Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造方法
【課題】コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルピロリドンの中間体として重要なＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的かつ安価な製造法の提供。
【解決手段】コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するに当たり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いる方法。
（Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基。）
【解決手段】コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するに当たり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いる方法。
（Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法に係り、詳しくは、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いることにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的にかつ安価に製造する方法に関する。本発明はまた、この方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸およびその誘導体は、ポリエステル等の樹脂原料や溶媒、その他の化学品の重要な前駆体であり、種々の樹脂原料および化学品の前駆体への誘導化が研究されている（例えば非特許文献１および２）。
また、環状アミド化合物であるピロリドン類は、洗浄溶媒や抽出剤として金属、電子材料分野等において広く用いられている。
【０００３】
コハク酸およびその誘導体からピロリドン類の一種であるＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、例えばコハク酸アンモニウム塩またはコハク酸とアンモニアの混合物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを合成し、このＮ−アルキルコハク酸イミドを触媒存在下で水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する。
【０００４】
このＮ−アルキルピロリドンの製造において重要な中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法として、古くはコハク酸に対して過剰量のアルキルアミンを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを合成する方法が報告されている（特許文献１）。Ｎ−アルキルコハク酸イミドはまた、コハク酸アンモニウム塩またはコハク酸とアンモニアの混合物とアルキル化剤との反応で合成することもできる。
【０００５】
Ｎ−アルキルコハク酸イミドの合成において、アルキル化剤として高価なアルキルアミンをコハク酸に対して等モル以上用いることは、経済的に不利であり、専ら、安価で工業的な入手が容易なアルコール類が使用されている。また、アルコールの他、カルボキシレート、アセタール、エポキシド、アジリジン、尿素、ハロゲン化アルキル、アルキルアミン、カーボネート、チオール等の化合物をアルキル化剤として使用できる旨の報告もなされている（特許文献２，３）が、従来において、特定の化合物の混合物をアルキル化剤として利用することによる効用を見出す試みはされていない。
【０００６】
一方で、原料のコハク酸は、従来はブタンより合成した無水マレイン酸から石油化学的方法によって製造されるのが一般的であったが、近年、バイオマス資源を原料とした発酵製造法の研究が進み、発酵製造法による工業的規模でのコハク酸の製造の可能性も期待され、発酵製造法によるコハク酸を原料としたＮ−メチルピロリドンの合成法も提案されている（特許文献２，３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＤＥ２１６４３５０
【特許文献２】ＷＯ２００２／１０２７７２
【特許文献３】ＷＯ２００４／０５８７０８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，Ｖｏｌ．１０７，Ｎｏ．６，２４１７−２４２１
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ．，２００９，１１，１３−１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、洗浄溶媒や抽出剤として金属、電子材料分野等で有用なＮ−アルキルピロリドンの製造において、Ｎ−アルキルコハク酸イミドは重要な中間体であり、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に製造することが有効である。
【００１０】
本発明は、コハク酸アンモニウム塩からＮ−アルキルピロリドンの中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に製造し、製造したＮ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を使用することにより、通常アルキル化剤として使用されるアルコールのみを使用した場合と比較して、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの収率または選択率が向上すること、また、アルキル化剤として高価なアルキルアミンをコハク酸アンモニウム塩に対して過剰量使用する方法に比べて製造コストを大幅に低減することができること、を見出し、本発明に到達した。
本発明に従って、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類の混合物を使用することは、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造において収率が向上するだけではなく、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造反応後の回収アルコールを高度に精製することなく再利用することができ、アルコール回収にかかるエネルギーコストを大幅に削減することができる点においても有利である。
【００１２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１３】
［１］ 下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、下記一般式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、該アルキル化剤がアルコールとアルキルアミン類との混合物であることを特徴とするＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００１４】
【化１】
【００１５】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【００１６】
【化２】
【００１７】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【００１８】
［２］ 前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物が、コハク酸および／またはその塩を含む発酵液、或いは発酵液から取り出したコハク酸および／またはその塩を含む混合物から得られることを特徴とする［１］に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００１９】
［３］ 前記アルキル化剤の使用量が、前記コハク酸アンモニウム塩に対して化学量論量以上であることを特徴とする［１］または［２］に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２０】
［４］ 前記アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、前記アルキルアミン類がメチルアミン類および／またはエチルアミン類である［１］ないし［３］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２１】
［５］ 前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物と前記アルキル化剤との反応温度が５０℃〜５００℃で、反応圧力が標準圧力〜３０ＭＰａであることを特徴とする［１］ないし［４］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２２】
［６］ ［１］ないし［５］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造することを特徴とするＮ−アルキルピロリドンの製造方法。
【００２３】
【化３】
【００２４】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するにあたり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を使用することにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの収率ないしは選択率を向上させることができると共に、高価なアルキルアミンの使用量を低減してＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的にかつ経済的に有利に製造することが可能となる。
特に、バイオマス資源由来の発酵製造法によるコハク酸およびその塩類を原料として、Ｎ−アルキルピロリドンの中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを安価に、効率的に製造することにより、洗浄溶媒や抽出剤等として各種の分野に有用なＮ−アルキルピロリドンの製造コストを下げることができ、その工業的有用性は極めて大きい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例（代表例）であり、本発明のその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。
【００２７】
［Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造方法］
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するに当たり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いることを特徴とするものである。
【００２８】
｛コハク酸アンモニウム塩を含む組成物｝
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、下記一般式（Ｉ）で表される。
【００２９】
【化４】
【００３０】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【００３１】
上記他のカチオンとは、１価のカチオンもしくは２価のカチオンである。
他の１価のカチオンとしては、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオン等が挙げられる。
【００３２】
上記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩としては、具体的には、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウム、コハク酸アンモニウムナトリウム等のアンモニウム塩が挙げられ、好ましくは、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウムのようなアンモニウム塩が挙げられ、これらのアンモニウム塩の混合物を用いても良い。
【００３３】
なお、本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、コハク酸二ナトリウム、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二カリウム、コハク酸一カリウム、コハク酸マグネシウム、コハク酸カルシウム等のＮＨ４＋を含まないコハク酸塩にＮＨ４＋を含有する化合物を加えて調製することもできる。ここで、ＮＨ４＋を含有する化合物としては、アンモニア水、炭酸アンモニウム等が挙げられる。
【００３４】
コハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のＮＨ４＋の含有量は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸成分１モルに対して、通常１モル以上、より好ましくは１．２モル以上、一方、通常５モル以下、好ましくは３モル以下である。このＮＨ４＋の割合が少なすぎると、反応収率が低下する傾向があり、多すぎると、加水分解等の好ましくない副反応が起こりやすくなる傾向がある。なお、ここで、コハク酸成分とは、前記一般式（Ｉ）において、ＸとＹを除いたコハク酸残基（Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯ−）２）を指す。また、ＮＨ４＋とは組成物中に存在する遊離のＮＨ４＋と、アニオンと結合して化合物中に存在するＮＨ４＋との双方を指す。
【００３５】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸アンモニウム塩の濃度には、特段の制限はないが、コハク酸換算濃度として通常１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、一方、通常８０％重量以下、好ましくは７０重量％以下である。該濃度が薄すぎると、反応工程での操作性や反応効率に問題が生じる可能性があり、該濃度が濃すぎると、コハク酸アンモニウム塩が析出する問題が生じる可能性がある。
なお、コハク酸アンモニウム塩が石油や石炭を原料として石油化学的手段によって製造されたものである場合、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とは、コハク酸アンモニウム塩の水溶液であってもよい。
【００３６】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、石油や石炭を原料として石油化学的手段によって製造されたものでもよいが、バイオマス資源由来であるのが環境保護の点から好ましい。
【００３７】
バイオマス資源としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣であり、最も好ましくはとうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシである。これらのバイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。
【００３８】
これらのバイオマス資源は、特に限定はされないが、例えば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その工程には、特に限定はされないが、例えば、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法、微生物や酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００３９】
上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、これらの中では、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類が好ましく、このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セルロースが好ましい。
【００４０】
これらのバイオマス資源から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸であるコハク酸を誘導する方法としては、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによる方法が挙げられるが、これらの中でも脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。
【００４１】
脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物は脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌、酵母菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
【００４２】
好気性微生物としては、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられ、これらのうちコリネ型細菌がより好ましい。
