ＡＭＰＫ活性化剤、ＧＬＵＴ４活性化剤、およびそれらを用いた医薬品・飲食品
【課題】副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果が得られる薬剤、およびこれら各効果に伴う糖尿病・肥満等の改善効果等が期待できる医薬品・飲食品の提供。
【解決手段】２−８量体のプロアントシアニジンを有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤。また、プロアントシアニジンを有効成分として含有するＧＬＵＴ４活性化剤。また、上記各薬剤からなる、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤。また、これら薬剤を含有する飲食品。
【解決手段】２−８量体のプロアントシアニジンを有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤。また、プロアントシアニジンを有効成分として含有するＧＬＵＴ４活性化剤。また、上記各薬剤からなる、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤。また、これら薬剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）活性化剤、ＧＬＵＴ４（インスリン依存性糖輸送担体[glucose transporter 4] ）活性化剤、およびそれらを用いた医薬品・飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満の予防および治療は、健康の維持・増進において非常に重要な課題である。肥満は、２型糖尿病、高血圧症、高脂血症等を引き起こす。さらにこれらの疾病は、脳卒中や虚血性心疾患等の基礎疾患でもある。現在、これらの疾病は、肥満によって引き起こされるインスリン抵抗性を基盤とする、一連の代謝異常状態と解されている。近年の分子生物学的研究により、肥満・インスリン抵抗性に関与する様々な因子の存在が明らかになりつつある。
【０００３】
生体内の糖・脂質代謝に大きく関与する脂肪細胞には、主にＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４といった輸送担体（glucose transporter ：ＧＬＵＴ）が発現している。その中でも、特にＧＬＵＴ４は、脂肪細胞の膜上におけるグルコースの取込み活性における主要な役割を果たしていることが知られている。ＧＬＵＴ４は、インスリン感受型ＧＬＵＴと呼ばれ、通常は脂肪細胞及び筋肉細胞における細胞内小胞に存在し、インスリンの刺激を受けると、細胞膜上に移行（トランスロケーション）し、グルコースを取り込める状態とする。ＧＬＵＴ４のトランスロケーションは、インスリンが受容体に結合し、受容体のβサブユニットが自己リン酸化することが情報伝達の開始となり、その後インスリン受容体基質（ＩＲＳ）のリン酸化、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化、Akt ／Protein Kinase Bの活性化（およびプロテインキナーゼＣの活性化）という経路を介して細胞内の小胞体から細胞膜へのエキソサイトーシスにより、移行が完了する（特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、内臓脂肪細胞に蓄積された中性脂肪が分解されて放出される遊離脂肪酸や、内臓脂肪細胞から分泌されるＴＮＦ−αによる、ＰＩ３−キナーゼ活性の抑制が生じると、ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行が抑制され、上記のようなインスリンによるグルコース代謝に異常が生じ、糖尿病を発症するおそれがある。糖尿病患者数は、肥満の増加を反映して増える傾向にある。そして、糖尿病は、いったん発症するとなかなか完治しづらいばかりか、合併症を発症させるおそれもある。具体的には、プロテインキナーゼＣ等の酵素の働きが異常に亢進して細胞機能が低下したり、高血糖の持続により酵素などの蛋白質にグルコースが化学結合して酵素機能が低下したり、高血糖による代謝障害のためにソルビトール（糖アルコール）が細胞内に蓄積して細胞障害を起こし、それにより、細小血管の細胞や血液細胞に異常が生じ、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害といった合併症を発症する。
【０００５】
一方、インスリンによらないグルコース代謝方法として、筋肉や肝臓にあるＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）を活性化させる方法がある。ＡＭＰＫは、細胞での糖や脂質代謝の流れを調節する酵素であり、ＧＬＵＴ４を細胞表面に移行させて、筋肉がエネルギーを作るためのグルコースを取り込ませたり、脂肪を燃焼させたりする働きがある。
【０００６】
しかし、上記のようにＡＭＰＫを活性化させるには、運動による筋収縮が必要である。そこで、近年、薬剤投与によりＡＭＰＫを活性化させ、それによる「運動疑似効果」を通じて、糖代謝や高脂血症を改善し抗動脈硬化作用を発揮させる手法が検討されている。このような薬剤としては、例えば、メトホルミン（ビグアナイド薬）、チアゾリジン誘導体等が有用であることが知られている。
【０００７】
ところが、これらの薬剤は、副作用を伴うものも多く、そのため、日常的な飲食品に含有させることが好ましいものは少ないのが実情である。そのようななか、近年、葡萄の葉又はその抽出物を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献２）、ローズマリーやセージの抽出物を含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献３）、グレープフルーツ由来のヌートカトンを含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献４）といったものも提案されており、食品として従来から用いられている植物を由来とするものであることから、日常的な飲食品への適用においても安全性が高いと考えられる（特許文献２〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１９２９公報
【特許文献２】特開２００８−２５５０４８公報
【特許文献３】特開２００８−２０８０８１公報
【特許文献４】特開２００７−６３２４１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来からある植物由来のＡＭＰＫ活性化剤は、実際には、ＡＭＰＫ活性作用はあまり高くなく、化学薬品であるメトホルミン等の性能に比べると、かなり劣る。そのため、更なる研究による活性能の向上が期待されている。
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果が得られる薬剤、およびこれら各効果に伴う糖尿病・肥満等の改善効果等が期待できる医薬品・飲食品の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤を第１の要旨とする。
【化１】
【００１２】
また、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＧＬＵＴ４活性化剤を第２の要旨とする。
【化２】
【００１３】
また、本発明は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤のいずれか一つの医薬品であって、上記第１の要旨の薬剤や第２の要旨の薬剤を含有する医薬品を第３の要旨とする。
【００１４】
また、本発明は、上記第１〜第３の要旨の薬剤を含有する飲食品を第４の要旨とする。
【００１５】
すなわち、本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた。その研究の過程で、各種の生理作用が報告されているプロアントシアニジンに着目した。プロアントシアニジンは、エピカテキン（またはエピガロカテキン）の重合体であり、２量体，３量体，４量体，５量体等の多重合体が存在し、さらに、これらには、結合位置の違うものや、各種の立体異性体も存在する。そして、これらは、それぞれ生理作用も異なるものである。本発明者らは、このようなプロアントシアニジンに関する研究を更に進めた。その結果、ＡＭＰＫの活性効果，ＧＬＵＴ４の活性効果において、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として用いたとき、有利な効果が認められることを、実験により新たに突き止めた。なお、ＧＬＵＴ４の活性化は、ＡＭＰＫの活性化によりなされる以外にも、インスリン情報伝達経路の全部または一部によりなされる場合も含まれる。また、これらの作用効果を発揮すると、それに関連し、特に、肥満・糖尿病等の改善効果等も得られることから、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途にも適用することができることを見いだした。さらに、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンは、副作用を生じることがないことから、安全性が高く、日常的な飲食品に含有させるのに好適なものとなり得ることから、所期の目的が達成できることを見いだし、本発明に到達した。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。これにより、上記薬剤は、それぞれ、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病等の予防・改善効果を発揮することができる。
【００１７】
特に、上記各作用効果を良好に発揮することができると、肥満，糖尿病等の改善効果等に優れた効果を発揮することができる。したがって、上記薬剤は、特に、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に有利に適用することができる。
【００１８】
そして、上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分する上記薬剤を含有する飲食品とする場合、このものを通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、ＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果、およびそれに伴う肥満・糖尿病等の改善効果等が得られるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プロアントシアニジンの糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図２】ＰＡ４（プロシアニジン４量体であるシナムタンニンＡ２）の糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図３】細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図４】プロアントシアニジンによるタンパク質のリン酸化および発現量の結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図５】ＡＭＰＫの活性阻害による、ＰＡ４等の糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図６】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図７】プロアントシアニジンのＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図８】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図９】ＰＡ４のＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１０】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図１１】ＰＡ４のＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１２】Ｐ−ＡＣＣおよびＡＣＣの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図１３】ＰＡ４のＡＣＣリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１４】ＰＡ４投与によるＰＰＡＲαの遺伝子発現量を測定した結果を示すグラフ図である。
【図１５】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、食餌摂取量の推移を示すグラフ図である。
【図１６】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、体重の推移を示すグラフ図である。
【図１７】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清グルコース濃度の推移を示すグラフ図である。
【図１８】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清トリグリセライド濃度を示すグラフ図である。
【図１９】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清総コレステロール濃度を示すグラフ図である。
【図２０】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清インスリン濃度を示すグラフ図である。
【図２１】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、ＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図２２】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群の各組織におけるＧＬＵＴ４の発現量を測定した結果を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
つぎに、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
【００２１】
先に述べたように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。
【００２２】
【化３】
【００２３】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンのなかでも、特に、下記の一般式（１’）で表される特定構造のプロアントシアニジン（プロシアニジン）を有効成分として含有すると、他のプロアントシアニジンに比べ、極めて高いＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果が得られるようになるため、好ましい。
【００２４】
