３量体サイトカイン用の３量体結合タンパク質
本発明は、３量体サイトカインに結合する３量体結合単位の提供に関する。特に、３量体サイトカインを結合する能力を有する結合成員を伴う３つの単量体及び３量体ドメインを含む３量体ポリペプチドが提供されている。好ましくは、該３量体結合単位は、結合時点で、３量体サイトカインの全てのレセプタ結合部位が実質的に遮断され、ひいては３量体サイトカインの潜在的生物活性が抑制されるような形で結合する。１つの態様においては、本発明は、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦといったような腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの３量体サイトカインに結合する能力を有する３量体結合剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３量体サイトカインに結合する３量体結合タンパク質の提供に関する。特に、結合時点で、３量体サイトカインの全てのレセプタ結合部位が実質的に遮断され、ひいては３量体サイトカインの潜在的生物活性が抑制されるような形で結合する３量体結合剤が提供されている。１つの態様においては、本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含めた腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーのサイトカインに結合する能力を有する３量体結合剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、細胞内シグナル伝達を担いその他の細胞の成長、分割及び機能に影響を及ぼす高等真核生物由来の小さい分泌ポリペプチドである。これらは、例えば対応するレセプタを介して局所的又は全身的細胞内調節因子として作用し、従って免疫性、炎症、及び造血（骨髄中の血球の形成及び発達）といったような数多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす、効能のある多面発現ポリペプチドである。サイトカインは、繊維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球及びリンパ球を含めたさまざまな細胞型によって産生される。今日までに、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン及びリンフォカインを含め、多数のサイトカインが同定されてきた。これらは、特殊な腺によってではなくむしろ一定数の組織又は細胞型によって産生されるという点において、従来のホルモンとは異なっている。
【０００３】
サイトカイン−レセプタ相互作用の変調は、さまざまな疾病及び病理における治療的介入のための有用なメカニズムであり得る。サイトカインと相互作用し得る可溶性結合タンパク質は、レセプタから離れるようにサイトカインを潜在的に封鎖し、かくして、その特定のレセプタ経路の活性化を低減又は防止することができる。
【０００４】
或る種のサイトカインは、同じサブユニットの多数のコピーを含むマルチ−サブユニット複合体として発生する。マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ＴＮＦＬＳＦ成員２）及びリンフォトキシンアルファ（ＬＴ−アルファ；ＴＮＦＬＳＦ成員１）といったような腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＬＳＦ）内のタンパク質は、３つの同一のサブユニットにより形成されたホモ３量体として発生する。これらの３量体サイトカインの多くは、シグナル伝達に関与し調節因子として作用し、又数多くの異なるタイプの疾病及び医学的適応に関与するものとして知られている。
【０００５】
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの３量体サイトカインは、複数のレベルで免疫及び炎症性応答を制御し組織化するものとして知られている。同様に、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの成員が、急性又は慢性炎症性身体条件といったいくつかの疾病身体条件に関連づけされていることも知られている。現在、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーはＬＴＡ（リンフォトキシンアルファ；ＴＮＦＬＳＦ成員１）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：ＴＮＦＬＳＦ成員２）、ＬＴＢ（リンフォトキシンベータ；ＴＮＦＬＳＦ成員３）；ＯＸ−４０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員４）；ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員５）；ＦａｓＬ（ＴＮＦＬＳ成員６）；ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員７）；ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員８）；４−１ＢＢ−Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員９）；ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１０）；ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＬＳ成員１１）；ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳ成員１２）；ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１３）；ＢＡＦＦ（ＴＮＦＬＳ成員１３Ｂ）；ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＬＳ成員１４）；ＶＥＧＩ（ＴＮＦＬＳ成員１５）；及びＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＬＳ成員１８）を含む少なくとも１７の認知されたリガンドを有する。
【０００６】
ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの３量体サイトカイン及びその対応するレセプタのシグナリング単位が、単一のサイトカイン３量体が３つのレセプタ分子に結合している６量体複合体として組立てられた３つのレセプタと３つのリガンドの形をしているという証拠が存在している（非特許文献１）。この６量体複合体の一部となる前に、レセプタは単量体形態で存在する。この一般的メカニズムについては図１で例示されている。
【０００７】
ＴＮＦ（ＴＮＦＬＳＦ成員２）は、免疫及び炎症性応答の主たる媒介物質の１つであり、例えば、ヒト集団の約０.５〜１％に影響を及ぼす一般的な自己免疫炎症性疾患である関節リウマチの病因において重要な役割を果たしているものとして知られている。さらにＴＮＦは同様に、内毒素ショック、脳マラリア及び移植片対宿主反応を含めた広範囲の疾病状態の病因に関与するものとしても知られている。ＴＮＦは、多数の細胞型、主として活性化されたマクロファージにより産生される。ＴＮＦの可溶性形態は、３つの同一の１７ｋＤのタンパク質サブユニットから成り、一方膜結合形態は３つの同一の２６ｋＤのサブユニットで構成されている。ＴＮＦは同様に、従来「ＴＮＦ−アルファ」及び「カケクチン」として知られている。
【０００８】
ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳＦ成員１２）は最近になって、ピコモル濃度のＴＷＥＡＫが正常な内皮細胞の増殖を促進すること及びＴＷＥＡＫがインビボラット角膜モデル内で血管形成を誘発することが考察されたため（非特許文献２）、血管形成（血管の形成と成長）の直接的かつ強い誘発物質であることが発見された。特に、血管形成は、中実腫瘍の成長及び永続及びその転移にとって不可欠であり、それは又糖尿性網膜症、乾癬、接触性皮ふ炎及び再狭窄といったようなその他の病的身体条件に関与するものとしても知られている。
【０００９】
特許文献１において、３量体サイトカインＢＡＦＦ（ＴＮＦＬＳ成員１３Ｂ）は、Ｂ細胞同時刺激を目的としてＴ細胞及び樹状細胞によって発現されるものとして記述されており、その結果、Ｂ細胞機能の制御において重要な役割を果たすことができる。そこでは、ＢＡＦＦ及びそのレセプタが抗ガン及び免疫調節の利用分野ならびにＨＩＶといったような免疫抑制性疾患の治療のための用途を有し得るということが示唆されている。
【００１０】
ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１３）は、レセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ及びＴＮＦＲＳＦ１７に結合する３量体サイトカインである。最近になって、さまざまな腫瘍細胞に対する組換え型ＡＰＲＩＬの付加がそれらの増殖を刺激し、ひいてはＡＰＲＩＬが腫瘍細胞成長の調節に関与しうるということが示されてきた（非特許文献３）。ＡＰＲＩＬが単球／マクロファージ媒介免疫原性プロセスにも関与しうるということも示唆されてきた。
【００１１】
さらに、ＴＮＦスーパーファミリー内のサイトカインが、高ＩｇＭ症候群、Ｉ型自己免疫リンパ増殖症候群、ＴＮＦ−Ｒ１関連間欠熱症候群、発汗減少性外胚葉性形成異常及び家族性拡張性骨溶解といったような遺伝性疾病に関与するものとしても記述されてきた。
【００１２】
特異的３量体サイトカインに結合し、かくして３量体サイトカインが例えば細胞膜結合レセプタに結合するのを防ぎ従ってその特定のレセプタ経路の活性化を抑制する能力を有する、３量体サイトカイン用の適切なアンタゴニスト及び結合剤を発見し開発するため、いくつかの試みがなされてきた。
【００１３】
１つの例としては、３量体サイトカインＴＮＦ（ＴＮＦＬＳＦ成員２）に対するアンタゴニストがある。現在、２つのタイプのＴＮＦアンタゴニスト、すなわち、共に関節リウマチの治療のため米国及び欧州で販売承認を受けたインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））及びエタナルセプト（Ｅｔｅｒｎａｒｃｅｐｔ）（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ））が市販されている。これら２つの製品は同様に、乾癬及びクローン病の治療に有効であることも示されてきた。インフリキシマブは、ＴＮＦの可溶性及び膜内外形態に結合することによってＴＮＦの生物学的活性を中和しＴＮＦとそのレセプタの結合を阻害する、マウス可変領域及びヒトＩｇＧ１及び定常領域を伴うキメラ抗体である。インフリキシマブの構造は、天然に発生する抗体のものに類似している。エタナセプト（Ｅｔｅｒｎａｃｅｐｔ）は、ｐ７５ＴＮＦレセプタの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃドメインから成る融合タンパク質である。
【００１４】
３量体サイトカインに対するアンタゴニストのもう１つの例が、３量体サイトカインＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳ成員１２）に対するモノクローナル抗体を開示する特許文献２の中で記されている。抗体は移植片対宿主反応の進行を遮断することができる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２００３７８５２Ａ１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／４２０７３号パンフレット
【非特許文献１】ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ら、２００２年、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７（１）、ｐ１９−２６
【非特許文献２】リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、１９９９年、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４（１３）ｐｐ．８４５５−８４５９
【非特許文献３】ハーン Ｍ（Ｈａｈｎｅ Ｍ．）ら、１９９８年；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−１１９０
【００１５】
しかしながら、現在既知の３量体サイトカインに対する結合剤及び阻害剤製品で遭遇する一般的な技術的問題は、３量体サイトカインと結合剤又は阻害剤製品の１：１の複合体の形成時点で、３つのレセプタ結合部位のうちの少なくとも１つ又は２つが開放状態に残されることから、３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位の全てが有効に遮断されるわけではないという点にある。開放したサイトカインレセプタ結合部位は対応する細胞表面サイトカインレセプタと会合することができ、そのため、細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して、サイトカインレセプタのさらなる動員を開始しレセプタシグナリングを媒介し得る。
【００１６】
該問題点は、ＴＮＦ３量体と１：１の複合体を形成する２価の分子であるＴＮＦ結合剤エタナセプトにより、明白に例示される。エタナセプトがＴＮＦに結合するとき、考えられる３つのレセプタ結合部位のうちの２つのみがエタナセプト分子によって占有され、第３のレセプタ結合部位は開放状態に残される。このことはすなわち、開放したＴＮＦレセプタ結合部位が、細胞表面ＴＮＦレセプタと会合でき、そのため、細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して、ＴＮＦレセプタのさらなる動員及びそれによるシグナル伝達を開始しうる、ということを暗示している。この問題は、図２で例示されている。
【００１７】
同じ問題は、ＴＮＦ結合剤インフリキシマブでも見られる。各々のインフリキシマブ分子は、一定の与えられたＴＮＦ分子の１つのレセプタ結合部位（サブユニット）を結合する能力しかもたず、従って２つの開放したレセプタ結合部位を残す。これらの開放したレセプタ結合部位はその後、対応する遊離レセプタを会合して、結果としてＴＮＦレセプタのさらなる動員及びレセプタシグナリングをもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
現在、本発明人らにより、３量体ドメインに対する３量体サイトカイン用の結合単位（結合剤）の１つの融合としてみなされる融合タンパク質（プロトマー）の提供によって上述の技術的問題を克服することができる、ということが発見されてきた。本発明の融合タンパク質は、３量体タンパク質として、３量体サイトカインと１：１の複合体を形成すると同時に好ましくは３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位の全てを有効に結合させる能力をもち、そのため開放状態のレセプタ結合部位はひとつも残されず、従って細胞表面に対するサイトカインのドッキングを阻害することができる。かくして、今や、現在既知の３量体サイトカインアンタゴニストと比べてさらに効果的に３量体サイトカインの生物活性を阻害し中和する能力を有するという利点をもつ融合タンパク質が提供されている。本発明に従った融合タンパク質のさらなる利点は、医薬品として応用された場合に、治療効果を得るために、現在既知の３量体サイトカイン用結合剤に比べて少ない量の融合タンパク質しか必要とされない、という点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、本発明は、第１の態様において、３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含みかつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチドに関する。
【００２０】
さらなる態様においては、本発明に従った３量体ポリペプチドを含む医薬組成物が提供されている。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、腫瘍壊死因子といったような３量体サイトカインにより媒介される病理を有する被験者に対し本発明に従った３量体ポリペプチドを有効量投与することによって、該被験者を治療する方法に関する。
【００２２】
最後に、本発明に従った３量体ポリペプチドの調製方法ならびに、試料中の３量体ポリペプチドサイトカインの検出用検定方法が提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
一態様においては、本発明は、好ましくは結合時点で３量体サイトカインの全てのレセプタ結合部位が実質的に遮断されかつ／又は中和され、ひいては３量体サイトカインの潜在的な生物活性が抑制されるか又は中和されるような形で、３量体サイトカインに結合する能力を有する３量体結合剤を提供している。従って、３つの単量体を含む３量体ポリペプチドにおいて、各単量体が３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を含みかつ各単量体が３量体化ドメインを含む、３量体ポリペプチドが提供されている。
【００２４】
この状況下で、「３量体サイトカイン」という語は、１つの細胞によって産生され分泌され、例えばその細胞の成長、分割及び／又は機能に影響を及ぼすことによって、そのサイトカインのためのレセプタを有する１つの細胞内で特異的応答を惹起する、小さいタンパク質及びそのフラグメントを意味する。「３量体の」という語は、本書では、３つのサブユニット、好ましくは３つの同一サブユニットを含有するマルチ−サブユニット複合体（単独３量体）として本発明に従ったサイトカインが発生することを記すために用いられている。
【００２５】
このような３量体サイトカインの標準的な例としては、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＦＬＳＦ）内のサイトカインがある。現在、上述の通り、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーは、レセプタ結合を担う「ＴＮＦ相同性ドメイン」（ＴＨＤ）として知られている保存された３量体Ｃ末端ドメインを全て共有している少なくとも１７の認識されたリガンドを有する。この３量体ドメインの配列同一性は、ＴＮＦファミリー成員間で約２０〜３０％である。ＴＨＤは、ボッドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ら、２００２、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７（１）、ｐ１９〜２６内で図２に例示されている芳香族及び疎水性残基の保存された枠組を含有する１５０のアミノ酸長配列である。従って、ここで、「腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの成員」は、ＴＮＦ相同性ドメイン、ＴＨＤを含む３量体タンパク質を意味するように意図されている。現在既知のＴＮＦリガンドスーパーファリミリー内の３量体サイトカインが下表１に、同義語及びその対応するジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ、国立バイオテクノロジー情報センタ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ）と合わせて列挙されている。本書で使用されている通りのＴＮＦリガンドスーパーファリミリー用の命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ／ｔｎｆｔｏｐ．ｈｔｍｌで見出すことのできる公式ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）命名法に準じている。
【００２６】
【表１】
【００２７】
従って、本発明の１つの有用な実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドは、ＬＴＡ；ＴＮＦ；ＬＴＢ；ＴＮＦＳＦ４；ＴＮＦＳＦ５；ＴＮＦＳＦ６；ＴＮＦＳＦ７；ＴＮＦＳＦ８；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０；ＴＮＦＳＦ１１；ＴＮＦＳＦ１２；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＲＳＦ Ｆｎ１４；ＴＮＦＳＦ１５及びＴＮＦＳＦ１８の中から選択された腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの一員である３量体サイトカインを結合する能力を有する。
【００２８】
本書で用いられる「特異的結合成員」という語は、互いに結合特異性をもつ分子対の一員を意味している。特異的結合対の成員は、天然に誘導されていても、又全体的又は部分的に合成的に産生されていてもよい。分子対の一成員は、その対のもう一方の成員の特定の空間的及び極性組織に特異的に結合し従ってそれに対し相補的であるその表面上の一部域又はキャビティを有する。かくして、その対の成員は、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対のタイプの例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプタ、リガンド−リガンドレセプタ、酵素−基質がある。特異的結合対のその他の例としては、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列（標的核酸配列を検出するべくＤＮＡハイブリダイゼーション検定内で使用されるプローブ及び捕捉核酸配列を含む）、組換え型方法によって形成されるものを含む相補的ペプチド配列、エフェクタ及びレセプタ分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害物質及び酵素、などが含まれる。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合成員の類似体又はフラグメントである成員を含むことができる。
【００２９】
有用な実施形態においては、３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員は、好ましくは表面プラズモン共鳴により決定される１×１０−８Ｍ以下の３量体サイトカインに対する結合親和力（Ｋｄ）を有する本発明に従った３量体ポリペプチドを提供する。その他の有用な実施形態においては、Ｋｄ値は１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、さらには１×１０−１５Ｍ未満でさえある。さらなる有用な実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドについてのＫ−ｏｆｆ速度は、表面プラズモン共鳴で決定されて、１×１０−３Ｓ−１未満例えば、１×１０−５Ｓ−１を含め１×１０−４Ｓ−１未満、さらには１×１０−６Ｓ−１未満である。本書に使用される「Ｋ−ｏｆｆ」という語は、特異的結合成員／３量体サイトカイン複合体からの特異的結合成員の解離のためのｏｆｆ速度定数を意味するように意図されている。本書で使用される「表面プラズモン共鳴」という語は、例えばＢＩＡコアシステム（ファーマシア、バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）ＡＢ、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）を用いたバイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の改変の検出によって実時間生物特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象を意味している。さらなる記述については、実施例１０を参照のこと。
【００３０】
以上で記した通り、本発明に従った３量体サイトカイン結合剤が、３量体サイトカインの生物活性を少なくとも部分的に又は完全に遮断、阻害又は中和することが好まれる。本書で使用されている通り、「中和する」又は「中和」という表現は、インビボ又はインビトロで測定される通りの３量体サイトカインの生物活性の阻害又は低減を意味している。
【００３１】
有用な実施形態においては、特異的結合成員は、腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの１成員から誘導されたポリペプチドである。現在のところ、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内で少なくとも２９のレセプタが知られており、下表２に、同義語及びその対応するジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ、国立バイオテクノロジー情報センタ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ）と合わせて列挙されている。本書で使用されている通りのＴＮＦレセプタスーパーファミリーの成員用の命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ／ｔｎｆｔｏｐ．ｈｔｍｌで見い出すことのできる公式ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）命名法に準じている。
【００３２】
【表２】
【００３３】
かくして、有用な実施形態においては、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内のレセプタから誘導された特異的結合成員は、レセプタＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＬＴＢＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２２、及びＴＮＦＲＳＦ２３の中から選択される。しかしながら、このタンパク質ファミリー内でさらなる有用なレセプタ、ひいてはさらなる官能的特異的結合成員を同定することができるということも考慮されている。
【００３４】
有用な実施形態においては、ＴＮＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦｒＩ、ｐ５５レセプタ）及び／又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦｒＩＩ、ｐ７５ＴＮＦレセプタ）から、特異的結合成員が誘導される。特に、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ及びそのサブユニットは、ＴＮＦを特異的に結合し中和するために有効であることが証明された。一例としては、ＴＮＦ結合タンパク質エタナセプト（Ｅｔｅｒｎａｃｅｐｔ）は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタの細胞外ドメインから成る融合タンパク質、すなわちＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタのサブユニットである。従って、特定の実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドは、米国特許第５，７１２，１５５号明細書で開示されているＴＮＦＲＳＦ１ＢレセプタフラグメントといったようなＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ（ＴＮＦｒＩＩ）のサブユニット又はフラグメントである特異的結合成員を含んでいる。かくして、有用な実施形態においては、特異的結合成員は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）の中から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３５】
さらなる有用な実施形態においては、以下の実施例に開示されているように、特異的結合成員は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦｒＩＩ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）の中から選択されたＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドといったような、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ（ＴＮＦｒＩＩ）の１つ以上のフラグメント及びかかるフラグメントの組合せであり得る。
【００３６】
本発明に従うと、３量体サイトカインを結合させる能力を有する特異的結合成員は同様に、抗体又は抗体フラグメントであってよい。ここでは、「抗体」という語は、天然のものであろうと又は部分的に又は完全に合成的に産生されたものであろうと免疫グロブリンを記述するために使用される。抗体は数多くの方法で修飾され得ることから、「抗体」という語は、必要とされる３量体サイトカインの特異性を伴う結合ドメインを有するあらゆる特異的結合成員又は物質を網羅するものとみなされるべきである。かくしてこの語は、天然であるか完全に又は部分的に合成であるかに関わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含めた、抗体のフラグメント、誘導体、官能性等価物及び相同体を網羅している。従って、もう１つのポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子又はその等価物も含まれる。この用語は同様に、例えば抗体擬態などの抗体結合ドメインであるか又はそれに相同である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質も網羅している。これらは、天然供給源から誘導され得、そうでなければ、部分的に又は完全に合成的に産生され得る。抗体の例としては、免疫グロブリンイソタイプ及びそのイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄといったような抗原結合ドメインを含むフラグメント；及びダイアボディがある。