【００４３】
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌またはアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌が挙げられる。
【００４４】
脂肪族ジカルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
【００４５】
微生物変換における反応温度、圧力等の反応条件は、選択される菌体、カビなど微生物の活性に依存することになるが、ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００４６】
微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、一般的には中和剤を使用してｐＨを調整する。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤を添加することによりｐＨを調節する。ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整される。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
【００４７】
中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。好ましくはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素である。なお上記アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物としてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２等、或いはこれらの混合物などが挙げられ、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩としては、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＮａＫＣＯ３等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。
【００４８】
本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性や反応効率を考慮して適宜濃縮しても良い。濃縮方法としては、特に限定されないが、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法、減圧で水を留去させる方法ならびにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。
【００４９】
なお、本発明の方法において、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物として発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の分離方法は、限外濾過膜や遠心分離等既存の方法を任意に用いることができる。また、微生物変換後の発酵液をオートクレーブ滅菌、加熱滅菌または低温殺菌しても良い。
【００５０】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩を含む組成物としては、上記のようにして得られた発酵液に含まれるコハク酸および／またはその塩をそのままコハク酸アンモニウム塩のコハク酸成分として用いることができるが、活性炭等の吸着剤処理やイオン交換カラム処理等の簡易精製を行った発酵液に含まれるコハク酸および／またはその塩を、必要に応じてＮＨ４＋を含有する化合物とともに用いてもよい。また、発酵液から取り出し、更に後述の精製処理を施したコハク酸をＮＨ４＋を含有する化合物とともに用いてもよい。
【００５１】
以下に発酵液に含まれるコハク酸塩をコハク酸へ変換する方法および精製する方法を例示するが、本発明は以下の方法に限定されるものではない。また、コハク酸は、コハク酸に変換された以降の精製工程のうち、任意の工程において系内から取り出して用いてもよい。
【００５２】
（１）コハク酸塩のコハク酸への変換・抽出
コハク酸塩のコハク酸への変換方法としては、コハク酸よりもｐＨの高い弱酸性の有機酸を使用した反応晶析方法が挙げられる。この場合、用いる弱酸性の有機酸としては、例えば、酢酸が挙げられる。また、別法として、コハク酸塩を無機酸でコハク酸に変換しても良い。ここで、使用する無機酸としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが例示される。より具体的には、コハク酸発酵の場合、生成したコハク酸をアンモニアや水酸化マグネシウムで中和しながら発酵を行うと、発酵液中にはコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムが生成する。このようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムを含む発酵液を硫酸等で処理すると、コハク酸を含む水溶液が得られる。
【００５３】
コハク酸を含む溶液或いは水溶液とはコハク酸を主体として含む溶液或いは水溶液である。従って、上記のようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムのようなコハク酸塩を主体として含む溶液或いは水溶液はコハク酸塩を含む溶液或いは水溶液と表す。ここでいう「主体として含む」状態とは、溶媒を除く全成分の重量に対する該成分の重量が、通常５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上含まれる状態を示す。
【００５４】
上記の無機酸でコハク酸塩をコハク酸に変換した水溶液は、特には限定されないが、有機溶媒を用いて該水溶液からコハク酸を抽出しても良い。
この方法で使用される有機溶媒は、通常、無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）が０．２以上２．３以下であり、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上の有機溶媒であるが、より好ましくは、Ｉ／Ｏ値が、０．３以上２．０以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒であり、更に好ましくは、Ｉ／Ｏ値が０．３以上２．０以下であり、常圧で沸点が６０℃以上の有機溶媒である。このような有機溶媒を用いることにより、コハク酸を選択的に抽出して、効率よく糖類やアミノ酸と分離できる。また、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒を用いることにより、溶媒が気化して引火する危険性や、溶媒が気化してコハク酸の抽出効率が低下するという問題や溶媒のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。
【００５５】
なお、無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）は、有機概念図論（「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４））に提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値および無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
【００５６】
Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒としては、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン等のケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、プロパノール、ブタノール、オクタノール等の炭素数３以上のアルコールが例示される。
【００５７】
各溶媒のＩ／Ｏ値および沸点を以下に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
抽出工程においては、有機溶媒は、コハク酸を含有する水溶液の容量１に対し０．５〜５の容量で加えることが好ましく、コハク酸を含有する水溶液の容量１に対し１〜３の容量で加えることがより好ましい。
【００６０】
抽出工程の温度はコハク酸が抽出される温度であればよいが、１０〜９０℃が好ましく、２０〜８５℃がより好ましい。
【００６１】
抽出工程により、コハク酸が有機溶媒中に回収され、糖類や発酵由来の窒素元素の他、発酵菌由来のアンモニア、硫黄含有不純物ならびに金属カチオン等の不純物はある程度分離される。なお、コハク酸をさらに効率よく抽出するために、有機溶媒による抽出処理を複数回繰り返してもよいし、向流抽出を行ってもよい。
【００６２】
（２）抽出相の濃縮
一般に抽出相におけるコハク酸濃度は希薄であるため濃縮操作が必要となる。濃縮度は特に限定されるものではないが、最終濃縮液中のコハク酸の溶解度が飽和溶解度以下であり、かつ極力飽和溶解度に近いほうが好ましい。
【００６３】
また抽出に用いる溶媒は水と最低共沸組成を形成することが多く、また共沸組成は溶媒リッチな組成であることが多い。従って濃縮操作に伴い溶媒が多く留去することとなり濃縮液中の溶媒濃度は濃縮前に比べ低下する。
【００６４】
生物由来原料から誘導されたコハク酸は、一般に水溶性の高い不純物を多く含むため、後続の晶析工程において溶媒共存系よりも水系の方が高い精製効果が期待できる。また溶媒が後続工程まで残留するとその回収がより困難となるため、濃縮後の溶媒濃度は１重量％以下とすることが望ましい。
【００６５】
最終濃縮液の溶媒濃度を１重量％以下、コハク酸濃度を飽和溶解度近傍とするためには濃縮前および／または濃縮操作の過程で水を加えてもよい。
【００６６】
（３）晶析
濃縮後の晶析は冷却晶析、蒸発晶析さらに断熱減圧冷却晶析等により行う。また操作はバッチ晶析でも、連続晶析でもよい。
【００６７】
（４）固液分離
晶析で得られたコハク酸スラリーは固液分離操作によりコハク酸結晶と母液を分離する。分離方法は特に限定するものではなく、濾過分離、沈降分離などが挙げられる。また、操作はバッチ式でも連続式でもよい。固液分離に用いる装置として、例えば効率の良い固液分離機として連続式の遠心濾過機、デカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。
また、求められるコハク酸の純度により固液分離操作で回収したウェットケーキは冷水等でリンス（洗浄）することができる。
【００６８】
（５）晶析母液のリサイクル
固液分離工程で得られた母液やリンス液の少なくとも一部は晶析工程より前の工程にリサイクルすることができる。リサイクルする工程は特に限定はないが、抽出工程、濃縮工程へリサイクルできる。抽出工程へリサイクルすると抽出塔は大きくなるが、水相へ分配されやすい（分配係数が小さい）不純物をリサイクル系内から選択的に除去することができ、好ましい。一方、濃縮工程にリサイクルすると抽出塔は小さくてすむが、不揮発性の不純物は全てリサイクル系内に蓄積することとなる。
【００６９】
母液やリンス液の全てをリサイクルすることも可能であるが、長期間の運転を続けることで不純物がリサイクル系内に蓄積することから、少なくとも一部は系外にパージすることが望ましい。パージ液は通常活性汚泥処理等により有機物を処理した後廃液とされるが、パージ液はコハク酸を含みｐＨが低いことから、発酵操作で回収された使用済菌体の失活処理剤として有効利用することができる。
【００７０】
このリサイクルに際して、リサイクル量、リサイクル場所は求められるコハク酸の仕様により決めることができる。
【００７１】
（６）高度精製
上述の工程を経たコハク酸はその要求純度等に応じ、乾燥処理またはさらに高度精製処理を施すこともできる。この高度精製処理としては、例えば活性炭等の吸着剤による脱色工程、イオン交換樹脂により共存イオン類を除去するイオン交換工程、共存する不飽和ジカルボン酸を水添処理する工程、さらに高度精製するための晶析工程などの処理が挙げられる。
【００７２】
｛アルキル化剤｝
本発明に係るアルキル化剤は、アルコールとアルキルアミン類との混合物である。
【００７３】
このアルコールとしては、炭素数１〜６の直鎖、分岐または環状のアルコールが好ましく、炭素数１〜４の直鎖または分岐のアルコールがより好ましく、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが好ましく、メタノール、エタノールが特に好ましい。これらのアルコールは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７４】
これらのアルコールと共に用いるアルキルアミン類としては、メチルアミン類、エチルアミン類、プロピルアミン類、ブチルアミン類が挙げられ、好ましくは、メチルアミン類、エチルアミン類である。
なお、ここで、アルキルアミン類の「類」とは、モノアルキルアミンとジアルキルアミン、トリアルキルアミン等のアルキル基を有するアミンの総称である。
これらのアルキルアミン類は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７５】
なお、上記アルコールおよびアルキルアミン類は、後述のＮ−アルキルコハク酸イミドを表す一般式（II）におけるＲ１のアルキル基が有していてもよい置換基で置換されてもよい。
【００７６】
アルコールとアルキルアミン類との混合物としては最も好ましくは、メタノールおよび／またはエタノールとメチルアミン類および／またはエチルアミン類との混合物が用いられる。
【００７７】
アルキル化剤を構成するアルコールとアルキルアミン類の混合比は任意であるが、コハク酸アンモニウム塩に対するアルキルアミン類の量比は、０．０００１〜１０倍モル、好ましくは０．００１〜５倍モル、より好ましくは０．０１〜１．５倍モル程度である。コハク酸アンモニウム塩に対するアルキルアミン類の量比が多過ぎると、高価なアルキルアミン類量が多くなることにより経済性が損なわれ、少な過ぎると反応効率が低下する。
【００７８】
本発明において、アルキル化剤は、アルコールとアルキルアミン類との合計でコハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸アンモニウム塩に対して、化学量論または化学量論量を超える量で用いられる。好ましくは、コハク酸アンモニウム塩に対して１〜１００倍モル、より好ましくは１〜５０倍モル、最も好ましくは、１〜２５倍モルのアルキル化剤が用いられる。
アルキル化剤の使用量が少な過ぎると反応効率が低下し、多過ぎてもそれ以上の反応効率の向上は望めず、また、反応規模が大型化するため、経済的にも工業的にも不利である。
アルキル化剤中のアルキルアミン類の割合としては、上述の如く、任意であるが、経済性と反応効率の面からアルコールに対するアルキルアミン類の割合が０．０００１〜１００モル％、特に０．００１〜１０モル％であることが好ましい。
【００７９】
アルキル化剤として用いるアルコールとアルキルアミン類の混合物は、アルコールとアルキルアミン類を混合して調製することもできるが、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造工程で反応後回収される未反応アルコールから、敢えてアルキルアミン類を完全に分離せず、一部または全部のアルキルアミン類を含有したまま使用してもよい。元来、アルコールと対応するアルキルアミン類を完全に分離するためには精密蒸留をする等、精製に多大なエネルギーを必要とし、結果として製造コストを上げることになる。本発明で開示するように、アルキルアミン含有アルコールを使用することにより、アルコールの回収および精製にかかる負荷を大幅に低減でき、より安価にＮ−アルキルコハク酸イミドを製造することができ、結果としてＮ−アルキルピロリドンの製造コストを下げることができる。
【００８０】
なお、反応には、上記アルキル化剤と共に、必要に応じて触媒を用いてもよい。
【００８１】
｛Ｎ−アルキルコハク酸イミド｝
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されるＮ−アルキルコハク酸イミドとは、下記一般式（II）で表される化合物である。
【００８２】
【化５】
【００８３】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【００８４】
一般式（II）において、Ｒ１の直鎖、分岐または環状のアルキル基とは、好ましくは炭素数１〜４の直鎖または分岐のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。最も好ましくは、メチル基、エチル基である。上記のＲ１のアルキル基は置換されていても良い。
【００８５】
Ｒ１のアルキル基が置換されている場合、その置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、エーテル基、チオエーテル基、ハロゲン原子等が挙げられる。なお、ここで、Ｒ１の炭素数とは、Ｒ１のアルキル基が置換基を有する場合、当該置換基の炭素数を含まない、アルキル基のみの炭素数である。
【００８６】
