ＡＤＤＬ受容体を含む組成物、関連する組成物、および関連する方法を本明細書中に開示し、特許請求の範囲に記載する。ＡＤＤＬ受容体は、典型的には、ニューロン細胞のシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在するが、おそらくこれに限定されない。関連する組成物には、シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在した１又は複数の受容体またはそれ以外のいずれかを介してニューロン細胞へのＡＤＤＬ結合に正または負の影響を与える化合物が含まれるが、これらに限定されない。関連する方法には、シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在した１又は複数の受容体またはそれ以外のいずれかを介してニューロン細胞へのＡＤＤＬ結合に正または負の影響を与える化合物のスクリーニング手順が含まれるが、これらに限定されない。他の関連する方法には、ニューロン細胞のシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬ結合を阻害するか、遮断するか、そうでなければ妨害する組成物を使用したアルツハイマー病、軽度認知障害、およびダウン症候群などのＡＤＤＬ関連疾患の防止および治療が含まれるが、これらに限定されない。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の記述
本明細書中に記載の本発明の一部を、保健社会福祉省の国立衛生研究所からの助成金（助成金番号ＮＩＨＲ０１−ＡＧ１８８７７、ＮＩＨ Ｒ０１−ＡＧ２２５４７、およびＮＩＨ Ｒ０３−ＡＧ２２２３７）を使用して行った。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有し得る。さらに、本発明の一部を、イリノイ州公衆衛生局の助成金（ＡＤＲＦ助成金番号３３２８００１０および４３２８０００３）を使用して行った。
【０００２】
本発明は、生物学および薬物の分野に関する。具体的には、本発明は、神経変性疾患（アルツハイマー病、軽度認知障害、およびダウン症候群などのＡＤＤＬ関連疾患が含まれるが、これらに限定されない）の防止、診断、および治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、剖検で病理学的特性（脳質量の減少、特定のニューロン小集団の喪失、ならびに老人斑および神経原線維変化の蔓延が含まれるが、これらに限定されない）によって特徴づけられる進行性の変性認知症である（例えば、Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．３０，ｐｐ．５７２−５８０；Ｃｏｙｌｅ，Ｊ．Ｔ．（１９８７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｄｅｌｍａｎ Ｇ，ｅｄ），ｐｐ ２９−３１．Ｂｏｓｔｏｎ−Ｂａｓｅｌ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ：Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。しかし、その初期段階では、ＡＤは、主に、新たな記憶形成が著しく不可能になることによって発症する（例えば、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。この特定の影響についての根拠は知られていないが、現在、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド由来の神経毒の関与が支持されている。Ａβは、両親媒性ペプチドであり、そのより長い凝集傾向のある４２アミノ酸形態が豊富なことにより、遺伝子の変異およびＡＤに関連する危険因子が増加する。Ａβ １〜４２は原線維に容易にアセンブリし、ＡＤの病理学的特性の１つであるアミロイド斑としてＡＤ脳組織に沈着する（用語「アミロイド」は、特色のある複屈折コンゴレッド染色性を有するタンパク質沈着物に与えられた一般名である）。アミロイド斑の蔓延およびＡβ１〜４２原線維のインビトロ神経毒性により、元のアミロイドカスケード仮説についての中心となる論理的根拠が得られ、原線維Ａβの沈着がニューロンの死滅ならびにその後の記憶喪失および認知低下の原因とされた。
【０００４】
その強力な実験による裏付けおよび直感的な魅力（ａｐｐｅａｌ）にも関わらず、元のアミロイドカスケード仮説は、鍵となる所見との矛盾（認知症とアミロイド斑負荷との間の相関が低いことが含まれる）が証明された（例えば、Ｋａｔｚｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１３８−１４４；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。特に、最近の研究で、トランスジェニックｈＡＰＰマウスを使用して実施したＡＤワクチン実験が報告されている（例えば、Ｄｏｄａｒｔ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．５，ｐｐ．４５２−４５７；Ｋｏｔｉｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．６３３１−６３３５；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。これらのマウスにより、発症年齢依存性アミロイド斑、最も重要には、発症年齢依存性記憶機能障害を発症する初期ＡＤの良好なモデルが得られる。マウスをＡβに対するモノクローナル抗体で処置した場合に、以下の２つの驚くべき所見が得られた。（１）ワクチン接種したマウスは記憶喪失の逆転が認められ、２４時間で明らかに回復したこと、（２）プラークレベルは変化しないにもかかわらず、ワクチン接種の認知に対する利点が生じた。このような所見は、アミロイド原線維に起因するニューロン死に依存的な記憶喪失機構と一致しない。
【０００５】
元の仮説の主な欠点を、Ａβ自己組織化によって形成された非原線維性の（ｎｏｎ−ｆｉｂｒｉｌｌａｒ）神経学的に活性な分子が果たす役割を組み込んだ最新の仮説で解決しようと努力している（例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１９−２２４；およびその参考文献などを参照のこと）。このような分子を、ＡＤＤＬといい、４２アミノ酸Ａβペプチドの可溶性神経毒性アセンブリである。ＡＤＤＬは、ＡＤ関連アミロイド斑で見出される不溶性Ａβ原線維と基本的に構造が異なり（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、ＡＤＤＬは、記憶機能不全の根本にある原因としてＡβ原線維に対する概念的サロゲートである。プラークに起因する非特異的細胞損傷と対照的に、ＡＤＤＬはニューロンの特定のサブセットにおける異常なシグナル伝達を誘発し、細胞死に遥か先立って記憶機能を危うくする（例えば、Ｋｉｒｋｉｔａｄｚｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６９，ｐｐ．５６７−５７７；Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１９−２２４；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。Ａβ１−４２オリゴマーはＳＤＳに対して安定であり、低濃度のＡβ４２で形成される（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；およびその参考文献などを参照のこと）。本質的に、元のカスケードの連鎖の喪失により、動物および脳組織スライス培養物の両方において、ＡＤＤＬが急速に長期電位（ＬＴＰ）を阻害する。ＬＴＰは、記憶およびシナプス可塑性についての古典的な実験パラダイムである。したがって、ＡＤＤＬは特異的な神経薬理学的リガンドであり、その作用は、適切な治療介入によって可逆的なはずであり、これは本出願の主題である。ＡＤについての最新のＡＤＤＬ仮説により、以下のように結論づけられている。（１）記憶喪失は、ニューロン死前のシナプス不全に起因すること、および（２）シナプス不全は原線維ではなくＡＤＤＬに起因すること（例えば、Ｈａｒｄｙ，Ｊ．＆ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９７；ｐｐ．３５３−３５６；およびその参考文献などを参照のこと）。この仮説は、脳組織内に可溶性オリゴマーが生じ、これがＡＤ（例えば、Ｋａｙｅｄ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３００，ｐｐ．４８６−４８９；Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）およびｈＡＰＰトランスジェニックマウスＡＤモデル（Ｋｏｔｉｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．６３３１−６３３５；Ｃｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３０５−３１３；および上記のいずれかにおける参考文献など）で著しく上昇し得るという最近の報告で支持され得る。ＡＤＤＬはまた、年齢適合コントロールでのレベルと比較してＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）で上昇する（Ｇｅｏｒｇａｎｏｐｏｕｌｏｕ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．７，ｐｐ．２２７３−２２７６；およびその参考文献など）。
【０００６】
現在、ＡＤＤＬオリゴマーがニューロンと相互作用する機構が非常に注目されている（例えば、Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｂ．＆ Ｌａｎｓｂｕｒｙ，Ｐ．Ｔ．（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２６，ｐｐ．２６７−２９８；およびその参考文献などを参照のこと）。以前の仮説は、Ａβ単量体またはオリゴマーの膜挿入または細胞傷害性の孔の形成が思い出されるが、これらの過程は非特異的であり、ＡＤで認められた損傷した神経細胞の選択性の高いパターンを説明することができない。あるいは、ＡＤＤＬは、特異性の高いリガンドとして特定の膜標的に結合し、それにより、ＡＤで見出される高度に選択的なシナプス病変および異なるパターンの症状が生じ得る。本明細書中では、ＡＤＤＬと培養した海馬ニューロンの小集団との間の高度に特異的な結合相互作用を報告するために結果を示す。これらの相互作用は、ＡＤ脳組織から抽出したＡＤＤＬおよび合成Ａβ１−４２からインビトロで調製したＡＤＤＬで同一なようである。細胞表面でのＡＤＤＬ結合は、シナプス終末の小集団とほとんど排他的に同時局在化された小さな点状のクラスターとして出現する。高特異的シナプス結合は、その過剰発現が学習機能障害に関連しているＡｒｃ（最初期遺伝子）の異所性誘導に付随して起こる。ＡＤＤＬによる特定のシナプスの選択的ターゲティングおよび機能崩壊が初期ＡＤおよび軽度認知障害における記憶機能の特異的喪失の根底にあり得る可能性がある。この事象では、これらのＡＤＤＬ関連疾患の治療介入は、ＡＤＤＬ形成、ＡＤＤＬシグナル伝達、またはＡＤＤＬ受容体結合を妨害する薬剤（本出願の主題）に注目すべきである。
【０００７】
本出願は、米国特許第６，２１８，５０６号；国際特許公開番号ＷＯ ９８／３３８１５号；米国特許出願番号第６０／０８６，５８２号；米国特許出願番号第０９／３６９，２３６号；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２１４５８号；米国特許出願番号第０９／７４５，０５７；米国特許出願番号第１０／１６６，８５６；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１９６４０；米国特許出願番号第６０／０９５，２６４；米国特許出願番号第６０／４１５，０７４号；米国特許出願番号第１０／６７６，８７１号；米国特許出願番号第１０／９２４，３７２号；国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／３０９３０；米国特許出願番号第６０／５６８，４４９号；米国特許出願番号第６０／５７１，２６７号；米国特許出願番号第６０／５８４，６９５号；米国特許出願番号第６０／６２１，７７６号；米国特許出願番号第６０／６３６，４６６号；米国特許出願番号第２００３／００６８３１６号；国際特許公開番号ＷＯ ０４／０３１４００；国際特許公開番号ＷＯ ０１／１０９００；および国際特許公開番号ＷＯ ９８／３３８１５などに関連する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書中に開示され、且つ特許請求の範囲に記載の発明の実施形態は、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体であって、前記１又は複数の受容体がＡＤＤＬに結合する１又は複数の受容体を含む組成物を含む。当該１又は複数の受容体は、ｓｙｎＧＡＰ、ｐｒｏＳＡＰ２／Ｓｈａｎｋ３、グルタミン酸受容体、カイニン酸サブタイプグルタミン酸受容体、ＧｌｕＲ６、ＡＭＰＡサブタイプグルタミン酸受容体、ＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ１ｂ、ｍＧｌｕＲ１ｃ、ｍＧｌｕＲ１ｄ、ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂ、ＮＭＤＡサブタイプグルタミン酸受容体、インテグリン受容体、接着受容体、ＮＣＡＭ、Ｌ１、カドヘリン、栄養因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体１、線維芽細胞成長因子受容体２、ＴｒｋＡ受容体、ＴｒｋＢ受容体、ｅｒｂＢ４受容体、ｅｒｂＢ／ＥＧＦ受容体ファミリーの近接な（ｃｌｏｓｅ）ホモログ、トロフィン（ｔｒｏｐｈｉｎ）に結合する受容体、インスリン受容体（ＩＲ）、インスリン成長因子受容体１（ＩＧＦ−１）で、ＧＡＢＡ受容体、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ⁺／Ｋ^-ＡＴＰアーゼ）、ＣＡＭキナーゼＩＩ、ＰｒＰタンパク質、タンパク質チロシンホスファターゼα（ＲＰＴＰα）タンパク質、ソマトスタチン受容体、カンナビノイド受容体、σ受容体、および／またはＶＩＰ／ＰＡＣＡＬ受容体であり得る。本発明はまた、上記受容体の任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを含む。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を含む組成物を含む。本発明は、さらに、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を含む医薬調製物を含む。別の実施形態は、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を阻害する１又は複数の化合物を含む組成物を含む。別の実施形態は、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を阻害する１又は複数の化合物を含む組成物であって、前記１又は複数の化合物がＣＮＱＸである、組成物を含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を投与する工程を含む、ＡＤＤＬ関連疾患の治療方法を含む。特に、ＡＤＤＬ関連疾患には、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、およびダウン症候群などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態は、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を投与する工程と、前記１又は複数の化合物が、ＣＮＱＸまたはＣＮＱＸの医薬として許容される誘導体であることとを含む、ＡＤＤＬ関連疾患の治療方法を含む。本発明の別の実施形態は、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を投与する工程と、前記１又は複数の受容体が、ｓｙｎＧＡＰ、ｐｒｏＳＡＰ２／Ｓｈａｎｋ３、グルタミン酸受容体、カイニン酸サブタイプグルタミン酸受容体、ＧｌｕＲ６、ＡＭＰＡサブタイプグルタミン酸受容体、ＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ１ａ、ｍＧｌｕＲ１ｂ、ｍＧｌｕＲ１ｃ、ｍＧｌｕＲ１ｄ、ｍＧｌｕＲ５ａ、ｍＧｌｕＲ５ｂ、ＮＭＤＡサブタイプグルタミン酸受容体、インテグリン受容体、接着受容体、ＮＣＡＭ、Ｌ１、カドヘリン、栄養因子受容体、線維芽細胞成長因子受容体１、線維芽細胞成長因子受容体２、ＴｒｋＡ受容体、ＴｒｋＢ受容体、ｅｒｂＢ４受容体、ｅｒｂＢ／ＥＧＦ受容体ファミリーの近接な（ｃｌｏｓｅ）ホモログ、トロフィン（ｔｒｏｐｈｉｎ）に結合する受容体、インスリン受容体（ＩＲ）、インスリン成長因子受容体１（ＩＧＦ−１）で、ＧＡＢＡ受容体、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ⁺／Ｋ^-ＡＴＰアーゼ）、ＣＡＭキナーゼＩＩ、ＰｒＰタンパク質、受容体タンパク質チロシンホスファターゼα（ＲＰＴＰα）タンパク質、ソマトスタチン受容体、カンナビノイド受容体、σ受容体、および／またはＶＩＰ／ＰＡＣＡＬ受容体であることとを含む、ＡＤＤＬ関連疾患の治療方法を含む。本発明は、さらに、これらの受容体の任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを含むこのような方法を含む。
【００１１】
本発明は、さらに、ビオチン標識ＡＤＤＬを含む組成物を含む。特に、当該組成物は、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬを含む。より具体的には、当該組成物は、抗体によって認識される１又は複数のエピトープを含むＡＤＤＬを含む。特に、当該エピトープはペプチド配列である。より具体的には、当該エピトープは有機小分子である。
【００１２】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートである、組成物を含む。
【００１３】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、前記サロゲートが、内部βシートを形成することができる特定の構造エレメントを含むペプチドまたはペプチド模倣物を含み、その形成によってオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１４】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、内部Ｃ末端βシートを形成することができる特定の構造エレメントを含むペプチドまたはペプチド模倣物を含み、その形成によってオリゴマーにアセンブリすることができ、ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１５】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、モチーフ：
【化１】

（式中、Ｚは、グリシル−グリシル、プロリル−グリシル、グリシル−プロリル、またはβターンを形成することができる任意の他のジペプチドもしくはジペプチド模倣物または任意の他のβターン模倣物であり、Ｘは任意のアミノ酸またはアミノ酸模倣物である）を含むペプチドまたはペプチド模倣物を含み、その存在によって内部βシートを形成することができ、その形成によってオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１６】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、オリゴマーにアセンブリすることができるジペプチド官能化βターン模倣物を含み、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１７】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化２】

（式中、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１８】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化３】

（式中、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基であり、Ｘは任意の疎水性アミノ酸である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００１９】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化４】

（式中、Ｒは任意のペプチドであり、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００２０】
本発明は、さらに、１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化５】

（式中、Ｒは任意のペプチドであり、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基であり、Ｘは任意の疎水性アミノ酸である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーがニューロンのシナプス後膜肥厚に局在したＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物を含む。
【００２１】
本発明は、さらに、蛍光標識ＡＤＤＬを含む、組成物を含む。特に、蛍光標識は、フルオレセイン、テトラメチルローダミンおよび／またはＡｌｅｘａ（登録商標）色素である。
【００２２】
本発明は、さらに、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を妨害する化合物のスクリーニング方法であって、ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、ｃ）シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程とを含む方法を含む。特に、ＡＤＤＬは、ビオチン標識ＡＤＤＬ、蛍光標識ＡＤＤＬ、またはビオチン標識ＡＤＤＬと蛍光標識ＡＤＤＬとの組み合わせである。さらにより具体的には、１又は複数のシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体に結合した場合にＡＤＤＬを認識する抗体を測定（または検出）に使用する。さらにより具体的には、組成物が１又は複数のニューロンのシナプス後膜肥厚に局在した受容体に結合する場合、ビオチン標識ＡＤＤＬ内でビオチンを認識するアビジンまたはストレプトアビジンを測定（または検出）に使用する。また、特に、検出によって抗ＡＤＤＬ抗体を認識する蛍光標識二次抗体に会合した蛍光量を測定（または検出）する。特に、測定（または検出）によって酵素−抗体抱合体または酵素−ストレプトアビジン抱合体によって生成された蛍光シグナルまたは発光シグナルを測定する。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する化合物の同定方法であって、ａ）ＡＤＤＬサロゲートを生成する工程と、ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬサロゲートを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、ｃ）シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程とを含む方法を含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する化合物の同定方法であって、ａ）ＡＤＤＬサロゲートを生成する工程と、ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬサロゲートを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、ｃ）抗ａｒｃ抗体を使用して、ニューロン内で産生されたａｒｃタンパク質量を測定する工程と
を含む方法を含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合を測定する方法であって、ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、ｃ）シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合に特徴的な点状の結合を測定する工程とを含む方法を含む。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合を妨害する化合物の同定方法であって、ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、ｃ）シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合に特徴的な点状の結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程とを含む方法を含む。
【００２７】
別の実施形態は、ＡＤＤＬとシナプス後樹状突起棘との間の相互作用を媒介するＡＤＤＬ結合タンパク質を含む。本発明の１つの実施形態は、ＡＤＤＬ（ｓｙｎＧＡＰとグルタミン酸受容体とで共有されるアミノ酸配列）に結合するｓｙｎＧＡＰタンパク質である。当該配列は、ｓｙｎＧＡＰのアミノ酸
【化６】