【化４】
【００２５】
そして、上記一般式（１’）において、ｎは、好ましくは、１，２または３であり、より好ましくは、１または２である。ｎ＝１のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（２）で表されるプロシアニジンＣ１を示す。また、ｎ＝２のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（３）で表されるシナムタンニンＡ２を示す。
【００２６】
【化５】
【００２７】
【化６】
【００２８】
そして、上記のプロアントシアニジンは、自然界に存在する生物が保有または産生する組成物の中から精製し抽出したものであっても、エピカテキンやカテキンの重合促進等を行うことにより化学的に合成することによって調製したものであって、微生物などを利用する生物学的方法により得たものであってもよい。
【００２９】
上記特定構造のプロアントシアニジンは、植物では、黒大豆種皮、リンゴ、カカオ、ブドウ、シナモン、ムタンバ、サンザシ、ブニノキ、ゴレンシ、マザーワート、ケクロピア、コーラ（コーラナッツ）、茶等に多く含まれる。これらの植物に対する上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法としては、例えば、抽出溶媒に上記植物を浸漬することにより行われる。上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出溶媒としては、例えば、水や、メタノール, エタノール, イソプロパノール, ｎ−プロパノール, アセトン等の水溶性溶媒が用いられるが、特に、黒大豆種皮を原料とする場合、黒大豆種皮には１〜３０量体程度の各種プロアントシアニジンが含まれることから、高濃度の低級アルコールやアセトンで抽出すると、高重合度のプロアントシアニジンが混入してしまう。したがって、この場合、水や０．１〜３０％の含水エタノールが、所望のプロアントシアニジンを高純度で抽出することができるものとして好適に用いられる。また、上記抽出溶媒による抽出温度は、７０℃以下であることが、純度および安定性の点から好ましい。
【００３０】
そして、このようにして得られた抽出液から、所望のプロアントシアニジンを高純度で含有する画分を、吸着処理，樹脂精製処理，ゲル濾過処理，イオン交換処理，膜分離処理，塩析出処理等により抽出し、それを、乾燥、濃縮することにより、目的とするプロアントシアニジンを得ることができる。
【００３１】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、そのＡＭＰＫ活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤は、そのＧＬＵＴ４活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。
【００３２】
さらに、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。
【００３３】
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤には、前記特定構造のプロアントシアニジンとともに、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）を含有することにより、そのＡＭＰＫ活性効果およびＧＬＵＴ４活性効果をさらに向上させることができるため好ましい。なお、Ｃ３Ｇは、アントシアニンの一種であり、上記特定構造のプロアントシアニジンを抽出した各種植物にも多く含まれる物質である。そして、Ｃ３Ｇの抽出方法は、上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法（分離精製方法）に準じる。
【００３４】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。
【００３５】
なお、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤は、それらの作用効果を良好に発揮することにより、肥満・糖尿病等の予防・改善効果に優れた効果を発揮することができるため、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に適用する場合も、上記特定構造のプロアントシアニジンの含量および上記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量は、上記各薬剤に規定された割合に準じる。
【００３６】
また、本発明の上記各薬剤においては、先のプロアントシアニジン抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には、上記抽出物を、適当な液状担体に溶解あるいは分散させたり、適当な粉末担体に混合させたものを使用する。
【００３７】
薬理学的に許容される担体としては、例えば、固形製剤における賦形剤，滑沢剤，結合剤および崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤，溶解補助剤，懸濁化剤，等張化剤，緩衝剤および無痛化剤等があげられる。
【００３８】
また、本発明の薬剤は、その製剤化の際に、通常製剤化に用いられる各種の成分が任意に使用されるが、その例としては、例えば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等があげられる。
【００３９】
本発明の薬剤の剤型としては、例えば、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等があげられる。
【００４０】
さらに、本発明の薬剤は、それを飲食品に関与させた形態としても提供することができる。上記飲食品としては、例えば、健康食品（タブレット、粉末、顆粒、濃縮液体）、清涼飲料、特定保健用食品、ドリンク、お茶、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、ワイン、焼酎、日本酒、ドレッシング、煮豆、豆腐、納豆、豆乳、煎り豆、乾燥豆、味噌等があげられる。そして、これらの飲食品を、通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、肥満抑制効果が得られるようになる。
【００４１】
本発明の薬剤は、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病（特に、肥満や糖尿病）等の予防・改善効果を発揮することができる。また、ヒトのみでなく、ペットや家畜等の動物においても上記効果が得られるものであり、その投与量は、投与対象とする生物の違い、投与される者の性別、体重、年齢等の条件に応じて適宜設定される。そして、上記のように、本発明の薬剤は、ペットや家畜等の動物においても肥満抑制効果等が得られるものであることから、ペットフードや飼料に関与させた形態としても提供することもできる。
【００４２】
つぎに、実施例について説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
〔Ｌ６骨格筋細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用のＬ６骨格筋細胞の作製＞
Ｌ６筋芽細胞の濃度が２×１０4 ／ｍＬになるようにＭＥＭ培地〔１０％ｖ／ｖ牛胎児血清（ＦＢＳ）含有〕で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、２４穴組織培養プレートに１穴当たり５００μＬ播種し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を２日間培養した。上記細胞がコンフルエントになった後、培地をＭＥＭ培地（２％ｖ／ｖＦＢＳ含有）に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を５日間培養することにより、Ｌ６骨格筋細胞を作製した。そして、さらに培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記の糖取り込み測定等に用いた。一方、Ｌ６筋芽細胞の濃度が３×１０4 ／ｍＬとなるようにＭＥＭ培地（１０％ｖ／ｖＦＢＳ含有）で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、６０ｍｍ培養皿に１枚当たり４ｍＬ播種し、上記と同様の条件で骨格筋細胞を作製した後、培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記のウェスタンブロット解析に用いた。
【００４４】
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の調製＞
黒大豆種皮抽出物（製品名：クロノケア、フジッコ社製）を４５％メタノール水溶液に溶解し、セファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体としたゲル濾過カラムに通してプロシアニジンを吸着させ、１．２倍カラム容量の４５％メタノール水溶液、１．２倍カラム容量の５５％メタノール水溶液の順に洗浄した。その後、２倍カラム容量の７０％アセトン水溶液を通液、回収、濃縮乾層することによりプロシアニジン粗画分を得た。この粗画分は、酢酸メチル/アセトン＝８０/２０（ｖ/ｖ）溶液に溶解し、濾過操作により沈殿を除去し、再度濃縮乾燥することによりプロシアニジン精製物を得た。本プロシアニジン精製物を４５％メタノールに溶解し、再度セファデックスＬＨ−２０カラムに供し、メタノール濃度４５％から７５％までの濃度勾配によりプロシアニジン２、３及び４量体の各粗画分を分離した。この各粗画分を、逆層液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ-Ｃ１８、液層：０．１％ギ酸水溶液とアセトニトリル、アセトニトリルの比率が５％〜２０％までの濃度勾配）により２、３及び、４量体プロシアニジンの各画分を分離、濃縮乾固することにより、下記一般式（４）においてｎ＝０で表されるプロシアニジンの２量体（プロシアニジンＢ２）、下記一般式（４）においてｎ＝１で表されるプロシアニジンの３量体（プロシアニジンＣ１）、および、下記一般式（４）においてｎ＝２で表されるプロシアニジンの４量体（シナムタンニンＡ２）を分離精製した。
【００４５】
【化７】
【００４６】
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験＞
先に準備した、プロアントシアニジンの２量体であるプロシアニジンＢ２（ＰＡ２）、３量体であるプロシアニジンＣ１（ＰＡ３）、４量体であるシナムタンニンＡ２（ＰＡ４）を、それぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、これを用いて、３０μＭのプロアントシアニジン（ＰＡ）を含有するKrebs-Ringer-Hepes（ＫＲＨ）緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ4 ）を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、これらの調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有する緩衝液を調製し、それを陰性対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。また、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を１００ｎＭ含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、それを陽性対照として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。
【００４７】
その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。
【００４８】
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験結果＞
プロアントシアニジンによる糖取り込み促進活性（Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（見かけの糖取り込み活性）から、非特異的な取り込み量を引いた値（真の糖取り込み活性、図中では２ＤＧ uptakeと表示）の結果は、図１のグラフに示す通りである。図おいて、＊は、有意水準５％で有意差があったことを示しており、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに糖取り込み活性が認められたが、特に、ＰＡ３、ＰＡ４で有意に糖取り込み活性を促進していた。特に、ＰＡ４は、インスリンと同等の糖取り込み促進効果が認められた。なお、上記の手法に準じ、ＰＡ４の濃度依存的な糖取り込み促進効果も測定・評価した。その結果を図２のグラフに示す。図２より、ＰＡ４は濃度依存的に糖取り込みを促進し、１０μＭ以上で有意差が認められた。
【００４９】
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により細胞膜画分を調製した。このようにして得られた細胞膜画分のタンパク質量を測定し、その２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ブロッキング試薬であるBlocking one（ナカライテスク社製）でブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをTris-buffered saline-Tween〔ＴＢＳＴ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０. １５Ｍ ＮａＣｌ、０. ０５％ Ｔｗｅｅｎ２０〕溶液（ＴＢＳＴ溶液）で数回洗浄した後、１次抗体として抗ＧＬＵＴ４抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質（ロッシュ社製) と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、細胞膜移行したＧＬＵＴ４を検出した。
【００５０】
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験結果＞
ＧＬＵＴ４の細胞膜移行をウェスタンブロット法により確認した結果は、図３に示す通りである。図３より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用が認められたが、特に糖取り込み促進作用の高かったＰＡ３、ＰＡ４は、細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用も高いことを示した。また、３０μＭＰＡ４によるＧＬＵＴ４の存在量増加は、インスリンによるＧＬＵＴ４の存在量増加と同程度であった。このことから、特に、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＧＬＵＴ４の活性化剤としての作用に優れていることがわかる。
