Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びＬ−アミノ酸の製造法
【課題】Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物、及び、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、または、アミノ酸輸液等として、Ｌ−フェニルアラニンはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの合成前駆体等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００３】
上記のような微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】
さらに、近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増大させること（特許文献５、特許文献６）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献７）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００５】
非特許文献２では、yggG遺伝子が、膜に局在する約２５ｋＤａの熱ショックタンパクで、その配列情報からメタロペプチダーゼと推測されるタンパク質をコードすること、および、yggG遺伝子産物がＧＴＰａｓｅであるEraタンパク質と相互作用することが報告されている。また、非特許文献３では、yggG遺伝子がera変異株やera過剰発現株で発現上昇することが報告されている。しかしながら、yggG遺伝子の生理的機能は特定されておらず、yggG遺伝子の発現増強とＬ−アミノ酸生産の関係については調べられていない。
【特許文献１】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献５】米国特許第5168056号明細書
【特許文献６】米国特許第5776736号明細書
【特許文献７】米国特許第5906925号明細書
【非特許文献１】明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 8−15
【非特許文献３】Curr Microbiol. 2008 Jan;56(1):14-20. Epub 2007 Oct 2.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）yggG遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりyggG遺伝子の発現が増大した、前記微生物。
（３）yggG遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載の遺伝子である、前記微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子。
（４）前記yggG遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできるＤＮＡ。
（５）エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌又はパントエア属細菌である、前記微生物。
（６）エシェリヒア属細菌である、前記微生物。
（７）前記いずれかの微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
（９）前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及びＬ−スレオニンから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、又はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本
発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１１】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等のような酸性アミノ酸が挙げられ、特に、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンなどの芳香族アミノ酸やＬ−スレオニンが好ましい。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１２】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１３】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属を用いることが望ましい。
【００１４】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１５】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
【００１７】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。
【００１８】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１９】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２０】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２１】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２２】
エルビニア・アミロボーラATCC15580株
エルビニア・カロトボーラATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368
号明細書)
【００２３】
以下、腸内細菌科に属する微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの微生物にＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００２４】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２６】
以下、Ｌ−アミノ酸生産菌又はその構築方法を例として示す。
【００２７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
まず、Ｌ−アミノ酸生産菌として、Ｌ−グルタミン酸生産菌について例示する。
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する、又は細菌のＬ−グルタミン酸生産能を増強するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（以下「ＰＲＰＣ」ともいう）（prpC）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいず
れか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。（WO2006/051660号パンフレット参照）。
【００２９】
以下に、目的遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を例示する。
【００３０】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（gltA遺伝子）あるいはＰＲＰＣをコードする遺伝子（prpC遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ppc遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（gdhA遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Biochemistry、第22巻、5243〜5249頁、1983年；J. Biochem.、第95巻、909〜916頁、1984年；Gene、第27巻、193〜199頁、1984年；Microbiology、第140巻、1817〜1828頁、1994年；Mol. Gen. Genet.、第218巻、330〜339頁、1989年；Molecular Microbiology、第6巻、317〜326頁、1992年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、腸内細菌科に属する細菌から染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００３１】
形質転換に用いるプラスミドとしては、腸内細菌群に属する細菌の中で自律複製可能なプラスミド、例えばpUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、gltA遺伝子、ppc遺伝子及びgdhA遺伝子が組み込まれたRSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）、及びRSFCPGのgltA遺伝子をprpCに置き換えたRSFPPGが挙げられる。
【００３２】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen, S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood,O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００３３】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
【００３４】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PRプロモーター、lacUVプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。
【００３５】
発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。本発明の腸内細菌科に属する細菌に使用できる出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が挙げられる。
【００３６】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【００３７】
なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００３８】
上記のような遺伝子置換を行う方法としては、例えば「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００３９】
尚、Redドリブンインテグレーションには、参考例１に示すように、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株、例えばパントエア・アナナティスSC17(0)株を好適に用いることができる。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【００４０】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、メチルクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開平2001-333769号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2000-333769、特開2006-129840、国際公開2006/051660号パンフレット等に記載された微生物が例示できる。
【００４１】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。
【００４２】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ）(sucA)、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ(putA)などが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００４３】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。
【００４４】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って測定することができる。