｛イミド化反応｝
＜反応温度＞
本発明において、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤であるアルコールとアルキルアミン類との混合物とを反応させてコハク酸アンモニウム塩をイミド化するイミド化反応の反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃であり、一方、通常５００℃以下、好ましくは４５０℃以下、より好ましくは４００℃以下である。反応温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応温度が高すぎると、好ましくない副反応が起こったり、反応器内で有機物が焦げ付くという問題が生じる傾向がある。
【００８７】
＜反応圧力＞
本発明に係るイミド化反応圧力は、特段の制限はないが、通常、大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。
反応系は、反応実施温度での原料および反応生成物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、本発明に係るイミド化反応は、気相および／または液相で、好ましくは液相で実施される。
【００８８】
＜反応方法＞
本発明の一実施形態において、反応は例えば以下のａ）〜ｃ）のいずれかの手順で行われるが、これに限定されるものではない。
（ａ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを所定の反応温度・圧力にて反応させる。
（ｂ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを所定の温度・圧力（以下「１段目の条件」と称す。）で反応させた後、再度所定の温度・圧力（以下「２段目の条件」と称す。）で反応させる。この場合、それぞれの反応温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
（ｃ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物のみを予め所定の温度・圧力（以下「１段目の条件」と称す。）にて処理した後、アルキル化剤を加えて所定の温度・圧力（以下「２段目の条件」と称す。）で反応させる。この場合、それぞれの温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
【００８９】
上記（ａ）〜（ｃ）の方法のうち、特に、コハク酸骨格から窒素原子を含む５員環であるコハク酸イミド構造に環化する過程と、アルキル化剤により窒素原子をアルキル化する過程とを段階的に行って反応効率を高めることができることから、（ｃ）の方法が好ましい。
【００９０】
上記（ｂ），（ｃ）、特に上記（ｃ）の場合、通常２段目の条件は１段目の条件より高温・高圧下で実施することが好ましく、１段目の温度条件を１００℃〜３００℃、２段目の温度条件を１５０℃〜４００℃とすることが有利である。これは、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とからＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する過程において、コハク酸骨格から窒素原子を含む５員環であるコハク酸イミド構造に環化する過程と、アルキル化剤により窒素原子をアルキル化する過程とでは、前者より後者において、より高い反応温度を必要とするためである。反応温度は、高いほど環化およびアルキル化に有利であるが、副反応の抑制と省エネルギーの観点から、上述の温度範囲がより有利である。
【００９１】
｛Ｎ−アルキルコハク酸イミドの精製｝
後述する触媒の存在下でＮ−アルキルコハク酸イミドを水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、触媒反応を良好に実施して、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドが合成された反応生成物から、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に分離回収する必要がある。
【００９２】
水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミドは、反応生成物をそのまま使用するか、反応生成物中の軽沸成分を留去し、濃縮して使用することもできるが、目的とする還元反応を良好に実施し、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、反応生成物からＮ−アルキルコハク酸イミドを分離して精製して使用することが好ましい。特に、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物がバイオマス資源由来である場合には、合成されたＮ−アルキルコハク酸イミドを反応生成物から分離、精製することが好ましい。
Ｎ−アルキルコハク酸イミドの回収および精製方法としては、晶析、蒸留、抽出、クロマトグラフィなど、公知の方法から選択することができ、複数の方法を組み合わせてもよい。
【００９３】
なお、本発明に係るイミド化反応で副生するＮ−アルキルスクシナミン酸は、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの加水分解体であり、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの蒸留条件で容易に脱水環化してＮ−アルキルコハク酸イミドに変換される。そのため、精製工程に蒸留操作を入れることは収率向上のために好ましく、Ｎ−アルキルスクシナミン酸はＮ−アルキルコハク酸イミドと等価な有効成分と見做すことができる。
【００９４】
［Ｎ−アルキルピロリドン］
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法により製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドは、これを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造するための中間体として好適に用いられる。
【００９５】
【化６】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【００９６】
ここでＲ１は、前記一般式（II）におけると同義であり、その好ましいものも同様である。
【００９７】
＜還元工程＞
Ｎ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンへの還元工程は、触媒の存在下で水素を用いる接触水素化反応、複合水素化物を用いる水素化反応、または、例えばメタノールやイソプロパノール等のアルコールがアルデヒドやケトンに変換されながら水素を供給する水素移動反応等によって行われる。
【００９８】
その中でも好ましくは、接触水素化反応であり、接触水素化反応は気相または液相で実施することができる。水素化反応はバッチ式、連続式いずれの反応形式でもよく、従来の公知の方法に従って行うことができる。水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミドは、前述の如く、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造工程で得られたＮ−アルキルコハク酸イミドを含有する反応生成物をそのまま用いても、また反応に悪影響を及ぼさない溶媒で希釈して用いてもよいが、目的とする触媒反応を良好に実施し、低コストでＮ−アルキルピロリドンを製造するためには、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを精製して使用することが好ましい。
【００９９】
本発明に係る水素化反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃以上、一方、通常４００℃以下、好ましくは３５０℃以下、より好ましくは３００℃以下である。反応温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応温度が高すぎると、炭素窒素結合が水素化分解される等の好ましくない副反応が進行するという問題が生じる傾向がある。
【０１００】
本発明に係る水素化反応圧力は、特段の制限はないが、通常、大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。反応圧力が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応圧力が高すぎると、目的物の水添反応が進行し、過水添副生物が多くなるという問題が生じる傾向がある。
【０１０１】
反応系は反応実施温度での原料および反応生成物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、気相および／または液相、好ましくは液相で実施される。
【０１０２】
水素化反応の具体的な方法としては、加圧反応器内にＮ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物と水素化触媒とを共存させ、この混合物を撹拌しながら水素ガスを導入して水素化反応を行い、反応生成物から水素化触媒を分離して反応器から取り出す方法、固定床多管式または単管式の反応器を用いて、Ｎ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物と水素ガスを反応器の上部または下部から流通させながら水素化反応を行い、反応生成物を取り出す方法、あるいは水素ガスを反応器の下部から、Ｎ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物は上部から流通させて水素化反応を行い、反応生成物を取り出す方法、あるいは流動床反応器を用いる方法などが挙げられる。
【０１０３】
＜水素化触媒＞
上記水素化反応に用いられる水素化触媒としては、公知の均一系ならびに不均一系の水素化触媒を用いることができる。具体的な水素化触媒としては、特に限定はされないが、好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、鉄、マンガン、クロム、亜鉛、スズ、インジウム、アンチモンなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられ、より好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、クロム、亜鉛、スズなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられる。
【０１０４】
これらの水素化触媒は上記の金属を含む化合物をそのまま使用したり、有機ホスフィンなどの配位子を共存させて使用することができるが、触媒分離の容易性の観点から不均一系の金属含有触媒が好ましい。
【０１０５】
水素化触媒としては、これらの触媒活性成分となる金属を含む化合物をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭共存下で用いるか、または上記の金属をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭などの担体に担持した担持触媒が好適に使用される。ここで用いられる担体は、モンモリロナイト、シリケートおよびゼオライトのように特異な構造を有しているものでもよい。また、上記の触媒活性成分となる金属を酸化物或いは複合酸化物として含む沈殿触媒として用いてもよく、担体成分の存在下で生成させた沈殿触媒を用いることもできる。
【０１０６】
このような水素化触媒の触媒活性成分である金属の含有量は、通常、触媒全体に対して約０．１〜約９０重量％であるが、貴金属担持触媒においては、好ましくは約０．１〜約５０重量％の含有量であり、金属酸化物の沈殿触媒においては、好ましくは約１０〜約９０重量％の含有量である。
【０１０７】
本発明において、上述の水素化触媒の触媒活性金属の種類、複数種の金属の組み合わせ、担体との組み合わせや、触媒活性金属の含有量および調製方法は、目的とする水素化反応に悪影響を及ぼさない限り、任意の組み合わせが可能であり、特に限定されるものではない。
【０１０８】
不均一触媒の使用においては、反応開始時に存在する水素ガスによって、反応系中で活性化して使用することができるが、使用前に水素ガス存在下で活性化した触媒を用いてもよい。使用前の触媒活性化は、触媒に悪影響を及ぼさない溶媒の存在下あるいは非存在下で、バッチ式反応器内で水素ガス処理する方法、連続式の固定床反応器あるいは流動床反応器に触媒を入れ、水素ガスを流通させて水素ガス処理する方法などが挙げられる。水素ガス処理における温度および圧力は、それぞれの触媒に適した範囲から選択される。
【０１０９】
＜水素ガス＞
水素化反応に使用する水素ガスは、純水素ガスでもよいが、窒素、ヘリウム、アルゴンなどの不活性ガスで希釈させたものも使用できる。ただし、一酸化炭素は、水素化反応効率への影響が懸念される為、水素ガス中の一酸化炭素濃度は通常１００００ｐｐｍ以下、好ましくは２０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下とする。
【実施例】
【０１１０】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１１１】
なお、下記例における酸類、糖類、コハク酸、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）およびＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析はＬＣ（液体クロマトグラフィー）を用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い、それぞれ以下の条件で測定を行った。
【０１１２】
＜酸類、糖類の定量分析＞
カラム；信和加工（株）製 ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ
溶離液：水／過塩素酸（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
【０１１３】
＜コハク酸、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）およびＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析＞
カラム：イオン交換カラム ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８ＥＨ ８ｍｍ×３００ｍｍ
温度：５０℃
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２０μｌ
検出器：ＲＩ検出器
【０１１４】
＜アミノ酸の定量分析＞
装置：日立アミノ酸分析計 Ｌ−８９００
分析条件：生体アミノ酸分離条件−ニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ，４４０ｎｍ）
標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
注入量：１０μｌ
定量計算：プロリンは、波長４４０ｎｍ、他のアミノ酸は波長５７０ｎｍのピークの面積から、一点外部標準法にてアミノ酸含有を算出
【０１１５】
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）増強株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【０１１６】
Ａ培地（尿素：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ：６ｍｇ、ビオチン：２００μｇ、チアミン：１００μｇ、イーストエキストラクト：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、グルコース：２０ｇを蒸留水：１Ｌに溶解）１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加えて混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１１７】
（Ｂ）ＰＣ遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１１８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１１９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０１２０】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１２１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２２】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【０１２３】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０１２４】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１２５】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２６】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０１２７】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。
