ＴＬＲ９の新規な合成アゴニスト
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介免疫応答の調節に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすトール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
関連出願
本出願は、２００７年８月１日に出願された米国仮出願第６０／９５３，２５１号、２００７年１０月３０日に出願された米国仮出願第６０／９８３，６０１号、２００７年１１月１２日に出願された米国仮出願第６０／９８７，１５１号、および２００７年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／０１５，２９２号の利益を主張し、その全内容は、本明細書に参照として組込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介性免疫応答の調節に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすトール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
トール様受容体（ＴＬＲ）は多くの免疫系細胞上に存在し、先天性免疫応答に関与することが示されている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。脊椎動物において、このファミリーは、細菌、真菌、寄生生物、およびウィルスからの病原体関連分子パターンを認識することで知られる、ＴＬＲ１からＴＬＲ１１と呼ばれる１１のタンパク質からなる（Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943）。
【０００４】
ＴＬＲは、脊椎動物が、外来性分子を認識し、それに対する免疫応答を開始するための鍵となる手段であり、先天性免疫応答および適応免疫応答を結びつけるための手段を提供する（Akira, S et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。いくつかのＴＬＲは、細胞外病原体を検出し、それに対する応答を開始するために細胞表面に位置し、別のＴＬＲは、細胞内病原体を検出し、それに対する応答を開始するために細胞内に位置する。
【０００５】
ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡ中および合成オリゴヌクレオチド中の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745）。ＣｐＧ含有ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの別の修飾もまた、ＴＬＲ９を介した免疫応答の調節物質として働くためのその能力に影響し得る（例えばZhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; and Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813参照）。ＴＬＲ９の天然に存在するアゴニストは、抗腫瘍活性（例えば腫瘍成長および血管新生）を産生し、効果的な抗癌応答（例えば抗白血病）をもたらすことが示されている（Smith, J.B. and Wickstrom, E. (1998) J.Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154）。加えて、ＴＬＲ９アゴニストは他の知られた抗腫瘍化合物（例えばセツキシマブ、イリノテカン）と相乗的に働くことが示されている（Vincenzo, D., et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(2):577-583）。
【０００６】
あるＴＬＲ９アゴニストは、コアＣｐＲジヌクレオチドを含む３’−３’結合ＤＮＡ構造を含み、ここでＲは修飾グアノシンである（米国特許第７，２７６，４８９号）。加えて、特定の化学的修飾は、免疫応答の特異な調節を起こす特定のオリゴヌクレオチドアナログの調製を可能にする。とくに、構造活性相関研究は、免疫応答の特定の調節を起こす合成モチーフおよび新規ＤＮＡベース化合物の同定を可能にし、これらの調節は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによって起こるものとは異なる（Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308; Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238）。
【０００７】
発明者らは、驚くべきことに、コアＣｐＲジヌクレオチドに隣接する配列、ヌクレオチド間の結合またはオリゴヌクレオチドに接続するリンカーを独自に修飾することが、in vitroおよびin vivoサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすＴＬＲ９の新規アゴニストを産生することを発見した。ＣｐＲ含有オリゴヌクレオチドに対するサイトカインおよびケモカイン応答を「カスタムチューン（custom-tune）」するこの能力は、様々な疾患状態を、疾患特異的およびさらには患者特異的なやり方で、予防および／または処置する能力を提供する。したがって、かかるカスタムチューンされた応答を提供する新たなオリゴヌクレオチドアナログ化合物に対する要求がある。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、アゴニストとしてのＴＬＲ９との相互作用を通じて個別に特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、特定のおよび固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それによりその特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。
【０００９】
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、様々な細胞型ならびに様々なin vitroおよびin vivo研究モデルにおいて免疫応答を誘導し、各アゴニストは特異な免疫応答プロファイルを提供する。本発明のＴＬＲ９アゴニストはまた、単独で、他の薬剤と組み合わせてもしくは共投与されるか、またはワクチンとして用いられる抗原のアジュバントとしてのどちらかにおいて、様々な疾患の予防および／または処置に有用である。このように、これらは免疫系の研究のための、かつ人間およびマウスなどの様々な動物種の免疫系の比較のための道具として有用である。
【００１０】
したがって、第１の側面において、本発明は、ＴＬＲ９のオリゴヌクレオチドベースのアゴニスト（「化合物」）を提供する。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドベースＴＬＲ９アゴニストおよびその薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤を提供する。
【００１２】
第３の側面において、本発明は、ワクチンを提供する。この側面のワクチンは、本発明の医薬製剤を含み、さらに抗原を含む。
【００１３】
第４の側面において、本発明は、個体においてＴＬＲ９媒介免疫応答を起こす方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを個体に投与することを含む。
【００１４】
第５の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを患者に投与することを含む。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、疾患または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の免疫調節化合物のリニア合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１７】
【図２】図２は、本発明の免疫調節化合物のパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ａは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｂは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｃは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００１９】
【図３Ｄ】図３Ｄは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｄは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｅは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｆ】図３Ｆは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｆは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｇ】図３Ｇは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｇは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２１】
【図４Ｃ−４Ｈ】図４Ｃ〜４Ｈは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｃ〜４Ｈは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２２】
【図４Ｉ】図４Ｉは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｉは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｊ】図４Ｊは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｊは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｋ】図４Ｋは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｋは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｌ】図４Ｌは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｌは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｍ】図４Ｍは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｍは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｎ】図４Ｎは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｎは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２３】
【図４Ｏ−４Ｔ】図４Ｏ〜４Ｔは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｏ〜４Ｔは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｕ−４Ｚ】図４Ｕ〜４Ｚは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｕ〜４Ｚは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４ＡＡ−４ＦＦ】図４ＡＡ〜４ＦＦは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４ＡＡ〜４ＦＦは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２４】
【図５Ａ】図５Ａは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ｐＤＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図５Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ｐＤＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図５Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｃは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｄは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｅは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｆ】図６Ｆは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｆは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、下記例５にしたがって処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清サイトカインおよびケモカイン誘導を描写したものである。簡潔には、１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。
【００２７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。
【００２８】
【図７Ｃ】図７Ｃは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｃは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｄは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｅ】図７Ｅは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｅは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｆ】図７Ｆは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｆは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、アゴニストとしてのＴＬＲ９との相互作用を通して独立して特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明のＴＬＲ９アゴニストは、固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それにより特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。本明細書で参照される全ての公表文献は、当業者の技術レベルを反映し、その全体が参照として本明細書に組込まれる。それらの参考文献の教示と本明細書との間のあらゆる競合は、後者を支持することにより解決される。
【００３０】
本発明のＴＬＲ９アゴニストは、様々な細胞型および様々なin vivoおよびin vitro実験モデルにおいて免疫応答を誘導し、各々のアゴニストは特異な免疫応答プロファイルを提供する。このように、これらは免疫システムの研究のための、ならびにヒトおよびマウスなど、様々な動物種の免疫システムを比較するためのツールとして有用である。本発明のＴＬＲ９アゴニストはまた、単独で、他の薬剤と組み合わせてもしくは共投与されるか、またはワクチンとして用いられる抗原のアジュバントとしてのどちらかにおいて、様々な疾患の予防および／または処置にも有用である。
【００３１】
定義
「２’−置換ヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」という語は、一般的に、ペントースまたはアラビノース部分の２’位のヒドロキシル基が置換されて２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドを産生するヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、かかる置換は、１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基によって、ハロゲン原子によって、または６〜１０の炭素原子を含むアリール基によってなされ、ここでかかるヒドロカルビルまたはアリール基は非置換であってよく、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、もしくはアミノ基によって置換されていてよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例は、限定されずに、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドを含む。
