エンドセリアーゼ−２リガンド
本開示は、とりわけ、エンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）に結合するタンパク質、例えば、高い親和性および選択性でＥＴ２を阻害する免疫グロブリンを提供する。ＥＴ２結合タンパク質は、血管新生関連障害を含む種々の障害を治療するために使用され得る。１つの態様において、本発明は、ＥＴ２（本明細書ではＥＴ２リガンドまたはＥＴ２−結合リガンドともいう）に結合するタンパク質リガンドを特徴とする。典型的には、このリガンドは、天然には存在していない。１つの実施形態において、このタンパク質リガンドは、重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。例えば、このリガンドは、抗体または全長抗体の抗原結合フラグメント（本明細書では抗ＥＴ２抗体ともいう）である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで、
（１）該第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトエンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し；かつ
（２）該タンパク質が以下の特徴：
（ａ）該タンパク質が３００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）でＥＴ２を阻害する；
（ｂ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｃ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｄ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｅ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；および
（ｆ）該タンパク質が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９によって結合されるエピトープと重複するエピトープに結合する、
のうちの１つ以上を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、ＥＴ２活性部位に結合する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、ＥＴ２酵素活性を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、インビボで血管新生の部位に蓄積する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、血管基底膜のタンパク質分解を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、インビトロまたはインビボで血管新生を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、同じポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、異なるポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、全長抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質が、ヒト抗体フレームワーク領域を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が、Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記ＨＣ可変ドメイン配列が配列番号８９を含み、前記ＬＣ可変ドメイン配列が配列番号９０を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて腫瘍増殖を減少する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
ＥＴ２に特異的に結合するタンパク質を同定する方法であって、該方法は：
ＥＴ２抗原を提供する工程；
ディスプレイライブラリーを提供する工程；
ＥＴ２抗原に特異的に結合する、該ライブラリー中に存在するメンバーを同定する工程であって、ここで該ライブラリーの各メンバーは、その表面上に異種タンパク質成分を提示し、各メンバーは該異種タンパク質成分をコードする核酸を含み、該異種タンパク質成分は多様なタンパク質成分のセットのメンバーである、工程；および
該同定されたメンバーから核酸分子を単離する工程であって、ここで、該核酸分子がＥＴ２抗原に特異的に結合するポリペプチドをコードする、工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記ライブラリーがファージライブラリーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記同定されたファージが、ＥＴ２に結合する競合リガンドを使用して溶出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中のエンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼ活性を検出する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とサンプルを接触させる工程、および標識を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
ＥＴ２発現細胞の活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とＥＴ２発現細胞を接触させ、それによってＥＴ２発現細胞の活性を調節する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記ＥＴ２発現細胞は、ヒト被験体におけるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、ＥＴ２発現細胞の基質への結合を妨害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質分解を調節する方法であって、該方法は、基質のタンパク質分解を阻害するために十分な量で請求項１に記載のタンパク質を与える工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記基質が、増殖促進因子（ｐｒｏ−ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）または血管新生促進因子（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質分解の調節が、血管新生および／または細胞増殖を減少する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を死滅させるかまたは該細胞の増殖を阻害するために十分な量で、該細胞を請求項１に記載のタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記細胞が癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体においてエンドセリアーゼを検出する方法であって、該方法は、検出可能な標識をさらに含む請求項１に記載のタンパク質を被験体に投与する工程；および該被験体において該標識を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
被験体においてエンドセリアーゼの活性を調節する方法であって、該方法は、エンドセリアーゼ活性の減少の必要がある被験体を同定する工程；および該被験体においてＥＴ２活性を調節するために有効な量で、請求項１に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、別の処置、または抗癌剤および／もしくは抗血管新生剤から選択される薬剤と組み合わせて投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
被験体における望ましくない血管新生によって特徴付けられる障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該障害を有するかまたは該障害に対する素因を有する被験体に、請求項１に記載されるタンパク質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記障害が、関節リウマチ、乾癬、糖尿病網膜症、翼状片の再発のような眼の障害、瘢痕エキシマレーザー手術および緑内障濾過手術、心臓血管障害、慢性炎症性障害、創傷修復、循環障害、クレスト症候群、皮膚科学的障害、および癌からなる群より選択される障害である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも８０％同一である配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項３６】
請求項１に記載の第１の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質および／または第２の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３８】
請求項３６に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１】
重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで、
（１）該第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列および第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ヒトエンドセリアーゼ−２（ＥＴ２）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し；かつ
