エンドグルカナーゼＳＴＣＥおよびそれを含むセルラーゼ調製物
スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来の新規エンドグルカナーゼ、前記エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、及び前記エンドグルカナーゼを含むセルラーゼ調製物を開示する。
前記エンドグルカナーゼ又はセルラーゼ調製物は、セルロース含有繊維の色の澄明化、毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の局所的変化、ごわつきの低減などを目的とした洗剤用、並びに繊維加工用途に有用である。
前記エンドグルカナーゼ又はセルラーゼ調製物は、セルロース含有繊維の色の澄明化、毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の局所的変化、ごわつきの低減などを目的とした洗剤用、並びに繊維加工用途に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ（Endoglucanases STCE）及びそれを含むセルラーゼ調製物、並びにそれらを利用したセルロース含有繊維の処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、セルロース含有繊維を、その繊維に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、又は着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている［欧州特許第３０７，５６４号明細書（特許文献１）］。
【０００３】
また、着色されたセルロース含有繊維は繰り返し洗濯をすることによって毛羽が生じ、着色生地の色を不鮮明にすることが知られている。そこで、洗剤中にセルラーゼを含ませることによって、毛羽を除去する、もしくは毛羽が生じないようにすることによって着色生地の色を鮮明にする、すなわち澄明化することから［欧州特許第２２０，０１６号明細書（特許文献２）、国際公開第９５／０２６７５号パンフレット（特許文献３）、国際公開第９７／３０１４３号パンフレット（特許文献４）、国際公開第９８／０８９２６号パンフレット（特許文献５）］、セルラーゼを含んだ洗剤が欧米を中心に市販されている。
【０００４】
洗剤に用いられるセルラーゼとして、洗剤中において、フミコーラ（Humicola）属由来の精製された４３ｋＤエンドグルカナーゼ成分（ＥＧＶ）が従来の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物に対して約３０倍もの澄明化活性（生地に生ずる毛羽を取り、生地の色を鮮やかにする活性）があることが知られている［国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献６）］。また、フミコーラ属由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ５（以下「ＮＣＥ５」と略記することもある。）を洗剤中で反応させることによって、着色生地の澄明化をもたらすことが知られている［国際公開第０１／９０３７５号パンフレット（特許文献７）］。更には、洗剤中において、リゾプス（Rhizopus）属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ（以下「ＲＣＥＩ」と略記することもある。）をフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）にて増強発現させた培養液が、ＲＣＥＩを増強発現させていないフミコーラ・インソレンス培養液の２０倍以上もの澄明化活性があることが知られている［国際公開第００／２４８７９号パンフレット（特許文献８）］。
【０００５】
このように、様々なエンドグルカナーゼが着色生地の澄明化活性をもつことは知られているものの、実際に、欧米の洗剤に配合された場合、十分に活性を発揮できるエンドグルカナーゼは少ない。これは、欧米の洗剤に含まれている多量のアニオン界面活性剤やビルダーなどが活性を阻害するためと考えられる。
【０００６】
また、洗濯に用いられる欧米の水道水は一般的に硬度が高く、Ｃａ２＋やＭｇ２＋などの２価のカチオンが多量に含まれている。この２価のカチオンは洗剤中の界面活性剤による洗浄能力を著しく低下させるため、洗剤にはこの２価のカチオンを吸着させるためにビルダーが配合されている［“Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ”，１９９５年，１１巻，ｐ．３３−５５（非特許文献１）］。また、地域によって水道水の硬度はかなり違うため、洗剤に配合するビルダーの種類や添加量には地域別に工夫が凝らされている。また、洗剤による洗浄能力だけでなく、セルラーゼ活性もこれら２価のカチオンの影響を受ける事が知られている［Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．”２３，１９９８年，ｐ．１３３−１４０（非特許文献２）、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｃ．ＡＮＤ Ｓｕｂｅｒｋｒｏｐｐ，Ｋ．，“Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，３３巻第２号，１９９５年，ｐ．２４５−２５３（非特許文献３）］。従って、水の硬度によっては、セルラーゼ活性が阻害され、満足な澄明化効果が得られない問題や、反対に、セルラーゼ活性が増強され、生地の強度低下をおこす問題が発生する。
【０００７】
ビルダー自体がセルラーゼ活性に影響を与えるため、セルラーゼの澄明化活性に対して水の硬度が及ぼす影響を、ビルダーの添加によって緩和することは難しい。そこで、水道水の硬度の影響を受けにくく、安定した澄明化活性を有するセルラーゼが求められている。
【０００８】
従来、セルロース含有繊維の処理には、複数のセルラーゼ成分の混合物が使用されてきたが、その実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を得るには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。そこで多くの場合、セルラーゼ調製物は、多量の高活性エンドグルカナーゼを含む調製物として提供されている。その製造方法としては、遺伝子組換えの技術を用いて、目的の高活性エンドグルカナーゼ成分を宿主細胞において大量に発現させる方法が知られている［国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献６）、国際公開第９８／０３６６７号パンフレット（特許文献９）、国際公開第９８／１１２３９号パンフレット（特許文献１０）］。
【０００９】
そして、これらの方法において好ましい宿主細胞としては、不完全菌類に属する糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属の糸状菌などが挙げられている。更に、洗剤に用いるセルラーゼを生産させる場合、洗剤中のｐＨがアルカリ性であるため、酸性セルラーゼを生産するトリコデルマ属の糸状菌よりも、中性セルラーゼを生産するアスペルギルス属やフミコーラ属の糸状菌を宿主とする方が適している。特に、工業レベルでの酵素の生産を考慮した場合、生産性の高いフミコーラ属の菌は極めて優良な宿主となる［国際公開第０１／９０３７５号パンフレット（特許文献７）、国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献１１）］。
【００１０】
しかしながら、異種由来の遺伝子を、フミコーラ属の糸状菌において発現させる際、その塩基配列上の特性が異なる（遺伝子のコドン使用頻度が違う）などの理由で、発現が妨げられる場合が多い。そのため、異種由来の遺伝子に対して改変操作を行うことが必要となる。例えば、接合菌類に属するリゾプス属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩをフミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させるためには、ＲＣＥＩをコードする遺伝子を宿主細胞のコドン使用頻度に合わせて最適化しなければならない［国際公開第００／２４８７９号パンフレット（特許文献８）］。しかし、このように最適化されたとしても、通常、同種遺伝子の発現量と同程度の発現量を得ることは難しいことが予想されている。また、実際に発現し、宿主により生産されてきた目的の酵素が、培養中に培養液中のプロテアーゼなどによる分解を受け、分解物もしくは部分分解物として得られてくる場合も予想される。
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第３０７，５６４号明細書
【特許文献２】欧州特許第２２０，０１６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／０２６７５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９７／３０１４３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９８／０８９２６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／９０３７５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第００／２４８７９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９８／０３６６７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９８／１１２３９号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９８／０３６４０号パンフレット
【非特許文献１】“Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ”，１９９５年，１１巻，ｐ．３３−５５
【非特許文献２】Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．”２３，１９９８年，ｐ．１３３−１４０
【非特許文献３】Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｃ．ＡＮＤ Ｓｕｂｅｒｋｒｏｐｐ，Ｋ．，“Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，３３巻第２号，１９９５年，ｐ．２４５−２５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これまでに、繊維用・洗剤用途に使用するために、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、リゾプス（Rhizopus）属、ムコール（Mucor）属、ファイコマイセス（Phycomyces）属などの様々な糸状菌からセルラーゼが単離され、それらセルラーゼをコードする遺伝子が単離されている。しかしながら、アニオン界面活性剤及びビルダーを多量に含有する欧米タイプの洗剤中において高い澄明化活性を有し、なおかつ、水道水の硬度の影響を受けにくく、安定した澄明化活性を有するセルラーゼはいまだ報告されていない。
【００１３】
更に、優良な宿主であるフミコーラ属の糸状菌において、遺伝子改変操作なしで大量に発現させることができるような異種糸状菌由来のセルラーゼ遺伝子があれば、その産業上の価値は計り知れないが、まだそのような遺伝子の報告もない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、今般、セルラーゼ酵素やセルラーゼ遺伝子を単離した報告は全くされていなかったスタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物から、新規な高いエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及びその遺伝子を見出し、これらを提供するものである。
【００１５】
本発明者は、本発明のスタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物から単離された新規な高いエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、欧米の洗剤中において、セルロース含有着色生地に対して極めて強い澄明化活性を示すことを見出した。例えば、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来の本発明のエンドグルカナーゼ、特にその一例であるエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１（以下「ＳＴＣＥ１」と略記することもある）は、代表的なヨーロッパ洗剤中において、洗剤用セルラーゼとして澄明化活性を有することが知られているエンドグルカナーゼＮＣＥ５（以下「ＮＣＥ５」と略記することもある）（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）に比べて約１６倍、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）に比べて約８０倍以上もの高い澄明化活性を有していた。
【００１６】
更に、そのエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、水道水の硬度によらず、安定した澄明化活性を有するという驚くべき知見を得た。例えば、セルロース含有繊維に対して高い毛羽除去活性を有することが知られているエンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）やＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）は、水道水中の硬度が上がると澄明化活性が上がるのに対して、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）は、水道水中の硬度が上がると澄明化活性が下がる。しかしながら、本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、水道水の硬度によらず、安定した澄明化活性を有していた。このように、欧米の洗剤中において高い澄明化活性を有し、しかも、水道水の硬度によらず、安定した活性を有するセルラーゼに関する知見は今までに全くない。
【００１７】
更に驚くべきことに、スタフィロトリクム・ココスポラム由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、スタフィロトリクム・ココスポラムとは異種菌株であるフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）を宿主として用いた形質転換において、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１遺伝子の改変操作を全く行わないで大量発現することを見出した。
【００１８】
従って、本発明は、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来のエンドグルカナーゼ活性を有する新規なタンパク質及びその遺伝子、並びに前記タンパク質を含有し、良好な特性を有するセルラーゼ調製物を提供するものである。また、本発明は、前記タンパク質をコードする遺伝子によって形質転換された宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養して目的タンパク質を採取する方法を提供するものである。更に、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する方法を提供するものである。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来であって、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する、（１）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列である。
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、（２）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した平均分子量が４９ｋＤである。
（４）以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、（２）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した平均分子量が４５ｋＤである。
（５）スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（６）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含む、タンパク質、
（ｂ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
（７）（１）〜（６）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（８）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（９）（７）又は（８）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１０）（９）に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１１）宿主が酵母又は糸状菌である、（１０）に記載の宿主細胞。
（１２）酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属又はピキア（Pichia）属に属する微生物である、（１１）に記載の宿主細胞。
（１３）糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、又はアクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物である、（１１）に記載の宿主細胞。
（１４）糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）である、（１３）に記載の宿主細胞。
（１５）（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から（１）〜（６）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（１６）（１５）に記載の方法で生産されたタンパク質。
（１７）（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
（１８）（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
（１９）セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２０）セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２１）セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２２）着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２３）着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２４）セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２５）繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、（１９）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法。
（２６）古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
（２７）紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
（２８）動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のタンパク質、特にはエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、セルロース含有繊維の色の澄明化、毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の局所的変化、ごわつきの低減などを目的とした洗剤用、並びに繊維加工用途に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、前記酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。また、本明細書の「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。更に、「ＣＭＣアーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
【００２２】
エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍＬを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍＬ中にＤＮＳ試薬３．０ｍＬを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍＬで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。なお、ＤＮＳ試薬は文献（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、ｐ．１９〜２０、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することができるが、例えば、次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍＬ、及びロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１．０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍＬに結晶フェノール１０ｇを加え、更に水を加えて溶解して１００ｍＬとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍＬに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
【００２３】
本発明によるタンパク質は、糸状菌類、具体的には、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物、好ましくは、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）、より好ましくはスタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum
coccosporum）ＩＦＯ ３１８１７株から取得することができる。また、これらはその変異株であってもよい。
【００２４】
更に、本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有する。Ｎ末端のアミノ酸配列は、例えば後述の実施例２で示した方法により決定することができる。
【００２５】
本発明によれば、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が４９ｋＤである。
【００２６】
更に、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が４５ｋＤである。
ここで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる平均分子量は、実施例１に示した方法によって決定することができる。
【００２７】
本発明の別の態様では、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにその改変タンパク質又はその相同タンパク質が提供される。
【００２８】
「配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質」には、例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表わされるアミノ酸配列にシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに配列番号３で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
シグナルペプチドは、例えば、配列番号２で表わされる塩基配列において、１〜３位のＡＴＧで始まり、６１〜６３位で終了するヌクレオチド配列からコードされる２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号３３）である。前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製などを容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
【００２９】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個（好ましくは、１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「欠失、置換、挿入、又は付加」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜６個である。また、改変を行うアミノ酸は、エンドクルカナーゼ活性を維持又は向上させることができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、触媒領域、リンカー領域、又はセルロース結合領域に含まれるアミノ酸を改変することができる。
【００３０】
更に、改変タンパク質には、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個又は複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。
このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３１】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値（同一性；identity）を示す。
【００３２】
本発明のタンパク質の具体例として、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１又はエンドグルカナーゼＳＴＣＥ３が挙げられる。本発明では、これらを総称して、「エンドグルカナーゼＳＴＣＥ」とする。
【００３３】
本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥは、後述の実施例２に示すように、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼである。ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼとしては、例えば、フミコーラ属由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）若しくはＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、又はリゾプス（Rhizopus）属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）を挙げることができる。
【００３４】
図１及び図２に、本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号３３）及び成熟タンパク質（配列番号３）］と、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号３４）及び成熟タンパク質（配列番号３５）］及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号３６）及び成熟タンパク質（配列番号３７）］の各アミノ酸配列とを比較した結果を示す。
図１は前半部（Ｎ末端側）の結果を示し、図２は後半部（Ｃ末端側）の結果を示す。図１及び図２において、記号「＊」は、ＳＴＣＥ１と共通するアミノ酸であることを示す。
【００３５】
図１及び図２に示すとおり、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼは、共通するドメインとして触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）（１番〜２０７番）を有し、場合により、更に、リンカー領域（Ｌｉｎｋｅｒ）（２０８番〜２５８番）及び／又はセルロース結合領域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＣＢＤ）（２５９番〜２９５番）を有することがある。なお、各ドメインの後の括弧内に示す番号は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列（配列番号３）におけるアミノ酸番号である。
【００３６】
前記各領域の内、触媒領域及びセルロース結合領域では、各エンドグルカナーゼ間で多くの保存アミノ酸が認められるのに対して、リンカー領域では顕著な保存領域は認められない。保存アミノ酸を多く含む領域（例えば、触媒領域又はセルロース結合領域、特には触媒領域）、あるいは、その領域に含まれる共通アミノ酸は、本発明のエンドグルカナーゼ（例えば、ＳＴＣＥ１）の酵素活性に重要な領域又はアミノ酸と考えられるため、それ以外の領域又はアミノ酸においてアミノ酸改変（例えば、欠失、置換、挿入、及び／又は付加、特には保存的置換）を行うことにより、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。
【００３７】
また、保存アミノ酸を多く含む領域であっても、各エンドグルカナーゼ間で非共通のアミノ酸は、別のアミノ酸（好ましくは、保存的置換可能な類似アミノ酸）に改変してもその酵素活性を維持する可能性が高く、このようなアミノ酸改変を行うことによっても、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。