【００３２】
指向的に用いられた場合、「３’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から（オリゴヌクレオチドの３’位置へ）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’の領域または位置をいう。
【００３３】
指向的に用いられた場合、「５’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から（オリゴヌクレオチドの５’位置へ）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’の領域または位置をいう。
【００３４】
「約」という語は、一般的に、正確な数が重要でないことを意味する。したがって、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は重要ではなく、１または２少ないヌクレオシド残基の数または１から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記のそれぞれの態様の等価物であると意図される。
【００３５】
「気道炎症」という語は一般的に、限定することなく、ぜんそくを含むアレルゲンに起因する気道の炎症を含む。
【００３６】
「アレルゲン」という語は一般的に、抗原または分子、通常はタンパク質、の抗原部分をいい、これは対象への曝露によってアレルギー反応を引き起こす。典型的には、対象は、例えば膨疹および発赤試験（wheal and flare test）または当該技術分野において知られたあらゆる方法によって示されたように、アレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、たとえ対象の小さなサブセットのみが分子への曝露によってアレルギー性（例えばＩｇＥ）免疫応答を示した場合でも、アレルゲンといわれる。
【００３７】
「アレルギー」という語は一般的に、限定することなく、食物アレルギー、呼吸器アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００３８】
「抗原」という語は一般的に、抗体またはＴ細胞受容体によって認識され、選択的に結合される基質のことをいう。抗原は、これに限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含んでよい。抗原は天然または合成であってよく、一般的に抗原特異的な免疫応答を誘導する。
【００３９】
「自己免疫障害」という語は一般的に、「自分」の抗原が免疫系の攻撃を被る障害をいう。かかる語は、限定することなく、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血性ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性喘息（autoimmune asthma）、敗血性ショック、乾癬およびマラリアを含む。
【００４０】
「癌」という語は一般的に、限定することなく、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂に起因する、あらゆる悪性増殖または腫瘍をいう。癌はヒトおよび／または動物で起こり得、あらゆるおよび全ての組織において生じ得る。本発明によるがんを有する患者の処置は、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂が影響を受けるように、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含んでよい。
【００４１】
「担体」という語は一般的に、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填材、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油脂、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソーム被包、または医薬製剤に用いられることが当業者に周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途についての投与ルートに依存するであろうことが理解されるだろう。これらの材料を含有する薬学的に許容可能な製剤の調製は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990などに記載されている。
【００４２】
「薬学的に許容可能な」または「生理学的に許容可能な」という語は一般的に、本発明の化合物の有効性を妨害せず、細胞、細胞カルチャー、組織または生物体などの生物システムに適合する材料のことをいう。好ましくは、生物システムは、脊椎動物などの生きている生物体である。
【００４３】
「共投与」または「共投与された」という語は一般的に、少なくとも２つの異なる基質を、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で投与することをいう。好ましくは、共投与は、少なくとも二つの異なる基質の同時投与をいう。
【００４４】
「薬学的に有効な量」という語は一般的に、有益な結果などの所望の生物学的効果に影響するのに十分な量をいう。したがって「薬学的に有効な量」は投与される背景に依存し得る。薬学的に有効な量は、１または２以上の予防的または治療的投与において投与されてよい。
【００４５】
「組み合わせて」という語は一般的に、患者の処置過程において、本発明の化合物ならびに、該化合物のＴＬＲ９アンタゴニスト効果を無効にしない、疾患および病態を処置するのに有用な別の剤を投与することを意味する。かかる投与は、同時投与、ならびに数秒から数日までの間隔で時間的に間隔が置かれた順番を含む、あらゆる順番で行われてよい。かかる組合せ治療はまた、単なる本発明の化合物および／または独立して他の剤の単一投与以上のものを含んでよい。本発明の化合物および他の剤の投与は、同一または異なるルートによってよい。
【００４６】
「個体」または「対象」という語は一般的に、ヒトなどの哺乳類をいう。哺乳類は一般的に、これに限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００４７】
「キナーゼ阻害剤」という語は一般的に、細胞において、リン酸化依存性細胞シグナリング経路および／または細胞増殖経路を拮抗または阻害する分子をいう。キナーゼ阻害剤は天然または合成であってよく、経口治療として投与される可能性を有する小分子を含んでよい。キナーゼ阻害剤は、標的キナーゼ分子の活性化を速やかにおよび特異的に阻害する能力を有する。プロテインキナーゼは、１つにはそれらが広範なシグナリングおよび増殖経路を制御し、多くの異なるタンパク質を含むことから、魅力的な薬剤標的である。このようにそれらは、癌、循環器疾患、炎症性障害、糖尿病、黄斑変性症、神経障害を含む、キナーゼシグナリングが関与する疾患の治療に大きな可能性を有する。キナーゼ阻害剤の例は、ソラフェニブ（Nexavar(R)）、スーテント(R)、ダサチニブ、ダサチニブＴＭ、ザクティマＴＭ、タイカーブＴＭおよびＳＴＩ５７１を含む。
【００４８】
「リニア合成」という語は一般的に、１つの末端のオリゴヌクレオチドから開始して、他端まで線形的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成、および／または組込まれた化学的修飾に関して）どちらかのモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組込むことを可能にする。
【００４９】
「哺乳類」という語は明示的に、限定することなくヒトを含む、温血の、脊椎動物を含むことを意図する。
【００５０】
「修飾ヌクレオシド」という語は一般的に、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載されたように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のため、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリンアナログあるいは非天然のピリミジンまたはプリンは互換的に用いることができ、非天然の塩基および／または非天然の糖部分を含むヌクレオシドをいう。本発明の目的のため、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合、非天然であると考えられる。
【００５１】
「調節」または「調節的」という語は一般的に、応答における増加またはＴＬＲ−９媒介性応答における質的な相違などの変化をいう。
【００５２】
「リンカー」という語は一般的に、糖、塩基または骨格を介して、共有または非共有結合を通じてオリゴヌクレオチドに取り付け可能なあらゆる部分をいう。リンカーは２または３以上のヌクレオシドを取り付けるために用いることができ、またはオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端ヌクレオチドに取り付けることができる。本発明のある態様において、かかるリンカーは非ヌクレオチドリンカーである
【００５３】
「非ヌクレオチドリンカー」という語は一般的に、共有または非共有結合を通じてオリゴヌクレオチドに取り付け可能な、ヌクレオチド結合以外の化学的部分をいう。好ましくは、かかる非ヌクレオチドリンカーは、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さであり、シスまたはトランス配置のどちらかであってよい。
【００５４】
「ヌクレオチド結合」という語は一般的に、隣接するヌクレオシド間のリン原子および帯電した、または中性の基（例えばホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロチジオアート）からなる、２つのヌクレオチドをそれらの糖を介して（例えば３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）結びつける化学的結合をいう。
【００５５】
「オリゴヌクレオチドベース化合物」という語は、複数の結合したヌクレオシドユニットから形成されるポリヌクレオシドをいう。ヌクレオシドユニットはウィルス、細菌、細胞片、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの一部であってよく、またはそれらの一部にしてもよい。かかるオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることもできるが、好ましくは合成法により産生される。好ましい態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られたヌクレオシド間結合によって、お互いに組み合わされることができる。かかるヌクレオシド間結合は、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カルバマート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオアート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む。「オリゴヌクレオチドベース化合物」という語もまた、１または２以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオアート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用された場合、「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は明示的に、結合がリン酸基を含もうと含まなかろうと、あらゆるかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート結合、あるいはそれらの組み合わせである。
【００５６】
用語「ペプチド」は、該ペプチドがハプテンであろうと無かろうと、例えば抗体産生またはサイトカイン活性など、生物学的応答に影響するのに十分な長さおよび組成を有するポリペプチドを一般的にいう。用語「ペプチド」は、修飾アミノ酸（天然または非天然であるかどうかにかかわらず）を含んでもよく、かかる修飾は、これに限定されるものではないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化（lipidization）およびメチル化を含む。
【００５７】
「ＴＬＲ９アゴニスト」という語は一般的に、ＴＬＲ９によって媒介される免疫刺激を増強、誘導または調節することができるオリゴヌクレオチドベースの化合物をいう。
【００５８】
「処置」という語は一般的に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
【００５９】
本発明のあるＴＬＲ９アゴニストを、下の表Ｉに示す。この表において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは全て、別に指示のある場合を除き、ホスホロチオアート（ＰＳ）結合を有する。しかし当業者は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳ結合とＰＯ結合の組み合わせも用いることができることを、認識する。別に指示のある場合を除き、全てのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表１−２】
【００６２】
【表１−３】
【００６３】
【表１−４】
【００６４】
【表１−５】
【００６５】
Ｇ１＝７−デアザ−ｄＧ、Ｇ２＝ＡｒａＧ、Ｇ３＝７−デアザＡｒａＧ、Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｕ＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ｄＵ＝Ｕ１＝２’−デオキシ−Ｕ、ｏ＝ホスホジエステル結合、ｐｏ＝５’−モノリン酸、ｐｓ＝５’ホスホロチオアート結合、ｐｍ＝メチルホスホナート（非イオン結合）、Ｌ＝１，５−ペンタンジオールリンカー、Ｌ＝１，２−ジデオキシリボース、Ｌ１＝トリエチレングリコールリンカー、Ｌ２＝テトラエチレングリコールリンカー、Ｌ３＝ヘキサエチレングリコールリンカー、Ｍ＝ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカー、ｍ＝ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカー、Ｘ＝グリセロールリンカー、Ｘ１＝１，２，４−ブタントリオールリンカー、Ｘ２＝１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸リンカー、Ｘ３＝イソブタントリオールリンカー、Ｙ＝１，３−プロパンジオールリンカー、Ｙ１＝１，２−エチレンジオールリンカー、Ｙ２＝１，４−ブタンジオールリンカー、Ｙ３＝１，５−ペンタンジオールリンカー、Ｚ＝１，３，５−ペンタントリオールリンカー。
【００６６】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例２の記載のようにして、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞において免疫刺激活性について試験した。下の図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後１８時間においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＮＦ−κＢ活性化を増加または減少できることを示す。
【００６７】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトＰＢＭＣ中のＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２ＲおよびＭＣＰ−１アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図４Ａ〜４ＦＦに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２Ｒおよび／またはＭＣＰ−１活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２ＲおよびＭＣＰ−１活性化を増加または減少できることを示す。
