コラーゲン合成促進剤
【課題】 加齢等により低下するコラーゲン合成を促進させる医薬品、栄養食品等が望まれている。すなわち本発明の目的は、コラーゲン合成促進剤を提供することにある。
【解決手段】 本発明によれば、オルニチンまたはその塩を有効成分として含有する、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲン、TypeVコラーゲン等のコラーゲン合成促進剤を提供することができる。
【解決手段】 本発明によれば、オルニチンまたはその塩を有効成分として含有する、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲン、TypeVコラーゲン等のコラーゲン合成促進剤を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン合成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは結合組織や皮膚、骨、軟骨、腱、歯、血管などほとんどの組織に存在する繊維状のタンパク質であり、細胞外マトリクスの構成成分であるとともに、細胞の足場となって、その増殖や機能の維持に役立っている。
３本のポリペプチド鎖（α鎖）が右巻きに絡み合った３本鎖の構造をしており、主要な繊維成分である。動物組織中のコラーゲンには、遺伝的に異なる２０種類以上のTypeが存在する（非特許文献1参照）。このうち軟骨以外の組織ではTypeI、軟骨ではTypeIIコラーゲンがコラーゲンが大部分を占める。一方、TypeIIIコラーゲンは通常TypeIコラーゲンとの共重合体の形で組織中に一定量存在する。また、TypeVコラーゲンも組織中の量はごくわずかであるものの、TypeIコラーゲンとの共重合体を構成しており、コラーゲン繊維形成の開始時に重要な役割を果たす事が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
骨では基質タンパク質の約９０％を占めており、骨の石灰化の基質として重要な役割を果たしている。加齢などにより、コラーゲン量が減少することによって、骨粗鬆症の発症要因となる。
生体内のコラーゲン合成を促進する物質としては、ローヤルゼリー抽出物（特許文献１参照）、キク科ヤーコン抽出物（特許文献２参照）、ミロバラン果実抽出物（特許文献３参照）などが報告されている。
【０００４】
オルニチンには、寝つきまたは寝起き改善作用（特許文献４参照）、美肌作用（非特許文献３参照）、創傷治癒促進作用（非特許文献４参照）等を有することが知られている。
しかしながら、オルニチンにより、コラーゲン合成を促進することは知られていない。
【非特許文献１】「バイオケミカル ジャーナル（Biochemical Journal）」、 １９９６年、第３１６巻、ｐ．１−１１
【非特許文献２】「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)」、２００４年、第２７９巻、第５１号、 ｐ．５３３３１−５３３３７
【非特許文献３】「日経ヘルス７月号」、２００５年、第８巻、第１７号、ｐ．１４
【非特許文献４】「ザ ジャーナル オブ サージカル リサーチ(The Journal of surgical research)」、２００２年、第１０６巻、第２号、ｐ．２９９−３０２
【特許文献１】特開２００６−２９０８１３号公報
【特許文献２】特開２００６−２７３７５６号公報
【特許文献３】特開２００６−２６５１２０号公報
【特許文献４】特開２００６−３４２１４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、コラーゲン合成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下（１）〜（２）に関する。
（１）オルニチンまたはその塩を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤。
（２）コラーゲンが、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲンおよびTypeVコラーゲンからなる群から選ばれる１以上のものである、上記（１）のコラーゲン合成促進剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、オルニチンまたはその塩を有効成分として含有する、コラーゲン合成促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いられるオルニチンとしては、L-オルニチンおよびD-オルニチンがあげられるが、L-オルニチンが好ましい。
オルニチンは、化学的に合成する方法、発酵生産する方法等により取得することができる。また、オルニチンは、市販品を購入することにより取得することもできる。
L-オルニチンを化学的に合成する方法としては、例えば、Coll.Czechoslov.Chem.Commun.,24,1993(1959)に記載の方法があげられる。
【０００９】
L-オルニチンを発酵生産する方法としては、例えば、特開昭５３−２４０９６号公報、特開昭６１−１１９１９４号公報に記載の方法があげられる。