なお、保存アミノ酸を多く含む領域における共通アミノ酸であっても、別のアミノ酸に改変してもその酵素活性が維持されることがあり、特に保存的置換可能な類似アミノ酸に改変した場合、その可能性は高くなる。本発明の改変タンパク質又は相同タンパク質には、エンドグルカナーゼ活性を有する（すなわち、改変前のエンドグルカナーゼ活性が維持又は向上される）限り、任意の領域、例えば、触媒領域、リンカー領域、又はセルロース結合領域に含まれるアミノ酸を改変したタンパク質が含まれる。
【００３８】
本発明のタンパク質は、例えば実施例１に記載のように微生物から単離、精製することにより得ることができる。また、後述のように遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離、精製することによっても得ることができる。
【００３９】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、その改変タンパク質、及び相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４１】
配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、更に好ましくは１〜９個である。
【００４２】
ここで、前記（iii）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、エンドグルカナーゼＮＣＥ５遺伝子（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。
【００４３】
より具体的には、例えば、プローブとして標識化したエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、前記プローブを添加し、４２℃で１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．４倍以下の濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度のＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノミックライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００４５】
本発明による、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列をコードする、典型的塩基配列は、配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を有するものである。配列番号２で表わされる塩基配列は、１〜３位のＡＴＧで始まり、９４９〜９５１位のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６４〜６６のヌクレオチド配列は、２９５アミノ酸残基からなるエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００４６】
発現ベクター及び形質転換された微生物
本発明においては、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、その改変タンパク質及び相同タンパク質をコードする塩基配列（以下「本発明によるポリヌクレオチド」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４７】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチドの他に、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカーなどを含んでいるのが望ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードする塩基配列などがこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導される塩基配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００４８】
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００４９】
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その宿主細胞又は培養物から前記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００５０】
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列によってコードされる、エンドグルカナーゼを発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、又はピキア（Pichia）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【００５１】
また、本発明における新規タンパク質の最も好適な製造方法として、不完全菌類に属する糸状菌における発現方法が提供される。本発明における好適な宿主糸状菌として、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属又はアクレモニウム（Acremonium）属に属するものが挙げられるが、より好ましくは、フミコーラ（Humicola）属、又はトリコデルマ（Trichoderma）属が挙げられる。より具体的には、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・サーモイデア（Humicola
thermoidea）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma
reesei）、トリコデルマ・ロンジブラシアトウム（Trichoderma longibrachiatum）、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum
coccosporum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
oryzae）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、又はアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium
cellulolyticus）が挙げられるが、更により好ましくは、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）が挙げられる。
【００５２】
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のタンパク質（例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、又はその改変タンパク質若しくは相同タンパク質、あるいは、本発明の宿主細胞を培養することにより得られるタンパク質）を含むセルラーゼ調製物にも関する。
【００５３】
一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素の他に、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトールなど）、防腐剤、及び／又は非イオン系界面活性剤などを含有させることができる。また、セルラーゼ調製物の形態は、固形状であっても液体状であってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げられる。本発明のセルラーゼ調製物には、本発明のタンパク質に加えて、他のセルラーゼ酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、及び／又は本発明のエンドグルカナーゼ以外のエンドグルカナーゼを含めてもよい。
【００５４】
セルラーゼ調製物の１種である非粉塵化顆粒（好ましくは、飛散性のない顆粒状）は、通常の乾式造粒法を用いて製造することが可能である。すなわち、粉末状態の本発明のタンパク質を、中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩（例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム）、エンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物（例えば、ベントナイト、モンモリナイト）、及び中性の有機物（例えば、澱粉又は粒状セルロースなど）などから選ばれる１種又は複数種に混合した後、非イオン界面活性剤の１種又は複数種の粉末、あるいは微細に懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は混練する。状況に応じ、固形物を結着させる合成高分子（例えば、ポリエチレングリコールなど）又は天然高分子（例えば、スターチなど）を適宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。また、顆粒表面をポリマーなどでコーティングすることにより、酸素透過や水分透過をコントロールすることも可能である。
【００５５】
一方、セルラーゼ調製物の１種である液状製剤（好ましくは、安定化された液体状）は、本発明のタンパク質を含む溶液に、エンドグルカナーゼの安定化剤（例えば、合成高分子、天然高分子など）を配合し、必要に応じて無機塩類及び／又は合成防腐剤を添加して調製することが可能である。このとき、非イオン界面活性剤の１種又は複数種を配合することも可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。
【００５６】
更に、本発明は、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物を提供する。本発明の洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラ−ゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、及び／又は発泡促進剤などをも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキル硫酸塩（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＭｅ）、及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などがある。ノニオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロース、及びグルコースの脂肪酸エステル、並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステルなどがある。
【００５７】
本発明のセルロース含有繊維の処理方法は、本発明のタンパク質、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を、セルロース含有繊維と接触させることにより行う。本発明の繊維処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、以下のものが含まれる。
（１）毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、毛羽立ちの低減）
（２）減量による繊維の肌触り及び外観の改善
（３）着色セルロース含有繊維の色の澄明化
（４）着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与
（５）柔軟化（ごわつき始める速度の低減、ごわつきの低減）
本発明の繊維処理方法は、具体的には、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のタンパク質、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を添加することにより行うことができ、例えば、繊維の浸漬工程、洗濯工程、又はすすぎ工程で行うことができる。
【００５８】
接触温度、又は本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、若しくは洗剤組成物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００５９】
更に、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．１〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６０】
また、着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化することを目的とした場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６１】
また、着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供するために用いる場合、２０〜６０℃程度の温度で、０．１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６２】
また、上記の方法は、セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減させる場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６３】
更に、本発明は、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法に関する。
【００６４】
本発明のタンパク質又はセルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱インキの効率を向上させるため、古紙から再生紙を製造する過程において有用である。上記脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大幅に減少するため、古紙の白色度を向上させることができる。
【００６５】
上記脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品であればよく、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、又はオレイン酸などの補集材などが挙げられ、助剤として、ｐＨ安定剤、キレート剤、又は分散剤などが挙げられる。
【００６６】
上記脱インキ方法を適用し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるものであればよく、特に限定されないが、例えば、機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙などの印刷古紙が挙げられる。更に、一般に古紙と呼ばれるもの以外であっても、インクの付着している紙であれば、上記脱インキ方法を適用することができる。
【００６７】
更に、本発明は、紙パルプのろ水性の改善方法に関し、前記方法は、紙パルプを、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
【００６８】
前記方法によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、有意に改善されるものと考えられる。前記方法を適用し得るパルプは特に限定されないが、例えば、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、加工熱処理その他の高収率パルプなどが挙げられる。
【００６９】
更に、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
【００７０】
前記方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
【００７１】
更に、本発明によるタンパク質を動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。従って、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のタンパク質又はセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む方法が提供される。
【００７２】
微生物の寄託
本発明によるエンドグルカナーゼＳＴＣＥの由来であるスタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）ＩＦＯ ３１８１７株は、１９８５年に財団法人 醗酵研究所に国内寄託されたものであり、国内受託番号は、ＩＦＯ ３１８１７である。また、２００４年（平成１６年）９月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、国際受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３５である。更に、ＩＦＯ ３１８１７株は現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８かずさアカデミアパーク内）にＮＢＲＣ ３１８１７として受託されている。同菌株が第三者に公開され、分譲可能な状態にあることは、同本部から交付された証明書［平成１５年（２００３年）１１月１９日付］によって明らかとなっている。
【００７３】
プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にＳＴＣＥ１遺伝子を挿入したプラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘで形質転換された本発明の大腸菌（Esherichia coli）ＤＨ５α／ｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ株は、２００３年（平成１５年）１２月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、２００４年（平成１６年）９月１５日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２７［ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０２］である。
【００７４】
本発明の発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）ＭＮ２００−１株は、１９９６年（平成８年）７月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７［ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６］である。
【００７５】
本発明の発現ベクターの宿主となりうるトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）ＭＣ３００−１株は、１９９６年（平成８年）９月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）８月１１日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０４７［ＦＥＲＭ Ｐ−１５８４２］である。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例をもって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７７】
《実施例１：スタフィロトリクム・ココスポラムからの脱脂綿フィブリル遊離活性を有する成分の単離精製》
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を、（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）中、２８℃で振とう培養した。１０日間培養の後、菌体を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液を最終濃度１．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム液で平衡化させたＨｉＴｒａｐＴＭＰｈｅｎｙｌＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度が１．５ｍｏｌ／Ｌ、０．９ｍｏｌ／Ｌ、０．７５ｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ、０ｍｏｌ／Ｌのステップワイズ溶離法により溶出して、分画した。このうち硫酸アンモニウム濃度が０．７５ｍｏｌ／Ｌと０ｍｏｌ／Ｌのときに溶出した画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。
【００７８】
次に、硫酸アンモニウム０ｍｏｌ／Ｌ溶出画分をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）となるよう調整し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ ５／５ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムに対して、リニアグラジェント溶離法で溶出し、分画した。その結果、塩化ナトリウム濃度が約０．０５ｍｏｌ／Ｌのときに得られた画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。この画分をＳＴＣＥ１として単離した。
【００７９】
また、硫酸アンモニウム０．７５ｍｏｌ／Ｌ溶出画分も同様にウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）となるよう調整し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ ５／５ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムに対して、リニアグラジェント溶離法で溶出し、分画した。その結果、塩化ナトリウム濃度が約０．０５ｍｏｌ／Ｌのときに得られた画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。この画分をＳＴＣＥ３として単離した。これらＳＴＣＥ１画分、ＳＴＣＥ３画分は、前記カラムによる分画精製操作を何回も繰り返すことによって、大量の精製サンプルを取得した。
【００８０】
このＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて各々単一なバンドを示し、その平均分子量（ＭＷ）は順に約４９ｋＤ及び約４５ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、セイフティーセルミニＳＴＣ−８０８電気泳動槽（テフコ社製）及びプリキャストミニゲル １０％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、１．０ｍｍゲル厚（テフコ社製）を使用し、泳動及び染色は製品取扱い説明書の方法に従った。分子量マーカーはプレシジョンプロテインスタンダード（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。また、ＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分はいずれもＣＭＣアーゼ活性を有していた。
【００８１】
脱脂綿フィブリル遊離活性はＮｅｅｎａ Ｄｉｎらによる方法（Ｎｅｅｎａ Ｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，９（１９９１），ｐ．１０９６−１０９９）を改良した方法で行った。すなわち、洗濯堅牢度試験機を用いて以下の条件で反応させた場合の脱脂綿から遊離される毛羽の量を６００ｎｍ吸光度にて測定した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度 ：４０℃
時間 ：１２０分
反応ｐＨ：ｐＨ７（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液には、分画液とともにステンレスビーズと脱脂綿を適当量加えた。
【００８２】
《実施例２：スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の部分アミノ酸配列の決定》
（１）ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３のＮ末端アミノ酸配列の同定
実施例１において得られたＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜プロブロットＴＭ（アプライドバイオシステムズ社製）に電気的に写し取った。そしてＣＢＢ染色液（０．１％クマシーブルーＧ２５０、３０％メタノール、１０％酢酸）で染色した後、脱色し、風乾した。この膜からＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分に該当する分子量約４９ｋＤ及び約４５ｋＤのタンパク質（ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３）がブロットされた部分をそれぞれ切り出し、極少量のメタノールで湿らせ、還元用緩衝液（８ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩、０．５ｍｏｌ／Ｌトリス、０．３％ＥＤＴＡ−２ナトリウム、５％アセトニトリル）でこの膜片を軽く洗浄し、それぞれの膜片をマイクロチューブ中で１００μＬ程度の還元用緩衝液に浸漬した。そこに１ｍｇのジチオスレイトールを添加し、窒素封入して密閉し、１時間以上静置した。更に４−ビニルピリジン（アルドリッチ社製）１．５μＬを加え、遮光し、時々撹拌しながら２０分以上置いてタンパク質のシステイン残基のピリジルエチル化を行った。その後、蒸留水、２％アセトニトリル水の順でＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３の膜片を洗浄し、プロテインシークエンサーＰｒｏｃｉｓｅ４９１（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、それぞれＮ末端アミノ酸配列を２５残基決定した。ＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３のＮ末端２５残基のアミノ酸配列は同じであり、得られた配列は以下の通りであった。
ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３のＮ末端アミノ酸配列：Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn（２５残基）（配列番号１）
【００８３】
（２）ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の内部アミノ酸の同定
実施例１において得られたＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。凍結乾燥したＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３約４０μｇを１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに入れ、５００μＬの還元用緩衝液を添加して溶解した。そこに１．４ｍｇのジチオスレイトールを添加し、窒素封入して密閉し、５時間静置した。更にモノヨード酢酸２．７ｍｇを添加し、遮光して３０分静置してタンパク質のシステイン残基のカルボキシメチル化を行った。その後、ウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩濃縮した。この還元カルボキシメチル化したＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３それぞれ約１０μｇに対し、約１／１００モル量のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）５０μＬ中で、３７℃で７２時間反応させた。この消化液を１７３Ａマイクロブロッターシステム（アプライドバイオシステムズ社製）に供したところ、ＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３それぞれ７種のペプチドが分離され、ＰＶＤＦ［ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）］膜にブロットされた。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシークエンサーにより決定した。
【００８４】
その結果、ＳＴＣＥ１の内部アミノ酸配列は以下に示される通りであった。
LE-1：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys（８残基）（配列番号４）
LE-2：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys（９残基）（配列番号５）
LE-3：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg（１０残基）（配列番号６）
LE-4：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys（１０残基）（配列番号７）
LE-5：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe（７残基）（配列番号８）
LE-6：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr（７残基）（配列番号９）
LE-7：Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu（９残基）（配列番号１０）
これらＮ末端アミノ酸配列及びペプチドマッピングによって得られた内部アミノ酸配列の相同性検索から、ＳＴＣＥ１はファミリー４５に属する新規なエンドグルカナーゼであることが示唆された。
【００８５】
一方、ＳＴＣＥ３の内部アミノ酸配列は以下に示される通りであった。
LE-8：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys（８残基）（配列番号１１）
LE-9：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys（９残基）（配列番号１２）
LE-10：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg（１０残基）（配列番号１３）
LE-11：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg（１６残基）（配列番号１４）
LE-12：Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-Ala-Val-Asn-Asp-Asn（２２残基）（配列番号１５）
