ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡシュードノット構造に結合してリボソームフレームシフトを抑制するホモピペラジン系化合物
【課題】ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡシュードノット構造に結合してリボソームフレームシフトを抑制するホモピペラジン系化合物の提供、抗ウイルス治療及び予防に有用な化合物並びにこれを含有した薬剤組成物の提供。
【解決手段】治療学的有効量の下記式のホモピペラジン系化合物、またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体もしくは賦形剤とともに含む薬剤組成物。
【解決手段】治療学的有効量の下記式のホモピペラジン系化合物、またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体もしくは賦形剤とともに含む薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス治療及び予防に有用な化合物並びにこれを含有した薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、ＳＡＲＳと略す）は、２００２年１１月から中国廣東地域を中心に発生して全世界に広がっており、発熱と咳、呼吸困難、非定型肺炎などの症状を伴う症候群である。今のところは、治療法に対する充分な情報がなく、一部抗菌剤や抗ウイルス剤とともに投与して治療を行っているが、その効果が満足できるほどではなく、死亡率が高くなっている。よって、強力な急性呼吸器症候群の治療剤の開発が急である。本発明は、このような必要によってなされたものである。
一方、ウイルスが起こす疾病を治療するために開発される殆どの抗ウイルス剤は、ウイルスの生存に重要な蛋白質をターゲットとして開発されている。このような方式により開発された薬剤の場合、はじめには反応を見せるが、治療期間中に薬物に対して耐性を示すという問題が発生する。これは、ウイルスでは速い速度で蛋白質自体の突然変異が起きるから、特定ウイルスの蛋白質をターゲットとして開発された薬剤に耐性を持ちやすくなるためである。したがって、ウイルスの治療においては、薬剤に対するウイルスの耐性を阻止することがなによりも重要である。したがって、蛋白質をターゲットとする代わりに、点突然変異による耐性発現が相対的に遅く生じるＲＮＡの特定構造をターゲットとする薬物を開発することが、こういう問題点を解決するための一つの方法として考えられている。しかしながら、ＳＡＲＳコロナウイルスをはじめとする他の様々なウイルスでも、蛋白質生成の重要な機序である−１フレームシフトの重要因子であるＲＮＡシュードノット構造をターゲットとして開発された抗ウイルス製剤として可能性を有する化合物の開発は皆無である。
【特許文献１】特開２００５−２６３７７３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＳＡＲＳコロナウイルスに存在するＲＮＡシュードノット構造をターゲットとして、従来の抗ウイルス剤が有する限界を念頭に置いてなされたものであって、急性呼吸器症候群に対して生存抑制の優れた活性を見せ、かつ薬剤に対する耐性の発生を最小化した抗ウイルス剤として有用な化合物またはこれを含有した薬剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成すべく、本発明は、下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を含む薬剤組成物を提供する。さらに具体的に説明すると、治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を含む、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡシュードノット構造に結合して、リボソーム−１フレームシフトを抑制するための薬剤組成物を提供する。
【０００５】
本発明は、治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害することを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されてもよく、または置換されなくてもよい
【０００６】
また、本発明は、治療学的有効量の式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含むことを特徴とする抗ウイルス性治療または予防のための薬剤組成物を提供する。
【０００７】
また、本発明は、ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスであることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、式（１）の化合物が、
２−（（４−（２メチル−チアゾール−４−イルメチル）−［１，４］ジアゼペン−１−カルボニル）アミノ）安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−［５−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−［１，２，４］オキサジアゾール−３−イルメチル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−（５−メチル−イソオキサゾール−３−イルメチル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；または
２−（｛４−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステルであることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、経口投与のための剤形であることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、非経口投与のための剤形であることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物によれば、急性呼吸器症候群の原因ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して、−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害することによって、抗ウイルス剤としての潜在的効能を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１３】