また、L-オルニチンおよびD-オルニチンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。
オルニチンの塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等があげられる。
【００１０】
酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩があげられる。
金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。
【００１１】
アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩があげられる。
アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩があげられる。
上記のオルニチンの塩のうち、塩酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、α−ケトグルタル酸塩、アスパラギン酸塩が好ましく用いられるが、他の塩、または２以上の塩を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００１２】
本発明のコラーゲン合成促進剤には、オルニチンまたはその塩に加え、適宜、各用途に適した添加剤を含有させることができる。該添加剤としては、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、リジン、グルタミン、アラニン、セリン、グリシン、システイン、スレオニン等のアミノ酸等があげられる。
本発明のコラーゲン合成促進剤は、オルニチンまたはその塩を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種または二種以上の担体、さらに必要に応じて他の治療のための有効成分を含有していてもよい。
【００１３】
本発明のコラーゲン合成促進剤は、オルニチンまたはその塩を必要に応じ担体等と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。
製剤の投与形態は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができるが、経口投与が好ましい。
【００１４】
投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、縣濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。
本発明のコラーゲン合成促進剤を製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
【００１５】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤等の液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類などを添加して、製剤化することができる。
【００１６】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤、顆粒剤等の場合には、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して、製剤化することができる。
【００１７】
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態として皮膚コラーゲン合成促進用の健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品等の飲食品として用いてもよい。
【００１８】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張であるオルニチンまたはその塩を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種またはそれ以上の補助成分を添加してもよい。
【００１９】
本発明のコラーゲン合成促進剤中のオルニチンまたはその塩の濃度は、製剤の種類、当該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、オルニチンまたはその塩として、通常は０．１〜９０重量％、好ましくは０．５〜８０重量％、特に好ましくは１〜７０重量％である。
本発明の製剤の投与量および投与回数は、投与形態、投与される者の年齢、体重等に応じて異なるが、成人に対し一日あたりオルニチンまたはその塩として、通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように、１日に１回ないし数回に分けて投与する。投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ケ月間である。
【００２０】
なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以下、非ヒト動物と略す）に対しても使用することができる。非ヒト動物としては、ほ乳類、は虫類、両生類、魚類等、ヒト以外の動物をあげることができる。
