Ｔ細胞の単離および同定
【課題】抗原（例えば、ＭＢＰ）に対する特異性を有するＴ細胞を単離する改良された方法を開発すること。
【解決手段】本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンの改良および、それらの産生方法の改良に関連する。本発明はまた、自家Ｔ細胞ワクチンを使用する、多発性硬化症または慢性間接リウマチの様な自己免疫疾患の処置方法に関連する。本発明はさらに、Ｔ細胞が関連する疾患の診断法に関連する。本発明は一般に、抗原特異的Ｔ細胞およびより詳細には自己抗原に対し特異的なＴ細胞の単離方法に関する。
【解決手段】本発明は、自己Ｔ細胞ワクチンの改良および、それらの産生方法の改良に関連する。本発明はまた、自家Ｔ細胞ワクチンを使用する、多発性硬化症または慢性間接リウマチの様な自己免疫疾患の処置方法に関連する。本発明はさらに、Ｔ細胞が関連する疾患の診断法に関連する。本発明は一般に、抗原特異的Ｔ細胞およびより詳細には自己抗原に対し特異的なＴ細胞の単離方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）のような、自己免疫疾患の診断および処置の分野に関連する。より詳細には、本発明は、抗原特異的なＴ細胞の単離に関する。さらに、本発明は、例えば、ＭＳのような、自己免疫疾患の処置のための抗原特異的なＴ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ／ぺプチド複合体により形成される細胞間認識複合体は、個々の生体内におけるＴ細胞のレパートリーの発生（ポジティブ選択；ネガティブ選択；末梢生存）および適応的免疫反応のコントロールステージ（Ｔヘルパー）ならびにエフェクターステージ（Ｔキラー）の両方の間において、Ｔ細胞を活性化する細胞−細胞接触の様々なセットにおける共通の認識要素である。
【０００３】
適応的免疫反応において、抗原は、超可変分子（例えば、抗体またはＴＣＲ）により認識され、超可変分子は、任意の抗原を認識し得るほど十分に多様な構造体を有し発現される。抗体は、抗原の表面の任意の一部と結合し得る。ＴＣＲはしかし、ＡＰＣの表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子と結合する短いペプチドとの結合に限定される。ＴＣＲのペプチド／ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞の活性化（クローン性増殖）の引き金となる。
【０００４】
ＴＣＲは、αβ（アルファ−ベータ）またはγδ（ガンマ−デルタ）であり得る二本の鎖からなるヘテロダイマーである。ＴＣＲの構造は、免疫グリブリン（Ｉｇ）の構造に大変似ている。それぞれの鎖は、二つの細胞外ドメインを有し、細胞外ドメインは、免疫グリブリンの折り畳みである。このアミノ末端ドメインは、非常に可変性であり、可変（Ｖ）ドメインと呼ばれる。膜に最も近いドメインは、定常（Ｃ）ドメインである。これら二つのドメインは、免疫グリブリンのこれら二つのドメインと類似しており、かつＦａｂフラグメントに類似している。それぞれの鎖のＶドメインは、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。膜に近接部においては、それぞれのＴＣＲ鎖は、両鎖との間のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、短い連結配列を有する。
【０００５】
αβおよびγδヘテロダイマーをコードする遺伝子は、Ｔ細胞系統にのみ発現される。この四つのＴＣＲ部位（α、β、γ、およびδ）は、Ｉｇの遺伝子構造編成と非常に近似した遺伝子構造編成を有する。α鎖およびγ鎖は、ＶセグメントおよびＪセグメントの再配置により産生され、対して、β鎖およびδ鎖は、Ｖセグメント、ＤセグメントおよびＪセグメントの再編成により産生される。このＴＣＲ鎖の遺伝子セグメントは、α鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間であるδ鎖遺伝子セグメントを除き、異なる染色体上に位置する。δ鎖遺伝子セグメントの位置は、重要である：α鎖遺伝子セグメントの生産的な再編成は、δ鎖のＣ遺伝子を削除し、その結果所定の細胞においてαβヘテロダイマーは、γδレセプターとともに共発現し得ない。
【０００６】
マウスにおいては、およそ１００個のＶα遺伝子セグメントおよび５０個のＪα遺伝子セグメントおよび１個のＣα遺伝子セグメントのみが存在する。δ鎖遺伝子ファミリーは、およそ１０個のＶ遺伝子セグメント、２個のＤ遺伝子セグメントおよび２個のＪ遺伝子セグメントを有する。β鎖遺伝子ファミリーは、２０〜３０個のＶセグメントならびに１個のＤβ、６個のＪβおよび１個のＣβを含む二つ同一のリピートを有する。最後に、γ鎖遺伝子ファミリーは、７個のＶおよび３個の異なるＪ−Ｃリピートを含む。ヒトにおいては、この編成は、マウスと類似しているが、セグメントの個数は、変化する。
【０００７】
α鎖およびβ鎖における遺伝子セグメントの再編成は、Ｉｇの遺伝子セグメントの再編成と類似する。α鎖は、Ｉｇの軽鎖と同様に、Ｖ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ遺伝子セグメントによりコードされる。β鎖は、Ｉｇの重鎖と同様にＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされる。α鎖遺伝子セグメントの再編成は、ＶＪの連結を生じ、そしてβ鎖遺伝子セグメントの再編成は、ＶＤＪの連結を生じる。再編成された遺伝子の転写、ＲＮＡプロセッシング、および翻訳の後、α鎖およびβ鎖は、Ｔ細胞の膜上にジスルフィド結合により連結され発現される。
【０００８】
ＴＣＲ遺伝子セグメントは、１２ヌクレオチド（１ターン）または２３ヌクレオチド（２ターン）のいずれかの介在配列を有するヘプタマーおよびノナマーを含む認識シグナル配列（ＲＳＳ）と隣接する。Ｉｇの様に、組換え−活性化遺伝子（ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２）によりコードされる酵素は、組換えプロセスを担う。ＲＡＧ１／２は、Ｉｇ再編成と同一の様式で、ＲＳＳを認識しそして、Ｖ−ＪセグメントおよびＶ−Ｄ−Ｊセグメントを連結する。簡単に言えば、これらの酵素は、一つのＤＮＡ鎖を遺伝子セグメントとＲＳＳとの間で切断し、コード配列におけるヘアピン形成を触媒する。シグナル配列は、次いで切除される。
【０００９】
α鎖におけるＶセグメントおよびＪセグメント、ならびにβ鎖におけるＶセグメント、ＤセグメントおよびＪセグメントのコンビナトリアル連結は、多数の可能な分子を産生し、それによりＴＣＲの多様性を引き起こす。多様性はまた、遺伝子セグメントの代替的な連結によりＴＣＲにおいて達成される。Ｉｇとは対照的に、β遺伝子セグメントおよびδ遺伝子セグメントは、代替的方法により連結され得る。β遺伝子セグメントおよびδ遺伝子セグメントのＲＳＳ隣接遺伝子セグメントは、β鎖のＶＪおよびＶＤＪ、ならびにδ鎖上のＶＪ、ＶＤＪおよびＶＤＤＪを産生し得る。Ｉｇの場合と同様に、多様性はまた、遺伝子セグメントの連結の可変性により生じる。
【００１０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知であるＴＣＲの超可変ループは、ＭＨＣ分子および結合したペプチドより構成される複合体の表面を認識する。αおよびβのＣＤＲループは、ＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子だけと接触し、一方、ＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ３ループは、ペプチドおよびＭＨＣ分子の両方と接触する。Ｉｇと比べ、ＴＣＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３においてさらに限定された多様性を有する。しかし、ＴＣＲのＣＤＲ３ループの多様性は、Ｉｇの多様性よりも大きい、なぜならＴＣＲは、増大された連結の多様性を誘導する一以上のＤセグメントと連結し得るからである。
【００１１】
多数の自己免疫疾患の病因は、生物体に存在する自己抗原に対する自己免疫性Ｔ細胞の反応により引き起こされると考えられている。クローン選択説の概念に対し、全ての自己反応性Ｔ細胞が、胸腺で除去されるわけではない。複数の自己抗原に対するＴＣＲを有するこれらのＴ細胞は、正常Ｔ細胞レパートリーの一部を提示し、そして自然に末梢に循環する。なぜ自己反応性のＴ細胞が、進化の過程において、胸腺で分化させられ得るのか、ならびに、末梢で適応させられるのかについては、明らかではない。それらの生理学的機能については、理解されていないが、これらの自己反応性Ｔ細胞は、活性化した時、自己免疫性病理の誘発といった潜在的リスクを呈する。自己反応性Ｔ細胞はまた、自己免疫疾患の結果なしに、正常な個体から単離し得る。自己反応性の抗原認識自体は、自己破壊工程を媒介するには十分ではないことが、立証されている。自己反応性Ｔ細胞を病原へとする必須条件の一つは、自己反応性Ｔ細胞が活性化されなければならないことである。
【００１２】
自己反応性Ｔ細胞は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ））の病理に関連づけられる。ＭＳの自己反応性Ｔ細胞の病理は一般に、ミエリン抗原、特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、に対するＴ細胞の反応から生じ続ける。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボ活性化を受け、そしてコントロールの個体とは対照的に、ＭＳの患者の血液および脳脊髄液中に高頻度で前駆体が発生することが見出される。これらＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ＴＨ１サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびγ−インターフェロン（ＩＦＮγ）を産生し、それは炎症性細胞の中枢神経系への移動を促進し、そしてＭＳにおけるミエリン破壊的炎症反応を悪化させる。
【００１３】
ミエリン反応性Ｔ細胞もまた、動物における実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＭＳに類似する）の病理に関連することが示された。ＥＡＥは、補助剤中に乳化されたミエリンタンパク質を注射することにより、感受性の高い動物に積極的に誘導し得、または、ミエリン反応性Ｔ細胞系統およびミエリン感作させた動物由来のクローンを注射することにより、受動的に誘導し得る。インビトロで活性化された場合、極めて少数のミエリン反応性Ｔ細胞が、ＥＡＥを誘導するために必要であり、１００倍以上の静止状態にある同様の反応性を有するＴ細胞は、ＥＡＥを媒介し得ない。
【００１４】
ＥＡＥは、不活性化されたミエリン反応性Ｔ細胞を用いたワクチン接種（Ｔ細胞ワクチン接種と呼ばれる手法）により、予防およびまた処置されることが示された（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１）。Ｔ細胞ワクチン接種は、抗イディオタイプＴ細胞および抗エルゴタイプＴ細胞を含む調節免疫反応を引き起こし、調節免疫反応は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇を誘導する。ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇により、治療的効果が、ＥＡＥおよび他の実験的な自己免疫疾患モデルでみられる（Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２；Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２）。
【００１５】
自己免疫疾患モデルにおける、この成功により、Ｔ細胞ワクチン接種は近年、ＭＳの患者での臨床試験に進んだ。ＥＡＥのような実験モデルにおける結果に基づいて、自己反応性Ｔ細胞の枯渇は、ＭＳおよび別の自己免疫疾患の臨床経過を改善し得ると考えられている。
【００１６】
試験的な臨床試験において、放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンを用いたワクチン接種は、ＣＤ８＋細胞溶解性のＴ細胞の反応（循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞を特異的に認識および溶解した）を誘発した（Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４，Ｍｅｄａｅｒら．Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８）。放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンによる三回の皮下注射は、ＭＳ患者の循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を生じる。
【００１７】
予備的な臨床試験において、循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の三回の皮下注射による患者へのワクチン接種により、再発が寛解したＭＳ患者および第二段階に進行したＭＳ患者で枯渇された（Ｚｈａｎｇら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００２；２４９：２１２−８）。Ｔ細胞ワクチン接種は、溶解速度、不活性数値の増大およびＭＲＩ傷害活性による測定から、それぞれの患者のグループに有益であった。しかし、最後の注射からおよそ１２月後に加速度的に病気が進行する傾向があった。この明確な加速度的な病気の進行の意味は、不明であるが、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対するＴ細胞ワクチン接種により引き起こされた免疫の漸落に関連する可能性がある。ワクチン接種を受けた患者のおよそ１０〜１２％の患者で、加速度的な進行とおよそ同じ時間に、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が再出現した。いくつかの場合において、異なるクローン集団（ワクチン接種前は検出されなかった集団）由来の再出現したＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、クローンのシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔ）またはエピトープ拡延（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を起こした可能性があることを示唆する。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のクローンのシフトは、以前の研究（Ｚｈａｎｇら．１９９５）で観察されており、進行中の疾患の工程に関連する可能性がある。
【００１８】
Ｔ細胞ワクチン接種は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇に有効的であり、潜在的にＭＳ患者に有益であることが示されたが、処置に関し複数の問題が存在する。それぞれの患者へのＴ細胞ワクチン処置は、個人に合わせたものにしなければならない、なぜならミエリン反応性Ｔ細胞のレセプターは、異なるＭＳ患者との間で、極めて多様でありおよび変化するからである（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；２５：９５８−９６８，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４；１５２：５５８１−５５９２，Ｈｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９；１６３：３５３０−３５３８）。
【００１９】
さらにそれぞれの患者個人に合わせたものにするために、８週間までは、現行の方法を使用して所定のＴ細胞ワクチンを産生するのに必要とされる。Ｔ細胞ワクチンの産生は、患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）または末梢血（ＰＢＭＣ）から単核球の単離から始める。単離された単核球は次いで、活性化ミエリン反応性Ｔ細胞になるまでミエリンペプチドと共に７〜１０日間培養される。培養物は次いで、３日間、ミエリンペプチドの存在下で［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定することにより、ミエリンペプチドへの特異的増加について試験される。ミエリンペプチドへの特異的増加に対して陽性と出た培養物は次いで、クローンのＴ細胞株を得るために段階的に希釈されるか、または直接的に増殖させられる。この細胞は次いで、６〜８週間まで、培養されるこれらのＴ細胞が増殖される。最後のＴ細胞ワクチン産物がクローンである場合、Ｔ細胞は、単一のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法と同質である。通常、３〜６のクローン細胞株が、複数のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有する不均一な製剤を産生するために組み合わせられる。最後のＴ細胞ワクチン産物が、直接的な増殖により産生された場合、Ｔ細胞は、一以上のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法と異種である。
【００２０】
現行の方法では、Ｔ細胞ワクチン接種の個人に合わせた性質およびそれぞれのワクチンの産生のために必要な長期間の細胞培養により、処置は高価なりそして労働は激務になる。細胞培養に必要とされる長期の時間はまた、コンタミネーションの重大なリスクを生じる。最終的に、クローンシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔ）またはミエリン反応性Ｔ細胞のエピトープ拡延（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の可能性は、異なるパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有するそれぞれの患者に対するＴ細胞ワクチンのその後の産生を必要とし得る。
【００２１】
従って、抗原（例えば、ＭＢＰ）に対する特異性を有するＴ細胞を単離する改良された方法を開発する必要性が存在し、Ｔ細胞媒介性の疾患（例えば、ＭＳ）を有する患者の処置のためのＴ細胞ワクチンを産生するのに使用され得る。自己反応性Ｔ細胞のクローンシフトの原因である不均一なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有するＴ細胞ワクチンを産生するための改良された方法を開発する必要性もまた、存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は一般に、抗原特異的Ｔ細胞およびより詳細には自己抗原（ｓｅｌｆ ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）に対し特異的なＴ細胞の単離方法に関する。目的の抗原に特異的な一以上のＴ細胞を単離するための方法は、一般的に、以下の工程：該抗原またはそれらの誘導体とともに患者から得たＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、を包含する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
目的の抗原に特異的な一以上のＴ細胞を単離するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該抗原またはそれらの誘導体とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記抗原は、自己抗原である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、タイプＩＩコラーゲンペプチド、ヒートショックタンパク質、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＧＡＤタンパク質および、腫瘍関連抗原からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記抗原は、自己抗原の免疫優先エピトープである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記免疫優性エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質の残基８８〜９９およびミエリン塩基性タンパク質の残基１５１〜１７０からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第一マーカーおよび前記第二マーカーを発現する前記細胞は、該第一マーカーおよび該第二マーカーそれぞれに対する抗体を使用して、または必要に応じて、該第二マーカーに結合する抗体と組み合わせて、第一および第二マーカーの両方に結合する二重特異性抗体を使用して選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
