キメラタンパク質、それらの製造およびそれを含有する医薬組成物
本発明は、移行ポリペプチドによって結合された、細胞−標的因子およびエルシニア外側タンパク質を含むキメラタンパク質に関する。本発明は、さらにそのようなキメラタンパク質の製造および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移行ポリペプチドによって結合された、細胞標的因子およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）外側タンパク質を含むキメラタンパク質に関する。本発明は、さらに、そのようなキメラタンパク質の製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのサイトカインは、生物学的制御について独自の観点を提供する。これらのサイトカインおよびそれらの受容体は、ほとんど全ての細胞で発現され、様々な、部分的に対照的な、広範囲の細胞活動を誘発する（Wallachら、１９９９、Locksleyら、２００１、およびWallachら、２０００）。それらは、免疫防御のすべての局面、並びに特定の発生過程を実質的に制御する助けになっている。これらの活動はすべて、異なる受容体に共有される、明らかに少数の一組のシグナル伝達タンパク質よって媒介される（Wallachら、１９９９）。
【０００３】
サイトカインは、通常、防御を強化する役割を果たす。しかし、過剰に作用すると、それらは、病原体が引起す損傷に匹敵し得る多大な損傷を引起し得る。実際に、サイトカインの不当な効果は、多くの疾患において、主要な病原性原因を構成する。
【０００４】
ＴＮＦファミリーのサイトカインは、先天性型および適合性型の両方の種々の免疫防御機序を広範囲に制御する。ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンドおよびその他などのサイトカインのいくつかの過剰な機能は、種々の疾患の病状に関与してきた。特に、広範な疾患、たとえば、マラリアおよび敗血症のような感染性疾患、リューマチ性関節炎、炎症性大腸炎および乾癬のような自己免疫疾患、および所定の型の癌におけるＴＮＦの病理学上の主要な役割については、幅広い証拠がある。実際に、抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体などの薬剤によってＴＮＦ作用を遮断することは、このような状況で療法を提供することが発見されている（Beutler、１９９９、Kolliasら、１９９９およびReimold、２００３）。リューマチ性関節炎やクローン病のようなある種の病理学的状況では、かなり多くの割合の患者が、抗ＴＮＦ療法に順調に応答する。しかし、これらの薬剤に、かなり不十分な応答を示すこれらの疾患の患者もいて、治療法について別のアプローチを見出す必要が生じている（Andreakosら、２００２）。
【０００５】
サイトカイン生産細胞による分泌後、可溶性タンパク質として単に作用する多くの他のサイトカインと異なり、ＴＮＦファミリーのリガンドは、細胞結合ＩＩ型膜透過タンパク質（可溶性の分泌タンパク質として製造されるリンホトキシンの例外を伴って）として生産される。それらは、この形態でそれらの効果を発揮することができ、リガンド生産細胞に隣接して位置する細胞にのみ影響を及ぼす（ジャクスタクリン制御）。それらのほとんどは、また減らされ（are also shed）、循環する可溶性分子を形成する。それらの可溶性リガンド、たとえば、ＴＮＦの一部は、可溶性サイトカインとして作用する能力があり、パラクリン制御因子（リガンド生産細胞に比較的密着して位置する細胞に影響を及ぼす）およびエンドクリン制御因子（遠く離れた細胞に影響を及ぼす）として作用する。ＴＮＦファミリーのある種のリガンド、たとえばＦａｓリガンドは、それらのシェド形態においては有効に作用せず、その形態では、細胞結合形態に対する拮抗剤としてさえ役割を果たし得る（Wallachら、１９９９およびLocksleyら、２００１）。
【０００６】
それらを産生する細胞の表面上のＴＮＦファミリーのリガンドの発生は、これらのリガンド産生細胞の特異的な標的化のための強力な手段を提供する。このような手段は、リガンドが病理学的役割を果たす状況においてリガンド産生細胞の選択的死滅を可能にできる。
【０００７】
いくつかの態様において、サイトカインを産生する細胞の破壊は、単なるサイトカイン分子の機能の直接的遮断より、このサイトカインの病理学上の効果に対してよりよい防御を提供することになり得る。サイトカイン生産細胞の破壊は、サイトカインのさらなる合成を防ぎ、従って、すでに合成されたサイトカイン分子の効果をただ遮断することによって得られる保護よりも、いっそう耐久性のある保護を提供し得る。
【０００８】
あるサイトカインを産生する細胞は、しばしば、特定の型の免疫応答を引出す役割を共に果たすいくつかの他のサイトカインを同時に製造する。周知の例は、固有の群のサイトカインを産生するＴｈ１−およびＴｈ２−型Ｔリンパ球であり、各々は、異なる型の免疫防御を引出す役割を果たす（Jankovicら、２００１）。従って、サイトカイン産生細胞の破壊は、その特定のサイトカイン合成の阻止に加えて、病理学的効果におけるその特定のサイトカインを支援するいくつかの他のサイトカイン合成の阻止につながる。
【０００９】
循環するサイトカインを遮断することが、全身に影響する一方で、サイトカイン生産細胞を死滅させること、またはサイトカイン生産を弱体化させることは、これらの細胞が存在する体内における特定の部位に限定することができ、従って、他の部位でのサイトカインの利益効果を維持しつつ、その特定の部位でのサイトカイン有毒効果の破棄を可能にし得る。
【００１０】
クローン病における抗ＴＮＦ療法効果の研究は、ＴＮＦ生産細胞を死滅させることが、ある種の病理学的状況では、実際に、ただＴＮＦを遮断することによって得られるよりも有効な治療法を提供しうることを示唆する。この疾患における抗ＴＮＦ抗体の治療的効果は、抗体によるＴＮＦ生産細胞の死の早期の初期導入に関連することが分かった（Lugeringら、２００１、Van Deventer、２００１およびVan den Brandeら、２００３）。
【００１１】
ＴＮＦ−αは、活性化単核細胞、マクロファージおよびＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現される。これらの細胞は、それらの細胞分解経路における主要成分として、膜固定ＴＮＦ−αを示す。以下の疾患において、活性化マクロファージが、それらの病理学に関与することが推測されている：敗血性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎および乾癬性関節炎（SinghおよびSuruchi、２００４）、乾癬（Asadullahら、２００２）、筋萎縮性側索硬化症（Ghezziら、１９９８）、インシュリン依存性糖尿病（Kagiら、１９９９）、移植片対宿主疾患（Hongoら、２００４）および鎌状赤血球貧血（Belcherら、２０００年）。以下の疾患において、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が、それらの病理学に関与することが推測されている：全身性紅斑性狼瘡(Pachecoら、2002)、反応性関節炎および他の自己免疫疾患(Mittler、２００４）。しばしば、活性化ＣＤ８＋Ｔは、特定の臓器に対して有害である。たとえば、肝臓炎症中に起こる集約的肝細胞アポトーシスは、肝臓への活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸透に続いて誘発される。
【００１２】
細胞表面構成要素に結合する標的分子に連結した細胞毒素より構成されるキメラ分子は、強力な細胞キラー剤としての役割を果たし得る。細胞型特異的表面構成要素を認識する標的部分の選択が、インビボで特定の細胞の選択的破壊のためにこのような細胞傷害性キメラを使用することを可能にし得る。たとえば、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素（ＰＥ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）に融合した癌特異的エピトープに対する抗体より構成されるキメラ融合タンパク質は、癌細胞を特異的に標的として、死滅させることができる。このような抗癌効果は、毒素が、その受容体が特定の腫瘍において優勢である、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のようなホルモンまたはリガンドと融合しているキメラを用いて得ることもできた。同様に、細胞毒素含有キメラは、病原体に苦しめられた細胞に標的とされるように設計された。たとえば、ＨＩＶ感染細胞は、シュードモナス外毒素に結合した、ｇｐ１２０の保存的ＣＤ４結合部位またはＣＤ４に対する、抗−ｇｐ１２０抗体より構成される免疫毒素を使用して選択的に破壊することができる（BrinkmannおよびPastan、１９９５、PastanおよびKreitman、１９９８およびPastan、２００３）。
【００１３】
細胞毒素を標的とする可能な一種の薬剤またはＴＮＦファミリーのリガンドを発現する細胞に対する他の調節剤は、これらのリガンドに対する抗体である。実際に、ＣＤ４０リガンドに対する抗体は、ＣＤ４０リガンド生産細胞に対する毒素を標的にするために適用されてきた（ＥＰ１００５３７２）。
【００１４】
米国仮出願番号第６０／５８２，８２７号は、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas eruginosa）外毒素移行およびＡＤＰリボース化ドメイン（ＰＥ３８またはＰＥ Ｉ−ＩＩ）に結合したｐ５５ＴＮＦ受容体（ＴＢＰ−１）の細胞外部分を含むキメラタンパク質（ＴＢＰ−ＰＥ３８）を開示する。ＴＢＰ−ＰＥ３８が、表面ＴＮＦを過剰発現する上皮細胞と結合し、このような細胞における細胞毒性を誘発することが示された。
【００１５】
多様な細菌毒素は、細胞表面上で受容体と特異的に結合し、受容体媒介型エンドサイトーシスを介して内在化する。一般に、受容体媒介型エンドサイトーシスは、細胞外タンパク質（たとえば、受容体）および小型粒子（たとえば、リガンド）の選択的取り込みを可能にする（Molecular cell biology、Darnell LodishおよびBaltimore）。特に、原形質膜上における受容体に対する粒子の結合の後、受容体−リガンド複合体は、クラスリン被覆ピット内に内在化され、摘み取られ、クラスリン被覆小胞となる。その後、クラスリン被覆物はトリスケリオンに脱重合化し、エンドソームと称される、非被覆小胞を生じる。エンドソームは、約５．０の内部ｐＨによって特徴づけられるＣＵＲＬ（受容体とリガンドを分離する区分（compartment uncoupling receptor and ligands））と称される分離小胞と融合する。低いｐＨは、粒子を受容体から解離させる。受容体に富んだ領域は、萌芽して、受容体を再循環して原形質膜に戻す別個の小胞を形成する。
【００１６】
受容体媒介型エンドサイトーシスによって内在化されるタンパク質は、種々の巡り合わせを受ける。たとえば、それらのタンパク質は、リソソームに移動され、破壊され、最小限に加工され、細胞中に残り得るか、または別の場合には、エンドサイトーシスされた物質は、細胞膜を完全に通過し、内在化されるかまたは反対側で原形質膜から分泌される。
【００１７】
シュードモナス内毒素Ａ（ＰＥ）は、α２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質を介して結合し、細胞に入る。内在化に続いて、ＰＥは、フリン様プロテアーゼによってエンドソーム中でタンパク質分解によって加工され、３８ｋＤａ活性フラグメント（ＰＥ−３８）へと分解され、そのようなフラグメントが細胞質ゾルに移行し、そのＡＤＰが伸長因子２をリボース化してタンパク質合成阻害を引起す。
【００１８】
ＰＥのタンパク質分解処理（エンドソーム中で、またはフリン様プロテアーゼにより、小胞体中で行われる）および細胞質ゾルへのＰＥ−３８の移行は共に、有効な細胞毒性に必須である。ＰＥのドメインＩ（図１）は、細胞結合活性を含み、ドメインＩＩは移行活性を含み、ドメインＩＩＩは、ＡＤＰリボシル化活性を含む。これらのドメインの各々は、独立して再折り畳みされうる構造単位から構成される。移行ドメイン（ＰＥＩＩ）は、６つの連続ａ−へリックス（Ａ−Ｆ）を含む。タンパク質の一次構造に基づいた欠失地図作製研究は、ＡおよびＢへリックスを包含するアミノ末端セグメントが、ＰＥ移行に必要とされることを示す（Siegallら、１９８９）。カルボキシル末端では、Ｅへリックス内のいくつかの残基が重要であり、一方他の残渣およびＦへリックス全体は、移行活性の見掛け損失なしに欠失され得ることが分かった。さらに、最後のαへリックス（Ｆ）の欠失は、ＰＥの移行活性および細胞毒性の両方を増強した（Taupiacら、１９９９）。
【００１９】
ＰＥ Ｉ−ＩＩなどのＰＥ外毒素の部分はｂａｒｎａｓｅという細菌酵素をエンドソームから真核細胞の細胞質へ移行できるという証拠はあるが（Priorら、１９９６）、異種タンパク質に隣接されたドメインIIの移行活性は報告も証明もなされていない。
【００２０】
シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は強力な細胞傷害性薬剤である。シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は、多種多様な細胞における細胞性代謝全体に影響を及ぼすタンパク質の合成を阻害する。対して、他の種類の細菌毒素は特定の代謝経路を制御することが知られている。たとえば、６つのエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）毒素は各自、特定のシグナル伝達経路を調節する。
【００２１】
ペスト菌（Yersinia pestis）は、腺ペストの原因物質である。ペスト菌は、３つのヒト流行病：ユスティニアヌスペスト（Justinian plague）（６〜８世紀）、黒死病および近代ペストの原因である。エルシニア エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）およびエルシニア シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）は、食品媒介病原体であり、胃腸炎を引き起こす。エルシニアの病原性は、哺乳類宿主の免疫防御に打ち勝つその能力に起因する。
【００２２】
エルシニアの外側タンパク質Ｐ（ＹｏｐＰ）は、Ｙ．エンテロコリティカにより産生される毒素である。ＹｏｐＰは、マウスにおける全身性感染の確立に必須であり、ＴＮＦ−αの産生を阻害し、感染したマクロファージにおいてアポトーシスを誘発する（Cornelis, Nature２００１）。ＹｏｐＰの細胞質ゾル送達は、細菌性二重膜エンベロープおよび宿主細胞膜を横切った移行を伴い、宿主細胞との接触時に活性化される、活性化タンパク質分泌機械設備（III型タンパク質分泌システム）により誘発される。このようなタンパク質分泌機械設備は、ＹｏｐＰの細胞質ゾルへの送達に絶対に必要とされる。
【００２３】
ＹｏｐＰは、ＢＩＤ／カスパーゼ８経路の活性化および抗アポトーシス因子の放出の抑制によるか、またはＮＦ−κＢの阻害を伴う少し「直接的」な経路を通して、のいずれかの２つの経路の１つを通してアポトーシスを活性化すると考えられる。ＹｏｐＰは、ＩＫＫによるＮＦ−κＢ阻害剤のリン酸化を妨げ、それによりＮＦ−κＢの核への移動を阻害する。ＹｏｐＰはまた、上流ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫｓ）を阻害することにより、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の阻害を引き起こす。ＹｏｐＰのこれらの阻害作用の結果として、ｃＡＭＰ−応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および活性化転写調節因子（ＡＴＦ）−１などの転写アクチベーター、ならびにＮＦ−κＢは、接着分子およびＴＮＦ−αなどの前−炎症性サイトカインの合成に関与する遺伝子の転写を刺激することが出来ない（Orthら、１９９９、Orth、２００２およびPalmerら、１９９９）。
【００２４】
ＹｏｐＰは、プロテアーゼ、たぶん脱−ＳＵＭＯ化ファミリーのプロテアーゼであると思われる（ＳＵＭＯは「低分子ユビキチン−関連変更分子（small ubiquitin-related modifier）」である。）。ＹｏｐＰの推定二次構造は、アデノウイルス（ＡＶＰ）のシステインプロテアーゼのものと類似している。触媒トライアッドにおける突然変異（ＹｏｐＰのＨｉｓ１０９、Ｇｌｕ１２８およびＣｙｓ１７２）により、ＹｏｐＰはＭＡＲＫまたはＮＦ−ｋＢ経路のいずれかを阻害することができなくなる。
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、キメラタンパク質の、エンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへの移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合された、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列およびエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質に関する。
【００２６】
本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質の細胞特異的標的因子は、標的細胞の表面に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分である。たとえば、ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）またはＴＮＦ結合タンパク質２（ＴＢＰ−２）のようなＴＮＦ／ＮＧＦリガンドの受容体の細胞外部分である。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質におけるＹｏｐは、ＹｏｐＰ、またはアルギニン−１４３残基で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９またはＯ：８などの減少したアポトーシス活性を有するか、またはアポトーシス活性を有さないＹｏｐＰである。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドは、最後のα−へリックスドメイン（Ｆ）に欠損のある移行ドメインもしくは図３でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のアミノ酸配列に相当する、本明細書においてＰＥＩＩｔｒと称される移行ドメイン（配列番号：３）のようなシュードモナス外毒素移行ドメインまたはそのフラグメントを含む。
【００２９】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、１つまたは２つのフリン切断部位を含む。さらに詳細には、ＰＥ外毒素の切断部位ような１つのフリン切断部位が、移行可能な前記ポリペプチドのＮ末端に配置され、一方、ジフテリア毒素の切断部位（たとえば、ＲＶＲＲ）のような他のフリン切断部位は、前記Ｙｏｐタンパク質のＮ末端に配置される。
【００３０】
さらに別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称される、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素ＰＥＩＩｔｒの移行ドメインフラグメント、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩より構成される。
【００３１】
本発明の１つの態様において、本発明のキメラタンパク質の細胞標的は、マクロファージまたは単核細胞のようなリンパ球様細胞である。
【００３２】
本発明別の態様において、本発明のキメラタンパク質の細胞標的は、上皮細胞である。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し、さらに、そのＤＮＡ配列は、真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをコードしうる。
【００３４】
さらに別の実施態様において、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供し、そのＤＮＡは任意に、ＥＦ−１αプロモーターのような、ＮＦ−ｋＢから独立する活性を示すプロモーターに機能的に連結する。
【００３５】
さらに別の実施態様において、本発明は、前記発現ベクターを包含するＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、酵母および昆虫細胞などの原核または真核細胞のような宿主細胞を提供する。
【００３６】
本発明の１つの態様において、前記宿主細胞を培養し、産生された前記キメラタンパク質を単離することを含む前記キメラタンパク質を製造する方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様において、前記キメラタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、ＴＮＦのようなＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、疾患の発症または経過に関与している疾患治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用を提供する。該疾患の例として、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患、および癌が挙げられる。
【００３９】
１つの実施態様において、本発明は、活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用に関する。該疾患の例として、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患、および鎌型赤血球貧血があげられる。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、疾患治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用に関し、ＮＦ−ｋＢ活性が、好ましくは、該疾患におけるＮＦ−ｋＢ活性が標準経路を介してＮＩＫにより誘発される際に、該疾患の発症または経過において関与する。
【００４１】
１つの態様において、本発明は、ＴＮＦのようなＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが、発症または経過に関与している疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
１つの実施態様において、本発明は、活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与している疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、ＮＦ−ｋＢ活性化が、発症または経過に関与しており、おそらくＮＦ−ｋＢ活性化が、標準経路を介してＮＩＫによって誘発される疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４４】
さらに別の実施態様において、本発明は、単球細胞やマクロファージ細胞などの標的細胞における細胞表面上のＴＮＦなどのリガンドの異常な発現を減少させる方法であって、該標的細胞をキメラタンパク質に暴露することを含み、該キメラタンパク質が、細胞の細胞質ゾルにエンドソームから、該キメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメント（ＰＥＩＩｔｒなど）によって結合される、標的細胞の表面上に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分およびＹｏｐを含む方法を提供する。
【００４５】
別の実施態様において、細胞は、インビトロで前記キメラタンパク質に暴露される。
【００４６】
さらに別の実施態様において、細胞は、インビトロで前記キメラタンパク質に暴露される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列、およびエンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへのキメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントに結合されたエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質に関する。
【００４８】
本発明によれば、細胞特異的標的因子は、特定の細胞に存在する特異的細胞表面構成要素に結合する能力のある任意の因子であり得る。たとえば、可能な標的因子は、特異的細胞表面構成要素に結合する抗体、ホルモン、サイトカイン、および好ましくはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のような標的細胞の表面上に発現されるリガンド用受容体の細胞外部分である。受容体の可溶型の自然発生が、ＴＮＦの２つの受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、Ｆａｓおよびその他を含むＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのほとんど全ての構成要素について説明されている。本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質は、自然発生か、または人工的可溶型ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のいずれかを包含する。ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいずれかの特定の受容体の全細胞外ドメイン、またはそのフラグメント、ムテイン、融合タンパク質または他の機能性誘導体を使用できる。本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＮＦ受容体の細胞外部分；ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）を包含する。本発明の別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＢＰ−２を包含する。
【００４９】
本発明によるキメラタンパク質は、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、好ましくはＹｏｐＰ、さらに好ましくは、Ｙｏｐ血清群Ｏ：８より低いアポトーシス活性を示すことが示されたアルギニン−１４３で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９およびＯ：８のような、アポトーシス活性が減少したか、またはアポトーシス活性がないＹｏｐＰのようなエルシニア外側タンパク質を包含する（Ruckdeschelら、２００１）。
【００５０】
本発明によれば、移行を可能にするポリペプチドは、細胞質ゾルへのタンパク質のアクセスを可能にする能力のある任意のポリペプチドを含む。移行を可能にするこのようなポリペプチドは、細菌毒素、たとえば、ボツリナム毒素、アントラックス毒素、ジフテリア毒素、リシン毒素、および好ましくはシュードモナス外毒素に由来し得る。本発明の１つの実施態様において、最後のａ−へリックスドメインを欠くシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のポリペプチド（図２におけるＤＮＡ配列、配列番号：２、図３におけるおよびアミノ酸配列、配列番号：３参照）（ＰＥＩＩｔｒ）が移行のために使用される。
【００５１】
本発明のキメラタンパク質は、１つまたはそれ以上のフリン切断部位を含み得る。本発明の１つの実施態様において、２つの異なるフリン切断部位は、キメラタンパク質中に存在し、特に、一方は、移行ポリペプチドのＮ末端に配置され、もう一方は、ＹｏｐのＮ末端に配置され、それらはシュードモナス・アエルギノーサ外毒素、およびジフテリア毒素起源由来である。
【００５２】
本発明の１つの実施態様において、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素の移行ドメインフラグメントＰＥＩＩｔｒ、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰより構成されるキメラタンパク質が開発される（ＴＢＰ−ＹｏｐＰと名付けられた）。
【００５３】
本発明は、ＴＮＦを結合し、かつＮＦ−ｋＢ活性を阻害し、および／または細胞におけるＴＮＦ放出を阻害する能力のある、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩を提供する。
【００５４】
本発明によるキメラタンパク質は、マクロファージおよび単核細胞などのリンパ球様細胞において、および上皮細胞において結合、貫通および作用することが分かった。ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、単核細胞の特徴を示す活性化細胞株（ＴＨＰＩ）において、結合し、細胞毒性を誘発することが分かった。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性活性は、ＴＨＰＩ細胞の表面ＴＮＦを通して特異的に誘発されることが分かった。対照的に、シュードモナス外毒素の移行および触媒ドメイン（ＰＥ３８）に融合したＴＢＰより構成される別のキメラタンパク質であるＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号で開示された）は、活性化ＴＨＰＩ細胞の細胞毒性を引き起さなかった。ＴＢＰ−ＰＥ３８は、表面ＴＮＦを過剰発現するように遺伝子操作された上皮細胞株であるＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞毒性がある一方で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、これらの細胞に対して細胞毒性がないことが分かった。
【００５５】
本発明によるキメラタンパク質は、所定のリガンドが細胞の表面で過剰に発現される特定の細胞で作用する能力があり、そのようなリガンドがより低いレベル、または正常なレベルを発現するように該細胞を「育成する」能力がある。たとえば、本発明の１つの実施態様において、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化一次マクロファージに対して、細胞毒性を誘発せず、ＴＮＦ分泌を阻害するという、望ましく特異的効果を有する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「ムテイン」は、タンパク質の天然に存在する成分の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、元のタンパク質と比較して、得られる産物の活性を大きく変化させることなく、様々のアミノ酸残基によって置換されるか、または欠失されるか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、タンパク質の元の配列に加えられるタンパク質の類似体を意味する。これらのムテインは、既知の合成により、および／または部位指定突然変異発生技術、またはそれらに適切な他のあらゆる既知技術によって製造される。
【００５７】
本発明によるムテインとしては、ストリンジェントな条件化で、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるタンパク質が挙げられる。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が、従来的に「ストリンジェント」と称す、ハイブリダイゼーションおよびそれ続く洗浄条件を意味する。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、前記、Interscience, N.Y.,§§6.3および6.4（１９８７、１９９２）、およびSambrookら（Sambrook, J. C.、Fritsch, E. F.およびManiatis, T.（１９８９）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００５８】
限定されないが、ストリンジェントな条件の例としては、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間において、試験下のハイブリッドの算定Ｔｍより１２〜２０℃低い洗浄条件；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃で３０〜６０分間および、その後、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、６８℃で３０−６０分間の洗浄条件が挙げられる。当業者らは、ストリンジェントな条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにもよることを理解している。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubel、前記参照。
【００５９】
このようないずれかのムテインは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰと実質的に同様であるか、または勝る活性を示すように、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのアミノ酸配列を十分に複写したアミノ酸配列を有する。たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの１つの特徴的活性は、特定の細胞に浸透し、細胞毒性を引起し、および／またはＴＮＦ放出および／またはＭＡＲＫのシグナル伝達を阻害する能力である。細胞毒性、ＴＮＦ分泌、およびｐ３８リン酸化を測定するためのアッセイは、以下の実施例で示される。ムテインが、活性化ＴＨＰＩ細胞において実質的な細胞毒性活性を有し、および／または活性化一次マクロファージ細胞においてＴＮＦ放出を阻害し、および／またはＨｅＬａＭ９細胞においてｐＰ３８リン酸化を阻害する能力がある限り、ＴＢＰ−ＹｏｐＰと実質的に同様の活性を示すとみなされ得る。したがって、いかなる所定のムテインが、以下の実施例でＴＢＰ−ＹｏｐＰについて示されるように、日常的な実験の手段によって、本発明のキメラタンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を示すかどうかが決定され得る。