−１フレームシフト（−１ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ）機序とは、一つのｍＲＮＡで互いに異なる蛋白質を作ることができる機序のうちの一つであって、特定位置で正常な翻訳フレームの代わりに−１、すなわち、５´方向に１フレーム分だけシフトしたフレームを翻訳過程に用いて、２種類の異なる蛋白質を作る機序のことである。ＳＡＲＳウイルスは、宿主細胞内でＲＮＡシュードノット構造が引き起こす−１フレームシフトを用いて、自己増殖に必要な２種類以上の蛋白質を正確な割合で作って使用するから、−１フレームシフトの効率において、増加または減少が起きるようになれば、ウイルスの自己増殖の過程が抑制されたり破壊されたりするという致命的な結果を引き起こす。
【００１４】
ＲＮＡシュードノット構造は、−１フレームシフトの効率に重要な機能を果たすものと知られており、これらの構造的特性と安定性が−１フレームシフトの正確な効率を維持するのに極めて重要な機能を果たしている。本発明者等は、商業的に利用可能な数十万ケの化合物データベースを用いて、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造の三次元構造モデルをターゲットとしてコンピュータを用いた仮想検索を行なうことによって候補化合物群を確保し、試験管内と動物細胞内での−１フレームシフト効率分析実験を介して、既存の新薬開発法とは差別化した標的選定と方法により、ウイルスの生存に必ず必要な蛋白質に対して生成段階から抑制して合成できなくする低分子物質である下記式（１）の化合物を開発した。
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されるか、または置換されることができる。
【００１５】
前記式（１）の化合物のうち、特に好ましい化合物を下記の表１に示した。
【表１】
【００１６】
本発明は、前記式（１）で表されるホモピペラジン系化合物及び薬学的に許容されるその塩、かつそれから製造可能な溶媒和物及び水和物を全て含む。
【００１７】
本発明の式（１）の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩には、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。遊離酸には、有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸には、塩酸、リン酸、硫酸、窒酸などを使用することができ、有機酸には、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨード酸などを使用することができる。
【００１８】
本発明に係る酸付加塩は、通常の方法、例えば式（１）の化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造し得る。同量の式（１）の化合物及び水中の酸またはアルコール（たとえば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次にこの混合物を乾燥させるか、または析出された塩を吸入ろ過させて製造することもできる。
【００１９】
また、式（１）の化合物を可能な有機溶媒、例えばジエチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジクロロメタン、アセトニトリルを使用して溶解させ、前記列挙した様々な無機酸及び有機酸を直接あるいは有機溶媒に溶解されている形態で加えて、生成される塩を沈殿させ吸入ろ過して製造することもできる。
【００２０】
式（１）の化合物は、臨床投与時に経口及び非経口の種々の剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の式（１）の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、蔗糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）または乳糖（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤等も使用される。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、乳剤シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の機序には、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｒｃｒｏｇｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されることができる。
【００２１】
本発明に係る有効性分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、水活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって適切に選択されるが、一般に成人に１日に体重１ｋｇ当り式（１）の化合物を０．１〜５００ｍｇの範囲の量で１回または数回に分けて投与でき、好ましくは、１〜２０ｍｇの範囲である。
【００２２】
以下、本発明を、実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例らは、本発明を例示するものであって、本発明の内容が実施例により限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞本発明の化合物の試験管内での−１フレームシフト効率分析法（ｉｎｖｉｔｒｏ−１ ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）
【００２４】
前記表１に記載されたサンプル１〜４の化合物は、Ｔｒｉｐｏｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｕｄｅ−Ｓｔｒａｔｔｏｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｂｕｄｅ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＥＸ２３ ８ＬＹ ＵＫ社から商業的に入手した。また、サンプル１の化合物は、下記の細胞−基材実験（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のために、（株）ＬＥＡＤＧＥＮＥＸ社に大量合成を依頼して使用した。
【００２５】