【００４５】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌としては、以下の菌株が挙げられる（米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号）。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624 (FERM BP-3853)
エシェリヒア・コリAJ12628 (FERM BP-3854)
エシェリヒア・コリAJ12949 (FERM BP-4881)
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr は、エシェリヒア・コリW3110の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA遺伝子）を破壊することにより得られた株である。この株は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００４６】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した他の細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。
【００４７】
パントエア・アナナティスAJ13601（FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989）
パントエア・アナナティスAJ13356（FERM BP-6615 米国特許6.331,419号）
パントエア・アナナティスSC17sucA（FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号）
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410（FERM BP-6617 米国特許6,197,559号）
【００４８】
尚、SC17sucA株は、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として自然界より単離されたAJ13355株から、粘液質低生産変異株（SC17）を取得し、同株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA）を破壊することによって得られた株である。AJ13601は、このSC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhA
の各遺伝子を含むプラスミドRSFCPG、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から、さらに、低pHにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である（欧州特許出願公開0952221号明細書）。AJ13356は、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させた株である。
AJ13355株及びAJ13356株は、平成１０年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ受託番号FERM P-16644、及びFERMP-16645として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614、及びFERM BP-6615が付与されている。SC17sucA株は、プライベートナンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。AJ13601株は、1999年8月18日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００４９】
上記パントエア・アナナティスAJ13355株、AJ13356株、AJ13601株、及び前述のクレブシエラ・プランティコーラAJ13399株は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する。
【００５０】
また、腸内細菌科のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるためには、arcA遺伝子を欠損させる方法（米国特許7,090,998号公報）、グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅させる方法（WO2005/085419パンフレット）も用いることが出来る。
【００５１】
上記の酵素活性を増強又は欠損させる方法は、以下に示す他のアミノ酸の生産菌についても、同様に適用することができる。
【００５２】
Ｌ−スレオニン生産菌
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。VKPM B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。VKPM B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-3996で寄託されている。
【００５４】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００５５】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００５６】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００５７】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００５８】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００５９】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製さ
れたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００６０】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００６１】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００６２】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００６３】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００６４】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００６５】
Ｌ−システイン生産菌
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換
されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００７０】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００７１】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005
099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００７２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089（ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
また、AJ12741株も親株として使用することができる。AJ12741株は、tyrR、tyrA遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリK-12のW3110株に、フィードバック阻害が解除された３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、フィードバック阻害が解除されたコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ、およびシキミ酸キナーゼのそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミドpMGAL1を導入した株（W3110(tyrR、tyrA)/pMGAL1）である（特許第3225597号公報）。同株は、平成４年６月１１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-13000の受託番号で寄託され、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-4796として寄託されている。
【００７３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667A1)。
【００７４】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする
変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００７５】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００７６】
Ｌ−プロリン生産菌
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００７７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００８０】
Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定
されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００８１】
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００８２】
Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株（特開平5-130882号）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００８３】
＜１−２＞yggG遺伝子の発現を増大させるための改変
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、yggG遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、yggG遺伝子の発現が増大するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。
【００８４】
なお、yggG遺伝子の発現量を増大させるための改変は、プロモーター改変を始めとする発現調節領域の改変などによる内因性遺伝子の発現を増大させることであってもよいし、yggG遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現を増大させることであってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００８５】
本発明において、「yggG遺伝子の発現が増大するように改変された」とは、例えば、野生株又は非改変株と比較して、yggG遺伝子の発現量が増大していればよいが、野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に増大するように改変されていることが好ましい。また、比較対象となる野生型の腸内細菌科に属する微生物とは、例えばエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）や、パントエア・アナナティスAJ13355（FERM BP-6615）等が挙げられる。
【００８６】
yggG遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、yggG遺伝子のmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRなどが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００８７】
本発明の微生物において、発現を増大させるために使用するyggG遺伝子としては、配列番号１の塩基配列を有するエシェリヒア・コリ由来のyggG遺伝子が例示される。