LE-13：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys（１１残基）（配列番号１６）
LE-14：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn（１６残基）（配列番号１７）
これらＮ末端アミノ酸配列及びペプチドマッピングによって得られた内部アミノ酸配列の相同性検索から、ＳＴＣＥ３もファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであると思われた。しかしながら、ＳＴＣＥ１とＳＴＣＥ３の対応する内部アミノ酸配列が完全に一致したため、ＳＴＣＥ３はＳＴＣＥ１から生じた部分分解物である可能性が示唆された。
【００８６】
《実施例３：精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるセルロース含有繊維の毛羽除去活性の評価》
実施例１で得られた粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１を用いて、綿ニット生地に対する毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された青色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた青色綿ニット生地を下記の条件で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ５０％除去されるのに要する粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のタンパク質濃度を算出した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ６（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第１表に示した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
《実施例４：精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるインデイゴ染めセルロース含有繊維の脱色活性の評価》
実施例１で得られた粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１を用いて、糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理した。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製 全自動洗濯機 ＳＣＷ５１０１）
温度：５５℃
時間：６０分
反応ｐＨ：ｐＨ６．２（６．７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液量：１５Ｌ
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製、ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝５となるのに必要な粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第２表に示した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
《実施例５：洗剤として配合した場合の精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５、及びＲＣＥＩの毛羽除去活性（澄明化活性）の比較評価》
実施例１で得られた精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、フミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させたものから単一に精製されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩ［セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ）（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）］を用いて、欧米の洗剤中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性（澄明化活性）を以下のように評価した。
予め染色された青色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた青色綿ニット生地を下記の条件において洗剤中で処理することにより、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５、及びＲＣＥＩのタンパク質濃度を算出した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．８％
処理液：人工硬度水（２５ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第３表に示した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
《実施例６：水道水中の硬度が各種精製エンドグルカナーゼの毛羽除去活性に与える影響》
実施例１で得られた精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、フミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させたものから単一に精製されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩ［セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ）（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）］を用いて、人工硬度水中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を、各種硬度（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ）の人工硬度水中において、４種の精製エンドグルカナーゼ溶液を用いて、下記の条件下で処理をした。処理後の生地において、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ５、ＮＣＥ４、ＲＣＥＩのタンパク質濃度を算出し、そのタンパク質濃度の逆数値を毛羽除去活性値とした。そして、０ＦＨの硬度における毛羽除去活性値を１００としたときの、各硬度での毛羽除去活性相対値を求めた。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：１００ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ６（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液：人工硬度水（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第４表に示した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
《実施例７：エンドグルカナーゼＳＴＣＥ遺伝子のクローニング》
実施例２で明らかにしたＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の内部及びＮ末端アミノ酸配列は、同じファミリー４５であるフミコーラ・インソレンス由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）のアミノ酸配列と相同性を有していた。そこで、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ中のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ遺伝子を検索するために、ＮＣＥ５遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションによる解析を行い、更にその相同性遺伝子を単離した。
【００９５】
（１）スタフィロトリクム・ココスポラム由来のゲノムＤＮＡの単離
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）で２８℃、７２時間培養し、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体を凍結乾燥し、ブレンダーにて細かく破砕した後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）緩衝液８ｍＬに溶解した。これに１０％ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液４ｍＬを加え、６０℃、３０分間保温した。その後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を１２ｍＬ加え、激しく振とうした。遠心後、水層を別の容器に移し、これに１ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを加え、氷中に１時間以上放置した。遠心後、水層を別の容器に移し、２．５容量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を乾燥させた後、５ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）溶液を５μＬ加え、３７℃で１時間保温し、更に２０ｍｇ／ｍＬプロティナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）溶液５０μＬを加え、３７℃で１時間保温した。その後、３ｍＬのポリエチレングリコール溶液（２０％ＰＥＧ６０００、２．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を５００μＬのＴＥ緩衝液に溶解し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出を２回行い、エタノール沈殿をした。沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ試料とした。
【００９６】
（２）サザンハイブリダイゼーションによるＮＣＥ５相同性遺伝子の検索
実施例７（１）で得られたスタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ約１０μｇを、複数の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩなど）で各々切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これをナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン、アマシャム社製）に移しとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでＤＮＡを固定し、５倍濃度ＳＳＣ（７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、７５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させ、ＤＮＡを固定した。
プローブは、ＮＣＥ５遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＪＮＤ−ｃ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）をＢａｍＨＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を回収することにより得た。これをＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）により標識化した。前述キット添付の説明書記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを固定したナイロンメンブランを４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションをした後、標識化したＮＣＥ５プローブを添加し、４２℃で１５時間、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のナイロンメンブランの洗浄は前述キット添付の説明書記載の方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６ｍｏｌ／Ｌ尿素を添加した０．６倍濃度ＳＳＣ（９ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、９０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を２回行った。洗浄処理を施したナイロンメンブランを、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させた。
その結果、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩで切断した場合、それぞれ大きさの異なる２本のバンドにハイブリダイズし、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ上には、ＮＣＥ５と相同性を有する２種類の遺伝子が存在することが推察された。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合のハイブリダイゼーションにおいては、約１０ｋｂｐと約５ｋｂｐの２本のバンドが検出された。そこで、約１０ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子のクローニングを行った。
【００９７】
（３）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、ＳｅａＫｅｍＬＥアガロース（ＦＭＣ社製）を用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。１０ｋｂｐ付近を含むよう、約８〜１２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従って抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ ベクター（ストラタジーン社製）に連結した。これをエタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液に溶解し、この全量をギガパックＩＩＩゴールドパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた５×１０４個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。
【００９８】
（４）プラークハイブリダイゼーションによるＮＣＥ５相同遺伝子のスクリーニング
次に、実施例７（３）に従って得られたゲノムＤＮＡライブラリー（ＥｃｏＲＩ ライブラリー）をナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン、アマシャム社製）に移しとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでＤＮＡを固定し、５倍濃度ＳＳＣで洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットの方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、実施例７（２）で標識化したＮＣＥ５遺伝子のプローブを添加し、４２℃で１５時間、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のナイロンメンブランの洗浄は前述キット添付の説明書の方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６ｍｏｌ／Ｌ尿素を添加した０．６倍濃度ＳＳＣで４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を２回行った。洗浄処理を施したナイロンメンブランを、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、４個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ株にファージを感染させ、１８時間後にファージ粒子を集めた。これら粒子を、Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．”，１５，６７３７，１９８７）に準じてプロテイナーゼＫ及びフェノール処理を行った後、エタノール沈殿により、ファージＤＮＡを分離した。
【００９９】
（５）ＮＣＥ５相同遺伝子のサブクローニング
４種のファージＤＮＡを複数の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，９８，ｐ．５０３−５１７，１９７５）によりナイロンメンブランに移しとり、実施例７（４）と同様にハイブリダイゼーションを行った。その結果、４種のファージＤＮＡは、複数の制限酵素の切断によっても共通のハイブリダイゼーションのパターンを示した。また、４種のファージＤＮＡをＳａｌＩで切断し、実施例７（４）と同様にハイブリダイゼーションを行った場合、共通して約４．４ｋｂｐのバンドに強いシグナル、及び約２．５ｋｂｐのバンドに弱いシグナルを示した。そのことから、この相同遺伝子はこの約４．４ｋｂｐと約２．５ｋｂｐのＤＮＡにまたがって存在していると考え、この２つの大きさのＤＮＡを回収し、プラスミドｐＵＣ１１９のＳａｌＩサイトにそれぞれサブクローニングを行った。約４．４ｋｂｐのＤＮＡをサブクローニングして得られたプラスミドをｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ４．４、約２．５ｋｂｐのＤＮＡをサブクローニングして得られたプラスミドをｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ２．５とした。
【０１００】
《実施例８：ＮＣＥ５相同遺伝子の塩基配列の決定》
実施例７（５）にてサブクローニングしたＮＣＥ５相同遺伝子の塩基配列解析は以下の様に進めた。
塩基配列解析装置は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーＩＩ（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲルは、ハイドロリンクロングレンジャー（ＦＭＣ社製）として入手可能なアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、尿素、及び過硫酸アンモニウム）はＡ．Ｌ．Ｆ．グレードの試薬（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作製条件、反応条件及び泳動条件の各々は、キットに添付の各説明書を参照し、設定した。
このようにしてプラスミドｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ４．４内の約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片とプラスミドｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ２．５内の約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従い、決定した。更に、解読された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が実施例２で示されたＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列、及び内部アミノ酸配列と完全に一致した。これらの結果から、このＮＣＥ５相同遺伝子がＳＴＣＥ１をコードする遺伝子であることが示唆された。従って、以降においてはこのＮＣＥ５相同遺伝子をＳＴＣＥ１遺伝子として記載する。また、このゲノムＤＮＡから翻訳されたＳＴＣＥ１アミノ酸配列から、ＳＴＣＥ１は、Ｎ末端側に触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、Ｃ末端側にセルロース結合領域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を有するファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであることが判明した。しかしながら、このＤＮＡ配列にはイントロンと考えられる領域が含まれていることが推察されたため、ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離を行うこととした。
【０１０１】
《実施例９：ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離と塩基配列決定》
（１）スタフィロトリクム・ココスポラムからのｍＲＮＡの単離
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を３０ｍＬの（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）で２８℃、７２時間培養し、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体を凍結乾燥し、スパーテルにて細かく破砕した。全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（和光純薬工業社製）を用いて単離した。
まず、菌体粉末にＩｓｏｇｅｎ ５ｍＬを入れ、３０秒間Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーで攪拌した後、５０℃で１０分間保温した。その後、室温で５分間放置した。次に、０．８ｍＬのクロロホルムを加えて、激しく振とうした。遠心分離後、水層を別の容器に移し、これに２ｍＬの４ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウムを加えて混合し、−７０℃で１５分放置した。その後、遠心分離し、上清液を除いた後、沈殿物を１．６ｍＬの水で溶解し、次に１．６ｍＬのイソプロパノールを加えて混合し、４℃で３０分放置した。遠心分離後、上清液を除き、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、沈殿物を１．６ｍＬの水で溶解した。この液をエタノール沈殿し、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、０．４ｍＬの水に溶解し、これを全ＲＮＡとした。
次に、ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡアイソレ−ションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。まず前記で調製した０．２ｍＬの全ＲＮＡに１０ｍＬのエリューションバッファーを加え、更に５ｍＬのオリゴｄＴ溶液を加えた。上清液を除いた後、このオリゴｄＴをハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで２回洗浄した後、６８℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。この溶液をエタノール沈殿し、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、１５μＬの水に溶解し、これをｍＲＮＡ画分とした。
【０１０２】
（２）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡからのＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの調製は、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を用い実施した。Ｎ末端側のプライマー配列は、ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列と実施例８で解析したゲノム配列から翻訳されるアミノ酸を考慮して決定し、Ｃ末端側のプライマー配列は、良く保存されているセルロース結合領域の情報（Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ａｎｎｎａ−Ｍａｒｊａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８，ｐ．４４３−４５０，１９９５）と実施例８で解析したゲノム配列から翻訳されるアミノ酸を考慮して決定した。すなわち、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、前記のように調製したｍＲＮＡのうち１μＬを鋳型とし、ＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。
STCE1-CN: 5'-GCGGATCCATGCGTTCCTCCCCCGTC-3'（26mer）（配列番号１８）
STCE1-CC: 5'-GCGGATCCTTAAAGGCACTGCGAGTACC-3'（28mer）（配列番号１９）
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、Ｃ末端のプライマーを加えて、逆転写酵素によって、反応させた後、Ｔａｑポリメラーゼ（リコンビナントＴａｑ 、宝酒造社製）、Ｎ末端のプライマーを加え、９４℃・１分間、５０℃・２分間、７２℃・２分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、約１ｋｂｐの１断片であった。これをｐＵＣ１８にサブクローニング（プラスミドｐＵＣ−ＳＴＣＥ１）した。
【０１０３】
（３）ＳＴＣＥ１遺伝子の塩基配列の決定
前記断片の塩基配列を実施例８の方法に従い決定した。更に、この塩基配列とゲノムの塩基配列を比較し、イントロンを決定した。この解析の結果、スタフィロトリクム・ココスポラム由来のＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した（配列番号２）。
得られたＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの配列情報をもとに、イントロンを含んだ状態のＳＴＣＥ１遺伝子翻訳領域を含むＤＮＡ断片の単離を行った。実施例７（５）で用いた４種のファージＤＮＡを混合したものを鋳型に、プライマーＳＴＣＥ−ＨＮＢａｍ及びＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍを用いてＰＣＲを行った。増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩにて切断後、再度アガロース電気泳動による分離精製を行った。
STCE-HNBam:
5'-GGG GGA TCC TGG GAC AAG ATG CGT TCC TCC CCC GTC CTC-3'（39mer）（配列番号２０）
STCE-HCBam:
5'-GGG GGA TCC GCT CAA AGG CAC TGC GAG TAC CAG TC-3'（35mer）（配列番号２１）
プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位に、約１．１ｋｂｐの前記断片を挿入し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０２）を得た。更に、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、ＳＴＣＥ１遺伝子のイントロン及び翻訳領域の配列（配列番号２２）を確認した。なお、ＰＣＲの際に、プライマーＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍを使用することで、終止コドンの配列が、ＴＡＡからＴＧＡに変わっているが、生成してくるタンパク質のアミノ酸配列に変化はない。
【０１０４】
《実施例１０：ＳＴＣＥ１遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現》
フミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７）における発現ベクターｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１は、発現したタンパク質がＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基とＳＴＣＥ１の残りのアミノ酸残基を融合するように作製した。すなわち、プラスミドｐＪＤ０１（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）のＢａｍＨＩ部位に、ＮＣＥ４遺伝子（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を連結したプラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４を利用して構築した。
この理由として、ＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基は、ＳＴＣＥ１のＮ末端１６アミノ酸残基と一致しているため、ＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基とＳＴＣＥ１の残りのアミノ酸残基を融合させても、発現させたタンパク質はＳＴＣＥ１と同一のものが得られるためである。
なお、プラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４は以下のように作製した。まず、ＮＣＥ４遺伝子（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を、プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に連結できるように、開始コドンのすぐ上流の配列と終止コドンのすぐ下流にＢａｍＨＩサイトを含む形で下記プライマーを設計し、国際公開第０１／９０３７５号パンフレットの実施例４（１）1)記載の方法に従って、プラスミドｐＣＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を鋳型に、ＰＣＲ法にて変異を導入し、増幅した。
NCE4-N-BamHI：
