クメストロールの生産方法及びそれにより生産されたクメストロール
本発明は、豆を発芽させる発芽工程；及び、豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法と、前記生産方法により生産されたクメストロールを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クメストロールの生産方法及びそれにより生産されたクメストロールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
豆は、栄養的価値に優れるとともに、多様な生理活性を有する機能性物質を多量に含有している。特に、豆に含まれているフィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）は、人間をはじめとする哺乳動物のエストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）とその構造が類似するため、ホルモン疾患を例として挙げられる慢性疾患を予防する効果がある。一般的に、こうしたフィトエストロゲンの種類としては、イソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）、クメスタン（ｃｏｕｍｅｓｔａｎ）又はリグナン（ｌｉｇｎａｎ）等を挙げることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、クメストロールの生産方法及びそれにより生産されたクメストロールを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一側面は、豆を発芽させる発芽工程；及び、豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法を提供する。
本発明の他の一側面は、前記方法により生産されたクメストロールを提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るクメストロールの生産方法は、豆内のクメストロールの含量を高めるので、それから多量のクメストロールを高い収率で得ることができるようにする。前記方法を通じて、高価なクメストロールを多量に生産することができる。このように生産したクメストロールは、薬学、食品や化粧品を例として挙げられる多様な分野に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】３０℃の自動注水装置で発芽させた豆から抽出したクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図２】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を接触させ、発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図３】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を接触させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図４】アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）を接種させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図５】ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）を接種させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図６】豆の種類によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図７】培地添加物によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図８】菌株処理濃度によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図９】最適な条件を組み合わせて工程を進行した後のクメストロール含量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
クメストロール（ＣＭＳ， ３，９−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｈ−ｂｅｎｚｏｆｕｒｏ（３，２−ｃ）（１）ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｏｎｅ Ｃ１５Ｈ８Ｏ５， ＭＷ：２６８．２）は、天然エストロゲンであるエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）又はスチルベストロール（ｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）と構造的に類似なクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）類似化合物であり、下記化学式１のような構造を持つ。
【０００８】
【化１】
クメストロールのエストロゲン活性（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、既存のエストロゲン活性効果があると知られているイソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）と比較して３０〜１００倍以上高く、子宮癌、骨髄癌、乳癌や脳癌、更年期症状等を緩和させる上で非常に有用である。こうしたエストロゲン活性と関連した機能は、クメストロールの前記のような構造のためであると考えられている。
【０００９】
クメストロールは、豆又はマメ科植物の原物にごく微量又はほとんど存在しないものと知られている。このように活用価値が非常に高いものの、豆に極微量しか含まれていないためにその活用が制限されていたクメストロールを効率的に生産する必要がある。
【００１０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一側面は、豆を発芽させる発芽工程；及び、豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法を提供する。
【００１１】
本発明の一側面において、前記豆は、クメストロールを合成するマメ科植物であれば、特別な制限なく使用可能である。たとえば、本発明において使用されてもよい豆の種類は、醤類及び豆腐用、ナムル（青菜）用、雑穀飯用又は枝豆用品種であってよい。醤類及び豆腐用品種としては、大豊、湖醤、壯元、大▲黄▼（ｄａｅｈｗａｎｇ）、ソダム、松鶴、大元、眞品、蛋白、豆油、新八達、太光、萬里、長壽、無限、白雲、セアル、黄金及び長葉等がある。ナムル用品種としては、シンファ、ソウォン、安平、西南、多彩、小緑、小湖、疏明、多元、豊産ナムル、益山ナムル、小白ナムル、光安、短葉及び銀河等がある。雑穀飯用品種としては、青磁、黒青、褐味、鮮黒、黒大豆及び一品黒大豆等がある。また、枝豆用品種では、ダオル、新緑、セウル、コムジョンウル、夕涼プッコン、華厳プッコンとクンウル等がある。
【００１２】
本発明の他の一側面において、豆は、発芽が可能であり、病虫害に強い品種であることが好ましい。そのような豆としては、たとえば、シンファ、ソウォン、安平、西南、多彩、小緑、小湖、疏明、多元、豊産ナムル、益山ナムル、小白ナムル、光安、短葉及び銀河等がある。
