コンジュゲートワクチン用修飾多糖
本発明は、特に対象における治療的免疫応答誘導用の医薬組成物において使用するための免疫原性複合糖質の製造方法に関する。本発明の免疫原性複合糖質は、活性アルデヒド基を介して１又は複数の担体タンパク質に結合した１又は複数のオリゴ糖又は多糖を含む。したがって、本発明は、（ｉ）不飽和微生物Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖、（ii）不飽和Ｎ−アシル誘導体の新規なコンジュゲート、及び（iii）１又は複数のタンパク質への共有結合性リンカーとしての機能を果たす微生物不飽和Ｎ−アシル誘導体断片のコンジュゲート分子を含む複合糖質組成物の作製方法を提供する。本発明は、感染症の予防又は治療のための免疫原性複合糖質医薬組成物の使用をさらに包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に対象における治療的免疫応答誘導用の医薬組成物で使用するための免疫原性複合糖質（immunogenic glycoconjugate）の製造方法に関する。本発明の免疫原性複合糖質は、活性アルデヒド基を介して１又は複数の担体タンパク質に結合した１又は複数のオリゴ糖又は多糖を含む。したがって、本発明は、（ｉ）不飽和微生物Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖、（ii）不飽和Ｎ−アシル誘導体の新規なコンジュゲート、及び（iii）１又は複数のタンパク質への共有結合性リンカーとしての機能を果たす微生物不飽和Ｎ−アシル誘導体の断片のコンジュゲート分子を含む複合糖質組成物の作製方法を提供する。本発明は、感染症の予防又は治療のための免疫原性複合糖質医薬組成物の使用をさらに包含する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌、例えば、連鎖球菌（Streptococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）、バチルス（Bacillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リステリア（Listeria）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、及びクロストリジウム（Clostridium）など、並びにグラム陰性菌、例えば、ヘモフィルス（Haemophilus）、シゲラ（Shigella）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ナイセリア（Neisseria）及びある特定の型の大腸菌（Escherichia coli）によって生じる微生物感染症は、世界中で深刻な罹患率で発生している。連鎖球菌は、例えば、その細胞壁多糖の抗原性及び構造に基づいていくつかの群に整理されている、大きな変化に富む、グラム陽性菌の属である（Lancefield, R. C. 1933. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp.Med. 57.571-595、Lancefield, R. C. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc.Soc.Exp.Biol.and Med. 38:473-478；そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０００３】
Ｂ群連鎖球菌は、例えば、莢膜多糖に基づいていくつかの異なる型、例えば、Ｉａ、Ｉｂ、II、III、IV、Ｖ、VI、VII、及びVIII型に分類され、これらは病原性の型の大部分を占める。多くの他のヒト細菌性病原体に関する知見と同様に、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖は、ワクチンにおいて使用される場合、これらの細菌を伴う感染症に対する有効な防御を提供することができる（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wessels, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 86:1428-1433、Wessels, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib group B streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61:4760-4766を参照されたい）。
【０００４】
グラム陰性菌も罹患率及び死亡率の重要な原因である。ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ型細菌（Ｈｉｂ）に対する多糖−タンパク質ワクチンが最近開発及び使用されるまで、Ｈｉｂ細菌感染症は、乳児における精神遅滞の多くの症例の原因であった。
【０００５】
乳児及び幼児は、一般に、多糖抗原に対する免疫原性応答が乏しい。これらの応答は、Ｔ細胞非依存性であると特徴づけられており、したがって、その後の感染症に対する長期免疫保護を付与するのに必要である重要な特性、例えば、記憶、アイソタイプスイッチング、又は親和性成熟に関連しない。このような、乳児及び幼児における、多糖に対する有効な免疫原性応答の欠如を回避するために、当分野では、多糖細菌性抗原を担体タンパク質に非共有結合的に結合させてコンジュゲート分子を形成することによって、Ｔ細胞非依存性応答をＴ細胞依存性応答に変換するための手法を開発することに向けて研究が行われてきた。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jenningsらの、米国特許第４，３５６，１７０号明細書を参照されたい。
【０００６】
アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する物質であり、したがって、多くのワクチン及びワクチン候補において使用されている。アジュバントの免疫刺激作用は、多くの異なる種類の抗原に向けて免疫応答をブーストするので抗原特異的ではない。ＦＤＡによってヒトに使用するために現在認可されている唯一のアジュバントはアルミニウム塩であるが、動物のワクチン接種及びより新規なワクチン候補において使用される多くのアジュバントは、起源が微生物である（White, R. G., 1976. The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann.Rev.Microbiol. 30:579-595；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）、ムラミルジペプチド、破傷風トキソイドなどが含まれる。
【０００７】
多糖の担体タンパク質への結合は、その多糖を効果的に、より免疫原性にすることができる。当技術分野で既知の担体タンパク質として、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、例えば、高分子量タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、又は呼吸器合胞体ウイルスＦ及びＧタンパク質が挙げられる。
【０００８】
破傷風トキソイドは、その担体としての性能において数十年間使用されており、その安全性プロファイルは確立されている。
【０００９】
様々な細菌感染症を標的とする莢膜多糖（ＣＰ）コンジュゲートワクチンは、現在、開発及び臨床評価中である。混合された複数のＣＰ血清型を単一の注射に含めることは、現在研究中である。しかし、ＣＰコンジュゲートワクチンを組み合わせて単一の多価注射にすることは、異なる成分間で競合をもたらし、任意の個々のコンジュゲートの免疫原性に悪影響を及ぼす場合がある（Fattom et al., 1999, Vaccine 17: 126-33；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００１０】
莢膜多糖をタンパク質に結合させるための様々な手順が当技術分野で記載されている。多糖の担体タンパク質への結合は、その多糖を効果的に、より免疫原性にすることができる（Robbins, J. B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J. Infect. Dis. 161:821-832；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。別の概説については、Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10, Conjugate Vaccines, volume editions J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr., 1989（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。一方法では、多糖を穏やかに酸加水分解することによって、タンパク質と反応して共有結合を形成することが可能な、還元末端基が作製される（Anderson, P. A., 1983, Infect. Immun., 39:233-238；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。しかし、タンパク質への結合に関与する末端糖基は、ヘミアセタールとアルデヒドの間の平衡状態で存在し、したがって低効率でタンパク質に結合する。末端還元糖の低い反応性を克服するために、当技術分野では、タンパク質への結合に使用される多糖の末端位置に、安定なアルデヒド基を導入するための、穏やかな酸化に目が向けられてきた（Jenningsらの米国特許第４，３５６，１７０号明細書、上記を参照されたい）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，３５６，１７０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Lancefield, R. C. 1933. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57:571-595
【非特許文献２】Lancefield, R. C. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 38:473-478
【非特許文献３】Wessels, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 86:1428-1433
【非特許文献４】Wessels, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib group B streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61:4760-4766
【非特許文献５】White, R. G., 1976. The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann.Rev.Microbiol. 30:579-595
【非特許文献６】Fattom et al., 1999, Vaccine 17: 126-33
【非特許文献７】Robbins, J. B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J. Infect. Dis. 161:821-832
【非特許文献８】Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10, Conjugate Vaccines, volume editions J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr., 1989
【非特許文献９】Anderson, P. A., 1983, Infect. Immun., 39:233-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
他の利用可能な方法、例えば、いくつかの多糖のＩＯ４−酸化による活性化は、１多糖分子当たり唯一の活性部位を生成することができ、結果として起こる担体タンパク質への結合により、単一末端の複合糖質ワクチンが生成される。この仕組みは、例えば、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、Ｂ型、及び連鎖球菌Ａ群に対する複合糖質ワクチンに見出される。しかし、活性部位が１分子当たり１個ということが、免疫原性増強の程度を制限する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、適当な担体タンパク質への結合によって、免疫原性の、架橋複合糖質ワクチンの生成を可能にする、複数の活性部位を有する多糖を提供する。さらに、この方法は、アミノ糖を含む任意の多糖にも適用可能であり、糖鎖中の２つの隣接する（adjacent）、即ち、隣接する（vicinal）遊離ヒドロキシ（−ＯＨ）基を必要とする現存するＩＯ４−酸化法に対して明らかに有利である。
【００１５】
本発明は、特に対象における治療的免疫応答誘導用の医薬組成物において使用するための免疫原性複合糖質の製造方法に関する。本発明の免疫原性複合糖質は、活性アルデヒド基を介して１又は複数の担体タンパク質に結合した１又は複数のオリゴ糖又は多糖を含む。当技術分野で既知の以前の結合方法と異なり、本発明は、少なくとも１つのアミノ糖を含む任意の多糖に適用可能な方法を提供し、この方法により、抗原性を維持する洗練された、可溶性コンジュゲートも生成される。
【００１６】
本発明は、免疫原性複合糖質の作製方法であって、１又は複数のアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖中の少なくとも１つのＮ−アセチル基を脱アセチル化し、１級アミノ基を含む少なくとも１つ、好ましくは複数のアミノ糖を有するオリゴ糖又は多糖を形成するステップと；１級アミノ基の少なくとも１つを、少なくとも４炭素長の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換し、それによって１又は複数のアルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つ、好ましくは複数の活性部位を含むオリゴ糖又は多糖を生成させるステップと；この化合物を酸化剤と接触させ、オリゴ糖又は多糖上の１又は複数の不飽和部位に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成するステップと；この化合物を担体タンパク質と結合させ、それによって免疫原性複合糖質を生成させるステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
代替の実施形態では、本発明は、免疫原性複合糖質の作製方法であって、１又は複数のアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖中の少なくとも１つのＮ−アセチル基を、少なくとも４炭素長の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換し、それによって１又は複数のアルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つ、好ましくは複数の活性部位を含むオリゴ糖又は多糖を生成させるステップと；この化合物を酸化剤と接触させ、オリゴ糖又は多糖上のアルキル部分の１又は複数の不飽和部位に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成させるステップと；この化合物を担体タンパク質と結合させ、それによって免疫原性複合糖質を生成させるステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法によれば、Ｎ−アシル部分は、不飽和アルキル部分を含む。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１部分であり、炭素主鎖内に１又は複数の二重結合を含むことができる。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、ただ１つの二重結合、即ち、１つの不飽和部位を含む。他の実施形態では、Ｎ−アシル部分は、Ｎ−ペンテノイル部分である。不飽和Ｎ−アシル部分は、本明細書に記載されているか、又は不飽和部位の活性アルデヒドへの酸化、及びその後の担体タンパク質への結合に適していると、当技術分野で知られている任意の不飽和アルキル部分、例えば、不飽和アシル無水物（例えば、ペンテン酸無水物（pentenoic anhydride））又は不飽和ハロゲン化アシル（例えば、塩化ペンテノイル、塩化アクロロイル（acroloyl chloride））を含むことができる。
【００１９】
本発明の分子の酸化は、不飽和Ｎ−アシル部分の二重結合（即ち、不飽和アルキル部分の不飽和部位（複数も））の酸化に限定されることが好ましく、したがって、本明細書で定義され、又は当技術分野で知られているような穏やかな条件下で実施される。例えば、４〜９．５のｐＨ範囲の過ヨウ素酸塩を使用する酸化が、当技術分野で知られている。穏やかな酸化条件のために、アシル基に非常に近く位置する不飽和部位は、酸化せず、且つ／又は活性アルデヒド基を形成しないことによって、その後の担体タンパク質への結合が可能になる。したがって、本発明の方法における使用に関しては、不飽和アルキル基の不飽和部位（即ち、二重結合の位置）は、不飽和アルキル基の炭素１と２の間でも、炭素２と３の間でもない（例えば、当技術分野で認められ、本明細書で使用するアルキル基の番号付けについては図１を参照されたい）。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、ただ１つの二重結合を含む。他の実施形態では、不飽和アルキル部分は、主炭素鎖の末端の２つの炭素の間に二重結合を含む。
【００２０】
本発明は、
ｉ）前記１又は複数のアミノ糖のＮ−アセチル基を脱アセチル化し、ii）得られるアミノ糖の１級アミノ基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル基を含むＮ−アシル基で置換し、iii）前記不飽和アルキル基を酸化することによって、主鎖の末端に活性アルデヒド基を有する、少なくとも３炭素のアルキル基を生成させることによって調製される、ａ）１又は複数のアミノ糖を含む少なくとも１つのオリゴ糖又は多糖と、ｂ）これに結合した担体タンパク質とを含む免疫原性複合糖質をさらに提供する。本発明の方法によれば、不飽和アルキル基の不飽和部位、即ち、二重結合は、主鎖の炭素１と２の間でも炭素２と３の間でもない（例えば、炭素の番号付けについては図１を参照されたい）。好適な実施形態では、不飽和アルキル鎖は、少なくとも５炭素長である。他の実施形態では、酸化前の不飽和部位又はアルキル鎖は、不飽和アルキル鎖の末端の２つの炭素の間にある。本発明の方法によれば、担体タンパク質は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載されている任意の方法によって、活性アルデヒド基を介して、少なくとも１つの多糖又はオリゴ糖に結合される。
【００２１】
本発明は、ａ）１又は複数のＮ−アセチル基を含む１又は複数のアミノ糖を含む、少なくとも１つのオリゴ糖又は多糖であって、前記１又は複数のＮ−アセチル基が、前記アルキル基主鎖の末端で活性アルデヒド基を含む少なくとも３炭素のアルキル基を含むＮ−アシル基で置換されているオリゴ糖又は多糖と、ｂ）これに結合した担体タンパク質とを含む免疫原性複合糖質も提供する。好適な実施形態では、活性アルデヒド基を含むアルキル鎖は、少なくとも４炭素長である。本発明の方法によれば、担体タンパク質は、当技術分野で既知の任意の方法、例えば還元的アミノ化、及び／又は本明細書に記載される任意の方法によって、活性アルデヒド基を介して少なくとも１つの多糖又はオリゴ糖に結合される。
【００２２】
本発明によれば、多糖又はオリゴ糖の１又は複数のアミノ糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基は、置換されることによって以下の（式Ｉ）の化合物を形成する：
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す）。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。特定の実施形態では、Ｒ１はＣ３又はＣ４であり、例えば、その結果それぞれ、Ｎ−ブテノイル基又はＮ−ペンテノイル基が形成される。他の実施形態では、Ｒ１は唯一の二重結合、即ち、不飽和部位を含み、この二重結合は、アルキル主鎖の末端の２つの炭素の間に位置する。
【００２５】
不飽和Ｎ−アシル部分は、活性アルデヒド基に対する不飽和部位の酸化、及びその後の担体タンパク質への結合を介した、オリゴ糖又は多糖を前記タンパク質と結合させる連結部分としての機能を果たす。アルキル部分の不飽和部位の酸化は、本明細書に記載されており、且つ／又は当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば過ヨウ素酸塩を用いて実施することができる。酸化は、多糖鎖を切断することができるので、本発明によって包含される酸化ステップは、穏やかな条件下でのみ、例えば、約４〜約９．５のｐＨ範囲で、低温（例えば、約４℃〜約２７℃）で実施される。穏やかな酸化的な条件のために、不飽和部位が効率的に酸化されるためには、不飽和アルキル部分の二重結合は、不飽和アルキル主鎖の炭素１と２の間、及び炭素２と３の間とすることはできない（例えば、炭素の番号付けについては図１を参照されたい）。Ｒ１が不飽和のＣ３部分である（式１においてＮ−ブテノイル基を形成する）、この実施形態による非限定例では、Ｎ−アシル基は、アルキル主鎖の炭素３と４の間に二重結合を含む。Ｒ１が３炭素を超える鎖を含む他の実施形態では、不飽和部位は、炭素４より大きい位置とすることができる。
【００２６】
本発明の生成物及び方法によれば、酸化及び結合の後、複合糖質のタンパク質とオリゴ糖又は多糖は、以下に示すような連結を通じて共有結合的に連結されている（四角に囲まれている；式II）：
【００２７】
【化２】
【００２８】
（式中、Ｒ２は、飽和したＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１０アルキル部分であり、ＮＨ（四角で囲まれている）は、タンパク質の１級ＮＨ２基、例えば、リシニル又はアルギニル残基の１つに属する）。式IIの［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。式IIのＲ２は、式ＩのＲ１に由来する。式ＩのＲ１（即ち、不飽和アルキル部分）は、当技術分野で知られおり、且つ／又は本明細書に記載されるような酸化及び結合の後、所望の連結部分Ｒ２又は式II（即ち、飽和アルキル部分）が生じるように選択される。
【００２９】
本発明の方法によれば、多糖又はオリゴ糖の１又は複数のアミノ糖のＮ−アセチルは、糖の１、２、３、４、又は５を含めた任意の位置でアミノ糖に連結することができる。アミノ糖の構造は、当技術分野で公知であり、したがって、前記連結の位置は、ごく普通に決定することができる。例えば、アミノ糖がＧｌｃＮＡｃである場合、糖のＮ−アセチル基は炭素２にあり、アミノ糖がシアル酸である場合、糖のＮ−アセチル基は炭素４にある。
【００３０】
特定の実施形態では、糖分子のＮ−アセチル基は、Ｎ−ペンテノイル基で置換され、このＮ−ペンテノイル基は、オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるため、例えば、還元的アミノ化による結合の連結部分としての機能を果たす。特定の実施形態では、酸化及び結合の後の連結基は、飽和したＣ４主鎖を有する飽和Ｎ−アシル基である。本発明の方法によれば、置換されるＮ−アセチル基は、それだけに限らないが、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びシアル酸を含めた任意のアミノ糖のＮ−アセチル基とすることができる。
【００３１】
本発明のある特定の実施形態では、Ｎ−アセチル基の置換は、アルカリを用いて実施される。
【００３２】
本発明は、免疫原性コンジュゲートワクチンにおける使用に適しており、Ｔ細胞非依存性免疫応答からＴ細胞依存性免疫応答に変換するように機能する、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の担体タンパク質の使用を包含する。ある特定の実施形態では、担体タンパク質は、細菌タンパク質又はその断片、例えば、細菌毒素若しくはトキソイド又はその断片である。本発明の方法に従って使用することができる担体タンパク質の非限定例として、破傷風毒素又はトキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌に由来する外膜タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌に由来するＰ６及びＰ４、ヘモフィルス・インフルエンザ菌Ｂ型に由来するタンパク質、モラクセラ・カタラーリスに由来するＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、並びに呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質及びＧタンパク質が挙げられる。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本発明の方法に従って使用されるオリゴ糖又は多糖は、細菌又はその抗原断片に由来する多糖である。そのような細菌として、それだけに限らないが、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、バチルス、コリネバクテリウム、リステリア、エリジペロスリックス、クロストリジウム、シゲラ、クレブシエラ、コレラ菌、ナイセリア、及びエシェリキア（Escherichia）が挙げられる。関係する実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、任意の莢膜細菌に由来する莢膜多糖は、例えば、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、II、III、Ｖ、VI、若しくはVIII型；Ａ群連鎖球菌；髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、Ｙ、若しくはＷ１３５型；肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）III、IV若しくはXIV型；又は大腸菌Ｋ１である。好適な実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、これが由来する細菌に対する免疫応答を誘導することができるように選択される。ある特定の実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、天然に存在するオリゴ糖又は多糖ではなく、例えば、当技術分野で既知の任意の技法によって合成することができ、又は天然に存在する化合物に由来するが、修飾の結果得られるオリゴ糖又は多糖は、天然には見い出されない。例えば、多糖又はオリゴ糖は、修飾する結果、野生型の多糖又はオリゴ糖類縁体に対する抗原性を増大させる、例えば、免疫応答の増大を誘導することができる。本発明の方法によれば、有用な多糖は、免疫特異的応答を誘導することができる少なくとも１つの抗原エピトープを含む。そのような多糖又はオリゴ糖は、少なくとも７つの糖部分を含むことが好ましいが、２つという少ない糖部分でも活性を示すことができる。多糖又はオリゴ糖は、非分岐状又は分岐状とすることができ、約１０００〜数百万ダルトンの分子量を有することができる。ある特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の化学修飾を有する。本発明によって包含される化学修飾の非限定例には、多糖のカルボキシル化、スルホン化、硫酸化、及びリン酸化誘導体、これらの塩、並びにこれらの混合物が含まれる。
【００３４】
本発明は、対象において免疫応答を誘導するための治療上有効な濃度で１又は複数の免疫複合糖質（immuno-glycoconjugate）を含む組成物、特に医薬組成物の使用も包含する。免疫複合糖質のオリゴ糖又は多糖に対する免疫応答の誘導は、オリゴ糖又は多糖が由来する病原体（複数も）による感染症の治療及び／又は予防に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の複合糖質は、予防用ワクチン又は治療剤として使用することができる。ある特定の実施形態では、免疫複合糖質は、２以上の細菌の型又は系統に由来する、複数の多糖及び／又はオリゴ糖を含み、それによって１つを超える細菌の種／型又は系統に対する免疫応答を誘導する。他の実施形態では、本発明の免疫複合糖質の製造において使用されるオリゴ糖又は多糖は、細菌及び／又は他の病原体、例えば、原虫の複数の種／系統に由来する複数の抗原ドメインを含む結果、対象に投与すると多価免疫応答を生じるように合成される。
【００３５】
本発明は、ヒト又は動物のための免疫原性製剤、特に、本発明の１又は複数の免疫複合糖質を含む免疫原性組成物にも関する。ある特定の実施形態では、免疫原性製剤は、複数の免疫複合糖質及び／又は複数の担体タンパク質を含む。免疫複合糖質は、細菌の複数の型又は系統に由来する多糖若しくはオリゴ糖を含むように操作し、且つ／又はキメラの多糖若しくはオリゴ糖（即ち、細菌の複数の型及び／若しくは系統に由来するエピトープを含む多糖若しくはオリゴ糖）を含むように操作することができるので、本発明の免疫原性製剤は、複数の細菌型、１又は複数の系統変異体に対する予防又は療法のために操作することができる。それだけに限らないが、鼻腔内、イントラトラキアル（intratrachial）、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下の経路を含めた、当技術分野で公知及び通常の多くの方法を、本発明の免疫原性製剤を用いて対象を免疫するのに使用することができる。
【００３６】
３．１ 専門用語
本明細書で使用する場合、用語「約（about）」又は「約（approximately）」は、数値とともに使用されるとき、基準数値の１、５若しくは１０％以内、又は前記数値を測定及び／又は判定するのに使用される標準的な方法の一般的な実験誤差の範囲内の任意の数値を指す。
【００３７】
用語「担体」、「担体タンパク質」又は「担体ポリペプチド」は、多糖抗原が共有結合的に連結されているポリペプチド部分を指すのに互換的に使用される。担体タンパク質は、多くの場合免疫原性であり、したがって、ワクチン力価に寄与することもできる。担体タンパク質の連結により、一般に、結合された炭水化物分子の抗原性が増大する。担体タンパク質は、それに連結した多糖と同じ標的生物体に由来することができ、又は異なる生物体に由来することができる。例えば、担体タンパク質は、それだけに限らないが、細菌毒素又はトキソイドを含めた細菌タンパク質とすることができる。好適な実施形態では、担体タンパク質は、Ｔ細胞非依存性免疫応答をＴ細胞依存性免疫応答に変換するように機能するように選択される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、対象への療法（複数も）の投与の脈絡において、用語「組み合わせて」は、１つを超える療法（例えば、１つを超える予防剤及び／又は治療剤）の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用により、療法（例えば、予防剤及び／又は治療剤）が対象に投与される順序は制限されない。第１の療法（例えば、第１の予防剤又は治療剤）は、第２の療法（例えば、第２の予防剤又は治療剤）の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間前）、第２の療法と同時に、又は第２の療法に続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間）対象に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性複合糖質は、１又は複数の追加の療法、例えば、感染症、例えば、細菌の１又は複数の種／系統を含む感染症によって生じる疾患の予防又は治療について当技術分野で知られているワクチンと組み合わせて使用することができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「管理する」、「管理すること」、及び「管理」は、対象が療法（例えば、予防剤又は治療剤）から得る有益な効果を指し、これは、疾患の治癒をもたらさない。ある特定の実施形態では、対象は、１又は複数の療法（例えば、本発明の組成物などの予防剤又は治療剤）を投与されることによって、感染症、又はそれに関連する病状若しくは症状を「管理し」、その結果疾患／障害の進行又は悪化を予防する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、療法（例えば、予防組成物又は治療組成物）の投与の結果としての、対象における疾患／障害（例えば、細菌による感染症）の発症、再発の予防、疾患／障害の１又は複数の症状の低減を指す。本明細書で使用する場合、「予防」は、ワクチンとしての本発明の免疫複合体の使用に関連した、細菌の１又は複数の型及び／又は系統による感染症の予防も包含する。
【００４１】