【０１２８】
反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【０１３０】
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した。
【０１３１】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地（トリプトン：１０ｇ、イーストエキストラクト：５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、グルコース：２０ｇ、および寒天：１５ｇを、蒸留水：１Ｌに溶解）に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。
その結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１３２】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性の測定
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭアデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）および酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼの発現を強化した無細胞抽出液における比活性は０．１Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。尚、親株であるＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、本活性測定方法検出限界以下であった。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を有機酸生産菌として菌体調製用培養、および有機酸生産反応に用いた。
【０１３３】
＜コハク酸塩含有培養液の調製＞
<種培養>
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、および蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、予め滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨを接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【０１３４】
<本培養>
硫酸アンモニウム：１．０ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、塩化カリウム：１．６７ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．０ｍｇ、塩酸チアミン：１．０ｍｇ、酵母エキス１０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：１．０ｇおよび蒸留水：１０００ｍＬの培地４００ｍＬを１Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、予め滅菌した７２％グルコース水溶液：２０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を２０ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは９．３％アンモニア水を用いて７．０以下にならないように保ち、通気は毎分３００ｍＬ、攪拌は毎分６００回転で２４時間本培養を行った。溶存酸素濃度は培養開始直後から徐々に低下し、培養開始後４時間でほぼ０となった。その後、培養開始後１５時間で溶存酸素濃度が上昇したため、予め滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加したところ、再び急速に低下し、ほぼ０となった。約１３分後同様に溶存酸素濃度の上昇が観察されため、予め滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加し再び低下させた。以後、約１３分毎に同様の溶存酸素濃度の上昇が見られたが、その都度同様の方法で低下させた。培養２４時間後のＯＤ６６０は８７．３であった。
【０１３５】
<有機酸生産培養>
リン酸１アンモニウム：８４．４ｍｇ、リン酸２アンモニウム：７５．８ｍｇ、塩化カリウム１４９．１ｍｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇおよび蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、１Ｌのジャーファーメンターに入れた。この懸濁液２００ｍＬに上記の本培養により得られた培養液９０ｍＬ、予め滅菌した７２％グルコース溶液：４０ｍＬ、滅菌水：１２５ｍＬを添加して混合し、３５℃に保温した。ｐＨは炭酸アンモニウム：１５４ｇ、２８％アンモニア水：２３９ｍｌ、蒸留水：６５０ｍＬの水溶液を用いて７．６に保ち、毎分２００回転で攪拌しながら有機酸生産反応を行った。反応開始後２１時間における生産コハク酸濃度は３４．８ｇ／Ｌ、生産リンゴ酸濃度は３．１ｇ／Ｌ、生産フマル酸濃度は１．１ｇ／Ｌ、生産酢酸濃度は５．０ｇ／Ｌ、アラニン濃度は２．１ｇ／Ｌ、バリン濃度は１．４ｇ／Ｌであった。また、本培養液には、トレハロース０．２７ｇ／Ｌ、未反応グルコース０．３７ｇ／Ｌが含有されていた。
【０１３６】
このようにして調製したコハク酸発酵液から分画分子量１３００の限外濾過膜により菌体を分離し、減圧加温下で濃縮して、コハク酸濃度２５重量％のコハク酸発酵液を得た。このコハク酸発酵液中のコハク酸は、コハク酸ジアンモニウムとして存在する。このコハク酸発酵液を「コハク酸発酵液Ｉ」と称す。
【０１３７】
＜発酵液からのコハク酸の回収＞
上述の有機酸生産培養に準じて調製したコハク酸発酵液を遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分）処理して得られた上澄み液を減圧加温下で濃縮した。濃縮された培養液を攪拌しながら、４７％硫酸を培養液に滴下して溶液のｐＨを２とした。硫酸を添加した培養液に有機溶媒として培養液と等容量のメチルエチルケトン（ＭＥＫ）を添加し、２５℃で、約３０分攪拌した。得られた液を静置後、有機層と水層とに分け、分液された水層に水層の体積の半分の容量のＭＥＫを加え、２５℃で、３０分攪拌した。同様に液を静置後、有機層と水層とに分けた。同様の操作を更に３回繰り返し、全有機層をあわせた。有機層を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で分析した結果、有機層には、使用ブロス中に含有していた９７．９％量のコハク酸が抽出された。
【０１３８】
次に得られたＭＥＫ抽出液から７０℃にて４００ｍｍＨｇから１００ｍｍＨｇへ減圧度を調整しながらＭＥＫを留去して、ＭＥＫ抽出有機層を濃縮した。その後、得られた溶液を７０℃から４０℃まで３０分かけて降温し、その後、４０℃で１時間攪拌した。析出した結晶を濾過後、冷水でリンスして、粗結晶を得た。一方、濾液は、さらに４０℃から１０℃まで３０分かけて降温し、１０℃で１時間攪拌した。析出した結晶を濾過後、冷水でリンスして、コハク酸純度９４重量％のコハク酸粗結晶を得た。このコハク酸粗結晶を「コハク酸粗結晶Ｉ」と称す。この工程では、ＭＥＫ有機層に抽出されたコハク酸の９８％量のコハク酸が回収された。
【０１３９】
［比較例１］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸ジアンモニウム３．８６８ｇと水５．０１９ｇを仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して２．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素ガス雰囲気下にてメタノール１６．２９３ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉し、予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、反応生成物の組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、コハク酸ジアンモニウム転化率（以下、単に「転化率」と記す。）９８．７％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率８０．６％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率３．０％であった。下記式で算出した有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８７．４％であった。
有効成分選択率：（ＭＳＩ収率＋ＮＭＳＡ収率）／（転化率）×１００（％）
【０１４０】
［実施例１〜９］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表２に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例１と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って、結果を比較例１の結果と共に表２に示した。
なお、以下においてメチルアミン類は、
ＭＭＡ：モノメチルアミン
ＤＭＡ：ジメチルアミン
ＴＭＡ：トリメチルアミン
と表記する。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
表２に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【０１４３】
［比較例２］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸粗結晶Ｉを３．００４ｇと水３．５０９ｇおよび２８重量％アンモニア水３．０３８ｇ（コハク酸成分に対して約２モル倍）を仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して３時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素下にてメタノール１４．９３１ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉した。予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、生成物組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、転化率９８．３％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率７７．５％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率３．０％であった。有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８１．８％であった。
【０１４４】
［実施例１０〜１２］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表３に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例２と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って、結果を比較例２の結果と共に表３に示した。
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
表３に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【０１４７】
［比較例３］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸発酵液Ｉを６．０１９ｇ仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して２．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素下にてメタノール８．０１８ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉し、予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、生成物組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、転化率９７．２％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率７８．７％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率４．２％であった。有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８５．３％であった。
【０１４８】
［実施例１３〜１５］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表４に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例３と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って結果を比較例３の結果と共に表４に示した。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
表４に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法に係り、詳しくは、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いることにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的にかつ安価に製造する方法に関する。本発明はまた、この方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸およびその誘導体は、ポリエステル等の樹脂原料や溶媒、その他の化学品の重要な前駆体であり、種々の樹脂原料および化学品の前駆体への誘導化が研究されている（例えば非特許文献１および２）。
また、環状アミド化合物であるピロリドン類は、洗浄溶媒や抽出剤として金属、電子材料分野等において広く用いられている。
【０００３】
コハク酸およびその誘導体からピロリドン類の一種であるＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、例えばコハク酸アンモニウム塩またはコハク酸とアンモニアの混合物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを合成し、このＮ−アルキルコハク酸イミドを触媒存在下で水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する。
【０００４】
このＮ−アルキルピロリドンの製造において重要な中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法として、古くはコハク酸に対して過剰量のアルキルアミンを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを合成する方法が報告されている（特許文献１）。Ｎ−アルキルコハク酸イミドはまた、コハク酸アンモニウム塩またはコハク酸とアンモニアの混合物とアルキル化剤との反応で合成することもできる。
【０００５】
Ｎ−アルキルコハク酸イミドの合成において、アルキル化剤として高価なアルキルアミンをコハク酸に対して等モル以上用いることは、経済的に不利であり、専ら、安価で工業的な入手が容易なアルコール類が使用されている。また、アルコールの他、カルボキシレート、アセタール、エポキシド、アジリジン、尿素、ハロゲン化アルキル、アルキルアミン、カーボネート、チオール等の化合物をアルキル化剤として使用できる旨の報告もなされている（特許文献２，３）が、従来において、特定の化合物の混合物をアルキル化剤として利用することによる効用を見出す試みはされていない。
【０００６】
一方で、原料のコハク酸は、従来はブタンより合成した無水マレイン酸から石油化学的方法によって製造されるのが一般的であったが、近年、バイオマス資源を原料とした発酵製造法の研究が進み、発酵製造法による工業的規模でのコハク酸の製造の可能性も期待され、発酵製造法によるコハク酸を原料としたＮ−メチルピロリドンの合成法も提案されている（特許文献２，３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＤＥ２１６４３５０