またはその活性なフラグメントを含み得る。当該配列は、ＧｌｕＲ２のアミノ酸
【化７】

またはその活性なフラグメントを含み得る。当該配列は、ＧｌｕＲ５のアミノ酸
【化８】

またはその活性なフラグメントを含み得る。当該配列は、ＧｌｕＲ６のアミノ酸
【化９】

またはその活性なフラグメントを含み得る。当該配列は、１又は複数のこれらの配列と９５％相同、１又は複数のこれらの配列と９０％相同、１又は複数のこれらの配列と８５％相同、１又は複数のこれらの配列と８０％相同、１又は複数のこれらの配列と７５％相同、および１又は複数のこれらの配列と７０％相同である他の配列を含み得る。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、１又は複数のグルタミン酸受容体および１又は複数のシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）足場タンパク質（ｐｒｏＳＡＰ２／ｓｈａｎｋ３が含まれるが、これらに限定されない）を含むＡＤＤＬ受容体複合体である。ＡＤＤＬがこのような受容体複合体に結合する場合、グルタミン酸受容体シグナル伝達が活性化され、ＬＴＰが遮断される。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、ＡＤＤＬ受容体複合体へのＡＤＤＬの結合を無効にし、ＬＴＰのＡＤＤＬ遮断を防止するアンタゴニスト分子を含む。本発明のさらなる実施形態は、アルツハイマー病、軽度認知障害、虚血および脳卒中誘導性認知症、ならびにダウン症候群などのＡＤＤＬ関連疾患を治療するための抗ＡＤＤＬ化合物を発見する方法および抗ＡＤＤＬ化合物の使用方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
従来の研究技術および手順を、一般に、当分野で周知であり、本明細書中のいたるところで引用し、考察した種々の一般的な文献およびより特有の文献にしたがって行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（任意の目的のために本明細書中で参考として組み込まれる）を参照のこと。特に定義しない限り、本明細書中に記載の分子生物学、遺伝子操作、分析化学、有機合成化学、医化学、および薬化学に関連して使用した用語ならびにこれらの実験手順および技術は、当業者に周知であり、当分野で一般的に使用されている。化学合成、化学分析、医薬品、製剤、および送達、ならびに患者の治療のための標準的技術を使用することができる。
【００３１】
実施形態によっては、本発明は、治療有効量（すなわち、用量）のニューロン後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合を阻害する化合物を含む医薬組成物を提供する。当分野で周知のように、このような組成物を、医薬として許容される希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントと共に調製することができる。
【００３２】
本明細書中で使用される、用語「薬剤」は、化合物、化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作製した抽出物を示す。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「医薬組成物」は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる本明細書中に記載の医薬として許容されるキャリア、賦形剤、または希釈剤および化合物、ペプチド、または組成物を含む組成物をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される、用語「治療有効量」は、哺乳動物で治療反応が得られると判断された本発明のスクリーニング法で同定された本発明の医薬組成物または化合物の量をいう。このような治療有効量は、当業者によって本明細書中に記載の方法を使用して容易に突き止められる。
【００３５】
本明細書中で使用される、用語「実質的に純粋な」は、対象となる種が支配的に存在する種であることを意味する（すなわち、モルをベースとして、組成物の任意の他のそれぞれの種よりも豊富である）。実施形態によっては、実質的に精製された画分は、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０％（モルをベースとして、重量、または数をベースとする）の対象となる種を含む組成物である。実施形態によっては、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超を含む。実施形態によっては、対象となる種を本質的に均一に精製し（従来の検出方法によって組成物中に夾雑する種を検出することができない）、組成物が本質的に単一の高分子種からなる。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「患者」には、ヒトおよび動物の被験体が含まれる。
【００３７】
文脈上他で必要とされない限り、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。
【００３８】
本明細書中で意図される投与経路は、任意の全身手段（経口、腹腔内、皮下、静脈内、筋肉内、経皮、吸入、または他の投与経路が含まれる）であり得る。浸透圧ミニポンプおよび徐放性ペレット、または他のデポー投与形態も使用することができる。許容可能な処方材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒である。医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解および放出速度、吸着、または浸透の改変、維持、または保存のための処方材料（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含み得る。適切な処方材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）；抗菌薬；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸の緩衝液など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；着色料、香味物質、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（ポリソルベート２０およびポリソルベート８０など）、Ｔｒｉｔｏｎ、トリメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポールなど）；安定増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；等張化剤（アルカリ金属ハライド（好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、マンニトール、またはソルビトールなど）；送達媒体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）；希釈剤；賦形剤；および／または医薬アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【００３９】
当業者は、本明細書中で考察した化合物に関して、このような化合物はキラル中心を含み得ることを認識している。したがって、このような薬剤は、異なる鏡像異性体または鏡像異性体混合物として存在し得る。いずれか１つの鏡像異性体のみまたは１又は複数の立体異性体との鏡像異性体混合物内に含まれる鏡像異性体の使用は、本発明で意図される。
【００４０】
当業者は、最適な医薬組成物を、例えば、意図する投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定することができる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｉｄを参照のこと。このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。
【００４１】
医薬組成物中の主要な媒体またはキャリアは、事実上水性または非水性であり得る。例えば、適切な媒体またはキャリアは、場合によって非経口投与用組成物に共通の他の材料を補足した注射用の水、生理食塩水、または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的な媒体である。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含むことができ、ソルビトールまたは適切なそのサロゲートをさらに含み得る。本発明の医薬組成物を、保存のために凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で所望の精製度の選択された組成物と任意選択的な製剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｉｄ）との混合によって調製することができる。さらに、組成物を、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方することができる。
【００４２】
処方成分は、投与部位に許容可能な濃縮物中に存在する。緩衝液を有利に使用して、生理学的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲に組成物を維持する。
【００４３】
本発明の医薬組成物を、非経口送達させることができる。非経口投与を意図する場合、本発明で使用される治療組成物は、医薬として許容される媒体中に本発明のスクリーニング法で同定された所望の化合物を含む無発熱物質の非経口に許容可能な水溶液の形態であり得る。特に適切な非経口注射用媒体は、本発明のスクリーニング法で同定された化合物が適切に保存される滅菌等張溶液として配合される滅菌蒸留水である。調製物は、注射可能なミクロスフェア、生体侵食粒子、高分子化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、生成物を制御放出させるか徐放させ、その後にデポー注射によって送達することができるビーズまたはリポソームなどの薬剤を含む所望の分子の製剤を含み得る。ヒアルロン酸を含む製剤は、循環血液中での徐放を促進する効果がある。植え込み型薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を移入することができる。
【００４４】
組成物を、吸入のために処方することができる。これらの実施形態では、本明細書中に開示の組成物を、吸入用の乾燥粉末として処方することができるか、噴霧化によるなどのエアゾール送達のための噴射剤を使用して吸入溶液を処方することもできる。肺投与は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されており、肺送達を記載しており、参考として組み込まれる。
【００４５】
本発明の医薬組成物を、経口などの消化管を介して送達させることができる。このような医薬として許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。この様式で投与すべき本明細書中に開示の組成物を、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の配合で習慣的に使用卯されるキャリアを使用するか使用しないで処方することができる。カプセルを、生物学的利用能が最大になり、且つ事前の全身分解が最小になる場合に胃腸管で製剤の活性部分が放出されるようにデザインすることができる。本明細書中に開示のアンタゴニストまたはアゴニストの吸収を促進するためのさらなる薬剤を含めることができる。希釈剤、香味物質、低融点のワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤の崩壊剤、および結合剤も使用することができる。
【００４６】
医薬組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤と組み合わせた本明細書中に開示の有効量の化合物を含み得る。滅菌水または他の適切な媒体への錠剤の溶解により、溶液を単位剤形で調製することができる。適切な賦形剤には、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン、ゼラチン、またはアカシアなど）、または潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
追加の医薬組成物は当業者にとって自明であり、徐放性製剤または制御送達製剤中に本明細書中に開示の化合物を含む製剤が含まれる。リポソームキャリア、生体侵食性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射などの種々の他の徐放性送達手段または制御送達手段の処方技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔質高分子微粒子の制御放出を記載しているＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。徐放性調製物は、造形品（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド）（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１６７−２７７）およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｄ．）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）の形態の半透性ポリマーマトリクスを含み得る。徐放性組成物はまた、当分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８２，ｐｐ．３６８８−３６９２；欧州特許第０３６，６７６号；欧州特許第０８８，０４６号、および欧州特許第１４３，９４９号を参照のこと。
【００４８】
インビボ投与のために使用すべき医薬組成物は、典型的には滅菌されている。実施形態によっては、濾過滅菌膜での濾過によってこれを行うことができる。実施形態によっては、組成物を凍結乾燥させる場合に、この方法を使用した滅菌を、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行うことができる。実施形態によっては、非経口投与用組成物を、凍結乾燥形態か溶液中に保存することができる。実施形態によっては、非経口組成物を、一般に、滅菌アクセスポート（ａｃｃｅｓｓ ｐｏｒｔ）（例えば、皮下注射針を突き刺すことができるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル）を有する容器に入れる。
【００４９】
一旦本発明の医薬組成物が処方されると、これを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存することができる。このような製剤を、すぐに使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存することができる。
【００５０】
本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットを含み得る。本発明のキットは、それぞれ、本明細書中に開示の乾燥アンタゴニスト化合物またはアゴニスト化合物を有する第１の容器および水性製剤（例えば、一室および多室の事前に充填したシリンジ（例えば、液体シリンジ、リオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）、または無針シリンジが含まれる）が含まれる）を有する第２の容器の両方を含み得る。
【００５１】
治療で使用すべき本発明の医薬組成物の有効量は、例えば、治療の状況および対象に依存する。したがって、当業者は、実施形態により、治療のための適切な投薬量レベルが、送達されるアンタゴニストまたはアゴニスト（医薬組成物が使用される指標）、投与経路、患者のサイズ（体重、体表面、または臓器サイズ）、および／または容態（年齢および全体的な健康状態）に一部依存して変化することを認識する。臨床者は、至適な治療効果を得るために、投薬量を判定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を修正することができる。典型的な投薬量は、上記の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲である。実施形態によっては、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで、１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで、または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【００５２】
投与頻度は、製剤中の本明細書中に開示のアンタゴニストまたはアゴニストの薬物動態学的パラメーターに依存する。例えば、臨床者は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物を、単回用量または２回以上の用量（同量の所望の分子を含んでも含まなくてもよい）を長期にわたって投与することができるか、移植デバイスまたはカテーテルを介した連続的注入として投与することができる。当業者は、適切な投薬量を日常的にさらに改良し、これは、当業者の日常的作業の範囲内である。適切な投薬量を、適切な用量−応答データの使用によって確認することができる。
【００５３】
本発明の医薬組成物の投与経路には、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病変内経路による注射、徐放システム、または移植デバイスが含まれる。医薬組成物を、ボーラス注射によって投与するか、注入によって、または移植デバイスによって継続的に投与することができる。医薬組成物を、所望の分子が吸収されるかカプセル化される膜、スポンジ、または別の適切な材料の移植によって局所的に投与することもできる。移植デバイスを使用する場合、デバイスを、任意の適切な組織または器官に移植することができ、拡散、徐放性ボーラス、または連続投与によって所望の分子を送達することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物を、単独または他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【実施例１】
【００５５】
ＡＤＤＬの局在化およびターゲティング
材料と方法
ＡＤＤＬおよび分画：確立されたプロトコールにしたがって、Ａβ_1-42ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎａｐａ，ＣＡ）またはビオチンＡβ_1-42ペプチド（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）を使用して、合成ＡＤＤＬまたはビオチン化ＡＤＤＬを調製した（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９５−６０５；Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．３４５−３５２；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。製造者の説明書にしたがってＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−１００およびＹＭ−１０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、オリゴマー種の分子量を分画した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＨＲ １０／３０カラムを使用したＡｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＨＰＬＣ装置を使用したサイズ排除クロマトグラフィを、確立されたプロトコールにしたがって行った（例えば、Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０およびその参考文献などを参照のこと）。
【００５６】
組織抽出物およびＣＳＦ：アルツハイマー病および非認知症コントロール被験体由来の前頭葉皮質、小脳、およびＣＳＦを、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から得た。脳組織由来の可溶性抽出物を、以前に記載のように調製した（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献などを参照のこと）。
【００５７】
細胞培養：以前に記載のように、海馬ニューロンを、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補足した神経基本培地中で少なくとも３週間維持した（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）。細胞を、媒体、合成もしくはビオチン化ＡＤＤＬ（５００ｎＭ）、粗ヒトＣＳＦ（１００μｌ）、またはＦ１２抽出ヒト皮質（１．０ｍｇタンパク質／ｍｌ）と表示の時間インキュベートした。
【００５８】
免疫細胞化学：記載のように免疫細胞化学を行った（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）。いくつかの細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎを含む１０％正常ヤギ血清およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＮＧＳ：ＰＢＳ）にて室温（ＲＴ）で１時間透過処理を行った。細胞を、Ｍ９４（前に特徴づけられたＡβオリゴマー生成ポリクローナル抗体（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９５−６０５；Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．３４５−３５２；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）（１：５００）および抗αＣａＭＫＩＩ（１：２５０）もしくは抗ＰＳＤ−９５（１：５００）モノクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ，ＣＯ）またはヤギポリクローナル抗Ａｒｃ抗体（１：２００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＮＭＤＡ−Ｒ１（Ｃ−ｔｅｒｍ，１：２００）（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、またはシナプトフィジン（ＳＶＰ−３８，１：５００）（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のいずれかと４℃で一晩二重免疫標識し、その後、適切なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８または５９４抱合ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（２μｇ／ｍｌ）と室温で２時間インキュベートした。ＡＤＤＬおよびＮＭＤＡ−グルタミン酸受容体サブユニットＮＲ１（１：２００）またはＡＭＰＡ−グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲｌ（１：２００）（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）いずれかのための二重標識には、合成ビオチン化ＡＤＤＬおよびストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８抱合体を使用した。細胞を、一定の設定（レーザー出力、検出器の感度、増幅率、および補正）を行ったＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２供焦点スキャナＤＭＲＸＥ７顕微鏡（Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）を使用して視覚化した。ｚ軸方向の個々の視野の０．５μｍ間隔のスキャンによって画像を取得して、ＡＤＤＬがαＣａＭＫＩＩ、ＰＳＤ−９５、ＳＶＰ−３８、ＮＲ１、ＧｌｕＲ１、またはＡｒｃと同時局在化するかどうかを決定した。形態計測による定量を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像化ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して行った。
【００５９】
免疫組織化学：７症例のＡＤ由来の剖検脳（５９〜８７歳）および７つの非認知症の高齢コントロール（６８〜７８歳）を、１０％緩衝化ホルマリン中で３０〜４８時間浸漬固定し、その後、１０〜４０％スクロース勾配に移した。前頭葉皮質から厚さ４０μｍの浮遊性の連続切片が得られ、免疫標識を行うまで細胞保護剤中にて４℃で維持した。切片をＴＢＳでリンスし、２％ｍ−過ヨウ素酸ナトリウムを含むＴＢＳで２０分間予め処置し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む（ＴＢＳ）（ＴＢＳＴ）で透過処理を行った。特異的免疫反応性を、５％ウマ血清を含むＴＢＳＴで４０分間および１％脱脂粉乳を含むＴＢＳＴで３０分間遮断した。その後、切片を、Ｍ９４（１：１０００）と４℃で一晩インキュベートし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ウサギＩｇＧ（１：５００）と室温で９０分間インキュベートした。連続切片を、０．５％チオフラビン−Ｓを含む５０％エタノールで染色した。共焦点画像を、上記のようにＬｅｉｃａ供焦点顕微鏡にてｚ軸方向の１μｍ間隔のスキャンを使用して取得した。類似の切片を、Ｍ９４抗体および二次抗体／ＡＢＣ複合体ならびにジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で標識した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体または二次抗体を省略したコントロール切片は陰性であった。
【００６０】
免疫ブロット：細胞を１倍量のＰＢＳ／プロテアーゼインヒビターカクテル溶液および１倍量の２×ローディング緩衝液（ｐＨ ６．８）（８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６．７％グリセロール、１．６７％ ＳＤＳ、１．６７％β−メルカプトエタノール）中で溶解し、短時間超音波処理を行った。タンパク質を、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）にて１００Ｖで分離し、移動緩衝液（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ８．３）、１９２ ｍＭグリシン、２０％ ｖ／ｖメタノール）中、４℃で１時間１００Ｖでニトロセルロース膜に移した。ブロットを、５％脱脂粉乳を含む０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）で２時間ブロッキングした。ブロットを、抗Ａｒｃ抗体（１：２５０）と４℃で一晩およびＨＲＰ抱合ＩｇＧ（１：１００，０００）と２時間インキュベートした。膜を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ化学発光キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して発色させ、その後、洗浄し、ブロッキングし、タンパク質ローディングのコントロールとして使用した抗シクロフィリンＢ抗体（１：４０，０００）で再ブロットした。タンパク質を視覚化し、Ｋｏｄａｋ ＩＳ４４０ＣＦ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して定量した。
【００６１】
ドットブロットアッセイ：以前に記載されているドットブロットアッセイを使用して、ヒト前頭葉皮質および小脳の可溶性抽出物中のＡβのアセンブリ形態を測定した（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）。９つのＡＤサンプル（Ｂｒａａｋ ＆ Ｂｒａａｋ，ＣＥＲＡＤ ａｎｄ ＮＩＡ／Ｒｅａｇａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａに基づいた病理学的診断）を、１５の非ＡＤコントロールサンプルと比較した。組織（１００ｍｇ）を、組織剪断器（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ）（Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を使用して、氷上のプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ ｆｒｅｅ ｔａｂｌｅｔ；Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１ｍｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２無フェノール培地（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）中でホモジナイズした。２０，０００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を、１００，０００ｇで６０分間遠心分離した。１００，０００ｇの上清のタンパク質濃度を、標準的なＢＣＡアッセイによって決定した。ドットブロットアッセイのために、ニトロセルロースを、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で予め湿らせ、完全に乾燥させた。抽出物（総タンパク質は２μｌ、１μｌ）をニトロセルロースにアプライし、完全に風乾させた。次いで、ニトロセルロース膜を、５％脱脂粉乳を含有する０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中にて室温で１時間ブロッキングした。膜を、一次抗体Ｍ９３／３を含むブロッキング緩衝液（１：１０００）と１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで３×１５分間洗浄した。ＨＲＰ抱合二次抗体（１：５０，０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含むＴＢＳ−Ｔとの室温で１時間のインキュベーション後に洗浄した。タンパク質を化学発光を使用して視覚化し、Ｋｏｄａｋ １Ｄ画像ソフトウェアを使用したＫｏｄａｋ ＩＳ４４０ＣＦ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎで分析した。
【００６２】
結果
Ａβオリゴマー惹起抗体によって検出された可溶性Ａβ種は、ニューロン細胞体周囲に沈着し、ＡＤ皮質で増加する。
第１の目的は、ＡＤ脳内のＡＤＤＬの存在を確証することおよびその後の細胞生物学実験で使用した抗体がアルツハイマー病の病理学に特異的であることを確立することであった。したがって、ヒト前頭葉皮質（７人のＡＤ患者および非認知症年齢適合コントロール）由来の切片を、Ｍ９４（オリゴマー選択性抗体）で免疫標識し（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献などを参照のこと）、チオフラビン−Ｓを使用して線維性アミロイド沈着を評価した。免疫標識ＡＤ脳切片は、老人性神経炎および拡散性アミロイド斑の形態の特徴的なＡβ沈着も示す領域中の細胞体を選択的に取り囲む局在化免疫反応性沈着物を示した。しかし、全ＡＤ症例で見出された細胞周囲の拡散性免疫応答は、線維性アミロイド沈着物（チオフラビン−Ｓ染色によって検出、示さず）と明らかに異なった。免疫蛍光（図１Ａ）およびＨＲＰ染色（図１Ｂ）によって標識した皮質層ＩＩＩに存在するそれぞれの錐体ニューロンの代表的な画像を示す。（７つのうちの）１つのコントロールは、類似の構造を示し、この特定のコントロールの脳は、軽度認知障害を罹患した個体由来の低レベルの斑を有するブラーク病期０であった。非認知症年齢適合コントロール前頭葉では免疫応答は認められなかった（示さず）。全体として、ＡＤ切片の拡散したオリゴマー染色は、細胞内よりもむしろ細胞周囲に認められ、プリオン関連疾患で認められる拡散性のシナプス型沈着物の記載を連想させた（例えば、Ｈａｉｎｆｅｌｌｎｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．５４７−５５３；Ｋｏｖａｃｓ，Ｇ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１−１１および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【００６３】
ＡＤの診断を使用するか使用しないでドットブロット免疫アッセイを使用して、ヒト前頭葉皮質および小脳（図１Ｃ、ドットブロット）の可溶性抽出物中のオリゴマーＡβの存在を確証した。免疫反応性は、全てのＡＤ前頭葉皮質抽出物で強かった。コントロールでは、免疫反応性は、低レベルのプラークおよび線維濃縮体（ｔａｎｇｌｅ）を有する被験体由来の２つの皮質サンプル以外の全ての皮質および小脳サンプルについてアッセイバックグラウンドと類似していた（プラーク重症度１、ＣＥＲＡＤ Ａ、ＢｒａａｋＩＩ、低ＮＩＡ／Ｒｅａｇａｎ）。ＡＤ皮質サンプル中の平均シグナルは約１１倍に上昇したが（ｐ＜０．０００１）、多数のコントロールサンプルがアッセイバックグラウンドと類似していることにより、この比の大きさを不正確にしている。皮質サンプルと対照的に、ＡＤ小脳中の可溶性オリゴマーレベルは、非認知症コントロールよりも最低限に高かったが、有意ではなかった（ｐ＝０．１３１６）（図１Ｃ、散布図）。
【００６４】
これらの結果により、可溶性オリゴマーがＡＤ病変の真の構成要素であるという報告が確認および拡大適用される（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）。これらの結果は、さらに、ＡＤ脳由来の可溶性オリゴマーを特徴づけるために以前に使用した抗体がＡＤ脳の病変を特異的に認識することが確証される。したがって、データにより、下記のＡＤＤＬとニューロンとの間の相互作用の性質を特徴づけるためにデザインされた細胞生物学的実験でのこれらの抗体および可溶性ＡＤ脳抽出物の使用が有効になる。
【００６５】
ＡＤ脳から抽出したＡβオリゴマー（ＡＤＤＬ）は、クラスター化部位に特異的に結合する。
ＡＤＤＬは、Ａβ１〜４２の小さな拡散性のオリゴマー（両親媒性ペプチド）である。Ａβ１〜４２単量体と比較したその相対的に好ましい水溶性を考えると、オリゴマーはその疎水性ドメインを隠す一方で、その親水性ドメインを水性環境に示す可能性が高い。このような配向は、高次構造感受性抗体による溶液中のＡＤＤＬの免疫中和と一致する（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９５−６０５およびその参考文献を参照のこと）。したがって、ＡＤＤＬ構造は、理論的に、人工脂質二重層へのＡβ単量体の報告された挿入に関連する比較的非特異的な結合と対照的に、記憶関連ニューロンに対するリガンド様特異性に適合する能力を有する（例えば、ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．＆ Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ，Ａ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２６４８２−２６４８９およびその参考文献を参照のこと）。
【００６６】
この高特異性ＡＤＤＬ結合様式を確認するために、本発明者らは、本発明者らの実験モデルとして培養物中に少なくとも３週間維持したラットの海馬ニューロンを使用して、生理学的に関連する条件下でＡＤＤＬのニューロンとの相互作用を調査した。これらの培養物はシナプスを生成し（例えば、Ｆｏｎｇ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．２１５３−２１６４およびその参考文献を参照のこと）、成熟した複雑な分枝を有する高度に分化したニューロンを産生する。
【００６７】
第１の結合実験を、ヒト脳の抽出物およびヒトＣＳＦを使用して行った。インビトロで調製したオリゴマーと構造が等価なオリゴマーを含むことが以前に示されているＡＤ抽出物の可溶性抽出物（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）を、培養ニューロンとインキュベートした。非結合物質を洗浄によって除去し、細胞を免疫蛍光顕微鏡法によって試験した。ＡＤＤＬ分布を、合成Ａβオリゴマーのワクチン接種によって生成されたポリクローナル抗体（Ｍ９４）を使用して決定した。これらの抗体は、低容量の病原性Ａβオリゴマーに結合するが、生理学的単量体に結合せず（例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３０５−３１３；Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９５−６０５および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、上記のように、ＡＤ脳組織に特異的である。
【００６８】
ラット海馬細胞の十分に分化した培養物との抽出物のインキュベーションにより、５分ほどの時間でさえも、細胞体および神経突起に沿って膜型に標識された（図２Ａ）。同一条件下で、年齢適合非認知症コントロール由来の抽出物によってシグナルは得られなかった（図２Ｂ）。抗体がＡβ単量体またはアミロイド前駆体タンパク質などの生理学的分子を認識することは示されなかった。Ａβ１〜４２は、ＡＤおよびＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて細胞内に蓄積されることが報告されているが（例えば、Ｏｄｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．３９，ｐｐ．４０９−４２１；Ｇｏｕｒａｓ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１５６，ｐｐ．１５−２０および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、ニューロンに対するＡＤＤＬの免疫反応性は、透過処理後でさえも細胞表面に排他的に蓄積した。分布は、事実上明確に点状であった。ＡＤ抽出物のＣｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター分画は、結合活性が１０〜１００ｋＤの分子量のオリゴマーと共に存在し、これは、以前の特徴づけと一致することを示した（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２およびその参考文献を参照のこと）（図２Ｃ、Ｄ）。ヒトＣＳＦの非分画抽出物はまた、ＡＤ依存性の結合活性を示した（図２Ｅ、Ｆ）。細胞分泌経路内でＡβが高度に過剰産生および蓄積されるので、トランスジェニックＡＤモデルで認められた細胞内Ａβが生じる可能性が高い。
【００６９】
結果は、アルツハイマー病の脳およびＣＳＦ由来のヒト由来ＡＤＤＬが神経突起分枝内に豊富に見出される結合部位の点状クラスターによって特徴づけられるニューロン細胞表面に高い選択性で結合することができることを示す。
【００７０】
合成Ａβ１〜４２から生成したＡＤＤＬは、クラスター化部位に特異的に結合する。
インビトロで生成したＡＤＤＬの結合特性を調査した。このような調製物は、オリゴマーの神経学的影響を調査するための標準を構成する。これらの定義された調製物の使用により、結合およびその結果に寄与し得る抽出物およびＣＳＦの未知の要因を排除される。さらに、広範な使用および研究所間での都合のよい比較のためのツールとして、合成ＡＤＤＬは、ヒト脳抽出物またはＣＳＦよりも遥かに利用しやすい調製物を提供する。
