Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤による慢性骨髄性白血病の処置を最適化するための方法
本発明は、ヒト患者群における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の処置の最適化を補助するために、ヒトを評価する方法に関する。より具体的には、本方法は、（ａ）ＣＭＬを有する温血動物の治療前血液におけるＯＣＴ−１活性を測定する段階、および
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞、特に約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階を含む。
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞、特に約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト患者集団における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの慢性期ＣＭＬ患者におけるイマチニブメシル酸塩処置の成功は、十分に実証されている。しかし、あまりうまく行かなかった患者の処置結果の改善には、処置応答の臨床的数値の詳細な理解が必要である。既に、イマチニブ誘導性キナーゼ阻害に対する内因性感受性が応答の良好な予測因子であると示されており（White D, Saunders V, Lyons AB, et al. Blood. 2005;106:2520-2526; Schultheis B, Szydlo R, Mahon FX, Apperley JF, Melo JV. Blood. 2005;105:4893-4894）、そしてこれはイマチニブの細胞内取り込みおよび保持（ＩＵＲ）と密接に関連していることが示されている（White DL, Saunders VA, Dang P, et al. Blood. 2006;108:697-704）。さらに、イマチニブの能動輸送が有機カチオントランスポーターＯＣＴ−１に依存することが示されている（Thomas J, Wang L, Clark RE, Pirmohamed M. Blood. 2004;104:3739-3745; White DL, Saunders VA, Dang P, et al, OCT-1 mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib. Blood. 2006; 108: 697-704）。
【０００３】
ＯＣＴ−１タンパク質は、薬物、毒素および他の生体異物を含む多様な有機カチオンを起電的に輸送する溶質キャリアファミリーであるトランスポーターの最も大きなスーパーファミリーのメンバーである（Koepsell H, Endou H. Pflugers Arch. 2004;447:666-676）。該トランスポーターは１２個の膜貫通ドメインと、異なる基質および阻害剤についての部分的に重複した相互作用ドメインを有する結合ポケットを有すると予測されている（Koepsell H, Schmitt BM, Gorboulev V. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003;150:36-90）。リン酸化状態によるＯＣＴ−１の翻訳後制御（Ciarimboli G, Schlatter E. Pflugers Arch. 2005;449:423-441）ならびにＰＫＡ、Ｓｒｃ様ｐ５６およびＣａＭのようなかかる化合物も示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明において、ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の間に顕著な相関が存在し、そして低いＩＣ５０イマチニブを有する患者が、高いＩＣ５０イマチニブを有する患者よりも顕著に大きなＯＣＴ−１活性を有することを見出した。このことはより大きなＯＣＴ−１活性が、薬物標的のより効果的な阻害に関連していることを示唆している。ＴＩＤＥＬ試験に登録した全ての患者（慢性期と新たに診断された、前もって６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与されているＣＭＬ患者）においてＯＣＴ−１活性と分子応答を比較すると、高いＯＣＴ−１活性を有する患者は、低いＯＣＴ−１活性を有する患者よりも、２４ヶ月にわたるイマチニブ処置で、顕著に大きな分子応答が得られることが示された。さらに、６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与した患者は６００ｍｇ未満を投与したものよりも２４ヶ月で顕著に良好な分子応答が得られたことから、低いＯＣＴ−１活性を有する患者の分子応答は用量依存的であることを見出した。重要なことに、低いＯＣＴ−１活性を有する患者群は、１日あたり試験投与量６００ｍｇまたは少なくとも６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が投与されなければ、準最適乃至不良なイマチニブ応答の危険がより高いことが同定された。さらなる試験結果は、８００ｍｇのイマチニブにランダム化した、低いＯＣＴ−１活性を有する患者の大部分は、４００ｍｇにランダム化したものと比較したとき、１２ヶ月でＭＭＲを得ることが示される。本明細書に記載のデータは、低ＯＣＴ−１活性患者における準最適応答の危険を克服するために、用量が重要な要因であることを示している。
【０００５】
重要なことに、この機能的アッセイを用いて診断時にＯＣＴ−１活性を測定することによって、標準用量のイマチニブメシル酸塩に十分応答すると思われるＣＭＬ患者と、より高い用量のイマチニブメシル酸塩が有利であると思われるものとを同定することができる。
【０００６】
従って、本発明は、温血動物におけるＣＭＬを処置する方法であって、
（ａ）ＣＭＬを有する温血動物の治療前血液におけるＯＣＴ−１活性を測定する段階、および
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞、特に約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階
を含む方法に関する。
【０００７】
「約」：用語「約」は、本明細書および本願を通じて使用するとき、指示した値の−１０％〜＋１０％の範囲内で変化し得る値を意味する。好ましくは、指示した値の−５％〜＋５％である。
【０００８】
好ましくは、温血動物はヒトである。
【０００９】
好ましい態様において、投与するイマチニブメシル酸塩の１日用量は約６００〜１０００ｍｇ、例えば６００ｍｇ／日、８００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日または１２００ｍｇ／日である。
【００１０】
１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量４００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量５００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。
【００１１】
１つの態様において、段階（ｂ）において１日用量約６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において１日用量６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａ．９９人の患者におけるＩＣ５０イマチニブとＩＵＲの相関。ボックスプロットは低および高ＩＣ５０イマチニブ群間のＩＵＲの差を示し、また強力なＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンを用いるとこの差がなくなることを示している。
