イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法
【課題】パブロバ藻体を容易に大量培養することにより、イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を同時に効率よく生産する方法を提供する。
【解決手段】培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養する。
【解決手段】培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハプト植物門に属するパブロバ藻体を培養することにより、イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、単細胞微細藻類を縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、ナンノクロロプシス藻体を、ＰＶＣ濃度を0 ．9 〜1 ．7ml ／l 接種して、水槽の前後面の何れかの片面から照度6000〜16000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が1 ．8 〜4 ．9ml ／l になるまで培養する第１工程と、当該ＰＶＣ濃度1 ．8 〜4 ．9ml ／l の培養液に、水槽の前後面の両面から照度11000 〜21000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が5 ．0 〜7 ．Oml ／l になるまで培養する第２工程と、当該ＰＶＣ濃度5 ．0 〜7 ．Oml ／l の培養液に、水槽の前後面の両面から照度10000 〜35000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が10．3 〜11．Oml ／l になるまで培養する第３工程とから成ることを特徴とするエイコサペンタエン酸を生産させることは、特許文献１に開示されており公知である。
【０００３】
また、単細胞微細藻類を縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、円石藻体を、ＰＶＣ濃度を0 ．1 〜0 ．4ml ／l に接種して、水槽の前後面の何れかの片面から照度3000〜4000lxの光照射をしつつ、ＰＶＣ濃度が0 ．5 〜1ml ／l まで培養する第１工程と、該0 ．5 〜1ml ／l 濃度の培養液に、水槽の前後の両面から照度3000〜4000lxの光照射をしつつ、ＰＶＣ濃度が2 ．0 〜2 ．3ml ／l まで培養する第２工程と、該2 ．0 〜2 ．3ml ／l 濃度の培養液に、水槽の前後の両面から照度5000〜6000lxの光照射しつつ、ＰＶＣ濃度が5 ．0 〜5 ．5ml ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするドコサヘキサエン酸を生産させることは、特許文献２に開示されており公知である。
【特許文献１】特開平９−２５２７６１号公報
【特許文献２】特開平９−２５２７６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記従来のナンノクロロプシス藻体の培養法では、（エ）イコサペンタエン酸だけしか生産させることができなかった。
【０００５】
さらに、上記従来の円石藻体の培養法では、ドコサヘキサエン酸だけしか生産させることができなかった。
【０００６】
そこで、本発明者は、イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を同時に大量に生産させるパブロバ藻体の培養法について研究した結果、本発明を達成したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ガラスなどの透明体からなる培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養するものとしている。
【０００８】
すなわち、本発明は、単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽に光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽に光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするものである。
【０００９】
さらに、本発明は、単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明で使用する培養槽としては、例えば縦型偏平水槽が挙げられる。この縦型偏平水槽とは、好ましくは、前後の各面の幅が0 ．5 〜2m程度、高さが1 ．5 〜2 ．5m程度で、左右の各側面の幅が7 〜17cmの縦長の偏平の水槽で、上端の細い長方形の開口部には、周壁に適数個の通気孔が設けられ、かつ先端部が閉鎖されている。炭酸ガス含有空気を無機液体培地に送入する通気管が、その先端から挿入され、また、下端部に形成された船底形状の底部には、培養液の排出管が、開閉自在の弁部材を介して装着されているものである。そして、側面幅は、17cmを超えると、パブロバ藻体が光りを十分に受けることかできず、イコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという）及びドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという）の生産が低下するので好ましくない。また、船底形態の底部は、培養液が排出され易いように培養液排出管に向けて下方に傾斜されていることが好ましく、水槽を形成するガラス板またはアクリル板の厚さは３ｃｍ程度が望ましい。なお、本発明での光照射は、白色、昼色蛍光灯または白熱灯の照射をいう。
【００１１】
本発明でいうパブロバ藻体とは、ハプト植物部門(Haptophyta)に属するハプト藻網(Haptophyceae)のパブロバ目(Pavlovales)のパブロバ（Pavlova)が挙げられ、具体的には本発明者らによって発見された新規な藻体である、ＮＰ−２００７０１２２（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１７０）が挙げられる。
【００１２】
ハプト植物部門に属するハプト藻網には、前記パブロバ目の他に、イソクリシス目(Isochrysidales)、コッコスフェラ目(Coccosphaerales) 、プリムネシウム目(Prymnesiales)が存在する。そして、パブロバ目には、前記パブロバの他に、ディアクロネマ(Diacronema)、エキサンテマクリシス(Exanthemachrysis)等が知られている。イソクリシス目には、アピストネマ(Apistonema)、クリソネマ(Chrysonema)、クリソティラ(Chrysotila)、クリコスフェラ(Cricosphaera)、ディクラテリア(Dicrateria)、エミリアニア(Emiliania) 、ゲフィロカプサ(Gephyrocapsa)、ヒメノモナス(Hymenomonas) 、イマントニア(Imantonia) 、イソクリシス(Isochrysis)、ペルロクリシス(Pleurochrysis) 、オクロスフェラ(Ochrosphaera)等が知られている。コッコスフェラ目には、アカントイカ(Acanthoica)、アノプロソレニア(Anoplosolenia) 、アントスフェラ(Anthosphaera)、ブラルドスフェラ(Braarudosphaera) 、カルシオパップス(Calciopappus)、カルシオソレニア(Calciosolenia) 、カリプトロスフェラ(Calyptrosphaera) 、コッコリタス(Coccolithus) 、コリスフェラ(Corisphaera) 、クリスタロリタス(Crystallolithus) 、シクロコッコリタス(Cyclococcolithus)、ドイツランディア(Deutschlandia) 、ディスコスフェラ(Discosphaera)、ヘリコスフェラ(Helicosphaera) 、ヘラドスフェラ(Helladosphaera)、ホモジゴスフェラ(Homozygosphaera) 、ミカエルサルシア(Michaelsarsia) 、オフィアスター(Ophiaster) 、パッポスフェラ(Papposphaera)、ポントスフェラ(Pontosphaera)、ラブドスフェラ(Rhabdosphaera) 、ラブドソラックス(Rhabdothorax)、シフォスフェラ(Scyphosphaera) 、スフェロカリテプトラ(Sphaerocalyptra) 、シラコリタス(Syracolithus)、シラコスフェラ(Syracosphaera) 、トラコスフェラ(Thoracosphaera)、ジゴスフェラ(Zygosphaera) 等が知られている。プリムネシウム目には、クリソクロムリナ(Chrysochromulina)、コリムベラス(Corymbellus) 、フェオシスティス(Phaeocystis) 、プラティクリシス(Platychrysis)、プリムネシウム(Prymnesium)等が知られている。
【００１３】
本発明では、これら多くのハプト植物部門に属するハプト藻網のうち、前記パブロバ目のパブロバ、具体的には前記ＮＰ−２００７０１２２が、ＥＰＡ及びＤＨＡを同時に大量に生産させることを見いだしたものである。
