アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用な薬剤組成物
本発明は、（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチンおよび７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリンおよび４−メチル−７−アセチルオキシクマリンのクマリン誘導体類から選択した天然の化合物類を含む薬剤組成物に関する。前記組成物は、高度のアセチルコリンエステラーゼ阻害（ＡＣｈＥ）性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥ）として有用な薬剤組成物に関する。本発明は特に、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用な組成物調製のための（±）マメルメシン（Marmesin）、コラムビアネチン（Columbianetin）、ジヒドロキサンサイレチン（Dihydroxanthyletin）および置換クマリン誘導体類から選択した天然化合物類の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６、２２７９、２００３）（非特許文献１）は、慢性神経変性疾患であり、重篤な行動異常と認知機能喪失を見出す。アルツハイマー病は脳コリン作動性機能不全と関連しており、アミロイドβ−ペプチドプラーク類、神経線維タングルおよび基底前脳コリン作動性ニューロンの変性すなわち萎縮を特徴とする。前脳コリン作動性細胞喪失の結果アセチルコリン減少が起こり、そのことは、アルツハイマー病関連認知不全において重要な役割を果たしている。アルツハイマー病治療のための最も有効な手法のひとつは、アセチルコリンエステラーゼ阻害によってアセチルコリンレベルの増大を図ることである。
【０００３】
ＡＣｈＥ阻害によるアルツハイマー病治療のため、いくつかの手法が開発された。最も使用されるＡＣｈＥ阻害剤類はガランサミン（Galanthamine）、ドネペジル、リバスチグミン、タクリンであり、さらに、２Ｈ−３，４−テトラヒドロキナゾリン−２−オンおよび２Ｈ−３，４−テトラヒドロキナゾリン−２、４−ジオン（米国特許第５，５０４，０８８号、１９９６）（特許文献１）もまた、報告されている。
【０００４】
ピラノクマリン類、フロクマリン類および置換クマリン類は、下剤（Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．６６、６６、１９８９）（非特許文献２）、殺虫剤（Ｊｐｎ．Ａｐｐｌ．７ ９７３ １２、１９７７；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ９１、ｐ１５２７７１ｕ、１９７７）（非特許文献３、４）、抗菌剤（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ５６、１８３５ｂ，１９６２）（非特許文献５）、アンチフィーダント（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７、１４３５、１９８９）（非特許文献６）、抗潰瘍（Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ Ｖｏｌ６８、４１０、１９９７；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ Ｖｏｌ１２８、２６８２４２ｊ、１９９８）（非特許文献７、８）、抗癌（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｖｏｌ５７、５１８、１９９４）（非特許文献９）および抗ＨＩＶ（）（特許文献２、非特許文献１０）のように、生物活性を有する天然化合物類である。クマリン誘導体類もまた、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ−Ａ＆Ｂ）阻害性を示した（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４３、４７４７、２０００；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４４、３１９５、２００１；Ａｒｋｉｖｏｃ、２７２、２００４）（非特許文献１１〜１３）。
【０００５】
本発明は、天然起源の化合物類（±）マルメシン、コラムビアネチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３９（６）、１３４７、１９９５）（非特許文献１４）、ジヒドロキサンサイレチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３４（３）、８１９、１９９３）（非特許文献１５）、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリンおよび４−メチル−７−アセチルオキシクマリンのクマリン誘導体類に関し、インビトロおよびインビボにおいてＡＣｈＥに対して極めて高選択性である。これらの化合物類は、ＡＣｈＥの処理および防止において極めて効果的である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５０４，０８８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６３７，５８９号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６、２２７９、２００３
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．６６、６６、１９８９
【非特許文献３】Ｊｐｎ．Ａｐｐｌ．７ ９７３ １２、１９７７
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ９１、ｐ１５２７７１ｕ、１９７７
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ５６、１８３５ｂ，１９６２
【非特許文献６】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７、１４３５、１９８９
【非特許文献７】Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ Ｖｏｌ６８、４１０、１９９７
【非特許文献８】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ Ｖｏｌ１２８、２６８２４２ｊ、１９９８
【非特許文献９】Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｖｏｌ５７、５１８、１９９４
【非特許文献１０】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ１２７、１０４３２６ｔ、１９９７
【非特許文献１１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４３、４７４７、２０００
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４４、３１９５、２００１
【非特許文献１３】Ａｒｋｉｖｏｃ、２７２、２００４
【非特許文献１４】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３９（６）、１３４７、１９９５
【非特許文献１５】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３４（３）、８１９、１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用な薬剤組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のもうひとつの目的は、スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて標準的薬剤ドネペジルよりも百分率の高い記憶保持を示す組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の目的のひとつは、（±）マルメシンおよびコラムビアネチン調製のため天然起源化合物類を使用することである。
【００１０】
本発明のもうひとつの目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、ジヒドロキサンサイレチンを用いて提供することである。
【００１１】
さらに本発明の目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、化合物類７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンおよび４−メチル−７−アセチルオキシクマリン類を用いて提供することである。