【００１３】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、豆を発芽させる発芽工程を含む。前記発芽工程は、豆の少なくとも一部を酸素又は空気と接触させて進められてよい。
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、豆を発酵させる発酵工程を含む。クメストロールは、マメ科植物がカビや病原性細菌等といった微生物から攻撃を受けた際に、自らを保護するために合成するフィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ）の一種として知られている。すなわち、豆に、真菌、酵母又は乳酸菌を例として挙げられる微生物を接触させると、これらがクメストロール合成誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用して、豆内のクメストロール含量を増進させることができる。本発明の一側面において、豆の少なくとも一部を微生物と接触させて進行される発酵工程を通じて、豆のクメストロール含量を高めることができる。本発明の他の一側面において、前記発酵工程は、豆に、微生物を１〜１０回、具体的には１〜５回、さらに具体的には１〜３回接種させて進められてよい。こうした過程を通じて、より微生物が豆に接触することができる。
【００１４】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法において、前記発芽工程と発酵工程が、同時に又は順次的に進行されてよい。本発明の他の一側面において、発芽工程と発酵工程が同時に進行される場合、豆を微生物と接触させた状態で、酸素又は空気と接触させる方法で進行されてよい。具体的に、前記豆を、前記微生物を含む培地に浸漬させた状態で、前記酸素又は空気と接触させて進行されてよい。
【００１５】
本発明の一側面において、前記微生物は、クメストロール生産誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用することができるならば、制限なく適用可能である。本発明の他の一側面において、前記微生物は、真菌、酵母又は乳酸菌であってよく、具体的に、前記真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属の微生物であってよい。より具体的に、前記微生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択された一つ以上であってよい。前記列挙された微生物は、豆のクメストロールの生産量を高めるのに適する。
【００１６】
本発明の一側面において、微生物胞子のサスペンション溶液を豆の双葉の表面に塗布することにより、豆に微生物を接触させてよい。本発明の他の一側面において、微生物パウダーを豆が含まれた培地に加えることにより、微生物を豆に接触させてよい。本発明の他の一側面において、培地重量を基準に、０．０５〜２重量％、具体的には０．７５〜２重量％、より具体的には１．０〜２．０重量％の微生物を接触させてよい。
【００１７】
本発明の一側面において、発芽工程及び発酵工程のうち一つの工程の条件は、発芽及び発酵が持続的に行われ得る条件であれば特に制限されない。発芽又は発酵工程の条件の例示は、次のとおりである。
【００１８】
本発明の一側面において、発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、反応器内で進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、反応器の体積比で２０〜８０体積％、具体的に４０〜６０体積％、より具体的には４５〜５５体積％の培地を含む反応器内で進行されてよい。
【００１９】
本発明の一側面において、前記培地は、発芽及び発酵が円滑に行われ得る培地であれば特に制限されず、具体的に、液体栄養培地、より具体的にＰＤＢ培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）を例に挙げることができる。本発明の他の一側面において、培地は、培地全体重量比で０．００１〜１０重量％、具体的には０．１〜５重量％、より具体的には０．５〜２重量％の糖類を含んでいてよい。このとき、糖類は、一般的な単糖類、二糖類又は多糖類をすべて含み、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）又はＳＲＴを例として挙げることができる。
【００２０】
本発明の一側面において、前記工程は、反応器の体積比で１〜５０体積％、具体的に５〜２０体積％、より具体的に６〜１２体積％の豆を反応器に接種して進行されてよい。このとき、工程を経る豆全体のうち少なくとも一部の豆は、培地に浸漬されるようにし、一部は培地に浸漬されないようにしてもよい。豆が完全に外部に露出した状態では、給水過程において、豆を発酵させるために接触させた微生物が洗い出されていくおそれが大きく、逆に完全に浸水した状態では、発芽させた豆が腐敗し得るためである。
【００２１】
本発明の一側面において、前記工程は、酸素又は空気を最大に供給しつつ進行されてよい。たとえば、５０００ｍｌ反応器において工程が進行される場合、２，５００ｖｖｍ／ｍ、３Ｌ反応器で工程が進行される場合、１５，０００ｖｖｍ／ｍで酸素又は空気を供給してよい。このように、十分な酸素や空気を供給することにより、発芽が円滑に行われ得る。
【００２２】
本発明の一側面において、前記工程は、２０〜３５℃、具体的には、２０〜３０℃の温度で進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、遮光条件下で行われてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、２〜１０日間進行されてよい。たとえば、発芽工程が２日間進行された後、発芽工程及び発酵工程が同時に６〜８日間進行されてよい。
【００２３】
前記のような条件の発芽工程及び発酵工程を通じて、豆内のクメストロールの含量が効果的に増進され得る。
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、発芽工程以前に、豆を、滅菌水、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ）のうち一つ以上、好ましくは滅菌水で洗浄する殺菌工程を含んでいてよい。
【００２４】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、発芽工程及び発酵工程以後に、発芽及び発酵させた豆からクメストロールを抽出する抽出ステップをさらに含んでいてよい。前記において、抽出は、当業界に通常的な方法により行われてよく、具体的にアルコール、より具体的にエタノール抽出法で行われてよい。
【００２５】
本発明の一側面は、前記クメストロールの生産方法により生産されたクメストロールを提供する。前記クメストロールは、薬学、食品又は化粧品の分野において多様に活用されてよい。本発明の他の一側面は、前記クメストロールを有効成分として含む薬学、食品又は化粧品組成物を提供する。
【００２６】
以下、実験例を挙げつつ、本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実験例は、本発明に対する理解を助けるために例示の目的でのみ記載されたものであるに過ぎず、本発明のカテゴリ及び範囲がそれにより制限されるものではない。