【００６０】
好ましい実施態様において、いかなるこのようなムテインは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性または相同性を示す。
【００６１】
同一性は、配列を比較することによって決定される２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較されるべき配列の長さに渡って、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸一致のことを言う。
【００６２】
正確な一致のない配列については、「同一性率（percent identity）」を決定し得る。一般的に、比較すべき２つの配列を、その配列間の最大相関を得るために、並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかでの、「ギャップ」の挿入が含まれる。同一性率は、同一、または非常に類似の長さの配列に対してとりわけ好適である、比較している配列のそれぞれの全配列にわたり（グローバルアライメントと呼ばれる）、または等しくない長さの配列により好適である、より短い、定義された長さにわたって（ローカルアライメントと呼ばれる）、決定してよい。
【００６３】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本発明分野でよく知られている。したがって、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Devereux Jら、１９８４、Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95）にて使用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（J Theor Biol.1981 Jul 21;91(2):379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25;147(1)195-7.1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最適な単独領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた、本技術分野で公知であり、たとえば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（www.ncbi.nlm.nih.govにて、ＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能、Altschul D Sら,1990 J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3)403-10,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul;87(14):5509-13, Altschul S Fら,Nucleic Acids Res.1997 Sep 1;25(17):3389-402)およびFASTA(Pearson W R,Methods Enzymol.1990;183:63-98.Pearson J Mol Biol.1998 Feb 13;276(1):71-84）がある。
【００６４】
従って、本発明によって使用することができるムテインＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそれをコードする核酸としては、本明細書において示される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、当業者が日常的に得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限の組が挙げられる。
【００６５】
本発明によるムテインについての好ましい変化は、「保存的」置換として知られている置換である。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの保存的アミノ酸置換としては、その群のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に類似の生理化学的特性を有する基内の同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham Science．１９７４ Ｓｅｐ ６；１８５（４１５４）：８６２−４）。アミノ酸の挿入および欠損がまた、それらの機能を変化することなく、好ましくは挿入または欠損が、数個のアミノ酸、たとえば３０以下、好ましくは１０以下にのみ関与し、機能的配座に対して必須であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換せず、前記で定義した配列で実施してよい。そのような欠損および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインが、本発明の範囲内である。
【００６６】
本発明に使用するためのＴＢＰ−ＹｏｐＰのムテインを得るために使用されうるタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、Markらに対する米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号；Kothsらに対する第５，１１６，９４３号、Namenらに対する第４，９６５，１９５号；Chongらに対する第４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する第５，０１７，６９１号で示されるもの、および米国特許番号第４，９０４，５８４号（Shawら）で示されるリシン置換タンパク質などのあらゆる既知方法段階を含む。
【００６７】
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、残基上の側鎖として存在するか、本技術分野で公知の方法によって、Ｎ−またはＣ−末端基への添加物である官能基から調製し、薬理学的許容性を維持する限り、すなわちＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性の活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊しない限り、本発明に含まれる、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの誘導体、およびそれらのムテインをカバーしている。
【００６８】
これらの誘導体には、たとえば、抗原部位をマスクし、体液中のＴＢＰ−ＹｏｐＰの滞留を延長しうるポリエチレングリコール側鎖が含まれる。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級または二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部位と形成したアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボン酸アロイル基）、またはアシル部位と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリルまたはスレオニル基のもの）が含まれる。
【００６９】
本発明による「活性分画」は、たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのフラグメントでありうる。用語フラグメントは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの所望の生物学的活性を保持する短いペプチドである分子の任意の一部（subset）に該当する。フラグメントは、ＴＮＰ−ＹｏｐＰのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、活性化ＴＨＰＩ細胞におけるその細胞分解特性および／または活性化一次マクロファージ細胞におけるＴＮＦ放出の阻害効果および／またはＨｅＬａＭ９細胞におけるｐＰ３８リン酸化の阻害について結果物フラグメントを試験することによって、十分に作製され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから、一度に１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが知られており、そのようにして決定された望む生物学的活性を保持するフラグメントが、従来の実験のみによって生じる。
【００７０】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ムテインおよびその融合タンパク質の活性分画として、本発明は、さらに、前記分画がＴＢＰ−ＹｏｐＰに実質的に類似の活性を示すという条件で、タンパク質分子単独、またはそれに連結した結合分子または残基を伴ったポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体、たとえば、糖またはリン酸残基、またはそれら自身によるタンパク質分子または糖残基の凝集体を網羅する。
【００７１】
本明細書において、用語「塩」は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのカルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野で知られた手段によって形成され得、無機塩、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩などを含み得、たとえば、トリエタノールアミン、アルギニン、またはリシン、ピペリジン、プロカイン等のようなアミンで形成されたものとして有機塩基を用いた塩が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、塩酸または硫酸のようなたとえば、鉱酸との塩、およびたとえば、酢酸またはオキザロ酸のような有機酸との塩が挙げられる。もちろん、このような塩はいずれも、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの生物学上の活性を保持するに違いない。
【００７２】
「機能性誘導体」は、あらゆる従来の方法により、変化がＴＢＰ−ＹｏｐＰを作製するアミノ酸の配列で導入されたＴＢＰ−ＹｏｐＰから作製される多量体も包含する。これらの変化は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ分子の伸長または切断、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰの１つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失または置換を含みうる。前記変化の内で、キメラタンパク質の特性に影響を及ぼしうるものはないことが分かった。
【００７３】
移行を可能にするポリペプチドに、そしてＹｏｐに細胞特異的標的因子を結合させる手段は様々である。１つの実施態様では、組換え手段によって、細胞特異的標的因子を、移行を可能にするポリペプチドに、そしてＹｏｐに融合させる。当業者に知られている任意のクローニング手段によって、２つのタンパク質およびポリペプチドをコードする遺伝子を、ｃＤＮＡとして、またはゲノム形態で単離できる。タンパク質およびポリペプチドも、化学的に連結させ得る。この化学的連結は、ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）から入手可能なもの、ロックフォードＩ１１（たとえば、ＢＳ３（ビス［スルホスクシニミジル］スベレート）のような二官能性リンカー分子を使用することによって行われうる。
【００７４】
組換え手段による細胞特異的標的因子、移行を可能にするポリペプチド、およびＹｏｐのあいだの融合は、直接的でありうるか、または任意の種類のリンカー、たとえばアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド、スルフィドリル基、ポリマーなどでありうる連結分子および／またはスペーサーを通してでありうる。連結分子は、キメラの局在化または内在化により崩壊されうる分子でありうる。
【００７５】
組換えＤＮＡ方法論を使用して本発明のキメラタンパク質を産生させることは、一般に、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出すこと、特定のプロモーターの制御下で、通常、発現ベクター中に存在する発現カセットに該ＤＮＡを入れること、宿主でタンパク質を発現させること、発現タンパク質を単離すること、必要に応じて、タンパク質を変性させることを含む。
【００７６】
本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および該ＤＮＡを包含する発現ベクターを提供する。本発明によるＤＮＡは、さらに、真核細胞で製造されるキメラタンパク質の分泌のためのシグナルペプチドをコードしうる。真核細胞における製造のための好ましい発現ベクターは、ＮＦ−ｋＢ、たとえばＥＦ−１αプロモーターに独立である活性を示すプロモーターに機能的に連結された本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００７７】
さらに、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを包含する宿主細胞に関する。宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、酵母、昆虫細胞のような真核細胞、および大腸菌のような原核細胞である。好ましくは、宿主細胞は、ＨｅＬａＭ９（下記の実施例参照）のようなＹｏｐの細胞死滅効果に耐性がある。
【００７８】
本発明によると、本発明の培養宿主を包含し、製造されたキメラタンパク質を単離するものである本発明によるキメラタンパク質を製造する方法の提供がある。
【００７９】
いったん発現されると、本発明の組換えキメラタンパク質を、当業界の標準手段によって精製でき、たとえば精製は、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの段階を含みうる。
【００８０】
発現および精製の後、キメラは、構成要素ポリペプチドの生来のコンフォメーションと実質的に異なるコンフォメーションを保有しうる。この場合には、ポリペプチドを変性させ、還元し、その後ポリペプチドに、好ましいコンフォメーションに再折り畳みさせることが必要でありうる。
【００８１】
変性は、組換えタンパク質を含有する粗材料を、カオトロピック剤（たとえば、尿素＜またはグアニジンＨＣｌ）、還元剤および高ｐＨの組合せに暴露することによって達成される。これらの条件は、通常、封入体でタンパク質の可溶化および変性を引起す。結局、タンパク質の透明液体を得る。この段階で、タンパク質は、二次または三次構造なしで完全に開放される。次の段階は、タンパク質の折り畳みを可能にするｐＨ、還元剤およびカオトロピック剤濃度の極端な条件を緩和することである。その生来の三次構造に折畳むタンパク質の能力を、その一次構造によって指示する。従って、混沌および還元剤濃度を低下させ、ｐＨを減らすことは、通常十分である。しかし、しばしば、条件の微細調節を必要とする。
【００８２】
本発明は、本発明のキメラタンパク質を包含する医薬組成物に関する。本発明の１つの実施態様では、キメラタンパク質は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内に特に有用である。非経口のための組成物は、一般に、抗体の溶液、または許容しうる担体、好ましくは水性担体中に溶解されたそのカクテルを包含する。多様な水性担体、たとえば水、緩衝液、０．４％生理食塩水などを使用しうる。
【００８４】
本発明の単回または多回投与は、患者によって要求され、寛容な場合に、投与量および頻度によって投与されうる。これらの処方におけるキメラ分子の濃度は、治療上の効果を得るために十分な量の分子を、体内に送出するように設計される。自己免疫疾患の場合には、組成物は、自己免疫疾患の経過および重度に影響を及ぼし、患者の症状を改善するのに十分である多量のキメラを送出するように設計されて、その疾患の減少または緩和にいたる。有効量は、投与の経路、治療されるべき疾患、および患者の症状による。
【００８５】
本発明のキメラタンパク質の種々の用途の中で、特定のヒト細胞によって引起される疾患または症状の治療または予防が挙げられる。たとえば、所定のリガンドが過剰に発現される特定の細胞。キメラタンパク質は、低レベルまたは正常レベルのリガンドを発現する細胞を死滅させるか、または「育成する」ために投与されうる。
【００８６】
１つの実施態様において、本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、疾患の病理発生または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造で、本発明のキメラタンパク質、好ましくはＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、またはフラグメントの使用を提供する。
【００８７】
別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＮＦが、敗血症ショック、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、マラリア、感染性肝炎、結核のような急性疾患、並びに癌関連悪液質、慢性ＧＶＨＤ、リューマチ様関節炎、小児性糖尿病、炎症性大腸疾患、および乾癬のような慢性疾患のような病原性の役割を果たす疾患の治療のために使用される。別の好ましい用途は、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現する悪性細胞によって引起される癌の治療のためのである。キメラタンパク質は、たとえば、移植の前の骨髄からの有害細胞の排除で、インビボでも使用されうる。
【００８８】
さらに別の実施態様において、キメラタンパク質は、活性化リンパ様細胞が、病気発生に、または疾患、たとえば敗血症ショック、リューマチ様関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患、および鎌状赤血球貧血の経過に関与している疾患の治療のために使用される。
【００８９】
さらに別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＮＦ−ｋＢ活性化が、疾患の発症または経過に関与している、好ましくは、ＮＦ−κＢを、正規の経路を介して誘発する疾患治療のために使用される。
【００９０】
ここで、本発明を記述して、例示によって提供される、本発明を限定することを意図しない、以下の実施例によって、本発明がより容易に理解できるものとなる。
【実施例】
【００９１】
実施例１． ｐ５５ＴＮＦ受容体（ＴＢＰ−１）の細胞外部分、シュードモナス外毒素ＩＩの切断移行ドメイン（ＰＥＩＩｔｒ）、ジフテリア毒素フリン切断部位（ＤＴ）、およびエルシニアＹｏｐＰタンパク質を含むキメラ遺伝子の構築（本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称す）。
図１Ａに図解で示されるとおり、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰ遺伝子（配列番号：１、図１Ｃ）を製造するために、可溶性型ｐ５５ＴＮＦ受容体をコードするＤＮＡフラグメント、最後の（Ｆ）α−へリックスを欠くシュードモナス外毒素ＩＩの切断移行ドメイン（それぞれ、図２、配列番号：２および図３、配列番号：３のＤＮＡおよびアミノ酸配列）、および毒素ＹｏｐＰに融合されたジフテリア毒素フリン切断部位の各々を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、ライゲーションした。
【００９２】
可溶性型ｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ジーンバンクＩＤ Ｍ７５８６６）は、ヒト尿から単離された可溶型受容体の主要な種のもの（ＴＢＰ−１）に対応し（米国特許第５，８１１，２６１号）、それは、受容体の細胞外ドメインのＡｓｐ４１からＡｓｎ２０１までを示す（スイス−プロット取得番号：Ｐ１９４３８）。テンプレートとして全長ＴＮＦＲＩ（プラスミドｐｃ５５）（Nopharら、１９９０に記載されるプラスミドｐｃ５５）および以下のプライマー：
フォアワードプライマー：
【化１】
を使用して、ＰＣＲ（１）増幅（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）から得た高誠実Ｔａｑポリメラーゼを使用）によって、可溶型ｐ５５ＴＮＦ受容体、ＴＢＰ−１を単離した。
【００９３】
このプライマーは、ＮｄｅＩ制限部位（キメラ遺伝子を発現ベクターに挿入するために後に必要とされる）、続いてＴＢＰ−１の５’末端を重複する２０ヌクレオチド（コーディング配列をイタリック体にする）を有する。
【００９４】
リバースプライマー：
【化２】
【００９５】
このプライマーは、ＴＢＰ−１の相補３’末端を重複する２２ヌクレオチド、続いてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＴＢＰ ＤＮＡを、ＰＥＩＩｔｒをコードするＤＮＡに連結するために後に必要とされる）を有する。
【００９６】
シュードモナス・アエルギノーサ外毒素Ａ型遺伝子（受託番号Ｋ０１３９７、ＮＣＢＩジーンバンク）の残基２７８から３８４までに対応するポリペプチド配列、ＰＥＩＩｔｒをコードするＤＮＡ配列（配列番号：２）は、テンプレートとしてシュードモナス・アエルギノーサの血清群６１のゲノムＤＮＡ（Leitner G. Kimron Veterinary Institute、イスラエル）、および以下のプライマー類：
フォアワードプライマー：
【化３】
を使用したＰＣＲ増幅によって単離した。
【００９７】
このプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＰＥＩＩｔｒを、前記増幅したＴＢＰ−１ ＤＮＡに連結するために後に必要とされる）、続いてリンカー配列をコードする１４ヌクレオチド、ccggaggtcccgag、および続いて外毒素Ａ（受託番号Ｋ０１３９７）のヌクレオチド１５７７−１６０３に対応するＰＥドメインＩＩの５’末端を重複する２７ヌクレオチドを有する。
リバースプライマー：
【化４】
【００９８】
このプライマーは、ＳｍａＩ制限部位、および３８４の前にあり、３８４アミノ酸残基を含むＰＥの残基をコードするＤＮＡに相補的なヌクレオチド１８９４−１８７４を有する。それは、ＰＥのアミノ酸３８４の前にあり、それを含むアミノ酸残基をコードする相補的ヌクレオチド（gtcgttgccggtgccctgccg）、停止コドンおよびＳｍａＩ（cccggg）およびＥｃｏＲＩ（gaattc）制限部位（下記で単離されるＤＴ−ＹｏｐＰ ＤＮＡフラグメントにライゲートするために後に必要とされる）を包含する。ＰＥＩＩｔｒフラグメント（ＰＣＲ２産物）を、ＤＴ−ＹｏｐＰ（ＰＣＲ３産物、下記参照）にライゲーションする前に、ｐＥＴ−ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００９９】
ジフテリア毒素（ＤＴ）−フリン切断部位（ＲＶＲＲ）をコードするＤＮＡで、その５’末端にライゲートされたＹｏｐＰをコードするＤＮＡを作製するために、三番目（ＰＣＲ３）を行った。ＰＣＲ３については、エルシニア・エンテロコリティカ血清群Ｏ：８のＹｏｐＰエフェクター残基１−８６４をコードするＤＮＡをテンプレート（ＴｒＥＭＢＬ、受託番号Ｑ９３ＫＱ５）として使用し、以下のプライマー：
フォアワードプライマー：
【化５】
を使用した。
【０１００】
このプライマーは、ＳｍａＩのヌクレオチド配列（ＴＢＰ−１−ＰＥＩＩｔｒにライゲートするために後に必要とされる）、続いてＤＴフリン切断部位（ＲＶＲＲ）をコードする１２ヌクレオチド、およびＹｏｐＰ遺伝子の５’末端を重複する３１ヌクレオチドを包含する。
【０１０１】
リバースプライマー：
【化６】
【０１０２】
このプライマーは、ＹｏｐＰ遺伝子の３’末端を重複する３０相補的ヌクレオチド、およびＥｃｏＲＩの制限部位（ＴＢＰ−１−ＰＥＩＩｔｒにライゲートするために後に必要とされる）を包含する。
【０１０３】
ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰフラグメントを得るために、前記増幅ＤＴ−ＹｏｐＰ（ＰＣＲ３産物）ＤＮＡフラグメントを、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、続いて適合性末端を通してＰＥＩＩｔｒにライゲートさせた。
【０１０４】
ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挟まれたキメラＴＢＰ−ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰフラグメントを得るために、ＴＢＰ−１（ＰＣＲ１産物）を、ＰＥＴＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰを含有するｐＥＴ基本のベクターのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。キメラＴＢＰ−ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰ遺伝子をコードするベクターｐＴＢＰ−ＹｏｐＰを、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＤＨ５α）中に形質転換し、増幅し、当技術分野において既知の方法により精製した。
【０１０５】
実施例２． 真核細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性の評価
ＹｏｐＰは、炎症の発生における中心であることが知られる転写因子であるＮＦ−κＢを阻害する。以下の実験は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質が、真核細胞におけるＮＦ−κＢ阻害活性を保持するかどうかを、細菌性封入体におけるタンパク質の製造および可溶化タンパク質の再折り畳みの前に試験するために行った。
【０１０６】
最初に、真核細胞におけるＹｏｐＰの発現用の適切なプロモーターを探すために、Ｙｏｐを単独で含むベクターを用いて実験を行った。この目的のために、ＹｏｐＰ ＤＮＡを、２つの異なる真核生物のベクターｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡおよびｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡ（インビトロゲン）に挿入した。ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡおよびｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡは、それぞれ異なるプロモーター、ＣＭＶおよびＥＦ−１αを有する。これらのベクターは、タグ付タンパク質の製造を可能にする。タグ付ＹｏｐＰタンパク質を得るために、ＹｏｐＰの停止コドンを、ＰＣＲによって突然変異させて、バリンをコードさせた。ＹｏｐＰをタグ付きにすることにより、タグ特異的抗体を使用することによってウエスタンブロット分析で発現したＹｏｐＰの検出を可能にする。
【０１０７】
ＹｏｐＰおよびＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＹｏｐＰをコードするｐｃＤＮＡ３基本のベクターと、レポーター遺伝子Ｈｉｓ−Ｔ７−ＧＦＰの両方を同時トランスフェクトさせることによって２９３細胞で発現された。平行して、ＹｏｐＰ−ｖ５およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ−ｖ５は、ＥＦ１−αプロモーターの制御下で、ＹｏｐＰ−ｖ５をコードするｐＥＦ６基本のベクターと、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ−ｖ５の両方を同時トランスフェクトさせることによって２９３細胞で発現された。
【０１０８】
図４のＢで示されるとおり、ＣＭＶプロモーターによって制御されるＨｉｓ−Ｔ７−ＹｏｐＰの発現は、弱すぎて、検出用の抗−Ｔ７抗体を使用したウエスタンブロット分析によって見ることができなかった。ＣＭＶプロモーターは、３つの強力なＮＦ−κＢ結合部位を含有する（図４のＣ）。従って、おそらく、ＣＭＶプロモーターによって制御されるタンパク質の発現は、ＮＦ−κＢの強力な阻害剤、ＹｏｐＰによって阻害された。
【０１０９】
図４のＢで観察された結果はまた、トランスフェクション反応におけるＹｏｐＰプラスミド濃度を１から５μｇまで増大させると、同様にＣＭＶプロモーターの阻害によってもっともおそらく引起されるＧＦＰ−発現の減少という結果になった。
【０１１０】
対照的に、ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーター下で発現された場合に容易に検出された（図４のＡ）。さらに、ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーター下で発現されたレポーター遺伝子β−ガラストシダーゼの発現を阻害しなかった（図４のＡ）。
【０１１１】
ＣＭＶプロモーターとは異なり、ＥＦ−１αプロモーターの活性は、ＮＦ−κＢ活性から独立している（図４のＣ）ので、ＹｏｐＰおよびキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーターの制御下で効率よく発現された。
【０１１２】
ＥＦ−１αプロモーターの制御下で発現されたＹｏｐＰが、真核細胞中でＮＦ−κＢ活性を阻害するかどうかを調べるために、以下の実験を行った。ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性を調べるために、２９３細胞を、ＹｏｐＰをコードするｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡまたは空のｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡベクターと、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔ−プロモーター下でルシフェラーゼをコードするベクターとで同時トランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＴＮＦで処理してＮＦ−κＢ活性化を誘発するか、または未処理細胞のままとし、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現（活性）を測定した。
【０１１３】
ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、トランスフェクションの４８時間後、２９３細胞を、６時間、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−αによる誘発後、細胞を、３回、ＰＢＳで洗浄し、トリトン／グリシルグリシン溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、氷上で溶解し、溶解物を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ Ｋ3ＰＯ4、ｐＨ７．８（またはＮａ2ＨＰＯ4））で４回希釈した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２ｍＭ ＡＴＰおよび２００μＭ ルシフェラーゼを添加した。
【０１１４】
図５のＡに示されるとおり、ベクター（ｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡ）単独でトランスフェクトされた細胞のＴＮＦ−α処理（およびＮＦ−κＢ活性化）は、非処理細胞に比較して、６，０００以上のルシフェラーゼ単位の増大を示した。空のベクターの代わりに、ＹｏｐＰをコードするベクター（０．１または５μｇ）を使用した場合に、ルシフェラーゼ活性の阻害（およびＮＦ−κＢ活性の阻害）が観察された。
【０１１５】
代わりに、ＮＦ−κＢ活性化は、ＮＩＫ（スイス−プロット一次受託番号Ｑ９９５５８、名称：細胞分裂で活性化されるタンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ１４、同義語：ＮＦ−カッパ ベータ−誘発性キナーゼ）を過剰発現させることによって誘発することができる。ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害作用を、ＮＩＫの過剰発現によって媒介されるＮＦ−κＢ活性化でも評価した。図５のＢは、ＮＩＫをコードする発現ベクター（ｐＮＩＫ）で細胞をトランスフェクトすると、トランスフェクトの４８時間後にＮＦ−κＢ活性化を誘発したこと、ｐＮＩＫと、ＹｏｐＰをコードするベクターとの同時トランスフェクトが、ＮＦ−κＢ活性化を防止することを示す。
【０１１６】
ＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害が、ＮＦ−κＢ活性化の代替経路の阻害を介して引起されるという可能性を探索した。この目的のために、代替経路によるＮＦ−κＢ活性化に特異的である代謝変化を、ＹｏｐＰの存在下で、または非存在下で誘発されるＮＦ−κＢ活性化に続いて測定した。たとえば、異所性の添加ＹｏｐＰの存在下、または不在下におけるＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化に続いて、ｐ１００の分解およびｐ５２の見掛けにおける変化をモニターした。図５のＣにおける結果は、ｐ５２およびｐ１００のレベルが、ＹｏｐＰの存在下で影響されなかったことを示す。従って、ＹｏｐＰによるＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化の阻害は、正規の経路の阻害のみを介して引起されるようである。
【０１１７】