【００７１】
ヒト調製物を使用して認められるように、インビトロで調製し、成熟海馬ニューロン培養物とインキュベートしたＡＤＤＬにより、ニューロン分枝内に豊富な点部位を示す特異的結合パターンが得られた。抗体の合成オリゴマー予備吸収によって検出可能なシグナルは得られず（示さず）、非特異的抗体会合が除外された。オリゴマー特異的モノクローナル抗体を使用した免疫標識により（例えば、Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０およびその参考文献を参照のこと）、リガンドが単量体や原線維（示さず）ではない（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター分画実験によって立証された結論）ことが示された。１０〜１００ｋＤａのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ画分（図３Ａ）は、ニューロン表面に結合することができるオリゴマーを含んでいたが、１０ｋＤａ未満の画分（図３Ｂ）は含んでいなかった。図３Ｃに示すように、海馬細胞とのインキュベーション時に（６時間まで）培養培地中に存在するＡβ種は変化しない。典型的な合成ＡＤＤＬ調製物は、分子量が２４量体までであり、主に１２量体の種を含むＳＤＳ安定性アセンブリを含む一方で、ＡＤ脳抽出物は一般的な１２量体（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２４８を参照のこと）および４８量体（データ示さず）を含む。
【００７２】
さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィによる分離後にＡβ種のニューロン結合を試験した（Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０に記載）。ビオチン−Ａβ_1-42ペプチドから調製したビオチン化ＡＤＤＬは、２つのピークで溶離された（図３Ｄ）。既知の分子量標準に対する較正により、ピーク１は、１２量体およびより大きな種と一致する見かけの分子量が５０ｋＤａを超える種を含む一方で、ピーク２は単量体および小さなオリゴマーを含んでいた。図１のように、最高レベルの免疫反応性物質を含む画分を同定するために、溶離画分に対してドットブロット（アセンブリした全Ａβ形態を検出する方法）を行った（示さず）。次いで、これらの画分を、成熟海馬細胞培養物に対する結合能力について試験した。ピーク１に含まれる高分子量のＡβ種は、海馬樹状突起樹への結合を示す一方で（図３Ｅ）、ピーク２由来の低分子量の種は結合しなかった（図３Ｆ）。
【００７３】
したがって、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターまたはクロマトグラフィによる分画由来の結果は、ニューロン上に画像化された免疫反応性はプロトフィブリルなどの巨大分子や単量体または二量体などの小分子に起因しないことを示す。
【００７４】
実験によって生成されたオリゴマーによる選択的結合−結合部位のクラスターおよび細胞−細胞特異性：
ＡＤＤＬが非選択性膜の吸着または挿入によって結合されると予想していることに反して、全細胞は結合部位の点クラスターを示さなかった。二重標識実験における細胞−細胞特異性を、αＣａＭＫＩＩ陽性ニューロン対について示し（図４Ａ、Ｂ）、その１つだけがＡＤＤＬ結合を示す。多くの実験により、ＡＤＤＬに結合した培養海馬ニューロンの小集団は、典型的には、所与の培養物中に３０〜５０％含まれた。これらの結果により、細胞レベルでのＡＤＤＬ結合の特異性が確立される。
【００７５】
ＡＤＤＬ結合部位のクラスターは、シナプスと一致する。
細胞内レベルでは、ＡＤＤＬが特異的にシナプスに結合するかどうかは、ＡＤにおける記憶喪失がオリゴマー誘導性シナプス不全であるという仮説に対して非常に重要である（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。ＡＤＤＬシナプス可塑性を阻害する速度により（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１６，ｐｐ．５３５−５３９；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、神経学的に関連する結合がシナプス付近で起こり得る一方で、特定のシナプスを特異的にターゲティングする結合がＡＤにおける記憶特異性の主な原因となるだけでなく、機構に相当な制限を与えることが示唆される。上記の樹状分枝内の点状結合部位へのＡＤＤＬの局在化は、ＡＤＤＬがシナプス特異的リガンドであるという仮説と明確に一致する。しかし、点状結合部位の形態もまた、膜ラフトまたは接触点などの他の細胞内特殊化（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）と一致する。
【００７６】
オリゴマー結合部位の性質をさらに試験するために、ＰＳＤ−９５との同時局在化を試験した。ＰＳＤ−９５は、興奮性ＣＮＳシグナル伝達経路で見出されるシナプス後膜肥厚の重要な足場成分であり（例えば、Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．＆ Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８６８，ｐｐ．４８３−４９３；およびその参考文献を参照のこと）、ＰＳＤ−９５のクラスターは、シナプス後終末の決定的なマーカーとして確立されている（例えば、Ｒａｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１２１７−１２２９；およびその参考文献を参照のこと）。成熟海馬細胞培養物（本明細書中で使用される者など）では、本質的に全てのＰＳＤ−９５のクラスターがシナプスで生じる（例えば、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４５４５−４５５４；およびその参考文献を参照のこと）。予想するように、ＡＤＤＬ結合部位は、低倍率での重ね合わせで認められるＰＳＤ−９５点と非常に一致する（図４Ｃ）。より高い倍率での重ね合わせ分析により、ＡＤＤＬ結合部位がほとんど排他的にＰＳＤ−９５の点と同時局在化することが示された（図５Ａ〜Ｃ）。ＡＤ脳の抽出物で同一パターンが得られた（示さず）。ＡＤＤＬ結合部位はまた、シナプトフィジン陽性シナプス前末端と並列したが（図５Ｄ）、ＡＤＤＬとシナプトフィジンの免疫反応性の完全な一致は稀であった。ＡＤＤＬによる明らかなシナプスターゲティングを確証するために、ＡＤＤＬとＰＳＤ−９５との間の同時局在化範囲を、画像分析によって定量した。１４の視野の定量により、部位の９３＋／−２％で、合成ＡＤＤＬがＰＳＤ−９５と同時局在化することが示された（図５Ｆ、Ｈ）。したがって、ＡＤＤＬ結合部位は、ほとんど完全にシナプスと共に局在した。形態計測定量に基づいて、これらの部位は、さらに、シナプス小集団に対しても選択的なようであった。ＡＤＤＬ点の検出のための一定の閾値レベルでは、ＰＳＤ−９５点の約半分がＡＤＤＬと同時局在化するが（図５Ｅ、Ｇ）、ＡＤＤＬクラスター検出のためのより高い閾値では、全てのＰＳＤ−９５陽性樹状突起棘がＡＤＤＬに結合することが可能なようである。
【００７７】
ＡＤＤＬ結合部位は、さらに、ＮＭＤＡ受容体（ＮＲ１）免疫反応性と重複することが見出され（示さず）、これは、興奮性海馬シグナル伝達経路中のＰＳＤ−９５とＮＭＤＡグルタミン酸受容体との会合と一致する（例えば、Ｓｈｅｎｇ，Ｍ．＆ Ｐａｋ，Ｄ．Ｔ．（１９９９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８６８，ｐｐ．４８３−４９３；およびその参考文献を参照のこと）。ＡＤＤＬはまた、ＰＳＤ−ファミリータンパク質およびスピノフィリンと高度に同時局在化した（示さず）。ＡＤＤＬとＧｌｕＲｌ（樹状軸中で発現した受容体を認識するＧｌｕＲ１のＣ末端抗体）、リン酸化τ（τ−１（軸索マーカー）を使用する）、およびＳｏｒＬａ（アポリポタンパク質Ｅ受容体ＬＲ１１とも呼ばれるＬＤＬＲクラスＡ反復を含む選別タンパク質（ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）関連受容体；Ｄｒ．Ｈ．Ｃ．Ｓｃｈａｌｌｅｒから贈与）との間の重複は明らかではなかった。したがって、同時局在化はシナプスマーカーに選択的であった。
【００７８】
ＡＤＤＬによる特異的シナプスターゲティングの分子基盤は知られていないが、Ｂ１０３ ＣＮＳニューロン細胞株を使用した初期の研究では、フローサイトメトリー実験においてトリプシン感受性細胞表面タンパク質への特異的結合が示された（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；およびその参考文献を参照のこと）。広範な候補タンパク質（神経伝達物質の受容体、栄養因子、接着分子、および細胞外基質タンパク質が含まれる）が、ＰＳＤ−９５シナプスで蓄積する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された特定のタンパク質への結合を検出する可能性があるリガンド重ね合わせアッセイでは、ＡＤＤＬは、高親和性で、海馬および皮質由来の２つの膜結合タンパク質（分子量１４０および２６０ｋＤａ）に結合する（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；およびその参考文献を参照のこと）。これらのタンパク質はまた、単離シナプトソームで有意に富化される（８００〜９００％；Ｄ．Ｋｈｕｏｎ，ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。これら２つの分子量に対応するタンパク質を、質量分析によって同定した。Ｐ１４０は、主に、シナプス後タンパク質ｓｙｎＧＡＰ（ｒａｓＧＴＰアーゼ活性を刺激することが公知の１３５ｋＤａタンパク質）に対応する。Ｐ２６０は、主に、ｐｒｏＳＡＰ２またはＳｈａｎｋ３として公知のシナプス後足場タンパク質に対応する。ｓｙｎＧＡＰはＰＳＤ−９５に会合することが公知である一方で、ｓｈａｎｋ３はグルタミン酸受容体に会合することが公知である。
【００７９】
ＡＤＤＬは、シナプス記憶関連ＩＥＧタンパク質「Ａｒｃ」を異所性に上方制御する。
点のシナプス関連性は、図６Ａに示す高度に分枝したαＣａＭＫＩＩ陽性ニューロンへのＡＤＤＬ結合の顕著な特異性と一致する。このニューロンは、主に樹状突起上で見出される個別にクラスター化した部位を示し、点結合は細胞体上で検出可能であるが、密度は遥かに低い。より高倍率では（図６Ｂ）、合成画像の重ね合わせは、αＣａＭＫＩＩ陽性樹状突起棘をキャッピングする多数のオリゴマーの点を示す。αＣａＭＫＩＩは、記憶機能に関連するニューロンのシナプス後末端に蓄積することが公知であり、突起のあるシナプス後末端中のタンパク質の３０％超を含む（例えば、Ｉｎａｇａｋｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．２７１６５−２７１７１；およびその参考文献を参照のこと）。樹状突起棘へのＡＤＤＬ結合部位の頻繁な局在化により、棘分子に急速に影響を与える可能性が示唆される。
【００８０】
この可能性を調査するために、長期記憶形成に非常に関連するシナプス最初期遺伝子機構に及ぼすＡＤＤＬ結合の影響を試験した。目的の遺伝子は、Ａｒｃ（活性調節細胞骨格関連）タンパク質をコードする（例えば、Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３９９３−４００１；およびその参考文献を参照のこと）。生理学的にタンパク質がシナプス活性によって一過性に誘導される場合、Ａｒｃ ｍＲＮＡがシナプスにターゲティングされる（例えば、Ｌｙｆｏｒｄ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．４３３−４４５；Ｌｉｎｋ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐｐ．５７３４−５７３８；Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｏ．＆ Ｗｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｆ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．７０６２−７０６８；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。動物モデル研究により、適切なＡｒｃ発現がＬＴＰおよび長期記憶形成に必須であることを示された（例えば、Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３９９３−４００１；およびその参考文献を参照のこと）。薬物乱用および睡眠妨害との関連に加えて（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１０４，ｐｐ．１１−２０；Ｃｉｒｅｌｌｉ，Ｃ．＆ Ｔｏｎｏｎｉ，Ｇ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．９１８７−９１９４；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、Ａｒｃの異所性および異常な発現は、長期記憶形成不全の原因であると予想されている（例えば、Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３９９３−４００１；およびその参考文献を参照のこと）。
【００８１】
海馬ニューロンを、インビトロで生成したＡＤＤＬまたは媒体と５分間、１時間、および６時間処置し、Ａｒｃタンパク質に及ぼす影響を、免疫蛍光および免疫ブロットによって決定した。前に考察しているように、合成ＡＤＤＬは、ＡＤ由来の種よりも容易に得ることができ、且つ可溶性脳抽出物中に存在する多数の未知の物質（ｍｙｒｉａｄ）によって汚染されていないので、合成ＡＤＤＬを使用した。最も初期の時点（５分）で、二重標識免疫蛍光により、オリゴマー結合が樹状点Ａｒｃ発現と同時局在化することが明らかとなった（図７）。構成性に発現する低レベルのＡｒｃタンパク質はシナプスではなく細胞体に局在することが公知であるので、この位置は異所性誘導のようである（例えば、Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｏ．＆ Ｗｏｒｌｅｙ，Ｐ．Ｆ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９８，ｐｐ．７０６２−７０６８；およびその参考文献を参照のこと）。
【００８２】
ＡＤＤＬへのより長い曝露後、Ａｒｃ発現は、強い上方制御を示した。棘および樹状突起の至る所でのＡｒｃ発現は、媒体処置コントロール（図８Ａおよび８Ｃ）と比較して、１時間後に顕著であり（図８Ｂ）、６時間後もそのままであった（図８Ｄ）。免疫ブロットにおいてＡｒｃ発現の上昇も明らかであり（図８Ａ〜Ｂ）、コントロールにおける低レベルのＡｒｃ−ＩＲはニューロン細胞体における最小基本Ａｒｃ発現と一致した。ＡＤＤＬ誘導性のＡｒｃ増加は、媒体処置培養物の５倍であった。
【００８３】
Ａｒｃタンパク質はＦ−アクチンと結合して棘の形態に機能的に関与し、その慢性過剰発現により、異常な棘構造が生成されることが示唆されている（例えば、Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．Ｐ．＆ Ｄｅａｄｗｙｌｅｒ，Ｓ．Ａ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．６４４３−６４５１；およびその参考文献を参照のこと）。本実験における棘形態の試験により、オリゴマー処置群中のＡｒｃ陽性棘がコントロール群中の少数のＡｒｃ陽性棘と異なることが示された。低レベルのＡｒｃを発現するコントロール棘は切り株状であり、密接に樹状軸に沿って存在するのに対して（図８Ｃ）、ＡＤＤＬ処置棘はより長く、且つ樹状軸から伸長しているようであった（図８Ｄ）。類似の突出した棘構造は、抗スピノフィリンで免疫標識した処置培養物で明らかであった（示さず）。
【００８４】
考察
ＡＤＤＬは、ＡＤ脳内に蓄積する神経学的に有害な分子である（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；およびその参考文献を参照のこと）。この開示は、ＡＤＤＬ作用の細胞生物学に取り組み、ＡＤＤＬがシナプス終末に特異的なリガンドとして作用し、ＡＤＤＬが長期記憶形成に必須のシナプス最初期遺伝子の正常な発現を破壊することを示す。データは、初期ＡＤ記憶喪失が、ニューロンの死滅およびアミロイド原線維と無関係にＡＤＤＬ誘導性シナプス不全に起因するという新規の仮説を支持するための新規の分子機構を提供する（例えば、Ｈａｒｄｙ，Ｊ．＆Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９７，ｐｐ．３５３−３５６；Ｋｉｒｋｉｔａｄｚｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．６９，ｐｐ．５６７−５７７；Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１９−２２４；Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【００８５】
種々の実験パラダイムにおける神経学的影響の研究と組み合わせた以前の臨床データおよびマウスモデルデータは、ＡＤ記憶喪失における非原線維Ａβ神経毒に強く関与している（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４０５０−４０５８；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１６，ｐｐ．５３５−５３９；Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．＆ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１１，ｐｐ．２１３−２２８；Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．９２４，ｐｐ．１３３−１４０；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。Ｒｏｈｅｒ ａｎｄ ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓは、可溶性Ａβに量体はＡＤ中で上昇するが、これらは当初は神経学的に無関係であると考えられ、有毒なアミロイド原線維の形成の途中の一過性の種としてのみ存在することを示した（例えば、Ｌｕｅ，Ｌ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１５５，ｐｐ．８５３−８６２；およびその参考文献を参照のこと）。Ａβオリゴマーは、現在、原線維構造に変換することなく長期間存在する安定な分子構成要素（ｅｎｔｉｔｙ）として確立されている（例えば、Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０；およびその参考文献を参照のこと）。さらに、ＡＤＤＬは、強力なＣＮＳ神経毒であることが公知である（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；およびその参考文献を参照のこと）。初期ＡＤに最も関連するＡＤＤＬはＬＴＰを阻害する。ｅｘ ｖｉｖｏおよびインビボで認められるように、阻害は急速であり、非変性であり、且つ高い選択性を示す。シナプス可塑性に及ぼすＡＤＤＬの影響は、年齢、領域、および導入遺伝子に依存する様式でＡＤＤＬを蓄積する（例えば、Ｃｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．３０５−３１３；およびその参考文献を参照のこと）ｈＡＰＰトランスジェニックマウスで認められるプラーク独立性認知不全の主な原因である可能性が高い（例えば、Ｈｓｉａ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．３２２８−３２３３；Ｍｕｃｋｅ，Ｌ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４０５０−４０５８；Ｂｕｔｔｉｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１０５３９−１０５４８；Ｖａｎ Ｄａｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．３８８−３９６；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。ＡＤＤＬは、ｈＡＰＰマウスにおける記憶喪失を逆転する（急速且つプラーク負荷に無関係の回復）治療抗体の標的である可能性が高い。
【００８６】
オリゴマー特異的抗体によって検出された抗原の存在も、ＡＤ脳切片で見出されている（例えば、Ｋａｙｅｄ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３００，ｐｐ．４８６−４８９；およびその参考文献を参照のこと）。これらの抗原の局在化は神経炎斑と異なり、原線維と無関係のオリゴマーのインサイチューでの存在が確立された。この調査で認められたパターンは、この初期の報告と一致する。ここで認められたニューロン周囲の分布により、さらに、樹状分枝へのＡＤＤＬの局在化が示唆される。ＡＤ脳組織から抽出されたＡＤＤＬによる樹状突起結合は、以前に、培養海馬ニューロンを使用した実験で認められている（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；およびその参考文献を参照のこと）。本結果は、ＡＤ脳抽出物中のリガンドが１０ｋＤａと１００ｋＤａとの間であり、主に１２量体（５６ｋＤａ）の種が確立される二次元ゲル免疫ブロットによる可溶性ＡＤ脳抽出物の分析と一致することを示す。１２量体のＡＤ脳は、インビトロで生成したＡＤＤＬ調製物で見出された１２量体と、等電点、高次構造感受性抗体による認識、および樹状分枝に選択的に結合する能力に関して区別できない。
【００８７】
本明細書中に示した新規のデータは、ＡＤＤＬの樹状突起標的がシナプス終末であることを証明する。この所見が、ＡＤＤＬがシナプス不全の原因であるという仮説と調和するにもかかわらず、点状結合部位のサイズおよび分布を膜ラフトまたは接触点への結合によって説明することもできる。本実験では、共焦点免疫蛍光顕微鏡法を使用して、オリゴマーの局在化を十分に確立されたシナプスマーカー（ＰＳＤ−９５）と比較した。成熟海馬培養物では、本明細書中で使用される場合、ＰＳＤ−９５点は、本質的に１００％シナプスである（例えば、Ｒａｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１２１７−１２２９；およびその参考文献を参照のこと）。インビトロまたはＡＤ脳のいずれかから生成されたＡＤＤＬは、ほとんど排他的にシナプスと同時局在化することが見出された。オリゴマーが全てのニューロンおよびシナプスに結合するわけではないが、ターゲティングされる特定の表現型が解明されることは注目に値する。しかし、予備実験は、ターゲティングしたシナプスがグルタミン酸受容体を含むことを示す。別の未解決の問題は、培養物中のシナプスへの結合とＡＤ脳切片中のオリゴマーによって認められる拡散性の染色との間の関係である。データは、インサイチューでの拡散性染色がシナプスに由来するであろうという仮説と一致し、この仮説は、現在、ＥＭ免疫金分析によって調査中である。
【００８８】
シナプスがインサイチューでターゲティングされた場合、記憶に及ぼす影響は、最終的に、ターゲティングされたシナプス数、各シナプスが影響を受ける範囲、記憶形成過程全体に対する罹患シナプスの関連に依存するであろう。リガンドが解離するかその結合部位の向きが変わった場合、シナプスの影響は自発的に逆になり得る。このような複雑さにより、シナプスの逆転および認知機能の日によるばらつきと調和するにもかかわらず、オリゴマーレベルと記憶喪失との間の単純な関係の予想が困難になる。しかし、記憶喪失が現れる前に占有閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ）を上回る可能性が高いようである。
【００８９】
Ａｒｃが長期記憶形成に関与すると予想されるので、ＡＤＤＬに対するＡｒｃの応答が特に興味深い（例えば、Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．（２００２）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．８６−１０４；およびその参考文献を参照のこと）。生理学的に、Ａｒｃ発現は、パターン化されたシナプス活性によって調節され（例えば、Ｌｙｆｏｒｄ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．４３３−４４５；Ｌｉｎｋ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐｐ．５７３４−５７３８；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、最近活性化された樹状突起棘で発現する（例えば、Ｍｏｇａ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．７−１１；およびその参考文献を参照のこと）。樹状突起では、Ａｒｃ ｍＲＮＡはシナプス棘（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｓｐｉｎｅ）に局在し、初期測定点でのＡｒｃおよびオリゴマーの同時局在化と一致する。このモデルにおけるシナプスＡｒｃタンパク質発現との関係が決定されていないにも関わらず、ｔｇ−マウスＡＤモデルにおいてＡｒｃ ｍＲＮＡが加齢に伴って減少することが以前に留意されている（例えば、Ｄｉｃｋｅｙ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．５２１９−５２２６；およびその参考文献を参照のこと）。本研究では、ＡＤＤＬによってＡｒｃ誘導が保持され、それにより、樹状分枝全体にタンパク質が異所性に拡散する。通常、Ａｒｃタンパク質が拍動（ｐｕｌｓａｔｅ）様式または一過性様式で機能し、保持されたＡｒｃ発現によってシナプス雑音が生じ、それにより、長期記憶形成が阻害されると提案されている（例えば、Ｇｕｚｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｆ．（２００２）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．８６−１０４；およびその参考文献を参照のこと）。この予想は、Ａｒｃの上昇と学習能力の低下との間の相関関係を示したｔｇ−マウス由来の所見によって支持される（例えば、Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．Ｐ．＆ Ｄｅａｄｗｙｌｅｒ，Ｓ．Ａ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．６４４３−６４５１；およびその参考文献を参照のこと）。
【００９０】
どのようにして異所性Ａｒｃの影響によってシナプス不全が起こるのかについては、棘の形状および受容体輸送が関与し得る（図９）。Ａｒｃは、細胞骨格およびシナプス後タンパク質に関連し（例えば、Ｌｙｆｏｒｄ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．４３３−４４５；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７６，ｐｐ．５１−６３；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）、ｔｇ−マウスにおけるＡｒｃの上昇によってシナプス棘が硬化し、これが、構造の可塑性を妨害し、学習を遅延させると提案されている（例えば、Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．Ｐ．＆ Ｄｅａｄｗｙｌｅｒ，Ｓ．Ａ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．６４４３−６４５１；およびその参考文献を参照のこと）。シナプス棘の異常は、種々の脳機能障害に共通し（例えば、Ｆｉａｌａ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．３９，ｐｐ．２９−５４；およびその参考文献を参照のこと）、棘が異常に曲がって突出する精神発達障害が含まれる（例えば、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｅ．＆ Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｗ．（２０００）Ｃｅｒｅｂ．Ｃｏｒｔｅｘ．，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．９８１−９９１；およびその参考文献を参照のこと）。棘の異常は、シナプスシグナル処理および関連する情報の保存を急速に変化させ得る（例えば、Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．（１９８２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．５，ｐｐ．４４−４６；Ｒａｏ，Ａ．＆ Ｃｒａｉｇ，Ａ．Ｍ．（２０００）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｖｏｌ．１０；ｐｐ．５２７−５４１；Ｙｕｓｔｅ，Ｒ．＆ Ｂｏｎｈｏｅｆｆｅｒ，Ｔ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０７１−１０８９；およびその参考文献を参照のこと）。Ａｒｃの上昇により、シナプス可塑性に必要な受容体の循環も破壊され得る（例えば、ＡＭＰＡ受容体の上方制御の遮断）。Ａｒｃの細胞生物学と一致して、この破壊は、棘構造を同時に変化させ得る機構を介した細胞骨格の組織化（例えば、ｆ−アクチンまたはＰＳＤ）またはシグナル伝達経路（例えば、ＣａＭＫＩＩを介する）に及ぼす影響に由来し得る。
【００９１】
他のシナプスシグナル伝達経路は、培養モデル中のオリゴマーにも影響を受ける。皮質培養物では、低濃度のオリゴマー（致死量以下）は、グルタミン酸のＣＲＥＢリン酸化を誘導する能力（例えば、Ｔｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７６，ｐｐ．１７３０１−１７３０６；およびその参考文献を参照のこと）、シナプス可塑性に関連するシグナル伝達経路（例えば、Ｓｗｅａｔｔ，Ｊ．Ｄ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７６，ｐｐ．１−１０；およびその参考文献を参照のこと）を阻害する。海馬スライス培養では、最近の薬理学的研究により、オリゴマーによるＬＴＰ阻害に特定のキナーゼが関与することが示されている。代謝調節型グルタミン酸受容体５型のアンタゴニストが行うように、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、およびｃｄｋ５のインヒビターがオリゴマーのＬＴＰへの影響を遮断することが潜在的に非常に興味深い（例えば、Ｗａｎｇ，Ｚ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４７，ｐｐ．３３２９−３３３３；およびその参考文献を参照のこと）。本発明者らはまた、オリゴマー作用における受容体の推定される関与を示唆し、公開されたデータはシナプスＡＤＤＬ結合を媒介する受容体タンパク質の同一性を確立していない（例えば、Ｖｅｒｄｉｅｒ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２２９−２４８；およびその参考文献を参照のこと）。上記のシグナル伝達事象およびＡｒｃ誘導がＡｒｃに及ぼすＡＤＤＬの影響に関して並行しているのかまたは連続しているかについては、依然として決定されていない。
【００９２】
破壊的シナプスリガンドとしてのＡＤＤＬの作用により、ＡＤシナプス不全についての直感的に魅力的な機構が得られる。手掛かりは、シナプス自体がターゲティングされることである。どのようにし記憶特異的喪失が非特異的細胞会合に由来するのかを説明する必要はない（例えば、細胞膜への無作為な挿入（例えば、 Ｇｉｂｓｏｎ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．１６１０，ｐｐ．２８１−２９０；およびその参考文献を参照のこと））。本データにより、記憶開始事象がシナプスで局所的に破壊される倹約機構（ｐａｒｓｉｍｏｎｉｏｕｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）が示唆される。最終的に、曝露の延長により、オリゴマーによってターゲティングされたシナプスが、関連するシナプスシグナル伝達分子（例えば、Ｆｙｎなど）によって媒介される物理的分解を受け得る（例えば、Ｃｈｉｎ，Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．４６９２−４６９７；およびその参考文献を参照のこと）。ＡＤＤＬは、いくつかの初期ＡＤのトランスジェニックモデルにおける終末のプラーク依存性喪失を説明するために提案されている（例えば、Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４０５０−４０５８；およびその参考文献を参照のこと）。ｔｇ−マウスにおけるＡｒｃ ｍＲＮＡの年齢依存性の減少の報告は、シナプス劣化の初期段階の可能性と一致するが、明らかな終末の喪失は、これらの系統で生じないようである（例えば、Ｄｉｃｋｅｙ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．５２１９−５２２６；およびその参考文献を参照のこと）。
【００９３】
末期ＡＤでは、認知変性は、記憶喪失を遥かに超えて拡大する（例えば、Ｃｏｙｌｅ，Ｊ．Ｔ．（１９８７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｄｅｌｍａｎ Ｇ，ｅｄ），ｐｐ ２９−３１．Ｂｏｓｔｏｎ−Ｂａｓｅｌ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ：Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ；およびその参考文献を参照のこと）。初期発病事象の遮断によってこの壊滅的な下流カスケードに決して到達させないことが望ましいであろう。ヒトワクチン試験の結果は、Ａβ由来の神経毒をターゲティングする治療抗体が実際に疾患の進行を食い止めることを示すが（例えば、Ｈｏｃｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．３８，ｐｐ．５４７−５５４；およびその参考文献を参照のこと）、能動ワクチンでの有意な脳炎の発生率がこのストラテジーを複雑にしている（例えば、Ｓｃｈｅｎｋ，Ｄ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．８２４−８２８；Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．＆ Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２０，ｐｐ．８７９−８８４；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。受動的ワクチン接種は、より高価であるが、副作用がより少なく、さらに、高齢者に共通する免疫応答障害の問題が克服される。可溶性Ａβ種を免疫中和するモノクローナル抗体は、２つの独立した研究で、初期ＡＤのｔｇ−マウスモデルで記憶喪失を逆転することが示されている（例えば、Ｄｏｄａｒｔ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．５，ｐｐ．４５２−４５７；Ｋｏｔｉｌｉｎｅｋ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．６３３１−６３３５；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。さらに、生理学的単量体に対する親和性が最小の毒性Ａβ型に特異的な抗体を作製するためにＡＤＤＬを使用することが可能であった（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９５−６０５；およびその参考文献を参照のこと）。さらに、最近のハイブリドーマ研究では、オリゴマーに結合するがアミロイド原線維に結合せず、プラークに結合した抗体に起因する炎症の懸念が減少した抗体を生成することが可能であることが示されている（例えば、Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０；およびその参考文献を参照のこと）（Ｃｈｒｏｍｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、記憶関連Ａβアセンブリをターゲティングするヒト治療抗体が開発される見込みがあるようである。
【実施例２】
【００９４】
受容体−ＡＤＤＬの付着および同時局在化
本質的にＬａｃｏｒ，Ｐ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｎｏ．４５，ｐｐ．１０１９１−１０２００に記載のように、受容体−ＡＤＤＬの付着および同時局在化を行った。簡単に述べれば、３週間培養した海馬（ＨＰ）細胞を、５００ｎＭ ＡＤＤＬで３０分間で処置し、固定し、５回洗浄した。使用した抗体に依存して、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００透過処理を使用するか使用しないで免疫標識を行った（すなわち、抗Ａβ Ｎ末端抗体を使用する場合、非透過処理条件を使用した）。抗グルタミン酸−受容体モノクローナル抗体＋Ｍ７１抗ＡＤＤＬポリクローナル抗体またはポリクローナルグルタミン酸−受容体抗体＋２０Ｃ２抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体のいずれかを使用して、二重標識を行った（例えば、２００４年１０月２５日出願の米国特許出願番号第６０／６２１，７７６号を参照のこと）。共焦点顕微鏡法を使用して、免疫反応性を画像化した。
【００９５】
図１１−１についての言及：パネル中に示したグルタミン酸（ＡＭＰＡまたはＫＡＩＮＡＴＥ）受容体抗体の色は、免疫反応（ＩＲ）の色に適合する。ＡＤＤＬ−ＩＲは、反対色である。ＡＤＤＬとグルタミン酸受容体の同時局在化は、黄色で認められる。画像は、表示の受容体およびＡＤＤＬについての二重標識した３週齢のＨＰ細胞の樹状突起樹の一部を示す。画像を、１００倍の対物レンズおよびデジタル３．５倍ズームで取得した。スケールバーは、４μｍ（ミクロン）を示す。示したデータは、捕捉した条件あたりの６視野の２つの異なる実験を代表する。
【００９６】
図１１−２についての言及：パネル中に示したグルタミン酸（ＮＭＤＡ）受容体抗体の色は、免疫反応（ＩＲ）の色に適合する。ＡＤＤＬ−ＩＲは、反対色である。同時局在化は、黄色で認められる。画像は、表示の受容体およびＡＤＤＬについての二重標識した３週齢のＨＰ細胞の樹状突起樹の一部を示す。画像を、デジタルズームを行っていないパネル標識「ＮＲ２Ａ／Ｂ Ｃｈｅｍ」以外は１００倍の対物レンズおよびデジタル３．５倍ズームで取得した。示したデータは、捕捉した条件あたりの６視野の1つの実験を代表する。
【００９７】
分析：この情報は、特異的グルタミン酸受容体とＡＤＤＬとの間の同時局在化の質的描写を示す。どの解釈にも拘束されないが、予備実験の結果により、ＡＭＰＡ−ＲがＮＭＤＡ−Ｒよりも頻繁にＡＤＤＬと同時局在化することが示唆される。ＡＤＤＬは、グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ−ＲまたはＮＭＤＡ−Ｒ）を発現する樹状突起で常に見出され、しばしばこれらの受容体に並列する。