ＴＮＴ Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを使用して、−１フレームシフトにより引き起こされる蛋白質を生成した。ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造が挿入された二重蛍光リポーター遺伝子が含まれたプラスミドを有する組み換えＤＮＡを作って実験を実施した。総２０μ?の反応に５００ｎｇのＤＮＡ、１６μ?のうさぎの網状赤血球分離混合物（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）、そしてメチオニンで標識された１０μＣｉ／μ?の濃度を有する３５Ｓ ０．８μ?を使用した。ここにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶かした２．５ｍＭの化合物（サンプル１）を添加した後、３０℃で約２時間の間反応を行った。生成された蛋白質の量は、ＳＤＳ−不連続電気泳動法と二重発光蛋白質分析法（ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）で分析した。
【００２６】
結果分析方法１：ＳＤＳ−不連続電気泳動法（ＳＤＳ−ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２７】
生成された蛋白質のうち、フレームシフトが起こらず生成された蛋白質（Ｎｏｎ−ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と−１フレームシフトにより生成された蛋白質（ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を分離するために、１２％スタッキングゲルと５％ランニングゲルに電気泳動して、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎに露出させてＢＡＳ機械で放射能写真を撮って得た結果を定量した。−１フレームシフト効率の計算は、反応で生成される蛋白質が有している３５Ｓ−メチオニンの数を考慮して、％＝（Ｉ［ＦＳ］／２６）／［（Ｉ［ＦＳ］／２６）＋（Ｉ［ＮＦＳ］）／９］×１００の式を用いる。ここで、Ｉ［ＦＳ」は、−１フレームシフトにより生成された蛋白質の量を表し、Ｉ［ＮＦＳ」は、−１フレームシフトが起こらずに生成された蛋白質の量を意味する。上記で言及した化合物の結果は、図１のとおりである。
【００２８】
本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果、本発明化合物と他の化合物の結果を比較すると、発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を顕著に妨害したことを見せている。ＤＭＳＯは、本発明化合物が添加されない状態であり、残りは、本発明化合物の存在下で（２．５ｍＭ）行われた。
【００２９】
結果分析方法２：二重発光蛋白質分析法（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）
【００３０】
−１フレームシフトの有無とその活性度をレポーター遺伝子の生成量を直接測定して再確認する実験である。Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ａｓｓａｙから得たサンプルを約１μ?取って蛍の発光蛋白質（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を測定するために、約５０μ?のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを添加して、蛍の発光蛋白質量を測定し、Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ ｒｅｇｅｎｔを５０μ?添加して、第２番目にレニラ内発光蛋白質（ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をＴＤ−２０／２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して定量した。結果は、図２に示した。
【００３１】
分析結果、本発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を顕著に妨害した結果を見せた。ＤＭＳＯは、発明化合物が添加されない状態であり、残りは、本発明化合物の存在下で（２．５ｍＭ）行われた。
【００３２】
＜実施例２＞本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験
【００３３】
上記で言及した同じ方法により、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造と全く類似性のない他のＲＮＡシュードノット構造を共に実験して、その結果を比較分析した。
【００３４】
本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果は、下記のとおりである。
【００３５】
結果分析方法１．
分析結果は、図３に示した。分析結果、本発明化合物が他のＲＮＡシュードノット構造に影響を与えないことを確認した。
【００３６】
結果分析方法２．
分析結果は、図４に示した。分析結果、本発明化合物が他のＲＮＡシュードノット構造に影響を与えないことを再確認した。
【００３７】
＜実施例３＞動物細胞内での−１フレームシフト分析
ＨＥＫ ２９３（人間腎臓細胞）を用いて実験した。細胞培養には、ペニシリンとストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ溶液を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）で補強した培地を使用し、３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件で培養し、３〜４日に一度ずつ継代維持した。
【００３８】
＜実施例４＞動物細胞内で発明化合物の−１フレームシフトに及ぼす影響実験
細胞を２４ウェルプレートに分注し、細胞が底に付着するように２４時間の間培養した。細胞が底面に付着した後、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造が含まれているＤＮＡを挿入させて、培養器で約１８時間を培養した後、発明化合物（サンプル１）をウェル当たり２μ?ずつ添加して、培養器で１８時間さらに培養する。培養が終わった後、発明化合物が−１フレームシフトに及ぼす影響を二重蛍光分析法で測定した。
【００３９】
測定結果は、図５に示した。分析結果、本発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を妨害した結果を見せた。０ｍＭは、発明化合物が添加されない状態であり、残りは、発明化合物の存在下で（０．０２〜２ｍＭ）行われた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＤＳ−不連続電気泳動法による本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果を示した図である。