【特許文献２】ＷＯ２００２／１０２７７２
【特許文献３】ＷＯ２００４／０５８７０８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００７，Ｖｏｌ．１０７，Ｎｏ．６，２４１７−２４２１
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ．，２００９，１１，１３−１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、洗浄溶媒や抽出剤として金属、電子材料分野等で有用なＮ−アルキルピロリドンの製造において、Ｎ−アルキルコハク酸イミドは重要な中間体であり、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に製造することが有効である。
【００１０】
本発明は、コハク酸アンモニウム塩からＮ−アルキルピロリドンの中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的に製造し、製造したＮ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンを安価に製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を使用することにより、通常アルキル化剤として使用されるアルコールのみを使用した場合と比較して、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの収率または選択率が向上すること、また、アルキル化剤として高価なアルキルアミンをコハク酸アンモニウム塩に対して過剰量使用する方法に比べて製造コストを大幅に低減することができること、を見出し、本発明に到達した。
本発明に従って、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類の混合物を使用することは、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造において収率が向上するだけではなく、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造反応後の回収アルコールを高度に精製することなく再利用することができ、アルコール回収にかかるエネルギーコストを大幅に削減することができる点においても有利である。
【００１２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１３】
［１］ 下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、下記一般式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、該アルキル化剤がアルコールとアルキルアミン類との混合物であることを特徴とするＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００１４】
【化１】
【００１５】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【００１６】
【化２】
【００１７】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【００１８】
［２］ 前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物が、コハク酸および／またはその塩を含む発酵液、或いは発酵液から取り出したコハク酸および／またはその塩を含む混合物から得られることを特徴とする［１］に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００１９】
［３］ 前記アルキル化剤の使用量が、前記コハク酸アンモニウム塩に対して化学量論量以上であることを特徴とする［１］または［２］に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２０】
［４］ 前記アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、前記アルキルアミン類がメチルアミン類および／またはエチルアミン類である［１］ないし［３］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２１】
［５］ 前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物と前記アルキル化剤との反応温度が５０℃〜５００℃で、反応圧力が標準圧力〜３０ＭＰａであることを特徴とする［１］ないし［４］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【００２２】
［６］ ［１］ないし［５］のいずれかに記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造することを特徴とするＮ−アルキルピロリドンの製造方法。
【００２３】
【化３】
【００２４】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するにあたり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を使用することにより、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの収率ないしは選択率を向上させることができると共に、高価なアルキルアミンの使用量を低減してＮ−アルキルコハク酸イミドを効率的にかつ経済的に有利に製造することが可能となる。
特に、バイオマス資源由来の発酵製造法によるコハク酸およびその塩類を原料として、Ｎ−アルキルピロリドンの中間体であるＮ−アルキルコハク酸イミドを安価に、効率的に製造することにより、洗浄溶媒や抽出剤等として各種の分野に有用なＮ−アルキルピロリドンの製造コストを下げることができ、その工業的有用性は極めて大きい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例（代表例）であり、本発明のその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。
【００２７】
［Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造方法］
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドを製造するに当たり、アルキル化剤としてアルコールとアルキルアミン類との混合物を用いることを特徴とするものである。
【００２８】
｛コハク酸アンモニウム塩を含む組成物｝
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、下記一般式（Ｉ）で表される。
【００２９】
【化４】
【００３０】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【００３１】
上記他のカチオンとは、１価のカチオンもしくは２価のカチオンである。
他の１価のカチオンとしては、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋等のアルカリ金属イオン等が挙げられる。
【００３２】
上記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩としては、具体的には、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウム、コハク酸アンモニウムナトリウム等のアンモニウム塩が挙げられ、好ましくは、コハク酸ジアンモニウム、コハク酸モノアンモニウムのようなアンモニウム塩が挙げられ、これらのアンモニウム塩の混合物を用いても良い。
【００３３】
なお、本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、コハク酸二ナトリウム、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二カリウム、コハク酸一カリウム、コハク酸マグネシウム、コハク酸カルシウム等のＮＨ４＋を含まないコハク酸塩にＮＨ４＋を含有する化合物を加えて調製することもできる。ここで、ＮＨ４＋を含有する化合物としては、アンモニア水、炭酸アンモニウム等が挙げられる。
【００３４】
コハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のＮＨ４＋の含有量は、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸成分１モルに対して、通常１モル以上、より好ましくは１．２モル以上、一方、通常５モル以下、好ましくは３モル以下である。このＮＨ４＋の割合が少なすぎると、反応収率が低下する傾向があり、多すぎると、加水分解等の好ましくない副反応が起こりやすくなる傾向がある。なお、ここで、コハク酸成分とは、前記一般式（Ｉ）において、ＸとＹを除いたコハク酸残基（Ｃ２Ｈ４（ＣＯＯ−）２）を指す。また、ＮＨ４＋とは組成物中に存在する遊離のＮＨ４＋と、アニオンと結合して化合物中に存在するＮＨ４＋との双方を指す。
【００３５】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸アンモニウム塩の濃度には、特段の制限はないが、コハク酸換算濃度として通常１重量％以上、好ましくは１０重量％以上、一方、通常８０％重量以下、好ましくは７０重量％以下である。該濃度が薄すぎると、反応工程での操作性や反応効率に問題が生じる可能性があり、該濃度が濃すぎると、コハク酸アンモニウム塩が析出する問題が生じる可能性がある。
なお、コハク酸アンモニウム塩が石油や石炭を原料として石油化学的手段によって製造されたものである場合、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とは、コハク酸アンモニウム塩の水溶液であってもよい。
【００３６】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩は、石油や石炭を原料として石油化学的手段によって製造されたものでもよいが、バイオマス資源由来であるのが環境保護の点から好ましい。
【００３７】
バイオマス資源としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥、食品廃棄物等が挙げられる。この中でも木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣等の植物資源が好ましく、より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙、製紙残渣であり、最も好ましくはとうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシである。これらのバイオマス資源は、一般に、窒素元素やＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ等の多くのアルカリ金属、アルカリ土類金属を含有する。
【００３８】
これらのバイオマス資源は、特に限定はされないが、例えば酸やアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その工程には、特に限定はされないが、例えば、バイオマス資源をチップ化する、削る、擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。こうして微細化されたバイオマス資源は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導されるが、その具体的な方法としては、硫酸、硝酸、塩酸、燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理、酸化剤処理等の化学的方法や、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理、電子線照射等の物理的方法、微生物や酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００３９】
上記のバイオマス資源から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸、セラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、これらの中では、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉、セルロース等の２糖・多糖類が好ましく、このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セルロースが好ましい。
【００４０】
これらのバイオマス資源から誘導される炭素源から脂肪族ジカルボン酸であるコハク酸を誘導する方法としては、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法や加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法ならびにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによる方法が挙げられるが、これらの中でも脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。
【００４１】
脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物は脂肪族ジカルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌、コリネ型細菌、酵母菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
【００４２】
好気性微生物としては、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌、またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられ、これらのうちコリネ型細菌がより好ましい。
【００４３】
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌またはアースロバクター属に属する細菌などが挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌が挙げられる。
【００４４】
脂肪族ジカルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
【００４５】
微生物変換における反応温度、圧力等の反応条件は、選択される菌体、カビなど微生物の活性に依存することになるが、ジカルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００４６】
微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、或いは微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、一般的には中和剤を使用してｐＨを調整する。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤を添加することによりｐＨを調節する。ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整される。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
【００４７】
中和剤としてはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素、アルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アルカリ金属の炭酸塩、アルカリ土類金属の炭酸塩が挙げられる。好ましくはアンモニア、炭酸アンモニウム、尿素である。なお上記アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物としてはＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｍｇ（ＯＨ）２等、或いはこれらの混合物などが挙げられ、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩としては、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＮａＫＣＯ３等、或いはこれらの混合物などが挙げられる。
【００４８】
本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性や反応効率を考慮して適宜濃縮しても良い。濃縮方法としては、特に限定されないが、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法、減圧で水を留去させる方法ならびにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。