【図２】Ａ．９９人の患者におけるＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の相関。Ｂ．ボックスプロットは低および高ＩＣ５０イマチニブ群間のＯＣＴ−１活性の差を示す。
【図３】Ａ．ＯＣＴ−１活性と分子応答。低および高ＯＣＴ−１活性群。Ｂ．高ＯＣＴ−１活性を有する患者における用量の影響。Ｃ．低ＯＣＴ−１活性を有する患者における用量の影響。
【図４】Kaplan Meierは低および高ＯＣＴ−１活性群間の多様な時点でのＭＭＲの達成の差を示す。
【図５】患者を低および高ＯＣＴ−１活性群に分け、次いでさらにＡＤＤに基づいて分けて、用量漸増の影響を示す。
【図６】１８ヶ月での分子応答（ＢＣＲ−ＡＢＬにおける対数減少）と比較したＯＣＴ−１活性。評価した応答基準は準最適応答（１８ヶ月でＭＭＲが得られなかった）および最適応答（１８ヶ月でＢＣＲ−ＡＢＬにおける３〜４対数減少および＞４対数減少が得られた）である。コホート群は：Ａ．投与した用量に関わりなく全患者、Ｂ．最初の１２ヶ月にわたってＡＤＤ＜６００ｍｇを投与した患者、Ｃ．１２ヶ月後にＡＤＤ８００ｍｇに用量を漸増しなかった患者、Ｄ．治療の１２ヶ月後にＡＤＤ８００ｍｇに用量を漸増した患者に分ける。
【図７】Ａ．丸はＯＣＴ−１活性とＯＣＴ−１ｍＲＮＡの相関を示す。Ｂ．四角は低および高ＯＣＴ−１活性群におけるＯＣＴ−１ｍＲＮＡのレベルの差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
用語「大きな分子応答（ＭＭＲ）」は、本明細書において使用するとき、実時間定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、好ましくは治療の１２ヶ月後、例えばイマチニブメシル酸塩治療の１２ヶ月後の末梢血から定量したＢＣＲ−ＡＢＬ転写産物における３対数減少を意味する。
【００１４】
用語「完全細胞発生応答（ＣＣＲ）」は、本明細書において使用するとき、骨髄吸引液中分裂中期の少なくとも２０または２５個の細胞にわたってフィラデルフィア染色体陽性分裂中期が０％であることを意味する（Colombat M, Fort MP, Chollet C, et al. Molecular remission in chronic myeloid leukemia patients with sustained complete cytogenetic remission after imatinib mesylate treatment. Haematologica 2006;91:162-8.）。
【００１５】
イマチニブは米国特許出願5,521,184、特に実施例２１に一般的および具体的に記載されており、その内容を参照により本明細書に引用する。イマチニブはWO03/066613に記載の方法に準じて製造してもよい。
【００１６】
本発明の目的のために、イマチニブは好ましくは、モノメシル酸塩の形態で適用する。イマチニブモノメシル酸塩はUS 6,894,051に記載の方法に準じて製造することができ、その内容を参照により本明細書に引用する。それらに開示されている対応する多型、例えば結晶修飾物も同様に含まれる。
【００１７】
イマチニブモノメシル酸塩はUS 5,521,184、US 6,894,051またはUS 2005-0267125に記載の投与形態で投与することができる。
【００１８】
本明細書に記載の方法の段階（ａ）で必要なＣＭＬ患者の血液サンプルの採取は、当該技術分野における標準的な方法で実施することができる。ＯＣＴ−１活性を評価するアッセイを実施するための患者の血液由来の細胞は、新鮮であっても凍結してもよい。
【００１９】
本明細書に記載のＯＣＴ−１活性は、薬物の細胞内レベルによって定義されるとおり、イマチニブの輸送におけるＯＣＴ−１タンパク質の活性の測定するために、ＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンの非存在下（全ＩＵＲ）と存在下での薬物／イマチニブのＩＵＲの差として計算する。例えば：［全ＩＵＲ ３２ｎｇ／２００，０００細胞］−［プラゾシンＩＵＲ ２３ｎｇ／２００，０００細胞］によって９ｎｇ／２００，０００細胞のＯＣＴ−１活性を得る。
【００２０】
下記実施例に記載のとおり、ＯＣＴ−１活性はＣＭＬ患者の治療前血液で測定した。ＯＣＴ−１の活性は、ＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンの存在下または非存在下でインビトロで増殖したＣＭＬ患者由来の細胞における、［１４Ｃ］−イマチニブの細胞内取り込みおよび保持（ＩＵＲ）の差を測定することに由来する。＞平均（高い）ＯＣＴ−１活性を有する患者の８５％は２４ヶ月で大きな分子応答（ＭＭＲ）を得たが、≦平均（低い）ＯＣＴ−１活性を有するものでは４５％であった。１２ヶ月にわたる治療で６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩／日を投与した患者および平均＜６００ｍｇの患者を評価すると、高ＯＣＴ−１活性を有する患者は用量に拘わらず優れた分子応答を得たが、低ＯＣＴ−１活性を有する患者の応答は極めて用量依存的であることが示された。＜６００ｍｇを投与した低ＯＣＴ−１活性を有する患者の４５％が１２ヶ月で２対数減少に達せず、８２％が１８ヶ月でＭＭＲを得なかったが、高ＯＣＴ−１活性および用量＜６００ｍｇ／日のコホートにおいて８％および１７％であった（ｐ＝０．０１７およびｐ＝０．０２２）。ＯＣＴ−１活性はイマチニブに対する分子応答の重要な決定因子であり、用量と密接に関連した予測値を有する。
【実施例】
【００２１】
実施例
下記実施例は、本明細書に記載の発明の範囲を限定することなく説明する。実施例は本発明を実施する方法を提案することのみを意味する。下記データはＴＩＤＥＬ試験のＣＭＬ患者のサンプルから得た。
【００２２】
細胞内イマチニブ濃度によってＯｃｔ−１活性を測定する
薬剤：ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない。SAFC Biosciences。使用前に０．０５ｍＭのＨｅｐｅｓを加える。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）。Lymphoprep, Axis Shield。MICROSCINT-20シンチレーション液、PerkinElmer。ＲＰＭＩ培地、Ｗ／ｏ Ｌ−グルタミン、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない、SAFC Biosciences。
プラゾシン − ＯＣＴ−１を阻害する
（プラゾシン塩酸塩、ＭＷ＝４１９．９、Sigma）
１０ｍＭ原液から１００μＭで使用する。
１０ｍＭ原液＝４．２ｍｇ／ｍＬのメタノール
【００２３】
１４Ｃ−イマチニブ作用液
放射性および非放射性イマチニブ、１ｍＬにつき１００μＭの５０％混合物：
【表１】
【００２４】
必要な試料
末梢血、骨髄および造血細胞を含む他の液体をリチウムまたはナトリウムヘパリン中、無菌で採取する。
血液をフィコールで分離し、単核細胞（ＭＮＣ）をこのアッセイに用いるべきである。ＭＮＣの分離は密度勾配を用いた標準的な実験技術に準じて行う。
新鮮なものの代わりに、生存能力の補完を確実にするため、凍結保存後に解凍したＭＮＣを用いることができる。
【００２５】
方法
１． 全アッセイ点は３連で実施する。
２． ２４×２ｍｌのマイクロチューブは以下に詳述するとおりにラベルを付す（付録１）。
３． ステッパーピペットを用いて、１ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを各チューブに分注する。