一以上の前記抗体は、蛍光標識される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｔ細胞は、蛍光活性セルソーティングにより選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第一抗体は、磁性ビーズに結合される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｔ細胞は、磁気活性セルソーティングにより選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗原は、前記サンプルとともに１〜７日間インキュベートされる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記抗原は、前記サンプルとともに１日未満の間インキュベートされる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記抗原は、前記サンプルとともに１６時間未満の間インキュベートされる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記抗原は、前記サンプルとともに１２時間未満の間インキュベートされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記抗原は、前記サンプルとともに８時間未満の間インキュベートされる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗原は、前記サンプルとともに４時間未満の間インキュベートされる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記抗原は、前記サンプルとともに２時間未満の間インキュベートされる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１に記載の方法により、単離されるＴ細胞。
（項目１９）
前記単離されたＴ細胞は、ＴＨ１Ｔ細胞もしくはＴＨ２Ｔ細胞またはそれらの組合せである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
サンプル中のＴ細胞の個数を定量するための方法であって、該Ｔ細胞は、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は以下の工程：
（ａ）該抗原またはそれらの誘導体とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により選択された該Ｔ細胞の個数を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）
患者の自己免疫疾患の診断をするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該疾患に関係している一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目２２）
患者の自己免疫疾患のモニタリングをするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ａ）により選択された自己反応性の該Ｔ細胞の個数を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
患者の自己免疫疾患の処置をするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）該選択された自己反応性Ｔ細胞を不活性化する工程；および
（ｄ）工程（ｂ）により不活性化された自己反応性の該Ｔ細胞を該患者へ投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）
患者の自己免疫疾患の処置をするための組成物を産生するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）該自己反応性のＴ細胞を不活性化する工程、
を包含する、方法。
（項目２５）
工程（ｂ）で選択された前記自己反応性のＴ細胞の個数を増加させる工程をさらに包含する、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
項目２４または２５に記載の方法により産生される、自己免疫疾患の患者の処置のための組成物。
（項目２７）
Ｔ細胞レセプター、またはその一部分をコードする核酸を分離するための方法であって、該Ｔ細胞レセプターは、目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該抗原とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞からＴ細胞レセプターをコードする核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程、
を包含する、方法。
（項目２８）
一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする一以上の核酸を単離するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の抗原とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）
患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする一以上の核酸のレパートリーを決定するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の抗原とともに、Ｔ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）により増幅された該一以上の核酸の該ヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３０）
自己免疫性の患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする前記核酸のレパートリーを決定するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の自己抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該自己免疫性の患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）により増幅された該一以上の核酸の該ヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【００２３】
本発明の方法は特に、自己免疫疾患の病原の一因である自己反応性Ｔ細胞を単離するために有益である。
【００２４】
本発明の方法はまた、自己免疫疾患の診断ならびに自己免疫疾患の進行のモニタリングを可能とし、そしてこの疾患のための処置の効果のモニタリングを可能とする。
【００２５】
本発明の方法はまた、Ｔ細胞が関連する自己免疫疾患の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンの調製を可能とする。
【００２６】
ワクチン調製のための方法は一般的に、抗原特異的Ｔ細胞の単離（上記）、必要に応じてそれに続いて単離された抗原特異的Ｔ細胞の集団の増殖を可能にする培養工程、を包含する。
【００２７】
本発明はまた、特にＴ細胞ワクチンおよび本発明の方法を使用して単離された抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物に関連する。
本発明の方法はまた、Ｔ細胞レセプターおよびそれらをコードする核酸を特徴付けるために有益である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、刺激前（左）、ＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（中）およびＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（右）の多発性硬化症患者のＣＤ６９およびγＩＦＮ（上）およびＣＤ６９およびＴＮＦα（下）を発現する細胞のＦＡＣＳ同定を示す。
【図２】図２は、刺激前（左）、ＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（中）およびＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（右）の健常なコントロールの患者のＣＤ６９およびγＩＦＮ（上）およびＣＤ６９およびＴＮＦα（下）を発現する細胞のＦＡＣＳ同定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（詳細な説明）
（１．定義）
本発明を理解することを補助するため、いくつかの用語は、下に定義される。
【００３０】
本明細書中で用いられた場合「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己−抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」は、哺乳動物に対してネイティブであり、哺乳動物において免疫原性であり、哺乳動物の種に保存される抗原またはエピトープをいい、これは、自己免疫疾患の病原に関与し得る。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合「ＣＤ」、「分化クラスター」または「共通決定因子（ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、抗体により認識される細胞表面分子をいう。いくつかのＣＤの発現は、特定の系統または成熟の経路の細胞に対して特異的であり、そして他の発現は、活性化の状態、位置の状態、または同一の細胞の分化の状態に従って変動する。
【００３２】
ヌクレオチド配列の脈絡において、「から誘導された」または「それらの誘導体」は、ヌクレオチド配列が、記述された特定の配列に限定されないだけでなく、その配列のバリエーションをも含むことを意味し、配列のバリエーションは、記述された配列に対するバリエーションが、適切なまたは非常にストリンジェントな条件下で、記述された配列の相補体へハイブリダイズする能力を保持する程度まで、ヌクレオチドの付加、欠失、置換または改変を含み得る。ペプチド配列またはポリペプチド配列の脈絡において、「から誘導された」または「それらの誘導体」は、ペプチドまたはポリペプチドは、記述された特定の配列に限定されないだけでなく、その配列におけるバリエーションをも含むことを意味し、配列のバリエーションは、列挙された配列におけるバリエーションが、記述された配列への免疫反応を誘発する能力を保持する程度まで、アミノ酸の付加、欠失、置換または改変を含み得る。
【００３３】
ペプチドまたはポリペプチドを記述するために使用される場合、「免疫原性」は、ペプチドまたはポリペプチドが免疫反応（Ｔ細胞媒介性、抗体のいずれかまたは両方）を誘発し得ることを意味する。
【００３４】
「免疫関連疾患」は、免疫系が疾患の病因に関与する疾患を意味する。免疫関連疾患のサブセットは、自己免疫疾患である。自己免疫疾患としては、慢性関接リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（ハシモト甲状腺炎）、バセドウ病、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、およびある種の糖尿病が含まれるが、これらに限定はされない。本開示に鑑みて、当業者は容易に、本発明の組成物および方法により、他の自己免疫疾患を処置できることを理解し得る。
【００３５】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、例えば、一般に米国特許第４，６８３，２０２号に記載され（Ｍｕｌｌｉｓに対して、１９８７年７月２８日発行）、これらは、本明細書において参考として援用される。ＰＣＲは、増幅技術であり、選択されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーが、重合因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）およびヌクレオチド三リン酸塩の存在下で、核酸テンプレートへハイブリダイズさせられ得、それにより伸長する産物が、プライマーから形成され得る。これら産物は次いで、変性させられ得、そしてテンプレートとしてサイクル反応に使用され得、サイクル反応は、既存の核酸の数と量を増幅させ、続くそれらの核酸の検出を容易にし得る。様々なＰＣＲ技術が、当該分野において公知であり、そして本明細書中の開示に関連して使用され得る。
【００３６】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、結合したアミノ酸の配列であり、そして天然、合成、または改変あるいは天然および合成の組み合わせであり得る。
【００３７】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチドを意味し、天然、合成またはそれらの改変であろうとなかろうと、テンプレート分子上の特定のヌクレオチド配列に対し十分に相補的なヌクレオチド合成の開始点として機能し得る。
【００３８】
「プローブ」は、オリゴヌクレオチドを意味し、天然、合成またはそれらの改変であろうとなかろうと、十分に相補的なヌクレオチド配列に特異的に結合し得る。
【００３９】
「Ｔ細胞媒介性疾患」は、Ｔ細胞による自己抗原の認識の結果として生じる疾患を意味する。
【００４０】
疾患からの動物の保護をいう場合、「処置」または「処置する」は、疾患を防ぐか、抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）か、抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）か、または完全に排除することを意味する。疾患を防ぐとは、疾患の発症前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）とは、疾患の発症後ではあるが臨床的兆候の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）とは、疾患の臨床的兆候の後に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００４１】
（２．抗原特異的Ｔ細胞の単離）
（ａ．モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離）
Ｔ細胞は、抗原標的および抗原提示細胞とともにインキュベーションすることにより、細胞培養内で活性化および増殖させられ得る。一度活性化されると、Ｔ細胞は、多くの遺伝子産物の転写および発現を誘導する複雑な細胞シグナルカスケードを受ける。本明細書中に記載される本発明は、所望の抗原特異性を有するＴ細胞の同定および単離のために活性化Ｔ細胞に特異的な遺伝子産物を利用する。
【００４２】
第一の局面において、本発明は、目的の抗原に対し特異的であるＴ細胞を単離するための方法に関する。Ｔ細胞を含むサンプルは、特定の抗原と共にインキュベートされ、これは目的の抗原に対し特異的なＴ細胞の活性化を生ずる。サンプルは、抗原と共に１〜７日間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１日未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１６時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１２時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に８時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に４時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に２時間未満の間インキュベートされ得る。
【００４３】
目的の抗原に対し特異的なＴ細胞は次いで、上記のように活性化されたＴ細胞の遺伝子産物を発現するＴ細胞を選択することにより単離され得る。活性化Ｔ細胞のサブセットは、サブセット特異的遺伝子産物または細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４対ＣＤ８）により、Ｔ細胞を選択することにより単離され得る。
【００４４】
目的の抗原としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン気突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、またはそれらのフラグメントが挙げられる。目的の抗原はまた、免疫優性フラグメント（ＭＢＰの残基８３〜９９または残基１５１〜１７０が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。目的の抗原はまた、目的の二つ以上の個々の抗原の組み合わせであり得る。
【００４５】
Ｔ細胞を活性化するために使用される抗原またはそれらの誘導体は、目的の抗原に対する免疫応答を誘発することができる任意の免疫原であり得る。活性化している抗原は、目的の抗原、またはそれらの誘導体であり得る。活性化している抗原は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧ、あるいはそれらのフラグメントおよび／または誘導体であり得る。活性化している抗原はまた、免疫優性フラグメント（ＭＢＰの残基８３〜９９または残基１５１〜１７０、あるいはそれらのフラグメントおよび／または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。活性化している抗原はまた、二つ以上の個々に活性化している抗原の組み合わせであり得る。活性化している抗原は、一回以上、目的の抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化するために使用され得る。
【００４６】
Ｔ細胞は、単核細胞を含む任意のサンプル内に存在し得る。このサンプルは、ＭＳ患者の末梢血または脳脊髄液からか、あるいはＲＡ患者の滑液から単離され得る。他の自己免疫疾患の患者からのＴ細胞は、末梢血および／または疾患に関連した組織から同様に単離し得る。単核細胞は、当該分野で公知である遠心分離技術（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配が挙げられるが、それらに限定されない）の手法を使用することによりサンプル内に濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞の遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより、サンプル内に濃縮され得る。
【００４７】
活性化Ｔ細胞を同定するまたはネガティブ選択するための遺伝子産物は、細胞表面マーカーまたはサイトカイン、またはそれらの組み合わせであり得る。活性化Ｔ細胞を同定するための細胞表面マーカーとしては、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２８およびＣＤ１３４が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ６９は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ＮＫ細胞および顆粒球に見出される初期の活性化マーカーである。ＣＤ２５は、ＩＬ−２レセプターであり、活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞に対するマーカーである。ＣＤ４は、ＴＣＲレセプターであり、胸腺細胞、ＴＨ１型Ｔ細胞およびＴＨ２型Ｔ細胞、単核細胞、およびマクロファージに対するマーカーである。ＣＤ８はまた、ＴＣＲレセプターであり、細胞傷害性Ｔ細胞に対するマーカーである。ＣＤ１３４は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞にのみ発現される。
【００４８】