【００４９】
なお、本発明の方法において、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物として発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の分離方法は、限外濾過膜や遠心分離等既存の方法を任意に用いることができる。また、微生物変換後の発酵液をオートクレーブ滅菌、加熱滅菌または低温殺菌しても良い。
【００５０】
本発明に係るコハク酸アンモニウム塩を含む組成物としては、上記のようにして得られた発酵液に含まれるコハク酸および／またはその塩をそのままコハク酸アンモニウム塩のコハク酸成分として用いることができるが、活性炭等の吸着剤処理やイオン交換カラム処理等の簡易精製を行った発酵液に含まれるコハク酸および／またはその塩を、必要に応じてＮＨ４＋を含有する化合物とともに用いてもよい。また、発酵液から取り出し、更に後述の精製処理を施したコハク酸をＮＨ４＋を含有する化合物とともに用いてもよい。
【００５１】
以下に発酵液に含まれるコハク酸塩をコハク酸へ変換する方法および精製する方法を例示するが、本発明は以下の方法に限定されるものではない。また、コハク酸は、コハク酸に変換された以降の精製工程のうち、任意の工程において系内から取り出して用いてもよい。
【００５２】
（１）コハク酸塩のコハク酸への変換・抽出
コハク酸塩のコハク酸への変換方法としては、コハク酸よりもｐＨの高い弱酸性の有機酸を使用した反応晶析方法が挙げられる。この場合、用いる弱酸性の有機酸としては、例えば、酢酸が挙げられる。また、別法として、コハク酸塩を無機酸でコハク酸に変換しても良い。ここで、使用する無機酸としては、硫酸、塩酸、炭酸、リン酸、硝酸などが例示される。より具体的には、コハク酸発酵の場合、生成したコハク酸をアンモニアや水酸化マグネシウムで中和しながら発酵を行うと、発酵液中にはコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムが生成する。このようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムを含む発酵液を硫酸等で処理すると、コハク酸を含む水溶液が得られる。
【００５３】
コハク酸を含む溶液或いは水溶液とはコハク酸を主体として含む溶液或いは水溶液である。従って、上記のようなコハク酸アンモニウムやコハク酸マグネシウムのようなコハク酸塩を主体として含む溶液或いは水溶液はコハク酸塩を含む溶液或いは水溶液と表す。ここでいう「主体として含む」状態とは、溶媒を除く全成分の重量に対する該成分の重量が、通常５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、特に好ましくは９０重量％以上含まれる状態を示す。
【００５４】
上記の無機酸でコハク酸塩をコハク酸に変換した水溶液は、特には限定されないが、有機溶媒を用いて該水溶液からコハク酸を抽出しても良い。
この方法で使用される有機溶媒は、通常、無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）が０．２以上２．３以下であり、常圧（１気圧）で沸点が４０℃以上の有機溶媒であるが、より好ましくは、Ｉ／Ｏ値が、０．３以上２．０以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒であり、更に好ましくは、Ｉ／Ｏ値が０．３以上２．０以下であり、常圧で沸点が６０℃以上の有機溶媒である。このような有機溶媒を用いることにより、コハク酸を選択的に抽出して、効率よく糖類やアミノ酸と分離できる。また、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒を用いることにより、溶媒が気化して引火する危険性や、溶媒が気化してコハク酸の抽出効率が低下するという問題や溶媒のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。
【００５５】
なお、無機性値／有機性値の比（Ｉ／Ｏ値）は、有機概念図論（「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４））に提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値および無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
【００５６】
Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の有機溶媒としては、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン等のケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、プロパノール、ブタノール、オクタノール等の炭素数３以上のアルコールが例示される。
【００５７】
各溶媒のＩ／Ｏ値および沸点を以下に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
抽出工程においては、有機溶媒は、コハク酸を含有する水溶液の容量１に対し０．５〜５の容量で加えることが好ましく、コハク酸を含有する水溶液の容量１に対し１〜３の容量で加えることがより好ましい。
【００６０】
抽出工程の温度はコハク酸が抽出される温度であればよいが、１０〜９０℃が好ましく、２０〜８５℃がより好ましい。
【００６１】
抽出工程により、コハク酸が有機溶媒中に回収され、糖類や発酵由来の窒素元素の他、発酵菌由来のアンモニア、硫黄含有不純物ならびに金属カチオン等の不純物はある程度分離される。なお、コハク酸をさらに効率よく抽出するために、有機溶媒による抽出処理を複数回繰り返してもよいし、向流抽出を行ってもよい。
【００６２】
（２）抽出相の濃縮
一般に抽出相におけるコハク酸濃度は希薄であるため濃縮操作が必要となる。濃縮度は特に限定されるものではないが、最終濃縮液中のコハク酸の溶解度が飽和溶解度以下であり、かつ極力飽和溶解度に近いほうが好ましい。
【００６３】
また抽出に用いる溶媒は水と最低共沸組成を形成することが多く、また共沸組成は溶媒リッチな組成であることが多い。従って濃縮操作に伴い溶媒が多く留去することとなり濃縮液中の溶媒濃度は濃縮前に比べ低下する。
【００６４】
生物由来原料から誘導されたコハク酸は、一般に水溶性の高い不純物を多く含むため、後続の晶析工程において溶媒共存系よりも水系の方が高い精製効果が期待できる。また溶媒が後続工程まで残留するとその回収がより困難となるため、濃縮後の溶媒濃度は１重量％以下とすることが望ましい。
【００６５】
最終濃縮液の溶媒濃度を１重量％以下、コハク酸濃度を飽和溶解度近傍とするためには濃縮前および／または濃縮操作の過程で水を加えてもよい。
【００６６】
（３）晶析
濃縮後の晶析は冷却晶析、蒸発晶析さらに断熱減圧冷却晶析等により行う。また操作はバッチ晶析でも、連続晶析でもよい。
【００６７】
（４）固液分離
晶析で得られたコハク酸スラリーは固液分離操作によりコハク酸結晶と母液を分離する。分離方法は特に限定するものではなく、濾過分離、沈降分離などが挙げられる。また、操作はバッチ式でも連続式でもよい。固液分離に用いる装置として、例えば効率の良い固液分離機として連続式の遠心濾過機、デカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。
また、求められるコハク酸の純度により固液分離操作で回収したウェットケーキは冷水等でリンス（洗浄）することができる。
【００６８】
（５）晶析母液のリサイクル
固液分離工程で得られた母液やリンス液の少なくとも一部は晶析工程より前の工程にリサイクルすることができる。リサイクルする工程は特に限定はないが、抽出工程、濃縮工程へリサイクルできる。抽出工程へリサイクルすると抽出塔は大きくなるが、水相へ分配されやすい（分配係数が小さい）不純物をリサイクル系内から選択的に除去することができ、好ましい。一方、濃縮工程にリサイクルすると抽出塔は小さくてすむが、不揮発性の不純物は全てリサイクル系内に蓄積することとなる。
【００６９】
母液やリンス液の全てをリサイクルすることも可能であるが、長期間の運転を続けることで不純物がリサイクル系内に蓄積することから、少なくとも一部は系外にパージすることが望ましい。パージ液は通常活性汚泥処理等により有機物を処理した後廃液とされるが、パージ液はコハク酸を含みｐＨが低いことから、発酵操作で回収された使用済菌体の失活処理剤として有効利用することができる。
【００７０】
このリサイクルに際して、リサイクル量、リサイクル場所は求められるコハク酸の仕様により決めることができる。
【００７１】
（６）高度精製
上述の工程を経たコハク酸はその要求純度等に応じ、乾燥処理またはさらに高度精製処理を施すこともできる。この高度精製処理としては、例えば活性炭等の吸着剤による脱色工程、イオン交換樹脂により共存イオン類を除去するイオン交換工程、共存する不飽和ジカルボン酸を水添処理する工程、さらに高度精製するための晶析工程などの処理が挙げられる。
【００７２】
｛アルキル化剤｝
本発明に係るアルキル化剤は、アルコールとアルキルアミン類との混合物である。
【００７３】
このアルコールとしては、炭素数１〜６の直鎖、分岐または環状のアルコールが好ましく、炭素数１〜４の直鎖または分岐のアルコールがより好ましく、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが好ましく、メタノール、エタノールが特に好ましい。これらのアルコールは１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７４】
これらのアルコールと共に用いるアルキルアミン類としては、メチルアミン類、エチルアミン類、プロピルアミン類、ブチルアミン類が挙げられ、好ましくは、メチルアミン類、エチルアミン類である。
なお、ここで、アルキルアミン類の「類」とは、モノアルキルアミンとジアルキルアミン、トリアルキルアミン等のアルキル基を有するアミンの総称である。
これらのアルキルアミン類は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００７５】
なお、上記アルコールおよびアルキルアミン類は、後述のＮ−アルキルコハク酸イミドを表す一般式（II）におけるＲ１のアルキル基が有していてもよい置換基で置換されてもよい。
【００７６】
アルコールとアルキルアミン類との混合物としては最も好ましくは、メタノールおよび／またはエタノールとメチルアミン類および／またはエチルアミン類との混合物が用いられる。
【００７７】
アルキル化剤を構成するアルコールとアルキルアミン類の混合比は任意であるが、コハク酸アンモニウム塩に対するアルキルアミン類の量比は、０．０００１〜１０倍モル、好ましくは０．００１〜５倍モル、より好ましくは０．０１〜１．５倍モル程度である。コハク酸アンモニウム塩に対するアルキルアミン類の量比が多過ぎると、高価なアルキルアミン類量が多くなることにより経済性が損なわれ、少な過ぎると反応効率が低下する。
【００７８】
本発明において、アルキル化剤は、アルコールとアルキルアミン類との合計でコハク酸アンモニウム塩を含む組成物中のコハク酸アンモニウム塩に対して、化学量論または化学量論量を超える量で用いられる。好ましくは、コハク酸アンモニウム塩に対して１〜１００倍モル、より好ましくは１〜５０倍モル、最も好ましくは、１〜２５倍モルのアルキル化剤が用いられる。
アルキル化剤の使用量が少な過ぎると反応効率が低下し、多過ぎてもそれ以上の反応効率の向上は望めず、また、反応規模が大型化するため、経済的にも工業的にも不利である。
アルキル化剤中のアルキルアミン類の割合としては、上述の如く、任意であるが、経済性と反応効率の面からアルコールに対するアルキルアミン類の割合が０．０００１〜１００モル％、特に０．００１〜１０モル％であることが好ましい。
【００７９】
アルキル化剤として用いるアルコールとアルキルアミン類の混合物は、アルコールとアルキルアミン類を混合して調製することもできるが、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造工程で反応後回収される未反応アルコールから、敢えてアルキルアミン類を完全に分離せず、一部または全部のアルキルアミン類を含有したまま使用してもよい。元来、アルコールと対応するアルキルアミン類を完全に分離するためには精密蒸留をする等、精製に多大なエネルギーを必要とし、結果として製造コストを上げることになる。本発明で開示するように、アルキルアミン含有アルコールを使用することにより、アルコールの回収および精製にかかる負荷を大幅に低減でき、より安価にＮ−アルキルコハク酸イミドを製造することができ、結果としてＮ−アルキルピロリドンの製造コストを下げることができる。
【００８０】
なお、反応には、上記アルキル化剤と共に、必要に応じて触媒を用いてもよい。
【００８１】
｛Ｎ−アルキルコハク酸イミド｝
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されるＮ−アルキルコハク酸イミドとは、下記一般式（II）で表される化合物である。
【００８２】
【化５】
【００８３】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【００８４】
一般式（II）において、Ｒ１の直鎖、分岐または環状のアルキル基とは、好ましくは炭素数１〜４の直鎖または分岐のアルキル基であり、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基である。最も好ましくは、メチル基、エチル基である。上記のＲ１のアルキル基は置換されていても良い。
【００８５】
Ｒ１のアルキル基が置換されている場合、その置換基としては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、エーテル基、チオエーテル基、ハロゲン原子等が挙げられる。なお、ここで、Ｒ１の炭素数とは、Ｒ１のアルキル基が置換基を有する場合、当該置換基の炭素数を含まない、アルキル基のみの炭素数である。
【００８６】
｛イミド化反応｝
＜反応温度＞
本発明において、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤であるアルコールとアルキルアミン類との混合物とを反応させてコハク酸アンモニウム塩をイミド化するイミド化反応の反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃であり、一方、通常５００℃以下、好ましくは４５０℃以下、より好ましくは４００℃以下である。反応温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応温度が高すぎると、好ましくない副反応が起こったり、反応器内で有機物が焦げ付くという問題が生じる傾向がある。
【００８７】
＜反応圧力＞
本発明に係るイミド化反応圧力は、特段の制限はないが、通常、大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。
反応系は、反応実施温度での原料および反応生成物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、本発明に係るイミド化反応は、気相および／または液相で、好ましくは液相で実施される。
【００８８】
＜反応方法＞
本発明の一実施形態において、反応は例えば以下のａ）〜ｃ）のいずれかの手順で行われるが、これに限定されるものではない。
（ａ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを所定の反応温度・圧力にて反応させる。
（ｂ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを所定の温度・圧力（以下「１段目の条件」と称す。）で反応させた後、再度所定の温度・圧力（以下「２段目の条件」と称す。）で反応させる。この場合、それぞれの反応温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
（ｃ）コハク酸アンモニウム塩を含む組成物のみを予め所定の温度・圧力（以下「１段目の条件」と称す。）にて処理した後、アルキル化剤を加えて所定の温度・圧力（以下「２段目の条件」と称す。）で反応させる。この場合、それぞれの温度・圧力は同じでも異なっていてもよい。
【００８９】
上記（ａ）〜（ｃ）の方法のうち、特に、コハク酸骨格から窒素原子を含む５員環であるコハク酸イミド構造に環化する過程と、アルキル化剤により窒素原子をアルキル化する過程とを段階的に行って反応効率を高めることができることから、（ｃ）の方法が好ましい。
【００９０】
上記（ｂ），（ｃ）、特に上記（ｃ）の場合、通常２段目の条件は１段目の条件より高温・高圧下で実施することが好ましく、１段目の温度条件を１００℃〜３００℃、２段目の温度条件を１５０℃〜４００℃とすることが有利である。これは、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とからＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する過程において、コハク酸骨格から窒素原子を含む５員環であるコハク酸イミド構造に環化する過程と、アルキル化剤により窒素原子をアルキル化する過程とでは、前者より後者において、より高い反応温度を必要とするためである。反応温度は、高いほど環化およびアルキル化に有利であるが、副反応の抑制と省エネルギーの観点から、上述の温度範囲がより有利である。