【００１２】
さらに本発明の目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリン類から選択した化合物類を用いて、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、式１の化合物、アナログ類およびその薬学的に許容できる塩類の有効量を含み、薬学的に許容できる担体または希釈剤を適宜一緒に含む薬剤組成物を提供することであり、ここで、組成物の有効量とは、５０乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある。
【００１４】
【化１】
【００１５】
（i）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【００１６】
【化２】
【００１７】
（ii）式中、Ｒ１とＲ３は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ１はＨである；
【００１８】
【化３】
【００１９】
（iii）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【００２０】
【化４】
【００２１】
（vi）式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の値は、下記から構成される群から選択される。
１．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
２．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
３．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
４．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
５．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
６．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
７．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
８．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
９．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
１０．Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
１１．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
１２．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１３．Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１４．Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１５．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
１６．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１７．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１８．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【００２２】
本発明の態様において、一般式１の化合物は、さらに、（±）マルメシンを含む。
【００２３】
【化５】
【００２４】
本発明の態様において、一般式１の化合物は、さらに、コラムビアネチンを含む。
【００２５】
【化６】
【００２６】
本発明のもう一つの態様において、一般式１の化合物は、さらに、ジヒドロキサンサイレチンを含む。
【００２７】
【化７】
【００２８】
本発明のさらなるもう一つの態様において、一般式１の化合物は、さらに、セセリンを含む。
【００２９】
【化８】
【００３０】
本発明のさらなる態様において、一般式１の化合物は、さらに、クマリンアナログ類を含む。
【００３１】
【化９】
【００３２】
式中、
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ。
【００３３】
さらに本発明のもう一つの態様において、組成物調製に用いた化合物は、（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンから構成される群から選択される。
【００３４】
本発明の態様において、組成物調製に用いた化合物類は、天然起源であるかまたは合成することもできる。
【００３５】
本発明のさらなるもう一つの態様において、前記組成物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用である。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、前記組成物は、４９％までコリンエステラーゼを阻害する。
【００３７】
本発明のもう一つの態様において、前記組成物は、経口投与される。
【００３８】
従って、本発明は、アルツハイマー病および関連する慢性神経変性疾患類を治療する方法を提供し、前記組成物を必要とする対象に対して投与することを含み、前記組成物は、適宜薬学的に許容できる担体または希釈剤類とともに、式１の化合物、そのアナログ類および薬学的に許容できる塩類の有効量を含む。
【００３９】
本発明の態様において、前記組成物は、経口投与される。
【００４０】
本発明の別の態様において、前記組成物は、スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて標準的薬剤ドネペジルよりもより高い記憶保持百分率を示す。
【００４１】
本発明のさらに別の態様において、前記組成物は、インビトロでＡＣｈＥを阻害する（±）マルメシン、コロンビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−メトキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジヒドロキシクマリン、４−メチル−７，８−ジベンジルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジメトキシクマリン、４−メチル−７，８−ジアセチルオキシクマリンから構成される群から選択される化合物を含む。
【００４２】
本発明の態様において、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリンから構成される群から選択した化合物を含む組成物は、インビボでアセチルコリンエステラーゼを阻害する。
【発明の効果】
【００４３】
利点：
１．化合物類（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチンおよびクマリン誘導体類は、ＡＣｈＥ阻害剤類として有用である。
２．阻害百分率は、初期に報告された化合物類に比較して、大きい。
３．上述の化合物類は全て、天然起源から容易に抽出可能で、実験室で効率的に合成可能である。
４．クマリン誘導体類は、実験室で効率的に合成された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明をさらに下記の実施例で詳細に説明するが、これらは例示のために述べたものであり、いかなる意味でも本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、セセリンおよびクマリン誘導体類の調製：
合成（±）マルメシン、コラムビアネチンを、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）から調製した。７−ヒドロキシクマリンを２−クロロ−２−メチル−ブト−３−インとともに塩基の存在下縮合させ、プロパルギルエーテルを得た。得られたエーテルに触媒的水素添加を行い、アルケンを得た。クライゼン転位によりこのアルケンが、２種の異性体産物を付与した。７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリンをｍ−クロロ過安息香酸で酢酸エチル溶媒中酸化し、（±）マルメシンを得た。７−ヒドロキシ−８−プレニルクマリンを酢酸エチル溶媒中ｍ−クロロ過安息香酸で酸化し、コラムビアネチンを得た。７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリンをｍ−クロロ過安息香酸でクロロホルム溶媒中酸化し、ジヒドロキサンサイレチンを得た（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、１２４７、１９７１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、４９０１、１９７１）。