【００６８】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトｐＤＣ中のＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦαアッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図５Ａおよび５Ｂに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトｐＤＣにおけるＴＬＲ９媒介性免疫活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦα活性化を増加または減少できることを示す。
【００６９】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例４の記載のようにして、ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ＴＬＲ９媒介性Ｂ細胞増殖活性を変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、Ｂ細胞増殖を調節できることを示す。
【００７０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例５の記載のようにして、Ｃ５７Ｂ１／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス中のin vivo免疫刺激活性について試験した。図７Ａ、７Ｂ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、マウスモデルにおけるＴＬＲ９媒介性免疫活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、in vivoサイトカインおよび／またはケモカイン濃度を変化させることができることを示し、これは多くの疾患における用途を見出すだろう。
【００７１】
上記したように、本発明は、第１の側面において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９合成アゴニストを提供する。塩基、糖、リンケージ、またはリンカーに対する一定の化学修飾に基づき、ＴＬＲ９のアゴニストは、接触可能５’末端を保持しつつ、他のＴＬＲ９アゴニスト分子と会合しおよび／または重複した場合に、増加した安定性を有することができる。
【００７２】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、これに限定されるものではないが、表ＩＩに列挙されたものを含んでよい。
【表２】
【００７３】
【表２−２】
【００７４】
【表２−３】
【００７５】
【表２−４】
【００７６】
【表２−５】
【００７７】
【表２−６】
【００７８】
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【００７９】
活性化合物は、薬学的に許容し得る担体または希釈剤中に、処置される患者に重篤な毒性効果を及ぼすことなく、薬学的に有効な量で患者に送達されるのに十分な量で、含有される。薬学的に許容し得る誘導体の有効な用量範囲は、送達される親化合物の重量、または当業者に知られた他の方法に基づき算出することができる。誘導体それ自体が活性を示す場合は、有効用量は誘導体の重量を用いて、または当業者に既知の他の手段により、上記のようにして推定可能である。
【００８０】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明の医薬製剤を含み、さらに抗原を含む。抗原とは、特異的免疫応答を誘発する分子である。かかる抗原は、限定することなく、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および複合体またはこれらの任意のものの組合せを含む。あらゆるかかる抗原は、任意に免疫原性タンパク質またはペプチドに連結してもよく、その例は例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、またはあらゆる他の免疫原性担体タンパク質である。
【００８１】
本発明によるワクチンはさらに、あらゆる過剰な既知のアジュバントをさらに含んでよく、その例は限定なく、フロイント完全アジュバント、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、ＴＬＲアゴニストまたはこれらの組合せを含む。
【００８２】
第４の側面において、本発明は、個体においてＴＬＲ９媒介性免疫応答を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、個体に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。いくつかの態様において、個体は哺乳類である。好ましい態様において、化合物、医薬製剤またはワクチンは、免疫刺激を必要とする個体に投与される。
【００８３】
本発明のこの側面による方法において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンの投与は任意の好適な経路により行うことができ、これには、限定することなく、非経口、経口、腫瘍内、舌下、経皮、局所、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、粘膜、膣、あるいは遺伝子銃、経皮パッチまたは点眼もしくは口腔洗浄の形態によるものを含む。化合物、医薬製剤またはワクチンの投与は、既知の手順を用いて、疾病の症状または代理マーカーを低減するのに有効な用量と期間で、行うことができる。全身投与の場合、化合物、医薬製剤またはワクチンは、本発明の化合物の約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度が有効であり得、またはるかに高い濃度が重篤な毒性効果なしに耐容され得る。好ましくは、本発明による化合物の総用量は１日約０．００１ｍｇ／患者〜１日約２００ｍｇ／体重１ｋｇまでの範囲である。本発明の１または２種以上の治療組成物の治療有効量を、同時に、または連続して、個体に対して１つの処置エピソードとして投与することが望ましい場合もある。
【００８４】
ある好ましい態様においては、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは他の剤と共投与または組み合わせて投与され、これらの剤は限定することなく、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、標的治療物（targeted therapies）、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫応答の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバントを含む。
【００８５】
本発明のこの側面による方法は、ヒトまたは動物の疾病の予防的または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児および獣医学の用途に有用である。本方法はまた、免疫系のモデル研究にも有用である。
【００８６】
第５の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、処置される疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染性疾患、気道炎症、炎症性障害、アレルギー、ぜん息、または病原体もしくはアレルゲンにより引き起こされる障害である。病原体は例えば、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００８７】
第６の側面において、本発明は、疾患または障害を予防するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、予防される疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、ぜん息、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００８８】
本発明のあらゆる方法において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは、疾病または状態を予防または処置するのに有用であり、かつ本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンの免疫刺激効果を無効にしないような他の剤と共投与または組み合わせて、投与することができる。本発明のあらゆる方法において、疾患または病態を予防または処置するのに有用な剤は、限定することなく、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫応答の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバント、または、共刺激性分子であって、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドなどを含む。例えば、癌の予防および／または処置において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを、化学治療化合物またはモノクローナル抗体と共投与または組み合わせて投与できることが意図される。
【００８９】
好ましい化学治療剤は、限定することなく、ゲムシタビンメトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、Taxol（Ｒ）、フラジリン（fragyline）、メグラミン（Meglamine）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスチン（carmustaine）およびポリフェプロサン（poliferposan）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ １２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメトレキソール（Lometexol）、グラモレック（Glamolec）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、Novantrone（Ｒ）／ミトロキサントロン（Mitroxantrone）、メタレット（Metaret）／スラミン、バスチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Incel）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ ６９８、ＴＡ ２５１６／マリマスタット（Marmistat）、ＢＢ２５１６／マリマスタット、ＣＤＰ ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール ＤＰ ２２０２、ＦＫ ３１７、メシル酸イマチニブ／Gleevec（Ｒ）、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ ３２／バルルビシン、Metastron（Ｒ）／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド、エバセット（Evacet）／リポソーム化ドキソルビシン、ユータキサン（Yewtaxan）／パクリタキセル（Placlitaxel）、Taxol（Ｒ）／パクリタキセル、ゼローダ（Xeload）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Cyclopax）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ １２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、UFTＴＭ（テガフール／ウラシル）、Ergamisol（Ｒ）／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵ増強剤、カンプト／レバミゾール、Camptosar（Ｒ）／イリノテカン、トミュデックス（Tumodex）／ラルチトレキセド（Ralitrexed）、Leustatin（Ｒ）／クラドリビン、パクセクス（Paxex）／パクリタキセル、Doxil（Ｒ）／リポソーム化ドキソルビシン、カエリクス（Caelyx）／リポソーム化ドキソルビシン、Fludara（Ｒ）／フルダラビン、ファルモルビシン（Pharmarubicin）／エピルビシン、DepoCyt（Ｒ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ １０３７９３／ドラスタチン（Dolastain）、カエティクス（Caetyx）／リポソーム化ドキソルビシン、Gemzar（Ｒ）／ゲムシタビン、ＺＤ ０４７３／Anormed（Ｒ）、ＹＭ １１６、ヨウ素種（lodine seeds）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Dexifosamide）、イフェックス（Ifes）／Mesnex（Ｒ）／イフォスファミド（Ifosamide）、Vumon（Ｒ）／テニポシド、Paraplatin（Ｒ）／カルボプラチン、プランチノール（Plantinol）／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ ９３３１、Taxotere（Ｒ）／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソウレア、メルファラン（melphelan）およびシクロフォスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロランブシル（Chlorombucil）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、または硫酸ビンデシンを含む。好ましいモノクローナル抗体は、これに限定するものではないが、Panorex（Ｒ）（Glaxo-Welicome）、Rituxan（Ｒ）（IDEC/Genentech/Hoffman la Roche）、Mylotarg（Ｒ）（Wyeth）、Campath（Ｒ）（Millennium）、Zevalin（Ｒ）（IDEC and Schering AG）、Bexxar（Ｒ）（Corixa/GSK）、Erbitux（Ｒ）（Imclone/BMS）、Avastin（Ｒ）（Genentech) Herceptin（Ｒ）（Genentech/Hoffman la Roche）、Tarceva（Ｒ）（OSI Pharmaceuticals/Genentech)を含む。
【００９０】
代替的に、疾患または病態を予防または処置するのに有用な剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは、アジュバントとして様々に作用し得、および／または直接的な免疫調節効果を産生し得る。
【００９１】
以下の例は、本発明の一定の好ましい態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を多少でも限定することを意図するものではない。
【００９２】
例１：
免疫刺激部分を含有するオリゴヌクレオチドベース化合物の合成
本発明の化学的実体は、１μｍｏｌから０．１ｍＭのスケールで、自動化ＤＮＡ合成機（OligoPilot II, AKTA, (Amersham)および／またはExpedite 8909 (Applied Biosystem)）を用いて、図１および２に概説したリニア合成またはパラレル合成手順にしたがって合成した。
【００９３】
５’−ＤＭＴ ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホロアミダイトは、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ ７−デアザｄＧおよびａｒａＧホスホロアミダイトはChemgenes（Wilmington, MA）から得た。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカー固体支持体はChemgenesから得た。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトはGlen Research（Sterlin, VA）から得、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイトはPromega（Obispo, CA）から得た。本発明の全ての化合物は、ホスホロチオアート骨格修飾であった。
【００９４】
全てのヌクレオシドホスホラミダイトは３１Ｐおよび１Ｈ ＮＭＲスペクトルで特定した。修飾ヌクレオシドは、供給者によって推奨された通常のカップリングサイクルを用いて特定の部位に組込まれた。合成の後、化合物を濃水酸化アンモニウムを用いて脱保護および逆相ＨＰＬＣによって精製、脱トリチル化、続いて透析した。ナトリウム塩の形態としての精製化合物を、使用の前に凍結乾燥した。純度はＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって試験した。エンドトキシンレベルをＬＡＬ試験によって決定し、１．０ＥＵ／ｍｇであった。