【００２７】
［実施例１〜６］豆の発芽及び発酵実験
本実験に使用された豆は、ナムル豆に該当するグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ）品種の２種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ ｖａｒｉｅｔｙ １（以下 「品種１」という）及びｖａｒｉｅｔｙ ２（以下「品種２」という））であった。前記豆を発芽させた後に微生物を接触させ、クメストロールの生産増大が誘導されるかを評価した。実験に使用された微生物菌株は、真菌類に属するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：１１２４０）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：６０３５４）（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ， ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）、及び乳酸菌に属するビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：１１２０７）であった。具体的な実験条件は以下のとおりである。
【００２８】
＜発芽条件＞
温度は３０℃、湿度は５５％に固定して恒温恒湿器で培養し、３つの群で２回繰り返し実験を実施し、光量は暗室条件に設定した。注水は、タイマーを使用して、４時間間隔で３分間、自動的に進行された。発芽容器は、底が網からなり、水が下に抜けるようにデザインされた自動注水装置を利用した。
【００２９】
＜微生物菌株の準備＞
１．真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）の準備
平板培地（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＤｉｆｃｏＴＭ，ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｐａｒｋｓ，マリーランド，アメリカ）に菌株を接種させた後、２週間、３７℃で培養して胞子を十分に形成するようにした。滅菌されたスパチュラ（ｓｐａｔｕｌａｒ）を利用して胞子を取り出し、水に均一に分散させた。その次に、ヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して濃度を確認した後、１０６個／ｍｌとなるように希釈して胞子サスペンション（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を準備した。
【００３０】
２．乳酸菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）の準備
滅菌された液体培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｏｘｏｉｄ ＬＴＤ．，ハンプシャ，イギリス）に菌を接種し、窒素充填及び密封した後、３７℃で１週間培養させて菌株培養液を準備した。
【００３１】
＜発芽及び微生物処理＞
各実施例ごとの発芽及び微生物の処理条件は、下表のとおりである。
【００３２】
【表１】
＜クメストロール含量の分析＞
発芽した豆と培養液に、最終濃度が８０％となるようにエタノールを添加して均質化した後、クメストロールを抽出して分析した。
・カラム：ＮＯＶＡ−ＰＡＫ ＲＰ１８ ５μｍ（３．９×１５０ｍｍ）
・カラム温度：２７℃
・検出器：ＵＶＤ（２６０ｎｍ）
・溶媒：１％酢酸水溶液（アセトニトリル勾配）
＜実験結果＞
［実施例１］
実施例１は、発芽のみ進行された場合であり、図１に示されているところのように、クメストロールがごく少量分析された。
【００３３】
［実施例２］
実施例２は、発芽及び微生物接種がいずれも遂行された場合であり、図２に示されたところのように、発芽のみ進行された実施例１に比べてクメストロールの生産量が相対的に増加したことを知ることができる。
【００３４】
ただ、菌株を芽の表面に接種しており、接種された菌株が誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として効果的に作用していなかった。これは、４時間間隔の注水により接種された微生物がきちんと生長できず、大部分が洗われて除去されたためであるものと判断される。実際に、８日間育った発芽豆の周辺において菌株の生長は観察されなかった。
【００３５】
これを通じ、微生物が豆に効率的なクメストロールの生産誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）としての役割を遂行し得ることを確認した。また、豆の生育に必要な水分が適切に供給されるようにすることが重要であるという点を確認した。
【００３６】
［実施例３］
２日間発芽させた豆をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）とともに培養したとき、図３に示されたところのように、品種１は６日目に約１７０ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）まで、品種２は８日目に８２．４ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）まで、格段にクメストロールが増加することを確認した。これは、微生物を接種させずに自動注水装置で育てた実施例１の結果である１２．８０ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（品種１）、５．８５ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（品種２）と比較した場合、約１３倍増加した数値である。前記結果を通じ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の接種が豆のクメストロールの生産を誘導することを確認することができた。
【００３７】
［実施例４］
２日間発芽させた豆をアスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）とともに培養したとき、図４に示されたところのように、品種１は７２．０４ｍｇ／ｋｇ乾燥重量、品種２は８１．６３ｍｇ／ｋｇ乾燥重量のクメストロールを生産した。これもまた、実施例１に比べてはるかにクメストロールの生産を増加させたが、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に比べるとその効果が多少低いものと示された。これを通じ、菌株の種類に応じて、豆のクメストロールの生産に差があることを知ることができた。
【００３８】
［実施例５］
乳酸菌の一種であるビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）と豆とを、４日間、ともに培養したとき、図５に示されたところのように、品種１のクメストロールの含量は８２．８５ｍｇ／ｋｇ乾燥重量、品種２のクメストロールの含量は４５．１ｍｇ／ｋｇ乾燥重量であるものと示された。この場合にも、クメストロールの生産が増加することを確認することができた。
【００３９】
［実施例６］
本実験条件では、豆が培地に完全に浸漬されて円滑な発芽が起こらなかった。さらに、処理した微生物によって腐敗が進み、クメストロールは全く検出されなかった。
【００４０】