【００４６】
合成セセリンを、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）から調製した。７−ヒドロキシクマリンを２−クロロ−２−メチル−ブト−３−インとともに塩基の存在下縮合させ、プロパルギルエーテルを得た。プロパルギルエーテルを２００℃でＮ，Ｎ−ジメチルアニリンとともに加熱し、セセリンを得た。（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、１２４７、１９７１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、４９０１、１９７１）。
【００４７】
（実施例２）
（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、セセリンおよびクマリン誘導体のインビトロおよびインビボ評価のための実験操作：
アセチルコリンエステラーゼ阻害能：
単回受動的回避試験は、霊長類における学習記憶機能を評価するための実験的試験として広く用いられている。霊長類における受動的回避（インビボ）のスコポラミン誘発不全およびアセチルコリンエステラーゼ阻害（インビトロ）は、認知増強（抗痴呆）薬物としてのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の能力を予測するため広く用いられており、スクリーニング試験である。
【００４８】
受動的回避試験（インビボ）：
本研究は、１２時間の明暗サイクルで標準的室内条件下飼育した３−４月齢（体重２０−２５ｇ）の成熟雄性スイスマウスで実施した。食料および水は、自由に摂取させた。
【００４９】
このマウスを、Ｂｒｉｏｎｉが記載したような単回受動的回避試験に供した。
【００５０】
この受動的回避試験は、ソフトウェアプログラムＰＡＣＳ３０を付属したコンピュータ化シャトルボックス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）により調べた。このシャトルボックスは、２個のコンパートメントから構成されている。自動ドアを用いてこのコンパートメントを区切った。順化のために３０秒の探索時間を置いた後、動物を、２７０秒の試験に供した。各マウスを明コンパートメントに入れ、暗コンパートメントに移した時点で、フロアグリッドを介して電気ショック（０．５ｍＡで５秒）を与えた。明コンパートメントから暗コンパートメントへのマウスの移動を、移動潜伏時間（ＴＬＴ）として秒単位で記録した。ＴＬＴは、コントロールおよび処理群で記録し（第１回試験、習得）、その後、２４時間後に記録した（第２回試験、保持）。第１回の試験（習得）に比較して第２回試験（保持）におけるＴＬＴの増大は、学習および記憶良好（認知活性）のための基準として採用した。
【００５１】
スコポラミン誘発欠損（痴呆）：
ムスカリンアンタゴニストであるスコポラミンは、ヒトおよび実験動物で認知機能不全（痴呆）をもたらすことが公知であり、それを用いて受動的回避学習における欠損を作製した（第２回試験では、有意な増加なし）。第１回試験の５分前にスコポラミンを投与した。試験物質によるスコポラミン誘発欠損の反転すなわち第２回試験における有意な増加は、潜在的抗痴呆活性を示している。スコポラミンは、第１回試験の５分前に投与した。
【００５２】
薬物投与：
試験物質コラムビアネチンは、１００ｍ／ｋｇ（アカシアゴム中１％水性懸濁液）の投与量で３日間、投与した。処理動物は、第３回目の試験物質投与６０分後に第１回試験に供した。スコポラミンは、試験群で第１回試験の５分前に投与した。
【００５３】
コントロール群には、担体１ｍｌ／ｋｇ（アカシアゴム中１％水性懸濁液）を３日間経口投与した。コントロールマウス中、半分（ｎ＝５）には第１回試験の５分前にスコポラミンを投与し（コントロール−痴呆）、残りの半分は、受動的回避試験に供した（コントロール−訓練）。
【００５４】
コントロール群は、第１回試験に比較して第２回試験でＴＬＴの有意な増加を示し、そのことは、学習および記憶機能良好であることを示唆している。スコポラミン処理マウスは、第１回試験に比較して第２回試験でもＴＬＴの有意な増加を示さず、そのことは、学習および記憶機能の欠損を示唆している。７−アリルクマリン（ＡＰ２０ａｍ１２）、７−ベンジルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１３）、７−メトキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１４）、７−アセチルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１５）、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１６）、および４−メチル−７−アセチルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１９）処理で前処理した動物において、スコポラミン処理は、第１回試験に比較して第２回試験でＴＬＴの有意な増加によって示唆されたような記憶欠損を引き起こさなかった。これらの化合物類の中でも、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリンは、非常に効果的であった。スコポラミン誘発記憶欠損の予防は、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリンが抗痴呆活性に対して潜在力を有していることを示唆している。
【００５５】
ｐ値＜０．０５のレベルは、統計的有意差を示している。ｐ値の低下はより大きな有意差を意味し、第１回試験のＴＬＴが極めて顕著に増加したことを示唆している。
【００５６】
表：標準的薬物ドネペジルとクマリン化合物類の比較データ
【００５７】
【表１】
【００５８】
脳におけるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）アッセイ（インビトロ）
本研究は、成熟ＳＤ雄性ラット（２００−２５０ｇ）で実施した。ラットは、緩和なエーテル麻酔下で心臓を介して氷冷正常生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を潅流させ、脳から血液運搬コリンエステラーゼを減少させた。潅流後、全血を採取した。脳の１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを、速度９５００ｒｐｍでリン酸ナトリウム緩衝液とともに（３０ｍｍｏｌ／ｌｉｔ、ｐＨ７．０）３回、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５ホモジナイザー中で均質化して調製し、均質化実験の間、数秒の間隔を空けた。リン酸ナトリウム緩衝液は、１０％ホモジネートに必要な最終容量の半分の容量で用いた。
【００５９】
次に、１０％ホモジネートの最終容量とするために必要な容量の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（３０ｍｍｏｌ／ｌｉｔリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中１ｗ／ｖ％）を、氷上でこのホモジネートをゆっくりと撹拌しながら、添加する。このホモジネートを、固定角度ローター（８０Ｔｉ）を用いてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心（ＬＥ８０）中で１００，０００×ｇ、４℃で６０分間、遠心分離した。上清を集め４℃で保存した。この上清のアリコットを、１：１０の比で希釈し、このアッセイ用の酵素源として使用した。
【００６０】
酵素アッセイ：
ＡＣｈＥアッセイは、Ｅｌｌｍａｎらにより記載された方法に従い、実施した。酵素アッセイの動態プロフィールは、１５秒おきに４１２ｎｍにおいて分光分析で調べた。各サンプルのアッセイは二重に行い、各実験を３回行った。ＡＣｈＥの比活性は、タンパク質のμｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／ｍｇで示す。試験物質（ＤＭＳＯに溶解）は、ＡＣｈＥ活性動態プロフィールを得る前に、濃度１００μｇ／１ｍｌ反応混合物中で酵素源と３７℃において３０分間インキュベーションした。ＡＣｈＥ阻害活性は、コントロール値からの低下％変化に基づき計算した。
【００６１】
タンパク質アッセイ：