【００９５】
例２：
細胞培養条件および試薬
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ細胞（Invivogen, San Diego, CA）を４８ウェルプレート中の２５０μｌ／ウェルの１０％加熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。８０％コンフルエンス時点で、培養物を、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ）レポータープラスミド（ｐＮｉｆｔｙ２−Ｓｅａｐ）（Invivogen）４００ｎｇ／ｍｌで、４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下、培養培地中で一時的にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、血清フリーの培地中で個別に希釈し、室温で５分インキュベートした。インキュベートの後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含有するＤＮＡ／リポフェクタミン混合物２５μｌのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間継続した。
【００９６】
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞中の、表Ｉからの代表的な化合物によるサイトカイン誘導
トランスフェクション後、培地を新鮮な培養培地と取り替え、表Ｉからの代表的な化合物を、０、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加し、培養を１８時間継続した。化合物処理の最後に、ＮＦ−κＢのレベルを、製造者のプロトコル（Invitrogen）にしたがってＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。簡潔には、３０μｌの培養上清をを各処置物から採取し、ｐ−ニトロフィニルホスフェート基質とともにインキュベートし、発生した黄色を４０５ｎｍでプレートリーダーで計測した（Putta MR et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8）。
【００９７】
例３：
表Ｉからの代表的な化合物による、ヒトＰＢＭＣ、ｐＤＣおよびマウス脾臓細胞におけるサイトカイン誘導
ヒトＰＢＭＣの単離
新しく収集した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離法（Histopaque-107, Sigma）により単離した。
【００９８】
ヒトｐＤＣの単離
ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣを、製造者の使用説明書にしたがってＢＤＣＡ４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いた陽性選択により単離した。
【００９９】
マウス脾臓細胞の単離
ヒトＰＢＭＣを、４８ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ヒトｐＤＣを、９６ウェルディシュに１×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）中に溶解した表Ｉの例示の化合物を、細胞培養物に、０、０．１、０．３、１．０、３．０または１０μｇ／ｍｌ加えた。細胞を次に３７℃で２４時間インキュベーションし、上清をLuminex Multiplex用またはＥＬＩＳＡアッセイ用に収集した。ある実験においては、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２のレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
【０１００】
サイトカインLuminex Multiplex
ある実験においては、培養物上清中のＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０のレベルを、Luminex Multiplexアッセイにより測定した；これは、Luminex 100装置上でBiosource製ヒトマルチプレクスサイトカインアッセイキットを用いて実施し、データをApplied Cytometry Systems（Sacramento, CA）が供給するStarStationソフトウェアを用いて解析した。
【０１０１】
ヒト免疫細胞の活性化
ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、５０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストまたはコントロールとともに２４時間培養した。細胞を蛍光物質抱合Ａｂｓ（ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６）で染色し、データをFC500 MPLサイトメーターで採取した。ＣＤ１２３＋細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ８６平均蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて分析し、ＰＢＳコントロールに対する変化倍率として表現した。
【０１０２】
ヒト骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）を新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、５０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストまたはコントロールとともに２４時間培養した。細胞を蛍光物質抱合Ａｂｓ（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ４０）で染色し、データをFC500 MPLサイトメーターで採取した。ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ４０平均蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて分析し、ＰＢＳコントロールに対する変化倍率として表現した。
【０１０３】
例４：
表Ｉからの代表的な化合物の存在下でのヒトＢ細胞増殖アッセイ
ヒトＢ細胞を、ＰＢＭＣから、製造業者の指示に従ってCD19 Cell Isolation Kit（Mitenyi Biotec, Auburn, CA）を用いた陽性選択により単離した。
アッセイに用いた培養培地は、１．５ｍＭのグルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物および１０％の熱非活性化ウシ胎仔血清からなる。
全体で１ｍｌ当たり０．５×１０６のＢ細胞（すなわち、１×１０５／２００μｌ／ウェル）を、９６ウェルの平底プレートで、表Ｉからの代表的な化合物の異なる濃度で、トリプリケートで、全６８時間刺激した。６８時間後、細胞を、１ウェル当たり、２０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（血清なし）中の０．７５μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ；Perkin Elmer Life Sciences）でパルスし、６〜８時間後に収穫した。次にプレートを細胞収穫器により収穫し、放射性混入物を標準の液体シンチレーション技術により決定した。いくつかのケースでは、対応する［３Ｈ］−Ｔ（ｃｐｍ）を増殖指数に変換し、これを用いて報告した。
【０１０４】
例５：
ＴＬＲ９アゴニスト化合物で処置されたマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス、５〜６週齢、をTaconic Farms, Germantown, NYから得、Idera PharmaceuticalのＩＡＣＵＣ認可動物プロトコルにしたがって維持した。マウス（ｎ＝３）に、表Ｉからのそれぞれの免疫調節化合物０．２５または１．０ｍｇ／ｋｇ（単一投与量）皮下注射（ｓ．ｃ．）した。免疫調節化合物の投与２時間後に血清を後眼窩出血により採取し、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１ＭＩＧ、ＭＩＰ−１αおよびＴＮＦ−α濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡまたはLuminex multiplexアッセイによって決定した。結果を７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆに示し、新規化学組成物を含む免疫調節化合物のin vivo投与が、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを実証する。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準を含むすべての試薬は、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【０１０５】
等価物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
関連出願
本出願は、２００７年８月１日に出願された米国仮出願第６０／９５３，２５１号、２００７年１０月３０日に出願された米国仮出願第６０／９８３，６０１号、２００７年１１月１２日に出願された米国仮出願第６０／９８７，１５１号、および２００７年１２月２０日に出願された米国仮出願第６１／０１５，２９２号の利益を主張し、その全内容は、本明細書に参照として組込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）媒介性免疫応答の調節に有用な合成化学組成物に関する。特に、本発明は、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすトール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の概要
トール様受容体（ＴＬＲ）は多くの免疫系細胞上に存在し、先天性免疫応答に関与することが示されている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。脊椎動物において、このファミリーは、細菌、真菌、寄生生物、およびウィルスからの病原体関連分子パターンを認識することで知られる、ＴＬＲ１からＴＬＲ１１と呼ばれる１１のタンパク質からなる（Poltorak, a. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill, D.M., et al. (1999) Nature 401:811-815; Hayashi, F. et. al (2001) Nature 410:1099-1103; Zhang, D. et al. (2004) Science 303:1522-1526; Meier, A. et al. (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos, M.A. et al. (2001) J. Immunol. 167: 416-423; Hoebe, K. et al. (2003) Nature 424: 743-748; Lund, J. (2003) J. Exp. Med. 198:513-520; Heil, F. et al. (2004) Science 303:1526-1529; Diebold, S.S., et al. (2004) Science 303:1529-1531; Hornung, V. et al. (2004) J. Immunol. 173:5935-5943）。
【０００４】
ＴＬＲは、脊椎動物が、外来性分子を認識し、それに対する免疫応答を開始するための鍵となる手段であり、先天性免疫応答および適応免疫応答を結びつけるための手段を提供する（Akira, S et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。いくつかのＴＬＲは、細胞外病原体を検出し、それに対する応答を開始するために細胞表面に位置し、別のＴＬＲは、細胞内病原体を検出し、それに対する応答を開始するために細胞内に位置する。
【０００５】
ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡ中および合成オリゴヌクレオチド中の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（Hemmi, H. et al. (2000) Nature 408:740-745）。ＣｐＧ含有ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの別の修飾もまた、ＴＬＲ９を介した免疫応答の調節物質として働くためのその能力に影響し得る（例えばZhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al. (1996) Biochem Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1051-1054; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; and Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813参照）。ＴＬＲ９の天然に存在するアゴニストは、抗腫瘍活性（例えば腫瘍成長および血管新生）を産生し、効果的な抗癌応答（例えば抗白血病）をもたらすことが示されている（Smith, J.B. and Wickstrom, E. (1998) J.Natl. Cancer Inst. 90:1146-1154）。加えて、ＴＬＲ９アゴニストは他の知られた抗腫瘍化合物（例えばセツキシマブ、イリノテカン）と相乗的に働くことが示されている（Vincenzo, D., et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12(2):577-583）。
【０００６】
あるＴＬＲ９アゴニストは、コアＣｐＲジヌクレオチドを含む３’−３’結合ＤＮＡ構造を含み、ここでＲは修飾グアノシンである（米国特許第７，２７６，４８９号）。加えて、特定の化学的修飾は、免疫応答の特異な調節を起こす特定のオリゴヌクレオチドアナログの調製を可能にする。とくに、構造活性相関研究は、免疫応答の特定の調節を起こす合成モチーフおよび新規ＤＮＡベース化合物の同定を可能にし、これらの調節は非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドによって起こるものとは異なる（Kandimalla, E. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102:6925-6930. Kandimalla, E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. U S A 100:14303-14308; Cong, Y. et al. (2003) Biochem Biophys Res. Commun.310:1133-1139; Kandimalla, E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla, E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu, D. et al. (2003) Bioorg. Med. Chem.11:459-464; Bhagat, L. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun.300:853-861; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res.30:4460-4469; Yu, D. et al. (2002) J. Med. Chem.45:4540-4548. Yu, D. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun.297:83-90; Kandimalla. E. et al. (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu, D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:2803-2808; Yu, D. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; Kandimalla, E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; Yu, D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Putta, M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238）。
