インターフェロン治療のための方法および組成物
【課題】上皮細胞、そして特に尿路上皮に対する、治療用タンパク質、ポリペプチド（例えば、インターフェロン、ＩｎｔｒｏｎＡ）または遺伝子送達系または核酸の送達を改善する方法を提供すること。
【解決手段】タンパク質またはこのタンパク質をコードする核酸は、標的組織または器官の細胞に対するインターフェロンまたは核酸の送達を増大する送達増強因子を用いた治療と組み合わせて、この標的組織または器官に投与される。この方法および組み合わせは特にインターフェロン療法に応答性の癌または他の症状の治療に有効である。例示的な方法は、αインターフェロンまたはこのインターフェロンをコードする遺伝子送達系およびＳＹＮ３またはＳＹＮ３のホモログもしくはアナログを含む薬学的組成物の治療上有効な量の膀胱への経尿道膀胱内投与を包含する。
【解決手段】タンパク質またはこのタンパク質をコードする核酸は、標的組織または器官の細胞に対するインターフェロンまたは核酸の送達を増大する送達増強因子を用いた治療と組み合わせて、この標的組織または器官に投与される。この方法および組み合わせは特にインターフェロン療法に応答性の癌または他の症状の治療に有効である。例示的な方法は、αインターフェロンまたはこのインターフェロンをコードする遺伝子送達系およびＳＹＮ３またはＳＹＮ３のホモログもしくはアナログを含む薬学的組成物の治療上有効な量の膀胱への経尿道膀胱内投与を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００３年６月４日出願、米国特許出願第１０／４５５，２１５号の一部継続出願であり、この出願は、２００２年１月２２日出願、米国特許出願第１０／０５５，８６３号の一部継続出願であり、この出願は、１９９８年７月８日出願、米国特許出願第０９／１１２，０７４号（２００２年５月２１日発行の米国特許第６，３９２，０６９号）の継続出願であり、この出願は、１９９７年７月８日出願、米国特許出願第０８／８８９，３５５号の一部継続出願であり、この出願は、１９９６年１月８日出願、米国特許出願第０８／５８４，０７７号（１９９８年８月４日発行、米国特許第５，７８９，２４４号）の一部継続であり；本出願はまた、２００３年６月３日出願、譲渡された米国特許出願番号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号０１６９３０−０００８１５）の一部継続出願であり、この出願は、２０００年８月２８日出願の米国特許出願第０９／６５０，３５９号の継続出願であり、この出願は、１９９７年１月７日出願、米国特許出願第０８／７７９，６２７号（２０００年１２月２６日発行、米国特許第６，１６５，７７９号）の継続出願であり、この出願は、１９９６年１月８日出願、米国特許出願第０８／５８４，０７７号の一部継続出願であり；本出願は、２００４年６月４日出願、譲渡される米国特許出願番号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号０１６９３０−０００８３１ＵＳに対する優先権を主張し、この出願は、２００３年６月４日出願米国特許出願第６０／４７５９２６号の恩典を請求する。本出願は、２００１年１２月２０日出願、米国特許出願第６０／３４２３２９号の恩典を請求する、２００２年１２月２０日出願、米国特許出願第１０／３２９，０４３号の主題に関する主題を含む。これらの優先出願の開示は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
毎年米国では４５，０００例を超える表在性膀胱癌が診断されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２００２）。表在性の疾患は典型的には、粘膜表面（Ｔａ）に限定されるか、または平面伝播性の改変型である上皮内癌（ＣＩＳ）として存在する。いくつかのタイプの疾患は、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）によって最初に切り出され得るが、おそらく、可視的な腫瘍の肉眼での切除では、最終的に腫瘍再発を生じる顕微鏡的な病巣が残留し得るので、新規な腫瘍形成の傾向は高いままである。さらに、上皮内癌（ＣＩＳ）の治療には、外科的な介入は不可能である。従って、膀胱内療法が、腫瘍再発を防止する外科手術に対する補助療法として、または小さい残留性疾患および／またはＣＩＳのようなアクセス不能な疾患を排除するために、開発されている。
【０００３】
表在性膀胱癌の治療のために、２つの一般的なタイプの膀胱内療法が現在使用されている：化学療法およびＢＣＧ免疫療法。膀胱内投与を介して有効性が示されている化学療法剤は３つしかない：チオテパ、アドリアマイシン（およびその誘導体、エピルビシンおよびバルビシン）、およびマイトマイシン。ＴＵＲＢＴ単独に対してこれらの化学療法剤を比較する多重無作為化トライアルによって、腫瘍再発の１２〜１５％という正味の減少（すなわち、ＴＵＲＢＴでの６０％の再発、対ＴＵＲＢＴに加えて化学療法での４５％の再発）があり、１因子では併用より明らかな優位性はないことが明らかになっている（非特許文献１）。さらに重要な事には、再発におけるこの統計学的に有意な低下にもかかわらず、化学療法が最終的な疾患の進行の可能性を減少させるか、または生存率を向上させるということを実証しているエビデンスは示されていない（非特許文献２）。
【０００４】
免疫療法は典型的に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（「ＢＣＧ」）の生ワクチン株の膀胱内投与からなる。腫瘍再発は、ＴＵＲＢＴ（または膀胱内化学療法約２回）後にＢＣＧを用いて約３０％に減少する（非特許文献３）。小さい乳頭状腫瘍（＜２ｃｍ）の切除は、その時点で５５〜６０％、そしてＣＩＳについては７５％まで達成され得る（非特許文献４）。膀胱内ＢＣＧは、再発または疾患の進行のリスクの高い表在性膀胱癌の患者では標準的な治療となっている。これに関して、ＢＣＧを用いる膀胱内療法によって、ある程度の疾患管理、および表在性膀胱癌のあらゆる患者について望ましい目標である、膀胱の機能的保持が可能である。しかし、高いリスクの表在性膀胱癌の初期治療についてのこのＢＣＧ介在性の利点にもかかわらず、約５０％の患者が２年以内に再発する。一般に、このような再発はＢＣＧで再治療される。しかし、複数回の膀胱内ＢＣＧ点滴で治療された患者は、用量制限毒性、例えば、膀胱炎、排尿障害、発熱、そして場合によりＢＣＧ敗血症を被り得ることが観察された。従って、十分な忍容性を示し、かつ有効であるＢＣＧ治療に対する代替法が望まれる。
【０００５】
近年では、研究者は、表在性膀胱癌の治療のための膀胱内での組換えインターフェロンα２ｂタンパク質（ＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））療法について評価している。第ＩＩ相ヒト臨床試験によって、５０〜１００ＭＩＵの用量での単独薬剤としての膀胱内滴下注入ＩｎｔｒｏｎＡは、表在性膀胱癌を有する患者の４０％において完全寛解を得ることが実証された（非特許文献５）。
【０００６】
上記の観点から、上皮細胞、そして特に尿路上皮に対する、治療用タンパク質、ポリペプチド（例えば、インターフェロン、ＩｎｔｒｏｎＡ）または遺伝子送達系または核酸の送達を改善する方法を有することは有利である。
【非特許文献１】Ｔｒａｙｎｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ：Ｓ．Ｎ．Ｒｏｕｓ（編）Ｕｒｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ」，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＷＷ Ｎｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏ，１９９４，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．１１３−１４３
【非特許文献２】Ｌａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｒｏｌ，（１９９５）１５３：１４４４〜５０
【非特許文献３】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＭＡ，「Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ＢＣＧ ｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ」Ｉｎ：Ｄｒｏｌｌｅｒ、編、Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２００１
【非特許文献４】Ｋａｖｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．（１９８８）１３９：９３５
【非特許文献５】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，２００１ Ｏｃｔ．，１６６（４）：１３００〜５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の１態様では、上皮細胞層を有する組織または器官に対してタンパク質療法を行うための方法および薬学的組成物が提供される。１態様では、タンパク質療法は、ベクターによって標的組織または器官の細胞の形質導入を増大する、タンパク質療法送達増強因子を用いた治療と併用して標的の組織または器官に投与される。この方法および組み合わせは、生物学的に活性なタンパク質を用いた治療に応答性である癌および他の状態の治療に有効であり得る。好ましい実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、タンパク質療法は、インターフェロンタンパク質自体の投与によって、または形質導入された上皮もしくは尿道上皮細胞において発現されるべきインターフェロンタンパク質を遺伝子がコードしている、インターフェロン遺伝子送達系の投与によって、インターフェロンタンパク質を提供する。例示的な実施形態では、この
方法は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３のホモログもしくはアナログおよびインターフェロンまたはこのインターフェロンをコードするアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物の治療上有効な量の膀胱への経尿道膀胱内投与を包含する。さらなる実施形態では、このインターフェロンは、αインターフェロンである。
【０００９】
別の態様では、本発明は、上皮組織に対する核酸の送達を増強するための組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、送達増強因子と組み合わせてインターフェロンを遺伝子がコードする、遺伝子送達系を、組織または器官の細胞と接触させる工程を提供する。１つのさらなる実施形態では、本発明は、インターフェロン遺伝子をコードする組換えアデノウイルスおよび送達増強因子を含む薬学的組成物を提供する。例示的な実施形態では、この送達増強因子はＳＹＮ３であり、そしてこの系は、生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、送達増強因子および治療タンパク質の膀胱内投与により、膀胱上皮に対する、治療タンパク質またはこのタンパク質をコードする遺伝子を有する遺伝子送達系の送達を増強することによって、膀胱癌を治療するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、この治療タンパク質はインターフェロンである。さらなる実施形態では、この治療タンパク質はインターフェロンα２ｂまたはインターフェロンα２α１である。さらに他の実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。例示的実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３であり、タンパク質はインターフェロン（例えば、生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチド）である。さらなる実施形態では、タンパク質は、タンパク質としてまたはこのタンパク質をコードする遺伝子送達系を介して投与され得る。さらに他の実施形態では、このタンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。さらなる実施形態では、抗体は、サイトカインを指向している。
【００１１】
別の態様では、本発明は、治療タンパク質または送達増強因子の投与のための薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、インターフェロンであり、そして送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。例示的な実施形態では、この送達増強因子はＳＹＮ３であり、このタンパク質は生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチドである。さらなる実施形態では、このインターフェロンはインターフェロンα２ｂまたはインターフェロンα２α１である。
【００１２】
いくつかの態様では、本発明の方法は、送達増強因子および治療用タンパク質または治療タンパク質をコードする核酸の膀胱内投与によって、上皮膜で裏打ちされたかまたは上皮膜を含む、内部の隙間、洞、室、通路、容積、腔、空隙または管腔を規定する任意の器官または組織を治療する工程を包含する。このように規定された表面または壁は、薬学的組成物の身体の別の部分への大量の液体の動きまたは移動を含むか、または遅らせるか、または制限するように機能し、そして上皮膜と薬学的組成物との長い接触時間を可能にし得る。器官または組織は、内面に上皮膜を有する膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）（例えば、膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ））であってもよい。ある実施形態では、器官は胃、子宮、腸、食道、口、結腸、上部もしくは下部の消化管、または上部もしくは下部の気道である。ある実施形態では、この器官または組織は、腹腔のような空間を規定し、上皮表面は、腹腔内の空間と液体接触し得る上皮表面上に位置する。ある実施形態では、この器官または組織は癌を有する。増殖性障害または感染性疾患および治療タンパク質は、インターフェロンであり、そして送達増強因子はＳＹＮ３またはＳＹＮ３アナログである。
【００１３】
本発明によれば、さらに以下が提供される。
（項目１）
１）ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子、ならびに２）インターフェロンタンパク質またはインターフェロン遺伝子送達系を含有する薬学的組成物であって、該遺伝子送達系がインターフェロンの遺伝子を含有し、かつ該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、薬学的組成物。
（項目２）
前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアを含有する、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目３）
前記組成物が、凍結乾燥される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目４）
前記組成物が、ＳＹＮ３を含有する、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目５）
前記インターフェロンが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、δ−インターフェロン、γ−インターフェロンおよびそれらの融合インターフェロンからなる群より選択される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目６）
前記インターフェロンが、インターフェロンα−２ｂ、融合インターフェロンα−／２α−１、およびインターフェロンα−２ｅからなる群より選択される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目７）
前記因子が、ＳＹＮ３であり、かつ前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンである、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目８）
前記αインターフェロンが、α１インターフェロンまたはα２インターフェロンである、項目７に記載の薬学的組成物。
（項目９）
前記インターフェロンが、ヒトインターフェロンである、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目１０）
前記ホモログが以下の式：
【化１】
の化合物である、項目１に記載の薬学的組成物であって、
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；
ｍおよびｎは、個々に独立して、約０〜２から選択され；
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は、個々に独立して、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸは、ハロゲンおよび任意に置換されたカルボキシレートからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである、
薬学的組成物。
（項目１１）
Ｒ１およびＲ２が、両方ともヒドロキシル基である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
ｍおよびｎが、それぞれ１である、項目１０に記載の組成物。
（項目１３）
前記化合物が、式ＩＩ：
【化２】
を有する、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
Ｒ４が、水素であり；そしてＲ５が、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシからなる群より選択されるメンバーである、項目１０に記載の組成物。
（項目１５）
前記化合物が、式ＩＩＩ：
【化３】
を有する、項目１０に記載の組成物。
（項目１６）
Ｒ４がスクシニルである、項目１０に記載の化合物。
（項目１７）
Ｒ４がアセチルである、項目１０に記載の化合物。
（項目１８）
Ｒ３がトリメチルアンモニウム塩である、項目１０に記載の化合物。
（項目１９）
Ｒ３がトリエチルアンモニウム塩である、項目１０に記載の化合物。
（項目２０）
哺乳動物被験体に対してインターフェロンを送達するための方法であって、該方法は、ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子を含有する薬学的組成物の治療上有効な量を該被験体の上皮組織または器官に投与する工程、およびインターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系を投与する工程を包含し、ここで該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、そして該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、方法。
（項目２１）
前記因子が、ＳＹＮ３である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記因子がＳＹＮ３であり、かつ前記組成物中の該ＳＹＮ３の濃度が０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍｌである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記インターフェロンが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、δ−インターフェロン、γ−インターフェロンおよびそれらの融合インターフェロンからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記インターフェロンが、インターフェロンα−２ｂからなる群より選択され、融合インターフェロンがα−／２α−１、およびインターフェロンα−２ｅである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体が、ヒトであり、前記因子が、ＳＹＮ３であり、そして前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記αインターフェロンが、α１インターフェロンまたはα２インターフェロンである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記インターフェロンが、ヒトインターフェロンである、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物が、組織または器官に対して膀胱内に投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記組織または器官が、癌性である、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
前記組織または器官が、ヒト膀胱である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記投与が、ほぼ週１回、月２回、毎月および隔月からなる群より選択される間隔である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記投与が、所定の範囲内でインターフェロン遺伝子の発現を維持するために投与される組成物の投与の頻度または量に関して調節される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物が、約５０〜６００ｍｌの体積で投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記体積が、約１００〜３００ｍｌである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、カテーテルによって投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記カテーテルが、バルーンカテーテルであり、該カテーテルのバルーン部分が、膀胱の空隙体積を減少させるために挿入後に膨張される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記被験体が、再発性または反復性の膀胱癌患者である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体が、ＢＣＧ療法を用いて事前処置された、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記組織または器官が、気道組織もしくは器官、上部もしくは下部胃腸の組織もしくは器官、または腹膜組織もしくは器官である、項目２０に記載の方法。
（項目４０）
前記組成物が、約５分間〜約２時間の時間にわたって投与される、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
前記組成物中のＳＹＮ３の濃度が、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの量である、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記ホモログが、式：
【化４】
を有する、項目２３に記載の方法であって、
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；
ｍおよびｎは、個々に独立して、約０〜２から選択され；
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は、個々に独立して、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸは、ハロゲンおよび任意に置換されたカルボキシレートからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである、方法。
（項目４３）
前記ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログが、インターフェロンまたは遺伝子送達系との同時処方物中で投与される、項目２０に記載の方法。
（項目４４）
前記ＳＹＮ３組成物またはＳＹＮ３ホモログ組成物、および前記インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系が、別個に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目４５）
前記ＳＹＮ３組成物またはＳＹＮ３ホモログ組成物が、前記インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系の投与の前に投与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
キットであって、以下：
インターフェロンの送達を強化し得るＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む第一の容器；および
インターフェロンまたは遺伝子送達系を含む第二の容器であって、該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、第二の容器、
を備えるキット。
（項目４７）
前記第一の容器が、ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
前記第二の容器が、インターフェロンまたは遺伝子送達系の凍結乾燥処方物を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４９）
前記インターフェロン遺伝子が、αインターフェロン遺伝子である、項目４６に記載のキット。
（項目５０）
前記インターフェロン遺伝子が、ヒトである、項目４６に記載のキット。
（項目５１）
ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される遺伝子送達増強因子ならびに遺伝子送達系を含有する薬学的組成物であって、該遺伝子送達系は、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子は、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、薬学的組成物。
（項目５２）
前記遺伝子送達系が、組換えウイルスベクターを含む、項目５１に記載の薬学的組成物。
（項目５３）
前記組換えウイルスベクターが、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、項目５２に記載の薬学的組成物。
（項目５４）
前記因子が、ＳＹＮ３であり、前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンであり、前記遺伝子送達系が、組換えアデノウイルス遺伝子送達系である、項目５３に記載の薬学的組成物。
（項目５５）
前記組成物が、単位投薬量形態であり、前記因子の量が１〜２０００ｍｇである治療量の組成物を含む、項目５１に記載の薬学的組成物。
（項目５６）
哺乳動物被験体にインターフェロンを送達するための方法であって、該方法は、ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子および遺伝子送達系を含む薬学的組成物の治療上有効な量を該被験体の上皮組織または器官に投与する工程を包含し、該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、方法。
（項目５７）
前記遺伝子送達系が、ＤＮＡおよび陽イオン性脂質を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５８）
前記インターフェロンの発現を測定するために、尿がモニタリングされる、項目５１に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
他に規定しない限り、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において引用される、各々の刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、本開示と矛盾しない程度までその全体が参考として援用される。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（「ａ」、「ａｎ」）」、および「この、その（「ｔｈｅ」）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の言及を包含する。
【００１６】
１態様では、本発明は、上皮層または尿路上皮を有する組織に対するタンパク質または核酸の送達を増強する組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、組織または器官の細胞と、インターフェロンまたはインターフェロンをコードする遺伝子送達系とを、送達増強因子と組み合わせて接触させる工程を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、上皮と送達増強因子（例えば、ＳＹＮ３）とを接触させることによって、上皮に対するタンパク質（例えば、インターフェロン）の送達を増強する組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、膀胱の尿路上皮と１）インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系、および２）ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログとを接触させる工程を提供する。本発明は、膀胱に対する遺伝子送達系およびタンパク質のＳＹＮ３増強性送達が、ＳＹＮ３を用いて組換えアデノウイルス遺伝子療法で得られたものに対抗する量で生物学的に活性なタンパク質（例えば、インターフェロン）を送達する高度に有効な方法であるという発見に関する。これらの結果によって、特に、インターフェロンのＳＹＮ３増強送達が膀胱癌を治療するのに有効であることが示される。この結果によってまた、一般に、ＳＹＮ３およびそのホモログがまた、特に尿路上皮に関して、上皮組織の細胞に対する上皮性の障壁を横切って他の治療タンパク質を送達するのに有効であるはずであるということが示される。
【００１８】
（遺伝子送達系：）
「遺伝子送達系（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、細胞中のタンパク質遺伝子の発現をもたらす発現調節配列に作動可能に連結された、生物学的に活性なタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む。インターフェロン遺伝子送達系は、細胞中でインターフェロン遺伝子の発現をもたらす発現調節配列に作動可能に連結された、インターフェロンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
ポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチドモノマーからなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドとは、天然に存在する核酸、例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）、ならびに核酸アナログを包含する。核酸アナログとは、それらの天然には存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外のヌクレオチドと連結されて係合しているか、またはホスホジエステル結合以外の連結を通じて結合された塩基を含むヌクレオチドを包含する。従って、ヌクレオチドアナログとしては、例えば、限定はしないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホラミダイト、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）などが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動的なＤＮＡシンセサイザーを用いて合成され得る。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という用語は典型的には、大型のポリヌクレオチドをいう。「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は典型的には、短いポリヌクレオチド、一般には約５０未満のヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって提示される場合、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」と置き換わっているＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解される。「組換えポリヌクレオチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、天然には一緒に連結されていない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅されるかまたはアセンブルされた組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれてもよく、そしてベクターを用いて、被験体の適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」と呼ばれる。次いで、遺伝子は、組換え宿主細胞中で発現されて、例えば、「組換えインターフェロンポリペプチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を産生する。
【００２０】
「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、生物学的プロセス中で他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列であって、ヌクレオチドの規定の配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する配列の固有の特性、ならびにそれから得られる生物学的特性をいう。従って、ある遺伝子によって生成されるｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系において、このタンパク質を産生する場合、この遺伝子はこのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列に対してヌクレオチド配列が同一であり、配列表において一般に提供される、両方のコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして用いられる、非コード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするということができる。他に特定しない限り、「インターフェロンのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、お互いの縮重バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００２１】
「発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列であって、それに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するヌクレオチド配列をいう。「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、２つの部分の間の機能的関係であって、１部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が他の部分（例えば、配列の転写）に対して作用を生じる関係をいう。発現調節配列としては、例えば、限定はしないが、プロモーター（例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナルおよび終止コドンの配列を挙げることができる。
【００２２】
発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞発現系によって供給され得る。発現ベクターとしては、当該分野で公知のベクター、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれるプラスミド）および組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルスが挙げられる。
【００２３】
１つの実施形態では、特定の発現調節配列を使用して、目的の組織により優先的に用いられるプロモーターおよび／または他の発現エレメントの使用によって、特定のタイプの組織中のインターフェロン遺伝子の選択的発現を得ることができる。公知の組織特異的プロモーターの例としては、筋肉および心臓組織におけるジストロフィンｃＤＮＡ発現の発現を指向するように用いられている、クレアチンキナーゼのプロモーター（Ｃｏｘ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：７２５−７２９（１９９３））；Ｂ細胞における遺伝子の発現のための免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター；それぞれ肝臓系統の細胞およびヘパトーマ細胞の標的細胞に対するアルブミンまたはαフェトプロテインプロモーターが挙げられる。肝臓についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼプロモーター（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７（５）：１８８１〜１８９３（１９８７））；ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ−１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（４）：２３０６〜２３１０（１９９０）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２（３）：１３９６〜１４０３（１９９２））；ヒトＣ応答性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５（７）：４１３６−４１４２（１９９０））；ヒトグルコキナーゼプロモーター（Ｔａｎｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，６（７）：１０７０−８１（１９９２）；コレステロール７αヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ−７）プロモーター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６８１−９（１９９４））；βガラクトシダーゼα−２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３４）：２０８６３−８（１９９０）；インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）プロモーター（Ｂａｂａｊｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９６（１）：４８０−６（１９９３））；アルドラーゼＢプロモーター（Ｂｒｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２９４（Ｐｔ２）：４７３−９（１９９３））；ヒトトランスフェリンプロモーター（Ｍｅｎｄｅｌｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（１９）：５７１７〜２１（１９９０）；コラーゲンＩ型プロモーター（Ｈｏｕｇｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４（２）：８０８−１４（１９９４））。前立腺の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター（Ｂａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１７（２）：１８８−９４（１９９４）；９４の前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ ９４）プロモーター（Ｎｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡＣＴＡ，１０９８（２）：２４７―９（１９９１））；前立腺特異的抗原複合体プロモーター（Ｃａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１−６）：１２７−３５（１９９３））；ヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ−１）（Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１１（４）：１８８−９１（１９９３）が挙げられる。胃組織の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないがヒトＨ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅαサブユニットプロモーター（Ｔａｎｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９８：（２−３）：１３７−４１（１９９２））が挙げられる。膵臓の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）（Ｄｕｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（１９）：１４４７０−５（１９９３））；エラスターゼ１転写エンハンサー（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７（５）：７７４−８６（１９９３））；膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサープロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１（９）：４４２３−３０（１９９１）；Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，４（８）：１３１６−２１（１９９０））；膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｆｏｎｔａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（２８）：７００８−１４（１９９１））が挙げられる。子宮内膜の例示的組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ウテログロビンプロモーター（Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６２２：６９−７９（１９９１））が挙げられる。副腎細胞の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、コレステロール側鎖切断（ＳＣＣ）プロモーター（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１７１３−２０（１９９０）が挙げられる。全身の神経系の例示的な組織特異的発現系としては、限定はしないが、γ−γエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーター（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ、５（２）：１８７−９７（１９９０））が挙げられる。脳の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、神経フィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）プロモーター（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（１８）１３４４４−５０（１９９４））が挙げられる。リンパ球の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ヒトＣＧＬ−１／グランザイムＢプロモーター（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３６）：２４４３３−８（１９９１））；末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、λ５、ＶｐｒｅＢおよびｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンプロテインキナーゼｐ５６ｌｃｋ）プロモーター（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１（１０）：５２２９−４３（１９９１））；ヒトＣＤ２プロモーターおよびその３’転写エンハンサー（Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９（１０）：３１２９−３６（１９９０））、ならびにヒトＮＫ細胞およびＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７（２）：１０２−７（１９９３））が挙げられる。結腸の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター（Ｔａｌａｍｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，９１（１）：５３−６０（１９９３））；器官特異的新生抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）（ＯＳＮ），ｍｗ４０ｋＤａ（ｐ４０）プロモーター（Ｉｌａｎｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７（２）：１１９−２８（１９９３））；結腸特異的抗原Ｐプロモーター（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，７３（３ ｓｕｐｐ．）８６４−７７（１９９４））が挙げられる。乳房細胞の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ヒトαラクトアルブミンプロモーター（Ｔｈｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，６１（５）：７７３−５（１９９０））が挙げられる。
【００２４】
「インターフェロン遺伝子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅ）」という用語の使用は、インターフェロンの発現を指向する遺伝子を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる「遺伝子（ｇｅｎｅ）」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列を指すものとする。この定義は、種々の配列多型性、変異および／または配列変異体であって、このような変更が遺伝子産物の機能に影響しないものを包含する。「遺伝子（ｇｅｎｅ）」という用語としては、コード配列だけではなく、プロモーター、エンハンサーおよび末端領域のような調節性領域を挙げることができる。この用語はさらに、選択的スプライシング部位から生じる変異体とともに、ｍＲＮＡ転写物からスプライシングされた全てのイントロンおよび他のＤＮＡ配列を包含し得る。ポリペプチドをコードする核酸配列は、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指向する、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列であっても、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列であってもよい。これらの核酸配列としては、全長核酸配列、および全長タンパク質に由来する非全長配列の両方が挙げられる。この配列は、特定の宿主細胞においてコドン優先を提供するために導入され得るネイティブの配列（単数または複数）の縮重コドンを包含することがさらに理解される。
