ケト化合物の立体選択的還元に用いる酸化還元酵素
本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元し、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または、（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法に関する。
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または、（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法であり、ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法に関する。さらに本発明は、ケト化合物をキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に還元するときに用いる新規な酸化還元酵素に関する。
【０００２】
光学活性ヒドロキシ化合物は、薬理活性のある化合物、芳香剤、フェロモン、農薬および酵素阻害剤の合成に幅広く応用できる有用なキラル合成子（ｃｈｉｒｏｎ）である。将来、おそらくラセミ化合物は医薬品としてほとんど使われなくなるため、キラル化合物およびキラル合成技術の需要の増加が、とりわけ製薬業界において注目されている。
【０００３】
プロキラルケト化合物の不斉還元は立体選択性触媒の分野であり、その中で生体触媒は、化学触媒に対する強力な競合技術である。化学的な不斉水素付加では、毒性が強く環境に有害である重金属触媒を使用する必要がある。また、大量の有機溶媒だけでなく、過度で、そのためエネルギーを大量消費する反応条件も必要となる。さらには、これらの方法には、副反応が生じ、エナンチオマー過剰率が不十分であるという特徴が頻繁にみられる。
【０００４】
現実には、全ての個体内で、プロキラルケト化合物からヒドロキシ化合物への還元およびその逆の反応が、多くの生化学的経路において、一次代謝および二次代謝のいずれにおいても起こっており、様々なタイプの第二級アルコール脱水素酵素および酸化還元酵素による触媒反応が起こっている。通常、これらの酵素は補因子依存性である。
【０００５】
プロキラルケト化合物をキラルヒドロキシ化合物に還元するために生体触媒を用いる基本的な実行可能性は、モデルシステムに基づきこれまでに繰り返し示されてきており、そこでは、単離した酸化還元酵素および様々な全細胞生体内変換システム（whole-cell biotransformation systems）が研究に用いられている。その結果、反応条件が穏やかであり、副生成物が生成されず、また、ときには極めて優れたエナンチオマー過剰率を達成できる点において、本生体触媒のアプローチは、本質的に利点があることが明らかになっている。
【０００６】
生成物の単離に関してはもとより、達成できるエナンチオマー過剰率、分解産物および副生成物の形成に関しても、単離した酵素を使用する方法は、全細胞系も含めた方法よりも有利である。さらに、全細胞処理を利用するには、特定の設備およびノウハウが必要であるため、必ずしも全ての化学企業に利用可能というわけではない。
【０００７】
近年、有機溶媒を用いた水／有機二相システムにおける単離酸化還元酵素の使用は、効率が極めて高く経済的であり、かつ高濃度（＞５％）でも使用可能であることが、実証できてきている。還元されるケト化合物は、通常は水に難溶であるが、上述したシステムにおいては、還元されるケト化合物は有機溶媒とともに有機相を形成している。また、有機溶媒そのものを、部分的に用いずに済ますことができる。この場合には、有機相は、還元されるケト化合物により形成されている（ＤＥ１０１１９２７４、ＤＥ１０３２７４５４．４、ＤＥ１０３３７４０１．９、ＤＥ１０３００３３５．５）。補酵素の再生は、同時に起こる第２級アルコールの酸化によって達成される。このために、多くの場合には、安価な水混和２−プロパノールが用いられる。
【０００８】
エナンチオ選択性が高く、適したＲ−およびＳ−特異的酸化還元酵素および脱水素酵素の例としては：
カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来のカルボニル還元酵素（ＣＰＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３およびＵＳ５，７６３，２３６（Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15（11）:950-8））およびピキア・カプスラタ（Pichia capsulata）のカルボニル還元酵素（ＤＥ１０３２７４５４．４）。ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のカルボニル還元酵素（ＲＥＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３）、ノルカルディア・フスカ（Norcardia fusca）のカルボニル還元酵素（Biosci. Biotechnol. Biochem.,63（10） （1999）, pp.1721-1729）、（Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62（4）: 380-6. Epub 2003 Apr 26）、およびロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）のカルボニル還元酵素（J Org Chem. 2003 Jan 24;68（2）:402-6.）。
【０００９】
ラクトバシルス属（ラクトバシルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）（ＵＳ５２００３３５）、ラクトバシルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（ＤＥ１９６１０９８４Ａ１）（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec;56 Pt 12:1696-8）、ラクトバシルス・ミノール（Lactobacillus minor）（ＤＥ１０１１９２７４）、またはシュードモナス（Pseudomonas）（ＵＳ０５３８５８３３）（Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug;59（4-5）:483-7. Epub 2002 Jun 26.,J. Org. Chem. 1992, 57, 1532））由来のＲ−特異的第２級アルコール脱水素酵素。
【００１０】
しかしながら、現在知られている酵素では、ケト化合物の立体選択的還元に関する市場のポテンシャル全体を生かすには到底十分ではない。一方、このことは、各酵素が、温度安定性および溶媒安定性はもとより、基質範囲、至適ｐＨ条件について、大きな性質の違いがあるという事実により説明できる。これらの違いはしばしば、各酵素がお互いに補完している。そのため、比較的に類似した相同な酵素であっても、ある特定の基質について全く異なる変換様式を示すことがある。一方、記載されているほとんど全ての酵素がクローン化されておらず、十分な量まで大量発現させられるものではない。このことは、これらの酵素が産業利用できるものではないことを意味している。酵素による不斉水素付加の合成ポテンシャルを可能な限り広範囲に生かすために、可能な限り幅広く異なる産業に利用し得る酸化還元酵素であり、有機溶媒を含む水／有機二相システムにおける使用に適している酸化還元酵素の製品ラインを保有していることが必須である。
【００１１】
本発明の内容は、ケト化合物を対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法に加えて、大腸菌（Escherichia coli）（＞５００ｕｎｉｔｓ／ｇ Ｅ．ｃｏｌｉウェットバイオマス）において優れた発現性を有していることはもとより、水／有機二相システムにおいて安定性に優れていることを特徴とする、複数の新規な、エナンチオ選択的Ｒ−およびＳ−特異的酸化還元酵素である。
【００１２】
本発明に係る酸化還元酵素は、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、からなることを特徴としている。
【００１３】
配列番号１に示されるポリペプチドは、酵母、特にロドトルラ（Rhodotorula）属の酵母、特にロドトルラ・ムシラギノサ（Rhodotorula mucilaginosa）から得ることができる。
【００１４】
本発明のさらなる内容は、配列番号９に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。
【００１５】
ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、例えば、２−オクタノンをＳ−２−オクタノールに還元し、２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化する。ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、例えば、ＳＤＳ−ゲルにより決定される分子量が３０±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは、７．０から８．０までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは、８．５から１０．０までの範囲内である。ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性およびｐＨ安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあり温度が３５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。さらには、ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、有機溶媒中で高い安定性を示す。
【００１６】
配列番号２または配列番号８に示されるポリペプチドは、酵母、特にピキア属、カンヂダ属、パチソレン（Pachysolen）属、デバロミセス（Debaromyces）属またはイッサチェンキア（Issatschenkia）属の酵母、特にピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）ＤＳＭＺ３３１６またはカンジダ・ネモデンドラ（Candida nemodendra）ＤＳＭＺ７０６４７から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１０に示される核酸配列および配列番号１６に示される核酸配列であり、これらの核酸配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードしている。この酸化還元酵素は、２−ブタノンをＲ−２−ブタノールに優先的に還元し、２−ブタノールの二つの鏡像異性体のうちからＲ−２−ブタノールを優先的に酸化する。
【００１７】
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、Ｒ−２−オクタノールよりもＲ−２−ブタノールおよび２−プロパノールに対して極めて高い活性を示し、さらにこの酵素は、２−オクタノンよりもアセトンおよび２−ブタノンに対して極めて高い活性を示す。
【００１８】
一方、カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、Ｒ−２−ブタノール、２−プロパノールおよびＲ−２−オクタノールの何れに対しても同じような活性を示し、さらにこの酵素は、２−オクタノンに対してほぼ同様の活性を示す。
【００１９】
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．０から６．０までの範囲内であり、酸化反応における至適ｐＨは７．５から１０までの範囲内である。ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２０】
カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨはｐＨ６であり、酸化反応の至適ｐＨは１０から１１までの範囲内である。カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが６．５から９．５までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２１】
配列番号３または配列番号７に示されるポリペプチドは、酵母、特にピキア属およびカンジダ属の酵母、特にピキア・スティピディス（Pichia stipidis）ＤＳＭＺ３６５１およびピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）ＤＳＭＺ７０３９１から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１１に示される核酸配列および配列番号１５に示される核酸配列であり、これらの核酸配列はそれぞれ、配列番号３および配列番号７に示されるポリペプチドをコードしている。
【００２２】
ピキア属およびカンジダ属の酵母由来のカルボニル還元酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６５％が一致しているかまたは配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％が一致しており、２−オクタノンをＳ−２−オクタノールに優先的に還元し、２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化する。これらの酵素はとりわけ、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することに適している。
【００２３】
ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３６±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．５から６．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは６．５から８．０までの範囲内である。ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２４】
ピキア・トレハロフィラ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３６±２ｋＤａであるホモマー（homomer）である。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは７から７．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７から８までの範囲内である。
【００２５】
配列番号４に示されるポリペプチドは、ロイコノストック（Leuconostoc）綱の細菌、特にロイコノストック・カルノサム（Leuconostoc carnosum）ＤＳＭＺ５５７６から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１２に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、とりわけ、２−オクタノンからＲ−２−オクタノールへの還元およびＲ−２−オクタノールの酸化に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＳ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００２６】
ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．０から６．０までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは６．０から９．０までの範囲内である。ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が３５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２７】
配列番号５に示されるポリペプチドは、アクチノバクテリア（Actinobacteria）綱の細菌、特にミクロバクテリウム（Microbacterium）綱の細菌、特にミクロバクテリウム・スピーシーズ（Microbacterium spec.）ＤＳＭＺ２００２８から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１３に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００２８】
ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の酸化還元酵素は、例えば、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３５±２ｋＤａであるホモテトラマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは６．０から７．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７．５から９．５までの範囲内である。ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が５０℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２９】
配列番号６に示されるポリペプチドは、アクチノバクテリア綱の細菌、特にゴルドニア（Gordonia）綱の細菌、特にゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Gordonia rubripertincta）ＤＳＭＺ４３５７０から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１４に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００３０】
ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が４１±３ｋＤａであるホモマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは４．５から５．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７．５から９．５までの範囲内である。ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が５５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００３１】
配列番号１２９に示されるポリペプチドは、酵母、特にロデロミセス（Lodderomyces）属の酵母、特にロデロミセス・エロンギスポラス（Lodderomyces elongisporus）ＤＳＭＺ７０３２０から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１３０に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号１２９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００３２】
さらに本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるアミノ酸配列からなる酸化還元酵素またはこれらのホモログであり、Ｎ側末端またはＣ側末端においてさらなるポリペプチドとペプチド性に連結している酸化還元酵素を表すことを特徴とする融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、例えば、他のタンパク質の中から、より容易に分離でき、組み換えにより大量に発現させることができる。
【００３３】
さらに本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはこれらのホモログに特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体の産生は、適切な哺乳動物の免疫化およびその後の抗体の回収という公知の方法により行われる。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００３４】
アミノ酸配列の比較は、例えば、ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースのみならずＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどのタンパク質データベースを用い、インターネットを介して、ＦＡＳＴＡプログラムまたはＢＬＡＳＴプログラムにより実施できる。
【００３５】
以上の実施により、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignement Search Tool）（Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268）アルゴリズムの手法により最適なアラインメントを決定できる。ベースとして、配列の類似性を評価するスコアリングマトリックスとしてＰＡＭ３０マトリックスを用いた（Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C. 1978. "A model of evolutionary change in Proteins" in "Atlas of Protein Sequence and structure" 5（3） M.O. Dayhoff （ed) 345-352, National Biomedical Research foundation）。
【００３６】
さらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり２６以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００３７】
本発明のさらなる内容は、ＭＰＡＴＬＲＬＤＫ（配列番号１７）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＱＡＬＡＡＰＳＮＬＡＰＫＡ（配列番号１８）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＶＥＩＩＫＴＱＶＱＤ（配列番号１９）、ＫＶＡＩＩＴＧＧＡＳＧＩＧＬ（配列番号２０）、ＳＣＹＶＴＰＥＧ（配列番号２１）、ＴＤＦＫＶＤＧＧ（配列番号２２）、ＶＭＦＮＮＡＧＩＭＨ（配列番号２３）およびＶＨＡＲＥＧＩＲＩＮ（配列番号２４）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００３８】
さらに、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１５以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００３９】
本発明のさらなる内容は、ＭＡＹＮＦＴＮＫＶＡ（配列番号２５）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＴＴＬＬＶＤＧＧＹＴＡＱ（配列番号２６）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＥＹＫＥＡＡＦＴＮ（配列番号２７）、ＮＫＶＡＩＩＴＧＧＩＳＧＩＧＬＡ（配列番号２８）、ＤＶＮＬＮＧＶＦＳ（配列番号２９）、ＨＹＣＡＳＫＧＧＶ（配列番号３０）、ＮＣＩＮＰＧＹＩ（配列番号３１）およびＬＨＰＭＧＲＬＧＥ（配列番号３２）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１５以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４１】
本発明のさらなる内容は、ＭＳＩＰＡＴＱＹＧＦＶ（配列番号３３）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＳＡＹＥＧＲＶＶＦＫＰ（配列番号３４）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＣＨＳＤＬＨＡＩＹ（配列番号３５）、ＧＹＱＱＹＬＬＶＥ（配列番号３６）、ＴＦＤＴＣＱＫＹＶ（配列番号３７）、ＬＬＴＰＹＨＡＭ（配列番号３８）、ＬＶＳＫＧＫＶＫＰ（配列番号３９）、ＧＡＧＧＬＧＶＮＧ（配列番号４０）、ＩＱＩＡＫＡＦＧＡＴ（配列番号４１）およびＬＧＳＦＷＧＴＳ（配列番号４２）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４２】
さらに、本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１８以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４３】
本発明のさらなる内容は、ＭＴＤＲＬＫＮＫＶＡ（配列番号４３）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＡＥＦＶＶＤＧＧＹＬＡＱ（配列番号４４）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＶＶＩＴＧＲＲＡＮ（配列番号４５）、ＧＧＡＳＩＩＮＭＳ（配列番号４６）、ＴＱＴＰＭＧＨＩ（配列番号４７）およびＧＹＩＫＴＰＬＶＤＧ（配列番号４８）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４４】
さらに、本発明は、配列番号５に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１８以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４５】
本発明のさらなる内容は、ＭＫＡＬＱＹＴＫＩＧＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＬＡＡＧＴＶＲＧＲＡＶＩＶＰ（配列番号５０）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、ＣＨＳＤＥＦＶＭＳＬＳＥ（配列番号５１）、ＶＹＧＰＷＧＣＧＲＣ（配列番号５２）、ＶＳＬＴＤＡＧＬＴＰＹＨＡ（配列番号５３）、ＬＲＡＶＳＡＡＴＶＩＡＬ（配列番号５４）およびＤＦＶＧＡＤＰＴＩ（配列番号５５）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４６】