用語「多糖」及び「オリゴ糖」は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、２〜２，０００超の反復単位を有する糖類をはじめとする、複数の反復単位を含む糖類を指す、その最も広い意味において使用される。一般に、当技術分野で認められているように、及び本明細書で使用する場合、用語「多糖」は、約５０〜約２，０００以上の反復単位を有する糖類を指す。当技術分野で認められているように、及び本明細書で使用する場合、用語「オリゴ糖」は、約５〜約４０、４５又は５０の反復単位を有する糖類を指す。多糖の反復単位は、単一の単糖分子とすることができ、又は二糖分子とすることができる。ある特定の実施形態では、反復単位は、３個以上の単糖分子である。本発明の方法によれば、細菌の異なる型及び／又は系統に由来する多糖又はオリゴ糖の断片は、化学的に結合、又は人工的に合成することによって、断片が最初に得られ、且つ／又は同定された細菌の、複数の型及び／又は系統に由来する複数のエピトープを含む、単一の多糖鎖又はオリゴ糖鎖を形成することができ、したがって、本発明の多糖又はオリゴ糖の反復単位（複数も）の組成は、糖鎖全体にわたって一定である必要はない。本発明の方法によって包含される多糖又はオリゴ糖は、１又は複数のアミノ糖を含む。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「対象」又は「患者」は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「対象（subject）」及び「対象（subjects）」は、動物（例えば、哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）並びに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト乳児、幼児、青年、女性、又は妊娠中の女性である。
【００４３】
用語「治療的免疫応答」は、本明細書で使用する場合、複合糖質に向けられている、標準的な技法によって測定した場合の、体液及び／又は細胞の免疫の増大を指す。限定するものではないが、複合糖質に向けられた体液免疫の誘導レベルは、好ましくは、対象に本発明の組成物を投与する前の、複合糖質に向けられた体液免疫レベルの少なくとも４倍、８倍、又は１０倍、好ましくは少なくとも１６倍である。免疫応答は、適当なインビトロ又はインビボアッセイの手段によって定性的に測定することもでき、対象における感染症又はその症状の進行の停止、又は緩解は、治療的免疫応答の誘導を示すとみなされる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」は、疾患／障害（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解において使用することができる、任意のプロトコル（複数も）、方法（複数も）、及び／又は薬剤（複数も）を指すことができる。ある特定の実施形態では、用語「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」は、生物学的療法、支持療法、及び／又は当業者に知られている、疾患又はそれに関連する病状若しくは症状（複数も）、感染症又はそれに関連する病状若しくは症状の治療、管理、予防、又は寛解において有用な他の療法を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「治療剤（therapeutic agent）」及び「治療剤（therapeutic agents）」は、疾患（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解において使用することができる任意の薬剤（複数も）を指す。疾患又はそれに関連する症状（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解のために有用であると知られている、又は使用されてきた、又は現在使用されている薬剤であることが好ましい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、疾患に対する対象への療法の投与の脈絡における用語「治療する」、「治療」、「治療すること」は、前記疾患／障害（例えば、細菌性の障害）の症状の根絶、低減、又は寛解を指す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｎ−アシル化複合糖質の合成の一般的な方法の概略の流れ図であり、図中ｎ＝反復単位の数値であり、これは、オリゴ／多糖の種類に応じて変化し、１〜１，０００以上とすることができる。
【図２】多糖−タンパク質結合の一般的な方法、例えばＮ−ペンテノイル化（pentenoylation）を介した、Ａ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートの調製の概略の流れ図である。ｎ＝反復単位の数値であり、これは、多糖又はオリゴ糖の性質に依存し、１〜１，０００以上とすることができる。
【図３】天然及び修飾Ａ群連鎖球菌多糖の６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】多糖−タンパク質結合の一般的な方法、例えば、Ｎ−ペンテノイル化を介した髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲートの調製の概略の流れ図であり、図中ｎ＝反復単位の数値である。
【図５】修飾髄膜炎菌Ｂ多糖の６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】ＢａｌｂＣマウスにおける、Ａ群連鎖球菌多糖−破傷風トキソイドコンジュゲートを含むワクチン接種によって生成される多糖に対する免疫応答を示す図である。説明文：免疫前：コンジュゲートで免疫化する前のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧＡＳＰ−ＴＴ：従来の方法（天然多糖の還元、及び穏やかなＮａ−メタ過ヨウ素酸塩酸化による１多糖分子当たり唯一の活性部位の生成）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。Ｎ−ブト−ＧＡＳＰ−ＴＴ（１）：新規の方法（Ｎ−ペンテノイル化による１多糖分子当たり複数の活性部位の生成、及び天然多糖の酸化）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌−多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧｌｃＮＡｃ残基の約５〜１０％がペンテノイル化された。Ｎ−ブト−ＧＡＳＰ−ＴＴ（２）：新規の方法（Ｎ−ペンテノイル化による１多糖分子当たり複数の活性部位の生成、及び天然多糖の酸化）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧｌｃＮＡｃ残基の約１５〜２０％がペンテノイル化された。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、一般に、（ｉ）不飽和微生物Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖；（ii）担体タンパク質に共有結合的に結合した不飽和Ｎ−アシル誘導体多糖又はオリゴ糖に由来する新規な免疫原性コンジュゲート；並びに（iii）本発明の分子及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性複合糖質組成物の作製方法を提供する。本発明は、ワクチンとしてのこれらの組成物の使用方法をさらに包含する。本明細書に開示されるように、本発明は、１又は複数のタンパク質、例えば、担体タンパク質への結合のための、１オリゴ糖又は１多糖当たりの複数の活性部位の生成を促進することができる方法を提供する。本発明は、複数の活性化部位を有するオリゴ糖又は多糖の形成方法も提供し、これは、１又は複数の適当な担体タンパク質と結合されるとき、当技術分野で以前に知られている製造方法と比較した場合、架橋複合糖質ワクチンを増強された効率で生成する。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、当技術分野で既知の同様のワクチンと比較して増強された免疫原性を示す複合糖質ワクチンも生成する。本明細書に提示される方法は、少なくとも１つのアミノ糖を含む任意の多糖にも適用可能であり、糖鎖中の２つの隣接する遊離ヒドロキシ基を必要とする、現存する過ヨウ素酸塩酸化法に対して明らかに有利である。
【００４９】
Ｎ−アセチル基を有する少なくとも１つのアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖（例えば、それだけに限らないが、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及び／又はシアル酸の１又は複数を含むもの）は、処理されて１又は複数のＮ−アセチル基が脱アセチル化されることによって、オリゴ糖又は多糖中に少なくとも１つの好ましくは複数の、１級アミノ基を含むアミノ糖（複数も）が生成される。次いで少なくとも１つの１級アミノ基（複数も）は、Ｎ−アシル部分で置換されることによって、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位が生成される。その後の酸化を可能にするために、Ｎ−アシル化は、少なくとも５炭素の不飽和脂肪族鎖を使用して実施される（例えば、ペンテノイル化）。長さが５炭素超の不飽和脂肪族鎖の使用も、本発明によって包含されており（例えば、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２、１３−若しくは１４−又はそれ以上の炭素の不飽和脂肪族鎖）、ただし不飽和部位は、前記部分の炭素１と２の間、又は炭素２と３ではない（図１を参照されたい、又は式Ｉによれば、アルデヒド基の炭素とＲ１のＣ１の間又はＲ１のＣ１とＣ２の間）。酸化は、多糖又はオリゴ糖鎖を切断することができるので、本発明によって包含される酸化方法は、不飽和脂肪族鎖の不飽和部位（複数も）のみを酸化するように選択される（本明細書に記載され、且つ／又は当技術分野で知られているように）。そのような酸化条件は、通常当技術分野で「温和な」と呼ばれ、日常の実験によって決定することができる。したがって、本発明の方法は、前記アルキル部分の不飽和部位（複数も）に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成するために、穏やかな条件下で（例えば、強緩衝液中、約４℃〜約２７℃の温度範囲及び約４〜約９．５のｐＨ範囲で）、不飽和基を酸化する酸化剤の使用（例えば、Ｏ３（オゾン分解用）又はＨ２Ｏ２の使用）を包含する。ある特定の実施形態では、アルキル部分の不飽和部位は、アルキル主鎖の末端の２つの炭素の間にある。二重結合の酸化により、不飽和部位で主アルキル鎖が切断され、新しいアルキル鎖末端で活性アルデヒド基が生成される。例えば、不飽和脂肪族鎖が炭素Ｃ４とＣ５の間に１つの二重結合を有するＣ５である実施形態では、酸化によりＣ４にアルデヒドを有する４炭素の鎖が生じる。不飽和脂肪族鎖が１つを超える二重結合、即ち不飽和部位を有する実施形態では、酸化反応は、１つ又は両方の不飽和部位に影響する場合があるが、反応により主炭素鎖が切断されるので、アルデヒド基は、新しく形成される脂肪族鎖の末端に常にあることになる。したがって、不飽和基を含む主鎖が、１つを超える不飽和部位を有する場合、酸化反応により、異なる長さの不飽和又は飽和Ｎ−アシルが生じる場合があるが（それぞれ、１つ又はすべての不飽和部位が酸化されたかどうか、及び二重結合の位置に依存する）、それぞれの部分は、脂肪族の主鎖の末端に活性アルデヒド基を含む。
【００５０】
本発明の多糖又はオリゴ糖は、本明細書で記載され、且つ／又は当技術分野で既知の任意の方法（例えば、還元的アミノ化）によって担体タンパク質に結合されることによって、免疫原性複合糖質を生成する。一般的な方法の概略の流れ図を図１に示す。
【００５１】
したがって、本発明は、式Ｉの微生物不飽和Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖に関する：
【００５２】
【化３】
【００５３】
（式中、Ｒ１は、少なくとも１つの不飽和炭素を含む、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。本発明は、複数の不飽和炭素（即ち、複数の二重結合）を含むＲ１を包含するが、本明細書に提供される方法によれば、Ｒ１は、１つの不飽和炭素（即ち、１つの二重結合；この二重結合は、Ｒ１のＣ１とＣ２間にはない）を有することのみ必要である。本発明のある特定の実施形態では、式ＩのＲ１は、１つの二重結合を含む、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分である。本発明のさらなる実施形態では、式ＩのＲ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分であり、二重結合の位置は、脂肪族鎖の末端の２つの炭素の間である。
【００５４】
特定の実施形態では、不飽和Ｎ−アシル部分は、酸化されてアルデヒド基になることによって（アルキル部分の主鎖の末端で）、化合物を担体タンパク質と結合させることにおけるリンカーとしての機能を果たす。次いで、Ｎ−アシル部分上のアルデヒド基は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の結合方法、例えば、還元的アミノ化によって担体タンパク質と連結することができる。
【００５５】
さらに別の実施形態では、アミノ（ＮＨ）基は、糖の１、２、３、４、又は５を含めた任意の位置で、オリゴ糖又は多糖の糖残基に連結される。アミノ糖の構造は、当技術分野で公知であり、したがって前記連結の位置はごく普通に決定することができる。例えば、アミノ糖がＧｌｃＮＡｃである場合、糖のＮ−アセチル基は炭素２にあり、アミノ糖がシアル酸である場合、糖のＮ−アセチル基は炭素４にある。
【００５６】
本発明で有用な式Ｉの修飾多糖、例えば、Ｎ−アシル誘導体多糖の非限定例は、以下の式IIIに示すような、少なくとも１つのＮ−ペンテノイル（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−）基を含む、Ｎ−ペンテノイル化誘導体多糖である：
【００５７】
【化４】
【００５８】
（式中、Ｎ−ペンテノイル基は、コンジュゲートタンパク質に対するリンカーとしての機能を果たす）。
【００５９】
任意の結合様式を、修飾オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるのに使用することができる。活性アルデヒド基を形成するために末端の隣接するヒドロキシル基の存在に依存する一例示的方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，３５６，１７０号明細書（’１７０特許）に記載されている。’１７０特許には、多糖中への末端アルデヒド基の導入、及び還元的アミノ化によるアルデヒド基のタンパク質アミノ基へのカップリングが記載されている。多糖とタンパク質は、それによって、式IIで以下に示すような基（四角で囲まれた）を通じて連結される：
【００６０】
【化５】
【００６１】
（式中、Ｒ２は、飽和したＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキル部分であり、四角で囲まれていないＮＨ（四角で囲まれた）は、タンパク質の１級ＮＨ２基（例えば、リシニル又はアルギニル残基）の１つに属する）。式IIの［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。
【００６２】
本発明の、得られるＮ−アシル化−多糖−タンパク質コンジュゲートは、マウスにおいてインビボで試験されており、従来技術において既知のＮ−プロピオニル化多糖（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９０２，５８６号明細書に記載されているもの）と比較した場合、改善された免疫原性を有することが一般に示されている。したがって、本発明のワクチンは、Ｂ群髄膜炎菌又は大腸菌Ｋ１生物体によって引き起こされる髄膜炎に対して有用であることが予期される。特に興味深いのは、細菌感染症（例えば、細菌性髄膜炎）のリスクが最もある対象、例えば、免疫無防備状態の個体及び乳児を保護するためのワクチンである。
【００６３】
本発明の特定の限定されない実施形態では、免疫応答を最適化するために、２種以上のオリゴ糖若しくは多糖、及び／又は２以上の担体タンパク質を含めることが望ましい場合がある。そのような手法は、免疫応答の回避をもたらす突然変異の急速な発生を特徴とする感染症、例えば、原虫感染の予防又は治療において特に有用となり得る。さらに、本発明の免疫原性複合糖質は、２以上の免疫原性／抗原ドメイン及び／又は２以上のエピトープを含むことができる。例えば、本発明は、異なる抗原に特異的な少なくとも２つの異なる多糖又はオリゴ糖が、１つの担体分子に結合されており、且つ／又は異なる抗原に特異的な２つの異なる多糖又はオリゴ糖が合わさって、担体タンパク質に結合された１つの多糖又はオリゴ糖になっている多価コンジュゲートを包含する。本発明は、複数の多糖若しくはオリゴ糖、及び又は複数の担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに包含する。本発明の方法により、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり、少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位が生成されるので、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の部位で担体タンパク質に共有結合的に結合することができ、さらに、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の担体タンパク質に結合することができる。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、多糖分子及び担体タンパク質の格子である。
【００６４】
本発明の複合糖質組成物中に使用するための多糖又はオリゴ糖は、サイズを変更することができる。本明細書で定義するように、本発明で使用するためのオリゴ糖は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の反復単位（例えば、糖残基）、好ましくは１０〜約５０の反復単位を含む。多糖は、本明細書で定義するように、５０を超える反復単位であり、約６００〜約２，０００の反復単位、又はそれ以上の大きさであってもよい。場合によっては、大きなコンストラクトが、免疫原性の増強のために望ましい。本発明の方法は、非常に大きな多糖の使用を提供するが、これは、多くの反応部位を１つの多糖中に導入することができるためである。
【００６５】
５．１ 多糖及びその単離
好適な実施形態において使用するのに適した多糖には、被包性細菌由来の多糖及びオリゴ糖が含まれる。多糖及びオリゴ糖は、任意の供給源由来とすることができ、例えば、これらは、天然に存在する細菌、遺伝子操作された細菌から得ることができ、又は合成的に作製することができる。多糖及びオリゴ糖は、活性化する前に１又は複数の処理ステップ、例えば、精製、機能付与、穏やかな酸化条件を使用する脱重合、脱アセチル化などにかけることができる。必要に応じて、修理後ステップも使用することができる。適当な多糖及びオリゴ糖を合成、調製、及び／又は精製するために、当技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。
【００６６】
本発明の方法に従って使用するための多糖及びオリゴ糖として、それだけに限らないが、例えば、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの肺炎球菌多糖；血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、及びＹの髄膜炎菌多糖、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型、多糖ポリリボシルリビトールホスフェート、血清型III及びＶのＢ群連鎖球菌多糖、並びにチフス菌（Salmonella typhi）Vi多糖が挙げられる。肺炎球菌及びＢ群連鎖球菌の血清型、並びに髄膜炎菌の血清型の他の多糖も本明細書で使用するのに適しており、他の一般にＴ非依存性の多糖及びオリゴ糖抗原、例えば、Ａ群連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌、緑膿菌、及び炭疽菌（Bacillus anthracis）に由来する多糖又はオリゴ糖も同様である。細菌性の多糖及びオリゴ糖は、特に好適であるが、グラム（−）細菌性のリポ多糖及びリポオリゴ糖、並びにその多糖及びオリゴ糖誘導体、並びにウイルス性の多糖及びオリゴ糖も使用することができる。
【００６７】
多糖は、当技術分野で既知の方法によって、細菌莢膜から単離される。例えば、１つのそのような方法では、Ｂ群髄膜炎菌（系統９８１Ｂ）などの細菌は、蒸留水１リットル当たり３０ｇの脱水Todd Hewitt Broth（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）を使用して、発酵槽中、３７℃で増殖される。発酵槽での増殖の前に、凍結乾燥した系統が、５％（ｖ／ｖ）のヒツジ血液寒天（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）プレート上で、３７℃で、ろうそく瓶中で最初に増殖される。次いで細菌は、エルレンマイヤーフラスコ中の１．０リットルのTodd Hewitt Broth（上記）に移され、これは、３７℃で、１９０ｒ．ｐ．ｍ．で７時間振盪される。次いで接種材料は、発酵槽に移される。発酵槽での増殖後（１６時間）、細菌は、０．７５％の最終濃度までホルマリンを添加することによって死滅される。タンパク質が、高温（５０〜６０℃）の代わりに、低温（４℃）の９０％のフェノールを用いて未精製の多糖の溶液を撹拌することによって抽出されることを除き、Bundle et al, J. Biol. Chem., 249, 4797-4801 (1974)に記載されているように、細菌は、連続的な遠心分離によって除去され、多糖は、上澄から単離され、本質的に精製される。後者のプロセスにより、高分子量形態の多糖、例えば、高分子量形態のＢ群髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）が生成されることが保証される。
【００６８】
他の特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖は、蒸留水中３７ｇ／リットルの濃度で、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）を含む発酵槽内で、３７℃で培養することによって、細菌、例えば、大腸菌（０１８：Ｋ１：Ｈ７）（ＮＲＣＣ４２８３）から単離することができる。試験用培養物（working culture）は、エルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＢＨＩ溶液（上記を参照されたい）中で原料及び初期培養物を再構成することによって、凍結乾燥原料から開始することができ、これは、３７℃で、２００ｒ．ｐ．ｍ．で７時間振盪される。次いで培養物は、１．５リットルのＢＨＩ（上記）に移され、上述した同じ条件下で７時間増殖される。次いで接種材料は、発酵槽に移される。これらの条件下で培養された細菌、例えば、大腸菌Ｋ１の莢膜多糖の単離及び精製は、当技術分野で知られ、且つ／又は本明細書に記載される任意の方法によるものとすることができる。
【００６９】
上述した単離及び精製手順は、利用することができる唯一のものではなく、他の公開された手順、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Watson et al, J. Immunol., 81, 331 (1958)によって、及び上述した米国特許第４，７２７，１３６号において記載されているものも利用可能であることが理解される。
【００７０】
５．２ オリゴ糖又は多糖中のＮ−アセチル基の置換：
天然のオリゴ糖又は多糖中のＮ−アセチル基は、置換することによって、分子のシアル酸残基中に反応性アミン基を提供することができる。置換は、任意の既知の方法によって、例えば、アルカリによって、例えば、塩基性水媒質中で、高温、例えば、約９０℃〜１１０℃で、及び約１３〜１４のｐＨで実施することができる。ある特定の実施形態では、置換は、１級アミノ基を形成するための、Ｎ−アセチル基の脱アセチル化を包含する。塩基性水媒質は、水性アルカリ金属水酸化物溶液、例えば、約２Ｍの濃度の水酸化ナトリウムを含むことができる。或いは、水溶液中のヒドラジンを使用することができる。本発明によって使用することができる塩基の非限定例は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＣＮ、Ｅｔ３Ｎ、ＮＨ３、Ｈ２Ｎ２Ｈ２、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔ又はＫＯｔＢｕである。塩基、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ又はＫＯｔＢｕなどは、０．５Ｎ〜５．０Ｎの範囲で最も有効に使用される。塩基、例えば、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３及びＫＣＮは、その溶解度が許容する高さの濃度で使用することができる。ＮＨ３又はＨ２Ｎ２Ｈ２などの塩基は、１００％を含めたほとんど任意の濃度で使用することができる。溶媒、例えば水、アルコール（好ましくはＣ１−Ｃ４）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合物及び他の有機溶媒を使用することができる。水を含む塩基溶液が最も好適である。
【００７１】
特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖のＮ−アセチル基の置換について好適なｐＨ範囲は、約９〜約１４であり、最適ｐＨは約１２である。Ｎ−置換多糖はその後、当技術分野で既知の標準的な方法によって、膜又は透析を使用する超高純度化によって、残留反応物から精製される。Ｎ−アセチル基置換の程度は、少なくとも１つのＮ−アセチル基の置換から、オリゴ糖又は多糖のＮ−アセチル基の最大１００％の置換及び１００％の置換を含めて変化し得る。ある特定の実施形態では、Ｎ−アセチル基置換の程度は、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％である。天然のＮ−アセチル基の９０〜９９％が置換されることが好ましい。置換されたオリゴ糖又は多糖は、例えば、冷却、中和、精製、及び凍結乾燥によって回収される。Ｎ−アセチル置換の程度の分析及び置換された生成物の精製は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の方法によって実施することができる。例えば、オリゴ糖及び／又は多糖は、精製／回収のために、Spectra/Por（登録商標）膜MWCO:3,500を用いて、脱イオン水に対して透析することができる。Ｎ−脱アセチル化の程度は、当技術分野で公知の方法によって、５００ＭＨｚのＨ１−ＮＭＲによって分析することができる。
【００７２】
Ｎ−アセチル基置換手順の前に、天然のオリゴ糖又は多糖は、例えば、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの範囲で、広範囲の平均分子量を有し、この平均分子量は、Ｎ−アセチル基置換反応によって実質的に低減される。例えば、Ｂ群髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）は、約５００，０００〜約８００，０００ダルトンの平均分子量を有し、本発明の方法によるＮ−アセチル基置換後に、約３，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する、Ｎ−アセチル置換多糖の断片が通常生成される。多糖の全長又は断片は、本発明の方法によって使用される。例えば、全長の多糖又はオリゴ糖は、断片化することによって、コンジュゲートワクチンにおいて使用するのにより適したサイズを生成することができる。例えば、１０，０００〜４０，０００ダルトン、好ましくは約１０，０００〜約１５，０００ダルトンの平均分子量のＮ−アシル化材料が使用される。所望のサイズの断片は、例えば、遠心分離法又は濾過法を含めた、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。ある特定の実施形態では、所望の分子量範囲のサイズで分類された分画又は分別は、分留カラムを使用することによって、出発物質、例えば、Ｎ−アシル化ＧＢＭＰ物質が導入されたサイジングカラム（例えば、分子篩）の溶出液の分画を収集することによって得ることができる。ある特定の実施形態では、より高い平均分子量、例えば、３０，０００〜４０，０００ダルトンの範囲のＮ−アシル化物質は、本発明の方法において使用するために収集される。
【００７３】
次いで、Ｎ−アセチル基置換多糖の断片又は多糖の全長は、Ｎ−アシル化されることによって、対応するＮ−アシル化生成物が生成される。Ｎ−アシル化は、穏やかな塩基性条件下で水性緩衝媒質中にＮ−アセチル基置換多糖を溶解させることによって実施することができる。そのような穏やかな緩衝水溶液は、約７．５〜９．０のｐＨを有することが好ましい。次いでアシル反応物は、糖含有溶液に添加され、反応が完了するまで１０℃未満に冷却される。アシル反応物は、結合完了時の所望のアルキル基、例えば、式IIの所望のＲ２に基づいて選択される。アシル反応物の不飽和部位は、酸化されて活性アルデヒドになり、したがって、Ｒ２の長さを決定する。例えば、アシル反応物は、不飽和アシル無水物（例えば、アセチル無水物若しくはプロピオニル無水物）又は不飽和ハロゲン化アシル（例えば、塩化ペンテノイル）とすることができる。この反応物は、溶解度を増大させるために、場合によりアルコールと混合される。必要に応じて、反応媒質は、当技術分野で既知の任意の方法によって精製することができる。利用することができる精製方法の非限定例は、透析とその後の凍結乾燥によるＮ−アシル化生成物の回収である。反応は、約１０〜２０時間以内に実質的に完了する。次いでＮ−アセチル基のＮ−アシル化の程度は、当技術分野で既知の分析方法、例えば、高分解能、例えば、５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲによって求められ、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約１００％である。前記Ｎ−アシル化反応では、断片の顕著な分子量低減は全く生じない。
【００７４】
５．３ 担体タンパク質
多糖が結合されているタンパク質（複数も）は、ワクチンの糖成分に対するＴ細胞非依存性免疫応答を、Ｔ細胞依存性の免疫応答に変換するのに適するように選択される。本発明のある特定の実施形態では、担体タンパク質は、天然の毒素又は解毒された毒素（即ち、トキソイド）とすることができる。また、タンパク質毒素の無毒性の突然変異形態も使用することができる。そのような突然変異は、天然の毒素のエピトープを保持していることが好ましい。そのような突然変異した毒素は「交差反応物質」、即ちＣＲＭと呼ばれる。ＣＲＭ１９７は、活性ジフテリア毒素から１つのアミノ酸変化を有し、活性毒素から免疫学的に区別不能である。ＣＲＭ１９７は、ヘモフィルス・インフルエンザ菌コンジュゲートワクチンの成分として、乳児において広く使用されている。
【００７５】
活性化された多糖又はオリゴ糖は、タンパク質に結合されることによってコンジュゲートワクチンを生じる。適当なタンパク質は、対象に投与するために、化学的又は遺伝学的手段によって安全にされた、免疫学的に有効な担体である細菌毒素が含まれる。例として、不活化された細菌毒素、例えば、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌由来の外毒素Ａなどが挙げられる。細菌性外膜タンパク質、例えば外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺剥離、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、又は肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１なども使用することができる。他のタンパク質、例えば炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びツベルクリンの精製タンパク誘導体（ＰＰＤ）なども使用することができる。タンパク質は、無毒性であり、非反応原性であり、好適な実施形態の結合方法に適用できる、十分な量及び純度で得られるタンパク質が好ましい。例えば、ジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）の培養物から精製し、ホルムアルデヒトを使用して化学的に解毒することによって、適当なタンパク質を得ることができる。
【００７６】