［実施例７］適切な大量生産条件
１．方法
大容量バイオ反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を利用して、様々な条件を変えてクメストロールを大量生産した。まず、すべての器具を微生物接種前に１２１℃の高圧滅菌器で滅菌して準備した。豆は、豊産ナムル豆又はソウォン豆を利用した。豆の種子を、滅菌水、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｉｒｉｔｅ）のうち一つ以上で２回洗浄殺菌した。それぞれ１％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、１％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び１％ＳＲＴのうち一つ以上を含む培地を、反応器の体積比で２０〜８０体積％の量で準備した。豆の種子は、反応器の体積比で３〜１２体積％の密度で接種した。培地と豆の種子を含む反応器で、温度２０〜３０℃、光又は遮光、空気供給１５０００ｖｖｍ／ｍの条件の下、それぞれ豆の種子を発芽させた。
【００４１】
発芽２日目に、豆に芽が出始めると、培地全体の重量比で０〜１．２５重量％の菌株（アスペルギルス・オリザエ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（（株）メディオジェンから入手、１×１０９ＣＦＵ／ｇ アスペルギルス・オリザエ）を培地に入れ、８日目まで培養した。
【００４２】
その後、培養した豆と培地のクメストロールを抽出して含量分析した。その分析方法は、前記実施例１〜６と同様である。
２．結果
（１）豆の種類による結果
豆の種類によるクメストロール含量を図６に示した。図６から確認できるように、本発明の一実施例に適用される豊産ナムル豆は、発芽条件の下で約３３．８μｇ／ｇの含量でクメストロールが観察され、また、ソウォン豆は発芽条件の下で約１９６μｇ／ｇの含量でクメストロールが観察された。自然に発生する豆中のクメストロール量が５μｇ／ｇ以下であることを勘案すれば、本発明の一実施例に適用される豆の場合、相対的に大量のクメストロールを生産できることを知ることができる。
【００４３】
（２）培地添加物による結果
それぞれ１％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、１％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び１％ＳＲＴのうち一つ以上を添加した培地によるクメストロール含量を図７に示した。図７から確認できるように、添加物を添加した場合、いずれも無処理群に比べて多くのクメストロールを生産することができ、特に、１％スクロースを添加する場合、最も多いクメストロールを生産することができた。これは、前記添加物が菌の成長を均一化して、誘導因子として一定に作用できるようにするためと考えられる。
【００４４】
（３）菌株の処理濃度による結果
誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用する微生物菌株の処理濃度によるクメストロール含量を図８に示した。図８から確認できるように、微生物菌株の処理濃度が一定以上である場合、その処理濃度が高くなるほど、より多くのクメストロールの生産が可能である。特に、微生物菌株の処理濃度が１．２５重量％である場合、無処理群に比べて１１倍ほど高いクメストロールの生産を示した。一方、微生物菌株を２重量％以上処理する場合、発芽は進行されず、発酵のみが進行され、２重量％以下の濃度で微生物菌株を処理することが適切であることを確認することができた。
【００４５】
（４）最適条件の組合せ結果
前記様々な条件のうち、最適な条件を組み合わせてクメストロールの生産程度を確認した。その最適条件は、下表のとおりである。
【００４６】
【表２】
最適条件を組み合わせた場合のクメストロール含量を図９に示した。図９から確認できるように、前記最適条件の下では、そうでない場合に比べて８倍以上多いクメストロールを生産することができる。
【００４７】
以上の結果から、豆を発芽及び微生物を利用して発酵させることにより、それに含まれるクメストロール含量を高め得ることを確認することができる。また、商業的に有用な大量生産に適した発芽及び発酵工程条件があることを確認することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クメストロールの生産方法及びそれにより生産されたクメストロールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
豆は、栄養的価値に優れるとともに、多様な生理活性を有する機能性物質を多量に含有している。特に、豆に含まれているフィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）は、人間をはじめとする哺乳動物のエストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）とその構造が類似するため、ホルモン疾患を例として挙げられる慢性疾患を予防する効果がある。一般的に、こうしたフィトエストロゲンの種類としては、イソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）、クメスタン（ｃｏｕｍｅｓｔａｎ）又はリグナン（ｌｉｇｎａｎ）等を挙げることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、クメストロールの生産方法及びそれにより生産されたクメストロールを提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一側面は、豆を発芽させる発芽工程；及び、豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法を提供する。
本発明の他の一側面は、前記方法により生産されたクメストロールを提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明に係るクメストロールの生産方法は、豆内のクメストロールの含量を高めるので、それから多量のクメストロールを高い収率で得ることができるようにする。前記方法を通じて、高価なクメストロールを多量に生産することができる。このように生産したクメストロールは、薬学、食品や化粧品を例として挙げられる多様な分野に活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】３０℃の自動注水装置で発芽させた豆から抽出したクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図２】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を接触させ、発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図３】アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を接触させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図４】アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）を接種させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図５】ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）を接種させ、３０℃の液体培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）で発芽させた豆から抽出されたクメストロール含量（ｍｇ／ｋｇ、乾燥重量）を示したグラフである。