同様に、本発明は、配列番号６に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり２６以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４７】
本発明のさらなる内容は、ＭＫＡＩＱＩＩＱ（配列番号５６）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＤＬＲＧＲＡＶＶＶＰ（配列番号５７）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＴＡＡＧＡＣＨＳＤ（配列番号５８）、ＴＰＹＨＡＩＫＰＳＬＰ（配列番号５９）、ＤＦＶＧＬＱＰＴ（配列番号６０）、ＶＹＧＡＷＧＣＧ（配列番号６１）、ＤＤＡＲＨＬＶＰ（配列番号６２）、ＭＴＬＧＨＥＧＡ（配列番号６３）およびＧＧＬＧＨＶＧＩＱＬＬＲＨＬ（配列番号６４）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４８】
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるカルボニル還元酵素またはこれらのホモログをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むクローニングベクターに関する。また、本発明は、カルボニル還元酵素の他に、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはグルコース脱水素酵素などのＮＡＤ（Ｐ）の再生に適した酵素をコードしているクローニングベクター、を含んでいる。
【００４９】
さらに、本発明は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞にある発現ベクターであり、かつ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるカルボニル還元酵素またはこれらのホモログをコードし、適当な手段により発現制御配列とつながっている核酸配列を含んでいる発現ベクターに関する。さらに、本発明は、上記の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされている細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である組換え宿主細胞、および、上記組換え宿主細胞を培養することによりカルボニル還元酵素を取得するための生成方法に関する。
【００５０】
適したクローニングベクターとしては、例えば、ｐｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＤｒｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｑｕｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、ｐＳ Ｂｌｕｅ、ｐＥＴ Ｂｌｕｅ、ｐＥＴ ＬＩＣ−ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、米国）およびＴＡ−ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）である。
【００５１】
適した発現ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＵＣ、ｐＴＺ、ｐＳＫ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＱＥ、ｐＥＴ、ＰＨＵＢ、ｐＰＬｃ、ｐＫＣ３０、ｐＲＭ１／ｐＲＭ９、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＡＳ１、ｐＧＥｘ、ｐＭＡＬまたはｐＴｒｘである。
【００５２】
適した発現制御配列としては、例えば、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）プロモータ、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータまたはλｐＬプロモータである。
【００５３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはそれらのホモログは、上述した組換え大腸菌を培養し、各酸化還元酵素の発現を誘導し、その後１０時間から１８時間後に、超音波処理、球状のミル内のグラスビーズによる湿式研削（wet grinding）（Ｒｅｔｓｃｈ、ＧｍｂＨ、Ｈａａｎ Ｇｅｒｍａｎｙ １０ｍｉｎ、２４Ｈｚ）または高圧ホモジェナイザーにより、細胞を破砕する、といった方法により得ることができる。得られた細胞抽出物は、直接使用してもよく、またはさらに精製してもよい。このために、細胞抽出物を例えば遠心分離し、得られた上清は、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーなどによるイオン交換クロマトグラフィーに供される。
【００５４】
さらに、本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法、に関する。
【００５５】
本発明に係る方法のさらに好ましい形態は、上記ケト化合物は下記一般式Ｉで表され、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２ ・・（Ｉ）
Ｒ１は、
（１）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル基、
（２）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルケニル基、
（３）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルキニル基、
（４）−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（５）−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（６）非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環、または、
（７）−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル基、
の何れか１つを表し、上記（１）から（７）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されており、
Ｒ２は、
（８）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
（９）直鎖状または分枝鎖状であり３以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル基、
（１０）直鎖状または分枝鎖状であり２以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル基、または、
（１１）直鎖状または分枝鎖状であり、かつ、非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
の何れか１つを表し、上記（８）から（１１）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、ことを含んでいる。
【００５６】
さらに、本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１３０からなる群より選択される１つの核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、または
（ｂ）上記（ａ）に記載されている核酸配列の１つに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の相補鎖の核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、
を用いることを特徴とする方法に関する。
【００５７】
用語「アリール」は、６から１４個の炭素原子を環に含む芳香族炭素部分であることが理解される。−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール部分としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基および２−ナフチル基などのナフチル基、２−ビフェニリル基、３−ビフェニリル基および４−ビフェニリル基などのビフェニリル基、アントリル基またはフルオレニル基が挙げられる。アリール部分としては、ビフェニリル部分、ナフチル部分、および、特にフェニル部分が好ましい。用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の族から選択される元素であることが理解される。用語「−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル」は、炭素鎖が直鎖状または分枝鎖状であり、１から２０個の炭素原子を含む炭化水素部分であることが理解され、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノネニル基またはデカニル基が挙げられる。用語「−（Ｃ０）−アルキル」は、共有結合であることが理解される。
【００５８】
用語「−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル」は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基またはシクロヘプチル基などの環状炭化水素部分であることが理解される。
【００５９】
用語「−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環」は、単環式または二環式で、部分的または完全に飽和している五員環から十四員環の複素環を表している。Ｎ、ＯおよびＳがヘテロ原子の例である。用語「−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環」の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、１，２，３，５−オキサチアジアゾール−２−オキシド、トリアゾロン、オキサジアゾロン、イソオキサゾロン、オキサジアゾリジネジオン、Ｆまたは−ＣＮまたは−ＣＦ３または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで置換したトリアゾール、３−ヒドロキシピロ−２，４−ジオン、５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルボリン、および上記複素環のベンズ−アネレート化（benz-anellated）またはシクロペンタ−もしくはシクロヘキサ−もしくはシクロヘプタ−アネレート化誘導体（anellated derivative）、由来の部分が挙げられる。２−または３−ピロリル基、４−または５−フェニル−２−ピロリル基などのフェニルピロリル基、２−フリル基、２−チエニル基、４−イミダゾリル基、１−メチル−２−、−４−または−５−イミダゾリル基などのメチルイミダゾリル基、１，３−チアゾール−２−イル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−、３−または４−ピリジル−Ｎ−オキシド、２−ピラジニル基、２−、４−または５−ピリミジニル基、２−、３−または５−インドリル基、１−メチル、５−メチル、５−メトキシ−、５−ベンジロキシ−、５−クロロ−または４，５−ジメチル−２−インドリル基などの置換２−インドリル基、１−ベンジル−２−または−３−インドリル基、４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル基、シクロヘプタ[ｂ]−５−ピロリル基、２−、３−または４−キノリル基、１−、３−または４−イソキノリル基、１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２−ベンゾフラニル基、２−ベンゾ−チエニル基、２−ベンゾオキサゾリル基またはベンゾチアゾリル基またはジヒドロピリジニル基、２−または３−（Ｎ−メチルピロリジニル）基などのピロリジニル基、ピペラジニル基、モルフォリニル基、チオモルフォリニル基、テトラヒドロチエニル基、またはベンゾジオキソラニル基が特に好ましい。
【００６０】
式Ｉの化合物としては、例えば、４−クロロアセト酢酸エチル、アセト酢酸メチル、８−クロロ−６−オキソオクタン酸エチル、３−オキソ吉草酸エチル、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、２−オキソ吉草酸エチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル、ピルビン酸エチル、フェニルグリオキシル酸エチル、１−フェニル−２−プロパノン、２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オン、アセトフェノン、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ブタノン、１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オン、２，５−ヘキサンジオン、１，４−ジクロロ−２−ブタノン、アセトキシアセトン、塩化フェナシル、４−臭化アセト酢酸エチル、１，１−ジクロロアセトン、１，１，３−トリクロロアセトン、または１−塩化アセトンが好ましい。
【００６１】
本発明に係る方法においては、酸化還元酵素を、完全に精製した状態または部分的に精製した状態で用いることができ、または、本発明に係る酸化還元酵素を有する細胞を用いて本発明の方法を実行することができる。それにより、使用する細胞を、そのままの状態、透過性にした状態または溶解した状態で提供できる。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはそのホモログのクローン化酸化還元酵素をそれぞれ用いることが好ましい。
【００６２】
変換に用いる式Ｉに示される化合物１ｋｇあたり、５．０００から１０００万Ｕの酸化還元酵素が使用される（上限はない）。１Ｕの酵素ユニットは、式Ｉに示される化合物を１分間あたりに１μｍｏｌ変換するために必要な酵素量に相当する。
【００６３】
酵素還元そのものは穏やかな条件化で進行するため、生成されたアルコールがさらに反応することはない。本発明に係る方法によれば、生成されるキラルアルコールの滞留時間が長く、生成されるキラルアルコールが通常９５％以上のエナンチオマー純度を示し、用いるケト化合物の量と対比したときの収率がよい。
【００６４】
本発明に係る方法において、用いるカルボニル化合物の量は、全体の量に対して、３％から５０％までであり、好ましくは５％から４０％までであり、特に好ましくは１０％から３０％までである。
【００６５】
さらに、本発明の好ましい実施形態は、還元の過程で形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰを、補基質を用いてそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに継続的に還元することを特徴とする。
【００６６】
その際に、用いる補基質としては、エタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールなどの第１級および第２級アルコールが好ましい。
【００６７】
上記補基質が反応して、対応するアルデヒドまたはケトンが生じ、また、酸化還元酵素およびＮＡＤまたはＮＡＤＰを利用してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをそれぞれ生じさせる。その結果、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがそれぞれ再生される。その結果、再生に用いる補基質の割合は、全体量の５から９５体積％濃度の範囲である。
【００６８】
補因子を再生するために、アルコール脱水素酵素をさらに添加することができる。適したＮＡＤＨ依存性アルコール脱水素酵素は、例えば、パン酵母、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、カンジダ・パラプシロシス、またはピキア・カプスラタから得ることができる。さらに適したＮＡＤＰＨ依存性アルコール脱水素酵素は、ラクトバシルス・ブレビス（ＤＥ１９６１０９８４Ａ１）、ラクトバシルス・ミノール（ＤＥ１０１１９２７４）、シュードモナス（ＵＳ５，３８５，８３３）、またはサーモアナエロビウム・ブロッキ（Thermoanaerobium brockii）が保持している。これらのアルコール脱水素酵素の適した補基質は、上述のように、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールなどの第二級アルコールが挙げられる。
【００６９】
さらに、例えばＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性ギ酸脱水素酵素を用いると、効率的に補因子を再生することができる（Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase）。ギ酸脱水素酵素の適した補基質としては、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウムまたはギ酸カルシウムなどのギ酸塩が挙げられる。しかしながら、本発明に係る方法は、このように脱水素酵素を追加することなく実施されることが好ましく、すなわち、基質に連動した補酵素の再生が行われる。
【００７０】
酵素還元が進行する反応混合液の水相部分は、例えば、５から１０までのｐＨ値、好ましくは６から９までのｐＨ値である、リン酸カリウム緩衝液、トリス／ＨＣｌ緩衝液またはトリエタノールアミン緩衝液などの緩衝液を含んでいることが好ましい。さらに、緩衝液は、酵素を安定化し活性化するために、例えば、亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンなどのイオンを含んでいてもよい。
【００７１】
本発明に係る方法を実施している間、温度は適切に１０℃から７０℃、好ましくは２０℃から４０℃までの範囲内にある。
【００７２】
本発明に係る方法のさらに好ましい実施形態においては、水と混和しない有機溶媒、または限られた量しか水と混和しない有機溶媒の存在下で、酵素による変換がなされる。上記溶媒としては、例えば、対称もしくは非対称のジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルエーテル、直鎖状もしくは分枝鎖状アルカンまたはシクロアルカン、または同時に補基質にもなる水溶性第二級アルコール、などが挙げられる。有機溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、２−オクタノール、２−ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノールまたはシクロヘキサンが好ましい。溶媒は、同時に、補因子の再生のための補基質として働くこともできる。
【００７３】
水不溶性の溶媒および補基質をそれぞれ用いると、反応バッチ（batch）は、水相と有機相とからなる。基質はその溶解度にしたがって、有機相と水相との間に分布する。有機相は、反応ボリューム全体に対して、通常５％から９５％の割合を占め、好ましくは１０％から９０％の割合を占める。二つの液相の間に生じる面が大きくなるように、二つの液相を機械的に混合することが好ましい。また本実施形態においては、上述したように、酵素還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰのそれぞれを、補基質を用いて、再びＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨにそれぞれ還元できる。
【００７４】
水相中の補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度は、通常０．００１ｍＭから１ｍＭまでの範囲内であり、０．０１ｍＭから０．１ｍＭまでの範囲内が好ましい。
【００７５】
本発明に係る方法において、酸化還元酵素／脱水素酵素の安定剤をさらに用いることができる。適した安定剤としては、例えば、グリセロール、ソルビトール、１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００７６】
本発明に係る方法は、例えば、ガラスまたは金属で作られている閉反応ベッセル（vessel）中で実施される。このために、各成分を別個に反応ベッセルに移し入れ、例えば窒素または空気などの雰囲気下で攪拌する。反応時間は、１時間から４８時間の範囲内であり、とりわけ２時間から２４時間の範囲内である。
【００７７】
次いで、反応混合物を処理する。このために、水相を分離し、有機相を濾過する。水相をもう一度抽出してもよく、有機相のようにさらに処理してもよい。その後に濾過した有機相から溶媒を蒸発させてもよい。
【００７８】
また、本発明は、式ＩＩで表されるキラルヒドロキシ化合物を取得する方法であって、
Ｒ１−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ２ （ＩＩ）
Ｒ１およびＲ２は上述の通りであり、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および１２９に示される本発明に係る酸化還元酵素ならびにそのホモログの何れか１つ、ＮＡＤ（Ｐ）および水の存在下で、式ＩＩのラセミ化合物を含む混合物をインキュベートし、それにより式ＩＩのヒドロキシ化合物のエナンチオマーが対応するケト化合物およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され、かつ
（ｂ）残存する式ＩＩのヒドロキシ化合物のエナンチオマーを単離する、
ことを特徴とする方法に関する。
【００７９】
配列番号１、３、５、６、７および１２９に示されるカルボニル還元酵素を用いると、対応するキラルＲ−ヒドロキシ化合物が優先的に得られる。配列番号２、４および８に示されるカルボニル還元酵素を用いると、対応するキラルＳ−ヒドロキシ化合物が優先的に得られる。
【００８０】
反応条件は、式Ｉのケト化合物をエナンチオ特異的に還元する上述した方法と基本的には同じである。しかしながら、式ＩＩの化合物のラセミ混合物から式Ｉのケト化合物をエナンチオ選択的に還元する代わりに、式ＩＩのヒドロキシ化合物の一方のエナンチオマーのみをエナンチオ選択的に対応するケト化合物に酸化する。それにより、式ＩＩのヒドロキシ化合物のもう一方のエナンチオマーが残り、単離できる。さらに、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノールまたは２−オクタノールなど補基質として用いたアルコールの代わりに、アセトンなど、これらのアルコールに対応するケトンが、ＮＡＤの再生プロセスに用いられる。例えば、アセトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、本発明に係る酸化還元酵素または追加した脱水素酵素により、ＮＡＤおよびイソプロパノールに変換される。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例によりさらに詳細に説明される。
【００８２】
〔実施例１：生物の培養およびカルボニル還元酵素活性のスクリーニング〕
スクリーニングとして、酵母菌株であるロドトルラ・ムシラギノサＤＳＭＺ７０８２５、ピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６、カンジダ・ネモデンドラＤＳＭＺ７０６４７、ピキア・スティピディスＤＳＭＺ３６５１、ピキア・トレハロフィラＤＳＭＺ７０３９１、およびロデロミセス・エロンギスポラスＤＳＭＺ７０３２０を以下の培地において培養した。この培地には、酵母エキス（３）、麦芽エキス（３）、ペプトン（５）、およびグルコース（１０）が含まれている（カッコ内に示した数値は、いずれも、ｇ／ｌを示す）。この培地を１２１℃で滅菌した。また、上記酵母を、それ以上ｐＨ調節をすることなく、２５℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）する攪拌機において培養した。
【００８３】
ロイコノストック・カルノサムＤＳＭＺ５５７６を、以下の培地において培養した。この培地には、グルコース（２０）、酵母エキス（５）、肉エキス（１０）、クエン酸水素二アンモニウム（２）、酢酸ナトリウム（５）、硫酸マグネシウム（０．２）、硫酸マンガン（０．０５）、およびリン酸水素二カリウム（２）が含まれている。この培地を１２１℃で滅菌した。また、上記菌株を、それ以上ｐＨ調節をすることなく、またさらなる酸素の供給もせずに、３０℃で培養した。
【００８４】
ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８を、酵母エキス（３）およびトリプチカーゼ大豆粉（３０）を含む培地において、３０℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）させながら培養した。
【００８５】
ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０を、酵母エキス（４）、グルコース（４）、麦芽エキス（１０）、および炭酸カルシウム（２）を含む培地において、３７℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）させながら培養した。
【００８６】
次に、８００μｍの分解バッファー（１００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ＝７．０）によって再懸濁した１２５ｍｇの細胞を、球状のミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製）において、１ｇのグラスビーズと混合し、４℃で１０分間分解した。１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後に得られる上清（溶解物）を、以下に示す活性スクリーニングにおいて、エナンチオマー過剰率（ｅｅ−評価）を測定するために用いた。また、基質として、２−ブタノン、２−オクタノン、４−クロロアセト酢酸エチル、アセトフェノン、または２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルのような種々のケトンを用いた。
【００８７】
活性スクリーニングのバッチ：
８６０μｌ ０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＰＯ４ 、ｐＨ＝７．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２
２０μｌ ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ（１０ｍＭ）