【０００７】
発明者らは、驚くべきことに、コアＣｐＲジヌクレオチドに隣接する配列、ヌクレオチド間の結合またはオリゴヌクレオチドに接続するリンカーを独自に修飾することが、in vitroおよびin vivoサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすＴＬＲ９の新規アゴニストを産生することを発見した。ＣｐＲ含有オリゴヌクレオチドに対するサイトカインおよびケモカイン応答を「カスタムチューン（custom-tune）」するこの能力は、様々な疾患状態を、疾患特異的およびさらには患者特異的なやり方で、予防および／または処置する能力を提供する。したがって、かかるカスタムチューンされた応答を提供する新たなオリゴヌクレオチドアナログ化合物に対する要求がある。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な概要
本発明は、アゴニストとしてのＴＬＲ９との相互作用を通じて個別に特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、特定のおよび固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それによりその特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。
【０００９】
本発明によるＴＬＲ９アゴニストは、様々な細胞型ならびに様々なin vitroおよびin vivo研究モデルにおいて免疫応答を誘導し、各アゴニストは特異な免疫応答プロファイルを提供する。本発明のＴＬＲ９アゴニストはまた、単独で、他の薬剤と組み合わせてもしくは共投与されるか、またはワクチンとして用いられる抗原のアジュバントとしてのどちらかにおいて、様々な疾患の予防および／または処置に有用である。このように、これらは免疫系の研究のための、かつ人間およびマウスなどの様々な動物種の免疫系の比較のための道具として有用である。
【００１０】
したがって、第１の側面において、本発明は、ＴＬＲ９のオリゴヌクレオチドベースのアゴニスト（「化合物」）を提供する。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドベースＴＬＲ９アゴニストおよびその薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤を提供する。
【００１２】
第３の側面において、本発明は、ワクチンを提供する。この側面のワクチンは、本発明の医薬製剤を含み、さらに抗原を含む。
【００１３】
第４の側面において、本発明は、個体においてＴＬＲ９媒介免疫応答を起こす方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを個体に投与することを含む。
【００１４】
第５の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを患者に投与することを含む。
【００１５】
第６の態様において、本発明は、疾患または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを患者に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の免疫調節化合物のリニア合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１７】
【図２】図２は、本発明の免疫調節化合物のパラレル合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル、ＣＥ＝シアノエチル。
【００１８】
【図３Ａ】図３Ａは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ａは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｂは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｃ】図３Ｃは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド１０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｃは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００１９】
【図３Ｄ】図３Ｄは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｄは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｅ】図３Ｅは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｅは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｆ】図３Ｆは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｆは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図３Ｇ】図３Ｇは、下記例２にしたがって培養、処置および分析されたＴＬＲ９発現ＨＥＫ２９３細胞における、ＮＦ−κＢ活性を描写したものである。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチド０（ＰＢＳ／培地）、０．１、０．３、１．０、３．０、または１０．０μｇ／ｍｌで１８時間刺激し、ＮＦ−κＢのレベルを、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。図３Ｇは、新規の塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２０】
【図４Ａ】図４Ａは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｂ】図４Ｂは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２１】
【図４Ｃ−４Ｈ】図４Ｃ〜４Ｈは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｃ〜４Ｈは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２２】
【図４Ｉ】図４Ｉは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｉは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｊ】図４Ｊは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｊは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｋ】図４Ｋは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｋは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｌ】図４Ｌは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｌは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｍ】図４Ｍは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｍは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｎ】図４Ｎは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、１．０、または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｎは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２３】
【図４Ｏ−４Ｔ】図４Ｏ〜４Ｔは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｏ〜４Ｔは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４Ｕ−４Ｚ】図４Ｕ〜４Ｚは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４Ｕ〜４Ｚは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図４ＡＡ−４ＦＦ】図４ＡＡ〜４ＦＦは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒトＰＢＭＣからのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ＰＢＭＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血から単離し、０（ＰＢＳ）、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図４ＡＡ〜４ＦＦは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２４】
【図５Ａ】図５Ａは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ｐＤＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図５Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、下記例３にしたがって単離、培養、処置および分析されたヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）からのサイトカインおよびケモカイン濃度を描写したものである。簡潔には、ｐＤＣを新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、１０μｇ／ｍｌ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに２４時間培養した。上清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。図５Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、特異なサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ａは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｂは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｃは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｄ】図６Ｄは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｄは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｅ】図６Ｅは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｅは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【図６Ｆ】図６Ｆは、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドによって誘導されるヒトＢ細胞増殖を描写したものである。ヒトＢ細胞は、下記例４にしたがって単離、培養、処置および分析された。簡潔には、ヒトＢ細胞を新たに採取した健康なヒト献血者のＰＢＭＣから単離し、異なる投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドとともに６８時間培養し、３Ｈ−チミジンで６〜８時間パルスした。３Ｈ−チミジンの取り込みを液体シンチレーションカウンターを用いて決定した。図６Ｆは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの投与が、塩基組成、固有の修飾、およびオリゴヌクレオチド投与量によって変化する、特異な細胞増殖プロファイルを起こすことを、より一般的に示している。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａは、下記例５にしたがって処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける血清サイトカインおよびケモカイン誘導を描写したものである。簡潔には、１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、Luminex multiplexアッセイにより、サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。
【００２７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。
【００２８】
【図７Ｃ】図７Ｃは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｃは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｄ】図７Ｄは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｄは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｅ】図７Ｅは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｅは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【図７Ｆ】図７Ｆは、下記例５にしたがって処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清サイトカイン誘導を描写したものである。簡潔には、０．２５または１ｍｇ／ｋｇ投与量の本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドをマウスに皮下注射した２時間後、血清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２レベルを分析した。図７Ｆは、新規な塩基、リンカーおよび／または固有の修飾を含む本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドのin vivo投与が、特異なＴＬＲ９活性化プロファイルを起こし、それが様々な疾患に応用されるであろうことをより一般的に示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、アゴニストとしてのＴＬＲ９との相互作用を通して独立して特異な免疫応答プロファイルを提供する、新規なオリゴヌクレオチドベース化合物を提供する。本発明のＴＬＲ９アゴニストは、固有の化学的修飾によって特徴付けられ、それにより特異な免疫応答活性化プロファイルを提供する。本明細書で参照される全ての公表文献は、当業者の技術レベルを反映し、その全体が参照として本明細書に組込まれる。それらの参考文献の教示と本明細書との間のあらゆる競合は、後者を支持することにより解決される。
【００３０】
本発明のＴＬＲ９アゴニストは、様々な細胞型および様々なin vivoおよびin vitro実験モデルにおいて免疫応答を誘導し、各々のアゴニストは特異な免疫応答プロファイルを提供する。このように、これらは免疫システムの研究のための、ならびにヒトおよびマウスなど、様々な動物種の免疫システムを比較するためのツールとして有用である。本発明のＴＬＲ９アゴニストはまた、単独で、他の薬剤と組み合わせてもしくは共投与されるか、またはワクチンとして用いられる抗原のアジュバントとしてのどちらかにおいて、様々な疾患の予防および／または処置にも有用である。
【００３１】
定義