【００５１】
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の作用機構の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により全タンパク質画分を得た。得られた全タンパク質画分のタンパク質量を測定し、その２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Blocking oneでブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で数回洗浄した後、１次抗体として抗ｐ−Ａｋｔ抗体、ｐ−ＡＭＰＫ抗体またはＡＭＰＫ抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した１次抗体に対応した抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、それぞれのタンパク質のリン酸化および発現量を検出した。
【００５２】
つぎに、ＡＭＰＫの阻害剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（Ｓｉｇｍａ社製）を、ＤＭＳＯに溶解して、３０μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃを含有するＫＲＨ緩衝液を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、上記調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で３０分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、この緩衝液を上記Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ含有緩衝液に代えて用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、ＤＭＳＯ、インスリン、ＡＭＰＫの活性化剤である５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、ＰＡ４のいずれかを添加した。なお、上記ＤＭＳＯは、その濃度が０．１％ｖ／ｖとなるように添加したものであり、上記インスリンは、その濃度が１００ｎＭとなるように添加したものであり、上記ＡＩＣＡＲは、その濃度が５００μＭとなるように添加したものであり、上記ＰＡ４は、ＤＭＳＯに溶解させ、ＰＡ４の終濃度が１０μＭとなるように添加したものである。
【００５３】
続いて、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。
【００５４】
＜ＰＡの作用機構の確認試験結果＞
タンパク質のリン酸化および発現量をウェスタンブロット法により確認した結果は図４に示す通りである。図より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに（特にＰＡ４）、ＡＭＰＫのリン酸化を促進していたが、インスリンのように、Ａｋｔのリン酸化には影響を及ぼしていなかった。また、図５のグラフに示すように、ＡＭＰＫの阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）を作用させた条件下でのＰＡ４の糖取り込み活性を測定した結果、ＡＭＰＫの活性化剤であるＡＩＣＡＲと同様、上記阻害剤によりＰＡ４の糖取り込み活性が抑制されたことから、ＰＡ４はＡＭＰＫを介して糖取り込みを促進することを示した。このことから、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＡＭＰＫの活性化剤としての作用を奏することがわかる。
【実施例２】
【００５５】
〔筋管細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用の筋管細胞の作製＞
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Dulbecco’s modified eagle’s medium, high glucose、ＳＩＧＭＡ社製）を用い、ＣＯ2 インキュベーター内（３７℃、ＣＯ2 濃度５％）で培養した。上記細胞が８０％コンフルエントになったところで継代し、ついで、その培養皿から培地を除去し、２％ＨＳ（ウマ血清、ＳＩＧＭＡ社製）含有のＤＭＥＭ培地（分化用培地）に交換した。その２日後、上記分化用培地を再度交換し、さらに２日後、同様に培地交換し、１〜２日培養した。このようにして得られた、分化後５日目あるいは６日目の筋管細胞を、実施例２における後記の各試験に使用した。
【００５６】
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験＞
上記筋管細胞の培地を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換し、約３時間培養した。これを、２４穴組織培養プレートの各ウェル内に１ｍＬずつ入れた。つぎに、実施例１で使用したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを上記培養プレートの各ウェル内の培地に添加した（ＰＡ濃度１０μＭ）。また、対照となる培地には、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯのみを添加した。そして、これら各成分の存在下、筋管細胞を１０分間培養した。その後、溶解バッファー（50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 % Triton X-100, 2 mM sodium metavanadate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and a protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ）中に細胞を回収し、軽く混合した後、遠心処理に供し、上清を回収した。このようにして回収した上清中のタンパク質についてウエスタンブロットで解析し、ＡＭＰＫの活性を調べた。ウェスタンブロットでは、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα（Thr172）抗体（Phospho-AMPKα antibody ）（Cell Signaling社製）、ＡＭＰＫα抗体を使用し、二次抗体として、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ抗体（Cell Signaling社製）を使用した。
【００５７】
また、得られたタンパク質の発現強度の測定のために化学発光試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により発光させて、その強度を検出し（ＬＡＳ−３０００、富士フィルム社製）、Gauge Ver 3.0 Densitograph Software （富士フィルム社製）により定量した。それぞれの定量値を元にしてｐ−ＡＭＰＫαの発現強度をＡＭＰＫαの発現強度で除して、コントロール（０. １％ＤＭＳＯ）に対する上昇率で表した。これにより、上記プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）を測定した。
【００５８】
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験結果＞
ウェスタンブロット法によるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果は、図６に示す通りである。また、プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の結果は、図７のグラフに示す通りである。図７の結果より、ＰＡ２投与群よりもＰＡ３投与群の方が、ＰＡ３投与群よりもＰＡ４投与群の方が、ＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が大きかった。したがって、ＰＡは重合度が高いものほどＡＭＰＫ活性化作用が強いことが示唆された。
【００５９】
また、上記図７の結果より、ＡＭＰＫ活性化作用が強いと予想されるＰＡ４に着目し、ＰＡ４投与によるＡＭＰＫ活性化レベルの経時変化、さらに、それに伴うアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化について検討した。図８は、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図９のグラフは、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を示したものである。また、図１０は、上記と同様の試験を５０μＭ ＰＡ４投与群に対しても行い、上記１０μＭ ＰＡ４投与群結果とともに、Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１１のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を併記したものである。さらに、先のＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を検討するに際し、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα抗体、ＡＭＰＫα抗体に代えて、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）抗体、ホスホ−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(Ser79) （Ｐ−ＡＣＣ）抗体（Cell Signaling社製）を用いる以外は、上記「筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験」と同様の試験を、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群に対して行った。そして、図１２は、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＣＣおよびＡＣＣの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１３のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を併記したものである。
【００６０】
以上の結果から、ＰＡ４投与直後から筋管細胞のＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が見られ、投与から３時間が経過してもＡＭＰＫの活性化が持続されていた。また、ＰＡ４投与直後のものにはＡＣＣリン酸化レベルの増大が確認された。この結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになった。なお、ＡＭＰＫは主に赤筋や肝臓に発現しており、これが活性化されるとＡＣＣのリン酸化（不活性化）を介してミトコンドリアでの脂肪酸酸化が促進されることが知られている。
【００６１】
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験＞
上記作製した試験用の筋管細胞（分化後５日目あるいは６日目の細胞を筋管細胞）を使用し、ＰＡ４投与の約３時間前に培地を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換した。所定の濃度の各成分存在下、筋管細胞を５時間さらに培養した。
【００６２】
（核酸の回収）
ＰＡ４投与の５時間後、培地を取り除き、細胞を、phosphate buffered saline （ＰＢＳ）で洗浄した後に、１ウェルあたり１ｍＬのＱＩＡＺＯＬ（キアゲン社製）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収し、全量を滅菌済みの１．５ｍＬ容チューブに加えてヴォルテックスミキサーでよく混合して５分間室温で静置した。その後、２００μＬのクロロホルムを加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した後、そのまま室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、その水層を、新しい１. ５ｍＬ容チューブに回収した。回収した液に同量のイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を取り除いた。さらに１ｍＬの冷７０％エタノールを加えてよく混合した後、１２０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。そのまま沈殿を室温で５分間風乾させた。次に、沈殿にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水（ＤＥＰＣ処理水）４０μＬを加えてピペッティングを行い、よく混合した。分光光度計（NanoDrop ND-1000）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を定量した。
【００６３】
（ｃＤＮＡ合成）
アプライドバイオシステムズ社のHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて行った。
得られたＲＮＡ１μｇを含む１３．２μＬのＤＥＰＣ処理水に、２μｍＬの10×reverse transcription buffer（アプライドバイオシステムズ社製）、０．８μＬの１００ｍＭ 25×dNTP Mixture （アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの２０Ｕ／μＬ ribonuclease inhibitor（アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの５０Ｕ／μＬ MuLV reverse transcriptase（アプライドバイオシステムズ社製）、２μＬの５０μＭ 10×random primer （アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２０μＬ）、雰囲気温度を所定の条件に制御（２５℃で１０分間、次いで３７℃で１２０分間、次いで８５℃で５秒間）することにより反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
【００６４】
（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量）