【実施例３】
【００９８】
受容体に及ぼすＡＤＤＬの影響
図１２に示すように、ＮＲ２Ｂ膜発現は、ＡＤＤＬ曝露後に減少する。非透過処理条件下では、ＮＲ２Ｂ膜発現量を、細胞外エピトープに対する抗体を使用して評価した。ＮＲ２Ｂ標識の比較分析を行うために等しい密度の神経網を画像化した。標識されたピクセルの総数の有意な減少が認められ、これはＮＲ２Ｂ点数の減少と一致した（ｐ＜０．００１、ｎ＝４、２つの異なる実験で認められた１実験由来の神経網画像）。神経突起に沿って標識したＮＲ２Ｂの例は、定量のために画像化した神経網中のＡＤＤＬ処置後のＮＲ２Ｂ標識の認められた減少の代表である（Ｃ、Ｄ、スケールバーは８μｍを示す）。
【実施例４】
【００９９】
棘幾何学に及ぼすＡＤＤＬの影響
図１３に示すように、ＡＤＤＬでの海馬ニューロンの経時処置により、スピノフィリン免疫蛍光（ＩＦ）強度および棘の形態によってモニタリングしたところ、一過性にシナプス後応答が得られる。ＡＤＤＬでの海馬ニューロンの経時処置により、１時間後にスピノフィリン蛍光の減少が明らかとなり、３時間後に有意にピークとなり、その後コントロールレベルに戻る（Ａ、ｐ＜０．０５、グラフにしたデータは、１つの実験から画像化した５つのニューロンの平均および対応するＳＥＭである）。ＡＤＤＬ曝露後のスピノフィリンＩＦの代表的画像を示す。（Ｂ、スケールバーは３０μｍを示す）。ＡＤＤＬでの経時処置後の棘の長さも測定し、ＡＤＤＬとの３時間のインキュベーション後に棘の長さの有意な増加が認められた（Ｃ、ｐ＜０．００５、グラフにしたデータは、１つの実験から画像化した異なるニューロン由来の１０の樹状突起の枝部から得た棘の長さの平均である）。棘の長さの測定値の分布により、より長い棘に向かうＡＤＤＬ誘導性のシフトが証明される（Ｄ）。スピノフィリンＩＦの高倍率画像を、棘の長さの定量に使用した（Ｅ、Ｆ、３時間のＡＤＤＬ／媒体インキュベーション後の代表的画像、スケールバーは８μｍを示す）。
【実施例５】
【０１００】
Ｅｒｂ−Ｂ４受容体に及ぼすＡＤＤＬの影響
図１４に示すように、１時間のＡＤＤＬ曝露後にＥｒｂ−Ｂ４ ＩＦ染色強度が減少する。成熟海馬ニューロンを、媒体（Ａ）およびＡＤＤＬ（Ｂ）で処置し、その後、Ｅｒｂ−Ｂ４について免疫標識した。Ｅｒｂ−Ｂ４（赤色）は、ＡＤＤＬによってターゲティングされない一握りの細胞で強く発現され、これは、ＥｒｂＢ４とＡＤＤＬ（緑色）の免疫反応性の画像の組み合わせによって証明される（Ｃ）。挿入図は、ＡＤＤＬ結合神経網のより高倍率の拡大画像であり、Ｅｒｂ−Ｂ４とＡＤＤＬ点との間で同時局在化を欠くことが示されている。等しい密度の神経網におけるＥｒｂＢ４ ＩＦの定量により、標識ピクセルおよび点の数の有意な増加が明らかとなった（Ｄ、Ｅ、ｐ＜０．０５、グラフは１つの実験から得られた４つの画像の平均および対応するＳＥＭを示す）。スケールバーは４０μｍを示す。
【実施例６】
【０１０１】
シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）へのＡＤＤＬの結合
図１５に示すように、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定したところ、ＡＤＤＬは、シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に結合するが活性帯（ＡＺ）に結合しない。ＰＳＤへのＡＤＤＬの結合を、ＡＤＤＬを含むＥＬＩＳＡプレートに付着した単離ＰＳＤのインキュベーションによってアッセイした。コントロールとして活性帯（ＡＺ）を使用した。図１５中のパネルＡは、ＰＳＤへのＡＤＤＬ結合のアッセイのための典型的なプロトコールを概説する。パネルＡの上部に示すように、最初に、標準的なプロトコールにしたがって、シナプトソームを使用してＰＳＤおよびＡＺを生成する（例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．３２，ｐｐ．６３−７７；およびその参考文献を参照のこと）。図では、本明細書中の他の場所に示すように、ＴＸ１００は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を示す。Ｍ７１／２は、以前に開示のＭ９３およびＭ９４に類似のＡＤＤＬ特異的ポリクローナル抗体を示す（例えば、２００２年６月１１日出願の米国特許出願番号第１０／１６６，８５６号）。図１５中のパネルＢは、このようなアッセイの典型的な結果を示す。
【０１０２】
図１６に示すように、ＣＮＱＸはシナプトソームへのＡＤＤＬの結合を遮断する。図１６中のパネルＡは、ＣＮＱＸの存在下でのシナプトソームへのＡＤＤＬ結合のアッセイのための典型的なプロトコールを概説する。図１６中のパネルＢは、このようなアッセイの典型的な結果を示す。ＷＢは、この場合は６Ｅ１０抗体を使用したウェスタンブロットを示す。
【０１０３】
図１７に示すように、ＡＤＤＬ免疫沈降アッセイにおいて、ＣＮＱＸは、ＰＳＤ−９５の共沈量を減少させる。図１７のパネルＡは、ＣＮＱＸの存在下でのＰＳＤ−９５へのＡＤＤＬ結合のアッセイのための典型的なプロトコールを概説する。図１７中のパネルＢは、このようなアッセイの典型的な結果を示す。ＰＳＤ−９５ ＷＢは、標準的なプロトコールにしたがって行ったＰＳＤ−９５ウェスタンブロットを示す。
【０１０４】
図１８に示すように、ＣＮＱＸは、ニューロン表面へのＡＤＤＬ結合を遮断する。ＡＤＤＬまたはＡＤＤＬ＋ＣＮＱＸを、本明細書中に記載の培養物中でニューロン細胞とインキュベートした。典型的なＡＤＤＬ点状結合が認められ、所与の突起長あたりの各点を計数した。ＣＮＱＸの存在下でＡＤＤＬ点状結合部位数は減少する。
【実施例７】
【０１０５】
ニューロンへのＡＤＤＬ結合の定量
図１９および２０に示すように、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を定量することができる。
【０１０６】
標準的なプロトコールにしたがって、ビオチン化ＡＤＤＬを調製した。
【０１０７】
漸増量のビオチン−ＡＤＤＬ（．０７μＭ〜１７．８μＭ）を、初代海馬培養物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ニューロンを、加温したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドにて４Ｃで２０分間固定した。ＰＢＳで細胞を数回洗浄することによってパラホルムアルデヒドを除去した。非特異的結合を、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳをを使用した室温で３０分間のインキュベーションによって遮断した。ニューロンを、アルカリホスファターゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，１：１５００）にカップリングしたストレプトアビジンと室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞を数回洗浄することによって非特異的結合を除去した。アルカリホスファターゼの基質としてＳａｐｐｈｉｎｅ−ＩＩを使用したＣＤＰ Ｓｔａｒを使用して、ＡＤＤＬ結合を検出した。終点発光を、Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓ ｐｒｏを使用して室温で３０分間のインキュベーション後に測定した（例えば、図１９を参照のこと）。
【０１０８】
ＡＤＤＬ結合の免疫細胞化学：初代海馬ニューロンを、２．５μＭ ＡＤＤＬと共に３７Ｃで１５分間インキュベートした。その後、ニューロンを加温ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、その後、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した。非特異的結合を、２％正常ヤギ血清を含むＰＢＳを使用して室温で３０分間遮断した。一次抗体を、４Ｃで一晩インキュベートした（ウサギ抗微小管関連タンパク質（ＭＡＰ２）の７００倍希釈物およびマウス抗ＡＤＤＬ抗体の２０００倍希釈物）。翌日、培養物をＰＢＳで洗浄し、その後、適切なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８または５９４抱合ＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（２μｇ／ｍｌ）と共に室温で２時間インキュベートした。さらに、３００ｎＭのＤＡＰＩ核色素を含むＰＢＳを３０分間添加した。その後、培養物を、ＰＢＳで４回洗浄し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ａｒｒａｙｓｃａｎプラットフォームを使用して画像化した。
【０１０９】
Ａｒｒａｙｓｃａｎ：Ａｒｒａｙｓｃａｎ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを、ＡＤＤＬ陽性初代海馬培養物の画像分析のために修正して使用した。蛍光強度を測定するために、３チャネルを使用して対象物を同定した。チャネル１は、第１の対象物（ＤＡＰＩ色素によって視覚化した核）のためであり、この対象物の平均強度および総強度を測定した。チャネル２および３は従属チャネルであるので、チャネル２をニューロンＭＡＰ２染色（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４によって視覚化）に割り当て、チャネル３をＡＤＤＬ染色（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８によって視覚化）に割り当てた。１０倍対物レンズを使用して画像を取得し、１ウェルあたり全部で１５視野をスキャニングした。（例えば、図２０のパネルＡおよびＢを参照のこと）。
【実施例８】
【０１１０】
ＡＤＤＬ受容体
膜の調製
（１）いくつかの工程で示した操作以外は、全ての操作を４℃で行った。氷上で成体ラットから全脳を除去した。
（２）小脳、皮質、および海馬をＰＢＳ中で分離した。望ましくない白質の切除後、大血管を除去した。
（３）冠状断面を、０．３２Ｍスクロース、５０ｍＭ ＨＥＰＳ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭジチオスレイトール、２００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、４μｇ／ｍｌロイペプチン、および３０μｇ／ｍｌ塩酸ベンズアミジンを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含む３倍量の緩衝液Ａで３回洗浄した。
（４）１ｇの組織を、２０倍量の緩衝液Ａで２０分間ホモジナイズし、混合物を、１，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
（５）ペレットを１５倍量の緩衝液Ａに再懸濁し、工程４を繰り返した。
（６）合わせた上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。
（７）ペレットを３０ｍｌＰＢＳに懸濁し、１００，０００×ｇで４５分間再度遠心分離した。
（８）ペレットを２ｍｌＰＢＳに再懸濁し、細胞膜として使用し、−８３℃で維持した。
【０１１１】
界面活性剤処置によるＡＤＤＬ受容体の富化および線形勾配超遠心
界面活性剤処置
成体ラット皮質の４０ｍｇ×６の皮質膜タンパク質を、０．４％双性イオンを含む１２０ｍｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）に室温で１時間溶解した。
【０１１２】
線形スクロース勾配超遠心
３０〜６０％スクロース線形勾配を含む１０ｍｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を調製し、１つの超遠心管の底に誘導した。２０ｍｌの界面活性剤処置溶液を、このスクロース線形勾配の上部に適用した。１００，０００ｇで１８時間超遠心を行った。底のペレットを、ｐ１４０およびｐ２６０を含む粗サンプルとして使用した。このサンプルを、３ｍｌ １０％ＳＤＳに溶解し、１０ｍＭリン酸ナトリウムによって室温で１時間１％ＳＤＳに再度希釈した。この溶液を、１００，０００ｇにて２１℃で１時間遠心分離した。上清を、ＣＨＴ ＨＰＬＣにアプライした。
【０１１３】
ＣＨＴカラムによるＡＤＤＬ受容体の富化
上清（すなわち、ＡＤＤＬ受容体の粗抽出物）を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、および０．５ｍＭ ＤＴＴで平衡化したＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ ＣＨＴ−ＩＩカートリッジにアプライした。平衡化緩衝液での洗浄後、同一緩衝液中のリン酸ナトリウムの線形勾配（１０〜７００ｍＭ）を使用してクロマトグラフィを行った。ＳＤＳの沈殿を防止するために緩衝液およびカラムを２８℃に保持した。２００μｌの溶離画分を、１％ＳＤＳを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して一晩透析した。これらの画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ、１０ｋＤａカットオフ）での限外濾過によって６０μｌに濃縮し、１００％ＰＥＧによって２５μｌに再度濃縮した。
【０１１４】
カラム由来の画分中のＡＤＤＬ受容体の同定
リガンドとして合成ＡＤＤＬを使用した。ラット皮質の７５μｇタンパク質を、コントロールのために、３０μｌの電気泳動サンプル緩衝液に溶解した。濃縮された画分を、２５μｌの電気泳動サンプル緩衝液と混合した。電気泳動条件は以下の通りである。４〜２０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル、１２０Ｖ、室温で１．５時間および冷所で２．５時間。移動：１００Ｖで１時間。ニトロセルロース膜を、５％無脂肪粉乳を含むＴＢＳ．Ｔ１で一晩ブロッキングし、ＴＢＳ．Ｔ１にて室温で３回×１５分間洗浄した。ニトロセルロース膜上のタンパク質を、１０ｎＭ ＡＤＤＬを含む１０ｍｌ Ｆ１２培地と冷所で３時間インキュベートした。ニトロセルロース膜を、ＴＢＳ．Ｔ１にて室温で３回×１５分間洗浄し、一次抗体Ｍ７１／２（１：４，０００）を含む５％ミルク含有ＴＢＳ．Ｔ１と室温で１時間インキュベートした。膜を、ＴＢＳ．Ｔ１にて室温で３回×１５分間洗浄し、５％ミルクと共にＭ７１／２に対する二次抗体Ｉｇウサギ（１：１６０，０００）と室温で１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳ．Ｔ１にて室温で３回×１５分間洗浄した。画像を、ＥＣＬ，Ｆｅｍｔｏ Ｋｉｔ（各０．５ｍｌおよび１．０ｍｌ水）によって現像した。
【０１１５】
電気泳動によるｐ１４０およびｐ２６０の分離
ＣＨＴ−カラム由来のｐ１４０およびｐ２６０を含む画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＡＤＤＬリガンドブロットのために、コントロールの膜タンパク質をニトロセルロースに移した。他のラインのゲルを、クーマジーブルーＲ２５０で染色した。コントロールとの比較後、ｐ１４０およびｐ２６０を切り出し、配列決定のためにミシガン州立大学に送った。
【０１１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＮ末端配列：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質を、クーマジーブルーＲ−２５０で染色する。バンドを切り出し、ゲル中のタンパク質をトリプシンで消化し、ＨＰＬＣによってペプチドを溶離および分画し、質量分析計に導入する。Ｍａｓｃｏｔでペプチド配列を検索した。
【０１１７】
Ｎ末端配列：
タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した後、タンパク質をクーマジーブルーＲ−２５０で染色した。タンパク質バンドを切り出し、Ｅｄｍａｎ化学によってタンパク質のＮ末端配列を決定した。
【０１１８】
ｐ１４０およびｐ２６０と同定された２つのタンパク質がｓｙｎＧＡＰと呼ばれるタンパク質およびＰｒｏＳＡＰ／Ｓｈａｎｋと呼ばれるタンパク質であるとさらに決定した（例えば、米国特許第６，７２３，８３８号；Ｐａｒｋ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７８，ｎｏ．２１，ｐｐ．１９２２０−１９２２９；Ｒｏｕｓｓｉｇｎｏｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．１４，ｐｐ．３５６０−３５７０；Ｓａｌａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．１８，４５８７−４５９２；Ｓｏｌｔａｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６５９−６６５；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。これらは、シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）中に存在し、種々の受容体およびチャネルを固定する働きをする足場タンパク質である。ＡＤＤＬは、両方と相互作用するようである。依然として同定されていない他の膜貫通ＡＤＤＬ受容体タンパク質が存在する可能性が高い。このような受容体には、シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）受容体、グルタミン酸受容体（例えば、ｍＧｌｕＲ、ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ５、およびＧｌｕＲ６など）、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ（すなわち、Ｎａ⁺／Ｋ^-ＡＴＰアーゼ）、インテグリン受容体、接着受容体、栄養因子受容体（例えば、トロフィン受容体）、ＧＡＢＡ受容体、およびＣＡＭキナーゼなどが含まれ得るが、これらに限定されない（例えば、米国特許第４，９７５，４３０号；Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｎｏ．１３，ｐｐ．３３７０−３３７８；Ｍａｊ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．４５，ｎｏ．７，ｐｐ．８９５−９０６；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，ｖｏｌ．２９３，ｎｏ．４，ｐｐ．１１９７−１２０３；Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，ｖｏｌ．２９３，ｎｏ．４，ｐｐ．１２０４−１２０８；Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．３８，ｎｏ．８，ｐｐ．１２４３−１２５２；Ｏｋａ，Ａ．＆ Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｓ．（１９９９）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ．），ｖｏｌ．９７，ｎｏ．３，ｐｐ．２７５−２７８；Ｃｏｐａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．４７，ｎｏ．５，ｐｐ．８９０−８９７；Ｌｏｕｚａｄａ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．３０１，ｐｐ．５９−６３；Ｌａｖｒｅｙｓｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．６３，ｎｏ．５，ｐｐ．１０８２−１０９３；Ｃｏｎｑｕｅｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３７２，ｐｐ．２３７−２４３；Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．１０７１−１０８３；Ｂｒｕｎｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００１）ｖｏｌ．２１，ｐｐ．１０１３−１０３３；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【実施例９】
【０１１９】
ｓｙｎＧＡＰ、ｓｈａｎｋ３、およびグルタミン酸受容体
初期アルツハイマー病におけるシナプス
歯状回中のシナプス前部位から放出され、細胞外斑中に沈着するアミロイドβ［ベータ］（Ａベータ）ペプチドは、シナプス機能に影響を与え得る（例えば、Ｌａｚａｒｏｖ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．９７８５−９７９３；およびその参考文献を参照のこと）。アルツハイマー病（ＡＤ）を罹患していると同定された脳内の新皮質および海馬の多くの領域でシナプス結合性およびシナプス小胞が有意に喪失し、シナプス数およびシナプス機能が変化する（例えば、Ｓｃｈｅｆｆ，Ｓ．Ｗ．＆ Ｐｒｉｃｅ，Ｄ．Ａ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０２９−１０４６；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｐ．Ｄ．＆ Ｙａｏ，Ｐ．Ｊ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０２３−１０２７；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。シナプス後膜肥厚は、ＡＤ脳で約５０％減少する（例えば、Ｂｒｕｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．１７１−１７７；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２０】
可溶性アミロイドおよびアルツハイマー病
Ａβ（Ａベータ）は、プラークの不在下でシナプス毒性である（例えば、Ｍｕｃｋｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４０５０−４０５８；およびその参考文献を参照のこと）。ニューロン生成前の海馬シナプス有効性の変化およびシナプス機能障害は、アミロイドβタンパク質の拡散性のオリゴマーアセンブリに起因する（例えば、Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．７８９−７９１；およびその参考文献を参照のこと）。β［ベータ］アミロイドペプチド１〜４０および１〜４２の水溶性オリゴマーは、正常およびアルツハイマー病の脳の大脳皮質中に存在する。ＡＤ脳は、コントロール脳より水溶性の高いＡβ（Ａベータ）を含む（例えば、Ｋｕｏ，Ｙ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．４０７７−４０８１；およびその参考文献を参照のこと）。ＡＤ患者由来の可溶性Ａベータの濃度は、シナプス喪失と強く相関する（例えば、Ｌｕｅ，Ｌ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１５５，ｐｐ．８５３−８６２；およびその参考文献を参照のこと）。ＬＲＰは、Ａベータの小さな可溶性形態のプールの調整によってアルツハイマー病に典型的な記憶障害に寄与し得る（例えば、Ｚｅｒｂｉｎａｔｔｉ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．１０７５−１０８０；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２１】
アルツハイマー病におけるＡＤＤＬ
Ａベータ（１〜４２）の自己アセンブリによって、球状の神経毒性ＡＤＤＬが形成される（例えば、Ｃｈｒｏｍｙ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４２，ｐｐ．１２７４９−１２７６０；およびその参考文献を参照のこと）。ＡＤＤＬは初期段階のアルツハイマー病のシナプス可塑性を低下させて記憶機能障害と結び付け、それにより、末期に細胞を変性させて認知症を発症する（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；およびその参考文献を参照のこと）。オリゴマーＡベータリガンド（ＡＤＤＬ、アミロイドβ由来の拡散性リガンド）は、ＡＤ前頭葉皮質で７０倍に増加した（例えば、Ｇｏｎｇ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐｐ．１０４１７−１０４２２；およびその参考文献を参照のこと）。小Ａベータオリゴマーのターゲティングは、アルツハイマー病という難題の解決法であり得る（例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１９−２２４；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２２】
アルツハイマー病におけるグルタミン酸受容体
複数の神経受容体の変化が、アルツハイマー病で存在する。興味深いことに、アルツハイマー病の脳皮質組織中でカイナイト受容体数が増加する一方で、ＮＭＤＡ受容体が減少する。ムスカリン性受容体（Ｍ１）、カイナイト受容体、およびＣＲＦ受容体は、おそらくアルツハイマー病における変性反応に起因する受容体代償反応を示す（例えば、Ｇｕａｎ，Ｚ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７１，ｎｏ．３，ｐｐ．３９７−４０６；Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３１，ｎｏ．１，ｐｐ．１０３−１１１；Ｎｏｒｄｂｅｒｇ，Ａ．（１９９２）Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ．Ｂｒａｉｎ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．４，ｎｏ．４，ｐｐ．３０３−３２８；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【０１２３】
グルタミン酸受容体
グルタミン酸受容体は、７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役受容体（代謝調節型）およびリガンド依存性イオンチャネル（向イオン性）の両方である。向イオン性受容体は、以下の３つの定義可能なファミリーにクラスター形成する。ＮＭＤＡ型、ＡＭＰＡ型（例えば、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、およびＧｌｕＲ４）、ならびにカイニン酸型（例えば、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、およびＧｌｕＲ７）。これらの受容体は、特定のサブユニットの多量体会合物（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ）であり、最終受容体複合体上に特異的結合ドメインを有する（例えば、Ｍｅａｄｏｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１００３，ｐｐ．７５−９３；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２４】
カイニン酸受容体サブユニットの相同性
ＧｌｕＲ５は、ＡＭＰＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ１−ＧｌｕＲ４と約４０％の配列相同性を示すクローン化すべき第１のカイニン酸受容体サブユニットであった。別の４つのカイニン酸受容体サブユニット（ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１、およびＫＡ２）を、その構造相同性および［³Ｈ］カイニン酸塩に対する親和性に基づいて、２つの群に分類することができる。カイニン酸受容体複合体は、５つの異なるタンパク質サブユニット（ＫＡ１およびＫＡ２（高親和性カイニン酸を好む）およびＧｌｕＲ５−ＧｌｕＲ７（低親和性カイニン酸を好む）が含まれる）から形成される。低親和性サブユニット（ＧｌｕＲ５−ＧｌｕＲ７）は約７５％相同である一方で、高親和性サブユニット（ＫＡ１およびＫＡ２）は約６８％相同である。ＧｌｕＲ５−ＧｌｕＲ７とＫＡｌ／ＫＡ２との間の相同性は、約４５％と遥かに低い。ＡＭＰＡ受容体サブユニットと同様に、各カイニン酸受容体サブユニットは、相対分子量（Ｍｒ）が約１００ｋＤａの約９００個のアミノ酸を含む（例えば、Ｃｈｉｔｔａｊａｌｌｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．ｌ，ｐｐ．２６−３５；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２５】
カイニン酸受容体および長期増強（ＬＴＰ）
カイニン酸受容体は、海馬中の苔状線維シナプスでの長期増強（ＬＴＰ）の誘導で役割を果たす。カイニン酸受容体ノックアウトマウスでは、ＧｌｕＲ６を欠くマウスでＬＴＰが減少するが、ＧｌｕＲ５（カイニン酸受容体サブユニット）では減少しない。これらの事実は、ＧｌｕＲ６サブユニットを含むカイニン酸受容体が苔状線維シナプス強度の調整因子であることを証明している（例えば、Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２０９−２１６；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１２６】
グルタミン酸受容体、ｓｙｎＧＡＰ、およびシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）
向イオン性受容体および代謝調節型受容体の両方の場合、両受容体型と特異的に会合するシナプス後膜肥厚に会合する細胞内タンパク質が同定された。ＰＳＤ９５は、ＮＭＤＡ（ＮＲ２）およびＧｌｕＲ５，６／ＫＡ２と特異的に会合する（例えば、Ｍｅａｄｏｒ−Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１００３，ｐｐ．７５−９３；Ｈｉｒｂｅｃ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．６２５−６３８；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【０１２７】
ＰＳＤ９５およびＮＭＤＡ受容体との巨大な高分子複合体中に存在する場合、ＳｙｎＧＡＰは脳内で選択的に発現し、興奮性シナプスで高度に富化される。ｓｙｎＧＡＰは、ＲａｓのＧＴＰアーゼ活性を刺激するので、興奮性シナプスでのＲａｓ活性を負に調節することが示唆される。シナプス後膜でのＲａｓシグナル伝達は、ＮＭＤＡ受容体およびニューロトロフィンによる興奮性シナプス伝達の調整に関与し得る。（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．６８３−６９１；およびその参考文献を参照のこと）。興奮性シナプスのシナプス後膜で、神経伝達物質受容体は巨大タンパク質の「シグナル伝達機構」（情報処理および記憶の形成に寄与するシナプス後膜肥厚）に付着する（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．Ｂ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２９０，ｐｐ．７５０−７５４；Ｗａｌｉｋｏｎｉｓ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．１１，ｐｐ．４０６９−４０８０；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【０１２８】
興奮性シナプスでは、シナプス後足場タンパク質であるシナプス後膜肥厚９５（ＰＳＤ９５）により、ＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）をＲａｓ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ｓｙｎＧＡＰと共役させる（例えば、Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．９７２１０９７３２；およびその参考文献を参照のこと）。ｓｙｎＧＡＰによるシナプスＲａｓシグナル伝達の調節は適切なニューロン発達およびグルタミン酸受容体輸送に重要であり、ＬＴＰの誘導に重要である。変異マウスでは、ｓｙｎＧＡＰによってＲａｓを適切に調節することなく、シナプスでのＲａｓの活性化により、Ｒａｓシグナル伝達を増加させることができる（ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化が含まれる）（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１１１９−１１２４；およびその参考文献を参照のこと）。ｓｙｎＧＡＰはまた、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達を調節する（例えば、Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．９７２１０９７３２；およびその参考文献を参照のこと）。ＣａＭＫＩＩによるｓｙｎＧＡＰの阻害により、ＧＴＰ結合Ｒａｓの不活化が停止され、ＮＭＤＡ受容体の活性化の際に海馬ニューロン中で分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路を活性することができる（例えば、Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．２０，ｐｐ．８９５−９０４；Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．９７２１０９７３２；および上記のいずれかにおける参考文献などを参照のこと）。
【０１２９】
ＡＤＤＬ、ｓｈａｎｋ３、およびグルタミン酸受容体
ニューロン細胞では、Ｓｈａｎｋタンパク質はシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に局在し、シナプス後シグナル伝達機能を皮質細胞骨格に関連させることによって樹状突起棘の形態を調節することが示されている（Ｎａｉｓｂｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｈｅｎｇ ａｎｄ Ｋｉｍ，２０００；Ｓａｌａ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｏｅｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。グルタミン酸受容体は、シナプス後シグナル伝達機構の鍵となる要素であり、ｓｈａｎｋタンパク質は、ＰＳＤ−９５、ＧＫＡＰ、およびタンパク質のホーマーファミリーなどの他のＰＳＤ足場タンパク質を介してｍＧｌｕＲとＧｌｕＲとの間の結合を確立する。ＡＤＤＬは、ＰｒｏＳＡＰ２／ｓｈａｎｋ３（海馬シナプトソームから単離され、質量分析によって同定されたｐ２６０タンパク質バンド）に結合することができる。ｓｈａｎｋ３と群ＩｍＧｌｕ受容体（ｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５）との複合体へのＡＤＤＬ結合により、ｍＧｌｕシグナル伝達を誘発し、それにより、ＬＴＰを妨害することができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【０１３０】
ＡＤＤＬおよびＬＴＰ
ＡＤＤＬは、初期アルツハイマー病においてシナプス可塑性を低下させてＬＴＰを阻害し、末期に細胞を変性させて認知症を発症させることができる（例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６４４８−６４５３；およびその参考文献を参照のこと）。アミロイドβタンパク質のオリゴマーは、潜在的にインビボで海馬の長期増強を阻害する（例えば、Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４１６，ｐｐ．５３５−５３９；およびその参考文献を参照のこと）。Ａベータの可溶性オリゴマー（１〜４２）は、ラット歯状回における長期増強を阻害するが、長期低下を阻害しなかった（例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．９２４，ｐｐ．１３３−１４０；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１３１】
他の基礎的情報には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第６，８１１，９９２号；米国特許第６，７２３，８３８号；米国特許第６，６５３，１０２号；米国特許第６，５１５，１０７号；米国特許第６，５００，６２４号；米国特許第６，２２８，６１０号；米国特許第６，２２１，６０９号；米国特許第６，０５１，６８８号；米国特許第６，０４０，１７５号；米国特許第６，０３３，８６５号；米国特許第５，９１２，１２２号；米国特許第５，８８８，９９６号；米国特許第５，７８３，５７５号；米国公開特許番号第２００３／０１７６６５１号；Ｆｌｅｃｋ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２３，ｎｏ．４，ｐｐ．１２１９−１２２７；Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｂ．Ｓ．（２０００）Ｊ．Ｎｕｔｒ．，ｖｏｌ．１３０，ｐｐ．１００７Ｓ−１０１５Ｓ；Ｓｅｎｋｏｗｓｋａ，Ａ．＆ Ｏｓｓｏｗｓｋａ，Ｋ．（２００３）Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．５５，ｎｏ．９３５−９５０；Ｒｏｎｎｂａｃｋ，Ｌ．＆ Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｅ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，ｎｏ．１，ｐｐ．２２−３０；Ｌｅｅ，Ｊ．−Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．６，ｐｐ．７２３−７３１；ａｎｄ Ｔａｏ，Ｈ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９８，ｎｏ．２０，ｐｐ．１１００９−１１０１５；および上記の全てにおける参考文献などを参照のこと。
【０１３２】
２つのタンパク質（ｐ１４０およびｐ２６０）は、高親和性でＡＤＤＬに結合することができ、これらは共に皮質および海馬のみで見出される。質量分析（ＭＳ）データから、ｐ１４０由来の５５個のペプチドがＰＳＤ中でｓｙｎＧＡＰと適合する。ｐ１４０の分子サイズは、ｓｙｎＧＡＰの分子サイズと近似する。免疫細胞化学実験では、ＡＤＤＬ「ホットスポット」は、ｓｙｎＧＡＰと同時局在化する。ＡＤＤＬを最初にニトロセルロース上でｐ１４０とインキュベートする場合、ＡＤＤＬは、ｓｙｎＧＡＰへのＮ末端特異的抗体の結合を遮断することができる。しかし、類似の条件下で、ＡＤＤＬは、ｓｙｎＧＡＰへのＣ末端特異的抗体の結合を遮断することができない。これにより、ＡＤＤＬはｓｙｎＧＡＰのＮ末端またはＮ末端付近でｓｙｎＧＡＰに結合することができる可能性が高く、Ｎ末端抗体の１又は複数のエピトープを遮断または被覆することができることが証明される。（例えば、Ｌａｃｏｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１０１９１−１０２００；およびその参考文献を参照のこと）。
【０１３３】
ｓｙｎＧＡＰおよびグルタミン酸受容体の相同配列
ｓｙｎＧＡＰ（配列番号＿）およびグルタミン酸受容体（配列番号＿）との間の以前に認識されていない配列相同性を本明細書中に開示する。
【化１０】