担体タンパク質の非限定例として、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、Ｃα、Ｃβタンパク質（例えば、非ＩｇＡ結合Ｃ−βタンパク質を含めた、Ｂ群連鎖球菌由来）、ジフテリアトキソイド、α溶血素、又はPanton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、例えば、髄膜炎菌外膜タンパク質、高分子量タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素／トキソイドＡ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、呼吸器合胞体ウイルスＦ、Ｇタンパク質、コレラ毒素サブユニットＢ、ニューモリソイド（pneumolysoid）、百日咳トキソイド、リシン又はシステイン残基を含有する合成タンパク質などが挙げられる。担体タンパク質は、天然タンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、解毒されたタンパク質又は組換えタンパク質とすることができる。タンパク質成分に関して、本発明によって調製されるコンジュゲート分子は、単量体、二量体、三量体及びより高度に架橋された分子とすることができる。
【００７７】
本発明は、担体タンパク質がＮ−アセチル含有多糖又はオリゴ糖に連結されているコンジュゲート分子の作製を可能にする。多糖又はオリゴ糖のサイズは、大きく変化し得る。１又は多数の多糖又はオリゴ糖は、１又は多数のタンパク質と架橋することができる。本発明のコンジュゲートは、格子構造であることが好ましい。
【００７８】
５．４ コンジュゲート
活性化された多糖を結合させるための多くの方法、即ち、少なくとも１つの部分を、タンパク質に供給結合的に結合することができるようにすることが必要である方法は、当技術分野で知られており、本明細書で使用するのに適している。例えば、Jenningsに発行された米国特許第４，３５６，１７０号明細書には、シアノボロヒドリドを使用する還元的アミノ化による、活性アルデヒド基を含む多糖の担体タンパク質への結合が記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり、少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位（即ち、活性アルデヒド基）の生成を可能にする。活性化された多糖分子は、１又は複数の担体タンパク質と反応し、このタンパク質への１つを超える連結を形成することができる。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲート生成物は、様々な架橋されたマトリックス型又は格子構造の混合物とすることができる。
【００８０】
結合後に、コンジュゲートは、任意の適当な方法によって精製することができる。精製は、未反応の多糖、タンパク質、又は小分子の反応副生物を除去するために用いられる。精製方法には、当技術分野で知られているように、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画などが含まれる。ある特定の実施形態では、精製はまったく必要でない場合があり、又は軽微な程度の精製のみが望ましい場合がある。コンジュゲートは、濃縮、又は希釈、又は処理して、所望の通りに、医薬組成物において使用するのに適した任意の形態にすることができる。
【００８１】
５．５ 医薬組成物
組成物（例えば、医薬組成物）は、混合物として、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤、及び活性成分として、本明細書に記載されているような、生物活性剤（例えば、複合糖質、オリゴ糖、多糖、ポリペプチド、又はペプチド）の１又は複数を含むことが好ましい。活性成分として生物活性剤を含む医薬組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。一般に、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液として調製されるが、投与における溶液又は懸濁液、投与前の液体にとって適した固体形態も調製することができる。配合物は、乳化することもできる。活性治療成分は、薬学的に許容され、活性成分、例えば、浸透エンハンサーと適合する賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せである。本発明の好適な担体、賦形剤、及び希釈剤は、生理食塩水（即ち、０．９％のＮａＣｌ）を含む。さらに、必要に応じて、組成物は、軽微な量の補助物質例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ−緩衝剤などを含むことができ、これは、活性成分の有効性を増強する。
【００８２】
本発明の組成物には、医薬組成物の製造に有用なバルク薬剤組成物（例えば、純粋でない又は滅菌していない組成物）、及び単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物（即ち、対象又は患者への投与に適した組成物）が含まれる。そのような組成物は、本明細書で開示される予防有効量若しくは治療有効量の予防剤並びに／若しくは治療剤又は、これらの薬剤及び薬学的に許容される担体の組合せを含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、免疫原性量の少なくとも１つの免疫原性複合糖質、及び場合により、薬学的に許容される担体を含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、予防有効量又は治療有効量の少なくとも１つの免疫原性複合糖質、及び場合により、薬学的に許容される担体を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、生理的に適合性であることを意味する。好ましくは、薬学的に許容されるは、動物、より詳細にはヒトにおいて使用するために、連邦又は州政府の管理機関によって認可されているか、米国薬局方又は他の一般に認知された薬局方において列挙されていることを意味する。用語「担体」は、希釈剤、賦形剤、浸透エンハンサー（上述したような当技術分野における）、又は一緒に治療剤が投与される媒体を指す。そのような医薬担体として、それだけに限らないが、滅菌液体、例えば、水、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含めた油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。一般的な適当な薬学的賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、軽微な量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとることができる。
【００８４】
上記に示した免疫原性複合糖質を含む本発明の医薬組成物は、本明細書では「ワクチン」と呼ばれる。用語ワクチンは、本発明の組成物が、予防的な又は治療的免疫応答を誘導するのに使用することができることを示すのに使用される。本発明のワクチンは、１つの抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質、又は複数の抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質を含むことができる。さらに、ワクチンは、１つ若しくは複数の抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質の混合物、又は前述の任意の組合せを含むことができる。本発明のコンジュゲートワクチンを含む医薬組成物は、弱免疫原性抗原（例えば、細菌性多糖又はオリゴ糖）の免疫原性の増強、使用される抗原の量の潜在的な低減、頻度の少ないブースター免疫化、効力の改善、免疫の選択的刺激又は免疫応答の潜在的な標的化を含めて、従来のワクチンに対して様々な利点を提供することができる。
【００８５】
本発明による１又は複数の免疫原性複合糖質を含むワクチン組成物は、皮膚、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、非経口的、肺内（intrapulmonarily）、膣内、直腸内、経鼻的、経口的又は局所的に投与することができる。ワクチン組成物は、注射、粒子ボンバードメントによって、経口的に、又はエアロゾルによって送達することができる。
【００８６】
本発明によるワクチン組成物は、薬学的に許容される担体などの様々な追加の物質をさらに含むことができる。適当な担体には、任意の標準的な薬学的に許容された担体、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン又はトリグリセリドエマルジョンなど、様々な種類の湿潤剤、錠剤、コーティングされた錠剤及びカプセルが含まれる。化合物の静脈内及び腹腔内投与において有用な許容されるトリグリセリドエマルジョンの例は、Intralipid.RTM.として商業的に知られているトリグリセリドエマルジョンである。一般に、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、ミルク、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性脂肪若しくは油、ゴム、グリコール、又は他の既知の賦形剤などを含む。そのような担体は、香味用添加物及び着色添加物、又は他の成分も含むことができる。
【００８７】
本発明のワクチン組成物は、適当な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、若しくは硫酸アルミニウム）及び／又は担体も含むことができる。そのような組成物は、液体又は凍結乾燥した、若しくは他の方法で乾燥した製剤の形態とすることができ、様々な緩衝液内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防止するための、アルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は張性調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール、ソルビトール）、タンパク質へのポリエチレングリコールなどのポリマーの共有結合性結合、金属イオンとの錯体形成、或いはポリマー化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの微粒子配合物中若しくは配合物上、又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層ベシクル、赤血球ゴースト、若しくはスフェロプラスト上への物質の取り込みを含むことができる。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響する。組成物の選択は、ワクチンの物理的及び化学的性質に依存する。例えば、膜結合形態の多糖及び／又は担体タンパク質に由来する生成物は、界面活性剤を含む製剤を必要とする場合がある。制御放出又は徐放組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。本発明の組成物の他の実施形態は、筋肉内、非経口、肺、経鼻、及び経口を含めた様々な投与経路ために、微粒子形態、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤又は浸透エンハンサーを組み入れる。
【００８８】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩として、それだけに限らないが、陰イオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどで形成されるもの、及び陽イオン、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどで形成されるものが挙げられる。
【００８９】
本発明の組成物、例えば、ワクチンは、組成物の免疫原性有効性を増強するための１又は複数のアジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、多糖ベースのワクチンとともに使用するのに適していることが当技術分野で既知の任意のアジュバントを用いることができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７７３，００７号明細書を参照されたい）。適当なアジュバントとして、それだけに限らないが、水中油型エマルジョン製剤（他の特定の免疫賦活剤、例えばムラミルペプチド又は細菌性細胞壁成分の有無にかかわらず）、例えば、（ａ）５％のスクアレン、０．５％のTween 80、及び０．５％のSpan 85（場合によりMTP-PEを含む）を含み、微小流動化剤（microfluidizer）を使用してサブミクロン粒子に製剤化された、ＭＦ５９．Ｍ．（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット；Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995）（ｂ）１０％のスクアラン、０．４％のTween 80、５％のプルロニックブロックポリマーL121、及びthr-MDPを含み、微小流動化してサブミクロンエマルジョンにされたか、より大きな粒径エマルジョンを生成するためにボルテックスされたＳＡＦ、及び（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のTween 80、及び１又は複数の細菌性細胞壁成分、例えば、モノホスホリリピド（monophosphorylipid）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Detox.TM.）などを含むRIBI.TM.アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ribi Immunochem社製、Hamilton, Mont.）などが挙げられる。他のアジュバントとして、サポニンアジュバント（QS21若しくはStimulon.TM.（Cambridge Bioscience社製、Worcester, Mass.）又はそれから生成される粒子、例えば追加の界面活性剤を欠いていてもよいＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）など（例えば、国際公開第００／０７６２１号パンフレット）；完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全なフロイントアジュバント（ＩＰＡ）；サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開第９９／４４６３６号パンフレット）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）又は３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、肺炎球菌糖とともに使用される場合、場合によりミョウバンの実質的な非存在下での、英国特許２２２０２２１号明細書、欧州特許出願公開第０６８９４５４号明細書、例えば、国際公開第００／５６３５８号パンフレット）；３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１及び／又は水中油型エマルジョン（例えば、欧州特許出願公開第０８３５３１８号明細書、欧州特許出願公開第０７３５８９８号明細書、欧州特許出願公開第０７６１２３１号明細書）との組合せ；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman et al., Nat. Med, 1997, 3, 849-854；Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837；Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876；Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631；Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344；Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224、Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549；Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883；Balks et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845；Cowdery et al, J. lmmunol, 1996, 156, 4570-4575；Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78；Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873；Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122；Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402；Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761；及びYi et al, J. lmmunol, 1998, 160, 5898-5906；国際特許出願、国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、国際公開第９８／１６２４７号パンフレット、国際公開第９８／１８８１０号パンフレット、国際公開第９８／４０１００号パンフレット、国際公開第９８／５５４９５号パンフレット、国際公開第９８／３７９１９号パンフレット及び国際公開第９８／５２５８１号パンフレット、即ち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、シトシンはメチル化されていない）；ポリオキシエチレンエーテル若しくはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開第９９／５２５４９号パンフレット）；オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１２０７号パンフレット）、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル、若しくはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１１５２号パンフレット）；サポニン及び免疫促進オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号パンフレット）；免疫賦活剤及び金属塩の粒子（例えば、国際公開第００／２３１０５号パンフレット）；サポニン及び水中油型エマルジョン、例えば、国際公開第９９／１１２４１号パンフレット；サポニン（例えば、QS21）＋3dMPL＋IM2（場合により＋ステロール）、例えば国際公開第９８／５７６５９号パンフレット；並びに／又は組成物の効力を増強するために免疫賦活剤として作用する他の物質が挙げられる。
【００９０】
医薬組成物は、生理的条件に近づけることが必要な場合、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。これらの製剤の抗原の濃度は、広く変更することができ（例えば、約０．１重量％未満から、通常約２重量％又は少なくとも約２重量％、２０重量％〜５０重量％又はそれ以上の程度まで）、選択される特定の投与様式及び患者の必要性に従って、流体の体積、粘度、体重などに主に基づいて選択される。得られる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション剤、軟膏、又はエアロゾルの形態とすることができる。
【００９１】
好適な実施形態によって調製されるコンジュゲートは、免疫学的に有効用量で、適当な形態で対象に投与されることによって、感染症を治療及び／又は予防する。用語「対象」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物などの動物を指す。例えば、企図される哺乳動物には、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどが含まれる。用語「対象」、「患者」、及び「宿主」は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、コンジュゲートワクチンの「免疫学的に有効な」用量は、免疫応答を誘導するのに適した用量である。特定の投与量は、治療される対象の年齢、体重及び医学的状態並びに投与方法に依存する。適当な用量は、当業者によって容易に決定することができる。
【００９２】
特定の疾患の治療及び／又は予防のための免疫化プロトコルを実行することにおいて、治療有効量のコンジュゲートが対象に投与される。本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、患者にとって意味のある利益、例えば、関連した医学的状態（疾患、感染症など）の免疫応答の増強、治療、治癒、予防若しくは寛解又はそのような状態の治療、治癒、予防若しくは寛解の速度の増加などを示すのに十分な治療剤（例えば、コンジュゲート）又は他の活性成分の総量を意味する。「有効量」が、単独で投与される個々の治療剤に適用されるとき、この用語は、その治療剤単独を指す。組合せに適用されるとき、この用語は、組合せ、連続的又は同時のいずれで投与されても、治療効果をもたらす成分の合わせた量を指す。本明細書で使用する場合、治療剤の「有効量を投与すること」という語句は、対象が、疾患、感染症、又は障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、好ましくは持続性の改善を誘導するのに十分な量及び時間、前記治療剤（複数も）を用いて治療されることを意味する。
【００９３】
本発明のコンジュゲートワクチンは、単一用量として、又は１若しくは複数の追加免疫を含む連続で投与することができる。例えば、乳児又は小児に、年少期に単一用量を投与し、次いで最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年後以上に追加免疫用量を投与することができる。追加免疫用量により、初回抗原刺激を受けたＢ細胞由来の抗体、即ち、既往応答が生じる。コンジュゲートワクチンは、乳児又は小児において、高い一次の機能抗体応答を誘導し、追加免疫投与後に既往応答を誘導することができ、コンジュゲートワクチンによって誘導される防御免疫反応が長続きすることを実証する。
【００９４】
本発明のワクチンは、製剤化して、例えば、経口（oral）、経鼻、肛門、直腸、頬側、膣、経口（peroral）、胃内、粘膜、舌下、肺胞、歯肉、嗅覚、又は呼吸器粘膜の投与用の液体製剤にすることができる。そのような投与に適した形態には、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤が含まれる。コンジュゲートワクチンは、非経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内又は静脈内の投与、注射可能投与、インプラントからの徐放、点眼剤による投与用にも製剤化することができる。そのような投与に適した形態には、滅菌した懸濁液及びエマルジョンが含まれる。そのようなコンジュゲートワクチンは、適当な担体、希釈剤、又は賦形剤、例えば滅菌した水、生理食塩水、グルコースなどとの混合物とすることができる。コンジュゲートワクチンは、凍結乾燥することもできる。コンジュゲートワクチンは、望まれる投与経路及び製剤に応じて、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加剤又は粘性増強添加剤、保存剤、香味剤、染料などを含むことができる。標準的な教科書、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれている、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (Jun. 1, 2003)並びに"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co.;18th and 19th editions （それぞれ、December 1985、及びJune 1990）を、過度の実験を伴うことなく、適当な製剤を調製するために調べることができる。そのような製剤は、錯化剤、金属イオン、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなど、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層ベシクル、赤血球ゴースト、又はスフェロブラストを含むことができる。リポソーム製剤用に適した脂質として、制限なく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。そのような追加成分の存在は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、インビボクリアランス速度に影響することができ、したがって、意図された用途によって選択され、その結果、担体の特徴は、選択された投与経路に適応される。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、レシピエントの血液又は他の体液と等張性であることが好ましい。組成物の等張性は、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール又は他の無機若しくは有機溶質を使用して得ることができる。塩化ナトリウムは、特に好適である。酢酸及び塩、クエン酸及び塩、ホウ酸及び塩、並びにリン酸及び塩などの緩衝剤を使用することができる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース。デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油が含まれる。静脈内媒体には、流体及び栄養分補給物、電解液補給物（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。
【００９６】
本発明の医薬組成物及び／又はワクチンは、疾患又は障害（例えば、細菌感染症）を罹患するリスクのある対象に投与することによって、疾患及び／又はそれに関連する症状若しくは合併症の発症を予防又は少なくとも部分的に停止することができる。治療用途に有効な量は、例えば、抗原組成物、投与様式、患者の体重及び健康の一般的な状態、並びに処方医師の判断に依存する。単一又は複数の用量の抗原組成物を、患者によって必要とされ、耐容性が示される投与量及び頻度、並びに投与経路に応じて投与することができる。
【００９７】
５．５．１ 免疫化レジメン
本発明の医薬組成物及び／又はワクチンは、検出可能な宿主の自己抗体をわずかしか、又はまったく生成することなく、選択的な抗多糖又は抗オリゴ糖抗体を生成する様式で宿主に投与される。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、連続的に投与される。最初に、免疫原性的に（immunogenically）有効な用量の本発明のワクチンが対象に投与される。この第１の用量は、一般に、免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞）を誘導するのに有効な量で投与される。初回免疫化のための量は、一般に、７０キログラムの患者当たり約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇ、より一般には、７０キログラムの患者当たり約０．００１ｍｇ〜約０．２ｍｇ、通常、７０キログラムの患者当たり約０．００５ｍｇ〜約０．０１５ｍｇの範囲である。特に抗原が、体腔又は器官の管腔中など、血流中に投与されない場合、患者１人当たり、１日あたり、０．００１〜最大約１０ｍｇの投与量を使用することができる。実質的により高い投与量（例えば、１０〜１００ｍｇ又はそれ以上）が、経口、経鼻、又は局所投与において可能である。
【００９９】
第１のワクチン投与量を投与した後、治療上有効な第２の用量の本発明のワクチンが、対象が、第１の用量への暴露によって免疫学的に初回抗原刺激を受けた後に対象に投与される。患者の応答及び状態に応じて、追加免疫を、最初に免疫化して数日、数週間、又は数カ月後に投与することができる。
【０１００】
第１のワクチン投与に対する免疫応答の存在は、既知の方法によって判定することができる（例えば、最初の免疫化の前後に個体から血清を得、個体の免疫状態の変化を示し（例えば、免疫沈降法アッセイ、若しくはＥＬＩＳＡ、若しくは殺菌アッセイ、若しくはウエスタンブロット、若しくはフローサイトメトリーアッセイなど）、且つ／又は第２の注射に対する免疫応答の規模が、第２の注射に使用した物質の組成物で最初に免疫化された対照動物の免疫応答の規模より高いことを示すことによって（例えば、免疫学的なプライミング））。第１のワクチン投与に対する免疫性のプライミング及び／又は免疫応答の存在は、以前の経験に基づいて、免疫応答及び／又はプライミングを起こさせるのに十分な時間である、第１の免疫化後の期間、例えば、２、４、６、１０又は１４週間待つことによって仮定することもできる。第２の免疫化の追加免疫投与量は、免疫原の性質及び免疫化の経路に応じて、一般に、約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇの抗原である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、個体が、初回抗原刺激を受け、且つ／又は第２のワクチン組成物に対する免疫応答を開始した後、治療有効用量の第３のワクチン組成物が対象に投与される。第３の追加免疫は、対象の応答及び状態に応じて、第２の免疫化から数日、数週間、又は数カ月後に投与することができる。
【０１０２】
本発明は、同じ又は異なるワクチン製剤を使用した、第４、第５、第６又はそれ以上の追加免疫の使用をさらに企図する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、抗原組成物は、免疫複合体の多糖又はオリゴ糖の細菌源に対して免疫学的に未処置の哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与される。特定の実施形態では、哺乳動物は、約５歳以下、好ましくは約２歳以下のヒト小児であり、抗原組成物は、以下の時間の任意の１又は複数に投与される：生後２週間、１カ月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１カ月、又は１年若しくは１５、１８、若しくは２１カ月、又は２、３、４、若しくは５歳。
【０１０４】
好適な実施形態では、任意の哺乳動物への投与は、疾患症状の最初の徴候の前、又は感染症若しくは疾患への予想される若しくは実際の暴露（例えば、ナイセリア若しくは大腸菌Ｋ１による暴露又は感染症による）の最初の徴候時に開始される。
【０１０５】
薬剤組成物又はワクチン組成物は、投与製剤と適合性の様式で、及び治療有効量で投与することができる。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系の、活性成分を利用する能力、及び必要とされる調節の程度に依存する。投与されるのに必要な正確な量は、専門家の判断に依存し、それぞれの個体に特定的である。しかし、ヒト乳児については、本発明の医薬組成物内の免疫原性複合糖質の、治療上の有効用量は、体重１ｋｇ当たり、約５〜約７．５μｇ、約５〜約１０μｇ、約５〜約１２．５μｇ、約５〜約１５μｇ、約５〜約１７．５μｇ、約５〜約２０μｇ、約５〜約２５μｇ、約５〜約３０μｇ、約５〜約３５μｇ、約５〜約４０μｇ、約５〜約４５μｇ、若しくは約５〜約５０μｇを含み、及び／又は約１〜約１．５μｇ、約１〜約２μｇ、約１〜約２．５μｇ、約１〜約３μｇ、約１〜約３．５μｇ、約１〜約４μｇ、約１〜約５μｇ、約１〜約６μｇ、約１〜約７μｇ、約１〜約８μｇ、約１〜約９μｇ、若しくは約１〜約１０μｇの範囲で含む。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物又はワクチン組成物は、ヒト対象を意図していても、非ヒト対象を意図していても、現在使用されている、又は開発中の様々なワクチンと組み合わせて投与することができる。ヒト対象用、かつ感染症に対するワクチンの例として、ジフテリア及び破傷風トキソイド混合ワクチン；百日咳全細胞ワクチン；不活化されたインフルエンザワクチン；２３価肺炎球菌ワクチン；麻疹生ワクチン；流行性耳下腺炎生ワクチン；風疹生ワクチン；カルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）結核ワクチン；Ａ型肝炎ワクチン；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型肝炎ワクチン；狂犬病ワクチン（例えば、ヒト二倍体細胞ワクチン）；不活化されたポリオワクチン；髄膜炎菌多糖ワクチン；四価髄膜炎菌ワクチン；黄熱病生ワクチン；腸チフス死菌全細胞ワクチン；コレラワクチン；Ｂ型日本脳炎死滅ウイルスワクチン；アデノウイルスワクチン；サイトメガロウイルスワクチン；ロタウイルスワクチン；水痘ワクチン；炭疽ワクチン；天然痘ワクチン；並びに他の市販ワクチン及び実験的ワクチンが挙げられる。
【０１０７】
５．６ 治療剤有用性の特徴づけ及び実証
