グルコシノレート混入が減少した天然物を生成するための植物細胞培養
アブラナ属の植物からグルコシノレート混入の減少した天然物調製物を得るための方法を開示する。これらの方法は、所望する天然物を生成することができる植物から植物カルスを培養するステップと、グルコシノレート生成の減少したカルスを選択するステップと、選択したカルスを液体培地中で培養するステップとを含むことができる。この方法はまた、培養物から天然物を回収するステップを含むことができる。グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンを得るための方法も開示する。これらの方法は、液体培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養して懸濁培養物を得るステップと、窒素源の欠如した培地中において懸濁培養物を培養するステップとを含むことができる。この方法はまた、培養物からグルコシノレート混入の減少したアントシアニンを回収するステップを含むことができる。最後に、いくつかの特定の低グルコシノレート細胞株を記載する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物細胞培養の分野、特に、グルコシレート混入の減少した天然物を生成するための植物細胞培養の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ２００８年１２月１８日出願の米国仮出願第６１／１３８，８８４号および２００９年４月３日出願の米国仮出願第６１／１６６，４３８号の特典を請求する。
【０００３】
合成食品用および化粧品用の着色料は、消費者の好みのため、天然着色料に着実に置き換わりつつある。アントシアニン（ポリフェノール性色素）は、果実および野菜から得られた天然の水溶性非毒性色素であり、オレンジから青までの様々な色を表す。アントシアニンは、それらの抗酸化特性のため、ヒトの健康に有益な影響も及ぼすことができる（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shenoy, 1993, Curr. Sci. 64: 575-579
【非特許文献２】Meyer and Adam, Eur Food Res Technol. 226:1429-1437, 2008
【非特許文献３】DiCosmo, F. and Misawa, M. (Eds.) Plant Cell Culture Secondary Metabolism, 1996, CRC Press, Boca Raton, 232 pp
【非特許文献４】Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C.L., and Shuler, M.L. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1992, John Wiley & Sons, Inc, New York, 346 pp
【非特許文献５】Gamborg, O. L. and Phillips, G. C. (Eds.). Plant cell, tissue and organ culture: Fundamental methods, 1995, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, 307 pp
【非特許文献６】Fu, T-J, Singh, G., and Curtis, W.R. (Eds.). Plant cell and tissue culture for the production of food ingredients, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 290 pp
【非特許文献７】Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15:473-497, 1962
【非特許文献８】Reddy et al., 1994, Plant Physiol. 105: 1059-1066
【非特許文献９】Nitsch and Nitsch, Science 163:85-87, 1969
【非特許文献１０】Mellon et al., Anal. Biochem. 306:83-91, 2002
【非特許文献１１】Song et al., J. Sci. Food Agriculture 86:1271-1280, 2006
【非特許文献１２】Rochfort et al., Phytochem. 69:1671-1679, 2008
【非特許文献１３】Heaney and Fenwick, Zeitschrift Pflanzenzuchtg 87:89-95, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品用または化粧品用の着色料としてアントシアニンを使用する欠点は、アントシアニンにおける不快な味および／または臭い、特に赤キャベツから抽出されたものにおけるそれらの存在である。
【０００６】
アントシアニンは、果実または野菜を刻むか、またはつぶし、その後一般的な食用酸で酸性化した水を注入することによって生じる。その後、この抽出物を非化学的分離技術によって濃縮する。植物原料からの色素抽出物は一般的に、水酸化、メチル化およびアシル化のレベルによって異なる様々なアントシアニン分子の混合物を含有する。いくつかの場合、例えば、赤キャベツおよびダイコンから抽出されたアントシアニンの場合、抽出物は、その抽出物の不快な味または臭いに寄与する所望しない成分も含有する。これらの因子は、その植物原料において年によって変化する可能性があり、気候および環境要因によって影響を受ける。植物からアントシアニン色素を商用に生産するためのもう１つの難題は、収穫が年に１回に制限されることが多いことである。これは、１年を通じて食品業界の需要に応えるために大量の抽出物を準備して、長期間保存しなければならないことを意味する。アントシアニンは不安定なため、特殊な保存条件を利用しなければならないことが多い。さらに、植物全体または植物組織からアントシアニンまたはその他の天然の植物生成物を精製した後で、不快な味および臭いが生じることも多い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
植物細胞培養技術は、所望する植物天然物の生成および抽出のための代替源をもたらす。合成栄養培地で増殖する植物細胞の制御された環境によって、年間を通した生成および生成物のバッチ毎の一貫性がもたらされる。さらに、植物細胞培養技術は、所望する化合物を生成する能力を増強し、一方で所望しない化合物、例えば抽出物に所望しない臭いまたは味を付与する化合物を生成しない細胞株を選択する能力を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本明細書では、グルコシノレート混入の減少した天然物調製物（例えば、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）天然物、例えば、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）天然物）およびこのような天然物を含む組成物を得るための方法を開示する。グルコシノレート混入の減少した天然物調製物の生成方法は、植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えばアブラナ属植物カルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成が減少した（例えば、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約５μｇ未満の）植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養して懸濁細胞培養物を得るステップとを含む。この方法はまた、細胞培養物から天然物（例えば、アブラナ科天然物、例えば、アブラナ属天然物）を回収するステップを含むことができる。いくつかの例では、天然物調製物は天然色素、例えば、アントシアニンである。
【０００９】
本明細書ではまた、アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法を開示する。アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法は、第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養するステップと、第２の懸濁培地中において懸濁細胞培養物を増殖させるステップとを含む。いくつかの例では、第２の懸濁培地は窒素源が欠如している（例えば、添加したアンモニアおよび／または硝酸が欠如した培地）、かつ／または添加したリン酸が欠如している（例えば、添加したリン酸が欠如した培地）。この方法はまた、細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜１０％（例えば、スクロース約６％または８％）を含む第２の懸濁培地中で増殖させる。
【００１０】
本開示の前述の特性およびその他の特性は、以下の詳細な説明から、添付の図面を参照にしてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】茎由来カルスにおける赤キャベツ栽培品種の総グルコシノレート濃度を示した一連のヒストグラムである。
【図１Ｂ】葉柄由来カルスにおける赤キャベツ栽培品種の総グルコシノレート濃度を示した一連のヒストグラムである。
【図２】１２ヵ月にわたって培養した代表的な低グルコシノレートルビーボールキャベツの懸濁細胞株、ＭＸ７９７−１２におけるアントシアニン生成を示したヒストグラムである。
【図３】キャベツ細胞株ＭＸ７９７−１２の増殖およびスクロース消費パターンを示した図である。ＰＣＶ、パック細胞容積；ＲＩ、屈折率。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．緒言
アブラナ属から天然物（例えば、アントシアニン）を生成するための生細胞培養系には、安定した生理活性分子の選択的生成を促進し、不確実な、変動しやすい、または季節性の供給の問題を回避することを含むいくつかの有望な利点がある。これには、原料植物からの組織培養系の開発および微生物発酵系に類似した大規模な植物懸濁培養物の増殖が関与する。培養による植物細胞の増殖によって、細胞増殖および／または所望する天然物の生成を増強するために栄養素を操作することができる高度に制御された環境を供給する。細胞培養物はまた、所望する化合物の生成を増加させるか、または所望しない化合物の生成を減少させる化学的または物理的誘発などの処理に適している。
【００１３】
本開示では、増殖条件を変化させることによって、グルコシノレート生成の減少した赤キャベツ細胞株の選択が可能となった。開示した方法および記載した細胞株によって、（以下の実施例で示したように）グルコシノレート含量の減少したアントシアニンを生成することができる。さらに、窒素源を欠如した懸濁培地中において細胞を培養することによって、細胞のアントシアニン生成が増加する。
【００１４】
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書では、グルコシノレート混入の減少した天然物調製物（例えば、アブラナ科天然物、例えば、アブラナ属天然物）およびこのような天然物を含む組成物を得るための方法を開示する。一実施形態では、グルコシノレート混入の減少した天然物を生成するための方法は、植物から植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えばアブラナ属植物カルス）（例えば、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｐｅｅｌ）から得られたカルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養してグルコシノレート混入の減少した天然物を生成することができる懸濁細胞培養物を得るステップとを含むことができる。いくつかの特定の例では、グルコシノレート生成の減少した植物カルスは、誘導培地中でインビトロ培養して植物カルスの形成を誘導することによって生成される。この方法はまた、培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップを含むことができる。
【００１５】
一実施形態では、グルコシノレート生成の減少した植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えば、アブラナ属植物カルス）は、新鮮細胞重量（ＦＣＷ）１グラム当たり全グルコシノレート５μｇ未満を含有する。
【００１６】
本明細書ではまた、アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを得る方法を開示する。
【００１７】
グルコシノレート混入１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法は、第１の懸濁培地中でグルコシノレート生成の減少した赤キャベツ植物カルス（例えば、赤キャベツルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロ（Ｂｕｓｃａｒｏ）またはカイロ（Ｃａｉｒｏ）栽培品種のカルス）を培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、第２の懸濁培地（例えば、窒素源および／またはリン酸を欠如した第２の懸濁培地）中で懸濁細胞培養物を増殖させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜１０％（例えば、スクロース約４〜８％、例えば、スクロース約６％または８％）も含む窒素源を欠如した第２の懸濁培地中で増殖させる。その他の実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜６％を含む第２の懸濁培地中で増殖させる。この方法はさらに、細胞培養物からアントシアニン色素を回収するステップを含むことができる。
【００１８】
グルコシノレート生成が低い可能性がある特定の細胞株も提供する。
【００１９】
ＩＩＩ．略語および用語
Ａ．略語
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＢＡ：６−ベンジルアミノプリン
ＥＳ：エレクトロスプレー
ＦＣＷ：新鮮細胞重量
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー−質量分析
ＭＳ：ムラシゲおよびスクーグビタミンまたは塩
ＮＡＡ：α−ナフタレン酢酸
ＮＮ：ニッチ＆ニッチビタミン
ＰＣＶ：パック細胞容積
ＰＤＡ：光ダイオードアレイ
ＲＩ：屈折率
【００２０】
Ｂ．用語
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下に特定の用語の説明を挙げる。
【００２１】
アントシアニン：植物の葉およびその他の器官にピンク／赤から紫までの色を付与する水溶性フラボノイドの一群。一般的なアントシアニンには、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン（malvidin）、およびペラルゴニジンの誘導体が含まれる。一例では、アントシアニン色素は、グルコシノレートの減少したアブラナ属植物カルスを液体培地（例えば、窒素源を欠如した培地）中において培養した後に形成される色素である。
【００２２】
アブラナ属：時々総称してキャベツまたはカラシナとして知られているカラシナのファミリー（ｆａｍｉｌｙ）（アブラナ科）の植物の１属である。この属の作物は時々アブラナ属作物（ｃｏｌｅ ｃｒｏｐ）と呼ばれる。
【００２３】
アブラナ属の種には、アビシニアガラシ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）（アビシニアガラシまたはアビシニアンキャベツ）、Ｂ．エロンガタ（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔａ）（エロンゲーテッドマスタード（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ））、Ｂ．フルティクロサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）（地中海キャベツ（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｃａｂｂａｇｅ））、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（例えば、カラシナ、セイヨウカラシナおよびタカナ、サレプタマスタード（Ｓａｒｅｐｔａ ｍｕｓｔａｒｄ））、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（例えば、ナタネ、セイヨウアブラナ、カブハボタン）、マスタード（Ｂ．ｎｉｇｒａ）（黒ガラシ）、Ｂ．オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）（例えば、ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）（Ｂ．カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）と同義）（例えば、ハクサイ、カブ、ラピニ）およびＢ．ルペストリス（Ｂ．ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）（セイヨウカラシナ）が含まれるがそれらだけに限らない。特定の例では、企図したアブラナ属植物は、Ｂ．オレラセア、例えば、アカキャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｆ．ｒｕｂｒａ）（例えば、栽培品種ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロおよびカイロ）である。