活性化Ｔ細胞をネガティブ選択するための細胞表面マーカーとしては、ＣＤ３６、ＣＤ４０、およびＣＤ４４が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ２８は、Ｔ細胞レセプター経路に非依存的な刺激性のＴ細胞活性化経路として機能し、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞上に発現される。ＣＤ３６は、膜糖タンパク質であり、血小板、単核球および内皮細胞に対するマーカーである。ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞に対するマーカーである。ＣＤ４４は、マクロファージおよび別の食細胞に対するマーカーである。Ｔ細胞の一部は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４対ＣＤ８）の細胞表面遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより単離し得る。
【００４９】
本発明の活性化Ｔ細胞を同定するためのサイトカインは、ＴＨ１型Ｔ細胞（細胞媒介性反応）およびＴＨ２型Ｔ細胞（抗体反応）により産生されるサイトカインに限定されない。活性化ＴＨ１型Ｔ細胞を同定するためのサイトカインとしてＩＬ−２、ガンマインターフェロン（γＩＦＮ）および組織壊死因子アルファ（ＴＮＦα）が挙げられるが、これらに限定されない。活性化ＴＨ２型Ｔ細胞を同定するためのサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の一部はまた、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、γＩＦＮ対ＩＬ−４）のサイトカイン遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより単離し得る。
【００５０】
目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞はまた、ＣＤ６９およびＣＤ４と共にＩＦＮγまたはＴＮＦαを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ２型Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞および活性化ＴＨ２型Ｔ細胞の組み合わせは、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組み合わせを発現する細胞およびＣＤ６９、ＣＤ４、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。
【００５１】
本発明の活性化Ｔ細胞のポジティブ選択またはネガティブ選択のために使用される遺伝子産物は、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気細胞ソーティング、パニング、およびクロマトグラフィー（しかし、それらに限定されない）を含む抗体を利用する当該分野で公知である免疫選択の手法により同定され得る。活性化Ｔ細胞上の二以上のマーカーの免疫選択は、一以上の工程（それぞれの工程は一以上のマーカーに対しポジティブに選択するまたはネガティブに選択する）で実施され得る。二以上マーカーの免疫選択が、ＦＡＣＳを使用する一工程で実施される場合、二以上の異なる抗体は、別の蛍光団で標識され得る。
【００５２】
磁気細胞ソーティングは、酸化鉄より構築されおよび多糖類でコートされた超常磁性マイクロビーズを使用することにより実施され得る。好ましくはこのマイクロビーズは、直径はおよそ５０ｎｍであり得、そして標準的な哺乳類の細胞の百万分の一の容量を有し得る。好ましくはこのマイクロビーズは、コロイド懸濁液（細胞表面抗原に対し早く能率的に結合することを可能とする）中にとどまるのに十分な小ささである。好ましくはこのマイクロビーズは、フローサイトメトリーと干渉せず、生体分解可能であり、および細胞機能にごくわずかな影響を有する。マイクロビーズに対する抗体結合は、直接的であっても関節的であってもよく、二次抗体を介するリガンド（例えば、蛍光団）に対するものであり得る。
【００５３】
抗体は、クラスＩｇＧ、クラスＩｇＭ、クラスＩｇＡ、クラスＩｇＤ、およびクラスＩｇＥ、もしくはそれらのフラグメントまたは誘導体であり得、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、二官能性抗体およびそれらの誘導体が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製された抗体、またはそれらの混合であり得、それらは活性化Ｔ細胞に特異的な遺伝子産物（またはそれらから生成された配列）のエピトープに対し特異的に十分な結合をすることを示す。抗体はまた、キメラ抗体であり得る。
【００５４】
抗体は、当該分野で公知である一以上の化学薬品部分、ペプチド部分、またはポリペプチド部分（活性化Ｔ細胞（抗体が結合される）の同定および／または選択を可能とする）の連結により誘導され得る。抗体は、化学薬品部分（例えば、蛍光団染色剤）により結合され得る。蛍光標識された抗体により結合された活性化Ｔ細胞は、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）（しかし、それらに限定されない）を含む手法を使用することで単離され得る。抗体はまた、磁性粒子（例えば、常磁性マイクロビーズ）により結合され得る（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。磁気標識された抗体により結合された活性化Ｔ細胞は、磁気活性セルソーティング（しかし、それらに限定されない）を含む手法を使用することで単離され得る。
【００５５】
細胞表面の発現された遺伝子産物に対して、抗体は、直接的にこの遺伝子産物に対し結合し得そして細胞選択のために使用され得る。低濃度で発現された細胞表面遺伝子産物に対して、磁気蛍光リポソーム（ｍａｇｎｅｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，ら．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ６：１０７−１１０，２０００）は、細胞選択のために使用され得る。低レベルの発現では、従来の蛍光標識された抗体は、細胞表面の発現された遺伝子産物の存在を検出するに十分なほどの感度ではあり得ない。蛍光団を含むリポソームは、目的物に対し特異性を有する抗体に対し結合させられ得、それにより細胞表面の発現された遺伝子産物の検出を可能とする。
【００５６】
細胞内の遺伝子産物（例えば、サイトカイン）に対して、抗体は、細胞透過処理をした後に使用され得る。あるいは、細胞透過処理により細胞を殺すことを避けるために、細胞内遺伝子産物（最終的に細胞から排出される場合）は、細胞膜を透過し排出された時、細胞表面上の「キャッチ（ｃａｔｃｈ）」抗体を使用することにより検出され得る。キャッチ抗体は、二つの異なる抗原（（ｉ）目的の排出された遺伝子産物および（ｉｉ）細胞表面タンパク質）に対して特異的である二重の抗体であり得る。細胞表面タンパク質は、特にＴ細胞上、または一般にリンパ球上に存在する任意の表面マーカーであり得る（例えば、ＣＤ４５）。キャッチ抗体はまた、始めに細胞表面タンパク質に対して結合し得、次いで目的の細胞内遺伝子産物が膜を透過し排出された時にこれに対して結合し得、このために、この遺伝子産物を細胞表面に保持する。次に捕捉された遺伝子産物に対して特異的な標識された抗体を使用して、捕捉された遺伝子産物に対して結合させる（活性化Ｔ細胞の選択を可能にする）ために使用され得る（Ｍａｎｚ，ら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１９２１−１９２５，１９９５，本明細書中において参考として援用される）。
【００５７】
サイトカインのある種の形態がまた、細胞表面上に低濃度で発現されることが見出された。例えば、γＩＦＮは、細胞内γＩＦＮ発現の速度論と同一の速度論を有し、細胞表面上に低濃度で提示される（Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ，ら．Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，２６：２６３−２６７）。細胞表面上の発現されたサイトカインの形態に対し、従来の蛍光標識された抗体または蛍光団を含むリポソームは、目的のサイトカインを検出するために使用され得る。当業者は、活性化Ｔ細胞に対し特異的な細胞外遺伝子産物および細胞内遺伝子産物を検出および選択するための別の手法を認識する。
【００５８】
本発明により単離されたはＴ細胞は、全血液から少なくとも９０％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９５％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９８％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９９．５％単離され得る。
【００５９】
（ｂ．単離されたモノクローナル抗原特異的Ｔ細胞）
第二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面の方法により単離された目的の抗原に対し特異的なＴ細胞に関連する。
【００６０】
（ｃ．ポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離）
第三の局面において、本発明は、一以上の目的の抗原に対して特異的であるＴ細胞を単離するための方法に関連する。Ｔ細胞を含むサンプルは、一以上の抗原（一以上の抗原に対して特異的なＴ細胞の活性化を生ずる）と共にインキュベートされる。一以上の抗原に対して特異的なＴ細胞は次いで、本発明の第一の局面のように単離され得る。
【００６１】
Ｔ細胞は、異なるＴＣＲ（目的の抗原に対してそれぞれ特異的である）を発現する不均質なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有し得る。Ｔ細胞はまた、異なるＴＣＲ（一つより多い目的の抗原に対して特異的である）を発現するＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法の不均質なパターンを有し得る。以下に記載されるように、不均質なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を含むＴ細胞は、ポリクローナルＴ細胞ワクチン（ワクチン接種された患者のにおいてエピトープ拡延を防止し得る）を処方するために使用され得る。
【００６２】
（ｄ．単離されたポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞）
第四の局面において、本発明は、本発明の第三の局面の方法により単離された一以上の目的の抗原に対して特異的なＴ細胞に関連する。
【００６３】
（３．抗原特異的Ｔ細胞の個数を定量する）
第五の局面において、本発明は、本発明の第一または第三の局面の方法により単離されたＴ細胞の個数を決定することにより、サンプル内の一以上の目的の抗原に対して特異的なＴ細胞の相対的頻度を決定する方法に関連する。
【００６４】
（４．自己免疫疾患を診断する）
本発明の第六の局面において、自己免疫疾患の患者は、患者からサンプルを取得するおよび本発明の第一または第三の局面の方法により自己反応性Ｔ細胞を単離することにより診断され得る。自己免疫疾患は、患者の自己反応性Ｔ細胞のレベルをコントロールと比較することにより診断され得る。自己反応性Ｔ細胞のレベルは、本発明の第五の局面の方法に従って決定され得る。
【００６５】
（５．自己免疫疾患の進行をモニタリングする）
本発明の第七の局面において、自己免疫疾患は、本発明の第五の局面に従い自己免疫疾患の患者由来のサンプルにおける自己反応性Ｔ細胞の頻度を決定することによりモニターされ得る。自己免疫疾患の症状の重症度は、自己反応性Ｔ細胞の個数と相関し得る。さらに、サンプル中の自己反応性Ｔ細胞の個数の増加は、症状の重篤度を小さくするおよび／または症状が現れる前に疾患を処置することが意図される処置を適用するための指標として使用され得る。
【００６６】
（６．自己免疫疾患の処置のためのワクチンを産生する）
本発明の第八の局面において、組成物は、本発明の第一または第三の局面の方法により単離された（および必要に応じて、本明細書中で記載されるように培養内で増殖させられる）不活性化自己反応性Ｔ細胞により自己免疫疾患を処置するために産生され得る。自己反応性Ｔ細胞は、化学的な不活性化または放射線照射を含む（しかし、それらに限定されない）当該分野において公知である多数の手法を使用することで不活性化され得る。自己反応性Ｔ細胞は、凍結保存を含む（しかし、それらに限定されない）当該分野において公知である多数の手法を使用することで不活性化前または不活性化後のいずれかで保存され得る。下記に記載するように、組成物は、自己免疫疾患の患者において自己反応性Ｔ細胞を枯渇するためのワクチンとして使用され得る。
【００６７】
この組成物は、薬学的組成物（当該分野において公知である方法を使用することで産生され得る）であり得る。疾患の処置または障害の処置における臨床前治療および臨床治療として使用される薬学的組成物は、診断および処置の認められた原則を使用する当業者により産生され得る。そのような原則は、当該分野において公知であり、および陳述される（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら，監修，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第ｌｌ版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ出版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８７））（本明細書中において参考として援用される）。薬学的組成物は、任意の動物に投与され得、この動物は、組成物の有益な効果を受け得る。薬学的組成物を受ける動物は、ヒトまたは別の哺乳類であり得る。
（ａ．ワクチン）
第九の局面において、本発明は、本発明の第八の局面の方法により産生される組成物に関連する。組成物は、自己免疫性患者の自己反応性Ｔ細胞を枯渇させるため使用され得るワクチンであり得る。
【００６８】
（７．自己免疫疾患の処置）
第十の局面において、自己免疫疾患は、本発明の第九の局面に従い組成物を投与することにより自己反応性Ｔ細胞を有する患者において処置され得る。組成物は、患者において自己反応性Ｔ細胞の枯渇を導き得るワクチンであり得る。
【００６９】
ワクチンは、均質（「モノクローナル」）または不均質（「ポリクローナル」）なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を含む自己反応性Ｔ細胞を含み得る。臨床的研究は、自己モノクローナルＴ細胞ワクチン接種を受ける自己免疫疾患の患者が、ミエリン反応性Ｔ細胞に対する免疫を漸減させることを示し得ることを示す。いくつかの場合において、再出現する自己反応性Ｔ細胞は、異なるクローン集団を起源とし得、このことは、ミエリン反応性Ｔ細胞が、進行する疾患の過程に潜在的に関連するクローンシフトまたはエピトープ拡延を起こし得ることを示唆する。クローンシフトまたはエピトープ拡延は、自己反応性Ｔ細胞により媒介される自己免疫疾患の問題であり得る。自己反応性Ｔ細胞の多様な集団を枯渇させることを可能とするポリクローナル自己反応性Ｔ細胞を含むワクチンは、クローンシフトまたはエピトープ拡延を伴う問題を回避し得る。
【００７０】
この組成物は、薬学的組成物であり得、これは、意図される目的を達成する任意の手段により投与される。例えば、投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、経粘膜経路、脳内経路、髄腔内経路、または脳室内経路によるものであり得る。あるいは、または同時に、投与は、経口経路によるものであり得る。この薬学的組成物は、ボーラス注射により、または長時間かけた漸進的な灌流により、非経口投与され得る。
【００７１】
投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、併用治療の種類（あるのであれば）、処置の頻度、および望まれる効果の性質に依存し得る。薬学的組成物の投与のための用量範囲は、望まれる効果（例えば、自己反応性Ｔ細胞が枯渇される（本発明の第七の局面により計測される）が達成されならびに自己免疫疾患が、有意に防止され、抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）され、または処置される）を生ずるために十分な大きさであり得る。この用量は、有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、全身的な免疫抑制、アナフェラキシー反応など）を生ずるほどの大きさではないかもしれない。
【００７２】
この薬学的組成物はさらに、適切な薬学的に受容可能なキァリア（賦形剤および補助剤（活性組成物を薬剤的に使用され得る調製物へと処理することを容易にし得る）を含む）を含み得る。この薬学的組成物に対する添加物は、アジュバンド（例えば、ミョウバン、キトサン）含有物または当該分野において公知の他のアジュバンド含有物を含み得る（例えば、Ｗａｒｒｅｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９−３８８（１９８６）；Ｃｈｅｄｉｄ，Ｌ．，Ｆｅｄｅｒ．Ｐｒｏｃ．４５：２５３１−２５６０（１９８６）（これらは参考文献として本明細書中に援用される）を参照のこと）。この薬学的組成物はまた、当該分野において公知である方法および化合物を使用して、送達または生理活性を高めるためにリポソームをさらに含み得る。
【００７３】
非経口投与のための適切な処方物は、不活性化自己反応性Ｔ細胞の水溶液（例えば、水溶液中に水溶性塩）を含む。さらに、不活性化自己反応性Ｔ細胞を含む油懸濁液が、投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪酸（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）またはトリグリセリドが挙げられる。水溶性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む）を含み得る。この懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
【００７４】
不活性化自己反応性Ｔ細胞は、注射による投与のための薬学的に受容可能な慣用的な非経口的ビヒクルを使用することにより処方され得る。これらのビヒクルは、無毒性であり治療的なものであり得、そして多くの処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記）に陳述される。限定されない賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液およびハンクス緩衝化塩溶液である。薬学的組成物はまた、少量の添加物（例えば、等張性、生理学的ｐＨ、および安定性を維持する物質）を含み得る。
【００７５】
不活性化自己反応性Ｔ細胞は、およそ５×１０２細胞／ｍｌからおよそ１×１０９細胞／ｍｌまでを含む全細胞濃度で処方され得る。自己免疫疾患を防止すること、抑制すること（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）または処置することに使用するための不活性化自己反応性Ｔ細胞の好ましい用量は、およそ２×１０６細胞からおよそ９×１０７細胞の範囲内であり得る。
【００７６】
（８．ＴＣＲレパートリーの決定）
第十一の局面において、本発明は、本発明の第一または第三の局面により単離されたＴ細胞からの一以上のＴ細胞レセプターをコードする核酸を増幅することにより、自己免疫患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはそれらの一部をコードする核酸のレパートリーを決定する方法に関連する。この増幅は、プライマー対を使用することにより行われる。このプライマー対の第一プライマーは、ＴＣＲ遺伝子の可変領域を含む核酸に対してハイブリダイズするおよそ１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このプライマー対の第二プライマーは、ＴＣＲ遺伝子の定常領域を含む核酸に対してハイブリダイズするおよそ１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このプライマー対は、ＴＣＲ遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域に対してハイブリダイズする核酸を増幅するために使用され得る。
【００７７】