２０μｌ 溶解物
１００μｌ 基質（１００ｍＭ）
３４０ｎｍを１分間で反応を追跡した（pursued）。
【００８８】
ｅｅ−評価測定のバッチ：
２０μｌ 溶解物
１００μｌ ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ（５０ｍＭ）
６０μｌ 基質（１００ｍＭ）
２４時間後（ｈ）、ｅｅ−測定のバッチを、例えばクロロホルムを用いて抽出した。また、エナンチオマー過剰率をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した。なお、エナンチオマー過剰率は次のとおりに算出される：
ｅｅ（％）＝（（Ｒ‐アルコール−Ｓ‐アルコール）／（Ｒ‐アルコール＋Ｓ‐アルコール））×１００
【００８９】
【表１】
【００９０】
ここで、ＤＳＭＺは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３８１２４ブラウンシュワイクを表す。酵素単位の定義として：１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの基質を変換させるために必要とされる酵素の量に相当する。
【００９１】
〔実施例２：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性微生物酸化還元酵素の分離および精製〕
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性微生物酸化還元酵素を分離するために、実施例１において記載したように微生物を培養した。定常期に達した後、この微生物の細胞を集菌し、遠心分離によって培地から分離した。酵素の放出は、グラスビーズにより湿式研削することによって生じるが、その他の分解方法によって放出してもよい。このため、例えば、１００ｇの湿潤細胞集団を、４００ｍｌの分解バッファー（１００ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．０）によって懸濁し、加圧型細胞破壊装置によってホモジェナイズした。
【００９２】
次に、遠心分離（７，０００ｒｐｍ）により得られた粗抽出物を、さらにＦＰＬＣ（ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー）によって精製した。
【００９３】
本発明に係るすべての酸化還元酵素は、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）またはＵｎｏＱ（Ｂｉｏｒａｄ社製，ミュンヘン，ドイツ）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびゲル・パーミエーションの様々な組み合わせによって精製されてもよい。
【００９４】
〔実施例２ａ：ピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６由来のＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素の精製〕
タンパク質分離のために、遠心分離後に得られるピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６の溶解物を、１００ｍＭトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ＝７．０、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）によって平衡化されたＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−カラムに直接のせ、直線塩勾配を下げることによって溶出した。酸化還元酵素含有分画を混合し、限外ろ過法（排除限界は１０ｋＤａである）によって適当な量に濃縮した。
【００９５】
次に、酸化還元酵素の濃縮した分画を、さらにＵｎｏＱによって精製した。また、この酸化還元酵素を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＵｎｏＱ‐カラム（Ｂｉｏｒａｄ社製）に直接のせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。このため、酸化還元酵素は結合することなく０Ｍ ＮａＣｌで溶出されたが、その一方、不純物の大部分は結合され、高い塩濃度で溶出された。
【００９６】
また、第３の精製工程を、セラミックヒドロキシルアパタイトカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行った。酸化還元酵素を、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって平衡化されたカラムにのせ、より高いバッファー濃度（４００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって溶出した。このとき、酸化還元酵素は８０−１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーにおいて溶出された。
【００９７】
その結果、得られた精製酸化還元酵素の分子量を、ゲル・パーミエーション（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，１００ｍＭトリエタノールアミン，ｐＨ＝７、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）によって決定した。また、分子量スタンダードとして、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、アルブミン（６９．８ｋＤａ）、およびオボアルブミン（４９．４ｋＤａ）を用いた。
【００９８】
以下の表２に、得られた結果をまとめている。
【００９９】
【表２】
【０１００】
酸化還元酵素の酵素活性を、実施例１（活性スクリーニングのバッチ）によるテストシステムにおいて決定した。また、タンパク質量の測定は、ローリーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９３（１９５１）：２６５−２７５、またはピーターソンら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、１００（１９７９）：２０１−２２０に準拠して実施した。タンパク質量に対する酵素活性指数は比活性度を与えるものであり、１分間あたりの１μｍｏｌの酵素の変換は１ユニット（Ｕ）に相当する。
【０１０１】
〔実施例２ｂ：ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来のＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素の精製〕
タンパク質分離のために、遠心分離後に得られるミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８の溶解物を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−カラムにのせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。これにより、酸化還元酵素は０．６〜０．８ＭのＮａＣｌで溶出された。酸化還元酵素含有分画を混合し、限外ろ過法（排除限界は１０ｋＤａである）によって適当な量に濃縮した。
【０１０２】
次に、酸化還元酵素の濃縮した分画を、さらにＵｎｏＱによって精製した。また、この酸化還元酵素を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＵｎｏＱ‐カラム（Ｂｉｏｒａｄ社製）に直接のせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。これにより、酸化還元酵素は０．２〜０．２５Ｍ ＮａＣｌにおいて溶出された。
【０１０３】
また、第３の精製工程を、セラミックヒドロキシルアパタイトカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行った。ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の酸化還元酵素を、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって平衡化されたカラムにのせ、より高いバッファー濃度（４００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって溶出した。このとき、酸化還元酵素は８０−１００ｍＭリン酸カリウムバッファーにおいて溶出された。その後、得られた精製酸化還元酵素の分子量を、実施例２ａにおいて記載したように決定した。
【０１０４】
以下の表３に、得られた結果をまとめている。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
〔実施例３：本発明に係る酸化還元酵素のＮ−末端配列の決定〕
１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）におけるゲル・パーミエーションの後、実施例２に従って酵素調製物を分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ−膜）に転写した。
【０１０７】
顕著なバンドについて、エドマン分解（Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製））によるＮ−末端配列決定を行った。
【０１０８】
〔実施例４：酵母から単離されたエナンチオ選択的アルコール脱水素酵素の一般的なクローニング技術〕
マニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”（Molecular Cloning）に記載の方法によって、染色体ＤＮＡを抽出した。ここで得られる核酸は、縮重プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として機能する。このとき、５’−プライマーはアミノ酸配列（配列番号６６；７２；８０）に由来し、３’−プライマーはアミノ酸配列（配列番号６７；７３，８１）に由来する。なお、上記配列は生物に対して特異的な遺伝コード（配列番号６８；６９；７４；７５；８２；８３）を含んでいる。
【０１０９】
増幅は、ＰＣＲバッファー〔６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０〕、０．２ｍＭデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ）、４０ｐＭｏｌの各プライマー、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）〕により実施した。ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼの活性化（８分９５℃）および、それに続く４５〜５０サイクルのタッチダウンＰＣＲの後、この反応物を４℃に冷却し、すべてのＰＣＲバッチを、分析のため１％アガロースゲルにアプライした。
【０１１０】
ポリメラーゼ連鎖反応により得られる特異的なフラグメントを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションし、ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーを用いて、プライマーＭ１３ｒｅｖ（配列番号６５）およびプライマーＭ１３ｕｎｉ（配列番号１２８）によって配列決定した。
【０１１１】
遺伝子をコードする配列の５’末端および３’末端領域を、ＲＡＣＥ法（rapid amplification of cDNA ends）によって決定した。特異的なフラグメントの核酸配列に基づいて、３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥのためのオリゴヌクレオチドを設計した。細胞から調製した全ＲＮＡは、３’−ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いた一本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型として機能する。次いで、３’−ＲＡＣＥオリゴヌクレオチド（配列番号７６；７７；８４；８５）よる特異的なｃＤＮＡの増幅および再増幅を行う。次に、分析のためにバッチを１％アガロースゲルにアプライする。欠損している３’側隣接配列情報を保持する特異的なフラグメントを単離し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にライゲーションして、配列決定した。
【０１１２】
コーディングおよび非コーディング５’末端配列を、５’−ＲＡＣＥシステム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて決定した。このために、すでに得られている全ＲＮＡのｍＲＮＡを、オリゴｄＴ−セルロース（ＮＥＢ社製、ベバリー、米国）を用いて濃縮し、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号７０；７１；７８；７９；８６；８７）を用いた一本鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。この後の、特異的ｃＤＮＡの増幅および再増幅により、分析のためにｐＣＲ２．１ＴＡクローニングベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）につなぐフラグメントが形成される。上記フラグメントを有するプラスミドを、ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーを用いて分析した。これにより、遺伝子の５’側末端に関する欠損している配列情報が得られる。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
次に、全長遺伝子（配列番号９；１０；１１）をコードしている配列に基づいて、適当な発現システムに上記ＤＮＡ領域をクローニングするための特異的なプライマーを設計した。このため、例えば、５’プライマーに、ＮｄｅＩの認識配列、またはＳｐｈＩもしくはＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ修飾付加し、また３’−プライマーに、ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を修飾付加した（配列番号８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６）。
【０１１５】
その後のＰＣＲにおいて、染色体ＤＮＡは鋳型として機能する。それぞれの酸化還元酵素をコードしているＤＮＡ領域を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ポリメラーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて増幅した。１％アガロースゲルで精製した後、得られたＰＣＲ産物を、適当なＤＮＡエンドヌクレアーゼによって処理し、ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン、米国）のバックボーン、またはｐＱＥ７０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン、ドイツ）のバックボーンそれぞれにライゲーションした。なお、このバックボーンは、同一のエンドヌクレアーゼにより処理されている。
【０１１６】
配列を決定した後、形成した発現コンストラクトは、発現菌株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国），それぞれに組み込まれる。
【０１１７】
〔実施例４ａ：酵母ピキア・ファリノサ由来のエナンチオ選択的酸化還元酵素のクローニング〕
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素をクローニングするために、例えばマニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法に従って、染色体ＤＮＡを、ピキア・ファリノサの新たな細胞から抽出した。これにより得られた核酸は、オリゴヌクレオチド配列番号７４；７５を用いたタッチダウンＰＣＲのための鋳型として機能する。ＰＣＲサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製，ハーキュリーズ、米国）においてＢｉｏｔｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼを８分間活性化した後、下記の３０温度サイクルを、特異的ＤＮＡフラグメントを同定するためにプログラムした。
９４℃ ４５秒
６０℃−０．５℃／サイクル ４５秒
６８℃ ２分
上記サイクルに次いで、増幅シグナルを別の２０サイクルによって増幅した。
９４℃ ４０秒
５２℃ ４０秒
７２℃ １分。
【０１１８】
１％アガロースゲルにおいてすべての反応バッチを分別した後、５５０ｂｐの大きさがある特異的フラグメントが検出された。上記フラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションした。形成したプラスミドｐＣＲ２．１−ＰＦ５５０の配列決定を行った。
【０１１９】
５５０ｂｐの長さがある遺伝子フラグメントの配列解析により、１７４アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームが明らかになった。なお、ここでは、Ｎ末端および内部ペプチドの２つの配列フラグメントが検出される可能性がある。
【０１２０】
５２１ｂｐの長さがあるフラグメントのヌクレオチド配列に基づいて、３’ＲＡＣＥ（配列番号７６；７７）および５’ＲＡＣＥ（配列番号７８；７９；８８）のためのオリゴヌクレオチドを設計した。ｃＤＮＡ合成反応のために、ピキア・ファリノサ細胞由来の全ＲＮＡを次のように調製した。
【０１２１】
まず、６００ｍｇの新たな細胞を、２．５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファー中で再懸濁した。硝酸で洗浄して３ｍｌフェノール（ｐＨ７．０）により平衡化した５ｍｌ（約２０ｇ）のグラスビーズを、上記細胞の懸濁液に加えた。また、すべてのバッチをそれぞれの場合において３０秒間、全部で１０分間ボルテックスし、その後３０秒間氷で冷やした。次に、５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファーを加え、再度十分にボルテックスした。上記細胞の懸濁液を、１１，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。これにより、水相を復元し、同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２４：１）により２回抽出した。その後に、クロロホルムによる抽出を行った。最後の抽出の後、全ＲＮＡを、１／１０量の５Ｍ ＬｉＣｌ２を加えることによって４時間、−２０℃で沈殿させた。３’ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。次に、特異的ｃＤＮＡを反応物において、オリゴヌクレオチド配列番号７６およびＡＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）によって増幅した。すなわち、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］、０．２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），１０ｐＭｏｌの各プライマーおよび２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）を用いて、以下の３０温度サイクルにより合成する。この温度サイクルとは：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で１分である。
【０１２２】
ＰＣＲシグナルは、プライマー配列番号７７およびプライマーＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅させた。このときの条件は、３０温度サイクル：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で５０秒であった。その結果、約４００ｂｐの大きさがある特異的なＤＮＡフラグメントが得られた。また、このフラグメントを、１％アガロースゲルから単離した後、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。３８２ｂｐの長さがあるＤＮＡ領域の配列解析により、ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素をコードするｃＤＮＡの、終止コドンまでの３’伸長部分およびポリ−Ａループに関する配列情報が得られる。５’ＲＡＣＥ反応のために、ピキア・ファリノサ細胞から調製した５μｇの全ＲＮＡを使用した。遺伝子特異的ｃＤＮＡの合成は、５’ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）およびオリゴヌクレオチド配列番号７８を用いて行った。結果として生じる遺伝子特異的ｃＤＮＡに対してホモポリマーｄＣＴＰ付加反応を行った。次いで、ＰＣＲ［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］、０．２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），２０ｐＭｏｌプライマー配列番号７９およびプライマーＡＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製），２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）によりｃＤＮＡを増幅した。このときの反応条件としては、３５温度サイクル：９４℃で４５秒，５４℃で４５秒，７２℃で１分３０秒に従って行った。ＰＣＲシグナルを、プライマー配列番号８８およびプライマーＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅した。このときの条件は、３０温度サイクル：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で１分であった。これにより、約３５０ｂｐの大きさの特異的なＤＮＡフラグメントが生じ、このフラグメントを１％アガロースゲルから溶出した後にベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。３５２ｂｐの長さがあるＤＮＡ領域の配列解析により、アルコール脱水素酵素／還元酵素をコードするｃＤＮＡの５’末端に関する配列情報が得られる。
【０１２３】
このように、タンパク質をコードするＤＮＡ領域は、全長７６５ｂｐ（配列番号１０）であり、２５４アミノ酸（配列番号２）のオープン・リーディング・フレームを有する。ピキア・ファリノサ細胞の染色体ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応［５０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）、２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９１、またはそれぞれ２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９２、２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９３、および２ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］における全長ＤＮＡの生成のための鋳型として用いた。このときの温度サイクルは：
サイクル１ ９４℃， ２分
サイクル２×３０ ９４℃， １５秒
５６℃， ２０秒
６８℃， １分１５秒。
【０１２４】
１％アガロースゲルで精製した後、得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって処理するか、またはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによってそれぞれ処理した。また、上記産物を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン，米国）またはｐＱＥ７０（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン，ドイツ）のバックボーンにそれぞれライゲーションした。なお、これらのバックボーンは同一のエンドヌクレアーゼにより処理されている。２μｌのライゲーションバッチを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞を形質転換した後、アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡについて、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれの限定解析によって、ライゲーション反応の正確さをチェックした。インサートがポジティブだったベクターのＤＮＡを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）それぞれを形質転換した。
【０１２５】
〔実施例５：細菌から分離されるエナンチオ選択的酸化還元酵素の一般的なクローニング技術〕
マニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法によって、ゲノムＤＮＡを抽出した。これにより得られた核酸は、縮重プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として機能する。このとき、５’プライマーはアミノ酸配列（配列番号１０４；１１２）に由来し、３’プライマーはアミノ酸配列（配列番号１０５；１１３）に由来する。なお、これらは生物の特異的な遺伝子コード（配列番号１０６；１０７；１１４；１１５）を含んでいる。
【０１２６】
ＰＣＲバッファー［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］，０．２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），各４０ｐＭｏｌのプライマー、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）］を用いて増幅を行った。ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼを活性化（８分、９５℃）した後、４５−５０サイクルのタッチダウンＰＣＲに続けて、反応物を４℃まで冷却し、分析のためにすべてのＰＣＲバッチを１％アガロースゲルにアプライした。