【００１４】
本発明でいう無機液体培地とは、培地100 リットルに対して、ＮａＣｌが2400〜3000g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが600 〜700g、ＫＮＯ3 が30〜100g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが10〜18g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が5 〜9g、ＮａＨＣＯ3 が3 〜5g、Tris−ＨＣｌが220 〜260g、ビタミンＢ12が0 ．3 〜0 ．7mg 、チアミン−ＨＣｌが40〜60mg、ビオチンが0 ．1 〜1mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが200 〜300mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1500〜2500mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．4 〜40mg、Ｈ3 ＢＯ3 が6 〜60mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．15〜1 ．5mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．4 〜4mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが4 〜40mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が0 ．37〜37mgの割合で含まれている培地をいう。
【００１５】
本発明で、第１工程において、培養開始重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l を接種し、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2光を照射して培養するのは、好適に培養することができるからであり、また50〜100mg ／ lまで培養するのは、100mg ／l を超えてまで培養すると、照度が不足となり、培養液中のパブロバ藻体を凝集・黄変させ、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産が低下するからである。よって、上記条件で培養することにより、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産を低下させることなく、順調に第２工程の培養に移行することができるからである。
【００１６】
第１工程で培養した重量乾燥藻体濃度50〜100mg ／l の培養液に、第２工程において、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射して、200 〜230mg ／l まで培養するのは、パブロバ藻体を順調に培養してＥＰＡ及びＤＨＡを生産させるためであり、そして、230mg ／l を超えるとＥＰＡ及びＤＨＡの生産速度を低下させるからである。また、培養液中のパブロバ藻体を凝集体させたり、黄変させたりして、第３工程の培養に移行できないからである。
【００１７】
第２工程で培養した重量乾燥藻体濃度200 〜230mg ／l の培養液に、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して500 〜550mg ／l まで培養するのは、550mg ／l まで培養した後の重量乾燥藻体濃度の増加は殆ど無くなり、従って、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産も無くなるからである。
【００１８】
本発明において、第１工程〜第３工程を通じ、温度10〜30℃で行うのが好ましく、10℃未満では重量乾燥藻体濃度の増加は殆どなく、30℃を超えればパブロバ藻体が凝集し、光照射時間が18〜24時間／日であればＥＰＡ及びＤＨＡの生産量の低下は来さず、また、炭酸ガス1 〜5 ％含有空気を5 〜7ml ／l の割合で通気、攪拌することにより、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産量の低下を来すことがない。
【００１９】
なお、確認試験として、パブロバ藻体を上記条件下において、10mg／l 培養（３０日間）したところ、図１に示したように、第１工程だけを行った場合は150mg ／l （２６日目）までしか増殖せず、第１工程、第２工程（６日目に開始）を行った場合は、287mg ／l （２４日目）までしか増殖しなかったが、第１工程、第２工程（６日目に開始）、第３工程（１８日目に開始）を行った場合は、503mg ／l （２６日目）まで増殖した。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、以上に述べたように構成されているので、パブロバ藻体を容易に大量培養することができ、ＥＰＡ及びＤＨＡを同時に効率よく生産できるものとなった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
〔実施例１〕
培地100 リットルに対して、ＮａＣｌが2700g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが660g、ＫＮＯ3 が36g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが15g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が7g、ＮａＨＣＯ3 が4g、Tris−ＨＣｌが242g、ビタミンＢ12が0 ．5mg 、チアミン−ＨＣｌが60mg、ビオチンが0 ．1mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが276.9mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1860mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．4 mg、Ｈ3 ＢＯ3 が6 mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．15mg、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．4mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが4mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が3.7mg の割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）100 リットルを、高さ2 m 、前後の各面の幅1m、左右の各面の幅13cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、230mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、507mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、48g の乾燥藻体を得た。
【００２２】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を、５％の塩酸を含むメタノール溶媒に入れ、95℃で3 時間還流後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出し、トリコサン酸を内部標準によるガスタロマイグラフイー分析法で定量した結果、2 ．2gのＥＰＡ及び1 ．OgのＤＨＡを得た。
【００２３】
〔実施例２〕
実施例１記載と同様に、無機液体培地100 リットルを縦型偏平水槽に入れ、培養温度を25℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％含有空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の100 リットルの無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度20mg／l の割合で接種して、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、100mg ／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度125 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、230mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．2 に調整して515mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた100 リットルの培養液から分取した70リットルの培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回転／分）で分取した藻体を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して32g の乾燥藻体を得た。そして、得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１記載と同様に定量した結果、1 ．6gのＥＰＡ及び0 ．6gのＤＨＡを得た。