【００２６】
１態様では、本発明は、上皮と送達増強因子（例えば、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログ）とを接触させることによって、上皮に対するタンパク質（例えば、インターフェロン）の送達を増強する組成物および方法を提供する。このタンパク質は、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子）、転移抑制因子または腫瘍抑制タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、任意の１つ以上のマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ｐ５３、および血管新生阻害因子（血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の血管形成作用に対向するタンパク質因子、転移抑制因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）およびＢＣＧ活性を増大する因子である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質療法のタンパク質は、抗体であり、この抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはＦａｂフラグメントであってもよい。この抗体は、キメラまたはヒト化抗体であってもよい。これらの抗体としては、限定はしないが、サイトカインに対する抗体ならびにＩ型およびＩＩ型インターフェロン（例えば、抗インターフェロンα、抗インターフェロンβ、抗インターフェロンδ、抗インターフェロンγ）、ならびにインターロイキン（例えば、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−４、抗Ｉｌ−６、抗ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０）に対する抗体が挙げられる。本発明の状況では、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）および組換え産生された結合パートナーを含むことが理解される。抗体は、Ｋａが１０−７Ｍ以上である場合に、この標的に対して反応性であることが理解される。
【００２８】
ポリクローナル抗体は、種々の温血動物から当業者によって容易に生成され得る。モノクローナル抗体はまた、従来の技術を用いて容易に生成され得る（例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号；同第４，５４３，４３９号；および同第４，４１１，９９３号を参照のこと；またＫｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，（１９８０）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８））を参照のこと。好ましい抗体の調製はさらに、以下の実施例の節に記載される。
【００２９】
本明細書において用いられるインターフェロンという用語は、インターフェロンポリペプチドの全てのクラスおよびサブクラス、ならびにその欠失、挿入または保存的アミノ酸置換を含む置換変異体、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメント、ならびにその対立形質を含むこととする。種々の適切なインターフェロンポリペプチドは、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチドは、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンおよびωインターフェロン（例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンおよびωインターフェロン）と通常命名されるインターフェロンおよびそれらの組み合わせを含む、Ｉ型またはＩＩ型のインターフェロンであり、αインターフェロンのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、αインターフェロンは、α１またはα２−インターフェロンである。いくつかの実施形態では、この遺伝子はインターフェロンα−２ｂをコードする。
【００３０】
いくつかの実施形態では、インターフェロンタンパク質（タンパク質として投与される場合、または遺伝子送達系によってコードされる）は、野生型インターフェロンポリペプチドである。他の実施形態では、インターフェロンは、野生型インターフェロンポリペプチドまたはその融合タンパク質に対して実質的に同一である。２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の状況では、「同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」パーセントという用語は、最大対応について比較および整列された場合、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列（単数または複数）をいう。２つの核酸またはポリペプチドの状況では、「実質的に同一な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」という用語は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて測定される場合、最大対応について比較および整列されるときに、少なくとも７０％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列（単数または複数）をいう。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般的に利用可能である。配列同一性のパーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の間のマッチが偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、この参照配列に類似であるとみなされる。
【００３１】
他の実施形態では、インターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる場合）は実質的に、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ネイティブまたは野生型ポリペプチドの配列に対して同一である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチド（投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸または全長のストレッチにわたって、野生型インターフェロンポリペプチドの配列に対して９９％、９８％、９５％または９０％同一である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ヒト野生型αインターフェロンポリペプチドの配列に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、遺伝子送達系によってコードされるインターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ヒト野生型ポリペプチドの配列に対して９９％、９８％、９５％または９０％同一である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、インターフェロン（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ハイブリッドインターフェロンである。種々のインターフェロンサブタイプ配列の組み合わせを含むハイブリッドαインターフェロン遺伝子の構築物（例えば、αおよびΔ、αおよびβ、ならびにαおよびＦ）は、米国特許第４，４１４，１５０号、同第４，４５６，７４８号および同第４，６７８，７５１号に開示される。米国特許第４，６９５，６２３号、同第４，８９７，４７１号および同第５，８３１，０６２号は、天然に存在するαインターフェロンサブタイプポリペプチドの間で各々の位置で見られる共通のまたは優勢なアミノ酸を含むアミノ酸配列を有し、そしてコンセンサスヒト白血球インターフェロンと呼ばれる、新規なヒト白血球インターフェロンポリペプチドを開示する。本発明の１つの実施形態では、ハイブリッドインターフェロンはインターフェロンα２ α１である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、インターフェロン（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、インターフェロンαである。組換えインターフェロンαは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローニングされて発現されている（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１３４３−１３４９（１９８０）；Ｓｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１３４３−１３４７（１９８０）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：２０−２６（１９８１）；Ｈｅｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８５：２２７−２６０（１９８５））。このような実施形態のいくつかでは、インターフェロンはヒトインターフェロンαである。いくつかの実施形態では、インターフェロンαは、インターフェロンα２ａまたは２ｂである（例えば、ＷＯ９１／１８９２７を参照のこと）。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗癌性、抗感染性または免疫系調節生物活性を有するインターフェロンである。いくつかの実施形態では、投与されたインターフェロンタンパク質は、半合成のタンパク質ポリマー結合体（例えば、ＰＥＧ化されたインターフェロン）である。いくつかの例示的な実施形態では、インターフェロンはＩ型インターフェロンα（ＩＦＮ−α）であり、抗感染性および抗腫瘍活性を有するか、またはＰＥＧ化ＩＦＮα２ｂである。１２，０００Ｄａのモノメトキシポキエチレングリコール（ＰＥＧ−１２０００）ポリマーが結合され得る。ＰＥＧ結合体化は、血清半減期を拡大増大させて、それによって患者に対する生物学的能力変更することなくＩＦＮ−α２ｂに対する患者の曝露を長くすると考えられる。
【００３４】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、アミノ酸残基からなるポリマー、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成の天然に存在しないアナログ、関連の天然に存在する構造的変異体、およびその合成の天然に存在しないアナログをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチドシンセサイザーを用いて合成され得る。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は典型的には、大きいポリペプチドをいう。「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は典型的には、短いポリペプチドをいう。「同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、ポリペプチドにおける機能的または構造的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をいう。以下の６つの群の各々は、お互いについて同類置換である、アミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」という用語は、当該分野で周知の技術によって測定した場合、任意の抗ウイルスまたは抗増殖性または抗癌活性をいう（例えば、Ｏｐｅｎａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５（１９８３）を参照のこと）。
【００３６】
「対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍ）」とは、同じ遺伝子座を占有するポリペプチドの任意の２つ以上の多型をいう。対立形質の変異体は、変異を通じて天然に生じ、そして集団内の表現型多型性を生じ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされたポリペプチドの変化はない）であってもよく、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。「対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍｓ）」はまた、遺伝的な対立遺伝子変異体のｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、インターフェロンは対立形質である。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「アルキル（ａｌｋｙｌ）」という用語は、分枝した炭化水素、未分枝の炭化水素、もしくは環状の炭化水素、またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全に飽和されても、単価または多価不飽和であってもよく、そして指定される多数の炭素原子を有する、二価置換および多価置換を包含してもよい（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）飽和された炭化水素置換基の例としては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、オクタ−デシル、２−メチルペンチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロペンチルメチルのような基が挙げられる。この置換基は、アルキル置換基、例えば、カルボキシメチル、トリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピルなどを形成するために、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、またはチオ、シアノ、アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミドなどのような鎖に対して通常結合される１つ以上の官能基で作動可能に置換されてもよい。不飽和アルキル置換基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有する置換基である。不飽和アルキル基の例としては、限定はしないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにそれ以上のホモログおよび異性体が挙げられる。置換基は、飽和炭化水素について記載されたような鎖に対して一般的に結合される、１つ以上の官能基で置換されてもよい。
【００３８】
「アリール（ａｒｙｌ）」という用語は、多価不飽和、典型的には芳香族の炭化水素置換基を意味し、この基は、一緒に縮合されるかまたは共有結合される単環または多環（３環まで）であってもよい。
【００３９】
「ヘテロアリール（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される０〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）をいい、ここで窒素原子およびイオウ原子は任意選択的に酸化され、窒素原子（単数または複数）は任意選択的に四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通じて分子の残りに対して結合され得る。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系は、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルコキシルまたはアミドのような環系に通常結合される、１つ以上の官能基でさらに置換されてもよい。
【００４０】
用語「アシル（ａｃｙｌ）」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ−置換基を指し、ここでＲは、上記のようなアルキルまたはアリール、例えば、限定はしないが、ベンゾイル、スクシニル、アセチル、プロピオニルまたはブチリルである。
【００４１】
「ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）」という用語は、置換基−ＯＨ−を意味する。
【００４２】
「アルコキシ（ａｌｋｏｘｙ）」という用語は、置換基−ＯＲ−を意味し、ここでＲはアルキルである。
【００４３】
「アミノ（ａｍｉｎｏ）」という用語は、アミノ連結（−ＮＲＲ’）を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素置換基、アルキル置換基、またはアリール置換基である。
【００４４】
「カルボキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）」という用語は、置換基−ＯＣ（Ｏ）Ｒ−を意味し、ここでＲは任意選択的に置換されたアルキルまたはアリールである。
【００４５】
「アシルオキシ（ａｃｙｌｏｘｙ）」という用語は、置換基−（ＣＲＲ’）ｍＣ（Ｏ）ＯＲ’’−を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立してアルキル置換基、アリール置換基または水素置換基からなる群より選択され、そしてＲ’’は、水素またはアルキル置換基であり、そしてｍは１〜８の間の包括的な整数である。
【００４６】
「ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）」または「ハロ（ｈａｌｏ）」という用語は、置換基Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００４７】
「糖残基（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）」という用語は、ホモオリゴ糖置換基（１タイプの単糖類を含むオリゴ糖類）または異種オリゴ糖類置換基（１つより多くのタイプの単糖類を含むオリゴ糖類）として連結された２つ以上の単糖置換基を含み得る単糖置換基を指す。好ましい実施形態では、同種および異種のオリゴ糖置換基は、２〜１０個の単糖単位から構成される。単糖類は、五炭糖または六炭糖の残基を含み得、そして残基は、環化型または非環化（開放鎖）型として存在し得る。単糖類が開放鎖型である場合、カルボニル炭素の酸素原子は、−ＲＲ’−で置換されてもよく、ここでＲおよびＲ’は独立してアルキル置換基、ハロゲン置換基、ヒドロキシル置換基、水素置換基、アミノ置換基またはアルコキシ置換基の群から選択される。好ましいオリゴ糖類としては、五炭糖−五炭糖の二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖五炭糖の二糖類基が挙げられる。単糖類は、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトースまたはタロースの群から選択されてもよく、それによって単糖類上の１つ以上のヒドロキシル基は、水素、アルキル置換基、アルコキシ置換基、アミノ置換基またはアシル置換基で置換されてもよい。
【００４８】
膀胱上皮または「尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）」は、膀胱内面の内側を覆い、従ってその内容物に近位である。尿路上皮はまた、腎盂、尿管および膀胱の内面の内側を覆い、そして尿の保持を可能にする緻密な障壁を形成し、一方でイオン、溶質および毒性代謝物の上皮障壁を横切る調節不可能な移動を妨げる。この透過性障壁は、器官自体を満たして空にする時の圧力において周期的変化を受けている場合でさえ正常に維持されなければならない。ほとんどの膀胱癌がこの上皮の細胞に由来する。尿道、尿管および腎盂はまた、この移行上皮によって内側を覆われるので、膀胱にみられる同じタイプの癌はまた、これらの部位でも生じ得る。いくつかの実施形態では、この方法および組成物は、尿道、尿管および腎盂におけるこれらの部位でこのような癌を治療するために用いられ得る。
【００４９】
この遺伝子送達系は一般に、真核生物細胞におけるインターフェロン遺伝子の発現を指向し得る真核生物発現ベクターの形態で提供される。真核生物発現ベクターの例としては、ウイルスおよび非ウイルスベクターが挙げられる。「真核生物発現ベクター（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、インターフェロン発現カセットを含む従来の組換えＤＮＡ技術によって調製されるウイルスおよび非ウイルスベクターをいう。本明細書において用いる場合、「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語を用いて、形質導入された哺乳動物細胞におけるインターフェロン配列の転写および翻訳を生じるために、インターフェロンコード配列に作動可能に連結される発現調節エレメントを含む、インターフェロンコード配列の転写および翻訳を指向し得るヌクレオチド配列を規定する。形質導入された細胞においてヌクレオチド配列の発現を達成するために有効な種々のウイルスおよび非ウイルス送達ベクターは当該分野で公知である。例えば、Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ．編）１９９８Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ １−１７２頁を参照のこと。
【００５０】
標的細胞に対してインターフェロン遺伝子を誘導するために用いられる非ウイルス送達系の例としては、インターフェロンの発現を指向し得る発現プラスミドが挙げられる。発現プラスミドは、標的細胞においてＤＮＡ配列の発現を達成し得る非選択的条件下で細胞生存について正常なゲノムとは異なりかつ必須のものではない、自己複製を行う染色体外の細胞性ＤＮＡ分子である。発現プラスミドはまた、プロモーター、エンハンサーまたは治療遺伝子の発現および／または分泌を補助する他の配列を含んでもよく、また発現ベクター中に含まれてもよい。さらなる遺伝子、例えば、薬物耐性をコードする遺伝子が、組換えベクターの存在についての選択またはスクリーニングを可能にするために含まれてもよい。このようなさらなる遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性、多剤耐性、チミジンキナーゼ、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５１】
インターフェロン遺伝子を含む発現プラスミドは、リポソーム中に包含されてもよい。リポソームは、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散剤、層状相などを含む。リポソームキャリアを用いる細胞への核酸の送達は当該分野で周知である。例えばＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０），Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，１９８３年７月１９日発行、米国特許第４，３９４，４４８号、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号に記載されるような種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能である。本発明の実施において有用なリポソームは、天然および負に荷電されたリン脂質およびコレステロールのようなステロールを一般に含む１つ以上の標準的な小胞形成脂質から形成され得る。このような脂質形成小胞の例としては、米国特許第５，６５０，０９６号に開示されるようなＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＰＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ−ＨＰ、ｎ−スペルミジンコレステロールカルバメートおよび他の陽イオン性脂質が挙げられる。脂質の選択は一般に、例えば、血流中のリポソームのサイズ、酸不安定性およびリポソームの安定性を検討することによって導かれる。１９９１年５月７日発行の米国特許第５，０１３，５５６号および１９９３年５月２５日発行の同第５，２１３，８０４号に記載されるような、ポリエチレングリコールコーティング（いわゆる「ＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｙｌａｔｉｏｎ）」）などの血清半減期を拡大するためのさらなる成分もリポソーム処方物に加えられてもよい。
【００５２】
特定の細胞に対する非ウイルスインターフェロン遺伝子送達系の直接送達を行うため、細胞標的化を容易にする非ウイルス送達系へエレメントを組み込むことが有利であり得る。例えば、脂質カプセル化発現プラスミドは、標的化を容易にするために改変された細胞表面レセプターリガンドを組み込んでもよい。単純なリポソーム処方物が投与され得るが、本発明の本発明の所望の組成物を充填されるかまたはそれを修飾されたリポソームは、全身的に送達され得るか、または目的の組織に指向されてもよく、ここで次にこのリポソームは選択された治療／免疫原性ペプチド組成物を送達する。このようなリガンドの例としては、抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体またはそれらの機能的フラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’）が挙げられる。あるいは、本発明のＤＮＡ構築物は、１９９２年１１月２４日発行、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１６６，３２０号、および１９９７年６月３日発行、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３５，３８３号に記載のような標的化部分に対してポリリシン部分を通じて連結され得る。
【００５３】
本明細書に例示されるような本発明の１つの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルス（単数または複数）およびウイルスベクター（単数または複数）という用語は、本明細書においては互換可能に用いられる。本発明の実施において有用なウイルスとしては、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科またはピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｎａｖｉｒｉｄｉａｅ）から選択された、組換え可能に改変されたエンベロープまたは非エンベロープのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。ウイルスゲノムはインターフェロンの発現を提供する従来の組換えＤＮＡ技術によって改変されてもよく、複製欠損、条件的複製または複製コンピテントになるように操作されてもよい。親のベクターの特性の各々の有利なエレメントを開発するキメラウイルスベクター（例えば、Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６−８７０を参照のこと）はまた、本発明の実施において有用であり得る。ウイルス骨格がウイルスベクターのパッケージングに必要な配列のみを含み、そして任意選択的にインターフェロン発現カセットを含んでもよい最小ベクター系がまた、本発明の実施において使用され得る。ある場合には、既存の免疫応答の回避のような好ましい病原性の特徴を保有する、投与されるべき種とは異なる種に由来するベクターを使用することが有利であり得る。例えば、ヒト遺伝子治療のためのウマヘルペスウイルスベクターは、１９９８年８月５日公開ＷＯ９８／２７２１６に記載されている。このベクターは、ヒトでの治療に有効であることが記載されている。なぜなら、このウマウイルスはヒトに毒性ではないからである。同様に、ヒツジアデノウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療に用いられ得る。なぜならそれらは、ヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避することが請求されているからである。このようなベクターは、１９９７年４月１０日公開ＷＯ９７／０６８２６に記載されている。
【００５４】
多くのウイルスが、広範囲の細胞型に影響する能力を示す。しかし、いくつかの適用では、細胞の特定の小集団にのみ影響することが望ましくあり得る。結果として、種々の技術によって、選択的または「標的とされた（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」ベクターが、特定の細胞タイプの成熟ウイルス粒子の優先的な感染性を生じることを容易にするように開発した。細胞タイプ特異性または細胞タイプ標的化はまた、特徴的な広範な感染性を有するウイルス、例えばアデノウイルスに由来するベクターにおいて、ウイルスエンベロープタンパク質の改変によって達成され得る。例えば、細胞標的化は、固有の細胞表面レセプターとの特異的相互作用を有する改変ノブおよびファイバードメインの発現を達成するために、ウイルスゲノムのノブおよびファイバーコード配列の選択的改変によって、アデノウイルスベクターで達成されている。このような改変の例は、Ｗｉｃｋｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）：８２２１−９２２９（アデノウイルスファイバータンパク質へのＲＧＤペプチドの組み込み）；Ａｒｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２７：２３９−２４４（眼および生殖器官に対する向性を達成するためのアデノウイルスファイバー遺伝子の改変）；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｍｏｎｉｎｅ（１９９６）ＴＩＧ １２（１０）：４００−４０５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（６）：４７８２−４７９０；Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８（アデノウイルスファイバータンパク質へのガストリン放出ペプチドフラグメントの組み込み）；およびＯｈｎｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７６３−７６７（ＳｉｎｄｂｉｓウイルスへのプロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの組み込み）に記載されている。細胞特異的標的化の他の方法は、エンベロープタンパク質への抗体または抗体フラグメントの結合体化によって達成されている（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６−６８６９，Ｗａｔｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１００４−１０１２；Ｄｏｕｇｌａｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１５７４−１５７８を参照のこと。このような標的化改変の１つ以上を包含するウイルスベクターを任意選択的に、本発明の実施において使用して、選択的な感染および肺組織、特に肺の上皮組織中でのインターフェロンの発現を増強し得る。
【００５５】
本明細書に例示されるような本発明の１つの実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターという用語は総称的に、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されないマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを指す。詳細には、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ−Ｆの亜属、ならびにその個々の血清型、個々の血清型およびＡ−Ｆの亜属が挙げられ、限定はしないが、これらには、ヒトアデノウイルス型１、２、３、４、４ａ、５、６、７、８、９、１０、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９ａ、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、および９１が挙げられる。ウシアデノウイルスという用語は、限定はしないが、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型および１０型を包含する。イヌアデノウイルスという用語は、限定はしないが、イヌ１型（株ＣＬＬ、Ｇｌａｘｏ、ＲＩ２６１、Ｕｔｒｅｃｔ、Ｔｒｏｎｔｏ２６−６１）および２を包含する。ウマアデノウイルスという用語は、限定はしないが、ウマ１型および２型を包含する。ブタアデノウイルスという用語は、限定はしないがブタ３型および４型を包含する。内因性導入遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの使用は当該分野で周知である。例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｗ−Ｗ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１３−１３８を参照のこと。１つの実施形態では、インターフェロン配列の発現のためのアデノウイルスベクターは、任意選択的に第ＩＸプロテインの機能を欠失している、標的組織において実質的に複製不能なウイルスを生じる、アデノウイルスＥ１遺伝子の排除によって作製された血清型２または５の複製欠損ヒトアデノウイルスである。好ましい組換えウイルスベクターは、第ＩＸプロテイン遺伝子が欠失しているアデノウイルスベクター送達系である。本発明と同じ譲受人に譲渡され、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される、米国特許第６，２１０，９３９号に開示されるこのようなシステムを参照のこと。
【００５６】
好ましいベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスのゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実施では、このベクターは、ヒトアデノウイルスゲノム由来である。好ましいベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２または５に由来する。このようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂコード領域における改変または欠失によって（「複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）」とみなされるポイントまで）減弱され得る。特定の発現特徴を達成するか、または反復投与を可能にするか、または免疫応答を低下させるためのウイルスゲノムへの他の改変が好ましい。
【００５７】
あるいは、ウイルスベクターは、条件的に複製されても、または複製コンピテントであってもよい。条件的に複製するウイルスベクターを用いて、望ましくない広範なスペクトルの感染を回避しながら、特定の細胞タイプにおいて選択的な発現を達成する。ウイルスゲノムは、特定の条件下でのみ複製または発現を達成する誘導性プロモーターを含むように改変されてもよい。誘導性プロモーターの例は、当該分野で公知である（例えば、ＹｏｓｈｉｄａおよびＨａｍａｄａ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３０：４２６−４３０；Ｉｉｄａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９）：６０５４−６０５９；Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１（９）：７１２８−７１３１；Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：５０９７−５１０５；およびＤｒｅｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４６）；２９３６４−２９３７１を参照のこと。ウイルスはまた、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ００／２２１３７、２０００年４月２０日に公開された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５２、およびＨｏｗｅ，Ｊ．ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ＷＯ００２２１３６、２０００年４月２０日公開、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５１記載されるウイルスのような選択的に複製するウイルスとなるように設計されてもよい。このウイルスはまた、特定の細胞タイプにおける複製について減弱されるように改変されてもよい。例えば、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子に特異的な欠失があるアデノウイルスｄｌ１５２０（ＢａｒｋｅｒおよびＢｅｒｋ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６：１０７）は、ヒトでの治療効果を伴って用いられている。このようなベクターはまた、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９９７年１０月１４日発行、米国特許第５，６７７，１７８号）および１９９８年１２月８日発行ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの米国特許第５，８４６，９４５号に記載されている。
【００５８】
本発明のベクターは、ＩＲＥＳエレメントの使用を通じてタンデムで、または独立調節性プロモーターを通じて、インターフェロン遺伝子に対するさらなる導入遺伝子をコードするように改変され得る。
【００５９】
本発明は、標的組織または器官の上皮に対するタンパク質または核酸の送達を、このタンパク質（例えば、インターフェロン）または核酸とともに処方された場合に増強する送達増強化合物を提供する。「送達増強化合物（ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「送達増強因子（ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」としては、膀胱内投与の際、上皮または尿路上皮に対してタンパク質または核酸の送達を強化する任意の化合物が挙げられる。タンパク質に関して、増強された送達は、標的組織または器官の上皮の細胞に接触するタンパク質の量の増大か、または上皮（例えば、尿路上皮）の細胞に入るタンパク質の量の増大のいずれかまたは両方によって確認され得る。特定の化合物がタンパク質の送達の増強に有効であるか否かの決定は、当業者によって容易に確認され得る。尿路上皮によるタンパク質の保持は、任意の手段、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光標識の検出、遺伝子発現を含む細胞活性の調節によって測定され得る。
【００６０】
遺伝子送達系に関して、本発明は、標的細胞、組織または器官に対するインターフェロン遺伝子の送達を増強する送達増強化合物を提供する。増強された送達は、各々の細胞に入るインターフェロン遺伝子もしくは遺伝子送達系のコピー数の増大によって、または例えば、インターフェロンもしくはインターフェロン遺伝子送達系を取り込む、組織もしくは器官中の細胞の割合の増大によって、そのいずれかまたはその両方で確認され得る。送達増強化合物と組み合わせた、組織または器官へのインターフェロン遺伝子送達系の投与によって、細胞内に送達され発現されるインターフェロン遺伝子の量における増大が、送達増強化合物の非存在下で投与された場合にこの細胞に送達されて発現される遺伝子の量に対応して生じる。特定の化合物が核酸送達系の送達を増強するのに有効であるか否かを決定することは当業者に公知の方法による。翻訳およびタンパク質発現を評価するために、βガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を、核酸送達系に組み込んで、増強された遺伝子発現のレベルを評価するために容易にアッセイ可能なシグナルを生成することができる。転写および複製を評価するために、ＤＮＡのコピーの存在をＰＣＲ分析によって評価してもよい。
【００６１】
特定の送達増強化合物は、不斉の炭素原子（光学的中心）または二重結合を保有し得る；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は全て、本発明の範囲内に包含されるものとする。例えば、対のエナンチオマーの単独のジアステレオマーは、適切な溶媒、例えば、メタノールもしくは酢酸エチルまたはそれらの混合物からの分別晶出によって得ることができる。このようにして得られたエナンチオマーの対は、従来の手段によって、例えば、分割剤のような光学活性な酸の使用によって、個々の立体異性体に分離され得る。あるいは、本発明の化合物の任意のエナンチオマーは、光学的に純粋な出発物質または立体配置が公知の試薬を用いて立体特異的合成によって得ることができる。
【００６２】
送達増強化合物は、互変異性体とも呼ばれる水素結合の種々のポイントが存在し得る。このような例は、ケトンおよびケト−エノール互変異性体として公知のそのエノール型であってもよい。個々の互変異性体およびその混合物は、本発明の処方物によって包含される。
【００６３】
送達増強化合物は、その原子の１つ以上で原子同位体の天然ではない比を有してもよい。例えば、化合物は、トリチウムまたは炭素−１４のような同位体で放射性標識されてもよい。本発明の化合物の全ての同位体バリエーションは、放射性であるか否かにかかわらず、本発明の範囲内である。「基（ｇｒｏｕｐ）」または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」が化合物の別の部分に結合される化合物処方において記載される場合、この「基」または「部分」に相当するラジカルであって、Ｈ原子が除去されて形成されているラジカルが意味されることが理解されるべきである。この送達増強化合物は、薬学的に受容可能な酸付加塩、例えば、無機および有機の酸の使用に由来する塩の形態で単離されてもよい。このような酸としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸などを挙げることができる。さらに、酸の機能を有する特定の化合物は、対イオンがナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなどから、そして有機塩基から選択され得るその無機塩の形態であってもよい。「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ）」という用語は、無機の塩基または酸および有機の塩基または酸を含む薬学的に受容可能な無毒性の塩基または酸から調製される塩をいう。
【００６４】
例示的な送達増強化合物は、各々が本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として援用されている、米国特許第６，１６５，７７９号、および１９９７年７月８日出願、米国特許出願第０８／８８９，３５５号および２０００年８月２８日出願、米国特許出願第０９／６５０，３５９号において教示されている。このような化合物としては、限定はしないが、崩壊剤、アルコール、グリコール、サーファクタント、胆汁塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液および酢酸塩が挙げられる。アルコールとしては、例えば、脂肪族アルコール、例えばエタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコールが挙げられる。グリコールとしては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の低分子量グリコール、例えば、グリセロールおよびトリグリセロールが挙げられる。アセテート、例えば、酢酸、グルコン酸および酢酸ナトリウムは、送達増強化合物のさらなる例である。高張性塩溶液、例えば１Ｍ ＮａＣｌも、送達増強化合物の例である。サーファクタントの例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびリゾレシチン、ポリソルベート８０、ノニルフェノキシ−ポリオキシエチレン、リゾホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール４００、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンエタノール、ポリグリコールエーテルサーファクタントおよびＤＭＳＯが挙げられる。胆汁酸塩、例えば、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸および硝酸銀などの他の収斂剤も、硫酸プロタミンのような四級アミンなどのヘパリンアンタゴニストが用いられ得るように、用いられてもよい。シクロオキシゲナーゼインヒビター、例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）例えば、ヨードメタシン、ナプロキセンおよびジクロフェナクもまた適切である。
【００６５】
送達増強化合物として機能し得る界面活性剤としては、例えば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤が挙げられる。例示的な界面活性剤としては、限定はしないが、タウロコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、セチルピリジウム（ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｕｍ）、塩化ベルコニウム（ｂｅｎａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４界面活性剤、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロラムイミドプロピル）ジメチルアンモニオール］−１−プロパンスルホネート、ヒドレート、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００界面活性剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）―Ｆ６８界面活性剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０界面活性剤およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０界面活性剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【００６６】