Ｔ細胞からの一以上のＴ細胞レセプターをコードする核酸（「標的配列」）またはそれらのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（当該分野において公知である任意の特定のＰＣＲ技術または装置を使用する）によりサンプルから増幅され得る。例えば、ＰＣＲ増幅は、以下の成分：５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ）、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．３μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｕＬ）（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）、３０ｐｍｏｌの第一プライマー、３０ｐｍｏｌの第二プライマー、および１μｌのサンプルＤＮＡ、を含む反応混合物が調製される手順に従い得る。ポリメラーゼは、少なくとも９５℃の温度において安定であり得、５０〜６０のプロセッシビリティーを有し得、かつ一分間につき５０ヌクレオチドより大きい伸長速度を有し得る。
【００７８】
ＰＣＲ反応は、９５℃（変性）一分、５６℃（アニーリング）２０秒、および７２℃（伸長）４０秒で全４０サイクルの増幅プロファイルを伴い実施され得る。第一サイクルが始まる前に、反応混合液は、およそ５分間から１５分間の最初の変性を受け得る。同様に、最後のサイクルが完了した後、反応混合液は、およそ５分間から１０分間の最終の伸張を受け得る。あるＰＣＲ反応は、わずか１５〜２０サイクルを伴いまたは５０サイクルも伴い作動し得る。特定のＰＣＲ反応に依存して、増幅プロファイルのそれぞれの工程について、より長いインキュベーション時間またはより短いインキュベーション時間およびより高い温度またはより低い温度が、使用され得る。
【００７９】
標的配列を含むサンプルは、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲによりあらかじめ増幅されたＤＮＡ、またはＤＮＡのその他の形態）であり得る。サンプルは、Ｔ細胞（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））を含む任意の動物組織またはヒト組織から直接的にまたは間接的に単離され得る。ゲノムＤＮＡは、Ｔ細胞を含む組織から直接的に単離され得る。ｃＤＮＡは、Ｔ細胞を含む組織から直接的に単離されるｍＲＮＡの逆転写により間接的に単離され得る。
【００８０】
標的配列を検出するための能力は、二段階のＰＣＲ反応によるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡのその他の形態の増幅により間接的にサンプルＤＮＡを単離することにより高められ得る。例えば、第一ＰＣＲ増幅反応は、予備的なフラグメント（第一プライマーおよび第二プライマーが、対向する鎖上に選択的に結合することが可能であるフラグメントよりも長く、かつこのフラグメントを含む）を増幅するために行われ得る。第二ＰＣＲ増幅反応は次いで、第一プライマーおよび第二プライマーを有するテンプレートとしてこの予備的なフラグメントを使用し、標的配列を含むフラグメントを増幅するために行われ得る。第一プライマーまたは第二プライマーのいずれかが、この予備的なフラグメントを増幅するために第一ＰＣＲ反応で使用された場合、第二ＰＣＲ反応は、「セミネステッド（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）」である。第一プライマーも第二プライマーもいずれも、この予備的なフラグメントを増幅するために第一ＰＣＲ反応で使用されなかった場合、第二ＰＣＲ反応は、「ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）」である。
【００８１】
模範的な二段階ＰＣＲ反応において、Ｔ細胞由来の一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸は、ＴＣＲ遺伝子のＶβ領域に対してアニールする第一予備的プライマーおよびＴＣＲ遺伝子のＣβ領域に対してアニールする第二予備的プライマー使用して第一ＰＣＲ反応（ＶβからＶβ−Ｄβ−Ｊβ連結を通過しＣβまで伸長する予備的なフラグメントを増幅する）を行うことにより増幅され得、その後、ネステッドまたはセミネステッドであり得る第二ＰＣＲ反応が行われ得る。本開示を考慮すると、当業者は、標的配列のＰＣＲ増幅のため適切なプライマーおよび反応条件を選択することが可能である。
【００８２】
標的配列の増幅後においては、この増幅産物は、多数の手法により検出され得る。例えば、増幅産物のアリコートが、電気泳動用ゲルにロードされ得、これに対して電場が、サイズによりＤＮＡ分子を分離するために適用される。別の方法においては、増幅産物のアリコートが、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、エチジウムブロマイド、またはＤＮＡに対して結合し、検出可能なシグナルを発する別の分子で染色されたゲルにロードされ得る。乾燥ゲルは、標的配列に対してハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチド（ここからのオートラジオグラフは、フィルムに対してこのゲルを曝すことにより得られ得る）を含み得る。
【００８３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すことが含まれる。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実施において本発明者により見出された技術が、十分に機能し、従ってその実施のため好ましい様式を構成すると見なされ得ることが、当業者により認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示された具体的な実施形態において、複数の変更が成され得、さらに本発明の趣旨および範囲から離れることなく、同一または類似の結果を得ることが可能であると評価する。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（Ｔ細胞ワクチン接種のためのミエリン反応性Ｔ細胞の単離）
（１．ＰＢＭＣの調製および初回刺激）
ＭＳ患者およびコントロールの患者由来の新鮮な血液試料を、収集の二時間以内に処理した。あるいは、単核細胞を、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）から取得し得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、全血から標準Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離法により単離した。具体的には、ヘパリン添加血液を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を用いて希釈（１：１血液／ＨＢＳＳ）し、次いで遠心チューブ内においてＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ溶液上にゆっくりと上層し、そして１８００ｒｐｍ、１８℃〜２５℃で２０分間、ブレーキを伴わず遠心分離した。ＰＢＭＣを、次いで、過剰のＨＢＳＳを加えることにより洗浄し、そして１７００ｒｐｍで１０分間１８℃〜２５℃で遠心分離した。精製されたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０培地内で遠心分離により三回洗浄し、その後ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）に再懸濁した。細胞数を、計数し、そして細胞を、９６ウェルＵ底培養プレートに一ウェルあたり２００，０００細胞の密度でプレートした。全てのプレートに、患者番号および患者名の頭文字を用いて標識した。細胞は、２０μｇ／ｍｌの濃度の合成ペプチド（表１に列挙され三個のミエリンタンパク質（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））の既知免疫優性領域に対応する）存在下で３７℃でインキュベートした。プレートを、３７℃のＣＯ２インキュベーター内に置き、そして視覚的に毎日観察した。細胞を、抗原特異的Ｔ細胞を選択的に培養するために７日〜１０日間培地の交換なしに培養した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
（２．抗原特異的Ｔ細胞の同定および選択）
上記の細胞は次いで、活性化Ｔ細胞を示す遺伝子産物の発現により選択される。上記セクション２（ａ）参照。Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（上記）は、最終的に細胞から排出された際、細胞内サイトカインγＩＦＮまたはＴＮＦαを検出するために使用される。簡単に言うと、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ（一般的に二重特異性抗体（活性化Ｔ細胞マーカーおよび排出サイトカインの両方に対して結合する））は、細胞表面上のＣＤ４５分子または他の活性化Ｔ細胞表面マーカー（例えばＣＤ６９）に対し結合するため、始めに細胞と共に４℃〜８℃でインキュベートされる。結合されたＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔを有する細胞は次いで、細胞内のγＩＦＮまたはＴＮＦαがまたＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔに対して結合し得る（サイトカインが、このインキュベーション時間の間に細胞内から排出される際に）ように３７℃で４５分間インキュベートされる。γＩＦＮまたはＴＮＦα（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔにより細胞表面に結合されている）は次いで、蛍光色素ＰＥに対して結合体化した目的のサイトカインに対し特異的な抗体を使用することにより検出される。
【００８７】
細胞表面分子ＣＤ４およびＣＤ６９は、別の蛍光色素に対し結合体化した抗体を使用することにより検出される。ＣＤ４＋細胞集団は、始めにゲーティングにより選択され、次いでこの集団内で「ダブルポジティブ」（ＣＤ６９およびＩＦＮγまたはＣＤ６９およびＴＮＦα）染色される細胞は、ＦＡＣＳにより分別されそして無菌的に採取される。
【００８８】
単離されたミエリン反応性Ｔ細胞は次いで、ｒＩＬ−２、ＰＨＡ、抗ＣＤ３または他の一般的なＴ細胞分裂促進因子を用いて刺激することにより、放射線照射された自己のＰＢＭＣ存在下で７日〜１０日間直接的に増殖させられる。ミエリン反応性Ｔ細胞株は、全細胞数がおよそ２０００万個に達するまで、培養内で増殖させられる。
【００８９】
（実施例２）
（ＭＳの診断）
２ｍｌ〜１００ｍｌの血液が、患者から採取され、ならびに一以上の合成ペプチドが、Ｔリンパ球を初回抗原刺激する（ｐｒｉｍｅ）ためまたは刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）ためにこの全血に直接的に加えられる。ペプチドは、三個のミエリンタンパク質（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））の公知の免疫優性領域に対応する。この血液を、ミエリン特異的Ｔ細胞を活性化させるため、ペプチドと共に１日〜７日間インキュベートする。この抗原初回刺激期間の最終において、この細胞は、短期再刺激アッセイにおいて抗原を用いて再チャレンジされる。
【００９０】
ミエリンペプチド活性化Ｔ細胞は、界面活性剤溶液を用いた細胞膜透過処理を行い、細胞を洗浄し、次いで細胞表面上のＣＤ４分子またはＣＤ６９分子あるいは細胞内のＩＦＮγまたはＴＮＦαを検出するために一以上の染色抗体と共にインキュベートすることにより、検出される。染色抗体は、異なる蛍光色素に対して結合体化されているため、ＦＡＣＳ分析による４８８ｎｍのレーザーにより励起された際、異なる波長で蛍光を発する。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、始めにゲーティング用のＣＤ４＋細胞を使用することにより選択され、次いでこの集団内で両抗体（ＣＤ６９およびγＩＦＮまたはＣＤ６９およびＴＮＦα）と免疫反応する細胞が同定される。この「ダブルポジティブ」ミエリン反応性Ｔ細胞の集団は、同一の試験における健常なコントロールと比較して多発性硬化症（ＭＳ）患者において有意に増加していることが示された（図１、ＭＳ患者、図２、健常なコントロール）。この方法を使用することで、患者の血液内において循環しているミエリン反応性Ｔ細胞の個数は、自己反応性Ｔ細胞集団に対するＭＳ治療法の効果を決定するための処置前、処置の間または処置の後に決定され得る。終末点は、ダブルポジティブ染色される細胞の割合またはダブルポジティブ染色される細胞の絶対数のいずれかとして決定される。
【００９１】
（実施例３）
（抗体結合体化リポソームを使用するＭＳの診断）
全血は、患者から採取され、一以上の合成ペプチド（実施例２に記載）を用いて刺激される。この血液は、ミエリン特異的Ｔ細胞を活性化するためにペプチドと共に３時間〜１６時間インキュベートされる。この抗原初回刺激期間の最終において、この細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組合せに対する抗体に対して結合体化した磁気蛍光リポソームを用いて染色する前に短期再刺激アッセイにおいて抗原を用いて再チャレンジされる。この細胞はまた、ＣＤ４および／またはＣＤ６９に対する抗体を用いて染色される。染色されたミエリン反応性Ｔ細胞は、実施例２に記載されるように検出される。
【００９２】
（実施例４）
（ＴＣＲクローンのレパートリーの決定）
細胞集団において提示されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンのレパートリーは、実施例２および実施例３において記載されるように細胞選別を行うことにより二重ポジティブ染色された細胞集団を単離することにより分析され得る。ＤＮＡを、単離された細胞から抽出し、これを用いて、２５個の既知ＴＣＲ可変ベータ鎖（Ｖβ）遺伝子ファミリーに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを行う。この手順は、ＴＣＲ Ｖβ遺伝子使用法の分布についての情報をもたらし、病原性Ｔ細胞集団のクローン性を示す。この方法はまた、ＭＳ患者においてミエリン反応性Ｔ細胞集団のクローンシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔｉｎｇ）またはエピトープシフト（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｈｉｆｔｉｎｇ）が発生しているのかを決定するために使用され得る。
【００９３】
（実施例５）
（Ｔ細胞ワクチン接種によるミエリン反応性Ｔ細胞の減少）
再発−軽減（ＲＲ）−ＭＳの患者および第二次進行（ＳＰ）ＭＳの患者は、放射線照射された自己ミエリン反応性Ｔ細胞クローン（直接的な増殖により単離された）の皮下注射を三回受け、その４週間後、１２週間後および２０週間後の三回の追加注射を受けた。患者を、ミエリン反応性Ｔ細胞の前駆体の頻度、再発率、拡大身体障害状態スコア（ＥＤＳＳ）およびＭＲＩ病変活性の変化について２４ヶ月の期間にわたってモニタリングした。この結果を、自己の値と対の様式でワクチン接種前の値と比較した。さらに、βインターフェロン−１ａの臨床試験におけるＲＲ−ＭＳのプラシーボ群の臨床データ（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６）および近年のβＩＦＮ−１ｂ研究におけるＳＰ−ＭＳのプラシーボ群の臨床データ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ，３５２：１４９１−１４９７（１９９８））を、比較のためにＭＳの自然歴データを提供するために含めた。Ｔ細胞の頻度は、ワクチン接種後２０週間目に検出不可能であったかまたは実質的に減少したかのいずれかであった。この結果は、ＭＳの患者におけるＴ細胞ワクチン接種によるミエリン反応性Ｔ細胞の減少を確認した。
【００９４】
（実施例６）
（自己ミエリン反応性Ｔ細胞を使用するＭＳ患者のワクチン接種）
ワクチン接種のプロトコールは、これまでの臨床研究（Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）で使用されたものと類似である。つまり、実施例１に従って調製されたミエリン反応性Ｔ細胞クローンを、放射線照射されたＰＢＭＣ（補助細胞源として）存在下でフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（４μｇ／ｍｌ）を用いて活性化する。細胞を次いで、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清および１ｍＬに対し１００ユニットのｒＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で１０日間培養する。活性化ミエリン反応性Ｔ細胞を次いで、滅菌生理食塩水で三回洗浄して残りのＰＨＡ、ｒＩＬ−２および細胞片を除去し、最終的に２ｍｌの生理食塩水に再懸濁する。放射線照射（１０，０００ラド、１３７Ｃｅ源）の後、この細胞を、両腕の皮下に注射（１ｍｌ／腕）する。ワクチン接種のために使用されるＴ細胞の個数は、一回の注射あたり４０×１０６細胞〜８０×１０６細胞までの範囲であり、相対皮膚表面積に基づいて、実験動物において効果的なＴ細胞用量の推定により選ばれる（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，１９８１）。それぞれの患者は、二回の皮下注射を、続いて４週目、１２週目、および２０週目での繰り返しの注射を受ける。
【００９５】
患者は次いで、障害の確認された進行の発症までの時間、ＥＤＳＳ、再発率、およびＭＲＩ病変活性について観察される。この結果を、患者自身の処置以前の経過ならびにＲＲ−ＭＳ患者およびＳＰ−ＭＳ患者における二つの近年の臨床試験におけるプラシーボ群（ＭＳの自然歴の推定値として役立つ）（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，１９９８）と比較する。進行までの時間を、少なくとも２ヶ月間持続するＥＤＳＳの少なくとも１．０の増加（Ｐｏｓｅｒら、１９８３）により決定する。研究中の病状の再燃は、神経学的検査における客観的な変化（ＥＤＳＳの少なくとも０．５ポイントの悪化）を伴う、新たな神経学的症状の出現または少なくとも４８時間続く既存の神経学的症状の悪化により定義される。患者は、定期的な来診予定の間の事象を報告するように指示され、症状が悪化を示唆するものであるか神経学者により調べられる。安全性の評価は、定期的来診における有害事象、生命徴候および身体検査を含んだ。Ｔ細胞ワクチン接種前および接種後の研究患者の臨床変数における差は、ウィルコクソンの順位和検定を使用することにより分析される。
【００９６】
（実施例７）
（ワクチン接種後のＭＳの臨床経過における変化）
患者は、実施例１に従って調製されたＴ細胞ワクチン接種を有害効果を伴わずに、受ける。平均的なＥＤＳＳは、ワクチン接種後２４ヶ月の間にわたってＲＲ−ＭＳの患者において減少する。これと比較して、同じ時期の観察の間ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝５６）の自然歴においてはＥＤＳＳ平均０．６１増加がある（βインターフェロン−１ａ試験（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６）を使用することで行われる試験において報告されたのと同様）。さらに、無変化のＥＤＳＳまたは改善されたＥＤＳＳのいずれかを有する患者の比率は、ＭＳの自然歴の比率よりも高い。ＭＳの自然歴における患者の１８％と比較して処置されたＲＲ−ＭＳ群内の（たとえあったとしても）ごくわずかの患者は、２４ヶ月以内で２．０のＥＤＳＳを超えて進行する。
【００９７】
ＳＰ−ＭＳコホート内で、ＥＤＳＳ平均は、ＳＰ−ＭＳの自然歴において記録された＋０．６（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５２：１４９１−１４９７）と比較して、２４ヶ月の期間にわたってよりゆっくりと進行する。さらに、カプラン−マイアー法を使用する確認された進行までの時間の推定値は、ＭＳ患者の自然歴（ＲＲ−ＭＳについて１２ヶ月で２０％の進行、そしてＳＰ−ＭＳについて９ヶ月で２０％の進行）（Ｊａｃｏｂｓら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，１９９６；３９：２８５−２９４，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，１９９８）と比較してかなりの遅延を示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）のような、自己免疫疾患の診断および処置の分野に関連する。より詳細には、本発明は、抗原特異的なＴ細胞の単離に関する。さらに、本発明は、例えば、ＭＳのような、自己免疫疾患の処置のための抗原特異的なＴ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ／ぺプチド複合体により形成される細胞間認識複合体は、個々の生体内におけるＴ細胞のレパートリーの発生（ポジティブ選択；ネガティブ選択；末梢生存）および適応的免疫反応のコントロールステージ（Ｔヘルパー）ならびにエフェクターステージ（Ｔキラー）の両方の間において、Ｔ細胞を活性化する細胞−細胞接触の様々なセットにおける共通の認識要素である。