【００９１】
｛Ｎ−アルキルコハク酸イミドの精製｝
後述する触媒の存在下でＮ−アルキルコハク酸イミドを水素化してＮ−アルキルピロリドンを製造する場合、触媒反応を良好に実施して、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させてＮ−アルキルコハク酸イミドが合成された反応生成物から、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを効率的に分離回収する必要がある。
【００９２】
水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミドは、反応生成物をそのまま使用するか、反応生成物中の軽沸成分を留去し、濃縮して使用することもできるが、目的とする還元反応を良好に実施し、Ｎ−アルキルピロリドンを低コストで製造するためには、反応生成物からＮ−アルキルコハク酸イミドを分離して精製して使用することが好ましい。特に、コハク酸アンモニウム塩を含む組成物がバイオマス資源由来である場合には、合成されたＮ−アルキルコハク酸イミドを反応生成物から分離、精製することが好ましい。
Ｎ−アルキルコハク酸イミドの回収および精製方法としては、晶析、蒸留、抽出、クロマトグラフィなど、公知の方法から選択することができ、複数の方法を組み合わせてもよい。
【００９３】
なお、本発明に係るイミド化反応で副生するＮ−アルキルスクシナミン酸は、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの加水分解体であり、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの蒸留条件で容易に脱水環化してＮ−アルキルコハク酸イミドに変換される。そのため、精製工程に蒸留操作を入れることは収率向上のために好ましく、Ｎ−アルキルスクシナミン酸はＮ−アルキルコハク酸イミドと等価な有効成分と見做すことができる。
【００９４】
［Ｎ−アルキルピロリドン］
本発明のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法により製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドは、これを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造するための中間体として好適に用いられる。
【００９５】
【化６】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【００９６】
ここでＲ１は、前記一般式（II）におけると同義であり、その好ましいものも同様である。
【００９７】
＜還元工程＞
Ｎ−アルキルコハク酸イミドからＮ−アルキルピロリドンへの還元工程は、触媒の存在下で水素を用いる接触水素化反応、複合水素化物を用いる水素化反応、または、例えばメタノールやイソプロパノール等のアルコールがアルデヒドやケトンに変換されながら水素を供給する水素移動反応等によって行われる。
【００９８】
その中でも好ましくは、接触水素化反応であり、接触水素化反応は気相または液相で実施することができる。水素化反応はバッチ式、連続式いずれの反応形式でもよく、従来の公知の方法に従って行うことができる。水素化反応に供するＮ−アルキルコハク酸イミドは、前述の如く、Ｎ−アルキルコハク酸イミドの製造工程で得られたＮ−アルキルコハク酸イミドを含有する反応生成物をそのまま用いても、また反応に悪影響を及ぼさない溶媒で希釈して用いてもよいが、目的とする触媒反応を良好に実施し、低コストでＮ−アルキルピロリドンを製造するためには、Ｎ−アルキルコハク酸イミドを精製して使用することが好ましい。
【００９９】
本発明に係る水素化反応温度は、特段の制限はないが、通常５０℃以上、好ましくは１００℃以上、より好ましくは１５０℃以上、一方、通常４００℃以下、好ましくは３５０℃以下、より好ましくは３００℃以下である。反応温度が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応温度が高すぎると、炭素窒素結合が水素化分解される等の好ましくない副反応が進行するという問題が生じる傾向がある。
【０１００】
本発明に係る水素化反応圧力は、特段の制限はないが、通常、大気圧以上、好ましくは０．５ＭＰａ以上、より好ましくは１ＭＰａ以上であり、一方、通常３０ＭＰａ以下、好ましくは２５ＭＰａ以下、より好ましくは２０ＭＰａ以下である。反応圧力が低すぎると、反応速度が遅く、反応完結までに時間がかかるという問題が生じる傾向があり、反応圧力が高すぎると、目的物の水添反応が進行し、過水添副生物が多くなるという問題が生じる傾向がある。
【０１０１】
反応系は反応実施温度での原料および反応生成物の蒸気圧であっても、その他のガス成分により加圧されていてもよく、気相および／または液相、好ましくは液相で実施される。
【０１０２】
水素化反応の具体的な方法としては、加圧反応器内にＮ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物と水素化触媒とを共存させ、この混合物を撹拌しながら水素ガスを導入して水素化反応を行い、反応生成物から水素化触媒を分離して反応器から取り出す方法、固定床多管式または単管式の反応器を用いて、Ｎ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物と水素ガスを反応器の上部または下部から流通させながら水素化反応を行い、反応生成物を取り出す方法、あるいは水素ガスを反応器の下部から、Ｎ−アルキルコハク酸イミド或いはそれを含む組成物は上部から流通させて水素化反応を行い、反応生成物を取り出す方法、あるいは流動床反応器を用いる方法などが挙げられる。
【０１０３】
＜水素化触媒＞
上記水素化反応に用いられる水素化触媒としては、公知の均一系ならびに不均一系の水素化触媒を用いることができる。具体的な水素化触媒としては、特に限定はされないが、好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、鉄、マンガン、クロム、亜鉛、スズ、インジウム、アンチモンなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられ、より好ましくは、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、レニウム、白金、銅、ニッケル、コバルト、クロム、亜鉛、スズなどの金属を１種以上含む水素化触媒が用いられる。
【０１０４】
これらの水素化触媒は上記の金属を含む化合物をそのまま使用したり、有機ホスフィンなどの配位子を共存させて使用することができるが、触媒分離の容易性の観点から不均一系の金属含有触媒が好ましい。
【０１０５】
水素化触媒としては、これらの触媒活性成分となる金属を含む化合物をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭共存下で用いるか、または上記の金属をシリカやチタン、ジルコニア、活性アルミナなどの金属酸化物またはこれらの複合金属酸化物、或いは活性炭などの担体に担持した担持触媒が好適に使用される。ここで用いられる担体は、モンモリロナイト、シリケートおよびゼオライトのように特異な構造を有しているものでもよい。また、上記の触媒活性成分となる金属を酸化物或いは複合酸化物として含む沈殿触媒として用いてもよく、担体成分の存在下で生成させた沈殿触媒を用いることもできる。
【０１０６】
このような水素化触媒の触媒活性成分である金属の含有量は、通常、触媒全体に対して約０．１〜約９０重量％であるが、貴金属担持触媒においては、好ましくは約０．１〜約５０重量％の含有量であり、金属酸化物の沈殿触媒においては、好ましくは約１０〜約９０重量％の含有量である。
【０１０７】
本発明において、上述の水素化触媒の触媒活性金属の種類、複数種の金属の組み合わせ、担体との組み合わせや、触媒活性金属の含有量および調製方法は、目的とする水素化反応に悪影響を及ぼさない限り、任意の組み合わせが可能であり、特に限定されるものではない。
【０１０８】
不均一触媒の使用においては、反応開始時に存在する水素ガスによって、反応系中で活性化して使用することができるが、使用前に水素ガス存在下で活性化した触媒を用いてもよい。使用前の触媒活性化は、触媒に悪影響を及ぼさない溶媒の存在下あるいは非存在下で、バッチ式反応器内で水素ガス処理する方法、連続式の固定床反応器あるいは流動床反応器に触媒を入れ、水素ガスを流通させて水素ガス処理する方法などが挙げられる。水素ガス処理における温度および圧力は、それぞれの触媒に適した範囲から選択される。
【０１０９】
＜水素ガス＞
水素化反応に使用する水素ガスは、純水素ガスでもよいが、窒素、ヘリウム、アルゴンなどの不活性ガスで希釈させたものも使用できる。ただし、一酸化炭素は、水素化反応効率への影響が懸念される為、水素ガス中の一酸化炭素濃度は通常１００００ｐｐｍ以下、好ましくは２０００ｐｐｍ以下、より好ましくは１０００ｐｐｍ以下とする。
【実施例】
【０１１０】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【０１１１】
なお、下記例における酸類、糖類、コハク酸、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）およびＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析はＬＣ（液体クロマトグラフィー）を用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い、それぞれ以下の条件で測定を行った。
【０１１２】
＜酸類、糖類の定量分析＞
カラム；信和加工（株）製 ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ
溶離液：水／過塩素酸（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃
【０１１３】
＜コハク酸、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）およびＮ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）の定量分析＞
カラム：イオン交換カラム ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８ＥＨ ８ｍｍ×３００ｍｍ
温度：５０℃
溶離液：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
注入量：２０μｌ
検出器：ＲＩ検出器
【０１１４】
＜アミノ酸の定量分析＞
装置：日立アミノ酸分析計 Ｌ−８９００
分析条件：生体アミノ酸分離条件−ニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ，４４０ｎｍ）
標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
注入量：１０μｌ
定量計算：プロリンは、波長４４０ｎｍ、他のアミノ酸は波長５７０ｎｍのピークの面積から、一点外部標準法にてアミノ酸含有を算出
【０１１５】
＜ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＣ）増強株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。
【０１１６】
Ａ培地（尿素：２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ：６ｍｇ、ビオチン：２００μｇ、チアミン：１００μｇ、イーストエキストラクト：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、グルコース：２０ｇを蒸留水：１Ｌに溶解）１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加えて混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の鋳型ＤＮＡに使用した。
【０１１７】
（Ｂ）ＰＣ遺伝子プロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１１８】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１１９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。
【０１２０】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（特開２００５−９５１６９）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。
【０１２１】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２２】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分からなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。
【０１２３】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬ カナマシンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。
【０１２４】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。
【０１２５】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２６】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。
【０１２７】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。
【０１２８】
反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。
【０１２９】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラーＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。
【０１３０】
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。このＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した。
【０１３１】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株：特開２００５−９５１６９）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡを用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地（トリプトン：１０ｇ、イーストエキストラクト：５ｇ、ＮａＣｌ：５ｇ、グルコース：２０ｇ、および寒天：１５ｇを、蒸留水：１Ｌに溶解）に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。
その結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨと命名した。
【０１３２】
（Ｄ）ピルベートカルボキシラーゼ酵素活性の測定
上記（Ｃ）で得られた形質転換株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株をグルコース２％を含むＡ培地１００ｍＬで終夜培養を行った。得られた菌体を集菌後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍＬで洗浄し、同組成の緩衝液２０ｍＬに再度懸濁させた。懸濁液をＳＯＮＩＦＩＥＲ ３５０（ＢＲＡＮＳＯＮ製）で破砕し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を用いピルベートカルボキシラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／１０ｍｌビオチン、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭアデノシン３リン酸ナトリウム、０．３２ｍＭ ＮＡＤＨ、２０ｕｎｉｔｓ／１．５ｍｌリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＷＡＫＯ製、酵母由来）および酵素を含む反応液中で２５℃で反応させることにより行った。１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。ピルベートカルボキシラーゼの発現を強化した無細胞抽出液における比活性は０．１Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。尚、親株であるＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株を同様に培養した菌体では、本活性測定方法検出限界以下であった。