5'-GGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCC-3'（39mer）（配列番号２３）
NCE4-C-BamHI：
5'-GGGGATCCTGCGTTTACAGGCACTGATGGTACCAGTC-3'（37mer）（配列番号２４）
増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩで消化後、プラスミドｐＪＤ０１（国際公開第００／２４８７９号パンフレットの実施例Ｄ１（２）（ｂ））のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングしたプラスミドをｐＪＮＤ−ＮＣＥ４とした。
【０１０５】
（１）ＳＴＣＥ１発現プラスミドの構築
実施例９（２）で作製したプラスミドｐＵＣ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｎ−Ｓ９Ａ４、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＦｏｋＦをプライマーに用いてＰＣＲにて増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩとＦｏｋＩにて切断後、再度アガロース電気泳動により分離精製を行った。
STCE1-N-S9A4:
5'-GGGATCCTGCGTTTAAAGGCACTGCGAGTACCAG-3'（34mer）（配列番号２５）
STCE1-C-FokF:
5'-GGGATGCAAGCCGTCGTGCTCGTG-3'（24mer）（配列番号２６）
次に前述のプラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４をＳＴＣＥ１−Ｎ−ＦｏｋＲ４、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＢａｍＦプライマーにより、ＰＣＲにて増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩとＦｏｋＩにて切断後、再度アガロース電気泳動により分離精製を行った。
STCE1-N-FokR4:5'-GGGATGGGCCCAGCCGCACGAAG-3'（23mer）（配列番号２７）
STCE1-C-BamF:5'-GGGATCCTGGGACAAGATGC-3'（20mer）（配列番号２８）
プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に、上記２断片を挿入し、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を得た。更に、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、ＳＴＣＥ１遺伝子（配列番号２）と同じであることを確認した。
【０１０６】
（２）プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換体の作製
フミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株をＮＳ培地（３．０％グルコ−ス、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）において、３７℃で２４時間培養し、３０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、１ｍｇ／ｍＬキチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、１ｍｇ／ｍＬザイモリエース（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）、０．５ｍｏｌ／Ｌ シュークロース）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのプラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１が入った溶液１０μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
このプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加ＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養し、形成したコロニーを形質転換体とした。
【０１０７】
（３）ｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１の形質転換体の培養及び同定
（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１をフミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株に導入し、ハイグロマイシン耐性を示す株を４０株選抜した。これらを（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）において、３７℃で４日間培養し、得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（プリキャストミニゲル １４％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、１．０ｍｍゲル厚（テフコ社製））により解析した。その結果、１３クローンにおいて、ＳＴＣＥ１と推定される分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質が顕著に増強されていることが確認できた。
【０１０８】
（ii）組換えＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸残基の同定
（３）（ｉ）で大量発現したタンパク質がＳＴＣＥ１遺伝子由来であることを確認するために、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。まず、培養上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分離し、実施例２の方法に従ってＰＶＤＦ膜にタンパク質を電気的に写し取り、分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質について、プロテインシーケンサーに供した。その結果、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と一致した。
【０１０９】
《実施例１１：フミコーラ・インソレンスによって発現したＳＴＣＥ１によるセルロース含有繊維の毛羽除去活性の評価
実施例１０（３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質の発現が確認された１３株のうち、特に発現が顕著な１株（４Ａ−９株）の培養上清液を用いて、綿ニット生地毛羽除去活性を測定した。コントロールとして非形質転換体である親株由来の培養上清液を用いた。方法は実施例３に従い、ｐＨ６、４０℃、１時間の処理条件で、予め毛羽立たせた青色綿ニット生地を各種培養上清液で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ１００％除去されるのに要する培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第５表に示した。
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
《実施例１２：フミコーラ・インソレンスによって発現したエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるインデイゴ染めセルロース含有繊維の脱色活性の評価》
実施例１０で得られたＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）と非形質転換体である親株（ＭＮ２００−１株）の培養上清液を用いて、糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理をした。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製 全自動洗濯機 ＳＣＷ５１０１）
温度：５５℃
時間：６０分
反応ｐＨ：ｐＨ６．２（６．７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液量：１５Ｌ
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
【０１１２】
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製 ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝７となるのに必要な培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第６表に示した。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
《実施例１３：洗剤として配合した場合のフミコーラ・インソレンスによって発現されたエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１の毛羽除去活性（澄明化活性）の評価》
実施例１０で得られたＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）と非形質転換体である親株（ＭＮ２００−１株）の培養上清液を用いて、欧米の洗剤中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性（澄明化活性）を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を下記の条件において洗剤中で処理することにより、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する、培養上清液量中のタンパク質濃度を求めた。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ （Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．４％
処理液：人工硬度水（２５ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第７表に示した。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
《実施例１４：水道水中の硬度が、フミコーラ・インソレンスにより発現された各種エンドグルカナーゼの毛羽除去活性に与える影響》
実施例１０で得られたエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）、ＮＣＥ５を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、ＮＣＥ４を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、ＲＣＥＩ（セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ））を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）の計４株の培養上清液を用いて、洗剤中の各種硬度の水における、綿ニット生地の毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を、界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を、各種硬度（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ）の人工硬度水中において、４種の培養上清液を用いて、下記の条件下で処理をした。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：１００ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．４％
処理液：人工硬度水（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
処理後の生地において、形成された毛羽が目視でほぼ５０％除去されるのに要する培養上清液量中のタンパク質濃度を求め、そのタンパク質濃度の逆数値を毛羽除去活性値とした。そして、０ＦＨの硬度における毛羽除去活性値を１００としたときの、各種硬度での毛羽除去活性相対値を求めた。その結果を第８表に示した。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
《実施例１５：ＳＴＣＥ１遺伝子のトリコデルマ・ビリデでの発現》
（１）ＳＴＣＥ１発現プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１の構築
ＳＴＣＥ１遺伝子は、開始コドンの上流の配列にＳｍａＩ、終止コドンの下流にＸｈｏＩを予め含む形で以下のような変異導入用プライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。
STCE1-N-SmaI：
5'-CAGCCCGGGGCGCATCATGCGTTCCTCCCCTCTCC-3'（35mer）（配列番号２９）
STCE1-C-XhoI：
5'-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3'（33mer）（配列番号３０）
ＰＣＲの反応は、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｎ−ＳｍａＩ、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩの２本の合成ＤＮＡをプライマーにして、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）を用いて行った。反応条件については酵素に添付の説明書の条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、更に制限酵素ＳｍａＩ及びＸｈｏＩにて切断し、約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−Ｎを得た。
一方、ｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第９８／１１２３９号パンフレット）を制限酵素ＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、７．３ｋｂｐの断片を回収した。これに約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−ＮをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−Ｍ２を作製した。
更に、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２のＸｂａＩサイトにＰＤＨ２５（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｄ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ＡＮＤ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，“Ｇｅｎｅ”，５７，ｐ．２１−２６、１９８７）由来ハイグロマイシンＢ耐性カセットを挿入し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１を構築した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１は、宿主のトリコデルマ内にて、自身の開始コドンを用いてＳＴＣＥ１タンパク質を発現するように構築した。
【０１１９】
（２）融合ＳＴＣＥ１発現プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１の構築
ＳＴＣＥ１遺伝子は、Ｎ末端をコードするアミノ酸（Ａｌａ）のコドンのすぐ上流にＳｐｈＩ、終止コドンの下流にＸｈｏＩを予め含む形で以下のような変異導入用プライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。
STCE1-M-SphI：
5'-CCGCATGCGCTGATGGCAAGTCCACC-3'（26mer）（配列番号３１）
STCE1-C-XhoI：
5'-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3'（33mer）（配列番号３２）
ＰＣＲの反応は、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｍ−ＳｐｈＩ、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩの２本の合成ＤＮＡをプライマーにして、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）を用いて行った。反応条件については酵素に添付の説明書の条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、更に制限酵素ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩにて切断し、約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−Ｍを得た。
一方、ｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第９８／１１２３９号パンフレット）を制限酵素ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩで切断し、７．３ｋｂｐの断片を回収した。これに０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−ＭをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２を作製した。
更に、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２のＸｂａＩサイトにＰＤＨ２５（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ＡＮＤ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，“Ｇｅｎｅ”，５７，ｐ．２１−２６、１９８７）由来ハイグロマイシンＢ耐性カセットを挿入し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１を構築した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１は、宿主のトリコデルマ内にて、ベクター由来の開始コドンを用い、ＣＢＨＩタンパク質のｐｒｅ−ｐｒｏ配列との融合タンパク質の形でＳＴＣＥ１タンパクを発現するように構築した。
【０１２０】
（３）プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
トリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０４７）をＳ培地（３．０％グルコース、１．０％イーストエキス、０．１％ポリペプトン、０．１４％硫酸アンモニウム、０．２％リン酸カリウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）において、２８℃で２４時間培養し、３０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬノボザイム２３４、５ｍｇ／ｍＬセルラ−ゼオノズカＲ−１０、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）に懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄した。
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、又はＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１の入ったＤＮＡ溶液１０μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離し、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
このプロトプラストを、ハイグロマイシンＢ（２０μｇ／ｍＬ）添加ポテトデキストロース（ＰＤ）寒天培地（３．９％ポテトデキストロースアガー、１７．１％シュークロース）上に、ＰＤ軟寒天（１．３％ポテトデキストロースアガー、１７．１％シュークロース）とともに重層し、２８℃で５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
【０１２１】
《実施例１６：ＳＴＣＥ１遺伝子のトリコデルマ・ビリデ形質転換体培養液中のＳＴＣＥ１の同定及び毛羽除去活性評価》
（１）ＨＰＬＣによる評価
プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１をトリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株に導入し、ハイグロマイシンＢに耐性を示す株を５０株選抜した。これらをＳ培地において、３７℃で５日間培養し、得られた培養上清液を、ＴＳＫｇｅｌ ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出し、ＵＶ２８０ｎｍでピークを検出した。その結果、ＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１形質転換体、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１形質転換体それぞれ３株に、野生株トリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株培養上清液には見られないピークを認めたため、それらピークを分取し、Ｎ末端アミノ酸分析を実施例２の方法に従って決定した結果、ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と一致した。
【０１２２】
（２）ＳＴＣＥ１形質転換体培養液の毛羽除去活性の評価
実施例１６（１）においてＳＴＣＥ１が発現している２株と非形質転換体である親株（ＭＣ３００−１株）の培養上清液を用いて、実施例３に従い、ｐＨ１０（５ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム緩衝液）、４０℃で１時間の処理条件で、予め毛羽立たせた青色綿ニット生地を各種培養上清液で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ５０％除去されるのに要する培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第９表に示した。
【０１２３】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明の新規エンドグルカナーゼＳＴＣＥは、例えば、セルロース含有繊維の処理、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善、動物試料の消化能の改善などの用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号３３）及び成熟タンパク質（配列番号３）］と、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号３４）及び成熟タンパク質（配列番号３５）］及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号３６）及び成熟タンパク質（配列番号３７）］の各アミノ酸配列とを比較した結果の内、そのＮ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【図２】図１に示す比較結果の内、そのＣ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１８〜２１の配列で表される各塩基配列は、プライマーＳＴＣＥ１−ＣＮ、プライマーＳＴＣＥ１−ＣＣ、プライマーＳＴＣＥ−ＨＮＢａｍ、及びプライマーＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍであり、配列番号２３〜３２の配列で表される各塩基配列は、プライマーＮＣＥ４−Ｎ−ＢａｍＨＩ、プライマーＮＣＥ４−Ｃ−ＢａｍＨＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−Ｓ９Ａ４、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＦｏｋＦ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−ＦｏｋＲ４、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＢａｍＦ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−ＳｍａＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｍ−ＳｐｈＩ、及びプライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ（Endoglucanases STCE）及びそれを含むセルラーゼ調製物、並びにそれらを利用したセルロース含有繊維の処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から、セルロース含有繊維を、その繊維に所望の特性を与えるためにセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触り及び外観を改善するために、又は着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウォッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている［欧州特許第３０７，５６４号明細書（特許文献１）］。
【０００３】
また、着色されたセルロース含有繊維は繰り返し洗濯をすることによって毛羽が生じ、着色生地の色を不鮮明にすることが知られている。そこで、洗剤中にセルラーゼを含ませることによって、毛羽を除去する、もしくは毛羽が生じないようにすることによって着色生地の色を鮮明にする、すなわち澄明化することから［欧州特許第２２０，０１６号明細書（特許文献２）、国際公開第９５／０２６７５号パンフレット（特許文献３）、国際公開第９７／３０１４３号パンフレット（特許文献４）、国際公開第９８／０８９２６号パンフレット（特許文献５）］、セルラーゼを含んだ洗剤が欧米を中心に市販されている。
【０００４】
洗剤に用いられるセルラーゼとして、洗剤中において、フミコーラ（Humicola）属由来の精製された４３ｋＤエンドグルカナーゼ成分（ＥＧＶ）が従来の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物に対して約３０倍もの澄明化活性（生地に生ずる毛羽を取り、生地の色を鮮やかにする活性）があることが知られている［国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献６）］。また、フミコーラ属由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ５（以下「ＮＣＥ５」と略記することもある。）を洗剤中で反応させることによって、着色生地の澄明化をもたらすことが知られている［国際公開第０１／９０３７５号パンフレット（特許文献７）］。更には、洗剤中において、リゾプス（Rhizopus）属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ（以下「ＲＣＥＩ」と略記することもある。）をフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）にて増強発現させた培養液が、ＲＣＥＩを増強発現させていないフミコーラ・インソレンス培養液の２０倍以上もの澄明化活性があることが知られている［国際公開第００／２４８７９号パンフレット（特許文献８）］。
【０００５】
このように、様々なエンドグルカナーゼが着色生地の澄明化活性をもつことは知られているものの、実際に、欧米の洗剤に配合された場合、十分に活性を発揮できるエンドグルカナーゼは少ない。これは、欧米の洗剤に含まれている多量のアニオン界面活性剤やビルダーなどが活性を阻害するためと考えられる。
【０００６】
また、洗濯に用いられる欧米の水道水は一般的に硬度が高く、Ｃａ２＋やＭｇ２＋などの２価のカチオンが多量に含まれている。この２価のカチオンは洗剤中の界面活性剤による洗浄能力を著しく低下させるため、洗剤にはこの２価のカチオンを吸着させるためにビルダーが配合されている［“Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ”，１９９５年，１１巻，ｐ．３３−５５（非特許文献１）］。また、地域によって水道水の硬度はかなり違うため、洗剤に配合するビルダーの種類や添加量には地域別に工夫が凝らされている。また、洗剤による洗浄能力だけでなく、セルラーゼ活性もこれら２価のカチオンの影響を受ける事が知られている［Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．”２３，１９９８年，ｐ．１３３−１４０（非特許文献２）、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｃ．ＡＮＤ Ｓｕｂｅｒｋｒｏｐｐ，Ｋ．，“Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，３３巻第２号，１９９５年，ｐ．２４５−２５３（非特許文献３）］。従って、水の硬度によっては、セルラーゼ活性が阻害され、満足な澄明化効果が得られない問題や、反対に、セルラーゼ活性が増強され、生地の強度低下をおこす問題が発生する。
【０００７】
ビルダー自体がセルラーゼ活性に影響を与えるため、セルラーゼの澄明化活性に対して水の硬度が及ぼす影響を、ビルダーの添加によって緩和することは難しい。そこで、水道水の硬度の影響を受けにくく、安定した澄明化活性を有するセルラーゼが求められている。
【０００８】