４． ２００，０００個の生存能力を有するＭＮＣを各チューブに分注する。
５． 必要に応じて流入／流出の阻害剤を以下に詳述するとおりに加える（付録１）。
６． 付録１のとおりに１４Ｃ−イマチニブをチューブに加える。
７． パスツールピペットを用いてＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを滴下して、全体積２ｍｌとする。
８． 標準２時間アッセイのために、３７℃／５％ ＣＯ２で２時間インキュベートする。
９． チューブを６８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１３０００ｒｐｍで３０秒間パルススピンする。
１０． 各チューブから上清（Ｓ／Ｎ）のアリコート２０μｌを取り、付録４の通り９６ウェルプレート中で１００μｌのMicroscint-20と混合する。
１１． 接着プラスチックカバーシールでプレートを被覆し、プレートをホイルでくるむ。
１２． チューブを１３０００ｒｐｍで３０秒間、再びパルススピンする。
１３． カニューレ＋イエローチップ装着吸い込み管を用いて残留液を全て吸引する−細胞ペレットをかき乱してはならない。
１４． ステッパーピペットを用いて５０μｌのMicroscintをペレットに加える。
１５． 細胞をボルテックス撹拌して再懸濁する。１３０００ｒｐｍで１５秒間パルススピンする。
１６． 溶解した細胞を、付録２の通りに２次９６ウェルプレートに移す。
１７． 接着カバーシールでプレートを被覆し、ホイルでくるむ。
１８． TopCountベータカウンターで全プレートを計測する。
１９． 測定したデータをＩＵＲ−イマチニブアッセイテンプレートスプレッドシートに入力する。
【００２６】
実施例１：ＩＣ５０イマチニブと１４ＣイマチニブＩＵＲの相関
小規模なシリーズにおいて（ｎ＝１９）、ＩＣ５０イマチニブとＩＵＲ間の良好な相関（ｐ＝０．０１４）が示された（White DL, Saunders VA, Dang P, et al. Blood. 2006;108:697-704）。この最新の拡大されたシリーズにおいて（ｎ＝９９）、再び強い相関（ｒ＝−０．３４２；ｐ＝０．０００５）が示され、２つのパラメーター間の関係を確認した（図１Ａ）。さらに、低および高ＩＣ５０イマチニブ群のＩＵＲ間に有意な差が示される（ｐ＝０．００１）が、この差はＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンを加えると消失する（ｐ＝０．１２９）（図１Ｂ）。これによって再び、イマチニブ流入におけるトランスポーターＯＣＴ−１の重要性が確認される。
【００２７】
実施例２：ＯＣＴ−１活性
ＩＵＲアッセイに強力なＯＣＴ−１の阻害剤であるプラゾシンを添加することによって、ＯＣＴ−１によるイマチニブの能動輸送が阻害される。両方の試験に登録された１３２人の患者の試験は、広範なＯＣＴ−１活性を示す（平均８．２：範囲０〜３１．２）。５人の患者の反復アッセイにおいて、プラゾシンの存在下でのＩＵＲ値はプラゾシンの非存在下での値と等しいか、あるいはそれより低かった。これらの患者は無視し得る（０ｎｇ／２００，０００細胞）ＯＣＴ−１活性を有すると記録した。
【００２８】
実施例３：ＯＣＴ−１活性およびＩＣ５０イマチニブ
ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の両方を測定した９９人の患者において、ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性間に有意な相関が存在した（ｒ＝−０．２３８；ｐ＝０．０１９）（図２Ａ）。さらに、ＩＣ５０イマチニブを低いものと高いものにグループ分けすると、低ＩＣ５０イマチニブ群は高い群と比較して顕著に高いＯＣＴ−１活性を示した（ｐ＝０．００８）（図２Ｂ）。
【００２９】
実施例４：ＯＣＴ−１活性、分子応答および実際の投与量の影響
ＴＩＤＥＬ試験に登録された５６人の患者におけるイマチニブメシル酸塩治療の最初の２４ヶ月にわたって、ＯＣＴ−１活性を分子応答と比較した。このコホートの平均活性７．２ｎｇ／２００，０００細胞に基づいて、低および高ＯＣＴ−１活性に患者をグループ分けした。表１および図３Ａに示すとおり。高ＯＣＴ−１活性を有する患者は（ｎ＝２７）、低ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝２９）よりも時間経過にわたって有意に高い分子応答を得た（ｎ＝２９）（２４ヶ月でｐ＝０．００５）。
【００３０】
しかし、耐容性の問題のため、全ての患者に治療の最初の１２ヶ月にわたって一貫して６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が投与されたわけではない。用量の変化の影響を評価するため、患者をさらに、イマチニブ治療の最初の１２ヶ月にわたって平均１日用量（ＡＤＤ）６００ｍｇ（ｎ＝３３）が投与された患者群と、１日あたりＡＤＤ６００ｍｇ未満が投与されたもの（ｎ＝２３、平均ＡＤＤ５２３ｍｇ）とにグループ分けした。ＡＤＤ＜４００ｍｇの４人の患者はこのコホートに含めた。
【００３１】
高ＯＣＴ−１活性を有する患者のみを評価すると、１２ヶ月にわたって＜６００ｍｇを投与した患者群と６００ｍｇまたはそれ以上を投与した患者群との分子応答に有意な差は存在しない（２４ヶ月でｐ＝０．４４９）（図３Ｂ、表１）。逆に、低ＯＣＴ−１活性を有するコホートでは、６００ｍｇが投与された患者群は、６００ｍｇが投与されなかったものとよりも有意に良好な分子応答が得られたように、有意な用量効果が存在する（２４ヶ月でｐ＝０．００５）（図３Ｂ、表１）。
【００３２】
Kaplan Meir分析によって、高ＯＣＴ−１活性を有する患者の８５％が２４ヶ月でＭＭＲを得たが（平均９ヶ月で得た）、低ＯＣＴ−１活性を有する患者では４５％のみである（平均時間２４ヶ月）ことが示された（ｐ＝０．００９、図４）。最初の１２ヶ月にわたるＡＤＤ＜６００ｍｇが投与された患者群のみを分析すると、低および高ＯＣＴ−１活性患者間で有意な用量の影響が示される：低ＯＣＴ−１活性患者の１８％と比較して、８３％の高ＯＣＴ−１活性患者（ｎ＝１２）がＭＭＲを得る（ｎ＝１１）ｐ＝０．０２２。しかし、６００ｍｇが投与された患者のコホートでは有意な差が存在しない（ｐ＝０．１１０）。
【００３３】
表１ ＯＣＴ−１活性およびＭＲ
【表２】
【００３４】
実施例５：用量増加の影響
ＴＩＤＥＬ試験において、標準化されたベースラインから４対数減少が１２ヶ月で得られなければ、初期の１日あたり６００ｍｇから８００ｍｇへの用量増加を実施した。本実施例の患者コホートにおいて、４６人の患者が用量増加を企画された。この分析において、少なくとも１ヶ月間ＡＤＤ８００ｍｇが患者に投与されたとき、用量増加が起こったと考えた。
【００３５】
毒性のため、このコホート中２９人（６３％）の患者においてのみ、８００ｍｇ／日に用量が増加された。不可能であった第一の理由は、用量が漸増されなかった１７人の患者の１３人に生じた上記毒性／耐容性の問題である。残り２人の患者のうち２人は１ヶ月間用量を漸増したがＡＤＤ６００ｍｇに達しなかった。残り２人の患者が漸増されなかった理由は不明である。
【００３６】
用量を増加することができる全患者において、１４ヶ月で用量増加を行った。用量漸増の影響を評価するため、患者を上記の通り低および高ＯＣＴ−１活性群にグループ分けし、次いでさらに増加用量を投与されたものと６００ｍｇまたはそれ未満のままのものとに再分割した。図５に示すとおり、高ＯＣＴ−１活性コホートでは用量を増加した患者群と用量を増加しなかった患者群とに有意な差がなかった（全時点でｐ＞０．０５）。逆に、低ＯＣＴ−１活性を有する患者群は、用量が増加されたとき、高い活性を有する患者のものと同様である。低ＯＣＴ−１活性を有するものでは、薬物が非効率的に取り込まれる。したがって、適切な細胞内レベル（これは投与された薬物のより低い用量で高ＯＣＴ−１／良好な輸送を有する細胞において達成される）に達するためには循環系における薬物量の増加が必要である。しかし、用量増加を行わなかったものは、２４ヶ月で有意に低い分子応答を有した（図５）。