さらに、yggG遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、
エルシニア属等の腸内細菌科に属する微生物からクローニングされるものであってもよい。
【００８８】
本発明に用いることが出来るyggG遺伝子は、既に配列が明らかにされている腸内細菌科に属する微生物の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、腸内細菌科に属する微生物の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって取得することができる。例えば、エシェリヒア・コリ由来のyggG遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型にし、配列番号３および４のプライマーを使用したPCRにより取得できる。他の微生物のyggG遺伝子のホモログも、同様にして取得され得る。
【００８９】
yggG遺伝子ホモログとは、エシェリヒア・コリのyggG遺伝子と高い類似性を示し、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子をいう。
yggG遺伝子ホモログは、配列番号２のアミノ酸配列全体に対し８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子を意味する。
【００９０】
ここで、「L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させる遺伝子」とは、遺伝子を上述したようなL-アミノ酸生産菌に導入した時に、該L-アミノ酸生産菌によって蓄積されるL-アミノ酸の量を、導入前と比較して増加させることができる遺伝子をいう。例えば、実施例に記載されたようなL-スレオニン生産菌E.coli VKPM B-3996株やL-フェニルアラニン生産菌E.coli AJ12741株にyggG遺伝子ホモログを導入し、該遺伝子導入株を非導入株とともに培養し、蓄積したL-スレオニンやL-フェニルアラニンの量を測定し、その量が非導入株に比べて増加していれば、そのようなyggG遺伝子ホモログを本発明の微生物の育種において使用することができる。
【００９１】
yggG遺伝子は、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させるものである限り、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、yggG遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異によって生じるものも含まれる。
【００９２】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe、trp、tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu、ile、val間で、極性アミノ酸である場合には、gln，asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys、arg、his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp、glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser、thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙
げられる。
【００９３】
また、yggG遺伝子は、宿主微生物により、遺伝子の縮重性が異なるので、yggG遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にyggG遺伝子は、増幅することによりＬ−アミノ酸の生産能を向上させることができる限り、コードされる各サブユニットのＮ末端側、及び／又は、Ｃ末端側が延長又は削られていてもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長又は削除されていてもよい。
【００９４】
yggG遺伝子は、さらに、配列番号１の塩基配列に相補的な配列を有するDNAまたは同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させるDNAであってもよい。
【００９５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、８０％以上、好ましく９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC, 0.1%SDS、好ましくは0.1×SSC, 0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００９６】
プローブは、yggG遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、yggG遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、yggG遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSで1回または２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００９７】
このようなyggG遺伝子のホモログ遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１の塩基配列中のコード領域を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号１の塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する微生物を、紫外線またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))などの方法が挙げられ、これによって人工的にyggG遺伝子に変異を導入して活性の高いyggG遺伝子を取得することが出来る。このようなyggG遺伝子のホモログがL-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させる否かは、上述したように、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物に導入し、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。
【００９８】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中または菌体内に生成蓄積させ、該培地または菌体からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する
ことができる。
【００９９】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【０１００】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【０１０１】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。通気量等の条件は用いるＬ−アミノ酸生産菌の種類や性質に基づいて適宜設定することができる。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に目的アミノ酸が蓄積される。
【０１０２】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
【０１０３】
なお、本発明において、特に芳香族Ｌ−アミノ酸生産菌を培養する場合、微好気条件で培養を行うことが好ましい。微好気条件とは、培地中の溶存酸素濃度が、25%以下、好ましくは20％以下、さらに好ましくは15%以下の条件をいう。また、培地中の酸素移動容量係数（Kla)が、100以下であることが好ましく、75以下であることがより好ましく、50以下であることがさらに好ましい。
【０１０４】
尚、培養中の酸素濃度は、培養の全行程において微好気条件であることが好ましいが、微好気条件である工程は一部分でもよい。例えば、本発明の方法が、Ｌ−アミノ酸生産能を持つ微生物を増殖させる段階（増殖期）と、Ｌ−アミノ酸を産生させる段階（L−アミノ酸生産期）を含む場合、L−アミノ酸生産期において微好気条件であればよく、Ｌ−アミノ酸蓄積微生物を増殖させる増殖期においては、好気条件と微好気条件のいずれでもよい。ここで、「増殖期」とは、培養開始から３時間、好ましくは６時間、特に好ましくは、１０時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、一方、「L−アミノ酸生産期」とは、培養開始から３時間以降、好ましくは６時間以降、特に好ましくは１０時間以降炭素源が主にL−アミノ酸生産に用いられている時期を意味する。
【０１０５】
また、本発明の方法によってＬ−フェニルアラニンを製造する場合、製造されたＬ−フェニルアラニンは、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。上記の本発明の方法によって得られたＬ−フェニルアラニン結晶を溶解し、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体とからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを製造することができる。低級アルキルエステルとし
ては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【０１０６】
Ｌ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にＬ−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第3,786,039号）。Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたＬ−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ−ホルミル−、Ｎ−カルボベンゾキシ−、又はＮ−ｐ−メトキシカルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物のようなＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンと、Ｎ−アシル−β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する（特開昭51-113841）。続いて、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを得る。
【０１０７】
また、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルから、Ｌ−フェニルアラニンが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのβ−エステル部位には求核攻撃せず、α−エステル部位を求核攻撃する反応を触媒する能力を有する酵素または酵素含有物を用いてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成させ、得られたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−エステルを生成させることにより、簡便かつ高収率でα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−エステルを製造することができる（WO2004/065610）。
【０１０８】
さらに、スフィンゴバクテリアム由来のペプチド合成酵素の変異体を用いて、ジペプチドを合成する技術が開示されており、この技術を利用してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる（WO2006/075486）。
【実施例】
【０１０９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１１０】
エシェリヒア・コリyggG遺伝子のクローニングと発現ベクター構築
Primer
Forward 5'→3' GCTCTAGAGATGAAAATTCGCG 22bp （配列番号３）
Reverse 5'→3' CGGAATTCTTACTTAATCCCATC 23bp（配列番号４）
