（図１２）。続いて、ｐＮＰＧ基質を用い、グルコースによるＢｇｌ活性の阻害効果を調べた。その結果、グルコース濃度依存的にＢｇｌ活性は減少し、グルコース濃度５．４％では、Ｂｇｌ活性は２％以下に減少した（図１３）。従って、グルコース濃度が１０％以上に達する糖化液において、Ｂｇｌはほとんど活性がなく、ＢｇｌによるＣ３Ｇ分解の影響はきわめて小さくなると考えられる。
【００５６】
以上のことから、糖化工程において、糖化残渣を固液分離により除いてからＣ３Ｇ添加することが有効と考えられた。また、このときのＣ３Ｇ供給源は、蒸きょう工程の前に黒米を精米し、その黒米糠を固液分離後の糖化液に添加することで、黒米全体を利用しつつもＣ３Ｇを最も効率良く回収可能と考えられた。
【００５７】
実施例４：搗精黒米麹糖化液による黒米糠Ｃ３Ｇ抽出と糖化
実施例３の結果を踏まえ、本発明では原料黒米の精米工程、搗精黒米の製麹工程、糖化工程、固液分離後の糖化液による黒米糠の抽出工程から成り、Ｃ３Ｇおよび黒米のその他栄養成分を効率回収する製造方法を提供する。
【００５８】
まず、黒米（朝紫品種）９．４６ｋｇを精米機で精米し、搗精黒米８．２６ｋｇと黒米糠１．１７ｋｇを得た。精米歩合は８７．３１％であった。得られた搗精黒米を水に３０分間浸漬、１００℃で５０分間蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、白麹菌（Ｎｏ．１３）を接種して、２４時間３７℃、さらに１９時間３３℃で培養して搗精黒米麹を製造した。搗精黒米麹はクエン酸と糖化酵素を多量に含んでいた。麹は乾燥させてから保存した。
【００５９】
次に、この搗精黒米麹に５．７倍量の水を加え、５５℃で６時間糖化した。その後遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して糖化液を得た。
【００６０】
糖化液に精米工程で得た黒米糠を１．６７％（Ｗ／Ｖ）添加し、５５℃で２時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して黒米のＣ３Ｇ（アントシアニン）を多量に含む黒米糖化液を得た。このとき、Ｃ３Ｇの回収率は６７．３３％であった。さらに、糖化液中の酵素活性が残存しているため、従来技術の有機溶媒による抽出と異なり、黒米糠のデンプンやタンパク質が分解され、グルコースおよびアミノ酸含量が増加した（図１４，１５）。ｐＨは３．６であった。
【００６１】
続いて、糖化液に対する黒米糠の添加量（Ｗ／Ｖ）とＣ３Ｇ回収率の関係を調べた。添加量を１，２．５，５，１０％として５５℃で１時間抽出したところ、添加量依存的にＣ３Ｇ回収率は減少したが、添加量１％のときは約７１％のＣ３Ｇを回収することができた（図１６）。
【００６２】
さらに、黒米糠の抽出時間とＣ３Ｇ回収率の関係を調べたところ、Ｃ３Ｇ回収率は1時間抽出で６０％程度、２時間抽出で６５％程度となった。２時間以降は徐々に減少していき、４時間抽出で６０％程度になった（図１７）。したがって、抽出時間が長すぎるとＣ３Ｇが損失する可能性が示唆された。また、アミノ態窒素は３時間程度まで増加したが、２時間までの増加に比べるとわずかであった（図１８）。グルコースおよびクエン酸濃度はほとんど変わらなかった。以上より、黒米糠からの抽出は５５℃で２時間程度が最良と考えられた。
【００６３】
酵素反応の停止および殺菌目的で得られた黒米糖化液を加熱することができる。Ｃ３Ｇ濃度５．９７ｍｇ／１００ｍｌ、ｐＨ３．８の黒米糖化液を用い、７０，８０，９０，９９．９℃で１０，２０，３０，６０分間加熱後、Ｃ３Ｇ濃度を再度測定した。その結果、７０℃で３０分間、８０℃で２０分間、９０℃で１０分間の加熱では、Ｃ３Ｇの損失は１０％未満であった（図１９）。本黒米糖化液においてＣ３Ｇは比較的安定であると考えられる。また、ｐＨが４．０以下であるため、本発明ではＣ３Ｇを損失することなく必要な加熱殺菌が可能であると考えられる。
【００６４】
比較例１：本発明と従来製法の比較
精米歩合が８７．３１％の搗精黒米５００ｇを洗米し、１５分間浸漬、水分測定後、不足した水を添加して２時間吸水させ、水分量を約３３％に調整した。精米を行っていない同じロットの黒米２００ｇを粗粉砕し、水を６６ｍｌ添加して２時間吸水させた。搗精黒米および粉砕黒米を１２１℃で１５分間オートクレーブにて蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、白麹菌（Ｎｏ．１３）を接種して３７℃で２４時間、３３℃で１９時間、シャーレ内で培養した。手入れは３回行い、乾燥させて保存した。
【００６５】
乾燥させた搗精黒米麹および粉砕黒米麹それぞれ２５ｇに対し、５倍量（Ｖ／Ｗ）加え、５５℃で６時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して糖化液を得た。
【００６６】
搗精黒米糖化液には精米工程で生じた４．４％（Ｗ／Ｖ）の黒米糠を添加し、５５℃で２時間保持し、遠心分離および濾紙ろ過により固液分離して搗精黒米黒米糖化液を得た。ｐＨは３．５であった。
【００６７】
搗精黒米および粉砕黒米糖化液を８０℃で２０分間保持して酵素失活後、０．２２μｍフィルター濾過後、成分分析に供した。
【００６８】
本発明（搗精黒米糖化液）と従来製法（粉砕黒米糖化液）を比較すると、グルコース、アミノ酸、クエン酸ついては大きな差は見られなかったが、Ｃ３Ｇ回収率については、本発明の方が、従来製法に比べて１０．４倍高く、本発明の有効性が確認された（以下の表１および図２０）。
【００６９】
【表１】
【００７０】
本比較例では糠添加率が４．４％（Ｗ／Ｖ）と高いためＣ３Ｇ回収率は４５％に止まったが、実施例４に示したように、黒米糠を添加する糖化液量を増やすことで、さらなるＣ３Ｇ回収率の向上が可能である。糖化液量を増やすには、搗精黒米麹に市販の白米麹をブレンドして糖化のスケールを大きくしても良いし、単純に食品、飲料用のクエン酸水溶液等を加水して用いても良い。
【００７１】
実施例５：３０Ｌパイロットプラントスケールでの製造
黒米（朝紫品種）１９．６８ｋｇを精米し、搗精黒米１６．７８ｋｇと糠２．５３ｋｇとが得た。精米歩合は８５．２６％であった。得られた搗精黒米を水に６０分間浸漬、無圧で５０分間蒸きょう、４０〜５０℃まで放冷後、小型円形自動製麹機に盛り込み、焼酎用白麹菌（本格焼酎米用）を接種して、２４時間３７℃、さらに１９時間３３℃で培養して搗精黒米麹を製造した。搗精黒米麹のクエン酸と糖化酵素は若干少なかった。麹は乾燥させてから保存した。
【００７２】