【００３７】
１８ヶ月でＭＭＲを得なかった患者群の平均ＯＣＴ−１活性は、ＭＭＲを得た患者群のＯＣＴ−１活性よりも有意に低い（図６）。分子応答群間でのこれらのＯＣＴ−１活性の差は、１２ヶ月で用量を漸増できなかった患者群において最も明らかである（図６ｃ）。１２ヶ月で用量を増加した患者群では、３つの群の間で有意な差は存在しない（図６ｄ）。
【００３８】
実施例６：ＯＣＴ−１活性、準最適応答およびイマチニブ不足
準最適応答は６ヶ月で主な細胞遺伝学的応答が得られず、１２ヶ月で完全な細胞遺伝学的応答がえられず、あるいは１８ヶ月でＭＭＲが得られないものとして定義される（Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. Blood. 2006;108:1809-1820）。分子応答と細胞遺伝学的応答の良好な相関は既に示されているため（Branford S, Hughes TP, Rudzki Z. Br J Haematol. 1999;107:587-599）、６ヶ月でＢＣＲ−ＡＢＬにおける１対数減少、１２ヶ月で２対数減少および１８ヶ月で３対数減少（ＭＭＲ）に達しない準最適応答を評価した。表２に示すKaplan Meier分析によって、患者にＡＤＤ６００ｍｇを投与するといずれの時点でも準最適応答の頻度に有意な差はないが、低い用量を患者に投与したとき全ての時点で有意な差が存在することが示され、これは低いＯＣＴ−１活性を有する患者に投与する用量が少ないと、イマチニブメシル酸塩に対する準最適応答の実質的リスクがあることを示している。
１８ヶ月で２対数減少の達成失敗を評価することによって（Imatinib failure, Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. see above）、低ＯＣＴ−１活性を有し、投与量が低い患者は有意に低い割合で、１８ヶ月で２対数減少を得ることも示される（高ＯＣＴ−１活性８％、低ＯＣＴ−１活性３６％、ｐ−０．０４）。
【００３９】
表２ 準最適応答
【表３】
【００４０】
実施例７：ＯＣＴ−１ｍＲＮＡとＯＣＴ−１活性
９３人の患者において、ＢＣＲｍＲＮＡと比較してＯＣＴ−１ｍＲＮＡのレベルを測定した。相対平均％ｍＲＮＡは０．０２〜３．５％の範囲で０．８３５であった。ｍＲＮＡとＯＣＴ−１活性の相関はｐ値０．００２で示された（ｒ＝０．３７８）（図７）。患者をこのコホートの平均値７．９で低および高ＯＣＴ−１活性にグループ分けすると、２つのグループ間で有意な差が示される。低ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝４７）の平均％ＯＣＴ−１ｍＲＮＡは０．３６７であり、高ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝４６）は０．６３５であった（ｐ＝０．０３６、図７）。
興味深いことに、ＩＣ５０とＯＣＴ−１ｍＲＮＡ分析が利用可能な７７人の患者において、２つのパラメーター間に相関が見られなかった（ｒ＝０．１６２；ｐ＝０．１７１）。患者を低および高ＩＣ５０イマチニブにさらにグループ分けしてＯＣＴ−１ｍＲＮＡ発現レベルを評価すると、２つのグループ間で有意な差が見られなかった（低ＩＣ５０イマチニブ ｎ＝４２、平均０．５８６；高ＩＣ５０イマチニブ ｎ＝３５、平均０．５４６；ｐ＝０．５７０）。
【００４１】
２４ヶ月分子追跡が利用可能な患者（ＴＩＤＥＬ患者）に分析を限定すると、２つのグループ間（低および高ＯＣＴ−１ｍＲＮＡ）の分子応答に有意な差が示され得なかった（表３）。またＯＣＴ−１活性とは逆に、用量に関する２つのグループ、６００ｍｇまたはそれ未満と用量漸増（８００ｍｇ）の間に有意な差が存在しなかった（表３）。ＯＣＴ−１活性と同様に、ｍＲＮＡ分析はイマチニブに対する準最適応答または不良のリスクを有する患者群を明らかにしなかった（データは示さず）。
【００４２】
表３．ＯＣＴ−１ｍＲＮＡとＭＲ
【表４】
【００４３】
実施例７ ６０人のＣＭＬ患者コホートにおける分子応答に対するＯＣＴ−１活性の影響の予備的分析
このアッセイは、これまで未処置であって、イマチニブ治療前の慢性期ＣＭＬ患者において実施した。１次エンドポイント：１２ヶ月でＭＭＲ（大きな分子応答の達成：ＲＱ−ＰＣＲで測定したときＢＣＲ−ＡＢＬにおいて＞３対数減少）。
【００４４】
統計 Kaplan Meier、対数ランク生存数、対数ランク分析およびｔ−検定。
＜０．０５のレベルで有意なｐ値とする。
【００４５】
結果
Ａ：１２ヶ月でのＭＭＲの達成（患者のパーセンテージ）
【表５】
【００４６】
Ｂ：平均分子応答（ＢＣＲ−ＡＢＬにおける対数減少）
【表６】
【００４７】
このデータは（ｉ）４００ｍｇにランダム化されたものと比較して、８００ｍｇのイマチニブにランダム化された低ＯＣＴ−１活性を有する患者がより大きな割合で、１２ヶ月でＭＭＲを得ること、（ｉｉ）低ＯＣＴ−１活性を有する患者について、１日あたり＞４００ｍｇ（この場合８００ｍｇ）のイマチニブ用量で有利な結果が観察されること；（ｉｉｉ）低ＯＣＴ−１活性を有する患者は８００ｍｇ以上に用量を増加することによってさらに利益を受けると思われることを示している。
このデータは、ＴＩＤＥＬ試験の最初の知見を支持し、したがってＭＭＲの達成におけるＯＣＴ−１活性の重要性について確認的な証拠を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト患者集団における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの慢性期ＣＭＬ患者におけるイマチニブメシル酸塩処置の成功は、十分に実証されている。しかし、あまりうまく行かなかった患者の処置結果の改善には、処置応答の臨床的数値の詳細な理解が必要である。既に、イマチニブ誘導性キナーゼ阻害に対する内因性感受性が応答の良好な予測因子であると示されており（White D, Saunders V, Lyons AB, et al. Blood. 2005;106:2520-2526; Schultheis B, Szydlo R, Mahon FX, Apperley JF, Melo JV. Blood. 2005;105:4893-4894）、そしてこれはイマチニブの細胞内取り込みおよび保持（ＩＵＲ）と密接に関連していることが示されている（White DL, Saunders VA, Dang P, et al. Blood. 2006;108:697-704）。さらに、イマチニブの能動輸送が有機カチオントランスポーターＯＣＴ−１に依存することが示されている（Thomas J, Wang L, Clark RE, Pirmohamed M. Blood. 2004;104:3739-3745; White DL, Saunders VA, Dang P, et al, OCT-1 mediated influx is a key determinant of the intracellular uptake of imatinib but not nilotinib. Blood. 2006; 108: 697-704）。
【０００３】