【図６】豆の種類によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図７】培地添加物によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図８】菌株処理濃度によるクメストロール含量を示したグラフである。
【図９】最適な条件を組み合わせて工程を進行した後のクメストロール含量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
クメストロール（ＣＭＳ， ３，９−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−６Ｈ−ｂｅｎｚｏｆｕｒｏ（３，２−ｃ）（１）ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−６−ｏｎｅ Ｃ１５Ｈ８Ｏ５， ＭＷ：２６８．２）は、天然エストロゲンであるエストラジオール（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ）又はスチルベストロール（ｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）と構造的に類似なクマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）類似化合物であり、下記化学式１のような構造を持つ。
【０００８】
【化１】
クメストロールのエストロゲン活性（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、既存のエストロゲン活性効果があると知られているイソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）と比較して３０〜１００倍以上高く、子宮癌、骨髄癌、乳癌や脳癌、更年期症状等を緩和させる上で非常に有用である。こうしたエストロゲン活性と関連した機能は、クメストロールの前記のような構造のためであると考えられている。
【０００９】
クメストロールは、豆又はマメ科植物の原物にごく微量又はほとんど存在しないものと知られている。このように活用価値が非常に高いものの、豆に極微量しか含まれていないためにその活用が制限されていたクメストロールを効率的に生産する必要がある。
【００１０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一側面は、豆を発芽させる発芽工程；及び、豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法を提供する。
【００１１】
本発明の一側面において、前記豆は、クメストロールを合成するマメ科植物であれば、特別な制限なく使用可能である。たとえば、本発明において使用されてもよい豆の種類は、醤類及び豆腐用、ナムル（青菜）用、雑穀飯用又は枝豆用品種であってよい。醤類及び豆腐用品種としては、大豊、湖醤、壯元、大▲黄▼（ｄａｅｈｗａｎｇ）、ソダム、松鶴、大元、眞品、蛋白、豆油、新八達、太光、萬里、長壽、無限、白雲、セアル、黄金及び長葉等がある。ナムル用品種としては、シンファ、ソウォン、安平、西南、多彩、小緑、小湖、疏明、多元、豊産ナムル、益山ナムル、小白ナムル、光安、短葉及び銀河等がある。雑穀飯用品種としては、青磁、黒青、褐味、鮮黒、黒大豆及び一品黒大豆等がある。また、枝豆用品種では、ダオル、新緑、セウル、コムジョンウル、夕涼プッコン、華厳プッコンとクンウル等がある。
【００１２】
本発明の他の一側面において、豆は、発芽が可能であり、病虫害に強い品種であることが好ましい。そのような豆としては、たとえば、シンファ、ソウォン、安平、西南、多彩、小緑、小湖、疏明、多元、豊産ナムル、益山ナムル、小白ナムル、光安、短葉及び銀河等がある。
【００１３】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、豆を発芽させる発芽工程を含む。前記発芽工程は、豆の少なくとも一部を酸素又は空気と接触させて進められてよい。
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、豆を発酵させる発酵工程を含む。クメストロールは、マメ科植物がカビや病原性細菌等といった微生物から攻撃を受けた際に、自らを保護するために合成するフィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ）の一種として知られている。すなわち、豆に、真菌、酵母又は乳酸菌を例として挙げられる微生物を接触させると、これらがクメストロール合成誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用して、豆内のクメストロール含量を増進させることができる。本発明の一側面において、豆の少なくとも一部を微生物と接触させて進行される発酵工程を通じて、豆のクメストロール含量を高めることができる。本発明の他の一側面において、前記発酵工程は、豆に、微生物を１〜１０回、具体的には１〜５回、さらに具体的には１〜３回接種させて進められてよい。こうした過程を通じて、より微生物が豆に接触することができる。
【００１４】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法において、前記発芽工程と発酵工程が、同時に又は順次的に進行されてよい。本発明の他の一側面において、発芽工程と発酵工程が同時に進行される場合、豆を微生物と接触させた状態で、酸素又は空気と接触させる方法で進行されてよい。具体的に、前記豆を、前記微生物を含む培地に浸漬させた状態で、前記酸素又は空気と接触させて進行されてよい。
【００１５】
本発明の一側面において、前記微生物は、クメストロール生産誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用することができるならば、制限なく適用可能である。本発明の他の一側面において、前記微生物は、真菌、酵母又は乳酸菌であってよく、具体的に、前記真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属の微生物であってよい。より具体的に、前記微生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択された一つ以上であってよい。前記列挙された微生物は、豆のクメストロールの生産量を高めるのに適する。
【００１６】
本発明の一側面において、微生物胞子のサスペンション溶液を豆の双葉の表面に塗布することにより、豆に微生物を接触させてよい。本発明の他の一側面において、微生物パウダーを豆が含まれた培地に加えることにより、微生物を豆に接触させてよい。本発明の他の一側面において、培地重量を基準に、０．０５〜２重量％、具体的には０．７５〜２重量％、より具体的には１．０〜２．０重量％の微生物を接触させてよい。
【００１７】
本発明の一側面において、発芽工程及び発酵工程のうち一つの工程の条件は、発芽及び発酵が持続的に行われ得る条件であれば特に制限されない。発芽又は発酵工程の条件の例示は、次のとおりである。
【００１８】