【図２】二重発光蛋白質分析法による−１フレームシフトの有無とその活性度に対する分析結果を示したグラフである。
【図３】本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験による本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果を示した図である。
【図４】本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験による−１フレームシフトの有無とその活性度に対する分析結果を示したグラフである。
【図５】本発明の化合物（サンプル１）の動物細胞内の−１フレームシフトに及ぼす影響力測定結果を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス治療及び予防に有用な化合物並びにこれを含有した薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、ＳＡＲＳと略す）は、２００２年１１月から中国廣東地域を中心に発生して全世界に広がっており、発熱と咳、呼吸困難、非定型肺炎などの症状を伴う症候群である。今のところは、治療法に対する充分な情報がなく、一部抗菌剤や抗ウイルス剤とともに投与して治療を行っているが、その効果が満足できるほどではなく、死亡率が高くなっている。よって、強力な急性呼吸器症候群の治療剤の開発が急である。本発明は、このような必要によってなされたものである。
一方、ウイルスが起こす疾病を治療するために開発される殆どの抗ウイルス剤は、ウイルスの生存に重要な蛋白質をターゲットとして開発されている。このような方式により開発された薬剤の場合、はじめには反応を見せるが、治療期間中に薬物に対して耐性を示すという問題が発生する。これは、ウイルスでは速い速度で蛋白質自体の突然変異が起きるから、特定ウイルスの蛋白質をターゲットとして開発された薬剤に耐性を持ちやすくなるためである。したがって、ウイルスの治療においては、薬剤に対するウイルスの耐性を阻止することがなによりも重要である。したがって、蛋白質をターゲットとする代わりに、点突然変異による耐性発現が相対的に遅く生じるＲＮＡの特定構造をターゲットとする薬物を開発することが、こういう問題点を解決するための一つの方法として考えられている。しかしながら、ＳＡＲＳコロナウイルスをはじめとする他の様々なウイルスでも、蛋白質生成の重要な機序である−１フレームシフトの重要因子であるＲＮＡシュードノット構造をターゲットとして開発された抗ウイルス製剤として可能性を有する化合物の開発は皆無である。
【特許文献１】特開２００５−２６３７７３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ＳＡＲＳコロナウイルスに存在するＲＮＡシュードノット構造をターゲットとして、従来の抗ウイルス剤が有する限界を念頭に置いてなされたものであって、急性呼吸器症候群に対して生存抑制の優れた活性を見せ、かつ薬剤に対する耐性の発生を最小化した抗ウイルス剤として有用な化合物またはこれを含有した薬剤組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記の目的を達成すべく、本発明は、下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を含む薬剤組成物を提供する。さらに具体的に説明すると、治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を含む、ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡシュードノット構造に結合して、リボソーム−１フレームシフトを抑制するための薬剤組成物を提供する。
【０００５】
本発明は、治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害することを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されてもよく、または置換されなくてもよい
【０００６】
また、本発明は、治療学的有効量の式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含むことを特徴とする抗ウイルス性治療または予防のための薬剤組成物を提供する。
【０００７】
また、本発明は、ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスであることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、式（１）の化合物が、
２−（（４−（２メチル−チアゾール−４−イルメチル）−［１，４］ジアゼペン−１−カルボニル）アミノ）安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−［５−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−［１，２，４］オキサジアゾール−３−イルメチル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−（５−メチル−イソオキサゾール−３−イルメチル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；または
２−（｛４−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステルであることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【０００９】
また、本発明は、経口投与のための剤形であることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、非経口投与のための剤形であることを特徴とする薬剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物によれば、急性呼吸器症候群の原因ウイルスであるＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して、−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害することによって、抗ウイルス剤としての潜在的効能を発揮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１３】