得られたｃＤＮＡ１μｇを含む１０．７５μＬのＤＥＰＣ処理水に、１２．５μＬのTakara premix Ex Taq（タカラバイオ社製）、０．５μＬのROX reference dye （タカラバイオ社製）及び１．２５μＬのTaqman(R) Gene expression Assays〔Peroxisome proliferator activated receptor (PPARα) (Assay ID : Mm00440839#m1) 、Ribosomal protein , large P2(Assay ID : Mm00782638#s1)を含有〕（アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２５μＬ）、7300 real-time PCRシステム（アプライドバイオシステムズ社製）のプロトコールに従ってreal-time PCR による遺伝子発現量測定を行なった。ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量と内因性コントロールとしてRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量を測定し、ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量をRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量で割って補正した値をＰＰＡＲαの発現量とした。
【００６５】
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験結果＞
β１サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されるとＡＣＣの不活性化を介して脂肪酸酸化が促進される。これに対しβ２サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されると、活性化ＡＭＰＫは核内に移行してＰＰＡＲαの遺伝子発現を増大することでぺルオキシソームにおける脂肪酸酸化が促進される。これまでの結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになったが、それとは別にＡＭＰＫの下流因子として調整を受けるＰＰＡＲαの遺伝子発現がＰＡの投与によってどのような変化を受けるか検討した。その結果を、図１４に示す。ＰＡ４投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＰＰＡＲαの遺伝子発現が濃度依存的に上昇しており、５０μＭ ＰＡ４投与群においては有意な差が確認された。したがって、ＰＡ４は筋組織において、ＰＰＡＲαの発現や、ＡＣＣのリン酸化などの脂肪代謝関連酵素の活性化により、脂肪代謝が促進されることがわかる。
【実施例３】
【００６６】
〔ＫＫ−Ａy マウスへ黒大豆抽出物を摂取させた時の血清グルコース濃度、血清トリグリセリド濃度低下作用〕
＜実験動物および飼育方法＞
［実験動物］
ＫＫ−Ａy マウス（２型糖尿病モデルマウス）の雄（４週齢）
室温２４℃、明暗調製８〜２０時、給水ビンによる給水で飼育を行った。
［投与物質］
黒大豆抽出成分の市販品であるクロノケア（ＢＥ）（フジッコ社製）
クロノケア（ＢＥ）中、プロアントシアニジン（ＰＡ）含量５９％、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）含量９％。
［試験食の調製］
通常飼料としては、日本クレア社製の配合飼料粉末ＣＥ−２を使用した。そして、上記粉末ＣＥ−２と、ＢＥを混合し、２．２％ＢＥ食（Ｃ３Ｇ含量として０．２％になるように計算された添加量）を調製した。
［飼育スケジュール］
(i) ４週齢マウスを購入し飼育を開始した。
(ii)予備飼育４日間飼料は、粉末ＣＥ−２（日本クレア配合飼料）を摂食させた。
(iii) 予備飼育後、体重、血糖値の平均値がほぼ等しくなるようにＣｏｎｔｒｏｌ群、ＢＦ群（ｎ＝８）に分け、Ｃｏｎｔｒｏl 群にはＣＥ−２食、ＢＥ群にはＣＥ−２食＋２．２％ＢＥ食を自由摂取させた（試験食摂食開始を試験０週目とした）。
(iv)１週間毎に体重測定・採血を行い、血清グルコース濃度を測定した。
(v) 試験６週目にマウスを屠殺した。血液はエッペンチューブに採取し、４℃, ５０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を分離し、−８０℃で冷凍保存した。
【００６７】
＜１週間毎の採血方法＞
(i) 採血日の午前９時から１時間絶食させた。
(ii)尾静脈を剃刀で切りエッぺンチューブに血液を取り、数分間室温に置いた後氷中に置いた。
(iii) ４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。
(iv)上清（血清）を採取して別のエッペンチューブに移し氷中に置いた。
(v) 得られた血清を用いて血糖値を測定した。
【００６８】
＜血清グルコース濃度の測定＞
１週間毎の採血から採取した上清（血清）のグルコース濃度を、グルコースＣII−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、測定した。
【００６９】
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定＞ 試験６週目のマウスを検体として、血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度の測定を行った。なお、血清トリグリセライド濃度は、トリグリセライドＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清総コレステロール（血中総コレステロール）濃度は、コレステロールＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清インスリン（血中インスリン）濃度は、モリナガインスリン測定キット（森永生科学研究所社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。
【００７０】
＜組織における特定タンパク質の定量＞
屠殺したマウスの解剖時に採取した肝臓、骨格筋におけるＡＭＰＫα, およびＰ−ＡＭＰＫα(Thr 172) のタンパク量の定量を行った。また、骨格筋においては、Whole lysate (細胞全体からの抽出液), Plasma membrane fraction(細胞膜画分） , Cytosol fraction （細胞膜画分以外の細胞質由来抽出液）のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。詳しくは、採取した組織をタンパク抽出用バッファでホモゲナイズし、４℃, １８０００×ｇ, ３０分間遠心分離して得られた上清を採取し、ウェスタンブロッティングにより各タンパク質を検出した。Plasma membrane fractionの採取はNishiumi&Ashida の方法（ＢＢＢ ２００７，７１ (９)2343-2346）に従った。Ｇｌｕｔ４に対する抗体はCell Signaling社の製品を用いた。二次抗体としてAnti-rabbit IgG, HRP-linked antibody（Cell Signaling）を使用した。
【００７１】
〔実施例３の試験結果〕
【００７２】
＜食餌摂取量、体重、血清グルコース濃度の１週間毎の推移＞
図１５および図１６のグラフより、食餌摂取量、体重は、飼育期間を通じて両群の間に有意な差は認められなかった。しかしながら、図１７のグラフより、血清グルコース濃度は、試験４週目以降において、ＢＥ投与群での有意な低下が認められた。
【００７３】
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定結果＞
図１８のグラフより、血清トリグリセライド濃度に関しては、ＢＥ群の血清トリグリセライド濃度は有意に低下した。また、図１９のグラフより、血清総コレステロール濃度は、ＢＥ群において、Ｃｏｎｔｒｏl 群と比べて有意な低下が確認された。また、図２０のグラフより、血清インスリン濃度に関しては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＢＥ群の血清インスリン濃度が有意に低下していた。
【００７４】
＜組織における特定タンパク質の定量結果＞
ＢＥ摂取による血糖値上昇抑制作用は、ＡＭＰＫの活性化、およびインスリン感受性の改善を介したＧｌｕｔ４のトランスロケーションの増大がその一端を担っているのではないかと考え、先に示したように、Whole lysate (Whole) , Plasma membrane fraction (PM), Cytosol fraction (Cytosol)の３種のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。その結果、図２１のグラフに示すように、ＢＥ摂取によるＡＭＰＫ活性化レベル（ＡＭＰＫαＴｈｒ１７２リン酸化）の有意な上昇が確認された。また、図２２のグラフに示すように、Whole lysate (Whole), Cytosol fraction (Cytosol)においては両群の間でＧｌｕｔ４の発現量に差が見られなかったが、Plasma membrane fraction(PM)においては、ＢＥ群のＧｌｕｔ４の発現が有意に上昇していた。
【００７５】
以上より、上記各実施例において、ＰＡ３（プロシアニジンＣ１）およびＰＡ４（シナムタンニンＡ２）が、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことが確認された。なお、前記一般式（４）のプロアントシアニジンにおいて、そのｎの値が３〜６の整数であるものにおいても、上記と同様、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことを実験により確認している。また、これらのプロアントシアニジンほどではないが、前記一般式（１）で表される本発明に規定のプロアントシアニジンに該当するものであれば、上記ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用において有意な効果が認められることを実験により確認している。また、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用は、肥満や糖尿病等の予防・改善と密接に関与することから、本実施例品である上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、上記各作用を発揮することができる薬剤は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，または内臓脂肪蓄積抑制剤として使用しても、有利な作用効果が認められると推測される。また、これらの薬剤は、実質的に何ら副作用を示すことがないことから、飲食品に含有させることもできる。なお、前記一般式（４）に示すプロアントシアニジンであっても、ｎの値が７以上の整数のものでは、上記作用効果において有意な結果が得られていない。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の薬剤は、特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を有するものであり、実質的に何ら副作用を示すことなく、これらの作用が効果的になされるため、安全性に優れており、産業上有用である。また、これらの作用に基づき、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、内臓脂肪蓄積抑制剤等に使用することも可能である。また、上記薬剤を含有する飲食品は、あらゆる飲食品に適用し得るため、飲食品に機能的付加価値をつける意味でも、産業上有用である。さらに、家畜・ペット用飼料等への応用も可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）活性化剤、ＧＬＵＴ４（インスリン依存性糖輸送担体[glucose transporter 4] ）活性化剤、およびそれらを用いた医薬品・飲食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肥満の予防および治療は、健康の維持・増進において非常に重要な課題である。肥満は、２型糖尿病、高血圧症、高脂血症等を引き起こす。さらにこれらの疾病は、脳卒中や虚血性心疾患等の基礎疾患でもある。現在、これらの疾病は、肥満によって引き起こされるインスリン抵抗性を基盤とする、一連の代謝異常状態と解されている。近年の分子生物学的研究により、肥満・インスリン抵抗性に関与する様々な因子の存在が明らかになりつつある。
【０００３】
生体内の糖・脂質代謝に大きく関与する脂肪細胞には、主にＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４といった輸送担体（glucose transporter ：ＧＬＵＴ）が発現している。その中でも、特にＧＬＵＴ４は、脂肪細胞の膜上におけるグルコースの取込み活性における主要な役割を果たしていることが知られている。ＧＬＵＴ４は、インスリン感受型ＧＬＵＴと呼ばれ、通常は脂肪細胞及び筋肉細胞における細胞内小胞に存在し、インスリンの刺激を受けると、細胞膜上に移行（トランスロケーション）し、グルコースを取り込める状態とする。ＧＬＵＴ４のトランスロケーションは、インスリンが受容体に結合し、受容体のβサブユニットが自己リン酸化することが情報伝達の開始となり、その後インスリン受容体基質（ＩＲＳ）のリン酸化、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化、Akt ／Protein Kinase Bの活性化（およびプロテインキナーゼＣの活性化）という経路を介して細胞内の小胞体から細胞膜へのエキソサイトーシスにより、移行が完了する（特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、内臓脂肪細胞に蓄積された中性脂肪が分解されて放出される遊離脂肪酸や、内臓脂肪細胞から分泌されるＴＮＦ−αによる、ＰＩ３−キナーゼ活性の抑制が生じると、ＧＬＵＴ４の細胞膜表面への移行が抑制され、上記のようなインスリンによるグルコース代謝に異常が生じ、糖尿病を発症するおそれがある。糖尿病患者数は、肥満の増加を反映して増える傾向にある。そして、糖尿病は、いったん発症するとなかなか完治しづらいばかりか、合併症を発症させるおそれもある。具体的には、プロテインキナーゼＣ等の酵素の働きが異常に亢進して細胞機能が低下したり、高血糖の持続により酵素などの蛋白質にグルコースが化学結合して酵素機能が低下したり、高血糖による代謝障害のためにソルビトール（糖アルコール）が細胞内に蓄積して細胞障害を起こし、それにより、細小血管の細胞や血液細胞に異常が生じ、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害といった合併症を発症する。
【０００５】