本発明の一側面において、発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、反応器内で進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、反応器の体積比で２０〜８０体積％、具体的に４０〜６０体積％、より具体的には４５〜５５体積％の培地を含む反応器内で進行されてよい。
【００１９】
本発明の一側面において、前記培地は、発芽及び発酵が円滑に行われ得る培地であれば特に制限されず、具体的に、液体栄養培地、より具体的にＰＤＢ培地（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ）を例に挙げることができる。本発明の他の一側面において、培地は、培地全体重量比で０．００１〜１０重量％、具体的には０．１〜５重量％、より具体的には０．５〜２重量％の糖類を含んでいてよい。このとき、糖類は、一般的な単糖類、二糖類又は多糖類をすべて含み、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）又はＳＲＴを例として挙げることができる。
【００２０】
本発明の一側面において、前記工程は、反応器の体積比で１〜５０体積％、具体的に５〜２０体積％、より具体的に６〜１２体積％の豆を反応器に接種して進行されてよい。このとき、工程を経る豆全体のうち少なくとも一部の豆は、培地に浸漬されるようにし、一部は培地に浸漬されないようにしてもよい。豆が完全に外部に露出した状態では、給水過程において、豆を発酵させるために接触させた微生物が洗い出されていくおそれが大きく、逆に完全に浸水した状態では、発芽させた豆が腐敗し得るためである。
【００２１】
本発明の一側面において、前記工程は、酸素又は空気を最大に供給しつつ進行されてよい。たとえば、５０００ｍｌ反応器において工程が進行される場合、２，５００ｖｖｍ／ｍ、３Ｌ反応器で工程が進行される場合、１５，０００ｖｖｍ／ｍで酸素又は空気を供給してよい。このように、十分な酸素や空気を供給することにより、発芽が円滑に行われ得る。
【００２２】
本発明の一側面において、前記工程は、２０〜３５℃、具体的には、２０〜３０℃の温度で進行されてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、遮光条件下で行われてよい。本発明の他の一側面において、前記工程は、２〜１０日間進行されてよい。たとえば、発芽工程が２日間進行された後、発芽工程及び発酵工程が同時に６〜８日間進行されてよい。
【００２３】
前記のような条件の発芽工程及び発酵工程を通じて、豆内のクメストロールの含量が効果的に増進され得る。
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、発芽工程以前に、豆を、滅菌水、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ）のうち一つ以上、好ましくは滅菌水で洗浄する殺菌工程を含んでいてよい。
【００２４】
本発明の一側面に係るクメストロールの生産方法は、発芽工程及び発酵工程以後に、発芽及び発酵させた豆からクメストロールを抽出する抽出ステップをさらに含んでいてよい。前記において、抽出は、当業界に通常的な方法により行われてよく、具体的にアルコール、より具体的にエタノール抽出法で行われてよい。
【００２５】
本発明の一側面は、前記クメストロールの生産方法により生産されたクメストロールを提供する。前記クメストロールは、薬学、食品又は化粧品の分野において多様に活用されてよい。本発明の他の一側面は、前記クメストロールを有効成分として含む薬学、食品又は化粧品組成物を提供する。
【００２６】
以下、実験例を挙げつつ、本発明の構成及び効果をより具体的に説明する。しかし、以下の実験例は、本発明に対する理解を助けるために例示の目的でのみ記載されたものであるに過ぎず、本発明のカテゴリ及び範囲がそれにより制限されるものではない。
【００２７】
［実施例１〜６］豆の発芽及び発酵実験
本実験に使用された豆は、ナムル豆に該当するグリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ）品種の２種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ ｖａｒｉｅｔｙ １（以下 「品種１」という）及びｖａｒｉｅｔｙ ２（以下「品種２」という））であった。前記豆を発芽させた後に微生物を接触させ、クメストロールの生産増大が誘導されるかを評価した。実験に使用された微生物菌株は、真菌類に属するアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：１１２４０）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：６０３５４）（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ， ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）、及び乳酸菌に属するビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ ＫＣＣＭ、韓国微生物保存センターから入手、分類番号：１１２０７）であった。具体的な実験条件は以下のとおりである。
【００２８】
＜発芽条件＞
温度は３０℃、湿度は５５％に固定して恒温恒湿器で培養し、３つの群で２回繰り返し実験を実施し、光量は暗室条件に設定した。注水は、タイマーを使用して、４時間間隔で３分間、自動的に進行された。発芽容器は、底が網からなり、水が下に抜けるようにデザインされた自動注水装置を利用した。
【００２９】
＜微生物菌株の準備＞
１．真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ， Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）の準備
平板培地（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＤｉｆｃｏＴＭ，ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓｐａｒｋｓ，マリーランド，アメリカ）に菌株を接種させた後、２週間、３７℃で培養して胞子を十分に形成するようにした。滅菌されたスパチュラ（ｓｐａｔｕｌａｒ）を利用して胞子を取り出し、水に均一に分散させた。その次に、ヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を利用して濃度を確認した後、１０６個／ｍｌとなるように希釈して胞子サスペンション（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）を準備した。
【００３０】
２．乳酸菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）の準備
滅菌された液体培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，Ｏｘｏｉｄ ＬＴＤ．，ハンプシャ，イギリス）に菌を接種し、窒素充填及び密封した後、３７℃で１週間培養させて菌株培養液を準備した。
【００３１】
＜発芽及び微生物処理＞
各実施例ごとの発芽及び微生物の処理条件は、下表のとおりである。
【００３２】
【表１】
＜クメストロール含量の分析＞