タンパク質は、改良ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により脳サンプル中で推定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を濃度１ｍｇ／ｍｌで標準として用いた。範囲０．０１−０．１ｍｇ／ｍｌで推定した。
【００６２】
結果：
ＡＣｈＥインビトロ阻害（２５−４９％）を示した化合物類は、（±）マルメシン、ジヒドロキサンサイレチン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−メトキシクマリンである。ＡＣｈＥインビトロ阻害（２０−２５％）を示した化合物類は、７−メトキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジベンジルオキシクマリンおよび４−メチル−７，８−ジアセチルオキシクマリンである。しかし、受動的回避試験（インビボ）では、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−メトキシクマリンが効果的であった。他のインビトロ活性化合物類がインビボ受動的回避試験において有効でなかったことは、吸収および代謝のような薬物動態因子によるのであろう。
【００６３】
統計分析
平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．）は、各群の脳サンプルの異なる領域中でＴＬＴおよびＡＣｈＥの比活性について計算した。２群のＡＣｈＥ活性とＴＬＴの有意差は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）検定の後、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により決定した。
【００６４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１ａはマウス受動的回避試験におけるスコポラミン誘発欠損に及ぼすＡＰ２０ａｍサンプル類（１００ｍｇ／Ｋｇ、経口×３日間）の効果であり、図１ｂはマウス受動的回避試験におけるスコポラミン誘発欠損に及ぼすＡＰ２０ａｍ１４、１５及び１６サンプル類（５０ｍｇ／Ｋｇ、経口×３日間）の効果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥ）として有用な薬剤組成物に関する。本発明は特に、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用な組成物調製のための（±）マメルメシン（Marmesin）、コラムビアネチン（Columbianetin）、ジヒドロキサンサイレチン（Dihydroxanthyletin）および置換クマリン誘導体類から選択した天然化合物類の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６、２２７９、２００３）（非特許文献１）は、慢性神経変性疾患であり、重篤な行動異常と認知機能喪失を見出す。アルツハイマー病は脳コリン作動性機能不全と関連しており、アミロイドβ−ペプチドプラーク類、神経線維タングルおよび基底前脳コリン作動性ニューロンの変性すなわち萎縮を特徴とする。前脳コリン作動性細胞喪失の結果アセチルコリン減少が起こり、そのことは、アルツハイマー病関連認知不全において重要な役割を果たしている。アルツハイマー病治療のための最も有効な手法のひとつは、アセチルコリンエステラーゼ阻害によってアセチルコリンレベルの増大を図ることである。
【０００３】
ＡＣｈＥ阻害によるアルツハイマー病治療のため、いくつかの手法が開発された。最も使用されるＡＣｈＥ阻害剤類はガランサミン（Galanthamine）、ドネペジル、リバスチグミン、タクリンであり、さらに、２Ｈ−３，４−テトラヒドロキナゾリン−２−オンおよび２Ｈ−３，４−テトラヒドロキナゾリン−２、４−ジオン（米国特許第５，５０４，０８８号、１９９６）（特許文献１）もまた、報告されている。
【０００４】
ピラノクマリン類、フロクマリン類および置換クマリン類は、下剤（Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．６６、６６、１９８９）（非特許文献２）、殺虫剤（Ｊｐｎ．Ａｐｐｌ．７ ９７３ １２、１９７７；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ９１、ｐ１５２７７１ｕ、１９７７）（非特許文献３、４）、抗菌剤（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ５６、１８３５ｂ，１９６２）（非特許文献５）、アンチフィーダント（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７、１４３５、１９８９）（非特許文献６）、抗潰瘍（Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ Ｖｏｌ６８、４１０、１９９７；Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ Ｖｏｌ１２８、２６８２４２ｊ、１９９８）（非特許文献７、８）、抗癌（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｖｏｌ５７、５１８、１９９４）（非特許文献９）および抗ＨＩＶ（）（特許文献２、非特許文献１０）のように、生物活性を有する天然化合物類である。クマリン誘導体類もまた、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ−Ａ＆Ｂ）阻害性を示した（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４３、４７４７、２０００；Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４４、３１９５、２００１；Ａｒｋｉｖｏｃ、２７２、２００４）（非特許文献１１〜１３）。
【０００５】
本発明は、天然起源の化合物類（±）マルメシン、コラムビアネチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３９（６）、１３４７、１９９５）（非特許文献１４）、ジヒドロキサンサイレチン（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３４（３）、８１９、１９９３）（非特許文献１５）、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリンおよび４−メチル−７−アセチルオキシクマリンのクマリン誘導体類に関し、インビトロおよびインビボにおいてＡＣｈＥに対して極めて高選択性である。これらの化合物類は、ＡＣｈＥの処理および防止において極めて効果的である。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５０４，０８８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６３７，５８９号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６、２２７９、２００３
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｎｄｉａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｖｏｌ．６６、６６、１９８９
【非特許文献３】Ｊｐｎ．Ａｐｐｌ．７ ９７３ １２、１９７７
【非特許文献４】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ９１、ｐ１５２７７１ｕ、１９７７
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ５６、１８３５ｂ，１９６２
【非特許文献６】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７、１４３５、１９８９
【非特許文献７】Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ Ｖｏｌ６８、４１０、１９９７
【非特許文献８】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ Ｖｏｌ１２８、２６８２４２ｊ、１９９８
【非特許文献９】Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｖｏｌ５７、５１８、１９９４
【非特許文献１０】Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．Ｖｏｌ１２７、１０４３２６ｔ、１９９７
【非特許文献１１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４３、４７４７、２０００