一方、インスリンによらないグルコース代謝方法として、筋肉や肝臓にあるＡＭＰＫ（アデノシン一リン酸活性型プロテインキナーゼ[AMP-activated protein kinase]）を活性化させる方法がある。ＡＭＰＫは、細胞での糖や脂質代謝の流れを調節する酵素であり、ＧＬＵＴ４を細胞表面に移行させて、筋肉がエネルギーを作るためのグルコースを取り込ませたり、脂肪を燃焼させたりする働きがある。
【０００６】
しかし、上記のようにＡＭＰＫを活性化させるには、運動による筋収縮が必要である。そこで、近年、薬剤投与によりＡＭＰＫを活性化させ、それによる「運動疑似効果」を通じて、糖代謝や高脂血症を改善し抗動脈硬化作用を発揮させる手法が検討されている。このような薬剤としては、例えば、メトホルミン（ビグアナイド薬）、チアゾリジン誘導体等が有用であることが知られている。
【０００７】
ところが、これらの薬剤は、副作用を伴うものも多く、そのため、日常的な飲食品に含有させることが好ましいものは少ないのが実情である。そのようななか、近年、葡萄の葉又はその抽出物を有効成分とするＡＭＰＫ活性化剤（特許文献２）、ローズマリーやセージの抽出物を含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献３）、グレープフルーツ由来のヌートカトンを含有するＡＭＰＫ活性化剤（特許文献４）といったものも提案されており、食品として従来から用いられている植物を由来とするものであることから、日常的な飲食品への適用においても安全性が高いと考えられる（特許文献２〜４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１９２９公報
【特許文献２】特開２００８−２５５０４８公報
【特許文献３】特開２００８−２０８０８１公報
【特許文献４】特開２００７−６３２４１公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来からある植物由来のＡＭＰＫ活性化剤は、実際には、ＡＭＰＫ活性作用はあまり高くなく、化学薬品であるメトホルミン等の性能に比べると、かなり劣る。そのため、更なる研究による活性能の向上が期待されている。
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果が得られる薬剤、およびこれら各効果に伴う糖尿病・肥満等の改善効果等が期待できる医薬品・飲食品の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的を達成するために、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＡＭＰＫ活性化剤を第１の要旨とする。
【化１】
【００１２】
また、本発明は、下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有するＧＬＵＴ４活性化剤を第２の要旨とする。
【化２】
【００１３】
また、本発明は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤のいずれか一つの医薬品であって、上記第１の要旨の薬剤や第２の要旨の薬剤を含有する医薬品を第３の要旨とする。
【００１４】
また、本発明は、上記第１〜第３の要旨の薬剤を含有する飲食品を第４の要旨とする。
【００１５】
すなわち、本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねた。その研究の過程で、各種の生理作用が報告されているプロアントシアニジンに着目した。プロアントシアニジンは、エピカテキン（またはエピガロカテキン）の重合体であり、２量体，３量体，４量体，５量体等の多重合体が存在し、さらに、これらには、結合位置の違うものや、各種の立体異性体も存在する。そして、これらは、それぞれ生理作用も異なるものである。本発明者らは、このようなプロアントシアニジンに関する研究を更に進めた。その結果、ＡＭＰＫの活性効果，ＧＬＵＴ４の活性効果において、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として用いたとき、有利な効果が認められることを、実験により新たに突き止めた。なお、ＧＬＵＴ４の活性化は、ＡＭＰＫの活性化によりなされる以外にも、インスリン情報伝達経路の全部または一部によりなされる場合も含まれる。また、これらの作用効果を発揮すると、それに関連し、特に、肥満・糖尿病等の改善効果等も得られることから、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途にも適用することができることを見いだした。さらに、上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンは、副作用を生じることがないことから、安全性が高く、日常的な飲食品に含有させるのに好適なものとなり得ることから、所期の目的が達成できることを見いだし、本発明に到達した。
【発明の効果】
【００１６】
以上のように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、上記一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。これにより、上記薬剤は、それぞれ、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病等の予防・改善効果を発揮することができる。
【００１７】
特に、上記各作用効果を良好に発揮することができると、肥満，糖尿病等の改善効果等に優れた効果を発揮することができる。したがって、上記薬剤は、特に、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に有利に適用することができる。
【００１８】
そして、上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分する上記薬剤を含有する飲食品とする場合、このものを通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、ＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果、およびそれに伴う肥満・糖尿病等の改善効果等が得られるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プロアントシアニジンの糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図２】ＰＡ４（プロシアニジン４量体であるシナムタンニンＡ２）の糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図３】細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図４】プロアントシアニジンによるタンパク質のリン酸化および発現量の結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図５】ＡＭＰＫの活性阻害による、ＰＡ４等の糖取り込み促進活性を測定した結果を示すグラフ図である。
【図６】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図７】プロアントシアニジンのＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図８】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図９】ＰＡ４のＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１０】Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図１１】ＰＡ４のＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１２】Ｐ−ＡＣＣおよびＡＣＣの検出結果（ウェスタンブロット解析結果）写真である。
【図１３】ＰＡ４のＡＣＣリン酸化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図１４】ＰＡ４投与によるＰＰＡＲαの遺伝子発現量を測定した結果を示すグラフ図である。
【図１５】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、食餌摂取量の推移を示すグラフ図である。
【図１６】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、体重の推移を示すグラフ図である。
【図１７】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清グルコース濃度の推移を示すグラフ図である。
【図１８】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清トリグリセライド濃度を示すグラフ図である。
【図１９】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清総コレステロール濃度を示すグラフ図である。
【図２０】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、血清インスリン濃度を示すグラフ図である。
【図２１】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群における、ＡＭＰＫ活性化レベルを測定した結果を示すグラフ図である。
【図２２】黒大豆抽出成分摂食群と非摂食群の各組織におけるＧＬＵＴ４の発現量を測定した結果を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
つぎに、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
【００２１】
先に述べたように、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用を有するものである。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、下記の一般式（１）で表される特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＧＬＵＴ４活性作用を有するものである。これらの薬剤は、それぞれの用途においてその作用が有為に発揮できるよう、その作用を阻害する物質の不含化等が考慮されたものであり、また、それぞれの用途においてその作用が充分に発揮できるよう、有効成分であるプロアントシアニジンの含有割合等が規定されたものである。
【００２２】
【化３】
【００２３】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンのなかでも、特に、下記の一般式（１’）で表される特定構造のプロアントシアニジン（プロシアニジン）を有効成分として含有すると、他のプロアントシアニジンに比べ、極めて高いＡＭＰＫ活性効果、ＧＬＵＴ４活性効果が得られるようになるため、好ましい。
【００２４】
【化４】
【００２５】
そして、上記一般式（１’）において、ｎは、好ましくは、１，２または３であり、より好ましくは、１または２である。ｎ＝１のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（２）で表されるプロシアニジンＣ１を示す。また、ｎ＝２のとき、上記一般式（１’）は、下記の化学式（３）で表されるシナムタンニンＡ２を示す。
【００２６】
【化５】
【００２７】
【化６】
【００２８】
そして、上記のプロアントシアニジンは、自然界に存在する生物が保有または産生する組成物の中から精製し抽出したものであっても、エピカテキンやカテキンの重合促進等を行うことにより化学的に合成することによって調製したものであって、微生物などを利用する生物学的方法により得たものであってもよい。
【００２９】
上記特定構造のプロアントシアニジンは、植物では、黒大豆種皮、リンゴ、カカオ、ブドウ、シナモン、ムタンバ、サンザシ、ブニノキ、ゴレンシ、マザーワート、ケクロピア、コーラ（コーラナッツ）、茶等に多く含まれる。これらの植物に対する上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法としては、例えば、抽出溶媒に上記植物を浸漬することにより行われる。上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出溶媒としては、例えば、水や、メタノール, エタノール, イソプロパノール, ｎ−プロパノール, アセトン等の水溶性溶媒が用いられるが、特に、黒大豆種皮を原料とする場合、黒大豆種皮には１〜３０量体程度の各種プロアントシアニジンが含まれることから、高濃度の低級アルコールやアセトンで抽出すると、高重合度のプロアントシアニジンが混入してしまう。したがって、この場合、水や０．１〜３０％の含水エタノールが、所望のプロアントシアニジンを高純度で抽出することができるものとして好適に用いられる。また、上記抽出溶媒による抽出温度は、７０℃以下であることが、純度および安定性の点から好ましい。
【００３０】
そして、このようにして得られた抽出液から、所望のプロアントシアニジンを高純度で含有する画分を、吸着処理，樹脂精製処理，ゲル濾過処理，イオン交換処理，膜分離処理，塩析出処理等により抽出し、それを、乾燥、濃縮することにより、目的とするプロアントシアニジンを得ることができる。
【００３１】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、そのＡＭＰＫ活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤は、そのＧＬＵＴ４活性作用の有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジン含量が０．０１〜１００重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１００重量％の範囲である。
【００３２】
さらに、本発明のＡＭＰＫ活性化剤は、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。本発明のＧＬＵＴ４活性化剤も、その有効性の観点から、前記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量が１〜２０００ｍｇの範囲になるよう、その分量を設定することが好ましく、より好ましくは１０〜１０００ｍｇの範囲である。
【００３３】
また、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤には、前記特定構造のプロアントシアニジンとともに、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）を含有することにより、そのＡＭＰＫ活性効果およびＧＬＵＴ４活性効果をさらに向上させることができるため好ましい。なお、Ｃ３Ｇは、アントシアニンの一種であり、上記特定構造のプロアントシアニジンを抽出した各種植物にも多く含まれる物質である。そして、Ｃ３Ｇの抽出方法は、上記特定構造のプロアントシアニジンの抽出方法（分離精製方法）に準じる。