エシェリヒア・コリ MM294株の染色体DNAを鋳型とし、上記のプライマーとKOD plus DNApolymerase(TOYOBO社製)を用いてPCR反応を行い、0.8 KbpのDNA断片を得た。PCR反応の条件は94℃ 2分間，55℃ 1.5分間，68℃ 1.5分間の反応を1サイクルとして30サイクル行った。
得られたDNA断片をアガロース電気泳動し、DNA回収キット(QIAGEN社製)を用いて回収した。このDNA断片を制限酵素XbaIとEcoRIによって切断した後，プラスミド pHSG299 (タカラバイオ社製)のXbaI，EcoRI切断物とライゲーションキット(ニッポンジーン社製)によって連結した。これをエシェリヒア・コリDH5αに形質転換し，プラスミドを回収した（pHSG299-yggG）。
【０１１１】
〔実施例１〕yggG高発現Ｌ−フェニルアラニン生産株の構築とＬ−フェニルアラニンの製造
フェニルアラニン生産菌エシェリヒア・コリAJ12741株（FERM BP-4796）を上記プラスミドpHSG299-yggGで形質転換し、AJ12741/pHSG299-yggG株を得た。
AJ12741/pHSG299-yggG株およびAJ12741株（コントロール）のグリセロールストックをLB-アガロースプレート培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、37℃で24時間、静地培養した。この培養菌体を200ml坂口フラスコに入れた40mlの培地（表１）に1エーゼ（約10μl）接種し、37℃で振盪培養した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
初発添加グルコースが消費された後、それぞれの株でL-フェニルアラニン濃度を測定した。その結果、yggG発現増強株において収率、L-フェニルアラニン蓄積の向上が認められた（表２）。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
〔実施例２〕yggG高発現Ｌ−スレオニン生産株の構築とＬ−スレオニンの製造
Ｌ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリVKPM B-3996（B-3996）を上記プラスミドpHSG299-yggGで形質転換し、B-3996/pHSG299-yggG株を得た。
B-3996/pHSG299-yggG株及びB-3996株（コントロール）のグリセロールストックをLB-アガロースプレート培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、37℃で24時間、静地培養した。この培養菌体を200ml坂口フラスコに入れた40mlの培地（表3）に1エーゼ（約10μl）接種し、40℃で振盪培養した。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
初発添加グルコースが消費された後、それぞれの株でL-スレオニン濃度を測定した。その結果、yggG発現増強株において収率、L-スレオニン蓄積の向上が認められた（表４）。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
〔配列表の説明〕
配列番号１：E.coliのyggG 遺伝子の塩基配列
配列番号２：E.coliのyggG 遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号３：E.coliのyggG 遺伝子をクローニングするためのフォワードプライマー
配列番号４：E.coliのyggG 遺伝子をクローニングするためのリバースプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にＬ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、または、アミノ酸輸液等として、Ｌ−フェニルアラニンはα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの合成前駆体等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、種々の微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（例えば、非特許文献１参照）。その他の微生物を用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物（例えば、特許文献１参照）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンディダ属等の微生物（例えば、特許文献２参照）、バチルス属、シュードモナス属、セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバクター・アエロゲネス）等の微生物（例えば、特許文献３参照）、エシェリヒア・コリの変異株（例えば、特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。また、クレブシエラ属、エルビニア属又はパントエア属、エンテロバクター属に属する微生物を用いたＬ−グルタミン酸の製造法も開示されている（例えば、特許文献２〜４参照）。
【０００３】
上記のような微生物を用いた発酵法によってＬ−アミノ酸等の目的物質を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】
さらに、近年は、目的物質の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われている。例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増大させること（特許文献５、特許文献６）、又はＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献７）によって、微生物のＬ−アミノ酸生産性を向上させることが行われている。
【０００５】
非特許文献２では、yggG遺伝子が、膜に局在する約２５ｋＤａの熱ショックタンパクで、その配列情報からメタロペプチダーゼと推測されるタンパク質をコードすること、および、yggG遺伝子産物がＧＴＰａｓｅであるEraタンパク質と相互作用することが報告されている。また、非特許文献３では、yggG遺伝子がera変異株やera過剰発現株で発現上昇することが報告されている。しかしながら、yggG遺伝子の生理的機能は特定されておらず、yggG遺伝子の発現増強とＬ−アミノ酸生産の関係については調べられていない。
【特許文献１】特開平５−２４４９７０号公報
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号明細書
【特許文献３】特公昭３２−９３９３号公報
【特許文献４】特開２０００−１８９１７５号公報
【特許文献５】米国特許第5168056号明細書
【特許文献６】米国特許第5776736号明細書
【特許文献７】米国特許第5906925号明細書
【非特許文献１】明石邦彦ら著 アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【非特許文献２】FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 8−15
【非特許文献３】Curr Microbiol. 2008 Jan;56(1):14-20. Epub 2007 Oct 2.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる腸内細菌科に属する微生物を提供すること、及び該微生物を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
（２）yggG遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりyggG遺伝子の発現が増大した、前記微生物。
（３）yggG遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載の遺伝子である、前記微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子。
（４）前記yggG遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、前記微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできるＤＮＡ。
（５）エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌又はパントエア属細菌である、前記微生物。
（６）エシェリヒア属細菌である、前記微生物。
（７）前記いずれかの微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（８）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
（９）前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及びＬ−スレオニンから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、又はＬ−システイン、Ｌ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本
発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１１】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリンのような塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシンのような脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリンのようなヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリンのような環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンのような芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンのような含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等のような酸性アミノ酸が挙げられ、特に、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシンなどの芳香族アミノ酸やＬ−スレオニンが好ましい。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１２】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
【００１３】
本発明に用いる微生物としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、サルモネラ属、モルガネラ属など、腸内細菌科に属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものであれば、特に限定されない。具体的にはNCBI（National Center for Biotechnology Information）データベースに記載されている分類により腸内細菌科に属するものが利用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）。改変に用いる腸内細菌科の親株としては、中でもエシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、パントエア属細菌、エルビニア属、エンテロバクター属、又はクレブシエラ属を用いることが望ましい。
【００１４】
本発明のエシェリヒア属細菌を得るために用いるエシェリヒア属細菌の親株としては、特に限定されないが、具体的にはNeidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるものが利用できる。その中では、例えばエシェリヒア・コリが挙げられる。エシェリヒア・コリとしては具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１５】
これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１６】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。