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ４４、３１９５、２００１
【非特許文献１３】Ａｒｋｉｖｏｃ、２７２、２００４
【非特許文献１４】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３９（６）、１３４７、１９９５
【非特許文献１５】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ３４（３）、８１９、１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用な薬剤組成物を提供することである。
【０００８】
本発明のもうひとつの目的は、スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて標準的薬剤ドネペジルよりも百分率の高い記憶保持を示す組成物を提供することである。
【０００９】
本発明の目的のひとつは、（±）マルメシンおよびコラムビアネチン調製のため天然起源化合物類を使用することである。
【００１０】
本発明のもうひとつの目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、ジヒドロキサンサイレチンを用いて提供することである。
【００１１】
さらに本発明の目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、化合物類７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンおよび４−メチル−７−アセチルオキシクマリン類を用いて提供することである。
【００１２】
さらに本発明の目的は、ＡＣｈＥ阻害剤として有用な組成物を、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリン類から選択した化合物類を用いて、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、式１の化合物、アナログ類およびその薬学的に許容できる塩類の有効量を含み、薬学的に許容できる担体または希釈剤を適宜一緒に含む薬剤組成物を提供することであり、ここで、組成物の有効量とは、５０乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある。
【００１４】
【化１】
【００１５】
（i）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【００１６】
【化２】
【００１７】
（ii）式中、Ｒ１とＲ３は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ１はＨである；
【００１８】
【化３】
【００１９】
（iii）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【００２０】
【化４】
【００２１】
（vi）式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の値は、下記から構成される群から選択される。
１．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
２．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
３．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
４．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
５．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
６．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
７．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
８．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
９．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
１０．Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
１１．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
１２．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１３．Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１４．Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１５．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
１６．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１７．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１８．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【００２２】
本発明の態様において、一般式１の化合物は、さらに、（±）マルメシンを含む。
【００２３】
【化５】
【００２４】
本発明の態様において、一般式１の化合物は、さらに、コラムビアネチンを含む。
【００２５】
【化６】
【００２６】
本発明のもう一つの態様において、一般式１の化合物は、さらに、ジヒドロキサンサイレチンを含む。
【００２７】
【化７】
【００２８】
本発明のさらなるもう一つの態様において、一般式１の化合物は、さらに、セセリンを含む。
【００２９】
【化８】
【００３０】
本発明のさらなる態様において、一般式１の化合物は、さらに、クマリンアナログ類を含む。
【００３１】
【化９】
【００３２】
式中、
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ。
【００３３】
さらに本発明のもう一つの態様において、組成物調製に用いた化合物は、（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンから構成される群から選択される。
【００３４】
本発明の態様において、組成物調製に用いた化合物類は、天然起源であるかまたは合成することもできる。
【００３５】
本発明のさらなるもう一つの態様において、前記組成物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤として有用である。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、前記組成物は、４９％までコリンエステラーゼを阻害する。
【００３７】
本発明のもう一つの態様において、前記組成物は、経口投与される。
【００３８】
従って、本発明は、アルツハイマー病および関連する慢性神経変性疾患類を治療する方法を提供し、前記組成物を必要とする対象に対して投与することを含み、前記組成物は、適宜薬学的に許容できる担体または希釈剤類とともに、式１の化合物、そのアナログ類および薬学的に許容できる塩類の有効量を含む。
【００３９】
本発明の態様において、前記組成物は、経口投与される。
【００４０】
本発明の別の態様において、前記組成物は、スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて標準的薬剤ドネペジルよりもより高い記憶保持百分率を示す。
【００４１】
本発明のさらに別の態様において、前記組成物は、インビトロでＡＣｈＥを阻害する（±）マルメシン、コロンビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−メトキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジヒドロキシクマリン、４−メチル−７，８−ジベンジルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジメトキシクマリン、４−メチル−７，８−ジアセチルオキシクマリンから構成される群から選択される化合物を含む。
【００４２】
本発明の態様において、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリンから構成される群から選択した化合物を含む組成物は、インビボでアセチルコリンエステラーゼを阻害する。
【発明の効果】
【００４３】
利点：