本発明のコラーゲン合成促進剤を非ヒト動物に投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、動物の年齢、種類等により異なるが、体重１Kg1日当たり、オルニチンまたはその塩として、通常は５ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、特に好ましくは２０ｍｇ〜３００ｍｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ケ月間である。
【００２１】
以下に、オルニチンの経口摂取によるコラーゲン合成促進効果を調べた試験例を示す。
試験例
６週齢のWistar系雄ラット10匹を1週間の予備飼育後、２群に分け、１３％カゼインを含む通常の食餌（対照群）、あるいは１２％カゼインに１％オルニチン塩酸塩を含む食餌（オルニチン群）を各ラットにつき１日当たり２０ｇを一週間自由摂取させた。各食餌の組成は表１に示す。期間中は10時から18時まで制限給餌とし、水は自由に摂取させた。実験食開始後8日目に各食餌を２時間摂食させ、その後１時間餌を取り除いた。ネンブタール深麻酔下で解剖を行い、皮膚組織を採取し、液体窒素で急速凍結した。
【表１】
【００２２】
各個体の皮膚組織より総RNAを抽出したのち、各群5匹の総RNAを等量混合し、Affymetrix社規定の方法に準拠してmRNAを調製した。DNAチップ「Rat Genome 230 2.0 Array」（Affymetrix社製）を用いて、遺伝子発現量（mRNA量）を解析した。DNAマイクロアレイ解析は、J. Nutr. 132, 3632-3637 (2002)に記載の方法に従って行った。
解析の結果は、各コラーゲン遺伝子のmRNA量をβ-アクチンのmRNA量（内部標準）で割り、対照群の値を１として示した（図1）。オルニチン群で1.5倍以上発現が変化した遺伝子のうち、コラーゲン遺伝子に注目したところ、主要なコラーゲンであるTypeIコラーゲンの２つの構成因子の遺伝子（Col1α1およびCol１α２）の発現上昇、TypeIコラーゲンに次いで含量が多いコラーゲンであるTypeIIIコラーゲンの構成因子の遺伝子（Col3α1）の発現上昇、含量は少ないがコラーゲン線維の形成に重要な役割を担うType Vコラーゲンの構成因子の遺伝子（Col5α1)の発現上昇が認められた。
【００２３】
次にこれら４つの遺伝子の発現について、DNAマイクロアレイの結果を確認する目的で、同じ総RNAサンプルを用いて、リアルタイムPCRによるmRNAの定量を実施した(Light Cycler ST300, Roche社)。総RNAよりcDNAを合成した後、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」（QIAGEN社製）を用いてサンプルを調製し、変性（94℃、15秒）、アニーリング（60℃、30秒）、及び、伸長（72℃、15秒）の35サイクルでPCR反応を行った。Col1α１遺伝子発現量の測定は、配列番号１および配列番号２でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col1α2遺伝子発現量の測定は、配列番号３および配列番号４でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col3α1遺伝子発現量の測定は、配列番号５および配列番号６でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col5α1遺伝子発現量の測定は、配列番号７および配列番号８でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、β-actin遺伝子発現量の測定は、配列番号９および配列番号１０でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAをそれぞれプライマーセットとして用いた。
【００２４】
解析結果は、各コラーゲン遺伝子のmRNA量をβ-アクチンmRNA量（内部標準）で割り、対照群の値を１として示した（図2）。2群間の有意差検定はstudent’s t-testを行い、危険率5%以下を有意差とした。オルニチン群では、Col1α1、Col1α2、Col3α1、Col5α1それぞれについて、対照群に比べて2.1倍、2.3倍、2.0倍、2.0倍と有意な増加を示した（P<0.05）。
【００２５】
以上の結果よりオルニチンには、コラーゲン遺伝子の発現を上昇させ、コラーゲン合成を促進させる作用があることが明らかとなった。
以下に、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００２６】
オルニチンを含有する錠剤の製造
オルニチン塩酸塩136.2kg（製品名:L-オルニチン塩酸塩、協和発酵工業社製）、微結晶セルロース36.0kg（製品名:アビセルFD101、旭化成ケミカルズ社製）、ショ糖脂肪酸エステル6.6kg（製品名:DKエステルF-20W、第一工業製薬社製）、リン酸カルシウム1.2kg（製品名:リン酸三カルシウム、太平化学産業社製）およびβ-シクロデキストリン20.0kg（製品名:セルデックスB-100、日本食品化工社製）を、コニカルブレンダー（CB-1200ブレンダー、日本乾燥機株式会社製）を用いて混合した。得られた混合物をロータリー圧縮成形機（VIRGO524SS1AY、菊水制作所社製）を用いて、圧縮成形圧10kNで圧縮成形して、直径8mm、250mgの錠剤を製造した。