【００３７】
米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書は、特にＴＮＦの生物活性を中和する能力を有するヒト腫瘍壊死因子に対する抗体について記述している。特に、米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書は、或る特定の局所解剖学的領域内で成熟ヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する能力を有する抗体及びそのフラグメントを提供している。従って本発明の有用な実施形態においては、特異的結合成員は、前記抗体又は抗体フラグメントが、アミノ酸残基１−１８、１−２０、１−２６、１−３０、１２−２２、２２−３１、２２−４０、３６−４５、４９−９７、４９−９８、５６−７９、５８−６５、６９−９７、７０−８７、７６−９０、９６−１０５、１０５−１２８、１０８−１２８、１１０−１２７、１１５−１２５、１１７−１２８、１３２−１５７、１３５−１５５、１３６−１５３、１３８−１４９、１４１−１５３及び１４６−１５７から成る領域の中から選択された少なくとも１つの領域内で成熟ヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する能力を持つ抗体又はそのフラグメントである。
【００３８】
米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書はさらに、本発明書において有用であり得る特異的モノクローナル抗体を提供する。従って、ヒトＴＮＦを結合させる能力を有する特異的結合成員は、ＭＡｂ １（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０１）、ＭＡｂ ２１（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３２）、ＭＡｂ ２５（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０１）、ＭＡｂ ３２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０２）、ＭＡｂ ３７（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０３）、ＭＡｂ ４２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０４）、ＭＡｂ ４７（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０２）、ＭＡｂ ５３（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３３）及びＭＡｂ ５４（ＥＣＡＣＣ ８９０８３１０３）の中から選択された抗体またはそのフラグメントであり得、ここでＥＣＡＣＣは、欧州動物細胞培養収集機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を意味する。
【００３９】
有用な抗体のさらなる例としては、米国特許第６，０９０，３８２号明細書に開示されているようなヒト化抗体Ｄ２Ｅ７及び国際公開第００１９４５８５号パンフレット内に開示されているようなヒト化抗体フラグメントＣＤＰ ８７０が含まれる。
【００４０】
特定の実施形態においては、本発明の特異的結合成員は、例えば国際公開第０２４８１８９号パンフレットの中で開示されているようなＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造を有するタンパク質といったような抗体類似体又は人口抗体を含むことができる。以下の実施例から明らかになるように、ＴＮＦを結合させる能力を有する有用なヒトテトラネクチンベースのＣＴＬＤ抗体類似体は、ＴＮ３−２−Ｂ（配列番号１０３）、ＴＮ３−２−Ｃ（配列番号１０４）及びＴＮ３−２−Ｄ（配列番号１０５）の中から選択され得る。
【００４１】
本発明の重要な態様は、３量体ポリペプチドの単量体が、特異的結合成員に加えてさらに３量体ドメインを含んでいるという点にある。ここにおいて、「３量体ドメイン」という語は、その他の類似の又は同一の３量体ドメインと相互作用する能力を有するペプチド、タンパク質又はその一部分である。この相互作用は、３量体タンパク質又はポリペプチドを産生するタイプのものである。かかる相互作用は、３量体ドメインの構成要素の間の共有結合によって、ならびに、水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力及び塩橋によってひき起こされ得る。
【００４２】
３量体ドメインの一例は、コレクチン頸部領域を含むポリペプチドを記述する国際公開第９５／３１５４０号パンフレットの中で開示されている。コレクチン頸部領域を構成するアミノ酸配列は、選択されたあらゆるポリペプチドに付着され得る。次に、コレクチン頸部領域アミノ酸配列を含む３つのポリペプチドを用いて、適切な条件下で３量体を作ることができる。
【００４３】
現在好ましい実施形態においては、３量体ドメインはテトラネクチンから誘導され、より詳細には国際公開第９８／５６９０６号パンフレットの中で記述されているテトラネクチン３量体化構造要素（以下ＴＴＳＥと呼ぶ）を含む。ＴＴＳＥのアミノ酸配列は、配列番号８１の中に示されている。ＴＴＳＥの３量体化効果は、比較的高温においてさえ例外的に安定している３重アルファヘリカルコイルドコイル３量体を形成するべくその他の２つのＴＴＳＥのコイルドコイル構造と相互作用するコイルドコイル構造によりひき起こされる。ＴＴＳＥという語は同様に、アルファヘリカルコイルドコイル３量体を形成するＴＴＳＥの能力に実質的な程度まで不利な影響を及ぼすことなくアミノ酸配列内で修飾された変異体である、タンパク質のテトラネクチンファミリーの自然に発生する成員のＴＴＳＥの変異体を包括するようにも意図されている。かくして、本発明に従った３量体ポリペプチドは、少なくとも９２％といった少なくとも８７％を含めた、少なくとも７５％といった少なくとも６８％のアミノ酸配列同一性を配列番号８１の配列を有する１つの配列を含むＴＴＳＥを３量体ドメインとして含み得る。これによると、ＴＴＳＥ（配列番号８１）のシステイン残基番号５０は、有利にも、セリン、トレオニン、メチオニンに対して、又はその他のあらゆるアミノ酸残基に対して突然変異誘発させられて、望ましくない多量体化を導く可能性のある望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避することができる。
【００４４】
さらなる実施形態においては、ＴＴＳＥ３量体ドメイン（配列番号８１）は、（ｉ）血液凝固因子Ｘａのための分割部位及び／又はポリヒスチジン配列の取込み、（ｉｉ）Ｃｙｓ５０とＳｅｒの置換及び（ｉｉｉ）Ｃ末端ＫＧＳ配列の内含により修飾され得る。
【００４５】
上述のＴＴＳＥ３量体ドメインを適用した本発明に従った異なる３量体ポリペプチドのいくつかの例が以下の実施例中で提供されている。これらには、特に、ＣＴＬＤベースのＴＮＦ結合単位ＴＮ−２−Ｂ（配列番号１０６）、ＴＮ−２−Ｃ（配列番号１０８）及びＴＮ−２−Ｄ（配列番号１０７）及び３量体化されたヒトＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０（配列１０９）が含まれる。
【００４６】
本発明に従うと、特異的結合成員は、３量体ドメインのＮ又はＣ末端アミノ酸残基のいずれかにリンクされ得る。しかしながら、或る種の実施形態においては、単量体の３量体ドメインのＮ末端及びＣ末端の両方に対し特異的結合成員をリンクさせ、かくして３量体サイトカインを結合する能力を有する６つの特異的結合成員を含む３量体ポリペプチドを提供することが有利であり得るということも考慮されている。
【００４７】
任意には特異的結合成員と３量体ドメインの間に可とう性ある分子リンカーを介在させ、これらを共有結合により接合させることができるということがわかるであろう。一部の実施形態においては、リンカーは、約１〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。該リンカーは、１０個未満のアミノ酸、最も好ましくは５、４、３、２又は１個のアミノ酸であり得る。或る種のケースでは、９、８、７又は６個のアミノ酸が適当であり得る。有用な実施形態においては、リンカーは基本的に非免疫原性であり、タンパク質分解による分割を受ける傾向をもたず、その他の残基（例えばシステイン残基）と相互作用するものとして知られているアミノ酸残基を含まない。
【００４８】
本発明の３量体ポリペプチドは、該３量体ポリペプチドが発現されるような条件の下で、この３量体ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された宿主を培養することにより、あらゆる適切な標準的タンパク質発現系の中で発現され得る。好ましくは、発現系は、所望のタンパク質をインビトロでそこから容易に単離させ再度折畳むことのできる系である。一般的に言って、高いタンパク質収量を得ることができ又効率の良い精製及び再折畳み戦略が利用可能であることから、原核生物発現系が好まれる。かくして、適切な又は好みの発現系を選択することは、過度の実験無く当業者の能力及び裁量の範囲内に充分入るものである。同様にして、本発明の３量体ポリペプチドのための一次アミノ酸配列がひとたび選択された時点で、当業者であれば、選択された宿主内のコドンバイアス、宿主体内での分泌シグナル配列に対するニーズ、シグナル配列内のプロティナーゼ分割部位の導入といったような因子を考慮に入れて、所望のタンパク質をコードすることになる適切な組換え型ＤＮＡ構成体を容易に設計することができる。これらの組換え型ＤＮＡ構成体は、選択された宿主に適した一定数の発現ベクターのいずれかの中に同じ枠内で挿入され得る。適切な又は好みの発現ベクターの選択も又、当業者の能力及び裁量の範囲内に充分入る事柄である。好ましくは、発現ベクターは、組換え型構成体の発現を駆動するため強いプロモータを内含することになる。最後に、３量体ポリペプチドは、当該技術分野において周知の適切な標準的手順を用いて単離され得、任意には例えば凍結乾燥といったようなさらなるプロセッシングを受けることができる。
【００４９】
本発明に従った３量体ポリペプチドは当該技術分野において周知のあらゆる適切な方法により医薬組成物の調製のために使用可能である。組成物は、３量体ポリペプチドと合わせて、１つ以上の受容可能な担体、そして任意にはその他の治療用成分を含むことができる。担体は、その他の成分と相溶性がありそのレシピエントにとって有害でないという意味で、受容可能でなくてはならない。一般に、医薬組成物の調製方法には、活性成分と担体の会合工程が含まれる。
【００５０】
本発明の治療的利用分野には、それを必要としている動物に対して本発明に従った３量体ポリペプチドを治療上有効な量だけ投与することにより、動物の体内の疾病又は疾患の治療が含まれる。上述のように、３量体サイトカイン、特にＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの３量体サイトカインは、特に免疫及び炎症性応答を制御し調整することにより細胞間シグナル伝達分子として作用する多面発現ポリペプチドであることがわかっている。従って、本発明の３量体ポリペプチドは、炎症性疾患、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、悪性腫瘍、及び神経変性病を含めた、３量体サイトカインにより媒介される広範囲の疾患及び疾病の治療に適用可能でありうる。１つの有用な実施形態においては、疾病は、関節リウマチ、乾癬及びクローン病といったような腫瘍壊死因子により媒介される病理である。
【００５１】
本発明の３量体ポリペプチドは、非経口投与を含めたあらゆる適切な技術により動物に直接投与することができ、局所的又は全身的に投与可能である。特定の投与経路は、例えばその動物の病歴によって左右される。非経口投与の例には、皮下、筋内、静脈内、動脈内及び腹腔内投与が含まれる。
【００５２】
本書で、３量体融合タンパク質で治療できる可能性のある動物としては、ヒトといったような哺乳動物が含まれる。
【００５３】
最後に、本発明は、（ｉ）本発明に従った３量体ポリペプチドと標本を接触させる工程及び（ｉｉ）３量体サイトカインに対する３量体ポリペプチドの結合を検出する工程を含む、試料中の３量体ポリペプチドサイトカインを検出するための検定方法を提供している。
【００５４】
本発明はここで、以下の制限的意味のない例及び図中の例示を用いて記述されることになる。
【実施例】
【００５５】
実施例１
トリップＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミド及び３量体サイトカイン結合剤の産生のためのファージミドの設計と構築
ファージミド
ファージミドｐｓｋｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてアマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により供給されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩプレカットベクター、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（コード番号：２７−９４０１−０１）へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号１）及びＮ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号２）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡフラグメントｓｋｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ＳｋｔｒｉｐＢインサートのヌクレオチド配列は、配列番号３として示されている。
【００５６】
ファージミドｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により供給されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩプレカットベクター、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（コード番号：２７−９４０１−０１）へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号１）及びＮ−ｓｆｉｋｐｎ−ｌ１０ＴＲＩ（配列番号４）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡフラグメントｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢインサートのヌクレオチド配列は、配列番号５として示されている。
【００５７】
発現プラスミド
発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限プラスミドｐＴ７Ｈ６へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号６）及びＮ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号７）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限ＤＮＡフラグメントｂｋｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｂｋｔｒｉｐＢのヌクレオチド配列は、配列番号８として示されている。
【００５８】
発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限プラスミドｐＴ７Ｈ６へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号６）及びＮ−ｂａｍｋｐｎ−ｌ１０ＴＲＩ（配列番号９）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限ＤＮＡフラグメントｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｂｋｌｔｒｉｐＢのヌクレオチド配列は、配列番号１０として示されている。
【００５９】
実施例２
ＴＮＦＲＩＩフラグメントを用いた３量体ＴＮＦ結合剤の設計と構築
テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づく３量体ＴＮＦ結合剤の構築のためには、ＴＮＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲＩＩ）のフラグメント及びサブユニットが使用された。設計及びクローニングは以下で概略的と説明されている。
【００６０】
ファージミドベクターへのＴＮＦＲＳＦ１Ｂフラグメントのクローニング
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１３として示されている。
【００６１】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１５として示されている。
【００６２】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１７として示されている。
【００６３】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１９として示されている。
【００６４】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２１として示されている。
【００６５】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２３として示されている。
【００６６】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１３として示されている。
【００６７】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１５として示されている。
【００６８】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１７として示されている。
【００６９】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１９として示されている。
【００７０】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２１として示されている。
【００７１】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２３として示されている。
【００７２】
ファージミドベクターｐＤ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２を連結させることによって構築される。Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２５として示されている。
【００７３】
ファージミドベクターｐＤ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２６として示されている。
【００７４】
ファージミドベクターｐＤ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２７として示されている。
【００７５】
ファージミドベクターｐＤ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２８として示されている。
【００７６】
ファージミドベクターｐＤ２１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２９として示されている。
【００７７】
ファージミドベクターｐＤ２Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３０として示されている。
【００７８】
ファージミドベクターｐＤ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２を連結させることによって構築される。Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２５として示されている。
【００７９】
ファージミドベクターｐＤ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２６として示されている。
【００８０】
ファージミドベクターｐＤ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２７として示されている。
【００８１】
ファージミドベクターｐＤ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２８として示されている。
【００８２】
ファージミドベクターｐＤ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２９として示されている。
【００８３】
ファージミドベクターｐＤ２Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３０として示されている。
【００８４】
発現ベクターへのＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲＩＩ）レセプタフラグメントのクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３２として示されている。
【００８５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３３として示されている。
【００８６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３４として示されている。
【００８７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３５として示されている。
【００８８】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３６として示されている。
【００８９】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３７として示されている。
【００９０】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３９として示されている。
【００９１】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４０として示されている。
【００９２】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４１として示されている。
【００９３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４２として示されている。
【００９４】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４３として示されている。
【００９５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４４として示されている。
【００９６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３２として示されている。
【００９７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３３として示されている。
【００９８】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３４として示されている。
【００９９】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３５として示されている。
【０１００】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３６として示されている。
【０１０１】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３７として示されている。
【０１０２】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３９として示されている。
【０１０３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４０として示されている。
【０１０４】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４１として示されている。
【０１０５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４２として示されている。
【０１０６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４３として示されている。
【０１０７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４４として示されている。
【０１０８】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｉ１６２（配列番号８３）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８４として示されている。
【０１０９】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−ＧＳＳ（配列番号８５）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８６として示されている。
【０１１０】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｄ２３５（配列番号８７）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８８として示されている。
【０１１１】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｉ１６２（配列番号８３）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８９として示されている。
【０１１２】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８３）及びｐＫｐｎＩ−ＧＳＳ（配列番号８５）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ２−ＧＳＳを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９０として示されている。
【０１１３】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋＩ１０−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８３）及びｐＫｐｎＩ−Ｄ２３５（配列番号８７）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９１として示されている。
【０１１４】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩカットベクター、ｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＫｐｎＩ−Ｖ１７（配列番号９２）及びｐＢＡＤ６Ｈ（配列番号９３）を用いて）ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントＶ１７−ＴｒｉｐＢを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９４として示されている。
【０１１５】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩカットベクター、ｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＫｐｎＩ−Ｖ１７（配列番号９２）及びｐＢＡＤ６Ｈ（配列番号９３）を用いて）ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントＶ１７−ＴｒｉｐＢを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９５として示されている。
【０１１６】
実施例３
３量体化ＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＢの産生、再折畳み及び精製
（ＴＮＦＲＩＩ誘導体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＢを発現する）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現プラスミドｐＴ７Ｄ１Ｄ４ＧＳＳｌ１０の構築については、上記実施例２の中で記述されている。
【０１１７】