好ましい送達増強化合物の１つの例は、例えば、コール酸塩誘導体であるＢｉｇ ＣＨＡＰである（例えば、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第６６巻７３４−７４９を参照のこと。特に好ましい送達増強化合物は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩおよびＶＩＩの化合物ならびにその薬学的に受容可能な塩である。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明は、インターフェロンおよび式Ｉ：
【００６８】
【化５】
を有する少なくとも１つの送達増強化合物を含む組成物を提供し、ここでＸ１がそしてＸ２が
【００６９】
【化６】
からなる群より選択され、そしてＸ３は、糖類基であり、ここで糖類基は、五炭糖単糖類基、六炭糖単糖類基、五炭糖−五炭糖二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖−五炭糖の二糖類基からなる群より選択され得る。他の糖類基としては、ホモオリゴ糖類またはヘテロオリゴ糖類のいずれかに連結された１つより多くの単糖類を挙げることができる。好ましい単糖類としては、五炭糖および／または六炭糖の残基が挙げられる。例えば、糖類基は、五炭糖の単糖類基、六炭糖の単糖類基、五炭糖−五炭糖二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖−五炭糖の二糖類基からなる群より選択され得る。Ｘ３の好ましい糖類基の１つの例はラクトースである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、式Ｉの送達増強化合物は、３つ以上の糖類基から構成されるＸ３糖類基を有する。好ましくは、糖類基は１〜８個の単糖類、より好ましくは１〜４個の単糖類、そして最も好ましくはおよそ２〜３個の単糖類を有する。三糖類の使用によって、例えば、溶解度を高める化合物を得ることができる。
【００７１】
さらなる実施形態では、Ｘ１およびＸ２は両方とも
【００７２】
【化７】
であり、そしてＸ３はグルコース基である。
【００７３】
本発明による使用のための例示的送達増強剤としては、式ＩＩ：
【００７４】
【化８】
の化合物が挙げられ、ここでＲ１およびＲ２が個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；ｍおよびｎが個々に独立して、約０〜２から選択され；Ｒ３が、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は個々に独立して、水素、糖残基、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８が独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸが薬学的に受容可能な対イオンからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである。いくつかの実施形態では、対イオンは水素または任意選択的に置換されたカルボキシレートである。
【００７５】
１つの実施形態では、式ＩＩの例示的化合物は、両方がヒドロキシル基であるＲ１およびＲ２を有する。別の実施形態では、式ＩＩの化合物は、ｍおよびｎが各々１である化合物である。別の実施形態では、式ＩＩの化合物は、Ｒ４が水素である化合物である；そしてＲ５は、水素、糖残基、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシからなる群より選択されるメンバーである。
【００７６】
１つの実施形態では、送達増強化合物は式ＶＩ：
【００７７】
【化９】
を有する。
【００７８】
別の実施形態では、送達増強化合物は、式ＶＩＩ（ＳＹＮ３）：
【００７９】
【化１０】
を有する。
【００８０】
別の実施形態では、Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つがスクシニルまたはアセチルである。別の実施形態では、Ｒ３がトリメチルアンモニウム塩である。
【００８１】
別の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は個々に独立して、水素、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８が独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸが薬学的に受容可能な対イオンからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである。
【００８２】
この方法および組成物における使用のための好ましい送達増強化合物の１つの例は、式ＶＩＩを有するＳＹＮ３である。ＳＹＮ３およびそのホモログを作製する方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として援用される、米国特許第６，３９２，０６９号に教示される。
【００８３】
いくつかの出願については、他の化合物に比較して水溶性の増大および／または送達増強活性を示す、本発明の方法および組成物における送達増強化合物を用いることが望ましい。例示的な送達増強化合物は、Ｒが陽イオン性基である式Ｉの化合物である。適切な陽イオン性基としては、例えば、テトラメチルおよびアンモニウム部分、ならびにその塩が挙げられる。
【００８４】
別の態様では、本発明は、タンパク質および送達増強因子を含む、膀胱へのタンパク質の膀胱内投与のための薬学的組成物を提供する。ある実施形態では、送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む。ある実施形態では、送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。ある実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３であり、タンパク質はインターフェロンである。ある実施形態では、この組成物は、インターフェロンおよびＳＹＮ３（例えば、インターフェロン、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３，ＳＹＮ３溶解因子（例えば、Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたはヒドロキシルプロピルβシロデキストリン（ＨＰβＣＧ）またはＴＲＩＴＯＮＴＭ−Ｘ−１００界面活性剤／オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むサーファクタント）緩衝液および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。ある実施形態では、インターフェロンは、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンまたはω−インターフェロンまたはそれらの融合物である。１つの実施形態では、処方物中のＳＹＮ３の量は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。この組成物は使用前に適切な医薬用キャリアで希釈するように凍結乾燥されてもよい。
【００８５】
ある実施形態では、本発明はまた、このタンパク質および送達増強化合物を含む薬学的組成物を提供する。処方物中のこの送達増強化合物の濃度は、多数の要因、例えば、用いられている特定のタンパク質および送達増強化合物、緩衝液、ｐＨならびに投与プロトコールに依存する。送達増強化合物の濃度は、タンパク質およびその溶解度に実質的に依存し得る。高濃度で有用な因子については、この濃度はしばしば、１％〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０％〜４０％（ｖ／ｖ）、そして最も好ましくは１５％〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲である。低濃度で有効な送達増強因子については、本発明の特定の送達増強化合物は好ましくは、約０．００２〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられ得る。ＳＹＮ３またはそのホモログもしくはアナログを含む本発明の送達増強化合物は好ましくは、０．００２〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられる。
【００８６】
別の態様では、本発明は、インターフェロン遺伝子をコードする組換えアデノウイルスおよび送達増強因子の投与のための薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、送達増強剤は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子送達系は、インターフェロン遺伝子をコードする約１０９〜１０１２粒子（ＰＮ）／ｍｌの組換えアデノウイルス、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３、ＳＹＮ３溶解性因子（例えば、Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたはヒドロキシルプロピルβシロデキストリン（ＨＰβＣＧ）またはＴＲＩＴＯＮＴＭ−Ｘ−１００界面活性剤／オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むサーファクタント）、緩衝液および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、このインターフェロン遺伝子は、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンもしくはωインターフェロンの遺伝子またはその融合物またはインターフェロン抗癌、抗感染性もしくは免疫系調節生物活性を有するポリペプチドをコードするその一部である。１つの実施形態では、処方物中のＳＹＮ３の量は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。この組成物は、使用前に適切な医薬用キャリアでの希釈のために凍結乾燥されてもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、インターフェロン遺伝子送達系および送達増強化合物を含む処方物を提供する。処方物中の送達増強化合物の濃度は、多数の要因、例えば、用いられている特定の遺伝子送達系および送達増強化合物、緩衝液、ｐＨ、標的組織または器官および投与形態に依存する。送達増強化合物の濃度は実質的に、用いられる因子に依存する。高濃度で有用な因子については、この濃度はしばしば、１％〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０％〜４０％（ｖ／ｖ）、そして最も好ましくは１５％〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲である。低濃度で有効な送達増強因子については、本発明の特定の送達増強化合物は好ましくは、０．００２〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられ得る。ＳＹＮ３またはそのホモログもしくはアナログを含む本発明の送達増強化合物は好ましくは、約０．００２〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられる。
【００８８】
本発明の方法および組成物における使用のための送達増強化合物は典型的には、化合物が溶解性である溶媒に処方されるが、化合物が部分的にのみ可溶性である処方物も適切である。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）は、これらの化合物の適切な可溶化剤の１つの例であり、そして他のものは当業者に公知である。当業者は、特定のさらなる賦形剤および添加物が、種々の薬学的処方物についてこれらの因子の溶解度特徴を達成することが所望され得るということを理解する。例えば、周知の可溶化因子、例えば、界面活性剤、脂肪酸エステルおよびサーファクタントは、使用される種々の溶媒におけるこの化合物の溶解度を促進するために適切な濃度で添加され得る。この処方物が界面活性剤を含む場合、患者に投与される最終処方物中の界面活性剤濃度は好ましくは、約０．５〜２×臨界ミセル化濃度（ＣＭＣ）である。適切な界面活性剤としては、上記に列挙されるものが挙げられる。それらの使用のために適切な界面活性剤および適切な濃度の同定は、本明細書に記載のように決定され得る。ＳＹＮ３のような化合物および関連の化合物の可溶化因子の１つの例は、約０．０５％〜約０．３％の濃度、より好ましくは約０．１０％〜約０．１５％の濃度のＴｗｅｅｎ ８０である。Ｂｉｇ ＣＨＡＰも、ＳＹＮ３および関連の化合物についての可溶化因子である。
【００８９】
医薬的用途のために用いる場合、本発明の処方物は、送達増強化合物を含む緩衝液を含む。緩衝液は、任意の薬学的に受容可能な緩衝液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水および当業者に公知の他の緩衝液、例えば、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９６６）５：４６７によって記載される緩衝液であってもよい。例えば、調節性の治療タンパク質を含む薬学的組成物中の緩衝液のｐＨは典型的には、６．４〜８．４、好ましくは７〜７．５、そして最も好ましくは７．２〜７．４の範囲である。
【００９０】
本発明の組成物はさらに、タンパク質安定化剤または可溶化剤、増強剤または他の薬学的に受容可能なキャリアもしくはビヒクルを含んでもよい。生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤を挙げることができる。他の生理学的に受容可能な化合物としては、微生物の増殖または作用を防止するために特に有効である湿潤剤、乳化剤、分散剤または防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、それらには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、治療タンパク質の投与の経路および特定の物理化学的特徴に依存することを承知している。キャリア、安定化剤またはアジュバントの例は、参考として本明細書に援用されるＭａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，第１５版（Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９７５）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５）に見出すことができる。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、薬学的に受容可能な水性キャリア、少なくとも１つの薬学的に受容可能な安定化剤と少なくとも１つの薬学的に受容可能な充填剤と組み合わせて、インターフェロンおよびＳＹＮ３を含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアおよびタンパク質と組み合わせてＳＹＮ３を含み得る。２００２年１２月２０日出願で、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される米国特許出願第１０／３２９，０４３号［タイトル「ＳＹＮ３ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」、代理人整理番号０１６９３０−０００８４１ＵＳ］を参照のこと。
【００９２】
組換えアデノウイルスの投与のための例示的な処方物は約１０９−１０１１ＰＮ／ｍｌウイルス、約０．１〜１ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３、さらに適切なＳＹＮ３可溶化剤（例えば、約２〜１０ｍＭ Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたは約０．１〜１．０ｍＭ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００）界面活性剤を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に含み、加えて約２〜３％スクロース（ｗ／ｖ）および約１〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含み、約ｐＨ６．４〜８．４である。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、インターフェロン遺伝子送達系およびＳＹＮ３を、薬学的に受容可能な水性キャリア、少なくとも１つの薬学的に受容可能な安定化剤と少なくとも１つの薬学的に受容可能な充填剤と組み合わせて含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリア、およびインターフェロンＤＮＡが外来性であるベクターにインターフェロンＤＮＡ配列が挿入されている発現ベクターまたは遺伝子送達系と組み合わせて、ＳＹＮ３を含んでもよい。インターフェロンの核酸配列は、ある実施形態では、外来性であってもよく、そうでない場合被験体における意図する組織もしくは器官において有意に発現されなくてもよい。２００２年１２月２０日出願で、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される、米国特許出願第１０／３２９，０４３号［タイトル「ＳＹＮ３ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ」、代理人整理番号０１６９３０−０００８４１ＵＳ］を参照のこと。
【００９４】
本発明の処方物に用いられ得る溶媒としては、好ましくは米国薬局方（ＵＳＰ）標準に従って調製されるような、例えば、注射用水のような水性溶媒ならびに／またはＤＭＳＯおよびＤＭＡとしても公知のＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドのような非水性の溶媒、ならびに共溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）混合物、例えば、グリセロールおよび水が挙げられる。
【００９５】
この処方物は好ましくは、とりわけ、例えば、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０を含む非イオン性サーファクタントの１クラスである、ポリソルベートすなわちポリオキシエチレンソルビタンエステル、とりわけ、例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ６８およびＬ９２を含む、非イオン性サーファクタントの１クラスである、プルロニックすなわちポリエチレンポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ならびに例えば、ＨＰβＣＤおよびＢｉｇ ＣＨＡＰを含む、非イオン性複合剤の１クラスである、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、ポリ置換ヒドロキシアルキルβシクロデキストリンを含む。ＨＰβＣＤ、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＬ６４およびプルロニックＬ９２が可溶化剤として好ましい。可溶化剤は、例えば、個々にまたは込み合わせて用いられ得る。可溶化剤の濃度は以下に示される。ＨＰβＣＤは、約５０〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、約２０〜約３６０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、ポリソルベート８０は、約１〜３６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、プルロニックは、約１〜約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、そしてその他の成分は、以下に示す濃度で存在してもよい。
【００９６】
ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物は好ましくは、クエン酸緩衝化系を含む。より好ましくは、このクエン酸緩衝化系は、少なくとも１つのクエン酸緩衝液、例えば、米国薬局方のクエン酸一水和物または米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物を含んでもよい。より好ましくは、クエン酸緩衝系は、米国薬局方のクエン酸一水和物と米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物の組み合わせを含む。組み合わせて用いられる場合、米国薬局方のクエン酸一水和物の量は、約０．００５〜約２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１６〜約１．３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１６〜約０．７２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００５〜約１．３５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る、そして米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物は、約０．０２〜約５．３７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜３．００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜２．３１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。適切である他の適切な緩衝化系は、例えば、クエン酸緩衝化系の代わりに、またはそれと組み合わせて、リン酸塩、グリシン、そして上記の全ての種々の組み合わせを含む。
【００９７】
緩衝化系は、溶解度が向上するような凍結乾燥処方物のｐＨを提供する。好ましくはこのｐＨは、約５〜約６の範囲である。ＳＹＮ３の混合水性処方物は好ましくは、約７〜約８．５、好ましくは約７．４のおよそのｐＨで緩衝化され、そしてＳＹＮ３は４０℃で少なくとも３ヶ月間、脱水された粉末中で安定なままである。
【００９８】
凍結乾燥処方物は好ましくは、凍結乾燥充填剤としてグリシンまたはマンニトールを含む。用いられ得る他の適切な凍結乾燥充填剤としては、例えば、ラクトース、組換えゼラチンおよびメチルセルロースが挙げられる。凍結乾燥充填剤は、この薬剤がマンニトールである場合、約５〜１００ｍｇ／ｍｌ、そしてこの薬剤がグリシンである場合、約１０〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００９９】
凍結乾燥処方物は好ましくは、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む。用いられ得る他の適切な抗酸化剤としては、例えば、クエン酸が挙げられる。アスコルビン酸が抗酸化剤である場合、これは約０．００１〜約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【０１００】
本発明の組成物は、さらに、例えば、安定化剤、増強剤または他の薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含んでもよい。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、腫瘍抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター送達系を安定化させるように作用する生理学的に受容可能な化合物を含んでもよい。生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランのような炭水化物、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤を挙げることができる。
【０１０１】
他の生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、保湿剤、乳化剤、分散剤または微生物の増殖もしくは作用を妨げるために特に有効な防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、これには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、治療タンパク質の投与経路および特定の物理化学的特長に依存することを承知している。キャリア、安定化剤またはアジュバントの例は、参考として本明細書に援用されるＧｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５）に見出すことができる。
【０１０２】
本発明の被験体は、哺乳動物であって、これには、限定はしないが、マウス、ラット、霊長類および特にヒトが挙げられる。
【０１０３】
核酸およびタンパク質の両方の送達のための例示的な送達増強化合物としては、式ＩＩの化合物を含む本発明による使用のためのＳＹＮ３のホモログが挙げられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、送達増強化合物を含む緩衝液中に、「治療上有効な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量の治療因子（例えば、タンパク質またはそのタンパク質の遺伝子送達系）を含む。本明細書において用いる場合、「治療上有効な」とは、癌もしくはウイルス感染のような疾患状態またはその症状の予防、軽減または治癒をいう。
【０１０５】
送達増強化合物は、単独で、またはインターフェロンもしくはインターフェロン遺伝子送達系と組み合わせて、またはさらなる因子とさらに組み合わせて適用され得る。例えば、この処方物は、癌、細胞増殖性障害および慢性の感染を含む疾患および状態を治療するのに有効である。「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は一般に、組織または器官内の細胞の制御されない増殖に関する。これは、１つ以上の細胞が癌性、悪性、腫瘍性、前癌性、トランスフォームした、または腺腫もしくは癌腫に分類される状態、あるいはこれらの状態について当該分野で一般に用いられる任意の他の同義語を包含するものとする。
【０１０６】
送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、組換えウイルス送達系にインターフェロン遺伝子を含む薬学的組成物の治療上有効な量が、本発明の教示に従って投与され得る。例えば、送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、組換えアデノウイルスベクター送達系のインターフェロン遺伝子の治療上有効な量は、約１０８粒子／ｍｌ〜１０１２粒子／ｍｌ、より典型的には約１０８粒子／ｍｌ〜５×１０１１粒子／ｍｌ、最も典型的には約１０９粒子／ｍｌ〜×１０１１粒子／ｍｌ（ＰＮ／ｍｌ）または１０１０粒子／ｍｌ〜１０１１粒子／ｍｌ（ＰＮ／ｍｌ）の範囲である。前述の投薬量は一般に、被験体が耐えられる範囲で高頻度に投与される。腫瘍学の分野では一般に、最大耐容用量で、またはほぼその付近の投薬量を投与することになる。
【０１０７】
送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、タンパク質（例えば、インターフェロン）を含む薬学的組成物の治療上有効な量が、本発明の教示に従って投与され得る。例えば、インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系の治療上有効な量は、同様に、当業者によって容易に決定され得る。この用量は一般に、被験体が耐えられる範囲で高頻度に投与される。上記のとおり、腫瘍学の分野では一般に、最大耐容用量で、またはほぼその付近で投薬量を与えることが行われる。
【０１０８】
膀胱癌の治療のための本発明の１つの実施形態では、インターフェロンは、各々のサイクルが各々のサイクルの１日目にまたは任意選択的に１日目および２日目に１回の膀胱内投与を提供する、３週サイクルの投与からなる複数回の投与レジメンの一部として送達増強因子と組み合わせて提供される。膀胱癌の治療の典型的な形態では、実施者は被験体が排泄できるように尿道にカテーテルを挿入する。処方された送達増強因子および治療用インターフェロンタンパク質またはインターフェロン遺伝子送達系を含む溶液を調製して、膀胱に点滴注入する。カテーテルをクランプして、約１時間の間、膀胱中に溶液を維持する。長時間の曝露によって、上皮に対する送達を増強することが所望され得るが実際的な懸念から、このような実施は制限されることが注意されるべきである。例えば、１時間は一般に、被験体が排尿する必要を感じるポイントである。送達増強因子の効果は、長期の効果を生じ、その結果、タンパク質の注入の前に膀胱を送達増強因子に事前に曝露することが送達の増強をもたらすことが実証されている。これは、タンパク質処方物と送達増強因子処方物との間の適合性が懸念される場合に使用され得る。所望の曝露後に、カテーテルクランプをカテーテルから外して、被験体を排尿可能にさせた。前述の手順は、治療効果を達成するために、患者が耐容可能な範囲で何度も繰り返され得る。この治療効果は、膀胱に挿入された膀胱鏡のような従来の手段によって容易に評価できる。
【０１０９】
これらの処方物は、充填される空隙、または投与される器官もしくは組織のサイズに相当する用量で投与され得る。ヒト膀胱については、適切な投与用量は、被験体の、そして詳細にはその膀胱の、年齢およびサイズに依存する。投与される用量は典型的には、５０〜５００ｍｌの範囲、そしてより一般的には５０〜２５０ｍｌ、または１００〜２００ｍｌの範囲に及んでもよい。ある投与方法では、投与されるべき量は、投与されるべき膀胱（ｖｅｓｉｃａｌまたはｂｌａｄｄｅｒ）にへバルーンカテーテルを挿入すること、およびカテーテルのバルーン部分を膨張させ、それらによって投与組成物が占有する空隙容積を軽減することによって、経済的に節約され得る。
【０１１０】
さらに、上記の投与レジメンは、治療効果の増強を得るために、補充されてもよいし、または他の治療投与レジメンと組み合わせて用いられてもよい。本発明の方法は、例えば、従来のＢＣＧおよび／または化学療法投与レジメンによって補充され得る。腫瘍学の分野では、効果を最大化するために個体に対応して複数回の投与レジメンを行うことが標準的な施行である。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、第一の容器に送達増強化合物を、そして第二の容器にタンパク質または遺伝子送達系を有するキットを提供する。１つの実施形態では、この容器の中身は、送達増強因子およびタンパク質または遺伝子送達系の両方を含む処方物を調製するのに組み合わされて、これがその後被験体に投与される。別の実施形態では、この容器の内容物は、患者に対して個別の調製物として投与される。送達増強因子は、タンパク質または遺伝子送達系の投与の前、間または後に投与され得る。例示的な実施形態では、それらは、同時にまたはほぼ同時に投与される。容器のうち一方または両方の処方物は、薬学的に受容可能な液体キャリア中で戻される凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１１２】
別の実施形態では、このキットは、タンパク質の送達を増強し得るＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログもしくはアナログ、あるいは遺伝子送達系を含む第一の容器；ならびにタンパク質または遺伝子送達系を含む第二の容器を提供する。１つのさらなる実施形態では、第一の容器は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３のモホログもしくはアナログの凍結乾燥処方物を含む。別の実施形態では、第二の容器は、タンパク質の凍結乾燥処方物を含む。さらなる実施形態では、第一の容器および第二の容器の両方が、そのそれぞれの内容物の凍結乾燥処方物を保持する。例示的なさらなる実施形態では、このタンパク質は、ヒトαインターフェロンポリペプチドに対して実質的に同一であるか、もしくはヒトαインターフェロンポリペプチドであるポリペプチドであるか、またはこの遺伝子送達系がタンパク質、すなわち、ヒトαインターフェロンポリペプチドに対して実質的に同一であるか、もしくはヒトαインターフェロンポリペプチドであるポリペプチドをコードする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物による投与は、治療効果を増大するために種々の時間間隔にわたって繰り返され得る。これらの間隔は、ほぼ毎日、毎週または毎月であってもよい。投与の回数は、治療レジメンおよびその期間で変化する。一般には本発明の治療投与は、週２回、毎週、隔週で、毎月または隔月で、最大２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月またはそれ以上でさえ投与されてもよい。投与の回数は、被験体におけるインターフェロンの産生もしくは放出をモニタリングすることによって、または患者の臨床効果（例えば、治療される疾患が癌である場合、腫瘍軽減）を評価することによって個々の被験体に対して耐容され得る。
【０１１４】
治療されるべき状態が膀胱の癌であり、治療タンパク質（例えば、インターフェロン）または遺伝子送達系（例えば、インターフェロンをコードする遺伝子について）が膀胱内に投与される別の実施形態では、本発明の治療方法および組成物に対する被験体における効果は、膀胱で見出される腫瘍塊のサイズおよび数をモニタリングすることによって評価される。このモニタリングは、血液もしくは尿のような体液中での腫瘍特異的な抗原または産生物の測定によっても、またはＭＲＩもしくは放射性同位体画像化技術のような直接画像化方法によってもよい。
【０１１５】
送達増強因子およびインターフェロンまたはインターフェロンをコードする遺伝子で処方された組成物を用いて、詳細には、器官および組織の上皮細胞を含む細胞に対してインターフェロンを提供してもよい。インターフェロンの治療効果および用法は当業者に公知である。例えば、本発明による組成物は、癌の治療において有効である。本発明の方法および組成物による投与に適切な癌組織および器官としては、胃腸管、膀胱、呼吸器および肺のような上皮性の膜を有する任意の組織または器官を包含する。例としては、限定はしないが、膀胱および上部気道、陰門、子宮頸部、膣、子宮または気管支の癌腫；腹膜の局所転移性腫瘍；気管支肺胞の癌腫；胸膜転移性癌腫；口腔および扁桃の癌腫；鼻咽頭、鼻、喉頭、食道、胃、結腸および直腸、胆嚢または皮膚の癌腫；または黒色腫が挙げられる。
【０１１６】
本発明の方法および組成物は詳細には、哺乳動物および詳細にはヒトにおける膀胱癌の治療において有効である。１つの実施形態では、本発明の方法および組成物は、種々の膀胱癌治療で投与されており、膀胱腫瘍塊のサイズもしくは数を減少することができないこと、またはこのような腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅまたはｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅまたはｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を遅らせることによって測定した場合に満足な効果が見られない個体を治療するために用いられる。１つの実施形態では、本発明の方法および組成物は、ＢＣＧ治療において満足な効果が見られない被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、膀胱癌の治療においてＢＣＧ治療のような別の癌治療と組み合わされる。このような実施形態では、被験体は、ＢＣＧ治療の前、後または間に本発明の方法および組成物を受けてもよい。
【０１１７】
ある実施形態では、膀胱癌の再発または治療の有効性は、膀胱内視鏡、より好ましくは尿中のマイクロサテライトＤＮＡの測定によって評価され得る。Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｇ，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ ＭＰ，Ｌｉｎｎ ＪＦ，Ｍａｏ Ｌ，Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｔｅｌｌｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｒｉｎｅ」Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１９９７ Ｊｕｎ；３（６）６２１−４を参照のこと。膀胱の治療のための１つの実施形態では、治療組成物は、バルーンカテーテルを介して投与される。カテーテルは、本発明に従って投与された組成物によって占有される空隙の残りを最小にするように、空隙の一部、好ましくは空隙のほとんどを占有するために膨張される場合、膀胱の空隙に対して尿道を介して挿入され得るバルーン部分を有する。カテーテルは、膀胱の空隙と接触するように、膀胱に組成物を輸送する別の部分を有する。バルーン尿道カテーテルは、当業者に公知である。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明の組成物は、送達増強因子の希釈を減少するかまたは回避する方法で投与されてもよく、あるいは、調製物中の送達増強因子の量は、予想される希釈用量を考慮して増大され得る。希釈物を回避するための方法は、生理学的方法（例えば、排尿、絶食）または薬理学的介入（例えば、下剤）または医学的介入（カテーテルによる排液）によって標的の空間を空にする工程を包含する。バルーンカテーテルまたは他の方法を用いて、この組成物によって占有される管腔または通路内の空間の容積を隔絶してもよい。ある実施形態では、占有される必要がある空間を減少させるように、充填されている空間を部分的に占有するために、バルーンカテーテルが用いられ得る。他の実施形態では、処方物自体が、この因子のリザーバとして機能するように、または標的空間の表面に対して固定するために処方され、これによってバルク混合による即時希釈またはバルクフローによる損失を回避する。
【０１１９】
膀胱への膀胱内投与の際の送達増強剤とインターフェロンまたはインターフェロン遺伝子インターフェロン治療との間の相乗作用は、インターフェロン治療に一般的に伴う副作用を軽減または回避することを補助する。
【０１２０】
適切な量の組成物の投与は、例えば、局所投与、部分投与、経口投与または直腸投与、非経口的投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、肺内投与、経皮投与または経尿道投与、膀胱内投与、筋肉内投与または経尿道投与および膀胱内投与のような当該分野で公知の任意の方法によるものであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は経皮的に行う。本発明の適切な量および用量は、当該分野で公知であるように経験的に決定され得る。
【０１２１】
薬学的に受容可能な、または生理学的に受容可能な塩としては、限定はしないが、金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など；アルカリ土類金属、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など；有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩など；無機酸塩、例えば、塩酸、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など；有機酸塩、例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩など；スルホン酸塩、例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩など；アミノ酸塩、例えば、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、例示目的で提供されるものであり、本明細書において請求されるような本発明の範囲内に限定されないものとする。当業者が行う例示された物品および／または方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内におさまるものとする。
【０１２３】
（実施例１）
米国特許第６，３１２，６８１号は、膀胱の上皮性膜で癌細胞に対する導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを送達するための方法を開示するが、この方法は、上皮性膜に対してアデノウイルスベクター、および１％〜５０％（ｖ／ｖ）のエタノールまたは別の送達増強因子を投与する工程であって、このアデノウイルスベクターが細胞に感染して、導入遺伝子が感染細胞中で発現される工程を包含する。本出願と同じ譲受人に譲渡された米国特許第６，３１２，６８１号は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０１２４】
（実施例２）
以下の表は、本発明の非水性液体ＳＹＮ３処方物の成分の例示的な範囲を示す。投与前に（例えば、膀胱癌のため）、ＳＹＮ３溶液を、組換えアデノウイルス調製物と１：５０ｖ／ｖ比で組み合わせて、患者に投与される混合物を形成する。
【０１２５】
【表１】
調製するために、ガラスビーカー中に約７５％のＤＭＡを秤量する。個別のビーカーに、サーファクタント（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＬ６４またはプルロニックＬ９２）を加えて、少量（最終用量の約１０％）のＤＭＡに溶解する。連続的に撹拌しながらＤＭＡ／サーファクタント溶液をＤＭＡ中に加える。個別の容器にＳＹＮ３を事前秤量する。撹拌しながら溶液中にＳＹＮ３をゆっくり加える。一旦ＳＹＮ３が溶解されれば、十分なＤＭＡを最終の重量容積まで添加する（２５℃で、密度＝０．９６２ｇ／ｍｌ）。ラテックスでない栓を備えるシリンジに取り付けた０．２２のフィルターを通じて溶液を濾過して、緊密に密閉されたガラス容器に４℃で溶液を貯蔵する。
【０１２６】
以下のさらなる組成物は、実施例１に従って調製され得る。
【０１２７】
【表２】
以下の２５ｍｌのバッチは、同じ手順によって調製した。
【０１２８】
【表３】
（実施例３）
以下の表は、本発明の凍結乾燥されたＳＹＮ３処方物の成分の例示的な範囲を示す。配合された溶液は、示されるように２０ｍｌの用量のＩＩ型ガラスバイアルに充填させて、凍結乾燥する。投与のための調製物は、ＳＹＮ３を再溶解するために凍結乾燥ケーキを含むバイアルへの２０ｍｌのＷＦＩの添加を要する。ＳＹＮ３溶液はｐ５３と、または任意の組換えアデノウイルス調製物と１：５のｖ／ｖ比で合わされる。次いでこの混合物を例えば膀胱癌については患者に投与する。
【０１２９】
【表４】
以下の実施例は、凍結乾燥処方物を調製する方法である。
【０１３０】
（実施例４）
【０１３１】
【表５】
充填されるＳＹＮ３の正確な量は、以下の式を用いて薬物バッチの純度に従って調節される：
ＳＹＮ３のグラム数＝２４．０×１００／（純度％）
例えば：
ＳＹＮ３薬物＝９７．０％純粋。
【０１３２】
２４．０×１００／９７．０＝１リットルに２４．７ｇのＳＹＮ３が加えられる。
【０１３３】
従って、以下の式に従って、バッチに加えられるＳＹＮ３の量を決定する：
ＳＹＮ３のｇ数／リットル＝２４．０ｇ／リットル×［１００／（ＳＹＮ３バッチ純度％）］
このバッチに加えられる注射用水の用量は、以下の式に従って決定されるものである：
注射用水の用量（リットル）＝バッチ用量（リットル）×０．５
撹拌機を備える風袋測定配合容器に上記の式を用いて算出した用量の注射用水を加える。Ｂｉｇ ＣＨＡＰを撹拌しながら添加して溶解する。注射用滅菌水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。Ｂｉｇ ＣＨＡＰの完全溶解には、中程度の撹拌速度での約３０〜６０分の連続的な撹拌を要し得る。Ｂｉｇ ＣＨＡＰ溶液中にＳＹＮ３を撹拌（中程度の撹拌速度）しながら加えて溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。ＳＹＮ３の完全な溶解には、最大１時間におよぶ混合を要し得る。撹拌しながら、かつ以下の順序：グリシン、アスコルビン酸、クエン酸一水和物およびクエン酸ナトリウム二水和物で、Ｂｉｇ ＣＨＡＰおよびＳＹＮ３の両方を含む溶液に添加して溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。注射用水を添加してこのバッチを最終用量にする（溶液の密度は２５℃で約１．０５１ｇ／ｍｌである）。この溶液を１５分間、混合する。
【０１３４】
ｐＨ測定のために溶液のわずかな（＜５ｍｌ）サンプルを取り出す。ｐＨは５．０〜６．０であるべきである。ｐＨの調節は必須である。当業者は得られた産物のｐＨを容易に確認できる。
【０１３５】
配合を完了するため、溶液を無菌処理して濾過する。任意選択的に、化合物のバッチは、バイアルに充填する前に、密閉された滅菌のステンレス製圧力容器に２℃〜８℃で最大２４時間まで保管してもよい。このバッチは、滅菌性を確保するために２回以上濾過してもよい。
【０１３６】
洗浄して滅菌されている２０ｍｌの１型フリントガラスバイアルに５．３±０．１ｍｌの溶液を無菌処理して満たす。洗浄されて、シリコン処理されて、滅菌されている２０−ｍｍのＷｅｓｔ ４４１６／５０リオ型（ｌｙｏ−ｓｈａｐｅｄ）ゴム栓をバイアルの凍結乾燥位置に無菌処理して挿入する。
【０１３７】
凍結乾燥棚を４±２℃に事前冷却する。凍結乾燥棚上に充填したバイアルのトレイを無菌処理して並べる。全てのトレイを置いた後、−４０℃に１時間この棚を冷却して、処理前に−３５℃以下で少なくとも４時間この生成物を維持する。コンデンサーの冷却を開始する。コンデンサーの温度が−４５℃以下である場合、チャンバの排出を開始する。５０〜７０ｍｍ Ｈｇの真空圧が得られれば、棚の温度を０．５時間で−２０℃まで加熱する。棚の温度を−２０℃で３６時間、約１５０ｍｍＨｇの圧（１００〜２００ｍｍＨｇの圧）で維持する。生成物の温度は、処理前少なくとも６時間は−２０℃以上に保たなければならない。棚を１時間で２５℃まで加熱して、圧力を約５０ｍｍＨｇの圧まで低下させる。棚の温度を２５℃で、約５０ｍｍＨｇの圧で１４時間維持する。滅菌濾過した窒素を用いてチャンバを約９５０ｍｍＨｇまで排気する。凍結乾燥機の内側でバイアルに栓をする。凍結乾燥機からバイアルを取り出して、２０ｍｍのアルミニウムシールでこのバイアルを圧着する。バイアルは、検査が終了するまで２℃〜８℃で保管しなければならない。
【０１３８】
この生成物は灰白色のケーキである。このバイアルは、検査後、２℃〜８℃で保管しなければならない。標識および検査の目的で、このバイアルを最大６時間まで１９℃〜２５℃に曝してもよい。
【０１３９】
（実施例５）
以下の実施例は、上記の実施例４に示されるようなバッチ調製に従って調製した。
【０１４０】
【表６】
得られた生成物のｐＨは５．３４であった。
【０１４１】
【表７】
得られた生成物のｐＨは５．４５であった。
【０１４２】
【表８】
得られた生成物のｐＨは５．７６であった。
【０１４３】
得られた凍結乾燥生成物の安定性試験によって、それらがＳＹＮ３に関して高度に安定であることが示された。安定性試験はＨＰＬＣによって達成した。
【０１４４】
凍結乾燥処方物は、１９．５ｍｌ ＷＦＩで再構成（再溶解）した：サンプルを指定の温度条件で、特定の時間インキュベートして、濃度をＨＰＬＣによって決定して、最初の濃度と比較した。
【０１４５】
（実施例６）
【０１４６】
【表９】
加えられるＳＹＮ３の正確な量は、以下の式を用いて、製剤原料のバッチの純度に従って調節する：
ＳＹＮ３のグラム数＝２４．０×１００（純度％）。
【０１４７】
サンプルの算出：
ＳＹＮ３の製剤原料＝９７．０％純粋。
【０１４８】
２４．０×１００／９７．０＝１リットルのバッチに加えられるべきＳＹＮ３が２４．７グラム。
【０１４９】
以下の実施例は次の手順で調製した：
最初に、以下の式に従ってバッチに加えられるＳＹＮ３の量を決定する：
ＳＹＮ３のｇ数／リットル＝２４．０ｇ／リットル×［１００（ＳＹＮ３のバッチ純度％）］
次に、以下の式に従って、バッチに加えられる注射用水の用量を決定する：
注射用水の用量（リットル）＝バッチ用量（リットル）×０．５