【００２４】
アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）：カラシナ科、またはキャベツ科として（また、十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）または十字花植物（ｃｒｕｃｉｆｅｒ）として）知られる植物の科。アブラナ科に含まれる属には、アブラナ属、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、セイヨウワサビ属（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびイワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）が含まれる。アブラナ科の仲間はグルコシノレート化合物を生成する。この科には、食用作物（例えば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ナタネ、セイヨウアブラナ、カラシナ、ダイコン（ｒａｄｉｓｈ）、セイヨウワサビ、芽キャベツ、ケールおよびカブハボタン）および遺伝学的モデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を含む数多くの経済的に重要な植物が含まれる。
【００２５】
カルス：未分化型細胞の塊。植物細胞カルスは、対象植物の未分化体細胞、例えば成体の対象植物または植物胚を含む植物部分から構成される。一例では、カルス（例えば、赤キャベツカルス）のグルコシノレート含量は減少している。
【００２６】
混入（コンタミネーション）：調製物中における所望しない成分の存在。一例では、「グルコシノレート混入」には、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは１種または複数の特定のグルコシノレート）が不快な味および／または臭いを生じるレベル（例えば、約５μｇ／植物カルス中の新鮮細胞の重量ｇ、または約１００ｍｇ／天然物調製物Ｌを上回るグルコシノレート）で存在するときのアブラナ科の植物の天然物調製物中におけるグルコシノレートの存在が含まれる。
【００２７】
対照：「対照」とは、実験試料と比較するために使用される試料または標準物を意味する。いくつかの実施形態では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物または植物カルス（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、α−ナフタレン酢酸および／または６−ベンジルアミノプリンを含まない培地で誘導されたカルス）から得られた試料である。他の実施形態では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物カルスまたは懸濁培養物から生成したアントシアニン調製物である。いくつかの例では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されたカルスが得られた植物または植物カルス由来であってもよい。その他の実施形態では、対照は、歴史的な対照または標準参照値もしくは数値範囲（例えば、以前に試験した対照試料、例えば、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物もしくは植物カルスまたはグルコシノレート生成の減少について選択されていない植物カルスもしくは懸濁培養物から生成したアントシアニン調製物）である。
【００２８】
グルコシノレート：グルコースおよびアミノ酸から得られた硫黄および窒素を含有する有機化合物の１種。グルコシノレートは、アブラナ目（アブラナ科を含む）のほとんど全ての植物によって生成され、カラシナ、ダイコン、キャベツ、芽キャベツ、ケール、カリフラワー、ブロッコリーおよびカブを含む食品の苦味または「ピリッとする」味の原因となっている。グルコシノレート由来の化合物は、昆虫および草食動物に対する植物の天然の防御化合物である。
【００２９】
いくつかの例では、グルコシノレートにはアブラナ科植物によって生成されるグルコシノレート、例えば、赤キャベツによって生成されるグルコシノレート（例えば、グルコイベリン（３−メトキシスルフィニルプロピル−グルコシノレート）、プロゴイトリン（（２Ｒ）−ヒドロキシ−３−ブテニル−グルコシノレート）、シニグリン（２−プロペニル−グルコシノレート）、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル−グルコシノレート）、グルコナピン（３−ブテニル−グルコシノレート）、４−ヒドロキシ−グルコブラシキン（４−ヒドロキシ−３−インドリルメチル−グルコシノレート）、グルコトロパエオリン（ベンジル−グルコシノレート）、グルコエルシン（４−メチルチオブチル−グルコシノレート）、グルコブラシキン（３−インドールメチル−グルコシノレート）、４−メトキシ−グルコブラシキン（４−メトキシ−３−インドリルメチル−グルコシノレート）およびネオ−グルコブラシキン（１−メトキシ−３−インドールメチル−グルコシノレート）が含まれる。例えば、非特許文献２参照。
【００３０】
天然物：生きた生物または細胞（例えば培養した細胞）によって生成される、（例えば薬物として、または創薬、または設計において使用するため）薬理学的活性または生物学的活性または（例えば、食品添加物のための）その他の有用な特性を通常有する化合物または物質。一例では、天然物は、アントシアニン、例えば、アブラナ科植物（例えば、アブラナ属植物、例えば、赤キャベツ）または培養したアブラナ科植物（例えば、アブラナ属カルスまたは懸濁培養物、例えば、赤キャベツカルスまたは懸濁培養物）によって生成されるアントシアニンである。
【００３１】
アブラナ科の植物または細胞から生成される天然物（例えば、アントシアニン）は、不快な味または臭いを生じる所望しない混入物（例えば、グルコシノレート）を含有してもよい。一例では、天然物（例えば、天然物抽出物）は、グルコシノレート生成の減少したアブラナ科植物カルスから生成され、グルコシノレート混入の減少した天然物がもたらされる。
【００３２】
窒素源：窒素を植物または植物細胞培養物（例えば、カルスまたは懸濁培養物）に供給する化合物。窒素源には、アンモニア（例えば、硝酸アンモニアまたは硫酸アンモニア）および硝酸（例えば、硝酸アンモニア、硝酸カリウムまたは硝酸カルシウム）が含まれる。窒素源を欠如した増殖培地は、添加した窒素源、例えば、アンモニアまたは硝酸の形態で添加した窒素を含まない培地、例えば、アンモニアおよび／または硝酸を約１００μＭ未満（例えば、アンモニアおよび／または硝酸を約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満）含有する培地、または例えば質量分析によって検出可能なレベルのアンモニアおよび／または硝酸を含有しない培地である。
【００３３】
ｐＨ：溶液の酸性またはアルカリ性の測定値。ｐＨ７未満の２５℃の水性溶液は酸性であり、一方、ｐＨ７を上回る溶液は塩基性（アルカリ性）と考えられる。一例では、酸性ｐＨは５未満、例えば、１と３の間である。
【００３４】
植物細胞：未分化型組織（例えば、カルス）ならびに植物の種、花粉、栄養繁殖体および胚由来の細胞を含む植物から得られた任意の細胞。植物細胞は、任意の植物器官または組織およびそれらから調製した培養物から得ることができる。
【００３５】
植物部分：限定はしないが、種、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、茎、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む任意の植物器官または組織。
【００３６】
赤キャベツ：赤キャベツ（例えば、アカキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｆ．ｒｕｂｒａ））は、調製後赤クラウト（Ｒｅｄ Ｋｒａｕｔ）または青クラウト（Ｂｌｕｅ Ｋｒａｕｔ）（例えば、調理後青色を形成する）としても知られるキャベツの変種である。一例では、赤キャベツは栽培品種ルビーボールである。
【００３７】
減少した：数、量、レベル、濃度または強度が少ないことまたは小さいこと。一例では、（例えば、植物カルスによる）グルコシノレート生成の減少は、対照植物カルスと比較したグルコシノレートの量（例えば、グルコシノレートの濃度、またはアントシアニンに対するグルコシノレートの比）の減少である。別の例では、グルコシノレート混入の減少は、対照調製物と比較した調製物中のグルコシノレートの量（例えば、グルコシノレートの濃度、またはグルコシノレートに対するアントシアニンの比）の減少である。
【００３８】
懸濁培養：生物体から分離された細胞の増殖。これは一般的に、液体培地（「懸濁培地」）を使用することによって促進される。懸濁培養は、液体栄養培地における細胞の増殖を意味することができる。
【００３９】
組織培養：組織培養は通常、固体栄養培地上における細胞および組織の培養を意味する。
【００４０】
特に説明しない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。単数用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示しない限り、複数の参照物を含む。同様に、「または」という語は、文脈で明確に指示しない限り、「および」を含むものとする。「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」はＡまたはＢまたはＡおよびＢを包含することを意味する。
【００４１】
核酸またはポリペプチドまたはその他の分子について与えられた塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさおよび全分子量または分子質量値は近似値であり、特に指示しない限り、便宜的に挙げられているものとさらに理解されたい。本明細書で記載したのと類似、または同等の方法、および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は全て、全体を参考として組み込む。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が基準となる。さらに、材料、方法および実施例は、例示のために過ぎず、制限するものではない。
【００４２】
特に記載した場合を除いて、本開示の方法および技術は一般的に、当業界で周知の従来の方法にしたがって、本明細書全体で引用し、検討した様々な一般的な、およびより具体的な参考文献で記載されたように実施する。例えば、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと。
ＩＶ．グルコシノレートの減少した天然物の生成方法
グルコシノレート混入の減少した天然物、例えばアブラナ科天然物（例えば、アブラナ属天然物、例えば、アントシアニン）の生成方法を本明細書で開示する。一実施形態では、これらの方法は、アブラナ科植物カルスなどの植物カルス（例えば、アブラナ属植物カルス、例えばブラッシカ オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａｅ）植物カルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、細胞培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップとを含む。特定の例では、グルコシノレート混入の少ない天然物はアントシアニン（例えば、赤キャベツアントシアニン）である。
【００４３】
アブラナ科植物。本明細書で開示した方法は、グルコシノレート生成植物、例えば、アブラナ科の植物からグルコシノレート混入の減少した天然物を生成するために使用することができる。
【００４４】
アブラナ科の植物には、アビシニアガラシ（アビシニアガラシまたはアビシニアンキャベツ）、Ｂ．エロンガタ（エロンゲーテッドマスタード）、Ｂ．フルティクロサ（地中海キャベツ）、カラシナ（例えば、カラシナ、セイヨウカラシナおよびタカナ、サレプタマスタード）、セイヨウアブラナ（例えば、ナタネ、セイヨウアブラナ、カブハボタン）、マスタード（黒ガラシ）、Ｂ．オレラセア（例えば、ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．カンペストリスと同義）（例えば、ハクサイ、カブ、ラピニ）およびＢ．ルペストリス（セイヨウカラシナ）が含まれるがそれらだけに限らない。特定の例では、開示した方法で使用できる植物には、アカキャベツ（赤キャベツ）、例えば、栽培品種ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロが含まれる。
【００４５】
開示した方法で使用できるアブラナ科の植物にはまた、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の植物、例えば、Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ（栽培されているダイコン）およびセイヨウワサビ属の植物、例えば、セイヨウワサビ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）（ホースラディッシュ（Ｃｏｃｈｌｅａｒｉａ ａｒｍｏｒａｃｉａ）（ホースラディッシュ）と同義）が含まれる。開示した方法で使用できるアブラナ科の他の植物には、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アリッサム属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、ワサビ属（Ｗａｓａｂｉａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）およびマメグンバイナズナ属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）を含むがそれらだけに限定しないアブラナ科のその他の属の植物が含まれる。
【００４６】
グルコシノレートの減少した天然物を生成するために使用する培養条件。一例では、グルコシノレートの減少した天然物を生成するために、植物カルスおよび／または懸濁培養を使用する。植物カルスは、周知技術を使用して適切な植物から得ることができる。植物組織は、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片を含む様々な原料由来であってもよい。カルスは、適切な栄養培地中におけるインビトロ培養によって所望する天然物（例えば、アントシアニン）を生成することができる植物の組織外植片から誘導され得る。例えば、カルスの形成の誘導ステップで使用した栄養培地（「誘導培地」）には、固形培地が含まれる。植物細胞培養、例えば、カルス形成の誘導に適した栄養培地は当業者には周知である。特定の例では、カルス誘導培地には、ムラシゲおよびスクーグ（ＭＳ）塩（例えば、カタログ番号５２４、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）およびＭＳビタミン（例えば、カタログ番号５３３、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）が含まれる。例えば、非特許文献７参照。
【００４７】
一例では、カルス形成は、様々な濃度のホルモン（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）またはアルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ））を含有する誘導培地上で培養することによって誘導する。この誘導培地は、２，４−Ｄ約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ約０〜４ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌまたは４ｍｇ／Ｌ）、ＢＡ約０〜０．１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌまたは０．１ｍｇ／Ｌ）、またはそれらの１種または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。特定の例では、カルス形成は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸約２ｍｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含む固形誘導培地上で培養することによって誘導する。得られたカルスによるグルコシノレート生成を測定し、グルコシノレート生成の減少したカルスを選択することができる。
【００４８】
いくつかの例では、グルコシノレート生成の減少は、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、およびＢＡの１種、または複数を含有する誘導培地上で増殖したカルスによって生成したグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）の量を対照（例えば、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、および／またはＢＡを欠如した誘導培地で誘導したカルス、またはカルスを得た植物の実生）と比較することよって決定する。減少したグルコシノレート生成には、対照（例えば、２，４−Ｄ、ＮＡＡおよび／またはＢＡを欠如した誘導培地で誘導したカルス、またはカルスを得た植物の実生）と比較して少なくとも約１０％減少（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％も減少）が含まれる。その他の例では、減少したグルコシノレート生成には、低量のグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）、例えば、約５μｇ／ｇＦＣＷ未満、例えば、約０．０１μｇ／ｇＦＣＷから約５μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約２．５μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約１μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約０．７５μｇ／ｇＦＣＷまたは約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約０．５μｇ／ｇＦＣＷの全グルコシノレート）が含まれる。