乾燥させた搗精黒米麹６ｋｇに対し、３０Ｌの水を加え、５０Ｌジャーファーメンターにて５５℃で１８時間保持した。
【００７３】
糖化液の約半分を振動篩法により濾過を行ったところ、液量回収率は９３．５％であった。残りの約半分を濾布法により濾過を行ったところ、液量回収率は９３．８％であった。合計で３１．１Ｌの糖化液を回収した。いずれの方法でも濾過は可能であった。
【００７４】
３１．１Ｌの糖化液に対し、黒米糠を６００ｇ（１．９３％、Ｗ／Ｖ）添加、５５℃で２時間保持後、糖化液と同様に濾過を行った。振動篩法および濾布法の液量回収率は、それぞれ９４．０％および９５．７％であり、合計２９．６Ｌの黒米糖化液を回収した。黒米糠の濾過についても、いずれの方法でも濾過は可能であった。
【００７５】
黒米糖化液を５０Ｌジャーファーメンターにて８０℃で２０分間保持した。その後成分分析を行うまで凍結保存した。
【００７６】
濾過前の黒米糖化液のＣ３Ｇ濃度は１４．６５ｍｇ／１００ｍｌであった。振動篩濾過後は１４．４２ｍｇ／１００ｍｌ、濾布濾過後は１５．２４ｍｇ／１００ｍｌであり、濾過による損失はみられなかった。このとき、黒米糠からのＣ３Ｇ回収率は６４．１％であった。殺菌工程においては８．３％のＣ３Ｇの損失がみられた。グルコース濃度は１４．２１ｇ／１００ｍｌ、クエン酸濃度は０．４１ｇ／１００ｍｌ、アミノ酸含量は４７０ｍｇ／１００ｍｌであった。
【００７７】
以上より、本発明は３０Ｌパイロットプラントスケールでも有効な製造方法であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明方法により、黒米に由来するアントシアニン、特にＣ３Ｇ、ならびにその他の栄養成分を多く含む組成物を製造することが可能であり、機能性食品・飲料素材の製造に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、Amberlite 200CT(陽イオン交換)を用いて精製した,各フラクションについて520nmの吸光度およびＣ３Ｇ含量の測定結果を示す。
【図２】図２は、各焼酎用麹菌株におけるBgl活性の測定結果を示す。
【図３】図３は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のＣ３Ｇ含量の測定結果を示す。
【図４】図４は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のグルコース含量の測定結果を示す。
【図５】図５は、各焼酎用麹菌株を用いて作製した糖化液中のクエン酸含量の測定結果を示す。
【図６】図６は、従来技術の各工程におけるＣ３Ｇ残存率の測定結果を示す。
【図７】図７は、蒸きょう工程における、クエン酸の存在によるＣ３Ｇ残存率への影響を測定した結果を示す。
【図８】図８は、糖化工程における、デンプンの存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図９】図９は、糖化工程における、胞子の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、糖化工程における、菌体の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、糖化工程における、各麹構成物の存在によるＣ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１２】図１２は、糖化工程における、BglによるＣ３Ｇ分解による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、糖化工程における、グルコースの存在によるBgl活性への影響を測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、黒米糠の添加の前後における、糖化液中のグルコース含量の測定結果を示す。
【図１５】図１５は、黒米糠の添加の前後における、糖化液中のアミノ酸含量の測定結果を示す。
【図１６】図１６は、糖化液に対する黒米糠の添加量による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１７】図１７は、黒米糠の抽出時間による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図１８】図１８は、黒米糠の抽出時間による、糖化液中のアミノ態窒素含量への影響を測定した結果を示す。
【図１９】図１９は、黒米糖化液の加熱温度による、Ｃ３Ｇ回収率への影響を測定した結果を示す。
【図２０】図２０は、本発明方法と従来法による、Ｃ３Ｇ回収率の比較結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
搗精黒米から麹を作製して糖化し、その糖化液に黒米の糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンに富む黒米糖化液を得ることを含む、黒米由来のアントシアニンを含む組成物を製造する方法。
【請求項２】
以下の工程を包含する、請求項１記載の方法：
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程；
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程；
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程；
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程；および
（５）得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程。
【請求項３】
アントシアニンが、シアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（Ｃ３Ｇ）である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（１）において、黒米を８０〜９５％の精米歩合で精米する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程（２）において、麹菌が、焼酎用麹菌である、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