【実施例２】
【００２７】
オルニチンを含有する腸溶カプセルの製造
実施例１で調製した混合物20ｋｇと0.2ｋｇの二酸化ケイ素とを混合攪拌して得られた混合物をカプセル充填機に投入し、ゼラチン製２号ハードカプセル20000錠に充填し、ハードカプセルを得た。得られたハードカプセルの表面を、ハイコーターHCT-48型（フロイント産業社製）により、ツェイン溶液を用いてコーティングし、腸溶カプセル20000錠を製造した。
【実施例３】
【００２８】
オルニチンを含有する腸溶錠剤の製造
実施例１で調製した錠剤の表面を、ハイコーターHCT-48型（フロイント産業社製）により、シェラック溶液を用いてコーティングし、腸溶錠剤を製造した。
【実施例４】
【００２９】
オルニチンを含有する飲料の製造
オルニチン塩酸塩1.28ｋｇ（製品名:L-オルニチン塩酸塩、協和発酵社製）、エリスリトール3ｋｇ（日研化学社製）、クエン酸0.05ｋｇ（協和ハイフーズ社製）、人工甘味料3ｇ、香料0.06ｋｇを液温70℃で水50Ｌに攪拌溶解し、クエン酸でｐＨを3.3に調整後、プレート殺菌を用いて滅菌して瓶に充填後、パストライザー殺菌し、オルニチン飲料を製造した。
比較例１
実施例１におけるオルニチン塩酸塩の代りに同量の乳糖を使用して、オルニチンを含有しない錠剤を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、DNAマイクロアレイ法を用いた、オルニチンによるコラーゲン遺伝子の発現促進作用を示すグラフである。
【図２】図2は、リアルタイムPCR法を用いた、オルニチンによるコラーゲン遺伝子の発現促進作用を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００３１】
配列番号１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１０−人工配列の説明：合成DNA
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン合成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは結合組織や皮膚、骨、軟骨、腱、歯、血管などほとんどの組織に存在する繊維状のタンパク質であり、細胞外マトリクスの構成成分であるとともに、細胞の足場となって、その増殖や機能の維持に役立っている。
３本のポリペプチド鎖（α鎖）が右巻きに絡み合った３本鎖の構造をしており、主要な繊維成分である。動物組織中のコラーゲンには、遺伝的に異なる２０種類以上のTypeが存在する（非特許文献1参照）。このうち軟骨以外の組織ではTypeI、軟骨ではTypeIIコラーゲンがコラーゲンが大部分を占める。一方、TypeIIIコラーゲンは通常TypeIコラーゲンとの共重合体の形で組織中に一定量存在する。また、TypeVコラーゲンも組織中の量はごくわずかであるものの、TypeIコラーゲンとの共重合体を構成しており、コラーゲン繊維形成の開始時に重要な役割を果たす事が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
骨では基質タンパク質の約９０％を占めており、骨の石灰化の基質として重要な役割を果たしている。加齢などにより、コラーゲン量が減少することによって、骨粗鬆症の発症要因となる。
生体内のコラーゲン合成を促進する物質としては、ローヤルゼリー抽出物（特許文献１参照）、キク科ヤーコン抽出物（特許文献２参照）、ミロバラン果実抽出物（特許文献３参照）などが報告されている。
【０００４】
オルニチンには、寝つきまたは寝起き改善作用（特許文献４参照）、美肌作用（非特許文献３参照）、創傷治癒促進作用（非特許文献４参照）等を有することが知られている。
しかしながら、オルニチンにより、コラーゲン合成を促進することは知られていない。
【非特許文献１】「バイオケミカル ジャーナル（Biochemical Journal）」、 １９９６年、第３１６巻、ｐ．１−１１
【非特許文献２】「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)」、２００４年、第２７９巻、第５１号、 ｐ．５３３３１−５３３３７
【非特許文献３】「日経ヘルス７月号」、２００５年、第８巻、第１７号、ｐ．１４
【非特許文献４】「ザ ジャーナル オブ サージカル リサーチ(The Journal of surgical research)」、２００２年、第１０６巻、第２号、ｐ．２９９−３０２
【特許文献１】特開２００６−２９０８１３号公報
【特許文献２】特開２００６−２７３７５６号公報
【特許文献３】特開２００６−２６５１２０号公報
【特許文献４】特開２００６−３４２１４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、コラーゲン合成促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下（１）〜（２）に関する。
（１）オルニチンまたはその塩を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤。