【００１７】
特に、パントエア属細菌、エルビニア属細菌、エンテロバクター属細菌は、γ−プロテオバクテリアに分類される細菌であり、分類学的に非常に近縁である（J Gen Appl Microbiol 1997 Dec;43(6) 355-361, International Journal of Systematic Bacteriology, Oct. 1997,p1061-1067）。近年、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験等により、エンテロバクター属に属する細菌には、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・ディスパーサ（Pantoea dispersa）等に再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, July 1989;39(3).p.337-345）。また、エルビニア属に属する細菌にはパントエア・アナナス（Pantoea ananas）、パントエア・スチューアルティに再分類されているものがある（International Journal of Systematic Bacteriology, Jan 1993;43(1), p.162-173 参照）。
【００１８】
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacteragglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には、欧州特許出願公開952221号明細書に例示された菌株を使用することが出来る。
エンテロバクター属の代表的な株として、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。
【００１９】
パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２０】
パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13356株（FERM BP-6615）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
パントエア・アナナティスAJ13601株（FERM BP-7207）(欧州特許出願公開0952221号明細書)
これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２１】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。具体的には、下記の菌株が挙げられる。
【００２２】
エルビニア・アミロボーラATCC15580株
エルビニア・カロトボーラATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株（FERM BP-6600）(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株（FERM BP-6617）(欧州特許出願公開955368
号明細書)
【００２３】
以下、腸内細菌科に属する微生物にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又はこれらの微生物にＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００２４】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第77-100頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２６】
以下、Ｌ−アミノ酸生産菌又はその構築方法を例として示す。
【００２７】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
まず、Ｌ−アミノ酸生産菌として、Ｌ−グルタミン酸生産菌について例示する。
本発明のＬ−グルタミン酸生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する、又は細菌のＬ−グルタミン酸生産能を増強するための改変の方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」ともいう）(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（以下「ＰＲＰＣ」ともいう）（prpC）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいず
れか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。（WO2006/051660号パンフレット参照）。
【００２９】
以下に、目的遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を例示する。
【００３０】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得られたプラスミドを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。例えば、目的遺伝子としてＣＳをコードする遺伝子（gltA遺伝子）あるいはＰＲＰＣをコードする遺伝子（prpC遺伝子）、ＰＥＰＣをコードする遺伝子（ppc遺伝子）、およびＧＤＨをコードする遺伝子（gdhA遺伝子）を用いる場合、これらの遺伝子はエシェリヒア属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌において、既に塩基配列が明らかにされていることから（Biochemistry、第22巻、5243〜5249頁、1983年；J. Biochem.、第95巻、909〜916頁、1984年；Gene、第27巻、193〜199頁、1984年；Microbiology、第140巻、1817〜1828頁、1994年；Mol. Gen. Genet.、第218巻、330〜339頁、1989年；Molecular Microbiology、第6巻、317〜326頁、1992年）、それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、腸内細菌科に属する細菌から染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００３１】
形質転換に用いるプラスミドとしては、腸内細菌群に属する細菌の中で自律複製可能なプラスミド、例えばpUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージＤＮＡをベクターとして用いてもよい。上記ＣＳ又はＰＲＰＣ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの活性を同時に増強するためのプラスミドとして、gltA遺伝子、ppc遺伝子及びgdhA遺伝子が組み込まれたRSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）、及びRSFCPGのgltA遺伝子をprpCに置き換えたRSFPPGが挙げられる。
【００３２】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen, S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood,O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【００３３】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（Experimentsin Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。
【００３４】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列をより強力なものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PRプロモーター、lacUVプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。
【００３５】
発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。本発明の腸内細菌科に属する細菌に使用できる出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載のプラスミドpMAN997等が挙げられる。
【００３６】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【００３７】
なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【００３８】
上記のような遺伝子置換を行う方法としては、例えば「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００３９】
尚、Redドリブンインテグレーションには、参考例１に示すように、λ Red遺伝子産物に耐性な菌株、例えばパントエア・アナナティスSC17(0)株を好適に用いることができる。同株は、2005年9月21にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika）（住所：Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1）に受託番号VKPM B-9246のもとに寄託されている。
【００４０】
以上のような方法によりクエン酸シンターゼ遺伝子、メチルクエン酸シンターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増強するように改変された微生物としては、特開平2001-333769号公報、特開2000-106869号公報、特開2000-189169号公報、特開2000-333769、特開2006-129840、国際公開2006/051660号パンフレット等に記載された微生物が例示できる。
【００４１】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能は、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性を増強させることによっても付与することが出来る。６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を上昇させた微生物としては、特開2003-274988に開示された微生物を挙げることが出来る。
【００４２】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための改変は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させることにより行ってもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ）(sucA)、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ(putA)などが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００４３】
上記のような酵素の活性を低下または欠損させるには、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク質をコードするコード領域であってもよく、プロモーター等の発現制御領域であってもよい。また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法がある。
【００４４】
細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と比較することによって確認することができる。例えば、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reedらの方法（L.J. Reed and B.B. Mukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って測定することができる。