ＯＣＴ−１タンパク質は、薬物、毒素および他の生体異物を含む多様な有機カチオンを起電的に輸送する溶質キャリアファミリーであるトランスポーターの最も大きなスーパーファミリーのメンバーである（Koepsell H, Endou H. Pflugers Arch. 2004;447:666-676）。該トランスポーターは１２個の膜貫通ドメインと、異なる基質および阻害剤についての部分的に重複した相互作用ドメインを有する結合ポケットを有すると予測されている（Koepsell H, Schmitt BM, Gorboulev V. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003;150:36-90）。リン酸化状態によるＯＣＴ−１の翻訳後制御（Ciarimboli G, Schlatter E. Pflugers Arch. 2005;449:423-441）ならびにＰＫＡ、Ｓｒｃ様ｐ５６およびＣａＭのようなかかる化合物も示されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明において、ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の間に顕著な相関が存在し、そして低いＩＣ５０イマチニブを有する患者が、高いＩＣ５０イマチニブを有する患者よりも顕著に大きなＯＣＴ−１活性を有することを見出した。このことはより大きなＯＣＴ−１活性が、薬物標的のより効果的な阻害に関連していることを示唆している。ＴＩＤＥＬ試験に登録した全ての患者（慢性期と新たに診断された、前もって６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与されているＣＭＬ患者）においてＯＣＴ−１活性と分子応答を比較すると、高いＯＣＴ−１活性を有する患者は、低いＯＣＴ−１活性を有する患者よりも、２４ヶ月にわたるイマチニブ処置で、顕著に大きな分子応答が得られることが示された。さらに、６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与した患者は６００ｍｇ未満を投与したものよりも２４ヶ月で顕著に良好な分子応答が得られたことから、低いＯＣＴ−１活性を有する患者の分子応答は用量依存的であることを見出した。重要なことに、低いＯＣＴ−１活性を有する患者群は、１日あたり試験投与量６００ｍｇまたは少なくとも６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が投与されなければ、準最適乃至不良なイマチニブ応答の危険がより高いことが同定された。さらなる試験結果は、８００ｍｇのイマチニブにランダム化した、低いＯＣＴ−１活性を有する患者の大部分は、４００ｍｇにランダム化したものと比較したとき、１２ヶ月でＭＭＲを得ることが示される。本明細書に記載のデータは、低ＯＣＴ−１活性患者における準最適応答の危険を克服するために、用量が重要な要因であることを示している。
【０００５】
重要なことに、この機能的アッセイを用いて診断時にＯＣＴ−１活性を測定することによって、標準用量のイマチニブメシル酸塩に十分応答すると思われるＣＭＬ患者と、より高い用量のイマチニブメシル酸塩が有利であると思われるものとを同定することができる。
【０００６】
従って、本発明は、温血動物におけるＣＭＬを処置する方法であって、
（ａ）ＣＭＬを有する温血動物の治療前血液におけるＯＣＴ−１活性を測定する段階、および
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞、特に約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階
を含む方法に関する。
【０００７】
「約」：用語「約」は、本明細書および本願を通じて使用するとき、指示した値の−１０％〜＋１０％の範囲内で変化し得る値を意味する。好ましくは、指示した値の−５％〜＋５％である。
【０００８】
好ましくは、温血動物はヒトである。
【０００９】
好ましい態様において、投与するイマチニブメシル酸塩の１日用量は約６００〜１０００ｍｇ、例えば６００ｍｇ／日、８００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日または１２００ｍｇ／日である。
【００１０】
１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量４００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量５００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において少なくとも１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。
【００１１】
１つの態様において、段階（ｂ）において１日用量約６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。１つの態様において、段階（ｂ）において１日用量６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口的に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａ．９９人の患者におけるＩＣ５０イマチニブとＩＵＲの相関。ボックスプロットは低および高ＩＣ５０イマチニブ群間のＩＵＲの差を示し、また強力なＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンを用いるとこの差がなくなることを示している。
【図２】Ａ．９９人の患者におけるＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の相関。Ｂ．ボックスプロットは低および高ＩＣ５０イマチニブ群間のＯＣＴ−１活性の差を示す。
【図３】Ａ．ＯＣＴ−１活性と分子応答。低および高ＯＣＴ−１活性群。Ｂ．高ＯＣＴ−１活性を有する患者における用量の影響。Ｃ．低ＯＣＴ−１活性を有する患者における用量の影響。
【図４】Kaplan Meierは低および高ＯＣＴ−１活性群間の多様な時点でのＭＭＲの達成の差を示す。
【図５】患者を低および高ＯＣＴ−１活性群に分け、次いでさらにＡＤＤに基づいて分けて、用量漸増の影響を示す。
【図６】１８ヶ月での分子応答（ＢＣＲ−ＡＢＬにおける対数減少）と比較したＯＣＴ−１活性。評価した応答基準は準最適応答（１８ヶ月でＭＭＲが得られなかった）および最適応答（１８ヶ月でＢＣＲ−ＡＢＬにおける３〜４対数減少および＞４対数減少が得られた）である。コホート群は：Ａ．投与した用量に関わりなく全患者、Ｂ．最初の１２ヶ月にわたってＡＤＤ＜６００ｍｇを投与した患者、Ｃ．１２ヶ月後にＡＤＤ８００ｍｇに用量を漸増しなかった患者、Ｄ．治療の１２ヶ月後にＡＤＤ８００ｍｇに用量を漸増した患者に分ける。
【図７】Ａ．丸はＯＣＴ−１活性とＯＣＴ−１ｍＲＮＡの相関を示す。Ｂ．四角は低および高ＯＣＴ−１活性群におけるＯＣＴ−１ｍＲＮＡのレベルの差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
用語「大きな分子応答（ＭＭＲ）」は、本明細書において使用するとき、実時間定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、好ましくは治療の１２ヶ月後、例えばイマチニブメシル酸塩治療の１２ヶ月後の末梢血から定量したＢＣＲ−ＡＢＬ転写産物における３対数減少を意味する。
【００１４】
用語「完全細胞発生応答（ＣＣＲ）」は、本明細書において使用するとき、骨髄吸引液中分裂中期の少なくとも２０または２５個の細胞にわたってフィラデルフィア染色体陽性分裂中期が０％であることを意味する（Colombat M, Fort MP, Chollet C, et al. Molecular remission in chronic myeloid leukemia patients with sustained complete cytogenetic remission after imatinib mesylate treatment. Haematologica 2006;91:162-8.）。
【００１５】