いくつかの態様の本発明の医薬組成物は、ヒトに使用する前に、所望の治療活性について、インビトロで、例えば、細胞培養系において、次いでインビボで、例えば、げっ歯類動物モデル系などの動物モデル生物体において試験されることが好ましい。特定のワクチン組成物に対する治療的免疫応答を生じる可能性を評価するのに使用することができるアッセイは、当技術分野で公知である。
【０１０８】
予防剤及び／又は治療剤の組合せは、ヒトにおいて使用する前に適当な動物モデル系において試験することができる。そのような動物モデル系には、それだけに限らないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれる。当技術分野で公知の任意の動物系を使用することができる。本発明の特定の実施形態では、予防剤及び／又は治療剤の組合せは、マウスモデル系において試験される。予防剤及び／又は治療剤は、繰り返して投与することができる。予防剤及び／又は治療剤を投与する時間的な投与法、及びそのような薬剤が別々に又は混合物として投与されるかどうかなどの手順のいくつかの側面は、変更することができる。
【０１０９】
５．７ 毒性研究
本発明の組成物の毒性及び／又は効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を求めるために、細胞培養又は実験動物において、標準的な薬学の手順によって求めることができる。毒性作用と治療効果の用量比は治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す療法が好適である。毒性副作用を示す療法を使用することができるが、非感染細胞の潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を患部組織の部位に向ける送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０１１０】
動物研究から得たデータは、対象において使用するために、様々な投与量の療法を製剤化することに使用することができる。そのような薬剤の投与量は、毒性をわずかしか、又はまったく含まないＥＤ５０を含む、様々な濃度内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。本発明の方法において使用される任意の療法について、治療上有効な用量は、動物アッセイから最初に推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方することによって、動物モデルで求めた場合のＩＣ５０（即ち、症状の最大半量の阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む、投与される濃度範囲を実現することができる。そのような情報は、対象（例えば、ヒト）における有用な用量をより正確に求めるために使用することができる。
【０１１１】
５．８ キット
本発明は、点滴注入する前の混合の利便性のため、及び滅菌性を維持するための適切な包装及び取扱いデバイスと一緒に、所望の投与量に可溶性又は希釈可能な貯蔵に安定した形態で存在する単位用量の組成物を有するキットも包含する。そのようなキットは、例えば、原液中の単位用量又は凍結乾燥粉末としての単位用量として、安定な貯蔵形態で活性成分を含む第１の容器と；別々又は混合された希釈剤、又は溶媒と希釈剤を含む第２の容器であって、その体積は、投与に適切な体積で単位用量の治療化合物を提供する第２の容器と；希釈剤を原液又は凍結乾燥粉末と混合する手段と、必要に応じ、患者に用量を投与するための手段とを含むことができる。希釈剤を原液又は凍結乾燥粉末に移す手段として、それだけに限らないが、活性成分を希釈剤と分離している破壊可能な（breachable）内部封止剤を有するシリンジ又は多室（multi-chambered）容器を挙げることができる。
【０１１２】
本発明は、本発明の医薬組成物又はその一部で満たされた１又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。さらに、疾患又は障害の治療に有用な１又は複数の他の予防剤又は治療剤も、医薬品パック又はキット中に含めることができる。本発明は、本発明の医薬組成物の１又は複数の成分で満たされた１又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を統制する行政機関によって規定された形態での通知書を、そのような容器（複数も）に付随させてもよく、この通知書はヒトへの投与ための製造、使用又は販売の機関による認可を反映する。
【０１１３】
一般に、発明の組成物の成分は、例えば、活性薬剤の量を示している、アンプル又はサシェなどの気密封止して密閉された容器中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に、又は単位剤形中に一緒に混合して供給することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、凍結乾燥後の取扱いを容易にするのに十分な物質を提供するために、増量剤、例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ポリビニルピロリドンなどをさらに含む。
【０１１４】
本発明は、上記方法において使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１又は複数の本発明の医薬組成物を含む。別の実施形態では、キットは、１又は複数の容器中に、感染症又はそれに関連する症状の治療に有用な１又は複数の他の予防剤又は治療剤をさらに含む。
【０１１５】
本発明を、特定の実施形態の例によって開示してきたが、他の実施形態、方法、組成物、活性成分、指示、組成物及びキットは、当業者に明らかになるであろう。すべてのそのような変更及び拡張は、本明細書に開示し、主張したように、本発明に含まれる。
［実施例］
【０１１６】
６．１ 実施例Ｉ：結合：
図１は、全般的な本発明の方法の概略の流れ図を表す。多糖中のＮ−アセチル基の少なくとも１つ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びサイル酸（sailic acid）由来の）は、アルカリを使用し、その後にＮ−ペンテノイル化（５炭素の不飽和脂肪族鎖を使用して）によって、Ｎ−アシル部分と置換することによって式Ｉの化合物を形成する。次いで得られるアシル化化合物を酸化することによって、ペンテノイル基の不飽和部位に活性アルデヒド基を生成する。次いで酸化化合物を、活性化された多糖の還元的アミノ化によって担体タンパク質と結合させ、これにより免疫原性複合糖質を生成する。生成物の免疫原性は、動物モデル（下記）を使用して実証することができる。
【０１１７】
すべての実験について、結合の進行は、スパロース１２カラムを備えたBiologicシステム（Bio-Rad社製）を用いて分析した。多糖の抗原タンパク質への結合は、カラムの空隙容積中で溶出して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定によってモニターした、ピークの漸進的増大によって示した。結合が完了した後、０．１ＮのＨＣｌを用いて溶液をｐＨ７に中和し、次いでＰＢＳに対して透析した。コンジュゲートは、Superdex 200PG（Pharmacia社製）の１．６×６０ｃｍのカラムを通過させることによって精製し、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳを用いて溶出した。空隙−容積ピークに対応する分画をプールした。コンジュゲート中の炭水化物及びタンパク質含量は、Dubois et al. (51)のフェノール−硫酸アッセイ、及びBradford (9)のクーマシーアッセイによって推定した。
【０１１８】
６．２ 実施例II．Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）多糖−タンパク質コンジュゲート：
ＧＡＳ多糖のＮ−アセチル基の一部（３５〜４０％）の置換：
０．０１２ＮのＮａＯＨ中のＧＡＳ多糖（３０ｍｇ／ｍｌ）を、室温（（ＲＴ）約２０〜２５℃）で攪拌しながら、ＮａＢＨ４（８ｍｇ／ｍｌ）で７５分間処理した。３ＮのＮａＯＨ（０．０１２ＮのＮａＯＨの体積の１／２）を攪拌しながら反応混合物中に添加することによって、２０ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度を実現した。次いでこの反応混合物を８０℃に１時間維持した。次いでこれをＲＴに冷却し、水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの最終ＧＡＳ多糖濃度にした。これを、Stir-cell中の３Ｋ再生セルロース膜を使用して水に対してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水をダイアフィルトレーションのために使用することによって、２４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳの濃度を実現した。Ｎ−アセチル基の１級アミノ基との置換の程度は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってモニターした。
【０１１９】
Ｎ−アセチル基置換ＧＡＳ多糖のＮ−アシル化（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）（１５〜２５％）：
１，４−ジオキサン（４−塩化ペンテノイル１ｍｌ当たり１ｍｌ）中の４−塩化ペンテノイル（多糖１００ｍｇ当たり１ｍｌ）を、Ｎ−アセチル基置換ＧＡＳ多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。溶液のｐＨは、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで４５分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．８に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１０倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。
【０１２０】
Ｎ−アセチル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）−ＧＡＳ多糖の任意選択のキャッピング（例えば、Ｎ−アセチル化）（図２を参照されたい）：
無水酢酸（多糖１００ｍｇ当たり０．６ｍｌ）をＮ−ペンテノイル化ＧＡＳ多糖の撹拌した溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで７５分の時間にわたって液滴で添加した。この溶液のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで６０分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。多糖中のペンテノイル基の取り込みは、６００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ分析によって推定した（図３を参照されたい）。
【０１２１】
Ｎ−アシル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）ＧＡＳ多糖の酸化（図２を参照されたい）：
メタノール（多糖溶液の体積の１／２）を、Ｎ−ペンテノイルＧＡＳ多糖の撹拌した水溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで徐々に添加した。この混合物を、ドライアイス−エタノール浴を使用して、約−１５〜−２０℃に冷却した。温度を−１５〜−２０℃で維持しながら、オゾン（オゾン製造機（ozonolyzer）Ozomax 1を使用して空気から生成した）を、徐々に撹拌している反応混合物に通して４０分間バブリングした。次いで窒素を、混合物に通して１０分間バブリングすることによって、過剰のオゾンを排出した。次いでこの反応物を水で希釈することによって、５ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。２５倍の体積の水を浸透液として収集し、保持液を濃縮することによって、２０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にした。次いでこれを凍結乾燥して次のステップで使用した。
【０１２２】
破傷風トキソイド／組換え破傷風トキソイド断片Ｃへの結合：
０．２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中のＮ−ブチルオキシ（Ｎ−ＢｕＯ）ＧＡＳ多糖（９６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）（Ｎ−ペンテノイルＧＡＳ多糖の酸化から生じる）を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中の破傷風トキソイド（濃縮された１２０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｌ）の溶液に添加した。ナトリウムシアノボロヒドリド（４０ｍｇ）をこの溶液に添加し、反応混合物を撹拌することによって均一な混合物を実現した。この反応混合物を、穏やかに振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、別の１６ｍｇのナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、この反応をさらに４８時間進めさせた。４８時間後に、追加の４ｍｇのナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、反応物を３７℃で振盪しながらさらに２４時間放置した。
【０１２３】
次いで０．０５ＮのＮａＯＨ（０．５ｍｌ）中の水素化ホウ素ナトリウムの５％溶液を添加し、ＲＴで１時間穏やかに撹拌した。次に、１Ｎの酢酸（３部分で０．７２ｍｌ）をＲＴで攪拌しながら添加した。反応物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して３２ｍｌにし、３０Ｋ膜を使用して、Labscale TFFシステム中で精製した。３０倍の体積の浸透液を収集した。保持液（３０ｍｌ）を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、ＰＢＳ（０．３ｍｌ）中のチメロサールの１０％溶液を、コンジュゲート溶液に添加した。コンジュゲート溶液は、２〜８℃で貯蔵した。ＧＡＳ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１２４】
６．３ 実施例III．髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲート：
Ｎ−アセチル基置換−基置換髄膜炎菌Ｂ多糖のＮ−アシル化（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）（１５〜２５％）：
１，４−ジオキサン（４−塩化ペンテノイル１ｍｌ当たり１ｍｌ）中の４−塩化ペンテノイル（多糖１００ｍｇ当たり１ｍｌ）を、Ｎ−アセチル基置換多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。溶液のｐＨは、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで４５分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。次いでこの反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１０倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。
【０１２５】
Ｎ−アセチル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）−髄膜炎菌Ｂ多糖の任意選択のキャッピング（例えば、Ｎ−プロピオニル化）（図４を参照されたい）：
無水プロピオン酸−エタノール混合物（２．５：１、多糖１００ｍｇ当たり０．８４ｍｌ）をＮ−ペンテノイル化多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで撹拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。この溶液のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで６０分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。多糖中のペンテノイル基の取り込みは、６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲ分析によって推定した（図５を参照されたい）。
【０１２６】
Ｎ−アシル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）及び任意選択のキャップ化（例えば、Ｎ−プロピオニル化）−Ｂ群髄膜炎菌Ｂ多糖（ＧＢＭＰ）の酸化（図４を参照されたい）：
メタノール（多糖溶液の体積の１／２）を、Ｎ−ペント−Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰの水溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら徐々に添加した。次いでこの混合物を、ドライアイス−エタノール浴を使用して、約−１５〜−２０℃に冷却した。温度を約−１５〜−２０℃で維持しながら、オゾン（オゾン製造機Ozomax 1を使用して空気から生成した）を、穏やかに撹拌した反応混合物に通して４０分間バブリングした。次いで窒素を、混合物に通して１０分間バブリングすることによって、過剰のオゾンを排出した。この反応物を水で希釈することによって、５ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を用いて、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。２５倍の体積の水を浸透液として収集し、保持液を濃縮することによって、２０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にした。次いでこれを凍結乾燥して次のステップで使用した。
【０１２７】
髄膜炎菌由来の組換え髄膜炎菌タンパク質（ｒＰｏｒＢ）／外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）への結合：
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中の活性Ｎ−ブタノイルオキシ−（ＮｂｕＯ）Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ（Ｎ−ブト−［−ＣＨ＝Ｏ］−Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ、１７ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中のｒＰｏｒＢ／ＯＭＰＣ（濃縮された１５ｍｇ／ｍｌ）の溶液に添加した。反応混合物中のタンパク質と多糖の最終濃度は１：３であった。ナトリウムシアノボロヒドリド（多糖の質量の０．５倍）を添加し、反応混合物を撹拌することによって均一な混合物を保証した。この反応混合物を、穏やかに振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、ナトリウムシアノボロヒドリド（多糖の質量の０．１２５倍）を再び添加し、この反応をさらに４８時間続けた。４８時間後に、さらなる量のナトリウムシアノボロヒドリドを混合物に添加し（多糖の質量の０．０３２倍）、反応物を３７℃で振盪しながら２４時間維持した。
【０１２８】
次いで０．０５ＮのＮａＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウムの５％溶液（最初の反応体積の０．２倍）を添加し、ＲＴで１時間穏やかに撹拌した。１Ｎの酢酸の溶液（３部分で最初の反応体積の０．３倍）をＲＴで攪拌しながら添加した。反応物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、次いで３０Ｋ膜を使用して、Labscale TFFシステム中で精製した。３０倍の体積の浸透液を収集した。保持液を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、ＰＢＳ中のチメロサールの１０％溶液（チメロサール０．０１％の最終濃度）を、コンジュゲート溶液に添加した。コンジュゲート溶液は、２〜８℃で貯蔵した。髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１２９】
６．４ 実施例IV．髄膜炎菌Ｃ多糖−タンパク質コンジュゲート：
Ｎ−アセチル基の一部の置換、アシル化、酸化、及びタンパク質との結合を、上述した手順に従って行った。髄膜炎菌Ｃ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１３０】
６．５ 実施例Ｖ．Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質コンジュゲート：
上述した同様の実験手順に従って、Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質の活性化及び結合を実施した。Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
６．６ 実施例VI．ＧＡＳＰ−ＴＴコンジュゲートを用いたＢＡＬＢ Ｃマウスの免疫化：
コンジュゲート（ＰＢＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌ）をアンヒドロゲル（anhydrogel）（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて製剤化した。アンヒドロゲル中のコンジュゲート溶液（２００ｍｌ、２μｇ当量のコンジュゲート多糖）の懸濁液を、２週間間隔でＢａｌｂＣマウス中に注射した。３回の連続した注射の後、最後の注射から１週間後に血液試料を収集した。血清を試料から分離し、血清中の抗多糖抗体をＥＬＩＳＡによって定量化した。ＢａｌｂＣマウスにおける、多糖に対するＡ群連鎖球菌多糖−破傷風トキソイドコンジュゲートによって誘導された免疫応答の結果を図６に示す。
【０１３３】
６．７ 実施例VII．ＭＥＮＧＢ−ＲＰＯＲＢコンジュゲートを用いたＣＤＩマウスの免疫化：
コンジュゲート（ＰＢＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）をアンヒドロゲル（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて製剤化した。アンヒドロゲル中のコンジュゲート溶液（２００ｍｌ、２μｇ当量のコンジュゲート多糖）の懸濁液を、２週間間隔でＣＤＩマウス中に注射した。３回の連続した注射の後、最後の注射から１週間後に血液試料を収集し、血清を分離した。血清中の多糖特異的抗体をＥＬＩＳＡによって求めた。血清の細菌活性は、血清の存在下で、チョコレート寒天をコーティングしたプレートにおける細菌増殖の阻害を測定することによって判定した。ＣＤＩマウスにおける、髄膜炎菌Ｂ多糖−ｒＰｏｒＢコンジュゲートによって上昇した血清の殺菌活性を表２に示す。
【０１３４】
本発明によって調製した３つの別個のロットのＮＰｒ−（ＮｂｕＯ）−ＧＢＭＰ−ｒＰｏｒＢコンジュゲート、即ちロット１〜ロット３によって生じた血清の血清殺菌活性（ＳＢＡ）は、シアル酸鎖末端の従来の還元的アミノ化によって調製したＮＰｒ−ＧＢＭＰ−ｒＰｏｒＢコンジュゲートから生じた血清のＳＢＡより、４２と５２日目で抜血した後に著しく高かった（表２を参照されたい）。本発明によって調製されたコンジュゲートは、多糖鎖に沿って複数の部位で活性化された、比較的大きなサイズの多糖部分の使用により、免疫応答の改善をもたらし、コンジュゲートの架橋結合を改善すると考えられる。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
記述、具体的な実施例、及びデータは、例示的な実施形態を示すが、例として示されており、本発明を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び改変は、本明細書に含まれる考察、開示、及びデータから当業者に明らかとなり、したがって本発明の一部とみなされる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に対象における治療的免疫応答誘導用の医薬組成物で使用するための免疫原性複合糖質（immunogenic glycoconjugate）の製造方法に関する。本発明の免疫原性複合糖質は、活性アルデヒド基を介して１又は複数の担体タンパク質に結合した１又は複数のオリゴ糖又は多糖を含む。したがって、本発明は、（ｉ）不飽和微生物Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖、（ii）不飽和Ｎ−アシル誘導体の新規なコンジュゲート、及び（iii）１又は複数のタンパク質への共有結合性リンカーとしての機能を果たす微生物不飽和Ｎ−アシル誘導体の断片のコンジュゲート分子を含む複合糖質組成物の作製方法を提供する。本発明は、感染症の予防又は治療のための免疫原性複合糖質医薬組成物の使用をさらに包含する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性菌、例えば、連鎖球菌（Streptococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）、バチルス（Bacillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リステリア（Listeria）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、及びクロストリジウム（Clostridium）など、並びにグラム陰性菌、例えば、ヘモフィルス（Haemophilus）、シゲラ（Shigella）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ナイセリア（Neisseria）及びある特定の型の大腸菌（Escherichia coli）によって生じる微生物感染症は、世界中で深刻な罹患率で発生している。連鎖球菌は、例えば、その細胞壁多糖の抗原性及び構造に基づいていくつかの群に整理されている、大きな変化に富む、グラム陽性菌の属である（Lancefield, R. C. 1933. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J.Exp.Med. 57.571-595、Lancefield, R. C. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc.Soc.Exp.Biol.and Med. 38:473-478；そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０００３】
Ｂ群連鎖球菌は、例えば、莢膜多糖に基づいていくつかの異なる型、例えば、Ｉａ、Ｉｂ、II、III、IV、Ｖ、VI、VII、及びVIII型に分類され、これらは病原性の型の大部分を占める。多くの他のヒト細菌性病原体に関する知見と同様に、Ｂ群連鎖球菌の莢膜多糖は、ワクチンにおいて使用される場合、これらの細菌を伴う感染症に対する有効な防御を提供することができる（そのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wessels, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 86:1428-1433、Wessels, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib group B streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61:4760-4766を参照されたい）。
【０００４】
グラム陰性菌も罹患率及び死亡率の重要な原因である。ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）ｂ型細菌（Ｈｉｂ）に対する多糖−タンパク質ワクチンが最近開発及び使用されるまで、Ｈｉｂ細菌感染症は、乳児における精神遅滞の多くの症例の原因であった。
【０００５】
乳児及び幼児は、一般に、多糖抗原に対する免疫原性応答が乏しい。これらの応答は、Ｔ細胞非依存性であると特徴づけられており、したがって、その後の感染症に対する長期免疫保護を付与するのに必要である重要な特性、例えば、記憶、アイソタイプスイッチング、又は親和性成熟に関連しない。このような、乳児及び幼児における、多糖に対する有効な免疫原性応答の欠如を回避するために、当分野では、多糖細菌性抗原を担体タンパク質に非共有結合的に結合させてコンジュゲート分子を形成することによって、Ｔ細胞非依存性応答をＴ細胞依存性応答に変換するための手法を開発することに向けて研究が行われてきた。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jenningsらの、米国特許第４，３５６，１７０号明細書を参照されたい。
【０００６】
アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する物質であり、したがって、多くのワクチン及びワクチン候補において使用されている。アジュバントの免疫刺激作用は、多くの異なる種類の抗原に向けて免疫応答をブーストするので抗原特異的ではない。ＦＤＡによってヒトに使用するために現在認可されている唯一のアジュバントはアルミニウム塩であるが、動物のワクチン接種及びより新規なワクチン候補において使用される多くのアジュバントは、起源が微生物である（White, R. G., 1976. The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann.Rev.Microbiol. 30:579-595；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、コリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）、ムラミルジペプチド、破傷風トキソイドなどが含まれる。
【０００７】
多糖の担体タンパク質への結合は、その多糖を効果的に、より免疫原性にすることができる。当技術分野で既知の担体タンパク質として、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、例えば、高分子量タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、又は呼吸器合胞体ウイルスＦ及びＧタンパク質が挙げられる。
【０００８】
破傷風トキソイドは、その担体としての性能において数十年間使用されており、その安全性プロファイルは確立されている。
【０００９】
様々な細菌感染症を標的とする莢膜多糖（ＣＰ）コンジュゲートワクチンは、現在、開発及び臨床評価中である。混合された複数のＣＰ血清型を単一の注射に含めることは、現在研究中である。しかし、ＣＰコンジュゲートワクチンを組み合わせて単一の多価注射にすることは、異なる成分間で競合をもたらし、任意の個々のコンジュゲートの免疫原性に悪影響を及ぼす場合がある（Fattom et al., 1999, Vaccine 17: 126-33；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００１０】
莢膜多糖をタンパク質に結合させるための様々な手順が当技術分野で記載されている。多糖の担体タンパク質への結合は、その多糖を効果的に、より免疫原性にすることができる（Robbins, J. B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J. Infect. Dis. 161:821-832；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。別の概説については、Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10, Conjugate Vaccines, volume editions J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr., 1989（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。一方法では、多糖を穏やかに酸加水分解することによって、タンパク質と反応して共有結合を形成することが可能な、還元末端基が作製される（Anderson, P. A., 1983, Infect. Immun., 39:233-238；その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。しかし、タンパク質への結合に関与する末端糖基は、ヘミアセタールとアルデヒドの間の平衡状態で存在し、したがって低効率でタンパク質に結合する。末端還元糖の低い反応性を克服するために、当技術分野では、タンパク質への結合に使用される多糖の末端位置に、安定なアルデヒド基を導入するための、穏やかな酸化に目が向けられてきた（Jenningsらの米国特許第４，３５６，１７０号明細書、上記を参照されたい）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，３５６，１７０号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Lancefield, R. C. 1933. A serological differentiation of human and other groups of hemolytic streptococci. J. Exp. Med. 57:571-595