従来、セルロース含有繊維の処理には、複数のセルラーゼ成分の混合物が使用されてきたが、その実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を得るには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。そこで多くの場合、セルラーゼ調製物は、多量の高活性エンドグルカナーゼを含む調製物として提供されている。その製造方法としては、遺伝子組換えの技術を用いて、目的の高活性エンドグルカナーゼ成分を宿主細胞において大量に発現させる方法が知られている［国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献６）、国際公開第９８／０３６６７号パンフレット（特許文献９）、国際公開第９８／１１２３９号パンフレット（特許文献１０）］。
【０００９】
そして、これらの方法において好ましい宿主細胞としては、不完全菌類に属する糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属の糸状菌などが挙げられている。更に、洗剤に用いるセルラーゼを生産させる場合、洗剤中のｐＨがアルカリ性であるため、酸性セルラーゼを生産するトリコデルマ属の糸状菌よりも、中性セルラーゼを生産するアスペルギルス属やフミコーラ属の糸状菌を宿主とする方が適している。特に、工業レベルでの酵素の生産を考慮した場合、生産性の高いフミコーラ属の菌は極めて優良な宿主となる［国際公開第０１／９０３７５号パンフレット（特許文献７）、国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献１１）］。
【００１０】
しかしながら、異種由来の遺伝子を、フミコーラ属の糸状菌において発現させる際、その塩基配列上の特性が異なる（遺伝子のコドン使用頻度が違う）などの理由で、発現が妨げられる場合が多い。そのため、異種由来の遺伝子に対して改変操作を行うことが必要となる。例えば、接合菌類に属するリゾプス属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩをフミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させるためには、ＲＣＥＩをコードする遺伝子を宿主細胞のコドン使用頻度に合わせて最適化しなければならない［国際公開第００／２４８７９号パンフレット（特許文献８）］。しかし、このように最適化されたとしても、通常、同種遺伝子の発現量と同程度の発現量を得ることは難しいことが予想されている。また、実際に発現し、宿主により生産されてきた目的の酵素が、培養中に培養液中のプロテアーゼなどによる分解を受け、分解物もしくは部分分解物として得られてくる場合も予想される。
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第３０７，５６４号明細書
【特許文献２】欧州特許第２２０，０１６号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／０２６７５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９７／３０１４３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９８／０８９２６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０１／９０３７５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第００／２４８７９号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９８／０３６６７号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９８／１１２３９号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９８／０３６４０号パンフレット
【非特許文献１】“Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ”，１９９５年，１１巻，ｐ．３３−５５
【非特許文献２】Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．”２３，１９９８年，ｐ．１３３−１４０
【非特許文献３】Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｃ．ＡＮＤ Ｓｕｂｅｒｋｒｏｐｐ，Ｋ．，“Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，３３巻第２号，１９９５年，ｐ．２４５−２５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これまでに、繊維用・洗剤用途に使用するために、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、リゾプス（Rhizopus）属、ムコール（Mucor）属、ファイコマイセス（Phycomyces）属などの様々な糸状菌からセルラーゼが単離され、それらセルラーゼをコードする遺伝子が単離されている。しかしながら、アニオン界面活性剤及びビルダーを多量に含有する欧米タイプの洗剤中において高い澄明化活性を有し、なおかつ、水道水の硬度の影響を受けにくく、安定した澄明化活性を有するセルラーゼはいまだ報告されていない。
【００１３】
更に、優良な宿主であるフミコーラ属の糸状菌において、遺伝子改変操作なしで大量に発現させることができるような異種糸状菌由来のセルラーゼ遺伝子があれば、その産業上の価値は計り知れないが、まだそのような遺伝子の報告もない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、今般、セルラーゼ酵素やセルラーゼ遺伝子を単離した報告は全くされていなかったスタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物から、新規な高いエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質及びその遺伝子を見出し、これらを提供するものである。
【００１５】
本発明者は、本発明のスタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物から単離された新規な高いエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が、欧米の洗剤中において、セルロース含有着色生地に対して極めて強い澄明化活性を示すことを見出した。例えば、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来の本発明のエンドグルカナーゼ、特にその一例であるエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１（以下「ＳＴＣＥ１」と略記することもある）は、代表的なヨーロッパ洗剤中において、洗剤用セルラーゼとして澄明化活性を有することが知られているエンドグルカナーゼＮＣＥ５（以下「ＮＣＥ５」と略記することもある）（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）に比べて約１６倍、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）に比べて約８０倍以上もの高い澄明化活性を有していた。
【００１６】
更に、そのエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、水道水の硬度によらず、安定した澄明化活性を有するという驚くべき知見を得た。例えば、セルロース含有繊維に対して高い毛羽除去活性を有することが知られているエンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）やＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）は、水道水中の硬度が上がると澄明化活性が上がるのに対して、エンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）は、水道水中の硬度が上がると澄明化活性が下がる。しかしながら、本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、水道水の硬度によらず、安定した澄明化活性を有していた。このように、欧米の洗剤中において高い澄明化活性を有し、しかも、水道水の硬度によらず、安定した活性を有するセルラーゼに関する知見は今までに全くない。
【００１７】
更に驚くべきことに、スタフィロトリクム・ココスポラム由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、スタフィロトリクム・ココスポラムとは異種菌株であるフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）を宿主として用いた形質転換において、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１遺伝子の改変操作を全く行わないで大量発現することを見出した。
【００１８】
従って、本発明は、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来のエンドグルカナーゼ活性を有する新規なタンパク質及びその遺伝子、並びに前記タンパク質を含有し、良好な特性を有するセルラーゼ調製物を提供するものである。また、本発明は、前記タンパク質をコードする遺伝子によって形質転換された宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養して目的タンパク質を採取する方法を提供するものである。更に、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する方法を提供するものである。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来であって、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
（２）以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する、（１）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列である。
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、（２）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した平均分子量が４９ｋＤである。
（４）以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、（２）に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した平均分子量が４５ｋＤである。
（５）スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質。
（６）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含む、タンパク質、
（ｂ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
（７）（１）〜（６）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（８）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（９）（７）又は（８）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１０）（９）に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１１）宿主が酵母又は糸状菌である、（１０）に記載の宿主細胞。
（１２）酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属又はピキア（Pichia）属に属する微生物である、（１１）に記載の宿主細胞。
（１３）糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、又はアクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物である、（１１）に記載の宿主細胞。
（１４）糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）である、（１３）に記載の宿主細胞。
（１５）（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から（１）〜（６）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（１６）（１５）に記載の方法で生産されたタンパク質。
（１７）（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
（１８）（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
（１９）セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２０）セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２１）セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２２）着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２３）着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２４）セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、（１７）に記載のセルラーゼ調製物、又は（１８）に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
（２５）繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、（１９）〜（２４）のいずれか一項に記載の方法。
（２６）古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
（２７）紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
（２８）動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（６）及び（１６）のいずれか一項に記載のタンパク質、又は（１７）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のタンパク質、特にはエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１は、セルロース含有繊維の色の澄明化、毛羽立ちの低減、肌触り及び外観の改善、色の局所的変化、ごわつきの低減などを目的とした洗剤用、並びに繊維加工用途に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、前記酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。また、本明細書の「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。更に、「ＣＭＣアーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
【００２２】
エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍＬを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍＬ中にＤＮＳ試薬３．０ｍＬを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍＬで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。なお、ＤＮＳ試薬は文献（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、ｐ．１９〜２０、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することができるが、例えば、次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍＬ、及びロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１．０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍＬに結晶フェノール１０ｇを加え、更に水を加えて溶解して１００ｍＬとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍＬに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
【００２３】
本発明によるタンパク質は、糸状菌類、具体的には、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物、好ましくは、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）、より好ましくはスタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum
coccosporum）ＩＦＯ ３１８１７株から取得することができる。また、これらはその変異株であってもよい。
【００２４】
更に、本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有する。Ｎ末端のアミノ酸配列は、例えば後述の実施例２で示した方法により決定することができる。
【００２５】
本発明によれば、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が４９ｋＤである。
【００２６】
更に、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が４５ｋＤである。
ここで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる平均分子量は、実施例１に示した方法によって決定することができる。
【００２７】
本発明の別の態様では、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにその改変タンパク質又はその相同タンパク質が提供される。
【００２８】
「配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質」には、例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号３で表わされるアミノ酸配列にシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに配列番号３で表されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
シグナルペプチドは、例えば、配列番号２で表わされる塩基配列において、１〜３位のＡＴＧで始まり、６１〜６３位で終了するヌクレオチド配列からコードされる２１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（配列番号３３）である。前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製などを容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
【００２９】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個（好ましくは、１又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「欠失、置換、挿入、又は付加」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜６個である。また、改変を行うアミノ酸は、エンドクルカナーゼ活性を維持又は向上させることができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、触媒領域、リンカー領域、又はセルロース結合領域に含まれるアミノ酸を改変することができる。
【００３０】
更に、改変タンパク質には、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個又は複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。
このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３１】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４−２４４８（１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値（同一性；identity）を示す。
【００３２】
本発明のタンパク質の具体例として、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１又はエンドグルカナーゼＳＴＣＥ３が挙げられる。本発明では、これらを総称して、「エンドグルカナーゼＳＴＣＥ」とする。
【００３３】
本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥは、後述の実施例２に示すように、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼである。ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼとしては、例えば、フミコーラ属由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）若しくはＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、又はリゾプス（Rhizopus）属由来のエンドグルカナーゼＲＣＥＩ（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）を挙げることができる。
【００３４】
図１及び図２に、本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号３３）及び成熟タンパク質（配列番号３）］と、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号３４）及び成熟タンパク質（配列番号３５）］及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号３６）及び成熟タンパク質（配列番号３７）］の各アミノ酸配列とを比較した結果を示す。
図１は前半部（Ｎ末端側）の結果を示し、図２は後半部（Ｃ末端側）の結果を示す。図１及び図２において、記号「＊」は、ＳＴＣＥ１と共通するアミノ酸であることを示す。
【００３５】
図１及び図２に示すとおり、ファミリー４５に属するエンドグルカナーゼは、共通するドメインとして触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）（１番〜２０７番）を有し、場合により、更に、リンカー領域（Ｌｉｎｋｅｒ）（２０８番〜２５８番）及び／又はセルロース結合領域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＣＢＤ）（２５９番〜２９５番）を有することがある。なお、各ドメインの後の括弧内に示す番号は、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列（配列番号３）におけるアミノ酸番号である。
【００３６】
前記各領域の内、触媒領域及びセルロース結合領域では、各エンドグルカナーゼ間で多くの保存アミノ酸が認められるのに対して、リンカー領域では顕著な保存領域は認められない。保存アミノ酸を多く含む領域（例えば、触媒領域又はセルロース結合領域、特には触媒領域）、あるいは、その領域に含まれる共通アミノ酸は、本発明のエンドグルカナーゼ（例えば、ＳＴＣＥ１）の酵素活性に重要な領域又はアミノ酸と考えられるため、それ以外の領域又はアミノ酸においてアミノ酸改変（例えば、欠失、置換、挿入、及び／又は付加、特には保存的置換）を行うことにより、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。
【００３７】
また、保存アミノ酸を多く含む領域であっても、各エンドグルカナーゼ間で非共通のアミノ酸は、別のアミノ酸（好ましくは、保存的置換可能な類似アミノ酸）に改変してもその酵素活性を維持する可能性が高く、このようなアミノ酸改変を行うことによっても、その酵素活性を維持した改変タンパク質又は相同タンパク質を、過度の実験を必要とすることなく、高い確率で取得することができる。
なお、保存アミノ酸を多く含む領域における共通アミノ酸であっても、別のアミノ酸に改変してもその酵素活性が維持されることがあり、特に保存的置換可能な類似アミノ酸に改変した場合、その可能性は高くなる。本発明の改変タンパク質又は相同タンパク質には、エンドグルカナーゼ活性を有する（すなわち、改変前のエンドグルカナーゼ活性が維持又は向上される）限り、任意の領域、例えば、触媒領域、リンカー領域、又はセルロース結合領域に含まれるアミノ酸を改変したタンパク質が含まれる。
【００３８】
本発明のタンパク質は、例えば実施例１に記載のように微生物から単離、精製することにより得ることができる。また、後述のように遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離、精製することによっても得ることができる。
【００３９】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、その改変タンパク質、及び相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４１】
配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、更に好ましくは１〜９個である。
【００４２】
ここで、前記（iii）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、エンドグルカナーゼＮＣＥ５遺伝子（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。
【００４３】
より具体的には、例えば、プローブとして標識化したエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、前記プローブを添加し、４２℃で１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．４倍以下の濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度のＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノミックライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００４５】
本発明による、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列をコードする、典型的塩基配列は、配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を有するものである。配列番号２で表わされる塩基配列は、１〜３位のＡＴＧで始まり、９４９〜９５１位のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６４〜６６のヌクレオチド配列は、２９５アミノ酸残基からなるエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１の成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００４６】
発現ベクター及び形質転換された微生物
本発明においては、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、その改変タンパク質及び相同タンパク質をコードする塩基配列（以下「本発明によるポリヌクレオチド」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４７】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチドの他に、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカーなどを含んでいるのが望ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードする塩基配列などがこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導される塩基配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００４８】
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、及び、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００４９】
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その宿主細胞又は培養物から前記の本発明によるタンパク質を単離して得ることができる。従って、本発明の別の態様によれば、前記の本発明による新規タンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００５０】
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドの塩基配列によってコードされる、エンドグルカナーゼを発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、又はピキア（Pichia）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が挙げられる。
【００５１】
また、本発明における新規タンパク質の最も好適な製造方法として、不完全菌類に属する糸状菌における発現方法が提供される。本発明における好適な宿主糸状菌として、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属又はアクレモニウム（Acremonium）属に属するものが挙げられるが、より好ましくは、フミコーラ（Humicola）属、又はトリコデルマ（Trichoderma）属が挙げられる。より具体的には、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコーラ・サーモイデア（Humicola