発芽した豆と培養液に、最終濃度が８０％となるようにエタノールを添加して均質化した後、クメストロールを抽出して分析した。
・カラム：ＮＯＶＡ−ＰＡＫ ＲＰ１８ ５μｍ（３．９×１５０ｍｍ）
・カラム温度：２７℃
・検出器：ＵＶＤ（２６０ｎｍ）
・溶媒：１％酢酸水溶液（アセトニトリル勾配）
＜実験結果＞
［実施例１］
実施例１は、発芽のみ進行された場合であり、図１に示されているところのように、クメストロールがごく少量分析された。
【００３３】
［実施例２］
実施例２は、発芽及び微生物接種がいずれも遂行された場合であり、図２に示されたところのように、発芽のみ進行された実施例１に比べてクメストロールの生産量が相対的に増加したことを知ることができる。
【００３４】
ただ、菌株を芽の表面に接種しており、接種された菌株が誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として効果的に作用していなかった。これは、４時間間隔の注水により接種された微生物がきちんと生長できず、大部分が洗われて除去されたためであるものと判断される。実際に、８日間育った発芽豆の周辺において菌株の生長は観察されなかった。
【００３５】
これを通じ、微生物が豆に効率的なクメストロールの生産誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）としての役割を遂行し得ることを確認した。また、豆の生育に必要な水分が適切に供給されるようにすることが重要であるという点を確認した。
【００３６】
［実施例３］
２日間発芽させた豆をアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）とともに培養したとき、図３に示されたところのように、品種１は６日目に約１７０ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）まで、品種２は８日目に８２．４ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ）まで、格段にクメストロールが増加することを確認した。これは、微生物を接種させずに自動注水装置で育てた実施例１の結果である１２．８０ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（品種１）、５．８５ｍｇ／ｋｇ乾燥重量（品種２）と比較した場合、約１３倍増加した数値である。前記結果を通じ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の接種が豆のクメストロールの生産を誘導することを確認することができた。
【００３７】
［実施例４］
２日間発芽させた豆をアスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）とともに培養したとき、図４に示されたところのように、品種１は７２．０４ｍｇ／ｋｇ乾燥重量、品種２は８１．６３ｍｇ／ｋｇ乾燥重量のクメストロールを生産した。これもまた、実施例１に比べてはるかにクメストロールの生産を増加させたが、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に比べるとその効果が多少低いものと示された。これを通じ、菌株の種類に応じて、豆のクメストロールの生産に差があることを知ることができた。
【００３８】
［実施例５］
乳酸菌の一種であるビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）と豆とを、４日間、ともに培養したとき、図５に示されたところのように、品種１のクメストロールの含量は８２．８５ｍｇ／ｋｇ乾燥重量、品種２のクメストロールの含量は４５．１ｍｇ／ｋｇ乾燥重量であるものと示された。この場合にも、クメストロールの生産が増加することを確認することができた。
【００３９】
［実施例６］
本実験条件では、豆が培地に完全に浸漬されて円滑な発芽が起こらなかった。さらに、処理した微生物によって腐敗が進み、クメストロールは全く検出されなかった。
【００４０】
［実施例７］適切な大量生産条件
１．方法
大容量バイオ反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を利用して、様々な条件を変えてクメストロールを大量生産した。まず、すべての器具を微生物接種前に１２１℃の高圧滅菌器で滅菌して準備した。豆は、豊産ナムル豆又はソウォン豆を利用した。豆の種子を、滅菌水、エタノール及び次亜塩素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｐｏｃｈｌｉｒｉｔｅ）のうち一つ以上で２回洗浄殺菌した。それぞれ１％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、１％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び１％ＳＲＴのうち一つ以上を含む培地を、反応器の体積比で２０〜８０体積％の量で準備した。豆の種子は、反応器の体積比で３〜１２体積％の密度で接種した。培地と豆の種子を含む反応器で、温度２０〜３０℃、光又は遮光、空気供給１５０００ｖｖｍ／ｍの条件の下、それぞれ豆の種子を発芽させた。
【００４１】
発芽２日目に、豆に芽が出始めると、培地全体の重量比で０〜１．２５重量％の菌株（アスペルギルス・オリザエ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（（株）メディオジェンから入手、１×１０９ＣＦＵ／ｇ アスペルギルス・オリザエ）を培地に入れ、８日目まで培養した。
【００４２】
その後、培養した豆と培地のクメストロールを抽出して含量分析した。その分析方法は、前記実施例１〜６と同様である。
２．結果
（１）豆の種類による結果
豆の種類によるクメストロール含量を図６に示した。図６から確認できるように、本発明の一実施例に適用される豊産ナムル豆は、発芽条件の下で約３３．８μｇ／ｇの含量でクメストロールが観察され、また、ソウォン豆は発芽条件の下で約１９６μｇ／ｇの含量でクメストロールが観察された。自然に発生する豆中のクメストロール量が５μｇ／ｇ以下であることを勘案すれば、本発明の一実施例に適用される豆の場合、相対的に大量のクメストロールを生産できることを知ることができる。
【００４３】
（２）培地添加物による結果
それぞれ１％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、１％グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）及び１％ＳＲＴのうち一つ以上を添加した培地によるクメストロール含量を図７に示した。図７から確認できるように、添加物を添加した場合、いずれも無処理群に比べて多くのクメストロールを生産することができ、特に、１％スクロースを添加する場合、最も多いクメストロールを生産することができた。これは、前記添加物が菌の成長を均一化して、誘導因子として一定に作用できるようにするためと考えられる。
【００４４】
（３）菌株の処理濃度による結果
誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）として作用する微生物菌株の処理濃度によるクメストロール含量を図８に示した。図８から確認できるように、微生物菌株の処理濃度が一定以上である場合、その処理濃度が高くなるほど、より多くのクメストロールの生産が可能である。特に、微生物菌株の処理濃度が１．２５重量％である場合、無処理群に比べて１１倍ほど高いクメストロールの生産を示した。一方、微生物菌株を２重量％以上処理する場合、発芽は進行されず、発酵のみが進行され、２重量％以下の濃度で微生物菌株を処理することが適切であることを確認することができた。