【００３４】
本発明のＡＭＰＫ活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。また、本発明のＧＬＵＴ４活性化剤におけるＣ３Ｇ含量は、その有効性の観点から、０．１〜４０重量％の範囲のものであることが好ましく、より好ましくは、１〜１０重量％の範囲である。
【００３５】
なお、本発明のＡＭＰＫ活性化剤およびＧＬＵＴ４活性化剤は、それらの作用効果を良好に発揮することにより、肥満・糖尿病等の予防・改善効果に優れた効果を発揮することができるため、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤といった医薬品の用途に適用する場合も、上記特定構造のプロアントシアニジンの含量および上記特定構造のプロアントシアニジンの一日の摂取量は、上記各薬剤に規定された割合に準じる。
【００３６】
また、本発明の上記各薬剤においては、先のプロアントシアニジン抽出物をそのまま直接使用してもよいが、一般的には、上記抽出物を、適当な液状担体に溶解あるいは分散させたり、適当な粉末担体に混合させたものを使用する。
【００３７】
薬理学的に許容される担体としては、例えば、固形製剤における賦形剤，滑沢剤，結合剤および崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤，溶解補助剤，懸濁化剤，等張化剤，緩衝剤および無痛化剤等があげられる。
【００３８】
また、本発明の薬剤は、その製剤化の際に、通常製剤化に用いられる各種の成分が任意に使用されるが、その例としては、例えば、デンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類等があげられる。
【００３９】
本発明の薬剤の剤型としては、例えば、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤等があげられる。
【００４０】
さらに、本発明の薬剤は、それを飲食品に関与させた形態としても提供することができる。上記飲食品としては、例えば、健康食品（タブレット、粉末、顆粒、濃縮液体）、清涼飲料、特定保健用食品、ドリンク、お茶、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、ワイン、焼酎、日本酒、ドレッシング、煮豆、豆腐、納豆、豆乳、煎り豆、乾燥豆、味噌等があげられる。そして、これらの飲食品を、通常の飲食品と同様に継続して飲食することにより、肥満抑制効果が得られるようになる。
【００４１】
本発明の薬剤は、副作用を生じることなく、人体にやさしく、ＡＭＰＫ活性効果，ＧＬＵＴ４活性効果，およびこれに関連する各種疾病（特に、肥満や糖尿病）等の予防・改善効果を発揮することができる。また、ヒトのみでなく、ペットや家畜等の動物においても上記効果が得られるものであり、その投与量は、投与対象とする生物の違い、投与される者の性別、体重、年齢等の条件に応じて適宜設定される。そして、上記のように、本発明の薬剤は、ペットや家畜等の動物においても肥満抑制効果等が得られるものであることから、ペットフードや飼料に関与させた形態としても提供することもできる。
【００４２】
つぎに、実施例について説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
〔Ｌ６骨格筋細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用のＬ６骨格筋細胞の作製＞
Ｌ６筋芽細胞の濃度が２×１０4 ／ｍＬになるようにＭＥＭ培地〔１０％ｖ／ｖ牛胎児血清（ＦＢＳ）含有〕で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、２４穴組織培養プレートに１穴当たり５００μＬ播種し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を２日間培養した。上記細胞がコンフルエントになった後、培地をＭＥＭ培地（２％ｖ／ｖＦＢＳ含有）に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記細胞を５日間培養することにより、Ｌ６骨格筋細胞を作製した。そして、さらに培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記の糖取り込み測定等に用いた。一方、Ｌ６筋芽細胞の濃度が３×１０4 ／ｍＬとなるようにＭＥＭ培地（１０％ｖ／ｖＦＢＳ含有）で調製して得られたＬ６筋芽細胞懸濁液を、６０ｍｍ培養皿に１枚当たり４ｍＬ播種し、上記と同様の条件で骨格筋細胞を作製した後、培地をＭＥＭ培地〔０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有〕に変更し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で上記Ｌ６骨格筋細胞を１８時間培養し、この細胞を、実施例１における後記のウェスタンブロット解析に用いた。
【００４４】
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の調製＞
黒大豆種皮抽出物（製品名：クロノケア、フジッコ社製）を４５％メタノール水溶液に溶解し、セファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を担体としたゲル濾過カラムに通してプロシアニジンを吸着させ、１．２倍カラム容量の４５％メタノール水溶液、１．２倍カラム容量の５５％メタノール水溶液の順に洗浄した。その後、２倍カラム容量の７０％アセトン水溶液を通液、回収、濃縮乾層することによりプロシアニジン粗画分を得た。この粗画分は、酢酸メチル/アセトン＝８０/２０（ｖ/ｖ）溶液に溶解し、濾過操作により沈殿を除去し、再度濃縮乾燥することによりプロシアニジン精製物を得た。本プロシアニジン精製物を４５％メタノールに溶解し、再度セファデックスＬＨ−２０カラムに供し、メタノール濃度４５％から７５％までの濃度勾配によりプロシアニジン２、３及び４量体の各粗画分を分離した。この各粗画分を、逆層液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＳ-Ｃ１８、液層：０．１％ギ酸水溶液とアセトニトリル、アセトニトリルの比率が５％〜２０％までの濃度勾配）により２、３及び、４量体プロシアニジンの各画分を分離、濃縮乾固することにより、下記一般式（４）においてｎ＝０で表されるプロシアニジンの２量体（プロシアニジンＢ２）、下記一般式（４）においてｎ＝１で表されるプロシアニジンの３量体（プロシアニジンＣ１）、および、下記一般式（４）においてｎ＝２で表されるプロシアニジンの４量体（シナムタンニンＡ２）を分離精製した。
【００４５】
【化７】
【００４６】
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験＞
先に準備した、プロアントシアニジンの２量体であるプロシアニジンＢ２（ＰＡ２）、３量体であるプロシアニジンＣ１（ＰＡ３）、４量体であるシナムタンニンＡ２（ＰＡ４）を、それぞれ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、これを用いて、３０μＭのプロアントシアニジン（ＰＡ）を含有するKrebs-Ringer-Hepes（ＫＲＨ）緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１．８５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ4 ）を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、これらの調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有する緩衝液を調製し、それを陰性対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。また、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）を１００ｎＭ含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、それを陽性対照として用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。
【００４７】
その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。
【００４８】
＜Ｌ６骨格筋細胞における糖取り込み促進作用の確認試験結果＞
プロアントシアニジンによる糖取り込み促進活性（Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（見かけの糖取り込み活性）から、非特異的な取り込み量を引いた値（真の糖取り込み活性、図中では２ＤＧ uptakeと表示）の結果は、図１のグラフに示す通りである。図おいて、＊は、有意水準５％で有意差があったことを示しており、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに糖取り込み活性が認められたが、特に、ＰＡ３、ＰＡ４で有意に糖取り込み活性を促進していた。特に、ＰＡ４は、インスリンと同等の糖取り込み促進効果が認められた。なお、上記の手法に準じ、ＰＡ４の濃度依存的な糖取り込み促進効果も測定・評価した。その結果を図２のグラフに示す。図２より、ＰＡ４は濃度依存的に糖取り込みを促進し、１０μＭ以上で有意差が認められた。
【００４９】
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により細胞膜画分を調製した。このようにして得られた細胞膜画分のタンパク質量を測定し、その２μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ブロッキング試薬であるBlocking one（ナカライテスク社製）でブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをTris-buffered saline-Tween〔ＴＢＳＴ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０. １５Ｍ ＮａＣｌ、０. ０５％ Ｔｗｅｅｎ２０〕溶液（ＴＢＳＴ溶液）で数回洗浄した後、１次抗体として抗ＧＬＵＴ４抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した抗ヤギＩｇＧ抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質（ロッシュ社製) と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、細胞膜移行したＧＬＵＴ４を検出した。
【００５０】
＜ＧＬＵＴ４の細胞膜移行の確認試験結果＞
ＧＬＵＴ４の細胞膜移行をウェスタンブロット法により確認した結果は、図３に示す通りである。図３より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用が認められたが、特に糖取り込み促進作用の高かったＰＡ３、ＰＡ４は、細胞膜画分におけるＧＬＵＴ４の存在量を増加させる作用も高いことを示した。また、３０μＭＰＡ４によるＧＬＵＴ４の存在量増加は、インスリンによるＧＬＵＴ４の存在量増加と同程度であった。このことから、特に、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＧＬＵＴ４の活性化剤としての作用に優れていることがわかる。
【００５１】
＜プロアントシアニジン（ＰＡ）の作用機構の確認試験＞
先に準備したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを用いて、１０μＭまたは３０μＭのＰＡを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）を調製した。また、対照として、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）、および、インスリン（１００ｎＭ）を含有するＭＥＭ培地（０．２％ｗ／ｖＢＳＡ含有）も調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞の培養皿にこれらの調製培地を１枚当たり４ｍＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で１５分培養した。その後、細胞を、ＫＲＨ緩衝液により培養皿１枚当たり１ｍＬで２回洗浄し、所定の方法（非特許文献である、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 71, 9, 2343-2346, 2007 を参照）により全タンパク質画分を得た。得られた全タンパク質画分のタンパク質量を測定し、その２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離した。分離後のタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、Blocking oneでブロッキングした。ＰＶＤＦメンブレンをＴＢＳＴ溶液で数回洗浄した後、１次抗体として抗ｐ−Ａｋｔ抗体、ｐ−ＡＭＰＫ抗体またはＡＭＰＫ抗体を、２次抗体としてhorseradish peroxidase標識した１次抗体に対応した抗体を反応させた。メンブレン上の免疫複合体をＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング基質と反応させ、Ｘ線フィルムに露光させることにより、それぞれのタンパク質のリン酸化および発現量を検出した。
【００５２】
つぎに、ＡＭＰＫの阻害剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（Ｓｉｇｍａ社製）を、ＤＭＳＯに溶解して、３０μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃを含有するＫＲＨ緩衝液を調製した。そして、先に準備したＬ６骨格筋細胞が入った２４穴組織培養プレートに、上記調製緩衝液を１穴当たり３００μＬ添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で３０分培養した。また、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯを含有するＫＲＨ緩衝液を調製し、この緩衝液を上記Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ含有緩衝液に代えて用い、上記と同様の手法でＬ６骨格筋細胞の培養を行った。その後、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、ＤＭＳＯ、インスリン、ＡＭＰＫの活性化剤である５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、ＰＡ４のいずれかを添加した。なお、上記ＤＭＳＯは、その濃度が０．１％ｖ／ｖとなるように添加したものであり、上記インスリンは、その濃度が１００ｎＭとなるように添加したものであり、上記ＡＩＣＡＲは、その濃度が５００μＭとなるように添加したものであり、上記ＰＡ４は、ＤＭＳＯに溶解させ、ＰＡ４の終濃度が１０μＭとなるように添加したものである。