（２）コラーゲンが、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲンおよびTypeVコラーゲンからなる群から選ばれる１以上のものである、上記（１）のコラーゲン合成促進剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、オルニチンまたはその塩を有効成分として含有する、コラーゲン合成促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いられるオルニチンとしては、L-オルニチンおよびD-オルニチンがあげられるが、L-オルニチンが好ましい。
オルニチンは、化学的に合成する方法、発酵生産する方法等により取得することができる。また、オルニチンは、市販品を購入することにより取得することもできる。
L-オルニチンを化学的に合成する方法としては、例えば、Coll.Czechoslov.Chem.Commun.,24,1993(1959)に記載の方法があげられる。
【０００９】
L-オルニチンを発酵生産する方法としては、例えば、特開昭５３−２４０９６号公報、特開昭６１−１１９１９４号公報に記載の方法があげられる。
また、L-オルニチンおよびD-オルニチンは、シグマ−アルドリッチ社等より購入することもできる。
オルニチンの塩としては、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等があげられる。
【００１０】
酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、α−ケトグルタル酸塩、グルコン酸塩、カプリル酸塩等の有機酸塩があげられる。
金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。
【００１１】
アンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられる。有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジン等の塩があげられる。
アミノ酸付加塩としては、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の塩があげられる。
上記のオルニチンの塩のうち、塩酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、α−ケトグルタル酸塩、アスパラギン酸塩が好ましく用いられるが、他の塩、または２以上の塩を適宜組み合わせて用いてもよい。
【００１２】
本発明のコラーゲン合成促進剤には、オルニチンまたはその塩に加え、適宜、各用途に適した添加剤を含有させることができる。該添加剤としては、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、リジン、グルタミン、アラニン、セリン、グリシン、システイン、スレオニン等のアミノ酸等があげられる。
本発明のコラーゲン合成促進剤は、オルニチンまたはその塩を含有し、必要に応じて薬理学的に許容される一種または二種以上の担体、さらに必要に応じて他の治療のための有効成分を含有していてもよい。
【００１３】
本発明のコラーゲン合成促進剤は、オルニチンまたはその塩を必要に応じ担体等と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。
製剤の投与形態は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または、例えば静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができるが、経口投与が好ましい。
【００１４】
投与する剤形としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、縣濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよいが、経口剤として好適に用いられる。
本発明のコラーゲン合成促進剤を製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
【００１５】
経口投与に適当な、例えばシロップ剤等の液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類などを添加して、製剤化することができる。
【００１６】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤、顆粒剤等の場合には、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して、製剤化することができる。
【００１７】
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態として皮膚コラーゲン合成促進用の健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品等の飲食品として用いてもよい。
【００１８】