１．化合物類（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチンおよびクマリン誘導体類は、ＡＣｈＥ阻害剤類として有用である。
２．阻害百分率は、初期に報告された化合物類に比較して、大きい。
３．上述の化合物類は全て、天然起源から容易に抽出可能で、実験室で効率的に合成可能である。
４．クマリン誘導体類は、実験室で効率的に合成された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明をさらに下記の実施例で詳細に説明するが、これらは例示のために述べたものであり、いかなる意味でも本発明を限定することを意図していない。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、セセリンおよびクマリン誘導体類の調製：
合成（±）マルメシン、コラムビアネチンを、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）から調製した。７−ヒドロキシクマリンを２−クロロ−２−メチル−ブト−３−インとともに塩基の存在下縮合させ、プロパルギルエーテルを得た。得られたエーテルに触媒的水素添加を行い、アルケンを得た。クライゼン転位によりこのアルケンが、２種の異性体産物を付与した。７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリンをｍ−クロロ過安息香酸で酢酸エチル溶媒中酸化し、（±）マルメシンを得た。７−ヒドロキシ−８−プレニルクマリンを酢酸エチル溶媒中ｍ−クロロ過安息香酸で酸化し、コラムビアネチンを得た。７−ヒドロキシ−６−プレニルクマリンをｍ−クロロ過安息香酸でクロロホルム溶媒中酸化し、ジヒドロキサンサイレチンを得た（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、１２４７、１９７１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、４９０１、１９７１）。
【００４６】
合成セセリンを、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）から調製した。７−ヒドロキシクマリンを２−クロロ−２−メチル−ブト−３−インとともに塩基の存在下縮合させ、プロパルギルエーテルを得た。プロパルギルエーテルを２００℃でＮ，Ｎ−ジメチルアニリンとともに加熱し、セセリンを得た。（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、１２４７、１９７１；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、２７、４９０１、１９７１）。
【００４７】
（実施例２）
（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、セセリンおよびクマリン誘導体のインビトロおよびインビボ評価のための実験操作：
アセチルコリンエステラーゼ阻害能：
単回受動的回避試験は、霊長類における学習記憶機能を評価するための実験的試験として広く用いられている。霊長類における受動的回避（インビボ）のスコポラミン誘発不全およびアセチルコリンエステラーゼ阻害（インビトロ）は、認知増強（抗痴呆）薬物としてのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の能力を予測するため広く用いられており、スクリーニング試験である。
【００４８】
受動的回避試験（インビボ）：
本研究は、１２時間の明暗サイクルで標準的室内条件下飼育した３−４月齢（体重２０−２５ｇ）の成熟雄性スイスマウスで実施した。食料および水は、自由に摂取させた。
【００４９】
このマウスを、Ｂｒｉｏｎｉが記載したような単回受動的回避試験に供した。
【００５０】
この受動的回避試験は、ソフトウェアプログラムＰＡＣＳ３０を付属したコンピュータ化シャトルボックス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）により調べた。このシャトルボックスは、２個のコンパートメントから構成されている。自動ドアを用いてこのコンパートメントを区切った。順化のために３０秒の探索時間を置いた後、動物を、２７０秒の試験に供した。各マウスを明コンパートメントに入れ、暗コンパートメントに移した時点で、フロアグリッドを介して電気ショック（０．５ｍＡで５秒）を与えた。明コンパートメントから暗コンパートメントへのマウスの移動を、移動潜伏時間（ＴＬＴ）として秒単位で記録した。ＴＬＴは、コントロールおよび処理群で記録し（第１回試験、習得）、その後、２４時間後に記録した（第２回試験、保持）。第１回の試験（習得）に比較して第２回試験（保持）におけるＴＬＴの増大は、学習および記憶良好（認知活性）のための基準として採用した。
【００５１】
スコポラミン誘発欠損（痴呆）：
ムスカリンアンタゴニストであるスコポラミンは、ヒトおよび実験動物で認知機能不全（痴呆）をもたらすことが公知であり、それを用いて受動的回避学習における欠損を作製した（第２回試験では、有意な増加なし）。第１回試験の５分前にスコポラミンを投与した。試験物質によるスコポラミン誘発欠損の反転すなわち第２回試験における有意な増加は、潜在的抗痴呆活性を示している。スコポラミンは、第１回試験の５分前に投与した。
【００５２】
薬物投与：
試験物質コラムビアネチンは、１００ｍ／ｋｇ（アカシアゴム中１％水性懸濁液）の投与量で３日間、投与した。処理動物は、第３回目の試験物質投与６０分後に第１回試験に供した。スコポラミンは、試験群で第１回試験の５分前に投与した。
【００５３】
コントロール群には、担体１ｍｌ／ｋｇ（アカシアゴム中１％水性懸濁液）を３日間経口投与した。コントロールマウス中、半分（ｎ＝５）には第１回試験の５分前にスコポラミンを投与し（コントロール−痴呆）、残りの半分は、受動的回避試験に供した（コントロール−訓練）。
【００５４】
コントロール群は、第１回試験に比較して第２回試験でＴＬＴの有意な増加を示し、そのことは、学習および記憶機能良好であることを示唆している。スコポラミン処理マウスは、第１回試験に比較して第２回試験でもＴＬＴの有意な増加を示さず、そのことは、学習および記憶機能の欠損を示唆している。７−アリルクマリン（ＡＰ２０ａｍ１２）、７−ベンジルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１３）、７−メトキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１４）、７−アセチルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１５）、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１６）、および４−メチル−７−アセチルオキシクマリン（ＡＰ２０ａｍ１９）処理で前処理した動物において、スコポラミン処理は、第１回試験に比較して第２回試験でＴＬＴの有意な増加によって示唆されたような記憶欠損を引き起こさなかった。これらの化合物類の中でも、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリンは、非常に効果的であった。スコポラミン誘発記憶欠損の予防は、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−ヒドロキシクマリンが抗痴呆活性に対して潜在力を有していることを示唆している。
【００５５】
ｐ値＜０．０５のレベルは、統計的有意差を示している。ｐ値の低下はより大きな有意差を意味し、第１回試験のＴＬＴが極めて顕著に増加したことを示唆している。
【００５６】
表：標準的薬物ドネペジルとクマリン化合物類の比較データ
【００５７】
【表１】
【００５８】
脳におけるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）アッセイ（インビトロ）
本研究は、成熟ＳＤ雄性ラット（２００−２５０ｇ）で実施した。ラットは、緩和なエーテル麻酔下で心臓を介して氷冷正常生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を潅流させ、脳から血液運搬コリンエステラーゼを減少させた。潅流後、全血を採取した。脳の１０％（ｗ／ｖ）ホモジネートを、速度９５００ｒｐｍでリン酸ナトリウム緩衝液とともに（３０ｍｍｏｌ／ｌｉｔ、ｐＨ７．０）３回、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５ホモジナイザー中で均質化して調製し、均質化実験の間、数秒の間隔を空けた。リン酸ナトリウム緩衝液は、１０％ホモジネートに必要な最終容量の半分の容量で用いた。
【００５９】