【非特許文献２】Lancefield, R. C. 1938. A micro-precipitin technique for classifying hemolytic streptococci and improved methods for producing antigen. Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 38:473-478
【非特許文献３】Wessels, et al. 1990. Immunogenicity in animals of a polysaccharide-protein conjugate vaccine against type III group B Streptococcus. J. Clin. Invest. 86:1428-1433
【非特許文献４】Wessels, et al. 1993. Stimulation of protective antibodies against type Ia and Ib group B streptococci by a type Ia polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. Infect. Immun. 61:4760-4766
【非特許文献５】White, R. G., 1976. The adjuvant effect of microbial products on the immune response. Ann.Rev.Microbiol. 30:579-595
【非特許文献６】Fattom et al., 1999, Vaccine 17: 126-33
【非特許文献７】Robbins, J. B. and R. Schneerson. 1990. Polysaccharide-protein conjugates: A new generation of vaccines. J. Infect. Dis. 161:821-832
【非特許文献８】Contributions to Microbiology and Immunology, vol 10, Conjugate Vaccines, volume editions J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr., 1989
【非特許文献９】Anderson, P. A., 1983, Infect. Immun., 39:233-238
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
他の利用可能な方法、例えば、いくつかの多糖のＩＯ４−酸化による活性化は、１多糖分子当たり唯一の活性部位を生成することができ、結果として起こる担体タンパク質への結合により、単一末端の複合糖質ワクチンが生成される。この仕組みは、例えば、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃ型、Ｂ型、及び連鎖球菌Ａ群に対する複合糖質ワクチンに見出される。しかし、活性部位が１分子当たり１個ということが、免疫原性増強の程度を制限する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、適当な担体タンパク質への結合によって、免疫原性の、架橋複合糖質ワクチンの生成を可能にする、複数の活性部位を有する多糖を提供する。さらに、この方法は、アミノ糖を含む任意の多糖にも適用可能であり、糖鎖中の２つの隣接する（adjacent）、即ち、隣接する（vicinal）遊離ヒドロキシ（−ＯＨ）基を必要とする現存するＩＯ４−酸化法に対して明らかに有利である。
【００１５】
本発明は、特に対象における治療的免疫応答誘導用の医薬組成物において使用するための免疫原性複合糖質の製造方法に関する。本発明の免疫原性複合糖質は、活性アルデヒド基を介して１又は複数の担体タンパク質に結合した１又は複数のオリゴ糖又は多糖を含む。当技術分野で既知の以前の結合方法と異なり、本発明は、少なくとも１つのアミノ糖を含む任意の多糖に適用可能な方法を提供し、この方法により、抗原性を維持する洗練された、可溶性コンジュゲートも生成される。
【００１６】
本発明は、免疫原性複合糖質の作製方法であって、１又は複数のアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖中の少なくとも１つのＮ−アセチル基を脱アセチル化し、１級アミノ基を含む少なくとも１つ、好ましくは複数のアミノ糖を有するオリゴ糖又は多糖を形成するステップと；１級アミノ基の少なくとも１つを、少なくとも４炭素長の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換し、それによって１又は複数のアルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つ、好ましくは複数の活性部位を含むオリゴ糖又は多糖を生成させるステップと；この化合物を酸化剤と接触させ、オリゴ糖又は多糖上の１又は複数の不飽和部位に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成するステップと；この化合物を担体タンパク質と結合させ、それによって免疫原性複合糖質を生成させるステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
代替の実施形態では、本発明は、免疫原性複合糖質の作製方法であって、１又は複数のアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖中の少なくとも１つのＮ−アセチル基を、少なくとも４炭素長の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換し、それによって１又は複数のアルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つ、好ましくは複数の活性部位を含むオリゴ糖又は多糖を生成させるステップと；この化合物を酸化剤と接触させ、オリゴ糖又は多糖上のアルキル部分の１又は複数の不飽和部位に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成させるステップと；この化合物を担体タンパク質と結合させ、それによって免疫原性複合糖質を生成させるステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法によれば、Ｎ−アシル部分は、不飽和アルキル部分を含む。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１部分であり、炭素主鎖内に１又は複数の二重結合を含むことができる。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、ただ１つの二重結合、即ち、１つの不飽和部位を含む。他の実施形態では、Ｎ−アシル部分は、Ｎ−ペンテノイル部分である。不飽和Ｎ−アシル部分は、本明細書に記載されているか、又は不飽和部位の活性アルデヒドへの酸化、及びその後の担体タンパク質への結合に適していると、当技術分野で知られている任意の不飽和アルキル部分、例えば、不飽和アシル無水物（例えば、ペンテン酸無水物（pentenoic anhydride））又は不飽和ハロゲン化アシル（例えば、塩化ペンテノイル、塩化アクロロイル（acroloyl chloride））を含むことができる。
【００１９】
本発明の分子の酸化は、不飽和Ｎ−アシル部分の二重結合（即ち、不飽和アルキル部分の不飽和部位（複数も））の酸化に限定されることが好ましく、したがって、本明細書で定義され、又は当技術分野で知られているような穏やかな条件下で実施される。例えば、４〜９．５のｐＨ範囲の過ヨウ素酸塩を使用する酸化が、当技術分野で知られている。穏やかな酸化条件のために、アシル基に非常に近く位置する不飽和部位は、酸化せず、且つ／又は活性アルデヒド基を形成しないことによって、その後の担体タンパク質への結合が可能になる。したがって、本発明の方法における使用に関しては、不飽和アルキル基の不飽和部位（即ち、二重結合の位置）は、不飽和アルキル基の炭素１と２の間でも、炭素２と３の間でもない（例えば、当技術分野で認められ、本明細書で使用するアルキル基の番号付けについては図１を参照されたい）。ある特定の実施形態では、不飽和アルキル部分は、ただ１つの二重結合を含む。他の実施形態では、不飽和アルキル部分は、主炭素鎖の末端の２つの炭素の間に二重結合を含む。
【００２０】
本発明は、
ｉ）前記１又は複数のアミノ糖のＮ−アセチル基を脱アセチル化し、ii）得られるアミノ糖の１級アミノ基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル基を含むＮ−アシル基で置換し、iii）前記不飽和アルキル基を酸化することによって、主鎖の末端に活性アルデヒド基を有する、少なくとも３炭素のアルキル基を生成させることによって調製される、ａ）１又は複数のアミノ糖を含む少なくとも１つのオリゴ糖又は多糖と、ｂ）これに結合した担体タンパク質とを含む免疫原性複合糖質をさらに提供する。本発明の方法によれば、不飽和アルキル基の不飽和部位、即ち、二重結合は、主鎖の炭素１と２の間でも炭素２と３の間でもない（例えば、炭素の番号付けについては図１を参照されたい）。好適な実施形態では、不飽和アルキル鎖は、少なくとも５炭素長である。他の実施形態では、酸化前の不飽和部位又はアルキル鎖は、不飽和アルキル鎖の末端の２つの炭素の間にある。本発明の方法によれば、担体タンパク質は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載されている任意の方法によって、活性アルデヒド基を介して、少なくとも１つの多糖又はオリゴ糖に結合される。
【００２１】
本発明は、ａ）１又は複数のＮ−アセチル基を含む１又は複数のアミノ糖を含む、少なくとも１つのオリゴ糖又は多糖であって、前記１又は複数のＮ−アセチル基が、前記アルキル基主鎖の末端で活性アルデヒド基を含む少なくとも３炭素のアルキル基を含むＮ−アシル基で置換されているオリゴ糖又は多糖と、ｂ）これに結合した担体タンパク質とを含む免疫原性複合糖質も提供する。好適な実施形態では、活性アルデヒド基を含むアルキル鎖は、少なくとも４炭素長である。本発明の方法によれば、担体タンパク質は、当技術分野で既知の任意の方法、例えば還元的アミノ化、及び／又は本明細書に記載される任意の方法によって、活性アルデヒド基を介して少なくとも１つの多糖又はオリゴ糖に結合される。
【００２２】
本発明によれば、多糖又はオリゴ糖の１又は複数のアミノ糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基は、置換されることによって以下の（式Ｉ）の化合物を形成する：
【００２３】
【化１】
【００２４】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す）。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。特定の実施形態では、Ｒ１はＣ３又はＣ４であり、例えば、その結果それぞれ、Ｎ−ブテノイル基又はＮ−ペンテノイル基が形成される。他の実施形態では、Ｒ１は唯一の二重結合、即ち、不飽和部位を含み、この二重結合は、アルキル主鎖の末端の２つの炭素の間に位置する。
【００２５】
不飽和Ｎ−アシル部分は、活性アルデヒド基に対する不飽和部位の酸化、及びその後の担体タンパク質への結合を介した、オリゴ糖又は多糖を前記タンパク質と結合させる連結部分としての機能を果たす。アルキル部分の不飽和部位の酸化は、本明細書に記載されており、且つ／又は当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば過ヨウ素酸塩を用いて実施することができる。酸化は、多糖鎖を切断することができるので、本発明によって包含される酸化ステップは、穏やかな条件下でのみ、例えば、約４〜約９．５のｐＨ範囲で、低温（例えば、約４℃〜約２７℃）で実施される。穏やかな酸化的な条件のために、不飽和部位が効率的に酸化されるためには、不飽和アルキル部分の二重結合は、不飽和アルキル主鎖の炭素１と２の間、及び炭素２と３の間とすることはできない（例えば、炭素の番号付けについては図１を参照されたい）。Ｒ１が不飽和のＣ３部分である（式１においてＮ−ブテノイル基を形成する）、この実施形態による非限定例では、Ｎ−アシル基は、アルキル主鎖の炭素３と４の間に二重結合を含む。Ｒ１が３炭素を超える鎖を含む他の実施形態では、不飽和部位は、炭素４より大きい位置とすることができる。
【００２６】
本発明の生成物及び方法によれば、酸化及び結合の後、複合糖質のタンパク質とオリゴ糖又は多糖は、以下に示すような連結を通じて共有結合的に連結されている（四角に囲まれている；式II）：
【００２７】
【化２】
【００２８】
（式中、Ｒ２は、飽和したＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９又はＣ１０アルキル部分であり、ＮＨ（四角で囲まれている）は、タンパク質の１級ＮＨ２基、例えば、リシニル又はアルギニル残基の１つに属する）。式IIの［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。式IIのＲ２は、式ＩのＲ１に由来する。式ＩのＲ１（即ち、不飽和アルキル部分）は、当技術分野で知られおり、且つ／又は本明細書に記載されるような酸化及び結合の後、所望の連結部分Ｒ２又は式II（即ち、飽和アルキル部分）が生じるように選択される。
【００２９】
本発明の方法によれば、多糖又はオリゴ糖の１又は複数のアミノ糖のＮ−アセチルは、糖の１、２、３、４、又は５を含めた任意の位置でアミノ糖に連結することができる。アミノ糖の構造は、当技術分野で公知であり、したがって、前記連結の位置は、ごく普通に決定することができる。例えば、アミノ糖がＧｌｃＮＡｃである場合、糖のＮ−アセチル基は炭素２にあり、アミノ糖がシアル酸である場合、糖のＮ−アセチル基は炭素４にある。
【００３０】
特定の実施形態では、糖分子のＮ−アセチル基は、Ｎ−ペンテノイル基で置換され、このＮ−ペンテノイル基は、オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるため、例えば、還元的アミノ化による結合の連結部分としての機能を果たす。特定の実施形態では、酸化及び結合の後の連結基は、飽和したＣ４主鎖を有する飽和Ｎ−アシル基である。本発明の方法によれば、置換されるＮ−アセチル基は、それだけに限らないが、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びシアル酸を含めた任意のアミノ糖のＮ−アセチル基とすることができる。
【００３１】
本発明のある特定の実施形態では、Ｎ−アセチル基の置換は、アルカリを用いて実施される。
【００３２】
本発明は、免疫原性コンジュゲートワクチンにおける使用に適しており、Ｔ細胞非依存性免疫応答からＴ細胞依存性免疫応答に変換するように機能する、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の担体タンパク質の使用を包含する。ある特定の実施形態では、担体タンパク質は、細菌タンパク質又はその断片、例えば、細菌毒素若しくはトキソイド又はその断片である。本発明の方法に従って使用することができる担体タンパク質の非限定例として、破傷風毒素又はトキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌に由来する外膜タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌に由来するＰ６及びＰ４、ヘモフィルス・インフルエンザ菌Ｂ型に由来するタンパク質、モラクセラ・カタラーリスに由来するＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、並びに呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質及びＧタンパク質が挙げられる。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本発明の方法に従って使用されるオリゴ糖又は多糖は、細菌又はその抗原断片に由来する多糖である。そのような細菌として、それだけに限らないが、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、バチルス、コリネバクテリウム、リステリア、エリジペロスリックス、クロストリジウム、シゲラ、クレブシエラ、コレラ菌、ナイセリア、及びエシェリキア（Escherichia）が挙げられる。関係する実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、任意の莢膜細菌に由来する莢膜多糖は、例えば、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、II、III、Ｖ、VI、若しくはVIII型；Ａ群連鎖球菌；髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、Ｙ、若しくはＷ１３５型；肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）III、IV若しくはXIV型；又は大腸菌Ｋ１である。好適な実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、これが由来する細菌に対する免疫応答を誘導することができるように選択される。ある特定の実施形態では、オリゴ糖又は多糖は、天然に存在するオリゴ糖又は多糖ではなく、例えば、当技術分野で既知の任意の技法によって合成することができ、又は天然に存在する化合物に由来するが、修飾の結果得られるオリゴ糖又は多糖は、天然には見い出されない。例えば、多糖又はオリゴ糖は、修飾する結果、野生型の多糖又はオリゴ糖類縁体に対する抗原性を増大させる、例えば、免疫応答の増大を誘導することができる。本発明の方法によれば、有用な多糖は、免疫特異的応答を誘導することができる少なくとも１つの抗原エピトープを含む。そのような多糖又はオリゴ糖は、少なくとも７つの糖部分を含むことが好ましいが、２つという少ない糖部分でも活性を示すことができる。多糖又はオリゴ糖は、非分岐状又は分岐状とすることができ、約１０００〜数百万ダルトンの分子量を有することができる。ある特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の化学修飾を有する。本発明によって包含される化学修飾の非限定例には、多糖のカルボキシル化、スルホン化、硫酸化、及びリン酸化誘導体、これらの塩、並びにこれらの混合物が含まれる。
【００３４】
本発明は、対象において免疫応答を誘導するための治療上有効な濃度で１又は複数の免疫複合糖質（immuno-glycoconjugate）を含む組成物、特に医薬組成物の使用も包含する。免疫複合糖質のオリゴ糖又は多糖に対する免疫応答の誘導は、オリゴ糖又は多糖が由来する病原体（複数も）による感染症の治療及び／又は予防に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の複合糖質は、予防用ワクチン又は治療剤として使用することができる。ある特定の実施形態では、免疫複合糖質は、２以上の細菌の型又は系統に由来する、複数の多糖及び／又はオリゴ糖を含み、それによって１つを超える細菌の種／型又は系統に対する免疫応答を誘導する。他の実施形態では、本発明の免疫複合糖質の製造において使用されるオリゴ糖又は多糖は、細菌及び／又は他の病原体、例えば、原虫の複数の種／系統に由来する複数の抗原ドメインを含む結果、対象に投与すると多価免疫応答を生じるように合成される。
【００３５】
本発明は、ヒト又は動物のための免疫原性製剤、特に、本発明の１又は複数の免疫複合糖質を含む免疫原性組成物にも関する。ある特定の実施形態では、免疫原性製剤は、複数の免疫複合糖質及び／又は複数の担体タンパク質を含む。免疫複合糖質は、細菌の複数の型又は系統に由来する多糖若しくはオリゴ糖を含むように操作し、且つ／又はキメラの多糖若しくはオリゴ糖（即ち、細菌の複数の型及び／若しくは系統に由来するエピトープを含む多糖若しくはオリゴ糖）を含むように操作することができるので、本発明の免疫原性製剤は、複数の細菌型、１又は複数の系統変異体に対する予防又は療法のために操作することができる。それだけに限らないが、鼻腔内、イントラトラキアル（intratrachial）、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下の経路を含めた、当技術分野で公知及び通常の多くの方法を、本発明の免疫原性製剤を用いて対象を免疫するのに使用することができる。
【００３６】
３．１ 専門用語
本明細書で使用する場合、用語「約（about）」又は「約（approximately）」は、数値とともに使用されるとき、基準数値の１、５若しくは１０％以内、又は前記数値を測定及び／又は判定するのに使用される標準的な方法の一般的な実験誤差の範囲内の任意の数値を指す。
【００３７】
用語「担体」、「担体タンパク質」又は「担体ポリペプチド」は、多糖抗原が共有結合的に連結されているポリペプチド部分を指すのに互換的に使用される。担体タンパク質は、多くの場合免疫原性であり、したがって、ワクチン力価に寄与することもできる。担体タンパク質の連結により、一般に、結合された炭水化物分子の抗原性が増大する。担体タンパク質は、それに連結した多糖と同じ標的生物体に由来することができ、又は異なる生物体に由来することができる。例えば、担体タンパク質は、それだけに限らないが、細菌毒素又はトキソイドを含めた細菌タンパク質とすることができる。好適な実施形態では、担体タンパク質は、Ｔ細胞非依存性免疫応答をＴ細胞依存性免疫応答に変換するように機能するように選択される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、対象への療法（複数も）の投与の脈絡において、用語「組み合わせて」は、１つを超える療法（例えば、１つを超える予防剤及び／又は治療剤）の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用により、療法（例えば、予防剤及び／又は治療剤）が対象に投与される順序は制限されない。第１の療法（例えば、第１の予防剤又は治療剤）は、第２の療法（例えば、第２の予防剤又は治療剤）の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間前）、第２の療法と同時に、又は第２の療法に続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間）対象に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の免疫原性複合糖質は、１又は複数の追加の療法、例えば、感染症、例えば、細菌の１又は複数の種／系統を含む感染症によって生じる疾患の予防又は治療について当技術分野で知られているワクチンと組み合わせて使用することができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「管理する」、「管理すること」、及び「管理」は、対象が療法（例えば、予防剤又は治療剤）から得る有益な効果を指し、これは、疾患の治癒をもたらさない。ある特定の実施形態では、対象は、１又は複数の療法（例えば、本発明の組成物などの予防剤又は治療剤）を投与されることによって、感染症、又はそれに関連する病状若しくは症状を「管理し」、その結果疾患／障害の進行又は悪化を予防する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」及び「予防」は、療法（例えば、予防組成物又は治療組成物）の投与の結果としての、対象における疾患／障害（例えば、細菌による感染症）の発症、再発の予防、疾患／障害の１又は複数の症状の低減を指す。本明細書で使用する場合、「予防」は、ワクチンとしての本発明の免疫複合体の使用に関連した、細菌の１又は複数の型及び／又は系統による感染症の予防も包含する。
【００４１】
用語「多糖」及び「オリゴ糖」は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、２〜２，０００超の反復単位を有する糖類をはじめとする、複数の反復単位を含む糖類を指す、その最も広い意味において使用される。一般に、当技術分野で認められているように、及び本明細書で使用する場合、用語「多糖」は、約５０〜約２，０００以上の反復単位を有する糖類を指す。当技術分野で認められているように、及び本明細書で使用する場合、用語「オリゴ糖」は、約５〜約４０、４５又は５０の反復単位を有する糖類を指す。多糖の反復単位は、単一の単糖分子とすることができ、又は二糖分子とすることができる。ある特定の実施形態では、反復単位は、３個以上の単糖分子である。本発明の方法によれば、細菌の異なる型及び／又は系統に由来する多糖又はオリゴ糖の断片は、化学的に結合、又は人工的に合成することによって、断片が最初に得られ、且つ／又は同定された細菌の、複数の型及び／又は系統に由来する複数のエピトープを含む、単一の多糖鎖又はオリゴ糖鎖を形成することができ、したがって、本発明の多糖又はオリゴ糖の反復単位（複数も）の組成は、糖鎖全体にわたって一定である必要はない。本発明の方法によって包含される多糖又はオリゴ糖は、１又は複数のアミノ糖を含む。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「対象」又は「患者」は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「対象（subject）」及び「対象（subjects）」は、動物（例えば、哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス）並びに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）を含む哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト乳児、幼児、青年、女性、又は妊娠中の女性である。
【００４３】
用語「治療的免疫応答」は、本明細書で使用する場合、複合糖質に向けられている、標準的な技法によって測定した場合の、体液及び／又は細胞の免疫の増大を指す。限定するものではないが、複合糖質に向けられた体液免疫の誘導レベルは、好ましくは、対象に本発明の組成物を投与する前の、複合糖質に向けられた体液免疫レベルの少なくとも４倍、８倍、又は１０倍、好ましくは少なくとも１６倍である。免疫応答は、適当なインビトロ又はインビボアッセイの手段によって定性的に測定することもでき、対象における感染症又はその症状の進行の停止、又は緩解は、治療的免疫応答の誘導を示すとみなされる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」は、疾患／障害（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解において使用することができる、任意のプロトコル（複数も）、方法（複数も）、及び／又は薬剤（複数も）を指すことができる。ある特定の実施形態では、用語「療法（therapies）」及び「療法（therapy）」は、生物学的療法、支持療法、及び／又は当業者に知られている、疾患又はそれに関連する病状若しくは症状（複数も）、感染症又はそれに関連する病状若しくは症状の治療、管理、予防、又は寛解において有用な他の療法を指す。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「治療剤（therapeutic agent）」及び「治療剤（therapeutic agents）」は、疾患（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解において使用することができる任意の薬剤（複数も）を指す。疾患又はそれに関連する症状（例えば、細菌感染症又はそれに関連する病状若しくは症状）の予防、治療、管理、又は寛解のために有用であると知られている、又は使用されてきた、又は現在使用されている薬剤であることが好ましい。
【００４６】
本明細書で使用する場合、疾患に対する対象への療法の投与の脈絡における用語「治療する」、「治療」、「治療すること」は、前記疾患／障害（例えば、細菌性の障害）の症状の根絶、低減、又は寛解を指す。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】Ｎ−アシル化複合糖質の合成の一般的な方法の概略の流れ図であり、図中ｎ＝反復単位の数値であり、これは、オリゴ／多糖の種類に応じて変化し、１〜１，０００以上とすることができる。
【図２】多糖−タンパク質結合の一般的な方法、例えばＮ−ペンテノイル化（pentenoylation）を介した、Ａ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートの調製の概略の流れ図である。ｎ＝反復単位の数値であり、これは、多糖又はオリゴ糖の性質に依存し、１〜１，０００以上とすることができる。
【図３】天然及び修飾Ａ群連鎖球菌多糖の６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】多糖−タンパク質結合の一般的な方法、例えば、Ｎ−ペンテノイル化を介した髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲートの調製の概略の流れ図であり、図中ｎ＝反復単位の数値である。
【図５】修飾髄膜炎菌Ｂ多糖の６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】ＢａｌｂＣマウスにおける、Ａ群連鎖球菌多糖−破傷風トキソイドコンジュゲートを含むワクチン接種によって生成される多糖に対する免疫応答を示す図である。説明文：免疫前：コンジュゲートで免疫化する前のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧＡＳＰ−ＴＴ：従来の方法（天然多糖の還元、及び穏やかなＮａ−メタ過ヨウ素酸塩酸化による１多糖分子当たり唯一の活性部位の生成）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。Ｎ−ブト−ＧＡＳＰ−ＴＴ（１）：新規の方法（Ｎ−ペンテノイル化による１多糖分子当たり複数の活性部位の生成、及び天然多糖の酸化）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌−多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧｌｃＮＡｃ残基の約５〜１０％がペンテノイル化された。Ｎ−ブト−ＧＡＳＰ−ＴＴ（２）：新規の方法（Ｎ−ペンテノイル化による１多糖分子当たり複数の活性部位の生成、及び天然多糖の酸化）によって調製されたＡ群連鎖球菌多糖−タンパク質コンジュゲートで免疫化した後のＡ群連鎖球菌多糖に対する血清ＩｇＧ濃度。ＧｌｃＮＡｃ残基の約１５〜２０％がペンテノイル化された。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明は、一般に、（ｉ）不飽和微生物Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖；（ii）担体タンパク質に共有結合的に結合した不飽和Ｎ−アシル誘導体多糖又はオリゴ糖に由来する新規な免疫原性コンジュゲート；並びに（iii）本発明の分子及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性複合糖質組成物の作製方法を提供する。本発明は、ワクチンとしてのこれらの組成物の使用方法をさらに包含する。本明細書に開示されるように、本発明は、１又は複数のタンパク質、例えば、担体タンパク質への結合のための、１オリゴ糖又は１多糖当たりの複数の活性部位の生成を促進することができる方法を提供する。本発明は、複数の活性化部位を有するオリゴ糖又は多糖の形成方法も提供し、これは、１又は複数の適当な担体タンパク質と結合されるとき、当技術分野で以前に知られている製造方法と比較した場合、架橋複合糖質ワクチンを増強された効率で生成する。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、当技術分野で既知の同様のワクチンと比較して増強された免疫原性を示す複合糖質ワクチンも生成する。本明細書に提示される方法は、少なくとも１つのアミノ糖を含む任意の多糖にも適用可能であり、糖鎖中の２つの隣接する遊離ヒドロキシ基を必要とする、現存する過ヨウ素酸塩酸化法に対して明らかに有利である。
【００４９】