３量体化されたヒトＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０（配列番号１０９）は、スチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）及びモファット（Ｍｏｆｆａｔ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８９；１１３−１３０、１９８６によって記述されているように中規模（６×１リットル）のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞中でプラスミドｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０を成長させ発現させることにより産生された。簡単に言うと、３７℃で指数増殖する培養を、約５という多重度でバクテリオファージλ−ＣＥ６を用いて０．８というＯＤ６００で感染させた。培養をさらに３時間３７℃で成長させてから、遠心分離により細胞を収獲した。細胞を浸透圧衝撃及び音波処理により分解させ、合計細胞タンパク質を（トリズマ（Ｔｒｉｓｍａ）塩基でｐＨ８に調整した）フェノール中に抽出させた。２．５体積のエタノールの添加と遠心分離によりフェノール相からタンパク質を沈降させた。６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び５０ｍＭのジチオエリスリオールを含む緩衝液中に、タンパク質ペレットを溶解させた。８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール中へのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（アマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのゲル浸透の後、融合タンパク質の精製のため（ホチュリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）ら、１９８８）そしてカラム上に固定化される一方で国際公開第９４／１８２２７号パンフレットで以前に記述された通りの循環折畳み手順を受けるためＮｉ２＋活性化ＮＴＡ−アガロース（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ドイツ）カラムに対し、粗製タンパク質調製物を適用した。
【０１１８】
液体クロマトグラフィのために調製された全ての緩衝液を、還元剤添加及び／又は使用に先立ち、真空下で脱ガスした。
【０１１９】
Ｎｉ２＋ＮＴＡ−アガロースカラム上に粗製タンパク質抽出物を適用した時点で、カラム溶出液の２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が安定するまで１カラム体積のローディングバッファとそれに続く６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールで洗浄することによって、大腸菌及びλファージタンパク質の大部分から融合タンパク質、ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０を精製した。
【０１２０】
表１に記されているような勾配管理プロフィールそして、緩衝液Ａとして０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び２ｍＭ／０．２ｍＭの還元／酸化済みグルタチオン及び緩衝液Ｂとして８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び３ｍＭの還元済みグルタチオンを用いて、融合タンパク質を、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロースカラム上で再折畳みさせた。
【０１２１】
循環折畳み手順の完了後、８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及び１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８を含有する緩衝液でＮｉ２＋ＮＴＡ−アガロースカラムからＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を溶出させた。
【０１２２】
Ｓ−及びＱ−セファロース（アマーシャム・バイオサイエンス（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィにより２量体又はより高次の多量体から、単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を精製した。溶出緩衝液により溶出された融合タンパク質（融合タンパク質材料の約８０％）を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５上の８Ｍの尿素、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０及び２５ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液の中にゲルろ過させ、Ｓ−セファロースイオン交換カラム上に適用した。「ランスルー」画分中の結合していないタンパク質を、Ｑ−セファロースカラム上に直接投入した。１０カラム体積全体にわたり、８Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８から８Ｍの尿素、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８までの線形勾配で、Ｑ−セファロースカラムから単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を溶出させた。単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質は、勾配の極く初期に溶出し、一方２量体及びより高次の多量体はさらに遅く溶出した。単量体融合タンパク質を含有する画分を復元させ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１２５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中にゲルろ過させた。
【０１２３】
【表３】
【表４】
【表５】
【０１２４】
実施例４
３量体化されたＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０の生物活性
実施例３中に記述されている通りに産生された３量体化されたＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−１１０の生物活性を、ＴＮＦアルファ媒介細胞毒性の阻害を決定するためＬ９２９細胞検定において測定した。
【０１２５】
ＴＮＦアルファ媒介細胞毒性を測定するために、マウス線維芽細胞系統Ｌ９２９（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５０１１４２５）を使用した。１０％のＦＢＳ及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で補足したＲＰＭＩ１６４０液体培地（バイオウィッタカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、英国）中に維持した。細胞を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、ロスキレ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）内に３×１０５細胞／ｍｌ及び７５μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ１６４０培地の割合で平板固定し、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩培養した。組換え型ヒトＴＮＦアルファ（ｒｈＴＮＦａ、ＲＤシステムズ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国）（１ｎｇ／ｍｌ及び０．１ｎｇ／ｍｌ）を、２μ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補足された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中のさまざまな濃度（１０倍希釈）の３量体化されたレセプタフラグメント（ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０）と共に、５％のＣＯ２中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩のインキュベーションのため、細胞培養に７５μｌ／ウェルのＴＮＦ−アルファ／３量体化レセプタフラグメントの混合物を添加した。各濃度のＴＮＦ−アルファ／レセプタフラグメントの混合物を３通りで試験した。セルタイター９６非放射性細胞増殖検定キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の一部分として、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジ−フェニル−テトラゾリウム臭化物）を用いて細胞増殖を決定した。１５０μｌ体積で培養された細胞を含む１つの９６ウェル平板に充分な試薬を調製するために、１５０μｌのＰＭＳに対し３．０ｍｌのＭＴＳ溶液を添加した。３０μｌ／ウェルの組合されたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液を添加し、ＥＬＩＳＡ平板読取り装置を用いて４９２ｎｍでの吸収度を記録する前に、５％のＣＯ２中３７℃で１〜４時間、平板をインキュベートした。各検定には、細胞を伴うＴＮＦアルファ、細胞単独及び緩衝液対照という対照も内含された。
【０１２６】
実験の結果は、図４に要約されている。ＴＮＦアルファの細胞毒性効果は、最も高い濃度のＡＤ１Ｄ−４−ＧＳＳ−ｌ１０の存在下で有意に阻害され、かくして、該化合物の生物活性を実証した。
【０１２７】
実施例５
Ｄ２Ｅ７抗体フラグメントを用いた３量体ＴＮＦ結合剤の設計、構築及び産生
ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７の１本鎖抗体可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）が、ＴＮＦを結合する能力を有する３量体ポリペプチドの構築における結合剤として選択される。３量体結合剤は、米国特許第６，０９０，３８２号明細書中に開示された配列に基づいて、Ｄ２Ｅ７のＶＨ及びＶＬドメインを増幅することによって構築可能である。
【０１２８】
Ｎ末端ｓｃＦｖとＣ末端３量体化ドメインの間のＧｌｙ、Ｔｈｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢの構築である。このベクターは、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ｂｋｔｒｉｐＢベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマＦＸＶＨ（配列番号４５）及びＶＨＢａｍＫｐｎ（配列番号４６）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ（Ｄ７Ｅ２ＶＨ）を連結させることによって構築される。第２工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＧ４ＳＶＬ（配列番号４７）及びＶＬｋｐｎ（配列番号４８）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＧ４ＳＶＬを連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢの構築である。ＦＸＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は配列番号４９として示されている。
【０１２９】
Ｎ末端ｓｃＦｖとＣ末端３量体化ドメインの間のＧｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ｂｋｔｒｉｐＢベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマＦＸＶＨ（配列番号４５）及びＶＨＢａｍＫｐｎ（配列番号４６）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ（Ｄ７Ｅ２ＶＨ）を連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢの構築である。第２工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＧ４ＳＶＬ（配列番号４７）及びＶＬＧ４Ｓｋｐｎ（配列番号５０）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＧ４ＳＶＬを連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢの構築である。結果として得られるＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４Ｓのヌクレオチド配列は配列番号５１として示されている。
【０１３０】
Ｎ末端３量体化ドメインとＣ末端ｓｃＦＶの間のＧｌｙ、Ｓｅｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７６ＨＦＸＴｒｉｐＡＧＳＤ２Ｅ７は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでカットされたベクター、ｐＴ７６ＨＦＸｔｒｉｐａ（ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．；３４７：８３−８７、２０００）へと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｃｌＶＨ（配列番号５２）及びＶＬｈｉｎｄ（配列番号５３）を用いて）ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢから増幅されたＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントを連結することによって構築される。結果として得られるＧＳＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は、配列番号５４として示されている。
【０１３１】
Ｎ末端３量体化ドメインとＣ末端ｓｃＦＶの間のＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７６ＨＦＸＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでカットされたベクター、ｐＴ７６ＨＦＸｔｒｉｐａ（ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．；３４７：８３−８７、２０００）へと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｃｌＧＡＳＶＨ（配列番号５５）及びＶＬｈｉｎｄ（配列番号５３）を用いて）ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢから増幅されたＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントを連結することによって構築される。結果として得られるＧ４ＳＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は、配列番号５６として示されている。
【０１３２】
上述の融合タンパク質Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢ、Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢ、Ｈ６ＦＸＴｒｉｐＡＤ２Ｄ７ＴｒｉｐＡ及びＨ６ＦｘＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７を調製するためには、プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢ、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢ、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴｒｉｐＡＤ２Ｄ７ＴｒｉｐＡ及びｐＴ７Ｈ６ＦｘＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７をスチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、（１９９０）によって記述されている通りに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞中において小規模で（１リットル；２×ＴＹ培地、５ｍＭのＭｇＳＯ４及び１００ ４ｇアンピシリン）成長させる。３７℃で指数増殖している培養を、０．８のＯＤ６００で、約５の多重度でバクテリオファージラムダＣＥ６に感染させる。培養をさらに３時間３７℃で成長させ、細胞を遠心分離によって収獲する。細胞を５０ｍｌの０．５Ｍ、ＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８中で再懸濁させる。各々にフェノール（ｐＨ８に調整された５０ｍｌ）を添加し、合計タンパク質を抽出するために混合物を音波処理する。遠心分離（１０．０００ｇで２５分間）による清澄化の後、２．５体積のエタノールを添加し遠心分離することによりフェノール相から粗製タンパク質画分を沈殿させる。６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び０．１Ｍのジチオエリスリオールを含む緩衝液（１５〜２５ｍｌ）中に、タンパク質ペレットを溶解させる。８Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中へのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）スウェーデン）上でのゲル浸透の後、精製のため（ホチュリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）ら、１９８８）Ｎｉ活性化ＮＴＡ−アガロースカラム（７５ｍｌのカラム体積）に対し、粗製タンパク質調製物を適用する。次に安定した基線が得られるまで、カラムを通して洗浄緩衝液（６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）を流す。
【０１３３】
その後、ほぼ純粋な融合タンパク質は、各々のカラムに対するｐＨ勾配（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ５緩衝液）及び５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８緩衝液）を含む溶液の線形（体積による）混合により得られる８Ｍの尿素及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中の１０００ｍｌ勾配）を適用することによって溶出される。
【０１３４】
トーゲルセンら（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ）（国際公開第９４／１８２２７号パンフレット）の方法によるインビトロでの再折畳みに備えて、２０ｍｇずつの各々の精製融合タンパク質を、約７５ｍｌの充てん層体積のカラムを生成するのに充分なＮｉ２＋活性化ＮＴＡ−アガロースマトリクスの懸濁液アリコートと再折畳み用「緩衝液Ｂ」（以下で記述）中の懸濁液内で混合させる。このとき、「緩衝液Ａ」として０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭグルタチオン及び０．２ｍＭの酸化グルタチオンを含む緩衝液を、又、「緩衝液Ｂ」として８Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び２ｍＭのグルタチオンを含む緩衝液を用いて１０℃で融合タンパク質を含むｓｃＦｖの再折畳みが実施されるという点を除いて、国際公開第９４／１８２２７号パンフレット内のプラスミノーゲンクリングル４について記述された通りの反復的再折畳み手順に各々の融合タンパク質を付す。
【０１３５】
再折畳み手順の完了後に、グルタチオンを洗い流すため、０．５ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８を含む３００ｍｌの緩衝液で各カラムを洗浄する。各タンパク質の再折畳みされた画分を次に、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中のＮＴＡ−アガロースから溶出緩衝液へと溶出させる。各々のタンパク質試料に約８Ｍの最終濃度を達成するための固体尿素の添加、及びＮａＣｌ濃度を５ｍＭ未満まで低下させるための希釈又は透析の後、イオン交換クロマトグラフィ（２ｍｌ／分で溶出された８Ｍの尿素、５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８の１Ｍ原液から）及び２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５の１Ｍ原液から）を含有する緩衝液中の９０センチメートルのカラムによるＳ−セファロース、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１，６（ｉ．ｄ．））により、各々の適正に折畳まれた融合タンパク質生成物の最終的精製を達成する。水性緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）に対する透析の後、各々の純粋かつ適正に再折畳みされた融合タンパク質を、成長した培養１リットルあたり２〜６ｍｇの収量で回収する。
【０１３６】
実施例６
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂレセプタフラグメントを用いた３量体ＡＰＲＩＬ結合剤の設計及び構築
ＡＰＲＩＬレセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂは、３量体サイトカインＡＰＲＩＬに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。異なるリンカーでのこのような結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１３７】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ６ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ６ｋｐｎ（配列番号６０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６１として示されている。
【０１３８】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ１０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０ｋｐｎ（配列番号６２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ１０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６３として示されている。
【０１３９】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ２０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦＲ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦＲ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０ｋｐｎ（配列番号６４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ２０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６５として示されている。
【０１４０】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ３０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０ｋｐｎ（配列番号６６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６７として示されている。
【０１４１】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ６１ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１ｋｐｎ（配列番号６８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６９として示されている。
【０１４２】
実施例７
ＴＮＦＲＳＦＦｎ１４レセプタフラグメントを用いた３量体ＴＷＥＡＫ結合剤の設計及び構築
ＴＷＥＡＫレセプタＴＮＦＲＳＦＦｎ１４は、３量体サイトカインＴＷＥＡＫに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。該結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１４３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＦｎ１４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＦｎ−ｒｅｖ（配列番号７０）及びＦＮＫｐｎ−ｆｏ（配列番号７１）を用いて）ヒトの心臓（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１２１−１）から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＦｎ１４を連結させることによって構築される。ＦＸＦｎ１４の結果として得られるヌクレオチド配列の概要は、配列番号７２として示されている。
【０１４４】
実施例８
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃレセプタフラグメントを用いた３量体ＢＡＦＦ結合剤の設計及び構築
ＢＡＦＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂは、３量体サイトカインＢＡＦＦに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。該結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１４５】
３量体ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃフラグメントのクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＳＦ１３ＣｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍ１３Ｃ−ｒｅｖ（配列番号７３）及び１３Ｃｋｐｎ−ｆｏ（配列番号７４）を用いて）ヒトのリンパ節（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１６４−１）から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｃを連結させることによって構築される。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｃの結果として得られるヌクレオチド配列の概要は、配列番号７５として示されている。
【０１４６】
実施例９
ＴＮＦのための３量体化されたＣＴＬＤ結合剤の単離及び構築
国際公開第０２４８１８９号パンフレット中で以前に開示されているようなテトラネクチン（配列番号９６）Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造は、３量体サイトカインＴＮＦ（ＴＮＦアルファ）のための３量体結合単位の単離及び構築のために使用された。結合単位の設計及びクローニングについて以下で概略説明されている。
【０１４７】
ライブラリ構築及び一次的選択
ＴＮＦ ＣＴＬＤ結合剤を単離するために、ファージ提示法を使用した。使用したファージ提示ライブラリは、テトラネクチンの１価のＣＴＬＤフォーマット（配列番号９７）であった。組合せライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−Ｉｂ００３（国際公開第０２４８１８９号パンフレット、実施例５）及び、ＰｈｔＣＴＬＤ−Ｉｂ００３として必須とされたもののループ１のための２つの付加的なランダム化されたオリゴヌクレオチドすなわち、テトラネクチン（配列番号９８）アミノ酸残基位置１１６−１２２でランダム化されたＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｒｅｖ及びＴＮ−１ｉｂ２−ｔｐｒｅｖ（配列番号９９）及びループ４のための２つの付加的なオリゴヌクレオチドすなわち位置１４６−１４９でランダム化されたＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｆｏ（配列番号１００）及び組立て反応内のＴＮ−１ｉｂ２−ｔｐｆｏ（配列番号１０１）を含む。前記ライブラリの変異体、インプットとして約１×１０１２のファージをそして第１回パニングラウンド内で１０μｇ／ｍｌ、第２ラウンドで１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＴＮＦを用いて、２回の選択ラウンドを実施した。
【０１４８】