撹拌機を備える風袋測定配合容器にこの用量の注射用水を加える。ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを撹拌しながら添加して溶解する。ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンの完全な溶解には、中程度の速度での約３０〜４５分の連続的撹拌が必要であり得る。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。ポリソルベート８０をこの溶液に加えて溶解する。ポリソルベート８０は、０．１×注射用水の総バッチ容量（リットル）に再溶解して、この溶液に加えてもよい。
【０１５０】
この溶液中にＳＹＮ３を撹拌しながら加えて溶解する。ＳＹＮ３の完全溶解には、最大１時間までの混合を要し得る。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。
【０１５１】
撹拌しながら、かつ以下の順序：アスコルビン酸、クエン酸一水和物およびクエン酸ナトリウム二水和物をこの溶液に加えて溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。注射用水を添加してこのバッチを最終用量にする（溶液の密度は２５℃で約１．０５８ｇ／ｍｌである）。この溶液を最大１５分間、混合する。
【０１５２】
ｐＨ測定のために溶液のわずかな（＜５ｍｌ）サンプルを取り出す。ｐＨは５．０〜６．０でなければならない。ｐＨの調節は必須ではない。洗浄されて完全性について試験されている溶液を、滅菌されたステンレス製の圧力容器中に無菌処理して濾過するか、またはその等価物を用いなければならない。任意選択的に、この配合されたバッチは、充填前に、密閉した無菌のステンレス製の圧力容器中に最長２４時間まで２℃〜８℃で保管され得る。このバッチは、滅菌性を確保するために２回以上濾過してもよい。
【０１５３】
洗浄して滅菌されている２０ｍｌの１型フリントガラスバイアル中に５．３±０．１ｍｌの溶液を無菌処理して満たす。洗浄されて、シリコン処理されて、滅菌されているリオ型ゴム栓をバイアルの凍結乾燥位置に無菌処理して挿入する。
【０１５４】
凍結乾燥するために、凍結乾燥棚を４±２℃に予備冷却する。凍結乾燥棚上に充填したバイアルのトレイを無菌処理して並べる。全てのトレイを置いた後、この棚を−４０℃に１時間冷却して、処理前には−３５℃以下で少なくとも４時間この生成物を維持する。コンデンサーの冷却を開始する。コンデンサーの温度が−４５℃以下である場合、チャンバの排出を開始する。５０〜７０ｍｍ Ｈｇの真空圧が得られれば、棚の温度を０．５時間で−２０℃まで加熱する。棚の温度を−２０℃で３６時間、約１５０ｍｍＨｇの圧（１００〜２００ｍｍＨｇの圧）で維持する。生成物の温度は、処理前には少なくとも６時間にわたり−２０℃以上に保たなければならない。棚を１時間で２５℃に加熱して、圧力を約５０ｍｍＨｇの圧まで低下させる。棚の温度を２５℃で、約５０ｍｍＨｇの圧で１４時間維持する。滅菌濾過した窒素を用いてチャンバを約９５０ｍｍＨｇまで排気する。凍結乾燥機の内側でバイアルに栓をする。凍結乾燥機からバイアルを取り出して、２０ｍｍのアルミニウムでこのバイアルを圧着する。バイアルは、検査が終了するまで２℃〜８℃で保管しなければならない。
【０１５５】
この生成物は灰白色のケーキである。このバイアルは、検査後、２℃〜８℃で保管しなければならない。標識および検査の目的で、このバイアルを最大６時間まで１９℃〜２５℃に曝してもよい。
【０１５６】
組換えアデノウイルスベクター（例えば、ｐ５３（ｒＡＤ／ｐ５３））は、ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物と合わせた場合、３７℃で少なくとも２時間、そして２５℃で２４時間、安定なままであり得る。ｐ５３は、ＳＹＮ３の水溶液処方物と合わせた場合、３７℃で少なくとも４時間、そして２５℃で２４時間、安定なままである。
【０１５７】
（実施例７．化合物Ａ−ＬＢの合成）
以下の実施例では、「ｇ」は、グラムを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「℃」はセ氏温度を意味し、「分（ｍｉｎ．）」は分を意味し、「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを意味し、そして「ＰＮ」は、粒子数を特定する。全ての温度は、他に特定しない限り、セ氏温度である。
【０１５８】
以下は、Ａ−ＬＢとしても公知である化合物ＶＩＩの合成において利用される方法形態に関する。以下に示すのは、化合物５−６の合成の詳細および精製に必要な工程である。
【０１５９】
用いられる材料および試薬
Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン
コール酸
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
イソブチルクロロホルメート
トリエチルアミン
ラクトビオン酸。
【０１６０】
（実験）
（化合物Ａ−ＬＢの合成）
以下は、Ａ−ＬＢとしても公知の化合物ＶＩＩの合成において利用される方法形態に関する。以下に示すのは、化合物５−６の合成の詳細および精製に必要な工程である。
【０１６１】
用いられる材料および試薬
Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン
コール酸
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
イソブチルクロロホルメート
トリエチルアミン
ラクトビオン酸。
【０１６２】
化合物５：ラクトビオン酸（７１６ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を含むメタノール（６０ｍＬ）の溶液を加熱還流させた。この溶液にＤＣＣ（５００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液を還流させながら撹拌した。２時間後、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン（８００ｍＬ，５．７ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液をさらに１時間撹拌した。この反応溶液を室温まで冷却して濃縮し、粗生成物５を得た。粗アミド５をジクロロメタンを用いる倍散によって精製して、粘着性の吸湿性固体として５（２．７２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を得た。
【０１６３】
化合物６：コール酸（４．１ｍｇ，１０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（６０ｍＬ）の溶液を０℃に冷却した。この溶液にイソブチルクロロホルメート（１．２ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．４ｍＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液を１０分間撹拌し、続いて５（２．５ｇ，５．３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４０ｍＬ）を添加した。次いで、この反応溶液を７２時間撹拌して濃縮し、粗生成物６を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、純粋な６（Ａ−ＬＢ）を得た。
【０１６４】
【化１１】
【０１６５】
【化１２】
（実施例８）
（膀胱癌のインターフェロン療法）
本実施例では、ヒトインターフェロンα導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの使用を前臨床動物モデルにおいて評価した。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物の膀胱内投与を受けた動物は、動物の尿中のインターフェロンタンパク質の局所濃度が極めて高く、インターフェロンの全身的レベルは最小であった。本発明者らはまた、胸腺欠損マウスを用いて表在性膀胱癌の正所性腫瘍モデルにおけるｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性を試験した。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与されたマウスは、コントロールに比較して膀胱腫瘍のサイズの劇的な減少があった。これらの結果に基づいて、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３は、表在性膀胱癌の新規な代替的治療法であり得る。
【０１６６】
（実施例８Ａ．ｒＡｄ−ＩＦＮの抗腫瘍活性）
ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）（ｒＡＤ−ＩＦＮ）をコードするＥ１領域欠失アデノウイルスを構築した。インビボの膀胱内送達研究のために、本発明者らは、ヒトα２ｂインターフェロン遺伝子（ＩＡＣＢ）をコードするアデノウイルスベクターを利用した。このベクターを用いる細胞の形質導入によって、ＩＮＴＲＯＮ Ａと同一の一次アミノ酸配列を有するヒトα２ｂインターフェロンタンパク質の産生が生じる。このタンパク質は、１６５アミノ酸のインターフェロンタンパク質に連結された２３アミノ酸の分泌リーダーペプチドを含む。Ｎ末端アミノ酸配列決定によって、分泌リーダーペプチドが翻訳後改変の間に適切に切断されることが確認されている。Ｅ．ｃｏｌｉの産生した組換えＩＮＴＲＯＮ Ａと比較して、ｒＡｄ−ＩＦＮ形質導入から生成されるインターフェロンタンパク質をグリコシル化する。ＩＦＮの明らかなグリコシル化は、イムノアッセイまたは抗ウイルスバイオアッセイによるＩＦＮのｒＡｄ−ＩＦＮ介在性発現の検出に影響しなかった。電気化学発光免疫アッセイを用いる血清および尿の両方からのＩＦＮタンパク質の検出のための生物分析方法が開発された。
【０１６７】
インターフェロンα種は一般に、生物学的特性において高レベルの種特異性を示す。ヒト腫瘍異種移植片を含むマウス腫瘍モデルにおけるインターフェロンαの抗腫瘍有効性を評価するために、マウスおよびヒトの両方のインターフェロンレセプターに結合し得るインターフェロンα種を有することが最適である。マウス腫瘍モデルを用いるインビボの有効性実験のために、本発明者らは、ハイブリッド型のインターフェロン（α２／α１）を含むアデノウイルスベクターを利用した。ハイブリッドインターフェロンタンパク質は、ヒト腫瘍細胞およびマウス腫瘍細胞の両方に対して抗腫瘍活性を有する（Ｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（１９）：１１４９７−５０２（１９８２））。ハイブリッドインターフェロンは、マウス細胞に対してもヒト細胞に対しても活性であるので（Ｒｅｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２５７（１９）：１１４９７−５０２（１９８２））、ハイブリッドインターフェロンの高次構造は、マウスＩＦＮレセプターに結合して活性化できる必要がある。従って、ハイブリッドＩＦＮタンパク質は、ヒトのインターフェロンα２ｂの抗腫瘍有効性をより密接にモデルすると考えられた。
【０１６８】
インターフェロン導入遺伝子は、参考として援用される米国特許第６，２１０，９３９号においてＡ／Ｃ／Ｎ ５３として記載されるベクターと同じアデノウイルス骨格に組み込まれる。このベクターの模式的な提示は図１に例示されている。ｒＡｄ−ＩＦＮによる細胞培養物および動物におけるＩＦＮの発現およびＩＦＮの生物学的活性の実証後、皮下異種移植片腫瘍モデルにおけるｒＡｄ−ＩＦＮの抗腫瘍有効性を評価した（図２）。腫瘍増殖の阻害は、グリア芽細胞腫（ＬＮ２２９、Ｕ８７ＭＧ）、肝細胞腫（ＨＥＰ３Ｂ）およびＣＭＬ（Ｋ５６２）から誘導された腫瘍を有するヌードマウスでの腫瘍内ｒＡｄ−ＩＦＮ投与後に観察された。これらの研究では、投与を開始する前に、腫瘍モデルに応じて腫瘍は１０〜３０日間で樹立された。
【０１６９】
Ｋ５６２モデルでは、５匹のマウスのうち３匹に腫瘍がなく、そしてＵ８７ＭＧモデルでは、５匹のマウスのうち４匹に腫瘍がなかった。これらの結果に基づいて、ｒＡｄ−ＩＦＮは、種々の腫瘍サブタイプにおいて皮下固形腫瘍モデルにおける強力な抗腫瘍活性を有することが明らかである。図２を参照のこと。
【０１７０】
（実施例８Ｂ）
（アデノウイルス遺伝子発現のＳＹＮ３増強）
本実施例では、組換えアデノウイルスの膀胱内投与は、全身への曝露は極めて微量であって、膀胱の管腔内に局所的に適用され得る。しかし、ヒト組換え複製欠損アデノウイルス（ｒＡｄ）の単回の膀胱内投与は、以前の研究においてはごく限られた遺伝子移入および発現しか示していない（Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２（２）：９７−１０４（１９９５））。膀胱の構造は、ウイルスベクターによって形質導入されることが不能である原因となり得ると考えられる。膀胱は病原性細菌およびウイルスに対する主要な天然の防御として機能し得るが、一方では尿の封入のためのリザーバとしても機能する。管腔の膀胱上皮は、膀胱管腔から組織への尿の通過を妨害する親水性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層で覆われる。ＧＡＧ層は、他の上皮保護機構（例えば、胃腸管（胃腸管参照））に匹敵して、細菌結合を防御する（Ｐａｒｓｏｎｓ ＣＬ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ．，１２（１）：３８−４２（１９９４））。アデノウイルス結合および形質導入を増強するためにこの層を改変する因子の同定についての研究が重ねられている。エタノールはアデノウイルスの遺伝子導入を増大させ得る因子として最初に同定されたが（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ、５３（５）：１０４９−５３（１９９９））、出血性膀胱炎も投与後に注目され、この処方物は不適切であると思われた。代替的処方物のさらなるスクリーニングをＣａｎｊｉで行って、エタノールの有害作用がなくアデノウイルス遺伝子の膀胱への移入を増強し得る因子を同定した。種々の界面活性剤（陽イオン性、陰イオン性、両性イオン性および非イオン性）を、それがアデノウイルス送達を増強する能力について評価した。非イオン性界面活性剤Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、膀胱炎なしにアデノウイルスベクターで膀胱上皮の形質導入を強力に増強することが見出された。Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、濃度依存性の様式で遺伝子導入を向上させ、最大の形質導入および遺伝子発現の飽和は、３０ｍｇ／ｍｌ（３４ｍＭ）のＢｉｇ ＣＨＡＰ濃度で達成された。
【０１７１】
Ｂｉｇ ＣＨＡＰの増強活性のさらなる特徴によって、種々の市販の調製物の間の変動が明らかになり、これによって界面活性剤の組成の異質性が示唆される。実際、Ｂｉｇ ＣＨＡＰのいくつかの調製物は、ウイルス導入遺伝子発現を全体として増強できなかった。Ｂｉｇ ＣＨＡＰの生物活性ロットを薄層クロマトグラフィーによって不活性なロットと比較した場合、この生物活性ロットには少なくとも３つのさらなる化合物が存在した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ構造分析によって、３つのさらなる成分がＢｉｇ ＣＨＡＰ製造プロセス由来の最も可能性の高い副産物であることが示された。各々の不純物を単離して、ｒＡｄ−β−ｇａｌとの同時投与により膀胱中のウイルス導入遺伝子発現を増強する能力について評価した。不純物２番は、最も強力な化合物であったが、極めて不溶性でもあった。その全体が参考として本明細書に援用される米国特許第６，３９２，０６９号を参照のこと。
【０１７２】
膀胱上皮におけるｒＡｄ遺伝子形質導入を増強する能力についてＳＹＮ３を試験した。ラットには、ｒＡｄ−β−ｇａｌ（０．５ｍｌ；７．６×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物またはビヒクル処方物（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０）のいずれかの膀胱内投与を与えた。４５分後、被験体を取り出して、動物を回復させた。２日後、動物を屠殺して、その膀胱を回収してＸ−ｇａｌを染色してｒＡｄ遺伝子発現の程度を判定した。ｒＡｄ−β−ｇａｌを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、同じウイルスをビヒクル処方物に含むものの送達に比較して、ｌａｃＺ遺伝子発現の劇的な増強を有した（図３）。
【０１７３】
（実施例８Ｃ）
（膀胱におけるインターフェロン発現に対する併用療法の効果）
ＳＹＮ３を用いる膀胱癌の治療と、インターフェロン遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターとの併用は、膀胱の治療におけるインターフェロンに対して、導入遺伝子インターフェロンの発現における予期せぬ多大な増大をもたらした。前臨床試験によって、ＳＹＮ３は、種々の組換えアデノウイルスベクターの膀胱上皮への送達および発現を劇的に増強し得ることが実証された。マウスで研究を行って、ＳＹＮ３処方物を用いる膀胱上皮に対する遺伝子移入の増大を定量した。マウスは、ＳＹＮ３またはビヒクル処方物のいずれかにおいてｒＡｄ−ＩＦＮの膀胱内投与を受けた。投与の２日後、マウスを屠殺して、それらの膀胱を回収して、ドライアイス上で急速凍結させた。次いで各々の膀胱から核酸を抽出して、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、存在するｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡおよびＲＮＡのレベルをアッセイした。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物を投与されたマウスは、ｒＡｄ−ＩＦＮを含むビヒクル処方物を投与されたマウスに比較してｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡのコピー数が約千倍多く（図４ａ）、そしてｒＡｄ−ＩＦＮを含むビヒクル処方物を投与されたマウスよりも膀胱ホモジネート中で決定されたＲＮＡが少なくとも１万倍多い。
【０１７４】
【表１０】
表１。マウスには、ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物（１００μｌ；７．４×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むまたはビヒクル処方物のいずれかを４５分間膀胱内投与した。投与の２日後、マウスを屠殺して、その膀胱を回収してドライアイス上で急速凍結させた。次いで各々の膀胱から核酸を抽出して、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、存在するｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡおよびＲＮＡのレベルをアッセイした。ＢＱＬ：定量レベル未満：ＤＮＡ：１０コピー数／組織１ｍｇ；ＲＮＡ：１０００ＭＥＱ／組織１ｍｇ。比較のために、ＳＹＮ３単独の投与によって得たレベルも示す。これらの結果に基づいて、ＳＹＮ３処方物が、膀胱上皮におけるｒＡｄ−ＩＦＮの送達および発現を増強するために必要とされることは明白である。
【０１７５】
（実施例８Ｄ）
（表在性膀胱癌についてのｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性）
ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性を、正所性腫瘍モデルを用いて評価した（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７（１２）：１５７５−８０（２０００））。表在性腫瘍は、腫瘍細胞結合を増強するための短時間のトリプシン事前投与の後にヒトＵＭＵＳ−３移行上皮癌（ＴＣＣ）の膀胱内投与によって胸腺欠損マウスの膀胱において樹立された。処理の開始前に６日間増殖することによって腫瘍を形成させた。次いで、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−コントロール／ＳＹＮ３またはＳＹＮ３−ビヒクル単独のいずれかをマウスに膀胱内投与した。２つの異なるコントロールのアデノウイルス構築物をこれらの研究において比較のために用いたが、一方は導入遺伝子を含まず（ＺＺＣＢ）、もう一方は、ヒト分泌アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰＣＢ）を含む。なぜなら、ｒＡｄ−ＩＦＮは、分泌遺伝子産物を産生する。マウスに、１００μｌのｒＡｄ（１．１×１０１１Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物を２日連続して１時間投与した。投与の１４日後（腫瘍の開始後２０日）、マウスを屠殺して、その膀胱を回収して、ホルマリンで固定し、それらの腫瘍負荷を顕微鏡検査で評価した。腫瘍があった膀胱の全体的割合、および腫瘍の相対的サイズを記録した。腫瘍によって占有される膀胱管腔の割合に基づいて０〜４のスケールで腫瘍をスコア付けした。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３投与群における腫瘍の全体的頻度は、ｒＡｄ−コントロールまたはＳＹＮ３のみの群における腫瘍の頻度よりも有意に低かった（図４）。著しいことに、ｒＡｄ−ＩＦＮ投与動物においては残りの腫瘍のわずかな例だけがコントロールに比較して有意に小さいサイズを有した。これらの結果によって、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３が、この正所性腫瘍モデルにおいて表在性膀胱腫瘍の増殖を大きく軽減させることが示される。
【０１７６】
他の研究では、トリプシン前処理後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトされたヒトＫＵ−７膀胱癌細胞の膀胱内投与によって表在性腫瘍が胸腺欠損マウスの膀胱で樹立される正所性腫瘍モデルが用いられている。膀胱を外科的に露出させて、ＧＦＰ蛍光を活性化させる光を用いて照射することによって、腫瘍サイズの連続的評価は、動物を屠殺することなくインビボでモニターできる。腫瘍細胞を１０日間増殖させて、その後すぐ膀胱を外科的に露出させて、照射して、各々の動物についての蛍光腫瘍負荷を写真で記録した。画像分析ソフトウェアを用いて、膀胱の総面積に対する、腫瘍細胞を含む膀胱の面積の割合をまた投与の前後に決定した。マウスには、１００μｌのｒＡｄ（１×１０１１Ｐ／ｍｌ）の膀胱内投与を２日続けて１時間ずつ行った。４つの投与群を比較した；ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−β−ｇａｌｌ／ＳＹＮ３ ｒＡｄ−ＩＦＮ単独またはＳＹＮ３単独。投与の２１日後（腫瘍増殖の開始の３１日後）、膀胱を再度膨張させて、外科的に露出させて、ＧＦＰ腫瘍負荷を上記のように再度測定した。
【０１７７】
ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与された動物は、経時的に腫瘍負荷の有意な減少を示した（図５）。対照的に、腫瘍のサイズは他の全ての投与群では増大させ続けた。ｒＡｄ−ＩＦＮ単独の投与では、腫瘍増殖の有意な軽減は生じず、このことはこの処方物に増強因子ＳＹＮ３を含むことの必要性を示す。ｒＡｄ−β−ｇａｌ／ＳＹＮ３群では腫瘍増殖の軽減は観察されないので、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３群で観察される腫瘍増殖の減少は、インターフェロン導入遺伝子発現の結果であるはずであり、アデノウイルスベクターの投与に起因する単なる非特異性効果ではない。要するに、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３は、この正所性腫瘍モデルにおける表在性膀胱腫瘍の増殖を有意に軽減するようである。コントロールに比較してＳＹＮ３／ｒＡｄ−ＩＦＮを用いて達成された腫瘍負荷の軽減を可視化するために、投与の前後での個々の動物についての腫瘍負荷の写真が各々の投与群について提供される）。
【０１７８】
（実施例８Ｅ．ラット膀胱におけるｒＡｄ−ＩＦＮ発現の検出）
細胞にｒＡｄ−ＩＦＮを形質導入する場合、分泌されたタンパク質産物が産生される。従って、膀胱上皮において得られるウイルスの導入遺伝子発現のレベルは尿中で分泌されるインターフェロンの量によって評価され得るという仮説が立てられた。最初の実験で、ｒＡｄ−ＩＦＮまたはｒＡｄ−コントロール（ＺＺＣＢ）を含むＳＹＮ３処方物の膀胱内投与を受けた雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット由来の尿中のインターフェロンのレベルを比較した。ラットには、ｒＡｄ（５×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３（１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内投与を４５分間行って、回復させた。投与の４８時間後、代謝ケージを用いて（４時間の収集）各々の動物から尿を得た。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、その尿中で極めて高レベルのインターフェロン有し（約２５ｎｇ／ｍｌ）、その血清中のインターフェロンのレベルは極めて低かった（図５）。対照的に、ｒＡｄ−コントロールを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、その尿または血清中にインターフェロンタンパク質を有さなかった。４８時間後、ラットを屠殺して、その膀胱を回収して、ホモジナイズして、インターフェロンレベルを決定した。ＳＹＮ３／ｒＡｄ−ＩＦＮを投与されたラットは、膀胱ホモジネート中に有意に高レベルのＩＦＮタンパク質が検出された。ＳＹＮ３／ｒＡｄ−コントロール動物の膀胱ホモジネート中ではインターフェロンは検出されなかった。これらの結果は、ＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致しており、これによって尿が膀胱のウイルス導入遺伝子発現のレベルおよび期間の両方をモニターするツールとして用いられ得ることが示唆される。
【０１７９】
（実施例９）
（パート１：化合物３の合成）
米国特許第６，３９２，０６９号から改変されているＳＹＮ３の合成スキームを図７に示す。ラクトビオン酸（２）のラクトンは、５０ｍｌのエタノールにラクトビオン酸（１）の１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）を溶解すること、ロータリー・エバポレーター中で蒸発乾燥するまでエバポレートし、そのプロセスを６回繰り返すことによって、合成された。化合物３を得るためには、５０℃まで加熱することによって、得られた残滓（２）を５０ｍｌのイソプロパノールに溶解した。この溶液に、１．２ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）のＮ−３−アミノプロピル）−１，２−プロパンジアミンを添加した。この温度を１００℃まで上昇させて、この溶液を３時間撹拌させた。ロータリー・エバポレーションによって溶媒を除去して、得られた残滓をクロロホルムを用いて数回洗浄して、過剰な未処理のＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンを除去した。この残留している残滓（３）を以下のパート３においてそのままに用いた。
【０１８０】
（パート２：化合物４の合成）
２．２８ｇのコール酸（５．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に、６０℃に加熱することで溶解することによって化合物４を合成した。トリエチルアミン（０．７８ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ））を添加して、溶液を氷浴中で冷却した。次いで、イソブチルクロロホルメート（０．７３ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ））を添加して、撹拌を１０分間続けて白色沈殿物を形成した。
【０１８１】
（パート３：ＳＹＮ３（化合物５）の合成）
化合物ＩＩＩをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解して、氷浴中で冷却して、撹拌した。化合物４の合成から得られる懸濁物を化合物３を含む溶液中に濾過した。得られた溶液を室温下で６時間撹拌した。この溶媒を高圧ロータリー・エバポレーションを用いて除去して、その残滓を１００ｍｌのクロロホルム／メタノール（５０／５０）に溶解した。この溶液の２５ｍｌを、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール（６０／４０）を用いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）からなる移動相を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって、カラムから溶出する分画の分析を行った。硫酸エタノールの噴霧後の炭化によってこの化合物を可視化した。フラッシュクロマトグラフィーを用い、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）を用いて、生成物を含む画分を確認して、再精製した。生成物を含む画分を確認して白色粉末までエバポレートした（３００ｍｇの化合物５）。この生成物の１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、示した構造と一致した。
【０１８２】
（実施例１１）
好ましい送達増強化合物は以下の表に示す。この表は、コール酸置換基を有する化合物を例示するが、当業者は、他のステロイド置換基がこの化合物の送達増強特性を損なうことなくコール酸と置換できることを容易に理解する。このような化合物を作製する方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号：０１６９３０−０００８３０ＵＳとして２００３年６月４日に提出された仮出願に教示されており、そこに開示される形質導入因子および送達増強因子、これらを作製する方法およびそれらの用途が特に参照される。
【０１８３】
【表１１】
（実施例１２）
（ＳＹＮ３処方物における膀胱内投与後のＩＦＮタンパク質の取り込み）
本実施例は、ＳＹＮ３処方物中で投与されたときに、インターフェロンタンパク質の組織レベルを、ＳＹＮ３が増大させ得るか否かを決定することによって、インターフェロンタンパク質の取り込みをＳＹＮ３が増強するか否かを検討した。
【０１８４】
方法。ハイブリッドＩＦＮタンパク質の供給は限定されているので、ＩＦＮα／２ｂタンパク質（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）が主に用いられた。比較の目的で、ｔ＝０時点でハイブリッドタンパク質も包含され得る。非近交系のＨＳＤラットを、イソフルランを用いて麻酔した。投与前の尿を収集した。カテーテルおよび潤滑剤を用いて膀胱に経尿道的に投与した。被験体を膀胱に投与した。尿道はカテーテルを引き抜くことなく２．０Ｇの縫合糸で結紮した。４５分後（０時間）、被験体を取り出して、動物を飼育ケージ中で回復させた。屠殺の直前にラットから尿サンプルを得た。尿を収集した後、ラットからその日に膀胱を回収した。組織を凍結させて、ＩＦＮ応答性遺伝子の上方制御についてアッセイした。
【０１８５】
【表１２】
物質：
３８匹の雌性Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット；
ＩＡＣＢ： Ｔｒｉｓ−グリセロール処方物 ７．５７×１０１１Ｐ／ｍｌ
ＩＨＣＢ： ｖＰＢＳ処方物 １．１０×１０１２Ｐ／ｍｌ
ＳＹＮ３： ６×ストック（６ｍｇ／ｍｌ）
Ｉｎｔｒｏｎ Ａ： 使用参照バイアル：１ｍｌの滅菌ナノピュアｄＨ２Ｏ中で水和（１０ＭＩＵ／ｍｌ）
３，００８μｌのＰＢＳで希釈した９５０μｌのＩｎｔｒｏｎ Ａ（２．４ ＭＩＵ／ｍｌ）
ＰＢＳまたはＳＹＮ３のいずれか１２５μｌに添加された６２５μｌの希釈されたＩｎｔｒｏｎ Ａ（６ｍｇ／ｍｌ）
ＩＦＮ α２α１タンパク質： １０５μｇ／ｍｌ＝１０５×１０６ｐｇ／ｍｌ
１．３４×１０７ＩＵ／ｍｌ
１．２８×１０８ＩＵ／ｍｇ
ＩＡＣＢは、インターフェロンα２ｂの組換えアデノウイルスベクターであり、ＣＭＶプロモーターおよびＥ１領域欠失を有する。ＩＨＣＢはハイブリッドインターフェロンα２α１の組換えアデノウイルスベクターであり、ＣＭＶプロモーターおよびＥ１領域欠失を有する。
【０１８６】
（被験体の調製：）
２．４ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度でＩＦＮα２ｂを調製する（１参照バイアルを１ｍｌの滅菌注射用水中で水和する）。
９５０μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物
３，００８μｌ ＰＢＳ。
【０１８７】
ＰＢＳ中でＩＦＮα２ｂを調製するため：
６２５μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ２．４ＭＩＵ／ｍｌ
１２５μｌ ＰＢＳ。
【０１８８】
ＳＹＮ３中でＩＦＮα２ｂを調製するため：
６２５μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ２．４ＭＩＵ／ｍｌ
１２５μｌ ＳＹＮ３。
【０１８９】
ＳＹＮ３中でｒＡｄ−ＩＦＮα２ｂ（ＩＡＣＢ）を調製するため：
６６μｌ ＩＡＣＢ
２５０μｌ ＳＹＮ３
１１８４μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０１９０】
ＩＦＮα／２α１タンパク質の濃縮物調製（２．２ｍｌ）：
２４３μｌ ＩＦＮ α２α１タンパク質
１９５７μｌ ＰＢＳ。
【０１９１】
ＩＦＮα２α１／ＰＢＳ：
６２５μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
１２５μｌ ＰＢＳ。
【０１９２】
ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３：
６２５μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
１２５μｌ ＳＹＮ３。
【０１９３】
【表１３】
従って、賦形剤の最終濃度は以下のとおりである：
ＳＹＮ３： （１２０ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝１ｍｇ／ｍｌ
クエン酸一水和物 （１．６ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．０１３３３ｍｇ／ｍｌ
クエン酸ナトリウム二水和物（５．１ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．０４２５ｍｇ／ｍｌ
ヒドロキシ−シクロデキストリン（１０００ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝８．３３ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）（６０ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．５ｍｇ／ｍｌ。
【０１９４】
組織ホモジネート中に存在するＩＦＮα２ｂの量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ）を用いて決定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて測定した。組織に存在するＩＦＮのレベルは、組織１ｍｇあたりのＩＦＮのｐｇ数（ｐｇＩＦＮ／組織ｍｇ）として表した（図８を参照のこと）。図８に示されるように、ＳＹＮ３処方物中のＩＦＮα２ｂの送達は、投与後最長２４時間まで検出可能なＩＦＮα２ｂタンパク質の量の約１５倍の増大を生じた。ハイブリッドＩＦＮタンパク質（ＩＦＮα２α１）の送達はまた、ＳＹＮ３処方物中の送達によって増強され、そしてＩＦＮα２ｂタンパク質と同様の組織濃度レベルで検出された。
【０１９５】
（実施例１３）
（ＩＦＮタンパク質を含むＳＹＮ３処方物の投与後の膀胱上皮に対するインターフェロンの生物学的作用の分析）
本実施例によって、ＩＦＮ組織濃度の増大が測定可能な生物学的応答を生じたか否かを検討した。生物学的活性を評価するため、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＩＦＮタンパク質での投与後のラット膀胱ホモジネート中のＩＦＮ応答性遺伝子の発現をモニターした（Ｉｎｔｒｏｎ Ａおよび「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」インターフェロン（ＩＦＮ Ａ／Ｄ；ＩＦＮα２α１）の両方。以下のラット遺伝子をアッセイした：２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（２’，５’−ＯＡＳ）；インターフェロン誘導性ｐ７８タンパク質をコードする遺伝子（ＭｘＡＭＸ１）（ＭＸ１）；インターフェロン調節性因子１（ＩＲＦ−１）；およびインターフェロンγＩＦＮγ。（ＩＦＮγは、正常にはＩＦＮ応答性遺伝子とはみなされないが、一般にはＢＣＧのような病原体に対する曝露後に発現させ、同様のＩＦＮγ応答が組換えアデノウイルスによって誘導されるか否かを決定するために含まれた）。この方法は概して、実施例１２において上記されるものであった。１時間後、被験体を取り出して、動物をホームケージで回復させた。ラットを指定の時点で屠殺し（０時間＝投与の直後）、そしてそのサンプルを液体Ｎ２中で急速凍結させて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１９６】
【表１４】
（必要な材料：）
３８例の雌性Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット；プロトコール０４−６３４から移した
ＩＡＣＢ： Ｔｒｉｓ−グリセロール処方物 ７．５７×１０１１Ｐ／ｍｌ
ＩＨＣＢ： ｖＰＢＳ処方物 １．１０×１０１２Ｐ／ｍｌ
ＳＹＮ３： ６×ストック（６ｍｇ／ｍｌ）
Ｄ−ＰＢＳ
Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液：
滅菌ＷＦＩ
ＩＦＮα２α１タンパク質： １０５μｇ／ｍｌ＝１０５×１０６ｐｇ／ｍｌ
１．３４×１０７ＩＵ／ｍｌ
１．２８×１０８ＩＵ／ｍｇ。
【０１９７】
（被験物質の調製：）
（１）ＩＦＮα２ｂ／ＰＢＳ：２ ＭＩＵ／ｍｌ最終濃度で５ｍｌ）
・１ｍｌ注射用滅菌水１，０００μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物中で１参照バイアルを水和する（１０ＭＩＵ／バイアル）
４，０００μｌ ＰＢＳ。
【０１９８】
（２）ＩＦＮ α２ｂ／ＳＹＮ３：最終濃度２ＭＩＵ／ｍｌで１０ｍｌ）
・２ｍｌ注射用滅菌水２，０００μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物で２つの参照バイアルを水和する。
６，３３４μｌ ＰＢＳ
１，６６６μｌ ＳＹＮ３。
【０１９９】
（ＩＡＣＢ／ＳＹＮ３：ＳＹＮ３中に１．０×１０１１Ｐ／ｍｌで４．５ｍｌ）
６６０μｌ ＩＡＣＢ
７５０μｌ ＳＹＮ３
３，０９０μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０２００】
（ＩＦＮα２α／ＰＢＳ：１ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度で４ｍｌ）
２９８μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
３，７０２μｌ ＰＢＳ。
【０２０１】
（ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３：１ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度で６ｍｌ）
４４４μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
４，５５６μｌ ＰＢＳ
１，０００μｌ ＳＹＮ３。
【０２０２】
（ＩＨＣＢ／ＳＹＮ３ ＳＹＮ３中に１．０×１０１１Ｐ／ｍｌで４．０ｍｌ）
３６４μｌ ＩＨＣＢ
６６７μｌ ＳＹＮ３
２，９６９μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０２０３】
動物を指定の時点（図９〜１１を参照のこと）において屠殺して、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために液体窒素上にその膀胱を回収した。一次分析では、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ／ＰＢＳ送達後に観察されるレベルに対して上記の遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較した。これにより、示されるグラフでは、遺伝子活性化のレベルは、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ／ＰＢＳ群に対して正規化される（１．０）。
【０２０４】
図９〜１２に示されるように、ＳＹＮ３の追加は、同じ量のタンパク質を含むＰＢＳ処方物の送達に比較して、公知の下流ＩＦＮ活性化遺伝子（２’−５’ＯＡＳ，ＭＸ１）の発現を増大させた。ＳＹＮ３におけるハイブリッドタンパク質（ＢＳ：ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３）は、ＩＦＮα２ｂについて２ＭＩＵ／ｍｌの代わりに１ＭＩＵ／ｍｌで投与された場合でさえ、より強力な生物学的応答をもたらすと思われた。Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（ＩＦＮα２ｂ）およびハイブリッドＩＦＮ（ＩＦＮα２α１）の両方ともＳＹＮ３処方物中で投与された場合、ラットＯＡＳおよびＭＸ１遺伝子の発現を増大させたが、両方ともｒＡｄ−ＩＦＮα２ｂまたはｒＡｄ−ＩＦＮα２α１の投与後に得られたレベルよりも幾分か劣った。
【０２０５】
本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示的な目的のものでしかなく、それらに照らして様々な改変または変化が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるものであるということが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が詳細にかつ個々に参考として援用されることを意図しているように、全ての目的についてその全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、腫瘍細胞における遺伝子発現を増強する送達増強因子の効果を実証するために、本明細書に記載された実験において用いられる、複製欠損組換えアデノウイルス遺伝子送達系の模式図を提供する。
【図２】図２は、皮下の異種移植片腫瘍モデルにおける、組換えアデノウイルスインターフェロン遺伝子送達系およびＳＹＮ３を含む、薬学的組成物の抗腫瘍有効性を示すグラフ表示である。グリア芽細胞種（ＬＮ２２９、Ｕ８７ＭＧ）、肝細胞腫（ＨＥＰ３Ｂ）およびＣＭＬ（Ｋ５６２）に由来する腫瘍を保有するヌードマウスにおいて腫瘍内ｒＡｄ−ＩＦＮ投与後に、腫瘍増殖の阻害が観察された。腫瘍内投与による皮下異種移植片腫瘍増殖の阻害。５匹のマウスの群に、ビヒクル、ｒＡｄ−コントロール、またはｒＡｄ−ＩＦＮを用いて２週間の間、週に３日の注射によって投与した（１×１０１０粒子／用量；総用量６×１０１０粒子）。
【図３】図３は、ラットにおける組換えアデノウイルス遺伝子送達系の送達をＳＹＮ３が増強する能力を示す。雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットには、４５分間に、ｒＡｄ−β−ｇａｌ（７．６×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物（ビヒクルに１ｍｇ／ｍｌ）、またはビヒクル単独（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０）のいずれかの膀胱内投与を与えた。４８時間後、動物を屠殺して、それらの膀胱を回収し、固定して、ｌａｃＺ発現についてＸ−ｇａｌ染色した。
【図４】図４は、マウスの膀胱腫瘍モデルにおける腫瘍に対する、ＳＹＮ３を有するインターフェロン遺伝子送達系を含む薬学的組成物の効果を示す。雌性ヌードマウスでは、経尿道的にカテーテルを使用して、３時間、ＵＭＵＣ−３細胞（１×１０７；１００ｍｌ）を投与する前に３０分間、１００ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）を投与した。６日後、ｒＡｄ−ＩＦＮまたはｒＡｄコントロール（１×１０１１／１００μｌ）またはＳＹＮ３のみ（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの膀胱内投与によって動物に２×（２４時間間隔；６日、７日）投与した。腫瘍細胞移植の２１日後、動物を屠殺して、それらの膀胱を、顕微鏡検査および腫瘍負荷のスコア付けのためにホルマリンに収集した。腫瘍は以下のようにスコア付けした：０＝腫瘍なし、１＝閉塞した膀胱管腔のうち２５％未満；２＝閉塞した膀胱管腔のうち２５〜５０％；３＝閉塞した膀胱管腔の５０％超。
【図５】図５は、トリプシン前処理後に緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトされたヒトＫＵ−７膀胱癌細胞の膀胱内投与により胸腺欠損マウスの膀胱で表在性腫瘍を樹立した表在性膀胱癌の同所性腫瘍モデルにおける、遺伝子送達増強系と組み合わせたＳＹＮ３の有効性に関連するデータを提供する。ＧＦＰ蛍光を活性化するために膀胱を外科的に露出および照射することによって、腫瘍サイズの経時的な評価は、動物を屠殺することなくインビボでモニターできる。腫瘍細胞を１０日間増殖させ、その後、膀胱を外科的に露出させて照射し、そして各々の動物についての蛍光の腫瘍負荷を写真で記録した。画像分析ソフトウェアを用いて、膀胱の総領域に対する腫瘍細胞を含む膀胱の領域の割合をまた、投与の前後に決定した。２日連続して１時間、１００μｌのｒＡｄ（１×１０１１Ｐ／ｍｌ）の膀胱内投与をマウスに行った。４つの投与群を比較した：ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−β−ｇａｌｌ／ＳＹＮ３ ｒＡｄ−ＩＦＮ単独またはＳＹＮ３単独。投与の２１日後（腫瘍増殖の開始後３１日）、膀胱を再度膨らませて、外科的に露出させて、ＧＦＰ腫瘍負荷を上記のように再度測定した。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与された動物は、経時的に腫瘍負荷が有意に低下した。
【図６】図６は、血液、尿および膀胱の組織におけるインターフェロンのレベルに対する、ＳＹＮ３およびインターフェロン遺伝子送達系を含む薬学的組成物の効果を示す。ｒＡｄ−ＩＦＮ（ＩＡＣＢ）またはｒＡｄ−コントロール（ＺＺＣＢ）のいずれかを含むＳＹＮ３処方物（１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内投与（１００μｌ；７．４×１０１０Ｐ／ｍｌ）をマウスに行った。投与の２日後、尿および血清を各々の動物から得るとすぐに動物を屠殺して、それらの膀胱を回収して、ホモジナイズして、ＩＦＮのレベルについてアッセイした。このデータによって、インターフェロン発現のレベルが尿のアッセイによって決定され得るということ、およびインターフェロンをコードする遺伝子送達系の膀胱内投与後のインターフェロンタンパク質に対する動物の識別可能な全身的曝露がないということがわかる。
【図７】図７は、ＳＹＮ３の合成の１つの方法を例示する。
【図８】図８は、種々の時点でのラットにおける尿路上皮によるインターフェロンの取り込みに対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。ハイブリッドＩＦＮタンパク質の供給が制限されるので、ＩＦＮα２ｂタンパク質（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）が主に用いられた。比較のためには、ハイブリッドタンパク質をまた、ｔ＝０時点で含んだ。