【００２４】
また、70リットルを分別した残余の、重量乾燥藻体濃度515mg ／l の培養液30リットルに、実施例１の無機液体培地を適量加えて、上記実施例２の第３工程と同様に光強度125 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を18時間／日照射しつつ培養することを６回繰り返して得た培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回転／分）で得た藻体を洗浄、凍結乾燥した乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を定量した結果、9 ．2gのＥＰＡ及び3 ．8gのＤＨＡが得られた。
【００２５】
〔実施例３〕
培地200 リットルに対して、ＮａＣｌが5400g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが1320g 、ＫＮＯ3 が72g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが30g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が14g 、ＮａＨＣＯ3 が8g、Tris−ＨＣｌが482g、ビタミンＢ12が1mg 、チアミン−ＨＣｌが120mg 、ビオチンが0 ．2mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが553.8mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが3730mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．8 mg、Ｈ3 ＢＯ3 が12mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．3mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．8mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが8mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が7.4mg の割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）200 リットルを、高さ2 m 、前後面の各幅2m、左右側面の各幅13cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を23℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の昼色蛍光灯を照射し、培養して、70mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の昼色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、520mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、101gの乾燥藻体を得た。
【００２６】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは4 ．4g、ＤＨＡは1 ．8gであった。
【００２７】
〔実施例４〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1350g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが330g、ＫＮＯ3 が18g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが7g、ＫＨ2 ＰＯ4 が3.5g、ＮａＨＣＯ3 が2g、Tris−ＨＣｌが121g、ビタミンＢ12が0.25mg、チアミン−ＨＣｌが30mg、ビオチンが0 ．05mg、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが138.5mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが930mg 、ＺｎＣｌ2 が0 ．2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が3mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．075mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが2mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が1.85mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ2 m 、前後面の各幅0.5m、左右側面の各幅13cmのガラス製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度13mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白熱灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度138 μE ／ｍ・ｓ2 の白熱灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、510mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、26g の乾燥藻体を得た。
【００２８】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．1g、ＤＨＡは0 ．5gであった。
【００２９】
〔実施例５〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1200g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが330g、ＫＮＯ3 が15g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが6g、ＫＨ2 ＰＯ4 が2.5g、ＮａＨＣＯ3 が1.5g、Tris−ＨＣｌが110g、ビタミンＢ12が0.15mg、チアミン−ＨＣｌが20mg、ビオチンが0 ．05mg、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが100mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが750mg 、ＺｎＣｌ2 が0 ．2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が3mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．075mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが2mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が1.85mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ1.5m、前後面の各幅0.5m、左右側面の各幅7cm のガラス製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を10℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス0.5 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度148 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、200mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．1 に調整して培養して、507mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、24g の乾燥藻体を得た。
【００３０】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．1g、ＤＨＡは0 ．6gであった。
【００３１】