「２’−置換ヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」という語は、一般的に、ペントースまたはアラビノース部分の２’位のヒドロキシル基が置換されて２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドを産生するヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、かかる置換は、１〜６の飽和または不飽和炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基によって、ハロゲン原子によって、または６〜１０の炭素原子を含むアリール基によってなされ、ここでかかるヒドロカルビルまたはアリール基は非置換であってよく、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシ、もしくはアミノ基によって置換されていてよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例は、限定されずに、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドを含む。
【００３２】
指向的に用いられた場合、「３’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から（オリゴヌクレオチドの３’位置へ）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’の領域または位置をいう。
【００３３】
指向的に用いられた場合、「５’」という語は一般的に、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置から（オリゴヌクレオチドの５’位置へ）の同じポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’の領域または位置をいう。
【００３４】
「約」という語は、一般的に、正確な数が重要でないことを意味する。したがって、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は重要ではなく、１または２少ないヌクレオシド残基の数または１から数個の追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記のそれぞれの態様の等価物であると意図される。
【００３５】
「気道炎症」という語は一般的に、限定することなく、ぜんそくを含むアレルゲンに起因する気道の炎症を含む。
【００３６】
「アレルゲン」という語は一般的に、抗原または分子、通常はタンパク質、の抗原部分をいい、これは対象への曝露によってアレルギー反応を引き起こす。典型的には、対象は、例えば膨疹および発赤試験（wheal and flare test）または当該技術分野において知られたあらゆる方法によって示されたように、アレルゲンに対してアレルギー性である。分子は、たとえ対象の小さなサブセットのみが分子への曝露によってアレルギー性（例えばＩｇＥ）免疫応答を示した場合でも、アレルゲンといわれる。
【００３７】
「アレルギー」という語は一般的に、限定することなく、食物アレルギー、呼吸器アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００３８】
「抗原」という語は一般的に、抗体またはＴ細胞受容体によって認識され、選択的に結合される基質のことをいう。抗原は、これに限定するものではないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含んでよい。抗原は天然または合成であってよく、一般的に抗原特異的な免疫応答を誘導する。
【００３９】
「自己免疫障害」という語は一般的に、「自分」の抗原が免疫系の攻撃を被る障害をいう。かかる語は、限定することなく、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、リウマチ性関節炎、敗血性ショック、全身性脱毛症、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、汗腺膿瘍、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性喘息（autoimmune asthma）、敗血性ショック、乾癬およびマラリアを含む。
【００４０】
「癌」という語は一般的に、限定することなく、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂に起因する、あらゆる悪性増殖または腫瘍をいう。癌はヒトおよび／または動物で起こり得、あらゆるおよび全ての組織において生じ得る。本発明によるがんを有する患者の処置は、異常なまたは制御されていない細胞増殖および／または分裂が影響を受けるように、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含んでよい。
【００４１】
「担体」という語は一般的に、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填材、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、油脂、脂質、脂質含有ベシクル、マイクロスフェア、リポソーム被包、または医薬製剤に用いられることが当業者に周知の他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性は、特定の用途についての投与ルートに依存するであろうことが理解されるだろう。これらの材料を含有する薬学的に許容可能な製剤の調製は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990などに記載されている。
【００４２】
「薬学的に許容可能な」または「生理学的に許容可能な」という語は一般的に、本発明の化合物の有効性を妨害せず、細胞、細胞カルチャー、組織または生物体などの生物システムに適合する材料のことをいう。好ましくは、生物システムは、脊椎動物などの生きている生物体である。
【００４３】
「共投与」または「共投与された」という語は一般的に、少なくとも２つの異なる基質を、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で投与することをいう。好ましくは、共投与は、少なくとも二つの異なる基質の同時投与をいう。
【００４４】
「薬学的に有効な量」という語は一般的に、有益な結果などの所望の生物学的効果に影響するのに十分な量をいう。したがって「薬学的に有効な量」は投与される背景に依存し得る。薬学的に有効な量は、１または２以上の予防的または治療的投与において投与されてよい。
【００４５】
「組み合わせて」という語は一般的に、患者の処置過程において、本発明の化合物ならびに、該化合物のＴＬＲ９アンタゴニスト効果を無効にしない、疾患および病態を処置するのに有用な別の剤を投与することを意味する。かかる投与は、同時投与、ならびに数秒から数日までの間隔で時間的に間隔が置かれた順番を含む、あらゆる順番で行われてよい。かかる組合せ治療はまた、単なる本発明の化合物および／または独立して他の剤の単一投与以上のものを含んでよい。本発明の化合物および他の剤の投与は、同一または異なるルートによってよい。
【００４６】
「個体」または「対象」という語は一般的に、ヒトなどの哺乳類をいう。哺乳類は一般的に、これに限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００４７】
「キナーゼ阻害剤」という語は一般的に、細胞において、リン酸化依存性細胞シグナリング経路および／または細胞増殖経路を拮抗または阻害する分子をいう。キナーゼ阻害剤は天然または合成であってよく、経口治療として投与される可能性を有する小分子を含んでよい。キナーゼ阻害剤は、標的キナーゼ分子の活性化を速やかにおよび特異的に阻害する能力を有する。プロテインキナーゼは、１つにはそれらが広範なシグナリングおよび増殖経路を制御し、多くの異なるタンパク質を含むことから、魅力的な薬剤標的である。このようにそれらは、癌、循環器疾患、炎症性障害、糖尿病、黄斑変性症、神経障害を含む、キナーゼシグナリングが関与する疾患の治療に大きな可能性を有する。キナーゼ阻害剤の例は、ソラフェニブ（Nexavar(R)）、スーテント(R)、ダサチニブ、ダサチニブＴＭ、ザクティマＴＭ、タイカーブＴＭおよびＳＴＩ５７１を含む。
【００４８】
「リニア合成」という語は一般的に、１つの末端のオリゴヌクレオチドから開始して、他端まで線形的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成、および／または組込まれた化学的修飾に関して）どちらかのモノマー単位をオリゴヌクレオチドに組込むことを可能にする。
【００４９】
「哺乳類」という語は明示的に、限定することなくヒトを含む、温血の、脊椎動物を含むことを意図する。
【００５０】
「修飾ヌクレオシド」という語は一般的に、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、またはそれらのあらゆる組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書に記載されたように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のため、修飾ヌクレオシド、ピリミジンまたはプリンアナログあるいは非天然のピリミジンまたはプリンは互換的に用いることができ、非天然の塩基および／または非天然の糖部分を含むヌクレオシドをいう。本発明の目的のため、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合、非天然であると考えられる。
【００５１】
「調節」または「調節的」という語は一般的に、応答における増加またはＴＬＲ−９媒介性応答における質的な相違などの変化をいう。
【００５２】
「リンカー」という語は一般的に、糖、塩基または骨格を介して、共有または非共有結合を通じてオリゴヌクレオチドに取り付け可能なあらゆる部分をいう。リンカーは２または３以上のヌクレオシドを取り付けるために用いることができ、またはオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端ヌクレオチドに取り付けることができる。本発明のある態様において、かかるリンカーは非ヌクレオチドリンカーである
【００５３】
「非ヌクレオチドリンカー」という語は一般的に、共有または非共有結合を通じてオリゴヌクレオチドに取り付け可能な、ヌクレオチド結合以外の化学的部分をいう。好ましくは、かかる非ヌクレオチドリンカーは、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さであり、シスまたはトランス配置のどちらかであってよい。
【００５４】
「ヌクレオチド結合」という語は一般的に、隣接するヌクレオシド間のリン原子および帯電した、または中性の基（例えばホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロチジオアート）からなる、２つのヌクレオチドをそれらの糖を介して（例えば３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）結びつける化学的結合をいう。
【００５５】
「オリゴヌクレオチドベース化合物」という語は、複数の結合したヌクレオシドユニットから形成されるポリヌクレオシドをいう。ヌクレオシドユニットはウィルス、細菌、細胞片、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの一部であってよく、またはそれらの一部にしてもよい。かかるオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む既存の核酸源から得ることもできるが、好ましくは合成法により産生される。好ましい態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多くの知られたヌクレオシド間結合によって、お互いに組み合わされることができる。かかるヌクレオシド間結合は、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホナート、アルキルホスホノチオアート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カルボナート、カルボアルコキシ、アセトアミダート、カルバマート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホロアミダート、架橋メチレンホスホナート、架橋ホスホロチオアート、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む。「オリゴヌクレオチドベース化合物」という語もまた、１または２以上の立体特異的ヌクレオシド間結合（例えば、（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオアート、アルキルホスホナート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書で使用された場合、「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は明示的に、結合がリン酸基を含もうと含まなかろうと、あらゆるかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオアートまたはホスホロジチオアート結合、あるいはそれらの組み合わせである。
【００５６】
用語「ペプチド」は、該ペプチドがハプテンであろうと無かろうと、例えば抗体産生またはサイトカイン活性など、生物学的応答に影響するのに十分な長さおよび組成を有するポリペプチドを一般的にいう。用語「ペプチド」は、修飾アミノ酸（天然または非天然であるかどうかにかかわらず）を含んでもよく、かかる修飾は、これに限定されるものではないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化（lipidization）およびメチル化を含む。
【００５７】
「ＴＬＲ９アゴニスト」という語は一般的に、ＴＬＲ９によって媒介される免疫刺激を増強、誘導または調節することができるオリゴヌクレオチドベースの化合物をいう。
【００５８】
「処置」という語は一般的に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせるかまたは改善することを含み得る、有益な、または所望の結果を得ることを意図したアプローチをいう。
【００５９】
本発明のあるＴＬＲ９アゴニストを、下の表Ｉに示す。この表において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストは全て、別に指示のある場合を除き、ホスホロチオアート（ＰＳ）結合を有する。しかし当業者は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳ結合とＰＯ結合の組み合わせも用いることができることを、認識する。別に指示のある場合を除き、全てのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。
【００６０】
【表１】
【００６１】
【表１−２】
【００６２】
【表１−３】
【００６３】
【表１−４】
【００６４】
【表１−５】
【００６５】
Ｇ１＝７−デアザ−ｄＧ、Ｇ２＝ＡｒａＧ、Ｇ３＝７−デアザＡｒａＧ、Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｕ＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ｄＵ＝Ｕ１＝２’−デオキシ−Ｕ、ｏ＝ホスホジエステル結合、ｐｏ＝５’−モノリン酸、ｐｓ＝５’ホスホロチオアート結合、ｐｍ＝メチルホスホナート（非イオン結合）、Ｌ＝１，５−ペンタンジオールリンカー、Ｌ＝１，２−ジデオキシリボース、Ｌ１＝トリエチレングリコールリンカー、Ｌ２＝テトラエチレングリコールリンカー、Ｌ３＝ヘキサエチレングリコールリンカー、Ｍ＝ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカー、ｍ＝ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−１，３，５−シクロヘキサントリオールリンカー、Ｘ＝グリセロールリンカー、Ｘ１＝１，２，４−ブタントリオールリンカー、Ｘ２＝１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸リンカー、Ｘ３＝イソブタントリオールリンカー、Ｙ＝１，３−プロパンジオールリンカー、Ｙ１＝１，２−エチレンジオールリンカー、Ｙ２＝１，４−ブタンジオールリンカー、Ｙ３＝１，５−ペンタンジオールリンカー、Ｚ＝１，３，５−ペンタントリオールリンカー。
【００６６】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例２の記載のようにして、ＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞において免疫刺激活性について試験した。下の図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄおよび３Ｅは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、投与後１８時間においてそれらのＴＬＲ９媒介性ＮＦ−κＢ活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＮＦ−κＢ活性化を増加または減少できることを示す。