【図９】図９は、ラットにおける、２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）のインターフェロン発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１０】図１０は、ラットにおける、ＭＸ１のインターフェロン誘導性発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１１】図１１は、ラットにおける、ＩＲＦ１の任意のインターフェロン誘導性発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１２】図１２は、ラットにおける、ＩＦＮγのインターフェロン発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、２００３年６月４日出願、米国特許出願第１０／４５５，２１５号の一部継続出願であり、この出願は、２００２年１月２２日出願、米国特許出願第１０／０５５，８６３号の一部継続出願であり、この出願は、１９９８年７月８日出願、米国特許出願第０９／１１２，０７４号（２００２年５月２１日発行の米国特許第６，３９２，０６９号）の継続出願であり、この出願は、１９９７年７月８日出願、米国特許出願第０８／８８９，３５５号の一部継続出願であり、この出願は、１９９６年１月８日出願、米国特許出願第０８／５８４，０７７号（１９９８年８月４日発行、米国特許第５，７８９，２４４号）の一部継続であり；本出願はまた、２００３年６月３日出願、譲渡された米国特許出願番号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号０１６９３０−０００８１５）の一部継続出願であり、この出願は、２０００年８月２８日出願の米国特許出願第０９／６５０，３５９号の継続出願であり、この出願は、１９９７年１月７日出願、米国特許出願第０８／７７９，６２７号（２０００年１２月２６日発行、米国特許第６，１６５，７７９号）の継続出願であり、この出願は、１９９６年１月８日出願、米国特許出願第０８／５８４，０７７号の一部継続出願であり；本出願は、２００４年６月４日出願、譲渡される米国特許出願番号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号０１６９３０−０００８３１ＵＳに対する優先権を主張し、この出願は、２００３年６月４日出願米国特許出願第６０／４７５９２６号の恩典を請求する。本出願は、２００１年１２月２０日出願、米国特許出願第６０／３４２３２９号の恩典を請求する、２００２年１２月２０日出願、米国特許出願第１０／３２９，０４３号の主題に関する主題を含む。これらの優先出願の開示は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
毎年米国では４５，０００例を超える表在性膀胱癌が診断されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２００２）。表在性の疾患は典型的には、粘膜表面（Ｔａ）に限定されるか、または平面伝播性の改変型である上皮内癌（ＣＩＳ）として存在する。いくつかのタイプの疾患は、経尿道的膀胱腫瘍切除術（ＴＵＲＢＴ）によって最初に切り出され得るが、おそらく、可視的な腫瘍の肉眼での切除では、最終的に腫瘍再発を生じる顕微鏡的な病巣が残留し得るので、新規な腫瘍形成の傾向は高いままである。さらに、上皮内癌（ＣＩＳ）の治療には、外科的な介入は不可能である。従って、膀胱内療法が、腫瘍再発を防止する外科手術に対する補助療法として、または小さい残留性疾患および／またはＣＩＳのようなアクセス不能な疾患を排除するために、開発されている。
【０００３】
表在性膀胱癌の治療のために、２つの一般的なタイプの膀胱内療法が現在使用されている：化学療法およびＢＣＧ免疫療法。膀胱内投与を介して有効性が示されている化学療法剤は３つしかない：チオテパ、アドリアマイシン（およびその誘導体、エピルビシンおよびバルビシン）、およびマイトマイシン。ＴＵＲＢＴ単独に対してこれらの化学療法剤を比較する多重無作為化トライアルによって、腫瘍再発の１２〜１５％という正味の減少（すなわち、ＴＵＲＢＴでの６０％の再発、対ＴＵＲＢＴに加えて化学療法での４５％の再発）があり、１因子では併用より明らかな優位性はないことが明らかになっている（非特許文献１）。さらに重要な事には、再発におけるこの統計学的に有意な低下にもかかわらず、化学療法が最終的な疾患の進行の可能性を減少させるか、または生存率を向上させるということを実証しているエビデンスは示されていない（非特許文献２）。
【０００４】
免疫療法は典型的に、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（「ＢＣＧ」）の生ワクチン株の膀胱内投与からなる。腫瘍再発は、ＴＵＲＢＴ（または膀胱内化学療法約２回）後にＢＣＧを用いて約３０％に減少する（非特許文献３）。小さい乳頭状腫瘍（＜２ｃｍ）の切除は、その時点で５５〜６０％、そしてＣＩＳについては７５％まで達成され得る（非特許文献４）。膀胱内ＢＣＧは、再発または疾患の進行のリスクの高い表在性膀胱癌の患者では標準的な治療となっている。これに関して、ＢＣＧを用いる膀胱内療法によって、ある程度の疾患管理、および表在性膀胱癌のあらゆる患者について望ましい目標である、膀胱の機能的保持が可能である。しかし、高いリスクの表在性膀胱癌の初期治療についてのこのＢＣＧ介在性の利点にもかかわらず、約５０％の患者が２年以内に再発する。一般に、このような再発はＢＣＧで再治療される。しかし、複数回の膀胱内ＢＣＧ点滴で治療された患者は、用量制限毒性、例えば、膀胱炎、排尿障害、発熱、そして場合によりＢＣＧ敗血症を被り得ることが観察された。従って、十分な忍容性を示し、かつ有効であるＢＣＧ治療に対する代替法が望まれる。
【０００５】
近年では、研究者は、表在性膀胱癌の治療のための膀胱内での組換えインターフェロンα２ｂタンパク質（ＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））療法について評価している。第ＩＩ相ヒト臨床試験によって、５０〜１００ＭＩＵの用量での単独薬剤としての膀胱内滴下注入ＩｎｔｒｏｎＡは、表在性膀胱癌を有する患者の４０％において完全寛解を得ることが実証された（非特許文献５）。
【０００６】
上記の観点から、上皮細胞、そして特に尿路上皮に対する、治療用タンパク質、ポリペプチド（例えば、インターフェロン、ＩｎｔｒｏｎＡ）または遺伝子送達系または核酸の送達を改善する方法を有することは有利である。
【非特許文献１】Ｔｒａｙｎｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ：Ｓ．Ｎ．Ｒｏｕｓ（編）Ｕｒｏｌｏｇｙ Ａｎｎｕａｌ」，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＷＷ Ｎｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏ，１９９４，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．１１３−１４３
【非特許文献２】Ｌａｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｒｏｌ，（１９９５）１５３：１４４４〜５０
【非特許文献３】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＭＡ，「Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ＢＣＧ ｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ」Ｉｎ：Ｄｒｏｌｌｅｒ、編、Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｎｃｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２００１
【非特許文献４】Ｋａｖｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．（１９８８）１３９：９３５
【非特許文献５】Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，２００１ Ｏｃｔ．，１６６（４）：１３００〜５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の１態様では、上皮細胞層を有する組織または器官に対してタンパク質療法を行うための方法および薬学的組成物が提供される。１態様では、タンパク質療法は、ベクターによって標的組織または器官の細胞の形質導入を増大する、タンパク質療法送達増強因子を用いた治療と併用して標的の組織または器官に投与される。この方法および組み合わせは、生物学的に活性なタンパク質を用いた治療に応答性である癌および他の状態の治療に有効であり得る。好ましい実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、タンパク質療法は、インターフェロンタンパク質自体の投与によって、または形質導入された上皮もしくは尿道上皮細胞において発現されるべきインターフェロンタンパク質を遺伝子がコードしている、インターフェロン遺伝子送達系の投与によって、インターフェロンタンパク質を提供する。例示的な実施形態では、この
方法は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３のホモログもしくはアナログおよびインターフェロンまたはこのインターフェロンをコードするアデノウイルスベクターを含む薬学的組成物の治療上有効な量の膀胱への経尿道膀胱内投与を包含する。さらなる実施形態では、このインターフェロンは、αインターフェロンである。
【０００９】
別の態様では、本発明は、上皮組織に対する核酸の送達を増強するための組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、送達増強因子と組み合わせてインターフェロンを遺伝子がコードする、遺伝子送達系を、組織または器官の細胞と接触させる工程を提供する。１つのさらなる実施形態では、本発明は、インターフェロン遺伝子をコードする組換えアデノウイルスおよび送達増強因子を含む薬学的組成物を提供する。例示的な実施形態では、この送達増強因子はＳＹＮ３であり、そしてこの系は、生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、送達増強因子および治療タンパク質の膀胱内投与により、膀胱上皮に対する、治療タンパク質またはこのタンパク質をコードする遺伝子を有する遺伝子送達系の送達を増強することによって、膀胱癌を治療するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、この治療タンパク質はインターフェロンである。さらなる実施形態では、この治療タンパク質はインターフェロンα２ｂまたはインターフェロンα２α１である。さらに他の実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。例示的実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３であり、タンパク質はインターフェロン（例えば、生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチド）である。さらなる実施形態では、タンパク質は、タンパク質としてまたはこのタンパク質をコードする遺伝子送達系を介して投与され得る。さらに他の実施形態では、このタンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。さらなる実施形態では、抗体は、サイトカインを指向している。
【００１１】
別の態様では、本発明は、治療タンパク質または送達増強因子の投与のための薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、インターフェロンであり、そして送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。例示的な実施形態では、この送達増強因子はＳＹＮ３であり、このタンパク質は生物学的に活性なヒトインターフェロンポリペプチドである。さらなる実施形態では、このインターフェロンはインターフェロンα２ｂまたはインターフェロンα２α１である。
【００１２】
いくつかの態様では、本発明の方法は、送達増強因子および治療用タンパク質または治療タンパク質をコードする核酸の膀胱内投与によって、上皮膜で裏打ちされたかまたは上皮膜を含む、内部の隙間、洞、室、通路、容積、腔、空隙または管腔を規定する任意の器官または組織を治療する工程を包含する。このように規定された表面または壁は、薬学的組成物の身体の別の部分への大量の液体の動きまたは移動を含むか、または遅らせるか、または制限するように機能し、そして上皮膜と薬学的組成物との長い接触時間を可能にし得る。器官または組織は、内面に上皮膜を有する膀胱（ｂｌａｄｄｅｒ）（例えば、膀胱（ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ））であってもよい。ある実施形態では、器官は胃、子宮、腸、食道、口、結腸、上部もしくは下部の消化管、または上部もしくは下部の気道である。ある実施形態では、この器官または組織は、腹腔のような空間を規定し、上皮表面は、腹腔内の空間と液体接触し得る上皮表面上に位置する。ある実施形態では、この器官または組織は癌を有する。増殖性障害または感染性疾患および治療タンパク質は、インターフェロンであり、そして送達増強因子はＳＹＮ３またはＳＹＮ３アナログである。
【００１３】
本発明によれば、さらに以下が提供される。
（項目１）
１）ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子、ならびに２）インターフェロンタンパク質またはインターフェロン遺伝子送達系を含有する薬学的組成物であって、該遺伝子送達系がインターフェロンの遺伝子を含有し、かつ該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、薬学的組成物。
（項目２）
前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアを含有する、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目３）
前記組成物が、凍結乾燥される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目４）
前記組成物が、ＳＹＮ３を含有する、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目５）
前記インターフェロンが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、δ−インターフェロン、γ−インターフェロンおよびそれらの融合インターフェロンからなる群より選択される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目６）
前記インターフェロンが、インターフェロンα−２ｂ、融合インターフェロンα−／２α−１、およびインターフェロンα−２ｅからなる群より選択される、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目７）
前記因子が、ＳＹＮ３であり、かつ前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンである、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目８）
前記αインターフェロンが、α１インターフェロンまたはα２インターフェロンである、項目７に記載の薬学的組成物。
（項目９）
前記インターフェロンが、ヒトインターフェロンである、項目１に記載の薬学的組成物。
（項目１０）
前記ホモログが以下の式：
【化１】
の化合物である、項目１に記載の薬学的組成物であって、
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；
ｍおよびｎは、個々に独立して、約０〜２から選択され；
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は、個々に独立して、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸは、ハロゲンおよび任意に置換されたカルボキシレートからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである、
薬学的組成物。
（項目１１）
Ｒ１およびＲ２が、両方ともヒドロキシル基である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
ｍおよびｎが、それぞれ１である、項目１０に記載の組成物。
（項目１３）
前記化合物が、式ＩＩ：
【化２】
を有する、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
Ｒ４が、水素であり；そしてＲ５が、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシからなる群より選択されるメンバーである、項目１０に記載の組成物。
（項目１５）
前記化合物が、式ＩＩＩ：
【化３】
を有する、項目１０に記載の組成物。
（項目１６）
Ｒ４がスクシニルである、項目１０に記載の化合物。
（項目１７）
Ｒ４がアセチルである、項目１０に記載の化合物。
（項目１８）
Ｒ３がトリメチルアンモニウム塩である、項目１０に記載の化合物。
（項目１９）
Ｒ３がトリエチルアンモニウム塩である、項目１０に記載の化合物。
（項目２０）
哺乳動物被験体に対してインターフェロンを送達するための方法であって、該方法は、ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子を含有する薬学的組成物の治療上有効な量を該被験体の上皮組織または器官に投与する工程、およびインターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系を投与する工程を包含し、ここで該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、そして該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、方法。
（項目２１）
前記因子が、ＳＹＮ３である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記因子がＳＹＮ３であり、かつ前記組成物中の該ＳＹＮ３の濃度が０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍｌである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記インターフェロンが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、δ−インターフェロン、γ−インターフェロンおよびそれらの融合インターフェロンからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記インターフェロンが、インターフェロンα−２ｂからなる群より選択され、融合インターフェロンがα−／２α−１、およびインターフェロンα−２ｅである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体が、ヒトであり、前記因子が、ＳＹＮ３であり、そして前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンである、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記αインターフェロンが、α１インターフェロンまたはα２インターフェロンである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記インターフェロンが、ヒトインターフェロンである、項目２０に記載の方法。
（項目２８）
前記組成物が、組織または器官に対して膀胱内に投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記組織または器官が、癌性である、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
前記組織または器官が、ヒト膀胱である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記投与が、ほぼ週１回、月２回、毎月および隔月からなる群より選択される間隔である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記投与が、所定の範囲内でインターフェロン遺伝子の発現を維持するために投与される組成物の投与の頻度または量に関して調節される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物が、約５０〜６００ｍｌの体積で投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記体積が、約１００〜３００ｍｌである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が、カテーテルによって投与される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記カテーテルが、バルーンカテーテルであり、該カテーテルのバルーン部分が、膀胱の空隙体積を減少させるために挿入後に膨張される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記被験体が、再発性または反復性の膀胱癌患者である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体が、ＢＣＧ療法を用いて事前処置された、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記組織または器官が、気道組織もしくは器官、上部もしくは下部胃腸の組織もしくは器官、または腹膜組織もしくは器官である、項目２０に記載の方法。
（項目４０）
前記組成物が、約５分間〜約２時間の時間にわたって投与される、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
前記組成物中のＳＹＮ３の濃度が、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの量である、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記ホモログが、式：
【化４】
を有する、項目２３に記載の方法であって、
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；
ｍおよびｎは、個々に独立して、約０〜２から選択され；
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は、個々に独立して、水素、糖残基、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアシル、および任意に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸは、ハロゲンおよび任意に置換されたカルボキシレートからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである、方法。
（項目４３）
前記ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログが、インターフェロンまたは遺伝子送達系との同時処方物中で投与される、項目２０に記載の方法。
（項目４４）
前記ＳＹＮ３組成物またはＳＹＮ３ホモログ組成物、および前記インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系が、別個に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目４５）
前記ＳＹＮ３組成物またはＳＹＮ３ホモログ組成物が、前記インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系の投与の前に投与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
キットであって、以下：
インターフェロンの送達を強化し得るＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む第一の容器；および
インターフェロンまたは遺伝子送達系を含む第二の容器であって、該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、第二の容器、
を備えるキット。
（項目４７）
前記第一の容器が、ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
前記第二の容器が、インターフェロンまたは遺伝子送達系の凍結乾燥処方物を含む、項目４６に記載のキット。
（項目４９）
前記インターフェロン遺伝子が、αインターフェロン遺伝子である、項目４６に記載のキット。
（項目５０）
前記インターフェロン遺伝子が、ヒトである、項目４６に記載のキット。
（項目５１）
ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される遺伝子送達増強因子ならびに遺伝子送達系を含有する薬学的組成物であって、該遺伝子送達系は、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子は、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、薬学的組成物。
（項目５２）
前記遺伝子送達系が、組換えウイルスベクターを含む、項目５１に記載の薬学的組成物。
（項目５３）
前記組換えウイルスベクターが、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターからなる群より選択される、項目５２に記載の薬学的組成物。
（項目５４）
前記因子が、ＳＹＮ３であり、前記インターフェロンが、ヒトαインターフェロンまたはその融合インターフェロンであり、前記遺伝子送達系が、組換えアデノウイルス遺伝子送達系である、項目５３に記載の薬学的組成物。
（項目５５）
前記組成物が、単位投薬量形態であり、前記因子の量が１〜２０００ｍｇである治療量の組成物を含む、項目５１に記載の薬学的組成物。
（項目５６）
哺乳動物被験体にインターフェロンを送達するための方法であって、該方法は、ＳＹＮ３およびＳＹＮ３ホモログからなる群より選択される送達増強因子および遺伝子送達系を含む薬学的組成物の治療上有効な量を該被験体の上皮組織または器官に投与する工程を包含し、該遺伝子送達系が、インターフェロンの遺伝子を含み、該インターフェロンの遺伝子が、該遺伝子の発現を調節する遺伝的調節要素に作動可能に連結されている、方法。
（項目５７）
前記遺伝子送達系が、ＤＮＡおよび陽イオン性脂質を含む、項目５１に記載の方法。
（項目５８）
前記インターフェロンの発現を測定するために、尿がモニタリングされる、項目５１に記載の方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
他に規定しない限り、本明細書において用いる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において引用される、各々の刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、本開示と矛盾しない程度までその全体が参考として援用される。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（「ａ」、「ａｎ」）」、および「この、その（「ｔｈｅ」）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の言及を包含する。
【００１６】
１態様では、本発明は、上皮層または尿路上皮を有する組織に対するタンパク質または核酸の送達を増強する組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、組織または器官の細胞と、インターフェロンまたはインターフェロンをコードする遺伝子送達系とを、送達増強因子と組み合わせて接触させる工程を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、上皮と送達増強因子（例えば、ＳＹＮ３）とを接触させることによって、上皮に対するタンパク質（例えば、インターフェロン）の送達を増強する組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、この方法は、膀胱の尿路上皮と１）インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系、および２）ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログとを接触させる工程を提供する。本発明は、膀胱に対する遺伝子送達系およびタンパク質のＳＹＮ３増強性送達が、ＳＹＮ３を用いて組換えアデノウイルス遺伝子療法で得られたものに対抗する量で生物学的に活性なタンパク質（例えば、インターフェロン）を送達する高度に有効な方法であるという発見に関する。これらの結果によって、特に、インターフェロンのＳＹＮ３増強送達が膀胱癌を治療するのに有効であることが示される。この結果によってまた、一般に、ＳＹＮ３およびそのホモログがまた、特に尿路上皮に関して、上皮組織の細胞に対する上皮性の障壁を横切って他の治療タンパク質を送達するのに有効であるはずであるということが示される。
【００１８】
（遺伝子送達系：）
「遺伝子送達系（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、細胞中のタンパク質遺伝子の発現をもたらす発現調節配列に作動可能に連結された、生物学的に活性なタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを含む。インターフェロン遺伝子送達系は、細胞中でインターフェロン遺伝子の発現をもたらす発現調節配列に作動可能に連結された、インターフェロンをコードする組換えポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
ポリヌクレオチドという用語は、ヌクレオチドモノマーからなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドとは、天然に存在する核酸、例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）、ならびに核酸アナログを包含する。核酸アナログとは、それらの天然には存在しない塩基、天然に存在するホスホジエステル結合以外のヌクレオチドと連結されて係合しているか、またはホスホジエステル結合以外の連結を通じて結合された塩基を含むヌクレオチドを包含する。従って、ヌクレオチドアナログとしては、例えば、限定はしないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホラミダイト、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）などが挙げられる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動的なＤＮＡシンセサイザーを用いて合成され得る。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という用語は典型的には、大型のポリヌクレオチドをいう。「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」という用語は典型的には、短いポリヌクレオチド、一般には約５０未満のヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって提示される場合、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」と置き換わっているＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を含むことが理解される。「組換えポリヌクレオチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、天然には一緒に連結されていない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅されるかまたはアセンブルされた組換えポリヌクレオチドは、適切なベクターに含まれてもよく、そしてベクターを用いて、被験体の適切な宿主細胞を形質転換することができる。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」と呼ばれる。次いで、遺伝子は、組換え宿主細胞中で発現されて、例えば、「組換えインターフェロンポリペプチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を産生する。
【００２０】
「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、生物学的プロセス中で他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして機能する遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列であって、ヌクレオチドの規定の配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する配列の固有の特性、ならびにそれから得られる生物学的特性をいう。従って、ある遺伝子によって生成されるｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系において、このタンパク質を産生する場合、この遺伝子はこのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列に対してヌクレオチド配列が同一であり、配列表において一般に提供される、両方のコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして用いられる、非コード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするということができる。他に特定しない限り、「インターフェロンのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、お互いの縮重バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。
【００２１】
「発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列であって、それに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するヌクレオチド配列をいう。「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、２つの部分の間の機能的関係であって、１部分の活性（例えば、転写を調節する能力）が他の部分（例えば、配列の転写）に対して作用を生じる関係をいう。発現調節配列としては、例えば、限定はしないが、プロモーター（例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーター）、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナルおよび終止コドンの配列を挙げることができる。
【００２２】
発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞発現系によって供給され得る。発現ベクターとしては、当該分野で公知のベクター、例えば、コスミド、プラスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれるプラスミド）および組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルスが挙げられる。
【００２３】
１つの実施形態では、特定の発現調節配列を使用して、目的の組織により優先的に用いられるプロモーターおよび／または他の発現エレメントの使用によって、特定のタイプの組織中のインターフェロン遺伝子の選択的発現を得ることができる。公知の組織特異的プロモーターの例としては、筋肉および心臓組織におけるジストロフィンｃＤＮＡ発現の発現を指向するように用いられている、クレアチンキナーゼのプロモーター（Ｃｏｘ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６４：７２５−７２９（１９９３））；Ｂ細胞における遺伝子の発現のための免疫グロブリン重鎖または軽鎖プロモーター；それぞれ肝臓系統の細胞およびヘパトーマ細胞の標的細胞に対するアルブミンまたはαフェトプロテインプロモーターが挙げられる。肝臓についての例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼプロモーター（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７（５）：１８８１〜１８９３（１９８７））；ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ−１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（４）：２３０６〜２３１０（１９９０）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２（３）：１３９６〜１４０３（１９９２））；ヒトＣ応答性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５（７）：４１３６−４１４２（１９９０））；ヒトグルコキナーゼプロモーター（Ｔａｎｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，６（７）：１０７０−８１（１９９２）；コレステロール７αヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ−７）プロモーター（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６８１−９（１９９４））；βガラクトシダーゼα−２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３４）：２０８６３−８（１９９０）；インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１）プロモーター（Ｂａｂａｊｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９６（１）：４８０−６（１９９３））；アルドラーゼＢプロモーター（Ｂｒｉｎｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２９４（Ｐｔ２）：４７３−９（１９９３））；ヒトトランスフェリンプロモーター（Ｍｅｎｄｅｌｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（１９）：５７１７〜２１（１９９０）；コラーゲンＩ型プロモーター（Ｈｏｕｇｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４（２）：８０８−１４（１９９４））。前立腺の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター（Ｂａｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１７（２）：１８８−９４（１９９４）；９４の前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ ９４）プロモーター（Ｎｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡＣＴＡ，１０９８（２）：２４７―９（１９９１））；前立腺特異的抗原複合体プロモーター（Ｃａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７（１−６）：１２７−３５（１９９３））；ヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ−１）（Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１１（４）：１８８−９１（１９９３）が挙げられる。胃組織の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないがヒトＨ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅαサブユニットプロモーター（Ｔａｎｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９８：（２−３）：１３７−４１（１９９２））が挙げられる。膵臓の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）（Ｄｕｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（１９）：１４４７０−５（１９９３））；エラスターゼ１転写エンハンサー（Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７（５）：７７４−８６（１９９３））；膵臓特異的アミラーゼおよびエラスターゼエンハンサープロモーター（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１（９）：４４２３−３０（１９９１）；Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，４（８）：１３１６−２１（１９９０））；膵臓コレステロールエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｆｏｎｔａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（２８）：７００８−１４（１９９１））が挙げられる。子宮内膜の例示的組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ウテログロビンプロモーター（Ｈｅｌｆｔｅｎｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６２２：６９−７９（１９９１））が挙げられる。副腎細胞の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、コレステロール側鎖切断（ＳＣＣ）プロモーター（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１７１３−２０（１９９０）が挙げられる。全身の神経系の例示的な組織特異的発現系としては、限定はしないが、γ−γエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーター（Ｆｏｒｓｓ−Ｐｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ、５（２）：１８７−９７（１９９０））が挙げられる。脳の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、神経フィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）プロモーター（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（１８）１３４４４−５０（１９９４））が挙げられる。リンパ球の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ヒトＣＧＬ−１／グランザイムＢプロモーター（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６（３６）：２４４３３−８（１９９１））；末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、λ５、ＶｐｒｅＢおよびｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンプロテインキナーゼｐ５６ｌｃｋ）プロモーター（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１（１０）：５２２９−４３（１９９１））；ヒトＣＤ２プロモーターおよびその３’転写エンハンサー（Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９（１０）：３１２９−３６（１９９０））、ならびにヒトＮＫ細胞およびＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７（２）：１０２−７（１９９３））が挙げられる。結腸の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター（Ｔａｌａｍｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，９１（１）：５３−６０（１９９３））；器官特異的新生抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）（ＯＳＮ），ｍｗ４０ｋＤａ（ｐ４０）プロモーター（Ｉｌａｎｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７（２）：１１９−２８（１９９３））；結腸特異的抗原Ｐプロモーター（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，７３（３ ｓｕｐｐ．）８６４−７７（１９９４））が挙げられる。乳房細胞の例示的な組織特異的発現エレメントとしては、限定はしないが、ヒトαラクトアルブミンプロモーター（Ｔｈｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，６１（５）：７７３−５（１９９０））が挙げられる。
【００２４】
「インターフェロン遺伝子（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇｅｎｅ）」という用語の使用は、インターフェロンの発現を指向する遺伝子を指す。
【００２５】
本明細書において用いられる「遺伝子（ｇｅｎｅ）」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列を指すものとする。この定義は、種々の配列多型性、変異および／または配列変異体であって、このような変更が遺伝子産物の機能に影響しないものを包含する。「遺伝子（ｇｅｎｅ）」という用語としては、コード配列だけではなく、プロモーター、エンハンサーおよび末端領域のような調節性領域を挙げることができる。この用語はさらに、選択的スプライシング部位から生じる変異体とともに、ｍＲＮＡ転写物からスプライシングされた全てのイントロンおよび他のＤＮＡ配列を包含し得る。ポリペプチドをコードする核酸配列は、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指向する、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列であっても、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列であってもよい。これらの核酸配列としては、全長核酸配列、および全長タンパク質に由来する非全長配列の両方が挙げられる。この配列は、特定の宿主細胞においてコドン優先を提供するために導入され得るネイティブの配列（単数または複数）の縮重コドンを包含することがさらに理解される。
【００２６】