〔実施例６〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1500g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが350g、ＫＮＯ3 が20g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが9g、ＫＨ2 ＰＯ4 が4.5g、ＮａＨＣＯ3 が2.5g、Tris−ＨＣｌが130g、ビタミンＢ12が0.35mg、チアミン−ＨＣｌが30mg、ビオチンが0 ．5mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが150mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1250mg、ＺｎＣｌ2 が1mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が15mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．375mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが1mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが10mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が9.25mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ2.5m、前後面の各幅2m、左右側面の各幅16cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を30℃とし、照射の時間を24時間／日として、炭酸ガス5 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度40mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度100 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、100mg ／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度100 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、550mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、43g の乾燥藻体を得た。
【００３２】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．2g、ＤＨＡは0 ．5gであった。
【００３３】
〔実施例７〕
培地500 リットルに対して、ＮａＣｌが13. 5kg 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが3.3kg 、ＫＮＯ3 が180g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが70g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が35g 、ＮａＨＣＯ3 が20g 、Tris−ＨＣｌが1.21kg、ビタミンＢ12が2.5mg 、チアミン−ＨＣｌが300mg 、ビオチンが0 ．5mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが1385mg、Ｎａ2 ＥＤＴＡが9.3g、ＺｎＣｌ2 が2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が30mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．75mg、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが20mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が18.5mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）500 リットルを、直径１．１ｍ、高さ０．８ｍの５００リットル容積の円形ポリタンクに入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、円形ポリタンク中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度13mg／l の割合で接種し、円形ポリタンクの上方から光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、円形ポリタンクの上方から光強度138 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、510mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、260gの乾燥藻体を得た。
【００３４】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 1g、ＤＨＡは5gであった。
【００３５】
〔実施例８〕
培地2000リットルに対して、ＮａＣｌが54Kg、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが13.2Kg、ＫＮＯ3 が720g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが300g、ＫＨ2 ＰＯ4 が140g、ＮａＨＣＯ3 が80g 、Tris−ＨＣｌが4.82Kg、ビタミンＢ12が10mg、チアミン−ＨＣｌが1.2g、ビオチンが2mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが5.538g、Ｎａ2 ＥＤＴＡが37.3g 、ＺｎＣｌ2 が8mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が120mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが3mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが8mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが80mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が74mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）2000リットルを、縦１０ｍ、横３ｍの２トン容の強化プラスチック製レースウェイ培養タンクに入れ、培養温度を23℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、培養タンク中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、培養タンクの前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、70mg／l となった後、第２工程として、培養タンクの前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、520mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、1010g の乾燥藻体を得た。
【００３６】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは44g 、ＤＨＡは18g であった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】第１〜３工程の各工程までそれぞれパブロア藻体を３０日間培養した培養曲線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハプト植物門に属するパブロバ藻体を培養することにより、イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、単細胞微細藻類を縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、ナンノクロロプシス藻体を、ＰＶＣ濃度を0 ．9 〜1 ．7ml ／l 接種して、水槽の前後面の何れかの片面から照度6000〜16000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が1 ．8 〜4 ．9ml ／l になるまで培養する第１工程と、当該ＰＶＣ濃度1 ．8 〜4 ．9ml ／l の培養液に、水槽の前後面の両面から照度11000 〜21000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が5 ．0 〜7 ．Oml ／l になるまで培養する第２工程と、当該ＰＶＣ濃度5 ．0 〜7 ．Oml ／l の培養液に、水槽の前後面の両面から照度10000 〜35000lx の光を照射しつつ、ＰＶＣ濃度が10．3 〜11．Oml ／l になるまで培養する第３工程とから成ることを特徴とするエイコサペンタエン酸を生産させることは、特許文献１に開示されており公知である。
【０００３】