麹菌が、クエン酸高生産性、かつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）低活性性である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程（２）において、麹菌を接種して、２８〜４０℃にて４０〜７２時間培養を行う、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（３）において製造される糖化液が、１０〜３０％（Ｗ／Ｖ）のグルコースおよび、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）のクエン酸を含有する、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（３）において、糖化液を濾過して不水溶性の物質を除去する、請求項２〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
不水溶性の物質が、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、またはそれらの混合物を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（４）において、ｐＨ２．０〜５．０、２５〜６０℃にて、１〜１０時間、抽出処理する、請求項２〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程（５）にて得られる黒米糖化液がまた、糠由来の糖、アミノ酸、ミネラルを含有する、請求項２〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
さらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程、を含む、請求項２〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法により製造された、アントシアニンに富む黒米糖化液を含む組成物。
【請求項１５】
組成物が飲食品である、請求項１４項記載の組成物。
【請求項１６】
飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
栄養補助成分をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１】
搗精黒米から麹を作製して糖化し、その糖化液に黒米の糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンに富む黒米糖化液を得ることを含む、黒米由来のアントシアニンを含む組成物を製造する方法。
【請求項２】
以下の工程を包含する、請求項１記載の方法：
（１）黒米を精米して、搗精黒米と糠とに分離する工程；
（２）搗精黒米を蒸きょうし、麹菌を加えて培養して、麹を製造する工程；
（３）麹から麹糖化液を製造して、それを濾過する工程；
（４）濾過した糖化液に工程（１）で得た糠を加えて抽出処理し、これによりアントシアニンを含む糖化液を得る工程；および
（５）得られた糖化液を濾過して、黒米糖化液を得る工程。
【請求項３】
アントシアニンが、シアニジン−３−Ｏ−β―グルコシド（Ｃ３Ｇ）である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程（１）において、黒米を８０〜９５％の精米歩合で精米する、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程（２）において、麹菌が、焼酎用麹菌である、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
麹菌が、クエン酸高生産性、かつβ−グルコシダーゼ（Ｂｇｌ）低活性性である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程（２）において、麹菌を接種して、２８〜４０℃にて４０〜７２時間培養を行う、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（３）において製造される糖化液が、１０〜３０％（Ｗ／Ｖ）のグルコースおよび、０．５〜３．０％（Ｗ／Ｖ）のクエン酸を含有する、請求項２〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（３）において、糖化液を濾過して不水溶性の物質を除去する、請求項２〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
不水溶性の物質が、デンプン、糠固形分、麹菌の菌体および胞子、またはそれらの混合物を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
工程（４）において、ｐＨ２．０〜５．０、２５〜６０℃にて、１〜１０時間、抽出処理する、請求項２〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程（５）にて得られる黒米糖化液がまた、糠由来の糖、アミノ酸、ミネラルを含有する、請求項２〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
さらに、（６）黒米糖化液を加熱して、酵素失活および／または殺菌を行う工程、を含む、請求項２〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法により製造された、アントシアニンに富む黒米糖化液を含む組成物。
【請求項１５】
組成物が飲食品である、請求項１４項記載の組成物。
【請求項１６】
飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示を付した飲食品である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
栄養補助成分をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１０−１５４７６８（Ｐ２０１０−１５４７６８Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３３６１１（Ｐ２００８−３３３６１１）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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