選択は以下の通りに実施された。すなわち、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））２０μｌを１ｍｌのＰＢＳ（ＰＢＳ、０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、８ｇのＮａＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、２Ｈ２Ｏ、１ｌに至るまでの水そしてｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）の中で２回洗浄し、室温で１時間３％の脱脂粉乳中で遮断させ、３％の脱脂粉乳／ＰＢＳ中の２５０μｌの予め遮断されたファージを２５０μｌの可溶性ビオチニル化ＴＮＦと混合し、３０分間３７℃でインキュベートさせた。ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１回、ＰＢＳ中で２回ストレプトアビジンビーズを洗浄した後、これらを反応に加えて、抗原結合したファージを捕捉した。ビーズをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳで大規模に洗浄し、室温で３０分間２００μｌの５０ｍＭジチオトレイトールでビーズから抗原結合ファージを溶出させた。溶出したファージを、指数増殖するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞内で再度感染させた後、２％のグルロース及び０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹの寒天平板上で平板固定し滴定した。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡ内でＴＮＦアルファに対する結合の分析による選択された集団からの単一のクローンのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ中で被膜用に用いた抗原が５μｇ／ｍｌのＴＮＦであったという点を除いて、基本的に国際公開第０２４８１８９号パンフレットの中で記述されている通りに実施された。
【０１５０】
ＴＮ３−２と呼ばれる特異的ＴＮＦアルファ結合剤を、第２の選択ラウンドから単離した（表４）。
【０１５１】
二次ライブラリの構築及び親和力による選択
ＴＮ３−２に対し新しい配列変動を導入することによってＴＮ３−２のＴＮＦ親和力を改善できるか否かを調査した。ＴＮ３−２突然変異体のライブラリの構築のためには、鋳型としてＴＮ３−２クローンを使用し、オリゴヌクレオチドＴＮ−ｌｉｂ２−ｔｐｆｏ（配列番号１０１）及びＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｆｏ（配列番号１００）（Ｌｉｂ．ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒ）を用いてループ４内で新しいランダム化に付した。該ライブラリ構築は基本的に国際公開第０２４８１８９号パンフレット内で記述されている通りに行なった。
【０１５２】
ビオチニル化ＴＮＦの濃度を減少させながら（１００ｎｇ／ｍｌから０．１ｎｇ／ｍｌへ）、３回の親和力駆動型選択ラウンドの中で、ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒライブラリを使用した。上述の通りに選択を行なった。陽性クローンについてのスクリーニングを上述の通りに行なった。
【０１５３】
結果
親クローンＴＮ３−２の配列は、ループ１（テトラネクチンアミノ酸番号１１６−１２２）及びループ４（テトラネクチンアミノ酸番号１４６〜１４９）内のテトラネクチンとは異なっていた。ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒライブラリに対する３回の親和力による選択の後、陽性クローンをＥＬＩＳＡ分析により同定し、４８のクローンのうちの４５個がＴＮＦアルファに結合することが示された。同定されたＴＮＦアルファ結合クローンとその対応する配列番号のセレクションのうちループ１及びループ４が表４で示されている（ＴＮ３−２−Ｂ、ＴＮ３−２−Ｃ、ＴＮ３−２−Ｄ）。
【０１５４】
【表６】
ａ：テトラネクチン中のループ４配列の外での突然変異
【０１５５】
実施例１０
ＴＮＦについての３量体化ＣＴＬＤ結合剤の親和力測定
実施例７に記述されている通りに単離された単量体ＣＴＬＤＴＮＦアルファ結合剤をコードするＤＮＡインサートを、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＡＤ発現ベクター（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）ＵＳＡ）内にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換え型単量体ＴＮＦアルファ結合剤を発現させ、メーカーの指示事項に従って周辺質からこれを精製した。精製された単量体を１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２の中に透析し後、バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）上で分析した。
【０１５６】
ＴＮＦアルファ結合剤の３量体フォーマットを発現させるため、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ ＩＩ及びＭｕｎＩで、（実施例７からの）ＴＮＦアルファ結合剤をコードする適切なＤＮＡインサートを分割し、ＤＮＡフラグメントを含むループ１及び４をＢｇｌ ＩＩ ＭｕｎＩ制限Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ ＤＮＡ内にサブクローニングさせた（国際公開第０２／４８１８９号パンフレット、実施例１及び図５で概略説明されている通り）。
【０１５７】
組換え型３量体ＴＮＦアルファ結合剤をＥ．ｃｏｌｉ内で発現させ、折畳み解除された融合タンパク質誘導体の精製を、基本的に国際公開第９４／１８２２７号パンフレット、実施例９中に記述されている通りに実施した。
【０１５８】
簡単に言うと、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール中でＮｉ２＋荷電ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）カラム上に融合タンパク質を投入することにより、ＴＮＦアルファ結合剤の再折畳みを実施した。投入された後、カラムを循環再折畳み手順に付した。使用した再折畳み緩衝液は、復元緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭの還元グルタチオン及び０．２ｍＭの酸化グルタチオン）及び変性緩衝液Ｂ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、３ｍＭの還元グルタチオン）であった。再折畳みされた融合タンパク質を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０，５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡから溶出させ、融合タンパク質を一晩４℃でウシ血液凝固因子Ｘａ（プロテインエンジニアリングテクノロジー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）オルフス（Ａａｒｈｕｓ），デンマーク）により１：１００（ｗ／ｗ）で分割した。分割したタンパク質を８Ｍの尿素、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中に、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５上でのゲルろ過により取り込み、１０ｍｌのＳＰ−セファロースカラム（アマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上に投入し、２０カラム体積全体にわたり５０ｍＭから５００ＭのＮａＣｌまで勾配溶出させた。非還元性ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により判断されるように分割された単量体タンパク質を含有する画分をプールし、緩衝液を１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２に対し、ＰＤ１０カラム上のゲルろ過（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により交換させた。
【０１５９】
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００計器（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）スウェーデン）上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析を実施した。固定化させるべきＴＮＦアルファ捕捉抗体（ＡＨＣ３７１２、バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｓｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０中に溶解させ、次にアミンカップリングキット（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）、スウェーデン）を用いてＣＭ５ ＢｉａＣｏｒｅセンサーチップ上で固定化させた。
【０１６０】
５μｌ／分の流速で結合分析を実施した。タンパク質試料の投入の前に、チップを１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５０μＭのＥＤＴＡ及び０．００５％の界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）Ｐ２０の中で平衡化した。ＴＮＦアルファを１０μｇ／ｍＬで１０ｍＭのトリスｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２中に溶解させて、１０μＬを注入した。単量体又は３量体フォーマットのＴＮＦアルファ結合剤のアリコート（２０μｌ）をＫＩＮＪＥＣＴオプションを用いて注入した。チップを、１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５で再生させる前に５分間解離させた。ＴＮＦアルファ結合剤の結合を１〜２００ｎＭの範囲内の６つの異なるタンパク質濃度でテストした。ＢＩＡ評価プログラム、バージョン３．２（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ））を用いて、結合データを評価した。
【０１６１】
表５は、バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）データから導出された反応速度値を示している。ＴＮＦアルファ結合剤ＴＮ３−２−Ｂ、ＴＮ３−２−Ｃ、ＴＮ３−２−Ｄを３量体化することのもつ結合活性効果は、単量体結合剤から対応する３量体結合剤（ＴＮ−２−Ｂ、ＴＮ−２−Ｃ及びＴＮ−２−Ｄ）に移行する親和力の増加倍数からわかる。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
ＴＮＦアルファ結合剤を３量体化することにより、親和力（ＫＤ）の著しい増大が得られる。例えば単量体ＴＮ３−２−Ｂは、非常に低いＫoｆｆ値を有する。これに対して、同じＣＴＬＤ結合剤の３量体バージョン（ＴＮ−２−Ｂ）は、１０００倍を超える改善を示すｋｏｆｆ値を有する。一般に３量体化によってオフレートが改善することがわかる。その上、実施例７の低い密接性の親クローンＴＮ３−２は、単量体が検出レベルより低い親和力しかもたなかったため、その３量体形態でしかバイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）上で測定できなかった。
【０１６４】
参考文献
スチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）及びモファット（Ｍｏｆｆａｔ）、（１９８６）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８９：１１３−１３０
ホチュリ、Ｅ（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．）、バンワース、Ｗ（Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．）、ドベリ、Ｈ（Ｄｏｅｂｅｌｉ，Ｈ．）、ゲンツ、Ｒ（Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．）及びスチューバ、Ｄ（Ｓｔｕｅｂｅｒ，Ｄ．）、（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１３２１−１３２５
ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、３４７：８３−８７
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】さらに２つのサイトカインレセプタのさらなる動員を開始して結果として６量体サイトカイン・レセプタシグナリング単位の形成をひき起こす、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内の３量体サイトカインの、対応する細胞結合型単量体レセプタに対する結合を示す。
【図２】３量体サイトカインと１：１の複合体を形成する、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）内の３量体サイトカインに対する２価結合剤の結合を示す。該２価結合剤が３量体ＴＮＦＳＦサイトカインに結合する場合、考えらえる３つのレセプタ結合部位のうちの２つのみが２価結合剤分子により占有され、第３のレセプタ結合部位は、開放状態に残される。このことはすなわち、開放した３量体サイトカインレセプタ結合部位は、細胞表面の３量体サイトカインレセプタと会合し、かくして細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して３量体レセプタのさらなる動員ひいてはシグナル伝達を開始させることができる、ということを意味する。
【図３】３量体サイトカインとの１．１の複合体を形成すると同時に３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位全てを有効に結合させ、かくしていかなるレセプタ結合部位も開放状態に残されないようにする能力を有する３量体サイトカイン用結合剤を示す。細胞表面に対するサイトカインのドッキングは遮断され、従っていかなるシグナル伝達も発生しないことになる。
【図４】１０倍希釈物中での３量体化されたレセプタフラグメントＤ１Ｄ４ＧＳＳＩ１０Ｔｒｉｐのための２つの異なる固定されたＴＮＦアルファ濃度（１．０ｎｇ／ｍｌ及び０．１ｎｇ／ｍｌ）でのマウス線維芽細胞系統Ｌ９２９検定におけるＴＮＦアルファに媒介される細胞毒性の阻害を示す。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３量体サイトカインに結合する３量体結合タンパク質の提供に関する。特に、結合時点で、３量体サイトカインの全てのレセプタ結合部位が実質的に遮断され、ひいては３量体サイトカインの潜在的生物活性が抑制されるような形で結合する３量体結合剤が提供されている。１つの態様においては、本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含めた腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーのサイトカインに結合する能力を有する３量体結合剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、細胞内シグナル伝達を担いその他の細胞の成長、分割及び機能に影響を及ぼす高等真核生物由来の小さい分泌ポリペプチドである。これらは、例えば対応するレセプタを介して局所的又は全身的細胞内調節因子として作用し、従って免疫性、炎症、及び造血（骨髄中の血球の形成及び発達）といったような数多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす、効能のある多面発現ポリペプチドである。サイトカインは、繊維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球及びリンパ球を含めたさまざまな細胞型によって産生される。今日までに、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン及びリンフォカインを含め、多数のサイトカインが同定されてきた。これらは、特殊な腺によってではなくむしろ一定数の組織又は細胞型によって産生されるという点において、従来のホルモンとは異なっている。
【０００３】
サイトカイン−レセプタ相互作用の変調は、さまざまな疾病及び病理における治療的介入のための有用なメカニズムであり得る。サイトカインと相互作用し得る可溶性結合タンパク質は、レセプタから離れるようにサイトカインを潜在的に封鎖し、かくして、その特定のレセプタ経路の活性化を低減又は防止することができる。
【０００４】
或る種のサイトカインは、同じサブユニットの多数のコピーを含むマルチ−サブユニット複合体として発生する。マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ＴＮＦＬＳＦ成員２）及びリンフォトキシンアルファ（ＬＴ−アルファ；ＴＮＦＬＳＦ成員１）といったような腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＬＳＦ）内のタンパク質は、３つの同一のサブユニットにより形成されたホモ３量体として発生する。これらの３量体サイトカインの多くは、シグナル伝達に関与し調節因子として作用し、又数多くの異なるタイプの疾病及び医学的適応に関与するものとして知られている。
【０００５】
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの３量体サイトカインは、複数のレベルで免疫及び炎症性応答を制御し組織化するものとして知られている。同様に、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの成員が、急性又は慢性炎症性身体条件といったいくつかの疾病身体条件に関連づけされていることも知られている。現在、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーはＬＴＡ（リンフォトキシンアルファ；ＴＮＦＬＳＦ成員１）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：ＴＮＦＬＳＦ成員２）、ＬＴＢ（リンフォトキシンベータ；ＴＮＦＬＳＦ成員３）；ＯＸ−４０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員４）；ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員５）；ＦａｓＬ（ＴＮＦＬＳ成員６）；ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員７）；ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員８）；４−１ＢＢ−Ｌ（ＴＮＦＬＳ成員９）；ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１０）；ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＬＳ成員１１）；ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳ成員１２）；ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１３）；ＢＡＦＦ（ＴＮＦＬＳ成員１３Ｂ）；ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＬＳ成員１４）；ＶＥＧＩ（ＴＮＦＬＳ成員１５）；及びＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＬＳ成員１８）を含む少なくとも１７の認知されたリガンドを有する。
【０００６】
ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの３量体サイトカイン及びその対応するレセプタのシグナリング単位が、単一のサイトカイン３量体が３つのレセプタ分子に結合している６量体複合体として組立てられた３つのレセプタと３つのリガンドの形をしているという証拠が存在している（非特許文献１）。この６量体複合体の一部となる前に、レセプタは単量体形態で存在する。この一般的メカニズムについては図１で例示されている。
【０００７】
ＴＮＦ（ＴＮＦＬＳＦ成員２）は、免疫及び炎症性応答の主たる媒介物質の１つであり、例えば、ヒト集団の約０.５〜１％に影響を及ぼす一般的な自己免疫炎症性疾患である関節リウマチの病因において重要な役割を果たしているものとして知られている。さらにＴＮＦは同様に、内毒素ショック、脳マラリア及び移植片対宿主反応を含めた広範囲の疾病状態の病因に関与するものとしても知られている。ＴＮＦは、多数の細胞型、主として活性化されたマクロファージにより産生される。ＴＮＦの可溶性形態は、３つの同一の１７ｋＤのタンパク質サブユニットから成り、一方膜結合形態は３つの同一の２６ｋＤのサブユニットで構成されている。ＴＮＦは同様に、従来「ＴＮＦ−アルファ」及び「カケクチン」として知られている。
【０００８】
ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳＦ成員１２）は最近になって、ピコモル濃度のＴＷＥＡＫが正常な内皮細胞の増殖を促進すること及びＴＷＥＡＫがインビボラット角膜モデル内で血管形成を誘発することが考察されたため（非特許文献２）、血管形成（血管の形成と成長）の直接的かつ強い誘発物質であることが発見された。特に、血管形成は、中実腫瘍の成長及び永続及びその転移にとって不可欠であり、それは又糖尿性網膜症、乾癬、接触性皮ふ炎及び再狭窄といったようなその他の病的身体条件に関与するものとしても知られている。
【０００９】
特許文献１において、３量体サイトカインＢＡＦＦ（ＴＮＦＬＳ成員１３Ｂ）は、Ｂ細胞同時刺激を目的としてＴ細胞及び樹状細胞によって発現されるものとして記述されており、その結果、Ｂ細胞機能の制御において重要な役割を果たすことができる。そこでは、ＢＡＦＦ及びそのレセプタが抗ガン及び免疫調節の利用分野ならびにＨＩＶといったような免疫抑制性疾患の治療のための用途を有し得るということが示唆されている。
【００１０】
ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＬＳ成員１３）は、レセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ及びＴＮＦＲＳＦ１７に結合する３量体サイトカインである。最近になって、さまざまな腫瘍細胞に対する組換え型ＡＰＲＩＬの付加がそれらの増殖を刺激し、ひいてはＡＰＲＩＬが腫瘍細胞成長の調節に関与しうるということが示されてきた（非特許文献３）。ＡＰＲＩＬが単球／マクロファージ媒介免疫原性プロセスにも関与しうるということも示唆されてきた。
【００１１】
さらに、ＴＮＦスーパーファミリー内のサイトカインが、高ＩｇＭ症候群、Ｉ型自己免疫リンパ増殖症候群、ＴＮＦ−Ｒ１関連間欠熱症候群、発汗減少性外胚葉性形成異常及び家族性拡張性骨溶解といったような遺伝性疾病に関与するものとしても記述されてきた。
【００１２】
特異的３量体サイトカインに結合し、かくして３量体サイトカインが例えば細胞膜結合レセプタに結合するのを防ぎ従ってその特定のレセプタ経路の活性化を抑制する能力を有する、３量体サイトカイン用の適切なアンタゴニスト及び結合剤を発見し開発するため、いくつかの試みがなされてきた。
【００１３】
１つの例としては、３量体サイトカインＴＮＦ（ＴＮＦＬＳＦ成員２）に対するアンタゴニストがある。現在、２つのタイプのＴＮＦアンタゴニスト、すなわち、共に関節リウマチの治療のため米国及び欧州で販売承認を受けたインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））及びエタナルセプト（Ｅｔｅｒｎａｒｃｅｐｔ）（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ））が市販されている。これら２つの製品は同様に、乾癬及びクローン病の治療に有効であることも示されてきた。インフリキシマブは、ＴＮＦの可溶性及び膜内外形態に結合することによってＴＮＦの生物学的活性を中和しＴＮＦとそのレセプタの結合を阻害する、マウス可変領域及びヒトＩｇＧ１及び定常領域を伴うキメラ抗体である。インフリキシマブの構造は、天然に発生する抗体のものに類似している。エタナセプト（Ｅｔｅｒｎａｃｅｐｔ）は、ｐ７５ＴＮＦレセプタの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のヒンジ及びＦｃドメインから成る融合タンパク質である。
【００１４】
３量体サイトカインに対するアンタゴニストのもう１つの例が、３量体サイトカインＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＬＳ成員１２）に対するモノクローナル抗体を開示する特許文献２の中で記されている。抗体は移植片対宿主反応の進行を遮断することができる。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２００３７８５２Ａ１号明細書
【特許文献２】国際公開第００／４２０７３号パンフレット
【非特許文献１】ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ら、２００２年、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７（１）、ｐ１９−２６
【非特許文献２】リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、１９９９年、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４（１３）ｐｐ．８４５５−８４５９
【非特許文献３】ハーン Ｍ（Ｈａｈｎｅ Ｍ．）ら、１９９８年；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１１８５−１１９０
【００１５】
しかしながら、現在既知の３量体サイトカインに対する結合剤及び阻害剤製品で遭遇する一般的な技術的問題は、３量体サイトカインと結合剤又は阻害剤製品の１：１の複合体の形成時点で、３つのレセプタ結合部位のうちの少なくとも１つ又は２つが開放状態に残されることから、３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位の全てが有効に遮断されるわけではないという点にある。開放したサイトカインレセプタ結合部位は対応する細胞表面サイトカインレセプタと会合することができ、そのため、細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して、サイトカインレセプタのさらなる動員を開始しレセプタシグナリングを媒介し得る。
【００１６】
該問題点は、ＴＮＦ３量体と１：１の複合体を形成する２価の分子であるＴＮＦ結合剤エタナセプトにより、明白に例示される。エタナセプトがＴＮＦに結合するとき、考えられる３つのレセプタ結合部位のうちの２つのみがエタナセプト分子によって占有され、第３のレセプタ結合部位は開放状態に残される。このことはすなわち、開放したＴＮＦレセプタ結合部位が、細胞表面ＴＮＦレセプタと会合でき、そのため、細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して、ＴＮＦレセプタのさらなる動員及びそれによるシグナル伝達を開始しうる、ということを暗示している。この問題は、図２で例示されている。
【００１７】
同じ問題は、ＴＮＦ結合剤インフリキシマブでも見られる。各々のインフリキシマブ分子は、一定の与えられたＴＮＦ分子の１つのレセプタ結合部位（サブユニット）を結合する能力しかもたず、従って２つの開放したレセプタ結合部位を残す。これらの開放したレセプタ結合部位はその後、対応する遊離レセプタを会合して、結果としてＴＮＦレセプタのさらなる動員及びレセプタシグナリングをもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
現在、本発明人らにより、３量体ドメインに対する３量体サイトカイン用の結合単位（結合剤）の１つの融合としてみなされる融合タンパク質（プロトマー）の提供によって上述の技術的問題を克服することができる、ということが発見されてきた。本発明の融合タンパク質は、３量体タンパク質として、３量体サイトカインと１：１の複合体を形成すると同時に好ましくは３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位の全てを有効に結合させる能力をもち、そのため開放状態のレセプタ結合部位はひとつも残されず、従って細胞表面に対するサイトカインのドッキングを阻害することができる。かくして、今や、現在既知の３量体サイトカインアンタゴニストと比べてさらに効果的に３量体サイトカインの生物活性を阻害し中和する能力を有するという利点をもつ融合タンパク質が提供されている。本発明に従った融合タンパク質のさらなる利点は、医薬品として応用された場合に、治療効果を得るために、現在既知の３量体サイトカイン用結合剤に比べて少ない量の融合タンパク質しか必要とされない、という点にある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、本発明は、第１の態様において、３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含みかつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチドに関する。