非経口投与に適当な、例えば注射剤は、好ましくは受容者の血液と等張であるオルニチンまたはその塩を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種またはそれ以上の補助成分を添加してもよい。
【００１９】
本発明のコラーゲン合成促進剤中のオルニチンまたはその塩の濃度は、製剤の種類、当該製剤の投与により期待する効果等に応じて適宜選択されるが、オルニチンまたはその塩として、通常は０．１〜９０重量％、好ましくは０．５〜８０重量％、特に好ましくは１〜７０重量％である。
本発明の製剤の投与量および投与回数は、投与形態、投与される者の年齢、体重等に応じて異なるが、成人に対し一日あたりオルニチンまたはその塩として、通常は５０ｍｇ〜３０ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇ、特に好ましくは２００ｍｇ〜３ｇとなるように、１日に１回ないし数回に分けて投与する。投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ケ月間である。
【００２０】
なお、本発明の製剤は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物（以下、非ヒト動物と略す）に対しても使用することができる。非ヒト動物としては、ほ乳類、は虫類、両生類、魚類等、ヒト以外の動物をあげることができる。
本発明のコラーゲン合成促進剤を非ヒト動物に投与する場合の投与量および投与回数は、投与形態、動物の年齢、種類等により異なるが、体重１Kg1日当たり、オルニチンまたはその塩として、通常は５ｍｇ〜３０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、特に好ましくは２０ｍｇ〜３００ｍｇとなるように、一日一回ないし数回投与する。投与期間は、特に限定されないが、通常は１日間〜１年間、好ましくは１週間〜３ケ月間である。
【００２１】
以下に、オルニチンの経口摂取によるコラーゲン合成促進効果を調べた試験例を示す。
試験例
６週齢のWistar系雄ラット10匹を1週間の予備飼育後、２群に分け、１３％カゼインを含む通常の食餌（対照群）、あるいは１２％カゼインに１％オルニチン塩酸塩を含む食餌（オルニチン群）を各ラットにつき１日当たり２０ｇを一週間自由摂取させた。各食餌の組成は表１に示す。期間中は10時から18時まで制限給餌とし、水は自由に摂取させた。実験食開始後8日目に各食餌を２時間摂食させ、その後１時間餌を取り除いた。ネンブタール深麻酔下で解剖を行い、皮膚組織を採取し、液体窒素で急速凍結した。
【表１】
【００２２】
各個体の皮膚組織より総RNAを抽出したのち、各群5匹の総RNAを等量混合し、Affymetrix社規定の方法に準拠してmRNAを調製した。DNAチップ「Rat Genome 230 2.0 Array」（Affymetrix社製）を用いて、遺伝子発現量（mRNA量）を解析した。DNAマイクロアレイ解析は、J. Nutr. 132, 3632-3637 (2002)に記載の方法に従って行った。
解析の結果は、各コラーゲン遺伝子のmRNA量をβ-アクチンのmRNA量（内部標準）で割り、対照群の値を１として示した（図1）。オルニチン群で1.5倍以上発現が変化した遺伝子のうち、コラーゲン遺伝子に注目したところ、主要なコラーゲンであるTypeIコラーゲンの２つの構成因子の遺伝子（Col1α1およびCol１α２）の発現上昇、TypeIコラーゲンに次いで含量が多いコラーゲンであるTypeIIIコラーゲンの構成因子の遺伝子（Col3α1）の発現上昇、含量は少ないがコラーゲン線維の形成に重要な役割を担うType Vコラーゲンの構成因子の遺伝子（Col5α1)の発現上昇が認められた。
【００２３】
次にこれら４つの遺伝子の発現について、DNAマイクロアレイの結果を確認する目的で、同じ総RNAサンプルを用いて、リアルタイムPCRによるmRNAの定量を実施した(Light Cycler ST300, Roche社)。総RNAよりcDNAを合成した後、「QuantiTect SYBR Green PCR Kit」（QIAGEN社製）を用いてサンプルを調製し、変性（94℃、15秒）、アニーリング（60℃、30秒）、及び、伸長（72℃、15秒）の35サイクルでPCR反応を行った。Col1α１遺伝子発現量の測定は、配列番号１および配列番号２でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col1α2遺伝子発現量の測定は、配列番号３および配列番号４でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col3α1遺伝子発現量の測定は、配列番号５および配列番号６でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、Col5α1遺伝子発現量の測定は、配列番号７および配列番号８でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAを、β-actin遺伝子発現量の測定は、配列番号９および配列番号１０でそれぞれ表される塩基配列からなるDNAをそれぞれプライマーセットとして用いた。
【００２４】