前記結果に基づいて、ＥＦ−１αプロモーターを、真核細胞におけるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰの発現を制御するために選択した。ｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡベクターのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩクローニング部位に、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩに隣接したＴＢＰ−ＹｏｐＰ挿入物をライゲートするために、挿入物およびベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ突出部位を、それぞれ、ライゲーションの前に充填した。ライゲーション後、生じたプラスミドは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６と名付けられた。
【０１１８】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性を調べるために、２９３細胞を、空のベクター、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６またはｐＹｏｐＰ−ｖ５−Ｈｉｓのいずれかと、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔ−プロモーター下でルシフェラーゼをコードするレポーターベクターとを同時トランスフェクトした。ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、トランスフェクトした４８時間後、細胞を、６時間、５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−αによる誘発後、細胞を、ＰＢＳで三回洗浄し、トリトン／グリシルグリシン溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で氷上で溶解し、溶解物を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ Ｋ3ＰＯ4、ｐＨ７．８（またはＮａ2ＨＰＯ4））で４回希釈した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２ｍＭ ＡＴＰおよび２００μＭ ルシフェラーゼを添加した。
【０１１９】
ベクター単独でトランスフェクトされ、ＴＮＦ−αで処理された細胞の溶解液が、非処理細胞の溶解液と比較して、８０，０００以上のルシフェラーゼ単位の増大（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化）を示した。空のベクターの代わりに、ＹｏｐＰ単独またはＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラのいずれかをコードするベクターを使用した場合、ルシフェラーゼ発現の阻害（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化の阻害）が観察された（図６のＡ）。抗−ｖ５および抗−ＴＢＰ−１抗体を用いた、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６でトランスフェクトされた細胞由来の溶解液のウエスタンブロット分析により、全長キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、約６３ｋＤａの見掛け分子量で真核細胞の細胞質で発現されることを示した（図６のＢ）。プラスミドから発現されることによって、キメラタンパク質が、フリンおよびフリン様タンパク質が作用するオルガネラであるゴルジまたはエンドソームに入らなかったので、キメラタンパク質は、フリンまたはフリン様プロテアーゼによって切断されなかった。
【０１２０】
得られた結果は、いったん真核細胞中に入ると、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質が、ＹｏｐＰ単独と同じくらい有効にＮＦ−κＢ活性を阻害する能力があることを示す。
【０１２１】
実施例３． 細菌細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの産生
ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、真核細胞で活性であること（先行の実施例参照）が立証された後、キメラタンパク質は、以下のとおり細菌細胞中で産生された。
コンピテントＢＬ−２１／ｐＬｙｓＳ（ＤＥ３）細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰを含有するベクター（ｐＴＢＰ−ＹｏｐＰ、実施例１参照）で形質転換し、アンピシリンを含有する２ＹＴ寒天プレートに播種し、３０℃で、一晩（約１６時間）インキュベートした。細胞形質転換体を、寒天プレートから収集し、プレート当たり５ｍｌの２ＹＴ中に懸濁させた。収集した細菌細胞を、３リットルの２ＹＴ中で、２００μｇ／ｍｌカルベニシリンと共に培養し、細胞培養物のＯ．Ｄ．600が、０．６になるまで３０℃でインキュベートした。その後、細胞を２０℃に移し、組換えタンパク質発現の誘発のために、１ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で処理した。ＩＰＴＧ添加の４５分後、２００μｇ／ｍｌリファンピシン（ＤＭＳＯ中に１００ｍｇ／ｍｌの保存溶液）を、その細胞に添加した。細胞培養物を、５時間、２０℃で成長させ、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により収集し、得られた細胞ペレットは、−７０℃で凍結保存した。
【０１２２】
細胞溶解物を調製するために、凍結細胞ペレットを、氷上で解凍させ、１００ｍｌの緩衝液Ａ［カルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ ｗ／ｏ」）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍｇのＭｇＳＯ4、４錠の完全プロテアーゼカクテル（ロッシュ）、３０ｍｇ／ｌのＤＮＡエースＩ（シグマ））］に再懸濁させた。細胞凝集塊を破壊するために、細菌懸濁液を、氷上で超音波処理した。以下の方法により、全細菌溶解を得た。３×３５ｍｌの細胞を、５０００プサイでフレンチプレスにかけ、その後、１５０００プサイで二回プレスにかけた。その後、溶解細胞を、ＳＳ−３４ローターを採用する、ソルバル遠心機で５０分間、４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心分離（２７，０００×ｇ）にかけた。ペレットを、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび３％トリトンＸ−１００を含有する４０ｍｌの「ＰＢＳ ｗ／ｏ」に再懸濁し、氷上で超音波処理して、封入体を再懸濁した。溶解細胞から放出される封入体を、５０分間、４℃、２７，０００×ｇで、超遠心分離により沈澱させた。封入体を、さらに二回、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよびトリトンを含有する４０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、トリトンの不在下で、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する４０ｍｌのＰＢＳで三回洗浄した。
【０１２３】
組換えタンパク質のほとんどを含有する封入体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定されるように、図７のＡ）を、８Ｍ 尿素を含み、ｐＨ１２〜１２．８に滴定された５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する変性溶液に溶解した。使用された変性溶液の量は、封入体の湿重量の４４３倍に等しかった。封入体の全溶解を促進するために、溶液を激しく渦回転させ、氷上で超音波処理した。
【０１２４】
タンパク質を、ｐＨ９．５で、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液で１０倍希釈して再生させ、穏やかに攪拌（２００ｒｐｍ）しながら、４℃で１８〜２０時間インキュベーションにかけた。
【０１２５】
２．５リットルの再折り畳みタンパク質を、限外濾過機ＰＭ３０（アミコン）を介して超遠心分離により１５倍濃縮し、濃縮タンパク質の最終体積を、約１７０ｍｌとした。ブラッドフォード試薬（Bradford reagent）（シグマ）によって、再折り畳み粗タンパク質のタンパク質濃度を、約１００μｇ／ｍｌであると概算した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ融合タンパク質を、約１０％の再折り畳み粗タンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質バンドの密度測定器により概算されるとおり）であると概算した。したがって、３リットルの細菌培養物から、約１．７ｍｇのキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質を得るか、または５００ｍｇ封入体から、１７ｍｇの全粗タンパク質を得て、その１％付近のもの（約１７０ｎｇ）が、活性キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質であった（下記の実施例４参照）。
【０１２６】
得られた結果は、細菌性封入体で産生されるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰは、再折り畳みでき、６３Ｋｄａの正確なサイズを示したことを示す（図７）。
【０１２７】
実施例４． ＴＮＦに対するキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質の結合
細菌細胞で産生されるタンパク質（実施例３参照）である再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＴＮＦ結合活性を保持するかどうかを評価するために、以下の実験を行った。
【０１２８】
ＴＮＦ被覆プレートを使用して、ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合を評価した。ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合を、ＴＮＦに対する非キメラ組換えヒトＴＢＰ−１（ＣＨＯ起源のＨＰＬＣ精製）と、ＴＮＦに対するシュードモナス・エルギノーサ外毒素の移行および触媒ドメインに融合されたＴＢＰ−１を含む別のキメラタンパク質であるＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された仮米国出願第６０／５８２８２７号で開示される）の結合と比較した（図８）。
【０１２９】
４℃で、１６時間、０．０２％ＮａＮ3を含有する０．１ＭのＮａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）中の２ｍｇ／ｍｌ精製ＴＮＦの溶液でプレートをインキュベートすることによって、９６ウエルのマイクロタイタープレートを、ＴＮＦで被覆した。インキュベーション後、ウエルをＰＢＳで洗浄して、さらに、３％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3を含有する０．２ｍｌ／ウエルＰＢＳ（遮断溶液）と共に、３７℃で、３時間インキュベートした。図８のＡで示される量のタンパク質を含有する、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ＴＢＰ−１またはＴＢＰ−ＰＥ３８の５０μｌサンプルを、ウエル（三重に）当たりに塗布し、そのプレートを、３７℃で、１時間インキュベートした。必要であれば、サンプルを遮断溶液で希釈した。１時間のインキュベーションに続いて、プレートを、遮断溶液で三回洗浄した。遮断溶液で１：１０００に希釈した５０μｌのウサギ抗−ＴＢＰ−１抗体を、ウエルに添加し、３７℃で、１時間、または４℃で一晩インキュベートし、遮断溶液で三回洗浄した。５０μｌの二次抗体、１：１０００に希釈された抗−ウサギ−ＨＲＰを、ウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、遮断溶液で三回洗い流した。０．０１％Ｈ2Ｏ2を含有する１００μｌの新しく調整した溶液ＡＢＴＳを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＢＰまたはキメラＴＢＰの存在を、４０５ｎｍで測定された緑色強度の見掛けにより検出した。
【０１３０】
図８で要約されるＴＮＦ結合アッセイで、ＨＰＬＣ精製ＴＢＰ−１のＴＮＦ結合活性を、１００％（図８のＢ）とすると、ＴＮＦ−αに対する粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合許容量は、約０．５〜１％であることが分かった（図８のＢ）。再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰが、封入体の全タンパク質のわずか５〜１０％であることを考慮して（先行の実施例および図７参照）、我々は、タンパク質の少なくとも１０％が適切に再折り畳みされていると結論付けた。したがって、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ再折り畳みの効率が、１０％に近いＴＢＰ−ＰＥ３８の再折り畳みの効率（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号）に類似であると分かった。主要な差は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８が、封入体中の粗タンパク質の３０％以上を表すことであった。
【０１３１】
得られた結果は、細菌中で産生されるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、正確に再折畳まれ、ＴＮＦを結合する能力があることを示す。
【０１３２】
実施例５． インサイチューでの再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性
エルシニアの感染中に、ＹｏｐＰを細胞に注入する。いったん細胞の内側に入ると、ＹｏｐＰは、ＴＮＦ−α放出を抑制すること、および感染マクロファージにおけるアポトーシスを誘発することが知られている（Cornelis G.R. Nature、２００１）。以下の実験は、３つの異なる細胞：ＬＰＳ活性化ヒト単球ＴＨＰＩ細胞株、表面ＴＮＦ−αを過剰発現するヒト上皮ＨｅＬａ Ｍ９細胞株、およびマウスＬＰＳ−活性化一次マクロファージ中でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素の移行および触媒ドメインに融合したＴＢＰ−１を包含する別のキメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号）との比較で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性を調べるように設計された。特異性を試験するために、非キメラヒト組換えＴＢＰ−１を、ＴＮＦ結合について競合するいくつかのウエルにキメラタンパク質の直前に適用した。
【０１３３】
マクロファージ様細胞株に対するキメラタンパク質の細胞毒性を調べるために、ＴＨＰＩ細胞（実施例７）を、１６時間、インシュリン １ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン １μｇ／ｍｌ、亜セレン酸Ｎａ １ｎｇ／ｍｌ、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、ＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌのグルタミン、を含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中の９６ウェルプレート中でウエル当たり密度２００，０００細胞で播種した（マクロファージ様表現型およびＬＰＳ受容体の露出を誘発するために）。その後、１〜１．５時間、濃度１μｇ／ｍｌでＬＰＳ Ｅ．ｃｏｌｉ（０１１１−Ｂ４）を、１０μｇ／ｍｌの濃度でＧＭ６００１（細胞表面からＴＮＦ陰り（shading）を防止するメタロプロテイナーゼ阻害剤）と一緒に添加した。得られたＰＭＡ−ＬＰＳ−ＧＭ６００１処理ＴＨＰＩ細胞は、大量の表面ＴＮＦを有するマクロファージ細胞の表現型の特徴を示す。これらのマクロファージ様細胞株を、約２０時間、種々の濃度の再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８とインキュベートし、生存を評価するためにニュートラルレッドで染色した。表示した場合、組換えヒトＴＢＰ−１を、細胞表面ＴＮＦと競合する再折り畳みキメラタンパク質の直前に添加した。図９のＡで示されるとおり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、２５および５０μｇ／ｍｌの濃度で、活性化ＴＨＰＩ細胞の５０〜７０％の細胞死を引起す。活性ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、粗再折り畳みタンパク質のわずか１％付近を構成すること（図８のＢ）を考慮に入れると、我々は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの有効濃度が、０．２５μｇ／ｍｌ程度の低さであると評価した。ＴＢＰ−１は、１００倍過剰で使用した場合、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの毒性から細胞を完全に保護することが分かり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性効果が、活性化ＴＨＰＩ細胞の表面ＴＮＦを通して特異的に誘発されることを示した。
【０１３４】
対照的に、他のキメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ３８が、活性化ＴＨＰＩ細胞の細胞死を引起さないことが分かった（図９Ｂ）。
【０１３５】
得られた結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、活性化単球様細胞株の表面に特異的に結合し、細胞に浸透し、細胞死を引起すことを示す。
【０１３６】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰ細胞毒性の細胞特異性を試験するために、膜結合ＴＮＦを過剰発現する遺伝子操作された上皮細胞株であるＨｅＬａ Ｍ９においてＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性効果を評価した（実施例７）。
【０１３７】
ＨｅＬａ Ｍ９細胞を、１０％Ｆｃｓを有するＲＰＭＩ中の９６ウェルプレート中のウエル当たり密度１００，０００細胞で播種した。接着後、それぞれ、所定の濃度の再折り畳みキメラタンパク質ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８を、ウエルに添加し、約２０時間インキュベートした。表示した場合、組換えヒトＴＢＰ−１を、細胞表面におけるＴＮＦに対する結合に競合するため、再折り畳みキメラタンパク質の直前に添加した。２０時間のインキュベーションに続いて、細胞を、細胞生存を評価するためにニュートラルレッドで染色した。
【０１３８】
図１０で示される結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＴＨＰＩ細胞の約７５％細胞死を引起すことが示された濃度である２５μｇ／ｍｌ程度の高さの濃度で、上皮ＨｅＬａＭ９細胞に対する細胞毒性はなかったことを示す（図９のＡ）。
【０１３９】
対照的に、ＴＢＰ−ＰＥ３８は、０．６μｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９細胞において９０％以上の細胞死を引起した。このＴＢＰ−ＰＥ３８の濃度では、ＴＨＰＩ単球細胞株において細胞毒性効果を示さなかった（図９のＢ）。ＴＢＰ−１は、ＴＢＰ−ＰＥ３８の細胞毒性効果を防止し、ＴＮＦ結合によるＴＢＰ−ＰＥ３８作用の特異性を示す。ＴＢＰ−ＰＥ３８のバッチの一つは、非常に活性があり、０．０６μｇ／ｍｌ程度に低い濃度で細胞毒性があり、ＨｅＬａＭ９細胞の６５％近くまで死滅させた。
【０１４０】
全体において、これらのデータは、いったん細胞の内側に入ると、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、マクロファージ様細胞株に対して細胞毒性であるが、上皮ＨｅＬａＭ９細胞に対しては毒性がないことを示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞毒性ではないが、飢餓の後の血清活性化により引起されるｐ３８リン酸化のＴＢＰ−ＹｏｐＰ阻害により立証されるとおり（実施例６および図１０参照）、それは、表面ＴＮＦに結合し、ＨｅＬａ Ｍ９細胞に浸透することを示す実験上の証拠を得た（下記の実施例６参照）。
【０１４１】
再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性は、ＬＰＳ活性化一次マクロファージでも試験した。一次マクロファージの作製のために、雌マウスＣ５７ＢＬ／６に、１．５ｍｌ滅菌ブリューワーのチオグリコレートブロス（ジフコ（Difco））を、４日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）で注入した。腹腔滲出液（＞８５％マクロファージ）を、４日目に収穫し、遠心分離によりＰＢＳで洗浄し、１０％加熱不活化Ｆｃｓを含むＲＰＭＩ中に１×１００，０００マクロファージ／ウエルで、９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を１８時間接着させた。暖かい培地で洗浄することによって、非接着細胞を除去した。
【０１４２】
マクロファージ活性化を誘発するために、５μｇ／ｍｌのＧＭ６００１（カルバイオケム）の存在下で、マクロファージ単層を、図１２に示される濃度（１μｇおよび１０μｇ）のＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ ０１１：Ｂ４）を用いて１時間処理した。誘発後、細胞を、再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８の存在下、または非存在下で、さらに２時間インキュベートした。次に、細胞培養用の培地へのＴＮＦ−αの分泌を可能にするためＧＭ６００１なしで、同じ濃度のＬＰＳを用いて、培地をＲＰＭＩ＋１０％ＨＦｃｓに交換した。一晩インキュベートしたマクロファージの細胞培養培地を収集し、ＴＮＦ−αを、バイオアッセイによって測定した。細胞単層を、ニュートラルレッドで染色して、細胞生存を測定した。
【０１４３】
図１２で要約された、得られた結果は、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８のいずれも、活性化一次マクロファージに細胞毒性でなかったことを示す。
【０１４４】
ＹｏｐＰが、ＴＮＦ分泌を阻害することが知られているので、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下でインキュベートされたＬＰＳ−活性化一次マクロファージの成長培地中に分泌されるＴＮＦのレベルを評価した（図１３）。活性化一次マクロファージの培地を収集して、新鮮な培地で２倍、４倍および８倍（それぞれ、０．５、０．２５、０．１２５）に希釈し、ウエル当たり密度１×１０5細胞（９６ウェルプレート上に）で播種されたＴＮＦ感受性細胞（Ｌ９２９）の単層に塗布した。１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で、バイオアッセイを行った。Ｌ９２９細胞（ネズミ結合組織クローンＬ９２９ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を、活性化マクロファージの調整培地でインキュベートし、２０時間インキュベートした。Ｌ９２９細胞毒性のレベルは、活性化一次マクロファージの調整培地中に存在するＴＮＦの濃度に比例している。
【０１４５】
図１３で示されるとおり、チオグリコレート処理腹腔マクロファージは、ある程度のＴＮＦ−αを産生した。たとえば、チオグリコレート処理済腹腔マクロファージの２または４倍希釈培地は、４０％以上のＴＮＦ感受性Ｌ９２９細胞の死を引起した。しかし、ＬＰＳによる別のマクロファージ活性化は、ＴＮＦ分泌を増大した。たとえば、細胞死は、活性化マクロファージの８倍希釈された調整培地にさらされたときに６０％以上高かった（図１３のＡ、Ｂ）。ＴＢＰ−ＰＥ３８の存在下の活性化一次マクロファージの調整培地は、ＴＢＰ−ＰＥ３８の非存在下における活性化マクロファージの調整培地と等しくＬ９２９について毒性であることが分かった（図１３のＢ）。この結果は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、一次活性化マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害しないことを示す。対照的に、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で活性化されたマクロファージの調整培地は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの非存在下で活性化されたマクロファージの調整培地に比較して、比較的毒性が低い。たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で活性化されたマクロファージの調整培地を、８倍希釈（図１３１Ａで０．１２５）すると、ＴＮＦの量は、低すぎてＬ９２９細胞に毒性でなかった。４倍または２倍希釈のような低希釈は、なお、Ｌ９２９細胞の６０〜７０％を死滅させるのに十分なＴＮＦを含有した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰと組合わせたＴＢＰ−１とのマクロファージのインキュベーションは、ＴＮＦ製造におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの阻害影響を防止した（図１３Ｂ、０．１２５）。この場合には、細胞死は、約６０％であり、すなわち、同じレベルの細胞死が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの非存在下における活性化マクロファージの調整培地を使用して観察された。
【０１４６】
これらの結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８のいずれも、活性化一次マクロファージの死を引起さないが、しかしＴＢＰ−ＰＥ３８とは異なり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化一次マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害する能力があることを示す。
【０１４７】
従って、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化マクロファージにおいて、このような細胞を死滅させることなく、マクロファージ細胞中におけるＴＮＦ−α産生を減少させるという治療目的のために利用することができる、望ましく、特定の効果を有する。
【０１４８】
実施例６． ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるｐ３８のリン酸化におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの阻害効果
ＹｏｐＰタンパク質は、ＭＡＲＫおよびＮＦ−κＢ経路を阻害することが知られている。前述の実施例で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞変性効果を有さないことが示された。ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰのなんらかの効果があるかどうかを調査するために、ＭＡＰＫカスケードのシグナル伝達の指標であるｐ３８のリン酸化を調べた。
【０１４９】
ＨｅＬａ Ｍ９（ウエル当たり２００，０００細胞）を、９６ウェルプレートに播種し、インシュリン（１ｍｋｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸Ｎａ（１ｎｇ／ｍｌ）、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸グルタミンを含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中で１６〜１８時間飢餓状態にさせた。その後、１０μｌの体積中に１μｇの組換えＴＢＰ−ＹｏｐＰを、細胞上に塗布し、細胞表面上でＴＮＦと相互作用させ、１時間、細胞を浸透させた。対照として、１０μｌの溶媒（５０ｍＭホウ酸塩／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）を細胞に添加した。その後、図１１のＡで示されるとおり、全ての細胞についてのＴＢＰ−ＹｏｐＰとのインキュベーションの総時間が２時間となるよう、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で、６０から５分までの異なる時間の時間間隔で、１０％加熱不活化Ｆｃｓ（ＨＦｃｓ）によって、細胞を活性化させた。続いて、細胞を、ホスファターゼ阻害剤ＮａＶａ（１ｍＭ）およびＮａＦ（１０ｍＭ）、およびプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、および完全（ロシュ）の存在下で、５０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトン（ｐＨ８．０））中で氷上で溶解させた。細胞溶解物を、リン酸化ｐ３８（ｐＰ３８）に特異的なポリクローナル抗体（セル・シグナリング（Cell Signalling））を用いて検出されるウエスタンブロット分析にかけた。同じブロットを、負荷されたタンパク質の正規化のために抗ＩＫＫ−α（モノクローナル抗−ＩＫＫ−α、サンタ・クルーズ）で再調査した。
【０１５０】
図１１のＢおよびＣは、細胞が図１１のＡに例示されるとおり処理されたか、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰの代わりに、溶媒（ホウ酸塩緩衝液）が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下でｐ３８リン酸化を比較するために使用された２つの実験の結果を示す。
【０１５１】
２つの実験の結果（図１１のＢおよびＣ）において、ＨＦｃｓ活性化の５分後に、ＨｅＬａＭ９でのｐ３８のリン酸化が観察された。リン酸化は、最初の１０分で増大し、ＨＦｃｓ活性化の３０および６０分後に徐々に減少した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨＦｃｓ活性化の少なくとも３０分後までに、ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるｐ３８のリン酸化を阻害することが分かった。
【０１５２】
この実験で得られた結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、上皮細胞ＨｅＬａ Ｍ９細胞にとって細胞毒性でないが、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードでのＴＢＰ−ＹｏｐＰ阻害作用により明示されるとおり、明らかにＨｅＬａＭ９細胞に浸透することを示す。
【０１５３】
実施例７． その表面にＴＮＦを発現する細胞
２つの細胞株を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの効果を調査するために使用した。（ａ）ヒト急性単球性白血病ＴＨＰＩ細胞（ドイツ国コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セル・カルチャーから入手）。これらの細胞の単核細胞分化は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で誘発しうる。これらの細胞を、１０％Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、１％ 非必須アミノ酸、９ｍｇ／ｍｌインシュリン、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で、０．３〜１×１０6／ｍｌの細胞密度範囲で培養する。細胞表面ＴＮＦ発現を増強するために、ＰＭＡで活性化された（１６〜２０時間、１００ｎｇ／ｍｌ）これらの細胞を、試験の前に２時間、ＬＰＳ（１．５時間、１ｍｋｇ／ｍｌ）で、１０ｍｃｇ／ｍｌメタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（カルバイオケム）で処理した。
【０１５４】
（ｂ）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞、位置＋２でアルギニン、位置＋３でセリンを、スレオニンに置換するヒトＴＮＦ突然変異体ｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構造上発現する上皮ＨｅＬａ頸部癌株のクローン。これらの突然変異は、２６ｋＤａ ＴＮＦの約１０倍の切断速度の減少を引起す。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、および５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養する。
【０１５５】
ＴＮＦ−αの削減（shedding）を防止するメタロプロテアーゼＧＭ６００１（１０μｇ／ｍｌ（カルバイオケム））の阻害剤の存在下で、ＦＡＣＳによって、ＴＨＰＩ細胞の細胞表面におけるＴＮＦ発現を評価した。５×１０5細胞のサンプルを、１６時間、インシュリン（１ｍｋｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（1μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸Ｎａ（１ｎｇ／ｍｌ）、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸グルタミンをＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌと共に含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中でインキュベートした。その後、２時間、ＬＰＳＥ．ｃｏｌｉ ０１１１−Ｂ４を濃度１μ／ｍｌで、ＧＭ６００１（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に添加した。細胞表面におけるＴＮＦ発現のＦＡＣＳ分析のために、細胞を、４Ｃで、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＦＩＴＣ−抗−ヒトＴＮＦ抗体と共にインキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン．ディキンソン、マウンテン・ビュー、ＣＡ）によって分析を行った。少なくとも３０％の細胞が、それらの表面上にＴＮＦ−αを発現することが分かった。