【００４９】
グルコシノレートの減少した天然物を生成する植物のカルスおよび懸濁培養物は、当技術分野において公知のプロトコールによって確立することができる。プロトコールの代表例は、以下の実施例に挙げる。簡単に説明すると、以下の詳細は当業者によって改変させることができるが、代表的な方法において、グルコシノレートの減少した所望する天然物を生成する細胞培養の開始は、安定した連続継代性組織培養からカルス、および懸濁培養物を作製することによって実現する。
【００５０】
カルスおよび懸濁培養物は、自然に、または自発的に所望する天然物を生成してもよい。しかし、時として、宿主植物は天然物を生成するが、カルス、および／または懸濁培養物は天然物を生成しなくてもよく、または宿主植物よりも低レベルで天然物を生成してもよい。天然物の生成を誘導、または増加させる方法は、当業者には公知である。例えば、培養は、光照射、特にアントシアニン生合成の誘発因子である紫外線（ＵＶ）−Ｂ光を使用してアントシアニンを生成するように誘導することができる（例えば、非特許文献８参照）。さらに、以下に記載したように、アントシアニン生成は、適切な培地、例えば、窒素源を欠如した培地中における培養物の増殖によって増加させることができる。
【００５１】
懸濁培養物は、（以下の実施例で記載したように）カルス培養物から作出し、新鮮な懸濁培地中で維持することができる。植物細胞懸濁培養に適した栄養培地は、当業者には周知である。特定の例では、植物細胞懸濁培地には、ムラシゲおよびスクーグ（ＭＳ）塩（例えば、カタログ番号Ｍ５２４、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）およびニッチおよびニッチビタミン（例えば、カタログ番号Ｎ６０８、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）が含まれる。例えば、非特許文献９参照。懸濁培養物は、定期的な計画で、一般的に、７〜１４日間隔で、パック細胞容積（ＰＣＶ）として表現される既知の細胞量を、新鮮な培地に無菌的に移すことによって確立することができる。
【００５２】
懸濁培養のための培地（「懸濁培地」）は、懸濁培養の開始、または所望する特性（例えば、細胞構造または天然物の生成）のために至適化することができる。いくつかの例では、ホルモン（例えば、２，４−Ｄ、ジカンバ、ＮＡＡ、６−γ−γ−ジメチルアリル−アミノプリン（２ｉＰ）、ピクロラム、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ジベレリン酸（ＧＡ）またはカイネチン）の濃度は、個々に、または組み合わせて変化させることができる。特定の例では、この懸濁培地は、２，４−Ｄ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０約０ｍｇ／Ｌ、０．００５ｍｇ／ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌ、または０．１ｍｇ／Ｌ）、ジカンバ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ）、ＧＡ約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、または１ｍｇ／Ｌ）、ＩＡＡ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ）、カイネチン約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌまたは２ｍｇ／Ｌ）、ピクロラム約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌまたは２ｍｇ／Ｌ）、ＢＡ約０〜０．１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０２５ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌまたは０．１ｍｇ／Ｌ）、またはそれらの１種、または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。特定の例では、懸濁培地は２，４−Ｄ約１．５ｍｇ／Ｌを含む。
【００５３】
グルコシノレート生成の測定方法。グルコシノレートの測定方法、または定量方法は、当業者には周知である。一例では、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは特定のグルコシノレート）は、質量分析、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）技術によって測定する。植物、植物カルス、または植物細胞培養物（例えば、グルコシノレート生成の減少した植物カルス）の抽出物（例えば、水性抽出物）は、ＬＣ−ＭＳによって評価する。グルコシノレートは、分子量、および滞留時間に基づいて検出する。定量は、グルコシノレート（例えば、シニグリン）の既知の濃度を使用した外部検量線をベースにすることができる。例えば、非特許文献１０、１１、１２参照。
【００５４】
別の例では、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは特定のグルコシノレート）は、酵素ミロシナーゼでグルコシノレートを加水分解し、遊離するグルコースの量を定量することによって測定する。例えば、非特許文献１３参照。
Ｖ．グルコシノレートの減少したキャベツアントシアニンの生成方法
本明細書では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンの生成方法を開示する。一例では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンは、第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、第２の懸濁培地中において懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップによって生成する。いくつかの例では、第２の懸濁培地は窒素源が欠如している（例えば、添加した窒素源、例えば、外来性アンモニア、または硝酸の形態で添加された窒素を有さない）。他の例では、第２の懸濁培地は、糖を約３〜１０％（例えば、スクロースを約３〜１０％、例えば、スクロースを約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％）含む。
【００５５】
グルコシノレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスの生成は、以下に説明したように実施する。いくつかの例では、キャベツアントシアニンのグルコシノレート混入の減少は、赤キャベツ植物カルス、または懸濁培養物から調製したアントシアニン中のグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）の量を対照（例えば、グルコシノレートの減少したカルスを得た植物の植物カルスまたは懸濁培養物から調製したアントシアニン）と比較することよって決定する。グルコシノレート混入の減少には、対照（例えば、グルコシノレートの減少したカルスを得た植物の植物カルスまたは懸濁培養物から調製したアントシアニン）と比較して少なくとも約１０％減少（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％も減少）が含まれる。その他の例では、グルコシノレート混入の減少は、アントシアニン調製物中のグルコシノレート約１００ｍｇ／Ｌ未満（例えば、約１００ｍｇ／Ｌ未満、約７５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌも）と決定する。他の例では、グルコシノレート混入の減少には、グルコシノレートに対するアントシアニンの比が少なくとも約４０：１（例えば、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１またはそれ以上）が含まれる。
【００５６】
アントシアニン生成の増加のために使用する培養条件。懸濁培養用培地は、アントシアニン生成のために至適化することができる。いくつかの例では、窒素源（例えば、硝酸アンモニウム、および／または硫酸アンモニウム）の量、または炭素源（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）もしくはその他の成分（例えば、カゼインまたはリン酸）の量、もしくは種類は、個々に、または組み合わせて変化させることができる。特定の例では、懸濁培地は、窒素源０〜８０ｍＭ（例えば、アンモニアおよび／または硝酸約０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは８０ｍＭ）、グルコース、フルクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトール約３〜１０％（例えば、約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％）、カゼイン０．５〜１０ｇ／Ｌ（例えば、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌ）またはそれらの１種、または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。一例では、懸濁培地はスクロース約４％を含有する（例えば、培地ＢＯ１０９２３）。その他の例では、懸濁培地は、減少したリン酸を含有してもよく、またはリン酸を欠如してもよい（例えば、添加したリン酸を含まない培地、例えば、リン酸を約１０μＭ未満（例えばリン酸約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満）含有する培地、または、例えば質量分析によって検出可能なレベルのリン酸を含有しない培地）。特定の例では、懸濁培地は、スクロース約８％を含有し、窒素源を欠如する培地（例えば、培地ＢＯ１２２４）またはスクロース約８％を含有し、窒素源および添加したリン酸の両方を欠如する培地（例えば、培地ＢＯ１８５１）である。いくつかの例では、懸濁培地はまた、２，４−Ｄ（例えば、２，４−Ｄ約１〜２ｍｇ／Ｌ、例えば、２，４−Ｄ約１．５ｍｇ／Ｌ）を含む。得られた細胞培養物によるアントシアニン生成を測定し、アントシアニン生成の増加した、または至適化した培養条件を選択することができる。
【００５７】
アントシアニン色素の回収。アントシアニンは、本明細書で記載した方法によって調製した細胞培養物から、任意のその他のアントシアニンの抽出について当業界で公知の方法と類似の方法で回収または抽出する。例えば、代表的な実施形態では、細胞をホモジナイズし、酸性水（硫酸０．１％、ｐＨ３）で抽出する。抽出に使用される溶媒の変更には、エタノール、またはメタノールの添加（５０％ｖ／ｖまで）および溶媒を酸性化するための（硫酸の代わりの）酢酸、またはその他の食用グレードの酸の使用が含まれる。細胞は、保存が必要な場合、ホモジナイズ前に冷凍することができる。例えば、細胞は液体窒素中で冷凍し、−８０℃で保存することができる。
【００５８】
一例では、細胞懸濁培養物は、使用した培地を除去する前にホモジナイズし、得られたホモジネートを濾過する。ホモジナイズし濾過した細胞集団をその後溶媒で抽出して、アントシアニンを取り出す。他の例では、細胞培養物を濾過して使用済培地を除去し、残存する細胞集団に溶媒を添加し、その後細胞を溶媒存在下でホモジナイズする。他の例では、使用済培地を傾瀉し、残存する細胞集団に溶媒を添加し、細胞をホモジナイズしてアントシアニンを抽出する。前述の例の全てにおいて、溶媒によるアントシアニン抽出は数回反復して、細胞集団から可能な限り多くのアントシアニンを抽出することができる。
【００５９】
アントシアニン生成の測定方法。調製物中のアントシアニン量、または質量の測定方法は、当業者には公知である。調製物（例えば、細胞培養物の抽出物）のアントシアニン含量は、５２０ｎｍでの吸光度を測定し、ベールの法則（Ａ520nm×１０００×シアニジングルコシドのＭＷ）/（吸光係数）を使用してアントシアニン含量を算出することができる。
【００６０】
調製物中に見出されたアントシアニンの量、および種類は、ＬＣ−ＭＳ、およびＵＶ吸光度によって決定することができる。いくつかの例では、調製物はＬＣ−ＭＳ分析を行う。試料を５２０ｎｍでモニターする。その後、未知の抽出物の全アントシアニン濃度は、５２０ｎｍでのピーク領域を積算し、標準曲線と比較することによってシアニジン−３，５−ジグルコシド当量として表すことができる。
【００６１】
アントシアニン調製物の使用。アントシアニンは、清涼飲料、飲料、およびヨーグルトなどの多くの食品において天然の着色添加物として幅広く使用されている。しかし、従来通り生成されたアントシアニン、例えば、赤キャベツなどの植物からの抽出物は、調製物中にグルコシノレートが存在する結果として所望しない臭いおよび／または味を有することが多い。したがって、本明細書で記載した方法によって、通例の調製物の所望しない臭いおよび／または味を欠如した、グルコシノレート混入の減少したアントシアニンを生成することができる。開示した方法によって生成したアントシアニンは、従来通り調製したアントシアニンの代わりに、任意の食物、飲料、薬剤、化粧品またはその他の調製物で使用することができる。
【００６２】
以下の実施例は、ある特定の特性および／または実施形態を例示するために挙げる。これらの実施例は、記載した特定の特性または実施形態に本開示を限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
グルコシノレート低生成赤キャベツ細胞株の選択
この実施例は、低量のグルコシノレートを生成するか、またはグルコシノレートを生成しない赤キャベツ細胞株の選択について説明する。
【００６４】
赤キャベツ（ブラッシカ オレラセア）の７種類の異なる栽培品種、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロ、およびカイロの種３０個それぞれを５０ｍＬチューブに入れ、漂白溶液１００ｍＬ当たりＴｗｅｅｎ−２０を１滴含有する２５％漂白液３０〜４０ｍＬを試験管に添加した。チューブをＬａｂＱｕａｋｅ（登録商標）振盪機（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で１５分間振盪した。種および漂白液を滅菌した茶漉し器に注いだ。次に、種を滅菌水で３回濯ぎ、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／Ｌ、およびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２０ｇ／Ｌを含むＭＳ塩をベースにした発芽培地（ＢＯ２５４、表１）に播種した。３週間後、発芽した実生は小刀で３つの部分（子葉、胚軸、および根）に切断し、種々の濃度のホルモン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、アルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）を含むＭＳ塩、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．０ｇ／Ｌをベースにしたカルス誘導培地（培地ＢＯ２７８、ＢＯ２７９、ＢＯ２８０、ＢＯ２８１、ＢＯ２８２、ＢＯ２８３、表１）上に滅菌ピンセットで移した。２〜３週間後、カルスはうまく誘導され、最終的にいくつかの継代培養物の増殖速度が良好であった。良好に増殖するカルスを、ＮＡＡ２．０ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．０ｇ／Ｌを有するＭＳ培地（ＢＯ２８３、表１）に移した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