１態様では、本発明は、上皮と送達増強因子（例えば、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログ）とを接触させることによって、上皮に対するタンパク質（例えば、インターフェロン）の送達を増強する組成物および方法を提供する。このタンパク質は、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子）、転移抑制因子または腫瘍抑制タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、このタンパク質は、任意の１つ以上のマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ｐ５３、および血管新生阻害因子（血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）の血管形成作用に対向するタンパク質因子、転移抑制因子、例えば、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ）およびＢＣＧ活性を増大する因子である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質療法のタンパク質は、抗体であり、この抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体またはＦａｂフラグメントであってもよい。この抗体は、キメラまたはヒト化抗体であってもよい。これらの抗体としては、限定はしないが、サイトカインに対する抗体ならびにＩ型およびＩＩ型インターフェロン（例えば、抗インターフェロンα、抗インターフェロンβ、抗インターフェロンδ、抗インターフェロンγ）、ならびにインターロイキン（例えば、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−４、抗Ｉｌ−６、抗ＩＬ−７および抗ＩＬ−１０）に対する抗体が挙げられる。本発明の状況では、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）および組換え産生された結合パートナーを含むことが理解される。抗体は、Ｋａが１０−７Ｍ以上である場合に、この標的に対して反応性であることが理解される。
【００２８】
ポリクローナル抗体は、種々の温血動物から当業者によって容易に生成され得る。モノクローナル抗体はまた、従来の技術を用いて容易に生成され得る（例えば、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号；同第４，５４３，４３９号；および同第４，４１１，９９３号を参照のこと；またＫｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，（１９８０）；ならびにＨａｒｌｏｗ ａｎｄ ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８））を参照のこと。好ましい抗体の調製はさらに、以下の実施例の節に記載される。
【００２９】
本明細書において用いられるインターフェロンという用語は、インターフェロンポリペプチドの全てのクラスおよびサブクラス、ならびにその欠失、挿入または保存的アミノ酸置換を含む置換変異体、その生物学的に活性なポリペプチドフラグメント、ならびにその対立形質を含むこととする。種々の適切なインターフェロンポリペプチドは、当業者に公知である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチドは、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンおよびωインターフェロン（例えば、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンおよびωインターフェロン）と通常命名されるインターフェロンおよびそれらの組み合わせを含む、Ｉ型またはＩＩ型のインターフェロンであり、αインターフェロンのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態では、αインターフェロンは、α１またはα２−インターフェロンである。いくつかの実施形態では、この遺伝子はインターフェロンα−２ｂをコードする。
【００３０】
いくつかの実施形態では、インターフェロンタンパク質（タンパク質として投与される場合、または遺伝子送達系によってコードされる）は、野生型インターフェロンポリペプチドである。他の実施形態では、インターフェロンは、野生型インターフェロンポリペプチドまたはその融合タンパク質に対して実質的に同一である。２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の状況では、「同一な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」パーセントという用語は、最大対応について比較および整列された場合、同じであるか、または同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列（単数または複数）をいう。２つの核酸またはポリペプチドの状況では、「実質的に同一な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」という用語は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて測定される場合、最大対応について比較および整列されるときに、少なくとも７０％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列（単数または複数）をいう。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般的に利用可能である。配列同一性のパーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の間のマッチが偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、この参照配列に類似であるとみなされる。
【００３１】
他の実施形態では、インターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる場合）は実質的に、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ネイティブまたは野生型ポリペプチドの配列に対して同一である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチド（投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸または全長のストレッチにわたって、野生型インターフェロンポリペプチドの配列に対して９９％、９８％、９５％または９０％同一である。いくつかの実施形態では、インターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ヒト野生型αインターフェロンポリペプチドの配列に対して実質的に同一である。いくつかの実施形態では、遺伝子送達系によってコードされるインターフェロンポリペプチド（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ネイティブポリペプチドの５０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸または全長のストレッチにわたって、ヒト野生型ポリペプチドの配列に対して９９％、９８％、９５％または９０％同一である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、インターフェロン（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、ハイブリッドインターフェロンである。種々のインターフェロンサブタイプ配列の組み合わせを含むハイブリッドαインターフェロン遺伝子の構築物（例えば、αおよびΔ、αおよびβ、ならびにαおよびＦ）は、米国特許第４，４１４，１５０号、同第４，４５６，７４８号および同第４，６７８，７５１号に開示される。米国特許第４，６９５，６２３号、同第４，８９７，４７１号および同第５，８３１，０６２号は、天然に存在するαインターフェロンサブタイプポリペプチドの間で各々の位置で見られる共通のまたは優勢なアミノ酸を含むアミノ酸配列を有し、そしてコンセンサスヒト白血球インターフェロンと呼ばれる、新規なヒト白血球インターフェロンポリペプチドを開示する。本発明の１つの実施形態では、ハイブリッドインターフェロンはインターフェロンα２ α１である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、インターフェロン（タンパク質として投与されるか、または遺伝子送達系によってコードされる）は、インターフェロンαである。組換えインターフェロンαは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローニングされて発現されている（例えば、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１３４３−１３４９（１９８０）；Ｓｒｅｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１３４３−１３４７（１９８０）；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：２０−２６（１９８１）；Ｈｅｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８５：２２７−２６０（１９８５））。このような実施形態のいくつかでは、インターフェロンはヒトインターフェロンαである。いくつかの実施形態では、インターフェロンαは、インターフェロンα２ａまたは２ｂである（例えば、ＷＯ９１／１８９２７を参照のこと）。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗癌性、抗感染性または免疫系調節生物活性を有するインターフェロンである。いくつかの実施形態では、投与されたインターフェロンタンパク質は、半合成のタンパク質ポリマー結合体（例えば、ＰＥＧ化されたインターフェロン）である。いくつかの例示的な実施形態では、インターフェロンはＩ型インターフェロンα（ＩＦＮ−α）であり、抗感染性および抗腫瘍活性を有するか、またはＰＥＧ化ＩＦＮα２ｂである。１２，０００Ｄａのモノメトキシポキエチレングリコール（ＰＥＧ−１２０００）ポリマーが結合され得る。ＰＥＧ結合体化は、血清半減期を拡大増大させて、それによって患者に対する生物学的能力変更することなくＩＦＮ−α２ｂに対する患者の曝露を長くすると考えられる。
【００３４】
「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、アミノ酸残基からなるポリマー、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成の天然に存在しないアナログ、関連の天然に存在する構造的変異体、およびその合成の天然に存在しないアナログをいう。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチドシンセサイザーを用いて合成され得る。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は典型的には、大きいポリペプチドをいう。「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は典型的には、短いポリペプチドをいう。「同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、ポリペプチドにおける機能的または構造的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換をいう。以下の６つの群の各々は、お互いについて同類置換である、アミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）」という用語は、当該分野で周知の技術によって測定した場合、任意の抗ウイルスまたは抗増殖性または抗癌活性をいう（例えば、Ｏｐｅｎａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５（１９８３）を参照のこと）。
【００３６】
「対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍ）」とは、同じ遺伝子座を占有するポリペプチドの任意の２つ以上の多型をいう。対立形質の変異体は、変異を通じて天然に生じ、そして集団内の表現型多型性を生じ得る。遺伝子突然変異は、サイレント（コードされたポリペプチドの変化はない）であってもよく、または変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。「対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ ｆｏｒｍｓ）」はまた、遺伝的な対立遺伝子変異体のｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、インターフェロンは対立形質である。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「アルキル（ａｌｋｙｌ）」という用語は、分枝した炭化水素、未分枝の炭化水素、もしくは環状の炭化水素、またはそれらの組み合わせを意味し、これは、完全に飽和されても、単価または多価不飽和であってもよく、そして指定される多数の炭素原子を有する、二価置換および多価置換を包含してもよい（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）飽和された炭化水素置換基の例としては、限定はしないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、オクタ−デシル、２−メチルペンチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロペンチルメチルのような基が挙げられる。この置換基は、アルキル置換基、例えば、カルボキシメチル、トリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピルなどを形成するために、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、またはチオ、シアノ、アルキルチオ、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミドなどのような鎖に対して通常結合される１つ以上の官能基で作動可能に置換されてもよい。不飽和アルキル置換基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有する置換基である。不飽和アルキル基の例としては、限定はしないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにそれ以上のホモログおよび異性体が挙げられる。置換基は、飽和炭化水素について記載されたような鎖に対して一般的に結合される、１つ以上の官能基で置換されてもよい。
【００３８】
「アリール（ａｒｙｌ）」という用語は、多価不飽和、典型的には芳香族の炭化水素置換基を意味し、この基は、一緒に縮合されるかまたは共有結合される単環または多環（３環まで）であってもよい。
【００３９】
「ヘテロアリール（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）」という用語は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される０〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）をいい、ここで窒素原子およびイオウ原子は任意選択的に酸化され、窒素原子（単数または複数）は任意選択的に四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通じて分子の残りに対して結合され得る。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系は、ヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプト、チオ、シアノ、アルキルチオ、カルボキシル、ニトロ、アミノ、アルコキシルまたはアミドのような環系に通常結合される、１つ以上の官能基でさらに置換されてもよい。
【００４０】
用語「アシル（ａｃｙｌ）」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ−置換基を指し、ここでＲは、上記のようなアルキルまたはアリール、例えば、限定はしないが、ベンゾイル、スクシニル、アセチル、プロピオニルまたはブチリルである。
【００４１】
「ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ）」という用語は、置換基−ＯＨ−を意味する。
【００４２】
「アルコキシ（ａｌｋｏｘｙ）」という用語は、置換基−ＯＲ−を意味し、ここでＲはアルキルである。
【００４３】
「アミノ（ａｍｉｎｏ）」という用語は、アミノ連結（−ＮＲＲ’）を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して水素置換基、アルキル置換基、またはアリール置換基である。
【００４４】
「カルボキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）」という用語は、置換基−ＯＣ（Ｏ）Ｒ−を意味し、ここでＲは任意選択的に置換されたアルキルまたはアリールである。
【００４５】
「アシルオキシ（ａｃｙｌｏｘｙ）」という用語は、置換基−（ＣＲＲ’）ｍＣ（Ｏ）ＯＲ’’−を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立してアルキル置換基、アリール置換基または水素置換基からなる群より選択され、そしてＲ’’は、水素またはアルキル置換基であり、そしてｍは１〜８の間の包括的な整数である。
【００４６】
「ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）」または「ハロ（ｈａｌｏ）」という用語は、置換基Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味する。
【００４７】
「糖残基（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅ）」という用語は、ホモオリゴ糖置換基（１タイプの単糖類を含むオリゴ糖類）または異種オリゴ糖類置換基（１つより多くのタイプの単糖類を含むオリゴ糖類）として連結された２つ以上の単糖置換基を含み得る単糖置換基を指す。好ましい実施形態では、同種および異種のオリゴ糖置換基は、２〜１０個の単糖単位から構成される。単糖類は、五炭糖または六炭糖の残基を含み得、そして残基は、環化型または非環化（開放鎖）型として存在し得る。単糖類が開放鎖型である場合、カルボニル炭素の酸素原子は、−ＲＲ’−で置換されてもよく、ここでＲおよびＲ’は独立してアルキル置換基、ハロゲン置換基、ヒドロキシル置換基、水素置換基、アミノ置換基またはアルコキシ置換基の群から選択される。好ましいオリゴ糖類としては、五炭糖−五炭糖の二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖五炭糖の二糖類基が挙げられる。単糖類は、リボース、アラビノース、キシロースおよびリキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グルコース、イドース、ガラクトースまたはタロースの群から選択されてもよく、それによって単糖類上の１つ以上のヒドロキシル基は、水素、アルキル置換基、アルコキシ置換基、アミノ置換基またはアシル置換基で置換されてもよい。
【００４８】
膀胱上皮または「尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）」は、膀胱内面の内側を覆い、従ってその内容物に近位である。尿路上皮はまた、腎盂、尿管および膀胱の内面の内側を覆い、そして尿の保持を可能にする緻密な障壁を形成し、一方でイオン、溶質および毒性代謝物の上皮障壁を横切る調節不可能な移動を妨げる。この透過性障壁は、器官自体を満たして空にする時の圧力において周期的変化を受けている場合でさえ正常に維持されなければならない。ほとんどの膀胱癌がこの上皮の細胞に由来する。尿道、尿管および腎盂はまた、この移行上皮によって内側を覆われるので、膀胱にみられる同じタイプの癌はまた、これらの部位でも生じ得る。いくつかの実施形態では、この方法および組成物は、尿道、尿管および腎盂におけるこれらの部位でこのような癌を治療するために用いられ得る。
【００４９】
この遺伝子送達系は一般に、真核生物細胞におけるインターフェロン遺伝子の発現を指向し得る真核生物発現ベクターの形態で提供される。真核生物発現ベクターの例としては、ウイルスおよび非ウイルスベクターが挙げられる。「真核生物発現ベクター（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、インターフェロン発現カセットを含む従来の組換えＤＮＡ技術によって調製されるウイルスおよび非ウイルスベクターをいう。本明細書において用いる場合、「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」という用語を用いて、形質導入された哺乳動物細胞におけるインターフェロン配列の転写および翻訳を生じるために、インターフェロンコード配列に作動可能に連結される発現調節エレメントを含む、インターフェロンコード配列の転写および翻訳を指向し得るヌクレオチド配列を規定する。形質導入された細胞においてヌクレオチド配列の発現を達成するために有効な種々のウイルスおよび非ウイルス送達ベクターは当該分野で公知である。例えば、Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １（Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｔ．編）１９９８Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ １−１７２頁を参照のこと。
【００５０】
標的細胞に対してインターフェロン遺伝子を誘導するために用いられる非ウイルス送達系の例としては、インターフェロンの発現を指向し得る発現プラスミドが挙げられる。発現プラスミドは、標的細胞においてＤＮＡ配列の発現を達成し得る非選択的条件下で細胞生存について正常なゲノムとは異なりかつ必須のものではない、自己複製を行う染色体外の細胞性ＤＮＡ分子である。発現プラスミドはまた、プロモーター、エンハンサーまたは治療遺伝子の発現および／または分泌を補助する他の配列を含んでもよく、また発現ベクター中に含まれてもよい。さらなる遺伝子、例えば、薬物耐性をコードする遺伝子が、組換えベクターの存在についての選択またはスクリーニングを可能にするために含まれてもよい。このようなさらなる遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性、多剤耐性、チミジンキナーゼ、βガラクトシダーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。
【００５１】
インターフェロン遺伝子を含む発現プラスミドは、リポソーム中に包含されてもよい。リポソームは、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散剤、層状相などを含む。リポソームキャリアを用いる細胞への核酸の送達は当該分野で周知である。例えばＳｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０），Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，１９８３年７月１９日発行、米国特許第４，３９４，４４８号、ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号および同第５，０１９，３６９号に記載されるような種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能である。本発明の実施において有用なリポソームは、天然および負に荷電されたリン脂質およびコレステロールのようなステロールを一般に含む１つ以上の標準的な小胞形成脂質から形成され得る。このような脂質形成小胞の例としては、米国特許第５，６５０，０９６号に開示されるようなＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＯＧＳ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＰＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＲＩＥ、ＤＭＲＩＥ−ＨＰ、ｎ−スペルミジンコレステロールカルバメートおよび他の陽イオン性脂質が挙げられる。脂質の選択は一般に、例えば、血流中のリポソームのサイズ、酸不安定性およびリポソームの安定性を検討することによって導かれる。１９９１年５月７日発行の米国特許第５，０１３，５５６号および１９９３年５月２５日発行の同第５，２１３，８０４号に記載されるような、ポリエチレングリコールコーティング（いわゆる「ＰＥＧ化（ＰＥＧ−ｙｌａｔｉｏｎ）」）などの血清半減期を拡大するためのさらなる成分もリポソーム処方物に加えられてもよい。
【００５２】
特定の細胞に対する非ウイルスインターフェロン遺伝子送達系の直接送達を行うため、細胞標的化を容易にする非ウイルス送達系へエレメントを組み込むことが有利であり得る。例えば、脂質カプセル化発現プラスミドは、標的化を容易にするために改変された細胞表面レセプターリガンドを組み込んでもよい。単純なリポソーム処方物が投与され得るが、本発明の本発明の所望の組成物を充填されるかまたはそれを修飾されたリポソームは、全身的に送達され得るか、または目的の組織に指向されてもよく、ここで次にこのリポソームは選択された治療／免疫原性ペプチド組成物を送達する。このようなリガンドの例としては、抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、キメラ抗体またはそれらの機能的フラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’）が挙げられる。あるいは、本発明のＤＮＡ構築物は、１９９２年１１月２４日発行、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１６６，３２０号、および１９９７年６月３日発行、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３５，３８３号に記載のような標的化部分に対してポリリシン部分を通じて連結され得る。
【００５３】
本明細書に例示されるような本発明の１つの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ウイルス（単数または複数）およびウイルスベクター（単数または複数）という用語は、本明細書においては互換可能に用いられる。本発明の実施において有用なウイルスとしては、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ）、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科またはピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｎａｖｉｒｉｄｉａｅ）から選択された、組換え可能に改変されたエンベロープまたは非エンベロープのＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。ウイルスゲノムはインターフェロンの発現を提供する従来の組換えＤＮＡ技術によって改変されてもよく、複製欠損、条件的複製または複製コンピテントになるように操作されてもよい。親のベクターの特性の各々の有利なエレメントを開発するキメラウイルスベクター（例えば、Ｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６−８７０を参照のこと）はまた、本発明の実施において有用であり得る。ウイルス骨格がウイルスベクターのパッケージングに必要な配列のみを含み、そして任意選択的にインターフェロン発現カセットを含んでもよい最小ベクター系がまた、本発明の実施において使用され得る。ある場合には、既存の免疫応答の回避のような好ましい病原性の特徴を保有する、投与されるべき種とは異なる種に由来するベクターを使用することが有利であり得る。例えば、ヒト遺伝子治療のためのウマヘルペスウイルスベクターは、１９９８年８月５日公開ＷＯ９８／２７２１６に記載されている。このベクターは、ヒトでの治療に有効であることが記載されている。なぜなら、このウマウイルスはヒトに毒性ではないからである。同様に、ヒツジアデノウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療に用いられ得る。なぜならそれらは、ヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避することが請求されているからである。このようなベクターは、１９９７年４月１０日公開ＷＯ９７／０６８２６に記載されている。
【００５４】
多くのウイルスが、広範囲の細胞型に影響する能力を示す。しかし、いくつかの適用では、細胞の特定の小集団にのみ影響することが望ましくあり得る。結果として、種々の技術によって、選択的または「標的とされた（ｔａｒｇｅｔｅｄ）」ベクターが、特定の細胞タイプの成熟ウイルス粒子の優先的な感染性を生じることを容易にするように開発した。細胞タイプ特異性または細胞タイプ標的化はまた、特徴的な広範な感染性を有するウイルス、例えばアデノウイルスに由来するベクターにおいて、ウイルスエンベロープタンパク質の改変によって達成され得る。例えば、細胞標的化は、固有の細胞表面レセプターとの特異的相互作用を有する改変ノブおよびファイバードメインの発現を達成するために、ウイルスゲノムのノブおよびファイバーコード配列の選択的改変によって、アデノウイルスベクターで達成されている。このような改変の例は、Ｗｉｃｋｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１１）：８２２１−９２２９（アデノウイルスファイバータンパク質へのＲＧＤペプチドの組み込み）；Ａｒｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２７：２３９−２４４（眼および生殖器官に対する向性を達成するためのアデノウイルスファイバー遺伝子の改変）；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｍｏｎｉｎｅ（１９９６）ＴＩＧ １２（１０）：４００−４０５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（６）：４７８２−４７９０；Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２：６６０−６６８（アデノウイルスファイバータンパク質へのガストリン放出ペプチドフラグメントの組み込み）；およびＯｈｎｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７６３−７６７（ＳｉｎｄｂｉｓウイルスへのプロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの組み込み）に記載されている。細胞特異的標的化の他の方法は、エンベロープタンパク質への抗体または抗体フラグメントの結合体化によって達成されている（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６−６８６９，Ｗａｔｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１００４−１０１２；Ｄｏｕｇｌａｓ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１５７４−１５７８を参照のこと。このような標的化改変の１つ以上を包含するウイルスベクターを任意選択的に、本発明の実施において使用して、選択的な感染および肺組織、特に肺の上皮組織中でのインターフェロンの発現を増強し得る。
【００５５】
本明細書に例示されるような本発明の１つの実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターという用語は総称的に、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されないマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスを指す。詳細には、ヒトアデノウイルスとしては、Ａ−Ｆの亜属、ならびにその個々の血清型、個々の血清型およびＡ−Ｆの亜属が挙げられ、限定はしないが、これらには、ヒトアデノウイルス型１、２、３、４、４ａ、５、６、７、８、９、１０、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９ａ、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４ａ、３５、３５ｐ、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、および９１が挙げられる。ウシアデノウイルスという用語は、限定はしないが、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型および１０型を包含する。イヌアデノウイルスという用語は、限定はしないが、イヌ１型（株ＣＬＬ、Ｇｌａｘｏ、ＲＩ２６１、Ｕｔｒｅｃｔ、Ｔｒｏｎｔｏ２６−６１）および２を包含する。ウマアデノウイルスという用語は、限定はしないが、ウマ１型および２型を包含する。ブタアデノウイルスという用語は、限定はしないがブタ３型および４型を包含する。内因性導入遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの使用は当該分野で周知である。例えば、Ｚｈａｎｇ，Ｗ−Ｗ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１３−１３８を参照のこと。１つの実施形態では、インターフェロン配列の発現のためのアデノウイルスベクターは、任意選択的に第ＩＸプロテインの機能を欠失している、標的組織において実質的に複製不能なウイルスを生じる、アデノウイルスＥ１遺伝子の排除によって作製された血清型２または５の複製欠損ヒトアデノウイルスである。好ましい組換えウイルスベクターは、第ＩＸプロテイン遺伝子が欠失しているアデノウイルスベクター送達系である。本発明と同じ譲受人に譲渡され、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される、米国特許第６，２１０，９３９号に開示されるこのようなシステムを参照のこと。
【００５６】
好ましいベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスのゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実施では、このベクターは、ヒトアデノウイルスゲノム由来である。好ましいベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２または５に由来する。このようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂコード領域における改変または欠失によって（「複製欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）」とみなされるポイントまで）減弱され得る。特定の発現特徴を達成するか、または反復投与を可能にするか、または免疫応答を低下させるためのウイルスゲノムへの他の改変が好ましい。
【００５７】
あるいは、ウイルスベクターは、条件的に複製されても、または複製コンピテントであってもよい。条件的に複製するウイルスベクターを用いて、望ましくない広範なスペクトルの感染を回避しながら、特定の細胞タイプにおいて選択的な発現を達成する。ウイルスゲノムは、特定の条件下でのみ複製または発現を達成する誘導性プロモーターを含むように改変されてもよい。誘導性プロモーターの例は、当該分野で公知である（例えば、ＹｏｓｈｉｄａおよびＨａｍａｄａ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３０：４２６−４３０；Ｉｉｄａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９）：６０５４−６０５９；Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１（９）：７１２８−７１３１；Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：５０９７−５１０５；およびＤｒｅｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４６）；２９３６４−２９３７１を参照のこと。ウイルスはまた、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ００／２２１３７、２０００年４月２０日に公開された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５２、およびＨｏｗｅ，Ｊ．ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ＷＯ００２２１３６、２０００年４月２０日公開、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５１記載されるウイルスのような選択的に複製するウイルスとなるように設計されてもよい。このウイルスはまた、特定の細胞タイプにおける複製について減弱されるように改変されてもよい。例えば、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子に特異的な欠失があるアデノウイルスｄｌ１５２０（ＢａｒｋｅｒおよびＢｅｒｋ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５６：１０７）は、ヒトでの治療効果を伴って用いられている。このようなベクターはまた、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９９７年１０月１４日発行、米国特許第５，６７７，１７８号）および１９９８年１２月８日発行ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの米国特許第５，８４６，９４５号に記載されている。
【００５８】
本発明のベクターは、ＩＲＥＳエレメントの使用を通じてタンデムで、または独立調節性プロモーターを通じて、インターフェロン遺伝子に対するさらなる導入遺伝子をコードするように改変され得る。
【００５９】
本発明は、標的組織または器官の上皮に対するタンパク質または核酸の送達を、このタンパク質（例えば、インターフェロン）または核酸とともに処方された場合に増強する送達増強化合物を提供する。「送達増強化合物（ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「送達増強因子（ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」としては、膀胱内投与の際、上皮または尿路上皮に対してタンパク質または核酸の送達を強化する任意の化合物が挙げられる。タンパク質に関して、増強された送達は、標的組織または器官の上皮の細胞に接触するタンパク質の量の増大か、または上皮（例えば、尿路上皮）の細胞に入るタンパク質の量の増大のいずれかまたは両方によって確認され得る。特定の化合物がタンパク質の送達の増強に有効であるか否かの決定は、当業者によって容易に確認され得る。尿路上皮によるタンパク質の保持は、任意の手段、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光標識の検出、遺伝子発現を含む細胞活性の調節によって測定され得る。
【００６０】
遺伝子送達系に関して、本発明は、標的細胞、組織または器官に対するインターフェロン遺伝子の送達を増強する送達増強化合物を提供する。増強された送達は、各々の細胞に入るインターフェロン遺伝子もしくは遺伝子送達系のコピー数の増大によって、または例えば、インターフェロンもしくはインターフェロン遺伝子送達系を取り込む、組織もしくは器官中の細胞の割合の増大によって、そのいずれかまたはその両方で確認され得る。送達増強化合物と組み合わせた、組織または器官へのインターフェロン遺伝子送達系の投与によって、細胞内に送達され発現されるインターフェロン遺伝子の量における増大が、送達増強化合物の非存在下で投与された場合にこの細胞に送達されて発現される遺伝子の量に対応して生じる。特定の化合物が核酸送達系の送達を増強するのに有効であるか否かを決定することは当業者に公知の方法による。翻訳およびタンパク質発現を評価するために、βガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を、核酸送達系に組み込んで、増強された遺伝子発現のレベルを評価するために容易にアッセイ可能なシグナルを生成することができる。転写および複製を評価するために、ＤＮＡのコピーの存在をＰＣＲ分析によって評価してもよい。
【００６１】
特定の送達増強化合物は、不斉の炭素原子（光学的中心）または二重結合を保有し得る；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体は全て、本発明の範囲内に包含されるものとする。例えば、対のエナンチオマーの単独のジアステレオマーは、適切な溶媒、例えば、メタノールもしくは酢酸エチルまたはそれらの混合物からの分別晶出によって得ることができる。このようにして得られたエナンチオマーの対は、従来の手段によって、例えば、分割剤のような光学活性な酸の使用によって、個々の立体異性体に分離され得る。あるいは、本発明の化合物の任意のエナンチオマーは、光学的に純粋な出発物質または立体配置が公知の試薬を用いて立体特異的合成によって得ることができる。
【００６２】
送達増強化合物は、互変異性体とも呼ばれる水素結合の種々のポイントが存在し得る。このような例は、ケトンおよびケト−エノール互変異性体として公知のそのエノール型であってもよい。個々の互変異性体およびその混合物は、本発明の処方物によって包含される。
【００６３】
送達増強化合物は、その原子の１つ以上で原子同位体の天然ではない比を有してもよい。例えば、化合物は、トリチウムまたは炭素−１４のような同位体で放射性標識されてもよい。本発明の化合物の全ての同位体バリエーションは、放射性であるか否かにかかわらず、本発明の範囲内である。「基（ｇｒｏｕｐ）」または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」が化合物の別の部分に結合される化合物処方において記載される場合、この「基」または「部分」に相当するラジカルであって、Ｈ原子が除去されて形成されているラジカルが意味されることが理解されるべきである。この送達増強化合物は、薬学的に受容可能な酸付加塩、例えば、無機および有機の酸の使用に由来する塩の形態で単離されてもよい。このような酸としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸などを挙げることができる。さらに、酸の機能を有する特定の化合物は、対イオンがナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなどから、そして有機塩基から選択され得るその無機塩の形態であってもよい。「薬学的に受容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ）」という用語は、無機の塩基または酸および有機の塩基または酸を含む薬学的に受容可能な無毒性の塩基または酸から調製される塩をいう。
【００６４】
例示的な送達増強化合物は、各々が本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として援用されている、米国特許第６，１６５，７７９号、および１９９７年７月８日出願、米国特許出願第０８／８８９，３５５号および２０００年８月２８日出願、米国特許出願第０９／６５０，３５９号において教示されている。このような化合物としては、限定はしないが、崩壊剤、アルコール、グリコール、サーファクタント、胆汁塩、ヘパリンアンタゴニスト、シクロオキシゲナーゼインヒビター、高張性塩溶液および酢酸塩が挙げられる。アルコールとしては、例えば、脂肪族アルコール、例えばエタノール、Ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ブチルアルコール、アセチルアルコールが挙げられる。グリコールとしては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の低分子量グリコール、例えば、グリセロールおよびトリグリセロールが挙げられる。アセテート、例えば、酢酸、グルコン酸および酢酸ナトリウムは、送達増強化合物のさらなる例である。高張性塩溶液、例えば１Ｍ ＮａＣｌも、送達増強化合物の例である。サーファクタントの例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびリゾレシチン、ポリソルベート８０、ノニルフェノキシ−ポリオキシエチレン、リゾホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール４００、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレンエタノール、ポリグリコールエーテルサーファクタントおよびＤＭＳＯが挙げられる。胆汁酸塩、例えば、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、ケノデオキシコール酸塩、グリココール酸、グリコケノデオキシコール酸および硝酸銀などの他の収斂剤も、硫酸プロタミンのような四級アミンなどのヘパリンアンタゴニストが用いられ得るように、用いられてもよい。シクロオキシゲナーゼインヒビター、例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）例えば、ヨードメタシン、ナプロキセンおよびジクロフェナクもまた適切である。
【００６５】
送達増強化合物として機能し得る界面活性剤としては、例えば、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤が挙げられる。例示的な界面活性剤としては、限定はしないが、タウロコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、セチルピリジウム（ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｕｍ）、塩化ベルコニウム（ｂｅｎａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４界面活性剤、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロラムイミドプロピル）ジメチルアンモニオール］−１−プロパンスルホネート、ヒドレート、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、Ｄｅｏｘｙ Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００界面活性剤、Ｃ１２Ｅ８、オクチル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）―Ｆ６８界面活性剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０界面活性剤およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０界面活性剤（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。
【００６６】
好ましい送達増強化合物の１つの例は、例えば、コール酸塩誘導体であるＢｉｇ ＣＨＡＰである（例えば、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第６６巻７３４−７４９を参照のこと。特に好ましい送達増強化合物は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩおよびＶＩＩの化合物ならびにその薬学的に受容可能な塩である。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明は、インターフェロンおよび式Ｉ：