【００６７】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトＰＢＭＣ中のＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２ＲおよびＭＣＰ−１アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図４Ａ〜４ＦＦに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトＰＢＭＣにおけるＴＬＲ９媒介性ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２Ｒおよび／またはＭＣＰ−１活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−２ＲおよびＭＣＰ−１活性化を増加または減少できることを示す。
【００６８】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例３の記載のようにして、ヒトｐＤＣ中のＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦαアッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図５Ａおよび５Ｂに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ヒトｐＤＣにおけるＴＬＲ９媒介性免疫活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＮＦα活性化を増加または減少できることを示す。
【００６９】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例４の記載のようにして、ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて免疫刺激活性について試験した。図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、ＴＬＲ９媒介性Ｂ細胞増殖活性を変化させること、および、この活性化プロファイルは、化学修飾に依存して用量依存性となり得ることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、Ｂ細胞増殖を調節できることを示す。
【００７０】
表Ｉからの例示のＴＬＲ９アゴニストを、例５の記載のようにして、Ｃ５７Ｂ１／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス中のin vivo免疫刺激活性について試験した。図７Ａ、７Ｂ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆに示す結果は、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾が、マウスモデルにおけるＴＬＲ９媒介性免疫活性化プロファイルを変化させることを実証する。より一般的には、これらのデータは、３’−３’結合オリゴヌクレオチドへの特異的化学修飾を用いて、in vivoサイトカインおよび／またはケモカイン濃度を変化させることができることを示し、これは多くの疾患における用途を見出すだろう。
【００７１】
上記したように、本発明は、第１の側面において、オリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９合成アゴニストを提供する。塩基、糖、リンケージ、またはリンカーに対する一定の化学修飾に基づき、ＴＬＲ９のアゴニストは、接触可能５’末端を保持しつつ、他のＴＬＲ９アゴニスト分子と会合しおよび／または重複した場合に、増加した安定性を有することができる。
【００７２】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、これに限定されるものではないが、表ＩＩに列挙されたものを含んでよい。
【表２】
【００７３】
【表２−２】
【００７４】
【表２−３】
【００７５】
【表２−４】
【００７６】
【表２−５】
【００７７】
【表２−６】
【００７８】
第２の側面において、本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニスト（「化合物」）および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【００７９】
活性化合物は、薬学的に許容し得る担体または希釈剤中に、処置される患者に重篤な毒性効果を及ぼすことなく、薬学的に有効な量で患者に送達されるのに十分な量で、含有される。薬学的に許容し得る誘導体の有効な用量範囲は、送達される親化合物の重量、または当業者に知られた他の方法に基づき算出することができる。誘導体それ自体が活性を示す場合は、有効用量は誘導体の重量を用いて、または当業者に既知の他の手段により、上記のようにして推定可能である。
【００８０】
第３の側面において、本発明はワクチンを提供する。この側面によるワクチンは、本発明の医薬製剤を含み、さらに抗原を含む。抗原とは、特異的免疫応答を誘発する分子である。かかる抗原は、限定することなく、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物および複合体またはこれらの任意のものの組合せを含む。あらゆるかかる抗原は、任意に免疫原性タンパク質またはペプチドに連結してもよく、その例は例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、またはあらゆる他の免疫原性担体タンパク質である。
【００８１】
本発明によるワクチンはさらに、あらゆる過剰な既知のアジュバントをさらに含んでよく、その例は限定なく、フロイント完全アジュバント、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバン、およびＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモド、Ｒ８４８、ＴＬＲアゴニストまたはこれらの組合せを含む。
【００８２】
第４の側面において、本発明は、個体においてＴＬＲ９媒介性免疫応答を引き起こすための方法を提供し、かかる方法は、個体に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。いくつかの態様において、個体は哺乳類である。好ましい態様において、化合物、医薬製剤またはワクチンは、免疫刺激を必要とする個体に投与される。
【００８３】
本発明のこの側面による方法において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンの投与は任意の好適な経路により行うことができ、これには、限定することなく、非経口、経口、腫瘍内、舌下、経皮、局所、経鼻、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、粘膜、膣、あるいは遺伝子銃、経皮パッチまたは点眼もしくは口腔洗浄の形態によるものを含む。化合物、医薬製剤またはワクチンの投与は、既知の手順を用いて、疾病の症状または代理マーカーを低減するのに有効な用量と期間で、行うことができる。全身投与の場合、化合物、医薬製剤またはワクチンは、本発明の化合物の約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与するのが好ましい。局所投与の場合、これよりはるかに低い濃度が有効であり得、またはるかに高い濃度が重篤な毒性効果なしに耐容され得る。好ましくは、本発明による化合物の総用量は１日約０．００１ｍｇ／患者〜１日約２００ｍｇ／体重１ｋｇまでの範囲である。本発明の１または２種以上の治療組成物の治療有効量を、同時に、または連続して、個体に対して１つの処置エピソードとして投与することが望ましい場合もある。
【００８４】
ある好ましい態様においては、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは他の剤と共投与または組み合わせて投与され、これらの剤は限定することなく、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、標的治療物（targeted therapies）、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫応答の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバントを含む。
【００８５】
本発明のこの側面による方法は、ヒトまたは動物の疾病の予防的または治療的処置に有用である。例えば、本方法は、小児および獣医学の用途に有用である。本方法はまた、免疫系のモデル研究にも有用である。
【００８６】
第５の側面において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、処置される疾患または障害は、癌、自己免疫障害、感染性疾患、気道炎症、炎症性障害、アレルギー、ぜん息、または病原体もしくはアレルゲンにより引き起こされる障害である。病原体は例えば、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００８７】
第６の側面において、本発明は、疾患または障害を予防するための方法を提供し、かかる方法は、患者に対し、本発明による化合物、医薬製剤またはワクチンを投与することを含む。種々の態様において、予防される疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、アレルギー、ぜん息、または病原体により引き起こされる疾患である。病原体は、限定することなく、細菌、寄生生物、真菌、ウィルス、ウィロイド、およびプリオンを含む。投与は、本発明の第４の側面において記載されたようにして実施する。
【００８８】
本発明のあらゆる方法において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは、疾病または状態を予防または処置するのに有用であり、かつ本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンの免疫刺激効果を無効にしないような他の剤と共投与または組み合わせて、投与することができる。本発明のあらゆる方法において、疾患または病態を予防または処置するのに有用な剤は、限定することなく、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、および／または免疫応答の特異性もしくは強さを増強するためのアジュバント、または、共刺激性分子であって、例えばサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチド、および修飾アミノ酸を含むペプチドなどを含む。例えば、癌の予防および／または処置において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンを、化学治療化合物またはモノクローナル抗体と共投与または組み合わせて投与できることが意図される。
【００８９】
好ましい化学治療剤は、限定することなく、ゲムシタビンメトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、Taxol（Ｒ）、フラジリン（fragyline）、メグラミン（Meglamine）ＧＬＡ、バルルビシン、カルムスチン（carmustaine）およびポリフェプロサン（poliferposan）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ １２−９５６６、ＲＡＳファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファメシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメトレキソール（Lometexol）、グラモレック（Glamolec）、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、Novantrone（Ｒ）／ミトロキサントロン（Mitroxantrone）、メタレット（Metaret）／スラミン、バスチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル（Incel）／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ ６９８、ＴＡ ２５１６／マリマスタット（Marmistat）、ＢＢ２５１６／マリマスタット、ＣＤＰ ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナール ＤＰ ２２０２、ＦＫ ３１７、メシル酸イマチニブ／Gleevec（Ｒ）、ピシバニール／ＯＫ−４３２、ＡＤ ３２／バルルビシン、Metastron（Ｒ）／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド、エバセット（Evacet）／リポソーム化ドキソルビシン、ユータキサン（Yewtaxan）／パクリタキセル（Placlitaxel）、Taxol（Ｒ）／パクリタキセル、ゼローダ（Xeload）／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス（Cyclopax）／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ １２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、UFTＴＭ（テガフール／ウラシル）、Ergamisol（Ｒ）／レバミゾール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵ増強剤、カンプト／レバミゾール、Camptosar（Ｒ）／イリノテカン、トミュデックス（Tumodex）／ラルチトレキセド（Ralitrexed）、Leustatin（Ｒ）／クラドリビン、パクセクス（Paxex）／パクリタキセル、Doxil（Ｒ）／リポソーム化ドキソルビシン、カエリクス（Caelyx）／リポソーム化ドキソルビシン、Fludara（Ｒ）／フルダラビン、ファルモルビシン（Pharmarubicin）／エピルビシン、DepoCyt（Ｒ）、ＺＤ１８３９、ＬＵ ７９５５３／ビス−ナフタルイミド、ＬＵ １０３７９３／ドラスタチン（Dolastain）、カエティクス（Caetyx）／リポソーム化ドキソルビシン、Gemzar（Ｒ）／ゲムシタビン、ＺＤ ０４７３／Anormed（Ｒ）、ＹＭ １１６、ヨウ素種（lodine seeds）、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド（Dexifosamide）、イフェックス（Ifes）／Mesnex（Ｒ）／イフォスファミド（Ifosamide）、Vumon（Ｒ）／テニポシド、Paraplatin（Ｒ）／カルボプラチン、プランチノール（Plantinol）／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ ９３３１、Taxotere（Ｒ）／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサンアナログ、ニトロソウレア、メルファラン（melphelan）およびシクロフォスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロランブシル（Chlorombucil）、塩酸シタラビン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、塩酸メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）、塩酸ミトキサントロン、オクトレオチド、プリカマイシン、塩酸プロカルバジン、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）、または硫酸ビンデシンを含む。好ましいモノクローナル抗体は、これに限定するものではないが、Panorex（Ｒ）（Glaxo-Welicome）、Rituxan（Ｒ）（IDEC/Genentech/Hoffman la Roche）、Mylotarg（Ｒ）（Wyeth）、Campath（Ｒ）（Millennium）、Zevalin（Ｒ）（IDEC and Schering AG）、Bexxar（Ｒ）（Corixa/GSK）、Erbitux（Ｒ）（Imclone/BMS）、Avastin（Ｒ）（Genentech) Herceptin（Ｒ）（Genentech/Hoffman la Roche）、Tarceva（Ｒ）（OSI Pharmaceuticals/Genentech)を含む。
【００９０】
代替的に、疾患または病態を予防または処置するのに有用な剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。これらの態様において、本発明の化合物、医薬製剤またはワクチンは、アジュバントとして様々に作用し得、および／または直接的な免疫調節効果を産生し得る。