以下、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨ株を有機酸生産菌として菌体調製用培養、および有機酸生産反応に用いた。
【０１３３】
＜コハク酸塩含有培養液の調製＞
<種培養>
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：５ｇ、カザミノ酸：５ｇ、および蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬを５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、予め滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−４／ΔＬＤＨを接種して２４時間３０℃にて種培養した。
【０１３４】
<本培養>
硫酸アンモニウム：１．０ｇ、リン酸１カリウム：１．５ｇ、リン酸２カリウム１．５ｇ、塩化カリウム：１．６７ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：１．０ｍｇ、塩酸チアミン：１．０ｍｇ、酵母エキス１０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：１．０ｇおよび蒸留水：１０００ｍＬの培地４００ｍＬを１Ｌの発酵糟に入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、予め滅菌した７２％グルコース水溶液：２０ｍＬを添加し、これに前述の種培養液を２０ｍＬ加えて、３０℃に保温した。ｐＨは９．３％アンモニア水を用いて７．０以下にならないように保ち、通気は毎分３００ｍＬ、攪拌は毎分６００回転で２４時間本培養を行った。溶存酸素濃度は培養開始直後から徐々に低下し、培養開始後４時間でほぼ０となった。その後、培養開始後１５時間で溶存酸素濃度が上昇したため、予め滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加したところ、再び急速に低下し、ほぼ０となった。約１３分後同様に溶存酸素濃度の上昇が観察されため、予め滅菌した７２％グルコース水溶液を３８０μＬ添加し再び低下させた。以後、約１３分毎に同様の溶存酸素濃度の上昇が見られたが、その都度同様の方法で低下させた。培養２４時間後のＯＤ６６０は８７．３であった。
【０１３５】
<有機酸生産培養>
リン酸１アンモニウム：８４．４ｍｇ、リン酸２アンモニウム：７５．８ｍｇ、塩化カリウム１４９．１ｍｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．２ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：８ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：８ｍｇ、Ｄ−ビオチン：８０μｇ、塩酸チアミン：８０μｇおよび蒸留水：２００ｍＬの培地を５００ｍＬの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、１Ｌのジャーファーメンターに入れた。この懸濁液２００ｍＬに上記の本培養により得られた培養液９０ｍＬ、予め滅菌した７２％グルコース溶液：４０ｍＬ、滅菌水：１２５ｍＬを添加して混合し、３５℃に保温した。ｐＨは炭酸アンモニウム：１５４ｇ、２８％アンモニア水：２３９ｍｌ、蒸留水：６５０ｍＬの水溶液を用いて７．６に保ち、毎分２００回転で攪拌しながら有機酸生産反応を行った。反応開始後２１時間における生産コハク酸濃度は３４．８ｇ／Ｌ、生産リンゴ酸濃度は３．１ｇ／Ｌ、生産フマル酸濃度は１．１ｇ／Ｌ、生産酢酸濃度は５．０ｇ／Ｌ、アラニン濃度は２．１ｇ／Ｌ、バリン濃度は１．４ｇ／Ｌであった。また、本培養液には、トレハロース０．２７ｇ／Ｌ、未反応グルコース０．３７ｇ／Ｌが含有されていた。
【０１３６】
このようにして調製したコハク酸発酵液から分画分子量１３００の限外濾過膜により菌体を分離し、減圧加温下で濃縮して、コハク酸濃度２５重量％のコハク酸発酵液を得た。このコハク酸発酵液中のコハク酸は、コハク酸ジアンモニウムとして存在する。このコハク酸発酵液を「コハク酸発酵液Ｉ」と称す。
【０１３７】
＜発酵液からのコハク酸の回収＞
上述の有機酸生産培養に準じて調製したコハク酸発酵液を遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分）処理して得られた上澄み液を減圧加温下で濃縮した。濃縮された培養液を攪拌しながら、４７％硫酸を培養液に滴下して溶液のｐＨを２とした。硫酸を添加した培養液に有機溶媒として培養液と等容量のメチルエチルケトン（ＭＥＫ）を添加し、２５℃で、約３０分攪拌した。得られた液を静置後、有機層と水層とに分け、分液された水層に水層の体積の半分の容量のＭＥＫを加え、２５℃で、３０分攪拌した。同様に液を静置後、有機層と水層とに分けた。同様の操作を更に３回繰り返し、全有機層をあわせた。有機層を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）で分析した結果、有機層には、使用ブロス中に含有していた９７．９％量のコハク酸が抽出された。
【０１３８】
次に得られたＭＥＫ抽出液から７０℃にて４００ｍｍＨｇから１００ｍｍＨｇへ減圧度を調整しながらＭＥＫを留去して、ＭＥＫ抽出有機層を濃縮した。その後、得られた溶液を７０℃から４０℃まで３０分かけて降温し、その後、４０℃で１時間攪拌した。析出した結晶を濾過後、冷水でリンスして、粗結晶を得た。一方、濾液は、さらに４０℃から１０℃まで３０分かけて降温し、１０℃で１時間攪拌した。析出した結晶を濾過後、冷水でリンスして、コハク酸純度９４重量％のコハク酸粗結晶を得た。このコハク酸粗結晶を「コハク酸粗結晶Ｉ」と称す。この工程では、ＭＥＫ有機層に抽出されたコハク酸の９８％量のコハク酸が回収された。
【０１３９】
［比較例１］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸ジアンモニウム３．８６８ｇと水５．０１９ｇを仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して２．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素ガス雰囲気下にてメタノール１６．２９３ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉し、予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、反応生成物の組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、コハク酸ジアンモニウム転化率（以下、単に「転化率」と記す。）９８．７％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率８０．６％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率３．０％であった。下記式で算出した有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８７．４％であった。
有効成分選択率：（ＭＳＩ収率＋ＮＭＳＡ収率）／（転化率）×１００（％）
【０１４０】
［実施例１〜９］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表２に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例１と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って、結果を比較例１の結果と共に表２に示した。
なお、以下においてメチルアミン類は、
ＭＭＡ：モノメチルアミン
ＤＭＡ：ジメチルアミン
ＴＭＡ：トリメチルアミン
と表記する。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
表２に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【０１４３】
［比較例２］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸粗結晶Ｉを３．００４ｇと水３．５０９ｇおよび２８重量％アンモニア水３．０３８ｇ（コハク酸成分に対して約２モル倍）を仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して３時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素下にてメタノール１４．９３１ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉した。予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、生成物組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、転化率９８．３％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率７７．５％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率３．０％であった。有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８１．８％であった。
【０１４４】
［実施例１０〜１２］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表３に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例２と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って、結果を比較例２の結果と共に表３に示した。
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
表３に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【０１４７】
［比較例３］
磁気攪拌子を入れた７０ｍＬハステロイ製耐圧容器に、コハク酸発酵液Ｉを６．０１９ｇ仕込み密閉した。反応器内を窒素ガスにて置換し、予め２００℃に加熱した電気炉に設置して２．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、窒素下にてメタノール８．０１８ｇ（コハク酸成分に対して約２０モル倍）を加え密閉し、予め２５０℃に加熱した電気炉に設置して３．５時間加熱攪拌した。加熱終了後周辺温度まで冷却し、反応器を開放して反応液を採取し、生成物組成を液体クロマトグラフィにて分析したところ、転化率９７．２％、Ｎ−メチルコハク酸イミド（ＭＳＩ）収率７８．７％、Ｎ−メチルスクシナミン酸（ＮＭＳＡ）収率４．２％であった。有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率は８５．３％であった。
【０１４８】
［実施例１３〜１５］
メタノールの代わりに、メタノール（コハク酸成分に対して約２０モル倍）と表４に示す量比のメチルアミン類の混合物を用いたこと以外は、比較例３と同様の操作を行い、同様に得られた反応生成物の分析を行って結果を比較例３の結果と共に表４に示した。
【０１４９】
【表４】
【０１５０】
表４に示すように、アルキル化剤としてメタノールのみを用いた場合より、メタノールとメチルアミン類の混合物を用いた場合において、有効成分であるＭＳＩとＮＭＳＡを合わせた選択率が高いことが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、下記一般式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、該アルキル化剤がアルコールとアルキルアミン類との混合物であることを特徴とするＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【化１】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【化２】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【請求項２】
前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物が、コハク酸および／またはその塩を含む発酵液、或いは発酵液から取り出したコハク酸および／またはその塩を含む混合物から得られることを特徴とする請求項１に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項３】
前記アルキル化剤の使用量が、前記コハク酸アンモニウム塩に対して化学量論量以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項４】
前記アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、前記アルキルアミン類がメチルアミン類および／またはエチルアミン類である請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項５】
前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物と前記アルキル化剤との反応温度が５０℃〜５００℃で、反応圧力が標準圧力〜３０ＭＰａであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造することを特徴とするＮ−アルキルピロリドンの製造方法。
【化３】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるコハク酸アンモニウム塩を含む組成物とアルキル化剤とを反応させて、下記一般式（II）で表されるＮ−アルキルコハク酸イミドを製造する方法において、該アルキル化剤がアルコールとアルキルアミン類との混合物であることを特徴とするＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【化１】
（式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、Ｈ，ＮＨ４＋または他のカチオンを表し、かつＸおよびＹの少なくとも一方はＮＨ４＋を表す。）
【化２】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
【請求項２】
前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物が、コハク酸および／またはその塩を含む発酵液、或いは発酵液から取り出したコハク酸および／またはその塩を含む混合物から得られることを特徴とする請求項１に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項３】
前記アルキル化剤の使用量が、前記コハク酸アンモニウム塩に対して化学量論量以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項４】
前記アルコールがメタノールおよび／またはエタノールであり、前記アルキルアミン類がメチルアミン類および／またはエチルアミン類である請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項５】
前記コハク酸アンモニウム塩を含む組成物と前記アルキル化剤との反応温度が５０℃〜５００℃で、反応圧力が標準圧力〜３０ＭＰａであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＮ−アルキルコハク酸イミドの製造方法で製造されたＮ−アルキルコハク酸イミドを還元することにより、下記一般式(III)で表されるＮ−アルキルピロリドンを製造することを特徴とするＮ−アルキルピロリドンの製造方法。
【化３】
（式中、Ｒ１は、置換されていても良い直鎖、分岐または環状の、炭素数１〜６のアルキル基である。）
【公開番号】特開２０１１−２０７８１２（Ｐ２０１１−２０７８１２Ａ）
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７７２６５（Ｐ２０１０−７７２６５）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月２０日（２０１１．１０．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【出願人】（０００００５９６８）三菱化学株式会社 (4,356)
【Ｆターム（参考）】
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