【００６８】
【化５】
を有する少なくとも１つの送達増強化合物を含む組成物を提供し、ここでＸ１がそしてＸ２が
【００６９】
【化６】
からなる群より選択され、そしてＸ３は、糖類基であり、ここで糖類基は、五炭糖単糖類基、六炭糖単糖類基、五炭糖−五炭糖二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖−五炭糖の二糖類基からなる群より選択され得る。他の糖類基としては、ホモオリゴ糖類またはヘテロオリゴ糖類のいずれかに連結された１つより多くの単糖類を挙げることができる。好ましい単糖類としては、五炭糖および／または六炭糖の残基が挙げられる。例えば、糖類基は、五炭糖の単糖類基、六炭糖の単糖類基、五炭糖−五炭糖二糖類基、六炭糖−六炭糖の二糖類基、五炭糖−六炭糖の二糖類基、および六炭糖−五炭糖の二糖類基からなる群より選択され得る。Ｘ３の好ましい糖類基の１つの例はラクトースである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、式Ｉの送達増強化合物は、３つ以上の糖類基から構成されるＸ３糖類基を有する。好ましくは、糖類基は１〜８個の単糖類、より好ましくは１〜４個の単糖類、そして最も好ましくはおよそ２〜３個の単糖類を有する。三糖類の使用によって、例えば、溶解度を高める化合物を得ることができる。
【００７１】
さらなる実施形態では、Ｘ１およびＸ２は両方とも
【００７２】
【化７】
であり、そしてＸ３はグルコース基である。
【００７３】
本発明による使用のための例示的送達増強剤としては、式ＩＩ：
【００７４】
【化８】
の化合物が挙げられ、ここでＲ１およびＲ２が個々に独立して、水素およびヒドロキシル基からなる群より選択されるメンバーであり；ｍおよびｎが個々に独立して、約０〜２から選択され；Ｒ３が、−ＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され、ここでＲ４およびＲ５は個々に独立して、水素、糖残基、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８が独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸが薬学的に受容可能な対イオンからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである。いくつかの実施形態では、対イオンは水素または任意選択的に置換されたカルボキシレートである。
【００７５】
１つの実施形態では、式ＩＩの例示的化合物は、両方がヒドロキシル基であるＲ１およびＲ２を有する。別の実施形態では、式ＩＩの化合物は、ｍおよびｎが各々１である化合物である。別の実施形態では、式ＩＩの化合物は、Ｒ４が水素である化合物である；そしてＲ５は、水素、糖残基、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシからなる群より選択されるメンバーである。
【００７６】
１つの実施形態では、送達増強化合物は式ＶＩ：
【００７７】
【化９】
を有する。
【００７８】
別の実施形態では、送達増強化合物は、式ＶＩＩ（ＳＹＮ３）：
【００７９】
【化１０】
を有する。
【００８０】
別の実施形態では、Ｒ４またはＲ５の少なくとも１つがスクシニルまたはアセチルである。別の実施形態では、Ｒ３がトリメチルアンモニウム塩である。
【００８１】
別の実施形態では、Ｒ４およびＲ５は個々に独立して、水素、任意選択的に置換されたアルキル、任意選択的に置換されたアシル、および任意選択的に置換されたアシルオキシ、および四級アンモニウム塩−ＮＲ６Ｒ７Ｒ８Ｘからなる群より選択されるメンバーであり、ここでＲ６、Ｒ７およびＲ８が独立して、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群より選択されるメンバーであり、そしてＸが薬学的に受容可能な対イオンからなる群より選択される負に荷電されたイオン結合された対イオンである。
【００８２】
この方法および組成物における使用のための好ましい送達増強化合物の１つの例は、式ＶＩＩを有するＳＹＮ３である。ＳＹＮ３およびそのホモログを作製する方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として援用される、米国特許第６，３９２，０６９号に教示される。
【００８３】
いくつかの出願については、他の化合物に比較して水溶性の増大および／または送達増強活性を示す、本発明の方法および組成物における送達増強化合物を用いることが望ましい。例示的な送達増強化合物は、Ｒが陽イオン性基である式Ｉの化合物である。適切な陽イオン性基としては、例えば、テトラメチルおよびアンモニウム部分、ならびにその塩が挙げられる。
【００８４】
別の態様では、本発明は、タンパク質および送達増強因子を含む、膀胱へのタンパク質の膀胱内投与のための薬学的組成物を提供する。ある実施形態では、送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む。ある実施形態では、送達増強因子は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログである。ある実施形態では、送達増強因子はＳＹＮ３であり、タンパク質はインターフェロンである。ある実施形態では、この組成物は、インターフェロンおよびＳＹＮ３（例えば、インターフェロン、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３，ＳＹＮ３溶解因子（例えば、Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたはヒドロキシルプロピルβシロデキストリン（ＨＰβＣＧ）またはＴＲＩＴＯＮＴＭ−Ｘ−１００界面活性剤／オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むサーファクタント）緩衝液および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。ある実施形態では、インターフェロンは、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロンまたはω−インターフェロンまたはそれらの融合物である。１つの実施形態では、処方物中のＳＹＮ３の量は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。この組成物は使用前に適切な医薬用キャリアで希釈するように凍結乾燥されてもよい。
【００８５】
ある実施形態では、本発明はまた、このタンパク質および送達増強化合物を含む薬学的組成物を提供する。処方物中のこの送達増強化合物の濃度は、多数の要因、例えば、用いられている特定のタンパク質および送達増強化合物、緩衝液、ｐＨならびに投与プロトコールに依存する。送達増強化合物の濃度は、タンパク質およびその溶解度に実質的に依存し得る。高濃度で有用な因子については、この濃度はしばしば、１％〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０％〜４０％（ｖ／ｖ）、そして最も好ましくは１５％〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲である。低濃度で有効な送達増強因子については、本発明の特定の送達増強化合物は好ましくは、約０．００２〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられ得る。ＳＹＮ３またはそのホモログもしくはアナログを含む本発明の送達増強化合物は好ましくは、０．００２〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられる。
【００８６】
別の態様では、本発明は、インターフェロン遺伝子をコードする組換えアデノウイルスおよび送達増強因子の投与のための薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、送達増強剤は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子送達系は、インターフェロン遺伝子をコードする約１０９〜１０１２粒子（ＰＮ）／ｍｌの組換えアデノウイルス、約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３、ＳＹＮ３溶解性因子（例えば、Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたはヒドロキシルプロピルβシロデキストリン（ＨＰβＣＧ）またはＴＲＩＴＯＮＴＭ−Ｘ−１００界面活性剤／オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを含むサーファクタント）、緩衝液および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、このインターフェロン遺伝子は、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロンもしくはωインターフェロンの遺伝子またはその融合物またはインターフェロン抗癌、抗感染性もしくは免疫系調節生物活性を有するポリペプチドをコードするその一部である。１つの実施形態では、処方物中のＳＹＮ３の量は、１〜１０ｍｇ／ｍｌである。この組成物は、使用前に適切な医薬用キャリアでの希釈のために凍結乾燥されてもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明はまた、インターフェロン遺伝子送達系および送達増強化合物を含む処方物を提供する。処方物中の送達増強化合物の濃度は、多数の要因、例えば、用いられている特定の遺伝子送達系および送達増強化合物、緩衝液、ｐＨ、標的組織または器官および投与形態に依存する。送達増強化合物の濃度は実質的に、用いられる因子に依存する。高濃度で有用な因子については、この濃度はしばしば、１％〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは１０％〜４０％（ｖ／ｖ）、そして最も好ましくは１５％〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲である。低濃度で有効な送達増強因子については、本発明の特定の送達増強化合物は好ましくは、０．００２〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられ得る。ＳＹＮ３またはそのホモログもしくはアナログを含む本発明の送達増強化合物は好ましくは、約０．００２〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で、本発明の処方物中で用いられる。
【００８８】
本発明の方法および組成物における使用のための送達増強化合物は典型的には、化合物が溶解性である溶媒に処方されるが、化合物が部分的にのみ可溶性である処方物も適切である。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）は、これらの化合物の適切な可溶化剤の１つの例であり、そして他のものは当業者に公知である。当業者は、特定のさらなる賦形剤および添加物が、種々の薬学的処方物についてこれらの因子の溶解度特徴を達成することが所望され得るということを理解する。例えば、周知の可溶化因子、例えば、界面活性剤、脂肪酸エステルおよびサーファクタントは、使用される種々の溶媒におけるこの化合物の溶解度を促進するために適切な濃度で添加され得る。この処方物が界面活性剤を含む場合、患者に投与される最終処方物中の界面活性剤濃度は好ましくは、約０．５〜２×臨界ミセル化濃度（ＣＭＣ）である。適切な界面活性剤としては、上記に列挙されるものが挙げられる。それらの使用のために適切な界面活性剤および適切な濃度の同定は、本明細書に記載のように決定され得る。ＳＹＮ３のような化合物および関連の化合物の可溶化因子の１つの例は、約０．０５％〜約０．３％の濃度、より好ましくは約０．１０％〜約０．１５％の濃度のＴｗｅｅｎ ８０である。Ｂｉｇ ＣＨＡＰも、ＳＹＮ３および関連の化合物についての可溶化因子である。
【００８９】
医薬的用途のために用いる場合、本発明の処方物は、送達増強化合物を含む緩衝液を含む。緩衝液は、任意の薬学的に受容可能な緩衝液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水および当業者に公知の他の緩衝液、例えば、Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９６６）５：４６７によって記載される緩衝液であってもよい。例えば、調節性の治療タンパク質を含む薬学的組成物中の緩衝液のｐＨは典型的には、６．４〜８．４、好ましくは７〜７．５、そして最も好ましくは７．２〜７．４の範囲である。
【００９０】
本発明の組成物はさらに、タンパク質安定化剤または可溶化剤、増強剤または他の薬学的に受容可能なキャリアもしくはビヒクルを含んでもよい。生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤を挙げることができる。他の生理学的に受容可能な化合物としては、微生物の増殖または作用を防止するために特に有効である湿潤剤、乳化剤、分散剤または防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、それらには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、治療タンパク質の投与の経路および特定の物理化学的特徴に依存することを承知している。キャリア、安定化剤またはアジュバントの例は、参考として本明細書に援用されるＭａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，第１５版（Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９７５）、およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９５）に見出すことができる。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、薬学的に受容可能な水性キャリア、少なくとも１つの薬学的に受容可能な安定化剤と少なくとも１つの薬学的に受容可能な充填剤と組み合わせて、インターフェロンおよびＳＹＮ３を含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアおよびタンパク質と組み合わせてＳＹＮ３を含み得る。２００２年１２月２０日出願で、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される米国特許出願第１０／３２９，０４３号［タイトル「ＳＹＮ３ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」、代理人整理番号０１６９３０−０００８４１ＵＳ］を参照のこと。
【００９２】
組換えアデノウイルスの投与のための例示的な処方物は約１０９−１０１１ＰＮ／ｍｌウイルス、約０．１〜１ｍｇ／ｍｌ ＳＹＮ３、さらに適切なＳＹＮ３可溶化剤（例えば、約２〜１０ｍＭ Ｂｉｇ ＣＨＡＰまたは約０．１〜１．０ｍＭ ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ−１００）界面活性剤を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に含み、加えて約２〜３％スクロース（ｗ／ｖ）および約１〜３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含み、約ｐＨ６．４〜８．４である。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、インターフェロン遺伝子送達系およびＳＹＮ３を、薬学的に受容可能な水性キャリア、少なくとも１つの薬学的に受容可能な安定化剤と少なくとも１つの薬学的に受容可能な充填剤と組み合わせて含む薬学的組成物である。このような薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリア、およびインターフェロンＤＮＡが外来性であるベクターにインターフェロンＤＮＡ配列が挿入されている発現ベクターまたは遺伝子送達系と組み合わせて、ＳＹＮ３を含んでもよい。インターフェロンの核酸配列は、ある実施形態では、外来性であってもよく、そうでない場合被験体における意図する組織もしくは器官において有意に発現されなくてもよい。２００２年１２月２０日出願で、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される、米国特許出願第１０／３２９，０４３号［タイトル「ＳＹＮ３ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ
ＭＥＴＨＯＤＳ」、代理人整理番号０１６９３０−０００８４１ＵＳ］を参照のこと。
【００９４】
本発明の処方物に用いられ得る溶媒としては、好ましくは米国薬局方（ＵＳＰ）標準に従って調製されるような、例えば、注射用水のような水性溶媒ならびに／またはＤＭＳＯおよびＤＭＡとしても公知のＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドのような非水性の溶媒、ならびに共溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）混合物、例えば、グリセロールおよび水が挙げられる。
【００９５】
この処方物は好ましくは、とりわけ、例えば、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０を含む非イオン性サーファクタントの１クラスである、ポリソルベートすなわちポリオキシエチレンソルビタンエステル、とりわけ、例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ６８およびＬ９２を含む、非イオン性サーファクタントの１クラスである、プルロニックすなわちポリエチレンポリプロピレングリコールブロックコポリマー、ならびに例えば、ＨＰβＣＤおよびＢｉｇ ＣＨＡＰを含む、非イオン性複合剤の１クラスである、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、ポリ置換ヒドロキシアルキルβシクロデキストリンを含む。ＨＰβＣＤ、Ｂｉｇ ＣＨＡＰ、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＬ６４およびプルロニックＬ９２が可溶化剤として好ましい。可溶化剤は、例えば、個々にまたは込み合わせて用いられ得る。可溶化剤の濃度は以下に示される。ＨＰβＣＤは、約５０〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、約２０〜約３６０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、ポリソルベート８０は、約１〜３６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、プルロニックは、約１〜約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得、そしてその他の成分は、以下に示す濃度で存在してもよい。
【００９６】
ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物は好ましくは、クエン酸緩衝化系を含む。より好ましくは、このクエン酸緩衝化系は、少なくとも１つのクエン酸緩衝液、例えば、米国薬局方のクエン酸一水和物または米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物を含んでもよい。より好ましくは、クエン酸緩衝系は、米国薬局方のクエン酸一水和物と米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物の組み合わせを含む。組み合わせて用いられる場合、米国薬局方のクエン酸一水和物の量は、約０．００５〜約２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１６〜約１．３５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１６〜約０．７２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００５〜約１．３５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る、そして米国薬局方のクエン酸ナトリウム二水和物は、約０．０２〜約５．３７ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜３．００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５〜２．３１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。適切である他の適切な緩衝化系は、例えば、クエン酸緩衝化系の代わりに、またはそれと組み合わせて、リン酸塩、グリシン、そして上記の全ての種々の組み合わせを含む。
【００９７】
緩衝化系は、溶解度が向上するような凍結乾燥処方物のｐＨを提供する。好ましくはこのｐＨは、約５〜約６の範囲である。ＳＹＮ３の混合水性処方物は好ましくは、約７〜約８．５、好ましくは約７．４のおよそのｐＨで緩衝化され、そしてＳＹＮ３は４０℃で少なくとも３ヶ月間、脱水された粉末中で安定なままである。
【００９８】
凍結乾燥処方物は好ましくは、凍結乾燥充填剤としてグリシンまたはマンニトールを含む。用いられ得る他の適切な凍結乾燥充填剤としては、例えば、ラクトース、組換えゼラチンおよびメチルセルロースが挙げられる。凍結乾燥充填剤は、この薬剤がマンニトールである場合、約５〜１００ｍｇ／ｍｌ、そしてこの薬剤がグリシンである場合、約１０〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【００９９】
凍結乾燥処方物は好ましくは、抗酸化剤としてアスコルビン酸を含む。用いられ得る他の適切な抗酸化剤としては、例えば、クエン酸が挙げられる。アスコルビン酸が抗酸化剤である場合、これは約０．００１〜約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
【０１００】
本発明の組成物は、さらに、例えば、安定化剤、増強剤または他の薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含んでもよい。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、腫瘍抑制遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター送達系を安定化させるように作用する生理学的に受容可能な化合物を含んでもよい。生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロースもしくはデキストランのような炭水化物、ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤を挙げることができる。
【０１０１】
他の生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、保湿剤、乳化剤、分散剤または微生物の増殖もしくは作用を妨げるために特に有効な防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、これには、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、治療タンパク質の投与経路および特定の物理化学的特長に依存することを承知している。キャリア、安定化剤またはアジュバントの例は、参考として本明細書に援用されるＧｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９５）に見出すことができる。
【０１０２】
本発明の被験体は、哺乳動物であって、これには、限定はしないが、マウス、ラット、霊長類および特にヒトが挙げられる。
【０１０３】
核酸およびタンパク質の両方の送達のための例示的な送達増強化合物としては、式ＩＩの化合物を含む本発明による使用のためのＳＹＮ３のホモログが挙げられる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、送達増強化合物を含む緩衝液中に、「治療上有効な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」量の治療因子（例えば、タンパク質またはそのタンパク質の遺伝子送達系）を含む。本明細書において用いる場合、「治療上有効な」とは、癌もしくはウイルス感染のような疾患状態またはその症状の予防、軽減または治癒をいう。
【０１０５】
送達増強化合物は、単独で、またはインターフェロンもしくはインターフェロン遺伝子送達系と組み合わせて、またはさらなる因子とさらに組み合わせて適用され得る。例えば、この処方物は、癌、細胞増殖性障害および慢性の感染を含む疾患および状態を治療するのに有効である。「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は一般に、組織または器官内の細胞の制御されない増殖に関する。これは、１つ以上の細胞が癌性、悪性、腫瘍性、前癌性、トランスフォームした、または腺腫もしくは癌腫に分類される状態、あるいはこれらの状態について当該分野で一般に用いられる任意の他の同義語を包含するものとする。
【０１０６】
送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、組換えウイルス送達系にインターフェロン遺伝子を含む薬学的組成物の治療上有効な量が、本発明の教示に従って投与され得る。例えば、送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、組換えアデノウイルスベクター送達系のインターフェロン遺伝子の治療上有効な量は、約１０８粒子／ｍｌ〜１０１２粒子／ｍｌ、より典型的には約１０８粒子／ｍｌ〜５×１０１１粒子／ｍｌ、最も典型的には約１０９粒子／ｍｌ〜×１０１１粒子／ｍｌ（ＰＮ／ｍｌ）または１０１０粒子／ｍｌ〜１０１１粒子／ｍｌ（ＰＮ／ｍｌ）の範囲である。前述の投薬量は一般に、被験体が耐えられる範囲で高頻度に投与される。腫瘍学の分野では一般に、最大耐容用量で、またはほぼその付近の投薬量を投与することになる。
【０１０７】
送達増強因子を含む緩衝液中に処方された、タンパク質（例えば、インターフェロン）を含む薬学的組成物の治療上有効な量が、本発明の教示に従って投与され得る。例えば、インターフェロンまたはインターフェロン遺伝子送達系の治療上有効な量は、同様に、当業者によって容易に決定され得る。この用量は一般に、被験体が耐えられる範囲で高頻度に投与される。上記のとおり、腫瘍学の分野では一般に、最大耐容用量で、またはほぼその付近で投薬量を与えることが行われる。
【０１０８】
膀胱癌の治療のための本発明の１つの実施形態では、インターフェロンは、各々のサイクルが各々のサイクルの１日目にまたは任意選択的に１日目および２日目に１回の膀胱内投与を提供する、３週サイクルの投与からなる複数回の投与レジメンの一部として送達増強因子と組み合わせて提供される。膀胱癌の治療の典型的な形態では、実施者は被験体が排泄できるように尿道にカテーテルを挿入する。処方された送達増強因子および治療用インターフェロンタンパク質またはインターフェロン遺伝子送達系を含む溶液を調製して、膀胱に点滴注入する。カテーテルをクランプして、約１時間の間、膀胱中に溶液を維持する。長時間の曝露によって、上皮に対する送達を増強することが所望され得るが実際的な懸念から、このような実施は制限されることが注意されるべきである。例えば、１時間は一般に、被験体が排尿する必要を感じるポイントである。送達増強因子の効果は、長期の効果を生じ、その結果、タンパク質の注入の前に膀胱を送達増強因子に事前に曝露することが送達の増強をもたらすことが実証されている。これは、タンパク質処方物と送達増強因子処方物との間の適合性が懸念される場合に使用され得る。所望の曝露後に、カテーテルクランプをカテーテルから外して、被験体を排尿可能にさせた。前述の手順は、治療効果を達成するために、患者が耐容可能な範囲で何度も繰り返され得る。この治療効果は、膀胱に挿入された膀胱鏡のような従来の手段によって容易に評価できる。
【０１０９】
これらの処方物は、充填される空隙、または投与される器官もしくは組織のサイズに相当する用量で投与され得る。ヒト膀胱については、適切な投与用量は、被験体の、そして詳細にはその膀胱の、年齢およびサイズに依存する。投与される用量は典型的には、５０〜５００ｍｌの範囲、そしてより一般的には５０〜２５０ｍｌ、または１００〜２００ｍｌの範囲に及んでもよい。ある投与方法では、投与されるべき量は、投与されるべき膀胱（ｖｅｓｉｃａｌまたはｂｌａｄｄｅｒ）にへバルーンカテーテルを挿入すること、およびカテーテルのバルーン部分を膨張させ、それらによって投与組成物が占有する空隙容積を軽減することによって、経済的に節約され得る。
【０１１０】
さらに、上記の投与レジメンは、治療効果の増強を得るために、補充されてもよいし、または他の治療投与レジメンと組み合わせて用いられてもよい。本発明の方法は、例えば、従来のＢＣＧおよび／または化学療法投与レジメンによって補充され得る。腫瘍学の分野では、効果を最大化するために個体に対応して複数回の投与レジメンを行うことが標準的な施行である。
【０１１１】
別の態様では、本発明は、第一の容器に送達増強化合物を、そして第二の容器にタンパク質または遺伝子送達系を有するキットを提供する。１つの実施形態では、この容器の中身は、送達増強因子およびタンパク質または遺伝子送達系の両方を含む処方物を調製するのに組み合わされて、これがその後被験体に投与される。別の実施形態では、この容器の内容物は、患者に対して個別の調製物として投与される。送達増強因子は、タンパク質または遺伝子送達系の投与の前、間または後に投与され得る。例示的な実施形態では、それらは、同時にまたはほぼ同時に投与される。容器のうち一方または両方の処方物は、薬学的に受容可能な液体キャリア中で戻される凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１１２】
別の実施形態では、このキットは、タンパク質の送達を増強し得るＳＹＮ３またはＳＹＮ３ホモログもしくはアナログ、あるいは遺伝子送達系を含む第一の容器；ならびにタンパク質または遺伝子送達系を含む第二の容器を提供する。１つのさらなる実施形態では、第一の容器は、ＳＹＮ３またはＳＹＮ３のモホログもしくはアナログの凍結乾燥処方物を含む。別の実施形態では、第二の容器は、タンパク質の凍結乾燥処方物を含む。さらなる実施形態では、第一の容器および第二の容器の両方が、そのそれぞれの内容物の凍結乾燥処方物を保持する。例示的なさらなる実施形態では、このタンパク質は、ヒトαインターフェロンポリペプチドに対して実質的に同一であるか、もしくはヒトαインターフェロンポリペプチドであるポリペプチドであるか、またはこの遺伝子送達系がタンパク質、すなわち、ヒトαインターフェロンポリペプチドに対して実質的に同一であるか、もしくはヒトαインターフェロンポリペプチドであるポリペプチドをコードする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物による投与は、治療効果を増大するために種々の時間間隔にわたって繰り返され得る。これらの間隔は、ほぼ毎日、毎週または毎月であってもよい。投与の回数は、治療レジメンおよびその期間で変化する。一般には本発明の治療投与は、週２回、毎週、隔週で、毎月または隔月で、最大２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月またはそれ以上でさえ投与されてもよい。投与の回数は、被験体におけるインターフェロンの産生もしくは放出をモニタリングすることによって、または患者の臨床効果（例えば、治療される疾患が癌である場合、腫瘍軽減）を評価することによって個々の被験体に対して耐容され得る。
【０１１４】
治療されるべき状態が膀胱の癌であり、治療タンパク質（例えば、インターフェロン）または遺伝子送達系（例えば、インターフェロンをコードする遺伝子について）が膀胱内に投与される別の実施形態では、本発明の治療方法および組成物に対する被験体における効果は、膀胱で見出される腫瘍塊のサイズおよび数をモニタリングすることによって評価される。このモニタリングは、血液もしくは尿のような体液中での腫瘍特異的な抗原または産生物の測定によっても、またはＭＲＩもしくは放射性同位体画像化技術のような直接画像化方法によってもよい。
【０１１５】
送達増強因子およびインターフェロンまたはインターフェロンをコードする遺伝子で処方された組成物を用いて、詳細には、器官および組織の上皮細胞を含む細胞に対してインターフェロンを提供してもよい。インターフェロンの治療効果および用法は当業者に公知である。例えば、本発明による組成物は、癌の治療において有効である。本発明の方法および組成物による投与に適切な癌組織および器官としては、胃腸管、膀胱、呼吸器および肺のような上皮性の膜を有する任意の組織または器官を包含する。例としては、限定はしないが、膀胱および上部気道、陰門、子宮頸部、膣、子宮または気管支の癌腫；腹膜の局所転移性腫瘍；気管支肺胞の癌腫；胸膜転移性癌腫；口腔および扁桃の癌腫；鼻咽頭、鼻、喉頭、食道、胃、結腸および直腸、胆嚢または皮膚の癌腫；または黒色腫が挙げられる。
【０１１６】
本発明の方法および組成物は詳細には、哺乳動物および詳細にはヒトにおける膀胱癌の治療において有効である。１つの実施形態では、本発明の方法および組成物は、種々の膀胱癌治療で投与されており、膀胱腫瘍塊のサイズもしくは数を減少することができないこと、またはこのような腫瘍の再発（ｒｅｌａｐｓｅまたはｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅまたはｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を遅らせることによって測定した場合に満足な効果が見られない個体を治療するために用いられる。１つの実施形態では、本発明の方法および組成物は、ＢＣＧ治療において満足な効果が見られない被験体に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、膀胱癌の治療においてＢＣＧ治療のような別の癌治療と組み合わされる。このような実施形態では、被験体は、ＢＣＧ治療の前、後または間に本発明の方法および組成物を受けてもよい。
【０１１７】
ある実施形態では、膀胱癌の再発または治療の有効性は、膀胱内視鏡、より好ましくは尿中のマイクロサテライトＤＮＡの測定によって評価され得る。Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｇ，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ ＭＰ，Ｌｉｎｎ ＪＦ，Ｍａｏ Ｌ，Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ Ｄ，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｔｅｌｌｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｒｉｎｅ」Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１９９７ Ｊｕｎ；３（６）６２１−４を参照のこと。膀胱の治療のための１つの実施形態では、治療組成物は、バルーンカテーテルを介して投与される。カテーテルは、本発明に従って投与された組成物によって占有される空隙の残りを最小にするように、空隙の一部、好ましくは空隙のほとんどを占有するために膨張される場合、膀胱の空隙に対して尿道を介して挿入され得るバルーン部分を有する。カテーテルは、膀胱の空隙と接触するように、膀胱に組成物を輸送する別の部分を有する。バルーン尿道カテーテルは、当業者に公知である。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明の組成物は、送達増強因子の希釈を減少するかまたは回避する方法で投与されてもよく、あるいは、調製物中の送達増強因子の量は、予想される希釈用量を考慮して増大され得る。希釈物を回避するための方法は、生理学的方法（例えば、排尿、絶食）または薬理学的介入（例えば、下剤）または医学的介入（カテーテルによる排液）によって標的の空間を空にする工程を包含する。バルーンカテーテルまたは他の方法を用いて、この組成物によって占有される管腔または通路内の空間の容積を隔絶してもよい。ある実施形態では、占有される必要がある空間を減少させるように、充填されている空間を部分的に占有するために、バルーンカテーテルが用いられ得る。他の実施形態では、処方物自体が、この因子のリザーバとして機能するように、または標的空間の表面に対して固定するために処方され、これによってバルク混合による即時希釈またはバルクフローによる損失を回避する。
【０１１９】
膀胱への膀胱内投与の際の送達増強剤とインターフェロンまたはインターフェロン遺伝子インターフェロン治療との間の相乗作用は、インターフェロン治療に一般的に伴う副作用を軽減または回避することを補助する。
【０１２０】
適切な量の組成物の投与は、例えば、局所投与、部分投与、経口投与または直腸投与、非経口的投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、肺内投与、経皮投与または経尿道投与、膀胱内投与、筋肉内投与または経尿道投与および膀胱内投与のような当該分野で公知の任意の方法によるものであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は経皮的に行う。本発明の適切な量および用量は、当該分野で公知であるように経験的に決定され得る。
【０１２１】
薬学的に受容可能な、または生理学的に受容可能な塩としては、限定はしないが、金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など；アルカリ土類金属、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩など；有機アミン塩、例えば、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩など；無機酸塩、例えば、塩酸、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など；有機酸塩、例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩など；スルホン酸塩、例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩など；アミノ酸塩、例えば、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。
【実施例】
【０１２２】
以下の実施例は、例示目的で提供されるものであり、本明細書において請求されるような本発明の範囲内に限定されないものとする。当業者が行う例示された物品および／または方法における任意のバリエーションは、本発明の範囲内におさまるものとする。
【０１２３】
（実施例１）
米国特許第６，３１２，６８１号は、膀胱の上皮性膜で癌細胞に対する導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを送達するための方法を開示するが、この方法は、上皮性膜に対してアデノウイルスベクター、および１％〜５０％（ｖ／ｖ）のエタノールまたは別の送達増強因子を投与する工程であって、このアデノウイルスベクターが細胞に感染して、導入遺伝子が感染細胞中で発現される工程を包含する。本出願と同じ譲受人に譲渡された米国特許第６，３１２，６８１号は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０１２４】
（実施例２）
以下の表は、本発明の非水性液体ＳＹＮ３処方物の成分の例示的な範囲を示す。投与前に（例えば、膀胱癌のため）、ＳＹＮ３溶液を、組換えアデノウイルス調製物と１：５０ｖ／ｖ比で組み合わせて、患者に投与される混合物を形成する。
【０１２５】
【表１】
調製するために、ガラスビーカー中に約７５％のＤＭＡを秤量する。個別のビーカーに、サーファクタント（ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＬ６４またはプルロニックＬ９２）を加えて、少量（最終用量の約１０％）のＤＭＡに溶解する。連続的に撹拌しながらＤＭＡ／サーファクタント溶液をＤＭＡ中に加える。個別の容器にＳＹＮ３を事前秤量する。撹拌しながら溶液中にＳＹＮ３をゆっくり加える。一旦ＳＹＮ３が溶解されれば、十分なＤＭＡを最終の重量容積まで添加する（２５℃で、密度＝０．９６２ｇ／ｍｌ）。ラテックスでない栓を備えるシリンジに取り付けた０．２２のフィルターを通じて溶液を濾過して、緊密に密閉されたガラス容器に４℃で溶液を貯蔵する。
【０１２６】
以下のさらなる組成物は、実施例１に従って調製され得る。
【０１２７】
【表２】
以下の２５ｍｌのバッチは、同じ手順によって調製した。
【０１２８】
【表３】
（実施例３）
以下の表は、本発明の凍結乾燥されたＳＹＮ３処方物の成分の例示的な範囲を示す。配合された溶液は、示されるように２０ｍｌの用量のＩＩ型ガラスバイアルに充填させて、凍結乾燥する。投与のための調製物は、ＳＹＮ３を再溶解するために凍結乾燥ケーキを含むバイアルへの２０ｍｌのＷＦＩの添加を要する。ＳＹＮ３溶液はｐ５３と、または任意の組換えアデノウイルス調製物と１：５のｖ／ｖ比で合わされる。次いでこの混合物を例えば膀胱癌については患者に投与する。
【０１２９】
【表４】
以下の実施例は、凍結乾燥処方物を調製する方法である。
【０１３０】
（実施例４）
【０１３１】
【表５】
充填されるＳＹＮ３の正確な量は、以下の式を用いて薬物バッチの純度に従って調節される：
ＳＹＮ３のグラム数＝２４．０×１００／（純度％）
例えば：
ＳＹＮ３薬物＝９７．０％純粋。
【０１３２】
２４．０×１００／９７．０＝１リットルに２４．７ｇのＳＹＮ３が加えられる。
【０１３３】
従って、以下の式に従って、バッチに加えられるＳＹＮ３の量を決定する：
ＳＹＮ３のｇ数／リットル＝２４．０ｇ／リットル×［１００／（ＳＹＮ３バッチ純度％）］
このバッチに加えられる注射用水の用量は、以下の式に従って決定されるものである：
注射用水の用量（リットル）＝バッチ用量（リットル）×０．５
撹拌機を備える風袋測定配合容器に上記の式を用いて算出した用量の注射用水を加える。Ｂｉｇ ＣＨＡＰを撹拌しながら添加して溶解する。注射用滅菌水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。Ｂｉｇ ＣＨＡＰの完全溶解には、中程度の撹拌速度での約３０〜６０分の連続的な撹拌を要し得る。Ｂｉｇ ＣＨＡＰ溶液中にＳＹＮ３を撹拌（中程度の撹拌速度）しながら加えて溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。ＳＹＮ３の完全な溶解には、最大１時間におよぶ混合を要し得る。撹拌しながら、かつ以下の順序：グリシン、アスコルビン酸、クエン酸一水和物およびクエン酸ナトリウム二水和物で、Ｂｉｇ ＣＨＡＰおよびＳＹＮ３の両方を含む溶液に添加して溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。注射用水を添加してこのバッチを最終用量にする（溶液の密度は２５℃で約１．０５１ｇ／ｍｌである）。この溶液を１５分間、混合する。
【０１３４】
ｐＨ測定のために溶液のわずかな（＜５ｍｌ）サンプルを取り出す。ｐＨは５．０〜６．０であるべきである。ｐＨの調節は必須である。当業者は得られた産物のｐＨを容易に確認できる。
【０１３５】
配合を完了するため、溶液を無菌処理して濾過する。任意選択的に、化合物のバッチは、バイアルに充填する前に、密閉された滅菌のステンレス製圧力容器に２℃〜８℃で最大２４時間まで保管してもよい。このバッチは、滅菌性を確保するために２回以上濾過してもよい。
【０１３６】
洗浄して滅菌されている２０ｍｌの１型フリントガラスバイアルに５．３±０．１ｍｌの溶液を無菌処理して満たす。洗浄されて、シリコン処理されて、滅菌されている２０−ｍｍのＷｅｓｔ ４４１６／５０リオ型（ｌｙｏ−ｓｈａｐｅｄ）ゴム栓をバイアルの凍結乾燥位置に無菌処理して挿入する。
【０１３７】
凍結乾燥棚を４±２℃に事前冷却する。凍結乾燥棚上に充填したバイアルのトレイを無菌処理して並べる。全てのトレイを置いた後、−４０℃に１時間この棚を冷却して、処理前に−３５℃以下で少なくとも４時間この生成物を維持する。コンデンサーの冷却を開始する。コンデンサーの温度が−４５℃以下である場合、チャンバの排出を開始する。５０〜７０ｍｍ Ｈｇの真空圧が得られれば、棚の温度を０．５時間で−２０℃まで加熱する。棚の温度を−２０℃で３６時間、約１５０ｍｍＨｇの圧（１００〜２００ｍｍＨｇの圧）で維持する。生成物の温度は、処理前少なくとも６時間は−２０℃以上に保たなければならない。棚を１時間で２５℃まで加熱して、圧力を約５０ｍｍＨｇの圧まで低下させる。棚の温度を２５℃で、約５０ｍｍＨｇの圧で１４時間維持する。滅菌濾過した窒素を用いてチャンバを約９５０ｍｍＨｇまで排気する。凍結乾燥機の内側でバイアルに栓をする。凍結乾燥機からバイアルを取り出して、２０ｍｍのアルミニウムシールでこのバイアルを圧着する。バイアルは、検査が終了するまで２℃〜８℃で保管しなければならない。
【０１３８】
この生成物は灰白色のケーキである。このバイアルは、検査後、２℃〜８℃で保管しなければならない。標識および検査の目的で、このバイアルを最大６時間まで１９℃〜２５℃に曝してもよい。
【０１３９】
（実施例５）
以下の実施例は、上記の実施例４に示されるようなバッチ調製に従って調製した。
【０１４０】
【表６】
得られた生成物のｐＨは５．３４であった。
【０１４１】
【表７】
得られた生成物のｐＨは５．４５であった。
【０１４２】
【表８】
得られた生成物のｐＨは５．７６であった。
【０１４３】
得られた凍結乾燥生成物の安定性試験によって、それらがＳＹＮ３に関して高度に安定であることが示された。安定性試験はＨＰＬＣによって達成した。
【０１４４】
凍結乾燥処方物は、１９．５ｍｌ ＷＦＩで再構成（再溶解）した：サンプルを指定の温度条件で、特定の時間インキュベートして、濃度をＨＰＬＣによって決定して、最初の濃度と比較した。
【０１４５】
（実施例６）
【０１４６】
【表９】
加えられるＳＹＮ３の正確な量は、以下の式を用いて、製剤原料のバッチの純度に従って調節する：
ＳＹＮ３のグラム数＝２４．０×１００（純度％）。
【０１４７】
サンプルの算出：
ＳＹＮ３の製剤原料＝９７．０％純粋。
【０１４８】
２４．０×１００／９７．０＝１リットルのバッチに加えられるべきＳＹＮ３が２４．７グラム。
【０１４９】
以下の実施例は次の手順で調製した：
最初に、以下の式に従ってバッチに加えられるＳＹＮ３の量を決定する：
ＳＹＮ３のｇ数／リットル＝２４．０ｇ／リットル×［１００（ＳＹＮ３のバッチ純度％）］
次に、以下の式に従って、バッチに加えられる注射用水の用量を決定する：
注射用水の用量（リットル）＝バッチ用量（リットル）×０．５
撹拌機を備える風袋測定配合容器にこの用量の注射用水を加える。ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを撹拌しながら添加して溶解する。ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンの完全な溶解には、中程度の速度での約３０〜４５分の連続的撹拌が必要であり得る。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。ポリソルベート８０をこの溶液に加えて溶解する。ポリソルベート８０は、０．１×注射用水の総バッチ容量（リットル）に再溶解して、この溶液に加えてもよい。
【０１５０】
この溶液中にＳＹＮ３を撹拌しながら加えて溶解する。ＳＹＮ３の完全溶解には、最大１時間までの混合を要し得る。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。
【０１５１】
撹拌しながら、かつ以下の順序：アスコルビン酸、クエン酸一水和物およびクエン酸ナトリウム二水和物をこの溶液に加えて溶解する。注射用水を用いて秤量容器をリンスして、全ての物質を回収し得る。注射用水を添加してこのバッチを最終用量にする（溶液の密度は２５℃で約１．０５８ｇ／ｍｌである）。この溶液を最大１５分間、混合する。