【００４５】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌としては、以下の菌株が挙げられる（米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号）。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624 (FERM BP-3853)
エシェリヒア・コリAJ12628 (FERM BP-3854)
エシェリヒア・コリAJ12949 (FERM BP-4881)
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr は、エシェリヒア・コリW3110の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA遺伝子）を破壊することにより得られた株である。この株は、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００４６】
２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が欠損もしくは低下した他の細菌としては、具体的には次のような株が挙げられる。
【００４７】
パントエア・アナナティスAJ13601（FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989）
パントエア・アナナティスAJ13356（FERM BP-6615 米国特許6.331,419号）
パントエア・アナナティスSC17sucA（FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号）
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410（FERM BP-6617 米国特許6,197,559号）
【００４８】
尚、SC17sucA株は、低ｐＨでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として自然界より単離されたAJ13355株から、粘液質低生産変異株（SC17）を取得し、同株の２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucA）を破壊することによって得られた株である。AJ13601は、このSC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のgltA、ppc、gdhA
の各遺伝子を含むプラスミドRSFCPG、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のgltA遺伝子を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から、さらに、低pHにおける高濃度Ｌ−グルタミン酸耐性株の選択、及び増殖度及びＬ−グルタミン酸生産能が高い株の選択によって、取得された菌株である（欧州特許出願公開0952221号明細書）。AJ13356は、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させた株である。
AJ13355株及びAJ13356株は、平成１０年２月１９日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれ受託番号FERM P-16644、及びFERMP-16645として寄託され、平成１１年１月１１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614、及びFERM BP-6615が付与されている。SC17sucA株は、プライベートナンバーAJ417が付与され、平成１６年２月２６日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。AJ13601株は、1999年8月18日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現名称、産業技術総合研究所特許生物寄託センター、住所 郵便番号305-8566 茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００４９】
上記パントエア・アナナティスAJ13355株、AJ13356株、AJ13601株、及び前述のクレブシエラ・プランティコーラAJ13399株は、酸性条件下で培養したときに液体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する。
【００５０】
また、腸内細菌科のＬ−グルタミン酸生産能を向上させるためには、arcA遺伝子を欠損させる方法（米国特許7,090,998号公報）、グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子を増幅させる方法（WO2005/085419パンフレット）も用いることが出来る。
【００５１】
上記の酵素活性を増強又は欠損させる方法は、以下に示す他のアミノ酸の生産菌についても、同様に適用することができる。
【００５２】
Ｌ−スレオニン生産菌
本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。VKPM B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。VKPM B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-3996で寄託されている。
【００５４】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、本発明のＬ−スレオニン生産菌を誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００５５】
好ましくは、本発明の細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００５６】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００５７】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００５８】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている（rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性）。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００５９】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製さ
れたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００６０】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００６１】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００６２】
WC196株は、Escherichia coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、Escherichia coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００６３】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大している株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子(dapA)、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(asd)及びアスルターゼ遺伝子(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００６４】
本発明のＬ−リジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００６５】
Ｌ−システイン生産菌
本発明のＬ−システイン生産菌を誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする複数種のcysEアレルで形質転換
されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされるシステインレギュロンの正の転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
Ｌ−ロイシン生産菌
本発明のＬ−ロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００６８】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明のＬ−ヒスチジン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００７０】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００７１】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005
099号)、アミノ酸輸送の遺伝子であるrhtを導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００７２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
本発明のＬ−フェニルアラニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089（ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
また、AJ12741株も親株として使用することができる。AJ12741株は、tyrR、tyrA遺伝子を欠失したエシェリヒア・コリK-12のW3110株に、フィードバック阻害が解除された３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、フィードバック阻害が解除されたコリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ、およびシキミ酸キナーゼのそれぞれをコードする遺伝子を含むプラスミドpMGAL1を導入した株（W3110(tyrR、tyrA)/pMGAL1）である（特許第3225597号公報）。同株は、平成４年６月１１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にFERM P-13000の受託番号で寄託され、平成６年９月１４日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、FERM BP-4796として寄託されている。
【００７３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667A1)。
【００７４】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする
変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００７５】
本発明のＬ−トリプトファン生産菌を誘導するための親株の例としては、解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００７６】
Ｌ−プロリン生産菌
本発明のＬ−プロリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明の細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００７７】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−アルギニン生産菌
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明のＬ−アルギニン生産菌を誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。このような遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００８０】
Ｌ−バリン生産菌
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定
されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００８１】