thermoidea）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・レーセイ（Trichoderma
reesei）、トリコデルマ・ロンジブラシアトウム（Trichoderma longibrachiatum）、スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum
coccosporum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus
oryzae）、フザリウム・オキシスポーラム（Fusarium oxysporum）、又はアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium
cellulolyticus）が挙げられるが、更により好ましくは、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）、又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）が挙げられる。
【００５２】
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のタンパク質（例えば、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、又はその改変タンパク質若しくは相同タンパク質、あるいは、本発明の宿主細胞を培養することにより得られるタンパク質）を含むセルラーゼ調製物にも関する。
【００５３】
一般に、セルラーゼ調製物とは、セルラーゼ酵素の他に、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトールなど）、防腐剤、及び／又は非イオン系界面活性剤などを含有させることができる。また、セルラーゼ調製物の形態は、固形状であっても液体状であってもよく、具体的には、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、又は液体製剤が挙げられる。本発明のセルラーゼ調製物には、本発明のタンパク質に加えて、他のセルラーゼ酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、及び／又は本発明のエンドグルカナーゼ以外のエンドグルカナーゼを含めてもよい。
【００５４】
セルラーゼ調製物の１種である非粉塵化顆粒（好ましくは、飛散性のない顆粒状）は、通常の乾式造粒法を用いて製造することが可能である。すなわち、粉末状態の本発明のタンパク質を、中性でエンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない無機塩（例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム）、エンドグルカナーゼ活性に影響を及ぼさない鉱物（例えば、ベントナイト、モンモリナイト）、及び中性の有機物（例えば、澱粉又は粒状セルロースなど）などから選ばれる１種又は複数種に混合した後、非イオン界面活性剤の１種又は複数種の粉末、あるいは微細に懸濁された懸濁液を加え、充分に混合又は混練する。状況に応じ、固形物を結着させる合成高分子（例えば、ポリエチレングリコールなど）又は天然高分子（例えば、スターチなど）を適宜添加し、更に混練した後、ディスクペレッターなどの押し出し成形造粒を行い、成形物をマルメライザーにより球状に成形後、乾燥させることで非粉塵化顆粒を製造することが可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。また、顆粒表面をポリマーなどでコーティングすることにより、酸素透過や水分透過をコントロールすることも可能である。
【００５５】
一方、セルラーゼ調製物の１種である液状製剤（好ましくは、安定化された液体状）は、本発明のタンパク質を含む溶液に、エンドグルカナーゼの安定化剤（例えば、合成高分子、天然高分子など）を配合し、必要に応じて無機塩類及び／又は合成防腐剤を添加して調製することが可能である。このとき、非イオン界面活性剤の１種又は複数種を配合することも可能である。非イオン界面活性剤の１種又は複数種の添加量は特に限定されないが、本発明のセルラーゼ調製物の全体に対して、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％、更に好ましくは１〜１０重量％とする。
【００５６】
更に、本発明は、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物を提供する。本発明の洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性又は双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。また、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラ−ゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、及び／又は発泡促進剤などをも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、アルキル硫酸塩（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル塩（α−ＳＦＭｅ）、及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などがある。ノニオン性界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、脂肪酸メチルエステルエトキシレート、スクロース、及びグルコースの脂肪酸エステル、並びにアルキルグルコシド、ポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステルなどがある。
【００５７】
本発明のセルロース含有繊維の処理方法は、本発明のタンパク質、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を、セルロース含有繊維と接触させることにより行う。本発明の繊維処理方法により改善されうる、セルロース含有繊維の性質としては、以下のものが含まれる。
（１）毛羽の除去（毛羽立ち始める速度の低減、毛羽立ちの低減）
（２）減量による繊維の肌触り及び外観の改善
（３）着色セルロース含有繊維の色の澄明化
（４）着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与
（５）柔軟化（ごわつき始める速度の低減、ごわつきの低減）
本発明の繊維処理方法は、具体的には、繊維が浸漬されているか又は浸漬されうる水に、本発明のタンパク質、本発明のセルラーゼ調製物、又は本発明の洗剤組成物を添加することにより行うことができ、例えば、繊維の浸漬工程、洗濯工程、又はすすぎ工程で行うことができる。
【００５８】
接触温度、又は本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、若しくは洗剤組成物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００５９】
更に、セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的とした減量加工の場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．１〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６０】
また、着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化することを目的とした場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６１】
また、着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供するために用いる場合、２０〜６０℃程度の温度で、０．１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６２】
また、上記の方法は、セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減するか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減させる場合、１０〜６０℃程度の温度で、０．０１〜２０ｍｇ／Ｌのタンパク質濃度の本発明のタンパク質、セルラーゼ調製物、又は洗剤組成物を使用することが好ましい。
【００６３】
更に、本発明は、古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法に関する。
【００６４】
本発明のタンパク質又はセルラーゼ調製物は、古紙に作用させると脱インキの効率を向上させるため、古紙から再生紙を製造する過程において有用である。上記脱インキ方法によれば、残インキ繊維が大幅に減少するため、古紙の白色度を向上させることができる。
【００６５】
上記脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品であればよく、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、アニオン系の界面活性剤、ノニオン系の界面活性剤、又はオレイン酸などの補集材などが挙げられ、助剤として、ｐＨ安定剤、キレート剤、又は分散剤などが挙げられる。
【００６６】
上記脱インキ方法を適用し得る古紙は、一般に古紙と呼ばれるものであればよく、特に限定されないが、例えば、機械パルプ及び化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙などの印刷古紙が挙げられる。更に、一般に古紙と呼ばれるもの以外であっても、インクの付着している紙であれば、上記脱インキ方法を適用することができる。
【００６７】
更に、本発明は、紙パルプのろ水性の改善方法に関し、前記方法は、紙パルプを、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
【００６８】
前記方法によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、有意に改善されるものと考えられる。前記方法を適用し得るパルプは特に限定されないが、例えば、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、加工熱処理その他の高収率パルプなどが挙げられる。
【００６９】
更に、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。
【００７０】
前記方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
【００７１】
更に、本発明によるタンパク質を動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。従って、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のタンパク質又はセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含む方法が提供される。
【００７２】
微生物の寄託
本発明によるエンドグルカナーゼＳＴＣＥの由来であるスタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）ＩＦＯ ３１８１７株は、１９８５年に財団法人 醗酵研究所に国内寄託されたものであり、国内受託番号は、ＩＦＯ ３１８１７である。また、２００４年（平成１６年）９月２８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、国際受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−１０１３５である。更に、ＩＦＯ ３１８１７株は現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８かずさアカデミアパーク内）にＮＢＲＣ ３１８１７として受託されている。同菌株が第三者に公開され、分譲可能な状態にあることは、同本部から交付された証明書［平成１５年（２００３年）１１月１９日付］によって明らかとなっている。
【００７３】
プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位にＳＴＣＥ１遺伝子を挿入したプラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘで形質転換された本発明の大腸菌（Esherichia coli）ＤＨ５α／ｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ株は、２００３年（平成１５年）１２月１日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、２００４年（平成１６年）９月１５日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１２７［ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０２］である。
【００７４】
本発明の発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）ＭＮ２００−１株は、１９９６年（平成８年）７月１５日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）６月１３日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７［ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６］である。
【００７５】
本発明の発現ベクターの宿主となりうるトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）ＭＣ３００−１株は、１９９６年（平成８年）９月９日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国内寄託（原寄託）されたものであり、１９９７年（平成９年）８月１１日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６０４７［ＦＥＲＭ Ｐ−１５８４２］である。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例をもって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７７】
《実施例１：スタフィロトリクム・ココスポラムからの脱脂綿フィブリル遊離活性を有する成分の単離精製》
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を、（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）中、２８℃で振とう培養した。１０日間培養の後、菌体を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
この粗精製セルラーゼ調製液を最終濃度１．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、１．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム液で平衡化させたＨｉＴｒａｐＴＭＰｈｅｎｙｌＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライし、脱イオン水中、硫酸アンモニウム濃度が１．５ｍｏｌ／Ｌ、０．９ｍｏｌ／Ｌ、０．７５ｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌ、０ｍｏｌ／Ｌのステップワイズ溶離法により溶出して、分画した。このうち硫酸アンモニウム濃度が０．７５ｍｏｌ／Ｌと０ｍｏｌ／Ｌのときに溶出した画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。
【００７８】
次に、硫酸アンモニウム０ｍｏｌ／Ｌ溶出画分をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）となるよう調整し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ ５／５ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムに対して、リニアグラジェント溶離法で溶出し、分画した。その結果、塩化ナトリウム濃度が約０．０５ｍｏｌ／Ｌのときに得られた画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。この画分をＳＴＣＥ１として単離した。
【００７９】
また、硫酸アンモニウム０．７５ｍｏｌ／Ｌ溶出画分も同様にウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩した後、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）となるよう調整し、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させたＭｏｎｏＳ ５／５ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にアプライした。そして、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムに対して、リニアグラジェント溶離法で溶出し、分画した。その結果、塩化ナトリウム濃度が約０．０５ｍｏｌ／Ｌのときに得られた画分に脱脂綿フィブリル遊離活性が強く認められた。この画分をＳＴＣＥ３として単離した。これらＳＴＣＥ１画分、ＳＴＣＥ３画分は、前記カラムによる分画精製操作を何回も繰り返すことによって、大量の精製サンプルを取得した。
【００８０】
このＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて各々単一なバンドを示し、その平均分子量（ＭＷ）は順に約４９ｋＤ及び約４５ｋＤであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、セイフティーセルミニＳＴＣ−８０８電気泳動槽（テフコ社製）及びプリキャストミニゲル １０％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、１．０ｍｍゲル厚（テフコ社製）を使用し、泳動及び染色は製品取扱い説明書の方法に従った。分子量マーカーはプレシジョンプロテインスタンダード（バイオラッドラボラトリーズ社製）を使用した。また、ＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分はいずれもＣＭＣアーゼ活性を有していた。
【００８１】
脱脂綿フィブリル遊離活性はＮｅｅｎａ Ｄｉｎらによる方法（Ｎｅｅｎａ Ｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，９（１９９１），ｐ．１０９６−１０９９）を改良した方法で行った。すなわち、洗濯堅牢度試験機を用いて以下の条件で反応させた場合の脱脂綿から遊離される毛羽の量を６００ｎｍ吸光度にて測定した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度 ：４０℃
時間 ：１２０分
反応ｐＨ：ｐＨ７（５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液には、分画液とともにステンレスビーズと脱脂綿を適当量加えた。
【００８２】
《実施例２：スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の部分アミノ酸配列の決定》
（１）ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３のＮ末端アミノ酸配列の同定
実施例１において得られたＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜プロブロットＴＭ（アプライドバイオシステムズ社製）に電気的に写し取った。そしてＣＢＢ染色液（０．１％クマシーブルーＧ２５０、３０％メタノール、１０％酢酸）で染色した後、脱色し、風乾した。この膜からＳＴＣＥ１画分及びＳＴＣＥ３画分に該当する分子量約４９ｋＤ及び約４５ｋＤのタンパク質（ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３）がブロットされた部分をそれぞれ切り出し、極少量のメタノールで湿らせ、還元用緩衝液（８ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩酸塩、０．５ｍｏｌ／Ｌトリス、０．３％ＥＤＴＡ−２ナトリウム、５％アセトニトリル）でこの膜片を軽く洗浄し、それぞれの膜片をマイクロチューブ中で１００μＬ程度の還元用緩衝液に浸漬した。そこに１ｍｇのジチオスレイトールを添加し、窒素封入して密閉し、１時間以上静置した。更に４−ビニルピリジン（アルドリッチ社製）１．５μＬを加え、遮光し、時々撹拌しながら２０分以上置いてタンパク質のシステイン残基のピリジルエチル化を行った。その後、蒸留水、２％アセトニトリル水の順でＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３の膜片を洗浄し、プロテインシークエンサーＰｒｏｃｉｓｅ４９１（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、それぞれＮ末端アミノ酸配列を２５残基決定した。ＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３のＮ末端２５残基のアミノ酸配列は同じであり、得られた配列は以下の通りであった。
ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３のＮ末端アミノ酸配列：Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys-Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys-Ala-Ser-Val-Asn（２５残基）（配列番号１）
【００８３】
（２）ＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の内部アミノ酸の同定
実施例１において得られたＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３をウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩し、凍結乾燥した。凍結乾燥したＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３約４０μｇを１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに入れ、５００μＬの還元用緩衝液を添加して溶解した。そこに１．４ｍｇのジチオスレイトールを添加し、窒素封入して密閉し、５時間静置した。更にモノヨード酢酸２．７ｍｇを添加し、遮光して３０分静置してタンパク質のシステイン残基のカルボキシメチル化を行った。その後、ウルトラフリー／Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋ（ミリポア社製）を用いて脱塩濃縮した。この還元カルボキシメチル化したＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３それぞれ約１０μｇに対し、約１／１００モル量のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社製）を添加し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）５０μＬ中で、３７℃で７２時間反応させた。この消化液を１７３Ａマイクロブロッターシステム（アプライドバイオシステムズ社製）に供したところ、ＳＴＣＥ１、ＳＴＣＥ３それぞれ７種のペプチドが分離され、ＰＶＤＦ［ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）］膜にブロットされた。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシークエンサーにより決定した。
【００８４】
その結果、ＳＴＣＥ１の内部アミノ酸配列は以下に示される通りであった。
LE-1：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys（８残基）（配列番号４）
LE-2：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys（９残基）（配列番号５）
LE-3：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg（１０残基）（配列番号６）
LE-4：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys（１０残基）（配列番号７）
LE-5：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe（７残基）（配列番号８）
LE-6：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr（７残基）（配列番号９）
LE-7：Gln-Asn-Asp-Trp-Tyr-Ser-Gln-Cys-Leu（９残基）（配列番号１０）
これらＮ末端アミノ酸配列及びペプチドマッピングによって得られた内部アミノ酸配列の相同性検索から、ＳＴＣＥ１はファミリー４５に属する新規なエンドグルカナーゼであることが示唆された。
【００８５】
一方、ＳＴＣＥ３の内部アミノ酸配列は以下に示される通りであった。
LE-8：Pro-Ser-Cys-Ser-Trp-Pro-Gly-Lys（８残基）（配列番号１１）
LE-9：Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-Cys-Cys-Lys（９残基）（配列番号１２）
LE-10：Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Thr-Phe-Thr-Phe-Arg（１０残基）（配列番号１３）
LE-11：Ala-Ser-Val-Asn-Gln-Pro-Val-Phe-Ala-Cys-Ser-Ala-Asn-Phe-Gln-Arg（１６残基）（配列番号１４）
LE-12：Ser-Gly-Cys-Asp-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Ala-Cys-Ala-Asp-Gln-Thr-Pro-Trp-Ala-Val-Asn-Asp-Asn（２２残基）（配列番号１５）
LE-13：Pro-Gly-Cys-Tyr-Trp-Arg-Phe-Asp-Trp-Phe-Lys（１１残基）（配列番号１６）
LE-14：Thr-Met-Val-Val-Gln-Ser-Thr-Ser-Thr-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Thr-Asn（１６残基）（配列番号１７）
これらＮ末端アミノ酸配列及びペプチドマッピングによって得られた内部アミノ酸配列の相同性検索から、ＳＴＣＥ３もファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであると思われた。しかしながら、ＳＴＣＥ１とＳＴＣＥ３の対応する内部アミノ酸配列が完全に一致したため、ＳＴＣＥ３はＳＴＣＥ１から生じた部分分解物である可能性が示唆された。
【００８６】
《実施例３：精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるセルロース含有繊維の毛羽除去活性の評価》
実施例１で得られた粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１を用いて、綿ニット生地に対する毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された青色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた青色綿ニット生地を下記の条件で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ５０％除去されるのに要する粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のタンパク質濃度を算出した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ６（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第１表に示した。
【００８７】
【表１】
【００８８】
《実施例４：精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるインデイゴ染めセルロース含有繊維の脱色活性の評価》
実施例１で得られた粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１を用いて、糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理した。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製 全自動洗濯機 ＳＣＷ５１０１）
温度：５５℃
時間：６０分
反応ｐＨ：ｐＨ６．２（６．７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液量：１５Ｌ
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製、ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝５となるのに必要な粗精製セルラーゼ調製液と、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第２表に示した。
【００８９】
【表２】
【００９０】
《実施例５：洗剤として配合した場合の精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５、及びＲＣＥＩの毛羽除去活性（澄明化活性）の比較評価》