【００２０】
さらなる態様においては、本発明に従った３量体ポリペプチドを含む医薬組成物が提供されている。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、腫瘍壊死因子といったような３量体サイトカインにより媒介される病理を有する被験者に対し本発明に従った３量体ポリペプチドを有効量投与することによって、該被験者を治療する方法に関する。
【００２２】
最後に、本発明に従った３量体ポリペプチドの調製方法ならびに、試料中の３量体ポリペプチドサイトカインの検出用検定方法が提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
一態様においては、本発明は、好ましくは結合時点で３量体サイトカインの全てのレセプタ結合部位が実質的に遮断されかつ／又は中和され、ひいては３量体サイトカインの潜在的な生物活性が抑制されるか又は中和されるような形で、３量体サイトカインに結合する能力を有する３量体結合剤を提供している。従って、３つの単量体を含む３量体ポリペプチドにおいて、各単量体が３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を含みかつ各単量体が３量体化ドメインを含む、３量体ポリペプチドが提供されている。
【００２４】
この状況下で、「３量体サイトカイン」という語は、１つの細胞によって産生され分泌され、例えばその細胞の成長、分割及び／又は機能に影響を及ぼすことによって、そのサイトカインのためのレセプタを有する１つの細胞内で特異的応答を惹起する、小さいタンパク質及びそのフラグメントを意味する。「３量体の」という語は、本書では、３つのサブユニット、好ましくは３つの同一サブユニットを含有するマルチ−サブユニット複合体（単独３量体）として本発明に従ったサイトカインが発生することを記すために用いられている。
【００２５】
このような３量体サイトカインの標準的な例としては、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＦＬＳＦ）内のサイトカインがある。現在、上述の通り、ＴＮＦリガンドスーパーファリミリーは、レセプタ結合を担う「ＴＮＦ相同性ドメイン」（ＴＨＤ）として知られている保存された３量体Ｃ末端ドメインを全て共有している少なくとも１７の認識されたリガンドを有する。この３量体ドメインの配列同一性は、ＴＮＦファミリー成員間で約２０〜３０％である。ＴＨＤは、ボッドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ら、２００２、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２７（１）、ｐ１９〜２６内で図２に例示されている芳香族及び疎水性残基の保存された枠組を含有する１５０のアミノ酸長配列である。従って、ここで、「腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの成員」は、ＴＮＦ相同性ドメイン、ＴＨＤを含む３量体タンパク質を意味するように意図されている。現在既知のＴＮＦリガンドスーパーファリミリー内の３量体サイトカインが下表１に、同義語及びその対応するジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ、国立バイオテクノロジー情報センタ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ）と合わせて列挙されている。本書で使用されている通りのＴＮＦリガンドスーパーファリミリー用の命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ／ｔｎｆｔｏｐ．ｈｔｍｌで見出すことのできる公式ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）命名法に準じている。
【００２６】
【表１】
【００２７】
従って、本発明の１つの有用な実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドは、ＬＴＡ；ＴＮＦ；ＬＴＢ；ＴＮＦＳＦ４；ＴＮＦＳＦ５；ＴＮＦＳＦ６；ＴＮＦＳＦ７；ＴＮＦＳＦ８；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０；ＴＮＦＳＦ１１；ＴＮＦＳＦ１２；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＲＳＦ Ｆｎ１４；ＴＮＦＳＦ１５及びＴＮＦＳＦ１８の中から選択された腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの一員である３量体サイトカインを結合する能力を有する。
【００２８】
本書で用いられる「特異的結合成員」という語は、互いに結合特異性をもつ分子対の一員を意味している。特異的結合対の成員は、天然に誘導されていても、又全体的又は部分的に合成的に産生されていてもよい。分子対の一成員は、その対のもう一方の成員の特定の空間的及び極性組織に特異的に結合し従ってそれに対し相補的であるその表面上の一部域又はキャビティを有する。かくして、その対の成員は、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対のタイプの例としては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプタ、リガンド−リガンドレセプタ、酵素−基質がある。特異的結合対のその他の例としては、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列（標的核酸配列を検出するべくＤＮＡハイブリダイゼーション検定内で使用されるプローブ及び捕捉核酸配列を含む）、組換え型方法によって形成されるものを含む相補的ペプチド配列、エフェクタ及びレセプタ分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害物質及び酵素、などが含まれる。さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合成員の類似体又はフラグメントである成員を含むことができる。
【００２９】
有用な実施形態においては、３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員は、好ましくは表面プラズモン共鳴により決定される１×１０−８Ｍ以下の３量体サイトカインに対する結合親和力（Ｋｄ）を有する本発明に従った３量体ポリペプチドを提供する。その他の有用な実施形態においては、Ｋｄ値は１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ未満、さらには１×１０−１５Ｍ未満でさえある。さらなる有用な実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドについてのＫ−ｏｆｆ速度は、表面プラズモン共鳴で決定されて、１×１０−３Ｓ−１未満例えば、１×１０−５Ｓ−１を含め１×１０−４Ｓ−１未満、さらには１×１０−６Ｓ−１未満である。本書に使用される「Ｋ−ｏｆｆ」という語は、特異的結合成員／３量体サイトカイン複合体からの特異的結合成員の解離のためのｏｆｆ速度定数を意味するように意図されている。本書で使用される「表面プラズモン共鳴」という語は、例えばＢＩＡコアシステム（ファーマシア、バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）ＡＢ、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）を用いたバイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の改変の検出によって実時間生物特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象を意味している。さらなる記述については、実施例１０を参照のこと。
【００３０】
以上で記した通り、本発明に従った３量体サイトカイン結合剤が、３量体サイトカインの生物活性を少なくとも部分的に又は完全に遮断、阻害又は中和することが好まれる。本書で使用されている通り、「中和する」又は「中和」という表現は、インビボ又はインビトロで測定される通りの３量体サイトカインの生物活性の阻害又は低減を意味している。
【００３１】
有用な実施形態においては、特異的結合成員は、腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの１成員から誘導されたポリペプチドである。現在のところ、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内で少なくとも２９のレセプタが知られており、下表２に、同義語及びその対応するジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋ、国立バイオテクノロジー情報センタ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ）と合わせて列挙されている。本書で使用されている通りのＴＮＦレセプタスーパーファミリーの成員用の命名法は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ／ｔｎｆｔｏｐ．ｈｔｍｌで見い出すことのできる公式ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）命名法に準じている。
【００３２】
【表２】
【００３３】
かくして、有用な実施形態においては、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内のレセプタから誘導された特異的結合成員は、レセプタＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＬＴＢＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２２、及びＴＮＦＲＳＦ２３の中から選択される。しかしながら、このタンパク質ファミリー内でさらなる有用なレセプタ、ひいてはさらなる官能的特異的結合成員を同定することができるということも考慮されている。
【００３４】
有用な実施形態においては、ＴＮＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦｒＩ、ｐ５５レセプタ）及び／又はＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦｒＩＩ、ｐ７５ＴＮＦレセプタ）から、特異的結合成員が誘導される。特に、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ及びそのサブユニットは、ＴＮＦを特異的に結合し中和するために有効であることが証明された。一例としては、ＴＮＦ結合タンパク質エタナセプト（Ｅｔｅｒｎａｃｅｐｔ）は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタの細胞外ドメインから成る融合タンパク質、すなわちＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタのサブユニットである。従って、特定の実施形態においては、本発明に従った３量体ポリペプチドは、米国特許第５，７１２，１５５号明細書で開示されているＴＮＦＲＳＦ１ＢレセプタフラグメントといったようなＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ（ＴＮＦｒＩＩ）のサブユニット又はフラグメントである特異的結合成員を含んでいる。かくして、有用な実施形態においては、特異的結合成員は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）の中から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３５】
さらなる有用な実施形態においては、以下の実施例に開示されているように、特異的結合成員は、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦｒＩＩ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）の中から選択されたＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドといったような、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂレセプタ（ＴＮＦｒＩＩ）の１つ以上のフラグメント及びかかるフラグメントの組合せであり得る。
【００３６】
本発明に従うと、３量体サイトカインを結合させる能力を有する特異的結合成員は同様に、抗体又は抗体フラグメントであってよい。ここでは、「抗体」という語は、天然のものであろうと又は部分的に又は完全に合成的に産生されたものであろうと免疫グロブリンを記述するために使用される。抗体は数多くの方法で修飾され得ることから、「抗体」という語は、必要とされる３量体サイトカインの特異性を伴う結合ドメインを有するあらゆる特異的結合成員又は物質を網羅するものとみなされるべきである。かくしてこの語は、天然であるか完全に又は部分的に合成であるかに関わらず、免疫グロブリン結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含めた、抗体のフラグメント、誘導体、官能性等価物及び相同体を網羅している。従って、もう１つのポリペプチドに融合された免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子又はその等価物も含まれる。この用語は同様に、例えば抗体擬態などの抗体結合ドメインであるか又はそれに相同である結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質も網羅している。これらは、天然供給源から誘導され得、そうでなければ、部分的に又は完全に合成的に産生され得る。抗体の例としては、免疫グロブリンイソタイプ及びそのイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄといったような抗原結合ドメインを含むフラグメント；及びダイアボディがある。
【００３７】
米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書は、特にＴＮＦの生物活性を中和する能力を有するヒト腫瘍壊死因子に対する抗体について記述している。特に、米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書は、或る特定の局所解剖学的領域内で成熟ヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する能力を有する抗体及びそのフラグメントを提供している。従って本発明の有用な実施形態においては、特異的結合成員は、前記抗体又は抗体フラグメントが、アミノ酸残基１−１８、１−２０、１−２６、１−３０、１２−２２、２２−３１、２２−４０、３６−４５、４９−９７、４９−９８、５６−７９、５８−６５、６９−９７、７０−８７、７６−９０、９６−１０５、１０５−１２８、１０８−１２８、１１０−１２７、１１５−１２５、１１７−１２８、１３２−１５７、１３５−１５５、１３６−１５３、１３８−１４９、１４１−１５３及び１４６−１５７から成る領域の中から選択された少なくとも１つの領域内で成熟ヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する能力を持つ抗体又はそのフラグメントである。
【００３８】
米国特許第６，４５１，９８３Ｂ２号明細書はさらに、本発明書において有用であり得る特異的モノクローナル抗体を提供する。従って、ヒトＴＮＦを結合させる能力を有する特異的結合成員は、ＭＡｂ １（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０１）、ＭＡｂ ２１（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３２）、ＭＡｂ ２５（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０１）、ＭＡｂ ３２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０２）、ＭＡｂ ３７（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０３）、ＭＡｂ ４２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０４）、ＭＡｂ ４７（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０２）、ＭＡｂ ５３（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３３）及びＭＡｂ ５４（ＥＣＡＣＣ ８９０８３１０３）の中から選択された抗体またはそのフラグメントであり得、ここでＥＣＡＣＣは、欧州動物細胞培養収集機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を意味する。
【００３９】
有用な抗体のさらなる例としては、米国特許第６，０９０，３８２号明細書に開示されているようなヒト化抗体Ｄ２Ｅ７及び国際公開第００１９４５８５号パンフレット内に開示されているようなヒト化抗体フラグメントＣＤＰ ８７０が含まれる。
【００４０】
特定の実施形態においては、本発明の特異的結合成員は、例えば国際公開第０２４８１８９号パンフレットの中で開示されているようなＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造を有するタンパク質といったような抗体類似体又は人口抗体を含むことができる。以下の実施例から明らかになるように、ＴＮＦを結合させる能力を有する有用なヒトテトラネクチンベースのＣＴＬＤ抗体類似体は、ＴＮ３−２−Ｂ（配列番号１０３）、ＴＮ３−２−Ｃ（配列番号１０４）及びＴＮ３−２−Ｄ（配列番号１０５）の中から選択され得る。
【００４１】
本発明の重要な態様は、３量体ポリペプチドの単量体が、特異的結合成員に加えてさらに３量体ドメインを含んでいるという点にある。ここにおいて、「３量体ドメイン」という語は、その他の類似の又は同一の３量体ドメインと相互作用する能力を有するペプチド、タンパク質又はその一部分である。この相互作用は、３量体タンパク質又はポリペプチドを産生するタイプのものである。かかる相互作用は、３量体ドメインの構成要素の間の共有結合によって、ならびに、水素結合力、疎水性力、ファンデルワールス力及び塩橋によってひき起こされ得る。
【００４２】
３量体ドメインの一例は、コレクチン頸部領域を含むポリペプチドを記述する国際公開第９５／３１５４０号パンフレットの中で開示されている。コレクチン頸部領域を構成するアミノ酸配列は、選択されたあらゆるポリペプチドに付着され得る。次に、コレクチン頸部領域アミノ酸配列を含む３つのポリペプチドを用いて、適切な条件下で３量体を作ることができる。
【００４３】
現在好ましい実施形態においては、３量体ドメインはテトラネクチンから誘導され、より詳細には国際公開第９８／５６９０６号パンフレットの中で記述されているテトラネクチン３量体化構造要素（以下ＴＴＳＥと呼ぶ）を含む。ＴＴＳＥのアミノ酸配列は、配列番号８１の中に示されている。ＴＴＳＥの３量体化効果は、比較的高温においてさえ例外的に安定している３重アルファヘリカルコイルドコイル３量体を形成するべくその他の２つのＴＴＳＥのコイルドコイル構造と相互作用するコイルドコイル構造によりひき起こされる。ＴＴＳＥという語は同様に、アルファヘリカルコイルドコイル３量体を形成するＴＴＳＥの能力に実質的な程度まで不利な影響を及ぼすことなくアミノ酸配列内で修飾された変異体である、タンパク質のテトラネクチンファミリーの自然に発生する成員のＴＴＳＥの変異体を包括するようにも意図されている。かくして、本発明に従った３量体ポリペプチドは、少なくとも９２％といった少なくとも８７％を含めた、少なくとも７５％といった少なくとも６８％のアミノ酸配列同一性を配列番号８１の配列を有する１つの配列を含むＴＴＳＥを３量体ドメインとして含み得る。これによると、ＴＴＳＥ（配列番号８１）のシステイン残基番号５０は、有利にも、セリン、トレオニン、メチオニンに対して、又はその他のあらゆるアミノ酸残基に対して突然変異誘発させられて、望ましくない多量体化を導く可能性のある望ましくない鎖間ジスルフィド架橋の形成を回避することができる。
【００４４】
さらなる実施形態においては、ＴＴＳＥ３量体ドメイン（配列番号８１）は、（ｉ）血液凝固因子Ｘａのための分割部位及び／又はポリヒスチジン配列の取込み、（ｉｉ）Ｃｙｓ５０とＳｅｒの置換及び（ｉｉｉ）Ｃ末端ＫＧＳ配列の内含により修飾され得る。
【００４５】
上述のＴＴＳＥ３量体ドメインを適用した本発明に従った異なる３量体ポリペプチドのいくつかの例が以下の実施例中で提供されている。これらには、特に、ＣＴＬＤベースのＴＮＦ結合単位ＴＮ−２−Ｂ（配列番号１０６）、ＴＮ−２−Ｃ（配列番号１０８）及びＴＮ−２−Ｄ（配列番号１０７）及び３量体化されたヒトＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０（配列１０９）が含まれる。
【００４６】
本発明に従うと、特異的結合成員は、３量体ドメインのＮ又はＣ末端アミノ酸残基のいずれかにリンクされ得る。しかしながら、或る種の実施形態においては、単量体の３量体ドメインのＮ末端及びＣ末端の両方に対し特異的結合成員をリンクさせ、かくして３量体サイトカインを結合する能力を有する６つの特異的結合成員を含む３量体ポリペプチドを提供することが有利であり得るということも考慮されている。
【００４７】
任意には特異的結合成員と３量体ドメインの間に可とう性ある分子リンカーを介在させ、これらを共有結合により接合させることができるということがわかるであろう。一部の実施形態においては、リンカーは、約１〜２０個のアミノ酸残基のポリペプチド配列である。該リンカーは、１０個未満のアミノ酸、最も好ましくは５、４、３、２又は１個のアミノ酸であり得る。或る種のケースでは、９、８、７又は６個のアミノ酸が適当であり得る。有用な実施形態においては、リンカーは基本的に非免疫原性であり、タンパク質分解による分割を受ける傾向をもたず、その他の残基（例えばシステイン残基）と相互作用するものとして知られているアミノ酸残基を含まない。
【００４８】
本発明の３量体ポリペプチドは、該３量体ポリペプチドが発現されるような条件の下で、この３量体ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された宿主を培養することにより、あらゆる適切な標準的タンパク質発現系の中で発現され得る。好ましくは、発現系は、所望のタンパク質をインビトロでそこから容易に単離させ再度折畳むことのできる系である。一般的に言って、高いタンパク質収量を得ることができ又効率の良い精製及び再折畳み戦略が利用可能であることから、原核生物発現系が好まれる。かくして、適切な又は好みの発現系を選択することは、過度の実験無く当業者の能力及び裁量の範囲内に充分入るものである。同様にして、本発明の３量体ポリペプチドのための一次アミノ酸配列がひとたび選択された時点で、当業者であれば、選択された宿主内のコドンバイアス、宿主体内での分泌シグナル配列に対するニーズ、シグナル配列内のプロティナーゼ分割部位の導入といったような因子を考慮に入れて、所望のタンパク質をコードすることになる適切な組換え型ＤＮＡ構成体を容易に設計することができる。これらの組換え型ＤＮＡ構成体は、選択された宿主に適した一定数の発現ベクターのいずれかの中に同じ枠内で挿入され得る。適切な又は好みの発現ベクターの選択も又、当業者の能力及び裁量の範囲内に充分入る事柄である。好ましくは、発現ベクターは、組換え型構成体の発現を駆動するため強いプロモータを内含することになる。最後に、３量体ポリペプチドは、当該技術分野において周知の適切な標準的手順を用いて単離され得、任意には例えば凍結乾燥といったようなさらなるプロセッシングを受けることができる。
【００４９】
本発明に従った３量体ポリペプチドは当該技術分野において周知のあらゆる適切な方法により医薬組成物の調製のために使用可能である。組成物は、３量体ポリペプチドと合わせて、１つ以上の受容可能な担体、そして任意にはその他の治療用成分を含むことができる。担体は、その他の成分と相溶性がありそのレシピエントにとって有害でないという意味で、受容可能でなくてはならない。一般に、医薬組成物の調製方法には、活性成分と担体の会合工程が含まれる。
【００５０】
本発明の治療的利用分野には、それを必要としている動物に対して本発明に従った３量体ポリペプチドを治療上有効な量だけ投与することにより、動物の体内の疾病又は疾患の治療が含まれる。上述のように、３量体サイトカイン、特にＴＮＦリガンドスーパーファリミリーの３量体サイトカインは、特に免疫及び炎症性応答を制御し調整することにより細胞間シグナル伝達分子として作用する多面発現ポリペプチドであることがわかっている。従って、本発明の３量体ポリペプチドは、炎症性疾患、自己免疫疾患、免疫疾患、感染症、悪性腫瘍、及び神経変性病を含めた、３量体サイトカインにより媒介される広範囲の疾患及び疾病の治療に適用可能でありうる。１つの有用な実施形態においては、疾病は、関節リウマチ、乾癬及びクローン病といったような腫瘍壊死因子により媒介される病理である。
【００５１】
本発明の３量体ポリペプチドは、非経口投与を含めたあらゆる適切な技術により動物に直接投与することができ、局所的又は全身的に投与可能である。特定の投与経路は、例えばその動物の病歴によって左右される。非経口投与の例には、皮下、筋内、静脈内、動脈内及び腹腔内投与が含まれる。
【００５２】
本書で、３量体融合タンパク質で治療できる可能性のある動物としては、ヒトといったような哺乳動物が含まれる。
【００５３】
最後に、本発明は、（ｉ）本発明に従った３量体ポリペプチドと標本を接触させる工程及び（ｉｉ）３量体サイトカインに対する３量体ポリペプチドの結合を検出する工程を含む、試料中の３量体ポリペプチドサイトカインを検出するための検定方法を提供している。
【００５４】
本発明はここで、以下の制限的意味のない例及び図中の例示を用いて記述されることになる。
【実施例】
【００５５】
実施例１
トリップＥ．ｃｏｌｉ発現プラスミド及び３量体サイトカイン結合剤の産生のためのファージミドの設計と構築
ファージミド
ファージミドｐｓｋｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてアマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により供給されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩプレカットベクター、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（コード番号：２７−９４０１−０１）へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号１）及びＮ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号２）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡフラグメントｓｋｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ＳｋｔｒｉｐＢインサートのヌクレオチド配列は、配列番号３として示されている。
【００５６】
ファージミドｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により供給されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩプレカットベクター、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（コード番号：２７−９４０１−０１）へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｓｆｉｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号１）及びＮ−ｓｆｉｋｐｎ−ｌ１０ＴＲＩ（配列番号４）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限ＤＮＡフラグメントｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢインサートのヌクレオチド配列は、配列番号５として示されている。
【００５７】
発現プラスミド
発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限プラスミドｐＴ７Ｈ６へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号６）及びＮ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号７）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限ＤＮＡフラグメントｂｋｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｂｋｔｒｉｐＢのヌクレオチド配列は、配列番号８として示されている。
【００５８】