【０００３】
適応的免疫反応において、抗原は、超可変分子（例えば、抗体またはＴＣＲ）により認識され、超可変分子は、任意の抗原を認識し得るほど十分に多様な構造体を有し発現される。抗体は、抗原の表面の任意の一部と結合し得る。ＴＣＲはしかし、ＡＰＣの表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩ分子またはクラスＩＩ分子と結合する短いペプチドとの結合に限定される。ＴＣＲのペプチド／ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞の活性化（クローン性増殖）の引き金となる。
【０００４】
ＴＣＲは、αβ（アルファ−ベータ）またはγδ（ガンマ−デルタ）であり得る二本の鎖からなるヘテロダイマーである。ＴＣＲの構造は、免疫グリブリン（Ｉｇ）の構造に大変似ている。それぞれの鎖は、二つの細胞外ドメインを有し、細胞外ドメインは、免疫グリブリンの折り畳みである。このアミノ末端ドメインは、非常に可変性であり、可変（Ｖ）ドメインと呼ばれる。膜に最も近いドメインは、定常（Ｃ）ドメインである。これら二つのドメインは、免疫グリブリンのこれら二つのドメインと類似しており、かつＦａｂフラグメントに類似している。それぞれの鎖のＶドメインは、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。膜に近接部においては、それぞれのＴＣＲ鎖は、両鎖との間のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、短い連結配列を有する。
【０００５】
αβおよびγδヘテロダイマーをコードする遺伝子は、Ｔ細胞系統にのみ発現される。この四つのＴＣＲ部位（α、β、γ、およびδ）は、Ｉｇの遺伝子構造編成と非常に近似した遺伝子構造編成を有する。α鎖およびγ鎖は、ＶセグメントおよびＪセグメントの再配置により産生され、対して、β鎖およびδ鎖は、Ｖセグメント、ＤセグメントおよびＪセグメントの再編成により産生される。このＴＣＲ鎖の遺伝子セグメントは、α鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間であるδ鎖遺伝子セグメントを除き、異なる染色体上に位置する。δ鎖遺伝子セグメントの位置は、重要である：α鎖遺伝子セグメントの生産的な再編成は、δ鎖のＣ遺伝子を削除し、その結果所定の細胞においてαβヘテロダイマーは、γδレセプターとともに共発現し得ない。
【０００６】
マウスにおいては、およそ１００個のＶα遺伝子セグメントおよび５０個のＪα遺伝子セグメントおよび１個のＣα遺伝子セグメントのみが存在する。δ鎖遺伝子ファミリーは、およそ１０個のＶ遺伝子セグメント、２個のＤ遺伝子セグメントおよび２個のＪ遺伝子セグメントを有する。β鎖遺伝子ファミリーは、２０〜３０個のＶセグメントならびに１個のＤβ、６個のＪβおよび１個のＣβを含む二つ同一のリピートを有する。最後に、γ鎖遺伝子ファミリーは、７個のＶおよび３個の異なるＪ−Ｃリピートを含む。ヒトにおいては、この編成は、マウスと類似しているが、セグメントの個数は、変化する。
【０００７】
α鎖およびβ鎖における遺伝子セグメントの再編成は、Ｉｇの遺伝子セグメントの再編成と類似する。α鎖は、Ｉｇの軽鎖と同様に、Ｖ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントおよびＣ遺伝子セグメントによりコードされる。β鎖は、Ｉｇの重鎖と同様にＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントによりコードされる。α鎖遺伝子セグメントの再編成は、ＶＪの連結を生じ、そしてβ鎖遺伝子セグメントの再編成は、ＶＤＪの連結を生じる。再編成された遺伝子の転写、ＲＮＡプロセッシング、および翻訳の後、α鎖およびβ鎖は、Ｔ細胞の膜上にジスルフィド結合により連結され発現される。
【０００８】
ＴＣＲ遺伝子セグメントは、１２ヌクレオチド（１ターン）または２３ヌクレオチド（２ターン）のいずれかの介在配列を有するヘプタマーおよびノナマーを含む認識シグナル配列（ＲＳＳ）と隣接する。Ｉｇの様に、組換え−活性化遺伝子（ＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２）によりコードされる酵素は、組換えプロセスを担う。ＲＡＧ１／２は、Ｉｇ再編成と同一の様式で、ＲＳＳを認識しそして、Ｖ−ＪセグメントおよびＶ−Ｄ−Ｊセグメントを連結する。簡単に言えば、これらの酵素は、一つのＤＮＡ鎖を遺伝子セグメントとＲＳＳとの間で切断し、コード配列におけるヘアピン形成を触媒する。シグナル配列は、次いで切除される。
【０００９】
α鎖におけるＶセグメントおよびＪセグメント、ならびにβ鎖におけるＶセグメント、ＤセグメントおよびＪセグメントのコンビナトリアル連結は、多数の可能な分子を産生し、それによりＴＣＲの多様性を引き起こす。多様性はまた、遺伝子セグメントの代替的な連結によりＴＣＲにおいて達成される。Ｉｇとは対照的に、β遺伝子セグメントおよびδ遺伝子セグメントは、代替的方法により連結され得る。β遺伝子セグメントおよびδ遺伝子セグメントのＲＳＳ隣接遺伝子セグメントは、β鎖のＶＪおよびＶＤＪ、ならびにδ鎖上のＶＪ、ＶＤＪおよびＶＤＤＪを産生し得る。Ｉｇの場合と同様に、多様性はまた、遺伝子セグメントの連結の可変性により生じる。
【００１０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）として公知であるＴＣＲの超可変ループは、ＭＨＣ分子および結合したペプチドより構成される複合体の表面を認識する。αおよびβのＣＤＲループは、ＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子だけと接触し、一方、ＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ３ループは、ペプチドおよびＭＨＣ分子の両方と接触する。Ｉｇと比べ、ＴＣＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３においてさらに限定された多様性を有する。しかし、ＴＣＲのＣＤＲ３ループの多様性は、Ｉｇの多様性よりも大きい、なぜならＴＣＲは、増大された連結の多様性を誘導する一以上のＤセグメントと連結し得るからである。
【００１１】
多数の自己免疫疾患の病因は、生物体に存在する自己抗原に対する自己免疫性Ｔ細胞の反応により引き起こされると考えられている。クローン選択説の概念に対し、全ての自己反応性Ｔ細胞が、胸腺で除去されるわけではない。複数の自己抗原に対するＴＣＲを有するこれらのＴ細胞は、正常Ｔ細胞レパートリーの一部を提示し、そして自然に末梢に循環する。なぜ自己反応性のＴ細胞が、進化の過程において、胸腺で分化させられ得るのか、ならびに、末梢で適応させられるのかについては、明らかではない。それらの生理学的機能については、理解されていないが、これらの自己反応性Ｔ細胞は、活性化した時、自己免疫性病理の誘発といった潜在的リスクを呈する。自己反応性Ｔ細胞はまた、自己免疫疾患の結果なしに、正常な個体から単離し得る。自己反応性の抗原認識自体は、自己破壊工程を媒介するには十分ではないことが、立証されている。自己反応性Ｔ細胞を病原へとする必須条件の一つは、自己反応性Ｔ細胞が活性化されなければならないことである。
【００１２】
自己反応性Ｔ細胞は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ））の病理に関連づけられる。ＭＳの自己反応性Ｔ細胞の病理は一般に、ミエリン抗原、特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、に対するＴ細胞の反応から生じ続ける。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボ活性化を受け、そしてコントロールの個体とは対照的に、ＭＳの患者の血液および脳脊髄液中に高頻度で前駆体が発生することが見出される。これらＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ＴＨ１サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびγ−インターフェロン（ＩＦＮγ）を産生し、それは炎症性細胞の中枢神経系への移動を促進し、そしてＭＳにおけるミエリン破壊的炎症反応を悪化させる。
【００１３】
ミエリン反応性Ｔ細胞もまた、動物における実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）（ＭＳに類似する）の病理に関連することが示された。ＥＡＥは、補助剤中に乳化されたミエリンタンパク質を注射することにより、感受性の高い動物に積極的に誘導し得、または、ミエリン反応性Ｔ細胞系統およびミエリン感作させた動物由来のクローンを注射することにより、受動的に誘導し得る。インビトロで活性化された場合、極めて少数のミエリン反応性Ｔ細胞が、ＥＡＥを誘導するために必要であり、１００倍以上の静止状態にある同様の反応性を有するＴ細胞は、ＥＡＥを媒介し得ない。
【００１４】
ＥＡＥは、不活性化されたミエリン反応性Ｔ細胞を用いたワクチン接種（Ｔ細胞ワクチン接種と呼ばれる手法）により、予防およびまた処置されることが示された（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１；２９２：６０−６１）。Ｔ細胞ワクチン接種は、抗イディオタイプＴ細胞および抗エルゴタイプＴ細胞を含む調節免疫反応を引き起こし、調節免疫反応は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇を誘導する。ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇により、治療的効果が、ＥＡＥおよび他の実験的な自己免疫疾患モデルでみられる（Ｌｉｄｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２３９：８２０−８２２；Ｌｏｈｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：８２０−８２２）。
【００１５】
自己免疫疾患モデルにおける、この成功により、Ｔ細胞ワクチン接種は近年、ＭＳの患者での臨床試験に進んだ。ＥＡＥのような実験モデルにおける結果に基づいて、自己反応性Ｔ細胞の枯渇は、ＭＳおよび別の自己免疫疾患の臨床経過を改善し得ると考えられている。
【００１６】
試験的な臨床試験において、放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンを用いたワクチン接種は、ＣＤ８＋細胞溶解性のＴ細胞の反応（循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞を特異的に認識および溶解した）を誘発した（Ｚｈａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３；２６１：１４５１−１４５４，Ｍｅｄａｅｒら．Ｌａｎｃｅｔ １９９５：３４６：８０７−８０８）。放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンによる三回の皮下注射は、ＭＳ患者の循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞の枯渇を生じる。
【００１７】
予備的な臨床試験において、循環するＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、放射線照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の三回の皮下注射による患者へのワクチン接種により、再発が寛解したＭＳ患者および第二段階に進行したＭＳ患者で枯渇された（Ｚｈａｎｇら，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００２；２４９：２１２−８）。Ｔ細胞ワクチン接種は、溶解速度、不活性数値の増大およびＭＲＩ傷害活性による測定から、それぞれの患者のグループに有益であった。しかし、最後の注射からおよそ１２月後に加速度的に病気が進行する傾向があった。この明確な加速度的な病気の進行の意味は、不明であるが、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対するＴ細胞ワクチン接種により引き起こされた免疫の漸落に関連する可能性がある。ワクチン接種を受けた患者のおよそ１０〜１２％の患者で、加速度的な進行とおよそ同じ時間に、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が再出現した。いくつかの場合において、異なるクローン集団（ワクチン接種前は検出されなかった集団）由来の再出現したＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が、クローンのシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔ）またはエピトープ拡延（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を起こした可能性があることを示唆する。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のクローンのシフトは、以前の研究（Ｚｈａｎｇら．１９９５）で観察されており、進行中の疾患の工程に関連する可能性がある。
【００１８】
Ｔ細胞ワクチン接種は、ミエリン反応性Ｔ細胞の枯渇に有効的であり、潜在的にＭＳ患者に有益であることが示されたが、処置に関し複数の問題が存在する。それぞれの患者へのＴ細胞ワクチン処置は、個人に合わせたものにしなければならない、なぜならミエリン反応性Ｔ細胞のレセプターは、異なるＭＳ患者との間で、極めて多様でありおよび変化するからである（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５；２５：９５８−９６８，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４；１５２：５５８１−５５９２，Ｈｏｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９；１６３：３５３０−３５３８）。
【００１９】
さらにそれぞれの患者個人に合わせたものにするために、８週間までは、現行の方法を使用して所定のＴ細胞ワクチンを産生するのに必要とされる。Ｔ細胞ワクチンの産生は、患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）または末梢血（ＰＢＭＣ）から単核球の単離から始める。単離された単核球は次いで、活性化ミエリン反応性Ｔ細胞になるまでミエリンペプチドと共に７〜１０日間培養される。培養物は次いで、３日間、ミエリンペプチドの存在下で［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定することにより、ミエリンペプチドへの特異的増加について試験される。ミエリンペプチドへの特異的増加に対して陽性と出た培養物は次いで、クローンのＴ細胞株を得るために段階的に希釈されるか、または直接的に増殖させられる。この細胞は次いで、６〜８週間まで、培養されるこれらのＴ細胞が増殖される。最後のＴ細胞ワクチン産物がクローンである場合、Ｔ細胞は、単一のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法と同質である。通常、３〜６のクローン細胞株が、複数のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有する不均一な製剤を産生するために組み合わせられる。最後のＴ細胞ワクチン産物が、直接的な増殖により産生された場合、Ｔ細胞は、一以上のパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法と異種である。
【００２０】
現行の方法では、Ｔ細胞ワクチン接種の個人に合わせた性質およびそれぞれのワクチンの産生のために必要な長期間の細胞培養により、処置は高価なりそして労働は激務になる。細胞培養に必要とされる長期の時間はまた、コンタミネーションの重大なリスクを生じる。最終的に、クローンシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔ）またはミエリン反応性Ｔ細胞のエピトープ拡延（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）の可能性は、異なるパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有するそれぞれの患者に対するＴ細胞ワクチンのその後の産生を必要とし得る。
【００２１】
従って、抗原（例えば、ＭＢＰ）に対する特異性を有するＴ細胞を単離する改良された方法を開発する必要性が存在し、Ｔ細胞媒介性の疾患（例えば、ＭＳ）を有する患者の処置のためのＴ細胞ワクチンを産生するのに使用され得る。自己反応性Ｔ細胞のクローンシフトの原因である不均一なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有するＴ細胞ワクチンを産生するための改良された方法を開発する必要性もまた、存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
本発明は一般に、抗原特異的Ｔ細胞およびより詳細には自己抗原（ｓｅｌｆ ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）に対し特異的なＴ細胞の単離方法に関する。目的の抗原に特異的な一以上のＴ細胞を単離するための方法は、一般的に、以下の工程：該抗原またはそれらの誘導体とともに患者から得たＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、を包含する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
目的の抗原に特異的な一以上のＴ細胞を単離するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該抗原またはそれらの誘導体とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記抗原は、自己抗原である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、タイプＩＩコラーゲンペプチド、ヒートショックタンパク質、ＭＡＧＥ、ＰＳＡ、ＣＡ１２５、ＧＡＤタンパク質および、腫瘍関連抗原からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記抗原は、自己抗原の免疫優先エピトープである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記免疫優性エピトープは、ミエリン塩基性タンパク質の残基８８〜９９およびミエリン塩基性タンパク質の残基１５１〜１７０からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記第一マーカーおよび前記第二マーカーを発現する前記細胞は、該第一マーカーおよび該第二マーカーそれぞれに対する抗体を使用して、または必要に応じて、該第二マーカーに結合する抗体と組み合わせて、第一および第二マーカーの両方に結合する二重特異性抗体を使用して選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
一以上の前記抗体は、蛍光標識される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｔ細胞は、蛍光活性セルソーティングにより選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第一抗体は、磁性ビーズに結合される、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｔ細胞は、磁気活性セルソーティングにより選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗原は、前記サンプルとともに１〜７日間インキュベートされる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記抗原は、前記サンプルとともに１日未満の間インキュベートされる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記抗原は、前記サンプルとともに１６時間未満の間インキュベートされる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記抗原は、前記サンプルとともに１２時間未満の間インキュベートされる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記抗原は、前記サンプルとともに８時間未満の間インキュベートされる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗原は、前記サンプルとともに４時間未満の間インキュベートされる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記抗原は、前記サンプルとともに２時間未満の間インキュベートされる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１に記載の方法により、単離されるＴ細胞。