また、単細胞微細藻類を縦型偏平水槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、円石藻体を、ＰＶＣ濃度を0 ．1 〜0 ．4ml ／l に接種して、水槽の前後面の何れかの片面から照度3000〜4000lxの光照射をしつつ、ＰＶＣ濃度が0 ．5 〜1ml ／l まで培養する第１工程と、該0 ．5 〜1ml ／l 濃度の培養液に、水槽の前後の両面から照度3000〜4000lxの光照射をしつつ、ＰＶＣ濃度が2 ．0 〜2 ．3ml ／l まで培養する第２工程と、該2 ．0 〜2 ．3ml ／l 濃度の培養液に、水槽の前後の両面から照度5000〜6000lxの光照射しつつ、ＰＶＣ濃度が5 ．0 〜5 ．5ml ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするドコサヘキサエン酸を生産させることは、特許文献２に開示されており公知である。
【特許文献１】特開平９−２５２７６１号公報
【特許文献２】特開平９−２５２７６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記従来のナンノクロロプシス藻体の培養法では、（エ）イコサペンタエン酸だけしか生産させることができなかった。
【０００５】
さらに、上記従来の円石藻体の培養法では、ドコサヘキサエン酸だけしか生産させることができなかった。
【０００６】
そこで、本発明者は、イコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を同時に大量に生産させるパブロバ藻体の培養法について研究した結果、本発明を達成したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ガラスなどの透明体からなる培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養するものとしている。
【０００８】
すなわち、本発明は、単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽に光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽に光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするものである。
【０００９】
さらに、本発明は、単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするものである。
【００１０】
本発明で使用する培養槽としては、例えば縦型偏平水槽が挙げられる。この縦型偏平水槽とは、好ましくは、前後の各面の幅が0 ．5 〜2m程度、高さが1 ．5 〜2 ．5m程度で、左右の各側面の幅が7 〜17cmの縦長の偏平の水槽で、上端の細い長方形の開口部には、周壁に適数個の通気孔が設けられ、かつ先端部が閉鎖されている。炭酸ガス含有空気を無機液体培地に送入する通気管が、その先端から挿入され、また、下端部に形成された船底形状の底部には、培養液の排出管が、開閉自在の弁部材を介して装着されているものである。そして、側面幅は、17cmを超えると、パブロバ藻体が光りを十分に受けることかできず、イコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという）及びドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという）の生産が低下するので好ましくない。また、船底形態の底部は、培養液が排出され易いように培養液排出管に向けて下方に傾斜されていることが好ましく、水槽を形成するガラス板またはアクリル板の厚さは３ｃｍ程度が望ましい。なお、本発明での光照射は、白色、昼色蛍光灯または白熱灯の照射をいう。
【００１１】
本発明でいうパブロバ藻体とは、ハプト植物部門(Haptophyta)に属するハプト藻網(Haptophyceae)のパブロバ目(Pavlovales)のパブロバ（Pavlova)が挙げられ、具体的には本発明者らによって発見された新規な藻体である、ＮＰ−２００７０１２２（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１７０）が挙げられる。
【００１２】
ハプト植物部門に属するハプト藻網には、前記パブロバ目の他に、イソクリシス目(Isochrysidales)、コッコスフェラ目(Coccosphaerales) 、プリムネシウム目(Prymnesiales)が存在する。そして、パブロバ目には、前記パブロバの他に、ディアクロネマ(Diacronema)、エキサンテマクリシス(Exanthemachrysis)等が知られている。イソクリシス目には、アピストネマ(Apistonema)、クリソネマ(Chrysonema)、クリソティラ(Chrysotila)、クリコスフェラ(Cricosphaera)、ディクラテリア(Dicrateria)、エミリアニア(Emiliania) 、ゲフィロカプサ(Gephyrocapsa)、ヒメノモナス(Hymenomonas) 、イマントニア(Imantonia) 、イソクリシス(Isochrysis)、ペルロクリシス(Pleurochrysis) 、オクロスフェラ(Ochrosphaera)等が知られている。コッコスフェラ目には、アカントイカ(Acanthoica)、アノプロソレニア(Anoplosolenia) 、アントスフェラ(Anthosphaera)、ブラルドスフェラ(Braarudosphaera) 、カルシオパップス(Calciopappus)、カルシオソレニア(Calciosolenia) 、カリプトロスフェラ(Calyptrosphaera) 、コッコリタス(Coccolithus) 、コリスフェラ(Corisphaera) 、クリスタロリタス(Crystallolithus) 、シクロコッコリタス(Cyclococcolithus)、ドイツランディア(Deutschlandia) 、ディスコスフェラ(Discosphaera)、ヘリコスフェラ(Helicosphaera) 、ヘラドスフェラ(Helladosphaera)、ホモジゴスフェラ(Homozygosphaera) 、ミカエルサルシア(Michaelsarsia) 、オフィアスター(Ophiaster) 、パッポスフェラ(Papposphaera)、ポントスフェラ(Pontosphaera)、ラブドスフェラ(Rhabdosphaera) 、ラブドソラックス(Rhabdothorax)、シフォスフェラ(Scyphosphaera) 、スフェロカリテプトラ(Sphaerocalyptra) 、シラコリタス(Syracolithus)、シラコスフェラ(Syracosphaera) 、トラコスフェラ(Thoracosphaera)、ジゴスフェラ(Zygosphaera) 等が知られている。プリムネシウム目には、クリソクロムリナ(Chrysochromulina)、コリムベラス(Corymbellus) 、フェオシスティス(Phaeocystis) 、プラティクリシス(Platychrysis)、プリムネシウム(Prymnesium)等が知られている。
【００１３】
本発明では、これら多くのハプト植物部門に属するハプト藻網のうち、前記パブロバ目のパブロバ、具体的には前記ＮＰ−２００７０１２２が、ＥＰＡ及びＤＨＡを同時に大量に生産させることを見いだしたものである。
【００１４】
本発明でいう無機液体培地とは、培地100 リットルに対して、ＮａＣｌが2400〜3000g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが600 〜700g、ＫＮＯ3 が30〜100g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが10〜18g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が5 〜9g、ＮａＨＣＯ3 が3 〜5g、Tris−ＨＣｌが220 〜260g、ビタミンＢ12が0 ．3 〜0 ．7mg 、チアミン−ＨＣｌが40〜60mg、ビオチンが0 ．1 〜1mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが200 〜300mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1500〜2500mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．4 〜40mg、Ｈ3 ＢＯ3 が6 〜60mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．15〜1 ．5mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．4 〜4mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが4 〜40mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が0 ．37〜37mgの割合で含まれている培地をいう。
【００１５】