−１フレームシフト（−１ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ）機序とは、一つのｍＲＮＡで互いに異なる蛋白質を作ることができる機序のうちの一つであって、特定位置で正常な翻訳フレームの代わりに−１、すなわち、５´方向に１フレーム分だけシフトしたフレームを翻訳過程に用いて、２種類の異なる蛋白質を作る機序のことである。ＳＡＲＳウイルスは、宿主細胞内でＲＮＡシュードノット構造が引き起こす−１フレームシフトを用いて、自己増殖に必要な２種類以上の蛋白質を正確な割合で作って使用するから、−１フレームシフトの効率において、増加または減少が起きるようになれば、ウイルスの自己増殖の過程が抑制されたり破壊されたりするという致命的な結果を引き起こす。
【００１４】
ＲＮＡシュードノット構造は、−１フレームシフトの効率に重要な機能を果たすものと知られており、これらの構造的特性と安定性が−１フレームシフトの正確な効率を維持するのに極めて重要な機能を果たしている。本発明者等は、商業的に利用可能な数十万ケの化合物データベースを用いて、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造の三次元構造モデルをターゲットとしてコンピュータを用いた仮想検索を行なうことによって候補化合物群を確保し、試験管内と動物細胞内での−１フレームシフト効率分析実験を介して、既存の新薬開発法とは差別化した標的選定と方法により、ウイルスの生存に必ず必要な蛋白質に対して生成段階から抑制して合成できなくする低分子物質である下記式（１）の化合物を開発した。
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されるか、または置換されることができる。
【００１５】
前記式（１）の化合物のうち、特に好ましい化合物を下記の表１に示した。
【表１】
【００１６】
本発明は、前記式（１）で表されるホモピペラジン系化合物及び薬学的に許容されるその塩、かつそれから製造可能な溶媒和物及び水和物を全て含む。
【００１７】
本発明の式（１）の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩には、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。遊離酸には、有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸には、塩酸、リン酸、硫酸、窒酸などを使用することができ、有機酸には、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸（ｍａｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸（ｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨード酸などを使用することができる。
【００１８】
本発明に係る酸付加塩は、通常の方法、例えば式（１）の化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造し得る。同量の式（１）の化合物及び水中の酸またはアルコール（たとえば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次にこの混合物を乾燥させるか、または析出された塩を吸入ろ過させて製造することもできる。
【００１９】
また、式（１）の化合物を可能な有機溶媒、例えばジエチルエーテル、テトラハイドロフラン、ジクロロメタン、アセトニトリルを使用して溶解させ、前記列挙した様々な無機酸及び有機酸を直接あるいは有機溶媒に溶解されている形態で加えて、生成される塩を沈殿させ吸入ろ過して製造することもできる。
【００２０】
式（１）の化合物は、臨床投与時に経口及び非経口の種々の剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の式（１）の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、蔗糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）または乳糖（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤等も使用される。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、乳剤シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤には、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の機序には、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｒｃｒｏｇｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されることができる。
【００２１】
本発明に係る有効性分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、水活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって適切に選択されるが、一般に成人に１日に体重１ｋｇ当り式（１）の化合物を０．１〜５００ｍｇの範囲の量で１回または数回に分けて投与でき、好ましくは、１〜２０ｍｇの範囲である。
【００２２】
以下、本発明を、実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例らは、本発明を例示するものであって、本発明の内容が実施例により限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例１＞本発明の化合物の試験管内での−１フレームシフト効率分析法（ｉｎｖｉｔｒｏ−１ ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）
【００２４】
前記表１に記載されたサンプル１〜４の化合物は、Ｔｒｉｐｏｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｕｄｅ−Ｓｔｒａｔｔｏｎ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｂｕｄｅ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＥＸ２３ ８ＬＹ ＵＫ社から商業的に入手した。また、サンプル１の化合物は、下記の細胞−基材実験（ｃｅｌｌ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）のために、（株）ＬＥＡＤＧＥＮＥＸ社に大量合成を依頼して使用した。