（項目１９）
前記単離されたＴ細胞は、ＴＨ１Ｔ細胞もしくはＴＨ２Ｔ細胞またはそれらの組合せである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
サンプル中のＴ細胞の個数を定量するための方法であって、該Ｔ細胞は、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は以下の工程：
（ａ）該抗原またはそれらの誘導体とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により選択された該Ｔ細胞の個数を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）
患者の自己免疫疾患の診断をするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該疾患に関係している一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程、
を包含する、方法。
（項目２２）
患者の自己免疫疾患のモニタリングをするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ａ）により選択された自己反応性の該Ｔ細胞の個数を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）
患者の自己免疫疾患の処置をするための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）該選択された自己反応性Ｔ細胞を不活性化する工程；および
（ｄ）工程（ｂ）により不活性化された自己反応性の該Ｔ細胞を該患者へ投与する工程、
を包含する、方法。
（項目２４）
患者の自己免疫疾患の処置をするための組成物を産生するための方法であって、諸方法は、以下の工程：
（ａ）一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）該自己反応性のＴ細胞を不活性化する工程、
を包含する、方法。
（項目２５）
工程（ｂ）で選択された前記自己反応性のＴ細胞の個数を増加させる工程をさらに包含する、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
項目２４または２５に記載の方法により産生される、自己免疫疾患の患者の処置のための組成物。
（項目２７）
Ｔ細胞レセプター、またはその一部分をコードする核酸を分離するための方法であって、該Ｔ細胞レセプターは、目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該抗原とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞からＴ細胞レセプターをコードする核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程、
を包含する、方法。
（項目２８）
一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする一以上の核酸を単離するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の抗原とともにＴ細胞を含むサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程、
を包含する、方法。
（項目２９）
患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする一以上の核酸のレパートリーを決定するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の抗原とともに、Ｔ細胞を含む該患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）により増幅された該一以上の核酸の該ヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３０）
自己免疫性の患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはその一部分をコードする前記核酸のレパートリーを決定するための方法であって、該一以上のＴ細胞レセプターは、一以上の目的の自己抗原に特異的であり、諸方法は、以下の工程：
（ａ）該一以上の自己抗原とともにＴ細胞を含む該自己免疫性の患者由来のサンプルをインキュベートする工程；
（ｂ）ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ３６およびＨＬＡＤＲからなる群より選択される一以上の第一マーカーならびに、ＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦα、ＩＬ５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群より選択される一以上の第二マーカーを発現する一以上のＴ細胞を選択する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により単離されたＴ細胞から一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸を、Ｔ細胞レセプター遺伝子の可変領域に特異的な第一プライマーおよびＴ細胞レセプター遺伝子の定常領域に特異的な第二プライマーの少なくとも一つの使用により、増幅する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）により増幅された該一以上の核酸の該ヌクレオチド配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【００２３】
本発明の方法は特に、自己免疫疾患の病原の一因である自己反応性Ｔ細胞を単離するために有益である。
【００２４】
本発明の方法はまた、自己免疫疾患の診断ならびに自己免疫疾患の進行のモニタリングを可能とし、そしてこの疾患のための処置の効果のモニタリングを可能とする。
【００２５】
本発明の方法はまた、Ｔ細胞が関連する自己免疫疾患の処置のための自己Ｔ細胞ワクチンの調製を可能とする。
【００２６】
ワクチン調製のための方法は一般的に、抗原特異的Ｔ細胞の単離（上記）、必要に応じてそれに続いて単離された抗原特異的Ｔ細胞の集団の増殖を可能にする培養工程、を包含する。
【００２７】
本発明はまた、特にＴ細胞ワクチンおよび本発明の方法を使用して単離された抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物に関連する。
本発明の方法はまた、Ｔ細胞レセプターおよびそれらをコードする核酸を特徴付けるために有益である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、刺激前（左）、ＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（中）およびＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（右）の多発性硬化症患者のＣＤ６９およびγＩＦＮ（上）およびＣＤ６９およびＴＮＦα（下）を発現する細胞のＦＡＣＳ同定を示す。
【図２】図２は、刺激前（左）、ＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（中）およびＭＢＰの残基８３〜９９での刺激後（右）の健常なコントロールの患者のＣＤ６９およびγＩＦＮ（上）およびＣＤ６９およびＴＮＦα（下）を発現する細胞のＦＡＣＳ同定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（詳細な説明）
（１．定義）
本発明を理解することを補助するため、いくつかの用語は、下に定義される。
【００３０】
本明細書中で用いられた場合「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」または「自己−抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）」は、哺乳動物に対してネイティブであり、哺乳動物において免疫原性であり、哺乳動物の種に保存される抗原またはエピトープをいい、これは、自己免疫疾患の病原に関与し得る。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合「ＣＤ」、「分化クラスター」または「共通決定因子（ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、抗体により認識される細胞表面分子をいう。いくつかのＣＤの発現は、特定の系統または成熟の経路の細胞に対して特異的であり、そして他の発現は、活性化の状態、位置の状態、または同一の細胞の分化の状態に従って変動する。
【００３２】
ヌクレオチド配列の脈絡において、「から誘導された」または「それらの誘導体」は、ヌクレオチド配列が、記述された特定の配列に限定されないだけでなく、その配列のバリエーションをも含むことを意味し、配列のバリエーションは、記述された配列に対するバリエーションが、適切なまたは非常にストリンジェントな条件下で、記述された配列の相補体へハイブリダイズする能力を保持する程度まで、ヌクレオチドの付加、欠失、置換または改変を含み得る。ペプチド配列またはポリペプチド配列の脈絡において、「から誘導された」または「それらの誘導体」は、ペプチドまたはポリペプチドは、記述された特定の配列に限定されないだけでなく、その配列におけるバリエーションをも含むことを意味し、配列のバリエーションは、列挙された配列におけるバリエーションが、記述された配列への免疫反応を誘発する能力を保持する程度まで、アミノ酸の付加、欠失、置換または改変を含み得る。
【００３３】
ペプチドまたはポリペプチドを記述するために使用される場合、「免疫原性」は、ペプチドまたはポリペプチドが免疫反応（Ｔ細胞媒介性、抗体のいずれかまたは両方）を誘発し得ることを意味する。
【００３４】
「免疫関連疾患」は、免疫系が疾患の病因に関与する疾患を意味する。免疫関連疾患のサブセットは、自己免疫疾患である。自己免疫疾患としては、慢性関接リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（ハシモト甲状腺炎）、バセドウ病、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、およびある種の糖尿病が含まれるが、これらに限定はされない。本開示に鑑みて、当業者は容易に、本発明の組成物および方法により、他の自己免疫疾患を処置できることを理解し得る。
【００３５】
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味し、例えば、一般に米国特許第４，６８３，２０２号に記載され（Ｍｕｌｌｉｓに対して、１９８７年７月２８日発行）、これらは、本明細書において参考として援用される。ＰＣＲは、増幅技術であり、選択されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーが、重合因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）およびヌクレオチド三リン酸塩の存在下で、核酸テンプレートへハイブリダイズさせられ得、それにより伸長する産物が、プライマーから形成され得る。これら産物は次いで、変性させられ得、そしてテンプレートとしてサイクル反応に使用され得、サイクル反応は、既存の核酸の数と量を増幅させ、続くそれらの核酸の検出を容易にし得る。様々なＰＣＲ技術が、当該分野において公知であり、そして本明細書中の開示に関連して使用され得る。
【００３６】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、結合したアミノ酸の配列であり、そして天然、合成、または改変あるいは天然および合成の組み合わせであり得る。
【００３７】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチドを意味し、天然、合成またはそれらの改変であろうとなかろうと、テンプレート分子上の特定のヌクレオチド配列に対し十分に相補的なヌクレオチド合成の開始点として機能し得る。
【００３８】
「プローブ」は、オリゴヌクレオチドを意味し、天然、合成またはそれらの改変であろうとなかろうと、十分に相補的なヌクレオチド配列に特異的に結合し得る。
【００３９】
「Ｔ細胞媒介性疾患」は、Ｔ細胞による自己抗原の認識の結果として生じる疾患を意味する。
【００４０】
疾患からの動物の保護をいう場合、「処置」または「処置する」は、疾患を防ぐか、抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）か、抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）か、または完全に排除することを意味する。疾患を防ぐとは、疾患の発症前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）とは、疾患の発症後ではあるが臨床的兆候の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ）とは、疾患の臨床的兆候の後に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００４１】
（２．抗原特異的Ｔ細胞の単離）
（ａ．モノクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離）
Ｔ細胞は、抗原標的および抗原提示細胞とともにインキュベーションすることにより、細胞培養内で活性化および増殖させられ得る。一度活性化されると、Ｔ細胞は、多くの遺伝子産物の転写および発現を誘導する複雑な細胞シグナルカスケードを受ける。本明細書中に記載される本発明は、所望の抗原特異性を有するＴ細胞の同定および単離のために活性化Ｔ細胞に特異的な遺伝子産物を利用する。
【００４２】
第一の局面において、本発明は、目的の抗原に対し特異的であるＴ細胞を単離するための方法に関する。Ｔ細胞を含むサンプルは、特定の抗原と共にインキュベートされ、これは目的の抗原に対し特異的なＴ細胞の活性化を生ずる。サンプルは、抗原と共に１〜７日間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１日未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１６時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に１２時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に８時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に４時間未満の間インキュベートされ得る。サンプルはまた、抗原と共に２時間未満の間インキュベートされ得る。
【００４３】
目的の抗原に対し特異的なＴ細胞は次いで、上記のように活性化されたＴ細胞の遺伝子産物を発現するＴ細胞を選択することにより単離され得る。活性化Ｔ細胞のサブセットは、サブセット特異的遺伝子産物または細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４対ＣＤ８）により、Ｔ細胞を選択することにより単離され得る。
【００４４】
目的の抗原としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン気突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、またはそれらのフラグメントが挙げられる。目的の抗原はまた、免疫優性フラグメント（ＭＢＰの残基８３〜９９または残基１５１〜１７０が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。目的の抗原はまた、目的の二つ以上の個々の抗原の組み合わせであり得る。
【００４５】
Ｔ細胞を活性化するために使用される抗原またはそれらの誘導体は、目的の抗原に対する免疫応答を誘発することができる任意の免疫原であり得る。活性化している抗原は、目的の抗原、またはそれらの誘導体であり得る。活性化している抗原は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧ、あるいはそれらのフラグメントおよび／または誘導体であり得る。活性化している抗原はまた、免疫優性フラグメント（ＭＢＰの残基８３〜９９または残基１５１〜１７０、あるいはそれらのフラグメントおよび／または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。活性化している抗原はまた、二つ以上の個々に活性化している抗原の組み合わせであり得る。活性化している抗原は、一回以上、目的の抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化するために使用され得る。
【００４６】
Ｔ細胞は、単核細胞を含む任意のサンプル内に存在し得る。このサンプルは、ＭＳ患者の末梢血または脳脊髄液からか、あるいはＲＡ患者の滑液から単離され得る。他の自己免疫疾患の患者からのＴ細胞は、末梢血および／または疾患に関連した組織から同様に単離し得る。単核細胞は、当該分野で公知である遠心分離技術（Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配が挙げられるが、それらに限定されない）の手法を使用することによりサンプル内に濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、Ｔ細胞の遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより、サンプル内に濃縮され得る。
【００４７】
活性化Ｔ細胞を同定するまたはネガティブ選択するための遺伝子産物は、細胞表面マーカーまたはサイトカイン、またはそれらの組み合わせであり得る。活性化Ｔ細胞を同定するための細胞表面マーカーとしては、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２８およびＣＤ１３４が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ６９は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ＮＫ細胞および顆粒球に見出される初期の活性化マーカーである。ＣＤ２５は、ＩＬ−２レセプターであり、活性化Ｔ細胞および活性化Ｂ細胞に対するマーカーである。ＣＤ４は、ＴＣＲレセプターであり、胸腺細胞、ＴＨ１型Ｔ細胞およびＴＨ２型Ｔ細胞、単核細胞、およびマクロファージに対するマーカーである。ＣＤ８はまた、ＴＣＲレセプターであり、細胞傷害性Ｔ細胞に対するマーカーである。ＣＤ１３４は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞にのみ発現される。
【００４８】
活性化Ｔ細胞をネガティブ選択するための細胞表面マーカーとしては、ＣＤ３６、ＣＤ４０、およびＣＤ４４が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ２８は、Ｔ細胞レセプター経路に非依存的な刺激性のＴ細胞活性化経路として機能し、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞上に発現される。ＣＤ３６は、膜糖タンパク質であり、血小板、単核球および内皮細胞に対するマーカーである。ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞に対するマーカーである。ＣＤ４４は、マクロファージおよび別の食細胞に対するマーカーである。Ｔ細胞の一部は、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４対ＣＤ８）の細胞表面遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより単離し得る。