【０１２７】
ポリメラーゼ連鎖反応により得られる特異的なフラグメントを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションし、プライマーＭ１３ｒｅｖ（配列番号６５）およびＭ１３ｕｎｉ（配列番号１２８）を用いてＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーにより配列決定を行った。
【０１２８】
遺伝子コード配列の５’末端および３’末端領域は、インバースポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）を用いて決定される。特異的な内部フラグメントの核酸配列に基づいて、オリゴヌクレオチド配列番号１００；１０１；１０２；１０３；１０８；１０９；１１０；１１１；１１６；１１７；１１８；１１９を設計した。ゲノムＤＮＡを、制限酵素によって分解し、より小さなＤＮＡ領域が環状化できるように再ライゲーション反応に用いる。ついで、上記再ライゲーション反応の混合物は、ｉＰＣＲおよびプライマー配列番号１００；１０２；１０８；１１０；１１６；１１８の鋳型として用いられる。ＰＣＲシグナルを、プライマー配列番号１０１；１０３；１０９；１１１；１１７；１１９により、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅する。これにより得られた特異的フラグメントを、１％アガロースゲルから溶出した後、ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションする。
【０１２９】
このように、このフラグメントを含むベクターｐＣＲ２．１の配列解析により、アルコール脱水素酵素／酸化還元酵素遺伝子の３’および５’側領域に関する欠損している配列情報が得られる。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
全長遺伝子（配列番号１２；１３；１４）をコードする配列に基づいて、適切な発現システムへ上記ＤＮＡ領域をクローニングするための特異的なプライマーを設計する。このとき、５’プライマーにはＮｄｅＩの認識配列、またはＳｐｈＩもしくはＢａｍＨＩの認識配列が修飾付加され、３’プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩの認識配列が修飾付加される（配列番号１２０；１２１；１２２；１２３；１２４；１２５；１２６；１２７）。
【０１３２】
ゲノムＤＮＡから全長ＤＮＡを増幅した後、発現ベクターへの制限およびライゲーションを、実施例３に記載したように行う。この全長ＤＮＡはタンパク質をコードしている。形成した発現コンストラクトを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，ＵＳＡ）のそれぞれを形質転換する。
【０１３３】
〔実施例５ａ：ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来のエナンチオ選択的アルコール脱水素酵素／還元酵素のクローニング〕
ミクロバクテリウムｓｐ由来の酸化還元酵素をクローニングするために、例えばマニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法によって、ゲノムＤＮＡをミクロバクテリウムｓｐの新たな細胞から抽出した。これにより得られる核酸は、３０ｐＭｏｌの各オリゴヌクレオチド配列番号１０６，１０７を用いたＰＣＲの鋳型として機能した。ＰＣＲサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製，ハーキュリーズ，米国）においてＢｉｏｔｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼを１０分間活性化させた後、特異的なＤＮＡフラグメントを同定するために、以下の３０温度サイクルをプログラムした：
９４℃ ５０秒
６０℃ １分
７２℃ １分
１％アガロースゲルにおいてすべての反応バッチを分別した後、約１，０００ｂｐの大きさの特異的なフラグメントが検出された。上記フラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ ＴＡ−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ、ドイツ）にライゲーションした。形成したプラスミドｐＣＲ２．１−Ｍｓ１０００の配列決定を行った。
【０１３４】
１００２ｂｐの長さがある遺伝子フラグメントの配列解析は、Ｎ−末端および内部ペプチドの２つの配列断片が検出される可能性のある３３４アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームを示した。
【０１３５】
１００２ｂｐの長さがあるフラグメントのヌクレオチド配列に基づいて、インバースＰＣＲ（ｉＰＣＲ）のためのオリゴヌクレオチド（配列番号１０８；１０９；１１０；１１１）を設計した。
【０１３６】
ミクロバクテリウムｓｐの細胞由来のゲノムＤＮＡ（２．５μｇ）を、５０μｌバッチにおいて２０Ｕの制限酵素ＳａｃＩによって２５分間処理した。すべてのバッチをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出した後、１／１０ｖｏｌの３Ｍ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）および２．５ｖｏｌのエタノールによって沈殿させた。このように分解されたＤＮＡを２５μｌのＨ２Ｏに移した。また、このうちの５μｌ（２００ｎｇ）および２ＵのＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用いて、総量４０μｌでの再ライゲーション反応を行った。その後、再ライゲーションされたゲノムＤＮＡ（２μｌ＝２０ｎｇ）を、ｉＰＣＲ［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］，０．２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），３０ｐＭｏｌの各プライマー（配列番号１０８；１１０）、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）］に使用した。上記増幅を、以下のサイクルにより実施した：
サイクル１ ９５℃， １０分
サイクル２×３０ ９５℃， １分
５６℃， １分
７２℃， ２分
増幅シグナルを、オリゴヌクレオチド配列番号１０９および配列番号１１１を用いたｎｅｓｔｅｄＰＣＲにおいて増幅した。
【０１３７】
次に、増幅反応物を４℃まで冷却し、１％アガロースゲルに全体としてアプライした。これにより、約１，０００ｂｐの大きさがある特異的なフラグメントが得られた。その後、このフラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションさせた。
【０１３８】
このフラグメントを含んでいるプラスミドの配列解析により、５’および３’側の隣接配列に関する情報が得られる。タンパク質をコードするＤＮＡ部分は、終止コドンで終結する全長１，０４４ｂｐの領域（配列番号１３）であり、３４７アミノ酸（配列番号５）のオープン・リーディング・フレームを示す。
【０１３９】
ＧＣ−Ｒｉｃｈ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社製，マンハイム，ドイツ）および３０ｐＭｏｌのオリゴヌクレオチド配列番号１２３または配列番号１２４のそれぞれと、３０ｐＭｏｌのオリゴヌクレオチド配列番号１２５とを用いた、タンパク質をコードする全長ＤＮＡ生成のポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として、ミクロバクテリウムｓｐ細胞のゲノムＤＮＡを用いた。このときの温度サイクルは：
サイクル１ ９５℃，３分
サイクル２×３０ ９５℃，３０秒
５９℃，３０秒
７２℃，４５秒。
【０１４０】
１％アガロースゲルを用いて精製した後、得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、またはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより処理した。また、このＰＣＲ産物を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン，米国）またはｐＱＥ３２（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン，ドイツ）それぞれのバックボーンにライゲーションした。なお、これらのバックボーンは、それぞれ同一のエンドヌクレアーゼによって処理されている。２μｌのライゲーションバッチを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞を形質転換した後、アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡについて、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれによる限定解析により、ライゲーション反応の正確さをチェックした。インサートがポジティブであったベクターのＤＮＡを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）のそれぞれを形質転換した。
【０１４１】
〔実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えアルコール脱水素酵素／還元酵素の発現〕
発現コンストラクトによって形質転換されている大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｔｅｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２００ｍｌのＬＢ−培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）において、５５０ｎｍで測定される吸光度が０．５に達するまで培養した。０．１ｍＭの濃度のイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、組換えタンパク質の発現を誘導する。８時間または１６時間後、それぞれにおいて、２５℃、２２０ｒｐｍで誘導した細胞を回収し、−２０°Ｃにおいて凍結した。活性試験のために、１０ｍｇの細胞を５００μｌのＴＥＡバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）および５００μｌのグラスビーズと共に混合し、球状ミルを用いて１０分間分解した。これにより得られた溶解物を、その後希釈状態において、各測定のために用いた。活性試験を次のように構成した：ＴＥＡバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）を８７０μｌ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１６０μｇ、希釈した細胞溶解物を１０μｌ。反応混合物に１００ｍＭの基質溶液を１００μｌ添加することにより、反応を開始した。
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
〔実施例７：組換え酸化還元酵素の特徴づけ〕
７ａ：至適ｐＨ
表４に記載した緩衝液を調製した。それぞれにおける各緩衝液成分の濃度は５０ｍＭである。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
測定バッチ（３０℃）の至適ｐＨ還元：
表３に記載の緩衝液系 ８７０μｌ
１０ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ２０μｌ
希釈酵素 １０μｌ
およそ２分から３分間のインキュベーションを行い、次いで、
基質溶液（１００ｍＭ） １００μｌ
を添加した。
【０１４６】
酸化還元酵素に応じて、基質として２−ブタノンまたは２−オクタノンを用いた。３４０ｎｍを１分間で反応を追跡した。至適ｐＨを決定するために、表４に記載した各緩衝液における酵素反応を解析した。酸化反応の至適ｐＨを決定するために、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子として用い、２−プロパノールまたは２−オクタノールを基質として用いた。
【０１４７】
本発明に係る酸化還元酵素についての結果を表５にまとめた。
【０１４８】
【表８】
【０１４９】
７ｂ：ｐＨ安定性
表４に記載した緩衝液系に組換え酸化還元酵素を保持し、この組換え酸化還元酵素の活性の決定を行った。このために、ｐＨ範囲が４から１１までの異なる緩衝液（５０ｍＭ）を調製し、実施例４に従って調製した酸化還元酵素をこの緩衝液を用いて希釈した。３０分、６０分、および１２０分間インキュベートした後、バッチから１０μｌ取り出して、これを用いて実施例１に従って活性テストを行った。
【０１５０】
初期値は、５０ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸カリウム緩衝液に酵素を希釈（１：２０）した直後に取得した測定値である。与条件下において、上記値はおよそ０．７０／分の消失変化を表し、この値を１００％値としてセットし、続けて測定した全ての値をこの値との関連で評価した。
【０１５１】
表６には、本発明に係る酸化還元酵素において、インキュベーションを１２０分間続けても酵素が初期値の５０％以上を示したｐＨの範囲をまとめている。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
７ｃ：至適温度
至適テスト温度を決定するために、本発明に係る酸化還元酵素の酵素活性を、１５℃から７０℃の温度範囲における標準測定バッチ中で測定した。
【０１５４】
決定した至適温度を表７にまとめている。
【０１５５】
【表１０】
【０１５６】
７ｄ：温度安定性
実施例５ｃに記載した手法と類似の手法により、１５℃から７０℃の範囲における温度安定性を決定した。このために、本発明に係る酸化還元酵素を希釈したものを、それぞれにおいて各温度にて６０分間および１８０分間インキュベートし、次いで上述したテストバッチをもちいて３０℃で測定した。表８には、本発明に係る酸化還元酵素において、インキュベーションを１２０分間続けても酵素が初期活性の５０％以上を示した温度の範囲をまとめている。
【０１５７】
【表１１】
【０１５８】
７ｅ：基質範囲
複数のケトンおよびアルコールを用いて還元反応および酸化反応の酵素活性を測定し、本発明に係る酸化還元酵素の基質範囲を決定した。このために、実施例１に準拠した標準測定バッチを様々な基質とともに用いた。
【０１５９】
全ての酵素について、アセト酢酸メチルを用いたときの活性を１００％としてセットし、これとの関連で他の全ての基質について評価した。
【０１６０】
【表１２】
【０１６１】
７ｆ：水／有機二相システムにおける安定性
水／有機二相システムにおける新規酸化還元酵素の安定性を測定するために、実施例６（組換え発現由来）において得られた溶解物を、各酸化還元酵素に適した水性緩衝液に希釈（約１０Ｕ／ｍｌ緩衝液）した。次いで、水と混和しない同ボリュームの有機溶媒を、緩衝液で希釈した酸化還元酵素に加えた。そしてそのバッチを常に十分に混合し続けながら（サーモミキサで１７０ｒｐｍ）室温でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、水相からそれぞれ１０μｌを取り出し、これを用いて標準テストバッチ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ）、ｐＨ＝７、０．２ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１０ｍＭ 基質）における酵素活性を決定した。この場合にもまた、緩衝液に希釈した直後の初期値を１００％としてセットし、これとの関連で他の全ての値を評価した。
【０１６２】
【表１３】
【０１６３】
【表１４】
【０１６４】
〔実施例８：調製変換（preparative conversion）〕
８ａ：ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素を用いた（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルの合成
調製バッチとして、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１０％グリセロール）を２５ｍｌ、４−メチル−２−ペンタノールを３７５ｍｌ、３−オキソペンタン酸メチルを１００ｍｌ、ＮＡＤを１００ｍｇおよびロドトルラ・ムシラギノサＤＳＭＺ７０８２５由来の組換え酸化還元酵素を３７ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した３−オキソペンタン酸メチルの９７％が、（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルに還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルを蒸留により得た。
【０１６５】
この方法により、生成物である（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルが、＞９９％の純度、＞９９．５％のエナンチオマー過剰率で大量に得られた。
【０１６６】
８ｂ：ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素を用いた（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）を８０ｍｌ、２−プロパノールを１５ｍｌ、クロロアセトンを５ｍｌ、ＮＡＤを１０ｍｇおよびピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６由来の組換え酸化還元酵素を２ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用したクロロアセトンは完全に、（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールに還元されていた。次いで、反応混合物を酢酸エチルにより抽出し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去し、未精製の生成物を得た。この方法により生成された（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールは、エナンチオマー過剰率が＞９９％であった。
【０１６７】
８ｃ：ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素を用いた（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウム，ｐＨ＝８．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）を２０ｍｌ、８０ｍｌの４−メチル−２−ペンタノールに溶解した２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンを２０ｇ、ＮＡＤを１０ｍｇおよびピキア・スティピディスＤＳＭＺ３６５１由来の組換え酸化還元酵素を２００００Ｕ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンの９９％以上が還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールを蒸留により得た。
【０１６８】
この方法により、生成物である（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールが、＞９８％の純度、＞９９．９％のエナンチオマー過剰率で大量に得られた。
【０１６９】
８ｄ：ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素を用いた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を８ｍＬ、イソプロパノールを２４ｍｌ、４−クロロアセト酢酸エチルを８ｍｌ、ＮＡＤＰを２ｍｇおよびロイコノストック・カルノサムＤＳＭＺ５５７６由来の組換え酸化還元酵素を６．７ｋＵ（＝６ｍｌ）含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した４−クロロアセト酢酸エチルの９９％以上が、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに還元されていた。ロータリーエバポレータを用いて２−プロパノールの第一の除去を行い、反応混合物を再処理した。次いで、反応混合物を酢酸エチルにより抽出し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去し、未精製の生成物を得た。この方法により得られる未精製の生成物（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルは、エナンチオマー過剰率が＞９９．５％であった。
【０１７０】
８ｅ：ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来の酸化還元酵素を用いた（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１０％グリセロール、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）を１ｍＬ、４−メチル−２−ペンタノールを３ｍｌ、１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オンを１ｍｌ、ＮＡＤを２ｍｇおよびミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の組換え酸化還元酵素を０．７ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オンの９０％以上が、（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールに還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールを蒸留により得た。この方法により得られた未精製の生成物（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールは、エナンチオマー過剰率が＞９９．５％であった。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法であり、ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法に関する。さらに本発明は、ケト化合物をキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に還元するときに用いる新規な酸化還元酵素に関する。
【０００２】
光学活性ヒドロキシ化合物は、薬理活性のある化合物、芳香剤、フェロモン、農薬および酵素阻害剤の合成に幅広く応用できる有用なキラル合成子（ｃｈｉｒｏｎ）である。将来、おそらくラセミ化合物は医薬品としてほとんど使われなくなるため、キラル化合物およびキラル合成技術の需要の増加が、とりわけ製薬業界において注目されている。
【０００３】
プロキラルケト化合物の不斉還元は立体選択性触媒の分野であり、その中で生体触媒は、化学触媒に対する強力な競合技術である。化学的な不斉水素付加では、毒性が強く環境に有害である重金属触媒を使用する必要がある。また、大量の有機溶媒だけでなく、過度で、そのためエネルギーを大量消費する反応条件も必要となる。さらには、これらの方法には、副反応が生じ、エナンチオマー過剰率が不十分であるという特徴が頻繁にみられる。
【０００４】
現実には、全ての個体内で、プロキラルケト化合物からヒドロキシ化合物への還元およびその逆の反応が、多くの生化学的経路において、一次代謝および二次代謝のいずれにおいても起こっており、様々なタイプの第二級アルコール脱水素酵素および酸化還元酵素による触媒反応が起こっている。通常、これらの酵素は補因子依存性である。
【０００５】
プロキラルケト化合物をキラルヒドロキシ化合物に還元するために生体触媒を用いる基本的な実行可能性は、モデルシステムに基づきこれまでに繰り返し示されてきており、そこでは、単離した酸化還元酵素および様々な全細胞生体内変換システム（whole-cell biotransformation systems）が研究に用いられている。その結果、反応条件が穏やかであり、副生成物が生成されず、また、ときには極めて優れたエナンチオマー過剰率を達成できる点において、本生体触媒のアプローチは、本質的に利点があることが明らかになっている。
【０００６】
生成物の単離に関してはもとより、達成できるエナンチオマー過剰率、分解産物および副生成物の形成に関しても、単離した酵素を使用する方法は、全細胞系も含めた方法よりも有利である。さらに、全細胞処理を利用するには、特定の設備およびノウハウが必要であるため、必ずしも全ての化学企業に利用可能というわけではない。
【０００７】
近年、有機溶媒を用いた水／有機二相システムにおける単離酸化還元酵素の使用は、効率が極めて高く経済的であり、かつ高濃度（＞５％）でも使用可能であることが、実証できてきている。還元されるケト化合物は、通常は水に難溶であるが、上述したシステムにおいては、還元されるケト化合物は有機溶媒とともに有機相を形成している。また、有機溶媒そのものを、部分的に用いずに済ますことができる。この場合には、有機相は、還元されるケト化合物により形成されている（ＤＥ１０１１９２７４、ＤＥ１０３２７４５４．４、ＤＥ１０３３７４０１．９、ＤＥ１０３００３３５．５）。補酵素の再生は、同時に起こる第２級アルコールの酸化によって達成される。このために、多くの場合には、安価な水混和２−プロパノールが用いられる。
【０００８】
エナンチオ選択性が高く、適したＲ−およびＳ−特異的酸化還元酵素および脱水素酵素の例としては：
カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来のカルボニル還元酵素（ＣＰＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３およびＵＳ５，７６３，２３６（Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15（11）:950-8））およびピキア・カプスラタ（Pichia capsulata）のカルボニル還元酵素（ＤＥ１０３２７４５４．４）。ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のカルボニル還元酵素（ＲＥＣＲ）（ＵＳ５，５２３，２２３）、ノルカルディア・フスカ（Norcardia fusca）のカルボニル還元酵素（Biosci. Biotechnol. Biochem.,63（10） （1999）, pp.1721-1729）、（Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62（4）: 380-6. Epub 2003 Apr 26）、およびロドコッカス・ルバー（Rhodococcus ruber）のカルボニル還元酵素（J Org Chem. 2003 Jan 24;68（2）:402-6.）。
【０００９】
ラクトバシルス属（ラクトバシルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）（ＵＳ５２００３３５）、ラクトバシルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（ＤＥ１９６１０９８４Ａ１）（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec;56 Pt 12:1696-8）、ラクトバシルス・ミノール（Lactobacillus minor）（ＤＥ１０１１９２７４）、またはシュードモナス（Pseudomonas）（ＵＳ０５３８５８３３）（Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug;59（4-5）:483-7. Epub 2002 Jun 26.,J. Org. Chem. 1992, 57, 1532））由来のＲ−特異的第２級アルコール脱水素酵素。
【００１０】
しかしながら、現在知られている酵素では、ケト化合物の立体選択的還元に関する市場のポテンシャル全体を生かすには到底十分ではない。一方、このことは、各酵素が、温度安定性および溶媒安定性はもとより、基質範囲、至適ｐＨ条件について、大きな性質の違いがあるという事実により説明できる。これらの違いはしばしば、各酵素がお互いに補完している。そのため、比較的に類似した相同な酵素であっても、ある特定の基質について全く異なる変換様式を示すことがある。一方、記載されているほとんど全ての酵素がクローン化されておらず、十分な量まで大量発現させられるものではない。このことは、これらの酵素が産業利用できるものではないことを意味している。酵素による不斉水素付加の合成ポテンシャルを可能な限り広範囲に生かすために、可能な限り幅広く異なる産業に利用し得る酸化還元酵素であり、有機溶媒を含む水／有機二相システムにおける使用に適している酸化還元酵素の製品ラインを保有していることが必須である。
【００１１】
本発明の内容は、ケト化合物を対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法に加えて、大腸菌（Escherichia coli）（＞５００ｕｎｉｔｓ／ｇ Ｅ．ｃｏｌｉウェットバイオマス）において優れた発現性を有していることはもとより、水／有機二相システムにおいて安定性に優れていることを特徴とする、複数の新規な、エナンチオ選択的Ｒ−およびＳ−特異的酸化還元酵素である。
【００１２】
本発明に係る酸化還元酵素は、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、からなることを特徴としている。
【００１３】
配列番号１に示されるポリペプチドは、酵母、特にロドトルラ（Rhodotorula）属の酵母、特にロドトルラ・ムシラギノサ（Rhodotorula mucilaginosa）から得ることができる。
【００１４】
本発明のさらなる内容は、配列番号９に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。
【００１５】
ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、例えば、２−オクタノンをＳ−２−オクタノールに還元し、２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化する。ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、例えば、ＳＤＳ−ゲルにより決定される分子量が３０±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは、７．０から８．０までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは、８．５から１０．０までの範囲内である。ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性およびｐＨ安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあり温度が３５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。さらには、ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素は、有機溶媒中で高い安定性を示す。
【００１６】
配列番号２または配列番号８に示されるポリペプチドは、酵母、特にピキア属、カンヂダ属、パチソレン（Pachysolen）属、デバロミセス（Debaromyces）属またはイッサチェンキア（Issatschenkia）属の酵母、特にピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）ＤＳＭＺ３３１６またはカンジダ・ネモデンドラ（Candida nemodendra）ＤＳＭＺ７０６４７から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１０に示される核酸配列および配列番号１６に示される核酸配列であり、これらの核酸配列は、それぞれ、配列番号２および配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードしている。この酸化還元酵素は、２−ブタノンをＲ−２−ブタノールに優先的に還元し、２−ブタノールの二つの鏡像異性体のうちからＲ−２−ブタノールを優先的に酸化する。
【００１７】
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、Ｒ−２−オクタノールよりもＲ−２−ブタノールおよび２−プロパノールに対して極めて高い活性を示し、さらにこの酵素は、２−オクタノンよりもアセトンおよび２−ブタノンに対して極めて高い活性を示す。
【００１８】
一方、カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、Ｒ−２−ブタノール、２−プロパノールおよびＲ−２−オクタノールの何れに対しても同じような活性を示し、さらにこの酵素は、２−オクタノンに対してほぼ同様の活性を示す。
【００１９】
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．０から６．０までの範囲内であり、酸化反応における至適ｐＨは７．５から１０までの範囲内である。ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２０】
カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨはｐＨ６であり、酸化反応の至適ｐＨは１０から１１までの範囲内である。カンジダ・ネモデンドラ由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが６．５から９．５までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２１】
配列番号３または配列番号７に示されるポリペプチドは、酵母、特にピキア属およびカンジダ属の酵母、特にピキア・スティピディス（Pichia stipidis）ＤＳＭＺ３６５１およびピキア・トレハロフィラ（Pichia trehalophila）ＤＳＭＺ７０３９１から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１１に示される核酸配列および配列番号１５に示される核酸配列であり、これらの核酸配列はそれぞれ、配列番号３および配列番号７に示されるポリペプチドをコードしている。
【００２２】
ピキア属およびカンジダ属の酵母由来のカルボニル還元酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも６５％が一致しているかまたは配列番号７に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％が一致しており、２−オクタノンをＳ−２−オクタノールに優先的に還元し、２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化する。これらの酵素はとりわけ、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することに適している。
【００２３】
ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３６±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．５から６．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは６．５から８．０までの範囲内である。ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素は、優れたｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが５．５から１０までの範囲内にあっては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２４】
ピキア・トレハロフィラ由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３６±２ｋＤａであるホモマー（homomer）である。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは７から７．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７から８までの範囲内である。
【００２５】
配列番号４に示されるポリペプチドは、ロイコノストック（Leuconostoc）綱の細菌、特にロイコノストック・カルノサム（Leuconostoc carnosum）ＤＳＭＺ５５７６から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１２に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、とりわけ、２−オクタノンからＲ−２−オクタノールへの還元およびＲ−２−オクタノールの酸化に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＳ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００２６】
ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が２７±２ｋＤａであるホモダイマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは５．０から６．０までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは６．０から９．０までの範囲内である。ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が３５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２７】
配列番号５に示されるポリペプチドは、アクチノバクテリア（Actinobacteria）綱の細菌、特にミクロバクテリウム（Microbacterium）綱の細菌、特にミクロバクテリウム・スピーシーズ（Microbacterium spec.）ＤＳＭＺ２００２８から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１３に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００２８】
ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の酸化還元酵素は、例えば、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が３５±２ｋＤａであるホモテトラマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは６．０から７．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７．５から９．５までの範囲内である。ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が５０℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００２９】
配列番号６に示されるポリペプチドは、アクチノバクテリア綱の細菌、特にゴルドニア（Gordonia）綱の細菌、特にゴルドニア・ルブリペルティンクタ（Gordonia rubripertincta）ＤＳＭＺ４３５７０から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１４に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００３０】
ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０由来の酸化還元酵素は、ＳＤＳ−ゲルにより決定した分子量が４１±３ｋＤａであるホモマーである。上記酸化還元酵素における還元反応の至適ｐＨは４．５から５．５までの範囲内であり、酸化反応の至適ｐＨは７．５から９．５までの範囲内である。ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０由来の酸化還元酵素は、優れた温度安定性、ｐＨ安定性および溶媒安定性を示し、ｐＨが４．５から１０までの範囲内であり温度が５５℃以下においては、インキュベーションが数時間にわたっても、失活はわずかである。
【００３１】
配列番号１２９に示されるポリペプチドは、酵母、特にロデロミセス（Lodderomyces）属の酵母、特にロデロミセス・エロンギスポラス（Lodderomyces elongisporus）ＤＳＭＺ７０３２０から得ることができる。本発明のさらなる内容は、配列番号１３０に示される核酸配列であり、この核酸配列は、配列番号１２９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードしている。このポリペプチドは、２−オクタノンからＳ−２−オクタノールへの還元に非常に適しており、また２−オクタノールの二つの鏡像異性体のうちからＳ−２−オクタノールを優先的に酸化することに非常に適している。本ポリペプチドはまた、４−ハロアセト酢酸エステルをＲ−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルに還元することにも非常に適している。
【００３２】
さらに本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるアミノ酸配列からなる酸化還元酵素またはこれらのホモログであり、Ｎ側末端またはＣ側末端においてさらなるポリペプチドとペプチド性に連結している酸化還元酵素を表すことを特徴とする融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、例えば、他のタンパク質の中から、より容易に分離でき、組み換えにより大量に発現させることができる。
【００３３】
さらに本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはこれらのホモログに特異的に結合する抗体に関する。これらの抗体の産生は、適切な哺乳動物の免疫化およびその後の抗体の回収という公知の方法により行われる。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。
【００３４】
アミノ酸配列の比較は、例えば、ＥＭＢＬ，ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースのみならずＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどのタンパク質データベースを用い、インターネットを介して、ＦＡＳＴＡプログラムまたはＢＬＡＳＴプログラムにより実施できる。
【００３５】
以上の実施により、ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignement Search Tool）（Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268）アルゴリズムの手法により最適なアラインメントを決定できる。ベースとして、配列の類似性を評価するスコアリングマトリックスとしてＰＡＭ３０マトリックスを用いた（Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C. 1978. "A model of evolutionary change in Proteins" in "Atlas of Protein Sequence and structure" 5（3） M.O. Dayhoff （ed) 345-352, National Biomedical Research foundation）。
【００３６】
さらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり２６以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００３７】
本発明のさらなる内容は、ＭＰＡＴＬＲＬＤＫ（配列番号１７）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＱＡＬＡＡＰＳＮＬＡＰＫＡ（配列番号１８）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＶＥＩＩＫＴＱＶＱＤ（配列番号１９）、ＫＶＡＩＩＴＧＧＡＳＧＩＧＬ（配列番号２０）、ＳＣＹＶＴＰＥＧ（配列番号２１）、ＴＤＦＫＶＤＧＧ（配列番号２２）、ＶＭＦＮＮＡＧＩＭＨ（配列番号２３）およびＶＨＡＲＥＧＩＲＩＮ（配列番号２４）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００３８】
さらに、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１５以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００３９】
本発明のさらなる内容は、ＭＡＹＮＦＴＮＫＶＡ（配列番号２５）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＴＴＬＬＶＤＧＧＹＴＡＱ（配列番号２６）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＥＹＫＥＡＡＦＴＮ（配列番号２７）、ＮＫＶＡＩＩＴＧＧＩＳＧＩＧＬＡ（配列番号２８）、ＤＶＮＬＮＧＶＦＳ（配列番号２９）、ＨＹＣＡＳＫＧＧＶ（配列番号３０）、ＮＣＩＮＰＧＹＩ（配列番号３１）およびＬＨＰＭＧＲＬＧＥ（配列番号３２）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４０】
さらに、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１５以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４１】
本発明のさらなる内容は、ＭＳＩＰＡＴＱＹＧＦＶ（配列番号３３）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＳＡＹＥＧＲＶＶＦＫＰ（配列番号３４）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＣＨＳＤＬＨＡＩＹ（配列番号３５）、ＧＹＱＱＹＬＬＶＥ（配列番号３６）、ＴＦＤＴＣＱＫＹＶ（配列番号３７）、ＬＬＴＰＹＨＡＭ（配列番号３８）、ＬＶＳＫＧＫＶＫＰ（配列番号３９）、ＧＡＧＧＬＧＶＮＧ（配列番号４０）、ＩＱＩＡＫＡＦＧＡＴ（配列番号４１）およびＬＧＳＦＷＧＴＳ（配列番号４２）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４２】
さらに、本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１８以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４３】
本発明のさらなる内容は、ＭＴＤＲＬＫＮＫＶＡ（配列番号４３）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＡＥＦＶＶＤＧＧＹＬＡＱ（配列番号４４）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＶＶＩＴＧＲＲＡＮ（配列番号４５）、ＧＧＡＳＩＩＮＭＳ（配列番号４６）、ＴＱＴＰＭＧＨＩ（配列番号４７）およびＧＹＩＫＴＰＬＶＤＧ（配列番号４８）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４４】
さらに、本発明は、配列番号５に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり１８以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４５】
本発明のさらなる内容は、ＭＫＡＬＱＹＴＫＩＧＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＬＡＡＧＴＶＲＧＲＡＶＩＶＰ（配列番号５０）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、ＣＨＳＤＥＦＶＭＳＬＳＥ（配列番号５１）、ＶＹＧＰＷＧＣＧＲＣ（配列番号５２）、ＶＳＬＴＤＡＧＬＴＰＹＨＡ（配列番号５３）、ＬＲＡＶＳＡＡＴＶＩＡＬ（配列番号５４）およびＤＦＶＧＡＤＰＴＩ（配列番号５５）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４６】
同様に、本発明は、配列番号６に示されるアミノ酸配列の断片であり、１断片あたり２６以上のアミノ酸からなる複数の断片を表していることを特徴とするタンパク質断片に関する。
【００４７】
本発明のさらなる内容は、ＭＫＡＩＱＩＩＱ（配列番号５６）のアミノ酸配列をＮ末端に含み、および／または、ＤＬＲＧＲＡＶＶＶＰ（配列番号５７）のアミノ酸配列をＣ末端に含み、および／または、ＴＡＡＧＡＣＨＳＤ（配列番号５８）、ＴＰＹＨＡＩＫＰＳＬＰ（配列番号５９）、ＤＦＶＧＬＱＰＴ（配列番号６０）、ＶＹＧＡＷＧＣＧ（配列番号６１）、ＤＤＡＲＨＬＶＰ（配列番号６２）、ＭＴＬＧＨＥＧＡ（配列番号６３）およびＧＧＬＧＨＶＧＩＱＬＬＲＨＬ（配列番号６４）の内部部分配列の何れか一つを含んでいる、微生物のカルボニル脱水素酵素に関する。
【００４８】
さらに、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるカルボニル還元酵素またはこれらのホモログをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むクローニングベクターに関する。また、本発明は、カルボニル還元酵素の他に、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素またはグルコース脱水素酵素などのＮＡＤ（Ｐ）の再生に適した酵素をコードしているクローニングベクター、を含んでいる。
【００４９】
さらに、本発明は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞にある発現ベクターであり、かつ、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示されるカルボニル還元酵素またはこれらのホモログをコードし、適当な手段により発現制御配列とつながっている核酸配列を含んでいる発現ベクターに関する。さらに、本発明は、上記の発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされている細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である組換え宿主細胞、および、上記組換え宿主細胞を培養することによりカルボニル還元酵素を取得するための生成方法に関する。
【００５０】
適したクローニングベクターとしては、例えば、ｐｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＤｒｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｑｕｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）、ｐＳ Ｂｌｕｅ、ｐＥＴ Ｂｌｕｅ、ｐＥＴ ＬＩＣ−ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ、マディソン、米国）およびＴＡ−ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーエ、ドイツ）である。
【００５１】
適した発現ベクターとしては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＵＣ、ｐＴＺ、ｐＳＫ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＱＥ、ｐＥＴ、ＰＨＵＢ、ｐＰＬｃ、ｐＫＣ３０、ｐＲＭ１／ｐＲＭ９、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＡＳ１、ｐＧＥｘ、ｐＭＡＬまたはｐＴｒｘである。
【００５２】
適した発現制御配列としては、例えば、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）プロモータ、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータまたはλｐＬプロモータである。
【００５３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはそれらのホモログは、上述した組換え大腸菌を培養し、各酸化還元酵素の発現を誘導し、その後１０時間から１８時間後に、超音波処理、球状のミル内のグラスビーズによる湿式研削（wet grinding）（Ｒｅｔｓｃｈ、ＧｍｂＨ、Ｈａａｎ Ｇｅｒｍａｎｙ １０ｍｉｎ、２４Ｈｚ）または高圧ホモジェナイザーにより、細胞を破砕する、といった方法により得ることができる。得られた細胞抽出物は、直接使用してもよく、またはさらに精製してもよい。このために、細胞抽出物を例えば遠心分離し、得られた上清は、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーなどによるイオン交換クロマトグラフィーに供される。
【００５４】
さらに、本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法、に関する。
【００５５】
本発明に係る方法のさらに好ましい形態は、上記ケト化合物は下記一般式Ｉで表され、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２ ・・（Ｉ）
Ｒ１は、
（１）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル基、
（２）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルケニル基、
（３）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルキニル基、
（４）−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（５）−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（６）非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環、または、
（７）−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル基、
の何れか１つを表し、上記（１）から（７）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されており、
Ｒ２は、
（８）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
（９）直鎖状または分枝鎖状であり３以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル基、
（１０）直鎖状または分枝鎖状であり２以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル基、または、
（１１）直鎖状または分枝鎖状であり、かつ、非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
の何れか１つを表し、上記（８）から（１１）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、ことを含んでいる。
【００５６】
さらに、本発明は、ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１３０からなる群より選択される１つの核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、または
（ｂ）上記（ａ）に記載されている核酸配列の１つに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の相補鎖の核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、
を用いることを特徴とする方法に関する。
【００５７】
用語「アリール」は、６から１４個の炭素原子を環に含む芳香族炭素部分であることが理解される。−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール部分としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基および２−ナフチル基などのナフチル基、２−ビフェニリル基、３−ビフェニリル基および４−ビフェニリル基などのビフェニリル基、アントリル基またはフルオレニル基が挙げられる。アリール部分としては、ビフェニリル部分、ナフチル部分、および、特にフェニル部分が好ましい。用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の族から選択される元素であることが理解される。用語「−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル」は、炭素鎖が直鎖状または分枝鎖状であり、１から２０個の炭素原子を含む炭化水素部分であることが理解され、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノネニル基またはデカニル基が挙げられる。用語「−（Ｃ０）−アルキル」は、共有結合であることが理解される。
【００５８】
用語「−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル」は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基またはシクロヘプチル基などの環状炭化水素部分であることが理解される。
【００５９】
用語「−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環」は、単環式または二環式で、部分的または完全に飽和している五員環から十四員環の複素環を表している。Ｎ、ＯおよびＳがヘテロ原子の例である。用語「−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環」の例としては、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、１，２，３，５−オキサチアジアゾール−２−オキシド、トリアゾロン、オキサジアゾロン、イソオキサゾロン、オキサジアゾリジネジオン、Ｆまたは−ＣＮまたは−ＣＦ３または−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで置換したトリアゾール、３−ヒドロキシピロ−２，４−ジオン、５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルボリン、および上記複素環のベンズ−アネレート化（benz-anellated）またはシクロペンタ−もしくはシクロヘキサ−もしくはシクロヘプタ−アネレート化誘導体（anellated derivative）、由来の部分が挙げられる。２−または３−ピロリル基、４−または５−フェニル−２−ピロリル基などのフェニルピロリル基、２−フリル基、２−チエニル基、４−イミダゾリル基、１−メチル−２−、−４−または−５−イミダゾリル基などのメチルイミダゾリル基、１，３−チアゾール−２−イル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−、３−または４−ピリジル−Ｎ−オキシド、２−ピラジニル基、２−、４−または５−ピリミジニル基、２−、３−または５−インドリル基、１−メチル、５−メチル、５−メトキシ−、５−ベンジロキシ−、５−クロロ−または４，５−ジメチル−２−インドリル基などの置換２−インドリル基、１−ベンジル−２−または−３−インドリル基、４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル基、シクロヘプタ[ｂ]−５−ピロリル基、２−、３−または４−キノリル基、１−、３−または４−イソキノリル基、１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル基、２−キノキサリニル基、２−ベンゾフラニル基、２−ベンゾ−チエニル基、２−ベンゾオキサゾリル基またはベンゾチアゾリル基またはジヒドロピリジニル基、２−または３−（Ｎ−メチルピロリジニル）基などのピロリジニル基、ピペラジニル基、モルフォリニル基、チオモルフォリニル基、テトラヒドロチエニル基、またはベンゾジオキソラニル基が特に好ましい。
【００６０】
式Ｉの化合物としては、例えば、４−クロロアセト酢酸エチル、アセト酢酸メチル、８−クロロ−６−オキソオクタン酸エチル、３−オキソ吉草酸エチル、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、２−オキソ吉草酸エチル、２−オキソ−４−フェニル酪酸エチル、ピルビン酸エチル、フェニルグリオキシル酸エチル、１−フェニル−２−プロパノン、２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オン、アセトフェノン、２−オクタノン、３−オクタノン、２−ブタノン、１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オン、２，５−ヘキサンジオン、１，４−ジクロロ−２−ブタノン、アセトキシアセトン、塩化フェナシル、４−臭化アセト酢酸エチル、１，１−ジクロロアセトン、１，１，３−トリクロロアセトン、または１−塩化アセトンが好ましい。
【００６１】
本発明に係る方法においては、酸化還元酵素を、完全に精製した状態または部分的に精製した状態で用いることができ、または、本発明に係る酸化還元酵素を有する細胞を用いて本発明の方法を実行することができる。それにより、使用する細胞を、そのままの状態、透過性にした状態または溶解した状態で提供できる。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１２９に示される酸化還元酵素またはそのホモログのクローン化酸化還元酵素をそれぞれ用いることが好ましい。
【００６２】
変換に用いる式Ｉに示される化合物１ｋｇあたり、５．０００から１０００万Ｕの酸化還元酵素が使用される（上限はない）。１Ｕの酵素ユニットは、式Ｉに示される化合物を１分間あたりに１μｍｏｌ変換するために必要な酵素量に相当する。
【００６３】
酵素還元そのものは穏やかな条件化で進行するため、生成されたアルコールがさらに反応することはない。本発明に係る方法によれば、生成されるキラルアルコールの滞留時間が長く、生成されるキラルアルコールが通常９５％以上のエナンチオマー純度を示し、用いるケト化合物の量と対比したときの収率がよい。
【００６４】
本発明に係る方法において、用いるカルボニル化合物の量は、全体の量に対して、３％から５０％までであり、好ましくは５％から４０％までであり、特に好ましくは１０％から３０％までである。
【００６５】
さらに、本発明の好ましい実施形態は、還元の過程で形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰを、補基質を用いてそれぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに継続的に還元することを特徴とする。
【００６６】
その際に、用いる補基質としては、エタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−ヘプタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールなどの第１級および第２級アルコールが好ましい。
【００６７】
上記補基質が反応して、対応するアルデヒドまたはケトンが生じ、また、酸化還元酵素およびＮＡＤまたはＮＡＤＰを利用してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをそれぞれ生じさせる。その結果、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがそれぞれ再生される。その結果、再生に用いる補基質の割合は、全体量の５から９５体積％濃度の範囲である。
【００６８】
補因子を再生するために、アルコール脱水素酵素をさらに添加することができる。適したＮＡＤＨ依存性アルコール脱水素酵素は、例えば、パン酵母、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、カンジダ・パラプシロシス、またはピキア・カプスラタから得ることができる。さらに適したＮＡＤＰＨ依存性アルコール脱水素酵素は、ラクトバシルス・ブレビス（ＤＥ１９６１０９８４Ａ１）、ラクトバシルス・ミノール（ＤＥ１０１１９２７４）、シュードモナス（ＵＳ５，３８５，８３３）、またはサーモアナエロビウム・ブロッキ（Thermoanaerobium brockii）が保持している。これらのアルコール脱水素酵素の適した補基質は、上述のように、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−オクタノールまたはシクロヘキサノールなどの第二級アルコールが挙げられる。
【００６９】
さらに、例えばＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性ギ酸脱水素酵素を用いると、効率的に補因子を再生することができる（Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase）。ギ酸脱水素酵素の適した補基質としては、例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウムまたはギ酸カルシウムなどのギ酸塩が挙げられる。しかしながら、本発明に係る方法は、このように脱水素酵素を追加することなく実施されることが好ましく、すなわち、基質に連動した補酵素の再生が行われる。
【００７０】
酵素還元が進行する反応混合液の水相部分は、例えば、５から１０までのｐＨ値、好ましくは６から９までのｐＨ値である、リン酸カリウム緩衝液、トリス／ＨＣｌ緩衝液またはトリエタノールアミン緩衝液などの緩衝液を含んでいることが好ましい。さらに、緩衝液は、酵素を安定化し活性化するために、例えば、亜鉛イオンまたはマグネシウムイオンなどのイオンを含んでいてもよい。
【００７１】
本発明に係る方法を実施している間、温度は適切に１０℃から７０℃、好ましくは２０℃から４０℃までの範囲内にある。
【００７２】
本発明に係る方法のさらに好ましい実施形態においては、水と混和しない有機溶媒、または限られた量しか水と混和しない有機溶媒の存在下で、酵素による変換がなされる。上記溶媒としては、例えば、対称もしくは非対称のジ（Ｃ１−Ｃ６）アルキルエーテル、直鎖状もしくは分枝鎖状アルカンまたはシクロアルカン、または同時に補基質にもなる水溶性第二級アルコール、などが挙げられる。有機溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ｔｅｒｔブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン、２−オクタノール、２−ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノールまたはシクロヘキサンが好ましい。溶媒は、同時に、補因子の再生のための補基質として働くこともできる。
【００７３】
水不溶性の溶媒および補基質をそれぞれ用いると、反応バッチ（batch）は、水相と有機相とからなる。基質はその溶解度にしたがって、有機相と水相との間に分布する。有機相は、反応ボリューム全体に対して、通常５％から９５％の割合を占め、好ましくは１０％から９０％の割合を占める。二つの液相の間に生じる面が大きくなるように、二つの液相を機械的に混合することが好ましい。また本実施形態においては、上述したように、酵素還元の間に形成されるＮＡＤまたはＮＡＤＰのそれぞれを、補基質を用いて、再びＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨにそれぞれ還元できる。
【００７４】
水相中の補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度は、通常０．００１ｍＭから１ｍＭまでの範囲内であり、０．０１ｍＭから０．１ｍＭまでの範囲内が好ましい。
【００７５】
本発明に係る方法において、酸化還元酵素／脱水素酵素の安定剤をさらに用いることができる。適した安定剤としては、例えば、グリセロール、ソルビトール、１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００７６】
本発明に係る方法は、例えば、ガラスまたは金属で作られている閉反応ベッセル（vessel）中で実施される。このために、各成分を別個に反応ベッセルに移し入れ、例えば窒素または空気などの雰囲気下で攪拌する。反応時間は、１時間から４８時間の範囲内であり、とりわけ２時間から２４時間の範囲内である。
【００７７】
次いで、反応混合物を処理する。このために、水相を分離し、有機相を濾過する。水相をもう一度抽出してもよく、有機相のようにさらに処理してもよい。その後に濾過した有機相から溶媒を蒸発させてもよい。
【００７８】
また、本発明は、式ＩＩで表されるキラルヒドロキシ化合物を取得する方法であって、
Ｒ１−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ２ （ＩＩ）
Ｒ１およびＲ２は上述の通りであり、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および１２９に示される本発明に係る酸化還元酵素ならびにそのホモログの何れか１つ、ＮＡＤ（Ｐ）および水の存在下で、式ＩＩのラセミ化合物を含む混合物をインキュベートし、それにより式ＩＩのヒドロキシ化合物のエナンチオマーが対応するケト化合物およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換され、かつ
（ｂ）残存する式ＩＩのヒドロキシ化合物のエナンチオマーを単離する、
ことを特徴とする方法に関する。
【００７９】
配列番号１、３、５、６、７および１２９に示されるカルボニル還元酵素を用いると、対応するキラルＲ−ヒドロキシ化合物が優先的に得られる。配列番号２、４および８に示されるカルボニル還元酵素を用いると、対応するキラルＳ−ヒドロキシ化合物が優先的に得られる。
【００８０】
反応条件は、式Ｉのケト化合物をエナンチオ特異的に還元する上述した方法と基本的には同じである。しかしながら、式ＩＩの化合物のラセミ混合物から式Ｉのケト化合物をエナンチオ選択的に還元する代わりに、式ＩＩのヒドロキシ化合物の一方のエナンチオマーのみをエナンチオ選択的に対応するケト化合物に酸化する。それにより、式ＩＩのヒドロキシ化合物のもう一方のエナンチオマーが残り、単離できる。さらに、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノールまたは２−オクタノールなど補基質として用いたアルコールの代わりに、アセトンなど、これらのアルコールに対応するケトンが、ＮＡＤの再生プロセスに用いられる。例えば、アセトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、本発明に係る酸化還元酵素または追加した脱水素酵素により、ＮＡＤおよびイソプロパノールに変換される。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例によりさらに詳細に説明される。
【００８２】
〔実施例１：生物の培養およびカルボニル還元酵素活性のスクリーニング〕
スクリーニングとして、酵母菌株であるロドトルラ・ムシラギノサＤＳＭＺ７０８２５、ピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６、カンジダ・ネモデンドラＤＳＭＺ７０６４７、ピキア・スティピディスＤＳＭＺ３６５１、ピキア・トレハロフィラＤＳＭＺ７０３９１、およびロデロミセス・エロンギスポラスＤＳＭＺ７０３２０を以下の培地において培養した。この培地には、酵母エキス（３）、麦芽エキス（３）、ペプトン（５）、およびグルコース（１０）が含まれている（カッコ内に示した数値は、いずれも、ｇ／ｌを示す）。この培地を１２１℃で滅菌した。また、上記酵母を、それ以上ｐＨ調節をすることなく、２５℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）する攪拌機において培養した。
【００８３】
ロイコノストック・カルノサムＤＳＭＺ５５７６を、以下の培地において培養した。この培地には、グルコース（２０）、酵母エキス（５）、肉エキス（１０）、クエン酸水素二アンモニウム（２）、酢酸ナトリウム（５）、硫酸マグネシウム（０．２）、硫酸マンガン（０．０５）、およびリン酸水素二カリウム（２）が含まれている。この培地を１２１℃で滅菌した。また、上記菌株を、それ以上ｐＨ調節をすることなく、またさらなる酸素の供給もせずに、３０℃で培養した。
【００８４】
ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８を、酵母エキス（３）およびトリプチカーゼ大豆粉（３０）を含む培地において、３０℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）させながら培養した。
【００８５】
ゴルドニア・ルブリペルティンクタＤＳＭＺ４３５７０を、酵母エキス（４）、グルコース（４）、麦芽エキス（１０）、および炭酸カルシウム（２）を含む培地において、３７℃で１分間につき１６０回転（ｒｐｍ）させながら培養した。
【００８６】
次に、８００μｍの分解バッファー（１００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ＝７．０）によって再懸濁した１２５ｍｇの細胞を、球状のミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製）において、１ｇのグラスビーズと混合し、４℃で１０分間分解した。１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後に得られる上清（溶解物）を、以下に示す活性スクリーニングにおいて、エナンチオマー過剰率（ｅｅ−評価）を測定するために用いた。また、基質として、２−ブタノン、２−オクタノン、４−クロロアセト酢酸エチル、アセトフェノン、または２−オキソ−４−フェニル酪酸エチルのような種々のケトンを用いた。
【００８７】
活性スクリーニングのバッチ：
８６０μｌ ０．１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＰＯ４ 、ｐＨ＝７．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２
２０μｌ ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ（１０ｍＭ）
２０μｌ 溶解物
１００μｌ 基質（１００ｍＭ）
３４０ｎｍを１分間で反応を追跡した（pursued）。
【００８８】
ｅｅ−評価測定のバッチ：
２０μｌ 溶解物
１００μｌ ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ（５０ｍＭ）
６０μｌ 基質（１００ｍＭ）
２４時間後（ｈ）、ｅｅ−測定のバッチを、例えばクロロホルムを用いて抽出した。また、エナンチオマー過剰率をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した。なお、エナンチオマー過剰率は次のとおりに算出される：
ｅｅ（％）＝（（Ｒ‐アルコール−Ｓ‐アルコール）／（Ｒ‐アルコール＋Ｓ‐アルコール））×１００
【００８９】
【表１】
【００９０】
ここで、ＤＳＭＺは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，３８１２４ブラウンシュワイクを表す。酵素単位の定義として：１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの基質を変換させるために必要とされる酵素の量に相当する。
【００９１】
〔実施例２：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性微生物酸化還元酵素の分離および精製〕
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性微生物酸化還元酵素を分離するために、実施例１において記載したように微生物を培養した。定常期に達した後、この微生物の細胞を集菌し、遠心分離によって培地から分離した。酵素の放出は、グラスビーズにより湿式研削することによって生じるが、その他の分解方法によって放出してもよい。このため、例えば、１００ｇの湿潤細胞集団を、４００ｍｌの分解バッファー（１００ｍＭトリエタノールアミン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．０）によって懸濁し、加圧型細胞破壊装置によってホモジェナイズした。
【００９２】
次に、遠心分離（７，０００ｒｐｍ）により得られた粗抽出物を、さらにＦＰＬＣ（ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー）によって精製した。
【００９３】
本発明に係るすべての酸化還元酵素は、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）またはＵｎｏＱ（Ｂｉｏｒａｄ社製，ミュンヘン，ドイツ）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびゲル・パーミエーションの様々な組み合わせによって精製されてもよい。
【００９４】
〔実施例２ａ：ピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６由来のＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素の精製〕
タンパク質分離のために、遠心分離後に得られるピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６の溶解物を、１００ｍＭトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ＝７．０、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）によって平衡化されたＢｕｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−カラムに直接のせ、直線塩勾配を下げることによって溶出した。酸化還元酵素含有分画を混合し、限外ろ過法（排除限界は１０ｋＤａである）によって適当な量に濃縮した。
【００９５】
次に、酸化還元酵素の濃縮した分画を、さらにＵｎｏＱによって精製した。また、この酸化還元酵素を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＵｎｏＱ‐カラム（Ｂｉｏｒａｄ社製）に直接のせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。このため、酸化還元酵素は結合することなく０Ｍ ＮａＣｌで溶出されたが、その一方、不純物の大部分は結合され、高い塩濃度で溶出された。
