ＧｌｙｃｏＰＥＧ化された顆粒球コロニー刺激因子
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子とＰＥＧ部分とのコンジュゲートを提供する。これらのコンジュゲートは、ペプチドと修飾基の間に介在しペプチドと修飾基に共有結合している完全なグリコシル結合基を介して連結されている。これらのコンジュゲートは、グリコシルトランスフェラーゼの作用により、グリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドの双方から形成される。グリコシルトランスフェラーゼは、ペプチド上のアミノ酸残基またはグリコシル残基に修飾された糖部分を連結する。コンジュゲートを含む医薬製剤も提供される。コンジュゲートを調製するための方法も、本発明の範囲内である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の部分を含む顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【化１】
（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
【化２】
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項３】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化３】
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項４】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化４】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項５】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化５】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項６】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化６】
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項７】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化７】
【請求項８】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化８】
【請求項９】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化９】
（式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基である。）
【請求項１０】
前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項９に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基が、配列番号：１の１３３位のトレオニンである、請求項１１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１および配列番号：２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化１０】
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０〜６の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０〜１００の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つが１であり、
ＡＡは、前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、以下の式で表される。
【化１１】
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項１５】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
生理活性を有する顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
以下の部分を含むＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、
【化１２】
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
（ａ）転移に適した条件のもとで、基質のＧ−ＣＳＦペプチドを、以下の式で表されるＰＥＧ−シアル酸供与体部分と、
【化１３】
前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基上に前記ＰＥＧ−シアル酸を転移させる酵素と、に接触させる工程を含む方法。
【請求項１８】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１７に記載の方法。
【化１４】
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項１９】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１５】
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項２０】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１６】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２１】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１７】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２２】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１８】
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２３】
前記工程（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主中で前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させる工程、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主が昆虫細胞および哺乳動物細胞から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物に請求項１に記載のペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物における炎症性白血球産生を刺激する方法。
【請求項２６】
治療を必要とする被験者の感染症を治療する方法であって、前記被験者の前記状態を改善するのに有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項２８】
不溶性の組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質をリフォールディングさせる方法であって
（ａ）ＧＣＳＦタンパク質を可溶化する工程と、
（ｂ）酸化還元対を含む緩衝液に前記可溶性ＧＣＳＦタンパク質を接触させて前記ＧＣＳＦタンパク質をリフォールディングさせる工程と、を含み、
前記リフォールディングされたＧＣＳＦタンパク質が生物学的に活性である方法。
【請求項１】
以下の部分を含む顆粒球コロニー刺激因子ペプチド。
【化１】
（式中、Ｄは−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項２】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１に記載のペプチド。
【化２】
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項３】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化３】
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項４】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化４】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項５】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化５】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項６】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１に記載のペプチド。
【化６】
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項７】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化７】
【請求項８】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化８】
【請求項９】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化９】
（式中、ＡＡは、前記ペプチドのアミノ酸残基である。）
【請求項１０】
前記アミノ酸残基が、セリンまたはトレオニンから選択されるメンバーである、請求項９に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１１】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸残基が、配列番号：１の１３３位のトレオニンである、請求項１１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１および配列番号：２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１４】
前記部分が以下の式で表される、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦペプチド。
【化１０】
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｉ、ｒ、ｓ、ｔ、およびｕは、０および１からそれぞれ独立に選択される整数であり、
ｑは１であり、
ｅ、ｆ、ｇ、およびｈは、０〜６の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｊ、ｋ、ｌ、およびｍは、０〜１００の整数からそれぞれ独立に選択されるメンバーであり、
ｖ、ｗ、ｘ、およびｙは、０および１からそれぞれ独立に選択され、ｖ、ｗ、ｘ、およびｙのうちの少なくとも１つが１であり、
ＡＡは、前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基であり、
Ｓｉａ−（Ｒ）は、以下の式で表される。
【化１１】
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
【請求項１５】
前記アミノ酸残基がアスパラギン残基である、請求項１４に記載のペプチド。
【請求項１６】
生理活性を有する顆粒球コロニー刺激因子ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１７】
以下の部分を含むＧ−ＣＳＦペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、
【化１２】
（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換もしくは非置換のアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である。）
（ａ）転移に適した条件のもとで、基質のＧ−ＣＳＦペプチドを、以下の式で表されるＰＥＧ−シアル酸供与体部分と、
【化１３】
前記Ｇ−ＣＳＦペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基上に前記ＰＥＧ−シアル酸を転移させる酵素と、に接触させる工程を含む方法。
【請求項１８】
Ｌ−Ｒ１が以下の式で表される、請求項１７に記載の方法。
【化１４】
（式中、ａは０〜２０の整数である。）
【請求項１９】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１５】
（式中、ｅおよびｆは１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑは０〜２０の整数である。）
【請求項２０】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１６】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑおよびｑ’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２１】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１７】
（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、１〜２０からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２２】
Ｒ１が以下から選択されるメンバーである構造を有する、請求項１７に記載の方法。
【化１８】
（式中、ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）
【請求項２３】
前記工程（ａ）の前に、
（ｂ）適切な宿主中で前記基質顆粒球コロニー刺激因子ペプチドを発現させる工程、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主が昆虫細胞および哺乳動物細胞から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物に請求項１に記載のペプチドを投与する工程を含む、哺乳動物における炎症性白血球産生を刺激する方法。
【請求項２６】
治療を必要とする被験者の感染症を治療する方法であって、前記被験者の前記状態を改善するのに有効な量の請求項１に記載のペプチドを前記被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の顆粒球コロニー刺激因子ペプチド、および製薬上許容される担体を含む医薬製剤。
【請求項２８】
不溶性の組換え顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質をリフォールディングさせる方法であって
（ａ）ＧＣＳＦタンパク質を可溶化する工程と、
（ｂ）酸化還元対を含む緩衝液に前記可溶性ＧＣＳＦタンパク質を接触させて前記ＧＣＳＦタンパク質をリフォールディングさせる工程と、を含み、
前記リフォールディングされたＧＣＳＦタンパク質が生物学的に活性である方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１１Ｋ】
【図１１Ｌ】
【図１１Ｍ】
【図１１Ｎ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１１Ｋ】
【図１１Ｌ】
【図１１Ｍ】
【図１１Ｎ】
【公表番号】特表２００７−５１３１８９（Ｐ２００７−５１３１８９Ａ）
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４２８８６（Ｐ２００６−５４２８８６）
【出願日】平成１６年１２月３日（２００４．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１００４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５５９４６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０００６２２５４）ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月３日（２００４．１２．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０４１００４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５５９４６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（５０００６２２５４）ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド (19)
【Ｆターム（参考）】
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