【００２５】
ＴＮＴ Ｔ７−ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを使用して、−１フレームシフトにより引き起こされる蛋白質を生成した。ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造が挿入された二重蛍光リポーター遺伝子が含まれたプラスミドを有する組み換えＤＮＡを作って実験を実施した。総２０μ?の反応に５００ｎｇのＤＮＡ、１６μ?のうさぎの網状赤血球分離混合物（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）、そしてメチオニンで標識された１０μＣｉ／μ?の濃度を有する３５Ｓ ０．８μ?を使用した。ここにＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶かした２．５ｍＭの化合物（サンプル１）を添加した後、３０℃で約２時間の間反応を行った。生成された蛋白質の量は、ＳＤＳ−不連続電気泳動法と二重発光蛋白質分析法（ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）で分析した。
【００２６】
結果分析方法１：ＳＤＳ−不連続電気泳動法（ＳＤＳ−ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２７】
生成された蛋白質のうち、フレームシフトが起こらず生成された蛋白質（Ｎｏｎ−ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と−１フレームシフトにより生成された蛋白質（ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を分離するために、１２％スタッキングゲルと５％ランニングゲルに電気泳動して、ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ ｓｃｒｅｅｎに露出させてＢＡＳ機械で放射能写真を撮って得た結果を定量した。−１フレームシフト効率の計算は、反応で生成される蛋白質が有している３５Ｓ−メチオニンの数を考慮して、％＝（Ｉ［ＦＳ］／２６）／［（Ｉ［ＦＳ］／２６）＋（Ｉ［ＮＦＳ］）／９］×１００の式を用いる。ここで、Ｉ［ＦＳ」は、−１フレームシフトにより生成された蛋白質の量を表し、Ｉ［ＮＦＳ」は、−１フレームシフトが起こらずに生成された蛋白質の量を意味する。上記で言及した化合物の結果は、図１のとおりである。
【００２８】
本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果、本発明化合物と他の化合物の結果を比較すると、発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を顕著に妨害したことを見せている。ＤＭＳＯは、本発明化合物が添加されない状態であり、残りは、本発明化合物の存在下で（２．５ｍＭ）行われた。
【００２９】
結果分析方法２：二重発光蛋白質分析法（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）
【００３０】
−１フレームシフトの有無とその活性度をレポーター遺伝子の生成量を直接測定して再確認する実験である。Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ａｓｓａｙから得たサンプルを約１μ?取って蛍の発光蛋白質（ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を測定するために、約５０μ?のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを添加して、蛍の発光蛋白質量を測定し、Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ ｒｅｇｅｎｔを５０μ?添加して、第２番目にレニラ内発光蛋白質（ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をＴＤ−２０／２０ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用して定量した。結果は、図２に示した。
【００３１】
分析結果、本発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を顕著に妨害した結果を見せた。ＤＭＳＯは、発明化合物が添加されない状態であり、残りは、本発明化合物の存在下で（２．５ｍＭ）行われた。
【００３２】
＜実施例２＞本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験
【００３３】
上記で言及した同じ方法により、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造と全く類似性のない他のＲＮＡシュードノット構造を共に実験して、その結果を比較分析した。
【００３４】
本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果は、下記のとおりである。
【００３５】
結果分析方法１．
分析結果は、図３に示した。分析結果、本発明化合物が他のＲＮＡシュードノット構造に影響を与えないことを確認した。
【００３６】
結果分析方法２．
分析結果は、図４に示した。分析結果、本発明化合物が他のＲＮＡシュードノット構造に影響を与えないことを再確認した。
【００３７】
＜実施例３＞動物細胞内での−１フレームシフト分析
ＨＥＫ ２９３（人間腎臓細胞）を用いて実験した。細胞培養には、ペニシリンとストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ溶液を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）で補強した培地を使用し、３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件で培養し、３〜４日に一度ずつ継代維持した。
【００３８】
＜実施例４＞動物細胞内で発明化合物の−１フレームシフトに及ぼす影響実験
細胞を２４ウェルプレートに分注し、細胞が底に付着するように２４時間の間培養した。細胞が底面に付着した後、ＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造が含まれているＤＮＡを挿入させて、培養器で約１８時間を培養した後、発明化合物（サンプル１）をウェル当たり２μ?ずつ添加して、培養器で１８時間さらに培養する。培養が終わった後、発明化合物が−１フレームシフトに及ぼす影響を二重蛍光分析法で測定した。