【０１５６】
実施例８． 内在化アッセイ
ＴＮＦ−α発現細胞（ＨｅＬａＭ９またはその他）を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する培地中で、３７℃で、［125Ｉ］−接合体（１ｍｃｇ／ｍｌ）で標識した。その後、細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％プロナーゼに再懸濁し、ジブチルフタレートによる遠心分離の前に２℃で４０分間放置した。エンドサイトーシス効率は、取込みの３０分後に、細胞結合［125Ｉ］−接合体のプロナーゼ耐性率として表される（Taupiac M-Pら、A1、１９９９から改修された）。
【０１５７】
実施例９． ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
遠心分離によって収集された細胞を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解する。サンプルを、０．１％ＳＤＳ、１０％アクリルアミドスラブゲルへの適用の前に５分間煮沸する。クーマシーブルーによって、または銀染色によって、ゲルを染色することができる。
【０１５８】
免疫ブロッティングのため、電気泳動後にサンプルを、ニトロセルロース紙に移し、続いて毒素に対する抗体、または可溶型ＴＮＦ受容体に対する抗体と反応させ、その後ＨＲＰに連結した二次抗体（毒素に対して−ヤギ抗ウサギ抗体、可溶性ＴＮＦ受容体に対して−ヤギ抗マウス抗体）と反応させ、染色する。可溶性ＴＮＦ受容体に対する既知モノクローナル抗体を、記述されるとおり使用する（Engelmannら、１９９０およびBigdaら、１９９４）。
【０１５９】
実施例１０． 関節炎の自発的発症に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
ヒトＴＮＦトランスジーンの発現の翻訳制御を供する３’非コーディング領域が、β−グロビン遺伝子のものと共に発現される、ヒトＴＮＦトランスジーンを発現するトランスジェニックマウス（Kefferら、1991）を使用した。生後２週間で、マウスに、種々の用量の試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を腹腔内で注射し、その後、９週間の期間、週に１回再度注射した。関節の直径を測定することによって経時的にマウスの後足足首関節の腫れを評価した。関節構造に関与する病変／変化：関節皮膜、関節空間、滑膜、アキレス腱、および肋軟骨下の骨を、組織学的に評価する。
【０１６０】
実施例１１． 抗原誘発性関節炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
ルイスラットを、後足側面で、完全フロイントアジュバント中の０．５ｍｇメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）で免疫化させる。２１日後（０日目）、動物に、両方の後足膝関節で、発熱物質不含の生理食塩水中の５０μｇのｍＢＳＡを注射する。ラットに、関節内的に、その日、および続く２日に（０、１、２日目）、両方の膝関節中に試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。処置に比例して０〜６日目に、膝関節幅を毎日測定する。６日目に収集された関節の組織病理学上の試験を行う。膝関節構造に関与する病変／変化：関節皮膜、関節空間、滑膜、アキレス腱、および肋軟骨下の骨を、評価する。
【０１６１】
実施例１２． 抗原誘発関節炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
雄のＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）を、尾の根元での皮内注射によってＦＣＡ中に乳化した１００μｇのＩＩ型コラーゲン（ジフコ、デトロイト、ＭＩ）で免疫化する。免疫化の時間から開始して、マウスに、臨床上の関節炎の発生まで、腹腔内に、週２回、ＰＢＳ中の試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。免疫化の１５日後から、マウスを、２つの臨床パラメーター：脚の腫れおよび臨床上のスコアを使用して、疾患の発生について、１０日間、毎日試験する。第一に冒された後足の厚みを、カリパスを用いて測定することによって、脚の腫れを評価する。
【０１６２】
実施例１３． 大腸炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
Ｈａｒｌａｎ ＵＫで購入されたＩＬ−１０ノックアウトマウスを、相互交配して、ＩＬ１０遺伝子欠失についての同型接合のマウスを発生させ、それらの尾部ＤＮＡで行われるＰＣＲによって同型接合についてスクリーニングする。４週齢で開始して、２０週齢まで、マウスに、腹腔内で、週に三回、試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。腸の臨床スコア、組織学的分析、および糞便中の炎症性サイトカインの含有量を、（Scheininら、２００３）に記載されているとおりに評価した。
【０１６３】
実施例１４． 可溶型ｐ７５ＴＮＦ受容体の接合体の発現のためのプラスミドの構築
接合体に組込まれる可溶型ｐ７５ＴＮＦ受容体の配列（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ジーンバンクＩＤ Ｍ３２３１５）は、該受容体の細胞外ドメインの全配列（Ｌｅｕ１からＡｓｐ２３５まで）に対応する。この配列は、実施例１に記述されるとおり、毒素の配列に融合され、ｐＥＴベクターに挿入される。
【０１６４】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】ＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラタンパク質（Ａ）、およびシュードモナス外毒素（ＰＥ）（Ｂ）の略図を示す。ＴＢＰ−１は、ＴＮＦ結合タンパク質Ｉ；ＰＥＩＩｔｒは、シュードモナス外毒素の切断ドメインＩＩ；ＤＴは、ジフテリア毒素フリン切断部位；ＹｏｐＰは、エルシニア外側タンパク質である。Ｃは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）を示す。
【図２】シュードモナス外毒素の切断ドメインＩＩをコードするフラグメントＰＥＩＩｔｒのＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す。
【図３】ＰＥＩＩｔｒのアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図４】ＹｏｐＰおよび受容体遺伝子をコードするベクターを宿すＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）でのＹｏｐＰの組換え発現を示し、両方の遺伝子は、ＥＦ１−α（Ａ）またはＣＭＶ（Ｂ）プロモーターによって制御される。両方ともｖ５にタグ付けされ、ＥＦ１−αプロモーター（ベクターｐＥＦ６では、インビトロゲン）によって制御されるＹｏｐＰまたはβ−ガラクトシダーゼ（ｂＧａｌ）をコードするベクターを、２９３細胞に同時トランスフェクトした（Ａ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させ、検出用の抗ｖ５を使用してウエスタンブロット分析にかけた。１、２．５および５μｇのＹｏｐＰ−ｖ５／ＥＦ６、および０．１μｇのβ−Ｇａｌ／ＥＦ６プラスミドをトランスフェクションのために使用した。両方ともＨｉｓ−Ｔ７にタグ付けされ、ＣＭＶプロモーター（ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡで、インビトロゲン）によって制御されるＹｏｐＰまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターを、２９３細胞に同時トランスフェクトした（Ｂ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させ、検出用の抗Ｔ７を使用してウエスタンブロット分析にかけた。１、２．５および５μｇのＨｉｓ−ＹｏｐＰ／ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡ、および０．１μｇのＨｉｓ−ＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡプラスミドをトランスフェクションのために使用した。Ｃは、ＥＦ−１αおよびＣＭＶプロモーターの主要転写因子結合部位の略図を示す。活性化ＮＦ−κＢの非存在下で抑制されうるＣＭＶプロモーターから得られるＹｏｐＰの発現が、検出可能な濃度以下にあること（Ｂ）が観察されたが、しかし増大量のＹｏｐＰ発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターから得られるＧＦＰの発現を阻害するので、ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性が観察される。ＮＦ−κＢ活性に独立であるＥＦ−１αプロモーターは、ＹｏｐＰの発現用のＣＭＶプロモーターよりさらに適切であり、このプロモーターからのレポーター遺伝子の発現は、ＹｏｐＰによって影響されない（Ａ）。真核細胞を用いた全ての別の実験では、ＹｏｐＰまたはその融合誘導体は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下で発現される。
【図５】２９３細胞中でのＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ媒介阻害を示す。Ａは、２９３細胞中でのＴＮＦ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害を示す。ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する２９３細胞を、ＴＮＦで処理した。ＮＦ−κＢ活性化は、異所性ＹｏｐＰの存在下で達成された。Ｂは、２９３細胞中でのＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害を示す。ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する２９３細胞を、ＮＩＫでトランスフェクトして、異所性ＹｏｐＰの存在下でＮＦ−κＢ活性化を誘発した。ＮＦ−κＢが、ＴＮＦを用いた細胞の処理によるか、またはＮＩＫ過剰発現によって誘発される場合、ルシフェラーゼ発現が増大した。ＹｏｐＰの存在下で、ＮＦ−κＢの誘発は、活性化のために使用される因子に独立して阻害された。Ｃは、（左から右へ）ＮＩＫのみをコードするベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物、ＮＩＫおよびＹｏｐＰをコードするベクターで同時トランスフェクトされた細胞の溶解物、または空のベクターでトランスフェクトされた細胞の溶解物を示し、それらを、ウエスタンブロット分析にかけ、無傷のｐ１００またはｐ５２代謝産物を、抗−ｐ５２抗体で検出した。Ｃは、ＹｏｐＰが、代替経路を介して、ＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害しないことを示す。
【図６】真核細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの発現および活性を示す。Ａは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰを一過性で発現する真核細胞におけるＴＮＦ誘発ＮＦ−κＢ活性化の阻害を示す。ＴＮＦ−媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害するＴＢＰ−ＹｏｐＰの能力を、ＮＦ−κＢ依存性プロモーター（ｔａｔプロモーター）によって制御されるルシフェラーゼ発現レポーターベクターでトランスフェクトされた２９３細胞で調査した。レポータープラスミドに加えて、２９３細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードする発現ベクター、ＹｏｐＰをコードする発現ベクターまたは空のベクター（ｐＥＦ６Ａ）のいずれかで同時トランスフェクトした。結果は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＹｏｐＰの両方が、ＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼの発現を等しく阻害することを示す。Ｂは、真核細胞で発現されるＴＢＰ−ＹｏｐＰを示す。２９３細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードする発現ベクター、ＹｏｐＰをコードする発現ベクターまたは空のベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、細胞を溶解させ、２５μｌの溶解液（または約１００ｎｇのタンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンに載せた。レーン２、３および４、５および６、７（左から右へ）は、それぞれ、ベクターのみ（ｐＥＦ６Ａ−ベクター）、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードするベクター、およびＹｏｐＰをコードするベクターでトランスフェクトされた細胞の二重サンプルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解したタンパク質を、ウエスタンブロット分析にかけ、組換えタンパク質の検出を、ｖ５およびヒトＴＢＰ−１に特異的な抗体を用いて行った。Ｂは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＹｏｐＰが、それぞれ、およそ６３ｋＤａおよび３７．２ｋＤａの見掛けの分子量で移動することを示す。
【図７】細菌性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現されるＴＢＰ−ＹｏｐＰを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードするｐＥＴ−５発現ベクター、またはＴＢＰ−１および触媒ドメインと移行ドメインとを含むシュードモナス外毒素のフラグメントを含む別のキメラタンパク質（ＴＢＰ−ＰＥ３８、２００４年６月２８日に提出された米国仮出願第６０／５８２８２７号で開示された）をコードするｐＥＴ−５ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションおよびイソプロピルβ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発に続いて、ｐＴＢＰ−ＹｏｐＰを有するＥ．ｃｏｌｉを溶解させ、溶解物を可溶性タンパク質と不溶性封入体（ＩＢ）に分画した。８Ｍ尿素に溶解した封入体のサンプル、または全（非分画）溶解物を、レーン当たり３０μｇの濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離した。ゲル中のタンパク質を、クーマシーブルーで染色した。異なるバッチのＴＢＰ−Ｙｏｐは、ＡおよびＢに示される。Ｃは、Ｂと同じ溶解物であるが、ウエスタンブロットにかけ（レーン当たり１μｇタンパク質をかけた）、キメラタンパク質の検出のためにポリクローナルウサギ抗−ＴＢＰ−１を使用して分析した。その図は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、封入体中に見られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、およそ６３ｋＤａの見掛けの分子量で移動することを示す。矢印は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰに対応する位置を示す。全−全Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物。ＩＢ−封入体、ＭＷ−分子量基準。
【図８】細菌細胞で産生されるＴＢＰ−ＹｏｐＰのＴＮＦ結合活性を示す。Ａは、非キメラＨＰＬＣ−精製ＴＢＰ−１の活性と比較した、粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８のＴＮＦ結合活性を示す。ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ＴＢＰ−ＰＥ３８またはＴＢＰ−１タンパク質の結合を、ＴＮＦ被覆プレートを使用して評価した。所定量の再折り畳みキメラタンパク質またはＴＢＰ−１を、ＴＮＦ被覆プレートに載せ、プレートへの結合を、抗ＴＢＰ−１抗体によって検出した。たとえば、５００ｎｇの粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰは、２０ｎｇのＴＢＰ−ＰＥ３８または５ｎｇのＴＢＰ−１に近い程度の活性である。Ｂは、ＴＮＦ結合活性を示す粗再折り畳みキメラタンパク質の百分率（％）を示す。たとえば、１００％ＴＮＦ結合としてＴＢＰ−1の活性を使用した場合、際折りたたみＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の０．７％および２５％が、それぞれ、ＴＮＦ結合活性を示すことが分かった。
【図９】活性化単球様細胞におけるＴＢＰ−キメラタンパク質の細胞毒性を示す。単球様細胞（ＴＨＰＩ）の特徴を示す活性化細胞株で評価された再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）およびＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の細胞毒性効果を、競合するＴＢＰ−１の存在下、または非存在下で評価した。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８がＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。ＴＢＰ−ＹｏｐＰのみが、活性化ＴＨＰＩ細胞に対し細胞毒性効果を示すこと、またそのような細胞毒性効果はＴＢＰ−１との競合によって阻害されたので、特異的であることが分かった。競合相手ＴＢＰ−１は、キメラタンパク質の直前に１００倍過剰で使用した。ＴＢＰ−ＰＥ３８（１）および（２）は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８の２つの異なるバッチである。
【図１０】上皮細胞におけるＴＢＰ−キメラタンパク質の細胞毒性を示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）またはＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の細胞毒性効果を、競合するＴＢＰ−１の存在下または非存在下で、過剰発現表面ＴＮＦに遺伝子操作された細胞株（Pocsikら、１９９５）である上皮ＨｅＬａＭ９細胞のモデルで評価した。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。ＴＢＰ−ＰＥ３８のみが、上皮細胞株に対し細胞毒性効果を示すこと、およびそのような細胞毒性効果は、ＴＢＰ−１との競合によって阻害されるので特異的であることが分かった。ＴＢＰ−ＰＥ３８（１）および（２）は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８の２つの異なるバッチである。
【図１１】１０％加熱不活化仔ウシ血清（ＨＦｃｓ）を用いた飢餓ＨｅＬＡＭ９細胞の活性化によって誘導されるｐ３８リン酸化のＴＢＰ−ＹｏｐＰ−媒介阻害を示す。Ａは、実験の略図を示す。ＨｅＬａＭ９細胞を、１７−１８時間飢餓状態にさせた。その後、再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰを、２時間、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、その細胞を溶解させた。１０％ＨＦｃｓを、様々な時点、図式で矢印によって示されるとおり、細胞溶解の５、１０、３０および６０分前に添加した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下での活性化後、細胞を溶解させ、細胞溶解物を、リン酸化ｐ３８（ｐＰ３８）の検出用のｐＰ３８特異的ポリクロナール抗体を使用したウエスタンブロット分析にかけた。ゲル中の負荷タンパク質を正規化させるために、抗ＩＫＫ−αを用いて同じブロットを検出した。ＢおよびＣは、Ａで示したとおり細胞を処理したか、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰを溶媒（ホウ酸塩緩衝液）に置き換えた２つの実験の結果を示す。Ｐ３８リン酸化は、血清添加により増大すること、およびそのような血清媒介ｐＰ３８リン酸化は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で減少されることが示された。−は、未処理飢餓細胞、そして５’、１０’、３０’および６０’は、それぞれ、１０％ＨＦｅｓにより５分、１０分、３０分および６０分間の細胞の活性化を示す。
【図１２】活性化一次マクロファージ細胞でのＴＢＰキメラタンパク質の効果を示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）またはＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の指示濃度の細胞毒性効果は、競合するＴＢＰ−１の存在下または非存在下で、活性化一次マクロファージ細胞において評価した。組換えヒトＴＢＰ−１を、キメラタンパク質の直前で、１００倍過剰で添加した。所定の濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ０１１１−Ｂ４で処理することによって、一次マクロファージを活性化させた。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。キメラタンパク質はいずれも、活性一次マクロファージに対して細胞毒性効果を示さないことが分かった。
【図１３】活性化一次マクロファージによるＴＮＦ分泌に対するＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の効果を示す。実施例５で示されるとおり、実験を行った。キメラタンパク質の存在下または非存在下で、ＬＰＳ−活性化一次マクロファージの培養培地中に分泌されるＴＮＦを、ＴＮＦ感受性細胞株Ｌ９２９（マウス結合組織クローンＬ９２９、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を使用してバイオアッセイでモニターした。培養培地を収集し、新鮮な培養培地を用いて二倍、四倍および八倍に希釈し、Ｌ９２９細胞に塗布し、その細胞のＴＮＦ依存性の死をモニターした。活性化マクロファージによるＴＮＦ分泌が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰによって阻害されるが、ＴＢＰ−ＰＥ３８によっては阻害されないことが分かった（Ｂ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移行ポリペプチドによって結合された、細胞標的因子およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）外側タンパク質を含むキメラタンパク質に関する。本発明は、さらに、そのようなキメラタンパク質の製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのサイトカインは、生物学的制御について独自の観点を提供する。これらのサイトカインおよびそれらの受容体は、ほとんど全ての細胞で発現され、様々な、部分的に対照的な、広範囲の細胞活動を誘発する（Wallachら、１９９９、Locksleyら、２００１、およびWallachら、２０００）。それらは、免疫防御のすべての局面、並びに特定の発生過程を実質的に制御する助けになっている。これらの活動はすべて、異なる受容体に共有される、明らかに少数の一組のシグナル伝達タンパク質よって媒介される（Wallachら、１９９９）。
【０００３】
サイトカインは、通常、防御を強化する役割を果たす。しかし、過剰に作用すると、それらは、病原体が引起す損傷に匹敵し得る多大な損傷を引起し得る。実際に、サイトカインの不当な効果は、多くの疾患において、主要な病原性原因を構成する。
【０００４】
ＴＮＦファミリーのサイトカインは、先天性型および適合性型の両方の種々の免疫防御機序を広範囲に制御する。ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンドおよびその他などのサイトカインのいくつかの過剰な機能は、種々の疾患の病状に関与してきた。特に、広範な疾患、たとえば、マラリアおよび敗血症のような感染性疾患、リューマチ性関節炎、炎症性大腸炎および乾癬のような自己免疫疾患、および所定の型の癌におけるＴＮＦの病理学上の主要な役割については、幅広い証拠がある。実際に、抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体などの薬剤によってＴＮＦ作用を遮断することは、このような状況で療法を提供することが発見されている（Beutler、１９９９、Kolliasら、１９９９およびReimold、２００３）。リューマチ性関節炎やクローン病のようなある種の病理学的状況では、かなり多くの割合の患者が、抗ＴＮＦ療法に順調に応答する。しかし、これらの薬剤に、かなり不十分な応答を示すこれらの疾患の患者もいて、治療法について別のアプローチを見出す必要が生じている（Andreakosら、２００２）。
【０００５】
サイトカイン生産細胞による分泌後、可溶性タンパク質として単に作用する多くの他のサイトカインと異なり、ＴＮＦファミリーのリガンドは、細胞結合ＩＩ型膜透過タンパク質（可溶性の分泌タンパク質として製造されるリンホトキシンの例外を伴って）として生産される。それらは、この形態でそれらの効果を発揮することができ、リガンド生産細胞に隣接して位置する細胞にのみ影響を及ぼす（ジャクスタクリン制御）。それらのほとんどは、また減らされ（are also shed）、循環する可溶性分子を形成する。それらの可溶性リガンド、たとえば、ＴＮＦの一部は、可溶性サイトカインとして作用する能力があり、パラクリン制御因子（リガンド生産細胞に比較的密着して位置する細胞に影響を及ぼす）およびエンドクリン制御因子（遠く離れた細胞に影響を及ぼす）として作用する。ＴＮＦファミリーのある種のリガンド、たとえばＦａｓリガンドは、それらのシェド形態においては有効に作用せず、その形態では、細胞結合形態に対する拮抗剤としてさえ役割を果たし得る（Wallachら、１９９９およびLocksleyら、２００１）。
【０００６】
それらを産生する細胞の表面上のＴＮＦファミリーのリガンドの発生は、これらのリガンド産生細胞の特異的な標的化のための強力な手段を提供する。このような手段は、リガンドが病理学的役割を果たす状況においてリガンド産生細胞の選択的死滅を可能にできる。
【０００７】
いくつかの態様において、サイトカインを産生する細胞の破壊は、単なるサイトカイン分子の機能の直接的遮断より、このサイトカインの病理学上の効果に対してよりよい防御を提供することになり得る。サイトカイン生産細胞の破壊は、サイトカインのさらなる合成を防ぎ、従って、すでに合成されたサイトカイン分子の効果をただ遮断することによって得られる保護よりも、いっそう耐久性のある保護を提供し得る。
【０００８】
あるサイトカインを産生する細胞は、しばしば、特定の型の免疫応答を引出す役割を共に果たすいくつかの他のサイトカインを同時に製造する。周知の例は、固有の群のサイトカインを産生するＴｈ１−およびＴｈ２−型Ｔリンパ球であり、各々は、異なる型の免疫防御を引出す役割を果たす（Jankovicら、２００１）。従って、サイトカイン産生細胞の破壊は、その特定のサイトカイン合成の阻止に加えて、病理学的効果におけるその特定のサイトカインを支援するいくつかの他のサイトカイン合成の阻止につながる。
【０００９】
循環するサイトカインを遮断することが、全身に影響する一方で、サイトカイン生産細胞を死滅させること、またはサイトカイン生産を弱体化させることは、これらの細胞が存在する体内における特定の部位に限定することができ、従って、他の部位でのサイトカインの利益効果を維持しつつ、その特定の部位でのサイトカイン有毒効果の破棄を可能にし得る。
【００１０】
クローン病における抗ＴＮＦ療法効果の研究は、ＴＮＦ生産細胞を死滅させることが、ある種の病理学的状況では、実際に、ただＴＮＦを遮断することによって得られるよりも有効な治療法を提供しうることを示唆する。この疾患における抗ＴＮＦ抗体の治療的効果は、抗体によるＴＮＦ生産細胞の死の早期の初期導入に関連することが分かった（Lugeringら、２００１、Van Deventer、２００１およびVan den Brandeら、２００３）。
【００１１】
ＴＮＦ−αは、活性化単核細胞、マクロファージおよびＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現される。これらの細胞は、それらの細胞分解経路における主要成分として、膜固定ＴＮＦ−αを示す。以下の疾患において、活性化マクロファージが、それらの病理学に関与することが推測されている：敗血性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎および乾癬性関節炎（SinghおよびSuruchi、２００４）、乾癬（Asadullahら、２００２）、筋萎縮性側索硬化症（Ghezziら、１９９８）、インシュリン依存性糖尿病（Kagiら、１９９９）、移植片対宿主疾患（Hongoら、２００４）および鎌状赤血球貧血（Belcherら、２０００年）。以下の疾患において、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞が、それらの病理学に関与することが推測されている：全身性紅斑性狼瘡(Pachecoら、2002)、反応性関節炎および他の自己免疫疾患(Mittler、２００４）。しばしば、活性化ＣＤ８＋Ｔは、特定の臓器に対して有害である。たとえば、肝臓炎症中に起こる集約的肝細胞アポトーシスは、肝臓への活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸透に続いて誘発される。
【００１２】
細胞表面構成要素に結合する標的分子に連結した細胞毒素より構成されるキメラ分子は、強力な細胞キラー剤としての役割を果たし得る。細胞型特異的表面構成要素を認識する標的部分の選択が、インビボで特定の細胞の選択的破壊のためにこのような細胞傷害性キメラを使用することを可能にし得る。たとえば、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素（ＰＥ）またはジフテリア毒素（ＤＴ）に融合した癌特異的エピトープに対する抗体より構成されるキメラ融合タンパク質は、癌細胞を特異的に標的として、死滅させることができる。このような抗癌効果は、毒素が、その受容体が特定の腫瘍において優勢である、ＩＬ−２、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のようなホルモンまたはリガンドと融合しているキメラを用いて得ることもできた。同様に、細胞毒素含有キメラは、病原体に苦しめられた細胞に標的とされるように設計された。たとえば、ＨＩＶ感染細胞は、シュードモナス外毒素に結合した、ｇｐ１２０の保存的ＣＤ４結合部位またはＣＤ４に対する、抗−ｇｐ１２０抗体より構成される免疫毒素を使用して選択的に破壊することができる（BrinkmannおよびPastan、１９９５、PastanおよびKreitman、１９９８およびPastan、２００３）。
【００１３】
細胞毒素を標的とする可能な一種の薬剤またはＴＮＦファミリーのリガンドを発現する細胞に対する他の調節剤は、これらのリガンドに対する抗体である。実際に、ＣＤ４０リガンドに対する抗体は、ＣＤ４０リガンド生産細胞に対する毒素を標的にするために適用されてきた（ＥＰ１００５３７２）。
【００１４】
米国仮出願番号第６０／５８２，８２７号は、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas eruginosa）外毒素移行およびＡＤＰリボース化ドメイン（ＰＥ３８またはＰＥ Ｉ−ＩＩ）に結合したｐ５５ＴＮＦ受容体（ＴＢＰ−１）の細胞外部分を含むキメラタンパク質（ＴＢＰ−ＰＥ３８）を開示する。ＴＢＰ−ＰＥ３８が、表面ＴＮＦを過剰発現する上皮細胞と結合し、このような細胞における細胞毒性を誘発することが示された。
【００１５】
多様な細菌毒素は、細胞表面上で受容体と特異的に結合し、受容体媒介型エンドサイトーシスを介して内在化する。一般に、受容体媒介型エンドサイトーシスは、細胞外タンパク質（たとえば、受容体）および小型粒子（たとえば、リガンド）の選択的取り込みを可能にする（Molecular cell biology、Darnell LodishおよびBaltimore）。特に、原形質膜上における受容体に対する粒子の結合の後、受容体−リガンド複合体は、クラスリン被覆ピット内に内在化され、摘み取られ、クラスリン被覆小胞となる。その後、クラスリン被覆物はトリスケリオンに脱重合化し、エンドソームと称される、非被覆小胞を生じる。エンドソームは、約５．０の内部ｐＨによって特徴づけられるＣＵＲＬ（受容体とリガンドを分離する区分（compartment uncoupling receptor and ligands））と称される分離小胞と融合する。低いｐＨは、粒子を受容体から解離させる。受容体に富んだ領域は、萌芽して、受容体を再循環して原形質膜に戻す別個の小胞を形成する。
【００１６】
受容体媒介型エンドサイトーシスによって内在化されるタンパク質は、種々の巡り合わせを受ける。たとえば、それらのタンパク質は、リソソームに移動され、破壊され、最小限に加工され、細胞中に残り得るか、または別の場合には、エンドサイトーシスされた物質は、細胞膜を完全に通過し、内在化されるかまたは反対側で原形質膜から分泌される。