次に、１０％ホモジネートの最終容量とするために必要な容量の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（３０ｍｍｏｌ／ｌｉｔリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中１ｗ／ｖ％）を、氷上でこのホモジネートをゆっくりと撹拌しながら、添加する。このホモジネートを、固定角度ローター（８０Ｔｉ）を用いてベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心（ＬＥ８０）中で１００，０００×ｇ、４℃で６０分間、遠心分離した。上清を集め４℃で保存した。この上清のアリコットを、１：１０の比で希釈し、このアッセイ用の酵素源として使用した。
【００６０】
酵素アッセイ：
ＡＣｈＥアッセイは、Ｅｌｌｍａｎらにより記載された方法に従い、実施した。酵素アッセイの動態プロフィールは、１５秒おきに４１２ｎｍにおいて分光分析で調べた。各サンプルのアッセイは二重に行い、各実験を３回行った。ＡＣｈＥの比活性は、タンパク質のμｍｏｌｅｓ／ｍｉｎ／ｍｇで示す。試験物質（ＤＭＳＯに溶解）は、ＡＣｈＥ活性動態プロフィールを得る前に、濃度１００μｇ／１ｍｌ反応混合物中で酵素源と３７℃において３０分間インキュベーションした。ＡＣｈＥ阻害活性は、コントロール値からの低下％変化に基づき計算した。
【００６１】
タンパク質アッセイ：
タンパク質は、改良ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により脳サンプル中で推定した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を濃度１ｍｇ／ｍｌで標準として用いた。範囲０．０１−０．１ｍｇ／ｍｌで推定した。
【００６２】
結果：
ＡＣｈＥインビトロ阻害（２５−４９％）を示した化合物類は、（±）マルメシン、ジヒドロキサンサイレチン、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−メトキシクマリンである。ＡＣｈＥインビトロ阻害（２０−２５％）を示した化合物類は、７−メトキシクマリン、４−メチル−７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７，８−ジベンジルオキシクマリンおよび４−メチル−７，８−ジアセチルオキシクマリンである。しかし、受動的回避試験（インビボ）では、７−アセチルオキシクマリンおよび４−メチル−７−メトキシクマリンが効果的であった。他のインビトロ活性化合物類がインビボ受動的回避試験において有効でなかったことは、吸収および代謝のような薬物動態因子によるのであろう。
【００６３】
統計分析
平均値および平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．）は、各群の脳サンプルの異なる領域中でＴＬＴおよびＡＣｈＥの比活性について計算した。２群のＡＣｈＥ活性とＴＬＴの有意差は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）検定の後、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により決定した。
【００６４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１ａはマウス受動的回避試験におけるスコポラミン誘発欠損に及ぼすＡＰ２０ａｍサンプル類（１００ｍｇ／Ｋｇ、経口×３日間）の効果であり、図１ｂはマウス受動的回避試験におけるスコポラミン誘発欠損に及ぼすＡＰ２０ａｍ１４、１５及び１６サンプル類（５０ｍｇ／Ｋｇ、経口×３日間）の効果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の化合物、アナログ類およびその薬学的に許容できる塩類の有効量を含み、薬学的に許容できる担体または希釈剤を適宜一緒に含む薬剤組成物であって、組成物の有効量が、５０乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある薬剤組成物。
【化１】
（i）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【化２】
（ii）式中、Ｒ１とＲ３は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ１はＨである；
【化３】
（iii）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【化４】
（iv）式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の値は、下記から構成される群から選択される。
１．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
２．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
３．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
４．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
５．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
６．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
７．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
８．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
９．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
１０．Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
１１．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
１２．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１３．Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１４．Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１５．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
１６．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１７．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１８．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【請求項２】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化５】
【請求項３】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化６】
【請求項４】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化７】
【請求項５】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化８】
式中、Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【請求項６】
組成物調製に使用した化合物が、（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンから選択される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
組成物調製に使用した化合物類が、天然起源であるかまたは合成できる請求項１記載の組成物。
【請求項８】
スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて、標準的薬剤であるドネペジルよりも大きい記憶保持百分率を示す請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、コリンエステラーゼを４９％まで阻害する請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、アカシアゴム、メチルセルロースから選択した担体を用いて経口経路で投与される請求項に記載の組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病および関連する慢性神経変性疾患の治療に有用な医薬の調製における請求項１記載の組成物の用途。