（「｜」は、２配列間の同一アミノ酸を示し、「＾」は、グルタミン酸受容体中の特異的リガンド結合アミノ酸を示す。）
【０１３４】
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して同一領域をアラインメントする場合、アラインメントは以下である。
【化１１】

（コンセンサス中の「＊」は同一アミノ酸を示し、「：」は非常に類似したアミノ酸を示し、「．」は類似性の低いアミノ酸を示す）
【０１３５】
同一のＧｌｕＲ５前駆体タンパク質領域の配列（Ｎ．Ｃ．Ｂ．Ｉ Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎでのアクセッション番号Ｐ３９０８６）をアラインメントに加える場合、類似の相同性が存在する。
【化１２】

（同様に、コンセンサス中の「＊」は同一アミノ酸を示し、「：」は非常に類似したアミノ酸を示し、「．」は類似性の低いアミノ酸を示す。）
【０１３６】
この相同性は、グルタミン酸受容体のリガンド結合領域に局在し、ＡＤＤＬがグルタミン酸受容体中の相同配列に結合し、それにより、ＬＴＰを阻害することを示し得る。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９５，ｐｐ．９１３−９１７）に示すようにキナーゼに結合したグルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ２ Ｓ１Ｓ２）の結晶構造の表示を考慮すると、グルタミン酸受容体とｓｙｎＧＡＰとの間の相同領域は、ＧｌｕＲ２ Ｓ１Ｓ２結晶構造のＪヘリックス付近に存在するであろう。
【０１３７】
図２１（パネルＡ〜Ｃ）は、ヒトｓｙｎＧＡＰ（Ｎ．Ｃ．Ｂ．Ｉ．Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎでのアクセッション番号ＮＰ ００６７６３およびＱ９６ＰＶＯ）、ヒトグルタミン酸受容体２前駆体（Ｎ．Ｃ．Ｂ．Ｉ．Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎでのアクセッション番号Ｐ４２２６２）、およびヒトグルタミン酸受容体６イソ型１前駆体（Ｎ．Ｃ．Ｂ．Ｉ．Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎでのアクセッション番号ＮＰ ０６８７７５）の配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの結果を示す。ＮＰＳ＠：Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｏｍｂｅｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０００）ＴＩＢＳ，ｖｏｌ．２５，ｎｏ．３，ｐｐ．１４７−１５０によって配列アラインメントを行った（＜ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｅｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｈｔｍｌ＞；最終閲覧日２００４年１２月１５日）。
【０１３８】
グルタミン酸およびグルタミン酸受容体リガンド（ＣＮＱＸおよびＮＳ−１０２）は、樹状受容体へのＡＤＤＬ結合を遮断する。
【０１３９】
図２２のパネルＡおよびＢに示すように、グルタミン酸およびグルタミン酸受容体リガンド（ＣＮＱＸおよびＮＳ−１０２）の添加によってシナプス後局在受容体または受容体の複合体へのＡＤＤＬ結合を遮断することができる。結果としてＡＤＤＬ結合が減少するのは、ＡＤＤＬが１又は複数のグルタミン酸受容体に直接結合するか、グルタミン酸受容体リガンドがグルタミン酸受容体を介した変化を誘導し、それにより、ＡＤＤＬに対するＡＤＤＬ受容体の結合親和性が減少するからである。
【０１４０】
グルタミン酸受容体は、２つのクラス（代謝調節型および向イオン性）に分類される。シナプス後部位に局在する群ＩｍＧｌｕ受容体はｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５であり、ＡＤＤＬがこれらの受容体またはこれらの受容体および他のシナプス後膜肥厚固定タンパク質を含む複合体に直接結合する可能性が高い。
【０１４１】
向イオン性グルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ）は、イオンチャネルにゲーティングし、ＡＭＰＡおよびカイナイト受容体が含まれる。これらは、ＧｌｕＲ１−４サブユニットおよびＧｌｕＲ５−７サブユニットをそれぞれ含む四量体アセンブリである。機能的四量体チャネル内の異なるサブユニットの正確な組み合わせにより、特定の結合特性およびイオン輸送特性が決定される。ＡＤＤＬは、グルタミン酸リガンドによるシナプス結合の遮断を考慮してＡＭＰＡ受容体に結合する可能性が最も高いが、ＧｌｕＲとのリガンド結合によって誘発されるＡＤＤＬ受容体の高次構造の変化およびその後のＡＤＤＬ受容体に及ぼす間接的影響によってＡＤＤＬ受容体へのＡＤＤＬの結合を間接的に遮断することもできる。
【０１４２】
ＡＤＤＬは、シナプス後膜肥厚固定タンパク質ＳＨＡＮＫ３（ｍＧｌｕＲ５受容体と直接相互作用することが公知のタンパク質）に結合することが公知である。
【０１４３】
海馬細胞へのＡＤＤＬ結合に及ぼすＧｌｕＲ遮断剤の影響についての免疫蛍光試験。
以前の実験は、一部がＡＤＤＬと同時局在化したＧｌｕＲ６およびシナプトソームへのＡＤＤＬ結合を少なくとも一部遮断するグルタミンを示した。したがって、ＧｌｕＲ遮断剤がニューロン細胞へのＡＤＤＬ結合を遮断する能力を評価した。
【０１４４】
海馬細胞を、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたスライドガラス上にプレートし、Ｓａｒａによって２５日間成長させた。Ｄａｌｉｙａによって９／２１／０４に濃度５４．２μＭのＡＤＤＬを作製した。培養皿にＬ−グルタミン酸（５ｍＭ）、ＮＳ−１０２（５０μＭ）、ＣＮＱＸ（１００μＭ）を添加するか何も添加せず、その直後にＡＤＤＬ（０．５μＭ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。コントロールとして１つの皿に媒体を添加した。培地への同体積の３．７％ホルムアルデヒドの添加によって細胞を５分間固定し、その後、全ての固定培地溶液を除去し、１０分間のみ３．７％ホルムアルデヒドと置換した。細胞を、ＰＢＳで４回リンスし、次いで、ＰＢＳ：１０％ＮＧＳと８℃で一晩インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ：ＮＧＳで希釈した２０Ｃ２（１：１０００）にて室温で３時間免疫標識した。細胞を、ＰＢＳで４回リンスし、次いで、ＰＢＳ：ＮＧＳで希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウス（１：５００）と室温で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで５回リンスし、ＰｒｏＬｏｎｇ ａｎｔｉ−ｆａｄｅマウンティング培地を使用してマウントした。細胞を、ＭｅｔａＭｏｒｐｈを備えたＮｉｋｏｎで視覚化した。結果：ＣＮＱＸおよびグルタミン酸は、海馬細胞へのＡＤＤＬ結合を選択的に減少させる。ＮＳ−１０２は、ＡＤＤＬ結合をいくらか減少させる。
【０１４５】
グルタミン酸は、興奮性神経伝達で重要な役割を果たし、且つＬＴＰ生成および正常な脳機能に必要な３つの主な向イオン性受容体クラスおよび３つの主な代謝調節型受容体クラスのリガンドである（Ｍｅｌｄｒｕｍ ２０００）。グルタミン酸はまた、神経変性からの防御で主な役割を果たす２つのグリア型輸送体（ＧＬＡＳＴおよびＧＬＴ）および３つの神経輸送体（ＥＡＡＣ１、ＥＡＡＴ４および５）に結合する（Ｋａｎａｉ ａｎｄ Ｈｅｄｉｇｅｒ ２００３）。
【０１４６】
グルタミン酸は、高親和性（例えば、高親和性Ｎａ＋依存性グルタミン酸輸送体（Ｋｍ＝５〜２０μＭ））から低親和性（低親和性グルタミン酸輸送体（１〜２ｍＭ））までの範囲の種々の親和性でその基質と結合する（表１を参照のこと）。
【０１４７】
５ｍＭグルタミン酸は、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を阻害することができる。高濃度は、ＡＤＤＬが、グルタミン酸が同一部位に結合する親和性よりもはるかに高い親和性を有することを意味する。
【０１４８】
【表１】