【００４５】
（４）最適条件の組合せ結果
前記様々な条件のうち、最適な条件を組み合わせてクメストロールの生産程度を確認した。その最適条件は、下表のとおりである。
【００４６】
【表２】
最適条件を組み合わせた場合のクメストロール含量を図９に示した。図９から確認できるように、前記最適条件の下では、そうでない場合に比べて８倍以上多いクメストロールを生産することができる。
【００４７】
以上の結果から、豆を発芽及び微生物を利用して発酵させることにより、それに含まれるクメストロール含量を高め得ることを確認することができる。また、商業的に有用な大量生産に適した発芽及び発酵工程条件があることを確認することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆を発芽させる発芽工程；及び
豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法。
【請求項２】
発芽工程は、豆の少なくとも一部を酸素又は空気と接触させて進行され、
発酵工程は、豆の少なくとも一部を微生物と接触させて進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項３】
発芽工程と発酵工程が同時に又は順次的に進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項４】
発芽工程と発酵工程が同時に進行される方法は、豆を微生物と接触させた状態で、酸素又は空気と接触させて進行される、請求項３記載のクメストロールの生産方法。
【請求項５】
前記豆を、前記微生物を含む培地に浸漬させた状態で、前記酸素又は空気と接触させて進行される、請求項４記載のクメストロールの生産方法。
【請求項６】
微生物は、真菌、酵母又は乳酸菌を含む、請求項２記載のクメストロールの生産方法。
【請求項７】
真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属を含む、請求項６記載のクメストロールの生産方法。
【請求項８】
微生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択された一つ以上である、請求項２記載のクメストロールの生産方法。
【請求項９】
発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、反応器全体の体積比で２０〜８０体積％の培地を含む反応器内において、反応器全体の体積比で１〜５０体積％の豆で進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１０】
培地は、培地全体の重量比で０．００１〜１０重量％の糖類を含む、請求項９記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１１】
発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、２０〜３５℃の温度及び暗条件において２〜１０日間進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生産されたクメストロール。
【請求項１】
豆を発芽させる発芽工程；及び
豆を発酵させる発酵工程を含むクメストロールの生産方法。
【請求項２】
発芽工程は、豆の少なくとも一部を酸素又は空気と接触させて進行され、
発酵工程は、豆の少なくとも一部を微生物と接触させて進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項３】
発芽工程と発酵工程が同時に又は順次的に進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項４】
発芽工程と発酵工程が同時に進行される方法は、豆を微生物と接触させた状態で、酸素又は空気と接触させて進行される、請求項３記載のクメストロールの生産方法。
【請求項５】
前記豆を、前記微生物を含む培地に浸漬させた状態で、前記酸素又は空気と接触させて進行される、請求項４記載のクメストロールの生産方法。
【請求項６】
微生物は、真菌、酵母又は乳酸菌を含む、請求項２記載のクメストロールの生産方法。
【請求項７】
真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）又はモナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属を含む、請求項６記載のクメストロールの生産方法。
【請求項８】
微生物は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）からなる群より選択された一つ以上である、請求項２記載のクメストロールの生産方法。
【請求項９】
発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、反応器全体の体積比で２０〜８０体積％の培地を含む反応器内において、反応器全体の体積比で１〜５０体積％の豆で進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１０】
培地は、培地全体の重量比で０．００１〜１０重量％の糖類を含む、請求項９記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１１】
発芽工程及び発酵工程のうち一つ以上の工程は、２０〜３５℃の温度及び暗条件において２〜１０日間進行される、請求項１記載のクメストロールの生産方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生産されたクメストロール。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１７７９３（Ｐ２０１３−５１７７９３Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１０９９（Ｐ２０１２−５５１０９９）
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９３６８６
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０６２１３６８１）株式会社アモーレパシフィック (24)
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１８１，２−ｇａ，Ｈａｎｇａｎｇ−ｒｏ，Ｙｏｎｇｓａｎ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９３６８６
【国際公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【出願人】（５０６２１３６８１）株式会社アモーレパシフィック (24)
【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１８１，２−ｇａ，Ｈａｎｇａｎｇ−ｒｏ，Ｙｏｎｇｓａｎ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【Ｆターム（参考）】
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