（２）該タンパク質が以下の特徴：
（ａ）該タンパク質が３００ｎＭ未満の阻害定数（Ｋｉ）でＥＴ２を阻害する；
（ｂ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｃ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインのＣＤＲと少なくとも８５％同一である１つ以上のＣＤＲを含む；
（ｄ）該ＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＬＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；
（ｅ）該ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９のＨＣ可変ドメインと少なくとも８５％同一である；および
（ｆ）該タンパク質が、Ａ１０、Ｇ３、Ａ６、Ａ７、Ｃ８、Ｈ９、Ｇ１０−Ｒ２、Ｆ３−Ｒ２、Ｃ６−Ｒ２、Ａ４−Ｒ３、Ｃ１−Ｒ３、Ａ２、Ｂ５、Ｄ２、Ｄ５、Ｆ８、Ｈ１０、またはＣ９によって結合されるエピトープと重複するエピトープに結合する、
のうちの１つ以上を有する、タンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、ＥＴ２活性部位に結合する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、ＥＴ２酵素活性を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、インビボで血管新生の部位に蓄積する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、血管基底膜のタンパク質分解を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、インビトロまたはインビボで血管新生を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、同じポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ＨＣ可変ドメイン配列およびＬＣ可変ドメイン配列が、異なるポリペプチド鎖の成分である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、全長抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質が、ヒト抗体フレームワーク領域を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が、Ｆｃドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記ＨＣ可変ドメイン配列が配列番号８９を含み、前記ＬＣ可変ドメイン配列が配列番号９０を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて腫瘍増殖を減少する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
ＥＴ２に特異的に結合するタンパク質を同定する方法であって、該方法は：
ＥＴ２抗原を提供する工程；
ディスプレイライブラリーを提供する工程；
ＥＴ２抗原に特異的に結合する、該ライブラリー中に存在するメンバーを同定する工程であって、ここで該ライブラリーの各メンバーは、その表面上に異種タンパク質成分を提示し、各メンバーは該異種タンパク質成分をコードする核酸を含み、該異種タンパク質成分は多様なタンパク質成分のセットのメンバーである、工程；および
該同定されたメンバーから核酸分子を単離する工程であって、ここで、該核酸分子がＥＴ２抗原に特異的に結合するポリペプチドをコードする、工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記ライブラリーがファージライブラリーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記同定されたファージが、ＥＴ２に結合する競合リガンドを使用して溶出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中のエンドセリアーゼまたはエンドセリアーゼ活性を検出する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とサンプルを接触させる工程、および標識を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２０】
ＥＴ２発現細胞の活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載のタンパク質とＥＴ２発現細胞を接触させ、それによってＥＴ２発現細胞の活性を調節する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記ＥＴ２発現細胞は、ヒト被験体におけるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質が、ＥＴ２発現細胞の基質への結合を妨害する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が癌細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質分解を調節する方法であって、該方法は、基質のタンパク質分解を阻害するために十分な量で請求項１に記載のタンパク質を与える工程を包含する、方法。
【請求項２５】
前記基質が、増殖促進因子（ｐｒｏ−ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）または血管新生促進因子（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質分解の調節が、血管新生および／または細胞増殖を減少する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該細胞を死滅させるかまたは該細胞の増殖を阻害するために十分な量で、該細胞を請求項１に記載のタンパク質と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２８】
前記細胞が癌細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体においてエンドセリアーゼを検出する方法であって、該方法は、検出可能な標識をさらに含む請求項１に記載のタンパク質を被験体に投与する工程；および該被験体において該標識を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
被験体においてエンドセリアーゼの活性を調節する方法であって、該方法は、エンドセリアーゼ活性の減少の必要がある被験体を同定する工程；および該被験体においてＥＴ２活性を調節するために有効な量で、請求項１に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、別の処置、または抗癌剤および／もしくは抗血管新生剤から選択される薬剤と組み合わせて投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
被験体における望ましくない血管新生によって特徴付けられる障害を処置または予防する方法であって、該方法は、該障害を有するかまたは該障害に対する素因を有する被験体に、請求項１に記載されるタンパク質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
前記障害が、関節リウマチ、乾癬、糖尿病網膜症、翼状片の再発のような眼の障害、瘢痕エキシマレーザー手術および緑内障濾過手術、心臓血管障害、慢性炎症性障害、創傷修復、循環障害、クレスト症候群、皮膚科学的障害、および癌からなる群より選択される障害である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、または配列番号２４に対して少なくとも８０％同一である配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項３６】
請求項１に記載の第１の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質および／または第２の免疫グロブリンドメイン含有タンパク質を含むポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸。
【請求項３７】
請求項３６に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３８】
請求項３６に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２８７２１（Ｐ２００７−５２８７２１Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３３６７（Ｐ２００６−５２３３６７）
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６１４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９２７０
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５０４３２６８０４）ダイアックス コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６１４８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９２７０
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５０４３２６８０４）ダイアックス コーポレイション (8)
【Ｆターム（参考）】
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