Ｎ−アセチル基を有する少なくとも１つのアミノ糖を含むオリゴ糖又は多糖（例えば、それだけに限らないが、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及び／又はシアル酸の１又は複数を含むもの）は、処理されて１又は複数のＮ−アセチル基が脱アセチル化されることによって、オリゴ糖又は多糖中に少なくとも１つの好ましくは複数の、１級アミノ基を含むアミノ糖（複数も）が生成される。次いで少なくとも１つの１級アミノ基（複数も）は、Ｎ−アシル部分で置換されることによって、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位が生成される。その後の酸化を可能にするために、Ｎ−アシル化は、少なくとも５炭素の不飽和脂肪族鎖を使用して実施される（例えば、ペンテノイル化）。長さが５炭素超の不飽和脂肪族鎖の使用も、本発明によって包含されており（例えば、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２、１３−若しくは１４−又はそれ以上の炭素の不飽和脂肪族鎖）、ただし不飽和部位は、前記部分の炭素１と２の間、又は炭素２と３ではない（図１を参照されたい、又は式Ｉによれば、アルデヒド基の炭素とＲ１のＣ１の間又はＲ１のＣ１とＣ２の間）。酸化は、多糖又はオリゴ糖鎖を切断することができるので、本発明によって包含される酸化方法は、不飽和脂肪族鎖の不飽和部位（複数も）のみを酸化するように選択される（本明細書に記載され、且つ／又は当技術分野で知られているように）。そのような酸化条件は、通常当技術分野で「温和な」と呼ばれ、日常の実験によって決定することができる。したがって、本発明の方法は、前記アルキル部分の不飽和部位（複数も）に活性アルデヒド（−ＣＨＯ）基を生成するために、穏やかな条件下で（例えば、強緩衝液中、約４℃〜約２７℃の温度範囲及び約４〜約９．５のｐＨ範囲で）、不飽和基を酸化する酸化剤の使用（例えば、Ｏ３（オゾン分解用）又はＨ２Ｏ２の使用）を包含する。ある特定の実施形態では、アルキル部分の不飽和部位は、アルキル主鎖の末端の２つの炭素の間にある。二重結合の酸化により、不飽和部位で主アルキル鎖が切断され、新しいアルキル鎖末端で活性アルデヒド基が生成される。例えば、不飽和脂肪族鎖が炭素Ｃ４とＣ５の間に１つの二重結合を有するＣ５である実施形態では、酸化によりＣ４にアルデヒドを有する４炭素の鎖が生じる。不飽和脂肪族鎖が１つを超える二重結合、即ち不飽和部位を有する実施形態では、酸化反応は、１つ又は両方の不飽和部位に影響する場合があるが、反応により主炭素鎖が切断されるので、アルデヒド基は、新しく形成される脂肪族鎖の末端に常にあることになる。したがって、不飽和基を含む主鎖が、１つを超える不飽和部位を有する場合、酸化反応により、異なる長さの不飽和又は飽和Ｎ−アシルが生じる場合があるが（それぞれ、１つ又はすべての不飽和部位が酸化されたかどうか、及び二重結合の位置に依存する）、それぞれの部分は、脂肪族の主鎖の末端に活性アルデヒド基を含む。
【００５０】
本発明の多糖又はオリゴ糖は、本明細書で記載され、且つ／又は当技術分野で既知の任意の方法（例えば、還元的アミノ化）によって担体タンパク質に結合されることによって、免疫原性複合糖質を生成する。一般的な方法の概略の流れ図を図１に示す。
【００５１】
したがって、本発明は、式Ｉの微生物不飽和Ｎ−アシル誘導体オリゴ糖又は多糖に関する：
【００５２】
【化３】
【００５３】
（式中、Ｒ１は、少なくとも１つの不飽和炭素を含む、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。本発明は、複数の不飽和炭素（即ち、複数の二重結合）を含むＲ１を包含するが、本明細書に提供される方法によれば、Ｒ１は、１つの不飽和炭素（即ち、１つの二重結合；この二重結合は、Ｒ１のＣ１とＣ２間にはない）を有することのみ必要である。本発明のある特定の実施形態では、式ＩのＲ１は、１つの二重結合を含む、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分である。本発明のさらなる実施形態では、式ＩのＲ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０又はＣ１１アルキル部分であり、二重結合の位置は、脂肪族鎖の末端の２つの炭素の間である。
【００５４】
特定の実施形態では、不飽和Ｎ−アシル部分は、酸化されてアルデヒド基になることによって（アルキル部分の主鎖の末端で）、化合物を担体タンパク質と結合させることにおけるリンカーとしての機能を果たす。次いで、Ｎ−アシル部分上のアルデヒド基は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の結合方法、例えば、還元的アミノ化によって担体タンパク質と連結することができる。
【００５５】
さらに別の実施形態では、アミノ（ＮＨ）基は、糖の１、２、３、４、又は５を含めた任意の位置で、オリゴ糖又は多糖の糖残基に連結される。アミノ糖の構造は、当技術分野で公知であり、したがって前記連結の位置はごく普通に決定することができる。例えば、アミノ糖がＧｌｃＮＡｃである場合、糖のＮ−アセチル基は炭素２にあり、アミノ糖がシアル酸である場合、糖のＮ−アセチル基は炭素４にある。
【００５６】
本発明で有用な式Ｉの修飾多糖、例えば、Ｎ−アシル誘導体多糖の非限定例は、以下の式IIIに示すような、少なくとも１つのＮ−ペンテノイル（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ−）基を含む、Ｎ−ペンテノイル化誘導体多糖である：
【００５７】
【化４】
【００５８】
（式中、Ｎ−ペンテノイル基は、コンジュゲートタンパク質に対するリンカーとしての機能を果たす）。
【００５９】
任意の結合様式を、修飾オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるのに使用することができる。活性アルデヒド基を形成するために末端の隣接するヒドロキシル基の存在に依存する一例示的方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４，３５６，１７０号明細書（’１７０特許）に記載されている。’１７０特許には、多糖中への末端アルデヒド基の導入、及び還元的アミノ化によるアルデヒド基のタンパク質アミノ基へのカップリングが記載されている。多糖とタンパク質は、それによって、式IIで以下に示すような基（四角で囲まれた）を通じて連結される：
【００６０】
【化５】
【００６１】
（式中、Ｒ２は、飽和したＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキル部分であり、四角で囲まれていないＮＨ（四角で囲まれた）は、タンパク質の１級ＮＨ２基（例えば、リシニル又はアルギニル残基）の１つに属する）。式IIの［sugar］は、多糖又はオリゴ糖の前記１又は複数のアミノ糖を表す。ある特定の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分である。他の実施形態では、前記１又は複数のアミノ糖は、多糖又はオリゴ糖の反復単位の成分ではない。
【００６２】
本発明の、得られるＮ−アシル化−多糖−タンパク質コンジュゲートは、マウスにおいてインビボで試験されており、従来技術において既知のＮ−プロピオニル化多糖（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，９０２，５８６号明細書に記載されているもの）と比較した場合、改善された免疫原性を有することが一般に示されている。したがって、本発明のワクチンは、Ｂ群髄膜炎菌又は大腸菌Ｋ１生物体によって引き起こされる髄膜炎に対して有用であることが予期される。特に興味深いのは、細菌感染症（例えば、細菌性髄膜炎）のリスクが最もある対象、例えば、免疫無防備状態の個体及び乳児を保護するためのワクチンである。
【００６３】
本発明の特定の限定されない実施形態では、免疫応答を最適化するために、２種以上のオリゴ糖若しくは多糖、及び／又は２以上の担体タンパク質を含めることが望ましい場合がある。そのような手法は、免疫応答の回避をもたらす突然変異の急速な発生を特徴とする感染症、例えば、原虫感染の予防又は治療において特に有用となり得る。さらに、本発明の免疫原性複合糖質は、２以上の免疫原性／抗原ドメイン及び／又は２以上のエピトープを含むことができる。例えば、本発明は、異なる抗原に特異的な少なくとも２つの異なる多糖又はオリゴ糖が、１つの担体分子に結合されており、且つ／又は異なる抗原に特異的な２つの異なる多糖又はオリゴ糖が合わさって、担体タンパク質に結合された１つの多糖又はオリゴ糖になっている多価コンジュゲートを包含する。本発明は、複数の多糖若しくはオリゴ糖、及び又は複数の担体タンパク質を含むコンジュゲートをさらに包含する。本発明の方法により、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり、少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位が生成されるので、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の部位で担体タンパク質に共有結合的に結合することができ、さらに、多糖又はオリゴ糖は、１又は複数の担体タンパク質に結合することができる。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、多糖分子及び担体タンパク質の格子である。
【００６４】
本発明の複合糖質組成物中に使用するための多糖又はオリゴ糖は、サイズを変更することができる。本明細書で定義するように、本発明で使用するためのオリゴ糖は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０の反復単位（例えば、糖残基）、好ましくは１０〜約５０の反復単位を含む。多糖は、本明細書で定義するように、５０を超える反復単位であり、約６００〜約２，０００の反復単位、又はそれ以上の大きさであってもよい。場合によっては、大きなコンストラクトが、免疫原性の増強のために望ましい。本発明の方法は、非常に大きな多糖の使用を提供するが、これは、多くの反応部位を１つの多糖中に導入することができるためである。
【００６５】
５．１ 多糖及びその単離
好適な実施形態において使用するのに適した多糖には、被包性細菌由来の多糖及びオリゴ糖が含まれる。多糖及びオリゴ糖は、任意の供給源由来とすることができ、例えば、これらは、天然に存在する細菌、遺伝子操作された細菌から得ることができ、又は合成的に作製することができる。多糖及びオリゴ糖は、活性化する前に１又は複数の処理ステップ、例えば、精製、機能付与、穏やかな酸化条件を使用する脱重合、脱アセチル化などにかけることができる。必要に応じて、修理後ステップも使用することができる。適当な多糖及びオリゴ糖を合成、調製、及び／又は精製するために、当技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。
【００６６】
本発明の方法に従って使用するための多糖及びオリゴ糖として、それだけに限らないが、例えば、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ及び３３Ｆの肺炎球菌多糖；血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、及びＹの髄膜炎菌多糖、ヘモフィルス・インフルエンザｂ型、多糖ポリリボシルリビトールホスフェート、血清型III及びＶのＢ群連鎖球菌多糖、並びにチフス菌（Salmonella typhi）Vi多糖が挙げられる。肺炎球菌及びＢ群連鎖球菌の血清型、並びに髄膜炎菌の血清型の他の多糖も本明細書で使用するのに適しており、他の一般にＴ非依存性の多糖及びオリゴ糖抗原、例えば、Ａ群連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌、緑膿菌、及び炭疽菌（Bacillus anthracis）に由来する多糖又はオリゴ糖も同様である。細菌性の多糖及びオリゴ糖は、特に好適であるが、グラム（−）細菌性のリポ多糖及びリポオリゴ糖、並びにその多糖及びオリゴ糖誘導体、並びにウイルス性の多糖及びオリゴ糖も使用することができる。
【００６７】
多糖は、当技術分野で既知の方法によって、細菌莢膜から単離される。例えば、１つのそのような方法では、Ｂ群髄膜炎菌（系統９８１Ｂ）などの細菌は、蒸留水１リットル当たり３０ｇの脱水Todd Hewitt Broth（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）を使用して、発酵槽中、３７℃で増殖される。発酵槽での増殖の前に、凍結乾燥した系統が、５％（ｖ／ｖ）のヒツジ血液寒天（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）プレート上で、３７℃で、ろうそく瓶中で最初に増殖される。次いで細菌は、エルレンマイヤーフラスコ中の１．０リットルのTodd Hewitt Broth（上記）に移され、これは、３７℃で、１９０ｒ．ｐ．ｍ．で７時間振盪される。次いで接種材料は、発酵槽に移される。発酵槽での増殖後（１６時間）、細菌は、０．７５％の最終濃度までホルマリンを添加することによって死滅される。タンパク質が、高温（５０〜６０℃）の代わりに、低温（４℃）の９０％のフェノールを用いて未精製の多糖の溶液を撹拌することによって抽出されることを除き、Bundle et al, J. Biol. Chem., 249, 4797-4801 (1974)に記載されているように、細菌は、連続的な遠心分離によって除去され、多糖は、上澄から単離され、本質的に精製される。後者のプロセスにより、高分子量形態の多糖、例えば、高分子量形態のＢ群髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）が生成されることが保証される。
【００６８】
他の特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖は、蒸留水中３７ｇ／リットルの濃度で、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）（Difco Laboratories社製、Detroit, Mich.）を含む発酵槽内で、３７℃で培養することによって、細菌、例えば、大腸菌（０１８：Ｋ１：Ｈ７）（ＮＲＣＣ４２８３）から単離することができる。試験用培養物（working culture）は、エルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌのＢＨＩ溶液（上記を参照されたい）中で原料及び初期培養物を再構成することによって、凍結乾燥原料から開始することができ、これは、３７℃で、２００ｒ．ｐ．ｍ．で７時間振盪される。次いで培養物は、１．５リットルのＢＨＩ（上記）に移され、上述した同じ条件下で７時間増殖される。次いで接種材料は、発酵槽に移される。これらの条件下で培養された細菌、例えば、大腸菌Ｋ１の莢膜多糖の単離及び精製は、当技術分野で知られ、且つ／又は本明細書に記載される任意の方法によるものとすることができる。
【００６９】
上述した単離及び精製手順は、利用することができる唯一のものではなく、他の公開された手順、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Watson et al, J. Immunol., 81, 331 (1958)によって、及び上述した米国特許第４，７２７，１３６号において記載されているものも利用可能であることが理解される。
【００７０】
５．２ オリゴ糖又は多糖中のＮ−アセチル基の置換：
天然のオリゴ糖又は多糖中のＮ−アセチル基は、置換することによって、分子のシアル酸残基中に反応性アミン基を提供することができる。置換は、任意の既知の方法によって、例えば、アルカリによって、例えば、塩基性水媒質中で、高温、例えば、約９０℃〜１１０℃で、及び約１３〜１４のｐＨで実施することができる。ある特定の実施形態では、置換は、１級アミノ基を形成するための、Ｎ−アセチル基の脱アセチル化を包含する。塩基性水媒質は、水性アルカリ金属水酸化物溶液、例えば、約２Ｍの濃度の水酸化ナトリウムを含むことができる。或いは、水溶液中のヒドラジンを使用することができる。本発明によって使用することができる塩基の非限定例は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＣＮ、Ｅｔ３Ｎ、ＮＨ３、Ｈ２Ｎ２Ｈ２、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔ又はＫＯｔＢｕである。塩基、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮａＨ、ＮａＯＭｅ又はＫＯｔＢｕなどは、０．５Ｎ〜５．０Ｎの範囲で最も有効に使用される。塩基、例えば、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３及びＫＣＮは、その溶解度が許容する高さの濃度で使用することができる。ＮＨ３又はＨ２Ｎ２Ｈ２などの塩基は、１００％を含めたほとんど任意の濃度で使用することができる。溶媒、例えば水、アルコール（好ましくはＣ１−Ｃ４）、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合物及び他の有機溶媒を使用することができる。水を含む塩基溶液が最も好適である。
【００７１】
特定の実施形態では、多糖又はオリゴ糖のＮ−アセチル基の置換について好適なｐＨ範囲は、約９〜約１４であり、最適ｐＨは約１２である。Ｎ−置換多糖はその後、当技術分野で既知の標準的な方法によって、膜又は透析を使用する超高純度化によって、残留反応物から精製される。Ｎ−アセチル基置換の程度は、少なくとも１つのＮ−アセチル基の置換から、オリゴ糖又は多糖のＮ−アセチル基の最大１００％の置換及び１００％の置換を含めて変化し得る。ある特定の実施形態では、Ｎ−アセチル基置換の程度は、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％である。天然のＮ−アセチル基の９０〜９９％が置換されることが好ましい。置換されたオリゴ糖又は多糖は、例えば、冷却、中和、精製、及び凍結乾燥によって回収される。Ｎ−アセチル置換の程度の分析及び置換された生成物の精製は、当技術分野で知られており、且つ／又は本明細書に記載される任意の方法によって実施することができる。例えば、オリゴ糖及び／又は多糖は、精製／回収のために、Spectra/Por（登録商標）膜MWCO:3,500を用いて、脱イオン水に対して透析することができる。Ｎ−脱アセチル化の程度は、当技術分野で公知の方法によって、５００ＭＨｚのＨ１−ＮＭＲによって分析することができる。
【００７２】
Ｎ−アセチル基置換手順の前に、天然のオリゴ糖又は多糖は、例えば、約１，０００〜約１，０００，０００ダルトンの範囲で、広範囲の平均分子量を有し、この平均分子量は、Ｎ−アセチル基置換反応によって実質的に低減される。例えば、Ｂ群髄膜炎菌多糖（ＧＢＭＰ）は、約５００，０００〜約８００，０００ダルトンの平均分子量を有し、本発明の方法によるＮ−アセチル基置換後に、約３，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する、Ｎ−アセチル置換多糖の断片が通常生成される。多糖の全長又は断片は、本発明の方法によって使用される。例えば、全長の多糖又はオリゴ糖は、断片化することによって、コンジュゲートワクチンにおいて使用するのにより適したサイズを生成することができる。例えば、１０，０００〜４０，０００ダルトン、好ましくは約１０，０００〜約１５，０００ダルトンの平均分子量のＮ−アシル化材料が使用される。所望のサイズの断片は、例えば、遠心分離法又は濾過法を含めた、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。ある特定の実施形態では、所望の分子量範囲のサイズで分類された分画又は分別は、分留カラムを使用することによって、出発物質、例えば、Ｎ−アシル化ＧＢＭＰ物質が導入されたサイジングカラム（例えば、分子篩）の溶出液の分画を収集することによって得ることができる。ある特定の実施形態では、より高い平均分子量、例えば、３０，０００〜４０，０００ダルトンの範囲のＮ−アシル化物質は、本発明の方法において使用するために収集される。
【００７３】
次いで、Ｎ−アセチル基置換多糖の断片又は多糖の全長は、Ｎ−アシル化されることによって、対応するＮ−アシル化生成物が生成される。Ｎ−アシル化は、穏やかな塩基性条件下で水性緩衝媒質中にＮ−アセチル基置換多糖を溶解させることによって実施することができる。そのような穏やかな緩衝水溶液は、約７．５〜９．０のｐＨを有することが好ましい。次いでアシル反応物は、糖含有溶液に添加され、反応が完了するまで１０℃未満に冷却される。アシル反応物は、結合完了時の所望のアルキル基、例えば、式IIの所望のＲ２に基づいて選択される。アシル反応物の不飽和部位は、酸化されて活性アルデヒドになり、したがって、Ｒ２の長さを決定する。例えば、アシル反応物は、不飽和アシル無水物（例えば、アセチル無水物若しくはプロピオニル無水物）又は不飽和ハロゲン化アシル（例えば、塩化ペンテノイル）とすることができる。この反応物は、溶解度を増大させるために、場合によりアルコールと混合される。必要に応じて、反応媒質は、当技術分野で既知の任意の方法によって精製することができる。利用することができる精製方法の非限定例は、透析とその後の凍結乾燥によるＮ−アシル化生成物の回収である。反応は、約１０〜２０時間以内に実質的に完了する。次いでＮ−アセチル基のＮ−アシル化の程度は、当技術分野で既知の分析方法、例えば、高分解能、例えば、５００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲによって求められ、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約１００％である。前記Ｎ−アシル化反応では、断片の顕著な分子量低減は全く生じない。
【００７４】
５．３ 担体タンパク質
多糖が結合されているタンパク質（複数も）は、ワクチンの糖成分に対するＴ細胞非依存性免疫応答を、Ｔ細胞依存性の免疫応答に変換するのに適するように選択される。本発明のある特定の実施形態では、担体タンパク質は、天然の毒素又は解毒された毒素（即ち、トキソイド）とすることができる。また、タンパク質毒素の無毒性の突然変異形態も使用することができる。そのような突然変異は、天然の毒素のエピトープを保持していることが好ましい。そのような突然変異した毒素は「交差反応物質」、即ちＣＲＭと呼ばれる。ＣＲＭ１９７は、活性ジフテリア毒素から１つのアミノ酸変化を有し、活性毒素から免疫学的に区別不能である。ＣＲＭ１９７は、ヘモフィルス・インフルエンザ菌コンジュゲートワクチンの成分として、乳児において広く使用されている。
【００７５】
活性化された多糖又はオリゴ糖は、タンパク質に結合されることによってコンジュゲートワクチンを生じる。適当なタンパク質は、対象に投与するために、化学的又は遺伝学的手段によって安全にされた、免疫学的に有効な担体である細菌毒素が含まれる。例として、不活化された細菌毒素、例えば、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌由来の外毒素Ａなどが挙げられる。細菌性外膜タンパク質、例えば外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺剥離、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、又は肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１なども使用することができる。他のタンパク質、例えば炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びツベルクリンの精製タンパク誘導体（ＰＰＤ）なども使用することができる。タンパク質は、無毒性であり、非反応原性であり、好適な実施形態の結合方法に適用できる、十分な量及び純度で得られるタンパク質が好ましい。例えば、ジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Corynebacteria diphtheriae）の培養物から精製し、ホルムアルデヒトを使用して化学的に解毒することによって、適当なタンパク質を得ることができる。
【００７６】
担体タンパク質の非限定例として、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、Ｃα、Ｃβタンパク質（例えば、非ＩｇＡ結合Ｃ−βタンパク質を含めた、Ｂ群連鎖球菌由来）、ジフテリアトキソイド、α溶血素、又はPanton-Valentineロイコシジン（ＰＶＬ）、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、例えば、髄膜炎菌外膜タンパク質、高分子量タンパク質、分類不可能なヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素／トキソイドＡ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、呼吸器合胞体ウイルスＦ、Ｇタンパク質、コレラ毒素サブユニットＢ、ニューモリソイド（pneumolysoid）、百日咳トキソイド、リシン又はシステイン残基を含有する合成タンパク質などが挙げられる。担体タンパク質は、天然タンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、解毒されたタンパク質又は組換えタンパク質とすることができる。タンパク質成分に関して、本発明によって調製されるコンジュゲート分子は、単量体、二量体、三量体及びより高度に架橋された分子とすることができる。
【００７７】
本発明は、担体タンパク質がＮ−アセチル含有多糖又はオリゴ糖に連結されているコンジュゲート分子の作製を可能にする。多糖又はオリゴ糖のサイズは、大きく変化し得る。１又は多数の多糖又はオリゴ糖は、１又は多数のタンパク質と架橋することができる。本発明のコンジュゲートは、格子構造であることが好ましい。
【００７８】
５．４ コンジュゲート
活性化された多糖を結合させるための多くの方法、即ち、少なくとも１つの部分を、タンパク質に供給結合的に結合することができるようにすることが必要である方法は、当技術分野で知られており、本明細書で使用するのに適している。例えば、Jenningsに発行された米国特許第４，３５６，１７０号明細書には、シアノボロヒドリドを使用する還元的アミノ化による、活性アルデヒド基を含む多糖の担体タンパク質への結合が記載されている。
【００７９】
本発明の方法は、１多糖分子又は１オリゴ糖分子当たり、少なくとも１つの、好ましくは複数の活性部位（即ち、活性アルデヒド基）の生成を可能にする。活性化された多糖分子は、１又は複数の担体タンパク質と反応し、このタンパク質への１つを超える連結を形成することができる。したがって、ある特定の実施形態では、コンジュゲート生成物は、様々な架橋されたマトリックス型又は格子構造の混合物とすることができる。
【００８０】
結合後に、コンジュゲートは、任意の適当な方法によって精製することができる。精製は、未反応の多糖、タンパク質、又は小分子の反応副生物を除去するために用いられる。精製方法には、当技術分野で知られているように、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、疎水性相互作用クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画などが含まれる。ある特定の実施形態では、精製はまったく必要でない場合があり、又は軽微な程度の精製のみが望ましい場合がある。コンジュゲートは、濃縮、又は希釈、又は処理して、所望の通りに、医薬組成物において使用するのに適した任意の形態にすることができる。
【００８１】
５．５ 医薬組成物
組成物（例えば、医薬組成物）は、混合物として、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤、及び活性成分として、本明細書に記載されているような、生物活性剤（例えば、複合糖質、オリゴ糖、多糖、ポリペプチド、又はペプチド）の１又は複数を含むことが好ましい。活性成分として生物活性剤を含む医薬組成物の調製は、当技術分野でよく理解されている。一般に、そのような組成物は、液体溶液又は懸濁液として調製されるが、投与における溶液又は懸濁液、投与前の液体にとって適した固体形態も調製することができる。配合物は、乳化することもできる。活性治療成分は、薬学的に許容され、活性成分、例えば、浸透エンハンサーと適合する賦形剤と混合されることが多い。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せである。本発明の好適な担体、賦形剤、及び希釈剤は、生理食塩水（即ち、０．９％のＮａＣｌ）を含む。さらに、必要に応じて、組成物は、軽微な量の補助物質例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ−緩衝剤などを含むことができ、これは、活性成分の有効性を増強する。
【００８２】
本発明の組成物には、医薬組成物の製造に有用なバルク薬剤組成物（例えば、純粋でない又は滅菌していない組成物）、及び単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物（即ち、対象又は患者への投与に適した組成物）が含まれる。そのような組成物は、本明細書で開示される予防有効量若しくは治療有効量の予防剤並びに／若しくは治療剤又は、これらの薬剤及び薬学的に許容される担体の組合せを含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、免疫原性量の少なくとも１つの免疫原性複合糖質、及び場合により、薬学的に許容される担体を含む。他の実施形態では、本発明の組成物は、予防有効量又は治療有効量の少なくとも１つの免疫原性複合糖質、及び場合により、薬学的に許容される担体を含む。
【００８３】
特定の実施形態では、用語「薬学的に許容される」は、生理的に適合性であることを意味する。好ましくは、薬学的に許容されるは、動物、より詳細にはヒトにおいて使用するために、連邦又は州政府の管理機関によって認可されているか、米国薬局方又は他の一般に認知された薬局方において列挙されていることを意味する。用語「担体」は、希釈剤、賦形剤、浸透エンハンサー（上述したような当技術分野における）、又は一緒に治療剤が投与される媒体を指す。そのような医薬担体として、それだけに限らないが、滅菌液体、例えば、水、及び石油、動物、植物又は合成起源のものを含めた油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。一般的な適当な薬学的賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、軽微な量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放製剤などの形態をとることができる。
【００８４】
上記に示した免疫原性複合糖質を含む本発明の医薬組成物は、本明細書では「ワクチン」と呼ばれる。用語ワクチンは、本発明の組成物が、予防的な又は治療的免疫応答を誘導するのに使用することができることを示すのに使用される。本発明のワクチンは、１つの抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質、又は複数の抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質を含むことができる。さらに、ワクチンは、１つ若しくは複数の抗原ドメイン若しくはエピトープを有する複合糖質の混合物、又は前述の任意の組合せを含むことができる。本発明のコンジュゲートワクチンを含む医薬組成物は、弱免疫原性抗原（例えば、細菌性多糖又はオリゴ糖）の免疫原性の増強、使用される抗原の量の潜在的な低減、頻度の少ないブースター免疫化、効力の改善、免疫の選択的刺激又は免疫応答の潜在的な標的化を含めて、従来のワクチンに対して様々な利点を提供することができる。
【００８５】
本発明による１又は複数の免疫原性複合糖質を含むワクチン組成物は、皮膚、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、非経口的、肺内（intrapulmonarily）、膣内、直腸内、経鼻的、経口的又は局所的に投与することができる。ワクチン組成物は、注射、粒子ボンバードメントによって、経口的に、又はエアロゾルによって送達することができる。
【００８６】
本発明によるワクチン組成物は、薬学的に許容される担体などの様々な追加の物質をさらに含むことができる。適当な担体には、任意の標準的な薬学的に許容された担体、例えば、リン酸緩衝食塩溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水エマルジョン又はトリグリセリドエマルジョンなど、様々な種類の湿潤剤、錠剤、コーティングされた錠剤及びカプセルが含まれる。化合物の静脈内及び腹腔内投与において有用な許容されるトリグリセリドエマルジョンの例は、Intralipid.RTM.として商業的に知られているトリグリセリドエマルジョンである。一般に、そのような担体は、賦形剤、例えば、デンプン、ミルク、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸、タルク、植物性脂肪若しくは油、ゴム、グリコール、又は他の既知の賦形剤などを含む。そのような担体は、香味用添加物及び着色添加物、又は他の成分も含むことができる。
【００８７】