【００４９】
本発明の活性化Ｔ細胞を同定するためのサイトカインは、ＴＨ１型Ｔ細胞（細胞媒介性反応）およびＴＨ２型Ｔ細胞（抗体反応）により産生されるサイトカインに限定されない。活性化ＴＨ１型Ｔ細胞を同定するためのサイトカインとしてＩＬ−２、ガンマインターフェロン（γＩＦＮ）および組織壊死因子アルファ（ＴＮＦα）が挙げられるが、これらに限定されない。活性化ＴＨ２型Ｔ細胞を同定するためのサイトカインとしては、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞の一部はまた、ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、γＩＦＮ対ＩＬ−４）のサイトカイン遺伝子産物の発現に対するポジティブ選択、ネガティブ選択、またはそれらの組み合わせを使用することにより単離し得る。
【００５０】
目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞はまた、ＣＤ６９およびＣＤ４と共にＩＦＮγまたはＴＮＦαを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ２型Ｔ細胞は、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。目的の抗原に対し特異的な活性化ＴＨ１型Ｔ細胞および活性化ＴＨ２型Ｔ細胞の組み合わせは、ＣＤ６９、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組み合わせを発現する細胞およびＣＤ６９、ＣＤ４、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはそれらの組み合わせを発現する細胞を同定することにより単離し得る。
【００５１】
本発明の活性化Ｔ細胞のポジティブ選択またはネガティブ選択のために使用される遺伝子産物は、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気細胞ソーティング、パニング、およびクロマトグラフィー（しかし、それらに限定されない）を含む抗体を利用する当該分野で公知である免疫選択の手法により同定され得る。活性化Ｔ細胞上の二以上のマーカーの免疫選択は、一以上の工程（それぞれの工程は一以上のマーカーに対しポジティブに選択するまたはネガティブに選択する）で実施され得る。二以上マーカーの免疫選択が、ＦＡＣＳを使用する一工程で実施される場合、二以上の異なる抗体は、別の蛍光団で標識され得る。
【００５２】
磁気細胞ソーティングは、酸化鉄より構築されおよび多糖類でコートされた超常磁性マイクロビーズを使用することにより実施され得る。好ましくはこのマイクロビーズは、直径はおよそ５０ｎｍであり得、そして標準的な哺乳類の細胞の百万分の一の容量を有し得る。好ましくはこのマイクロビーズは、コロイド懸濁液（細胞表面抗原に対し早く能率的に結合することを可能とする）中にとどまるのに十分な小ささである。好ましくはこのマイクロビーズは、フローサイトメトリーと干渉せず、生体分解可能であり、および細胞機能にごくわずかな影響を有する。マイクロビーズに対する抗体結合は、直接的であっても関節的であってもよく、二次抗体を介するリガンド（例えば、蛍光団）に対するものであり得る。
【００５３】
抗体は、クラスＩｇＧ、クラスＩｇＭ、クラスＩｇＡ、クラスＩｇＤ、およびクラスＩｇＥ、もしくはそれらのフラグメントまたは誘導体であり得、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、二官能性抗体およびそれらの誘導体が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製された抗体、またはそれらの混合であり得、それらは活性化Ｔ細胞に特異的な遺伝子産物（またはそれらから生成された配列）のエピトープに対し特異的に十分な結合をすることを示す。抗体はまた、キメラ抗体であり得る。
【００５４】
抗体は、当該分野で公知である一以上の化学薬品部分、ペプチド部分、またはポリペプチド部分（活性化Ｔ細胞（抗体が結合される）の同定および／または選択を可能とする）の連結により誘導され得る。抗体は、化学薬品部分（例えば、蛍光団染色剤）により結合され得る。蛍光標識された抗体により結合された活性化Ｔ細胞は、蛍光活性セルソーティング（ＦＡＣＳ）（しかし、それらに限定されない）を含む手法を使用することで単離され得る。抗体はまた、磁性粒子（例えば、常磁性マイクロビーズ）により結合され得る（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。磁気標識された抗体により結合された活性化Ｔ細胞は、磁気活性セルソーティング（しかし、それらに限定されない）を含む手法を使用することで単離され得る。
【００５５】
細胞表面の発現された遺伝子産物に対して、抗体は、直接的にこの遺伝子産物に対し結合し得そして細胞選択のために使用され得る。低濃度で発現された細胞表面遺伝子産物に対して、磁気蛍光リポソーム（ｍａｇｎｅｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ，ら．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ６：１０７−１１０，２０００）は、細胞選択のために使用され得る。低レベルの発現では、従来の蛍光標識された抗体は、細胞表面の発現された遺伝子産物の存在を検出するに十分なほどの感度ではあり得ない。蛍光団を含むリポソームは、目的物に対し特異性を有する抗体に対し結合させられ得、それにより細胞表面の発現された遺伝子産物の検出を可能とする。
【００５６】
細胞内の遺伝子産物（例えば、サイトカイン）に対して、抗体は、細胞透過処理をした後に使用され得る。あるいは、細胞透過処理により細胞を殺すことを避けるために、細胞内遺伝子産物（最終的に細胞から排出される場合）は、細胞膜を透過し排出された時、細胞表面上の「キャッチ（ｃａｔｃｈ）」抗体を使用することにより検出され得る。キャッチ抗体は、二つの異なる抗原（（ｉ）目的の排出された遺伝子産物および（ｉｉ）細胞表面タンパク質）に対して特異的である二重の抗体であり得る。細胞表面タンパク質は、特にＴ細胞上、または一般にリンパ球上に存在する任意の表面マーカーであり得る（例えば、ＣＤ４５）。キャッチ抗体はまた、始めに細胞表面タンパク質に対して結合し得、次いで目的の細胞内遺伝子産物が膜を透過し排出された時にこれに対して結合し得、このために、この遺伝子産物を細胞表面に保持する。次に捕捉された遺伝子産物に対して特異的な標識された抗体を使用して、捕捉された遺伝子産物に対して結合させる（活性化Ｔ細胞の選択を可能にする）ために使用され得る（Ｍａｎｚ，ら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１９２１−１９２５，１９９５，本明細書中において参考として援用される）。
【００５７】
サイトカインのある種の形態がまた、細胞表面上に低濃度で発現されることが見出された。例えば、γＩＦＮは、細胞内γＩＦＮ発現の速度論と同一の速度論を有し、細胞表面上に低濃度で提示される（Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ，ら．Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，２６：２６３−２６７）。細胞表面上の発現されたサイトカインの形態に対し、従来の蛍光標識された抗体または蛍光団を含むリポソームは、目的のサイトカインを検出するために使用され得る。当業者は、活性化Ｔ細胞に対し特異的な細胞外遺伝子産物および細胞内遺伝子産物を検出および選択するための別の手法を認識する。
【００５８】
本発明により単離されたはＴ細胞は、全血液から少なくとも９０％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９５％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９８％まで濃縮され得る。Ｔ細胞はまた、全血液から少なくとも９９．５％単離され得る。
【００５９】
（ｂ．単離されたモノクローナル抗原特異的Ｔ細胞）
第二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面の方法により単離された目的の抗原に対し特異的なＴ細胞に関連する。
【００６０】
（ｃ．ポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離）
第三の局面において、本発明は、一以上の目的の抗原に対して特異的であるＴ細胞を単離するための方法に関連する。Ｔ細胞を含むサンプルは、一以上の抗原（一以上の抗原に対して特異的なＴ細胞の活性化を生ずる）と共にインキュベートされる。一以上の抗原に対して特異的なＴ細胞は次いで、本発明の第一の局面のように単離され得る。
【００６１】
Ｔ細胞は、異なるＴＣＲ（目的の抗原に対してそれぞれ特異的である）を発現する不均質なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を有し得る。Ｔ細胞はまた、異なるＴＣＲ（一つより多い目的の抗原に対して特異的である）を発現するＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法の不均質なパターンを有し得る。以下に記載されるように、不均質なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を含むＴ細胞は、ポリクローナルＴ細胞ワクチン（ワクチン接種された患者のにおいてエピトープ拡延を防止し得る）を処方するために使用され得る。
【００６２】
（ｄ．単離されたポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞）
第四の局面において、本発明は、本発明の第三の局面の方法により単離された一以上の目的の抗原に対して特異的なＴ細胞に関連する。
【００６３】
（３．抗原特異的Ｔ細胞の個数を定量する）
第五の局面において、本発明は、本発明の第一または第三の局面の方法により単離されたＴ細胞の個数を決定することにより、サンプル内の一以上の目的の抗原に対して特異的なＴ細胞の相対的頻度を決定する方法に関連する。
【００６４】
（４．自己免疫疾患を診断する）
本発明の第六の局面において、自己免疫疾患の患者は、患者からサンプルを取得するおよび本発明の第一または第三の局面の方法により自己反応性Ｔ細胞を単離することにより診断され得る。自己免疫疾患は、患者の自己反応性Ｔ細胞のレベルをコントロールと比較することにより診断され得る。自己反応性Ｔ細胞のレベルは、本発明の第五の局面の方法に従って決定され得る。
【００６５】
（５．自己免疫疾患の進行をモニタリングする）
本発明の第七の局面において、自己免疫疾患は、本発明の第五の局面に従い自己免疫疾患の患者由来のサンプルにおける自己反応性Ｔ細胞の頻度を決定することによりモニターされ得る。自己免疫疾患の症状の重症度は、自己反応性Ｔ細胞の個数と相関し得る。さらに、サンプル中の自己反応性Ｔ細胞の個数の増加は、症状の重篤度を小さくするおよび／または症状が現れる前に疾患を処置することが意図される処置を適用するための指標として使用され得る。
【００６６】
（６．自己免疫疾患の処置のためのワクチンを産生する）
本発明の第八の局面において、組成物は、本発明の第一または第三の局面の方法により単離された（および必要に応じて、本明細書中で記載されるように培養内で増殖させられる）不活性化自己反応性Ｔ細胞により自己免疫疾患を処置するために産生され得る。自己反応性Ｔ細胞は、化学的な不活性化または放射線照射を含む（しかし、それらに限定されない）当該分野において公知である多数の手法を使用することで不活性化され得る。自己反応性Ｔ細胞は、凍結保存を含む（しかし、それらに限定されない）当該分野において公知である多数の手法を使用することで不活性化前または不活性化後のいずれかで保存され得る。下記に記載するように、組成物は、自己免疫疾患の患者において自己反応性Ｔ細胞を枯渇するためのワクチンとして使用され得る。
【００６７】
この組成物は、薬学的組成物（当該分野において公知である方法を使用することで産生され得る）であり得る。疾患の処置または障害の処置における臨床前治療および臨床治療として使用される薬学的組成物は、診断および処置の認められた原則を使用する当業者により産生され得る。そのような原則は、当該分野において公知であり、および陳述される（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら，監修，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第ｌｌ版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ出版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８７））（本明細書中において参考として援用される）。薬学的組成物は、任意の動物に投与され得、この動物は、組成物の有益な効果を受け得る。薬学的組成物を受ける動物は、ヒトまたは別の哺乳類であり得る。
（ａ．ワクチン）
第九の局面において、本発明は、本発明の第八の局面の方法により産生される組成物に関連する。組成物は、自己免疫性患者の自己反応性Ｔ細胞を枯渇させるため使用され得るワクチンであり得る。
【００６８】
（７．自己免疫疾患の処置）
第十の局面において、自己免疫疾患は、本発明の第九の局面に従い組成物を投与することにより自己反応性Ｔ細胞を有する患者において処置され得る。組成物は、患者において自己反応性Ｔ細胞の枯渇を導き得るワクチンであり得る。
【００６９】
ワクチンは、均質（「モノクローナル」）または不均質（「ポリクローナル」）なパターンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ遺伝子使用法を含む自己反応性Ｔ細胞を含み得る。臨床的研究は、自己モノクローナルＴ細胞ワクチン接種を受ける自己免疫疾患の患者が、ミエリン反応性Ｔ細胞に対する免疫を漸減させることを示し得ることを示す。いくつかの場合において、再出現する自己反応性Ｔ細胞は、異なるクローン集団を起源とし得、このことは、ミエリン反応性Ｔ細胞が、進行する疾患の過程に潜在的に関連するクローンシフトまたはエピトープ拡延を起こし得ることを示唆する。クローンシフトまたはエピトープ拡延は、自己反応性Ｔ細胞により媒介される自己免疫疾患の問題であり得る。自己反応性Ｔ細胞の多様な集団を枯渇させることを可能とするポリクローナル自己反応性Ｔ細胞を含むワクチンは、クローンシフトまたはエピトープ拡延を伴う問題を回避し得る。
【００７０】
この組成物は、薬学的組成物であり得、これは、意図される目的を達成する任意の手段により投与される。例えば、投与は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、経粘膜経路、脳内経路、髄腔内経路、または脳室内経路によるものであり得る。あるいは、または同時に、投与は、経口経路によるものであり得る。この薬学的組成物は、ボーラス注射により、または長時間かけた漸進的な灌流により、非経口投与され得る。
【００７１】
投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、併用治療の種類（あるのであれば）、処置の頻度、および望まれる効果の性質に依存し得る。薬学的組成物の投与のための用量範囲は、望まれる効果（例えば、自己反応性Ｔ細胞が枯渇される（本発明の第七の局面により計測される）が達成されならびに自己免疫疾患が、有意に防止され、抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）され、または処置される）を生ずるために十分な大きさであり得る。この用量は、有害な副作用（例えば、望ましくない交差反応、全身的な免疫抑制、アナフェラキシー反応など）を生ずるほどの大きさではないかもしれない。
【００７２】
この薬学的組成物はさらに、適切な薬学的に受容可能なキァリア（賦形剤および補助剤（活性組成物を薬剤的に使用され得る調製物へと処理することを容易にし得る）を含む）を含み得る。この薬学的組成物に対する添加物は、アジュバンド（例えば、ミョウバン、キトサン）含有物または当該分野において公知の他のアジュバンド含有物を含み得る（例えば、Ｗａｒｒｅｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９−３８８（１９８６）；Ｃｈｅｄｉｄ，Ｌ．，Ｆｅｄｅｒ．Ｐｒｏｃ．４５：２５３１−２５６０（１９８６）（これらは参考文献として本明細書中に援用される）を参照のこと）。この薬学的組成物はまた、当該分野において公知である方法および化合物を使用して、送達または生理活性を高めるためにリポソームをさらに含み得る。
【００７３】
非経口投与のための適切な処方物は、不活性化自己反応性Ｔ細胞の水溶液（例えば、水溶液中に水溶性塩）を含む。さらに、不活性化自己反応性Ｔ細胞を含む油懸濁液が、投与され得る。適切な親油性溶媒または親油性ビヒクルとしては、脂肪酸（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチル）またはトリグリセリドが挙げられる。水溶性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を高める物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む）を含み得る。この懸濁液はまた、安定剤も含み得る。
【００７４】
不活性化自己反応性Ｔ細胞は、注射による投与のための薬学的に受容可能な慣用的な非経口的ビヒクルを使用することにより処方され得る。これらのビヒクルは、無毒性であり治療的なものであり得、そして多くの処方物が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（上記）に陳述される。限定されない賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液およびハンクス緩衝化塩溶液である。薬学的組成物はまた、少量の添加物（例えば、等張性、生理学的ｐＨ、および安定性を維持する物質）を含み得る。
【００７５】
不活性化自己反応性Ｔ細胞は、およそ５×１０２細胞／ｍｌからおよそ１×１０９細胞／ｍｌまでを含む全細胞濃度で処方され得る。自己免疫疾患を防止すること、抑制すること（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）または処置することに使用するための不活性化自己反応性Ｔ細胞の好ましい用量は、およそ２×１０６細胞からおよそ９×１０７細胞の範囲内であり得る。
【００７６】
（８．ＴＣＲレパートリーの決定）
第十一の局面において、本発明は、本発明の第一または第三の局面により単離されたＴ細胞からの一以上のＴ細胞レセプターをコードする核酸を増幅することにより、自己免疫患者の一以上のＴ細胞レセプター、またはそれらの一部をコードする核酸のレパートリーを決定する方法に関連する。この増幅は、プライマー対を使用することにより行われる。このプライマー対の第一プライマーは、ＴＣＲ遺伝子の可変領域を含む核酸に対してハイブリダイズするおよそ１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このプライマー対の第二プライマーは、ＴＣＲ遺伝子の定常領域を含む核酸に対してハイブリダイズするおよそ１５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このプライマー対は、ＴＣＲ遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域に対してハイブリダイズする核酸を増幅するために使用され得る。
【００７７】
Ｔ細胞からの一以上のＴ細胞レセプターをコードする核酸（「標的配列」）またはそれらのフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（当該分野において公知である任意の特定のＰＣＲ技術または装置を使用する）によりサンプルから増幅され得る。例えば、ＰＣＲ増幅は、以下の成分：５μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ）、３μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．３μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｕＬ）（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）、３０ｐｍｏｌの第一プライマー、３０ｐｍｏｌの第二プライマー、および１μｌのサンプルＤＮＡ、を含む反応混合物が調製される手順に従い得る。ポリメラーゼは、少なくとも９５℃の温度において安定であり得、５０〜６０のプロセッシビリティーを有し得、かつ一分間につき５０ヌクレオチドより大きい伸長速度を有し得る。