発現プラスミドｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限プラスミドｐＴ７Ｈ６へと、オリゴヌクレオチドプライマＣ−ｂａｍｋｐｎ−ＴＲＩ（配列番号６）及びＮ−ｂａｍｋｐｎ−ｌ１０ＴＲＩ（配列番号９）を用いて発現プラスミドｐＴｔｒｉｐｂから増幅されたＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ制限ＤＮＡフラグメントｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢを連結させることによって構築された。ｂｋｌｔｒｉｐＢのヌクレオチド配列は、配列番号１０として示されている。
【００５９】
実施例２
ＴＮＦＲＩＩフラグメントを用いた３量体ＴＮＦ結合剤の設計と構築
テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づく３量体ＴＮＦ結合剤の構築のためには、ＴＮＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲＩＩ）のフラグメント及びサブユニットが使用された。設計及びクローニングは以下で概略的と説明されている。
【００６０】
ファージミドベクターへのＴＮＦＲＳＦ１Ｂフラグメントのクローニング
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１３として示されている。
【００６１】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１５として示されている。
【００６２】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１７として示されている。
【００６３】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１９として示されている。
【００６４】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２１として示されている。
【００６５】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２３として示されている。
【００６６】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１３として示されている。
【００６７】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１５として示されている。
【００６８】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１７として示されている。
【００６９】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号１９として示されている。
【００７０】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２１として示されている。
【００７１】
ファージミドベクターｐＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ１−ｒｅｖ（配列番号１１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２３として示されている。
【００７２】
ファージミドベクターｐＤ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２を連結させることによって構築される。Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２５として示されている。
【００７３】
ファージミドベクターｐＤ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２６として示されている。
【００７４】
ファージミドベクターｐＤ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２７として示されている。
【００７５】
ファージミドベクターｐＤ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２８として示されている。
【００７６】
ファージミドベクターｐＤ２１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２９として示されている。
【００７７】
ファージミドベクターｐＤ２Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３０として示されている。
【００７８】
ファージミドベクターｐＤ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２を連結させることによって構築される。Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２５として示されている。
【００７９】
ファージミドベクターｐＤ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／６を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２６として示されている。
【００８０】
ファージミドベクターｐＤ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／４を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２７として示されている。
【００８１】
ファージミドベクターｐＤ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／３を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２８として示されている。
【００８２】
ファージミドベクターｐＤ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ１／２を連結させることによって構築される。Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号２９として示されている。
【００８３】
ファージミドベクターｐＤ２Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＳｆｉＩ及びＫｐｎＩカットベクターｐｓｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＤ２−ｒｅｖ（配列番号２４）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。Ｄ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３０として示されている。
【００８４】
発現ベクターへのＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦＲＩＩ）レセプタフラグメントのクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３２として示されている。
【００８５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３３として示されている。
【００８６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３４として示されている。
【００８７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３５として示されている。
【００８８】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３６として示されている。
【００８９】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３７として示されている。
【００９０】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３９として示されている。
【００９１】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／６ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４０として示されている。
【００９２】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４１として示されている。
【００９３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／３ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４２として示されている。
【００９４】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／２ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４３として示されている。
【００９５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｄ４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４４として示されている。
【００９６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３２として示されている。
【００９７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３３として示されている。
【００９８】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３４として示されている。
【００９９】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３５として示されている。
【０１００】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３６として示されている。
【０１０１】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ１−ｒｅｖ（配列番号３１）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ１Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３７として示されている。
【０１０２】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号３９として示されている。
【０１０３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／６ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／６ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／６を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／６の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４０として示されている。
【０１０４】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１Ｄ１／４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４１として示されている。
【０１０５】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／３ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／３ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号１８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／３を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／３の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４２として示されている。
【０１０６】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２，１／２ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ１／２ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ１／２を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２，１／２の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４３として示されている。
【０１０７】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ１Ｄ４ｌ１０ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７Ｈ６−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＤ２−ｒｅｖ（配列番号３８）及びＤ４ｋｐｎ−ｆｏ（配列番号２２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＳｆｉＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＤ２Ｄ４を連結させることによって構築される。ＦＸＤ２Ｄ４の結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号４４として示されている。
【０１０８】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｉ１６２（配列番号８３）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８４として示されている。
【０１０９】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−ＧＳＳ（配列番号８５）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８６として示されている。
【０１１０】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ｐＴ７−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｄ２３５（配列番号８７）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８８として示されている。
【０１１１】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８２）及びｐＫｐｎＩ−Ｉ１６２（配列番号８３）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｉ１６２−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号８９として示されている。
【０１１２】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋｌ１０ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８３）及びｐＫｐｎＩ−ＧＳＳ（配列番号８５）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ２−ＧＳＳを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９０として示されている。
【０１１３】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩカットベクター、ＰＴ７−ｂｋＩ１０−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＢａｍＨＩ−Ａ５（配列番号８３）及びｐＫｐｎＩ−Ｄ２３５（配列番号８７）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５を連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｉ１０−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９１として示されている。
【０１１４】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩカットベクター、ｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＫｐｎＩ−Ｖ１７（配列番号９２）及びｐＢＡＤ６Ｈ（配列番号９３）を用いて）ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントＶ１７−ＴｒｉｐＢを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９４として示されている。
【０１１５】
発現ベクターｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩカットベクター、ｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｐＫｐｎＩ−Ｖ１７（配列番号９２）及びｐＢＡＤ６Ｈ（配列番号９３）を用いて）ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントＶ１７−ＴｒｉｐＢを連結させることによって構築される。ＡＤ１Ｄ４−Ｄ２３５−Ｖ１７−ｔｒｉｐＢの結果として得られたヌクレオチド配列の概要は、配列番号９５として示されている。
【０１１６】
実施例３
３量体化ＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＢの産生、再折畳み及び精製
（ＴＮＦＲＩＩ誘導体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０−ＴｒｉｐＢを発現する）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現プラスミドｐＴ７Ｄ１Ｄ４ＧＳＳｌ１０の構築については、上記実施例２の中で記述されている。
【０１１７】
３量体化されたヒトＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０（配列番号１０９）は、スチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）及びモファット（Ｍｏｆｆａｔ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８９；１１３−１３０、１９８６によって記述されているように中規模（６×１リットル）のＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞中でプラスミドｐＴ７ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０を成長させ発現させることにより産生された。簡単に言うと、３７℃で指数増殖する培養を、約５という多重度でバクテリオファージλ−ＣＥ６を用いて０．８というＯＤ６００で感染させた。培養をさらに３時間３７℃で成長させてから、遠心分離により細胞を収獲した。細胞を浸透圧衝撃及び音波処理により分解させ、合計細胞タンパク質を（トリズマ（Ｔｒｉｓｍａ）塩基でｐＨ８に調整した）フェノール中に抽出させた。２．５体積のエタノールの添加と遠心分離によりフェノール相からタンパク質を沈降させた。６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び５０ｍＭのジチオエリスリオールを含む緩衝液中に、タンパク質ペレットを溶解させた。８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール中へのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（アマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのゲル浸透の後、融合タンパク質の精製のため（ホチュリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）ら、１９８８）そしてカラム上に固定化される一方で国際公開第９４／１８２２７号パンフレットで以前に記述された通りの循環折畳み手順を受けるためＮｉ２＋活性化ＮＴＡ−アガロース（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ドイツ）カラムに対し、粗製タンパク質調製物を適用した。
【０１１８】
液体クロマトグラフィのために調製された全ての緩衝液を、還元剤添加及び／又は使用に先立ち、真空下で脱ガスした。
【０１１９】
Ｎｉ２＋ＮＴＡ−アガロースカラム上に粗製タンパク質抽出物を適用した時点で、カラム溶出液の２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が安定するまで１カラム体積のローディングバッファとそれに続く６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールで洗浄することによって、大腸菌及びλファージタンパク質の大部分から融合タンパク質、ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０を精製した。
【０１２０】
表１に記されているような勾配管理プロフィールそして、緩衝液Ａとして０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び２ｍＭ／０．２ｍＭの還元／酸化済みグルタチオン及び緩衝液Ｂとして８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び３ｍＭの還元済みグルタチオンを用いて、融合タンパク質を、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロースカラム上で再折畳みさせた。
【０１２１】
循環折畳み手順の完了後、８Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ及び１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８を含有する緩衝液でＮｉ２＋ＮＴＡ−アガロースカラムからＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を溶出させた。
【０１２２】
Ｓ−及びＱ−セファロース（アマーシャム・バイオサイエンス（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のイオン交換クロマトグラフィにより２量体又はより高次の多量体から、単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を精製した。溶出緩衝液により溶出された融合タンパク質（融合タンパク質材料の約８０％）を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５上の８Ｍの尿素、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０及び２５ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液の中にゲルろ過させ、Ｓ−セファロースイオン交換カラム上に適用した。「ランスルー」画分中の結合していないタンパク質を、Ｑ−セファロースカラム上に直接投入した。１０カラム体積全体にわたり、８Ｍの尿素、２５ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８から８Ｍの尿素、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８までの線形勾配で、Ｑ−セファロースカラムから単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質を溶出させた。単量体ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０融合タンパク質は、勾配の極く初期に溶出し、一方２量体及びより高次の多量体はさらに遅く溶出した。単量体融合タンパク質を含有する画分を復元させ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１２５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液中にゲルろ過させた。
【０１２３】
【表３】
【表４】
【表５】
【０１２４】
実施例４
３量体化されたＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−ｌ１０の生物活性
実施例３中に記述されている通りに産生された３量体化されたＴＮＦＲＩＩフラグメントＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−１１０の生物活性を、ＴＮＦアルファ媒介細胞毒性の阻害を決定するためＬ９２９細胞検定において測定した。
【０１２５】
ＴＮＦアルファ媒介細胞毒性を測定するために、マウス線維芽細胞系統Ｌ９２９（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５０１１４２５）を使用した。１０％のＦＢＳ及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）で補足したＲＰＭＩ１６４０液体培地（バイオウィッタカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、英国）中に維持した。細胞を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、ロスキレ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）内に３×１０５細胞／ｍｌ及び７５μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ１６４０培地の割合で平板固定し、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩培養した。組換え型ヒトＴＮＦアルファ（ｒｈＴＮＦａ、ＲＤシステムズ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、英国）（１ｎｇ／ｍｌ及び０．１ｎｇ／ｍｌ）を、２μ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で補足された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中のさまざまな濃度（１０倍希釈）の３量体化されたレセプタフラグメント（ＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０）と共に、５％のＣＯ２中で３７℃で１時間インキュベートした。その後、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩のインキュベーションのため、細胞培養に７５μｌ／ウェルのＴＮＦ−アルファ／３量体化レセプタフラグメントの混合物を添加した。各濃度のＴＮＦ−アルファ／レセプタフラグメントの混合物を３通りで試験した。セルタイター９６非放射性細胞増殖検定キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））の一部分として、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル］−２，５−ジ−フェニル−テトラゾリウム臭化物）を用いて細胞増殖を決定した。１５０μｌ体積で培養された細胞を含む１つの９６ウェル平板に充分な試薬を調製するために、１５０μｌのＰＭＳに対し３．０ｍｌのＭＴＳ溶液を添加した。３０μｌ／ウェルの組合されたＭＴＳ／ＰＭＳ溶液を添加し、ＥＬＩＳＡ平板読取り装置を用いて４９２ｎｍでの吸収度を記録する前に、５％のＣＯ２中３７℃で１〜４時間、平板をインキュベートした。各検定には、細胞を伴うＴＮＦアルファ、細胞単独及び緩衝液対照という対照も内含された。
【０１２６】
実験の結果は、図４に要約されている。ＴＮＦアルファの細胞毒性効果は、最も高い濃度のＡＤ１Ｄ−４−ＧＳＳ−ｌ１０の存在下で有意に阻害され、かくして、該化合物の生物活性を実証した。
【０１２７】
実施例５
Ｄ２Ｅ７抗体フラグメントを用いた３量体ＴＮＦ結合剤の設計、構築及び産生
ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７の１本鎖抗体可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）が、ＴＮＦを結合する能力を有する３量体ポリペプチドの構築における結合剤として選択される。３量体結合剤は、米国特許第６，０９０，３８２号明細書中に開示された配列に基づいて、Ｄ２Ｅ７のＶＨ及びＶＬドメインを増幅することによって構築可能である。
【０１２８】