本発明のワクチン組成物は、適当な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、若しくは硫酸アルミニウム）及び／又は担体も含むことができる。そのような組成物は、液体又は凍結乾燥した、若しくは他の方法で乾燥した製剤の形態とすることができ、様々な緩衝液内容物（例えば、トリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防止するための、アルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は張性調節剤（例えば、ラクトース、マンニトール、ソルビトール）、タンパク質へのポリエチレングリコールなどのポリマーの共有結合性結合、金属イオンとの錯体形成、或いはポリマー化合物、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどの微粒子配合物中若しくは配合物上、又はリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層ベシクル、赤血球ゴースト、若しくはスフェロプラスト上への物質の取り込みを含むことができる。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響する。組成物の選択は、ワクチンの物理的及び化学的性質に依存する。例えば、膜結合形態の多糖及び／又は担体タンパク質に由来する生成物は、界面活性剤を含む製剤を必要とする場合がある。制御放出又は徐放組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）中の製剤を含む。本発明の組成物の他の実施形態は、筋肉内、非経口、肺、経鼻、及び経口を含めた様々な投与経路ために、微粒子形態、保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤又は浸透エンハンサーを組み入れる。
【００８８】
本発明の組成物は、中性又は塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩として、それだけに限らないが、陰イオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどで形成されるもの、及び陽イオン、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどで形成されるものが挙げられる。
【００８９】
本発明の組成物、例えば、ワクチンは、組成物の免疫原性有効性を増強するための１又は複数のアジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、多糖ベースのワクチンとともに使用するのに適していることが当技術分野で既知の任意のアジュバントを用いることができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７７３，００７号明細書を参照されたい）。適当なアジュバントとして、それだけに限らないが、水中油型エマルジョン製剤（他の特定の免疫賦活剤、例えばムラミルペプチド又は細菌性細胞壁成分の有無にかかわらず）、例えば、（ａ）５％のスクアレン、０．５％のTween 80、及び０．５％のSpan 85（場合によりMTP-PEを含む）を含み、微小流動化剤（microfluidizer）を使用してサブミクロン粒子に製剤化された、ＭＦ５９．Ｍ．（国際公開第９０／１４８３７号パンフレット；Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995）（ｂ）１０％のスクアラン、０．４％のTween 80、５％のプルロニックブロックポリマーL121、及びthr-MDPを含み、微小流動化してサブミクロンエマルジョンにされたか、より大きな粒径エマルジョンを生成するためにボルテックスされたＳＡＦ、及び（ｃ）２％のスクアレン、０．２％のTween 80、及び１又は複数の細菌性細胞壁成分、例えば、モノホスホリリピド（monophosphorylipid）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Detox.TM.）などを含むRIBI.TM.アジュバント系（ＲＡＳ）、（Ribi Immunochem社製、Hamilton, Mont.）などが挙げられる。他のアジュバントとして、サポニンアジュバント（QS21若しくはStimulon.TM.（Cambridge Bioscience社製、Worcester, Mass.）又はそれから生成される粒子、例えば追加の界面活性剤を欠いていてもよいＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）など（例えば、国際公開第００／０７６２１号パンフレット）；完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全なフロイントアジュバント（ＩＰＡ）；サイトカイン（インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開第９９／４４６３６号パンフレット）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）又は３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、肺炎球菌糖とともに使用される場合、場合によりミョウバンの実質的な非存在下での、英国特許２２２０２２１号明細書、欧州特許出願公開第０６８９４５４号明細書、例えば、国際公開第００／５６３５８号パンフレット）；３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１及び／又は水中油型エマルジョン（例えば、欧州特許出願公開第０８３５３１８号明細書、欧州特許出願公開第０７３５８９８号明細書、欧州特許出願公開第０７６１２３１号明細書）との組合せ；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3:15-24；Roman et al., Nat. Med, 1997, 3, 849-854；Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837；Davis et al, J. Immunol, 1998, 160, 810-876；Chu et al., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631；Lipford et al, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344；Moldoveami et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224、Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549；Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883；Balks et al, J. Immunol, 1996, 157, 1840-1845；Cowdery et al, J. lmmunol, 1996, 156, 4570-4575；Halpern et al, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78；Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873；Stacey et al, J. Immunol., 1996, 157,2116-2122；Messina et al, J. Immunol, 1991, 147, 1759-1764；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157,4918-4925；Yi et al, J. Immunol, 1996, 157, 5394-5402；Yi et al, J. Immunol, 1998, 160, 4755-4761；及びYi et al, J. lmmunol, 1998, 160, 5898-5906；国際特許出願、国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、国際公開第９８／１６２４７号パンフレット、国際公開第９８／１８８１０号パンフレット、国際公開第９８／４０１００号パンフレット、国際公開第９８／５５４９５号パンフレット、国際公開第９８／３７９１９号パンフレット及び国際公開第９８／５２５８１号パンフレット、即ち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、シトシンはメチル化されていない）；ポリオキシエチレンエーテル若しくはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開第９９／５２５４９号パンフレット）；オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１２０７号パンフレット）、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル、若しくはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたエステル界面活性剤（国際公開第０１／２１１５２号パンフレット）；サポニン及び免疫促進オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（国際公開第００／６２８００号パンフレット）；免疫賦活剤及び金属塩の粒子（例えば、国際公開第００／２３１０５号パンフレット）；サポニン及び水中油型エマルジョン、例えば、国際公開第９９／１１２４１号パンフレット；サポニン（例えば、QS21）＋3dMPL＋IM2（場合により＋ステロール）、例えば国際公開第９８／５７６５９号パンフレット；並びに／又は組成物の効力を増強するために免疫賦活剤として作用する他の物質が挙げられる。
【００９０】
医薬組成物は、生理的条件に近づけることが必要な場合、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含むことができる。これらの製剤の抗原の濃度は、広く変更することができ（例えば、約０．１重量％未満から、通常約２重量％又は少なくとも約２重量％、２０重量％〜５０重量％又はそれ以上の程度まで）、選択される特定の投与様式及び患者の必要性に従って、流体の体積、粘度、体重などに主に基づいて選択される。得られる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション剤、軟膏、又はエアロゾルの形態とすることができる。
【００９１】
好適な実施形態によって調製されるコンジュゲートは、免疫学的に有効用量で、適当な形態で対象に投与されることによって、感染症を治療及び／又は予防する。用語「対象」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物などの動物を指す。例えば、企図される哺乳動物には、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどが含まれる。用語「対象」、「患者」、及び「宿主」は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、コンジュゲートワクチンの「免疫学的に有効な」用量は、免疫応答を誘導するのに適した用量である。特定の投与量は、治療される対象の年齢、体重及び医学的状態並びに投与方法に依存する。適当な用量は、当業者によって容易に決定することができる。
【００９２】
特定の疾患の治療及び／又は予防のための免疫化プロトコルを実行することにおいて、治療有効量のコンジュゲートが対象に投与される。本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、患者にとって意味のある利益、例えば、関連した医学的状態（疾患、感染症など）の免疫応答の増強、治療、治癒、予防若しくは寛解又はそのような状態の治療、治癒、予防若しくは寛解の速度の増加などを示すのに十分な治療剤（例えば、コンジュゲート）又は他の活性成分の総量を意味する。「有効量」が、単独で投与される個々の治療剤に適用されるとき、この用語は、その治療剤単独を指す。組合せに適用されるとき、この用語は、組合せ、連続的又は同時のいずれで投与されても、治療効果をもたらす成分の合わせた量を指す。本明細書で使用する場合、治療剤の「有効量を投与すること」という語句は、対象が、疾患、感染症、又は障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において、改善、好ましくは持続性の改善を誘導するのに十分な量及び時間、前記治療剤（複数も）を用いて治療されることを意味する。
【００９３】
本発明のコンジュゲートワクチンは、単一用量として、又は１若しくは複数の追加免疫を含む連続で投与することができる。例えば、乳児又は小児に、年少期に単一用量を投与し、次いで最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年後以上に追加免疫用量を投与することができる。追加免疫用量により、初回抗原刺激を受けたＢ細胞由来の抗体、即ち、既往応答が生じる。コンジュゲートワクチンは、乳児又は小児において、高い一次の機能抗体応答を誘導し、追加免疫投与後に既往応答を誘導することができ、コンジュゲートワクチンによって誘導される防御免疫反応が長続きすることを実証する。
【００９４】
本発明のワクチンは、製剤化して、例えば、経口（oral）、経鼻、肛門、直腸、頬側、膣、経口（peroral）、胃内、粘膜、舌下、肺胞、歯肉、嗅覚、又は呼吸器粘膜の投与用の液体製剤にすることができる。そのような投与に適した形態には、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤が含まれる。コンジュゲートワクチンは、非経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内又は静脈内の投与、注射可能投与、インプラントからの徐放、点眼剤による投与用にも製剤化することができる。そのような投与に適した形態には、滅菌した懸濁液及びエマルジョンが含まれる。そのようなコンジュゲートワクチンは、適当な担体、希釈剤、又は賦形剤、例えば滅菌した水、生理食塩水、グルコースなどとの混合物とすることができる。コンジュゲートワクチンは、凍結乾燥することもできる。コンジュゲートワクチンは、望まれる投与経路及び製剤に応じて、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加剤又は粘性増強添加剤、保存剤、香味剤、染料などを含むことができる。標準的な教科書、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれている、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins; 20th edition (Jun. 1, 2003)並びに"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co.;18th and 19th editions （それぞれ、December 1985、及びJune 1990）を、過度の実験を伴うことなく、適当な製剤を調製するために調べることができる。そのような製剤は、錯化剤、金属イオン、ポリマー化合物、例えばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなど、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多層ベシクル、赤血球ゴースト、又はスフェロブラストを含むことができる。リポソーム製剤用に適した脂質として、制限なく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。そのような追加成分の存在は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、インビボクリアランス速度に影響することができ、したがって、意図された用途によって選択され、その結果、担体の特徴は、選択された投与経路に適応される。
【００９５】
本発明の医薬組成物は、レシピエントの血液又は他の体液と等張性であることが好ましい。組成物の等張性は、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール又は他の無機若しくは有機溶質を使用して得ることができる。塩化ナトリウムは、特に好適である。酢酸及び塩、クエン酸及び塩、ホウ酸及び塩、並びにリン酸及び塩などの緩衝剤を使用することができる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース。デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油が含まれる。静脈内媒体には、流体及び栄養分補給物、電解液補給物（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。
【００９６】
本発明の医薬組成物及び／又はワクチンは、疾患又は障害（例えば、細菌感染症）を罹患するリスクのある対象に投与することによって、疾患及び／又はそれに関連する症状若しくは合併症の発症を予防又は少なくとも部分的に停止することができる。治療用途に有効な量は、例えば、抗原組成物、投与様式、患者の体重及び健康の一般的な状態、並びに処方医師の判断に依存する。単一又は複数の用量の抗原組成物を、患者によって必要とされ、耐容性が示される投与量及び頻度、並びに投与経路に応じて投与することができる。
【００９７】
５．５．１ 免疫化レジメン
本発明の医薬組成物及び／又はワクチンは、検出可能な宿主の自己抗体をわずかしか、又はまったく生成することなく、選択的な抗多糖又は抗オリゴ糖抗体を生成する様式で宿主に投与される。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるワクチン組成物は、連続的に投与される。最初に、免疫原性的に（immunogenically）有効な用量の本発明のワクチンが対象に投与される。この第１の用量は、一般に、免疫応答（例えば、活性化Ｔ細胞）を誘導するのに有効な量で投与される。初回免疫化のための量は、一般に、７０キログラムの患者当たり約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇ、より一般には、７０キログラムの患者当たり約０．００１ｍｇ〜約０．２ｍｇ、通常、７０キログラムの患者当たり約０．００５ｍｇ〜約０．０１５ｍｇの範囲である。特に抗原が、体腔又は器官の管腔中など、血流中に投与されない場合、患者１人当たり、１日あたり、０．００１〜最大約１０ｍｇの投与量を使用することができる。実質的により高い投与量（例えば、１０〜１００ｍｇ又はそれ以上）が、経口、経鼻、又は局所投与において可能である。
【００９９】
第１のワクチン投与量を投与した後、治療上有効な第２の用量の本発明のワクチンが、対象が、第１の用量への暴露によって免疫学的に初回抗原刺激を受けた後に対象に投与される。患者の応答及び状態に応じて、追加免疫を、最初に免疫化して数日、数週間、又は数カ月後に投与することができる。
【０１００】
第１のワクチン投与に対する免疫応答の存在は、既知の方法によって判定することができる（例えば、最初の免疫化の前後に個体から血清を得、個体の免疫状態の変化を示し（例えば、免疫沈降法アッセイ、若しくはＥＬＩＳＡ、若しくは殺菌アッセイ、若しくはウエスタンブロット、若しくはフローサイトメトリーアッセイなど）、且つ／又は第２の注射に対する免疫応答の規模が、第２の注射に使用した物質の組成物で最初に免疫化された対照動物の免疫応答の規模より高いことを示すことによって（例えば、免疫学的なプライミング））。第１のワクチン投与に対する免疫性のプライミング及び／又は免疫応答の存在は、以前の経験に基づいて、免疫応答及び／又はプライミングを起こさせるのに十分な時間である、第１の免疫化後の期間、例えば、２、４、６、１０又は１４週間待つことによって仮定することもできる。第２の免疫化の追加免疫投与量は、免疫原の性質及び免疫化の経路に応じて、一般に、約０．００１ｍｇ〜約１．０ｍｇの抗原である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、個体が、初回抗原刺激を受け、且つ／又は第２のワクチン組成物に対する免疫応答を開始した後、治療有効用量の第３のワクチン組成物が対象に投与される。第３の追加免疫は、対象の応答及び状態に応じて、第２の免疫化から数日、数週間、又は数カ月後に投与することができる。
【０１０２】
本発明は、同じ又は異なるワクチン製剤を使用した、第４、第５、第６又はそれ以上の追加免疫の使用をさらに企図する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、抗原組成物は、免疫複合体の多糖又はオリゴ糖の細菌源に対して免疫学的に未処置の哺乳動物対象（例えば、ヒト）に投与される。特定の実施形態では、哺乳動物は、約５歳以下、好ましくは約２歳以下のヒト小児であり、抗原組成物は、以下の時間の任意の１又は複数に投与される：生後２週間、１カ月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１カ月、又は１年若しくは１５、１８、若しくは２１カ月、又は２、３、４、若しくは５歳。
【０１０４】
好適な実施形態では、任意の哺乳動物への投与は、疾患症状の最初の徴候の前、又は感染症若しくは疾患への予想される若しくは実際の暴露（例えば、ナイセリア若しくは大腸菌Ｋ１による暴露又は感染症による）の最初の徴候時に開始される。
【０１０５】
薬剤組成物又はワクチン組成物は、投与製剤と適合性の様式で、及び治療有効量で投与することができる。投与される量は、治療される対象、対象の免疫系の、活性成分を利用する能力、及び必要とされる調節の程度に依存する。投与されるのに必要な正確な量は、専門家の判断に依存し、それぞれの個体に特定的である。しかし、ヒト乳児については、本発明の医薬組成物内の免疫原性複合糖質の、治療上の有効用量は、体重１ｋｇ当たり、約５〜約７．５μｇ、約５〜約１０μｇ、約５〜約１２．５μｇ、約５〜約１５μｇ、約５〜約１７．５μｇ、約５〜約２０μｇ、約５〜約２５μｇ、約５〜約３０μｇ、約５〜約３５μｇ、約５〜約４０μｇ、約５〜約４５μｇ、若しくは約５〜約５０μｇを含み、及び／又は約１〜約１．５μｇ、約１〜約２μｇ、約１〜約２．５μｇ、約１〜約３μｇ、約１〜約３．５μｇ、約１〜約４μｇ、約１〜約５μｇ、約１〜約６μｇ、約１〜約７μｇ、約１〜約８μｇ、約１〜約９μｇ、若しくは約１〜約１０μｇの範囲で含む。
【０１０６】
本発明の薬剤組成物又はワクチン組成物は、ヒト対象を意図していても、非ヒト対象を意図していても、現在使用されている、又は開発中の様々なワクチンと組み合わせて投与することができる。ヒト対象用、かつ感染症に対するワクチンの例として、ジフテリア及び破傷風トキソイド混合ワクチン；百日咳全細胞ワクチン；不活化されたインフルエンザワクチン；２３価肺炎球菌ワクチン；麻疹生ワクチン；流行性耳下腺炎生ワクチン；風疹生ワクチン；カルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）結核ワクチン；Ａ型肝炎ワクチン；Ｂ型肝炎ワクチン；Ｃ型肝炎ワクチン；狂犬病ワクチン（例えば、ヒト二倍体細胞ワクチン）；不活化されたポリオワクチン；髄膜炎菌多糖ワクチン；四価髄膜炎菌ワクチン；黄熱病生ワクチン；腸チフス死菌全細胞ワクチン；コレラワクチン；Ｂ型日本脳炎死滅ウイルスワクチン；アデノウイルスワクチン；サイトメガロウイルスワクチン；ロタウイルスワクチン；水痘ワクチン；炭疽ワクチン；天然痘ワクチン；並びに他の市販ワクチン及び実験的ワクチンが挙げられる。
【０１０７】
５．６ 治療剤有用性の特徴づけ及び実証
いくつかの態様の本発明の医薬組成物は、ヒトに使用する前に、所望の治療活性について、インビトロで、例えば、細胞培養系において、次いでインビボで、例えば、げっ歯類動物モデル系などの動物モデル生物体において試験されることが好ましい。特定のワクチン組成物に対する治療的免疫応答を生じる可能性を評価するのに使用することができるアッセイは、当技術分野で公知である。
【０１０８】
予防剤及び／又は治療剤の組合せは、ヒトにおいて使用する前に適当な動物モデル系において試験することができる。そのような動物モデル系には、それだけに限らないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが含まれる。当技術分野で公知の任意の動物系を使用することができる。本発明の特定の実施形態では、予防剤及び／又は治療剤の組合せは、マウスモデル系において試験される。予防剤及び／又は治療剤は、繰り返して投与することができる。予防剤及び／又は治療剤を投与する時間的な投与法、及びそのような薬剤が別々に又は混合物として投与されるかどうかなどの手順のいくつかの側面は、変更することができる。
【０１０９】
５．７ 毒性研究
本発明の組成物の毒性及び／又は効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を求めるために、細胞培養又は実験動物において、標準的な薬学の手順によって求めることができる。毒性作用と治療効果の用量比は治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す療法が好適である。毒性副作用を示す療法を使用することができるが、非感染細胞の潜在的な損傷を最小限にし、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を患部組織の部位に向ける送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０１１０】
動物研究から得たデータは、対象において使用するために、様々な投与量の療法を製剤化することに使用することができる。そのような薬剤の投与量は、毒性をわずかしか、又はまったく含まないＥＤ５０を含む、様々な濃度内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。本発明の方法において使用される任意の療法について、治療上有効な用量は、動物アッセイから最初に推定することができる。用量は、動物モデルにおいて処方することによって、動物モデルで求めた場合のＩＣ５０（即ち、症状の最大半量の阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む、投与される濃度範囲を実現することができる。そのような情報は、対象（例えば、ヒト）における有用な用量をより正確に求めるために使用することができる。
【０１１１】
５．８ キット
本発明は、点滴注入する前の混合の利便性のため、及び滅菌性を維持するための適切な包装及び取扱いデバイスと一緒に、所望の投与量に可溶性又は希釈可能な貯蔵に安定した形態で存在する単位用量の組成物を有するキットも包含する。そのようなキットは、例えば、原液中の単位用量又は凍結乾燥粉末としての単位用量として、安定な貯蔵形態で活性成分を含む第１の容器と；別々又は混合された希釈剤、又は溶媒と希釈剤を含む第２の容器であって、その体積は、投与に適切な体積で単位用量の治療化合物を提供する第２の容器と；希釈剤を原液又は凍結乾燥粉末と混合する手段と、必要に応じ、患者に用量を投与するための手段とを含むことができる。希釈剤を原液又は凍結乾燥粉末に移す手段として、それだけに限らないが、活性成分を希釈剤と分離している破壊可能な（breachable）内部封止剤を有するシリンジ又は多室（multi-chambered）容器を挙げることができる。
【０１１２】
本発明は、本発明の医薬組成物又はその一部で満たされた１又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。さらに、疾患又は障害の治療に有用な１又は複数の他の予防剤又は治療剤も、医薬品パック又はキット中に含めることができる。本発明は、本発明の医薬組成物の１又は複数の成分で満たされた１又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を統制する行政機関によって規定された形態での通知書を、そのような容器（複数も）に付随させてもよく、この通知書はヒトへの投与ための製造、使用又は販売の機関による認可を反映する。
【０１１３】
一般に、発明の組成物の成分は、例えば、活性薬剤の量を示している、アンプル又はサシェなどの気密封止して密閉された容器中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別々に、又は単位剤形中に一緒に混合して供給することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、凍結乾燥後の取扱いを容易にするのに十分な物質を提供するために、増量剤、例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ポリビニルピロリドンなどをさらに含む。
【０１１４】
本発明は、上記方法において使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１又は複数の本発明の医薬組成物を含む。別の実施形態では、キットは、１又は複数の容器中に、感染症又はそれに関連する症状の治療に有用な１又は複数の他の予防剤又は治療剤をさらに含む。
【０１１５】
本発明を、特定の実施形態の例によって開示してきたが、他の実施形態、方法、組成物、活性成分、指示、組成物及びキットは、当業者に明らかになるであろう。すべてのそのような変更及び拡張は、本明細書に開示し、主張したように、本発明に含まれる。
［実施例］
【０１１６】
６．１ 実施例Ｉ：結合：
図１は、全般的な本発明の方法の概略の流れ図を表す。多糖中のＮ−アセチル基の少なくとも１つ（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びサイル酸（sailic acid）由来の）は、アルカリを使用し、その後にＮ−ペンテノイル化（５炭素の不飽和脂肪族鎖を使用して）によって、Ｎ−アシル部分と置換することによって式Ｉの化合物を形成する。次いで得られるアシル化化合物を酸化することによって、ペンテノイル基の不飽和部位に活性アルデヒド基を生成する。次いで酸化化合物を、活性化された多糖の還元的アミノ化によって担体タンパク質と結合させ、これにより免疫原性複合糖質を生成する。生成物の免疫原性は、動物モデル（下記）を使用して実証することができる。
【０１１７】
すべての実験について、結合の進行は、スパロース１２カラムを備えたBiologicシステム（Bio-Rad社製）を用いて分析した。多糖の抗原タンパク質への結合は、カラムの空隙容積中で溶出して、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度の測定によってモニターした、ピークの漸進的増大によって示した。結合が完了した後、０．１ＮのＨＣｌを用いて溶液をｐＨ７に中和し、次いでＰＢＳに対して透析した。コンジュゲートは、Superdex 200PG（Pharmacia社製）の１．６×６０ｃｍのカラムを通過させることによって精製し、０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳを用いて溶出した。空隙−容積ピークに対応する分画をプールした。コンジュゲート中の炭水化物及びタンパク質含量は、Dubois et al. (51)のフェノール−硫酸アッセイ、及びBradford (9)のクーマシーアッセイによって推定した。
【０１１８】
６．２ 実施例II．Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）多糖−タンパク質コンジュゲート：
ＧＡＳ多糖のＮ−アセチル基の一部（３５〜４０％）の置換：
０．０１２ＮのＮａＯＨ中のＧＡＳ多糖（３０ｍｇ／ｍｌ）を、室温（（ＲＴ）約２０〜２５℃）で攪拌しながら、ＮａＢＨ４（８ｍｇ／ｍｌ）で７５分間処理した。３ＮのＮａＯＨ（０．０１２ＮのＮａＯＨの体積の１／２）を攪拌しながら反応混合物中に添加することによって、２０ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度を実現した。次いでこの反応混合物を８０℃に１時間維持した。次いでこれをＲＴに冷却し、水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの最終ＧＡＳ多糖濃度にした。これを、Stir-cell中の３Ｋ再生セルロース膜を使用して水に対してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水をダイアフィルトレーションのために使用することによって、２４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳの濃度を実現した。Ｎ−アセチル基の１級アミノ基との置換の程度は、１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってモニターした。
【０１１９】
Ｎ−アセチル基置換ＧＡＳ多糖のＮ−アシル化（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）（１５〜２５％）：
１，４−ジオキサン（４−塩化ペンテノイル１ｍｌ当たり１ｍｌ）中の４−塩化ペンテノイル（多糖１００ｍｇ当たり１ｍｌ）を、Ｎ−アセチル基置換ＧＡＳ多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。溶液のｐＨは、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで４５分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．８に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１０倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。
【０１２０】