本発明で、第１工程において、培養開始重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l を接種し、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2光を照射して培養するのは、好適に培養することができるからであり、また50〜100mg ／ lまで培養するのは、100mg ／l を超えてまで培養すると、照度が不足となり、培養液中のパブロバ藻体を凝集・黄変させ、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産が低下するからである。よって、上記条件で培養することにより、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産を低下させることなく、順調に第２工程の培養に移行することができるからである。
【００１６】
第１工程で培養した重量乾燥藻体濃度50〜100mg ／l の培養液に、第２工程において、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射して、200 〜230mg ／l まで培養するのは、パブロバ藻体を順調に培養してＥＰＡ及びＤＨＡを生産させるためであり、そして、230mg ／l を超えるとＥＰＡ及びＤＨＡの生産速度を低下させるからである。また、培養液中のパブロバ藻体を凝集体させたり、黄変させたりして、第３工程の培養に移行できないからである。
【００１７】
第２工程で培養した重量乾燥藻体濃度200 〜230mg ／l の培養液に、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して500 〜550mg ／l まで培養するのは、550mg ／l まで培養した後の重量乾燥藻体濃度の増加は殆ど無くなり、従って、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産も無くなるからである。
【００１８】
本発明において、第１工程〜第３工程を通じ、温度10〜30℃で行うのが好ましく、10℃未満では重量乾燥藻体濃度の増加は殆どなく、30℃を超えればパブロバ藻体が凝集し、光照射時間が18〜24時間／日であればＥＰＡ及びＤＨＡの生産量の低下は来さず、また、炭酸ガス1 〜5 ％含有空気を5 〜7ml ／l の割合で通気、攪拌することにより、ＥＰＡ及びＤＨＡの生産量の低下を来すことがない。
【００１９】
なお、確認試験として、パブロバ藻体を上記条件下において、10mg／l 培養（３０日間）したところ、図１に示したように、第１工程だけを行った場合は150mg ／l （２６日目）までしか増殖せず、第１工程、第２工程（６日目に開始）を行った場合は、287mg ／l （２４日目）までしか増殖しなかったが、第１工程、第２工程（６日目に開始）、第３工程（１８日目に開始）を行った場合は、503mg ／l （２６日目）まで増殖した。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、以上に述べたように構成されているので、パブロバ藻体を容易に大量培養することができ、ＥＰＡ及びＤＨＡを同時に効率よく生産できるものとなった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
〔実施例１〕
培地100 リットルに対して、ＮａＣｌが2700g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが660g、ＫＮＯ3 が36g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが15g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が7g、ＮａＨＣＯ3 が4g、Tris−ＨＣｌが242g、ビタミンＢ12が0 ．5mg 、チアミン−ＨＣｌが60mg、ビオチンが0 ．1mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが276.9mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1860mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．4 mg、Ｈ3 ＢＯ3 が6 mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．15mg、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．4mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが4mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が3.7mg の割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）100 リットルを、高さ2 m 、前後の各面の幅1m、左右の各面の幅13cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、230mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、507mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、48g の乾燥藻体を得た。
【００２２】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を、５％の塩酸を含むメタノール溶媒に入れ、95℃で3 時間還流後、ヘキサン溶媒で脂肪酸メチルエステルを抽出し、トリコサン酸を内部標準によるガスタロマイグラフイー分析法で定量した結果、2 ．2gのＥＰＡ及び1 ．OgのＤＨＡを得た。
【００２３】
〔実施例２〕
実施例１記載と同様に、無機液体培地100 リットルを縦型偏平水槽に入れ、培養温度を25℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％含有空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の100 リットルの無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度20mg／l の割合で接種して、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、100mg ／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度125 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、230mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．2 に調整して515mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた100 リットルの培養液から分取した70リットルの培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回転／分）で分取した藻体を蒸留水で洗浄し、凍結乾燥して32g の乾燥藻体を得た。そして、得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１記載と同様に定量した結果、1 ．6gのＥＰＡ及び0 ．6gのＤＨＡを得た。
【００２４】
また、70リットルを分別した残余の、重量乾燥藻体濃度515mg ／l の培養液30リットルに、実施例１の無機液体培地を適量加えて、上記実施例２の第３工程と同様に光強度125 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を18時間／日照射しつつ培養することを６回繰り返して得た培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回転／分）で得た藻体を洗浄、凍結乾燥した乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を定量した結果、9 ．2gのＥＰＡ及び3 ．8gのＤＨＡが得られた。
【００２５】
〔実施例３〕
培地200 リットルに対して、ＮａＣｌが5400g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが1320g 、ＫＮＯ3 が72g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが30g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が14g 、ＮａＨＣＯ3 が8g、Tris−ＨＣｌが482g、ビタミンＢ12が1mg 、チアミン−ＨＣｌが120mg 、ビオチンが0 ．2mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが553.8mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが3730mg、ＺｎＣｌ2 が0 ．8 mg、Ｈ3 ＢＯ3 が12mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．3mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．8mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが8mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が7.4mg の割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）200 リットルを、高さ2 m 、前後面の各幅2m、左右側面の各幅13cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を23℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の昼色蛍光灯を照射し、培養して、70mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の昼色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、520mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、101gの乾燥藻体を得た。