７種類の様々な栽培品種の茎および葉柄由来のカルスの全グルコシノレートレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析を使用して評価した（図１）。抽出物は、新鮮なカルスまたは懸濁細胞約０．５ｍＬおよびＨ2ＳＯ4０．０５％を含む５０％（ｖ／ｖ）エタノール１．０ｍＬから調製した。細胞は微量遠心管（２．０ｍＬ）に収集し、ビーズミルホモジナイザ−で２分間ホモジナイズした。ホモジェネートを臨床用遠心器で４０００ｒｐｍで４分間遠心した。試料１０μｌをＬＣ−ＭＳ分析器に注入した。ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８ １０×２．１ｍｍガードカラムを備えたＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（１００×２．１ｍｍ、内径３．５μｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。ＬＣ分析は、ＣＴＣ分析ＰＡＬオートサンプラー（Ｌｅａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｂｏｒｏ、ＮＣ、ＵＳＡ）、６００Ｓ制御装置を具備したＷａｔｅｒｓ ６２６ポンプおよび１９０から７８０ｎｍを０〜２７分で走査するＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して実施した。勾配溶出は、水−ギ酸０．１％（溶媒Ａ）およびアセトニトリル−ギ酸０．１％（溶媒Ｂ）を０．３ｍＬ分-1の一定流速で実施した。溶媒Ｂの以下の比（ｖ／ｖ）の直線勾配プロファイルを適用した（ｔ（分）、％Ｂ）：（０、８）、（１５、４５）、（１５．１、１００）、（２５、１００）、（２５．１、８）、（３５、８）。Ｗａｔｅｒｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連４重極質量検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を同時に使用してＭＳデータを得た。質量分析条件は、ＥＳネガティブモード、キャピラリー電圧２．９５ｋＶ、コーン電圧１５Ｖ、イオン源温度１１５℃、脱溶媒和温度２２５℃、コーンガス流量０Ｌ／時間、脱溶媒和ガス流量６００Ｌ／時間、イオンエネルギー１、エントランス５０、コリジョン２、エグジット５０。
【００６７】
グルコシノレート検出は、１５０〜１０００ｍ／ｚのＥＳネガティブモードスキャンを使用した分子量に基づいた。定量は、シニグリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１５．６２５μｇ／ｍＬ、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬを使用した外部検量線をベースにした。化合物は、分子量およびＥＳネガティブモードスキャンの滞留時間をベースにして検出した。抽出物中の各グルコシノレート化合物の検出および定量は、分子量および滞留時間情報をベースにした（表２）。グルコブラシキン(glucobrassicin)、ネオグルコブラシキン(neoglucobrassicin)、４−メトキシグルコブラシキン(4-methoxyglucobrassicin)および４−ヒドロキシグルコブラシキン(4-hydroxyglucobrassicin)を含む４種類のグルコシノレート化合物を検出したところ、栽培品種のグルコシノレート含量は変動が著しかった。
【００６８】
【表２】
【００６９】
グルコシノレート含量が低いか、またはグルコシノレートを含有しない赤キャベツ変種全てのカルスを同定した。全グルコシノレート濃度は、対応する変種の実生の１５０〜３００μｇ／ｇ新鮮細胞重量（ＦＣＷ）と比較して、平均して０．０６〜７６．５４μｇ／ｇＦＣＷの間であった。ルビーボールのカルス（ＦＣＷ１グラム当たりグルコシノレート０．０６〜０．５μｇ）は格別に低いレベルを示した。したがって、ルビーボールのカルスは、グルコシノレート低生成細胞株として選択し、一貫して低いレベルのグルコシノレート生成を示した。ルビーボールキャベツから得られた９種の独立したカルスを選択し、ＭＸ７９７−１からＭＸ７９７−１９と指定した。
【００７０】
（実施例２）
キャベツ細胞の懸濁培養およびアントシアニンの生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成の至適化におけるキャベツ細胞懸濁培養物増殖のための培地の選択について説明する。
【００７１】
発色した砕けやすい細胞のみを収集するために、実施例１で記載したＢＯ２８３プレート上で増殖するルビーボールの健常なカルス（細胞株、ＭＸ７９７−５、−６、−８、−９、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５および−１７）を、ＮＮビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．５μｇ／Ｌおよび２，４−Ｄ１．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ塩をベースにした改変培地（ＢＯ１１６８、表３）に移した。培地のｐＨは、圧力１．０４ｋｇ／ｃｍ2（１２１℃）で２５分間オートクレーブする前に５．８に調節した。ＢＯ１１６８培地上に再度播種した赤キャベツカルスは、良好な増殖および発色を示した。細胞構造もより砕けやすくなり、懸濁培養の作製および増殖に適合した。４週間毎にカルスを同培地に継代培養し、暗紫色の砕けやすいカルスのみを各継代時に新鮮な培地に移した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
固形プレート上で２回継代した後、ＮＮビタミン、スクロース３０ｇ／Ｌおよび２，４−Ｄ１．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（ＤＣ１１５１、表３）中で懸濁培養作製を再度開始した。懸濁した細胞は、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（三角コルベン）内で新鮮なＤＣ１１５１培地（摂取量＝２５％ＰＣＶ（パック細胞容積））３０ｍＬに継代することによって維持した。培地のｐＨは、オートクレーブする前に５．４に調節した。培養物は、６０μＭ／ｍ2／秒で、白色蛍光灯（明期１６時間／日）の下で２３℃で１１５ｒｐｍでインキュベートした。
【００７４】
６日目に、全フラスコから試料を採取し、アントシアニン生成をＵＶ吸光法によって測定した。簡単に説明すると、アントシアニンは、新鮮なカルスまたは懸濁細胞約０．５ｍＬからＨ2ＳＯ4０．０５％を含む５０％（ｖ／ｖ）エタノール１．０ｍＬで抽出した。細胞は微量遠心管（２．０ｍＬ）に収集し、ビーズミルホモジナイザ−で２分間ホモジナイズした。ホモジェネートを臨床用遠心器で４０００ｒｐｍで４分間遠心した。この抽出物をｐＨ３．０緩衝溶液で５回希釈し、５２０ｎｍの吸光度を調べた。アントシアニン含量は、ベールの法則（Ａ５２０ｎｍ×１０００×シアニジングルコシドのＭＷ）／（吸光係数）を使用して算出した。生産性を至適化し、規模を拡大するために、均一に発色した良好な懸濁物を実現するために、さらなる細胞選択工程においてすぐれた増殖特性によって、この時点で細胞株ＭＸ７９７−１２を選択した。
【００７５】
７日目にアントシアニン高生成細胞を含有するフラスコを選択し、細胞１０ｍＬＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地３０ｍＬに移し、播種密度２５％（ｖ／ｖ）の培養物４０ｍＬを作製した。選択的に継代して９ヵ月後、高生産系を定期的に選択する工程によって１２５ｍＬフラスコ規模でアントシアニン生成の著しい改善が得られ、その生成には再現性があった。その後、１２５ｍＬフラスコにおける細胞培養を２５０ｍＬフラスコ規模に拡大した。２５０ｍＬフラスコ規模では、細胞の２０ｍＬＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地６０ｍＬに移し、培養物８０ｍＬ（２５％（ｖ／ｖ）播取密度）を作製した。細胞増殖およびアントシアニン生成は、２つの異なる容器容量でかなり類似したパターンを示した。継続的な細胞選択工程は、維持培養におけるアントシアニン生成増加を支え、ＭＸ７９７−１２細胞株によって生成されるアントシアニンの全量は、１２ヵ月の細胞選択工程によって最大約１３．６倍（８１．９±７．９ｍｇ／Ｌ ＰＣＶから１１１９．０±２４．６ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）に増加した（図２）。倍加時間によって測定すると、ＭＸ７９７−１２細胞株の０日と７日との間の最大増殖は、４．８日であった（図３）。
【００７６】
細胞増殖およびアントシアニン生成をさらに高めるために、維持培地の糖濃度を増加させるように改変した。こうして、スクロース濃度を４％（４０ｇ／Ｌ培地）に増加させた、ＤＣ１１５１とは異なる培地ＢＯ１９２３を開発した（表３）。この変更によって、ＢＯ１９２３で増殖させて８ヵ月後に、平均して２．３倍（１１１９．０±２４．６ｍｇ／Ｌ ＰＣＶから２６１２．５±５１３．２ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）のアントシアニン生成増加がもたらされた。
【００７７】
窒素源の除去の効果を評価するために、全窒素源をＢＯ１１５５から除去し、培地ＢＯ１２２４（表３）を作製した。培養７日後の消費済培地をＢＯ１２２４に置換した。この培地によって、アントシアニン生成がＰＣＶ約２０６０ｍｇ／Ｌまで上昇することが示され、窒素源除去によって高濃度のスクロースによるアントシアニン生成が改善されることが示唆された。
【００７８】
（実施例３）
スクロースを使用したキャベツ懸濁細胞におけるアントシアニン生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成に対するスクロース初期濃度およびスクロース補充添加の効果について説明する。
【００７９】
ＭＸ７９７−１２の懸濁培養におけるアントシアニンの生産性をスクロース添加後モニターした。７日後の細胞培養物２０ｍＬを、スクロース初期濃度としてスクロース３％、４％、５％または６％（ｗ／ｖ）を含むＤＣ１１５１培地６０ｍＬを含有する２５０ｍＬフラスコに接種し、細胞をさらに７日間増殖させ、実施例２で記載したのと同じ増殖条件でインキュベートした。その後、滅菌したスクロース５０％（ｗ／ｖ）の保存溶液を使用して、適量を各培養物に添加して屈折率（ＲＩ）を５％に調節し、２日後にアントシアニン生産性を処理間で比較した。スクロース６％で開始したフラスコは、９日後にアントシアニンを１４０８．７±１１６．５ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ生成し、これはスクロース３％で開始した細胞の生産性よりもほぼ２倍高かった（表４）。スクロース初期濃度は、７日間通常維持した培養のアントシアニン生成ならびに７日後のスクロース追加による生成増加に影響を及ぼした。
【００８０】
【表４】
【００８１】
（実施例４）
生成培地開発におけるリン酸の効果
この実施例は、アントシアニン生成に対するリン酸除去の効果を記載する。
【００８２】
生成培地中におけるアントシアニン生成を増加させるために、ＢＯ１２２４からリン酸を除去して生成培地ＢＯ１８５１を調製した（表３）。最初の７日間の培養のためにＭＸ７９７−１２細胞の２０ｍＬ ＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地６０ｍＬに播種し、実施例２に記載したように播種した。７日目に、培地交換の前にＰＣＶおよびＲＩを測定したところ、それぞれ５９．３±１．４％および０．５４±０．０５％であった。７日後の懸濁物の使用済培地を、ＰＣＶを変化させずにＢＯ１８５１と置換し、さらに７日間インキュベートした。アントシアニンの生成は、ＢＯ１２２４培地を含有する対照フラスコと比較した。ＢＯ１８５１で生成されたアントシアニンの量（１３６９．５±４６０ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）は、対照より２．２倍高かった（表５）。
【００８３】
【表５】
【００８４】
本開示は、特定の実施形態を強調して記載しているが、特定の実施形態の変更を使用することができ、本開示は本明細書で具体的に記載したものとは別の方法で実施できるものであることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示には、以下の特許請求の範囲に記載した本開示の精神および範囲内に包含される変更が全て含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、植物細胞培養の分野、特に、グルコシレート混入の減少した天然物を生成するための植物細胞培養の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ２００８年１２月１８日出願の米国仮出願第６１／１３８，８８４号および２００９年４月３日出願の米国仮出願第６１／１６６，４３８号の特典を請求する。
【０００３】
合成食品用および化粧品用の着色料は、消費者の好みのため、天然着色料に着実に置き換わりつつある。アントシアニン（ポリフェノール性色素）は、果実および野菜から得られた天然の水溶性非毒性色素であり、オレンジから青までの様々な色を表す。アントシアニンは、それらの抗酸化特性のため、ヒトの健康に有益な影響も及ぼすことができる（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shenoy, 1993, Curr. Sci. 64: 575-579
【非特許文献２】Meyer and Adam, Eur Food Res Technol. 226:1429-1437, 2008
【非特許文献３】DiCosmo, F. and Misawa, M. (Eds.) Plant Cell Culture Secondary Metabolism, 1996, CRC Press, Boca Raton, 232 pp
【非特許文献４】Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C.L., and Shuler, M.L. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1992, John Wiley & Sons, Inc, New York, 346 pp
【非特許文献５】Gamborg, O. L. and Phillips, G. C. (Eds.). Plant cell, tissue and organ culture: Fundamental methods, 1995, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, 307 pp
【非特許文献６】Fu, T-J, Singh, G., and Curtis, W.R. (Eds.). Plant cell and tissue culture for the production of food ingredients, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 290 pp
【非特許文献７】Murashige and Skoog, Physiol. Plant 15:473-497, 1962
【非特許文献８】Reddy et al., 1994, Plant Physiol. 105: 1059-1066
【非特許文献９】Nitsch and Nitsch, Science 163:85-87, 1969
【非特許文献１０】Mellon et al., Anal. Biochem. 306:83-91, 2002
【非特許文献１１】Song et al., J. Sci. Food Agriculture 86:1271-1280, 2006
【非特許文献１２】Rochfort et al., Phytochem. 69:1671-1679, 2008
【非特許文献１３】Heaney and Fenwick, Zeitschrift Pflanzenzuchtg 87:89-95, 1981
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
食品用または化粧品用の着色料としてアントシアニンを使用する欠点は、アントシアニンにおける不快な味および／または臭い、特に赤キャベツから抽出されたものにおけるそれらの存在である。
【０００６】
アントシアニンは、果実または野菜を刻むか、またはつぶし、その後一般的な食用酸で酸性化した水を注入することによって生じる。その後、この抽出物を非化学的分離技術によって濃縮する。植物原料からの色素抽出物は一般的に、水酸化、メチル化およびアシル化のレベルによって異なる様々なアントシアニン分子の混合物を含有する。いくつかの場合、例えば、赤キャベツおよびダイコンから抽出されたアントシアニンの場合、抽出物は、その抽出物の不快な味または臭いに寄与する所望しない成分も含有する。これらの因子は、その植物原料において年によって変化する可能性があり、気候および環境要因によって影響を受ける。植物からアントシアニン色素を商用に生産するためのもう１つの難題は、収穫が年に１回に制限されることが多いことである。これは、１年を通じて食品業界の需要に応えるために大量の抽出物を準備して、長期間保存しなければならないことを意味する。アントシアニンは不安定なため、特殊な保存条件を利用しなければならないことが多い。さらに、植物全体または植物組織からアントシアニンまたはその他の天然の植物生成物を精製した後で、不快な味および臭いが生じることも多い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
植物細胞培養技術は、所望する植物天然物の生成および抽出のための代替源をもたらす。合成栄養培地で増殖する植物細胞の制御された環境によって、年間を通した生成および生成物のバッチ毎の一貫性がもたらされる。さらに、植物細胞培養技術は、所望する化合物を生成する能力を増強し、一方で所望しない化合物、例えば抽出物に所望しない臭いまたは味を付与する化合物を生成しない細胞株を選択する能力を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本明細書では、グルコシノレート混入の減少した天然物調製物（例えば、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）天然物、例えば、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）天然物）およびこのような天然物を含む組成物を得るための方法を開示する。グルコシノレート混入の減少した天然物調製物の生成方法は、植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えばアブラナ属植物カルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成が減少した（例えば、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約５μｇ未満の）植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養して懸濁細胞培養物を得るステップとを含む。この方法はまた、細胞培養物から天然物（例えば、アブラナ科天然物、例えば、アブラナ属天然物）を回収するステップを含むことができる。いくつかの例では、天然物調製物は天然色素、例えば、アントシアニンである。