イマチニブは米国特許出願5,521,184、特に実施例２１に一般的および具体的に記載されており、その内容を参照により本明細書に引用する。イマチニブはWO03/066613に記載の方法に準じて製造してもよい。
【００１６】
本発明の目的のために、イマチニブは好ましくは、モノメシル酸塩の形態で適用する。イマチニブモノメシル酸塩はUS 6,894,051に記載の方法に準じて製造することができ、その内容を参照により本明細書に引用する。それらに開示されている対応する多型、例えば結晶修飾物も同様に含まれる。
【００１７】
イマチニブモノメシル酸塩はUS 5,521,184、US 6,894,051またはUS 2005-0267125に記載の投与形態で投与することができる。
【００１８】
本明細書に記載の方法の段階（ａ）で必要なＣＭＬ患者の血液サンプルの採取は、当該技術分野における標準的な方法で実施することができる。ＯＣＴ−１活性を評価するアッセイを実施するための患者の血液由来の細胞は、新鮮であっても凍結してもよい。
【００１９】
本明細書に記載のＯＣＴ−１活性は、薬物の細胞内レベルによって定義されるとおり、イマチニブの輸送におけるＯＣＴ−１タンパク質の活性の測定するために、ＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンの非存在下（全ＩＵＲ）と存在下での薬物／イマチニブのＩＵＲの差として計算する。例えば：［全ＩＵＲ ３２ｎｇ／２００，０００細胞］−［プラゾシンＩＵＲ ２３ｎｇ／２００，０００細胞］によって９ｎｇ／２００，０００細胞のＯＣＴ−１活性を得る。
【００２０】
下記実施例に記載のとおり、ＯＣＴ−１活性はＣＭＬ患者の治療前血液で測定した。ＯＣＴ−１の活性は、ＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンの存在下または非存在下でインビトロで増殖したＣＭＬ患者由来の細胞における、［１４Ｃ］−イマチニブの細胞内取り込みおよび保持（ＩＵＲ）の差を測定することに由来する。＞平均（高い）ＯＣＴ−１活性を有する患者の８５％は２４ヶ月で大きな分子応答（ＭＭＲ）を得たが、≦平均（低い）ＯＣＴ−１活性を有するものでは４５％であった。１２ヶ月にわたる治療で６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩／日を投与した患者および平均＜６００ｍｇの患者を評価すると、高ＯＣＴ−１活性を有する患者は用量に拘わらず優れた分子応答を得たが、低ＯＣＴ−１活性を有する患者の応答は極めて用量依存的であることが示された。＜６００ｍｇを投与した低ＯＣＴ−１活性を有する患者の４５％が１２ヶ月で２対数減少に達せず、８２％が１８ヶ月でＭＭＲを得なかったが、高ＯＣＴ−１活性および用量＜６００ｍｇ／日のコホートにおいて８％および１７％であった（ｐ＝０．０１７およびｐ＝０．０２２）。ＯＣＴ−１活性はイマチニブに対する分子応答の重要な決定因子であり、用量と密接に関連した予測値を有する。
【実施例】
【００２１】
実施例
下記実施例は、本明細書に記載の発明の範囲を限定することなく説明する。実施例は本発明を実施する方法を提案することのみを意味する。下記データはＴＩＤＥＬ試験のＣＭＬ患者のサンプルから得た。
【００２２】
細胞内イマチニブ濃度によってＯｃｔ−１活性を測定する
薬剤：ハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない。SAFC Biosciences。使用前に０．０５ｍＭのＨｅｐｅｓを加える。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）。Lymphoprep, Axis Shield。MICROSCINT-20シンチレーション液、PerkinElmer。ＲＰＭＩ培地、Ｗ／ｏ Ｌ−グルタミン、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない、SAFC Biosciences。
プラゾシン − ＯＣＴ−１を阻害する
（プラゾシン塩酸塩、ＭＷ＝４１９．９、Sigma）
１０ｍＭ原液から１００μＭで使用する。
１０ｍＭ原液＝４．２ｍｇ／ｍＬのメタノール
【００２３】
１４Ｃ−イマチニブ作用液
放射性および非放射性イマチニブ、１ｍＬにつき１００μＭの５０％混合物：
【表１】
【００２４】
必要な試料
末梢血、骨髄および造血細胞を含む他の液体をリチウムまたはナトリウムヘパリン中、無菌で採取する。
血液をフィコールで分離し、単核細胞（ＭＮＣ）をこのアッセイに用いるべきである。ＭＮＣの分離は密度勾配を用いた標準的な実験技術に準じて行う。
新鮮なものの代わりに、生存能力の補完を確実にするため、凍結保存後に解凍したＭＮＣを用いることができる。
【００２５】
方法
１． 全アッセイ点は３連で実施する。
２． ２４×２ｍｌのマイクロチューブは以下に詳述するとおりにラベルを付す（付録１）。
３． ステッパーピペットを用いて、１ｍＬのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを各チューブに分注する。
４． ２００，０００個の生存能力を有するＭＮＣを各チューブに分注する。
５． 必要に応じて流入／流出の阻害剤を以下に詳述するとおりに加える（付録１）。
６． 付録１のとおりに１４Ｃ−イマチニブをチューブに加える。
７． パスツールピペットを用いてＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを滴下して、全体積２ｍｌとする。
８． 標準２時間アッセイのために、３７℃／５％ ＣＯ２で２時間インキュベートする。
９． チューブを６８００ｒｐｍで５分間遠心分離する。１３０００ｒｐｍで３０秒間パルススピンする。
１０． 各チューブから上清（Ｓ／Ｎ）のアリコート２０μｌを取り、付録４の通り９６ウェルプレート中で１００μｌのMicroscint-20と混合する。
１１． 接着プラスチックカバーシールでプレートを被覆し、プレートをホイルでくるむ。
１２． チューブを１３０００ｒｐｍで３０秒間、再びパルススピンする。
１３． カニューレ＋イエローチップ装着吸い込み管を用いて残留液を全て吸引する−細胞ペレットをかき乱してはならない。
１４． ステッパーピペットを用いて５０μｌのMicroscintをペレットに加える。
１５． 細胞をボルテックス撹拌して再懸濁する。１３０００ｒｐｍで１５秒間パルススピンする。
１６． 溶解した細胞を、付録２の通りに２次９６ウェルプレートに移す。
１７． 接着カバーシールでプレートを被覆し、ホイルでくるむ。
１８． TopCountベータカウンターで全プレートを計測する。
１９． 測定したデータをＩＵＲ−イマチニブアッセイテンプレートスプレッドシートに入力する。
【００２６】
実施例１：ＩＣ５０イマチニブと１４ＣイマチニブＩＵＲの相関
小規模なシリーズにおいて（ｎ＝１９）、ＩＣ５０イマチニブとＩＵＲ間の良好な相関（ｐ＝０．０１４）が示された（White DL, Saunders VA, Dang P, et al. Blood. 2006;108:697-704）。この最新の拡大されたシリーズにおいて（ｎ＝９９）、再び強い相関（ｒ＝−０．３４２；ｐ＝０．０００５）が示され、２つのパラメーター間の関係を確認した（図１Ａ）。さらに、低および高ＩＣ５０イマチニブ群のＩＵＲ間に有意な差が示される（ｐ＝０．００１）が、この差はＯＣＴ−１阻害剤であるプラゾシンを加えると消失する（ｐ＝０．１２９）（図１Ｂ）。これによって再び、イマチニブ流入におけるトランスポーターＯＣＴ−１の重要性が確認される。
【００２７】
実施例２：ＯＣＴ−１活性
ＩＵＲアッセイに強力なＯＣＴ−１の阻害剤であるプラゾシンを添加することによって、ＯＣＴ−１によるイマチニブの能動輸送が阻害される。両方の試験に登録された１３２人の患者の試験は、広範なＯＣＴ−１活性を示す（平均８．２：範囲０〜３１．２）。５人の患者の反復アッセイにおいて、プラゾシンの存在下でのＩＵＲ値はプラゾシンの非存在下での値と等しいか、あるいはそれより低かった。これらの患者は無視し得る（０ｎｇ／２００，０００細胞）ＯＣＴ−１活性を有すると記録した。