【００２６】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは4 ．4g、ＤＨＡは1 ．8gであった。
【００２７】
〔実施例４〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1350g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが330g、ＫＮＯ3 が18g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが7g、ＫＨ2 ＰＯ4 が3.5g、ＮａＨＣＯ3 が2g、Tris−ＨＣｌが121g、ビタミンＢ12が0.25mg、チアミン−ＨＣｌが30mg、ビオチンが0 ．05mg、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが138.5mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが930mg 、ＺｎＣｌ2 が0 ．2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が3mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．075mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが2mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が1.85mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ2 m 、前後面の各幅0.5m、左右側面の各幅13cmのガラス製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度13mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白熱灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度138 μE ／ｍ・ｓ2 の白熱灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、510mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、26g の乾燥藻体を得た。
【００２８】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．1g、ＤＨＡは0 ．5gであった。
【００２９】
〔実施例５〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1200g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが330g、ＫＮＯ3 が15g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが6g、ＫＨ2 ＰＯ4 が2.5g、ＮａＨＣＯ3 が1.5g、Tris−ＨＣｌが110g、ビタミンＢ12が0.15mg、チアミン−ＨＣｌが20mg、ビオチンが0 ．05mg、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが100mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが750mg 、ＺｎＣｌ2 が0 ．2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が3mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．075mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが0 ．2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが2mg 、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が1.85mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ1.5m、前後面の各幅0.5m、左右側面の各幅7cm のガラス製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を10℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス0.5 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度148 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、200mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．1 に調整して培養して、507mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、24g の乾燥藻体を得た。
【００３０】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．1g、ＤＨＡは0 ．6gであった。
【００３１】
〔実施例６〕
培地50リットルに対して、ＮａＣｌが1500g 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが350g、ＫＮＯ3 が20g 、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが9g、ＫＨ2 ＰＯ4 が4.5g、ＮａＨＣＯ3 が2.5g、Tris−ＨＣｌが130g、ビタミンＢ12が0.35mg、チアミン−ＨＣｌが30mg、ビオチンが0 ．5mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが150mg 、Ｎａ2 ＥＤＴＡが1250mg、ＺｎＣｌ2 が1mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が15mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．375mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが1mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが10mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が9.25mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）50リットルを、高さ2.5m、前後面の各幅2m、左右側面の各幅16cmのアクリル製の縦型偏平水槽に入れ、培養温度を30℃とし、照射の時間を24時間／日として、炭酸ガス5 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、水槽中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度40mg／l の割合で接種し、水槽の前面片面に光強度100 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、100mg ／l となった後、第２工程として、水槽の前後の両面に、光強度100 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、550mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、43g の乾燥藻体を得た。
【００３２】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 ．2g、ＤＨＡは0 ．5gであった。
【００３３】
〔実施例７〕