【０１４９】
海馬細胞へのＡＤＤＬ結合に及ぼすグルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ）遮断剤の影響についての免疫蛍光試験
前文で開示したように、図２３が海馬培養物中のニューロンへの点状ＡＤＤＬ結合（前にシナプス結合であると示されている）は、グルタミン酸およびＣＮＱＸ（ＡＭＰＡおよびキナーゼ型グルタミン酸受容体の公知のアンタゴニスト）によって遮断されることを示す。前の実験により、ＧｌｕＲ６がＡＤＤＬと一部同時局在化し、グルタミンがシナプトソームへのＡＤＤＬ結合を少なくとも一部遮断することが示されている。したがって、ＧｌｕＲ遮断剤が細胞へのＡＤＤＬ結合を遮断することができるかどうかを決定するための試験に取り掛かった。海馬細胞を、標準的な条件下で２５日間成長させた。培養培地を含む個別の皿にＬ−グルタミン酸（５ｍＭ）、ＣＮＱＸ（１００μＭ）、ＮＳ−１０２（５０μＭ）、メマンチン（５０μＭ）を添加するか何も添加せず、その直後にＡＤＤＬ（０．１μＭ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。コントロールとして１つの皿に媒体を添加した。細胞を固定し、ＡＤＤＬ（２０Ｃ２）に特異的なモノクローナル抗体およびその後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウス抗体で免疫標識した。細胞を、落射蛍光アタッチメントおよびＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像化ソフトウェアを備えたＮｉｋｏｎ Ｏｐｔｉｐｈｏｔを使用して視覚化した。データは、グルタミン酸およびＣＮＱＸがＡＤＤＬ結合の遮断で有効であり、ＮＳ−１０２は部分的遮断を示し、メマンチンはＡＤＤＬ結合に及ぼす影響はごく小さいことを示す。
【０１５０】
パニングアッセイにおいて、５ｍＭグルタミン酸は、１００ｎＭ ＡＤＤＬの約７５％のシナプトソームへの結合を遮断／防止する
パラメーター：シナプトソームを、グルタミン酸、ＡＤＤＬ、および２０Ｃ２モノクローナル抗体に連続的に結合させ、抗マウスＩｇＧでコーティングしたアッセイプレートウェル中でインキュベートし、２０Ｃ２抗体について探索した。
【０１５１】
原理：本明細書中に開示されるように、ＧｌｕＲ６とＳｙｎＧＡＰとの間には配列相同性が存在する。ＡＤＤＬがグルタミン酸受容体に結合することが可能である。したがって、グルタミン酸を使用してＡＤＤＬ結合を遮断することができるかどうかを決定した。
【０１５２】
処置：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ））を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ９．５）で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００ｍｌ／ウェル（１ｍｇ）をＩｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）に室温で７時間結合させた。非結合部位を、２００ｍｌ ２％ＢＳＡを含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ７．５）、０．８％ＮａＣｌ）にて室温で１０分間の遮断を３回行った。シナプトソームを、１ｍｌ／チューブの１％ＢＳＡを含むＦ１２と混合し、４℃にて５，０００ｇで５分間遠心分離し、各ペレットを１ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２で洗浄し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁した。シナプトソームを分割し、１つのチューブに５ｍＭグルタミン酸を含む１ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２を添加し、室温で２時間インキュベートした。非結合グルタミン酸を、１ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄した。シナプトソームを再度分割し、１００ｎＭ ＡＤＤＬを含むＢＳＡ／Ｆ１２をグルタミン酸に結合しているシナプトソームおよび結合していないシナプトソームに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。上記のようにサンプルをペレット化し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄した。各ペレットを、１．５２ｍｇモノクローナル２０Ｃ２ ＩｇＧを含む１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁した。サンプルを、回転震盪器にいれ、４℃で２時間インキュベートした。上記のようにサンプルをペレット化し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄した。各ペレットを、２２０ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁し、１００ｍｌ／ウェルを準備したアッセイプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを２００ｍｌのＢＳＡ／ＴＢＳで１０分間の洗浄を３回行った。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＢＳＡ／ＴＢＳで２０００倍に希釈し、１００ｍｌ／ウェルを室温で１時間インキュベートした。上記のＢＳＡ／ＴＢＳでの洗浄および流れているｄＨ２Ｏでの３回のリンス後、１００ ｍｌ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄペルオキシダーゼ基質を使用して結合を視覚化した。室温で発色させ、Ｄｙｎｅｘ ＭＲＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒにて４０５ｎｍを読み取った。統計：データは、２つの値の平均として示し、エラーバーはＳＥＭを示す。
【０１５３】
結果：図２４に示すように、ＡＤＤＬで標識していないシナプトソームは、低バックグラウンド結合を示した。反復洗浄および遠心分離に起因するシナプトソームのいくつかの劣化にもかかわらず、ＡＤＤＬに結合したシナプトソームは、１５分および３０分で良好なシグナルを示した（３０分のデータを示す）。グルタミン酸が存在する場合、ＡＤＤＬシグナルがかなり減少する（約７５％）。
【０１５４】
確証：パニングアッセイにおいて、グルタミン酸の存在は、シナプトソームへのＡＤＤＬ結合に影響を及ぼす。いかなる１つの可能な機構にも拘束されないが、１又は複数のグルタミン酸受容体へのＡＤＤＬ結合を直接遮断することができるか、グルタミン酸はＡＤＤＬ受容体に影響を与え、そして／または修飾することができる。本明細書全体に開示のように、これらの結果は、グルタミン酸とＡＤＤＬ結合が関連することを示す。
【０１５５】
アルツハイマー病を治療するためのｓｙｎＧＡＰ／グルタミン酸受容体の配列相同性
本明細書中に開示のｓｙｎＧＡＰとグルタミン酸受容体との間の相同配列を使用して、ＡＤＤＬの神経毒性の遮断によってアルツハイマー病を治療することができる。本明細書中に開示の相同配列を含むペプチドおよびタンパク質フラグメントなどを使用して、ニューロンへのＡＤＤＬの結合を遮断し、それにより、アルツハイマー病を防止または治療することができる。
【０１５６】
抗ＡＤＤＬ治療薬の標的は、グルタミン酸受容体（カイニン酸、ＡＭＰＡ、およびＮＭＤＡサブタイプが含まれる）を含み得る。ＧｌｕＲ６サブタイプ（いわゆるカイニン酸受容体）は、ｓｙｎＧＡＰとの配列相同性を有する受容体サブタイプを例示する。他の配列相同性もＡＭＰＡ受容体（例えば、ＧｌｕＲ２）およびＮＭＤＡ受容体内に存在する。
【実施例１０】
【０１５７】
ＡＤＤＬ−シナプトソーム結合
シナプトソームパニングは、ＡＤＤＬ結合がシナプトソーム濃度に依存することを示す
パラメーター：シナプトソームを、ＡＤＤＬおよびモノクローナル２０Ｃ２抗体で連続的に標識し（例えば、２００４年１０月２５日出願の米国特許第６０／６２１，７７６号を参照のこと）、抗マウスＩｇＧでコーティングしたアッセイプレートウェル中でインキュベートし、２０Ｃ２抗体について探索した。
【０１５８】
原理：前のシナプトソームパニングの結果は、ＡＤＤＬで標識したシナプトソームを抗体コーティングウェル中で補足することができることを示した。時折、バックグラウンド蛍光シグナルが存在したが、おそらくプレートの選択に起因する（すなわち、ＥＬＩＳＡプレートではない）。
【０１５９】
処置：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ））を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ９．５）で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００ｍｌ／ウェル（１ｍｇ）をＩｍｍｕｌｏｎ ３ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）に室温で７時間結合させた。非結合部位を、２００ｍｌ ２％ＢＳＡを含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ７．５）、０．８％ＮａＣｌ）にて室温で１０分間の遮断を３回行った。シナプトソームを、１ｍｌ／チューブの１％ＢＳＡを含むＦ１２と混合し、４℃にて５，０００ｇで５分間遠心分離し、各ペレットを１ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２で洗浄し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁した。チューブにＡＤＤＬ（５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭ）を添加し、シナプトソームを３７℃で１時間インキュベートした。上記のようにサンプルをペレット化し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄した。各ペレットを、４２０ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁し、２００ｍｌアリコートを１．５２ｍｇモノクローナル２０Ｃ２ ＩｇＧを含む８００ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２と混合した。サンプルを、回転震盪器にいれ、４℃で２時間インキュベートした。上記のようにサンプルをペレット化し、１ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄した。各ペレットを、２２０ｍｌ ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁し、１００ｍｌ／ウェルを準備したアッセイプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＢＳＡ／Ｆ１２で希釈したモノクローナル２０Ｃ２（１．５〜１５ｎｇ／１００ｍｌ）も準備したウェル中でインキュベートした。ウェルを２００ｍｌのＢＳＡ／ＴＢＳで１０分間の洗浄を３回行った。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＢＳＡ／ＴＢＳで２０００倍に希釈し、１００ｍｌ／ウェルを室温で１時間インキュベートした。上記のＢＳＡ／ＴＢＳでの洗浄および流れているｄＨ２Ｏでの３回のリンス後、１００ ｍｌ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄペルオキシダーゼ基質を使用して結合を視覚化した。室温で発色させ、Ｄｙｎｅｘ ＭＲＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒにて４０５ｎｍを読み取った。
【０１６０】
結果：図２５に示すように、ＡＤＤＬおよび２０Ｃ２で標識したシナプトソームは、抗マウスＩｇＧコーティングアッセイプレートに結合するようであった。シナプトソームコントロールはいかなるシグナルも示さなかった。２０Ｃ２は、抗マウスＩｇＧコーティングアッセイプレートへの良好な線形結合を示した。８０ｍｇ／ウェルで予想されるような飽和は認められなかった。統計：データは、２つの値の平均として示し、エラーバーはＳＥＭを示す。
【０１６１】
確証：これらの結果は、本明細書中に開示の他の情報をさらに支持する。
【実施例１１】
【０１６２】
ＡＤＤＬ−シナプトソーム結合
シナプトソームを固定するためのコレラ毒素サブユニットＢの使用は、ＡＤＤＬおよびシナプトソーム濃縮依存性結合を示す
パラメーター：アッセイプレートウェルを、コレラ毒素サブユニットＢでコーティングした。シナプトソームが結合され、ＡＤＤＬおよび２０Ｃ２抗体を使用して視覚化した。
【０１６３】
原理：以前の手順は、シナプトソームの有意なプロセシングを含み、シナプトソームを喪失させ、且つ時間がかかる。ＣＴ−Ｂが脂質ラフトに結合するので、これは、アッセイウェルにシナプトソームを固定するための代替法であり得る。
【０１６４】
処置：コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴ−Ｂ，Ｓｉｇｍａ）を、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ７．５）、０．８％ＮａＣｌ）で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、１００ｍｌ／ウェル（１ｍｇ）をＩｍｍｕｌｏｎ ４ Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）に冷所で一晩結合させた。非結合部位を、２００ｍｌ ２％ＢＳＡを含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ ７．５）、０．８％ＮａＣｌ）にて室温で１０分間の遮断を３回行った。シナプトソームを、４℃にて５，０００ｇで５分間遠心分離し、１ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２で２回洗浄し、ＢＳＡ／Ｆ１２に再懸濁した。シナプトソームを適切な体積に希釈し、０、１０、２０、４０、および８０ｍｇ／ウェルをウェルに添加し、シナプトソームを４℃で１時間結合させた。シナプトソームを、２００ｍｌのＢＳＡ／Ｆ１２で３回洗浄する。ＡＤＤＬを希釈し（１０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００μｎＭ）、ウェルに添加し、３７℃で１時間結合させた。上記のように、サンプルをＢＳＡ／Ｆ１２で洗浄した。モノクローナル２０Ｃ２ＩｇＧ（１．５２ｍｇ／ｍｌ）をＢＳＡ／Ｆ１２で１０００倍希釈し、１００ｍｌ／ウェルを準備したアッセイプレートに添加した。プレートを４℃で２時間インキュベートした。サンプルを、上記のようにＢＳＡ／Ｆ１２で洗浄した。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をＢＳＡ／ＦＴＢＳで２０００倍に希釈し、１００ｍｌ／ウェルを室温で１時間インキュベートした。上記のＢＳＡ／ＴＢＳでの洗浄および流れているｄＨ２Ｏでの３回のリンス後、１００ ｍｌ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄペルオキシダーゼ基質を使用して結合を視覚化した。室温で発色させ、Ｄｙｎｅｘ ＭＲＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒにて４０５ｎｍを読み取った。統計：データは、２つの値の平均として示し、エラーバーはＳＥＭを示す。
【０１６５】
結果：図２６に示すように、吸光度は、ＡＤＤＬ濃度およびシナプトソーム濃度に依存する。２連のウェルは、１つのデータポイント以外は、良好な再生性を示した。
【０１６６】
確証：ＣＴ−Ｂを使用して、シナプトソームを固定することができる。
【実施例１２】
【０１６７】
ＡＤＤＬ−シナプトソーム免疫沈降
抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体（２０Ｃ２）でコーティングした磁性ビーズを使用したＡＤＤＬ処置シナプトソームの免疫沈降
シナプトソームを、ＡＤＤＬまたは媒体を含むＦ１２／ＦＢＳ（Ｆ１２培地、５％ＦＢＳ）とインキュベートした。処置したシナプトソームを、抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体（Ｄｙｎａ−２０Ｃ２）を含むＦ１２／ＦＢＳでコーティングした磁性ビーズを使用して免疫沈降を行った。標準的なウェスタンブロットで抗ＰＳＤ９５抗体を使用して、異なる画分中のシナプスマーカーの存在を評価した。
【０１６８】
パラメーター：Ｄｙｎａ−２０Ｃ２を使用してＡＤＤＬ処置シナプトソームを免疫沈降する。
【０１６９】
根拠：ＡＤＤＬに特異的なＭ７１／２抗体を使用して得た以前の情報を、抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体（２０Ｃ２）を使用して確認した。さらに、２０Ｃ２は、生物活性を示す高分子量のＡＤＤＬを認識する。したがって、２０Ｃ２は、本明細書中に開示の他の情報を与えられたシナプトソームへのＡＤＤＬ結合を認識すると予想されるであろう。
【０１７０】
処置：シナプトソームとのＡＤＤＬのインキュベーション：標準的なプロトコールにしたがって、シナプトソームを調製した。７５μｇのシナプトソームを、３００ｎＭ ＡＤＤＬ（２．５μｌ ＡＤＤＬ １／１０／０５）または賦形剤を含む５００μｌ Ｆ１２／ＦＢＳ（Ｆ１２培地、５％ＦＢＳ）と回転しながら４℃で３時間インキュベートした。溶液中のＡＤＤＬを除去するために、サンプルを、５０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、１ｍｌ Ｆ１２／ＦＢＳで５分間の洗浄を３回行った。上清を４℃で保存した。Ｄｙｎａ−２０Ｃ２を使用した免疫沈降：製造者によって提供された手順にしたがって、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−５００ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒを、２０Ｃ２でコーティングした。処置したシナプトソームを、３００μｌのＦ１２／ＦＢＳに再懸濁した。０．２５０ｍｇのＤｙｎａ−Ｍ７１．２をＰＢＳ中で洗浄し、シナプトソームに添加し、これらを回転させながら４℃で一晩インキュベートした。磁石でビーズを取り出した。ビーズを、１ｍｌ Ｆ１２／ＦＢＳで１２分間の洗浄を９回および１ｍｌ Ｆ１２での１２分間の洗浄を２回行った。上清を、「非結合」および「洗浄」として保存した。ペレット（「結合」）を、５０μｌ ＳＬＢ中に溶解した。「非結合」、「Ｗ１」、および「Ｗ２」を、２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、そのペレットを、６０μｌ ＳＬＢに溶解させた。免疫ブロッティング：１５μｌの各サンプルを、４〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルにロードした。ゲルを、１８０Ｖで４５分間泳動し、１００Ｖ、４℃で１時間ニトロセルロース膜に移した。膜を、５％ミルクを含むＴＢＳ−Ｔにて室温で１時間ブロッキングし、ＰＳＤ９５抗体と室温で１時間インキュベートした。ＰＳＤ９５（ＡＢＲのＭＡ１−０４５）：１：４，０００マウス−ＨＲＰ：１：５０，０００。膜を、ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間の洗浄を３回行い、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰと室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間の洗浄を３回行った後、ゲルを高感度化学発光（ＥＣＬ）を使用して発色させた。
【０１７１】
結果：図２７に示すように、ＰＳＤ９５を、ＡＤＤＬ−シナプトソームの結合画分中で検出することができるが、媒体−シナプトソームでは検出できない。
【０１７２】
確証：ＡＤＤＬ−シナプトソームを、２０Ｃ２を使用して免疫沈降を行うことができる。
【実施例１３】
【０１７３】
皮質ＰＳＤへのＡＤＤＬ結合
パラメーター：単離皮質ＰＳＤおよび／またはＡＺへのＡＤＤＬの結合を評価する
【０１７４】
原理：ファーウェスタンブロットおよびＡｎｔ２．０４１の実験では、ＡＤＤＬは、ＰＳＤに結合するが、活性帯に結合しないようである。単離ＰＳＤまたはＡＺをＡＤＤＬとインキュベートし、ＹＭ−１００で濾過した。
【０１７５】
処置：シナプトソームの分画：皮質シナプトソームを、少し修正した標準的な手順にしたがって調製した（例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ，ｖｏｌ．３２，ｐｐ．６３−７７を参照のこと）。９００μｇシナプトソームを、５ｍｌの０．１ｍＭ ＣａＣｌ２で希釈し、浸透圧溶解を３０分間行った。混合物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６）および１％ＴＸ−１００（５ｍｌ溶液２×）に入れ、膜を氷中で３０分間可溶化した。不溶性物質（シナプス接合部）を、３０，０００ｇで４５分間の遠心分離によってペレット化した。シナプス接合部（ＳＪ）を、３．５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）および１％ ＴＸ１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に再懸濁した。４℃で一晩のインキュベーション後、サンプルを４０，０００ｇで４５分間遠心分離した（ＴＬＡ １３００ローターにて２５ｋｒｐｍ）。ペレットは、ＰＳＤを含んでいた。上清を、Ｏ．１ｍＭ ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６）、および１％ＴＸ−１００に対して透析し（３×１０時間）、上記のように４０，０００ｇで４５分間遠心分離した。このペレットは、活性帯（ＡＺ）を含んでいた。ＡＺおよびＰＳＤを、プロテアーゼインヒビターを含む３０μｌ ＴＢＳ中に再懸濁した。サンプルを短時間超音波処理し、ＢＳＡアッセイを使用してタンパク質濃度を得た。両サンプルについて３μｇ／μｌ。ＥＬＩＳＡ：少し修正した標準的プロトコルにしたがってＥＬＩＳＡを行った。０．２５、０、５、１、２．５、または５μｇのサンプルをコーティングしたウェルを、１００μｌ ＴＢＳ＋２％ＢＳＡ（ＴＢＳ／ＢＳＡ）中に４℃で一晩溶解した。プレートを、２００μｌ ＴＢＳ／ＢＳＡにて室温で２０分間のブロッキングを３回行った。１００ｎＭ ＡＤＤＬを、１００μｌ ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡを含む各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ−Ｔでの室温で１０分間の洗浄を３回行った。検出のために、１０００倍希釈したＭ７１／２ポリクローナル抗体（ＡＤＤＬ特異的）を含む１００μｌのＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡを使用した。室温で１時間インキュベートし、２００μｌ ＴＢＳ−Ｔにて室温で１０分間の洗浄を３回行った。２０００倍希釈のウサギ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、二次抗体として１００μｌ ＴＢＳ−Ｔ中で使用した。室温で１時間インキュベートし、２００μｌ ＴＢＳ−Ｔにて１０分間の洗浄を３回行った。１００μｌの新たに調製したＨＲＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄの「ペルオキシダーゼ基質キット」１７２−１０６４）を添加し、室温で４５分間発色させた。色を、４０５ｎｍで測定した。ネイティブウェスタンブロット（ＷＢ）：９μｇのＰＳＤまたは活性帯を、１５μｌネイティブサンプル緩衝液中に溶解し、Ｔｒｉｓ−グリシン ４〜２０％ゲルにロードした。β−メルカプトエタノール、サンプルのボイル、および泳動緩衝液中のＳＤＳを使用しなかった。ゲルを１００Ｖで泳動し、４℃、１２０Ｖで１．５時間ニトロセルロース膜に移した。移動後、膜を、５％ミルクを含むＴＢＳ−Ｔにて室温で１時間ブロッキングし、一次抗体（Ａｂ）と４℃で一晩インキュベートした。ＰＳＤ９５（ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ−のＭＡＩ−０４５）：１：４，０００、マウス−ＨＲＰ：１：５０，０００。Ｓｙｎｔａｘｉｎ（ＣＨＥＭＩＣＯＮのＭＡＢ３３６）：１：４，０００、マウス−ＨＲＰ：１：１０，０００。ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間の洗浄を３回行い、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰと室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ中で１０分間の洗浄を３回行った後、ゲルをＥＣＬで発色させた。
【０１７６】
結果：図２８のパネルＡおよびＢに示すように、ＡＤＤＬは、ＰＳＤのみに結合し、ＡＺに結合しない。活性帯およびＰＳＤは共に、本明細書中に記載の調製後（すなわち、超音波処理）に多タンパク質複合体として残存する。したがって、これらは、ネイティブゲル電気泳動のウェル中に残存し、ゲルマトリクスに侵入することができない。
【実施例１４】
【０１７７】
生化学的および細胞生物学的測定で使用するためのビオチン標識ＡＤＤＬの形成
図２９に示すように、ＡＤＤＬへのビオチンの組み込みにより、ＬＭＷおよびＨＭＷオリゴマーが産生される。ビオチン−Ａベータ（１〜４２）により、ストレプトアビジン結合試薬を使用してＡＤＤＬが直接検出される。
【０１７８】
図２９を参照すると、ビオチン−ＡＤＤＬ（すなわち、ｂ−ＡＤＤＬ、Ｂ−ＡＤＤＬ、および／またはＢＡＤＤＬ）は、三量体／四量体およびＨＭＷアセンブリにオリゴマー化する。１：４の比率でＡベータを使用した場合、ビオチン−Ａベータ（１〜４２）により、ＡＤＤＬアセンブリの正確なプロフィールが得られる（例えば、米国特許第６，２１８，５０６号などを参照のこと）。１×ＰＢＳ（ｗ／ｏ ＣａおよびＭｇ）中にて３７℃で１時間の１００μＭの総ペプチド（２０μＭビオチン化、８０μＭ未変性）のインキュベーションにより、時間０での新たなペプチド単量体希釈物と比較して、可溶性オリゴマーが有意に形成される。ＨＦＩＰ蒸発およびＤＭＳＯ再懸濁後にＦ−１２組織培養培地の代わりに希釈剤としてＰＢＳを使用した標準的なＡＤＤＬ調製法を使用して１ｍｌのサンプルを生成した。図中の実線の曲線は、２２０ｎｍでのペプチドおよびペプチドアセンブリの吸光度を示す。これらの曲線を、室温で１×ＰＢＳ（ｗ／ｏ ＣａおよびＭｇ）を含むＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ＨＲ １０／３０カラムに流速０．５ｍｌ／分で注入した３００μｌのサンプルの吸光度のモニタリングによって得た。Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェアを使用してＡＫＴＡ基本クロマトグラフィシステムを操作し、データを収集した。点線の曲線は、多角度レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）によって決定した分子量（ＭＷ）値を示す。Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＤＡＷＮ ＥＯＳ ＭＡＬＬＳ装置を、ＨＰＬＣカラムおよび吸収フローセルとオンラインで接続し、Ｏｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ装置を使用して、溶離種のタンパク質濃度を決定した。Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’のＡＳＴＲＡ Ｖソフトウェアを使用して、ＭＷプロフィールを記録し、フィッティングした。時間０における新たな単量体サンプルで認められるように、単量体に対応するＭＷが、約２０〜１９分で溶離された第２のピークで認められた。１時間のサンプルは、有意にオリゴマー化した。８ｍｌ〜１５ｍｌに有意に軌跡を描く第１のピークは、１００万ダルトンから１０万ダルトンまでの範囲の種を含む。むしろ単量体ペプチドを主に含む第２のピークは、三量体および四量体の範囲の種を含む。単量体ＭＷは約４８００Ｄａであり、１時間のサンプルは、１５０００〜２００００の範囲の低分子量（ＬＭＷ）オリゴマーを含み、これらの種の安定な形成を示す。
【０１７９】
ビオチン標識ＡＤＤＬと同様に、フルオレセイン標識ＡＤＤＬがアセンブリする（データ示さず）。
【実施例１５】
【０１８０】
ビオチンで標識されたＡＤＤＬの特徴づけ
パラメーター：ビオチンかおよび非標識Ａｂ１〜４２の混合物由来のＡＤＤＬを、ＳＥＣによって分画し、ネイティブおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロットによって分析し、ビオチン標識またはモノクローナル６Ｅ１０抗体および２０Ｃ２抗体を使用して探索した。
【０１８１】
原理：ビオチン化ＡＤＤＬは、抗体と無関係の別の研究用ツールを提供する。ビオチン標識がオリゴマーのアセンブリ、構造、または機能に影響を与えるかどうかを調査するためにビオチン化Ａｂ１〜４２を使用して産生されたＡＤＤＬを分析する必要がある。
【０１８２】
処置：２つのペプチドのＨＦＩＰ溶液の混合および一晩の風乾、その後のＳａｖａｎｔＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ乾燥機での乾燥によって、ビオチン化および非標識Ａｂ１〜４２の混合物（１：４．７ ｍｏｌ：ｍｏｌ）からＡＤＤＬを調製した。ＨＦＩＰフィルムを約５ｍＭにＤＭＳＯに溶解し、氷冷Ｆ１２で約１００μＭに希釈し、短時間ボルテックスし、４℃で一晩静置した。サンプルを、１４，０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離し、清潔なチューブに移した。タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準を使用したＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。ビオチン化ＡＤＤＬを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ／１０／３０カラムによるＳＥＣに供し、画分を、ドットブロットによってビオチン標識について分析した。ビオチン化ＡＤＤＬおよびＳＥＣ画分を、Ｆ１２およびネイティブサンプル緩衝液（最終濃度は以下の通りである。５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３８．３ｍＭグリシン、１０％グリセロール、０．０１７％ブロモフェノールブルー）またはＴｒｉｃｉｎｅサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で希釈し、ＰＡＧＥによって分析した（銀染色用の約６０ｐｍｏｌまたはウェスタンブロット用の約２０ｐｍｏｌ）。比較のために非標識ＡＤＤＬを泳動した。ネイティブゲル（１０％Ｔアクリルアミド、５％Ｃ分離ゲル）は、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、３８．４ｍＭグリシン（ｐＨ ８．３）（Ｂｅｔｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．３０９，ｐｐ．３３３−３５０）の泳動緩衝液を１２０Ｖにて４℃で約３時間使用した。ＳＤＳゲル（１０〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して１２０Ｖにて室温で８０分間泳動した。Ｔｒｉｃｉｎｅゲルプロトコールを使用し、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して銀染色を行った。あるいは、ゲルを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−１９２ｍＭグリシン、２０％ ｖ／ｖメタノール（ｐＨ ８．３）を使用して、ゲルをＨｙｂｏｎｄＥＣＬニトロセルロース上に１００Ｖにて４℃で１時間エレクトロブロッティングを行った。ブロットを、５％ミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）、０．８％ＮａＣｌ）にて室温で１時間ブロッキングした。
【０１８３】
ビオチンプローブ：アビジン−ビオチン化ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ ｓｔａｎｄａｒｄ ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を、試薬ＡおよびＢの５％ミルク／ＴＢＳ−Ｔでの５００倍希釈および室温で３０分間のプレインキュベーションによって形成させた。ブロットを、予め形成させた複合体と１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔでの１０分間の洗浄を３回行い、ｄＨ２０で２回リンスし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｐｉｅｒｃｅ；ｄｄＨ２Ｏでの１：１希釈）で発色させ、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎで読み取った。
【０１８４】
免疫染色：モノクローナル抗Ａｂ（６Ｅ１０，Ｓｉｇｎｅｔ）または抗ＡＤＤＬ（２０Ｃ２；Ｍ．Ｌａｍｂｅｒｔ；ＩｇＧ ＰＶ０２−１０９，１．５２ ｍｇ／ｍｌ）を、ミルク／ＴＢＳで１０００倍希釈し、ブロットと室温で９０分間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで１０分間の洗浄を３回行った後、ブロットを、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇ（ミルク／ＴＢＳＴで４０，０００倍希釈；Ａｍｅｒｓｈａｍ）と室温で９０分間インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔで１０分間の洗浄を３回行い、ｄＨ２Ｏで２回リンスし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｐｉｅｒｃｅ；ｄｄＨ２Ｏでの１：１希釈）で発色させ、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎで読み取った。
【０１８５】
結果：ビオチン化ＡＤＤＬは、非標識ＡＤＤＬを使用して前に認められたＳＥＣプロフィールと類似のＳＥＣプロフィールを有する（図３０、左上のパネル）。ビオチン標識についてのドットブロットは、２８０ｎｍで読み取った吸光度と類似のプロフィールを示す。ビオチン標識のためのプローブを使用したＳＥＣ画分のネイティブＰＡＧＥウェスタンブロット（図３０、右上のパネル）は、ピーク１のオリゴマーよりも遅く移動する。主なネイティブ種のほとんど（^*）およびより速く移動するバンドはピーク２に存在していた。ピーク３の画分は染色されなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のビオチン化ＡＤＤＬの銀染色は、非標識ＡＤＤＬと類似のパターンを示した（図３０、左下のパネル）。ビオチン化ＡＤＤＬ中に約５２ｋＤａの単一の小さなバンドが存在した。ビオチン化および非標識ＡＤＤＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット（図３０、右下のパネル）は、ビオチンについてのプローブの特異性を示した。６Ｅ１０および２０Ｃ２は共にビオチン化および非標識ＡＤＤＬについて類似の免疫染色パターンを示した。銀染色物中の約５２ｋＤａのバンドは、いかなるウェスタンブロットでも認められない。
【０１８６】
確証：ビオチン化および非標識Ａｂ１〜４２の混合物は、ネイティブゲルおよびＳＤＳゲルの両方で典型的な電気泳動プロフィールのＡＤＤＬを形成する。ビオチン標識の探索により、抗体と共に得られるエピトープ特異的免疫染色と無関係に、種々のオリゴマー種の分布を検出することができる。ビオチン化ＡＤＤＬも、非標識ＡＤＤＬと類似のパターンでサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）にて分画される。
【０１８７】