本発明のＬ−バリン生産菌を誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００８２】
Ｌ−イソロイシン生産菌
本発明のＬ−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株（特開平5-130882号）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００８３】
＜１−２＞yggG遺伝子の発現を増大させるための改変
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する腸内細菌科に属する微生物を、yggG遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。ただし、yggG遺伝子の発現が増大するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。
【００８４】
なお、yggG遺伝子の発現量を増大させるための改変は、プロモーター改変を始めとする発現調節領域の改変などによる内因性遺伝子の発現を増大させることであってもよいし、yggG遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現を増大させることであってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００８５】
本発明において、「yggG遺伝子の発現が増大するように改変された」とは、例えば、野生株又は非改変株と比較して、yggG遺伝子の発現量が増大していればよいが、野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に増大するように改変されていることが好ましい。また、比較対象となる野生型の腸内細菌科に属する微生物とは、例えばエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）や、パントエア・アナナティスAJ13355（FERM BP-6615）等が挙げられる。
【００８６】
yggG遺伝子の発現量が上昇したことの確認は、yggG遺伝子のmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRなどが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００８７】
本発明の微生物において、発現を増大させるために使用するyggG遺伝子としては、配列番号１の塩基配列を有するエシェリヒア・コリ由来のyggG遺伝子が例示される。
さらに、yggG遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、
エルシニア属等の腸内細菌科に属する微生物からクローニングされるものであってもよい。
【００８８】
本発明に用いることが出来るyggG遺伝子は、既に配列が明らかにされている腸内細菌科に属する微生物の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて、腸内細菌科に属する微生物の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって取得することができる。例えば、エシェリヒア・コリ由来のyggG遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型にし、配列番号３および４のプライマーを使用したPCRにより取得できる。他の微生物のyggG遺伝子のホモログも、同様にして取得され得る。
【００８９】
yggG遺伝子ホモログとは、エシェリヒア・コリのyggG遺伝子と高い類似性を示し、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子をいう。
yggG遺伝子ホモログは、配列番号２のアミノ酸配列全体に対し８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつ、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子を意味する。
【００９０】
ここで、「L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させる遺伝子」とは、遺伝子を上述したようなL-アミノ酸生産菌に導入した時に、該L-アミノ酸生産菌によって蓄積されるL-アミノ酸の量を、導入前と比較して増加させることができる遺伝子をいう。例えば、実施例に記載されたようなL-スレオニン生産菌E.coli VKPM B-3996株やL-フェニルアラニン生産菌E.coli AJ12741株にyggG遺伝子ホモログを導入し、該遺伝子導入株を非導入株とともに培養し、蓄積したL-スレオニンやL-フェニルアラニンの量を測定し、その量が非導入株に比べて増加していれば、そのようなyggG遺伝子ホモログを本発明の微生物の育種において使用することができる。
【００９１】
yggG遺伝子は、L-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させるものである限り、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、yggG遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異によって生じるものも含まれる。
【００９２】
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、phe、trp、tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、leu、ile、val間で、極性アミノ酸である場合には、gln，asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、lys、arg、his間で、酸性アミノ酸である場合には、asp、glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ser、thr間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからgly、asn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙
げられる。
【００９３】
また、yggG遺伝子は、宿主微生物により、遺伝子の縮重性が異なるので、yggG遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にyggG遺伝子は、増幅することによりＬ−アミノ酸の生産能を向上させることができる限り、コードされる各サブユニットのＮ末端側、及び／又は、Ｃ末端側が延長又は削られていてもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。より具体的には、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端側50アミノ酸から5アミノ酸、Ｃ末端側50アミノ酸から5アミノ酸延長又は削除されていてもよい。
【００９４】
yggG遺伝子は、さらに、配列番号１の塩基配列に相補的な配列を有するDNAまたは同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させるDNAであってもよい。
【００９５】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、８０％以上、好ましく９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC, 0.1%SDS、好ましくは0.1×SSC, 0.1%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００９６】
プローブは、yggG遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、yggG遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、yggG遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC, 0.1%SDSで1回または２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００９７】
このようなyggG遺伝子のホモログ遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１の塩基配列中のコード領域を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号１の塩基配列をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する微生物を、紫外線またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンPCR(Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR(Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998))などの方法が挙げられ、これによって人工的にyggG遺伝子に変異を導入して活性の高いyggG遺伝子を取得することが出来る。このようなyggG遺伝子のホモログがL-アミノ酸生産菌のL-アミノ酸生産能を向上させる否かは、上述したように、これらの遺伝子をＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する微生物に導入し、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。
【００９８】
＜２＞本発明のＬ−アミノ酸の製造法
本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中または菌体内に生成蓄積させ、該培地または菌体からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造する
ことができる。
【００９９】
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
【０１００】
炭素源としては、グルコース、グリセロール、フラクトース、スクロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類が使用でき、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類も単独あるいは他の炭素源と併用して用いることができる。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができる。有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用でき、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。
【０１０１】
培養は、好ましくは、発酵温度２０〜４５℃、ｐＨを３〜９に制御し、通気培養を行う。通気量等の条件は用いるＬ−アミノ酸生産菌の種類や性質に基づいて適宜設定することができる。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス等のアルカリで中和する。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に目的アミノ酸が蓄積される。
【０１０２】
培養終了後の培養液からＬ−アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃縮晶析する方法あるいはイオン交換クロマトグラフィー等によって採取される。
【０１０３】
なお、本発明において、特に芳香族Ｌ−アミノ酸生産菌を培養する場合、微好気条件で培養を行うことが好ましい。微好気条件とは、培地中の溶存酸素濃度が、25%以下、好ましくは20％以下、さらに好ましくは15%以下の条件をいう。また、培地中の酸素移動容量係数（Kla)が、100以下であることが好ましく、75以下であることがより好ましく、50以下であることがさらに好ましい。
【０１０４】