培地500 リットルに対して、ＮａＣｌが13. 5kg 、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが3.3kg 、ＫＮＯ3 が180g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが70g 、ＫＨ2 ＰＯ4 が35g 、ＮａＨＣＯ3 が20g 、Tris−ＨＣｌが1.21kg、ビタミンＢ12が2.5mg 、チアミン−ＨＣｌが300mg 、ビオチンが0 ．5mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが1385mg、Ｎａ2 ＥＤＴＡが9.3g、ＺｎＣｌ2 が2mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が30mg、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが0 ．75mg、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが2mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが20mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が18.5mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）500 リットルを、直径１．１ｍ、高さ０．８ｍの５００リットル容積の円形ポリタンクに入れ、培養温度を26℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を5 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、円形ポリタンク中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度13mg／l の割合で接種し、円形ポリタンクの上方から光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、50mg／l となった後、第２工程として、円形ポリタンクの上方から光強度138 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを7 ．0 に調整して培養して、510mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、260gの乾燥藻体を得た。
【００３４】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは1 1g、ＤＨＡは5gであった。
【００３５】
〔実施例８〕
培地2000リットルに対して、ＮａＣｌが54Kg、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏが13.2Kg、ＫＮＯ3 が720g、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが300g、ＫＨ2 ＰＯ4 が140g、ＮａＨＣＯ3 が80g 、Tris−ＨＣｌが4.82Kg、ビタミンＢ12が10mg、チアミン−ＨＣｌが1.2g、ビオチンが2mg 、ＦｅＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが5.538g、Ｎａ2 ＥＤＴＡが37.3g 、ＺｎＣｌ2 が8mg 、Ｈ3 ＢＯ3 が120mg 、ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏが3mg 、ＣｕＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏが8mg 、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏが80mg、（ＮＨ4 ）6 ＭｏＯ24が74mgの割合で含まれている無機液体培地（pH8 ．0 ）2000リットルを、縦１０ｍ、横３ｍの２トン容の強化プラスチック製レースウェイ培養タンクに入れ、培養温度を23℃とし、照射の時間を18時間／日として、炭酸ガス1 ％を含む空気を7 l ／min の割合で通気しつつ、第１工程として、培養タンク中の無機液体培地に、パブロバを重量乾燥藻体濃度10mg／l の割合で接種し、培養タンクの前面片面に光強度75μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、70mg／l となった後、第２工程として、培養タンクの前後の両面に、光強度150 μE ／ｍ・ｓ2 の白色蛍光灯を照射し、培養して、220mg ／l となった後、第３工程として、培養液のpHを6 ．8 に調整して培養して、520mg ／l となった後、培養処理を止めて、得られた培養液をシャープレス遠心分離機（15000 回／分）で分別して得た藻体を蒸留水で洗浄してから凍結乾燥して、1010g の乾燥藻体を得た。
【００３６】
得られた乾燥藻体中のＥＰＡ量及びＤＨＡ量を実施例１と同様にして定量した結果、ＥＰＡは44g 、ＤＨＡは18g であった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】第１〜３工程の各工程までそれぞれパブロア藻体を３０日間培養した培養曲線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養することを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項２】
単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽に光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽に光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項３】
単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項４】
パブロバ藻体が、ＮＰ−２００７０１２２（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１７０）である請求項１〜３のいずれかに記載のイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項１】
培養槽中の無機液体培地に接種したパブロバ藻体に、光照射と、炭酸ガス含有空気を通気しつつ、第１工程として、培養槽に光を照射して、培養可能まで培養した後、この培養液に、第２工程として、培養槽に第１工程より強い光を照射して、培養可能まで培養した後、該培養液に第３工程として、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲内に調整して重量乾燥藻体濃度の増加が殆ど認められないまでに培養することを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項２】
単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽に光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽に光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項３】
単細胞微細藻類を培養槽中の無機液体培地に接種して、光照射しつつ、かつ、炭酸ガス含有空気を通気しつつ培養する方法において、パブロバ藻体を重量乾燥藻体濃度10〜40mg／l に接種して、培養槽の片側から光強度75〜100 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、50〜100mg ／l まで培養する第１工程と、この50〜100mg ／l 濃度の培養液に、培養槽の両側から光強度125 〜150 μE ／m ・s2の光を照射しつつ、200 〜230mg ／l まで培養する第２工程と、この200 〜230mg ／l 濃度の培養液に、培養液のpHを6 ．8 〜7 ．2 の範囲に調整して、500 〜550mg ／l まで培養する第３工程とから成ることを特徴とするイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【請求項４】
パブロバ藻体が、ＮＰ−２００７０１２２（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１１７０）である請求項１〜３のいずれかに記載のイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の生産方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１８２９６２（Ｐ２００８−１８２９６２Ａ）
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９４８３（Ｐ２００７−１９４８３）
【出願日】平成１９年１月３０日（２００７．１．３０）
【出願人】（３９９１２７６０３）株式会社日健総本社 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月３０日（２００７．１．３０）
【出願人】（３９９１２７６０３）株式会社日健総本社 (19)
【Ｆターム（参考）】
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