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Ｗａｌｓｈ ＤＭ，Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ（２００４）Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ：ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ １１ ：２１３−２２８．
Ｗａｎｇ ＨＷ，Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ＪＦ，Ｋｕｏ Ｈ，Ｒｉｓｔｉｃ Ｈ，Ｌａｍｂｅｒｔ ＭＰ，Ｃｈｒｏｍｙ Ｂ，Ｖｉｏｌａ ＫＬ，Ｋｌｅｉｎ ＷＬ，Ｓｔｉｎｅ ＷＢ，Ｋｒａｆｆｔ ＧＡ，Ｔｒｏｍｍｅｒ ＢＬ（２００２）Ｓｏｌｕｂｌｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｏｆ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ（１−４２）ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ９２４：１３３−１４０．
Ｗａｎｇ Ｑ，Ｗａｌｓｈ ＤＭ，Ｒｏｗａｎ ＭＪ，Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ，Ａｎｗｙｌ Ｒ．，Ｂｌｏｃｋ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｌｉｃｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ，ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ５，ａｎｄ ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ５．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４ Ｍａｒ ３１ ；２４（１３）：３３７０−８．
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【０１８８】
本書類で言及した特許、特許出願、ならびに任意の他の科学文献および技術文献は、これらが矛盾しない範囲で引用により組み入れられる。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態の上記開示は、例示および説明を目的として示している。厳密な形態または開示の形態は網羅的でなく、本発明を制限することを意図しない。意図する特定の用途に合わせる場合に当業者が種々の実施形態および種々の修正形態で本発明を最良に実施することができるようにするために本発明の原理およびこれらの原理の実際の適用を最良に説明するために説明を選択した。意図する特定の用途に適している。本発明の範囲は、明細書によって制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】Ａβオリゴマーが細胞外にニューロンを取り囲んで沈着しており、アルツハイマー病の大脳皮質で非常に増加している。ＡＤ脳の前頭葉の切片を、Ｍ９４抗体を使用してＡＤＤＬについて免疫標識し、蛍光またはペルオキシダーゼ抱合二次抗体（それぞれ、ＡおよびＢ）のいずれかで視覚化した。両方の標識条件における単一のピラミッド型のニューロンの細胞体周囲の拡散したシナプス型標識に留意のこと。非認知症のコントロールではＩＲ沈着は認められない（示さず）。画像ＡおよびＢ中のスケールバーは、１０μｍを示す。（Ｃ）は、ＡＤと診断された９人の被験体（黒塗りの記号）またはＡＤと診断されなかった１５人の被験体（白抜きの記号）の２つの脳領域［皮質（四角）および小脳（三角）］由来のドットブロットによって測定された可溶性Ａβレベルの散布図を示す。脳サンプルを、ドットブロット（挿入図）によってアッセイし、デンシトメトリーによって分析した。各ポイントは、２つの測定の相対強度の平均であれる。バーは、各群の平均を示す（ＡＤ皮質：２．２８１＋／−０．２０２；ＣＴＬ皮質：０．２０６＋／−０．０８３；ＡＤ小脳：０．２６３＋／−０．０９０およびＣＴＬ小脳：０．０９７＋／−０．０１３；値は、平均＋／−ＳＥＭを示す）。このプロットは、ＡＤ皮質中のＡβレベルの散乱がコントロール皮質よりも大きく、コントロールよりも有意に高い（ｐ＜０．０００１、ＡＤ対ＣＴＬ）ことを示す。しかし、小脳について、ＡＤとＣＴＬの間のＡβレベルの相違は明白でなく、あまり有意ではなかった（ｐ＝０．１３１６、ＡＤ対ＣＴＬ）。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳ（登録商標）ｔａｔ３ソフトウェアを使用して、有意性を試験するための片側検定のｐ値を確立した。
【図２】ＡＤ脳由来のＡβオリゴマー（ＡＤＤＬ）は、点状の特異性を有するニューロンに結合する。一次海馬ニューロンを、ＡＤ前頭葉（Ａ）またはＡＤ ＣＳＦ（Ｅ）由来の可溶性抽出物と３０分間インキュベートした。いくつかの培養物を、年齢適合コントロールの皮質抽出物（Ｂ）またはＣＳＦ（Ｆ）とインキュベートした。いくつかの実験では、海馬ニューロンを、同様に、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａとの間の質量の種（Ｃ）または１０ｋＤａ以下の質量の種（Ｄ）を含むＣｅｎｔｒｉｃｏｎ分画可溶性ＡＤ抽出物（方法を参照のこと）をインキュベートした。非結合種を洗い流し、ＡＤＤＬの付着を、ウサギポリクローナルオリゴマー特異的Ｍ９４抗体を使用した非透過処理免疫標識条件下で評価した（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００１に記載）。ＡＤ脳（Ａ）およびＣＳＦ（Ｅ）由来の可溶性抽出物は、点状に分布してニューロン表面に選択的に結合するＡＤＤＬを含む。年齢適合コントロール由来の皮質抽出物（Ｂ）およびＣＳＦ（Ｆ）で標識は検出されなかった。１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの質量範囲の種を含むＡＤ抽出物のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）フィルター分画物は、非分画可溶性抽出物と区別可能な点状の染色を示す一方で、１０ｋＤ以下の質量の種を含む画分には結合種は存在しなかった。３つの独立した実験で同様の所見が得られた。
【図３】合成ＡＤＤＬ（しかし、低分子量でない種）は、ＡＤ由来の種と同様に、ニューロンに結合する。一次海馬ニューロンを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）フィルター（Ａ、Ｂ）によって分画された合成ＡＤＤＬまたはサイズ排除クロマトグラフィ（Ｅ、Ｆ）によって分離したビオチン化ＡＤＤＬと３０分間インキュベートした（Ｃｈｒｏｍｙ ｅｔ ａｌ．，２００３に記載）。新鮮な培地での洗浄による非結合種の除去後、細胞結合ＡＤＤＬを、Ｍ９４およびＡｌｅｘａ−４８８抱合抗ウサギ二次抗体（Ａ、Ｂ）またはＡｌｅｘａ４８８抱合ストレプトアビジン（Ｅ、Ｆ）を使用した非透過処理免疫標識条件下で評価した。共焦点画像は、いくつかの細胞体への結合も明らかであるにも関わらず、オリゴマーの免疫反応性がニューロンの原形質膜および主に樹状分枝（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ａｒｂｏｒ）内に存在することを証明する。点状の結合は受容体クラスターを連想させ、アルツハイマー病のＡβオリゴマーの受容体クラスターに類似している（図２）。ＡＤ脳由来の分画された可溶性オリゴマーと同様に、１００〜１０ｋＤの範囲の合成ＡＤＤＬ種との海馬ニューロンのインキュベーションは免疫反応の点を示す一方で（Ａ）、１０ｋＤａ以下の種（単量体および二量体を含むであろう）は示さない（Ｂ）。（挿入図）海馬ニューロンとの６時間のインキュベーション後の培養培地中に存在するＡＤＤＬのウェスタンブロットにより、ＡＤＤＬが安定であり、且つ１００ｋＤａより高い分子量の種を含まないことが証明された（Ｃ）。レーンは、２つの異なる培養培地を示す。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５におけるサイズ排除クロマトグラフィによるビオチン化ＡＤＤＬ（約１４ｎｍｏｌの７０μＭ ＡＤＤＬ調製物）の分離により、２つのピークが得られた（Ｄ）。溶離体積対２８０ｎｍでの吸光度のヒストグラムは、１６．９ｍＡＵで吸収を示す８．１ｍｌでのピーク１および１１．７ｍＡＵで吸収を示す１３．９ｍｌでのピーク２を示した。それぞれのタンパク質濃度が６．５μＭおよび４μＭである画分Ｂ１およびＤ６を、（ピーク１と２との間で採取した）ＳＥＣコントロール画分と並行して５００ｎＭの最終濃度で成熟海馬細胞と１時間インキュベートした。ビオチン化種の結合を、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４８８抱合ストレプトアビジンを使用して検出した。ピーク１の画分Ｂ１（Ｅ）で蛍光のホットスポットが排他的に認められ、これは、十二量体などの５０ｋＤａを超える分子量の種と一致する。ピーク２の画分Ｄ６（Ｆ）またはコントロール画分（示さず）では蛍光は認められなかった。共焦点顕微鏡設定（レーザー出力、フィルター、検出器の感度、増幅率、および増幅補正）を常時使用して共焦点画像を得た。画像は、３つの異なる実験の代表である。スケールバーは、４０μｍを示す。
【図４】ＡＤＤＬ結合は細胞特異的である。二重標識免疫蛍光研究を、マウスモノクローナル抗αＣａＭキナーゼＩＩおよびウサギポリクローナル抗ＡＤＤＬ（Ｍ９４）を使用して、成熟海馬ニューロン（２１ ＤＩＶ）に対して行い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４（赤）二次抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（緑）二次抗体でそれぞれ視覚化した（Ａ、Ｂ）。類似の二重標識実験を、マウスモノクローナル抗ＰＳＤ−９５（Ｃ、赤）および抗ＡＤＤＬ（緑）を使用して行った。ｚ軸方向の共焦点スキャン（０．５μｍ間隔で取り込む）による三次元再構築画像の重ね合わせ（Ｂ、Ｃ）は、ＡＤＤＬがいくつかのαＣａＭキナーゼＩＩ陽性ニューロンに選択的に結合する（重複により黄色が出現する）ことを示した（ここでは、ＡＤＤＬとの６時間のインキュベーション後に示した）。ＰＳＤ−９５標識を使用して、類似の細胞選択性が認められた。２つのニューロンのうちの１つのみがＡＤＤＬによってターゲティングされることに留意のこと。３０分のインキュベーション後にＡＤＤＬとαＣａＭキナーゼＩＩまたはＰＳＤ−９５陽性ニューロンとの間の類似の細胞特異的結合および同時局在化が認められた（示さず）。スケールバーは、２０μｍを示す。
【図５】ＡＤＤＬは、ＰＳＤ−９５陽性末端のサブセットを特異的にターゲティングする。ＡＤＤＬで処置した海馬ニューロンを、ＰＳＤ−９５（赤、Ａ）およびＡＤＤＬ（緑、Ｂ）で二重免疫標識した。再構築したｚ軸方向の共焦点スキャンの重ね合わせは、組み合わせた画像における黄色の点の量によって認められるように、ＡＤＤＬ−ＩＲ点の樹状クラスターがＰＳＤ−９５とほとんど完全に同時局在化していることを示す（Ｃ）。ＡＤＤＬとＰＳＤ−９５との間の同時局在化の程度を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用して定量した。棒グラフは、１４の異なる視野についてのＡＤＤＬによってターゲティングされたＰＳＤ−９５数（Ｅ）およびＰＳＤ−９５と同時局在化したＡＤＤＬ結合部位数（Ｆ）を示す（４０倍の対物レンズ）。グラフ（Ｅ）は、多数のＰＳＤ−９５部位がＡＤＤＬによって占有されていないことを示す（黄色のバー：ＡＤＤＬと同時局在化したＰＳＤ−９５；赤色のバー：ＡＤＤＬを含まないＰＳＤ−９５）（１視野あたりの平均総オリゴマー結合部位は、１０６２＋／−１２５であった；ＰＳＤ−９５と同時局在化した平均オリゴマー部位は、９７１＋／−１０５であった）。グラフ（Ｆ）は、各視野についてのＰＳＤ−９５シナプス部位に局在したＡＤＤＬ点の比率を示す。ＰＳＤ−９５部位でのＡＤＤＬ数（黄色のバー）は、非シナプス部位でのＡＤＤＬ数（緑色）よりも遥かに多かった。円グラフは、ＡＤＤＬによって占められるＰＳＤ−９５画分（Ｇ）およびＰＳＤ−９５と同時局在化したＡＤＤＬ結合部位画分（Ｈ）を示す、全視野をまとめた分布を示す。結果を、１４の異なる全視野についての平均＋／−ＳＥＭとして示す（１視野あたりの総部位の平均は１９６０＋／−１７４であり、５０＋／−２％はオリゴマー結合部位に結合しなかった）。まとめると、ＰＳＤ−９５点の半分はＡＤＤＬによってターゲティングされる（Ｇ）が、９０％を超えるＡＤＤＬ点はＰＳＤ−９５と同時局在化する（Ｈ）。分析により、ＡＤＤＬがシナプス部位に特異的に局在することが立証される。スケールバーは、１０μｍを示す。（挿入図；Ｄ）シナプス前マーカー（シナプトフィジン）（赤色）が重なり合うよりもむしろ並列しているＡＤＤＬ（緑色）を示す海馬ニューロンの画像。
【図６】樹状突起棘へのＡＤＤＬ結合部位の局在化。合成ＡＤＤＬで１時間処置した高度に分化した海馬細胞（２１ ＤＩＶ）を、ＡＤＤＬ（緑色）およびαＣａＭキナーゼＩＩ（赤色）について二重免疫標識した。ＡＤＤＬ結合αＣａＭキナーゼＩＩ陽性ニューロンを描写する（Ａ）。高倍率の画像は、多数のＡＤＤＬ−ＩＲ点がαＣａＭキナーゼＩＩ富化樹状突起棘と同時分布していることを示す（Ｂ）。矢印で示すように、ＡＤＤＬは主に樹状突起棘をターゲティングした。画像は、３つの異なる試験の代表である。スケールバーは、４０μｍ（Ａ）および８μｍ（Ｂ）を示す。
【図７】最初期遺伝子Ａｒｃの急速なＡＤＤＬ誘導性シナプス発現。海馬ニューロンを、合成ＡＤＤＬに５分間曝露し、その後、Ａｒｃ（赤色）およびＡＤＤＬ（緑色）について標識する。画像の組み合わせは、ＡＤＤＬ点とＡｒｃ陽性シナプスとの同時局在化点を示す（黄色）。スケールバーは、８μｍを示す。
【図８】ＡＤＤＬは、Ａｒｃの上方制御の維持を促進する。賦形剤（Ａ、Ｃ）またはＡＤＤＬ（Ｂ、Ｄ）で１時間（Ａ、Ｂ）または６時間（Ｃ、Ｄ）処置した海馬細胞を固定し、透過処理し、Ａｒｃタンパク質について標識した。免疫蛍光により、ニューロンサブセットの樹状突起および樹状突起棘全体でＡＤＤＬ誘導性のＡｒｃ発現が非常に増加することが明らかになった。賦形剤処置細胞では、Ａｒｃ発現はニューロン細胞体に限定される。挿入図は、Ａｒｃポリクローナル抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に免疫ブロッティングを行った賦形剤（−）またはＡＤＤＬ（＋）で１時間処置した海馬細胞由来の抽出物を示す。免疫ブロットは、賦形剤処置（−）細胞抽出物と比較して、ＡＤＤＬ処置（＋）細胞抽出物でのＡｒｃ濃度の増加を示す。サイロフィリンＢ（ｃｙｌｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ）（シクロ）を使用して、タンパク質ローディングに関して正規化し、Ａｒｃ／シクロＩＲ比は、コントロールで０．７０＋／−０．１１であり、オリゴマー処置サンプルでは３．５１＋／−０．７６であった（ｎ＝４、ｔ検定を使用してｐ＝０．０１（対応する２サンプルについての平均値））。ブロットは、４つの独立した実験の代表である。また、海馬細胞を、賦形剤（Ｃ）またはＡＤＤＬ（Ｄ）で６時間処置し、透過処理し、Ａｒｃについて標識した。賦形剤処置ニューロンの高倍率の共焦点画像は、Ａｒｃ−ＩＲ点が樹状軸（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｈａｆｔ）に局在していることを示し、少数の棘の頭部（ｈｅａｄ）のみが樹状軸で見出された強度レベルよりも高い強度レベルに到達している。ＡＤＤＬ処置ニューロンの樹状突起は、樹状突起棘の頭部に集中した強いＡｒｃ−ＩＲの点パターンおよび樹状軸および棘全体に上方制御されたＡｒｃ−ＩＲを示す。一次抗体についてのコントロールは標識されなかった。３つの独立した試験で同一の結果が得られた。スケールバーは、２０μｍ（Ａ、Ｂ）および６μｍ（Ｃ、Ｄ）を示す。
【図９】ＡＤＤＬ誘導性シナプス不全および記憶喪失における仮説に基づくＡｒｃの役割。実施例１の考察の部を参照のこと。
【図１０】成熟Ｃａ＋＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａＭＫＩＩ^α）陽性海馬ニューロン（桃色−赤色）の樹状突起の枝部（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｂｒａｎｃｈ）上のＡβ可溶性オリゴマーの蛍光分布（緑色）を示す共焦点免疫蛍光画像。Ａβ可溶性オリゴマーは、ＣａＭＫＩＩ^αを高度に発現する樹状突起棘を特異的にターゲティングした（重複は黄色である）。ボックスは、樹状突起棘の拡大図を示す。
【図１１−１】受容体−ＡＤＤＬの付加および同時局在化。
【図１１−２】受容体−ＡＤＤＬの付加および同時局在化。
【図１２】ＡＤＤＬ曝露後にＮＲ２Ｂ膜発現が減少する。
【図１３】ＡＤＤＬでの海馬ニューロン処置の経時変化により、スピノフィリン免疫蛍光（ＩＦ）強度および棘の形態によってモニタリングしたところ、一過性シナプス後応答が得られる。
【図１４】Ｅｒｂ−Ｂ４ ＩＦ染色強度は、ＡＤＤＬ曝露の１時間後に増加する。
【図１５】（パネルＡおよびＢ）：ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＡＤＤＬはシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）に結合するが、活性帯に結合しない。
【図１６】（パネルＡおよびＢ）：ＣＮＱＸはシナプトソームへのＡＤＤＬの結合を遮断する。ＣＮＱＸは、シナプトソームに結合したＡＤＤＬの量を減少させる。
【図１７】（パネルＡおよびＢ）：ＣＮＱＸはシナプトソームへのＡＤＤＬの結合を遮断する。ＣＮＱＸは、ＡＤＤＬ免疫沈降（ＩＰ）中のＰＳＤ９５を減少させる。
【図１８】ＣＮＱＸは、ニューロン表面へのＡＤＤＬの結合を遮断する。
【図１９】パネルＡ：区画分析を使用した対象物（Ｏｂｊｅｃｔ）の同定。チャネル１は核染色を示し（ＤＡＰＩ）、チャネル２はＭＡＰ２抗体を使用したニューロン染色を示し、チャネル３は抗ＡＤＤＬ抗体を使用したＡＤＤＬ染色を示す。ニューロンのみがＤＡＰＩ陽性核およびＭＡＰ２陽性細胞体の両方を含む。ニューロン中の近位樹状突起へのＡＤＤＬ結合の平均強度を測定する（チャネル３中の緑色のピクセル）。パネルＢ：一次海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合の定量。ウェル１−１０、１３−２２、２５−３４、および３７−４２中でＡＤＤＬに曝露したニューロンは、賦形剤コントロールウェルよりも非常に強いＡＤＤＬ結合を示すニューロンの比率がはるかに高い。
【図２０】一次海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合。ストレプトアビジンにカップリングしたアルカリホスファターゼを使用したニューロン細胞に結合したビオチン化ＡＤＤＬ量の増加の検出。
【図２１Ａ】標準的な手順によるヒトｓｙｎＧＡＰ、ヒトＧｌｕＲ２前駆体、およびヒトＧｌｕＲ６前駆体のＣｌｕｓｔａｌＷ配列アラインメント。
【図２１Ｂ】標準的な手順によるヒトｓｙｎＧＡＰ、ヒトＧｌｕＲ２前駆体、およびヒトＧｌｕＲ６前駆体のＣｌｕｓｔａｌＷ配列アラインメント。
【図２１Ｃ】標準的な手順によるヒトｓｙｎＧＡＰ、ヒトＧｌｕＲ２前駆体、およびヒトＧｌｕＲ６前駆体のＣｌｕｓｔａｌＷ配列アラインメント。
【図２２】グルタミン酸およびグルタミン酸受容体リガンドＣＮＱＸおよびＮＳ−１０２は、樹状突起受容体へのＡＤＤＬ結合を遮断する。
【図２３】海馬細胞へのＡＤＤＬ結合に及ぼすグルタミン酸受容体（ＧｌｕＲ）遮断薬の影響についての免疫蛍光試験。
【図２４】パニングアッセイにおいて、グルタミン酸塩はシナプトソームへのＡＤＤＬ結合を遮断する。
【図２５】シナプトソームパニングは、ＡＤＤＬ結合がシナプトソーム濃度に依存することを示す。
【図２６】シナプトソームを免疫化するためのコレラ毒素サブユニットＢの使用は、ＡＤＤＬおよびシナプトソーム濃度依存性結合を示す。
【図２７】ＡＤＤＬ−シナプトソーム免疫沈降。シナプトソームを、ＡＤＤＬまたは賦形剤を含むＦ１２／ＦＢＳ（Ｆ１２培地、５％ＦＢＳ）とインキュベートした。処置したシナプトソームを、抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体（Ｄｙｎａ−２０Ｃ２）でコーティングした磁性ビーズを含むＦ１２／ＦＢＳを使用して免疫沈降を行った。異なる画分中のシナプスマーカーの存在を、標準的なウェスタンブロットで抗ＰＳＤ９５抗体を使用してアッセイした。
【図２８】ＡＤＤＬはＰＳＤに結合するが、皮質シナプトソームの活性帯に結合しない。
【図２９】ビオチン標識ＡＤＤＬの特徴づけ。ビオチン化ＡＤＤＬ（ｂ−ＡＤＤＬ）は、低分子量（ＬＭＷ）ピーク中に出現する。
【図３０】パネルＡ：ビオチン化および非標識Ａｂ１−４２の混合物由来のＡＤＤＬを、ＳＥＣにて分画し（ＡＤＤＬ３１、左上のパネル）、ピーク画分を、ビオチン標識のプローブを使用したネイティブ−ＰＡＧＥウェスタンブロットによって分析した（右上のパネル）。パネルＢ：ビオチン化および非標識Ａｂ１−４２の混合物由来のＡＤＤＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色（左下のパネル）およびウェスタンブロット（右下のパネル）によって分析した。ブロットを、ビオチンについて探索するか、モノクローナル抗体で免疫染色した（６Ｅ１０および２０Ｃ２）。比較のために非標識ＡＤＤＬを含んでいた。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体であって、ＡＤＤＬと結合する１又は複数の受容体を含む組成物。
【請求項２】
前記１又は複数の受容体がｓｙｎＧＡＰである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１又は複数の受容体がｐｒｏＳＡＰ２／Ｓｈａｎｋ３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記１又は複数の受容体がグルタミン酸受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記受容体がカイニン酸サブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記受容体がＧｌｕＲ６である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記受容体がＡＭＰＡサブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記受容体がＧｌｕＲ２である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ａである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｂである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｃである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｄである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記受容体がｍＧｌｕＲ５ａである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記受容体がｍＧｌｕＲ５ｂである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
前記受容体がＮＭＤＡサブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記受容体がインテグリン受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記受容体が接着受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記受容体がＮＣＡＭである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記受容体がＬ１である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記受容体がカドヘリンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記受容体が栄養因子受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記受容体が線維芽細胞成長因子受容体１である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記受容体が線維芽細胞成長因子受容体２である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記受容体がＴｒｋＡ受容体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記受容体がＴｒｋＢ受容体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記受容体がｅｒｂＢ４である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記受容体がｅｒｂＢ／ＥＧＦ受容体ファミリーの近接な（ｃｌｏｓｅ）ホモログである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記受容体がトロフィン（ｔｒｏｐｈｉｎ）に結合する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記受容体がインスリン受容体（ＩＲ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記受容体がインスリン成長因子受容体１（ＩＧＦ−１）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記受容体がＧＡＢＡ受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記受容体がナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ⁺／Ｋ^-ＡＴＰアーゼ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記受容体がＣＡＭキナーゼＩＩである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記受容体がＰｒＰタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記受容体が受容体タンパク質チロシンホスファターゼα（ＲＰＴＰα）タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記受容体がソマトスタチン受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記受容体がカンナビノイド受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記受容体がσ受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記受容体がＶＩＰ／ＰＡＣＡＬ受容体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
ニューロンのシナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を含む、組成物。
【請求項４１】
請求項４０に記載の組成物を含む医薬調製物。
【請求項４２】
シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を阻害する１又は複数の化合物を含む、組成物。
【請求項４３】
前記１又は複数の化合物がＣＮＱＸである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
ＡＤＤＬ関連疾患の処置方法であって、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を拮抗する１又は複数の化合物を投与する工程を含む方法。
【請求項４５】
前記ＡＤＤＬ関連疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＡＤＤＬ関連疾患が軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＡＤＤＬ関連疾患がダウン症候群を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記１又は複数の化合物が、ＣＮＱＸまたはＣＮＱＸの医薬として許容される誘導体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記１又は複数の受容体がｓｙｎＧＡＰである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記１又は複数の受容体がｐｒｏＳＡＰ２／Ｓｈａｎｋ３である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記１又は複数の受容体がグルタミン酸受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記受容体がカイニン酸サブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記受容体がＧｌｕＲ６である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記受容体がＡＭＰＡサブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記受容体がＧｌｕＲ２である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ａである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｂである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５８】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｃである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５９】
前記受容体がｍＧｌｕＲ１ｄである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記受容体がｍＧｌｕＲ５ａである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記受容体がｍＧｌｕＲ５ｂである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
前記受容体がＮＭＤＡサブタイプグルタミン酸受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
前記受容体がインテグリン受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６４】
前記受容体が接着受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６５】
前記受容体がＮＣＡＭである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６６】
前記受容体がＬ１である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６７】
前記受容体がカドヘリンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項６８】
前記受容体が栄養因子受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項６９】
前記受容体が線維芽細胞成長因子受容体１である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７０】
前記受容体が線維芽細胞成長因子受容体２である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７１】
前記受容体がＴｒｋＡ受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７２】
前記受容体がＴｒｋＢ受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７３】
前記受容体がｅｒｂＢ４である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７４】
前記受容体がｅｒｂＢ／ＥＧＦ受容体ファミリーの近接なホモログである、請求項４４に記載の方法。
【請求項７５】
前記受容体がトロフィンに結合する、請求項４４に記載の方法。
【請求項７６】
前記受容体がインスリン受容体（ＩＲ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７７】
前記受容体がインスリン成長因子受容体１（ＩＧＦ−１）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７８】
前記受容体がＧＡＢＡ受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項７９】
前記受容体がナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ⁺／Ｋ^-ＡＴＰアーゼ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８０】
前記受容体がＣＡＭキナーゼＩＩである、請求項４４に記載の方法。
【請求項８１】
前記受容体がＰｒＰタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８２】
前記受容体が受容体タンパク質チロシンホスファターゼα（ＲＰＴＰα）タンパク質である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８３】
前記受容体がソマトスタチン受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８４】
前記受容体がカンナビノイド受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８５】
前記受容体がσ受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８６】
前記受容体がＶＩＰ／ＰＡＣＡＬ受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項８７】
ビオチン標識ＡＤＤＬを含む、組成物。
【請求項８８】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬを含む、組成物。
【請求項８９】
抗体によって認識される１又は複数のエピトープを含むＡＤＤＬを含む、組成物。
【請求項９０】
前記エピトープがペプチド配列である、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記エピトープが有機小分子である、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９２】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートである、組成物。
【請求項９３】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、前記サロゲートが、内部βシートを形成することができる特定の構造エレメントを含むペプチドまたはペプチド模倣物を含み、前記形成によって、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーへのアセンブリが可能となる、組成物。
【請求項９４】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、内部Ｃ末端βシートを形成することができる特定の構造エレメントを含むペプチドまたはペプチド模倣物を含む組成物であって、前記形成によって、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーへのアセンブリが可能となる、組成物。
【請求項９５】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、モチーフ：
【化１】