尚、培養中の酸素濃度は、培養の全行程において微好気条件であることが好ましいが、微好気条件である工程は一部分でもよい。例えば、本発明の方法が、Ｌ−アミノ酸生産能を持つ微生物を増殖させる段階（増殖期）と、Ｌ−アミノ酸を産生させる段階（L−アミノ酸生産期）を含む場合、L−アミノ酸生産期において微好気条件であればよく、Ｌ−アミノ酸蓄積微生物を増殖させる増殖期においては、好気条件と微好気条件のいずれでもよい。ここで、「増殖期」とは、培養開始から３時間、好ましくは６時間、特に好ましくは、１０時間以内の、炭素源が主に菌体生育に使用されている時期、すなわち微生物が対数的に増殖している時期を意味し、一方、「L−アミノ酸生産期」とは、培養開始から３時間以降、好ましくは６時間以降、特に好ましくは１０時間以降炭素源が主にL−アミノ酸生産に用いられている時期を意味する。
【０１０５】
また、本発明の方法によってＬ−フェニルアラニンを製造する場合、製造されたＬ−フェニルアラニンは、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。上記の本発明の方法によって得られたＬ−フェニルアラニン結晶を溶解し、得られたＬ−フェニルアラニンと、アスパラギン酸又はその誘導体とからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを製造することができる。低級アルキルエステルとし
ては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【０１０６】
Ｌ−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にＬ−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第3,786,039号）。Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このＬ−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたＬ−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ−ホルミル−、Ｎ−カルボベンゾキシ−、又はＮ−ｐ−メトキシカルボベンゾキシ−Ｌ−アスパラギン酸無水物のようなＮ−アシル−Ｌ−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンと、Ｎ−アシル−β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する（特開昭51-113841）。続いて、Ｎ−アシル−α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを得る。
【０１０７】
また、Ｌ−フェニルアラニンとＬ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルから、Ｌ−フェニルアラニンが、Ｌ−アスパラギン酸−α，β−ジエステルのβ−エステル部位には求核攻撃せず、α−エステル部位を求核攻撃する反応を触媒する能力を有する酵素または酵素含有物を用いてα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルを生成させ、得られたα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルからα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−エステルを生成させることにより、簡便かつ高収率でα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−エステルを製造することができる（WO2004/065610）。
【０１０８】
さらに、スフィンゴバクテリアム由来のペプチド合成酵素の変異体を用いて、ジペプチドを合成する技術が開示されており、この技術を利用してα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンを製造することができる（WO2006/075486）。
【実施例】
【０１０９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１１０】
エシェリヒア・コリyggG遺伝子のクローニングと発現ベクター構築
Primer
Forward 5'→3' GCTCTAGAGATGAAAATTCGCG 22bp （配列番号３）
Reverse 5'→3' CGGAATTCTTACTTAATCCCATC 23bp（配列番号４）
エシェリヒア・コリ MM294株の染色体DNAを鋳型とし、上記のプライマーとKOD plus DNApolymerase(TOYOBO社製)を用いてPCR反応を行い、0.8 KbpのDNA断片を得た。PCR反応の条件は94℃ 2分間，55℃ 1.5分間，68℃ 1.5分間の反応を1サイクルとして30サイクル行った。
得られたDNA断片をアガロース電気泳動し、DNA回収キット(QIAGEN社製)を用いて回収した。このDNA断片を制限酵素XbaIとEcoRIによって切断した後，プラスミド pHSG299 (タカラバイオ社製)のXbaI，EcoRI切断物とライゲーションキット(ニッポンジーン社製)によって連結した。これをエシェリヒア・コリDH5αに形質転換し，プラスミドを回収した（pHSG299-yggG）。
【０１１１】
〔実施例１〕yggG高発現Ｌ−フェニルアラニン生産株の構築とＬ−フェニルアラニンの製造
フェニルアラニン生産菌エシェリヒア・コリAJ12741株（FERM BP-4796）を上記プラスミドpHSG299-yggGで形質転換し、AJ12741/pHSG299-yggG株を得た。
AJ12741/pHSG299-yggG株およびAJ12741株（コントロール）のグリセロールストックをLB-アガロースプレート培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、37℃で24時間、静地培養した。この培養菌体を200ml坂口フラスコに入れた40mlの培地（表１）に1エーゼ（約10μl）接種し、37℃で振盪培養した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
初発添加グルコースが消費された後、それぞれの株でL-フェニルアラニン濃度を測定した。その結果、yggG発現増強株において収率、L-フェニルアラニン蓄積の向上が認められた（表２）。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】
〔実施例２〕yggG高発現Ｌ−スレオニン生産株の構築とＬ−スレオニンの製造
Ｌ−スレオニン生産菌エシェリヒア・コリVKPM B-3996（B-3996）を上記プラスミドpHSG299-yggGで形質転換し、B-3996/pHSG299-yggG株を得た。
B-3996/pHSG299-yggG株及びB-3996株（コントロール）のグリセロールストックをLB-アガロースプレート培地（トリプトン1%、酵母抽出液0.5%、塩化ナトリウム１%、アガロース1.5%）に１エーゼ植菌し、37℃で24時間、静地培養した。この培養菌体を200ml坂口フラスコに入れた40mlの培地（表3）に1エーゼ（約10μl）接種し、40℃で振盪培養した。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
初発添加グルコースが消費された後、それぞれの株でL-スレオニン濃度を測定した。その結果、yggG発現増強株において収率、L-スレオニン蓄積の向上が認められた（表４）。
【０１１８】
【表４】
【０１１９】
〔配列表の説明〕
配列番号１：E.coliのyggG 遺伝子の塩基配列
配列番号２：E.coliのyggG 遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号３：E.coliのyggG 遺伝子をクローニングするためのフォワードプライマー
配列番号４：E.coliのyggG 遺伝子をクローニングするためのリバースプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
【請求項２】
yggG遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりyggG遺伝子の発現が増大した、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
yggG遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載の遺伝子である、請求項１又は２に記載の微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子。
【請求項４】
前記yggG遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできるＤＮＡ。
【請求項５】
エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌又はパントエア属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
エシェリヒア属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及びＬ−スレオニンから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、yggG遺伝子の発現が増大するように改変された腸内細菌科に属する微生物。
【請求項２】
yggG遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりyggG遺伝子の発現が増大した、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
yggG遺伝子が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載の遺伝子である、請求項１又は２に記載の微生物：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（Ｂ）配列番号２において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできる遺伝子。
【請求項４】
前記yggG遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１と相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ−アミノ酸生産菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることのできるＤＮＡ。
【請求項５】
エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌又はパントエア属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
エシェリヒア属細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項８】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−システインから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸が、芳香族Ｌ−アミノ酸及びＬ−スレオニンから選択される一種又はそれ以上のＬ−アミノ酸である、請求項７に記載の方法。
【公開番号】特開２００９−２０７４８３（Ｐ２００９−２０７４８３Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１６４２５（Ｐ２００８−２１６４２５）
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 化学工学会 第７３年会 主催者 社団法人 化学工学会 会長 正野 寛治 開催日 平成２０年３月１７日〜１９日 発行者名 社団法人日本生物工学会 刊行物名 第６０回日本生物工学会大会講演要旨集 発行日 ２００８年７月１１日
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 化学工学会 第７３年会 主催者 社団法人 化学工学会 会長 正野 寛治 開催日 平成２０年３月１７日〜１９日 発行者名 社団法人日本生物工学会 刊行物名 第６０回日本生物工学会大会講演要旨集 発行日 ２００８年７月１１日
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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