【００２８】
実施例３：ＯＣＴ−１活性およびＩＣ５０イマチニブ
ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性の両方を測定した９９人の患者において、ＩＣ５０イマチニブとＯＣＴ−１活性間に有意な相関が存在した（ｒ＝−０．２３８；ｐ＝０．０１９）（図２Ａ）。さらに、ＩＣ５０イマチニブを低いものと高いものにグループ分けすると、低ＩＣ５０イマチニブ群は高い群と比較して顕著に高いＯＣＴ−１活性を示した（ｐ＝０．００８）（図２Ｂ）。
【００２９】
実施例４：ＯＣＴ−１活性、分子応答および実際の投与量の影響
ＴＩＤＥＬ試験に登録された５６人の患者におけるイマチニブメシル酸塩治療の最初の２４ヶ月にわたって、ＯＣＴ−１活性を分子応答と比較した。このコホートの平均活性７．２ｎｇ／２００，０００細胞に基づいて、低および高ＯＣＴ−１活性に患者をグループ分けした。表１および図３Ａに示すとおり。高ＯＣＴ−１活性を有する患者は（ｎ＝２７）、低ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝２９）よりも時間経過にわたって有意に高い分子応答を得た（ｎ＝２９）（２４ヶ月でｐ＝０．００５）。
【００３０】
しかし、耐容性の問題のため、全ての患者に治療の最初の１２ヶ月にわたって一貫して６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が投与されたわけではない。用量の変化の影響を評価するため、患者をさらに、イマチニブ治療の最初の１２ヶ月にわたって平均１日用量（ＡＤＤ）６００ｍｇ（ｎ＝３３）が投与された患者群と、１日あたりＡＤＤ６００ｍｇ未満が投与されたもの（ｎ＝２３、平均ＡＤＤ５２３ｍｇ）とにグループ分けした。ＡＤＤ＜４００ｍｇの４人の患者はこのコホートに含めた。
【００３１】
高ＯＣＴ−１活性を有する患者のみを評価すると、１２ヶ月にわたって＜６００ｍｇを投与した患者群と６００ｍｇまたはそれ以上を投与した患者群との分子応答に有意な差は存在しない（２４ヶ月でｐ＝０．４４９）（図３Ｂ、表１）。逆に、低ＯＣＴ−１活性を有するコホートでは、６００ｍｇが投与された患者群は、６００ｍｇが投与されなかったものとよりも有意に良好な分子応答が得られたように、有意な用量効果が存在する（２４ヶ月でｐ＝０．００５）（図３Ｂ、表１）。
【００３２】
Kaplan Meir分析によって、高ＯＣＴ−１活性を有する患者の８５％が２４ヶ月でＭＭＲを得たが（平均９ヶ月で得た）、低ＯＣＴ−１活性を有する患者では４５％のみである（平均時間２４ヶ月）ことが示された（ｐ＝０．００９、図４）。最初の１２ヶ月にわたるＡＤＤ＜６００ｍｇが投与された患者群のみを分析すると、低および高ＯＣＴ−１活性患者間で有意な用量の影響が示される：低ＯＣＴ−１活性患者の１８％と比較して、８３％の高ＯＣＴ−１活性患者（ｎ＝１２）がＭＭＲを得る（ｎ＝１１）ｐ＝０．０２２。しかし、６００ｍｇが投与された患者のコホートでは有意な差が存在しない（ｐ＝０．１１０）。
【００３３】
表１ ＯＣＴ−１活性およびＭＲ
【表２】
【００３４】
実施例５：用量増加の影響
ＴＩＤＥＬ試験において、標準化されたベースラインから４対数減少が１２ヶ月で得られなければ、初期の１日あたり６００ｍｇから８００ｍｇへの用量増加を実施した。本実施例の患者コホートにおいて、４６人の患者が用量増加を企画された。この分析において、少なくとも１ヶ月間ＡＤＤ８００ｍｇが患者に投与されたとき、用量増加が起こったと考えた。
【００３５】
毒性のため、このコホート中２９人（６３％）の患者においてのみ、８００ｍｇ／日に用量が増加された。不可能であった第一の理由は、用量が漸増されなかった１７人の患者の１３人に生じた上記毒性／耐容性の問題である。残り２人の患者のうち２人は１ヶ月間用量を漸増したがＡＤＤ６００ｍｇに達しなかった。残り２人の患者が漸増されなかった理由は不明である。
【００３６】
用量を増加することができる全患者において、１４ヶ月で用量増加を行った。用量漸増の影響を評価するため、患者を上記の通り低および高ＯＣＴ−１活性群にグループ分けし、次いでさらに増加用量を投与されたものと６００ｍｇまたはそれ未満のままのものとに再分割した。図５に示すとおり、高ＯＣＴ−１活性コホートでは用量を増加した患者群と用量を増加しなかった患者群とに有意な差がなかった（全時点でｐ＞０．０５）。逆に、低ＯＣＴ−１活性を有する患者群は、用量が増加されたとき、高い活性を有する患者のものと同様である。低ＯＣＴ−１活性を有するものでは、薬物が非効率的に取り込まれる。したがって、適切な細胞内レベル（これは投与された薬物のより低い用量で高ＯＣＴ−１／良好な輸送を有する細胞において達成される）に達するためには循環系における薬物量の増加が必要である。しかし、用量増加を行わなかったものは、２４ヶ月で有意に低い分子応答を有した（図５）。
【００３７】
１８ヶ月でＭＭＲを得なかった患者群の平均ＯＣＴ−１活性は、ＭＭＲを得た患者群のＯＣＴ−１活性よりも有意に低い（図６）。分子応答群間でのこれらのＯＣＴ−１活性の差は、１２ヶ月で用量を漸増できなかった患者群において最も明らかである（図６ｃ）。１２ヶ月で用量を増加した患者群では、３つの群の間で有意な差は存在しない（図６ｄ）。
【００３８】
実施例６：ＯＣＴ−１活性、準最適応答およびイマチニブ不足
準最適応答は６ヶ月で主な細胞遺伝学的応答が得られず、１２ヶ月で完全な細胞遺伝学的応答がえられず、あるいは１８ヶ月でＭＭＲが得られないものとして定義される（Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. Blood. 2006;108:1809-1820）。分子応答と細胞遺伝学的応答の良好な相関は既に示されているため（Branford S, Hughes TP, Rudzki Z. Br J Haematol. 1999;107:587-599）、６ヶ月でＢＣＲ−ＡＢＬにおける１対数減少、１２ヶ月で２対数減少および１８ヶ月で３対数減少（ＭＭＲ）に達しない準最適応答を評価した。表２に示すKaplan Meier分析によって、患者にＡＤＤ６００ｍｇを投与するといずれの時点でも準最適応答の頻度に有意な差はないが、低い用量を患者に投与したとき全ての時点で有意な差が存在することが示され、これは低いＯＣＴ−１活性を有する患者に投与する用量が少ないと、イマチニブメシル酸塩に対する準最適応答の実質的リスクがあることを示している。
１８ヶ月で２対数減少の達成失敗を評価することによって（Imatinib failure, Baccarani M, Saglio G, Goldman J, et al. see above）、低ＯＣＴ−１活性を有し、投与量が低い患者は有意に低い割合で、１８ヶ月で２対数減少を得ることも示される（高ＯＣＴ−１活性８％、低ＯＣＴ−１活性３６％、ｐ−０．０４）。
【００３９】
表２ 準最適応答
【表３】
【００４０】
実施例７：ＯＣＴ−１ｍＲＮＡとＯＣＴ−１活性
９３人の患者において、ＢＣＲｍＲＮＡと比較してＯＣＴ−１ｍＲＮＡのレベルを測定した。相対平均％ｍＲＮＡは０．０２〜３．５％の範囲で０．８３５であった。ｍＲＮＡとＯＣＴ−１活性の相関はｐ値０．００２で示された（ｒ＝０．３７８）（図７）。患者をこのコホートの平均値７．９で低および高ＯＣＴ−１活性にグループ分けすると、２つのグループ間で有意な差が示される。低ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝４７）の平均％ＯＣＴ−１ｍＲＮＡは０．３６７であり、高ＯＣＴ−１活性を有する患者（ｎ＝４６）は０．６３５であった（ｐ＝０．０３６、図７）。