（式中、Ｚは、グリシル−グリシル、プロリル−グリシル、グリシル−プロリル、またはβターンを形成することができる任意の他のジペプチドもしくはジペプチド模倣物または任意の他のβターン模倣物であり、Ｘは任意のアミノ酸またはアミノ酸模倣物である）を含むペプチドまたはペプチド模倣物を含み、その存在によって内部βシートを形成することができ、その形成によって、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーへのアセンブリが可能となる、組成物。
【請求項９６】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーにアセンブリすることができるジペプチド官能化βターン模倣物を含む、組成物。
【請求項９７】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化２】

（式中、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーが請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物。
【請求項９８】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化３】

（式中、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基であり、Ｘは任意の疎水性アミノ酸である）を含み、前記ペプチドがオリゴマーにアセンブリすることができ、前記オリゴマーが請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができる、組成物。
【請求項９９】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化４】

（式中、Ｒは任意のペプチドであり、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基である）を含み、前記ペプチドが、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーにアセンブリすることができる、組成物。
【請求項１００】
１又は複数のビオチン部分を含むＡＤＤＬサロゲートであり、ペプチド配列：
【化５】

（式中、Ｒは任意のペプチドであり、Ｕはヒスチジン以外の任意の親水性アミノ酸残基であり、Ｘは任意の疎水性アミノ酸である）を含み、前記ペプチドが、請求項１に記載のＡＤＤＬ受容体に結合することができるオリゴマーにアセンブリすることができる、組成物。
【請求項１０１】
蛍光標識ＡＤＤＬを含む、組成物。
【請求項１０２】
前記蛍光標識がフルオレセインである、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記蛍光標識がテトラメチルローダミンである、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記蛍光標識がＡｌｅｘａ（登録商標）色素である、請求項１００に記載の組成物。
【請求項１０５】
シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を妨害する化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、
ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、
ｃ）シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程と
を含む、方法。
【請求項１０６】
前記ＡＤＤＬがビオチン標識ＡＤＤＬである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＡＤＤＬが蛍光標識ＡＤＤＬである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
１又は複数の請求項１に記載の受容体に結合した場合にＡＤＤＬを認識する抗体を検出に使用する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
組成物が１又は複数の請求項１に記載の受容体に結合する場合、請求項９１に記載の組成物内のビオチンを認識するアビジンまたはストレプトアビジンを検出に使用する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記検出によって抗ＡＤＤＬ抗体を認識する蛍光標識二次抗体に会合した蛍光量を測定する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
検出によって酵素−抗体抱合体または酵素−ストレプトアビジン抱合体によって生成された蛍光シグナルまたは発光シグナルを測定する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する化合物の同定方法であって、
ａ）ＡＤＤＬサロゲートを生成する工程と、
ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬサロゲートを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、
ｃ）シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬの結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程と
を含む、方法。
【請求項１１３】
シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する化合物の同定方法であって、
ａ）ＡＤＤＬサロゲートを生成する工程と、
ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬサロゲートを、シナプス後膜肥厚に局在している１又は複数の受容体へのＡＤＤＬサロゲートの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、
ｃ）抗ａｒｃ抗体を使用して、ニューロン内で産生されたａｒｃタンパク質量を測定する工程と
を含む、方法。
【請求項１１４】
シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合を測定する方法であって、
ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、
ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、
ｃ）シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合に特徴的な点状の結合を測定する工程と
を含む、方法。
【請求項１１５】
シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合を妨害する化合物の同定方法であって、
ａ）ＡＤＤＬを生成する工程と、
ｂ）工程ａ）で生成したＡＤＤＬを、シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬの結合を妨害する疑いのある１又は複数の化合物の存在下で、シナプス後膜肥厚を含む組織培養細胞に添加する工程と、
ｃ）シナプス後膜肥厚へのＡＤＤＬ結合に特徴的な点状の結合に及ぼす１又は複数の化合物の影響を測定する工程と
を含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【公表番号】特表２００８−５００２８６（Ｐ２００８−５００２８６Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１３４７８（Ｐ２００７−５１３４７８）
【出願日】平成１７年５月１６日（２００５．５．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７１７６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１００５６
【国際公開日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５９６０５７８９３）ノースウエスタン　ユニバーシティ (35)
【出願人】（５０６３８１２０１）アキュメン　ファーマシューティカルズ，インコーポレイティッド (1)
【Ｆターム（参考）】