【００１７】
シュードモナス内毒素Ａ（ＰＥ）は、α２−マクログロブリン受容体／低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質を介して結合し、細胞に入る。内在化に続いて、ＰＥは、フリン様プロテアーゼによってエンドソーム中でタンパク質分解によって加工され、３８ｋＤａ活性フラグメント（ＰＥ−３８）へと分解され、そのようなフラグメントが細胞質ゾルに移行し、そのＡＤＰが伸長因子２をリボース化してタンパク質合成阻害を引起す。
【００１８】
ＰＥのタンパク質分解処理（エンドソーム中で、またはフリン様プロテアーゼにより、小胞体中で行われる）および細胞質ゾルへのＰＥ−３８の移行は共に、有効な細胞毒性に必須である。ＰＥのドメインＩ（図１）は、細胞結合活性を含み、ドメインＩＩは移行活性を含み、ドメインＩＩＩは、ＡＤＰリボシル化活性を含む。これらのドメインの各々は、独立して再折り畳みされうる構造単位から構成される。移行ドメイン（ＰＥＩＩ）は、６つの連続ａ−へリックス（Ａ−Ｆ）を含む。タンパク質の一次構造に基づいた欠失地図作製研究は、ＡおよびＢへリックスを包含するアミノ末端セグメントが、ＰＥ移行に必要とされることを示す（Siegallら、１９８９）。カルボキシル末端では、Ｅへリックス内のいくつかの残基が重要であり、一方他の残渣およびＦへリックス全体は、移行活性の見掛け損失なしに欠失され得ることが分かった。さらに、最後のαへリックス（Ｆ）の欠失は、ＰＥの移行活性および細胞毒性の両方を増強した（Taupiacら、１９９９）。
【００１９】
ＰＥ Ｉ−ＩＩなどのＰＥ外毒素の部分はｂａｒｎａｓｅという細菌酵素をエンドソームから真核細胞の細胞質へ移行できるという証拠はあるが（Priorら、１９９６）、異種タンパク質に隣接されたドメインIIの移行活性は報告も証明もなされていない。
【００２０】
シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は強力な細胞傷害性薬剤である。シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素は、多種多様な細胞における細胞性代謝全体に影響を及ぼすタンパク質の合成を阻害する。対して、他の種類の細菌毒素は特定の代謝経路を制御することが知られている。たとえば、６つのエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）毒素は各自、特定のシグナル伝達経路を調節する。
【００２１】
ペスト菌（Yersinia pestis）は、腺ペストの原因物質である。ペスト菌は、３つのヒト流行病：ユスティニアヌスペスト（Justinian plague）（６〜８世紀）、黒死病および近代ペストの原因である。エルシニア エンテロコリティカ（Yersinia enterocolitica）およびエルシニア シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）は、食品媒介病原体であり、胃腸炎を引き起こす。エルシニアの病原性は、哺乳類宿主の免疫防御に打ち勝つその能力に起因する。
【００２２】
エルシニアの外側タンパク質Ｐ（ＹｏｐＰ）は、Ｙ．エンテロコリティカにより産生される毒素である。ＹｏｐＰは、マウスにおける全身性感染の確立に必須であり、ＴＮＦ−αの産生を阻害し、感染したマクロファージにおいてアポトーシスを誘発する（Cornelis, Nature２００１）。ＹｏｐＰの細胞質ゾル送達は、細菌性二重膜エンベロープおよび宿主細胞膜を横切った移行を伴い、宿主細胞との接触時に活性化される、活性化タンパク質分泌機械設備（III型タンパク質分泌システム）により誘発される。このようなタンパク質分泌機械設備は、ＹｏｐＰの細胞質ゾルへの送達に絶対に必要とされる。
【００２３】
ＹｏｐＰは、ＢＩＤ／カスパーゼ８経路の活性化および抗アポトーシス因子の放出の抑制によるか、またはＮＦ−κＢの阻害を伴う少し「直接的」な経路を通して、のいずれかの２つの経路の１つを通してアポトーシスを活性化すると考えられる。ＹｏｐＰは、ＩＫＫによるＮＦ−κＢ阻害剤のリン酸化を妨げ、それによりＮＦ−κＢの核への移動を阻害する。ＹｏｐＰはまた、上流ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫｓ）を阻害することにより、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の阻害を引き起こす。ＹｏｐＰのこれらの阻害作用の結果として、ｃＡＭＰ−応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）および活性化転写調節因子（ＡＴＦ）−１などの転写アクチベーター、ならびにＮＦ−κＢは、接着分子およびＴＮＦ−αなどの前−炎症性サイトカインの合成に関与する遺伝子の転写を刺激することが出来ない（Orthら、１９９９、Orth、２００２およびPalmerら、１９９９）。
【００２４】
ＹｏｐＰは、プロテアーゼ、たぶん脱−ＳＵＭＯ化ファミリーのプロテアーゼであると思われる（ＳＵＭＯは「低分子ユビキチン−関連変更分子（small ubiquitin-related modifier）」である。）。ＹｏｐＰの推定二次構造は、アデノウイルス（ＡＶＰ）のシステインプロテアーゼのものと類似している。触媒トライアッドにおける突然変異（ＹｏｐＰのＨｉｓ１０９、Ｇｌｕ１２８およびＣｙｓ１７２）により、ＹｏｐＰはＭＡＲＫまたはＮＦ−ｋＢ経路のいずれかを阻害することができなくなる。
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、キメラタンパク質の、エンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへの移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合された、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列およびエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質に関する。
【００２６】
本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質の細胞特異的標的因子は、標的細胞の表面に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分である。たとえば、ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）またはＴＮＦ結合タンパク質２（ＴＢＰ−２）のようなＴＮＦ／ＮＧＦリガンドの受容体の細胞外部分である。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質におけるＹｏｐは、ＹｏｐＰ、またはアルギニン−１４３残基で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９またはＯ：８などの減少したアポトーシス活性を有するか、またはアポトーシス活性を有さないＹｏｐＰである。
【００２８】
本発明の別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドは、最後のα−へリックスドメイン（Ｆ）に欠損のある移行ドメインもしくは図３でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のアミノ酸配列に相当する、本明細書においてＰＥＩＩｔｒと称される移行ドメイン（配列番号：３）のようなシュードモナス外毒素移行ドメインまたはそのフラグメントを含む。
【００２９】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、１つまたは２つのフリン切断部位を含む。さらに詳細には、ＰＥ外毒素の切断部位ような１つのフリン切断部位が、移行可能な前記ポリペプチドのＮ末端に配置され、一方、ジフテリア毒素の切断部位（たとえば、ＲＶＲＲ）のような他のフリン切断部位は、前記Ｙｏｐタンパク質のＮ末端に配置される。
【００３０】
さらに別の実施態様において、本発明のキメラタンパク質は、本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称される、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素ＰＥＩＩｔｒの移行ドメインフラグメント、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩より構成される。
【００３１】
本発明の１つの態様において、本発明のキメラタンパク質の細胞標的は、マクロファージまたは単核細胞のようなリンパ球様細胞である。
【００３２】
本発明別の態様において、本発明のキメラタンパク質の細胞標的は、上皮細胞である。
【００３３】
別の実施態様において、本発明は、前記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供し、さらに、そのＤＮＡ配列は、真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをコードしうる。
【００３４】
さらに別の実施態様において、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供し、そのＤＮＡは任意に、ＥＦ−１αプロモーターのような、ＮＦ−ｋＢから独立する活性を示すプロモーターに機能的に連結する。
【００３５】
さらに別の実施態様において、本発明は、前記発現ベクターを包含するＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、酵母および昆虫細胞などの原核または真核細胞のような宿主細胞を提供する。
【００３６】
本発明の１つの態様において、前記宿主細胞を培養し、産生された前記キメラタンパク質を単離することを含む前記キメラタンパク質を製造する方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様において、前記キメラタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が提供される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、ＴＮＦのようなＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、疾患の発症または経過に関与している疾患治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用を提供する。該疾患の例として、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患、および癌が挙げられる。
【００３９】
１つの実施態様において、本発明は、活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用に関する。該疾患の例として、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患、および鎌型赤血球貧血があげられる。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、疾患治療のための医薬品の製造における前記キメラタンパク質の使用に関し、ＮＦ−ｋＢ活性が、好ましくは、該疾患におけるＮＦ−ｋＢ活性が標準経路を介してＮＩＫにより誘発される際に、該疾患の発症または経過において関与する。
【００４１】
１つの態様において、本発明は、ＴＮＦのようなＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが、発症または経過に関与している疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４２】
１つの実施態様において、本発明は、活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与している疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、ＮＦ−ｋＢ活性化が、発症または経過に関与しており、おそらくＮＦ−ｋＢ活性化が、標準経路を介してＮＩＫによって誘発される疾患の治療方法であって、治療上有効量の前記キメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４４】
さらに別の実施態様において、本発明は、単球細胞やマクロファージ細胞などの標的細胞における細胞表面上のＴＮＦなどのリガンドの異常な発現を減少させる方法であって、該標的細胞をキメラタンパク質に暴露することを含み、該キメラタンパク質が、細胞の細胞質ゾルにエンドソームから、該キメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメント（ＰＥＩＩｔｒなど）によって結合される、標的細胞の表面上に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分およびＹｏｐを含む方法を提供する。
【００４５】
別の実施態様において、細胞は、インビトロで前記キメラタンパク質に暴露される。
【００４６】
さらに別の実施態様において、細胞は、インビトロで前記キメラタンパク質に暴露される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列、およびエンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへのキメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントに結合されたエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質に関する。
【００４８】
本発明によれば、細胞特異的標的因子は、特定の細胞に存在する特異的細胞表面構成要素に結合する能力のある任意の因子であり得る。たとえば、可能な標的因子は、特異的細胞表面構成要素に結合する抗体、ホルモン、サイトカイン、および好ましくはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のような標的細胞の表面上に発現されるリガンド用受容体の細胞外部分である。受容体の可溶型の自然発生が、ＴＮＦの２つの受容体、ＣＤ２７、ＣＤ３０、Ｆａｓおよびその他を含むＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのほとんど全ての構成要素について説明されている。本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質は、自然発生か、または人工的可溶型ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のいずれかを包含する。ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーのいずれかの特定の受容体の全細胞外ドメイン、またはそのフラグメント、ムテイン、融合タンパク質または他の機能性誘導体を使用できる。本発明の１つの実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＮＦ受容体の細胞外部分；ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）を包含する。本発明の別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＢＰ−２を包含する。
【００４９】
本発明によるキメラタンパク質は、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、好ましくはＹｏｐＰ、さらに好ましくは、Ｙｏｐ血清群Ｏ：８より低いアポトーシス活性を示すことが示されたアルギニン−１４３で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９およびＯ：８のような、アポトーシス活性が減少したか、またはアポトーシス活性がないＹｏｐＰのようなエルシニア外側タンパク質を包含する（Ruckdeschelら、２００１）。
【００５０】
本発明によれば、移行を可能にするポリペプチドは、細胞質ゾルへのタンパク質のアクセスを可能にする能力のある任意のポリペプチドを含む。移行を可能にするこのようなポリペプチドは、細菌毒素、たとえば、ボツリナム毒素、アントラックス毒素、ジフテリア毒素、リシン毒素、および好ましくはシュードモナス外毒素に由来し得る。本発明の１つの実施態様において、最後のａ−へリックスドメインを欠くシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のポリペプチド（図２におけるＤＮＡ配列、配列番号：２、図３におけるおよびアミノ酸配列、配列番号：３参照）（ＰＥＩＩｔｒ）が移行のために使用される。
【００５１】
本発明のキメラタンパク質は、１つまたはそれ以上のフリン切断部位を含み得る。本発明の１つの実施態様において、２つの異なるフリン切断部位は、キメラタンパク質中に存在し、特に、一方は、移行ポリペプチドのＮ末端に配置され、もう一方は、ＹｏｐのＮ末端に配置され、それらはシュードモナス・アエルギノーサ外毒素、およびジフテリア毒素起源由来である。
【００５２】
本発明の１つの実施態様において、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素の移行ドメインフラグメントＰＥＩＩｔｒ、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰより構成されるキメラタンパク質が開発される（ＴＢＰ−ＹｏｐＰと名付けられた）。
【００５３】
本発明は、ＴＮＦを結合し、かつＮＦ−ｋＢ活性を阻害し、および／または細胞におけるＴＮＦ放出を阻害する能力のある、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩を提供する。
【００５４】
本発明によるキメラタンパク質は、マクロファージおよび単核細胞などのリンパ球様細胞において、および上皮細胞において結合、貫通および作用することが分かった。ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、単核細胞の特徴を示す活性化細胞株（ＴＨＰＩ）において、結合し、細胞毒性を誘発することが分かった。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性活性は、ＴＨＰＩ細胞の表面ＴＮＦを通して特異的に誘発されることが分かった。対照的に、シュードモナス外毒素の移行および触媒ドメイン（ＰＥ３８）に融合したＴＢＰより構成される別のキメラタンパク質であるＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号で開示された）は、活性化ＴＨＰＩ細胞の細胞毒性を引き起さなかった。ＴＢＰ−ＰＥ３８は、表面ＴＮＦを過剰発現するように遺伝子操作された上皮細胞株であるＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞毒性がある一方で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、これらの細胞に対して細胞毒性がないことが分かった。
【００５５】
本発明によるキメラタンパク質は、所定のリガンドが細胞の表面で過剰に発現される特定の細胞で作用する能力があり、そのようなリガンドがより低いレベル、または正常なレベルを発現するように該細胞を「育成する」能力がある。たとえば、本発明の１つの実施態様において、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化一次マクロファージに対して、細胞毒性を誘発せず、ＴＮＦ分泌を阻害するという、望ましく特異的効果を有する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「ムテイン」は、タンパク質の天然に存在する成分の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、元のタンパク質と比較して、得られる産物の活性を大きく変化させることなく、様々のアミノ酸残基によって置換されるか、または欠失されるか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、タンパク質の元の配列に加えられるタンパク質の類似体を意味する。これらのムテインは、既知の合成により、および／または部位指定突然変異発生技術、またはそれらに適切な他のあらゆる既知技術によって製造される。
【００５７】
本発明によるムテインとしては、ストリンジェントな条件化で、本発明によるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸によってコードされるタンパク質が挙げられる。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が、従来的に「ストリンジェント」と称す、ハイブリダイゼーションおよびそれ続く洗浄条件を意味する。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、前記、Interscience, N.Y.,§§6.3および6.4（１９８７、１９９２）、およびSambrookら（Sambrook, J. C.、Fritsch, E. F.およびManiatis, T.（１９８９）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００５８】
限定されないが、ストリンジェントな条件の例としては、たとえば、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１５分間において、試験下のハイブリッドの算定Ｔｍより１２〜２０℃低い洗浄条件；０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、３７℃で３０〜６０分間および、その後、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、６８℃で３０−６０分間の洗浄条件が挙げられる。当業者らは、ストリンジェントな条件が、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブ（１０〜４０塩基など）または混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにもよることを理解している。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を使用することが好ましい。Ausubel、前記参照。
【００５９】
このようないずれかのムテインは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰと実質的に同様であるか、または勝る活性を示すように、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのアミノ酸配列を十分に複写したアミノ酸配列を有する。たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの１つの特徴的活性は、特定の細胞に浸透し、細胞毒性を引起し、および／またはＴＮＦ放出および／またはＭＡＲＫのシグナル伝達を阻害する能力である。細胞毒性、ＴＮＦ分泌、およびｐ３８リン酸化を測定するためのアッセイは、以下の実施例で示される。ムテインが、活性化ＴＨＰＩ細胞において実質的な細胞毒性活性を有し、および／または活性化一次マクロファージ細胞においてＴＮＦ放出を阻害し、および／またはＨｅＬａＭ９細胞においてｐＰ３８リン酸化を阻害する能力がある限り、ＴＢＰ−ＹｏｐＰと実質的に同様の活性を示すとみなされ得る。したがって、いかなる所定のムテインが、以下の実施例でＴＢＰ−ＹｏｐＰについて示されるように、日常的な実験の手段によって、本発明のキメラタンパク質と少なくとも実質的に同じ活性を示すかどうかが決定され得る。
【００６０】
好ましい実施態様において、いかなるこのようなムテインは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのアミノ酸配列と少なくとも４０％同一性または相同性を有する。さらに好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性または相同性を示す。
【００６１】
同一性は、配列を比較することによって決定される２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般に、同一性は、比較されるべき配列の長さに渡って、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸一致のことを言う。
【００６２】
正確な一致のない配列については、「同一性率（percent identity）」を決定し得る。一般的に、比較すべき２つの配列を、その配列間の最大相関を得るために、並べる。これには、アライメントの程度を増強するために、１つまたは両方の配列いずれかでの、「ギャップ」の挿入が含まれる。同一性率は、同一、または非常に類似の長さの配列に対してとりわけ好適である、比較している配列のそれぞれの全配列にわたり（グローバルアライメントと呼ばれる）、または等しくない長さの配列により好適である、より短い、定義された長さにわたって（ローカルアライメントと呼ばれる）、決定してよい。
【００６３】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法が、本発明分野でよく知られている。したがって、たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９．１（Devereux Jら、１９８４、Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11;12(1 Pt 1):387-95）にて使用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（J Theor Biol.1981 Jul 21;91(2):379-80およびJ Mol Biol.1981 Mar 25;147(1)195-7.1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを使用し、２つの配列間の類似性の最適な単独領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムもまた、本技術分野で公知であり、たとえば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（www.ncbi.nlm.nih.govにて、ＮＣＢＩのホームページを介してアクセス可能、Altschul D Sら,1990 J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3)403-10,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Jul;87(14):5509-13, Altschul S Fら,Nucleic Acids Res.1997 Sep 1;25(17):3389-402)およびFASTA(Pearson W R,Methods Enzymol.1990;183:63-98.Pearson J Mol Biol.1998 Feb 13;276(1):71-84）がある。
【００６４】
従って、本発明によって使用することができるムテインＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそれをコードする核酸としては、本明細書において示される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、当業者が日常的に得ることができる置換ペプチドまたはポリヌクレオチドとして実質的に対応する配列の有限の組が挙げられる。
【００６５】
本発明によるムテインについての好ましい変化は、「保存的」置換として知られている置換である。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの保存的アミノ酸置換としては、その群のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に類似の生理化学的特性を有する基内の同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham Science．１９７４ Ｓｅｐ ６；１８５（４１５４）：８６２−４）。アミノ酸の挿入および欠損がまた、それらの機能を変化することなく、好ましくは挿入または欠損が、数個のアミノ酸、たとえば３０以下、好ましくは１０以下にのみ関与し、機能的配座に対して必須であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換せず、前記で定義した配列で実施してよい。そのような欠損および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインが、本発明の範囲内である。
【００６６】
本発明に使用するためのＴＢＰ−ＹｏｐＰのムテインを得るために使用されうるタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例は、Markらに対する米国特許第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号；Kothsらに対する第５，１１６，９４３号、Namenらに対する第４，９６５，１９５号；Chongらに対する第４，８７９，１１１号；およびLeeらに対する第５，０１７，６９１号で示されるもの、および米国特許番号第４，９０４，５８４号（Shawら）で示されるリシン置換タンパク質などのあらゆる既知方法段階を含む。
【００６７】
本明細書で使用するところの「機能的誘導体（functional derivatives）」は、残基上の側鎖として存在するか、本技術分野で公知の方法によって、Ｎ−またはＣ−末端基への添加物である官能基から調製し、薬理学的許容性を維持する限り、すなわちＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性の活性と実質的に同様のタンパク質の活性を破壊しない限り、本発明に含まれる、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの誘導体、およびそれらのムテインをカバーしている。
【００６８】
これらの誘導体には、たとえば、抗原部位をマスクし、体液中のＴＢＰ−ＹｏｐＰの滞留を延長しうるポリエチレングリコール側鎖が含まれる。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは一級または二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部位と形成したアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえばアルカノイルまたはカルボン酸アロイル基）、またはアシル部位と形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（たとえばセリルまたはスレオニル基のもの）が含まれる。
【００６９】
本発明による「活性分画」は、たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのフラグメントでありうる。用語フラグメントは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの所望の生物学的活性を保持する短いペプチドである分子の任意の一部（subset）に該当する。フラグメントは、ＴＮＰ−ＹｏｐＰのいずれかの末端からアミノ酸を除去し、活性化ＴＨＰＩ細胞におけるその細胞分解特性および／または活性化一次マクロファージ細胞におけるＴＮＦ放出の阻害効果および／またはＨｅＬａＭ９細胞におけるｐＰ３８リン酸化の阻害について結果物フラグメントを試験することによって、十分に作製され得る。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかから、一度に１つのアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが知られており、そのようにして決定された望む生物学的活性を保持するフラグメントが、従来の実験のみによって生じる。
【００７０】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ムテインおよびその融合タンパク質の活性分画として、本発明は、さらに、前記分画がＴＢＰ−ＹｏｐＰに実質的に類似の活性を示すという条件で、タンパク質分子単独、またはそれに連結した結合分子または残基を伴ったポリペプチド鎖のあらゆるフラグメントまたは前駆体、たとえば、糖またはリン酸残基、またはそれら自身によるタンパク質分子または糖残基の凝集体を網羅する。
【００７１】
本明細書において、用語「塩」は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰのカルボキシル基の塩、およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は、当技術分野で知られた手段によって形成され得、無機塩、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩などを含み得、たとえば、トリエタノールアミン、アルギニン、またはリシン、ピペリジン、プロカイン等のようなアミンで形成されたものとして有機塩基を用いた塩が挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、塩酸または硫酸のようなたとえば、鉱酸との塩、およびたとえば、酢酸またはオキザロ酸のような有機酸との塩が挙げられる。もちろん、このような塩はいずれも、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの生物学上の活性を保持するに違いない。
【００７２】
「機能性誘導体」は、あらゆる従来の方法により、変化がＴＢＰ−ＹｏｐＰを作製するアミノ酸の配列で導入されたＴＢＰ−ＹｏｐＰから作製される多量体も包含する。これらの変化は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ分子の伸長または切断、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰの１つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失または置換を含みうる。前記変化の内で、キメラタンパク質の特性に影響を及ぼしうるものはないことが分かった。