Ｎ末端ｓｃＦｖとＣ末端３量体化ドメインの間のＧｌｙ、Ｔｈｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢの構築である。このベクターは、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ｂｋｔｒｉｐＢベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマＦＸＶＨ（配列番号４５）及びＶＨＢａｍＫｐｎ（配列番号４６）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ（Ｄ７Ｅ２ＶＨ）を連結させることによって構築される。第２工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＧ４ＳＶＬ（配列番号４７）及びＶＬｋｐｎ（配列番号４８）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＧ４ＳＶＬを連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢの構築である。ＦＸＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は配列番号４９として示されている。
【０１２９】
Ｎ末端ｓｃＦｖとＣ末端３量体化ドメインの間のＧｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ｂｋｔｒｉｐＢベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマＦＸＶＨ（配列番号４５）及びＶＨＢａｍＫｐｎ（配列番号４６）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ（Ｄ７Ｅ２ＶＨ）を連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢの構築である。第２工程は、ＢａｍＨＩＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ（Ｄ２Ｅ７ＶＨ）ｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマＧ４ＳＶＬ（配列番号４７）及びＶＬＧ４Ｓｋｐｎ（配列番号５０）を用いて）Ｄ２Ｅ７の配列を含むＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＧ４ＳＶＬを連結させることによるｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢの構築である。結果として得られるＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４Ｓのヌクレオチド配列は配列番号５１として示されている。
【０１３０】
Ｎ末端３量体化ドメインとＣ末端ｓｃＦＶの間のＧｌｙ、Ｓｅｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７６ＨＦＸＴｒｉｐＡＧＳＤ２Ｅ７は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでカットされたベクター、ｐＴ７６ＨＦＸｔｒｉｐａ（ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．；３４７：８３−８７、２０００）へと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｃｌＶＨ（配列番号５２）及びＶＬｈｉｎｄ（配列番号５３）を用いて）ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢから増幅されたＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントを連結することによって構築される。結果として得られるＧＳＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は、配列番号５４として示されている。
【０１３１】
Ｎ末端３量体化ドメインとＣ末端ｓｃＦＶの間のＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒリンカーを伴う３量体Ｄ２Ｅ７ｓｃＦｖの設計及び構築
発現ベクターｐＴ７６ＨＦＸＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩでカットされたベクター、ｐＴ７６ＨＦＸｔｒｉｐａ（ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．；３４７：８３−８７、２０００）へと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｃｌＧＡＳＶＨ（配列番号５５）及びＶＬｈｉｎｄ（配列番号５３）を用いて）ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢから増幅されたＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限ＤＮＡフラグメントを連結することによって構築される。結果として得られるＧ４ＳＤ２Ｅ７のヌクレオチド配列は、配列番号５６として示されている。
【０１３２】
上述の融合タンパク質Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢ、Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢ、Ｈ６ＦＸＴｒｉｐＡＤ２Ｄ７ＴｒｉｐＡ及びＨ６ＦｘＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７を調製するためには、プラスミドｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７ｔｒｉｐＢ、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＤ２Ｅ７Ｇ４ＳｔｒｉｐＢ、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴｒｉｐＡＤ２Ｄ７ＴｒｉｐＡ及びｐＴ７Ｈ６ＦｘＴｒｉｐＡＧ４ＳＤ２Ｅ７をスチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、（１９９０）によって記述されている通りに、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１細胞中において小規模で（１リットル；２×ＴＹ培地、５ｍＭのＭｇＳＯ４及び１００ ４ｇアンピシリン）成長させる。３７℃で指数増殖している培養を、０．８のＯＤ６００で、約５の多重度でバクテリオファージラムダＣＥ６に感染させる。培養をさらに３時間３７℃で成長させ、細胞を遠心分離によって収獲する。細胞を５０ｍｌの０．５Ｍ、ＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８中で再懸濁させる。各々にフェノール（ｐＨ８に調整された５０ｍｌ）を添加し、合計タンパク質を抽出するために混合物を音波処理する。遠心分離（１０．０００ｇで２５分間）による清澄化の後、２．５体積のエタノールを添加し遠心分離することによりフェノール相から粗製タンパク質画分を沈殿させる。６Ｍの塩化グアニジニウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び０．１Ｍのジチオエリスリオールを含む緩衝液（１５〜２５ｍｌ）中に、タンパク質ペレットを溶解させる。８Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中へのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）スウェーデン）上でのゲル浸透の後、精製のため（ホチュリ（Ｈｏｃｈｕｌｉ）ら、１９８８）Ｎｉ活性化ＮＴＡ−アガロースカラム（７５ｍｌのカラム体積）に対し、粗製タンパク質調製物を適用する。次に安定した基線が得られるまで、カラムを通して洗浄緩衝液（６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）を流す。
【０１３３】
その後、ほぼ純粋な融合タンパク質は、各々のカラムに対するｐＨ勾配（５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム（ｐＨ５緩衝液）及び５０ｍＭのリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８緩衝液）を含む溶液の線形（体積による）混合により得られる８Ｍの尿素及び１０ｍＭの２−メルカプトエタノール中の１０００ｍｌ勾配）を適用することによって溶出される。
【０１３４】
トーゲルセンら（Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ）（国際公開第９４／１８２２７号パンフレット）の方法によるインビトロでの再折畳みに備えて、２０ｍｇずつの各々の精製融合タンパク質を、約７５ｍｌの充てん層体積のカラムを生成するのに充分なＮｉ２＋活性化ＮＴＡ−アガロースマトリクスの懸濁液アリコートと再折畳み用「緩衝液Ｂ」（以下で記述）中の懸濁液内で混合させる。このとき、「緩衝液Ａ」として０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭグルタチオン及び０．２ｍＭの酸化グルタチオンを含む緩衝液を、又、「緩衝液Ｂ」として８Ｍの尿素、１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８及び２ｍＭのグルタチオンを含む緩衝液を用いて１０℃で融合タンパク質を含むｓｃＦｖの再折畳みが実施されるという点を除いて、国際公開第９４／１８２２７号パンフレット内のプラスミノーゲンクリングル４について記述された通りの反復的再折畳み手順に各々の融合タンパク質を付す。
【０１３５】
再折畳み手順の完了後に、グルタチオンを洗い流すため、０．５ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８を含む３００ｍｌの緩衝液で各カラムを洗浄する。各タンパク質の再折畳みされた画分を次に、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８中のＮＴＡ−アガロースから溶出緩衝液へと溶出させる。各々のタンパク質試料に約８Ｍの最終濃度を達成するための固体尿素の添加、及びＮａＣｌ濃度を５ｍＭ未満まで低下させるための希釈又は透析の後、イオン交換クロマトグラフィ（２ｍｌ／分で溶出された８Ｍの尿素、５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８の１Ｍ原液から）及び２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５の１Ｍ原液から）を含有する緩衝液中の９０センチメートルのカラムによるＳ−セファロース、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，１，６（ｉ．ｄ．））により、各々の適正に折畳まれた融合タンパク質生成物の最終的精製を達成する。水性緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）に対する透析の後、各々の純粋かつ適正に再折畳みされた融合タンパク質を、成長した培養１リットルあたり２〜６ｍｇの収量で回収する。
【０１３６】
実施例６
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂレセプタフラグメントを用いた３量体ＡＰＲＩＬ結合剤の設計及び構築
ＡＰＲＩＬレセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂは、３量体サイトカインＡＰＲＩＬに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。異なるリンカーでのこのような結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１３７】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ６ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ６ｋｐｎ（配列番号６０）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６１として示されている。
【０１３８】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ１０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０ｋｐｎ（配列番号６２）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ１０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ１０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６３として示されている。
【０１３９】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ２０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターｐＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦＲ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦＲ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０ｋｐｎ（配列番号６４）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＳＦ１３Ｂ２０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ２０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６５として示されている。
【０１４０】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ３０ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０ｋｐｎ（配列番号６６）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ３０の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６７として示されている。
【０１４１】
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１のクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳ１３Ｂ６１ｔｒｉｐＢは、２工程で構築される。第１工程は、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂｇｌｉｉＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５７）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂｋｐｎ（配列番号５８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを連結させることによって、ｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂを構築することから成る。第２工程は、標準的な手順を用いて、ＫｐｎＩでカットされたｐＴ７Ｈ６ＦＸ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂベクターへと、（オリゴヌクレオチドプライマｋｐｎ？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（配列番号５９）及び？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１ｋｐｎ（配列番号６８）を用いて）ヒト骨髄及びヒト白血球（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１８１−１及び７１８２−１）の混合物から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメント？ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１を連結させることによって、最終的発現ベクター、ｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１ｔｒｉｐＢを構築することから成る。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ６１の結果として得られたヌクレオチド配列は、配列番号６９として示されている。
【０１４２】
実施例７
ＴＮＦＲＳＦＦｎ１４レセプタフラグメントを用いた３量体ＴＷＥＡＫ結合剤の設計及び構築
ＴＷＥＡＫレセプタＴＮＦＲＳＦＦｎ１４は、３量体サイトカインＴＷＥＡＫに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。該結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１４３】
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＦｎ１４ｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍＦｎ−ｒｅｖ（配列番号７０）及びＦＮＫｐｎ−ｆｏ（配列番号７１）を用いて）ヒトの心臓（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１２１−１）から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＦｎ１４を連結させることによって構築される。ＦＸＦｎ１４の結果として得られるヌクレオチド配列の概要は、配列番号７２として示されている。
【０１４４】
実施例８
ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃレセプタフラグメントを用いた３量体ＢＡＦＦ結合剤の設計及び構築
ＢＡＦＦレセプタＴＮＦＲＳＦ１３Ｂは、３量体サイトカインＢＡＦＦに対する３量体結合剤の構築のために使用され、テトラネクチンから誘導された３量体化ドメインＴｒｉｐＢに基づいている。該結合剤の設計及びクローニングを以下で概略説明する。
【０１４５】
３量体ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃフラグメントのクローニング
発現ベクターｐＴ７Ｈ６ＦＸＴＮＦＳＦ１３ＣｔｒｉｐＢは、標準的な手順を用いてＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでカットされたベクターＰＴ７Ｈ６−ｂｋｔｒｉｐＢへと、（オリゴヌクレオチドプライマｂａｍ１３Ｃ−ｒｅｖ（配列番号７３）及び１３Ｃｋｐｎ−ｆｏ（配列番号７４）を用いて）ヒトのリンパ節（クローンテック・ラボラトリーズ・インク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号７１６４−１）から単離された、ｃＤＮＡから増幅されたＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ制限ＤＮＡフラグメントＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｃを連結させることによって構築される。ＦＸＴＮＦＲＳＦ１３Ｃの結果として得られるヌクレオチド配列の概要は、配列番号７５として示されている。
【０１４６】
実施例９
ＴＮＦのための３量体化されたＣＴＬＤ結合剤の単離及び構築
国際公開第０２４８１８９号パンフレット中で以前に開示されているようなテトラネクチン（配列番号９６）Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造は、３量体サイトカインＴＮＦ（ＴＮＦアルファ）のための３量体結合単位の単離及び構築のために使用された。結合単位の設計及びクローニングについて以下で概略説明されている。
【０１４７】
ライブラリ構築及び一次的選択
ＴＮＦ ＣＴＬＤ結合剤を単離するために、ファージ提示法を使用した。使用したファージ提示ライブラリは、テトラネクチンの１価のＣＴＬＤフォーマット（配列番号９７）であった。組合せライブラリＰｈｔＣＴＬＤ−Ｉｂ００３（国際公開第０２４８１８９号パンフレット、実施例５）及び、ＰｈｔＣＴＬＤ−Ｉｂ００３として必須とされたもののループ１のための２つの付加的なランダム化されたオリゴヌクレオチドすなわち、テトラネクチン（配列番号９８）アミノ酸残基位置１１６−１２２でランダム化されたＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｒｅｖ及びＴＮ−１ｉｂ２−ｔｐｒｅｖ（配列番号９９）及びループ４のための２つの付加的なオリゴヌクレオチドすなわち位置１４６−１４９でランダム化されたＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｆｏ（配列番号１００）及び組立て反応内のＴＮ−１ｉｂ２−ｔｐｆｏ（配列番号１０１）を含む。前記ライブラリの変異体、インプットとして約１×１０１２のファージをそして第１回パニングラウンド内で１０μｇ／ｍｌ、第２ラウンドで１μｇ／ｍｌのビオチニル化ＴＮＦを用いて、２回の選択ラウンドを実施した。
【０１４８】
選択は以下の通りに実施された。すなわち、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ））２０μｌを１ｍｌのＰＢＳ（ＰＢＳ、０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、８ｇのＮａＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、２Ｈ２Ｏ、１ｌに至るまでの水そしてｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）の中で２回洗浄し、室温で１時間３％の脱脂粉乳中で遮断させ、３％の脱脂粉乳／ＰＢＳ中の２５０μｌの予め遮断されたファージを２５０μｌの可溶性ビオチニル化ＴＮＦと混合し、３０分間３７℃でインキュベートさせた。ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１回、ＰＢＳ中で２回ストレプトアビジンビーズを洗浄した後、これらを反応に加えて、抗原結合したファージを捕捉した。ビーズをＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳで大規模に洗浄し、室温で３０分間２００μｌの５０ｍＭジチオトレイトールでビーズから抗原結合ファージを溶出させた。溶出したファージを、指数増殖するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞内で再度感染させた後、２％のグルロース及び０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＴＹの寒天平板上で平板固定し滴定した。
【０１４９】
ＥＬＩＳＡ内でＴＮＦアルファに対する結合の分析による選択された集団からの単一のクローンのスクリーニングは、ＥＬＩＳＡ中で被膜用に用いた抗原が５μｇ／ｍｌのＴＮＦであったという点を除いて、基本的に国際公開第０２４８１８９号パンフレットの中で記述されている通りに実施された。
【０１５０】
ＴＮ３−２と呼ばれる特異的ＴＮＦアルファ結合剤を、第２の選択ラウンドから単離した（表４）。
【０１５１】
二次ライブラリの構築及び親和力による選択
ＴＮ３−２に対し新しい配列変動を導入することによってＴＮ３−２のＴＮＦ親和力を改善できるか否かを調査した。ＴＮ３−２突然変異体のライブラリの構築のためには、鋳型としてＴＮ３−２クローンを使用し、オリゴヌクレオチドＴＮ−ｌｉｂ２−ｔｐｆｏ（配列番号１０１）及びＴＮ−ｌｉｂ３−ｔｐｆｏ（配列番号１００）（Ｌｉｂ．ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒ）を用いてループ４内で新しいランダム化に付した。該ライブラリ構築は基本的に国際公開第０２４８１８９号パンフレット内で記述されている通りに行なった。
【０１５２】
ビオチニル化ＴＮＦの濃度を減少させながら（１００ｎｇ／ｍｌから０．１ｎｇ／ｍｌへ）、３回の親和力駆動型選択ラウンドの中で、ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒライブラリを使用した。上述の通りに選択を行なった。陽性クローンについてのスクリーニングを上述の通りに行なった。
【０１５３】
結果
親クローンＴＮ３−２の配列は、ループ１（テトラネクチンアミノ酸番号１１６−１２２）及びループ４（テトラネクチンアミノ酸番号１４６〜１４９）内のテトラネクチンとは異なっていた。ＴＮ３−２ｌｏｏｐ４ｒライブラリに対する３回の親和力による選択の後、陽性クローンをＥＬＩＳＡ分析により同定し、４８のクローンのうちの４５個がＴＮＦアルファに結合することが示された。同定されたＴＮＦアルファ結合クローンとその対応する配列番号のセレクションのうちループ１及びループ４が表４で示されている（ＴＮ３−２−Ｂ、ＴＮ３−２−Ｃ、ＴＮ３−２−Ｄ）。
【０１５４】
【表６】
ａ：テトラネクチン中のループ４配列の外での突然変異
【０１５５】
実施例１０
ＴＮＦについての３量体化ＣＴＬＤ結合剤の親和力測定
実施例７に記述されている通りに単離された単量体ＣＴＬＤＴＮＦアルファ結合剤をコードするＤＮＡインサートを、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＡＤ発現ベクター（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）ＵＳＡ）内にサブクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換え型単量体ＴＮＦアルファ結合剤を発現させ、メーカーの指示事項に従って周辺質からこれを精製した。精製された単量体を１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２の中に透析し後、バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）上で分析した。
【０１５６】
ＴＮＦアルファ結合剤の３量体フォーマットを発現させるため、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌ ＩＩ及びＭｕｎＩで、（実施例７からの）ＴＮＦアルファ結合剤をコードする適切なＤＮＡインサートを分割し、ＤＮＡフラグメントを含むループ１及び４をＢｇｌ ＩＩ ＭｕｎＩ制限Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＴ７Ｈ６ＦＸ−ｈｔｌｅｃ ＤＮＡ内にサブクローニングさせた（国際公開第０２／４８１８９号パンフレット、実施例１及び図５で概略説明されている通り）。
【０１５７】
組換え型３量体ＴＮＦアルファ結合剤をＥ．ｃｏｌｉ内で発現させ、折畳み解除された融合タンパク質誘導体の精製を、基本的に国際公開第９４／１８２２７号パンフレット、実施例９中に記述されている通りに実施した。
【０１５８】
簡単に言うと、８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール中でＮｉ２＋荷電ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）カラム上に融合タンパク質を投入することにより、ＴＮＦアルファ結合剤の再折畳みを実施した。投入された後、カラムを循環再折畳み手順に付した。使用した再折畳み緩衝液は、復元緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭの還元グルタチオン及び０．２ｍＭの酸化グルタチオン）及び変性緩衝液Ｂ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、３ｍＭの還元グルタチオン）であった。再折畳みされた融合タンパク質を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０，５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡから溶出させ、融合タンパク質を一晩４℃でウシ血液凝固因子Ｘａ（プロテインエンジニアリングテクノロジー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）オルフス（Ａａｒｈｕｓ），デンマーク）により１：１００（ｗ／ｗ）で分割した。分割したタンパク質を８Ｍの尿素、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液中に、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５上でのゲルろ過により取り込み、１０ｍｌのＳＰ−セファロースカラム（アマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））上に投入し、２０カラム体積全体にわたり５０ｍＭから５００ＭのＮａＣｌまで勾配溶出させた。非還元性ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により判断されるように分割された単量体タンパク質を含有する画分をプールし、緩衝液を１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２に対し、ＰＤ１０カラム上のゲルろ過（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））により交換させた。
【０１５９】