解析結果は、各コラーゲン遺伝子のmRNA量をβ-アクチンmRNA量（内部標準）で割り、対照群の値を１として示した（図2）。2群間の有意差検定はstudent’s t-testを行い、危険率5%以下を有意差とした。オルニチン群では、Col1α1、Col1α2、Col3α1、Col5α1それぞれについて、対照群に比べて2.1倍、2.3倍、2.0倍、2.0倍と有意な増加を示した（P<0.05）。
【００２５】
以上の結果よりオルニチンには、コラーゲン遺伝子の発現を上昇させ、コラーゲン合成を促進させる作用があることが明らかとなった。
以下に、本発明の実施例を示す。
【実施例１】
【００２６】
オルニチンを含有する錠剤の製造
オルニチン塩酸塩136.2kg（製品名:L-オルニチン塩酸塩、協和発酵工業社製）、微結晶セルロース36.0kg（製品名:アビセルFD101、旭化成ケミカルズ社製）、ショ糖脂肪酸エステル6.6kg（製品名:DKエステルF-20W、第一工業製薬社製）、リン酸カルシウム1.2kg（製品名:リン酸三カルシウム、太平化学産業社製）およびβ-シクロデキストリン20.0kg（製品名:セルデックスB-100、日本食品化工社製）を、コニカルブレンダー（CB-1200ブレンダー、日本乾燥機株式会社製）を用いて混合した。得られた混合物をロータリー圧縮成形機（VIRGO524SS1AY、菊水制作所社製）を用いて、圧縮成形圧10kNで圧縮成形して、直径8mm、250mgの錠剤を製造した。
【実施例２】
【００２７】
オルニチンを含有する腸溶カプセルの製造
実施例１で調製した混合物20ｋｇと0.2ｋｇの二酸化ケイ素とを混合攪拌して得られた混合物をカプセル充填機に投入し、ゼラチン製２号ハードカプセル20000錠に充填し、ハードカプセルを得た。得られたハードカプセルの表面を、ハイコーターHCT-48型（フロイント産業社製）により、ツェイン溶液を用いてコーティングし、腸溶カプセル20000錠を製造した。
【実施例３】
【００２８】
オルニチンを含有する腸溶錠剤の製造
実施例１で調製した錠剤の表面を、ハイコーターHCT-48型（フロイント産業社製）により、シェラック溶液を用いてコーティングし、腸溶錠剤を製造した。
【実施例４】
【００２９】
オルニチンを含有する飲料の製造
オルニチン塩酸塩1.28ｋｇ（製品名:L-オルニチン塩酸塩、協和発酵社製）、エリスリトール3ｋｇ（日研化学社製）、クエン酸0.05ｋｇ（協和ハイフーズ社製）、人工甘味料3ｇ、香料0.06ｋｇを液温70℃で水50Ｌに攪拌溶解し、クエン酸でｐＨを3.3に調整後、プレート殺菌を用いて滅菌して瓶に充填後、パストライザー殺菌し、オルニチン飲料を製造した。
比較例１
実施例１におけるオルニチン塩酸塩の代りに同量の乳糖を使用して、オルニチンを含有しない錠剤を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、DNAマイクロアレイ法を用いた、オルニチンによるコラーゲン遺伝子の発現促進作用を示すグラフである。
【図２】図2は、リアルタイムPCR法を用いた、オルニチンによるコラーゲン遺伝子の発現促進作用を示すグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【００３１】
配列番号１−人工配列の説明：合成DNA
配列番号２−人工配列の説明：合成DNA
配列番号３−人工配列の説明：合成DNA
配列番号４−人工配列の説明：合成DNA
配列番号５−人工配列の説明：合成DNA
配列番号６−人工配列の説明：合成DNA
配列番号７−人工配列の説明：合成DNA
配列番号８−人工配列の説明：合成DNA
配列番号９−人工配列の説明：合成DNA
配列番号１０−人工配列の説明：合成DNA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンまたはその塩を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
コラーゲンが、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲンおよびTypeVコラーゲンからなる群から選ばれる１以上のものである、請求項１記載のコラーゲン合成促進剤。
【請求項１】
オルニチンまたはその塩を有効成分として含有するコラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
コラーゲンが、TypeIコラーゲン、TypeIIIコラーゲンおよびTypeVコラーゲンからなる群から選ばれる１以上のものである、請求項１記載のコラーゲン合成促進剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２１４２３２（Ｐ２００８−２１４２３２Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２１３４（Ｐ２００７−５２１３４）
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２日（２００７．３．２）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【Ｆターム（参考）】
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