【００７３】
移行を可能にするポリペプチドに、そしてＹｏｐに細胞特異的標的因子を結合させる手段は様々である。１つの実施態様では、組換え手段によって、細胞特異的標的因子を、移行を可能にするポリペプチドに、そしてＹｏｐに融合させる。当業者に知られている任意のクローニング手段によって、２つのタンパク質およびポリペプチドをコードする遺伝子を、ｃＤＮＡとして、またはゲノム形態で単離できる。タンパク質およびポリペプチドも、化学的に連結させ得る。この化学的連結は、ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemical Company）から入手可能なもの、ロックフォードＩ１１（たとえば、ＢＳ３（ビス［スルホスクシニミジル］スベレート）のような二官能性リンカー分子を使用することによって行われうる。
【００７４】
組換え手段による細胞特異的標的因子、移行を可能にするポリペプチド、およびＹｏｐのあいだの融合は、直接的でありうるか、または任意の種類のリンカー、たとえばアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチド、スルフィドリル基、ポリマーなどでありうる連結分子および／またはスペーサーを通してでありうる。連結分子は、キメラの局在化または内在化により崩壊されうる分子でありうる。
【００７５】
組換えＤＮＡ方法論を使用して本発明のキメラタンパク質を産生させることは、一般に、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を作り出すこと、特定のプロモーターの制御下で、通常、発現ベクター中に存在する発現カセットに該ＤＮＡを入れること、宿主でタンパク質を発現させること、発現タンパク質を単離すること、必要に応じて、タンパク質を変性させることを含む。
【００７６】
本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列、および該ＤＮＡを包含する発現ベクターを提供する。本発明によるＤＮＡは、さらに、真核細胞で製造されるキメラタンパク質の分泌のためのシグナルペプチドをコードしうる。真核細胞における製造のための好ましい発現ベクターは、ＮＦ−ｋＢ、たとえばＥＦ−１αプロモーターに独立である活性を示すプロモーターに機能的に連結された本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００７７】
さらに、本発明は、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを包含する宿主細胞に関する。宿主細胞の例は、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３Ｔ、酵母、昆虫細胞のような真核細胞、および大腸菌のような原核細胞である。好ましくは、宿主細胞は、ＨｅＬａＭ９（下記の実施例参照）のようなＹｏｐの細胞死滅効果に耐性がある。
【００７８】
本発明によると、本発明の培養宿主を包含し、製造されたキメラタンパク質を単離するものである本発明によるキメラタンパク質を製造する方法の提供がある。
【００７９】
いったん発現されると、本発明の組換えキメラタンパク質を、当業界の標準手段によって精製でき、たとえば精製は、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの段階を含みうる。
【００８０】
発現および精製の後、キメラは、構成要素ポリペプチドの生来のコンフォメーションと実質的に異なるコンフォメーションを保有しうる。この場合には、ポリペプチドを変性させ、還元し、その後ポリペプチドに、好ましいコンフォメーションに再折り畳みさせることが必要でありうる。
【００８１】
変性は、組換えタンパク質を含有する粗材料を、カオトロピック剤（たとえば、尿素＜またはグアニジンＨＣｌ）、還元剤および高ｐＨの組合せに暴露することによって達成される。これらの条件は、通常、封入体でタンパク質の可溶化および変性を引起す。結局、タンパク質の透明液体を得る。この段階で、タンパク質は、二次または三次構造なしで完全に開放される。次の段階は、タンパク質の折り畳みを可能にするｐＨ、還元剤およびカオトロピック剤濃度の極端な条件を緩和することである。その生来の三次構造に折畳むタンパク質の能力を、その一次構造によって指示する。従って、混沌および還元剤濃度を低下させ、ｐＨを減らすことは、通常十分である。しかし、しばしば、条件の微細調節を必要とする。
【００８２】
本発明は、本発明のキメラタンパク質を包含する医薬組成物に関する。本発明の１つの実施態様では、キメラタンパク質は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、または静脈内に特に有用である。非経口のための組成物は、一般に、抗体の溶液、または許容しうる担体、好ましくは水性担体中に溶解されたそのカクテルを包含する。多様な水性担体、たとえば水、緩衝液、０．４％生理食塩水などを使用しうる。
【００８４】
本発明の単回または多回投与は、患者によって要求され、寛容な場合に、投与量および頻度によって投与されうる。これらの処方におけるキメラ分子の濃度は、治療上の効果を得るために十分な量の分子を、体内に送出するように設計される。自己免疫疾患の場合には、組成物は、自己免疫疾患の経過および重度に影響を及ぼし、患者の症状を改善するのに十分である多量のキメラを送出するように設計されて、その疾患の減少または緩和にいたる。有効量は、投与の経路、治療されるべき疾患、および患者の症状による。
【００８５】
本発明のキメラタンパク質の種々の用途の中で、特定のヒト細胞によって引起される疾患または症状の治療または予防が挙げられる。たとえば、所定のリガンドが過剰に発現される特定の細胞。キメラタンパク質は、低レベルまたは正常レベルのリガンドを発現する細胞を死滅させるか、または「育成する」ために投与されうる。
【００８６】
１つの実施態様において、本発明は、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、疾患の病理発生または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造で、本発明のキメラタンパク質、好ましくはＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、またはフラグメントの使用を提供する。
【００８７】
別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＴＮＦが、敗血症ショック、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、マラリア、感染性肝炎、結核のような急性疾患、並びに癌関連悪液質、慢性ＧＶＨＤ、リューマチ様関節炎、小児性糖尿病、炎症性大腸疾患、および乾癬のような慢性疾患のような病原性の役割を果たす疾患の治療のために使用される。別の好ましい用途は、キメラタンパク質が結合するリガンドを発現する悪性細胞によって引起される癌の治療のためのである。キメラタンパク質は、たとえば、移植の前の骨髄からの有害細胞の排除で、インビボでも使用されうる。
【００８８】
さらに別の実施態様において、キメラタンパク質は、活性化リンパ様細胞が、病気発生に、または疾患、たとえば敗血症ショック、リューマチ様関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患、および鎌状赤血球貧血の経過に関与している疾患の治療のために使用される。
【００８９】
さらに別の実施態様において、キメラタンパク質は、ＮＦ−ｋＢ活性化が、疾患の発症または経過に関与している、好ましくは、ＮＦ−κＢを、正規の経路を介して誘発する疾患治療のために使用される。
【００９０】
ここで、本発明を記述して、例示によって提供される、本発明を限定することを意図しない、以下の実施例によって、本発明がより容易に理解できるものとなる。
【実施例】
【００９１】
実施例１． ｐ５５ＴＮＦ受容体（ＴＢＰ−１）の細胞外部分、シュードモナス外毒素ＩＩの切断移行ドメイン（ＰＥＩＩｔｒ）、ジフテリア毒素フリン切断部位（ＤＴ）、およびエルシニアＹｏｐＰタンパク質を含むキメラ遺伝子の構築（本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称す）。
図１Ａに図解で示されるとおり、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰ遺伝子（配列番号：１、図１Ｃ）を製造するために、可溶性型ｐ５５ＴＮＦ受容体をコードするＤＮＡフラグメント、最後の（Ｆ）α−へリックスを欠くシュードモナス外毒素ＩＩの切断移行ドメイン（それぞれ、図２、配列番号：２および図３、配列番号：３のＤＮＡおよびアミノ酸配列）、および毒素ＹｏｐＰに融合されたジフテリア毒素フリン切断部位の各々を製造し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させ、ライゲーションした。
【００９２】
可溶性型ｐ５５ＴＮＦ受容体のアミノ酸配列（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ジーンバンクＩＤ Ｍ７５８６６）は、ヒト尿から単離された可溶型受容体の主要な種のもの（ＴＢＰ−１）に対応し（米国特許第５，８１１，２６１号）、それは、受容体の細胞外ドメインのＡｓｐ４１からＡｓｎ２０１までを示す（スイス−プロット取得番号：Ｐ１９４３８）。テンプレートとして全長ＴＮＦＲＩ（プラスミドｐｃ５５）（Nopharら、１９９０に記載されるプラスミドｐｃ５５）および以下のプライマー：
フォアワードプライマー：
【化１】
を使用して、ＰＣＲ（１）増幅（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）から得た高誠実Ｔａｑポリメラーゼを使用）によって、可溶型ｐ５５ＴＮＦ受容体、ＴＢＰ−１を単離した。
【００９３】
このプライマーは、ＮｄｅＩ制限部位（キメラ遺伝子を発現ベクターに挿入するために後に必要とされる）、続いてＴＢＰ−１の５’末端を重複する２０ヌクレオチド（コーディング配列をイタリック体にする）を有する。
【００９４】
リバースプライマー：
【化２】
【００９５】
このプライマーは、ＴＢＰ−１の相補３’末端を重複する２２ヌクレオチド、続いてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＴＢＰ ＤＮＡを、ＰＥＩＩｔｒをコードするＤＮＡに連結するために後に必要とされる）を有する。
【００９６】
シュードモナス・アエルギノーサ外毒素Ａ型遺伝子（受託番号Ｋ０１３９７、ＮＣＢＩジーンバンク）の残基２７８から３８４までに対応するポリペプチド配列、ＰＥＩＩｔｒをコードするＤＮＡ配列（配列番号：２）は、テンプレートとしてシュードモナス・アエルギノーサの血清群６１のゲノムＤＮＡ（Leitner G. Kimron Veterinary Institute、イスラエル）、および以下のプライマー類：
フォアワードプライマー：
【化３】
を使用したＰＣＲ増幅によって単離した。
【００９７】
このプライマーは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をコードするヌクレオチド（ＰＥＩＩｔｒを、前記増幅したＴＢＰ−１ ＤＮＡに連結するために後に必要とされる）、続いてリンカー配列をコードする１４ヌクレオチド、ccggaggtcccgag、および続いて外毒素Ａ（受託番号Ｋ０１３９７）のヌクレオチド１５７７−１６０３に対応するＰＥドメインＩＩの５’末端を重複する２７ヌクレオチドを有する。
リバースプライマー：
【化４】
【００９８】
このプライマーは、ＳｍａＩ制限部位、および３８４の前にあり、３８４アミノ酸残基を含むＰＥの残基をコードするＤＮＡに相補的なヌクレオチド１８９４−１８７４を有する。それは、ＰＥのアミノ酸３８４の前にあり、それを含むアミノ酸残基をコードする相補的ヌクレオチド（gtcgttgccggtgccctgccg）、停止コドンおよびＳｍａＩ（cccggg）およびＥｃｏＲＩ（gaattc）制限部位（下記で単離されるＤＴ−ＹｏｐＰ ＤＮＡフラグメントにライゲートするために後に必要とされる）を包含する。ＰＥＩＩｔｒフラグメント（ＰＣＲ２産物）を、ＤＴ−ＹｏｐＰ（ＰＣＲ３産物、下記参照）にライゲーションする前に、ｐＥＴ−ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００９９】
ジフテリア毒素（ＤＴ）−フリン切断部位（ＲＶＲＲ）をコードするＤＮＡで、その５’末端にライゲートされたＹｏｐＰをコードするＤＮＡを作製するために、三番目（ＰＣＲ３）を行った。ＰＣＲ３については、エルシニア・エンテロコリティカ血清群Ｏ：８のＹｏｐＰエフェクター残基１−８６４をコードするＤＮＡをテンプレート（ＴｒＥＭＢＬ、受託番号Ｑ９３ＫＱ５）として使用し、以下のプライマー：
フォアワードプライマー：
【化５】
を使用した。
【０１００】
このプライマーは、ＳｍａＩのヌクレオチド配列（ＴＢＰ−１−ＰＥＩＩｔｒにライゲートするために後に必要とされる）、続いてＤＴフリン切断部位（ＲＶＲＲ）をコードする１２ヌクレオチド、およびＹｏｐＰ遺伝子の５’末端を重複する３１ヌクレオチドを包含する。
【０１０１】
リバースプライマー：
【化６】
【０１０２】
このプライマーは、ＹｏｐＰ遺伝子の３’末端を重複する３０相補的ヌクレオチド、およびＥｃｏＲＩの制限部位（ＴＢＰ−１−ＰＥＩＩｔｒにライゲートするために後に必要とされる）を包含する。
【０１０３】
ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰフラグメントを得るために、前記増幅ＤＴ−ＹｏｐＰ（ＰＣＲ３産物）ＤＮＡフラグメントを、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ、続いて適合性末端を通してＰＥＩＩｔｒにライゲートさせた。
【０１０４】
ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩ部位に挟まれたキメラＴＢＰ−ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰフラグメントを得るために、ＴＢＰ−１（ＰＣＲ１産物）を、ＰＥＴＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰを含有するｐＥＴ基本のベクターのＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。キメラＴＢＰ−ＰＥＩＩｔｒ−ＤＴ−ＹｏｐＰ遺伝子をコードするベクターｐＴＢＰ−ＹｏｐＰを、Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＤＨ５α）中に形質転換し、増幅し、当技術分野において既知の方法により精製した。
【０１０５】
実施例２． 真核細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性の評価
ＹｏｐＰは、炎症の発生における中心であることが知られる転写因子であるＮＦ−κＢを阻害する。以下の実験は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質が、真核細胞におけるＮＦ−κＢ阻害活性を保持するかどうかを、細菌性封入体におけるタンパク質の製造および可溶化タンパク質の再折り畳みの前に試験するために行った。
【０１０６】
最初に、真核細胞におけるＹｏｐＰの発現用の適切なプロモーターを探すために、Ｙｏｐを単独で含むベクターを用いて実験を行った。この目的のために、ＹｏｐＰ ＤＮＡを、２つの異なる真核生物のベクターｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡおよびｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡ（インビトロゲン）に挿入した。ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡおよびｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡは、それぞれ異なるプロモーター、ＣＭＶおよびＥＦ−１αを有する。これらのベクターは、タグ付タンパク質の製造を可能にする。タグ付ＹｏｐＰタンパク質を得るために、ＹｏｐＰの停止コドンを、ＰＣＲによって突然変異させて、バリンをコードさせた。ＹｏｐＰをタグ付きにすることにより、タグ特異的抗体を使用することによってウエスタンブロット分析で発現したＹｏｐＰの検出を可能にする。
【０１０７】
ＹｏｐＰおよびＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ｈｉｓ−Ｔ７−ＹｏｐＰをコードするｐｃＤＮＡ３基本のベクターと、レポーター遺伝子Ｈｉｓ−Ｔ７−ＧＦＰの両方を同時トランスフェクトさせることによって２９３細胞で発現された。平行して、ＹｏｐＰ−ｖ５およびレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ−ｖ５は、ＥＦ１−αプロモーターの制御下で、ＹｏｐＰ−ｖ５をコードするｐＥＦ６基本のベクターと、レポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼ−ｖ５の両方を同時トランスフェクトさせることによって２９３細胞で発現された。
【０１０８】
図４のＢで示されるとおり、ＣＭＶプロモーターによって制御されるＨｉｓ−Ｔ７−ＹｏｐＰの発現は、弱すぎて、検出用の抗−Ｔ７抗体を使用したウエスタンブロット分析によって見ることができなかった。ＣＭＶプロモーターは、３つの強力なＮＦ−κＢ結合部位を含有する（図４のＣ）。従って、おそらく、ＣＭＶプロモーターによって制御されるタンパク質の発現は、ＮＦ−κＢの強力な阻害剤、ＹｏｐＰによって阻害された。
【０１０９】
図４のＢで観察された結果はまた、トランスフェクション反応におけるＹｏｐＰプラスミド濃度を１から５μｇまで増大させると、同様にＣＭＶプロモーターの阻害によってもっともおそらく引起されるＧＦＰ−発現の減少という結果になった。
【０１１０】
対照的に、ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーター下で発現された場合に容易に検出された（図４のＡ）。さらに、ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーター下で発現されたレポーター遺伝子β−ガラストシダーゼの発現を阻害しなかった（図４のＡ）。
【０１１１】
ＣＭＶプロモーターとは異なり、ＥＦ−１αプロモーターの活性は、ＮＦ−κＢ活性から独立している（図４のＣ）ので、ＹｏｐＰおよびキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰは、ＥＦ−１αプロモーターの制御下で効率よく発現された。
【０１１２】
ＥＦ−１αプロモーターの制御下で発現されたＹｏｐＰが、真核細胞中でＮＦ−κＢ活性を阻害するかどうかを調べるために、以下の実験を行った。ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性を調べるために、２９３細胞を、ＹｏｐＰをコードするｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡまたは空のｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡベクターと、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔ−プロモーター下でルシフェラーゼをコードするベクターとで同時トランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に、細胞をＴＮＦで処理してＮＦ−κＢ活性化を誘発するか、または未処理細胞のままとし、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ発現（活性）を測定した。
【０１１３】
ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、トランスフェクションの４８時間後、２９３細胞を、６時間、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−αによる誘発後、細胞を、３回、ＰＢＳで洗浄し、トリトン／グリシルグリシン溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で、氷上で溶解し、溶解物を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ Ｋ3ＰＯ4、ｐＨ７．８（またはＮａ2ＨＰＯ4））で４回希釈した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２ｍＭ ＡＴＰおよび２００μＭ ルシフェラーゼを添加した。
【０１１４】
図５のＡに示されるとおり、ベクター（ｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡ）単独でトランスフェクトされた細胞のＴＮＦ−α処理（およびＮＦ−κＢ活性化）は、非処理細胞に比較して、６，０００以上のルシフェラーゼ単位の増大を示した。空のベクターの代わりに、ＹｏｐＰをコードするベクター（０．１または５μｇ）を使用した場合に、ルシフェラーゼ活性の阻害（およびＮＦ−κＢ活性の阻害）が観察された。
【０１１５】
代わりに、ＮＦ−κＢ活性化は、ＮＩＫ（スイス−プロット一次受託番号Ｑ９９５５８、名称：細胞分裂で活性化されるタンパク質キナーゼキナーゼキナーゼ１４、同義語：ＮＦ−カッパ ベータ−誘発性キナーゼ）を過剰発現させることによって誘発することができる。ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害作用を、ＮＩＫの過剰発現によって媒介されるＮＦ−κＢ活性化でも評価した。図５のＢは、ＮＩＫをコードする発現ベクター（ｐＮＩＫ）で細胞をトランスフェクトすると、トランスフェクトの４８時間後にＮＦ−κＢ活性化を誘発したこと、ｐＮＩＫと、ＹｏｐＰをコードするベクターとの同時トランスフェクトが、ＮＦ−κＢ活性化を防止することを示す。
【０１１６】
ＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害が、ＮＦ−κＢ活性化の代替経路の阻害を介して引起されるという可能性を探索した。この目的のために、代替経路によるＮＦ−κＢ活性化に特異的である代謝変化を、ＹｏｐＰの存在下で、または非存在下で誘発されるＮＦ−κＢ活性化に続いて測定した。たとえば、異所性の添加ＹｏｐＰの存在下、または不在下におけるＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化に続いて、ｐ１００の分解およびｐ５２の見掛けにおける変化をモニターした。図５のＣにおける結果は、ｐ５２およびｐ１００のレベルが、ＹｏｐＰの存在下で影響されなかったことを示す。従って、ＹｏｐＰによるＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化の阻害は、正規の経路の阻害のみを介して引起されるようである。
【０１１７】
前記結果に基づいて、ＥＦ−１αプロモーターを、真核細胞におけるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰの発現を制御するために選択した。ｐＥＦ６−ｖ５−ＨｉｓＡベクターのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩクローニング部位に、ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩに隣接したＴＢＰ−ＹｏｐＰ挿入物をライゲートするために、挿入物およびベクターのＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ突出部位を、それぞれ、ライゲーションの前に充填した。ライゲーション後、生じたプラスミドは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６と名付けられた。
【０１１８】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性を調べるために、２９３細胞を、空のベクター、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６またはｐＹｏｐＰ−ｖ５−Ｈｉｓのいずれかと、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔ−プロモーター下でルシフェラーゼをコードするレポーターベクターとを同時トランスフェクトした。ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、トランスフェクトした４８時間後、細胞を、６時間、５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＴＮＦ−αで処理した。ＴＮＦ−αによる誘発後、細胞を、ＰＢＳで三回洗浄し、トリトン／グリシルグリシン溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００、２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で氷上で溶解し、溶解物を、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ グリシルグリシン、ｐＨ７．８、１５ｍＭ ＭｇＳＯ4、４ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ Ｋ3ＰＯ4、ｐＨ７．８（またはＮａ2ＨＰＯ4））で４回希釈した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、２ｍＭ ＡＴＰおよび２００μＭ ルシフェラーゼを添加した。
【０１１９】
ベクター単独でトランスフェクトされ、ＴＮＦ−αで処理された細胞の溶解液が、非処理細胞の溶解液と比較して、８０，０００以上のルシフェラーゼ単位の増大（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化）を示した。空のベクターの代わりに、ＹｏｐＰ単独またはＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラのいずれかをコードするベクターを使用した場合、ルシフェラーゼ発現の阻害（すなわち、ＮＦ−κＢ活性化の阻害）が観察された（図６のＡ）。抗−ｖ５および抗−ＴＢＰ−１抗体を用いた、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ／ｐＥＦ６でトランスフェクトされた細胞由来の溶解液のウエスタンブロット分析により、全長キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、約６３ｋＤａの見掛け分子量で真核細胞の細胞質で発現されることを示した（図６のＢ）。プラスミドから発現されることによって、キメラタンパク質が、フリンおよびフリン様タンパク質が作用するオルガネラであるゴルジまたはエンドソームに入らなかったので、キメラタンパク質は、フリンまたはフリン様プロテアーゼによって切断されなかった。
【０１２０】
得られた結果は、いったん真核細胞中に入ると、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質が、ＹｏｐＰ単独と同じくらい有効にＮＦ−κＢ活性を阻害する能力があることを示す。
【０１２１】
実施例３． 細菌細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの産生
ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、真核細胞で活性であること（先行の実施例参照）が立証された後、キメラタンパク質は、以下のとおり細菌細胞中で産生された。
コンピテントＢＬ−２１／ｐＬｙｓＳ（ＤＥ３）細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰを含有するベクター（ｐＴＢＰ−ＹｏｐＰ、実施例１参照）で形質転換し、アンピシリンを含有する２ＹＴ寒天プレートに播種し、３０℃で、一晩（約１６時間）インキュベートした。細胞形質転換体を、寒天プレートから収集し、プレート当たり５ｍｌの２ＹＴ中に懸濁させた。収集した細菌細胞を、３リットルの２ＹＴ中で、２００μｇ／ｍｌカルベニシリンと共に培養し、細胞培養物のＯ．Ｄ．600が、０．６になるまで３０℃でインキュベートした。その後、細胞を２０℃に移し、組換えタンパク質発現の誘発のために、１ｍＭ イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で処理した。ＩＰＴＧ添加の４５分後、２００μｇ／ｍｌリファンピシン（ＤＭＳＯ中に１００ｍｇ／ｍｌの保存溶液）を、その細胞に添加した。細胞培養物を、５時間、２０℃で成長させ、遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により収集し、得られた細胞ペレットは、−７０℃で凍結保存した。
【０１２２】
細胞溶解物を調製するために、凍結細胞ペレットを、氷上で解凍させ、１００ｍｌの緩衝液Ａ［カルシウムおよびマグネシウムなしのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ ｗ／ｏ」）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍｇのＭｇＳＯ4、４錠の完全プロテアーゼカクテル（ロッシュ）、３０ｍｇ／ｌのＤＮＡエースＩ（シグマ））］に再懸濁させた。細胞凝集塊を破壊するために、細菌懸濁液を、氷上で超音波処理した。以下の方法により、全細菌溶解を得た。３×３５ｍｌの細胞を、５０００プサイでフレンチプレスにかけ、その後、１５０００プサイで二回プレスにかけた。その後、溶解細胞を、ＳＳ−３４ローターを採用する、ソルバル遠心機で５０分間、４℃、１５，０００ｒｐｍで遠心分離（２７，０００×ｇ）にかけた。ペレットを、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよび３％トリトンＸ−１００を含有する４０ｍｌの「ＰＢＳ ｗ／ｏ」に再懸濁し、氷上で超音波処理して、封入体を再懸濁した。溶解細胞から放出される封入体を、５０分間、４℃、２７，０００×ｇで、超遠心分離により沈澱させた。封入体を、さらに二回、２０ｍＭ ＥＤＴＡおよびトリトンを含有する４０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、トリトンの不在下で、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する４０ｍｌのＰＢＳで三回洗浄した。
【０１２３】
組換えタンパク質のほとんどを含有する封入体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定されるように、図７のＡ）を、８Ｍ 尿素を含み、ｐＨ１２〜１２．８に滴定された５ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有する変性溶液に溶解した。使用された変性溶液の量は、封入体の湿重量の４４３倍に等しかった。封入体の全溶解を促進するために、溶液を激しく渦回転させ、氷上で超音波処理した。
【０１２４】
タンパク質を、ｐＨ９．５で、５０ｍＭ ホウ酸緩衝液で１０倍希釈して再生させ、穏やかに攪拌（２００ｒｐｍ）しながら、４℃で１８〜２０時間インキュベーションにかけた。
【０１２５】
２．５リットルの再折り畳みタンパク質を、限外濾過機ＰＭ３０（アミコン）を介して超遠心分離により１５倍濃縮し、濃縮タンパク質の最終体積を、約１７０ｍｌとした。ブラッドフォード試薬（Bradford reagent）（シグマ）によって、再折り畳み粗タンパク質のタンパク質濃度を、約１００μｇ／ｍｌであると概算した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ融合タンパク質を、約１０％の再折り畳み粗タンパク質（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質バンドの密度測定器により概算されるとおり）であると概算した。したがって、３リットルの細菌培養物から、約１．７ｍｇのキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質を得るか、または５００ｍｇ封入体から、１７ｍｇの全粗タンパク質を得て、その１％付近のもの（約１７０ｎｇ）が、活性キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質であった（下記の実施例４参照）。
【０１２６】
得られた結果は、細菌性封入体で産生されるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰは、再折り畳みでき、６３Ｋｄａの正確なサイズを示したことを示す（図７）。
【０１２７】
実施例４． ＴＮＦに対するキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰタンパク質の結合
細菌細胞で産生されるタンパク質（実施例３参照）である再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＴＮＦ結合活性を保持するかどうかを評価するために、以下の実験を行った。
【０１２８】
ＴＮＦ被覆プレートを使用して、ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合を評価した。ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合を、ＴＮＦに対する非キメラ組換えヒトＴＢＰ−１（ＣＨＯ起源のＨＰＬＣ精製）と、ＴＮＦに対するシュードモナス・エルギノーサ外毒素の移行および触媒ドメインに融合されたＴＢＰ−１を含む別のキメラタンパク質であるＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された仮米国出願第６０／５８２８２７号で開示される）の結合と比較した（図８）。
【０１２９】