実施例１で得られた精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、フミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させたものから単一に精製されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩ［セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ）（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）］を用いて、欧米の洗剤中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性（澄明化活性）を以下のように評価した。
予め染色された青色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた青色綿ニット生地を下記の条件において洗剤中で処理することにより、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する、精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５、及びＲＣＥＩのタンパク質濃度を算出した。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．８％
処理液：人工硬度水（２５ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第３表に示した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
《実施例６：水道水中の硬度が各種精製エンドグルカナーゼの毛羽除去活性に与える影響》
実施例１で得られた精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、フミコーラ・インソレンス培養液から得られた精製エンドグルカナーゼＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、フミコーラ・インソレンスにおいて大量発現させたものから単一に精製されたエンドグルカナーゼＲＣＥＩ［セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ）（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）］を用いて、人工硬度水中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を、各種硬度（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ）の人工硬度水中において、４種の精製エンドグルカナーゼ溶液を用いて、下記の条件下で処理をした。処理後の生地において、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する精製エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１、ＮＣＥ５、ＮＣＥ４、ＲＣＥＩのタンパク質濃度を算出し、そのタンパク質濃度の逆数値を毛羽除去活性値とした。そして、０ＦＨの硬度における毛羽除去活性値を１００としたときの、各硬度での毛羽除去活性相対値を求めた。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：１００ｍＬ
反応ｐＨ：ｐＨ６（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液：人工硬度水（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、エンドグルカナーゼ溶液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第４表に示した。
【００９３】
【表４】
【００９４】
《実施例７：エンドグルカナーゼＳＴＣＥ遺伝子のクローニング》
実施例２で明らかにしたＳＴＣＥ１及びＳＴＣＥ３の内部及びＮ末端アミノ酸配列は、同じファミリー４５であるフミコーラ・インソレンス由来のエンドグルカナーゼＮＣＥ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）のアミノ酸配列と相同性を有していた。そこで、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ中のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ遺伝子を検索するために、ＮＣＥ５遺伝子をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションによる解析を行い、更にその相同性遺伝子を単離した。
【００９５】
（１）スタフィロトリクム・ココスポラム由来のゲノムＤＮＡの単離
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）で２８℃、７２時間培養し、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体を凍結乾燥し、ブレンダーにて細かく破砕した後、ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）緩衝液８ｍＬに溶解した。これに１０％ＳＤＳを含むＴＥ緩衝液４ｍＬを加え、６０℃、３０分間保温した。その後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を１２ｍＬ加え、激しく振とうした。遠心後、水層を別の容器に移し、これに１ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウムを加え、氷中に１時間以上放置した。遠心後、水層を別の容器に移し、２．５容量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を乾燥させた後、５ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ Ａ）溶液を５μＬ加え、３７℃で１時間保温し、更に２０ｍｇ／ｍＬプロティナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）溶液５０μＬを加え、３７℃で１時間保温した。その後、３ｍＬのポリエチレングリコール溶液（２０％ＰＥＧ６０００、２．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）を加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を５００μＬのＴＥ緩衝液に溶解し、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出を２回行い、エタノール沈殿をした。沈殿物を７０％エタノールで洗浄後、乾燥し、適当量のＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ試料とした。
【００９６】
（２）サザンハイブリダイゼーションによるＮＣＥ５相同性遺伝子の検索
実施例７（１）で得られたスタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ約１０μｇを、複数の制限酵素（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩなど）で各々切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。これをナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン、アマシャム社製）に移しとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでＤＮＡを固定し、５倍濃度ＳＳＣ（７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、７５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させ、ＤＮＡを固定した。
プローブは、ＮＣＥ５遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＪＮＤ−ｃ５（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）をＢａｍＨＩで消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を回収することにより得た。これをＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）により標識化した。前述キット添付の説明書記載の方法に従って、ゲノムＤＮＡを固定したナイロンメンブランを４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションをした後、標識化したＮＣＥ５プローブを添加し、４２℃で１５時間、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のナイロンメンブランの洗浄は前述キット添付の説明書記載の方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６ｍｏｌ／Ｌ尿素を添加した０．６倍濃度ＳＳＣ（９ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、９０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を２回行った。洗浄処理を施したナイロンメンブランを、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させた。
その結果、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩで切断した場合、それぞれ大きさの異なる２本のバンドにハイブリダイズし、スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡ上には、ＮＣＥ５と相同性を有する２種類の遺伝子が存在することが推察された。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断した場合のハイブリダイゼーションにおいては、約１０ｋｂｐと約５ｋｂｐの２本のバンドが検出された。そこで、約１０ｋｂｐのバンドとして検出される遺伝子のクローニングを行った。
【００９７】
（３）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
スタフィロトリクム・ココスポラムのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、ＳｅａＫｅｍＬＥアガロース（ＦＭＣ社製）を用いた０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。１０ｋｂｐ付近を含むよう、約８〜１２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を定法に従って抽出、精製した。このＤＮＡ断片をファージベクター、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ ベクター（ストラタジーン社製）に連結した。これをエタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液に溶解し、この全量をギガパックＩＩＩゴールドパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ株に感染させた。この方法により得られた５×１０４個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。
【００９８】
（４）プラークハイブリダイゼーションによるＮＣＥ５相同遺伝子のスクリーニング
次に、実施例７（３）に従って得られたゲノムＤＮＡライブラリー（ＥｃｏＲＩ ライブラリー）をナイロンメンブラン（ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン、アマシャム社製）に移しとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムでＤＮＡを固定し、５倍濃度ＳＳＣで洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットの方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、実施例７（２）で標識化したＮＣＥ５遺伝子のプローブを添加し、４２℃で１５時間、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後のナイロンメンブランの洗浄は前述キット添付の説明書の方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６ｍｏｌ／Ｌ尿素を添加した０．６倍濃度ＳＳＣで４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、５分間の洗浄を２回行った。洗浄処理を施したナイロンメンブランを、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、４個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ株にファージを感染させ、１８時間後にファージ粒子を集めた。これら粒子を、Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｄ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．”，１５，６７３７，１９８７）に準じてプロテイナーゼＫ及びフェノール処理を行った後、エタノール沈殿により、ファージＤＮＡを分離した。
【００９９】
（５）ＮＣＥ５相同遺伝子のサブクローニング
４種のファージＤＮＡを複数の制限酵素で切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。ＤＮＡをＳｏｕｔｈｅｒｎの方法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．”，９８，ｐ．５０３−５１７，１９７５）によりナイロンメンブランに移しとり、実施例７（４）と同様にハイブリダイゼーションを行った。その結果、４種のファージＤＮＡは、複数の制限酵素の切断によっても共通のハイブリダイゼーションのパターンを示した。また、４種のファージＤＮＡをＳａｌＩで切断し、実施例７（４）と同様にハイブリダイゼーションを行った場合、共通して約４．４ｋｂｐのバンドに強いシグナル、及び約２．５ｋｂｐのバンドに弱いシグナルを示した。そのことから、この相同遺伝子はこの約４．４ｋｂｐと約２．５ｋｂｐのＤＮＡにまたがって存在していると考え、この２つの大きさのＤＮＡを回収し、プラスミドｐＵＣ１１９のＳａｌＩサイトにそれぞれサブクローニングを行った。約４．４ｋｂｐのＤＮＡをサブクローニングして得られたプラスミドをｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ４．４、約２．５ｋｂｐのＤＮＡをサブクローニングして得られたプラスミドをｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ２．５とした。
【０１００】
《実施例８：ＮＣＥ５相同遺伝子の塩基配列の決定》
実施例７（５）にてサブクローニングしたＮＣＥ５相同遺伝子の塩基配列解析は以下の様に進めた。
塩基配列解析装置は、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーＩＩ（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲルは、ハイドロリンクロングレンジャー（ＦＭＣ社製）として入手可能なアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、尿素、及び過硫酸アンモニウム）はＡ．Ｌ．Ｆ．グレードの試薬（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作製条件、反応条件及び泳動条件の各々は、キットに添付の各説明書を参照し、設定した。
このようにしてプラスミドｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ４．４内の約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片とプラスミドｐＳＴＣＥ−Ｓａｌ２．５内の約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従い、決定した。更に、解読された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が実施例２で示されたＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列、及び内部アミノ酸配列と完全に一致した。これらの結果から、このＮＣＥ５相同遺伝子がＳＴＣＥ１をコードする遺伝子であることが示唆された。従って、以降においてはこのＮＣＥ５相同遺伝子をＳＴＣＥ１遺伝子として記載する。また、このゲノムＤＮＡから翻訳されたＳＴＣＥ１アミノ酸配列から、ＳＴＣＥ１は、Ｎ末端側に触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）、Ｃ末端側にセルロース結合領域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を有するファミリー４５に属するエンドグルカナーゼであることが判明した。しかしながら、このＤＮＡ配列にはイントロンと考えられる領域が含まれていることが推察されたため、ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離を行うこととした。
【０１０１】
《実施例９：ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離と塩基配列決定》
（１）スタフィロトリクム・ココスポラムからのｍＲＮＡの単離
スタフィロトリクム・ココスポラム ＩＦＯ ３１８１７株を３０ｍＬの（Ｔ）培地（２．０％アビセル、２．０％酵母エキス、２．０％コーンスチープリカー、１．０％グルコース、０．２％リン酸一カリウム）で２８℃、７２時間培養し、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体を凍結乾燥し、スパーテルにて細かく破砕した。全ＲＮＡはＩｓｏｇｅｎ（和光純薬工業社製）を用いて単離した。
まず、菌体粉末にＩｓｏｇｅｎ ５ｍＬを入れ、３０秒間Ｖｏｒｔｅｘ ミキサーで攪拌した後、５０℃で１０分間保温した。その後、室温で５分間放置した。次に、０．８ｍＬのクロロホルムを加えて、激しく振とうした。遠心分離後、水層を別の容器に移し、これに２ｍＬの４ｍｏｌ／Ｌ塩化リチウムを加えて混合し、−７０℃で１５分放置した。その後、遠心分離し、上清液を除いた後、沈殿物を１．６ｍＬの水で溶解し、次に１．６ｍＬのイソプロパノールを加えて混合し、４℃で３０分放置した。遠心分離後、上清液を除き、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、沈殿物を１．６ｍＬの水で溶解した。この液をエタノール沈殿し、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、０．４ｍＬの水に溶解し、これを全ＲＮＡとした。
次に、ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡアイソレ−ションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。まず前記で調製した０．２ｍＬの全ＲＮＡに１０ｍＬのエリューションバッファーを加え、更に５ｍＬのオリゴｄＴ溶液を加えた。上清液を除いた後、このオリゴｄＴをハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで２回洗浄した後、６８℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。この溶液をエタノール沈殿し、沈殿物を７５％エタノールで洗浄後、乾燥し、１５μＬの水に溶解し、これをｍＲＮＡ画分とした。
【０１０２】
（２）ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの単離
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡからのＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの調製は、Ｔａｋａｒａ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１を用い実施した。Ｎ末端側のプライマー配列は、ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列と実施例８で解析したゲノム配列から翻訳されるアミノ酸を考慮して決定し、Ｃ末端側のプライマー配列は、良く保存されているセルロース結合領域の情報（Ｈｏｆｆｒｅｎ，Ａｎｎｎａ−Ｍａｒｊａ．ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，８，ｐ．４４３−４５０，１９９５）と実施例８で解析したゲノム配列から翻訳されるアミノ酸を考慮して決定した。すなわち、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを作製し、前記のように調製したｍＲＮＡのうち１μＬを鋳型とし、ＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。
STCE1-CN: 5'-GCGGATCCATGCGTTCCTCCCCCGTC-3'（26mer）（配列番号１８）
STCE1-CC: 5'-GCGGATCCTTAAAGGCACTGCGAGTACC-3'（28mer）（配列番号１９）
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、Ｃ末端のプライマーを加えて、逆転写酵素によって、反応させた後、Ｔａｑポリメラーゼ（リコンビナントＴａｑ 、宝酒造社製）、Ｎ末端のプライマーを加え、９４℃・１分間、５０℃・２分間、７２℃・２分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、約１ｋｂｐの１断片であった。これをｐＵＣ１８にサブクローニング（プラスミドｐＵＣ−ＳＴＣＥ１）した。
【０１０３】
（３）ＳＴＣＥ１遺伝子の塩基配列の決定
前記断片の塩基配列を実施例８の方法に従い決定した。更に、この塩基配列とゲノムの塩基配列を比較し、イントロンを決定した。この解析の結果、スタフィロトリクム・ココスポラム由来のＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡ全塩基配列を決定した（配列番号２）。
得られたＳＴＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡの配列情報をもとに、イントロンを含んだ状態のＳＴＣＥ１遺伝子翻訳領域を含むＤＮＡ断片の単離を行った。実施例７（５）で用いた４種のファージＤＮＡを混合したものを鋳型に、プライマーＳＴＣＥ−ＨＮＢａｍ及びＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍを用いてＰＣＲを行った。増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩにて切断後、再度アガロース電気泳動による分離精製を行った。
STCE-HNBam:
5'-GGG GGA TCC TGG GAC AAG ATG CGT TCC TCC CCC GTC CTC-3'（39mer）（配列番号２０）
STCE-HCBam:
5'-GGG GGA TCC GCT CAA AGG CAC TGC GAG TAC CAG TC-3'（35mer）（配列番号２１）
プラスミドｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位に、約１．１ｋｂｐの前記断片を挿入し、プラスミドｐＵＣ１１８−ＳＴＣＥｅｘ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９６０２）を得た。更に、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、ＳＴＣＥ１遺伝子のイントロン及び翻訳領域の配列（配列番号２２）を確認した。なお、ＰＣＲの際に、プライマーＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍを使用することで、終止コドンの配列が、ＴＡＡからＴＧＡに変わっているが、生成してくるタンパク質のアミノ酸配列に変化はない。
【０１０４】
《実施例１０：ＳＴＣＥ１遺伝子のフミコーラ・インソレンスでの発現》
フミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７）における発現ベクターｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１は、発現したタンパク質がＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基とＳＴＣＥ１の残りのアミノ酸残基を融合するように作製した。すなわち、プラスミドｐＪＤ０１（国際公開第００／２４８７９号パンフレット）のＢａｍＨＩ部位に、ＮＣＥ４遺伝子（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を連結したプラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４を利用して構築した。
この理由として、ＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基は、ＳＴＣＥ１のＮ末端１６アミノ酸残基と一致しているため、ＮＣＥ４のＮ末端１６アミノ酸残基とＳＴＣＥ１の残りのアミノ酸残基を融合させても、発現させたタンパク質はＳＴＣＥ１と同一のものが得られるためである。
なお、プラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４は以下のように作製した。まず、ＮＣＥ４遺伝子（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を、プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に連結できるように、開始コドンのすぐ上流の配列と終止コドンのすぐ下流にＢａｍＨＩサイトを含む形で下記プライマーを設計し、国際公開第０１／９０３７５号パンフレットの実施例４（１）1)記載の方法に従って、プラスミドｐＣＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を鋳型に、ＰＣＲ法にて変異を導入し、増幅した。
NCE4-N-BamHI：
5'-GGGGATCCTGGGACAAGATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCC-3'（39mer）（配列番号２３）
NCE4-C-BamHI：
5'-GGGGATCCTGCGTTTACAGGCACTGATGGTACCAGTC-3'（37mer）（配列番号２４）
増幅されたＤＮＡをＢａｍＨＩで消化後、プラスミドｐＪＤ０１（国際公開第００／２４８７９号パンフレットの実施例Ｄ１（２）（ｂ））のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングしたプラスミドをｐＪＮＤ−ＮＣＥ４とした。
【０１０５】
（１）ＳＴＣＥ１発現プラスミドの構築
実施例９（２）で作製したプラスミドｐＵＣ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｎ−Ｓ９Ａ４、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＦｏｋＦをプライマーに用いてＰＣＲにて増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩとＦｏｋＩにて切断後、再度アガロース電気泳動により分離精製を行った。
STCE1-N-S9A4:
5'-GGGATCCTGCGTTTAAAGGCACTGCGAGTACCAG-3'（34mer）（配列番号２５）
STCE1-C-FokF:
5'-GGGATGCAAGCCGTCGTGCTCGTG-3'（24mer）（配列番号２６）
次に前述のプラスミドｐＪＮＤ−ＮＣＥ４をＳＴＣＥ１−Ｎ−ＦｏｋＲ４、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＢａｍＦプライマーにより、ＰＣＲにて増幅した断片をアガロース電気泳動により分離精製し、ＢａｍＨＩとＦｏｋＩにて切断後、再度アガロース電気泳動により分離精製を行った。
STCE1-N-FokR4:5'-GGGATGGGCCCAGCCGCACGAAG-3'（23mer）（配列番号２７）
STCE1-C-BamF:5'-GGGATCCTGGGACAAGATGC-3'（20mer）（配列番号２８）
プラスミドｐＪＤ０１のＢａｍＨＩ部位に、上記２断片を挿入し、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を得た。更に、この挿入断片について前述の方法にて塩基配列を決定し、ＳＴＣＥ１遺伝子（配列番号２）と同じであることを確認した。
【０１０６】
（２）プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換体の作製
フミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株をＮＳ培地（３．０％グルコ−ス、２．０％酵母エキス、０．１％ペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％塩化マグネシウム、ｐＨ６．８）において、３７℃で２４時間培養し、３０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（３ｍｇ／ｍＬβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、１ｍｇ／ｍＬキチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、１ｍｇ／ｍＬザイモリエース（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）、０．５ｍｏｌ／Ｌ シュークロース）１０ｍＬに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのプラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１が入った溶液１０μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