【０００９】
本明細書ではまた、アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法を開示する。アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法は、第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養するステップと、第２の懸濁培地中において懸濁細胞培養物を増殖させるステップとを含む。いくつかの例では、第２の懸濁培地は窒素源が欠如している（例えば、添加したアンモニアおよび／または硝酸が欠如した培地）、かつ／または添加したリン酸が欠如している（例えば、添加したリン酸が欠如した培地）。この方法はまた、細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜１０％（例えば、スクロース約６％または８％）を含む第２の懸濁培地中で増殖させる。
【００１０】
本開示の前述の特性およびその他の特性は、以下の詳細な説明から、添付の図面を参照にしてより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】茎由来カルスにおける赤キャベツ栽培品種の総グルコシノレート濃度を示した一連のヒストグラムである。
【図１Ｂ】葉柄由来カルスにおける赤キャベツ栽培品種の総グルコシノレート濃度を示した一連のヒストグラムである。
【図２】１２ヵ月にわたって培養した代表的な低グルコシノレートルビーボールキャベツの懸濁細胞株、ＭＸ７９７−１２におけるアントシアニン生成を示したヒストグラムである。
【図３】キャベツ細胞株ＭＸ７９７−１２の増殖およびスクロース消費パターンを示した図である。ＰＣＶ、パック細胞容積；ＲＩ、屈折率。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．緒言
アブラナ属から天然物（例えば、アントシアニン）を生成するための生細胞培養系には、安定した生理活性分子の選択的生成を促進し、不確実な、変動しやすい、または季節性の供給の問題を回避することを含むいくつかの有望な利点がある。これには、原料植物からの組織培養系の開発および微生物発酵系に類似した大規模な植物懸濁培養物の増殖が関与する。培養による植物細胞の増殖によって、細胞増殖および／または所望する天然物の生成を増強するために栄養素を操作することができる高度に制御された環境を供給する。細胞培養物はまた、所望する化合物の生成を増加させるか、または所望しない化合物の生成を減少させる化学的または物理的誘発などの処理に適している。
【００１３】
本開示では、増殖条件を変化させることによって、グルコシノレート生成の減少した赤キャベツ細胞株の選択が可能となった。開示した方法および記載した細胞株によって、（以下の実施例で示したように）グルコシノレート含量の減少したアントシアニンを生成することができる。さらに、窒素源を欠如した懸濁培地中において細胞を培養することによって、細胞のアントシアニン生成が増加する。
【００１４】
ＩＩ．いくつかの実施形態の概要
本明細書では、グルコシノレート混入の減少した天然物調製物（例えば、アブラナ科天然物、例えば、アブラナ属天然物）およびこのような天然物を含む組成物を得るための方法を開示する。一実施形態では、グルコシノレート混入の減少した天然物を生成するための方法は、植物から植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えばアブラナ属植物カルス）（例えば、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｐｅｅｌ）から得られたカルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養してグルコシノレート混入の減少した天然物を生成することができる懸濁細胞培養物を得るステップとを含むことができる。いくつかの特定の例では、グルコシノレート生成の減少した植物カルスは、誘導培地中でインビトロ培養して植物カルスの形成を誘導することによって生成される。この方法はまた、培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップを含むことができる。
【００１５】
一実施形態では、グルコシノレート生成の減少した植物カルス（例えば、アブラナ科植物カルス、例えば、アブラナ属植物カルス）は、新鮮細胞重量（ＦＣＷ）１グラム当たり全グルコシノレート５μｇ未満を含有する。
【００１６】
本明細書ではまた、アントシアニン調製物中におけるグルコシノレート混入１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを得る方法を開示する。
【００１７】
グルコシノレート混入１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンを生成する方法は、第１の懸濁培地中でグルコシノレート生成の減少した赤キャベツ植物カルス（例えば、赤キャベツルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロ（Ｂｕｓｃａｒｏ）またはカイロ（Ｃａｉｒｏ）栽培品種のカルス）を培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、第２の懸濁培地（例えば、窒素源および／またはリン酸を欠如した第２の懸濁培地）中で懸濁細胞培養物を増殖させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜１０％（例えば、スクロース約４〜８％、例えば、スクロース約６％または８％）も含む窒素源を欠如した第２の懸濁培地中で増殖させる。その他の実施形態では、懸濁細胞培養物は、スクロース約３〜６％を含む第２の懸濁培地中で増殖させる。この方法はさらに、細胞培養物からアントシアニン色素を回収するステップを含むことができる。
【００１８】
グルコシノレート生成が低い可能性がある特定の細胞株も提供する。
【００１９】
ＩＩＩ．略語および用語
Ａ．略語
２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
ＢＡ：６−ベンジルアミノプリン
ＥＳ：エレクトロスプレー
ＦＣＷ：新鮮細胞重量
ＬＣ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー−質量分析
ＭＳ：ムラシゲおよびスクーグビタミンまたは塩
ＮＡＡ：α−ナフタレン酢酸
ＮＮ：ニッチ＆ニッチビタミン
ＰＣＶ：パック細胞容積
ＰＤＡ：光ダイオードアレイ
ＲＩ：屈折率
【００２０】
Ｂ．用語
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、以下に特定の用語の説明を挙げる。
【００２１】
アントシアニン：植物の葉およびその他の器官にピンク／赤から紫までの色を付与する水溶性フラボノイドの一群。一般的なアントシアニンには、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン（malvidin）、およびペラルゴニジンの誘導体が含まれる。一例では、アントシアニン色素は、グルコシノレートの減少したアブラナ属植物カルスを液体培地（例えば、窒素源を欠如した培地）中において培養した後に形成される色素である。
【００２２】
アブラナ属：時々総称してキャベツまたはカラシナとして知られているカラシナのファミリー（ｆａｍｉｌｙ）（アブラナ科）の植物の１属である。この属の作物は時々アブラナ属作物（ｃｏｌｅ ｃｒｏｐ）と呼ばれる。
【００２３】
アブラナ属の種には、アビシニアガラシ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）（アビシニアガラシまたはアビシニアンキャベツ）、Ｂ．エロンガタ（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔａ）（エロンゲーテッドマスタード（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ））、Ｂ．フルティクロサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）（地中海キャベツ（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｃａｂｂａｇｅ））、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）（例えば、カラシナ、セイヨウカラシナおよびタカナ、サレプタマスタード（Ｓａｒｅｐｔａ ｍｕｓｔａｒｄ））、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）（例えば、ナタネ、セイヨウアブラナ、カブハボタン）、マスタード（Ｂ．ｎｉｇｒａ）（黒ガラシ）、Ｂ．オレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）（例えば、ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）（Ｂ．カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）と同義）（例えば、ハクサイ、カブ、ラピニ）およびＢ．ルペストリス（Ｂ．ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）（セイヨウカラシナ）が含まれるがそれらだけに限らない。特定の例では、企図したアブラナ属植物は、Ｂ．オレラセア、例えば、アカキャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｆ．ｒｕｂｒａ）（例えば、栽培品種ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロおよびカイロ）である。
【００２４】
アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）：カラシナ科、またはキャベツ科として（また、十字花科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）または十字花植物（ｃｒｕｃｉｆｅｒ）として）知られる植物の科。アブラナ科に含まれる属には、アブラナ属、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、セイヨウワサビ属（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびイワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）が含まれる。アブラナ科の仲間はグルコシノレート化合物を生成する。この科には、食用作物（例えば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、カブ、ナタネ、セイヨウアブラナ、カラシナ、ダイコン（ｒａｄｉｓｈ）、セイヨウワサビ、芽キャベツ、ケールおよびカブハボタン）および遺伝学的モデル生物であるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を含む数多くの経済的に重要な植物が含まれる。
【００２５】
カルス：未分化型細胞の塊。植物細胞カルスは、対象植物の未分化体細胞、例えば成体の対象植物または植物胚を含む植物部分から構成される。一例では、カルス（例えば、赤キャベツカルス）のグルコシノレート含量は減少している。
【００２６】
混入（コンタミネーション）：調製物中における所望しない成分の存在。一例では、「グルコシノレート混入」には、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは１種または複数の特定のグルコシノレート）が不快な味および／または臭いを生じるレベル（例えば、約５μｇ／植物カルス中の新鮮細胞の重量ｇ、または約１００ｍｇ／天然物調製物Ｌを上回るグルコシノレート）で存在するときのアブラナ科の植物の天然物調製物中におけるグルコシノレートの存在が含まれる。
【００２７】
対照：「対照」とは、実験試料と比較するために使用される試料または標準物を意味する。いくつかの実施形態では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物または植物カルス（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、α−ナフタレン酢酸および／または６−ベンジルアミノプリンを含まない培地で誘導されたカルス）から得られた試料である。他の実施形態では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物カルスまたは懸濁培養物から生成したアントシアニン調製物である。いくつかの例では、対照は、グルコシノレート生成の減少について選択されたカルスが得られた植物または植物カルス由来であってもよい。その他の実施形態では、対照は、歴史的な対照または標準参照値もしくは数値範囲（例えば、以前に試験した対照試料、例えば、グルコシノレート生成の減少について選択されていない植物もしくは植物カルスまたはグルコシノレート生成の減少について選択されていない植物カルスもしくは懸濁培養物から生成したアントシアニン調製物）である。
【００２８】
グルコシノレート：グルコースおよびアミノ酸から得られた硫黄および窒素を含有する有機化合物の１種。グルコシノレートは、アブラナ目（アブラナ科を含む）のほとんど全ての植物によって生成され、カラシナ、ダイコン、キャベツ、芽キャベツ、ケール、カリフラワー、ブロッコリーおよびカブを含む食品の苦味または「ピリッとする」味の原因となっている。グルコシノレート由来の化合物は、昆虫および草食動物に対する植物の天然の防御化合物である。
【００２９】
いくつかの例では、グルコシノレートにはアブラナ科植物によって生成されるグルコシノレート、例えば、赤キャベツによって生成されるグルコシノレート（例えば、グルコイベリン（３−メトキシスルフィニルプロピル−グルコシノレート）、プロゴイトリン（（２Ｒ）−ヒドロキシ−３−ブテニル−グルコシノレート）、シニグリン（２−プロペニル−グルコシノレート）、グルコラファニン（４−メチルスルフィニルブチル−グルコシノレート）、グルコナピン（３−ブテニル−グルコシノレート）、４−ヒドロキシ−グルコブラシキン（４−ヒドロキシ−３−インドリルメチル−グルコシノレート）、グルコトロパエオリン（ベンジル−グルコシノレート）、グルコエルシン（４−メチルチオブチル−グルコシノレート）、グルコブラシキン（３−インドールメチル−グルコシノレート）、４−メトキシ−グルコブラシキン（４−メトキシ−３−インドリルメチル−グルコシノレート）およびネオ−グルコブラシキン（１−メトキシ−３−インドールメチル−グルコシノレート）が含まれる。例えば、非特許文献２参照。
【００３０】
天然物：生きた生物または細胞（例えば培養した細胞）によって生成される、（例えば薬物として、または創薬、または設計において使用するため）薬理学的活性または生物学的活性または（例えば、食品添加物のための）その他の有用な特性を通常有する化合物または物質。一例では、天然物は、アントシアニン、例えば、アブラナ科植物（例えば、アブラナ属植物、例えば、赤キャベツ）または培養したアブラナ科植物（例えば、アブラナ属カルスまたは懸濁培養物、例えば、赤キャベツカルスまたは懸濁培養物）によって生成されるアントシアニンである。
【００３１】
アブラナ科の植物または細胞から生成される天然物（例えば、アントシアニン）は、不快な味または臭いを生じる所望しない混入物（例えば、グルコシノレート）を含有してもよい。一例では、天然物（例えば、天然物抽出物）は、グルコシノレート生成の減少したアブラナ科植物カルスから生成され、グルコシノレート混入の減少した天然物がもたらされる。
【００３２】
窒素源：窒素を植物または植物細胞培養物（例えば、カルスまたは懸濁培養物）に供給する化合物。窒素源には、アンモニア（例えば、硝酸アンモニアまたは硫酸アンモニア）および硝酸（例えば、硝酸アンモニア、硝酸カリウムまたは硝酸カルシウム）が含まれる。窒素源を欠如した増殖培地は、添加した窒素源、例えば、アンモニアまたは硝酸の形態で添加した窒素を含まない培地、例えば、アンモニアおよび／または硝酸を約１００μＭ未満（例えば、アンモニアおよび／または硝酸を約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満）含有する培地、または例えば質量分析によって検出可能なレベルのアンモニアおよび／または硝酸を含有しない培地である。
【００３３】
ｐＨ：溶液の酸性またはアルカリ性の測定値。ｐＨ７未満の２５℃の水性溶液は酸性であり、一方、ｐＨ７を上回る溶液は塩基性（アルカリ性）と考えられる。一例では、酸性ｐＨは５未満、例えば、１と３の間である。
【００３４】
植物細胞：未分化型組織（例えば、カルス）ならびに植物の種、花粉、栄養繁殖体および胚由来の細胞を含む植物から得られた任意の細胞。植物細胞は、任意の植物器官または組織およびそれらから調製した培養物から得ることができる。
【００３５】
植物部分：限定はしないが、種、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、苗条、茎、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む任意の植物器官または組織。