【００５３】
続いて、上記組織培養プレートの各ウェル（穴）内の培地に、［ 3Ｈ］で標識された２−デオキシグルコース（２ＤＧ）を、終濃度として６．５ｍＭ（１８．５μＣｉ）となるように添加し、３７℃の５％炭酸ガス培養器で５分間、Ｌ６骨格筋細胞を培養した。このようにして培養したＬ６骨格筋細胞を、氷冷したＫＲＨで４回洗浄し、細胞内に取り込まれなかった２ＤＧを除去した。続いて、Ｌ６骨格筋細胞から完全にＫＲＨを取り除き、この細胞を０．０５Ｎ ＮａＯＨ２５０μＬで可溶化して、それをシンチレーションカクテルの入ったバイアルビンに回収した。さらに組織培養プレートの各ウェル（穴）を、ＫＲＨ２００μＬで２回洗浄して、この洗液も合わせてバイアルビンに回収した。このようにして回収して得られた液体を、液体シンチレーションシステムＬＳＣ−５０００シリーズ（アロカ社製) を用いて分析し、Ｌ６骨格筋細胞内に取り込まれた２ＤＧに標識された［ 3Ｈ］の放射活性（糖取り込み活性）を測定した。なお、非特異的な取り込み量は、グルコース輸送の阻害剤であるサイトカラシンＢを用いて、上記回収した液体を処理（２０μＭ サイトカラシンＢで１５分間処理）した後、上記と同様の方法で取り込み活性を測定し、その値を「非特異的な取り込み量」とした。
【００５４】
＜ＰＡの作用機構の確認試験結果＞
タンパク質のリン酸化および発現量をウェスタンブロット法により確認した結果は図４に示す通りである。図より、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４ともに（特にＰＡ４）、ＡＭＰＫのリン酸化を促進していたが、インスリンのように、Ａｋｔのリン酸化には影響を及ぼしていなかった。また、図５のグラフに示すように、ＡＭＰＫの阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ）を作用させた条件下でのＰＡ４の糖取り込み活性を測定した結果、ＡＭＰＫの活性化剤であるＡＩＣＡＲと同様、上記阻害剤によりＰＡ４の糖取り込み活性が抑制されたことから、ＰＡ４はＡＭＰＫを介して糖取り込みを促進することを示した。このことから、ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４は、ＡＭＰＫの活性化剤としての作用を奏することがわかる。
【実施例２】
【００５５】
〔筋管細胞におけるプロアントシアニジンの活性実験〕
＜試験用の筋管細胞の作製＞
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Dulbecco’s modified eagle’s medium, high glucose、ＳＩＧＭＡ社製）を用い、ＣＯ2 インキュベーター内（３７℃、ＣＯ2 濃度５％）で培養した。上記細胞が８０％コンフルエントになったところで継代し、ついで、その培養皿から培地を除去し、２％ＨＳ（ウマ血清、ＳＩＧＭＡ社製）含有のＤＭＥＭ培地（分化用培地）に交換した。その２日後、上記分化用培地を再度交換し、さらに２日後、同様に培地交換し、１〜２日培養した。このようにして得られた、分化後５日目あるいは６日目の筋管細胞を、実施例２における後記の各試験に使用した。
【００５６】
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験＞
上記筋管細胞の培地を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換し、約３時間培養した。これを、２４穴組織培養プレートの各ウェル内に１ｍＬずつ入れた。つぎに、実施例１で使用したＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ４を、それぞれ、ＤＭＳＯに溶解し、これを上記培養プレートの各ウェル内の培地に添加した（ＰＡ濃度１０μＭ）。また、対照となる培地には、０．１％ｖ／ｖＤＭＳＯのみを添加した。そして、これら各成分の存在下、筋管細胞を１０分間培養した。その後、溶解バッファー（50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 10 mM sodium pyrophosphate, 1 % Triton X-100, 2 mM sodium metavanadate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride and a protease inhibitor cocktail (P8340, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) ）中に細胞を回収し、軽く混合した後、遠心処理に供し、上清を回収した。このようにして回収した上清中のタンパク質についてウエスタンブロットで解析し、ＡＭＰＫの活性を調べた。ウェスタンブロットでは、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα（Thr172）抗体（Phospho-AMPKα antibody ）（Cell Signaling社製）、ＡＭＰＫα抗体を使用し、二次抗体として、Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ、ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ抗体（Cell Signaling社製）を使用した。
【００５７】
また、得られたタンパク質の発現強度の測定のために化学発光試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により発光させて、その強度を検出し（ＬＡＳ−３０００、富士フィルム社製）、Gauge Ver 3.0 Densitograph Software （富士フィルム社製）により定量した。それぞれの定量値を元にしてｐ−ＡＭＰＫαの発現強度をＡＭＰＫαの発現強度で除して、コントロール（０. １％ＤＭＳＯ）に対する上昇率で表した。これにより、上記プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）を測定した。
【００５８】
＜筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験結果＞
ウェスタンブロット法によるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果は、図６に示す通りである。また、プロアントシアニジン（ＰＡ）の違いによるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の結果は、図７のグラフに示す通りである。図７の結果より、ＰＡ２投与群よりもＰＡ３投与群の方が、ＰＡ３投与群よりもＰＡ４投与群の方が、ＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が大きかった。したがって、ＰＡは重合度が高いものほどＡＭＰＫ活性化作用が強いことが示唆された。
【００５９】
また、上記図７の結果より、ＡＭＰＫ活性化作用が強いと予想されるＰＡ４に着目し、ＰＡ４投与によるＡＭＰＫ活性化レベルの経時変化、さらに、それに伴うアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）のリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化について検討した。図８は、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図９のグラフは、１０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を示したものである。また、図１０は、上記と同様の試験を５０μＭ ＰＡ４投与群に対しても行い、上記１０μＭ ＰＡ４投与群結果とともに、Ｐ−ＡＭＰＫαおよびＡＭＰＫαの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１１のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＭＰＫ活性化レベル（Ｐ−ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ）の経時変化を併記したものである。さらに、先のＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を検討するに際し、一次抗体として、Ｐ−ＡＭＰＫα抗体、ＡＭＰＫα抗体に代えて、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）抗体、ホスホ−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(Ser79) （Ｐ−ＡＣＣ）抗体（Cell Signaling社製）を用いる以外は、上記「筋管細胞におけるプロアントシアニジン（ＰＡ）のＡＭＰＫ活性化作用の確認試験」と同様の試験を、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群に対して行った。そして、図１２は、１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＰ−ＡＣＣおよびＡＣＣの検出結果（ウェスタンブロット法による経時変化）を示したものであり、図１３のグラフは、これら１０μＭおよび５０μＭ ＰＡ４投与群におけるＡＣＣのリン酸化レベル（Ｐ−ＡＣＣ／ＡＣＣ）の経時変化を併記したものである。
【００６０】
以上の結果から、ＰＡ４投与直後から筋管細胞のＡＭＰＫ活性化レベルの上昇が見られ、投与から３時間が経過してもＡＭＰＫの活性化が持続されていた。また、ＰＡ４投与直後のものにはＡＣＣリン酸化レベルの増大が確認された。この結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになった。なお、ＡＭＰＫは主に赤筋や肝臓に発現しており、これが活性化されるとＡＣＣのリン酸化（不活性化）を介してミトコンドリアでの脂肪酸酸化が促進されることが知られている。
【００６１】
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験＞
上記作製した試験用の筋管細胞（分化後５日目あるいは６日目の細胞を筋管細胞）を使用し、ＰＡ４投与の約３時間前に培地を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換した。所定の濃度の各成分存在下、筋管細胞を５時間さらに培養した。
【００６２】
（核酸の回収）
ＰＡ４投与の５時間後、培地を取り除き、細胞を、phosphate buffered saline （ＰＢＳ）で洗浄した後に、１ウェルあたり１ｍＬのＱＩＡＺＯＬ（キアゲン社製）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収し、全量を滅菌済みの１．５ｍＬ容チューブに加えてヴォルテックスミキサーでよく混合して５分間室温で静置した。その後、２００μＬのクロロホルムを加えてヴォルテックスミキサーでよく混合した後、そのまま室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、その水層を、新しい１. ５ｍＬ容チューブに回収した。回収した液に同量のイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５分間静置した。次に、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を取り除いた。さらに１ｍＬの冷７０％エタノールを加えてよく混合した後、１２０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を取り除いた。そのまま沈殿を室温で５分間風乾させた。次に、沈殿にジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水（ＤＥＰＣ処理水）４０μＬを加えてピペッティングを行い、よく混合した。分光光度計（NanoDrop ND-1000）を用いて、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度を定量した。
【００６３】
（ｃＤＮＡ合成）
アプライドバイオシステムズ社のHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて行った。
得られたＲＮＡ１μｇを含む１３．２μＬのＤＥＰＣ処理水に、２μｍＬの10×reverse transcription buffer（アプライドバイオシステムズ社製）、０．８μＬの１００ｍＭ 25×dNTP Mixture （アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの２０Ｕ／μＬ ribonuclease inhibitor（アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬの５０Ｕ／μＬ MuLV reverse transcriptase（アプライドバイオシステムズ社製）、２μＬの５０μＭ 10×random primer （アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２０μＬ）、雰囲気温度を所定の条件に制御（２５℃で１０分間、次いで３７℃で１２０分間、次いで８５℃で５秒間）することにより反応させ、ｃＤＮＡを合成した。
【００６４】
（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量）
得られたｃＤＮＡ１μｇを含む１０．７５μＬのＤＥＰＣ処理水に、１２．５μＬのTakara premix Ex Taq（タカラバイオ社製）、０．５μＬのROX reference dye （タカラバイオ社製）及び１．２５μＬのTaqman(R) Gene expression Assays〔Peroxisome proliferator activated receptor (PPARα) (Assay ID : Mm00440839#m1) 、Ribosomal protein , large P2(Assay ID : Mm00782638#s1)を含有〕（アプライドバイオシステムズ社製）を加え（計２５μＬ）、7300 real-time PCRシステム（アプライドバイオシステムズ社製）のプロトコールに従ってreal-time PCR による遺伝子発現量測定を行なった。ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量と内因性コントロールとしてRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量を測定し、ＰＰＡＲα遺伝子発現量のｍＲＮＡ量をRibosomal protein , large P2遺伝子発現量のｍＲＮＡ量で割って補正した値をＰＰＡＲαの発現量とした。