４℃で、１６時間、０．０２％ＮａＮ3を含有する０．１ＭのＮａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）中の２ｍｇ／ｍｌ精製ＴＮＦの溶液でプレートをインキュベートすることによって、９６ウエルのマイクロタイタープレートを、ＴＮＦで被覆した。インキュベーション後、ウエルをＰＢＳで洗浄して、さらに、３％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ3を含有する０．２ｍｌ／ウエルＰＢＳ（遮断溶液）と共に、３７℃で、３時間インキュベートした。図８のＡで示される量のタンパク質を含有する、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ＴＢＰ−１またはＴＢＰ−ＰＥ３８の５０μｌサンプルを、ウエル（三重に）当たりに塗布し、そのプレートを、３７℃で、１時間インキュベートした。必要であれば、サンプルを遮断溶液で希釈した。１時間のインキュベーションに続いて、プレートを、遮断溶液で三回洗浄した。遮断溶液で１：１０００に希釈した５０μｌのウサギ抗−ＴＢＰ−１抗体を、ウエルに添加し、３７℃で、１時間、または４℃で一晩インキュベートし、遮断溶液で三回洗浄した。５０μｌの二次抗体、１：１０００に希釈された抗−ウサギ−ＨＲＰを、ウエルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、遮断溶液で三回洗い流した。０．０１％Ｈ2Ｏ2を含有する１００μｌの新しく調整した溶液ＡＢＴＳを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＢＰまたはキメラＴＢＰの存在を、４０５ｎｍで測定された緑色強度の見掛けにより検出した。
【０１３０】
図８で要約されるＴＮＦ結合アッセイで、ＨＰＬＣ精製ＴＢＰ−１のＴＮＦ結合活性を、１００％（図８のＢ）とすると、ＴＮＦ−αに対する粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの結合許容量は、約０．５〜１％であることが分かった（図８のＢ）。再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰが、封入体の全タンパク質のわずか５〜１０％であることを考慮して（先行の実施例および図７参照）、我々は、タンパク質の少なくとも１０％が適切に再折り畳みされていると結論付けた。したがって、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ再折り畳みの効率が、１０％に近いＴＢＰ−ＰＥ３８の再折り畳みの効率（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号）に類似であると分かった。主要な差は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８が、封入体中の粗タンパク質の３０％以上を表すことであった。
【０１３１】
得られた結果は、細菌中で産生されるキメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、正確に再折畳まれ、ＴＮＦを結合する能力があることを示す。
【０１３２】
実施例５． インサイチューでの再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性
エルシニアの感染中に、ＹｏｐＰを細胞に注入する。いったん細胞の内側に入ると、ＹｏｐＰは、ＴＮＦ−α放出を抑制すること、および感染マクロファージにおけるアポトーシスを誘発することが知られている（Cornelis G.R. Nature、２００１）。以下の実験は、３つの異なる細胞：ＬＰＳ活性化ヒト単球ＴＨＰＩ細胞株、表面ＴＮＦ−αを過剰発現するヒト上皮ＨｅＬａ Ｍ９細胞株、およびマウスＬＰＳ−活性化一次マクロファージ中でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素の移行および触媒ドメインに融合したＴＢＰ−１を包含する別のキメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ３８（２００４年６月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／５８２８２７号）との比較で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性を調べるように設計された。特異性を試験するために、非キメラヒト組換えＴＢＰ−１を、ＴＮＦ結合について競合するいくつかのウエルにキメラタンパク質の直前に適用した。
【０１３３】
マクロファージ様細胞株に対するキメラタンパク質の細胞毒性を調べるために、ＴＨＰＩ細胞（実施例７）を、１６時間、インシュリン １ｍｋｇ／ｍｌ、トランスフェリン １μｇ／ｍｌ、亜セレン酸Ｎａ １ｎｇ／ｍｌ、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸、ＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌのグルタミン、を含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中の９６ウェルプレート中でウエル当たり密度２００，０００細胞で播種した（マクロファージ様表現型およびＬＰＳ受容体の露出を誘発するために）。その後、１〜１．５時間、濃度１μｇ／ｍｌでＬＰＳ Ｅ．ｃｏｌｉ（０１１１−Ｂ４）を、１０μｇ／ｍｌの濃度でＧＭ６００１（細胞表面からＴＮＦ陰り（shading）を防止するメタロプロテイナーゼ阻害剤）と一緒に添加した。得られたＰＭＡ−ＬＰＳ−ＧＭ６００１処理ＴＨＰＩ細胞は、大量の表面ＴＮＦを有するマクロファージ細胞の表現型の特徴を示す。これらのマクロファージ様細胞株を、約２０時間、種々の濃度の再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８とインキュベートし、生存を評価するためにニュートラルレッドで染色した。表示した場合、組換えヒトＴＢＰ−１を、細胞表面ＴＮＦと競合する再折り畳みキメラタンパク質の直前に添加した。図９のＡで示されるとおり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、２５および５０μｇ／ｍｌの濃度で、活性化ＴＨＰＩ細胞の５０〜７０％の細胞死を引起す。活性ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、粗再折り畳みタンパク質のわずか１％付近を構成すること（図８のＢ）を考慮に入れると、我々は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの有効濃度が、０．２５μｇ／ｍｌ程度の低さであると評価した。ＴＢＰ−１は、１００倍過剰で使用した場合、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの毒性から細胞を完全に保護することが分かり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性効果が、活性化ＴＨＰＩ細胞の表面ＴＮＦを通して特異的に誘発されることを示した。
【０１３４】
対照的に、他のキメラタンパク質ＴＢＰ−ＰＥ３８が、活性化ＴＨＰＩ細胞の細胞死を引起さないことが分かった（図９Ｂ）。
【０１３５】
得られた結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、活性化単球様細胞株の表面に特異的に結合し、細胞に浸透し、細胞死を引起すことを示す。
【０１３６】
ＴＢＰ−ＹｏｐＰ細胞毒性の細胞特異性を試験するために、膜結合ＴＮＦを過剰発現する遺伝子操作された上皮細胞株であるＨｅＬａ Ｍ９においてＴＢＰ−ＹｏｐＰの細胞毒性効果を評価した（実施例７）。
【０１３７】
ＨｅＬａ Ｍ９細胞を、１０％Ｆｃｓを有するＲＰＭＩ中の９６ウェルプレート中のウエル当たり密度１００，０００細胞で播種した。接着後、それぞれ、所定の濃度の再折り畳みキメラタンパク質ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８を、ウエルに添加し、約２０時間インキュベートした。表示した場合、組換えヒトＴＢＰ−１を、細胞表面におけるＴＮＦに対する結合に競合するため、再折り畳みキメラタンパク質の直前に添加した。２０時間のインキュベーションに続いて、細胞を、細胞生存を評価するためにニュートラルレッドで染色した。
【０１３８】
図１０で示される結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＴＨＰＩ細胞の約７５％細胞死を引起すことが示された濃度である２５μｇ／ｍｌ程度の高さの濃度で、上皮ＨｅＬａＭ９細胞に対する細胞毒性はなかったことを示す（図９のＡ）。
【０１３９】
対照的に、ＴＢＰ−ＰＥ３８は、０．６μｇ／ｍｌの濃度で、ＨｅＬａＭ９細胞において９０％以上の細胞死を引起した。このＴＢＰ−ＰＥ３８の濃度では、ＴＨＰＩ単球細胞株において細胞毒性効果を示さなかった（図９のＢ）。ＴＢＰ−１は、ＴＢＰ−ＰＥ３８の細胞毒性効果を防止し、ＴＮＦ結合によるＴＢＰ−ＰＥ３８作用の特異性を示す。ＴＢＰ−ＰＥ３８のバッチの一つは、非常に活性があり、０．０６μｇ／ｍｌ程度に低い濃度で細胞毒性があり、ＨｅＬａＭ９細胞の６５％近くまで死滅させた。
【０１４０】
全体において、これらのデータは、いったん細胞の内側に入ると、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、マクロファージ様細胞株に対して細胞毒性であるが、上皮ＨｅＬａＭ９細胞に対しては毒性がないことを示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞毒性ではないが、飢餓の後の血清活性化により引起されるｐ３８リン酸化のＴＢＰ−ＹｏｐＰ阻害により立証されるとおり（実施例６および図１０参照）、それは、表面ＴＮＦに結合し、ＨｅＬａ Ｍ９細胞に浸透することを示す実験上の証拠を得た（下記の実施例６参照）。
【０１４１】
再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰの活性は、ＬＰＳ活性化一次マクロファージでも試験した。一次マクロファージの作製のために、雌マウスＣ５７ＢＬ／６に、１．５ｍｌ滅菌ブリューワーのチオグリコレートブロス（ジフコ（Difco））を、４日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）で注入した。腹腔滲出液（＞８５％マクロファージ）を、４日目に収穫し、遠心分離によりＰＢＳで洗浄し、１０％加熱不活化Ｆｃｓを含むＲＰＭＩ中に１×１００，０００マクロファージ／ウエルで、９６ウェル平底プレートに播種した。細胞を１８時間接着させた。暖かい培地で洗浄することによって、非接着細胞を除去した。
【０１４２】
マクロファージ活性化を誘発するために、５μｇ／ｍｌのＧＭ６００１（カルバイオケム）の存在下で、マクロファージ単層を、図１２に示される濃度（１μｇおよび１０μｇ）のＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ ０１１：Ｂ４）を用いて１時間処理した。誘発後、細胞を、再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８の存在下、または非存在下で、さらに２時間インキュベートした。次に、細胞培養用の培地へのＴＮＦ−αの分泌を可能にするためＧＭ６００１なしで、同じ濃度のＬＰＳを用いて、培地をＲＰＭＩ＋１０％ＨＦｃｓに交換した。一晩インキュベートしたマクロファージの細胞培養培地を収集し、ＴＮＦ−αを、バイオアッセイによって測定した。細胞単層を、ニュートラルレッドで染色して、細胞生存を測定した。
【０１４３】
図１２で要約された、得られた結果は、キメラタンパク質ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８のいずれも、活性化一次マクロファージに細胞毒性でなかったことを示す。
【０１４４】
ＹｏｐＰが、ＴＮＦ分泌を阻害することが知られているので、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下でインキュベートされたＬＰＳ−活性化一次マクロファージの成長培地中に分泌されるＴＮＦのレベルを評価した（図１３）。活性化一次マクロファージの培地を収集して、新鮮な培地で２倍、４倍および８倍（それぞれ、０．５、０．２５、０．１２５）に希釈し、ウエル当たり密度１×１０5細胞（９６ウェルプレート上に）で播種されたＴＮＦ感受性細胞（Ｌ９２９）の単層に塗布した。１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドの存在下で、バイオアッセイを行った。Ｌ９２９細胞（ネズミ結合組織クローンＬ９２９ ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を、活性化マクロファージの調整培地でインキュベートし、２０時間インキュベートした。Ｌ９２９細胞毒性のレベルは、活性化一次マクロファージの調整培地中に存在するＴＮＦの濃度に比例している。
【０１４５】
図１３で示されるとおり、チオグリコレート処理腹腔マクロファージは、ある程度のＴＮＦ−αを産生した。たとえば、チオグリコレート処理済腹腔マクロファージの２または４倍希釈培地は、４０％以上のＴＮＦ感受性Ｌ９２９細胞の死を引起した。しかし、ＬＰＳによる別のマクロファージ活性化は、ＴＮＦ分泌を増大した。たとえば、細胞死は、活性化マクロファージの８倍希釈された調整培地にさらされたときに６０％以上高かった（図１３のＡ、Ｂ）。ＴＢＰ−ＰＥ３８の存在下の活性化一次マクロファージの調整培地は、ＴＢＰ−ＰＥ３８の非存在下における活性化マクロファージの調整培地と等しくＬ９２９について毒性であることが分かった（図１３のＢ）。この結果は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、一次活性化マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害しないことを示す。対照的に、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で活性化されたマクロファージの調整培地は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの非存在下で活性化されたマクロファージの調整培地に比較して、比較的毒性が低い。たとえば、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で活性化されたマクロファージの調整培地を、８倍希釈（図１３１Ａで０．１２５）すると、ＴＮＦの量は、低すぎてＬ９２９細胞に毒性でなかった。４倍または２倍希釈のような低希釈は、なお、Ｌ９２９細胞の６０〜７０％を死滅させるのに十分なＴＮＦを含有した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰと組合わせたＴＢＰ−１とのマクロファージのインキュベーションは、ＴＮＦ製造におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの阻害影響を防止した（図１３Ｂ、０．１２５）。この場合には、細胞死は、約６０％であり、すなわち、同じレベルの細胞死が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの非存在下における活性化マクロファージの調整培地を使用して観察された。
【０１４６】
これらの結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰまたはＴＢＰ−ＰＥ３８のいずれも、活性化一次マクロファージの死を引起さないが、しかしＴＢＰ−ＰＥ３８とは異なり、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化一次マクロファージにおけるＴＮＦ分泌を阻害する能力があることを示す。
【０１４７】
従って、ＴＢＰ−ＹｏｐＰは、活性化マクロファージにおいて、このような細胞を死滅させることなく、マクロファージ細胞中におけるＴＮＦ−α産生を減少させるという治療目的のために利用することができる、望ましく、特定の効果を有する。
【０１４８】
実施例６． ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるｐ３８のリン酸化におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの阻害効果
ＹｏｐＰタンパク質は、ＭＡＲＫおよびＮＦ−κＢ経路を阻害することが知られている。前述の実施例で、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨｅＬａＭ９細胞に対して細胞変性効果を有さないことが示された。ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰのなんらかの効果があるかどうかを調査するために、ＭＡＰＫカスケードのシグナル伝達の指標であるｐ３８のリン酸化を調べた。
【０１４９】
ＨｅＬａ Ｍ９（ウエル当たり２００，０００細胞）を、９６ウェルプレートに播種し、インシュリン（１ｍｋｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸Ｎａ（１ｎｇ／ｍｌ）、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸グルタミンを含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中で１６〜１８時間飢餓状態にさせた。その後、１０μｌの体積中に１μｇの組換えＴＢＰ−ＹｏｐＰを、細胞上に塗布し、細胞表面上でＴＮＦと相互作用させ、１時間、細胞を浸透させた。対照として、１０μｌの溶媒（５０ｍＭホウ酸塩／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）を細胞に添加した。その後、図１１のＡで示されるとおり、全ての細胞についてのＴＢＰ−ＹｏｐＰとのインキュベーションの総時間が２時間となるよう、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で、６０から５分までの異なる時間の時間間隔で、１０％加熱不活化Ｆｃｓ（ＨＦｃｓ）によって、細胞を活性化させた。続いて、細胞を、ホスファターゼ阻害剤ＮａＶａ（１ｍＭ）およびＮａＦ（１０ｍＭ）、およびプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（１ｍＭ）、および完全（ロシュ）の存在下で、５０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトン（ｐＨ８．０））中で氷上で溶解させた。細胞溶解物を、リン酸化ｐ３８（ｐＰ３８）に特異的なポリクローナル抗体（セル・シグナリング（Cell Signalling））を用いて検出されるウエスタンブロット分析にかけた。同じブロットを、負荷されたタンパク質の正規化のために抗ＩＫＫ−α（モノクローナル抗−ＩＫＫ−α、サンタ・クルーズ）で再調査した。
【０１５０】
図１１のＢおよびＣは、細胞が図１１のＡに例示されるとおり処理されたか、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰの代わりに、溶媒（ホウ酸塩緩衝液）が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下でｐ３８リン酸化を比較するために使用された２つの実験の結果を示す。
【０１５１】
２つの実験の結果（図１１のＢおよびＣ）において、ＨＦｃｓ活性化の５分後に、ＨｅＬａＭ９でのｐ３８のリン酸化が観察された。リン酸化は、最初の１０分で増大し、ＨＦｃｓ活性化の３０および６０分後に徐々に減少した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、ＨＦｃｓ活性化の少なくとも３０分後までに、ＨｅＬａ Ｍ９細胞におけるｐ３８のリン酸化を阻害することが分かった。
【０１５２】
この実験で得られた結果は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰが、上皮細胞ＨｅＬａ Ｍ９細胞にとって細胞毒性でないが、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードでのＴＢＰ−ＹｏｐＰ阻害作用により明示されるとおり、明らかにＨｅＬａＭ９細胞に浸透することを示す。
【０１５３】
実施例７． その表面にＴＮＦを発現する細胞
２つの細胞株を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの効果を調査するために使用した。（ａ）ヒト急性単球性白血病ＴＨＰＩ細胞（ドイツ国コレクション・オブ・マイクロオーガニズムス・アンド・セル・カルチャーから入手）。これらの細胞の単核細胞分化は、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）で誘発しうる。これらの細胞を、１０％Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、１％ 非必須アミノ酸、９ｍｇ／ｍｌインシュリン、１００ｍｇ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中で、０．３〜１×１０6／ｍｌの細胞密度範囲で培養する。細胞表面ＴＮＦ発現を増強するために、ＰＭＡで活性化された（１６〜２０時間、１００ｎｇ／ｍｌ）これらの細胞を、試験の前に２時間、ＬＰＳ（１．５時間、１ｍｋｇ／ｍｌ）で、１０ｍｃｇ／ｍｌメタロプロテアーゼ阻害剤ＧＭ６００１（カルバイオケム）で処理した。
【０１５４】
（ｂ）ＨｅＬａ−Ｍ９細胞、位置＋２でアルギニン、位置＋３でセリンを、スレオニンに置換するヒトＴＮＦ突然変異体ｃＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーターの制御下で、構造上発現する上皮ＨｅＬａ頸部癌株のクローン。これらの突然変異は、２６ｋＤａ ＴＮＦの約１０倍の切断速度の減少を引起す。細胞を、１０％ Ｆｃｓ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌ ペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、および５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンを補充されたＲＰＭＩ １６４０培地で培養する。
【０１５５】
ＴＮＦ−αの削減（shedding）を防止するメタロプロテアーゼＧＭ６００１（１０μｇ／ｍｌ（カルバイオケム））の阻害剤の存在下で、ＦＡＣＳによって、ＴＨＰＩ細胞の細胞表面におけるＴＮＦ発現を評価した。５×１０5細胞のサンプルを、１６時間、インシュリン（１ｍｋｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（1μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸Ｎａ（１ｎｇ／ｍｌ）、ピルビン酸Ｎａ、非必須アミノ酸グルタミンをＰＭＡ５０〜１００ｎｇ／ｍｌと共に含有するＦｃｓ不含ＲＰＭＩ中でインキュベートした。その後、２時間、ＬＰＳＥ．ｃｏｌｉ ０１１１−Ｂ４を濃度１μ／ｍｌで、ＧＭ６００１（１０μｇ／ｍｌ）と一緒に添加した。細胞表面におけるＴＮＦ発現のＦＡＣＳ分析のために、細胞を、４Ｃで、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、ＦＩＴＣ−抗−ヒトＴＮＦ抗体と共にインキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン．ディキンソン、マウンテン・ビュー、ＣＡ）によって分析を行った。少なくとも３０％の細胞が、それらの表面上にＴＮＦ−αを発現することが分かった。
【０１５６】
実施例８． 内在化アッセイ
ＴＮＦ−α発現細胞（ＨｅＬａＭ９またはその他）を、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する培地中で、３７℃で、［125Ｉ］−接合体（１ｍｃｇ／ｍｌ）で標識した。その後、細胞をトリプシン処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％プロナーゼに再懸濁し、ジブチルフタレートによる遠心分離の前に２℃で４０分間放置した。エンドサイトーシス効率は、取込みの３０分後に、細胞結合［125Ｉ］−接合体のプロナーゼ耐性率として表される（Taupiac M-Pら、A1、１９９９から改修された）。
【０１５７】
実施例９． ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
遠心分離によって収集された細胞を、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解する。サンプルを、０．１％ＳＤＳ、１０％アクリルアミドスラブゲルへの適用の前に５分間煮沸する。クーマシーブルーによって、または銀染色によって、ゲルを染色することができる。
【０１５８】
免疫ブロッティングのため、電気泳動後にサンプルを、ニトロセルロース紙に移し、続いて毒素に対する抗体、または可溶型ＴＮＦ受容体に対する抗体と反応させ、その後ＨＲＰに連結した二次抗体（毒素に対して−ヤギ抗ウサギ抗体、可溶性ＴＮＦ受容体に対して−ヤギ抗マウス抗体）と反応させ、染色する。可溶性ＴＮＦ受容体に対する既知モノクローナル抗体を、記述されるとおり使用する（Engelmannら、１９９０およびBigdaら、１９９４）。
【０１５９】
実施例１０． 関節炎の自発的発症に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
ヒトＴＮＦトランスジーンの発現の翻訳制御を供する３’非コーディング領域が、β−グロビン遺伝子のものと共に発現される、ヒトＴＮＦトランスジーンを発現するトランスジェニックマウス（Kefferら、1991）を使用した。生後２週間で、マウスに、種々の用量の試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を腹腔内で注射し、その後、９週間の期間、週に１回再度注射した。関節の直径を測定することによって経時的にマウスの後足足首関節の腫れを評価した。関節構造に関与する病変／変化：関節皮膜、関節空間、滑膜、アキレス腱、および肋軟骨下の骨を、組織学的に評価する。
【０１６０】
実施例１１． 抗原誘発性関節炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
ルイスラットを、後足側面で、完全フロイントアジュバント中の０．５ｍｇメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）で免疫化させる。２１日後（０日目）、動物に、両方の後足膝関節で、発熱物質不含の生理食塩水中の５０μｇのｍＢＳＡを注射する。ラットに、関節内的に、その日、および続く２日に（０、１、２日目）、両方の膝関節中に試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。処置に比例して０〜６日目に、膝関節幅を毎日測定する。６日目に収集された関節の組織病理学上の試験を行う。膝関節構造に関与する病変／変化：関節皮膜、関節空間、滑膜、アキレス腱、および肋軟骨下の骨を、評価する。
【０１６１】
実施例１２． 抗原誘発関節炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
雄のＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）を、尾の根元での皮内注射によってＦＣＡ中に乳化した１００μｇのＩＩ型コラーゲン（ジフコ、デトロイト、ＭＩ）で免疫化する。免疫化の時間から開始して、マウスに、臨床上の関節炎の発生まで、腹腔内に、週２回、ＰＢＳ中の試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。免疫化の１５日後から、マウスを、２つの臨床パラメーター：脚の腫れおよび臨床上のスコアを使用して、疾患の発生について、１０日間、毎日試験する。第一に冒された後足の厚みを、カリパスを用いて測定することによって、脚の腫れを評価する。
【０１６２】
実施例１３． 大腸炎に対するマウスモデルにおける融合タンパク質の治療活性
Ｈａｒｌａｎ ＵＫで購入されたＩＬ−１０ノックアウトマウスを、相互交配して、ＩＬ１０遺伝子欠失についての同型接合のマウスを発生させ、それらの尾部ＤＮＡで行われるＰＣＲによって同型接合についてスクリーニングする。４週齢で開始して、２０週齢まで、マウスに、腹腔内で、週に三回、試験タンパク質（融合タンパク質、および、対照として、毒素のタンパク質、および融合タンパク質に組込まれた可溶性ＴＮＦ受容体のタンパク質）を注射する。腸の臨床スコア、組織学的分析、および糞便中の炎症性サイトカインの含有量を、（Scheininら、２００３）に記載されているとおりに評価した。
【０１６３】
実施例１４． 可溶型ｐ７５ＴＮＦ受容体の接合体の発現のためのプラスミドの構築
接合体に組込まれる可溶型ｐ７５ＴＮＦ受容体の配列（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ジーンバンクＩＤ Ｍ３２３１５）は、該受容体の細胞外ドメインの全配列（Ｌｅｕ１からＡｓｐ２３５まで）に対応する。この配列は、実施例１に記述されるとおり、毒素の配列に融合され、ｐＥＴベクターに挿入される。
【０１６４】
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】ＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラタンパク質（Ａ）、およびシュードモナス外毒素（ＰＥ）（Ｂ）の略図を示す。ＴＢＰ−１は、ＴＮＦ結合タンパク質Ｉ；ＰＥＩＩｔｒは、シュードモナス外毒素の切断ドメインＩＩ；ＤＴは、ジフテリア毒素フリン切断部位；ＹｏｐＰは、エルシニア外側タンパク質である。Ｃは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）を示す。
【図２】シュードモナス外毒素の切断ドメインＩＩをコードするフラグメントＰＥＩＩｔｒのＤＮＡ配列（配列番号：２）を示す。
【図３】ＰＥＩＩｔｒのアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【図４】ＹｏｐＰおよび受容体遺伝子をコードするベクターを宿すＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）でのＹｏｐＰの組換え発現を示し、両方の遺伝子は、ＥＦ１−α（Ａ）またはＣＭＶ（Ｂ）プロモーターによって制御される。両方ともｖ５にタグ付けされ、ＥＦ１−αプロモーター（ベクターｐＥＦ６では、インビトロゲン）によって制御されるＹｏｐＰまたはβ−ガラクトシダーゼ（ｂＧａｌ）をコードするベクターを、２９３細胞に同時トランスフェクトした（Ａ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させ、検出用の抗ｖ５を使用してウエスタンブロット分析にかけた。１、２．５および５μｇのＹｏｐＰ−ｖ５／ＥＦ６、および０．１μｇのβ−Ｇａｌ／ＥＦ６プラスミドをトランスフェクションのために使用した。両方ともＨｉｓ−Ｔ７にタグ付けされ、ＣＭＶプロモーター（ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡで、インビトロゲン）によって制御されるＹｏｐＰまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターを、２９３細胞に同時トランスフェクトした（Ｂ）。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させ、検出用の抗Ｔ７を使用してウエスタンブロット分析にかけた。１、２．５および５μｇのＨｉｓ−ＹｏｐＰ／ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡ、および０．１μｇのＨｉｓ−ＧＦＰ／ｐｃＤＮＡ３−ＨｉｓＡプラスミドをトランスフェクションのために使用した。Ｃは、ＥＦ−１αおよびＣＭＶプロモーターの主要転写因子結合部位の略図を示す。活性化ＮＦ−κＢの非存在下で抑制されうるＣＭＶプロモーターから得られるＹｏｐＰの発現が、検出可能な濃度以下にあること（Ｂ）が観察されたが、しかし増大量のＹｏｐＰ発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターから得られるＧＦＰの発現を阻害するので、ＹｏｐＰのＮＦ−κＢ阻害活性が観察される。ＮＦ−κＢ活性に独立であるＥＦ−１αプロモーターは、ＹｏｐＰの発現用のＣＭＶプロモーターよりさらに適切であり、このプロモーターからのレポーター遺伝子の発現は、ＹｏｐＰによって影響されない（Ａ）。真核細胞を用いた全ての別の実験では、ＹｏｐＰまたはその融合誘導体は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下で発現される。
【図５】２９３細胞中でのＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ媒介阻害を示す。Ａは、２９３細胞中でのＴＮＦ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害を示す。ＮＦ−κＢ活性化を誘発するために、ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する２９３細胞を、ＴＮＦで処理した。ＮＦ−κＢ活性化は、異所性ＹｏｐＰの存在下で達成された。Ｂは、２９３細胞中でのＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化のＹｏｐＰ阻害を示す。ＮＦ−κＢ誘発性ｔａｔプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する２９３細胞を、ＮＩＫでトランスフェクトして、異所性ＹｏｐＰの存在下でＮＦ−κＢ活性化を誘発した。ＮＦ−κＢが、ＴＮＦを用いた細胞の処理によるか、またはＮＩＫ過剰発現によって誘発される場合、ルシフェラーゼ発現が増大した。ＹｏｐＰの存在下で、ＮＦ−κＢの誘発は、活性化のために使用される因子に独立して阻害された。Ｃは、（左から右へ）ＮＩＫのみをコードするベクターでトランスフェクトした細胞の溶解物、ＮＩＫおよびＹｏｐＰをコードするベクターで同時トランスフェクトされた細胞の溶解物、または空のベクターでトランスフェクトされた細胞の溶解物を示し、それらを、ウエスタンブロット分析にかけ、無傷のｐ１００またはｐ５２代謝産物を、抗−ｐ５２抗体で検出した。Ｃは、ＹｏｐＰが、代替経路を介して、ＮＩＫ媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害しないことを示す。