【００９６】
また、第３の精製工程を、セラミックヒドロキシルアパタイトカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行った。酸化還元酵素を、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって平衡化されたカラムにのせ、より高いバッファー濃度（４００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって溶出した。このとき、酸化還元酵素は８０−１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーにおいて溶出された。
【００９７】
その結果、得られた精製酸化還元酵素の分子量を、ゲル・パーミエーション（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，１００ｍＭトリエタノールアミン，ｐＨ＝７、０．１５Ｍ ＮａＣｌ）によって決定した。また、分子量スタンダードとして、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、アルブミン（６９．８ｋＤａ）、およびオボアルブミン（４９．４ｋＤａ）を用いた。
【００９８】
以下の表２に、得られた結果をまとめている。
【００９９】
【表２】
【０１００】
酸化還元酵素の酵素活性を、実施例１（活性スクリーニングのバッチ）によるテストシステムにおいて決定した。また、タンパク質量の測定は、ローリーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、１９３（１９５１）：２６５−２７５、またはピーターソンら、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、１００（１９７９）：２０１−２２０に準拠して実施した。タンパク質量に対する酵素活性指数は比活性度を与えるものであり、１分間あたりの１μｍｏｌの酵素の変換は１ユニット（Ｕ）に相当する。
【０１０１】
〔実施例２ｂ：ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来のＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素の精製〕
タンパク質分離のために、遠心分離後に得られるミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８の溶解物を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ−カラムにのせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。これにより、酸化還元酵素は０．６〜０．８ＭのＮａＣｌで溶出された。酸化還元酵素含有分画を混合し、限外ろ過法（排除限界は１０ｋＤａである）によって適当な量に濃縮した。
【０１０２】
次に、酸化還元酵素の濃縮した分画を、さらにＵｎｏＱによって精製した。また、この酸化還元酵素を、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）によって平衡化されたＵｎｏＱ‐カラム（Ｂｉｏｒａｄ社製）に直接のせ、直線塩勾配を上昇させることによって溶出した。これにより、酸化還元酵素は０．２〜０．２５Ｍ ＮａＣｌにおいて溶出された。
【０１０３】
また、第３の精製工程を、セラミックヒドロキシルアパタイトカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて行った。ミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の酸化還元酵素を、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって平衡化されたカラムにのせ、より高いバッファー濃度（４００ｍＭリン酸カリウムバッファー、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝６．８）によって溶出した。このとき、酸化還元酵素は８０−１００ｍＭリン酸カリウムバッファーにおいて溶出された。その後、得られた精製酸化還元酵素の分子量を、実施例２ａにおいて記載したように決定した。
【０１０４】
以下の表３に、得られた結果をまとめている。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
〔実施例３：本発明に係る酸化還元酵素のＮ−末端配列の決定〕
１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）におけるゲル・パーミエーションの後、実施例２に従って酵素調製物を分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ−膜）に転写した。
【０１０７】
顕著なバンドについて、エドマン分解（Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製））によるＮ−末端配列決定を行った。
【０１０８】
〔実施例４：酵母から単離されたエナンチオ選択的アルコール脱水素酵素の一般的なクローニング技術〕
マニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”（Molecular Cloning）に記載の方法によって、染色体ＤＮＡを抽出した。ここで得られる核酸は、縮重プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として機能する。このとき、５’−プライマーはアミノ酸配列（配列番号６６；７２；８０）に由来し、３’−プライマーはアミノ酸配列（配列番号６７；７３，８１）に由来する。なお、上記配列は生物に対して特異的な遺伝コード（配列番号６８；６９；７４；７５；８２；８３）を含んでいる。
【０１０９】
増幅は、ＰＣＲバッファー〔６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０〕、０．２ｍＭデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ）、４０ｐＭｏｌの各プライマー、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）〕により実施した。ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼの活性化（８分９５℃）および、それに続く４５〜５０サイクルのタッチダウンＰＣＲの後、この反応物を４℃に冷却し、すべてのＰＣＲバッチを、分析のため１％アガロースゲルにアプライした。
【０１１０】
ポリメラーゼ連鎖反応により得られる特異的なフラグメントを、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションし、ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーを用いて、プライマーＭ１３ｒｅｖ（配列番号６５）およびプライマーＭ１３ｕｎｉ（配列番号１２８）によって配列決定した。
【０１１１】
遺伝子をコードする配列の５’末端および３’末端領域を、ＲＡＣＥ法（rapid amplification of cDNA ends）によって決定した。特異的なフラグメントの核酸配列に基づいて、３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥのためのオリゴヌクレオチドを設計した。細胞から調製した全ＲＮＡは、３’−ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いた一本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型として機能する。次いで、３’−ＲＡＣＥオリゴヌクレオチド（配列番号７６；７７；８４；８５）よる特異的なｃＤＮＡの増幅および再増幅を行う。次に、分析のためにバッチを１％アガロースゲルにアプライする。欠損している３’側隣接配列情報を保持する特異的なフラグメントを単離し、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にライゲーションして、配列決定した。
【０１１２】
コーディングおよび非コーディング５’末端配列を、５’−ＲＡＣＥシステム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて決定した。このために、すでに得られている全ＲＮＡのｍＲＮＡを、オリゴｄＴ−セルロース（ＮＥＢ社製、ベバリー、米国）を用いて濃縮し、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号７０；７１；７８；７９；８６；８７）を用いた一本鎖ｃＤＮＡの合成に使用した。この後の、特異的ｃＤＮＡの増幅および再増幅により、分析のためにｐＣＲ２．１ＴＡクローニングベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）につなぐフラグメントが形成される。上記フラグメントを有するプラスミドを、ＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーを用いて分析した。これにより、遺伝子の５’側末端に関する欠損している配列情報が得られる。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
次に、全長遺伝子（配列番号９；１０；１１）をコードしている配列に基づいて、適当な発現システムに上記ＤＮＡ領域をクローニングするための特異的なプライマーを設計した。このため、例えば、５’プライマーに、ＮｄｅＩの認識配列、またはＳｐｈＩもしくはＢａｍＨＩの認識配列をそれぞれ修飾付加し、また３’−プライマーに、ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を修飾付加した（配列番号８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６）。
【０１１５】
その後のＰＣＲにおいて、染色体ＤＮＡは鋳型として機能する。それぞれの酸化還元酵素をコードしているＤＮＡ領域を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ポリメラーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて増幅した。１％アガロースゲルで精製した後、得られたＰＣＲ産物を、適当なＤＮＡエンドヌクレアーゼによって処理し、ｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン、米国）のバックボーン、またはｐＱＥ７０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン、ドイツ）のバックボーンそれぞれにライゲーションした。なお、このバックボーンは、同一のエンドヌクレアーゼにより処理されている。
【０１１６】
配列を決定した後、形成した発現コンストラクトは、発現菌株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国），それぞれに組み込まれる。
【０１１７】
〔実施例４ａ：酵母ピキア・ファリノサ由来のエナンチオ選択的酸化還元酵素のクローニング〕
ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素をクローニングするために、例えばマニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法に従って、染色体ＤＮＡを、ピキア・ファリノサの新たな細胞から抽出した。これにより得られた核酸は、オリゴヌクレオチド配列番号７４；７５を用いたタッチダウンＰＣＲのための鋳型として機能する。ＰＣＲサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製，ハーキュリーズ、米国）においてＢｉｏｔｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼを８分間活性化した後、下記の３０温度サイクルを、特異的ＤＮＡフラグメントを同定するためにプログラムした。
９４℃ ４５秒
６０℃−０．５℃／サイクル ４５秒
６８℃ ２分
上記サイクルに次いで、増幅シグナルを別の２０サイクルによって増幅した。
９４℃ ４０秒
５２℃ ４０秒
７２℃ １分。
【０１１８】
１％アガロースゲルにおいてすべての反応バッチを分別した後、５５０ｂｐの大きさがある特異的フラグメントが検出された。上記フラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションした。形成したプラスミドｐＣＲ２．１−ＰＦ５５０の配列決定を行った。
【０１１９】
５５０ｂｐの長さがある遺伝子フラグメントの配列解析により、１７４アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームが明らかになった。なお、ここでは、Ｎ末端および内部ペプチドの２つの配列フラグメントが検出される可能性がある。
【０１２０】
５２１ｂｐの長さがあるフラグメントのヌクレオチド配列に基づいて、３’ＲＡＣＥ（配列番号７６；７７）および５’ＲＡＣＥ（配列番号７８；７９；８８）のためのオリゴヌクレオチドを設計した。ｃＤＮＡ合成反応のために、ピキア・ファリノサ細胞由来の全ＲＮＡを次のように調製した。
【０１２１】
まず、６００ｍｇの新たな細胞を、２．５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファー中で再懸濁した。硝酸で洗浄して３ｍｌフェノール（ｐＨ７．０）により平衡化した５ｍｌ（約２０ｇ）のグラスビーズを、上記細胞の懸濁液に加えた。また、すべてのバッチをそれぞれの場合において３０秒間、全部で１０分間ボルテックスし、その後３０秒間氷で冷やした。次に、５ｍｌの氷冷ＬＥＴＳバッファーを加え、再度十分にボルテックスした。上記細胞の懸濁液を、１１，０００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。これにより、水相を復元し、同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：２４：１）により２回抽出した。その後に、クロロホルムによる抽出を行った。最後の抽出の後、全ＲＮＡを、１／１０量の５Ｍ ＬｉＣｌ２を加えることによって４時間、−２０℃で沈殿させた。３’ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。次に、特異的ｃＤＮＡを反応物において、オリゴヌクレオチド配列番号７６およびＡＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）によって増幅した。すなわち、６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］、０．２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），１０ｐＭｏｌの各プライマーおよび２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）を用いて、以下の３０温度サイクルにより合成する。この温度サイクルとは：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で１分である。
【０１２２】
ＰＣＲシグナルは、プライマー配列番号７７およびプライマーＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅させた。このときの条件は、３０温度サイクル：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で５０秒であった。その結果、約４００ｂｐの大きさがある特異的なＤＮＡフラグメントが得られた。また、このフラグメントを、１％アガロースゲルから単離した後、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。３８２ｂｐの長さがあるＤＮＡ領域の配列解析により、ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素をコードするｃＤＮＡの、終止コドンまでの３’伸長部分およびポリ−Ａループに関する配列情報が得られる。５’ＲＡＣＥ反応のために、ピキア・ファリノサ細胞から調製した５μｇの全ＲＮＡを使用した。遺伝子特異的ｃＤＮＡの合成は、５’ＲＡＣＥシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）およびオリゴヌクレオチド配列番号７８を用いて行った。結果として生じる遺伝子特異的ｃＤＮＡに対してホモポリマーｄＣＴＰ付加反応を行った。次いで、ＰＣＲ［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］、０．２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），２０ｐＭｏｌプライマー配列番号７９およびプライマーＡＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製），２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）によりｃＤＮＡを増幅した。このときの反応条件としては、３５温度サイクル：９４℃で４５秒，５４℃で４５秒，７２℃で１分３０秒に従って行った。ＰＣＲシグナルを、プライマー配列番号８８およびプライマーＵＡＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）を用いて、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅した。このときの条件は、３０温度サイクル：９４℃で４０秒，５５℃で４０秒，７２℃で１分であった。これにより、約３５０ｂｐの大きさの特異的なＤＮＡフラグメントが生じ、このフラグメントを１％アガロースゲルから溶出した後にベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションした。３５２ｂｐの長さがあるＤＮＡ領域の配列解析により、アルコール脱水素酵素／還元酵素をコードするｃＤＮＡの５’末端に関する配列情報が得られる。
【０１２３】
このように、タンパク質をコードするＤＮＡ領域は、全長７６５ｂｐ（配列番号１０）であり、２５４アミノ酸（配列番号２）のオープン・リーディング・フレームを有する。ピキア・ファリノサ細胞の染色体ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応［５０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＳＯ４；０．２ｍＭ ｄＮＴＰミックス、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，（ｐＨ８．０）、２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９１、またはそれぞれ２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９２、２０ｐＭｏｌプライマー配列番号９３、および２ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ ｐｆｘ ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］における全長ＤＮＡの生成のための鋳型として用いた。このときの温度サイクルは：
サイクル１ ９４℃， ２分
サイクル２×３０ ９４℃， １５秒
５６℃， ２０秒
６８℃， １分１５秒。
【０１２４】
１％アガロースゲルで精製した後、得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって処理するか、またはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによってそれぞれ処理した。また、上記産物を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン，米国）またはｐＱＥ７０（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン，ドイツ）のバックボーンにそれぞれライゲーションした。なお、これらのバックボーンは同一のエンドヌクレアーゼにより処理されている。２μｌのライゲーションバッチを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞を形質転換した後、アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡについて、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれの限定解析によって、ライゲーション反応の正確さをチェックした。インサートがポジティブだったベクターのＤＮＡを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）それぞれを形質転換した。
【０１２５】
〔実施例５：細菌から分離されるエナンチオ選択的酸化還元酵素の一般的なクローニング技術〕
マニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法によって、ゲノムＤＮＡを抽出した。これにより得られた核酸は、縮重プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として機能する。このとき、５’プライマーはアミノ酸配列（配列番号１０４；１１２）に由来し、３’プライマーはアミノ酸配列（配列番号１０５；１１３）に由来する。なお、これらは生物の特異的な遺伝子コード（配列番号１０６；１０７；１１４；１１５）を含んでいる。
【０１２６】
ＰＣＲバッファー［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］，０．２ｍＭデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），各４０ｐＭｏｌのプライマー、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）］を用いて増幅を行った。ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒ ポリメラーゼを活性化（８分、９５℃）した後、４５−５０サイクルのタッチダウンＰＣＲに続けて、反応物を４℃まで冷却し、分析のためにすべてのＰＣＲバッチを１％アガロースゲルにアプライした。
【０１２７】
ポリメラーゼ連鎖反応により得られる特異的なフラグメントを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションし、プライマーＭ１３ｒｅｖ（配列番号６５）およびＭ１３ｕｎｉ（配列番号１２８）を用いてＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーにより配列決定を行った。
【０１２８】
遺伝子コード配列の５’末端および３’末端領域は、インバースポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）を用いて決定される。特異的な内部フラグメントの核酸配列に基づいて、オリゴヌクレオチド配列番号１００；１０１；１０２；１０３；１０８；１０９；１１０；１１１；１１６；１１７；１１８；１１９を設計した。ゲノムＤＮＡを、制限酵素によって分解し、より小さなＤＮＡ領域が環状化できるように再ライゲーション反応に用いる。ついで、上記再ライゲーション反応の混合物は、ｉＰＣＲおよびプライマー配列番号１００；１０２；１０８；１１０；１１６；１１８の鋳型として用いられる。ＰＣＲシグナルを、プライマー配列番号１０１；１０３；１０９；１１１；１１７；１１９により、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲによって増幅する。これにより得られた特異的フラグメントを、１％アガロースゲルから溶出した後、ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にライゲーションする。
【０１２９】
このように、このフラグメントを含むベクターｐＣＲ２．１の配列解析により、アルコール脱水素酵素／酸化還元酵素遺伝子の３’および５’側領域に関する欠損している配列情報が得られる。
【０１３０】
【表５】
【０１３１】
全長遺伝子（配列番号１２；１３；１４）をコードする配列に基づいて、適切な発現システムへ上記ＤＮＡ領域をクローニングするための特異的なプライマーを設計する。このとき、５’プライマーにはＮｄｅＩの認識配列、またはＳｐｈＩもしくはＢａｍＨＩの認識配列が修飾付加され、３’プライマーにはＨｉｎｄＩＩＩの認識配列が修飾付加される（配列番号１２０；１２１；１２２；１２３；１２４；１２５；１２６；１２７）。
【０１３２】
ゲノムＤＮＡから全長ＤＮＡを増幅した後、発現ベクターへの制限およびライゲーションを、実施例３に記載したように行う。この全長ＤＮＡはタンパク質をコードしている。形成した発現コンストラクトを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，ＵＳＡ）のそれぞれを形質転換する。
【０１３３】
〔実施例５ａ：ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来のエナンチオ選択的アルコール脱水素酵素／還元酵素のクローニング〕
ミクロバクテリウムｓｐ由来の酸化還元酵素をクローニングするために、例えばマニアティスおよびサンブルックによる“モルキュラー・クローニング”に記載された方法によって、ゲノムＤＮＡをミクロバクテリウムｓｐの新たな細胞から抽出した。これにより得られる核酸は、３０ｐＭｏｌの各オリゴヌクレオチド配列番号１０６，１０７を用いたＰＣＲの鋳型として機能した。ＰＣＲサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製，ハーキュリーズ，米国）においてＢｉｏｔｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼを１０分間活性化させた後、特異的なＤＮＡフラグメントを同定するために、以下の３０温度サイクルをプログラムした：
９４℃ ５０秒
６０℃ １分
７２℃ １分
１％アガロースゲルにおいてすべての反応バッチを分別した後、約１，０００ｂｐの大きさの特異的なフラグメントが検出された。上記フラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ ＴＡ−ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ、ドイツ）にライゲーションした。形成したプラスミドｐＣＲ２．１−Ｍｓ１０００の配列決定を行った。