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００計器（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）スウェーデン）上で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析を実施した。固定化させるべきＴＮＦアルファ捕捉抗体（ＡＨＣ３７１２、バイオソース・インターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｓｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０中に溶解させ、次にアミンカップリングキット（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）、スウェーデン）を用いてＣＭ５ ＢｉａＣｏｒｅセンサーチップ上で固定化させた。
【０１６０】
５μｌ／分の流速で結合分析を実施した。タンパク質試料の投入の前に、チップを１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、５０μＭのＥＤＴＡ及び０．００５％の界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）Ｐ２０の中で平衡化した。ＴＮＦアルファを１０μｇ／ｍＬで１０ｍＭのトリスｐＨ８．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２中に溶解させて、１０μＬを注入した。単量体又は３量体フォーマットのＴＮＦアルファ結合剤のアリコート（２０μｌ）をＫＩＮＪＥＣＴオプションを用いて注入した。チップを、１０ｍＭのグリシンｐＨ２．５で再生させる前に５分間解離させた。ＴＮＦアルファ結合剤の結合を１〜２００ｎＭの範囲内の６つの異なるタンパク質濃度でテストした。ＢＩＡ評価プログラム、バージョン３．２（バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ））を用いて、結合データを評価した。
【０１６１】
表５は、バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）データから導出された反応速度値を示している。ＴＮＦアルファ結合剤ＴＮ３−２−Ｂ、ＴＮ３−２−Ｃ、ＴＮ３−２−Ｄを３量体化することのもつ結合活性効果は、単量体結合剤から対応する３量体結合剤（ＴＮ−２−Ｂ、ＴＮ−２−Ｃ及びＴＮ−２−Ｄ）に移行する親和力の増加倍数からわかる。
【０１６２】
【表７】
【０１６３】
ＴＮＦアルファ結合剤を３量体化することにより、親和力（ＫＤ）の著しい増大が得られる。例えば単量体ＴＮ３−２−Ｂは、非常に低いＫoｆｆ値を有する。これに対して、同じＣＴＬＤ結合剤の３量体バージョン（ＴＮ−２−Ｂ）は、１０００倍を超える改善を示すｋｏｆｆ値を有する。一般に３量体化によってオフレートが改善することがわかる。その上、実施例７の低い密接性の親クローンＴＮ３−２は、単量体が検出レベルより低い親和力しかもたなかったため、その３量体形態でしかバイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）上で測定できなかった。
【０１６４】
参考文献
スチュディア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）及びモファット（Ｍｏｆｆａｔ）、（１９８６）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１８９：１１３−１３０
ホチュリ、Ｅ（Ｈｏｃｈｕｌｉ，Ｅ．）、バンワース、Ｗ（Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．）、ドベリ、Ｈ（Ｄｏｅｂｅｌｉ，Ｈ．）、ゲンツ、Ｒ（Ｇｅｎｔｚ，Ｒ．）及びスチューバ、Ｄ（Ｓｔｕｅｂｅｒ，Ｄ．）、（１９８８）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１３２１−１３２５
ローレントセン、ＲＨ（Ｌｏｒｅｎｔｓｅｎ，ＲＨ．）ら、（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、３４７：８３−８７
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】さらに２つのサイトカインレセプタのさらなる動員を開始して結果として６量体サイトカイン・レセプタシグナリング単位の形成をひき起こす、腫瘍壊死因子スーパーファミリー内の３量体サイトカインの、対応する細胞結合型単量体レセプタに対する結合を示す。
【図２】３量体サイトカインと１：１の複合体を形成する、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）内の３量体サイトカインに対する２価結合剤の結合を示す。該２価結合剤が３量体ＴＮＦＳＦサイトカインに結合する場合、考えらえる３つのレセプタ結合部位のうちの２つのみが２価結合剤分子により占有され、第３のレセプタ結合部位は、開放状態に残される。このことはすなわち、開放した３量体サイトカインレセプタ結合部位は、細胞表面の３量体サイトカインレセプタと会合し、かくして細胞表面上のレセプタの高い局所的濃度に起因して３量体レセプタのさらなる動員ひいてはシグナル伝達を開始させることができる、ということを意味する。
【図３】３量体サイトカインとの１．１の複合体を形成すると同時に３量体サイトカインの３つのレセプタ結合部位全てを有効に結合させ、かくしていかなるレセプタ結合部位も開放状態に残されないようにする能力を有する３量体サイトカイン用結合剤を示す。細胞表面に対するサイトカインのドッキングは遮断され、従っていかなるシグナル伝達も発生しないことになる。
【図４】１０倍希釈物中での３量体化されたレセプタフラグメントＤ１Ｄ４ＧＳＳＩ１０Ｔｒｉｐのための２つの異なる固定されたＴＮＦアルファ濃度（１．０ｎｇ／ｍｌ及び０．１ｎｇ／ｍｌ）でのマウス線維芽細胞系統Ｌ９２９検定におけるＴＮＦアルファに媒介される細胞毒性の阻害を示す。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含み、かつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチド。
【請求項２】
前記３量体サイトカインが腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの一員である、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項３】
前記腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの前記成員が、ＬＴＡ；ＴＮＦ；ＬＴＢ；ＴＮＦＳＦ４；ＴＮＦＳＦ５；ＴＮＦＳＦ６；ＴＮＦＳＦ７；ＴＮＦＳＦ８；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０；ＴＮＦＳＦ１１；ＴＮＦＳＦ１２；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；及びＴＮＦＳＦ１８から成る群の中から選択されている、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項４】
前記特異的結合成員が腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの一員から誘導されたポリペプチドである、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項５】
前記腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの前記成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＬＴＢＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ Ｆｎ１４、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２２、及びＴＮＦＲＳＦ２３から成る群の中から選択されている、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項６】
前記特異的結合成員がＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ｐ５５ＴＮＦレセプタ）から誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項７】
前記特異的結合成員がＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ｐ７５ＴＮＦレセプタ）から誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項８】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）から成る群の中から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項９】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）から成る群の中から選択されたＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記特異的結合成員が、抗体又は抗体フラグメントである、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記抗体又は抗体フラグメントが、アミノ酸残基１−１８、１−２０、１−２６、１−３０、１２−２２、２２−３１、２２−４０、３６−４５、４９−９７、４９−９８、５６−７９、５８−６５、６９−９７、７０−８７、７６−９０、９６−１０５、１０５−１２８、１０８−１２８、１１０−１２７、１１５−１２５、１１７−１２８、１３２−１５７、１３５−１５５、１３６−１５３、１３８−１４９、１４１−１５３及び１４６−１５７から成る領域の中から選択された少なくとも１つの領域内でヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する、請求項１０に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記抗体又は抗体フラグメントが、ＭＡｂ １（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０１）、ＭＡｂ ２１（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３２）、ＭＡｂ ２５（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０１）、ＭＡｂ ３２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０２）、ＭＡｂ ３７（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０３）、ＭＡｂ ４２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０４）、ＭＡｂ ４７（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０２）、ＭＡｂ ５３（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３３）及びＭＡｂ ５４（ＥＣＡＣＣ ８９０８３１０３）又はそのフラグメントの中から選択されている、請求項１１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗体がＤ２Ｅ７又はそのフラグメントである、請求項１０に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記抗体がＣＤＰ ８７０又はそのフラグメントである、請求項９に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記特異的結合成員が、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造を有するタンパク質である、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｃ型レクチン様ドメインの前記足場構造を有する前記特異的結合成員が、ＴＮ３−２−Ｂ（配列番号１０３）、ＴＮ３−２−Ｃ（配列番号１０４）、及びＴＮ３−２−Ｄ（配列番号１０５）から成る群の中から選択されている、請求項１５に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記３量体化ドメインが、テトラネクチンから誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１８】
テトラネクチンから誘導された前記３量体ドメインが、配列番号８１の配列と少なくとも６８％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列同一性が、少なくとも７５％、例えば少なくとも９２％を含め少なくとも８７％である、請求項１８に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２０】
テトラネクチンから誘導された前記３量体ドメインが、アミノ配列番号８１を含む、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２１】
ＴＮ−２−Ｂ（配列番号１０６）、ＴＮ−２−Ｃ（配列番号１０８）、ＴＮ−２−Ｄ（配列番号１０７）及びＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０（配列番号１０９）から成る群の中から選択された、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２２】
前記特異的結合成員と前記３量体ドメインの間のリンカーをさらに含む、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の前記３量体ポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の前記３量体ポリペプチド又は請求項２３に記載の前記組成物を有効量だけ、腫瘍壊死因子といったような３量体サイトカインにより媒介される病理を有する患者に対し投与することを含む、前記患者の治療方法。
【請求項２５】
前記腫瘍壊死因子により媒介される病理が、関節リウマチ、乾癬、及びクローン病から成る群の中から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
３量体ポリペプチドサイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含み、かつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチドの調製方法であって、（ｉ）前記３量体ポリペプチドが発現されるような条件下で前記３量体ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された宿主を培養する工程、及び（ｉｉ）前記３量体ポリペプチドを単離する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）から成る群の中から選択される１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）から成る群の中から選択されたＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の３量体ポリペプチドの使用。
【請求項３０】
医薬組成物の調製のための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の３量体ポリペプチドの使用。
【請求項３１】
（ｉ）請求項１に記載の３量体ポリペプチドと試料を接触させる工程、及び（ｉｉ）３量体サイトカインに対する前記３量体ポリペプチドの前記結合を検出する工程を含む、前記試料中の前記３量体サイトカインを検出するための検定方法。
【請求項１】
３量体サイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含み、かつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチド。
【請求項２】
前記３量体サイトカインが腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの一員である、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項３】
前記腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーの前記成員が、ＬＴＡ；ＴＮＦ；ＬＴＢ；ＴＮＦＳＦ４；ＴＮＦＳＦ５；ＴＮＦＳＦ６；ＴＮＦＳＦ７；ＴＮＦＳＦ８；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０；ＴＮＦＳＦ１１；ＴＮＦＳＦ１２；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；及びＴＮＦＳＦ１８から成る群の中から選択されている、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項４】
前記特異的結合成員が腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの一員から誘導されたポリペプチドである、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項５】
前記腫瘍壊死因子レセプタスーパーファミリーの前記成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＬＴＢＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＮＦＲＳＦ１２Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ Ｆｎ１４、ＮＧＦＲ、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２２、及びＴＮＦＲＳＦ２３から成る群の中から選択されている、請求項２に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項６】
前記特異的結合成員がＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ｐ５５ＴＮＦレセプタ）から誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項７】
前記特異的結合成員がＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ｐ７５ＴＮＦレセプタ）から誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項８】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）から成る群の中から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項９】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）から成る群の中から選択されたＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１０】
前記特異的結合成員が、抗体又は抗体フラグメントである、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記抗体又は抗体フラグメントが、アミノ酸残基１−１８、１−２０、１−２６、１−３０、１２−２２、２２−３１、２２−４０、３６−４５、４９−９７、４９−９８、５６−７９、５８−６５、６９−９７、７０−８７、７６−９０、９６−１０５、１０５−１２８、１０８−１２８、１１０−１２７、１１５−１２５、１１７−１２８、１３２−１５７、１３５−１５５、１３６−１５３、１３８−１４９、１４１−１５３及び１４６−１５７から成る領域の中から選択された少なくとも１つの領域内でヒトＴＮＦ（配列番号８０）に結合する、請求項１０に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記抗体又は抗体フラグメントが、ＭＡｂ １（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０１）、ＭＡｂ ２１（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３２）、ＭＡｂ ２５（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０１）、ＭＡｂ ３２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０２）、ＭＡｂ ３７（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０３）、ＭＡｂ ４２（ＥＣＡＣＣ ８９０８０３０４）、ＭＡｂ ４７（ＥＣＡＣＣ ８９１２１４０２）、ＭＡｂ ５３（ＥＣＡＣＣ ９００１２４３３）及びＭＡｂ ５４（ＥＣＡＣＣ ８９０８３１０３）又はそのフラグメントの中から選択されている、請求項１１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記抗体がＤ２Ｅ７又はそのフラグメントである、請求項１０に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記抗体がＣＤＰ ８７０又はそのフラグメントである、請求項９に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記特異的結合成員が、Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の足場構造を有するタンパク質である、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｃ型レクチン様ドメインの前記足場構造を有する前記特異的結合成員が、ＴＮ３−２−Ｂ（配列番号１０３）、ＴＮ３−２−Ｃ（配列番号１０４）、及びＴＮ３−２−Ｄ（配列番号１０５）から成る群の中から選択されている、請求項１５に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１７】
前記３量体化ドメインが、テトラネクチンから誘導されている、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１８】
テトラネクチンから誘導された前記３量体ドメインが、配列番号８１の配列と少なくとも６８％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列同一性が、少なくとも７５％、例えば少なくとも９２％を含め少なくとも８７％である、請求項１８に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２０】
テトラネクチンから誘導された前記３量体ドメインが、アミノ配列番号８１を含む、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２１】
ＴＮ−２−Ｂ（配列番号１０６）、ＴＮ−２−Ｃ（配列番号１０８）、ＴＮ−２−Ｄ（配列番号１０７）及びＡＤ１Ｄ４−ＧＳＳ−Ｉ１０（配列番号１０９）から成る群の中から選択された、請求項１７に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２２】
前記特異的結合成員と前記３量体ドメインの間のリンカーをさらに含む、請求項１に記載の３量体ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の前記３量体ポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の前記３量体ポリペプチド又は請求項２３に記載の前記組成物を有効量だけ、腫瘍壊死因子といったような３量体サイトカインにより媒介される病理を有する患者に対し投与することを含む、前記患者の治療方法。
【請求項２５】
前記腫瘍壊死因子により媒介される病理が、関節リウマチ、乾癬、及びクローン病から成る群の中から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
３量体ポリペプチドサイトカインを結合する能力を有する特異的結合成員を各々含み、かつ３量体化ドメインを各々含む３つの単量体を含む３量体ポリペプチドの調製方法であって、（ｉ）前記３量体ポリペプチドが発現されるような条件下で前記３量体ポリペプチドをコードするベクターで形質転換された宿主を培養する工程、及び（ｉｉ）前記３量体ポリペプチドを単離する工程を含む方法。
【請求項２７】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−２３５（配列番号７６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１８５（配列番号７７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１６３（配列番号７８）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ １−１４２（配列番号７９）から成る群の中から選択される１つのアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記特異的結合成員が、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２（配列番号１３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／６（配列番号１５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２ １／４（配列番号１７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／３（配列番号１９）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ２、１／２（配列番号２１）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ１Ｄ４（配列番号２３）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２（配列番号２５）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／６（配列番号２６）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／４（配列番号２７）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／３（配列番号２８）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２、１／２（配列番号２９）及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ Ｄ２Ｄ４（配列番号３０）から成る群の中から選択されたＤＮＡ配列によりコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の３量体ポリペプチドの使用。
【請求項３０】
医薬組成物の調製のための請求項１〜２２のいずれか１項に記載の３量体ポリペプチドの使用。
【請求項３１】
（ｉ）請求項１に記載の３量体ポリペプチドと試料を接触させる工程、及び（ｉｉ）３量体サイトカインに対する前記３量体ポリペプチドの前記結合を検出する工程を含む、前記試料中の前記３量体サイトカインを検出するための検定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５２０３１８（Ｐ２００６−５２０３１８Ａ）
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４７４４７（Ｐ２００４−５４７４４７）
【出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００３／０００７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９８４１
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１６１９０９）ボレアン・ファルマ・アクティーゼルスカブ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＲＥＡＮ ＰＨＡＲＭＡ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月２９日（２００３．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００３／０００７３５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３９８４１
【国際公開日】平成１６年５月１３日（２００４．５．１３）
【出願人】（５０５１６１９０９）ボレアン・ファルマ・アクティーゼルスカブ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＲＥＡＮ ＰＨＡＲＭＡ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
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