【００６５】
＜筋管細胞へのＰＡ４投与による遺伝子発現量変化（ＰＰＡＲα）の確認試験結果＞
β１サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されるとＡＣＣの不活性化を介して脂肪酸酸化が促進される。これに対しβ２サブユニットを有するＡＭＰＫが活性化されると、活性化ＡＭＰＫは核内に移行してＰＰＡＲαの遺伝子発現を増大することでぺルオキシソームにおける脂肪酸酸化が促進される。これまでの結果から、ＰＡはＡＭＰＫの活性化を介してＡＣＣのリン酸化を促進することが明らかになったが、それとは別にＡＭＰＫの下流因子として調整を受けるＰＰＡＲαの遺伝子発現がＰＡの投与によってどのような変化を受けるか検討した。その結果を、図１４に示す。ＰＡ４投与群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＰＰＡＲαの遺伝子発現が濃度依存的に上昇しており、５０μＭ ＰＡ４投与群においては有意な差が確認された。したがって、ＰＡ４は筋組織において、ＰＰＡＲαの発現や、ＡＣＣのリン酸化などの脂肪代謝関連酵素の活性化により、脂肪代謝が促進されることがわかる。
【実施例３】
【００６６】
〔ＫＫ−Ａy マウスへ黒大豆抽出物を摂取させた時の血清グルコース濃度、血清トリグリセリド濃度低下作用〕
＜実験動物および飼育方法＞
［実験動物］
ＫＫ−Ａy マウス（２型糖尿病モデルマウス）の雄（４週齢）
室温２４℃、明暗調製８〜２０時、給水ビンによる給水で飼育を行った。
［投与物質］
黒大豆抽出成分の市販品であるクロノケア（ＢＥ）（フジッコ社製）
クロノケア（ＢＥ）中、プロアントシアニジン（ＰＡ）含量５９％、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）含量９％。
［試験食の調製］
通常飼料としては、日本クレア社製の配合飼料粉末ＣＥ−２を使用した。そして、上記粉末ＣＥ−２と、ＢＥを混合し、２．２％ＢＥ食（Ｃ３Ｇ含量として０．２％になるように計算された添加量）を調製した。
［飼育スケジュール］
(i) ４週齢マウスを購入し飼育を開始した。
(ii)予備飼育４日間飼料は、粉末ＣＥ−２（日本クレア配合飼料）を摂食させた。
(iii) 予備飼育後、体重、血糖値の平均値がほぼ等しくなるようにＣｏｎｔｒｏｌ群、ＢＦ群（ｎ＝８）に分け、Ｃｏｎｔｒｏl 群にはＣＥ−２食、ＢＥ群にはＣＥ−２食＋２．２％ＢＥ食を自由摂取させた（試験食摂食開始を試験０週目とした）。
(iv)１週間毎に体重測定・採血を行い、血清グルコース濃度を測定した。
(v) 試験６週目にマウスを屠殺した。血液はエッペンチューブに採取し、４℃, ５０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を分離し、−８０℃で冷凍保存した。
【００６７】
＜１週間毎の採血方法＞
(i) 採血日の午前９時から１時間絶食させた。
(ii)尾静脈を剃刀で切りエッぺンチューブに血液を取り、数分間室温に置いた後氷中に置いた。
(iii) ４℃、５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。
(iv)上清（血清）を採取して別のエッペンチューブに移し氷中に置いた。
(v) 得られた血清を用いて血糖値を測定した。
【００６８】
＜血清グルコース濃度の測定＞
１週間毎の採血から採取した上清（血清）のグルコース濃度を、グルコースＣII−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、測定した。
【００６９】
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定＞ 試験６週目のマウスを検体として、血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度の測定を行った。なお、血清トリグリセライド濃度は、トリグリセライドＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清総コレステロール（血中総コレステロール）濃度は、コレステロールＥ−テスト・ワコー（和光純薬工業社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。また、血清インスリン（血中インスリン）濃度は、モリナガインスリン測定キット（森永生科学研究所社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。
【００７０】
＜組織における特定タンパク質の定量＞
屠殺したマウスの解剖時に採取した肝臓、骨格筋におけるＡＭＰＫα, およびＰ−ＡＭＰＫα(Thr 172) のタンパク量の定量を行った。また、骨格筋においては、Whole lysate (細胞全体からの抽出液), Plasma membrane fraction(細胞膜画分） , Cytosol fraction （細胞膜画分以外の細胞質由来抽出液）のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。詳しくは、採取した組織をタンパク抽出用バッファでホモゲナイズし、４℃, １８０００×ｇ, ３０分間遠心分離して得られた上清を採取し、ウェスタンブロッティングにより各タンパク質を検出した。Plasma membrane fractionの採取はNishiumi&Ashida の方法（ＢＢＢ ２００７，７１ (９)2343-2346）に従った。Ｇｌｕｔ４に対する抗体はCell Signaling社の製品を用いた。二次抗体としてAnti-rabbit IgG, HRP-linked antibody（Cell Signaling）を使用した。
【００７１】
〔実施例３の試験結果〕
【００７２】
＜食餌摂取量、体重、血清グルコース濃度の１週間毎の推移＞
図１５および図１６のグラフより、食餌摂取量、体重は、飼育期間を通じて両群の間に有意な差は認められなかった。しかしながら、図１７のグラフより、血清グルコース濃度は、試験４週目以降において、ＢＥ投与群での有意な低下が認められた。
【００７３】
＜血清トリグリセライド濃度、血清総コレステロール濃度、血清インスリン濃度の測定結果＞
図１８のグラフより、血清トリグリセライド濃度に関しては、ＢＥ群の血清トリグリセライド濃度は有意に低下した。また、図１９のグラフより、血清総コレステロール濃度は、ＢＥ群において、Ｃｏｎｔｒｏl 群と比べて有意な低下が確認された。また、図２０のグラフより、血清インスリン濃度に関しては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて、ＢＥ群の血清インスリン濃度が有意に低下していた。
【００７４】
＜組織における特定タンパク質の定量結果＞
ＢＥ摂取による血糖値上昇抑制作用は、ＡＭＰＫの活性化、およびインスリン感受性の改善を介したＧｌｕｔ４のトランスロケーションの増大がその一端を担っているのではないかと考え、先に示したように、Whole lysate (Whole) , Plasma membrane fraction (PM), Cytosol fraction (Cytosol)の３種のサンプルを回収し、Whole lysateにおけるＡＭＰＫの活性化レベルと、それぞれのサンプルにおけるＧｌｕｔ４の発現量について検討した。その結果、図２１のグラフに示すように、ＢＥ摂取によるＡＭＰＫ活性化レベル（ＡＭＰＫαＴｈｒ１７２リン酸化）の有意な上昇が確認された。また、図２２のグラフに示すように、Whole lysate (Whole), Cytosol fraction (Cytosol)においては両群の間でＧｌｕｔ４の発現量に差が見られなかったが、Plasma membrane fraction(PM)においては、ＢＥ群のＧｌｕｔ４の発現が有意に上昇していた。
【００７５】
以上より、上記各実施例において、ＰＡ３（プロシアニジンＣ１）およびＰＡ４（シナムタンニンＡ２）が、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことが確認された。なお、前記一般式（４）のプロアントシアニジンにおいて、そのｎの値が３〜６の整数であるものにおいても、上記と同様、高いＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を示すことを実験により確認している。また、これらのプロアントシアニジンほどではないが、前記一般式（１）で表される本発明に規定のプロアントシアニジンに該当するものであれば、上記ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用において有意な効果が認められることを実験により確認している。また、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用は、肥満や糖尿病等の予防・改善と密接に関与することから、本実施例品である上記特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、上記各作用を発揮することができる薬剤は、抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，または内臓脂肪蓄積抑制剤として使用しても、有利な作用効果が認められると推測される。また、これらの薬剤は、実質的に何ら副作用を示すことがないことから、飲食品に含有させることもできる。なお、前記一般式（４）に示すプロアントシアニジンであっても、ｎの値が７以上の整数のものでは、上記作用効果において有意な結果が得られていない。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の薬剤は、特定構造のプロアントシアニジンを有効成分として含有し、ＡＭＰＫ活性作用，ＧＬＵＴ４活性作用を有するものであり、実質的に何ら副作用を示すことなく、これらの作用が効果的になされるため、安全性に優れており、産業上有用である。また、これらの作用に基づき、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、内臓脂肪蓄積抑制剤等に使用することも可能である。また、上記薬剤を含有する飲食品は、あらゆる飲食品に適用し得るため、飲食品に機能的付加価値をつける意味でも、産業上有用である。さらに、家畜・ペット用飼料等への応用も可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化剤。
【化１】
【請求項２】
下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有することを特徴とするＧＬＵＴ４活性化剤。
【化２】
【請求項３】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンが、下記の化学式（２）で表されるプロシアニジンＣ１、または下記の化学式（３）で表されるシナムタンニンＡ２である請求項１または２記載の薬剤。
【化３】
【化４】
【請求項４】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンとともに、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）を含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンの含量が０．０１〜１００重量％の範囲に設定されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンの一日の摂取量が０．１〜１０００ｍｇの範囲になるよう設定されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤のいずれか一つの医薬品であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１】
下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有することを特徴とするＡＭＰＫ活性化剤。
【化１】
【請求項２】
下記の一般式（１）で表されるプロアントシアニジンを有効成分として含有することを特徴とするＧＬＵＴ４活性化剤。
【化２】
【請求項３】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンが、下記の化学式（２）で表されるプロシアニジンＣ１、または下記の化学式（３）で表されるシナムタンニンＡ２である請求項１または２記載の薬剤。
【化３】
【化４】
【請求項４】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンとともに、シアニジン−３−グルコシド（Ｃ３Ｇ）を含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンの含量が０．０１〜１００重量％の範囲に設定されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項６】
上記一般式（１）で表されるプロアントシアニジンの一日の摂取量が０．１〜１０００ｍｇの範囲になるよう設定されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
抗糖尿病剤，抗肥満剤，内臓蓄積脂肪低減化剤，内臓脂肪蓄積抑制剤のいずれか一つの医薬品であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする医薬品。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤を含有することを特徴とする飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１１−１７８７２８（Ｐ２０１１−１７８７２８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４５４１１（Ｐ２０１０−４５４１１）
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【出願人】（３９１００３１２９）フジッコ株式会社 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１５日（２０１１．９．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２日（２０１０．３．２）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【出願人】（３９１００３１２９）フジッコ株式会社 (13)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]