【００３６】
赤キャベツ：赤キャベツ（例えば、アカキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ ｆ．ｒｕｂｒａ））は、調製後赤クラウト（Ｒｅｄ Ｋｒａｕｔ）または青クラウト（Ｂｌｕｅ Ｋｒａｕｔ）（例えば、調理後青色を形成する）としても知られるキャベツの変種である。一例では、赤キャベツは栽培品種ルビーボールである。
【００３７】
減少した：数、量、レベル、濃度または強度が少ないことまたは小さいこと。一例では、（例えば、植物カルスによる）グルコシノレート生成の減少は、対照植物カルスと比較したグルコシノレートの量（例えば、グルコシノレートの濃度、またはアントシアニンに対するグルコシノレートの比）の減少である。別の例では、グルコシノレート混入の減少は、対照調製物と比較した調製物中のグルコシノレートの量（例えば、グルコシノレートの濃度、またはグルコシノレートに対するアントシアニンの比）の減少である。
【００３８】
懸濁培養：生物体から分離された細胞の増殖。これは一般的に、液体培地（「懸濁培地」）を使用することによって促進される。懸濁培養は、液体栄養培地における細胞の増殖を意味することができる。
【００３９】
組織培養：組織培養は通常、固体栄養培地上における細胞および組織の培養を意味する。
【００４０】
特に説明しない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、本発明の属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。単数用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示しない限り、複数の参照物を含む。同様に、「または」という語は、文脈で明確に指示しない限り、「および」を含むものとする。「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」はＡまたはＢまたはＡおよびＢを包含することを意味する。
【００４１】
核酸またはポリペプチドまたはその他の分子について与えられた塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさおよび全分子量または分子質量値は近似値であり、特に指示しない限り、便宜的に挙げられているものとさらに理解されたい。本明細書で記載したのと類似、または同等の方法、および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及した出版物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は全て、全体を参考として組み込む。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が基準となる。さらに、材料、方法および実施例は、例示のために過ぎず、制限するものではない。
【００４２】
特に記載した場合を除いて、本開示の方法および技術は一般的に、当業界で周知の従来の方法にしたがって、本明細書全体で引用し、検討した様々な一般的な、およびより具体的な参考文献で記載されたように実施する。例えば、いずれも本明細書に全体を参考として組み込んだ非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと。
ＩＶ．グルコシノレートの減少した天然物の生成方法
グルコシノレート混入の減少した天然物、例えばアブラナ科天然物（例えば、アブラナ属天然物、例えば、アントシアニン）の生成方法を本明細書で開示する。一実施形態では、これらの方法は、アブラナ科植物カルスなどの植物カルス（例えば、アブラナ属植物カルス、例えばブラッシカ オレラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａｅ）植物カルス）を培養するステップと、グルコシノレート生成の減少した植物カルスを選択するステップと、選択したカルスを懸濁培地中で培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、細胞培養物からグルコシノレート混入の減少した天然物を回収するステップとを含む。特定の例では、グルコシノレート混入の少ない天然物はアントシアニン（例えば、赤キャベツアントシアニン）である。
【００４３】
アブラナ科植物。本明細書で開示した方法は、グルコシノレート生成植物、例えば、アブラナ科の植物からグルコシノレート混入の減少した天然物を生成するために使用することができる。
【００４４】
アブラナ科の植物には、アビシニアガラシ（アビシニアガラシまたはアビシニアンキャベツ）、Ｂ．エロンガタ（エロンゲーテッドマスタード）、Ｂ．フルティクロサ（地中海キャベツ）、カラシナ（例えば、カラシナ、セイヨウカラシナおよびタカナ、サレプタマスタード）、セイヨウアブラナ（例えば、ナタネ、セイヨウアブラナ、カブハボタン）、マスタード（黒ガラシ）、Ｂ．オレラセア（例えば、ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、Ｂ．ラパ（Ｂ．カンペストリスと同義）（例えば、ハクサイ、カブ、ラピニ）およびＢ．ルペストリス（セイヨウカラシナ）が含まれるがそれらだけに限らない。特定の例では、開示した方法で使用できる植物には、アカキャベツ（赤キャベツ）、例えば、栽培品種ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロが含まれる。
【００４５】
開示した方法で使用できるアブラナ科の植物にはまた、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）の植物、例えば、Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ（栽培されているダイコン）およびセイヨウワサビ属の植物、例えば、セイヨウワサビ（Ａｒｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）（ホースラディッシュ（Ｃｏｃｈｌｅａｒｉａ ａｒｍｏｒａｃｉａ）（ホースラディッシュ）と同義）が含まれる。開示した方法で使用できるアブラナ科の他の植物には、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アリッサム属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、ワサビ属（Ｗａｓａｂｉａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）およびマメグンバイナズナ属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）を含むがそれらだけに限定しないアブラナ科のその他の属の植物が含まれる。
【００４６】
グルコシノレートの減少した天然物を生成するために使用する培養条件。一例では、グルコシノレートの減少した天然物を生成するために、植物カルスおよび／または懸濁培養を使用する。植物カルスは、周知技術を使用して適切な植物から得ることができる。植物組織は、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片を含む様々な原料由来であってもよい。カルスは、適切な栄養培地中におけるインビトロ培養によって所望する天然物（例えば、アントシアニン）を生成することができる植物の組織外植片から誘導され得る。例えば、カルスの形成の誘導ステップで使用した栄養培地（「誘導培地」）には、固形培地が含まれる。植物細胞培養、例えば、カルス形成の誘導に適した栄養培地は当業者には周知である。特定の例では、カルス誘導培地には、ムラシゲおよびスクーグ（ＭＳ）塩（例えば、カタログ番号５２４、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）およびＭＳビタミン（例えば、カタログ番号５３３、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）が含まれる。例えば、非特許文献７参照。
【００４７】
一例では、カルス形成は、様々な濃度のホルモン（例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）またはアルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ））を含有する誘導培地上で培養することによって誘導する。この誘導培地は、２，４−Ｄ約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ約０〜４ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌまたは４ｍｇ／Ｌ）、ＢＡ約０〜０．１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌまたは０．１ｍｇ／Ｌ）、またはそれらの１種または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。特定の例では、カルス形成は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸約２ｍｇ／Ｌ、６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含む固形誘導培地上で培養することによって誘導する。得られたカルスによるグルコシノレート生成を測定し、グルコシノレート生成の減少したカルスを選択することができる。
【００４８】
いくつかの例では、グルコシノレート生成の減少は、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、およびＢＡの１種、または複数を含有する誘導培地上で増殖したカルスによって生成したグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）の量を対照（例えば、２，４−Ｄ、ＮＡＡ、および／またはＢＡを欠如した誘導培地で誘導したカルス、またはカルスを得た植物の実生）と比較することよって決定する。減少したグルコシノレート生成には、対照（例えば、２，４−Ｄ、ＮＡＡおよび／またはＢＡを欠如した誘導培地で誘導したカルス、またはカルスを得た植物の実生）と比較して少なくとも約１０％減少（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％も減少）が含まれる。その他の例では、減少したグルコシノレート生成には、低量のグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）、例えば、約５μｇ／ｇＦＣＷ未満、例えば、約０．０１μｇ／ｇＦＣＷから約５μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約２．５μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約１μｇ／ｇＦＣＷ、約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約０．７５μｇ／ｇＦＣＷまたは約０．０５μｇ／ｇＦＣＷから約０．５μｇ／ｇＦＣＷの全グルコシノレート）が含まれる。
【００４９】
グルコシノレートの減少した天然物を生成する植物のカルスおよび懸濁培養物は、当技術分野において公知のプロトコールによって確立することができる。プロトコールの代表例は、以下の実施例に挙げる。簡単に説明すると、以下の詳細は当業者によって改変させることができるが、代表的な方法において、グルコシノレートの減少した所望する天然物を生成する細胞培養の開始は、安定した連続継代性組織培養からカルス、および懸濁培養物を作製することによって実現する。
【００５０】
カルスおよび懸濁培養物は、自然に、または自発的に所望する天然物を生成してもよい。しかし、時として、宿主植物は天然物を生成するが、カルス、および／または懸濁培養物は天然物を生成しなくてもよく、または宿主植物よりも低レベルで天然物を生成してもよい。天然物の生成を誘導、または増加させる方法は、当業者には公知である。例えば、培養は、光照射、特にアントシアニン生合成の誘発因子である紫外線（ＵＶ）−Ｂ光を使用してアントシアニンを生成するように誘導することができる（例えば、非特許文献８参照）。さらに、以下に記載したように、アントシアニン生成は、適切な培地、例えば、窒素源を欠如した培地中における培養物の増殖によって増加させることができる。
【００５１】
懸濁培養物は、（以下の実施例で記載したように）カルス培養物から作出し、新鮮な懸濁培地中で維持することができる。植物細胞懸濁培養に適した栄養培地は、当業者には周知である。特定の例では、植物細胞懸濁培地には、ムラシゲおよびスクーグ（ＭＳ）塩（例えば、カタログ番号Ｍ５２４、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）およびニッチおよびニッチビタミン（例えば、カタログ番号Ｎ６０８、Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）が含まれる。例えば、非特許文献９参照。懸濁培養物は、定期的な計画で、一般的に、７〜１４日間隔で、パック細胞容積（ＰＣＶ）として表現される既知の細胞量を、新鮮な培地に無菌的に移すことによって確立することができる。
【００５２】
懸濁培養のための培地（「懸濁培地」）は、懸濁培養の開始、または所望する特性（例えば、細胞構造または天然物の生成）のために至適化することができる。いくつかの例では、ホルモン（例えば、２，４−Ｄ、ジカンバ、ＮＡＡ、６−γ−γ−ジメチルアリル−アミノプリン（２ｉＰ）、ピクロラム、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ジベレリン酸（ＧＡ）またはカイネチン）の濃度は、個々に、または組み合わせて変化させることができる。特定の例では、この懸濁培地は、２，４−Ｄ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０約０ｍｇ／Ｌ、０．００５ｍｇ／ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌ、または０．１ｍｇ／Ｌ）、ジカンバ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ）、ＧＡ約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、または１ｍｇ／Ｌ）、ＩＡＡ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、または２ｍｇ／Ｌ）、カイネチン約０〜１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌまたは１ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌまたは２ｍｇ／Ｌ）、ピクロラム約０〜２ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌまたは２ｍｇ／Ｌ）、ＢＡ約０〜０．１ｍｇ／Ｌ（例えば、約０ｍｇ／Ｌ、０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０２５ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌまたは０．１ｍｇ／Ｌ）、またはそれらの１種、または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。特定の例では、懸濁培地は２，４−Ｄ約１．５ｍｇ／Ｌを含む。
【００５３】
グルコシノレート生成の測定方法。グルコシノレートの測定方法、または定量方法は、当業者には周知である。一例では、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは特定のグルコシノレート）は、質量分析、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）技術によって測定する。植物、植物カルス、または植物細胞培養物（例えば、グルコシノレート生成の減少した植物カルス）の抽出物（例えば、水性抽出物）は、ＬＣ−ＭＳによって評価する。グルコシノレートは、分子量、および滞留時間に基づいて検出する。定量は、グルコシノレート（例えば、シニグリン）の既知の濃度を使用した外部検量線をベースにすることができる。例えば、非特許文献１０、１１、１２参照。
【００５４】
別の例では、グルコシノレート（例えば、全グルコシノレートまたは特定のグルコシノレート）は、酵素ミロシナーゼでグルコシノレートを加水分解し、遊離するグルコースの量を定量することによって測定する。例えば、非特許文献１３参照。
Ｖ．グルコシノレートの減少したキャベツアントシアニンの生成方法
本明細書では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンの生成方法を開示する。一例では、グルコシノレート混入の減少したキャベツアントシアニンは、第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、第２の懸濁培地中において懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップによって生成する。いくつかの例では、第２の懸濁培地は窒素源が欠如している（例えば、添加した窒素源、例えば、外来性アンモニア、または硝酸の形態で添加された窒素を有さない）。他の例では、第２の懸濁培地は、糖を約３〜１０％（例えば、スクロースを約３〜１０％、例えば、スクロースを約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％）含む。
【００５５】
グルコシノレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスの生成は、以下に説明したように実施する。いくつかの例では、キャベツアントシアニンのグルコシノレート混入の減少は、赤キャベツ植物カルス、または懸濁培養物から調製したアントシアニン中のグルコシノレート（例えば、全グルコシノレート、または１種、または複数の特定のグルコシノレート）の量を対照（例えば、グルコシノレートの減少したカルスを得た植物の植物カルスまたは懸濁培養物から調製したアントシアニン）と比較することよって決定する。グルコシノレート混入の減少には、対照（例えば、グルコシノレートの減少したカルスを得た植物の植物カルスまたは懸濁培養物から調製したアントシアニン）と比較して少なくとも約１０％減少（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％も減少）が含まれる。その他の例では、グルコシノレート混入の減少は、アントシアニン調製物中のグルコシノレート約１００ｍｇ／Ｌ未満（例えば、約１００ｍｇ／Ｌ未満、約７５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌまたは約０．１ｍｇ／Ｌも）と決定する。他の例では、グルコシノレート混入の減少には、グルコシノレートに対するアントシアニンの比が少なくとも約４０：１（例えば、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約８０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１またはそれ以上）が含まれる。
【００５６】
アントシアニン生成の増加のために使用する培養条件。懸濁培養用培地は、アントシアニン生成のために至適化することができる。いくつかの例では、窒素源（例えば、硝酸アンモニウム、および／または硫酸アンモニウム）の量、または炭素源（例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトール）もしくはその他の成分（例えば、カゼインまたはリン酸）の量、もしくは種類は、個々に、または組み合わせて変化させることができる。特定の例では、懸濁培地は、窒素源０〜８０ｍＭ（例えば、アンモニアおよび／または硝酸約０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは８０ｍＭ）、グルコース、フルクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトール約３〜１０％（例えば、約３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％）、カゼイン０．５〜１０ｇ／Ｌ（例えば、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌ）またはそれらの１種、または複数の様々な組み合わせを含有してもよい。一例では、懸濁培地はスクロース約４％を含有する（例えば、培地ＢＯ１０９２３）。その他の例では、懸濁培地は、減少したリン酸を含有してもよく、またはリン酸を欠如してもよい（例えば、添加したリン酸を含まない培地、例えば、リン酸を約１０μＭ未満（例えばリン酸約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満）含有する培地、または、例えば質量分析によって検出可能なレベルのリン酸を含有しない培地）。特定の例では、懸濁培地は、スクロース約８％を含有し、窒素源を欠如する培地（例えば、培地ＢＯ１２２４）またはスクロース約８％を含有し、窒素源および添加したリン酸の両方を欠如する培地（例えば、培地ＢＯ１８５１）である。いくつかの例では、懸濁培地はまた、２，４−Ｄ（例えば、２，４−Ｄ約１〜２ｍｇ／Ｌ、例えば、２，４−Ｄ約１．５ｍｇ／Ｌ）を含む。得られた細胞培養物によるアントシアニン生成を測定し、アントシアニン生成の増加した、または至適化した培養条件を選択することができる。
【００５７】
アントシアニン色素の回収。アントシアニンは、本明細書で記載した方法によって調製した細胞培養物から、任意のその他のアントシアニンの抽出について当業界で公知の方法と類似の方法で回収または抽出する。例えば、代表的な実施形態では、細胞をホモジナイズし、酸性水（硫酸０．１％、ｐＨ３）で抽出する。抽出に使用される溶媒の変更には、エタノール、またはメタノールの添加（５０％ｖ／ｖまで）および溶媒を酸性化するための（硫酸の代わりの）酢酸、またはその他の食用グレードの酸の使用が含まれる。細胞は、保存が必要な場合、ホモジナイズ前に冷凍することができる。例えば、細胞は液体窒素中で冷凍し、−８０℃で保存することができる。
【００５８】
一例では、細胞懸濁培養物は、使用した培地を除去する前にホモジナイズし、得られたホモジネートを濾過する。ホモジナイズし濾過した細胞集団をその後溶媒で抽出して、アントシアニンを取り出す。他の例では、細胞培養物を濾過して使用済培地を除去し、残存する細胞集団に溶媒を添加し、その後細胞を溶媒存在下でホモジナイズする。他の例では、使用済培地を傾瀉し、残存する細胞集団に溶媒を添加し、細胞をホモジナイズしてアントシアニンを抽出する。前述の例の全てにおいて、溶媒によるアントシアニン抽出は数回反復して、細胞集団から可能な限り多くのアントシアニンを抽出することができる。
【００５９】
アントシアニン生成の測定方法。調製物中のアントシアニン量、または質量の測定方法は、当業者には公知である。調製物（例えば、細胞培養物の抽出物）のアントシアニン含量は、５２０ｎｍでの吸光度を測定し、ベールの法則（Ａ520nm×１０００×シアニジングルコシドのＭＷ）/（吸光係数）を使用してアントシアニン含量を算出することができる。
【００６０】
調製物中に見出されたアントシアニンの量、および種類は、ＬＣ−ＭＳ、およびＵＶ吸光度によって決定することができる。いくつかの例では、調製物はＬＣ−ＭＳ分析を行う。試料を５２０ｎｍでモニターする。その後、未知の抽出物の全アントシアニン濃度は、５２０ｎｍでのピーク領域を積算し、標準曲線と比較することによってシアニジン−３，５−ジグルコシド当量として表すことができる。
【００６１】
アントシアニン調製物の使用。アントシアニンは、清涼飲料、飲料、およびヨーグルトなどの多くの食品において天然の着色添加物として幅広く使用されている。しかし、従来通り生成されたアントシアニン、例えば、赤キャベツなどの植物からの抽出物は、調製物中にグルコシノレートが存在する結果として所望しない臭いおよび／または味を有することが多い。したがって、本明細書で記載した方法によって、通例の調製物の所望しない臭いおよび／または味を欠如した、グルコシノレート混入の減少したアントシアニンを生成することができる。開示した方法によって生成したアントシアニンは、従来通り調製したアントシアニンの代わりに、任意の食物、飲料、薬剤、化粧品またはその他の調製物で使用することができる。
【００６２】
以下の実施例は、ある特定の特性および／または実施形態を例示するために挙げる。これらの実施例は、記載した特定の特性または実施形態に本開示を限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
グルコシノレート低生成赤キャベツ細胞株の選択
この実施例は、低量のグルコシノレートを生成するか、またはグルコシノレートを生成しない赤キャベツ細胞株の選択について説明する。
【００６４】
赤キャベツ（ブラッシカ オレラセア）の７種類の異なる栽培品種、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロ、およびカイロの種３０個それぞれを５０ｍＬチューブに入れ、漂白溶液１００ｍＬ当たりＴｗｅｅｎ−２０を１滴含有する２５％漂白液３０〜４０ｍＬを試験管に添加した。チューブをＬａｂＱｕａｋｅ（登録商標）振盪機（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で１５分間振盪した。種および漂白液を滅菌した茶漉し器に注いだ。次に、種を滅菌水で３回濯ぎ、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／Ｌ、およびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２０ｇ／Ｌを含むＭＳ塩をベースにした発芽培地（ＢＯ２５４、表１）に播種した。３週間後、発芽した実生は小刀で３つの部分（子葉、胚軸、および根）に切断し、種々の濃度のホルモン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、アルファ−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡ）を含むＭＳ塩、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．０ｇ／Ｌをベースにしたカルス誘導培地（培地ＢＯ２７８、ＢＯ２７９、ＢＯ２８０、ＢＯ２８１、ＢＯ２８２、ＢＯ２８３、表１）上に滅菌ピンセットで移した。２〜３週間後、カルスはうまく誘導され、最終的にいくつかの継代培養物の増殖速度が良好であった。良好に増殖するカルスを、ＮＡＡ２．０ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ、ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．０ｇ／Ｌを有するＭＳ培地（ＢＯ２８３、表１）に移した。
【００６５】
【表１】
【００６６】
７種類の様々な栽培品種の茎および葉柄由来のカルスの全グルコシノレートレベルは、液体クロマトグラフィー−質量分析を使用して評価した（図１）。抽出物は、新鮮なカルスまたは懸濁細胞約０．５ｍＬおよびＨ2ＳＯ4０．０５％を含む５０％（ｖ／ｖ）エタノール１．０ｍＬから調製した。細胞は微量遠心管（２．０ｍＬ）に収集し、ビーズミルホモジナイザ−で２分間ホモジナイズした。ホモジェネートを臨床用遠心器で４０００ｒｐｍで４分間遠心した。試料１０μｌをＬＣ−ＭＳ分析器に注入した。ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８ １０×２．１ｍｍガードカラムを備えたＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８カラム（１００×２．１ｍｍ、内径３．５μｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用した。ＬＣ分析は、ＣＴＣ分析ＰＡＬオートサンプラー（Ｌｅａｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｂｏｒｏ、ＮＣ、ＵＳＡ）、６００Ｓ制御装置を具備したＷａｔｅｒｓ ６２６ポンプおよび１９０から７８０ｎｍを０〜２７分で走査するＷａｔｅｒｓ９９６光ダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）を備えたＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して実施した。勾配溶出は、水−ギ酸０．１％（溶媒Ａ）およびアセトニトリル−ギ酸０．１％（溶媒Ｂ）を０．３ｍＬ分-1の一定流速で実施した。溶媒Ｂの以下の比（ｖ／ｖ）の直線勾配プロファイルを適用した（ｔ（分）、％Ｂ）：（０、８）、（１５、４５）、（１５．１、１００）、（２５、１００）、（２５．１、８）、（３５、８）。Ｗａｔｅｒｓ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｍｉｃｒｏ３連４重極質量検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）を同時に使用してＭＳデータを得た。質量分析条件は、ＥＳネガティブモード、キャピラリー電圧２．９５ｋＶ、コーン電圧１５Ｖ、イオン源温度１１５℃、脱溶媒和温度２２５℃、コーンガス流量０Ｌ／時間、脱溶媒和ガス流量６００Ｌ／時間、イオンエネルギー１、エントランス５０、コリジョン２、エグジット５０。
【００６７】
グルコシノレート検出は、１５０〜１０００ｍ／ｚのＥＳネガティブモードスキャンを使用した分子量に基づいた。定量は、シニグリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１５．６２５μｇ／ｍＬ、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬおよび２５０μｇ／ｍＬを使用した外部検量線をベースにした。化合物は、分子量およびＥＳネガティブモードスキャンの滞留時間をベースにして検出した。抽出物中の各グルコシノレート化合物の検出および定量は、分子量および滞留時間情報をベースにした（表２）。グルコブラシキン(glucobrassicin)、ネオグルコブラシキン(neoglucobrassicin)、４−メトキシグルコブラシキン(4-methoxyglucobrassicin)および４−ヒドロキシグルコブラシキン(4-hydroxyglucobrassicin)を含む４種類のグルコシノレート化合物を検出したところ、栽培品種のグルコシノレート含量は変動が著しかった。
【００６８】
【表２】
【００６９】
グルコシノレート含量が低いか、またはグルコシノレートを含有しない赤キャベツ変種全てのカルスを同定した。全グルコシノレート濃度は、対応する変種の実生の１５０〜３００μｇ／ｇ新鮮細胞重量（ＦＣＷ）と比較して、平均して０．０６〜７６．５４μｇ／ｇＦＣＷの間であった。ルビーボールのカルス（ＦＣＷ１グラム当たりグルコシノレート０．０６〜０．５μｇ）は格別に低いレベルを示した。したがって、ルビーボールのカルスは、グルコシノレート低生成細胞株として選択し、一貫して低いレベルのグルコシノレート生成を示した。ルビーボールキャベツから得られた９種の独立したカルスを選択し、ＭＸ７９７−１からＭＸ７９７−１９と指定した。
【００７０】
（実施例２）
キャベツ細胞の懸濁培養およびアントシアニンの生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成の至適化におけるキャベツ細胞懸濁培養物増殖のための培地の選択について説明する。
【００７１】
発色した砕けやすい細胞のみを収集するために、実施例１で記載したＢＯ２８３プレート上で増殖するルビーボールの健常なカルス（細胞株、ＭＸ７９７−５、−６、−８、−９、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５および−１７）を、ＮＮビタミン、スクロース３０ｇ／ＬおよびＰｈｙｔａｇｅｌ（商標）２．５μｇ／Ｌおよび２，４−Ｄ１．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ塩をベースにした改変培地（ＢＯ１１６８、表３）に移した。培地のｐＨは、圧力１．０４ｋｇ／ｃｍ2（１２１℃）で２５分間オートクレーブする前に５．８に調節した。ＢＯ１１６８培地上に再度播種した赤キャベツカルスは、良好な増殖および発色を示した。細胞構造もより砕けやすくなり、懸濁培養の作製および増殖に適合した。４週間毎にカルスを同培地に継代培養し、暗紫色の砕けやすいカルスのみを各継代時に新鮮な培地に移した。
【００７２】
【表３】
【００７３】
固形プレート上で２回継代した後、ＮＮビタミン、スクロース３０ｇ／Ｌおよび２，４−Ｄ１．５ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地（ＤＣ１１５１、表３）中で懸濁培養作製を再度開始した。懸濁した細胞は、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ（三角コルベン）内で新鮮なＤＣ１１５１培地（摂取量＝２５％ＰＣＶ（パック細胞容積））３０ｍＬに継代することによって維持した。培地のｐＨは、オートクレーブする前に５．４に調節した。培養物は、６０μＭ／ｍ2／秒で、白色蛍光灯（明期１６時間／日）の下で２３℃で１１５ｒｐｍでインキュベートした。
【００７４】
６日目に、全フラスコから試料を採取し、アントシアニン生成をＵＶ吸光法によって測定した。簡単に説明すると、アントシアニンは、新鮮なカルスまたは懸濁細胞約０．５ｍＬからＨ2ＳＯ4０．０５％を含む５０％（ｖ／ｖ）エタノール１．０ｍＬで抽出した。細胞は微量遠心管（２．０ｍＬ）に収集し、ビーズミルホモジナイザ−で２分間ホモジナイズした。ホモジェネートを臨床用遠心器で４０００ｒｐｍで４分間遠心した。この抽出物をｐＨ３．０緩衝溶液で５回希釈し、５２０ｎｍの吸光度を調べた。アントシアニン含量は、ベールの法則（Ａ５２０ｎｍ×１０００×シアニジングルコシドのＭＷ）／（吸光係数）を使用して算出した。生産性を至適化し、規模を拡大するために、均一に発色した良好な懸濁物を実現するために、さらなる細胞選択工程においてすぐれた増殖特性によって、この時点で細胞株ＭＸ７９７−１２を選択した。
【００７５】
７日目にアントシアニン高生成細胞を含有するフラスコを選択し、細胞１０ｍＬＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地３０ｍＬに移し、播種密度２５％（ｖ／ｖ）の培養物４０ｍＬを作製した。選択的に継代して９ヵ月後、高生産系を定期的に選択する工程によって１２５ｍＬフラスコ規模でアントシアニン生成の著しい改善が得られ、その生成には再現性があった。その後、１２５ｍＬフラスコにおける細胞培養を２５０ｍＬフラスコ規模に拡大した。２５０ｍＬフラスコ規模では、細胞の２０ｍＬＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地６０ｍＬに移し、培養物８０ｍＬ（２５％（ｖ／ｖ）播取密度）を作製した。細胞増殖およびアントシアニン生成は、２つの異なる容器容量でかなり類似したパターンを示した。継続的な細胞選択工程は、維持培養におけるアントシアニン生成増加を支え、ＭＸ７９７−１２細胞株によって生成されるアントシアニンの全量は、１２ヵ月の細胞選択工程によって最大約１３．６倍（８１．９±７．９ｍｇ／Ｌ ＰＣＶから１１１９．０±２４．６ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）に増加した（図２）。倍加時間によって測定すると、ＭＸ７９７−１２細胞株の０日と７日との間の最大増殖は、４．８日であった（図３）。