【００７８】
ＰＣＲ反応は、９５℃（変性）一分、５６℃（アニーリング）２０秒、および７２℃（伸長）４０秒で全４０サイクルの増幅プロファイルを伴い実施され得る。第一サイクルが始まる前に、反応混合液は、およそ５分間から１５分間の最初の変性を受け得る。同様に、最後のサイクルが完了した後、反応混合液は、およそ５分間から１０分間の最終の伸張を受け得る。あるＰＣＲ反応は、わずか１５〜２０サイクルを伴いまたは５０サイクルも伴い作動し得る。特定のＰＣＲ反応に依存して、増幅プロファイルのそれぞれの工程について、より長いインキュベーション時間またはより短いインキュベーション時間およびより高い温度またはより低い温度が、使用され得る。
【００７９】
標的配列を含むサンプルは、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲによりあらかじめ増幅されたＤＮＡ、またはＤＮＡのその他の形態）であり得る。サンプルは、Ｔ細胞（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））を含む任意の動物組織またはヒト組織から直接的にまたは間接的に単離され得る。ゲノムＤＮＡは、Ｔ細胞を含む組織から直接的に単離され得る。ｃＤＮＡは、Ｔ細胞を含む組織から直接的に単離されるｍＲＮＡの逆転写により間接的に単離され得る。
【００８０】
標的配列を検出するための能力は、二段階のＰＣＲ反応によるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡのその他の形態の増幅により間接的にサンプルＤＮＡを単離することにより高められ得る。例えば、第一ＰＣＲ増幅反応は、予備的なフラグメント（第一プライマーおよび第二プライマーが、対向する鎖上に選択的に結合することが可能であるフラグメントよりも長く、かつこのフラグメントを含む）を増幅するために行われ得る。第二ＰＣＲ増幅反応は次いで、第一プライマーおよび第二プライマーを有するテンプレートとしてこの予備的なフラグメントを使用し、標的配列を含むフラグメントを増幅するために行われ得る。第一プライマーまたは第二プライマーのいずれかが、この予備的なフラグメントを増幅するために第一ＰＣＲ反応で使用された場合、第二ＰＣＲ反応は、「セミネステッド（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）」である。第一プライマーも第二プライマーもいずれも、この予備的なフラグメントを増幅するために第一ＰＣＲ反応で使用されなかった場合、第二ＰＣＲ反応は、「ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）」である。
【００８１】
模範的な二段階ＰＣＲ反応において、Ｔ細胞由来の一以上のＴ細胞レセプターをコードする一以上の核酸は、ＴＣＲ遺伝子のＶβ領域に対してアニールする第一予備的プライマーおよびＴＣＲ遺伝子のＣβ領域に対してアニールする第二予備的プライマー使用して第一ＰＣＲ反応（ＶβからＶβ−Ｄβ−Ｊβ連結を通過しＣβまで伸長する予備的なフラグメントを増幅する）を行うことにより増幅され得、その後、ネステッドまたはセミネステッドであり得る第二ＰＣＲ反応が行われ得る。本開示を考慮すると、当業者は、標的配列のＰＣＲ増幅のため適切なプライマーおよび反応条件を選択することが可能である。
【００８２】
標的配列の増幅後においては、この増幅産物は、多数の手法により検出され得る。例えば、増幅産物のアリコートが、電気泳動用ゲルにロードされ得、これに対して電場が、サイズによりＤＮＡ分子を分離するために適用される。別の方法においては、増幅産物のアリコートが、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、エチジウムブロマイド、またはＤＮＡに対して結合し、検出可能なシグナルを発する別の分子で染色されたゲルにロードされ得る。乾燥ゲルは、標的配列に対してハイブリダイズする標識されたオリゴヌクレオチド（ここからのオートラジオグラフは、フィルムに対してこのゲルを曝すことにより得られ得る）を含み得る。
【００８３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すことが含まれる。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実施において本発明者により見出された技術が、十分に機能し、従ってその実施のため好ましい様式を構成すると見なされ得ることが、当業者により認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示された具体的な実施形態において、複数の変更が成され得、さらに本発明の趣旨および範囲から離れることなく、同一または類似の結果を得ることが可能であると評価する。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（Ｔ細胞ワクチン接種のためのミエリン反応性Ｔ細胞の単離）
（１．ＰＢＭＣの調製および初回刺激）
ＭＳ患者およびコントロールの患者由来の新鮮な血液試料を、収集の二時間以内に処理した。あるいは、単核細胞を、ＭＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦＭＣ）から取得し得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、全血から標準Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離法により単離した。具体的には、ヘパリン添加血液を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を用いて希釈（１：１血液／ＨＢＳＳ）し、次いで遠心チューブ内においてＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ溶液上にゆっくりと上層し、そして１８００ｒｐｍ、１８℃〜２５℃で２０分間、ブレーキを伴わず遠心分離した。ＰＢＭＣを、次いで、過剰のＨＢＳＳを加えることにより洗浄し、そして１７００ｒｐｍで１０分間１８℃〜２５℃で遠心分離した。精製されたＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ １６４０培地内で遠心分離により三回洗浄し、その後ＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）に再懸濁した。細胞数を、計数し、そして細胞を、９６ウェルＵ底培養プレートに一ウェルあたり２００，０００細胞の密度でプレートした。全てのプレートに、患者番号および患者名の頭文字を用いて標識した。細胞は、２０μｇ／ｍｌの濃度の合成ペプチド（表１に列挙され三個のミエリンタンパク質（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））の既知免疫優性領域に対応する）存在下で３７℃でインキュベートした。プレートを、３７℃のＣＯ２インキュベーター内に置き、そして視覚的に毎日観察した。細胞を、抗原特異的Ｔ細胞を選択的に培養するために７日〜１０日間培地の交換なしに培養した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
（２．抗原特異的Ｔ細胞の同定および選択）
上記の細胞は次いで、活性化Ｔ細胞を示す遺伝子産物の発現により選択される。上記セクション２（ａ）参照。Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（上記）は、最終的に細胞から排出された際、細胞内サイトカインγＩＦＮまたはＴＮＦαを検出するために使用される。簡単に言うと、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ（一般的に二重特異性抗体（活性化Ｔ細胞マーカーおよび排出サイトカインの両方に対して結合する））は、細胞表面上のＣＤ４５分子または他の活性化Ｔ細胞表面マーカー（例えばＣＤ６９）に対し結合するため、始めに細胞と共に４℃〜８℃でインキュベートされる。結合されたＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔを有する細胞は次いで、細胞内のγＩＦＮまたはＴＮＦαがまたＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔに対して結合し得る（サイトカインが、このインキュベーション時間の間に細胞内から排出される際に）ように３７℃で４５分間インキュベートされる。γＩＦＮまたはＴＮＦα（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｔｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔにより細胞表面に結合されている）は次いで、蛍光色素ＰＥに対して結合体化した目的のサイトカインに対し特異的な抗体を使用することにより検出される。
【００８７】
細胞表面分子ＣＤ４およびＣＤ６９は、別の蛍光色素に対し結合体化した抗体を使用することにより検出される。ＣＤ４＋細胞集団は、始めにゲーティングにより選択され、次いでこの集団内で「ダブルポジティブ」（ＣＤ６９およびＩＦＮγまたはＣＤ６９およびＴＮＦα）染色される細胞は、ＦＡＣＳにより分別されそして無菌的に採取される。
【００８８】
単離されたミエリン反応性Ｔ細胞は次いで、ｒＩＬ−２、ＰＨＡ、抗ＣＤ３または他の一般的なＴ細胞分裂促進因子を用いて刺激することにより、放射線照射された自己のＰＢＭＣ存在下で７日〜１０日間直接的に増殖させられる。ミエリン反応性Ｔ細胞株は、全細胞数がおよそ２０００万個に達するまで、培養内で増殖させられる。
【００８９】
（実施例２）
（ＭＳの診断）
２ｍｌ〜１００ｍｌの血液が、患者から採取され、ならびに一以上の合成ペプチドが、Ｔリンパ球を初回抗原刺激する（ｐｒｉｍｅ）ためまたは刺激する（ｓｔｉｍｕｌａｔｅ）ためにこの全血に直接的に加えられる。ペプチドは、三個のミエリンタンパク質（ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ））の公知の免疫優性領域に対応する。この血液を、ミエリン特異的Ｔ細胞を活性化させるため、ペプチドと共に１日〜７日間インキュベートする。この抗原初回刺激期間の最終において、この細胞は、短期再刺激アッセイにおいて抗原を用いて再チャレンジされる。
【００９０】
ミエリンペプチド活性化Ｔ細胞は、界面活性剤溶液を用いた細胞膜透過処理を行い、細胞を洗浄し、次いで細胞表面上のＣＤ４分子またはＣＤ６９分子あるいは細胞内のＩＦＮγまたはＴＮＦαを検出するために一以上の染色抗体と共にインキュベートすることにより、検出される。染色抗体は、異なる蛍光色素に対して結合体化されているため、ＦＡＣＳ分析による４８８ｎｍのレーザーにより励起された際、異なる波長で蛍光を発する。ＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、始めにゲーティング用のＣＤ４＋細胞を使用することにより選択され、次いでこの集団内で両抗体（ＣＤ６９およびγＩＦＮまたはＣＤ６９およびＴＮＦα）と免疫反応する細胞が同定される。この「ダブルポジティブ」ミエリン反応性Ｔ細胞の集団は、同一の試験における健常なコントロールと比較して多発性硬化症（ＭＳ）患者において有意に増加していることが示された（図１、ＭＳ患者、図２、健常なコントロール）。この方法を使用することで、患者の血液内において循環しているミエリン反応性Ｔ細胞の個数は、自己反応性Ｔ細胞集団に対するＭＳ治療法の効果を決定するための処置前、処置の間または処置の後に決定され得る。終末点は、ダブルポジティブ染色される細胞の割合またはダブルポジティブ染色される細胞の絶対数のいずれかとして決定される。
【００９１】
（実施例３）
（抗体結合体化リポソームを使用するＭＳの診断）
全血は、患者から採取され、一以上の合成ペプチド（実施例２に記載）を用いて刺激される。この血液は、ミエリン特異的Ｔ細胞を活性化するためにペプチドと共に３時間〜１６時間インキュベートされる。この抗原初回刺激期間の最終において、この細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、またはそれらの組合せに対する抗体に対して結合体化した磁気蛍光リポソームを用いて染色する前に短期再刺激アッセイにおいて抗原を用いて再チャレンジされる。この細胞はまた、ＣＤ４および／またはＣＤ６９に対する抗体を用いて染色される。染色されたミエリン反応性Ｔ細胞は、実施例２に記載されるように検出される。
【００９２】
（実施例４）
（ＴＣＲクローンのレパートリーの決定）
細胞集団において提示されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンのレパートリーは、実施例２および実施例３において記載されるように細胞選別を行うことにより二重ポジティブ染色された細胞集団を単離することにより分析され得る。ＤＮＡを、単離された細胞から抽出し、これを用いて、２５個の既知ＴＣＲ可変ベータ鎖（Ｖβ）遺伝子ファミリーに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを行う。この手順は、ＴＣＲ Ｖβ遺伝子使用法の分布についての情報をもたらし、病原性Ｔ細胞集団のクローン性を示す。この方法はまた、ＭＳ患者においてミエリン反応性Ｔ細胞集団のクローンシフト（ｃｌｏｎａｌ ｓｈｉｆｔｉｎｇ）またはエピトープシフト（ｅｐｉｔｏｐｉｃ ｓｈｉｆｔｉｎｇ）が発生しているのかを決定するために使用され得る。
【００９３】
（実施例５）
（Ｔ細胞ワクチン接種によるミエリン反応性Ｔ細胞の減少）
再発−軽減（ＲＲ）−ＭＳの患者および第二次進行（ＳＰ）ＭＳの患者は、放射線照射された自己ミエリン反応性Ｔ細胞クローン（直接的な増殖により単離された）の皮下注射を三回受け、その４週間後、１２週間後および２０週間後の三回の追加注射を受けた。患者を、ミエリン反応性Ｔ細胞の前駆体の頻度、再発率、拡大身体障害状態スコア（ＥＤＳＳ）およびＭＲＩ病変活性の変化について２４ヶ月の期間にわたってモニタリングした。この結果を、自己の値と対の様式でワクチン接種前の値と比較した。さらに、βインターフェロン−１ａの臨床試験におけるＲＲ−ＭＳのプラシーボ群の臨床データ（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６）および近年のβＩＦＮ−１ｂ研究におけるＳＰ−ＭＳのプラシーボ群の臨床データ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ，３５２：１４９１−１４９７（１９９８））を、比較のためにＭＳの自然歴データを提供するために含めた。Ｔ細胞の頻度は、ワクチン接種後２０週間目に検出不可能であったかまたは実質的に減少したかのいずれかであった。この結果は、ＭＳの患者におけるＴ細胞ワクチン接種によるミエリン反応性Ｔ細胞の減少を確認した。
【００９４】
（実施例６）
（自己ミエリン反応性Ｔ細胞を使用するＭＳ患者のワクチン接種）
ワクチン接種のプロトコールは、これまでの臨床研究（Ｚｈａｎｇら，１９９３，Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）で使用されたものと類似である。つまり、実施例１に従って調製されたミエリン反応性Ｔ細胞クローンを、放射線照射されたＰＢＭＣ（補助細胞源として）存在下でフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（４μｇ／ｍｌ）を用いて活性化する。細胞を次いで、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清および１ｍＬに対し１００ユニットのｒＩＬ−２を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で１０日間培養する。活性化ミエリン反応性Ｔ細胞を次いで、滅菌生理食塩水で三回洗浄して残りのＰＨＡ、ｒＩＬ−２および細胞片を除去し、最終的に２ｍｌの生理食塩水に再懸濁する。放射線照射（１０，０００ラド、１３７Ｃｅ源）の後、この細胞を、両腕の皮下に注射（１ｍｌ／腕）する。ワクチン接種のために使用されるＴ細胞の個数は、一回の注射あたり４０×１０６細胞〜８０×１０６細胞までの範囲であり、相対皮膚表面積に基づいて、実験動物において効果的なＴ細胞用量の推定により選ばれる（Ｂｅｎ−Ｎｕｎら，１９８１）。それぞれの患者は、二回の皮下注射を、続いて４週目、１２週目、および２０週目での繰り返しの注射を受ける。
【００９５】
患者は次いで、障害の確認された進行の発症までの時間、ＥＤＳＳ、再発率、およびＭＲＩ病変活性について観察される。この結果を、患者自身の処置以前の経過ならびにＲＲ−ＭＳ患者およびＳＰ−ＭＳ患者における二つの近年の臨床試験におけるプラシーボ群（ＭＳの自然歴の推定値として役立つ）（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６），Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，１９９８）と比較する。進行までの時間を、少なくとも２ヶ月間持続するＥＤＳＳの少なくとも１．０の増加（Ｐｏｓｅｒら、１９８３）により決定する。研究中の病状の再燃は、神経学的検査における客観的な変化（ＥＤＳＳの少なくとも０．５ポイントの悪化）を伴う、新たな神経学的症状の出現または少なくとも４８時間続く既存の神経学的症状の悪化により定義される。患者は、定期的な来診予定の間の事象を報告するように指示され、症状が悪化を示唆するものであるか神経学者により調べられる。安全性の評価は、定期的来診における有害事象、生命徴候および身体検査を含んだ。Ｔ細胞ワクチン接種前および接種後の研究患者の臨床変数における差は、ウィルコクソンの順位和検定を使用することにより分析される。
【００９６】
（実施例７）
（ワクチン接種後のＭＳの臨床経過における変化）
患者は、実施例１に従って調製されたＴ細胞ワクチン接種を有害効果を伴わずに、受ける。平均的なＥＤＳＳは、ワクチン接種後２４ヶ月の間にわたってＲＲ−ＭＳの患者において減少する。これと比較して、同じ時期の観察の間ＲＲ−ＭＳ（ｎ＝５６）の自然歴においてはＥＤＳＳ平均０．６１増加がある（βインターフェロン−１ａ試験（Ｊａｃｏｂｓら，１９９６）を使用することで行われる試験において報告されたのと同様）。さらに、無変化のＥＤＳＳまたは改善されたＥＤＳＳのいずれかを有する患者の比率は、ＭＳの自然歴の比率よりも高い。ＭＳの自然歴における患者の１８％と比較して処置されたＲＲ−ＭＳ群内の（たとえあったとしても）ごくわずかの患者は、２４ヶ月以内で２．０のＥＤＳＳを超えて進行する。
【００９７】
ＳＰ−ＭＳコホート内で、ＥＤＳＳ平均は、ＳＰ−ＭＳの自然歴において記録された＋０．６（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ １９９８；３５２：１４９１−１４９７）と比較して、２４ヶ月の期間にわたってよりゆっくりと進行する。さらに、カプラン−マイアー法を使用する確認された進行までの時間の推定値は、ＭＳ患者の自然歴（ＲＲ−ＭＳについて１２ヶ月で２０％の進行、そしてＳＰ−ＭＳについて９ヶ月で２０％の進行）（Ｊａｃｏｂｓら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，１９９６；３９：２８５−２９４，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，１９９８）と比較してかなりの遅延を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１７８７５９（Ｐ２０１０−１７８７５９Ａ）
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−９８２６３（Ｐ２０１０−９８２６３）
【出願日】平成２２年４月２１日（２０１０．４．２１）
【分割の表示】特願２００４−５２７７７２（Ｐ２００４−５２７７７２）の分割
【原出願日】平成１５年８月６日（２００３．８．６）
【出願人】（３９１０５８０６０）ベイラー カレッジ オブ メディスン (16)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【出願人】（５０４０５１７２２）オペクサ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２１日（２０１０．４．２１）
【分割の表示】特願２００４−５２７７７２（Ｐ２００４−５２７７７２）の分割
【原出願日】平成１５年８月６日（２００３．８．６）
【出願人】（３９１０５８０６０）ベイラー カレッジ オブ メディスン (16)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
【出願人】（５０４０５１７２２）オペクサ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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