【０１５２】
ｐＨ測定のために溶液のわずかな（＜５ｍｌ）サンプルを取り出す。ｐＨは５．０〜６．０でなければならない。ｐＨの調節は必須ではない。洗浄されて完全性について試験されている溶液を、滅菌されたステンレス製の圧力容器中に無菌処理して濾過するか、またはその等価物を用いなければならない。任意選択的に、この配合されたバッチは、充填前に、密閉した無菌のステンレス製の圧力容器中に最長２４時間まで２℃〜８℃で保管され得る。このバッチは、滅菌性を確保するために２回以上濾過してもよい。
【０１５３】
洗浄して滅菌されている２０ｍｌの１型フリントガラスバイアル中に５．３±０．１ｍｌの溶液を無菌処理して満たす。洗浄されて、シリコン処理されて、滅菌されているリオ型ゴム栓をバイアルの凍結乾燥位置に無菌処理して挿入する。
【０１５４】
凍結乾燥するために、凍結乾燥棚を４±２℃に予備冷却する。凍結乾燥棚上に充填したバイアルのトレイを無菌処理して並べる。全てのトレイを置いた後、この棚を−４０℃に１時間冷却して、処理前には−３５℃以下で少なくとも４時間この生成物を維持する。コンデンサーの冷却を開始する。コンデンサーの温度が−４５℃以下である場合、チャンバの排出を開始する。５０〜７０ｍｍ Ｈｇの真空圧が得られれば、棚の温度を０．５時間で−２０℃まで加熱する。棚の温度を−２０℃で３６時間、約１５０ｍｍＨｇの圧（１００〜２００ｍｍＨｇの圧）で維持する。生成物の温度は、処理前には少なくとも６時間にわたり−２０℃以上に保たなければならない。棚を１時間で２５℃に加熱して、圧力を約５０ｍｍＨｇの圧まで低下させる。棚の温度を２５℃で、約５０ｍｍＨｇの圧で１４時間維持する。滅菌濾過した窒素を用いてチャンバを約９５０ｍｍＨｇまで排気する。凍結乾燥機の内側でバイアルに栓をする。凍結乾燥機からバイアルを取り出して、２０ｍｍのアルミニウムでこのバイアルを圧着する。バイアルは、検査が終了するまで２℃〜８℃で保管しなければならない。
【０１５５】
この生成物は灰白色のケーキである。このバイアルは、検査後、２℃〜８℃で保管しなければならない。標識および検査の目的で、このバイアルを最大６時間まで１９℃〜２５℃に曝してもよい。
【０１５６】
組換えアデノウイルスベクター（例えば、ｐ５３（ｒＡＤ／ｐ５３））は、ＳＹＮ３の凍結乾燥処方物と合わせた場合、３７℃で少なくとも２時間、そして２５℃で２４時間、安定なままであり得る。ｐ５３は、ＳＹＮ３の水溶液処方物と合わせた場合、３７℃で少なくとも４時間、そして２５℃で２４時間、安定なままである。
【０１５７】
（実施例７．化合物Ａ−ＬＢの合成）
以下の実施例では、「ｇ」は、グラムを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「ｍｏｌ」はモルを意味し、「℃」はセ氏温度を意味し、「分（ｍｉｎ．）」は分を意味し、「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを意味し、そして「ＰＮ」は、粒子数を特定する。全ての温度は、他に特定しない限り、セ氏温度である。
【０１５８】
以下は、Ａ−ＬＢとしても公知である化合物ＶＩＩの合成において利用される方法形態に関する。以下に示すのは、化合物５−６の合成の詳細および精製に必要な工程である。
【０１５９】
用いられる材料および試薬
Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン
コール酸
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
イソブチルクロロホルメート
トリエチルアミン
ラクトビオン酸。
【０１６０】
（実験）
（化合物Ａ−ＬＢの合成）
以下は、Ａ−ＬＢとしても公知の化合物ＶＩＩの合成において利用される方法形態に関する。以下に示すのは、化合物５−６の合成の詳細および精製に必要な工程である。
【０１６１】
用いられる材料および試薬
Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン
コール酸
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
イソブチルクロロホルメート
トリエチルアミン
ラクトビオン酸。
【０１６２】
化合物５：ラクトビオン酸（７１６ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を含むメタノール（６０ｍＬ）の溶液を加熱還流させた。この溶液にＤＣＣ（５００ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液を還流させながら撹拌した。２時間後、Ｎ−（３−アミノプロピル）−１，３−ジアミンプロパン（８００ｍＬ，５．７ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液をさらに１時間撹拌した。この反応溶液を室温まで冷却して濃縮し、粗生成物５を得た。粗アミド５をジクロロメタンを用いる倍散によって精製して、粘着性の吸湿性固体として５（２．７２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を得た。
【０１６３】
化合物６：コール酸（４．１ｍｇ，１０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（６０ｍＬ）の溶液を０℃に冷却した。この溶液にイソブチルクロロホルメート（１．２ｍＬ、１０．２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．４ｍＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を添加して、得られた溶液を１０分間撹拌し、続いて５（２．５ｇ，５．３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（４０ｍＬ）を添加した。次いで、この反応溶液を７２時間撹拌して濃縮し、粗生成物６を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製し、純粋な６（Ａ−ＬＢ）を得た。
【０１６４】
【化１１】
【０１６５】
【化１２】
（実施例８）
（膀胱癌のインターフェロン療法）
本実施例では、ヒトインターフェロンα導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの使用を前臨床動物モデルにおいて評価した。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物の膀胱内投与を受けた動物は、動物の尿中のインターフェロンタンパク質の局所濃度が極めて高く、インターフェロンの全身的レベルは最小であった。本発明者らはまた、胸腺欠損マウスを用いて表在性膀胱癌の正所性腫瘍モデルにおけるｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性を試験した。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与されたマウスは、コントロールに比較して膀胱腫瘍のサイズの劇的な減少があった。これらの結果に基づいて、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３は、表在性膀胱癌の新規な代替的治療法であり得る。
【０１６６】
（実施例８Ａ．ｒＡｄ−ＩＦＮの抗腫瘍活性）
ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）（ｒＡＤ−ＩＦＮ）をコードするＥ１領域欠失アデノウイルスを構築した。インビボの膀胱内送達研究のために、本発明者らは、ヒトα２ｂインターフェロン遺伝子（ＩＡＣＢ）をコードするアデノウイルスベクターを利用した。このベクターを用いる細胞の形質導入によって、ＩＮＴＲＯＮ Ａと同一の一次アミノ酸配列を有するヒトα２ｂインターフェロンタンパク質の産生が生じる。このタンパク質は、１６５アミノ酸のインターフェロンタンパク質に連結された２３アミノ酸の分泌リーダーペプチドを含む。Ｎ末端アミノ酸配列決定によって、分泌リーダーペプチドが翻訳後改変の間に適切に切断されることが確認されている。Ｅ．ｃｏｌｉの産生した組換えＩＮＴＲＯＮ Ａと比較して、ｒＡｄ−ＩＦＮ形質導入から生成されるインターフェロンタンパク質をグリコシル化する。ＩＦＮの明らかなグリコシル化は、イムノアッセイまたは抗ウイルスバイオアッセイによるＩＦＮのｒＡｄ−ＩＦＮ介在性発現の検出に影響しなかった。電気化学発光免疫アッセイを用いる血清および尿の両方からのＩＦＮタンパク質の検出のための生物分析方法が開発された。
【０１６７】
インターフェロンα種は一般に、生物学的特性において高レベルの種特異性を示す。ヒト腫瘍異種移植片を含むマウス腫瘍モデルにおけるインターフェロンαの抗腫瘍有効性を評価するために、マウスおよびヒトの両方のインターフェロンレセプターに結合し得るインターフェロンα種を有することが最適である。マウス腫瘍モデルを用いるインビボの有効性実験のために、本発明者らは、ハイブリッド型のインターフェロン（α２／α１）を含むアデノウイルスベクターを利用した。ハイブリッドインターフェロンタンパク質は、ヒト腫瘍細胞およびマウス腫瘍細胞の両方に対して抗腫瘍活性を有する（Ｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７（１９）：１１４９７−５０２（１９８２））。ハイブリッドインターフェロンは、マウス細胞に対してもヒト細胞に対しても活性であるので（Ｒｅｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２５７（１９）：１１４９７−５０２（１９８２））、ハイブリッドインターフェロンの高次構造は、マウスＩＦＮレセプターに結合して活性化できる必要がある。従って、ハイブリッドＩＦＮタンパク質は、ヒトのインターフェロンα２ｂの抗腫瘍有効性をより密接にモデルすると考えられた。
【０１６８】
インターフェロン導入遺伝子は、参考として援用される米国特許第６，２１０，９３９号においてＡ／Ｃ／Ｎ ５３として記載されるベクターと同じアデノウイルス骨格に組み込まれる。このベクターの模式的な提示は図１に例示されている。ｒＡｄ−ＩＦＮによる細胞培養物および動物におけるＩＦＮの発現およびＩＦＮの生物学的活性の実証後、皮下異種移植片腫瘍モデルにおけるｒＡｄ−ＩＦＮの抗腫瘍有効性を評価した（図２）。腫瘍増殖の阻害は、グリア芽細胞腫（ＬＮ２２９、Ｕ８７ＭＧ）、肝細胞腫（ＨＥＰ３Ｂ）およびＣＭＬ（Ｋ５６２）から誘導された腫瘍を有するヌードマウスでの腫瘍内ｒＡｄ−ＩＦＮ投与後に観察された。これらの研究では、投与を開始する前に、腫瘍モデルに応じて腫瘍は１０〜３０日間で樹立された。
【０１６９】
Ｋ５６２モデルでは、５匹のマウスのうち３匹に腫瘍がなく、そしてＵ８７ＭＧモデルでは、５匹のマウスのうち４匹に腫瘍がなかった。これらの結果に基づいて、ｒＡｄ−ＩＦＮは、種々の腫瘍サブタイプにおいて皮下固形腫瘍モデルにおける強力な抗腫瘍活性を有することが明らかである。図２を参照のこと。
【０１７０】
（実施例８Ｂ）
（アデノウイルス遺伝子発現のＳＹＮ３増強）
本実施例では、組換えアデノウイルスの膀胱内投与は、全身への曝露は極めて微量であって、膀胱の管腔内に局所的に適用され得る。しかし、ヒト組換え複製欠損アデノウイルス（ｒＡｄ）の単回の膀胱内投与は、以前の研究においてはごく限られた遺伝子移入および発現しか示していない（Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２（２）：９７−１０４（１９９５））。膀胱の構造は、ウイルスベクターによって形質導入されることが不能である原因となり得ると考えられる。膀胱は病原性細菌およびウイルスに対する主要な天然の防御として機能し得るが、一方では尿の封入のためのリザーバとしても機能する。管腔の膀胱上皮は、膀胱管腔から組織への尿の通過を妨害する親水性グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）層で覆われる。ＧＡＧ層は、他の上皮保護機構（例えば、胃腸管（胃腸管参照））に匹敵して、細菌結合を防御する（Ｐａｒｓｏｎｓ ＣＬ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ．，１２（１）：３８−４２（１９９４））。アデノウイルス結合および形質導入を増強するためにこの層を改変する因子の同定についての研究が重ねられている。エタノールはアデノウイルスの遺伝子導入を増大させ得る因子として最初に同定されたが（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ、５３（５）：１０４９−５３（１９９９））、出血性膀胱炎も投与後に注目され、この処方物は不適切であると思われた。代替的処方物のさらなるスクリーニングをＣａｎｊｉで行って、エタノールの有害作用がなくアデノウイルス遺伝子の膀胱への移入を増強し得る因子を同定した。種々の界面活性剤（陽イオン性、陰イオン性、両性イオン性および非イオン性）を、それがアデノウイルス送達を増強する能力について評価した。非イオン性界面活性剤Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、膀胱炎なしにアデノウイルスベクターで膀胱上皮の形質導入を強力に増強することが見出された。Ｂｉｇ ＣＨＡＰは、濃度依存性の様式で遺伝子導入を向上させ、最大の形質導入および遺伝子発現の飽和は、３０ｍｇ／ｍｌ（３４ｍＭ）のＢｉｇ ＣＨＡＰ濃度で達成された。
【０１７１】
Ｂｉｇ ＣＨＡＰの増強活性のさらなる特徴によって、種々の市販の調製物の間の変動が明らかになり、これによって界面活性剤の組成の異質性が示唆される。実際、Ｂｉｇ ＣＨＡＰのいくつかの調製物は、ウイルス導入遺伝子発現を全体として増強できなかった。Ｂｉｇ ＣＨＡＰの生物活性ロットを薄層クロマトグラフィーによって不活性なロットと比較した場合、この生物活性ロットには少なくとも３つのさらなる化合物が存在した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ構造分析によって、３つのさらなる成分がＢｉｇ ＣＨＡＰ製造プロセス由来の最も可能性の高い副産物であることが示された。各々の不純物を単離して、ｒＡｄ−β−ｇａｌとの同時投与により膀胱中のウイルス導入遺伝子発現を増強する能力について評価した。不純物２番は、最も強力な化合物であったが、極めて不溶性でもあった。その全体が参考として本明細書に援用される米国特許第６，３９２，０６９号を参照のこと。
【０１７２】
膀胱上皮におけるｒＡｄ遺伝子形質導入を増強する能力についてＳＹＮ３を試験した。ラットには、ｒＡｄ−β−ｇａｌ（０．５ｍｌ；７．６×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物またはビヒクル処方物（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０）のいずれかの膀胱内投与を与えた。４５分後、被験体を取り出して、動物を回復させた。２日後、動物を屠殺して、その膀胱を回収してＸ−ｇａｌを染色してｒＡｄ遺伝子発現の程度を判定した。ｒＡｄ−β−ｇａｌを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、同じウイルスをビヒクル処方物に含むものの送達に比較して、ｌａｃＺ遺伝子発現の劇的な増強を有した（図３）。
【０１７３】
（実施例８Ｃ）
（膀胱におけるインターフェロン発現に対する併用療法の効果）
ＳＹＮ３を用いる膀胱癌の治療と、インターフェロン遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターとの併用は、膀胱の治療におけるインターフェロンに対して、導入遺伝子インターフェロンの発現における予期せぬ多大な増大をもたらした。前臨床試験によって、ＳＹＮ３は、種々の組換えアデノウイルスベクターの膀胱上皮への送達および発現を劇的に増強し得ることが実証された。マウスで研究を行って、ＳＹＮ３処方物を用いる膀胱上皮に対する遺伝子移入の増大を定量した。マウスは、ＳＹＮ３またはビヒクル処方物のいずれかにおいてｒＡｄ−ＩＦＮの膀胱内投与を受けた。投与の２日後、マウスを屠殺して、それらの膀胱を回収して、ドライアイス上で急速凍結させた。次いで各々の膀胱から核酸を抽出して、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、存在するｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡおよびＲＮＡのレベルをアッセイした。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物を投与されたマウスは、ｒＡｄ−ＩＦＮを含むビヒクル処方物を投与されたマウスに比較してｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡのコピー数が約千倍多く（図４ａ）、そしてｒＡｄ−ＩＦＮを含むビヒクル処方物を投与されたマウスよりも膀胱ホモジネート中で決定されたＲＮＡが少なくとも１万倍多い。
【０１７４】
【表１０】
表１。マウスには、ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物（１００μｌ；７．４×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むまたはビヒクル処方物のいずれかを４５分間膀胱内投与した。投与の２日後、マウスを屠殺して、その膀胱を回収してドライアイス上で急速凍結させた。次いで各々の膀胱から核酸を抽出して、それぞれＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、存在するｒＡｄ−ＩＦＮ ＤＮＡおよびＲＮＡのレベルをアッセイした。ＢＱＬ：定量レベル未満：ＤＮＡ：１０コピー数／組織１ｍｇ；ＲＮＡ：１０００ＭＥＱ／組織１ｍｇ。比較のために、ＳＹＮ３単独の投与によって得たレベルも示す。これらの結果に基づいて、ＳＹＮ３処方物が、膀胱上皮におけるｒＡｄ−ＩＦＮの送達および発現を増強するために必要とされることは明白である。
【０１７５】
（実施例８Ｄ）
（表在性膀胱癌についてのｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性）
ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３の有効性を、正所性腫瘍モデルを用いて評価した（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７（１２）：１５７５−８０（２０００））。表在性腫瘍は、腫瘍細胞結合を増強するための短時間のトリプシン事前投与の後にヒトＵＭＵＳ−３移行上皮癌（ＴＣＣ）の膀胱内投与によって胸腺欠損マウスの膀胱において樹立された。処理の開始前に６日間増殖することによって腫瘍を形成させた。次いで、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−コントロール／ＳＹＮ３またはＳＹＮ３−ビヒクル単独のいずれかをマウスに膀胱内投与した。２つの異なるコントロールのアデノウイルス構築物をこれらの研究において比較のために用いたが、一方は導入遺伝子を含まず（ＺＺＣＢ）、もう一方は、ヒト分泌アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰＣＢ）を含む。なぜなら、ｒＡｄ−ＩＦＮは、分泌遺伝子産物を産生する。マウスに、１００μｌのｒＡｄ（１．１×１０１１Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物を２日連続して１時間投与した。投与の１４日後（腫瘍の開始後２０日）、マウスを屠殺して、その膀胱を回収して、ホルマリンで固定し、それらの腫瘍負荷を顕微鏡検査で評価した。腫瘍があった膀胱の全体的割合、および腫瘍の相対的サイズを記録した。腫瘍によって占有される膀胱管腔の割合に基づいて０〜４のスケールで腫瘍をスコア付けした。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３投与群における腫瘍の全体的頻度は、ｒＡｄ−コントロールまたはＳＹＮ３のみの群における腫瘍の頻度よりも有意に低かった（図４）。著しいことに、ｒＡｄ−ＩＦＮ投与動物においては残りの腫瘍のわずかな例だけがコントロールに比較して有意に小さいサイズを有した。これらの結果によって、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３が、この正所性腫瘍モデルにおいて表在性膀胱腫瘍の増殖を大きく軽減させることが示される。
【０１７６】
他の研究では、トリプシン前処理後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトされたヒトＫＵ−７膀胱癌細胞の膀胱内投与によって表在性腫瘍が胸腺欠損マウスの膀胱で樹立される正所性腫瘍モデルが用いられている。膀胱を外科的に露出させて、ＧＦＰ蛍光を活性化させる光を用いて照射することによって、腫瘍サイズの連続的評価は、動物を屠殺することなくインビボでモニターできる。腫瘍細胞を１０日間増殖させて、その後すぐ膀胱を外科的に露出させて、照射して、各々の動物についての蛍光腫瘍負荷を写真で記録した。画像分析ソフトウェアを用いて、膀胱の総面積に対する、腫瘍細胞を含む膀胱の面積の割合をまた投与の前後に決定した。マウスには、１００μｌのｒＡｄ（１×１０１１Ｐ／ｍｌ）の膀胱内投与を２日続けて１時間ずつ行った。４つの投与群を比較した；ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−β−ｇａｌｌ／ＳＹＮ３ ｒＡｄ−ＩＦＮ単独またはＳＹＮ３単独。投与の２１日後（腫瘍増殖の開始の３１日後）、膀胱を再度膨張させて、外科的に露出させて、ＧＦＰ腫瘍負荷を上記のように再度測定した。
【０１７７】
ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与された動物は、経時的に腫瘍負荷の有意な減少を示した（図５）。対照的に、腫瘍のサイズは他の全ての投与群では増大させ続けた。ｒＡｄ−ＩＦＮ単独の投与では、腫瘍増殖の有意な軽減は生じず、このことはこの処方物に増強因子ＳＹＮ３を含むことの必要性を示す。ｒＡｄ−β−ｇａｌ／ＳＹＮ３群では腫瘍増殖の軽減は観察されないので、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３群で観察される腫瘍増殖の減少は、インターフェロン導入遺伝子発現の結果であるはずであり、アデノウイルスベクターの投与に起因する単なる非特異性効果ではない。要するに、ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３は、この正所性腫瘍モデルにおける表在性膀胱腫瘍の増殖を有意に軽減するようである。コントロールに比較してＳＹＮ３／ｒＡｄ−ＩＦＮを用いて達成された腫瘍負荷の軽減を可視化するために、投与の前後での個々の動物についての腫瘍負荷の写真が各々の投与群について提供される）。
【０１７８】
（実施例８Ｅ．ラット膀胱におけるｒＡｄ−ＩＦＮ発現の検出）
細胞にｒＡｄ−ＩＦＮを形質導入する場合、分泌されたタンパク質産物が産生される。従って、膀胱上皮において得られるウイルスの導入遺伝子発現のレベルは尿中で分泌されるインターフェロンの量によって評価され得るという仮説が立てられた。最初の実験で、ｒＡｄ−ＩＦＮまたはｒＡｄ−コントロール（ＺＺＣＢ）を含むＳＹＮ３処方物の膀胱内投与を受けた雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット由来の尿中のインターフェロンのレベルを比較した。ラットには、ｒＡｄ（５×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３（１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内投与を４５分間行って、回復させた。投与の４８時間後、代謝ケージを用いて（４時間の収集）各々の動物から尿を得た。ｒＡｄ−ＩＦＮを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、その尿中で極めて高レベルのインターフェロン有し（約２５ｎｇ／ｍｌ）、その血清中のインターフェロンのレベルは極めて低かった（図５）。対照的に、ｒＡｄ−コントロールを含むＳＹＮ３処方物を投与されたラットは、その尿または血清中にインターフェロンタンパク質を有さなかった。４８時間後、ラットを屠殺して、その膀胱を回収して、ホモジナイズして、インターフェロンレベルを決定した。ＳＹＮ３／ｒＡｄ−ＩＦＮを投与されたラットは、膀胱ホモジネート中に有意に高レベルのＩＦＮタンパク質が検出された。ＳＹＮ３／ｒＡｄ−コントロール動物の膀胱ホモジネート中ではインターフェロンは検出されなかった。これらの結果は、ＰＣＲ／ＲＴ−ＰＣＲの結果と一致しており、これによって尿が膀胱のウイルス導入遺伝子発現のレベルおよび期間の両方をモニターするツールとして用いられ得ることが示唆される。
【０１７９】
（実施例９）
（パート１：化合物３の合成）
米国特許第６，３９２，０６９号から改変されているＳＹＮ３の合成スキームを図７に示す。ラクトビオン酸（２）のラクトンは、５０ｍｌのエタノールにラクトビオン酸（１）の１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）を溶解すること、ロータリー・エバポレーター中で蒸発乾燥するまでエバポレートし、そのプロセスを６回繰り返すことによって、合成された。化合物３を得るためには、５０℃まで加熱することによって、得られた残滓（２）を５０ｍｌのイソプロパノールに溶解した。この溶液に、１．２ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）のＮ−３−アミノプロピル）−１，２−プロパンジアミンを添加した。この温度を１００℃まで上昇させて、この溶液を３時間撹拌させた。ロータリー・エバポレーションによって溶媒を除去して、得られた残滓をクロロホルムを用いて数回洗浄して、過剰な未処理のＮ−（３−アミノプロピル）−１，３−プロパンジアミンを除去した。この残留している残滓（３）を以下のパート３においてそのままに用いた。
【０１８０】
（パート２：化合物４の合成）
２．２８ｇのコール酸（５．６ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に、６０℃に加熱することで溶解することによって化合物４を合成した。トリエチルアミン（０．７８ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ））を添加して、溶液を氷浴中で冷却した。次いで、イソブチルクロロホルメート（０．７３ｍｌ（５．６ｍｍｏｌ））を添加して、撹拌を１０分間続けて白色沈殿物を形成した。
【０１８１】
（パート３：ＳＹＮ３（化合物５）の合成）
化合物ＩＩＩをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解して、氷浴中で冷却して、撹拌した。化合物４の合成から得られる懸濁物を化合物３を含む溶液中に濾過した。得られた溶液を室温下で６時間撹拌した。この溶媒を高圧ロータリー・エバポレーションを用いて除去して、その残滓を１００ｍｌのクロロホルム／メタノール（５０／５０）に溶解した。この溶液の２５ｍｌを、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール（６０／４０）を用いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）からなる移動相を用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって、カラムから溶出する分画の分析を行った。硫酸エタノールの噴霧後の炭化によってこの化合物を可視化した。フラッシュクロマトグラフィーを用い、溶出溶媒としてクロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム（１００／８０／１０／５）を用いて、生成物を含む画分を確認して、再精製した。生成物を含む画分を確認して白色粉末までエバポレートした（３００ｍｇの化合物５）。この生成物の１Ｈ−ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析は、示した構造と一致した。
【０１８２】
（実施例１１）
好ましい送達増強化合物は以下の表に示す。この表は、コール酸置換基を有する化合物を例示するが、当業者は、他のステロイド置換基がこの化合物の送達増強特性を損なうことなくコール酸と置換できることを容易に理解する。このような化合物を作製する方法は、本出願と同じ譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書に援用される、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ａｎｄ Ｃｒｅｗ ＬＬＰ代理人整理番号：０１６９３０−０００８３０ＵＳとして２００３年６月４日に提出された仮出願に教示されており、そこに開示される形質導入因子および送達増強因子、これらを作製する方法およびそれらの用途が特に参照される。
【０１８３】
【表１１】
（実施例１２）
（ＳＹＮ３処方物における膀胱内投与後のＩＦＮタンパク質の取り込み）
本実施例は、ＳＹＮ３処方物中で投与されたときに、インターフェロンタンパク質の組織レベルを、ＳＹＮ３が増大させ得るか否かを決定することによって、インターフェロンタンパク質の取り込みをＳＹＮ３が増強するか否かを検討した。
【０１８４】
方法。ハイブリッドＩＦＮタンパク質の供給は限定されているので、ＩＦＮα／２ｂタンパク質（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）が主に用いられた。比較の目的で、ｔ＝０時点でハイブリッドタンパク質も包含され得る。非近交系のＨＳＤラットを、イソフルランを用いて麻酔した。投与前の尿を収集した。カテーテルおよび潤滑剤を用いて膀胱に経尿道的に投与した。被験体を膀胱に投与した。尿道はカテーテルを引き抜くことなく２．０Ｇの縫合糸で結紮した。４５分後（０時間）、被験体を取り出して、動物を飼育ケージ中で回復させた。屠殺の直前にラットから尿サンプルを得た。尿を収集した後、ラットからその日に膀胱を回収した。組織を凍結させて、ＩＦＮ応答性遺伝子の上方制御についてアッセイした。
【０１８５】
【表１２】
物質：
３８匹の雌性Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット；
ＩＡＣＢ： Ｔｒｉｓ−グリセロール処方物 ７．５７×１０１１Ｐ／ｍｌ
ＩＨＣＢ： ｖＰＢＳ処方物 １．１０×１０１２Ｐ／ｍｌ
ＳＹＮ３： ６×ストック（６ｍｇ／ｍｌ）
Ｉｎｔｒｏｎ Ａ： 使用参照バイアル：１ｍｌの滅菌ナノピュアｄＨ２Ｏ中で水和（１０ＭＩＵ／ｍｌ）
３，００８μｌのＰＢＳで希釈した９５０μｌのＩｎｔｒｏｎ Ａ（２．４ ＭＩＵ／ｍｌ）
ＰＢＳまたはＳＹＮ３のいずれか１２５μｌに添加された６２５μｌの希釈されたＩｎｔｒｏｎ Ａ（６ｍｇ／ｍｌ）
ＩＦＮ α２α１タンパク質： １０５μｇ／ｍｌ＝１０５×１０６ｐｇ／ｍｌ
１．３４×１０７ＩＵ／ｍｌ
１．２８×１０８ＩＵ／ｍｇ
ＩＡＣＢは、インターフェロンα２ｂの組換えアデノウイルスベクターであり、ＣＭＶプロモーターおよびＥ１領域欠失を有する。ＩＨＣＢはハイブリッドインターフェロンα２α１の組換えアデノウイルスベクターであり、ＣＭＶプロモーターおよびＥ１領域欠失を有する。
【０１８６】
（被験体の調製：）
２．４ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度でＩＦＮα２ｂを調製する（１参照バイアルを１ｍｌの滅菌注射用水中で水和する）。
９５０μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物
３，００８μｌ ＰＢＳ。
【０１８７】
ＰＢＳ中でＩＦＮα２ｂを調製するため：
６２５μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ２．４ＭＩＵ／ｍｌ
１２５μｌ ＰＢＳ。
【０１８８】
ＳＹＮ３中でＩＦＮα２ｂを調製するため：
６２５μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ ２．４ＭＩＵ／ｍｌ
１２５μｌ ＳＹＮ３。
【０１８９】
ＳＹＮ３中でｒＡｄ−ＩＦＮα２ｂ（ＩＡＣＢ）を調製するため：
６６μｌ ＩＡＣＢ
２５０μｌ ＳＹＮ３
１１８４μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０１９０】
ＩＦＮα／２α１タンパク質の濃縮物調製（２．２ｍｌ）：
２４３μｌ ＩＦＮ α２α１タンパク質
１９５７μｌ ＰＢＳ。
【０１９１】
ＩＦＮα２α１／ＰＢＳ：
６２５μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
１２５μｌ ＰＢＳ。
【０１９２】
ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３：
６２５μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
１２５μｌ ＳＹＮ３。
【０１９３】
【表１３】
従って、賦形剤の最終濃度は以下のとおりである：
ＳＹＮ３： （１２０ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝１ｍｇ／ｍｌ
クエン酸一水和物 （１．６ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．０１３３３ｍｇ／ｍｌ
クエン酸ナトリウム二水和物（５．１ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．０４２５ｍｇ／ｍｌ
ヒドロキシ−シクロデキストリン（１０００ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝８．３３ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）（６０ｍｇ／２０ｍｌ）／６＝０．５ｍｇ／ｍｌ。
【０１９４】
組織ホモジネート中に存在するＩＦＮα２ｂの量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（ＰＢＬ）を用いて決定した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて測定した。組織に存在するＩＦＮのレベルは、組織１ｍｇあたりのＩＦＮのｐｇ数（ｐｇＩＦＮ／組織ｍｇ）として表した（図８を参照のこと）。図８に示されるように、ＳＹＮ３処方物中のＩＦＮα２ｂの送達は、投与後最長２４時間まで検出可能なＩＦＮα２ｂタンパク質の量の約１５倍の増大を生じた。ハイブリッドＩＦＮタンパク質（ＩＦＮα２α１）の送達はまた、ＳＹＮ３処方物中の送達によって増強され、そしてＩＦＮα２ｂタンパク質と同様の組織濃度レベルで検出された。
【０１９５】
（実施例１３）
（ＩＦＮタンパク質を含むＳＹＮ３処方物の投与後の膀胱上皮に対するインターフェロンの生物学的作用の分析）
本実施例によって、ＩＦＮ組織濃度の増大が測定可能な生物学的応答を生じたか否かを検討した。生物学的活性を評価するため、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＩＦＮタンパク質での投与後のラット膀胱ホモジネート中のＩＦＮ応答性遺伝子の発現をモニターした（Ｉｎｔｒｏｎ Ａおよび「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」インターフェロン（ＩＦＮ Ａ／Ｄ；ＩＦＮα２α１）の両方。以下のラット遺伝子をアッセイした：２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（２’，５’−ＯＡＳ）；インターフェロン誘導性ｐ７８タンパク質をコードする遺伝子（ＭｘＡＭＸ１）（ＭＸ１）；インターフェロン調節性因子１（ＩＲＦ−１）；およびインターフェロンγＩＦＮγ。（ＩＦＮγは、正常にはＩＦＮ応答性遺伝子とはみなされないが、一般にはＢＣＧのような病原体に対する曝露後に発現させ、同様のＩＦＮγ応答が組換えアデノウイルスによって誘導されるか否かを決定するために含まれた）。この方法は概して、実施例１２において上記されるものであった。１時間後、被験体を取り出して、動物をホームケージで回復させた。ラットを指定の時点で屠殺し（０時間＝投与の直後）、そしてそのサンプルを液体Ｎ２中で急速凍結させて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。
【０１９６】
【表１４】
（必要な材料：）
３８例の雌性Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット；プロトコール０４−６３４から移した
ＩＡＣＢ： Ｔｒｉｓ−グリセロール処方物 ７．５７×１０１１Ｐ／ｍｌ
ＩＨＣＢ： ｖＰＢＳ処方物 １．１０×１０１２Ｐ／ｍｌ
ＳＹＮ３： ６×ストック（６ｍｇ／ｍｌ）
Ｄ−ＰＢＳ
Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液：
滅菌ＷＦＩ
ＩＦＮα２α１タンパク質： １０５μｇ／ｍｌ＝１０５×１０６ｐｇ／ｍｌ
１．３４×１０７ＩＵ／ｍｌ
１．２８×１０８ＩＵ／ｍｇ。
【０１９７】
（被験物質の調製：）
（１）ＩＦＮα２ｂ／ＰＢＳ：２ ＭＩＵ／ｍｌ最終濃度で５ｍｌ）
・１ｍｌ注射用滅菌水１，０００μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物中で１参照バイアルを水和する（１０ＭＩＵ／バイアル）
４，０００μｌ ＰＢＳ。
【０１９８】
（２）ＩＦＮ α２ｂ／ＳＹＮ３：最終濃度２ＭＩＵ／ｍｌで１０ｍｌ）
・２ｍｌ注射用滅菌水２，０００μｌ Ｉｎｔｒｏｎ Ａ濃縮物で２つの参照バイアルを水和する。
６，３３４μｌ ＰＢＳ
１，６６６μｌ ＳＹＮ３。
【０１９９】
（ＩＡＣＢ／ＳＹＮ３：ＳＹＮ３中に１．０×１０１１Ｐ／ｍｌで４．５ｍｌ）
６６０μｌ ＩＡＣＢ
７５０μｌ ＳＹＮ３
３，０９０μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０２００】
（ＩＦＮα２α／ＰＢＳ：１ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度で４ｍｌ）
２９８μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
３，７０２μｌ ＰＢＳ。
【０２０１】
（ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３：１ＭＩＵ／ｍｌの最終濃度で６ｍｌ）
４４４μｌ ＩＦＮα２α１タンパク質
４，５５６μｌ ＰＢＳ
１，０００μｌ ＳＹＮ３。
【０２０２】
（ＩＨＣＢ／ＳＹＮ３ ＳＹＮ３中に１．０×１０１１Ｐ／ｍｌで４．０ｍｌ）
３６４μｌ ＩＨＣＢ
６６７μｌ ＳＹＮ３
２，９６９μｌ Ｔｒｉｓ−グリセロール緩衝液。
【０２０３】
動物を指定の時点（図９〜１１を参照のこと）において屠殺して、ＲＴ−ＰＣＲ分析のために液体窒素上にその膀胱を回収した。一次分析では、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ／ＰＢＳ送達後に観察されるレベルに対して上記の遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較した。これにより、示されるグラフでは、遺伝子活性化のレベルは、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ／ＰＢＳ群に対して正規化される（１．０）。
【０２０４】
図９〜１２に示されるように、ＳＹＮ３の追加は、同じ量のタンパク質を含むＰＢＳ処方物の送達に比較して、公知の下流ＩＦＮ活性化遺伝子（２’−５’ＯＡＳ，ＭＸ１）の発現を増大させた。ＳＹＮ３におけるハイブリッドタンパク質（ＢＳ：ＩＦＮα２α１／ＳＹＮ３）は、ＩＦＮα２ｂについて２ＭＩＵ／ｍｌの代わりに１ＭＩＵ／ｍｌで投与された場合でさえ、より強力な生物学的応答をもたらすと思われた。Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（ＩＦＮα２ｂ）およびハイブリッドＩＦＮ（ＩＦＮα２α１）の両方ともＳＹＮ３処方物中で投与された場合、ラットＯＡＳおよびＭＸ１遺伝子の発現を増大させたが、両方ともｒＡｄ−ＩＦＮα２ｂまたはｒＡｄ−ＩＦＮα２α１の投与後に得られたレベルよりも幾分か劣った。
【０２０５】
本明細書で記載される実施例および実施形態は、例示的な目的のものでしかなく、それらに照らして様々な改変または変化が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されるものであるということが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が詳細にかつ個々に参考として援用されることを意図しているように、全ての目的についてその全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、腫瘍細胞における遺伝子発現を増強する送達増強因子の効果を実証するために、本明細書に記載された実験において用いられる、複製欠損組換えアデノウイルス遺伝子送達系の模式図を提供する。
【図２】図２は、皮下の異種移植片腫瘍モデルにおける、組換えアデノウイルスインターフェロン遺伝子送達系およびＳＹＮ３を含む、薬学的組成物の抗腫瘍有効性を示すグラフ表示である。グリア芽細胞種（ＬＮ２２９、Ｕ８７ＭＧ）、肝細胞腫（ＨＥＰ３Ｂ）およびＣＭＬ（Ｋ５６２）に由来する腫瘍を保有するヌードマウスにおいて腫瘍内ｒＡｄ−ＩＦＮ投与後に、腫瘍増殖の阻害が観察された。腫瘍内投与による皮下異種移植片腫瘍増殖の阻害。５匹のマウスの群に、ビヒクル、ｒＡｄ−コントロール、またはｒＡｄ−ＩＦＮを用いて２週間の間、週に３日の注射によって投与した（１×１０１０粒子／用量；総用量６×１０１０粒子）。
【図３】図３は、ラットにおける組換えアデノウイルス遺伝子送達系の送達をＳＹＮ３が増強する能力を示す。雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットには、４５分間に、ｒＡｄ−β−ｇａｌ（７．６×１０１０Ｐ／ｍｌ）を含むＳＹＮ３処方物（ビヒクルに１ｍｇ／ｍｌ）、またはビヒクル単独（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−８０）のいずれかの膀胱内投与を与えた。４８時間後、動物を屠殺して、それらの膀胱を回収し、固定して、ｌａｃＺ発現についてＸ−ｇａｌ染色した。
【図４】図４は、マウスの膀胱腫瘍モデルにおける腫瘍に対する、ＳＹＮ３を有するインターフェロン遺伝子送達系を含む薬学的組成物の効果を示す。雌性ヌードマウスでは、経尿道的にカテーテルを使用して、３時間、ＵＭＵＣ−３細胞（１×１０７；１００ｍｌ）を投与する前に３０分間、１００ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％）を投与した。６日後、ｒＡｄ−ＩＦＮまたはｒＡｄコントロール（１×１０１１／１００μｌ）またはＳＹＮ３のみ（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの膀胱内投与によって動物に２×（２４時間間隔；６日、７日）投与した。腫瘍細胞移植の２１日後、動物を屠殺して、それらの膀胱を、顕微鏡検査および腫瘍負荷のスコア付けのためにホルマリンに収集した。腫瘍は以下のようにスコア付けした：０＝腫瘍なし、１＝閉塞した膀胱管腔のうち２５％未満；２＝閉塞した膀胱管腔のうち２５〜５０％；３＝閉塞した膀胱管腔の５０％超。
【図５】図５は、トリプシン前処理後に緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）で安定にトランスフェクトされたヒトＫＵ−７膀胱癌細胞の膀胱内投与により胸腺欠損マウスの膀胱で表在性腫瘍を樹立した表在性膀胱癌の同所性腫瘍モデルにおける、遺伝子送達増強系と組み合わせたＳＹＮ３の有効性に関連するデータを提供する。ＧＦＰ蛍光を活性化するために膀胱を外科的に露出および照射することによって、腫瘍サイズの経時的な評価は、動物を屠殺することなくインビボでモニターできる。腫瘍細胞を１０日間増殖させ、その後、膀胱を外科的に露出させて照射し、そして各々の動物についての蛍光の腫瘍負荷を写真で記録した。画像分析ソフトウェアを用いて、膀胱の総領域に対する腫瘍細胞を含む膀胱の領域の割合をまた、投与の前後に決定した。２日連続して１時間、１００μｌのｒＡｄ（１×１０１１Ｐ／ｍｌ）の膀胱内投与をマウスに行った。４つの投与群を比較した：ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３、ｒＡｄ−β−ｇａｌｌ／ＳＹＮ３ ｒＡｄ−ＩＦＮ単独またはＳＹＮ３単独。投与の２１日後（腫瘍増殖の開始後３１日）、膀胱を再度膨らませて、外科的に露出させて、ＧＦＰ腫瘍負荷を上記のように再度測定した。ｒＡｄ−ＩＦＮ／ＳＹＮ３を投与された動物は、経時的に腫瘍負荷が有意に低下した。
【図６】図６は、血液、尿および膀胱の組織におけるインターフェロンのレベルに対する、ＳＹＮ３およびインターフェロン遺伝子送達系を含む薬学的組成物の効果を示す。ｒＡｄ−ＩＦＮ（ＩＡＣＢ）またはｒＡｄ−コントロール（ＺＺＣＢ）のいずれかを含むＳＹＮ３処方物（１ｍｇ／ｍｌ）の膀胱内投与（１００μｌ；７．４×１０１０Ｐ／ｍｌ）をマウスに行った。投与の２日後、尿および血清を各々の動物から得るとすぐに動物を屠殺して、それらの膀胱を回収して、ホモジナイズして、ＩＦＮのレベルについてアッセイした。このデータによって、インターフェロン発現のレベルが尿のアッセイによって決定され得るということ、およびインターフェロンをコードする遺伝子送達系の膀胱内投与後のインターフェロンタンパク質に対する動物の識別可能な全身的曝露がないということがわかる。
【図７】図７は、ＳＹＮ３の合成の１つの方法を例示する。
【図８】図８は、種々の時点でのラットにおける尿路上皮によるインターフェロンの取り込みに対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。ハイブリッドＩＦＮタンパク質の供給が制限されるので、ＩＦＮα２ｂタンパク質（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）が主に用いられた。比較のためには、ハイブリッドタンパク質をまた、ｔ＝０時点で含んだ。
【図９】図９は、ラットにおける、２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ）のインターフェロン発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１０】図１０は、ラットにおける、ＭＸ１のインターフェロン誘導性発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１１】図１１は、ラットにおける、ＩＲＦ１の任意のインターフェロン誘導性発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【図１２】図１２は、ラットにおける、ＩＦＮγのインターフェロン発現に対する、ＰＢＳと比較したＳＹＮ３処方物の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の薬学的組成物。
【請求項１】
本明細書中に記載の薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２６９８０８（Ｐ２００７−２６９８０８Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１４７５１７（Ｐ２００７−１４７５１７）
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【分割の表示】特願２００６−５１５２０６（Ｐ２００６−５１５２０６）の分割
【原出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【出願人】（３９９０２５２８４）カンジ，インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【分割の表示】特願２００６−５１５２０６（Ｐ２００６−５１５２０６）の分割
【原出願日】平成１６年６月４日（２００４．６．４）
【出願人】（３９９０２５２８４）カンジ，インコーポレイテッド (21)
【Ｆターム（参考）】
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