興味深いことに、ＩＣ５０とＯＣＴ−１ｍＲＮＡ分析が利用可能な７７人の患者において、２つのパラメーター間に相関が見られなかった（ｒ＝０．１６２；ｐ＝０．１７１）。患者を低および高ＩＣ５０イマチニブにさらにグループ分けしてＯＣＴ−１ｍＲＮＡ発現レベルを評価すると、２つのグループ間で有意な差が見られなかった（低ＩＣ５０イマチニブ ｎ＝４２、平均０．５８６；高ＩＣ５０イマチニブ ｎ＝３５、平均０．５４６；ｐ＝０．５７０）。
【００４１】
２４ヶ月分子追跡が利用可能な患者（ＴＩＤＥＬ患者）に分析を限定すると、２つのグループ間（低および高ＯＣＴ−１ｍＲＮＡ）の分子応答に有意な差が示され得なかった（表３）。またＯＣＴ−１活性とは逆に、用量に関する２つのグループ、６００ｍｇまたはそれ未満と用量漸増（８００ｍｇ）の間に有意な差が存在しなかった（表３）。ＯＣＴ−１活性と同様に、ｍＲＮＡ分析はイマチニブに対する準最適応答または不良のリスクを有する患者群を明らかにしなかった（データは示さず）。
【００４２】
表３．ＯＣＴ−１ｍＲＮＡとＭＲ
【表４】
【００４３】
実施例７ ６０人のＣＭＬ患者コホートにおける分子応答に対するＯＣＴ−１活性の影響の予備的分析
このアッセイは、これまで未処置であって、イマチニブ治療前の慢性期ＣＭＬ患者において実施した。１次エンドポイント：１２ヶ月でＭＭＲ（大きな分子応答の達成：ＲＱ−ＰＣＲで測定したときＢＣＲ−ＡＢＬにおいて＞３対数減少）。
【００４４】
統計 Kaplan Meier、対数ランク生存数、対数ランク分析およびｔ−検定。
＜０．０５のレベルで有意なｐ値とする。
【００４５】
結果
Ａ：１２ヶ月でのＭＭＲの達成（患者のパーセンテージ）
【表５】
【００４６】
Ｂ：平均分子応答（ＢＣＲ−ＡＢＬにおける対数減少）
【表６】
【００４７】
このデータは（ｉ）４００ｍｇにランダム化されたものと比較して、８００ｍｇのイマチニブにランダム化された低ＯＣＴ−１活性を有する患者がより大きな割合で、１２ヶ月でＭＭＲを得ること、（ｉｉ）低ＯＣＴ−１活性を有する患者について、１日あたり＞４００ｍｇ（この場合８００ｍｇ）のイマチニブ用量で有利な結果が観察されること；（ｉｉｉ）低ＯＣＴ−１活性を有する患者は８００ｍｇ以上に用量を増加することによってさらに利益を受けると思われることを示している。
このデータは、ＴＩＤＥＬ試験の最初の知見を支持し、したがってＭＭＲの達成におけるＯＣＴ−１活性の重要性について確認的な証拠を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温血動物における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置する方法であって、
（ａ）ＣＭＬを有する温血動物の治療前血液におけるＯＣＴ−１活性を測定する段階、および
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階
を含む方法。
【請求項２】
温血動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量４００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｂ）において、１日用量約６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）において、１日用量６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）において、１日用量６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）において、１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｂ）において、１日用量１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）において、１日用量１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭＬを有する温血動物が、約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示す、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１】
温血動物における慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置する方法であって、
（ａ）ＣＭＬを有する温血動物の治療前血液におけるＯＣＴ−１活性を測定する段階、および
（ｂ）約６．０〜１０．０ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示したＣＭＬを有する温血動物に、１日用量約５００〜１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩を投与する段階
を含む方法。
【請求項２】
温血動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量４００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｂ）において、少なくとも１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｂ）において、１日用量約６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）において、１日用量６００〜１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｂ）において、１日用量６００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｂ）において、１日用量８００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｂ）において、１日用量１０００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）において、１日用量１２００ｍｇのイマチニブメシル酸塩が経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＭＬを有する温血動物が、約８．０〜８．５ｎｇ／２００，０００細胞以下のイマチニブ細胞内濃度に対応するＯＣＴ−１活性を示す、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５３０８５４（Ｐ２０１０−５３０８５４Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２４６５（Ｐ２０１０−５１２４６５）
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／０００９１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００００２３
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５００１０９７５５）メドベット・サイエンス・プロプライエタリー・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００８／０００９１１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００００２３
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５００１０９７５５）メドベット・サイエンス・プロプライエタリー・リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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