このプロトプラストを、ハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）添加ＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養し、形成したコロニーを形質転換体とした。
【０１０７】
（３）ｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１の形質転換体の培養及び同定
（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１をフミコーラ・インソレンス ＭＮ２００−１株に導入し、ハイグロマイシン耐性を示す株を４０株選抜した。これらを（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）において、３７℃で４日間培養し、得られた培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（プリキャストミニゲル １４％−ＳＤＳ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、１．０ｍｍゲル厚（テフコ社製））により解析した。その結果、１３クローンにおいて、ＳＴＣＥ１と推定される分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質が顕著に増強されていることが確認できた。
【０１０８】
（ii）組換えＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸残基の同定
（３）（ｉ）で大量発現したタンパク質がＳＴＣＥ１遺伝子由来であることを確認するために、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。まず、培養上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にて分離し、実施例２の方法に従ってＰＶＤＦ膜にタンパク質を電気的に写し取り、分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質について、プロテインシーケンサーに供した。その結果、エンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と一致した。
【０１０９】
《実施例１１：フミコーラ・インソレンスによって発現したＳＴＣＥ１によるセルロース含有繊維の毛羽除去活性の評価
実施例１０（３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分子量４５〜４９ｋＤ付近のタンパク質の発現が確認された１３株のうち、特に発現が顕著な１株（４Ａ−９株）の培養上清液を用いて、綿ニット生地毛羽除去活性を測定した。コントロールとして非形質転換体である親株由来の培養上清液を用いた。方法は実施例３に従い、ｐＨ６、４０℃、１時間の処理条件で、予め毛羽立たせた青色綿ニット生地を各種培養上清液で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ１００％除去されるのに要する培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第５表に示した。
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
《実施例１２：フミコーラ・インソレンスによって発現したエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１によるインデイゴ染めセルロース含有繊維の脱色活性の評価》
実施例１０で得られたＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）と非形質転換体である親株（ＭＮ２００−１株）の培養上清液を用いて、糊抜きした１２オンスのブルージーンズパンツを下記の条件で脱色処理をした。
試験機械：２０ｋｇワッシャー（三洋電機株式会社製 全自動洗濯機 ＳＣＷ５１０１）
温度：５５℃
時間：６０分
反応ｐＨ：ｐＨ６．２（６．７ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液）
処理液量：１５Ｌ
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
【０１１２】
脱色度を分光測色計（ミノルタ社製 ＣＭ−５２５ｉ）を用い、Ｌａｂ表示系のＬ値（明度）を測定した。コントロール（未処理繊維）に対するＬ値の増加（白色度の増加）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により脱色の度合いを評価した。すなわち、各試験区につき１０点のΔＬ値を測定し（ｎ＝１０）、その平均値を算出した。そして、ΔＬ値＝７となるのに必要な培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第６表に示した。
【０１１３】
【表６】
【０１１４】
《実施例１３：洗剤として配合した場合のフミコーラ・インソレンスによって発現されたエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１の毛羽除去活性（澄明化活性）の評価》
実施例１０で得られたＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）と非形質転換体である親株（ＭＮ２００−１株）の培養上清液を用いて、欧米の洗剤中における綿ニット生地に対する毛羽除去活性（澄明化活性）を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を下記の条件において洗剤中で処理することにより、形成された毛羽が目視で約５０％除去されるのに要する、培養上清液量中のタンパク質濃度を求めた。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：４０ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ （Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．４％
処理液：人工硬度水（２５ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
タンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第７表に示した。
【０１１５】
【表７】
【０１１６】
《実施例１４：水道水中の硬度が、フミコーラ・インソレンスにより発現された各種エンドグルカナーゼの毛羽除去活性に与える影響》
実施例１０で得られたエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１大量発現株（４Ａ−９株）、ＮＣＥ５を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第０１／９０３７５号パンフレット）、ＮＣＥ４を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）、ＲＣＥＩ（セルロース結合領域が欠失したＲＣＥＩ−Ｈ４（２５ｋＤ））を大量発現させたフミコーラ・インソレンス形質転換株（国際公開第０２／４２４７４号パンフレット）の計４株の培養上清液を用いて、洗剤中の各種硬度の水における、綿ニット生地の毛羽除去活性を以下のように評価した。
予め染色された茶色綿ニットの生地を、界面活性剤及びゴムボールとともに大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を、各種硬度（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ）の人工硬度水中において、４種の培養上清液を用いて、下記の条件下で処理をした。
試験機械：洗濯堅牢度試験機 Ｌ−１２（大栄科学精器製作所社製）
温度：４０℃
時間：６０分
処理液量：１００ｍＬ
洗剤の種類：ＮＥＷ Ｐｅｒｓｉｌ（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔａｂｌｅｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）（ＬＥＶＥＲ社製：イギリスにて２００２年３月に入手したもの。）
洗剤の添加量：０．４％
処理液：人工硬度水（０ＦＨ，５ＦＨ，１０ＦＨ，２０ＦＨ，４０ＦＨ：脱イオン水に８０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを加えた１０００ＦＨの人工硬度水を脱イオン水で希釈して作製。）
処理液には、培養上清液とともにゴムボールを適当量加えた。
処理後の生地において、形成された毛羽が目視でほぼ５０％除去されるのに要する培養上清液量中のタンパク質濃度を求め、そのタンパク質濃度の逆数値を毛羽除去活性値とした。そして、０ＦＨの硬度における毛羽除去活性値を１００としたときの、各種硬度での毛羽除去活性相対値を求めた。その結果を第８表に示した。
【０１１７】
【表８】
【０１１８】
《実施例１５：ＳＴＣＥ１遺伝子のトリコデルマ・ビリデでの発現》
（１）ＳＴＣＥ１発現プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１の構築
ＳＴＣＥ１遺伝子は、開始コドンの上流の配列にＳｍａＩ、終止コドンの下流にＸｈｏＩを予め含む形で以下のような変異導入用プライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。
STCE1-N-SmaI：
5'-CAGCCCGGGGCGCATCATGCGTTCCTCCCCTCTCC-3'（35mer）（配列番号２９）
STCE1-C-XhoI：
5'-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3'（33mer）（配列番号３０）
ＰＣＲの反応は、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｎ−ＳｍａＩ、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩの２本の合成ＤＮＡをプライマーにして、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）を用いて行った。反応条件については酵素に添付の説明書の条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、更に制限酵素ＳｍａＩ及びＸｈｏＩにて切断し、約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−Ｎを得た。
一方、ｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第９８／１１２３９号パンフレット）を制限酵素ＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで切断し、７．３ｋｂｐの断片を回収した。これに約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−ＮをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−Ｍ２を作製した。
更に、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２のＸｂａＩサイトにＰＤＨ２５（Ｃｕｌｌｅｎ， Ｄ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ＡＮＤ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，“Ｇｅｎｅ”，５７，ｐ．２１−２６、１９８７）由来ハイグロマイシンＢ耐性カセットを挿入し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１を構築した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１は、宿主のトリコデルマ内にて、自身の開始コドンを用いてＳＴＣＥ１タンパク質を発現するように構築した。
【０１１９】
（２）融合ＳＴＣＥ１発現プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１の構築
ＳＴＣＥ１遺伝子は、Ｎ末端をコードするアミノ酸（Ａｌａ）のコドンのすぐ上流にＳｐｈＩ、終止コドンの下流にＸｈｏＩを予め含む形で以下のような変異導入用プライマーを設計し、ＰＣＲ法にて増幅した。
STCE1-M-SphI：
5'-CCGCATGCGCTGATGGCAAGTCCACC-3'（26mer）（配列番号３１）
STCE1-C-XhoI：
5'-GCCTCGAGTACCTTAAAGGCACTGCGAGTACCA-3'（33mer）（配列番号３２）
ＰＣＲの反応は、プラスミドｐＪＮＤ−ＳＴＣＥ１を鋳型に、ＳＴＣＥ１−Ｍ−ＳｐｈＩ、ＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩの２本の合成ＤＮＡをプライマーにして、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）を用いて行った。反応条件については酵素に添付の説明書の条件に従った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、更に制限酵素ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩにて切断し、約０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−Ｍを得た。
一方、ｐＣＢ１−Ｍ２（国際公開第９８／１１２３９号パンフレット）を制限酵素ＳｐｈＩ及びＸｈｏＩで切断し、７．３ｋｂｐの断片を回収した。これに０．９ｋｂｐの遺伝子断片ＳＴＣＥ１−ＭをＴａＫａＲａ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結し、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２を作製した。
更に、プラスミドＳＴＣＥ１−Ｍ２のＸｂａＩサイトにＰＤＨ２５（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｌ．Ｊ．ＡＮＤ Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，“Ｇｅｎｅ”，５７，ｐ．２１−２６、１９８７）由来ハイグロマイシンＢ耐性カセットを挿入し、プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１を構築した。酵素などの反応条件についてはキットに添付の説明書の条件に従った。プラスミドＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１は、宿主のトリコデルマ内にて、ベクター由来の開始コドンを用い、ＣＢＨＩタンパク質のｐｒｅ−ｐｒｏ配列との融合タンパク質の形でＳＴＣＥ１タンパクを発現するように構築した。
【０１２０】
（３）プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１によるトリコデルマ・ビリデの形質転換体の作製
トリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０４７）をＳ培地（３．０％グルコース、１．０％イーストエキス、０．１％ポリペプトン、０．１４％硫酸アンモニウム、０．２％リン酸カリウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）において、２８℃で２４時間培養し、３０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、集菌した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬノボザイム２３４、５ｍｇ／ｍＬセルラ−ゼオノズカＲ−１０、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）に懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液で洗浄した。
このプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μＬに対し１０μｇのＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、又はＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１の入ったＤＮＡ溶液１０μＬを加え、氷中に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離し、最終的に１００μＬのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
このプロトプラストを、ハイグロマイシンＢ（２０μｇ／ｍＬ）添加ポテトデキストロース（ＰＤ）寒天培地（３．９％ポテトデキストロースアガー、１７．１％シュークロース）上に、ＰＤ軟寒天（１．３％ポテトデキストロースアガー、１７．１％シュークロース）とともに重層し、２８℃で５日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
【０１２１】
《実施例１６：ＳＴＣＥ１遺伝子のトリコデルマ・ビリデ形質転換体培養液中のＳＴＣＥ１の同定及び毛羽除去活性評価》
（１）ＨＰＬＣによる評価
プラスミドＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１をトリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株に導入し、ハイグロマイシンＢに耐性を示す株を５０株選抜した。これらをＳ培地において、３７℃で５日間培養し、得られた培養上清液を、ＴＳＫｇｅｌ ＴＭＳ−２５０カラム（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×７．５ｃｍ）（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、０．０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中、アセトニトリル濃度を０％から８０％までのリニアグラジエントにより流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで溶出し、ＵＶ２８０ｎｍでピークを検出した。その結果、ＳＴＣＥ１Ｎ−ｐＣＢ１形質転換体、ＳＴＣＥ１Ｍ−ｐＣＢ１形質転換体それぞれ３株に、野生株トリコデルマ・ビリデ ＭＣ３００−１株培養上清液には見られないピークを認めたため、それらピークを分取し、Ｎ末端アミノ酸分析を実施例２の方法に従って決定した結果、ＳＴＣＥ１のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と一致した。
【０１２２】
（２）ＳＴＣＥ１形質転換体培養液の毛羽除去活性の評価
実施例１６（１）においてＳＴＣＥ１が発現している２株と非形質転換体である親株（ＭＣ３００−１株）の培養上清液を用いて、実施例３に従い、ｐＨ１０（５ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム緩衝液）、４０℃で１時間の処理条件で、予め毛羽立たせた青色綿ニット生地を各種培養上清液で毛羽除去処理を行うことにより、形成された毛羽が目視評価でほぼ５０％除去されるのに要する培養上清液中のタンパク質濃度を算出した。
タンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッドラボラトリー社製）を用い、牛血清アルブミンをスタンダードとして定量した。その結果を第９表に示した。
【０１２３】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明の新規エンドグルカナーゼＳＴＣＥは、例えば、セルロース含有繊維の処理、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善、動物試料の消化能の改善などの用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】本発明のエンドグルカナーゼＳＴＣＥ１のアミノ酸配列［シグナルペプチド（配列番号３３）及び成熟タンパク質（配列番号３）］と、ファミリー４５に属する公知のエンドグルカナーゼであるＮＣＥ４［シグナルペプチド（配列番号３４）及び成熟タンパク質（配列番号３５）］及びＮＣＥ５［シグナルペプチド（配列番号３６）及び成熟タンパク質（配列番号３７）］の各アミノ酸配列とを比較した結果の内、そのＮ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【図２】図１に示す比較結果の内、そのＣ末端側配列に関する結果を示す説明図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。配列番号１８〜２１の配列で表される各塩基配列は、プライマーＳＴＣＥ１−ＣＮ、プライマーＳＴＣＥ１−ＣＣ、プライマーＳＴＣＥ−ＨＮＢａｍ、及びプライマーＳＴＣＥ−ＨＣＢａｍであり、配列番号２３〜３２の配列で表される各塩基配列は、プライマーＮＣＥ４−Ｎ−ＢａｍＨＩ、プライマーＮＣＥ４−Ｃ−ＢａｍＨＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−Ｓ９Ａ４、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＦｏｋＦ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−ＦｏｋＲ４、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＢａｍＦ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｎ−ＳｍａＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩ、プライマーＳＴＣＥ１−Ｍ−ＳｐｈＩ、及びプライマーＳＴＣＥ１−Ｃ−ＸｈｏＩである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来であって、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する、請求項１に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列である。
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、請求項２に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した平均分子量が４９ｋＤである。
【請求項４】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、請求項２に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した平均分子量が４５ｋＤである。
【請求項５】
スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含む、タンパク質、
（ｂ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項１１】
宿主が酵母又は糸状菌である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、又はピキア（Pichia）属に属する微生物である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、又はアクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法で生産されたタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
【請求項１８】
請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
【請求項１９】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２３】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２４】
セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２５】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
【請求項２７】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【請求項２８】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【請求項１】
スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属に属する微生物由来であって、エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特性を有する、請求項１に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列である。
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、請求項２に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した平均分子量が４９ｋＤである。
【請求項４】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）の特性を有する、請求項２に記載のタンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号１で表わされる配列を有し、
（Ｃ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した平均分子量が４５ｋＤである。
【請求項５】
スタフィロトリクム・ココスポラム（Staphylotrichum coccosporum）由来である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含む、タンパク質、
（ｂ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、及び
（ｃ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質と少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチド、
（ii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列において、１個又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（iii）配列番号２で表わされる塩基配列における第６４番目〜第９４８番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項１１】
宿主が酵母又は糸状菌である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
酵母が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、又はピキア（Pichia）属に属する微生物である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
糸状菌が、フミコーラ（Humicola）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、スタフィロトリクム（Staphylotrichum）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、フザリウム（Fusarium）属、又はアクレモニウム（Acremonium）属に属する微生物である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma
viride）である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法で生産されたタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
【請求項１８】
請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
【請求項１９】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２３】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２４】
セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項１８に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２５】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
【請求項２７】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【請求項２８】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜６及び請求項１６のいずれか一項に記載のタンパク質、又は請求項１７に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４７５
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５８８２（Ｐ２００５−５１５８８２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５７３３
【国際出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５７３３
【国際出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【出願人】（０００００６０９１）明治製菓株式会社 (180)
【Ｆターム（参考）】
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