【００９１】
以下の例は、本発明の一定の好ましい態様をさらに説明することを意図し、本発明の範囲を多少でも限定することを意図するものではない。
【００９２】
例１：
免疫刺激部分を含有するオリゴヌクレオチドベース化合物の合成
本発明の化学的実体は、１μｍｏｌから０．１ｍＭのスケールで、自動化ＤＮＡ合成機（OligoPilot II, AKTA, (Amersham)および／またはExpedite 8909 (Applied Biosystem)）を用いて、図１および２に概説したリニア合成またはパラレル合成手順にしたがって合成した。
【００９３】
５’−ＤＭＴ ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホロアミダイトは、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ ７−デアザｄＧおよびａｒａＧホスホロアミダイトはChemgenes（Wilmington, MA）から得た。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカー固体支持体はChemgenesから得た。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトはGlen Research（Sterlin, VA）から得、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドアミダイトはPromega（Obispo, CA）から得た。本発明の全ての化合物は、ホスホロチオアート骨格修飾であった。
【００９４】
全てのヌクレオシドホスホラミダイトは３１Ｐおよび１Ｈ ＮＭＲスペクトルで特定した。修飾ヌクレオシドは、供給者によって推奨された通常のカップリングサイクルを用いて特定の部位に組込まれた。合成の後、化合物を濃水酸化アンモニウムを用いて脱保護および逆相ＨＰＬＣによって精製、脱トリチル化、続いて透析した。ナトリウム塩の形態としての精製化合物を、使用の前に凍結乾燥した。純度はＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって試験した。エンドトキシンレベルをＬＡＬ試験によって決定し、１．０ＥＵ／ｍｇであった。
【００９５】
例２：
細胞培養条件および試薬
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３またはＨＥＫ２９３ＸＬ細胞（Invivogen, San Diego, CA）を４８ウェルプレート中の２５０μｌ／ウェルの１０％加熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。８０％コンフルエンス時点で、培養物を、ＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ）レポータープラスミド（ｐＮｉｆｔｙ２−Ｓｅａｐ）（Invivogen）４００ｎｇ／ｍｌで、４μｌ／ｍｌのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下、培養培地中で一時的にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびリポフェクタミンを、血清フリーの培地中で個別に希釈し、室温で５分インキュベートした。インキュベートの後、希釈ＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物を室温で２０分インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのリポフェクタミンを含有するＤＮＡ／リポフェクタミン混合物２５μｌのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間継続した。
【００９６】
マウスＴＬＲ９を発現するＨＥＫ２９３細胞中の、表Ｉからの代表的な化合物によるサイトカイン誘導
トランスフェクション後、培地を新鮮な培養培地と取り替え、表Ｉからの代表的な化合物を、０、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加し、培養を１８時間継続した。化合物処理の最後に、ＮＦ−κＢのレベルを、製造者のプロトコル（Invitrogen）にしたがってＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤由来アルカリホスファターゼ）アッセイを用いて決定した。簡潔には、３０μｌの培養上清をを各処置物から採取し、ｐ−ニトロフィニルホスフェート基質とともにインキュベートし、発生した黄色を４０５ｎｍでプレートリーダーで計測した（Putta MR et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8）。
【００９７】
例３：
表Ｉからの代表的な化合物による、ヒトＰＢＭＣ、ｐＤＣおよびマウス脾臓細胞におけるサイトカイン誘導
ヒトＰＢＭＣの単離
新しく収集した健康なボランティアの血液（CBR Laboratories, Boston, MA）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離法（Histopaque-107, Sigma）により単離した。
【００９８】
ヒトｐＤＣの単離
ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣを、製造者の使用説明書にしたがってＢＤＣＡ４細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を用いた陽性選択により単離した。
【００９９】
マウス脾臓細胞の単離
ヒトＰＢＭＣを、４８ウェルプレートに５×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ヒトｐＤＣを、９６ウェルディシュに１×１０６細胞／ｍｌでプレートした。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）中に溶解した表Ｉの例示の化合物を、細胞培養物に、０、０．１、０．３、１．０、３．０または１０μｇ／ｍｌ加えた。細胞を次に３７℃で２４時間インキュベーションし、上清をLuminex Multiplex用またはＥＬＩＳＡアッセイ用に収集した。ある実験においては、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２のレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標準を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
【０１００】
サイトカインLuminex Multiplex
ある実験においては、培養物上清中のＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１２ｐ４０ｐ７０のレベルを、Luminex Multiplexアッセイにより測定した；これは、Luminex 100装置上でBiosource製ヒトマルチプレクスサイトカインアッセイキットを用いて実施し、データをApplied Cytometry Systems（Sacramento, CA）が供給するStarStationソフトウェアを用いて解析した。
【０１０１】
ヒト免疫細胞の活性化
ヒト形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、５０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストまたはコントロールとともに２４時間培養した。細胞を蛍光物質抱合Ａｂｓ（ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６）で染色し、データをFC500 MPLサイトメーターで採取した。ＣＤ１２３＋細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ８６平均蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて分析し、ＰＢＳコントロールに対する変化倍率として表現した。
【０１０２】
ヒト骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）を新たに採取した健康なヒト献血者の血液ＰＢＭＣから単離し、５０μｇ／ｍｌのＴＬＲ９アゴニストまたはコントロールとともに２４時間培養した。細胞を蛍光物質抱合Ａｂｓ（ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ４０）で染色し、データをFC500 MPLサイトメーターで採取した。ＣＤ１１ｃ＋細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ４０平均蛍光強度を、FlowJoソフトウェアを用いて分析し、ＰＢＳコントロールに対する変化倍率として表現した。
【０１０３】
例４：
表Ｉからの代表的な化合物の存在下でのヒトＢ細胞増殖アッセイ
ヒトＢ細胞を、ＰＢＭＣから、製造業者の指示に従ってCD19 Cell Isolation Kit（Mitenyi Biotec, Auburn, CA）を用いた陽性選択により単離した。
アッセイに用いた培養培地は、１．５ｍＭのグルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン混合物および１０％の熱非活性化ウシ胎仔血清からなる。
全体で１ｍｌ当たり０．５×１０６のＢ細胞（すなわち、１×１０５／２００μｌ／ウェル）を、９６ウェルの平底プレートで、表Ｉからの代表的な化合物の異なる濃度で、トリプリケートで、全６８時間刺激した。６８時間後、細胞を、１ウェル当たり、２０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（血清なし）中の０．７５μＣｉの［３Ｈ］−チミジン（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ；Perkin Elmer Life Sciences）でパルスし、６〜８時間後に収穫した。次にプレートを細胞収穫器により収穫し、放射性混入物を標準の液体シンチレーション技術により決定した。いくつかのケースでは、対応する［３Ｈ］−Ｔ（ｃｐｍ）を増殖指数に変換し、これを用いて報告した。
【０１０４】
例５：
ＴＬＲ９アゴニスト化合物で処置されたマウスモデルにおけるin vivoサイトカイン分泌
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウス、５〜６週齢、をTaconic Farms, Germantown, NYから得、Idera PharmaceuticalのＩＡＣＵＣ認可動物プロトコルにしたがって維持した。マウス（ｎ＝３）に、表Ｉからのそれぞれの免疫調節化合物０．２５または１．０ｍｇ／ｋｇ（単一投与量）皮下注射（ｓ．ｃ．）した。免疫調節化合物の投与２時間後に血清を後眼窩出血により採取し、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ１ＭＩＧ、ＭＩＰ−１αおよびＴＮＦ−α濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡまたはLuminex multiplexアッセイによって決定した。結果を７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅおよび７Ｆに示し、新規化学組成物を含む免疫調節化合物のin vivo投与が、固有のサイトカインおよびケモカインプロファイルを起こすことを実証する。サイトカインおよびケモカイン抗体および標準を含むすべての試薬は、PharMingen（San Diego, CA）から購入した。
【０１０５】
等価物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物番号１〜１６９から選択される、免疫調節化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫調節化合物および生理学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項３】
個体において免疫応答を起こす方法であって、該方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を治療的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、１または２以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を予防的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは個体中の病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、１または２以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１】
化合物番号１〜１６９から選択される、免疫調節化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の免疫調節化合物および生理学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項３】
個体において免疫応答を起こす方法であって、該方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を治療的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項５】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、１または２以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
免疫応答の調節が有益な疾患または障害を有する個体を予防的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に効果的な量の請求項１に記載の化合物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、ぜんそくまたは個体中の病原体もしくはアレルゲンに起因する疾患である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、１または２以上の化学療法化合物、標的治療剤、ワクチン、抗原、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、キナーゼ阻害剤、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激性分子またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ−４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図４Ｋ】
【図４Ｌ】
【図４Ｍ】
【図４Ｎ】
【図４０−４Ｔ】
【図４Ｕ−４Ｚ】
【図４ＡＡ−４ＦＦ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ−４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図４Ｋ】
【図４Ｌ】
【図４Ｍ】
【図４Ｎ】
【図４０−４Ｔ】
【図４Ｕ−４Ｚ】
【図４ＡＡ−４ＦＦ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【公表番号】特表２０１０−５３５２４２（Ｐ２０１０−５３５２４２Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０１８５（Ｐ２０１０−５２０１８５）
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８４３１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３１日（２００８．７．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７１７３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０１８４３１
【国際公開日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【出願人】（３９８０３２７１７）イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (38)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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