【請求項１２】
前記組成物が経口経路で投与される請求項１２記載の用途。
【請求項１】
式１の化合物、アナログ類およびその薬学的に許容できる塩類の有効量を含み、薬学的に許容できる担体または希釈剤を適宜一緒に含む薬剤組成物であって、組成物の有効量が、５０乃至１００ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲にある薬剤組成物。
【化１】
（i）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【化２】
（ii）式中、Ｒ１とＲ３は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ１はＨである；
【化３】
（iii）式中、Ｒ１とＲ２は下記の部分で互いに結合しており、一緒になって融合系を形成し、かつ、Ｒ３はＨである；
【化４】
（iv）式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の値は、下記から構成される群から選択される。
１．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
２．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
３．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
４．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
５．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
６．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
７．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
８．Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
９．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
１０．Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
１１．Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
１２．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１３．Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１４．Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
１５．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
１６．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１７．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
１８．Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【請求項２】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化５】
【請求項３】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化６】
【請求項４】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化７】
【請求項５】
一般式１の化合物が、さらに下記を含む請求項１記載の組成物。
【化８】
式中、Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ＯＨ
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝プレニル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アリル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルキン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝２，２−ジメチルアルケン
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝ベンジル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝アセチル
Ｒ＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝メチル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ１＝Ｒ２＝プレニル
Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ；Ｒ３＝プレニル
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝メチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝Ｒ１＝アセチル；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＯＨ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝ベンジル、Ｒ２＝ベンジルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝メチル、Ｒ２＝メチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
Ｒ＝メチル；Ｒ１＝アセチル、Ｒ２＝アセチルオキシ、Ｒ３＝Ｈ
【請求項６】
組成物調製に使用した化合物が、（±）マルメシン、コラムビアネチン、ジヒドロキサンサイレチン、７−メトキシクマリン、７−アセチルオキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシクマリン、７−アリルオキシクマリン、７−ベンジルオキシクマリンから選択される請求項１記載の組成物。
【請求項７】
組成物調製に使用した化合物類が、天然起源であるかまたは合成できる請求項１記載の組成物。
【請求項８】
スコポラミン誘発記憶欠損マウスにおいて、標準的薬剤であるドネペジルよりも大きい記憶保持百分率を示す請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、コリンエステラーゼを４９％まで阻害する請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、アカシアゴム、メチルセルロースから選択した担体を用いて経口経路で投与される請求項に記載の組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病および関連する慢性神経変性疾患の治療に有用な医薬の調製における請求項１記載の組成物の用途。
【請求項１２】
前記組成物が経口経路で投与される請求項１２記載の用途。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５３１３２３（Ｐ２００９−５３１３２３Ａ）
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００９５４（Ｐ２００９−５００９５４）
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００６８６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０７８４６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１９日（２００７．３．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００６８６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０７８４６
【国際公開日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【出願人】（５０５１８５７０９）カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ (35)
【Ｆターム（参考）】
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