【０１３４】
１００２ｂｐの長さがある遺伝子フラグメントの配列解析は、Ｎ−末端および内部ペプチドの２つの配列断片が検出される可能性のある３３４アミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームを示した。
【０１３５】
１００２ｂｐの長さがあるフラグメントのヌクレオチド配列に基づいて、インバースＰＣＲ（ｉＰＣＲ）のためのオリゴヌクレオチド（配列番号１０８；１０９；１１０；１１１）を設計した。
【０１３６】
ミクロバクテリウムｓｐの細胞由来のゲノムＤＮＡ（２．５μｇ）を、５０μｌバッチにおいて２０Ｕの制限酵素ＳａｃＩによって２５分間処理した。すべてのバッチをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出した後、１／１０ｖｏｌの３Ｍ 酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）および２．５ｖｏｌのエタノールによって沈殿させた。このように分解されたＤＮＡを２５μｌのＨ２Ｏに移した。また、このうちの５μｌ（２００ｎｇ）および２ＵのＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）を用いて、総量４０μｌでの再ライゲーション反応を行った。その後、再ライゲーションされたゲノムＤＮＡ（２μｌ＝２０ｎｇ）を、ｉＰＣＲ［６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），１６ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４，１１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］，０．２ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸混合物（ｄＮＴＰｓ），３０ｐＭｏｌの各プライマー（配列番号１０８；１１０）、および２．５Ｕ ＢｉｏＴｈｅｒｍ Ｓｔａｒポリメラーゼ（Ｇｅｎｅｃｒａｆｔ社製，Ｌｕｄｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ，ドイツ）］に使用した。上記増幅を、以下のサイクルにより実施した：
サイクル１ ９５℃， １０分
サイクル２×３０ ９５℃， １分
５６℃， １分
７２℃， ２分
増幅シグナルを、オリゴヌクレオチド配列番号１０９および配列番号１１１を用いたｎｅｓｔｅｄＰＣＲにおいて増幅した。
【０１３７】
次に、増幅反応物を４℃まで冷却し、１％アガロースゲルに全体としてアプライした。これにより、約１，０００ｂｐの大きさがある特異的なフラグメントが得られた。その後、このフラグメントをゲルから溶出し、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）にライゲーションさせた。
【０１３８】
このフラグメントを含んでいるプラスミドの配列解析により、５’および３’側の隣接配列に関する情報が得られる。タンパク質をコードするＤＮＡ部分は、終止コドンで終結する全長１，０４４ｂｐの領域（配列番号１３）であり、３４７アミノ酸（配列番号５）のオープン・リーディング・フレームを示す。
【０１３９】
ＧＣ−Ｒｉｃｈ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社製，マンハイム，ドイツ）および３０ｐＭｏｌのオリゴヌクレオチド配列番号１２３または配列番号１２４のそれぞれと、３０ｐＭｏｌのオリゴヌクレオチド配列番号１２５とを用いた、タンパク質をコードする全長ＤＮＡ生成のポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として、ミクロバクテリウムｓｐ細胞のゲノムＤＮＡを用いた。このときの温度サイクルは：
サイクル１ ９５℃，３分
サイクル２×３０ ９５℃，３０秒
５９℃，３０秒
７２℃，４５秒。
【０１４０】
１％アガロースゲルを用いて精製した後、得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ、またはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより処理した。また、このＰＣＲ産物を、ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，マディソン，米国）またはｐＱＥ３２（Ｑｉａｇｅｎ社製，ヒルデン，ドイツ）それぞれのバックボーンにライゲーションした。なお、これらのバックボーンは、それぞれ同一のエンドヌクレアーゼによって処理されている。２μｌのライゲーションバッチを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ’細胞を形質転換した後、アンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡについて、エンドヌクレアーゼＮｄｅＩまたはＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのそれぞれによる限定解析により、ライゲーション反応の正確さをチェックした。インサートがポジティブであったベクターのＤＮＡを用いて、発現菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）のそれぞれを形質転換した。
【０１４１】
〔実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えアルコール脱水素酵素／還元酵素の発現〕
発現コンストラクトによって形質転換されている大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，カールスルーエ，ドイツ）およびＲＢ７９１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｔｅｉｃ ｓｔｏｃｋ社製，エール，米国）を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２００ｍｌのＬＢ−培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）において、５５０ｎｍで測定される吸光度が０．５に達するまで培養した。０．１ｍＭの濃度のイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、組換えタンパク質の発現を誘導する。８時間または１６時間後、それぞれにおいて、２５℃、２２０ｒｐｍで誘導した細胞を回収し、−２０°Ｃにおいて凍結した。活性試験のために、１０ｍｇの細胞を５００μｌのＴＥＡバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）および５００μｌのグラスビーズと共に混合し、球状ミルを用いて１０分間分解した。これにより得られた溶解物を、その後希釈状態において、各測定のために用いた。活性試験を次のように構成した：ＴＥＡバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）を８７０μｌ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを１６０μｇ、希釈した細胞溶解物を１０μｌ。反応混合物に１００ｍＭの基質溶液を１００μｌ添加することにより、反応を開始した。
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
〔実施例７：組換え酸化還元酵素の特徴づけ〕
７ａ：至適ｐＨ
表４に記載した緩衝液を調製した。それぞれにおける各緩衝液成分の濃度は５０ｍＭである。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
測定バッチ（３０℃）の至適ｐＨ還元：
表３に記載の緩衝液系 ８７０μｌ
１０ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ２０μｌ
希釈酵素 １０μｌ
およそ２分から３分間のインキュベーションを行い、次いで、
基質溶液（１００ｍＭ） １００μｌ
を添加した。
【０１４６】
酸化還元酵素に応じて、基質として２−ブタノンまたは２−オクタノンを用いた。３４０ｎｍを１分間で反応を追跡した。至適ｐＨを決定するために、表４に記載した各緩衝液における酵素反応を解析した。酸化反応の至適ｐＨを決定するために、ＮＡＤ（Ｐ）を補因子として用い、２−プロパノールまたは２−オクタノールを基質として用いた。
【０１４７】
本発明に係る酸化還元酵素についての結果を表５にまとめた。
【０１４８】
【表８】
【０１４９】
７ｂ：ｐＨ安定性
表４に記載した緩衝液系に組換え酸化還元酵素を保持し、この組換え酸化還元酵素の活性の決定を行った。このために、ｐＨ範囲が４から１１までの異なる緩衝液（５０ｍＭ）を調製し、実施例４に従って調製した酸化還元酵素をこの緩衝液を用いて希釈した。３０分、６０分、および１２０分間インキュベートした後、バッチから１０μｌ取り出して、これを用いて実施例１に従って活性テストを行った。
【０１５０】
初期値は、５０ｍＭ、ｐＨ＝７のリン酸カリウム緩衝液に酵素を希釈（１：２０）した直後に取得した測定値である。与条件下において、上記値はおよそ０．７０／分の消失変化を表し、この値を１００％値としてセットし、続けて測定した全ての値をこの値との関連で評価した。
【０１５１】
表６には、本発明に係る酸化還元酵素において、インキュベーションを１２０分間続けても酵素が初期値の５０％以上を示したｐＨの範囲をまとめている。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
７ｃ：至適温度
至適テスト温度を決定するために、本発明に係る酸化還元酵素の酵素活性を、１５℃から７０℃の温度範囲における標準測定バッチ中で測定した。
【０１５４】
決定した至適温度を表７にまとめている。
【０１５５】
【表１０】
【０１５６】
７ｄ：温度安定性
実施例５ｃに記載した手法と類似の手法により、１５℃から７０℃の範囲における温度安定性を決定した。このために、本発明に係る酸化還元酵素を希釈したものを、それぞれにおいて各温度にて６０分間および１８０分間インキュベートし、次いで上述したテストバッチをもちいて３０℃で測定した。表８には、本発明に係る酸化還元酵素において、インキュベーションを１２０分間続けても酵素が初期活性の５０％以上を示した温度の範囲をまとめている。
【０１５７】
【表１１】
【０１５８】
７ｅ：基質範囲
複数のケトンおよびアルコールを用いて還元反応および酸化反応の酵素活性を測定し、本発明に係る酸化還元酵素の基質範囲を決定した。このために、実施例１に準拠した標準測定バッチを様々な基質とともに用いた。
【０１５９】
全ての酵素について、アセト酢酸メチルを用いたときの活性を１００％としてセットし、これとの関連で他の全ての基質について評価した。
【０１６０】
【表１２】
【０１６１】
７ｆ：水／有機二相システムにおける安定性
水／有機二相システムにおける新規酸化還元酵素の安定性を測定するために、実施例６（組換え発現由来）において得られた溶解物を、各酸化還元酵素に適した水性緩衝液に希釈（約１０Ｕ／ｍｌ緩衝液）した。次いで、水と混和しない同ボリュームの有機溶媒を、緩衝液で希釈した酸化還元酵素に加えた。そしてそのバッチを常に十分に混合し続けながら（サーモミキサで１７０ｒｐｍ）室温でインキュベートした。２４時間インキュベートした後、水相からそれぞれ１０μｌを取り出し、これを用いて標準テストバッチ（１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＰ）、ｐＨ＝７、０．２ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、１０ｍＭ 基質）における酵素活性を決定した。この場合にもまた、緩衝液に希釈した直後の初期値を１００％としてセットし、これとの関連で他の全ての値を評価した。
【０１６２】
【表１３】
【０１６３】
【表１４】
【０１６４】
〔実施例８：調製変換（preparative conversion）〕
８ａ：ロドトルラ・ムシラギノサ由来の酸化還元酵素を用いた（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルの合成
調製バッチとして、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、１０％グリセロール）を２５ｍｌ、４−メチル−２−ペンタノールを３７５ｍｌ、３−オキソペンタン酸メチルを１００ｍｌ、ＮＡＤを１００ｍｇおよびロドトルラ・ムシラギノサＤＳＭＺ７０８２５由来の組換え酸化還元酵素を３７ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した３−オキソペンタン酸メチルの９７％が、（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルに還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルを蒸留により得た。
【０１６５】
この方法により、生成物である（３Ｓ）−３−ヒドロキシペンタン酸メチルが、＞９９％の純度、＞９９．５％のエナンチオマー過剰率で大量に得られた。
【０１６６】
８ｂ：ピキア・ファリノサ由来の酸化還元酵素を用いた（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）を８０ｍｌ、２−プロパノールを１５ｍｌ、クロロアセトンを５ｍｌ、ＮＡＤを１０ｍｇおよびピキア・ファリノサＤＳＭＺ３３１６由来の組換え酸化還元酵素を２ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用したクロロアセトンは完全に、（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールに還元されていた。次いで、反応混合物を酢酸エチルにより抽出し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去し、未精製の生成物を得た。この方法により生成された（２Ｒ）−１−クロロプロパン−２−オールは、エナンチオマー過剰率が＞９９％であった。
【０１６７】
８ｃ：ピキア・スティピディス由来の酸化還元酵素を用いた（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ リン酸カリウム，ｐＨ＝８．５、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）を２０ｍｌ、８０ｍｌの４−メチル−２−ペンタノールに溶解した２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンを２０ｇ、ＮＡＤを１０ｍｇおよびピキア・スティピディスＤＳＭＺ３６５１由来の組換え酸化還元酵素を２００００Ｕ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンの９９％以上が還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールを蒸留により得た。
【０１６８】
この方法により、生成物である（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールが、＞９８％の純度、＞９９．９％のエナンチオマー過剰率で大量に得られた。
【０１６９】
８ｄ：ロイコノストック・カルノサム由来の酸化還元酵素を用いた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）を８ｍＬ、イソプロパノールを２４ｍｌ、４−クロロアセト酢酸エチルを８ｍｌ、ＮＡＤＰを２ｍｇおよびロイコノストック・カルノサムＤＳＭＺ５５７６由来の組換え酸化還元酵素を６．７ｋＵ（＝６ｍｌ）含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した４−クロロアセト酢酸エチルの９９％以上が、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルに還元されていた。ロータリーエバポレータを用いて２−プロパノールの第一の除去を行い、反応混合物を再処理した。次いで、反応混合物を酢酸エチルにより抽出し、ロータリーエバポレータを用いて溶媒を除去し、未精製の生成物を得た。この方法により得られる未精製の生成物（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルは、エナンチオマー過剰率が＞９９．５％であった。
【０１７０】
８ｅ：ミクロバクテリウム・スピーシーズ由来の酸化還元酵素を用いた（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールの合成
変換反応のために、緩衝液（１００ｍＭ ＴＥＡ，ｐＨ＝７、１０％グリセロール、１ｍＭ ＺｎＣｌ２）を１ｍＬ、４−メチル−２−ペンタノールを３ｍｌ、１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オンを１ｍｌ、ＮＡＤを２ｍｇおよびミクロバクテリウム・スピーシーズＤＳＭＺ２００２８由来の組換え酸化還元酵素を０．７ｋＵ含む混合物を、常に十分に混合し続けながら室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、使用した１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オンの９０％以上が、（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールに還元されていた。次いで、生成物を含んでいる４−メチル−２−ペンタノール相を水相から分離し、濾過し、生成物である（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールを蒸留により得た。この方法により得られた未精製の生成物（１Ｓ）−１−[３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル]エタン−１−オールは、エナンチオマー過剰率が＞９９．５％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ケト化合物は下記一般式Ｉで表され、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２ ・・（Ｉ）
Ｒ１は、
（１）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル基、
（２）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルケニル基、
（３）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルキニル基、
（４）−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（５）−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（６）非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環、または、
（７）−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル基、
の何れか１つを表し、上記（１）から（７）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されており、
Ｒ２は、
（８）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
（９）直鎖状または分枝鎖状であり３以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル基、
（１０）直鎖状または分枝鎖状であり２以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル基、または、
（１１）直鎖状または分枝鎖状であり、かつ、非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
の何れか１つを表し、上記（８）から（１１）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１３０からなる群より選択される１つの核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、または
（ｂ）上記（ａ）に記載されている核酸配列の何れか１つに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の相補鎖の核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、
を用いることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の方法に使用する酸化還元酵素であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなることを特徴とする酸化還元酵素。
【請求項１】
ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなる酸化還元酵素を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
上記ケト化合物は下記一般式Ｉで表され、
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２ ・・（Ｉ）
Ｒ１は、
（１）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル基、
（２）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルケニル基、
（３）直鎖状または分枝鎖状であり４以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルキニル基、
（４）−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（５）−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール基、
（６）非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環、または、
（７）−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキル基、
の何れか１つを表し、上記（１）から（７）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されており、
Ｒ２は、
（８）直鎖状または分枝鎖状である、−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
（９）直鎖状または分枝鎖状であり３以下の二重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル基、
（１０）直鎖状または分枝鎖状であり２以下の三重結合を有していてもよい、−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル基、または、
（１１）直鎖状または分枝鎖状であり、かつ、非置換であるか、または−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、−（Ｃ１−Ｃ１０）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル基、
の何れか１つを表し、上記（８）から（１１）の構成は、非置換であるか、または互いに独立に−ＯＨ、ハロゲン、−ＮＯ２および／または−ＮＨ２により１、２もしくは３回置換されている、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ケト化合物を、対応するキラルヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に酵素還元する方法で、補因子の存在下において上記ケト化合物を酸化還元酵素によって還元する方法であって、
（ａ）配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１３０からなる群より選択される１つの核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、または
（ｂ）上記（ａ）に記載されている核酸配列の何れか１つに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の相補鎖の核酸配列によりコードされている酸化還元酵素、
を用いることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか１項に記載の方法に使用する酸化還元酵素であって、
（ａ）配列番号１、６および８に示されるアミノ酸配列の何れか１つの配列のアミノ酸と少なくとも７０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも６５％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも５０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、または
（ｇ）配列番号１２９に示されるアミノ酸配列のアミノ酸と少なくとも７２％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列、
からなることを特徴とする酸化還元酵素。
【公表番号】特表２００９−５０２１４８（Ｐ２００９−５０２１４８Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３１９０（Ｐ２００８−５２３１９０）
【出願日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７１５０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２４２８
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７１５０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２４２８
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０６３７１３１６）アイイーピー ゲーエムベーハー (7)
【Ｆターム（参考）】
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