【図６】真核細胞におけるＴＢＰ−ＹｏｐＰの発現および活性を示す。Ａは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰを一過性で発現する真核細胞におけるＴＮＦ誘発ＮＦ−κＢ活性化の阻害を示す。ＴＮＦ−媒介ＮＦ−κＢ活性化を阻害するＴＢＰ−ＹｏｐＰの能力を、ＮＦ−κＢ依存性プロモーター（ｔａｔプロモーター）によって制御されるルシフェラーゼ発現レポーターベクターでトランスフェクトされた２９３細胞で調査した。レポータープラスミドに加えて、２９３細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードする発現ベクター、ＹｏｐＰをコードする発現ベクターまたは空のベクター（ｐＥＦ６Ａ）のいずれかで同時トランスフェクトした。結果は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＹｏｐＰの両方が、ＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼの発現を等しく阻害することを示す。Ｂは、真核細胞で発現されるＴＢＰ−ＹｏｐＰを示す。２９３細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードする発現ベクター、ＹｏｐＰをコードする発現ベクターまたは空のベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションに続いて、細胞を溶解させ、２５μｌの溶解液（または約１００ｎｇのタンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの各レーンに載せた。レーン２、３および４、５および６、７（左から右へ）は、それぞれ、ベクターのみ（ｐＥＦ６Ａ−ベクター）、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードするベクター、およびＹｏｐＰをコードするベクターでトランスフェクトされた細胞の二重サンプルを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解したタンパク質を、ウエスタンブロット分析にかけ、組換えタンパク質の検出を、ｖ５およびヒトＴＢＰ−１に特異的な抗体を用いて行った。Ｂは、ＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＹｏｐＰが、それぞれ、およそ６３ｋＤａおよび３７．２ｋＤａの見掛けの分子量で移動することを示す。
【図７】細菌性Ｅ．ｃｏｌｉ細胞で発現されるＴＢＰ−ＹｏｐＰを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ＴＢＰ−ＹｏｐＰをコードするｐＥＴ−５発現ベクター、またはＴＢＰ−１および触媒ドメインと移行ドメインとを含むシュードモナス外毒素のフラグメントを含む別のキメラタンパク質（ＴＢＰ−ＰＥ３８、２００４年６月２８日に提出された米国仮出願第６０／５８２８２７号で開示された）をコードするｐＥＴ−５ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションおよびイソプロピルβ−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘発に続いて、ｐＴＢＰ−ＹｏｐＰを有するＥ．ｃｏｌｉを溶解させ、溶解物を可溶性タンパク質と不溶性封入体（ＩＢ）に分画した。８Ｍ尿素に溶解した封入体のサンプル、または全（非分画）溶解物を、レーン当たり３０μｇの濃度でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離した。ゲル中のタンパク質を、クーマシーブルーで染色した。異なるバッチのＴＢＰ−Ｙｏｐは、ＡおよびＢに示される。Ｃは、Ｂと同じ溶解物であるが、ウエスタンブロットにかけ（レーン当たり１μｇタンパク質をかけた）、キメラタンパク質の検出のためにポリクローナルウサギ抗−ＴＢＰ−１を使用して分析した。その図は、キメラＴＢＰ−ＹｏｐＰが、封入体中に見られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、およそ６３ｋＤａの見掛けの分子量で移動することを示す。矢印は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰに対応する位置を示す。全−全Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物。ＩＢ−封入体、ＭＷ−分子量基準。
【図８】細菌細胞で産生されるＴＢＰ−ＹｏｐＰのＴＮＦ結合活性を示す。Ａは、非キメラＨＰＬＣ−精製ＴＢＰ−１の活性と比較した、粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８のＴＮＦ結合活性を示す。ＴＮＦに対するＴＢＰ−ＹｏｐＰ、ＴＢＰ−ＰＥ３８またはＴＢＰ−１タンパク質の結合を、ＴＮＦ被覆プレートを使用して評価した。所定量の再折り畳みキメラタンパク質またはＴＢＰ−１を、ＴＮＦ被覆プレートに載せ、プレートへの結合を、抗ＴＢＰ−１抗体によって検出した。たとえば、５００ｎｇの粗再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰは、２０ｎｇのＴＢＰ−ＰＥ３８または５ｎｇのＴＢＰ−１に近い程度の活性である。Ｂは、ＴＮＦ結合活性を示す粗再折り畳みキメラタンパク質の百分率（％）を示す。たとえば、１００％ＴＮＦ結合としてＴＢＰ−1の活性を使用した場合、際折りたたみＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の０．７％および２５％が、それぞれ、ＴＮＦ結合活性を示すことが分かった。
【図９】活性化単球様細胞におけるＴＢＰ−キメラタンパク質の細胞毒性を示す。単球様細胞（ＴＨＰＩ）の特徴を示す活性化細胞株で評価された再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）およびＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の細胞毒性効果を、競合するＴＢＰ−１の存在下、または非存在下で評価した。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８がＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。ＴＢＰ−ＹｏｐＰのみが、活性化ＴＨＰＩ細胞に対し細胞毒性効果を示すこと、またそのような細胞毒性効果はＴＢＰ−１との競合によって阻害されたので、特異的であることが分かった。競合相手ＴＢＰ−１は、キメラタンパク質の直前に１００倍過剰で使用した。ＴＢＰ−ＰＥ３８（１）および（２）は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８の２つの異なるバッチである。
【図１０】上皮細胞におけるＴＢＰ−キメラタンパク質の細胞毒性を示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）またはＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の細胞毒性効果を、競合するＴＢＰ−１の存在下または非存在下で、過剰発現表面ＴＮＦに遺伝子操作された細胞株（Pocsikら、１９９５）である上皮ＨｅＬａＭ９細胞のモデルで評価した。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。ＴＢＰ−ＰＥ３８のみが、上皮細胞株に対し細胞毒性効果を示すこと、およびそのような細胞毒性効果は、ＴＢＰ−１との競合によって阻害されるので特異的であることが分かった。ＴＢＰ−ＰＥ３８（１）および（２）は、再折り畳みＴＢＰ−ＰＥ３８の２つの異なるバッチである。
【図１１】１０％加熱不活化仔ウシ血清（ＨＦｃｓ）を用いた飢餓ＨｅＬＡＭ９細胞の活性化によって誘導されるｐ３８リン酸化のＴＢＰ−ＹｏｐＰ−媒介阻害を示す。Ａは、実験の略図を示す。ＨｅＬａＭ９細胞を、１７−１８時間飢餓状態にさせた。その後、再折り畳みＴＢＰ−ＹｏｐＰを、２時間、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、その細胞を溶解させた。１０％ＨＦｃｓを、様々な時点、図式で矢印によって示されるとおり、細胞溶解の５、１０、３０および６０分前に添加した。ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下、または非存在下での活性化後、細胞を溶解させ、細胞溶解物を、リン酸化ｐ３８（ｐＰ３８）の検出用のｐＰ３８特異的ポリクロナール抗体を使用したウエスタンブロット分析にかけた。ゲル中の負荷タンパク質を正規化させるために、抗ＩＫＫ−αを用いて同じブロットを検出した。ＢおよびＣは、Ａで示したとおり細胞を処理したか、またはＴＢＰ−ＹｏｐＰを溶媒（ホウ酸塩緩衝液）に置き換えた２つの実験の結果を示す。Ｐ３８リン酸化は、血清添加により増大すること、およびそのような血清媒介ｐＰ３８リン酸化は、ＴＢＰ−ＹｏｐＰの存在下で減少されることが示された。−は、未処理飢餓細胞、そして５’、１０’、３０’および６０’は、それぞれ、１０％ＨＦｅｓにより５分、１０分、３０分および６０分間の細胞の活性化を示す。
【図１２】活性化一次マクロファージ細胞でのＴＢＰキメラタンパク質の効果を示す。ＴＢＰ−ＹｏｐＰ（Ａ）またはＴＢＰ−ＰＥ３８（Ｂ）の指示濃度の細胞毒性効果は、競合するＴＢＰ−１の存在下または非存在下で、活性化一次マクロファージ細胞において評価した。組換えヒトＴＢＰ−１を、キメラタンパク質の直前で、１００倍過剰で添加した。所定の濃度で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ０１１１−Ｂ４で処理することによって、一次マクロファージを活性化させた。試験されたＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の特定の濃度は、ＴＢＰ−ＰＥ３８が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰより約３６倍高いＴＮＦ結合活性を示すことを考慮に入れる（図８のＢ参照）。キメラタンパク質はいずれも、活性一次マクロファージに対して細胞毒性効果を示さないことが分かった。
【図１３】活性化一次マクロファージによるＴＮＦ分泌に対するＴＢＰ−ＹｏｐＰおよびＴＢＰ−ＰＥ３８の効果を示す。実施例５で示されるとおり、実験を行った。キメラタンパク質の存在下または非存在下で、ＬＰＳ−活性化一次マクロファージの培養培地中に分泌されるＴＮＦを、ＴＮＦ感受性細胞株Ｌ９２９（マウス結合組織クローンＬ９２９、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１）を使用してバイオアッセイでモニターした。培養培地を収集し、新鮮な培養培地を用いて二倍、四倍および八倍に希釈し、Ｌ９２９細胞に塗布し、その細胞のＴＮＦ依存性の死をモニターした。活性化マクロファージによるＴＮＦ分泌が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰによって阻害されるが、ＴＢＰ−ＰＥ３８によっては阻害されないことが分かった（Ｂ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラタンパク質の、エンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへの移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合された、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列およびエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質。
【請求項２】
細胞特異的標的因子が、標的細胞の表面に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分である請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
細胞特異的標的因子が、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分である請求項２記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分が、ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分が、ＴＢＰ−２である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
Ｙｏｐが、ＹｏｐＰである請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
Ｙｏｐが、減少したアポトーシス活性を有するか、またはアポトーシス活性を有さず、かつアルギニン−１４３残基で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９およびＯ：８から選択される請求項６記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
移行を可能にするポリペプチドが、シュードモナス外毒素移行ドメインまたはそのフラグメントを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
シュードモナス外毒素移行ドメインのフラグメントが、最後のα−ヘリックスドメイン（Ｆ）が欠失している請求項８記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
本明細書においてＰＥＩＩｔｒと称されるシュードモナス外毒素移行ドメインのフラグメントが、図３でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のアミノ酸配列（配列番号：３）に相当する請求項８記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
１つまたは２つのフリン切断部位を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
１つのフリン切断部位が、移行を可能にするポリペプチドのＮ末端に位置し、１つのフリン切断部位が、Ｙｏｐタンパク質のＮ末端に位置する請求項１１記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
１つのフリン切断部位が、ジフテリア毒素のフリン切断部位である請求項１１または１２記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
フリン切断部位が、本明細書においてＤＴと称されるアミノ酸配列ＲＶＲＲを有する請求項１３記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
キメラタンパク質が、本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称される、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素ＰＥＩＩｔｒの移行ドメインフラグメント、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰから構成されるか、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩から構成される請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
標的細胞が、リンパ球様細胞である請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
標的細胞が、マクロファージである請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
標的細胞が、単核細胞である請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
標的細胞が、上皮細胞である請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２１】
真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをさらにコードする請求項２０記載のＤＮＡ配列。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のＤＮＡ配列を包含する発現ベクター。
【請求項２３】
ＤＮＡが、ＮＦ−κＢから独立している、活性を有するプロモーターに官能基で連結される請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２４】
プロモーターが、ＥＦ−１αである請求項２３記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
細胞が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、酵母および昆虫細胞から選択される真核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
細胞が、原核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、製造されたキメラタンパク質を単離することを含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を製造する方法。
【請求項２９】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質もしくはフラグメントである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３３】
疾患の発症または経過に関与するリガンドが、ＴＮＦである請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
疾患が、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患および癌である請求項３２または３３記載の使用。
【請求項３５】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３７】
疾患が、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患および鎌形赤血球貧血から選択される請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３６または３７記載の使用。
【請求項３９】
ＮＦ−κＢ活性化が、発症または過程に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４０】
ＮＦ−κＢ活性が、標準経路を介してＮＩＫにより誘発される請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３９または４０記載の使用。
【請求項４２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが発症または経過に関与する疾患の治療方法。
【請求項４３】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが、ＴＮＦである請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
疾患が、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患および癌からなる群より選択される請求項４２または４３記載の使用。
【請求項４５】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の治療上有効量のキメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む、活性化マクロファージまたは単核細胞が発症または経過に関与している疾患の治療方法。
【請求項４７】
疾患が、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患および鎌形赤血球貧血からなる群より選択される請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４６または４７記載の使用。
【請求項４９】
ＮＦ−κＢ活性化が発症または経過に関与する疾患の治療方法であって、必要とする対象に、治療上有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項５０】
ＮＦ−κＢ活性化が、標準経路を介してＮＩＫによって誘発される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５２】
標的細胞における細胞表面上のリガンドの異常な発現を減少させる方法であって、細胞をキメラタンパク質に暴露することを含み、該キメラタンパク質が、細胞の細胞質ゾルにエンドソームから、該キメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合される、標的細胞の表面上に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分およびＹｏｐを含む方法。
【請求項５３】
リガンドがＴＮＦである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
移行を可能にするポリペプチドが、ＰＥＩＩｔｒである請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
細胞を、インビトロでキメラタンパク質に暴露する請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞を、インビボでキメラタンパク質に暴露する請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞が、マクロファージまたは単核細胞である請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
キメラタンパク質の、エンドソームから標的細胞の細胞質ゾルへの移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合された、細胞特異的標的因子のアミノ酸配列およびエルシニア外側タンパク質（Ｙｏｐ）のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質。
【請求項２】
細胞特異的標的因子が、標的細胞の表面に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分である請求項１記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
細胞特異的標的因子が、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分である請求項２記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分が、ＴＮＦ結合タンパク質１（ＴＢＰ−１）である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体の細胞外部分が、ＴＢＰ−２である請求項３記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
Ｙｏｐが、ＹｏｐＰである請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
Ｙｏｐが、減少したアポトーシス活性を有するか、またはアポトーシス活性を有さず、かつアルギニン−１４３残基で突然変異したＹｏｐＰ血清群Ｏ：３、Ｏ：９およびＯ：８から選択される請求項６記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
移行を可能にするポリペプチドが、シュードモナス外毒素移行ドメインまたはそのフラグメントを含む請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
シュードモナス外毒素移行ドメインのフラグメントが、最後のα−ヘリックスドメイン（Ｆ）が欠失している請求項８記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
本明細書においてＰＥＩＩｔｒと称されるシュードモナス外毒素移行ドメインのフラグメントが、図３でシュードモナス・アエルギノーサ外毒素のアミノ酸配列（配列番号：３）に相当する請求項８記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
１つまたは２つのフリン切断部位を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
１つのフリン切断部位が、移行を可能にするポリペプチドのＮ末端に位置し、１つのフリン切断部位が、Ｙｏｐタンパク質のＮ末端に位置する請求項１１記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
１つのフリン切断部位が、ジフテリア毒素のフリン切断部位である請求項１１または１２記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
フリン切断部位が、本明細書においてＤＴと称されるアミノ酸配列ＲＶＲＲを有する請求項１３記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
キメラタンパク質が、本明細書においてＴＢＰ−ＹｏｐＰと称される、ＴＢＰ−１、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素ＰＥＩＩｔｒの移行ドメインフラグメント、フリン切断部位ＤＴおよびＹｏｐＰから構成されるか、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩から構成される請求項１４記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
標的細胞が、リンパ球様細胞である請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
標的細胞が、マクロファージである請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
標的細胞が、単核細胞である請求項１６記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
標的細胞が、上皮細胞である請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２１】
真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをさらにコードする請求項２０記載のＤＮＡ配列。
【請求項２２】
請求項２０または２１記載のＤＮＡ配列を包含する発現ベクター。
【請求項２３】
ＤＮＡが、ＮＦ−κＢから独立している、活性を有するプロモーターに官能基で連結される請求項２２記載の発現ベクター。
【請求項２４】
プロモーターが、ＥＦ−１αである請求項２３記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
細胞が、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、２９３、酵母および昆虫細胞から選択される真核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
細胞が、原核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、製造されたキメラタンパク質を単離することを含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を製造する方法。
【請求項２９】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質もしくはフラグメントである請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能的誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドの活性が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３３】
疾患の発症または経過に関与するリガンドが、ＴＮＦである請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
疾患が、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患および癌である請求項３２または３３記載の使用。
【請求項３５】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
活性化マクロファージまたは単核細胞が、発症または経過に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項３７】
疾患が、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患および鎌形赤血球貧血から選択される請求項３６記載の使用。
【請求項３８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３６または３７記載の使用。
【請求項３９】
ＮＦ−κＢ活性化が、発症または過程に関与する疾患の治療のための医薬品の製造における請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
【請求項４０】
ＮＦ−κＢ活性が、標準経路を介してＮＩＫにより誘発される請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項３９または４０記載の使用。
【請求項４２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の治療上有効量を、必要とする対象に投与することを含む、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが発症または経過に関与する疾患の治療方法。
【請求項４３】
ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体のリガンドが、ＴＮＦである請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
疾患が、マラリア、敗血症、リューマチ性関節炎、乾癬、炎症性大腸疾患および癌からなる群より選択される請求項４２または４３記載の使用。
【請求項４５】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の治療上有効量のキメラタンパク質を、必要とする対象に投与することを含む、活性化マクロファージまたは単核細胞が発症または経過に関与している疾患の治療方法。
【請求項４７】
疾患が、敗血症性ショック、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、乾癬、筋萎縮性側索硬化症、インシュリン依存性糖尿病、移植片対宿主疾患および鎌形赤血球貧血からなる群より選択される請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４６または４７記載の使用。
【請求項４９】
ＮＦ−κＢ活性化が発症または経過に関与する疾患の治療方法であって、必要とする対象に、治療上有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む方法。
【請求項５０】
ＮＦ−κＢ活性化が、標準経路を介してＮＩＫによって誘発される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４８または４９記載の方法。
【請求項５２】
標的細胞における細胞表面上のリガンドの異常な発現を減少させる方法であって、細胞をキメラタンパク質に暴露することを含み、該キメラタンパク質が、細胞の細胞質ゾルにエンドソームから、該キメラタンパク質の移行を可能にするポリペプチドまたはそのフラグメントによって結合される、標的細胞の表面上に発現されるリガンドの受容体の細胞外部分およびＹｏｐを含む方法。
【請求項５３】
リガンドがＴＮＦである請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
移行を可能にするポリペプチドが、ＰＥＩＩｔｒである請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
細胞を、インビトロでキメラタンパク質に暴露する請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
細胞を、インビボでキメラタンパク質に暴露する請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞が、マクロファージまたは単核細胞である請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
キメラタンパク質が、ＴＢＰ−ＹｏｐＰ、またはそのムテイン、変異体、融合タンパク質、機能性誘導体、フラグメントもしくは塩である請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５３５５１４（Ｐ２００８−５３５５１４Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０６０５２（Ｐ２００８−５０６０５２）
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００４５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０９３０３
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１０日（２００６．４．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００６／０００４５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０９３０３
【国際公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【出願人】（５０００１８６０８）イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド (35)
【Ｆターム（参考）】
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