【００７６】
細胞増殖およびアントシアニン生成をさらに高めるために、維持培地の糖濃度を増加させるように改変した。こうして、スクロース濃度を４％（４０ｇ／Ｌ培地）に増加させた、ＤＣ１１５１とは異なる培地ＢＯ１９２３を開発した（表３）。この変更によって、ＢＯ１９２３で増殖させて８ヵ月後に、平均して２．３倍（１１１９．０±２４．６ｍｇ／Ｌ ＰＣＶから２６１２．５±５１３．２ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）のアントシアニン生成増加がもたらされた。
【００７７】
窒素源の除去の効果を評価するために、全窒素源をＢＯ１１５５から除去し、培地ＢＯ１２２４（表３）を作製した。培養７日後の消費済培地をＢＯ１２２４に置換した。この培地によって、アントシアニン生成がＰＣＶ約２０６０ｍｇ／Ｌまで上昇することが示され、窒素源除去によって高濃度のスクロースによるアントシアニン生成が改善されることが示唆された。
【００７８】
（実施例３）
スクロースを使用したキャベツ懸濁細胞におけるアントシアニン生成の至適化
この実施例は、アントシアニン生成に対するスクロース初期濃度およびスクロース補充添加の効果について説明する。
【００７９】
ＭＸ７９７−１２の懸濁培養におけるアントシアニンの生産性をスクロース添加後モニターした。７日後の細胞培養物２０ｍＬを、スクロース初期濃度としてスクロース３％、４％、５％または６％（ｗ／ｖ）を含むＤＣ１１５１培地６０ｍＬを含有する２５０ｍＬフラスコに接種し、細胞をさらに７日間増殖させ、実施例２で記載したのと同じ増殖条件でインキュベートした。その後、滅菌したスクロース５０％（ｗ／ｖ）の保存溶液を使用して、適量を各培養物に添加して屈折率（ＲＩ）を５％に調節し、２日後にアントシアニン生産性を処理間で比較した。スクロース６％で開始したフラスコは、９日後にアントシアニンを１４０８．７±１１６．５ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ生成し、これはスクロース３％で開始した細胞の生産性よりもほぼ２倍高かった（表４）。スクロース初期濃度は、７日間通常維持した培養のアントシアニン生成ならびに７日後のスクロース追加による生成増加に影響を及ぼした。
【００８０】
【表４】
【００８１】
（実施例４）
生成培地開発におけるリン酸の効果
この実施例は、アントシアニン生成に対するリン酸除去の効果を記載する。
【００８２】
生成培地中におけるアントシアニン生成を増加させるために、ＢＯ１２２４からリン酸を除去して生成培地ＢＯ１８５１を調製した（表３）。最初の７日間の培養のためにＭＸ７９７−１２細胞の２０ｍＬ ＰＣＶを新鮮なＤＣ１１５１培地６０ｍＬに播種し、実施例２に記載したように播種した。７日目に、培地交換の前にＰＣＶおよびＲＩを測定したところ、それぞれ５９．３±１．４％および０．５４±０．０５％であった。７日後の懸濁物の使用済培地を、ＰＣＶを変化させずにＢＯ１８５１と置換し、さらに７日間インキュベートした。アントシアニンの生成は、ＢＯ１２２４培地を含有する対照フラスコと比較した。ＢＯ１８５１で生成されたアントシアニンの量（１３６９．５±４６０ｍｇ／Ｌ ＰＣＶ）は、対照より２．２倍高かった（表５）。
【００８３】
【表５】
【００８４】
本開示は、特定の実施形態を強調して記載しているが、特定の実施形態の変更を使用することができ、本開示は本明細書で具体的に記載したものとは別の方法で実施できるものであることは当業者には明らかであろう。したがって、本開示には、以下の特許請求の範囲に記載した本開示の精神および範囲内に包含される変更が全て含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物調製物を生成する方法であって、
アブラナ属植物カルスを培養するステップと、
グルコシノレート生成の減少したアブラナ属植物カルスを選択するステップと、
選択した前記カルスを懸濁培地で培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、
前記懸濁細胞培養物からアブラナ属天然物を回収するステップと
を含むことを特徴とし、
それによってグルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物調製物を生成する方法。
【請求項２】
前記アブラナ属植物カルスの培養は、誘導培地中におけるインビトロ培養によってグルコシノレートの減少した植物カルスの形成を誘導することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸２ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁培地は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記懸濁培地は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１．５ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁培地はスクロース約３％から６％（重量／体積）をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記懸濁培地は窒素源を欠如し、添加したリン酸を含まないことを特徴とする請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
グルコシノレート生成の減少した前記アブラナ属植物カルスは、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約５μｇ未満を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコシノレート生成の減少した前記アブラナ属植物カルスは、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約０．０６μｇから約５μｇを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アブラナ属植物カルスは、アカキャベツ植物カルスであることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アカキャベツ植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロ栽培品種から得られることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グルコシノレート混入の減少した前記アブラナ属天然物調製物は、アントシアニンを含むことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カルスは、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片から得られることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載された方法によって生成されたグルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物の調製物。
【請求項１６】
キャベツアントシアニンにおけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンの生成方法であって、
第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養し、懸濁細胞培養物を得るステップと、
窒素源の欠如した第２の懸濁培地中において前記懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、
前記細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
グルコシノレート生成の減少した前記赤キャベツ植物のカルスの培養は、誘導培地中におけるインビトロ培養によってグルコシノレートの減少した前記植物カルスの形成を誘導することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸約２ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の懸濁培地は、スクロース約３％から８％（重量／体積）を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の懸濁培地は、添加したリン酸を含有しないことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
グルコシノレートが減少した前記赤キャベツ植物カルスは、グルコシノレートが減少したアカキャベツ植物カルスを含むことを特徴とする請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アカキャベツ植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
キャベツアントシアニンにおけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンの生成方法であって、
第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養し懸濁細胞培養物を得るステップと、
初期スクロース濃度がスクロース約３〜８％（ｗ／ｖ）である第２の懸濁培地中において前記懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、
前記細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記第２の懸濁培地は、スクロース約６％（ｗ／ｖ）の初期スクロース濃度を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
グルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物調製物を生成する方法であって、
アブラナ属植物カルスを培養するステップと、
グルコシノレート生成の減少したアブラナ属植物カルスを選択するステップと、
選択した前記カルスを懸濁培地で培養して懸濁細胞培養物を得るステップと、
前記懸濁細胞培養物からアブラナ属天然物を回収するステップと
を含むことを特徴とし、
それによってグルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物調製物を生成する方法。
【請求項２】
前記アブラナ属植物カルスの培養は、誘導培地中におけるインビトロ培養によってグルコシノレートの減少した植物カルスの形成を誘導することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸２ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁培地は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記懸濁培地は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１．５ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁培地はスクロース約３％から６％（重量／体積）をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記懸濁培地は窒素源を欠如し、添加したリン酸を含まないことを特徴とする請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
グルコシノレート生成の減少した前記アブラナ属植物カルスは、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約５μｇ未満を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコシノレート生成の減少した前記アブラナ属植物カルスは、新鮮細胞重量１グラム当たり全グルコシノレート約０．０６μｇから約５μｇを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アブラナ属植物カルスは、アカキャベツ植物カルスであることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アカキャベツ植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロ栽培品種から得られることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
グルコシノレート混入の減少した前記アブラナ属天然物調製物は、アントシアニンを含むことを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カルスは、子葉、根、胚軸、茎頂、茎、葉または表皮剥片から得られることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載された方法によって生成されたグルコシノレート混入の減少したアブラナ属天然物の調製物。
【請求項１６】
キャベツアントシアニンにおけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンの生成方法であって、
第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養し、懸濁細胞培養物を得るステップと、
窒素源の欠如した第２の懸濁培地中において前記懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、
前記細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
グルコシノレート生成の減少した前記赤キャベツ植物のカルスの培養は、誘導培地中におけるインビトロ培養によってグルコシノレートの減少した前記植物カルスの形成を誘導することを含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、アルファ−ナフタレン酢酸および６−ベンジルアミノプリンを含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導培地は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸約１ｍｇ／Ｌ、アルファ−ナフタレン酢酸約２ｍｇ／Ｌおよび６−ベンジルアミノプリン約０．１ｍｇ／Ｌを含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の懸濁培地は、スクロース約３％から８％（重量／体積）を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の懸濁培地は、添加したリン酸を含有しないことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
グルコシノレートが減少した前記赤キャベツ植物カルスは、グルコシノレートが減少したアカキャベツ植物カルスを含むことを特徴とする請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アカキャベツ植物カルスは、ルビーパーフェクション、レッドエーカー、ルビーボール、マンモスレッドロック、バスカロまたはカイロを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
キャベツアントシアニンにおけるグルコシノレート混入が１００ｍｇ／Ｌ未満のキャベツアントシアニンの生成方法であって、
第１の懸濁培地中においてグルコシレート生成の減少した赤キャベツ植物カルスを培養し懸濁細胞培養物を得るステップと、
初期スクロース濃度がスクロース約３〜８％（ｗ／ｖ）である第２の懸濁培地中において前記懸濁細胞培養物を増殖させるステップと、
前記細胞培養物からキャベツアントシアニンを回収するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記第２の懸濁培地は、スクロース約６％（ｗ／ｖ）の初期スクロース濃度を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５１２６６１（Ｐ２０１２−５１２６６１Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２４４９（Ｐ２０１１−５４２４４９）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８５５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０５３０
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５１１１４７２７４）ダイアナプラントサイエンシズ インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６８５５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０５３０
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５１１１４７２７４）ダイアナプラントサイエンシズ インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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