【００３９】
測定結果は、図５に示した。分析結果、本発明化合物が−１フレームシフトにより生成される蛋白質の合成を妨害した結果を見せた。０ｍＭは、発明化合物が添加されない状態であり、残りは、発明化合物の存在下で（０．０２〜２ｍＭ）行われた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＳＤＳ−不連続電気泳動法による本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果を示した図である。
【図２】二重発光蛋白質分析法による−１フレームシフトの有無とその活性度に対する分析結果を示したグラフである。
【図３】本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験による本発明の−１フレームシフトの影響力分析結果を示した図である。
【図４】本発明化合物のＳＡＲＳウイルスのＲＮＡシュードノット構造に対する特異性実験による−１フレームシフトの有無とその活性度に対する分析結果を示したグラフである。
【図５】本発明の化合物（サンプル１）の動物細胞内の−１フレームシフトに及ぼす影響力測定結果を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害するための薬剤組成物：
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されてもよく、または置換されなくてもよい
【請求項２】
治療学的有効量の式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む抗ウイルス性治療または予防のための薬剤組成物。
【請求項３】
ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスである請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
式（１）の化合物が、
２−（（４−（２メチル−チアゾール−４−イルメチル）−［１，４］ジアゼペン−１−カルボニル）アミノ）安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−［５−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−［１，２，４］オキサジアゾール−３−イルメチル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−（５−メチル−イソオキサゾール−３−イルメチル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；または
２−（｛４−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステルである請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
経口投与のための剤形である請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
非経口投与のための剤形である請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項１】
治療学的有効量の下記式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む、ＳＡＲＳコロナウイルスに特異的に存在するＲＮＡシュードノット構造に結合して−１フレームシフトにより誘導される蛋白質の生成を阻害するための薬剤組成物：
【化１】
（１）
式中、
Ｒは、Ｈ，Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０アリールまたは、アリールの炭素上にＮもしくはＯが介在したヘテロアリールであり；
Ｘ及びＹは、独立的に炭素または窒素であり；
Ｚは、酸素、硫黄または窒素であり；
Ｘ、Ｙ及びＺは、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで置換されてもよく、または置換されなくてもよい
【請求項２】
治療学的有効量の式（１）のホモピペラジン系化合物またはその薬剤学的に許容される塩を薬剤学的担体または賦形剤とともに含む抗ウイルス性治療または予防のための薬剤組成物。
【請求項３】
ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスである請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
式（１）の化合物が、
２−（（４−（２メチル−チアゾール−４−イルメチル）−［１，４］ジアゼペン−１−カルボニル）アミノ）安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−［５−（３，５−ジメチル−イソオキサゾール−４−イル）−［１，２，４］オキサジアゾール−３−イルメチル］−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；
２−（｛４−（５−メチル−イソオキサゾール−３−イルメチル）−［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステル；または
２−（｛４−（５−クロロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）［１，４］ジアゼパン−１−カルボニル｝−アミノ）−安息香酸エチルエステルである請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
経口投与のための剤形である請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
非経口投与のための剤形である請求項１または２に記載の薬剤組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１５６３５７（Ｐ２００８−１５６３５７Ａ）
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３２９４２８（Ｐ２００７−３２９４２８）
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０６３９２２７４）成均館大学校産学協力団 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０６３９２２７４）成均館大学校産学協力団 (10)
【Ｆターム（参考）】
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