Ｎ−アセチル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）−ＧＡＳ多糖の任意選択のキャッピング（例えば、Ｎ−アセチル化）（図２を参照されたい）：
無水酢酸（多糖１００ｍｇ当たり０．６ｍｌ）をＮ−ペンテノイル化ＧＡＳ多糖の撹拌した溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで７５分の時間にわたって液滴で添加した。この溶液のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで６０分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌのＧＡＳ多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。多糖中のペンテノイル基の取り込みは、６００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲ分析によって推定した（図３を参照されたい）。
【０１２１】
Ｎ−アシル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）ＧＡＳ多糖の酸化（図２を参照されたい）：
メタノール（多糖溶液の体積の１／２）を、Ｎ−ペンテノイルＧＡＳ多糖の撹拌した水溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで徐々に添加した。この混合物を、ドライアイス−エタノール浴を使用して、約−１５〜−２０℃に冷却した。温度を−１５〜−２０℃で維持しながら、オゾン（オゾン製造機（ozonolyzer）Ozomax 1を使用して空気から生成した）を、徐々に撹拌している反応混合物に通して４０分間バブリングした。次いで窒素を、混合物に通して１０分間バブリングすることによって、過剰のオゾンを排出した。次いでこの反応物を水で希釈することによって、５ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。２５倍の体積の水を浸透液として収集し、保持液を濃縮することによって、２０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にした。次いでこれを凍結乾燥して次のステップで使用した。
【０１２２】
破傷風トキソイド／組換え破傷風トキソイド断片Ｃへの結合：
０．２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中のＮ−ブチルオキシ（Ｎ−ＢｕＯ）ＧＡＳ多糖（９６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）（Ｎ−ペンテノイルＧＡＳ多糖の酸化から生じる）を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中の破傷風トキソイド（濃縮された１２０ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｌ）の溶液に添加した。ナトリウムシアノボロヒドリド（４０ｍｇ）をこの溶液に添加し、反応混合物を撹拌することによって均一な混合物を実現した。この反応混合物を、穏やかに振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、別の１６ｍｇのナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、この反応をさらに４８時間進めさせた。４８時間後に、追加の４ｍｇのナトリウムシアノボロヒドリドを添加し、反応物を３７℃で振盪しながらさらに２４時間放置した。
【０１２３】
次いで０．０５ＮのＮａＯＨ（０．５ｍｌ）中の水素化ホウ素ナトリウムの５％溶液を添加し、ＲＴで１時間穏やかに撹拌した。次に、１Ｎの酢酸（３部分で０．７２ｍｌ）をＲＴで攪拌しながら添加した。反応物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して３２ｍｌにし、３０Ｋ膜を使用して、Labscale TFFシステム中で精製した。３０倍の体積の浸透液を収集した。保持液（３０ｍｌ）を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、ＰＢＳ（０．３ｍｌ）中のチメロサールの１０％溶液を、コンジュゲート溶液に添加した。コンジュゲート溶液は、２〜８℃で貯蔵した。ＧＡＳ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１２４】
６．３ 実施例III．髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲート：
Ｎ−アセチル基置換−基置換髄膜炎菌Ｂ多糖のＮ−アシル化（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）（１５〜２５％）：
１，４−ジオキサン（４−塩化ペンテノイル１ｍｌ当たり１ｍｌ）中の４−塩化ペンテノイル（多糖１００ｍｇ当たり１ｍｌ）を、Ｎ−アセチル基置換多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。溶液のｐＨは、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで４５分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。次いでこの反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１０倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。
【０１２５】
Ｎ−アセチル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）−髄膜炎菌Ｂ多糖の任意選択のキャッピング（例えば、Ｎ−プロピオニル化）（図４を参照されたい）：
無水プロピオン酸−エタノール混合物（２．５：１、多糖１００ｍｇ当たり０．８４ｍｌ）をＮ−ペンテノイル化多糖の溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで撹拌しながら７５分にわたって液滴で添加した。この溶液のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって６．８〜９．５に維持した。次いで反応混合物のｐＨを、３ＮのＮａＯＨを液滴で添加することによって１２．７に上昇させ、ＲＴで６０分間撹拌した状態にした。次いで反応混合物のｐＨを、ＲＴで１ＮのＨＣｌを液滴で添加することによって、７．７に下げた。この反応混合物を水で希釈することによって、４ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を使用して、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。１５倍の体積の水を浸透液として収集した。最後に、保持液を濃縮することによって、２４ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にし、−２０℃で貯蔵した。多糖中のペンテノイル基の取り込みは、６００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲ分析によって推定した（図５を参照されたい）。
【０１２６】
Ｎ−アシル基置換（例えば、Ｎ−ペンテノイル化）及び任意選択のキャップ化（例えば、Ｎ−プロピオニル化）−Ｂ群髄膜炎菌Ｂ多糖（ＧＢＭＰ）の酸化（図４を参照されたい）：
メタノール（多糖溶液の体積の１／２）を、Ｎ−ペント−Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰの水溶液（２４ｍｇ／ｍｌ）に、ＲＴで攪拌しながら徐々に添加した。次いでこの混合物を、ドライアイス−エタノール浴を使用して、約−１５〜−２０℃に冷却した。温度を約−１５〜−２０℃で維持しながら、オゾン（オゾン製造機Ozomax 1を使用して空気から生成した）を、穏やかに撹拌した反応混合物に通して４０分間バブリングした。次いで窒素を、混合物に通して１０分間バブリングすることによって、過剰のオゾンを排出した。この反応物を水で希釈することによって、５ｍｇ／ｍｌの多糖の最終濃度にし、水を用いて、stircell中の３Ｋ膜を使用してダイアフィルトレートした。２５倍の体積の水を浸透液として収集し、保持液を濃縮することによって、２０ｍｇ／ｍｌの多糖濃度にした。次いでこれを凍結乾燥して次のステップで使用した。
【０１２７】
髄膜炎菌由来の組換え髄膜炎菌タンパク質（ｒＰｏｒＢ）／外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）への結合：
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中の活性Ｎ−ブタノイルオキシ−（ＮｂｕＯ）Ｎ−Ｐｒ ＧＢＭＰ（Ｎ−ブト−［−ＣＨ＝Ｏ］−Ｎ−Ｐｒ−ＧＢＭＰ、１７ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中のｒＰｏｒＢ／ＯＭＰＣ（濃縮された１５ｍｇ／ｍｌ）の溶液に添加した。反応混合物中のタンパク質と多糖の最終濃度は１：３であった。ナトリウムシアノボロヒドリド（多糖の質量の０．５倍）を添加し、反応混合物を撹拌することによって均一な混合物を保証した。この反応混合物を、穏やかに振盪しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、ナトリウムシアノボロヒドリド（多糖の質量の０．１２５倍）を再び添加し、この反応をさらに４８時間続けた。４８時間後に、さらなる量のナトリウムシアノボロヒドリドを混合物に添加し（多糖の質量の０．０３２倍）、反応物を３７℃で振盪しながら２４時間維持した。
【０１２８】
次いで０．０５ＮのＮａＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウムの５％溶液（最初の反応体積の０．２倍）を添加し、ＲＴで１時間穏やかに撹拌した。１Ｎの酢酸の溶液（３部分で最初の反応体積の０．３倍）をＲＴで攪拌しながら添加した。反応物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、次いで３０Ｋ膜を使用して、Labscale TFFシステム中で精製した。３０倍の体積の浸透液を収集した。保持液を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、ＰＢＳ中のチメロサールの１０％溶液（チメロサール０．０１％の最終濃度）を、コンジュゲート溶液に添加した。コンジュゲート溶液は、２〜８℃で貯蔵した。髄膜炎菌Ｂ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１２９】
６．４ 実施例IV．髄膜炎菌Ｃ多糖−タンパク質コンジュゲート：
Ｎ−アセチル基の一部の置換、アシル化、酸化、及びタンパク質との結合を、上述した手順に従って行った。髄膜炎菌Ｃ多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１３０】
６．５ 実施例Ｖ．Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質コンジュゲート：
上述した同様の実験手順に従って、Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質の活性化及び結合を実施した。Ｂ群連鎖球菌III型多糖−タンパク質コンジュゲートの組成を表１に示す。
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
６．６ 実施例VI．ＧＡＳＰ−ＴＴコンジュゲートを用いたＢＡＬＢ Ｃマウスの免疫化：
コンジュゲート（ＰＢＳ緩衝液中、１０μｇ／ｍｌ）をアンヒドロゲル（anhydrogel）（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて製剤化した。アンヒドロゲル中のコンジュゲート溶液（２００ｍｌ、２μｇ当量のコンジュゲート多糖）の懸濁液を、２週間間隔でＢａｌｂＣマウス中に注射した。３回の連続した注射の後、最後の注射から１週間後に血液試料を収集した。血清を試料から分離し、血清中の抗多糖抗体をＥＬＩＳＡによって定量化した。ＢａｌｂＣマウスにおける、多糖に対するＡ群連鎖球菌多糖−破傷風トキソイドコンジュゲートによって誘導された免疫応答の結果を図６に示す。
【０１３３】
６．７ 実施例VII．ＭＥＮＧＢ−ＲＰＯＲＢコンジュゲートを用いたＣＤＩマウスの免疫化：
コンジュゲート（ＰＢＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）をアンヒドロゲル（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて製剤化した。アンヒドロゲル中のコンジュゲート溶液（２００ｍｌ、２μｇ当量のコンジュゲート多糖）の懸濁液を、２週間間隔でＣＤＩマウス中に注射した。３回の連続した注射の後、最後の注射から１週間後に血液試料を収集し、血清を分離した。血清中の多糖特異的抗体をＥＬＩＳＡによって求めた。血清の細菌活性は、血清の存在下で、チョコレート寒天をコーティングしたプレートにおける細菌増殖の阻害を測定することによって判定した。ＣＤＩマウスにおける、髄膜炎菌Ｂ多糖−ｒＰｏｒＢコンジュゲートによって上昇した血清の殺菌活性を表２に示す。
【０１３４】
本発明によって調製した３つの別個のロットのＮＰｒ−（ＮｂｕＯ）−ＧＢＭＰ−ｒＰｏｒＢコンジュゲート、即ちロット１〜ロット３によって生じた血清の血清殺菌活性（ＳＢＡ）は、シアル酸鎖末端の従来の還元的アミノ化によって調製したＮＰｒ−ＧＢＭＰ−ｒＰｏｒＢコンジュゲートから生じた血清のＳＢＡより、４２と５２日目で抜血した後に著しく高かった（表２を参照されたい）。本発明によって調製されたコンジュゲートは、多糖鎖に沿って複数の部位で活性化された、比較的大きなサイズの多糖部分の使用により、免疫応答の改善をもたらし、コンジュゲートの架橋結合を改善すると考えられる。
【０１３５】
【表２】
【０１３６】
記述、具体的な実施例、及びデータは、例示的な実施形態を示すが、例として示されており、本発明を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び改変は、本明細書に含まれる考察、開示、及びデータから当業者に明らかとなり、したがって本発明の一部とみなされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性複合糖質の作製方法であって、
ａ）１又は複数のアミノ糖を含む抗原オリゴ糖又は抗原多糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基を脱アセチル化することによって、１級アミノ基を含む少なくとも１つのアミノ糖を有するオリゴ糖又は多糖を形成するステップと、
ｂ）前記少なくとも１つの１級アミノ基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換するステップであって、二重結合が、前記不飽和アルキル部分の炭素１と２の間以外又は炭素２と３の間以外の２つの炭素の間に位置するステップと、
ｃ）前記オリゴ糖又は多糖を酸化剤と接触させることによって、前記アルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つの活性アルデヒド基を生成させるステップと、
ｄ）前記少なくとも１つの活性アルデヒド基を介して前記オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるステップと
を含み、それによって免疫原性複合糖質を生成させる方法。
【請求項２】
免疫原性複合糖質の作製方法であって、
ａ）１又は複数のアミノ糖を含む抗原オリゴ糖又は抗原多糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換するステップであって、二重結合が、前記不飽和アルキル部分の炭素１と２の間以外又は炭素２と３の間以外の２つの炭素の間に位置するステップと、
ｂ）前記オリゴ糖又は多糖を酸化剤と接触させることによって、前記アルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つの活性アルデヒド基を生成させるステップと、
ｃ）前記少なくとも１つの活性アルデヒド基を介して前記オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるステップと
を含み、それによって免疫原性複合糖質を生成させる方法。
【請求項３】
１級アミノ基が、不飽和Ｎ−アシル基で置換されることによって式Ｉを形成する、請求項１に記載の方法：
【化１】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項４】
Ｎ−アセチル基が、不飽和Ｎ−アシル基で置換されることによって式Ｉを形成する、請求項２に記載の方法：
【化２】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項５】
不飽和アルキルが、５炭素長である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
二重結合が、不飽和アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
二重結合が、不飽和アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
不飽和アルキル部分が１つの二重結合を有し、この二重結合が、前記アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
不飽和アルキル部分が１つの二重結合を有し、この二重結合が、前記アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
活性アルデヒド基が、アルキル部分の末端部にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
活性アルデヒド基が、アルキル部分の末端部にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ基が、１又は複数のアミノ糖に、前記１又は複数のアミノ糖の１、２、３、４、又は５位で連結されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分が、酸化されることによってアルデヒド基を含み、前記Ｎ−アシル部分が、オリゴ糖又は多糖と担体タンパク質とを結合させる際のリンカーとしての機能を果たす、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴ糖又は多糖が、還元的アミノ化によって、Ｎ−アシル部分のアルデヒド基を介して、担体タンパク質に結合されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
複合糖質の担体タンパク質とオリゴ糖又は多糖が、以下のような連結によって共有結合的に連結されている、請求項１又は２に記載の方法：
【化３】
（式中、Ｒ２は、不飽和のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキル部分であり、前記連結のＮＨは、前記タンパク質の１級ＮＨ２基に属し、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項１６】
Ｎ−アセチル基が、Ｎ−ペンテノイル基で置換されており、前記Ｎ−ペンテノイル基が、化合物と担体タンパク質とを結合させる際のリンカーとしての機能を果たす、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｎ−アセチル基が、１又は複数のアミノ糖の一部であり、前記１又は複数のアミノ糖が、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びシアル酸の１又は複数である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
アルカリを使用してＮ−アシル部分で置換することにより、Ｎ−アセチル基が式Ｉを形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
担体タンパク質が、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、若しくは呼吸器合胞体ウイルスＦ及びＧタンパク質、又はこれらの活性部分である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴ糖又は多糖が、細菌由来のオリゴ糖又は多糖である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
細菌が、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、バチルス、コリネバクテリウム、リステリア、エリジペロスリックス、クロストリジウム、ヘモフィルス、シゲラ、クレブシエラ、コレラ菌、ナイセリア、又はエシェリキアである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴ糖又は多糖が、Ｂ群連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、又は大腸菌に由来する莢膜多糖である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
莢膜多糖が、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、II、III、Ｖ、VI、又はVIII型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
莢膜多糖が、髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、Ｙ、又はＷ１３５型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌III、IV、又はXIV型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
莢膜多糖が大腸菌Ｋ１に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
担体タンパク質が、同じ又は異なる抗原オリゴ糖又は抗原多糖に予め結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
担体タンパク質が、同じ又は異なる抗原オリゴ糖又は抗原多糖に予め結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１、２、２７、又は２８に記載の免疫原性複合糖質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
複数のオリゴ糖又は多糖を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
複数の担体タンパク質を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
複数の担体タンパク質を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
複数の免疫原性複合糖質を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
１又は複数のアジュバントをさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
１又は複数の型の細菌に対する免疫応答の誘導方法であって、その必要のある対象に、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
細菌感染症を治療又は予防する必要のある対象における、細菌感染症の治療又は予防方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１】
免疫原性複合糖質の作製方法であって、
ａ）１又は複数のアミノ糖を含む抗原オリゴ糖又は抗原多糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基を脱アセチル化することによって、１級アミノ基を含む少なくとも１つのアミノ糖を有するオリゴ糖又は多糖を形成するステップと、
ｂ）前記少なくとも１つの１級アミノ基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換するステップであって、二重結合が、前記不飽和アルキル部分の炭素１と２の間以外又は炭素２と３の間以外の２つの炭素の間に位置するステップと、
ｃ）前記オリゴ糖又は多糖を酸化剤と接触させることによって、前記アルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つの活性アルデヒド基を生成させるステップと、
ｄ）前記少なくとも１つの活性アルデヒド基を介して前記オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるステップと
を含み、それによって免疫原性複合糖質を生成させる方法。
【請求項２】
免疫原性複合糖質の作製方法であって、
ａ）１又は複数のアミノ糖を含む抗原オリゴ糖又は抗原多糖上の少なくとも１つのＮ−アセチル基を、少なくとも４炭素の不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分で置換するステップであって、二重結合が、前記不飽和アルキル部分の炭素１と２の間以外又は炭素２と３の間以外の２つの炭素の間に位置するステップと、
ｂ）前記オリゴ糖又は多糖を酸化剤と接触させることによって、前記アルキル部分の不飽和部位において、少なくとも１つの活性アルデヒド基を生成させるステップと、
ｃ）前記少なくとも１つの活性アルデヒド基を介して前記オリゴ糖又は多糖を担体タンパク質と結合させるステップと
を含み、それによって免疫原性複合糖質を生成させる方法。
【請求項３】
１級アミノ基が、不飽和Ｎ−アシル基で置換されることによって式Ｉを形成する、請求項１に記載の方法：
【化１】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項４】
Ｎ−アセチル基が、不飽和Ｎ−アシル基で置換されることによって式Ｉを形成する、請求項２に記載の方法：
【化２】
（式中、Ｒ１は、不飽和のＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、又はＣ１１アルキル部分であり、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項５】
不飽和アルキルが、５炭素長である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
二重結合が、不飽和アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
二重結合が、不飽和アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
不飽和アルキル部分が１つの二重結合を有し、この二重結合が、前記アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
不飽和アルキル部分が１つの二重結合を有し、この二重結合が、前記アルキル部分の末端の２つの炭素の間に位置する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
活性アルデヒド基が、アルキル部分の末端部にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
活性アルデヒド基が、アルキル部分の末端部にある、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ基が、１又は複数のアミノ糖に、前記１又は複数のアミノ糖の１、２、３、４、又は５位で連結されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
不飽和アルキル部分を含むＮ−アシル部分が、酸化されることによってアルデヒド基を含み、前記Ｎ−アシル部分が、オリゴ糖又は多糖と担体タンパク質とを結合させる際のリンカーとしての機能を果たす、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴ糖又は多糖が、還元的アミノ化によって、Ｎ−アシル部分のアルデヒド基を介して、担体タンパク質に結合されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
複合糖質の担体タンパク質とオリゴ糖又は多糖が、以下のような連結によって共有結合的に連結されている、請求項１又は２に記載の方法：
【化３】
（式中、Ｒ２は、不飽和のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキル部分であり、前記連結のＮＨは、前記タンパク質の１級ＮＨ２基に属し、［sugar］は、前記１又は複数のアミノ糖を表す）。
【請求項１６】
Ｎ−アセチル基が、Ｎ−ペンテノイル基で置換されており、前記Ｎ−ペンテノイル基が、化合物と担体タンパク質とを結合させる際のリンカーとしての機能を果たす、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
Ｎ−アセチル基が、１又は複数のアミノ糖の一部であり、前記１又は複数のアミノ糖が、ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃ、ＧａｌＮＡｃ、及びシアル酸の１又は複数である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
アルカリを使用してＮ−アシル部分で置換することにより、Ｎ−アセチル基が式Ｉを形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
担体タンパク質が、破傷風毒素／トキソイド、ＣＲＭ１９７、グラム陰性菌由来の外膜タンパク質、分類不能型ヘモフィルス・インフルエンザ菌由来のＰ６及びＰ４、モラクセラ・カタラーリス由来のＣＤ及びＵＳＰＡ、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒された緑膿菌毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド、ウェルシュ菌外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ７タンパク質、若しくは呼吸器合胞体ウイルスＦ及びＧタンパク質、又はこれらの活性部分である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
オリゴ糖又は多糖が、細菌由来のオリゴ糖又は多糖である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
細菌が、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、バチルス、コリネバクテリウム、リステリア、エリジペロスリックス、クロストリジウム、ヘモフィルス、シゲラ、クレブシエラ、コレラ菌、ナイセリア、又はエシェリキアである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴ糖又は多糖が、Ｂ群連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、又は大腸菌に由来する莢膜多糖である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
莢膜多糖が、Ｂ群連鎖球菌Ｉａ、Ｉｂ、II、III、Ｖ、VI、又はVIII型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
莢膜多糖が、髄膜炎菌Ｂ、Ｃ、Ｙ、又はＷ１３５型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌III、IV、又はXIV型に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
莢膜多糖が大腸菌Ｋ１に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
担体タンパク質が、同じ又は異なる抗原オリゴ糖又は抗原多糖に予め結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
担体タンパク質が、同じ又は異なる抗原オリゴ糖又は抗原多糖に予め結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１、２、２７、又は２８に記載の免疫原性複合糖質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
複数のオリゴ糖又は多糖を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
複数の担体タンパク質を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
複数の担体タンパク質を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
複数の免疫原性複合糖質を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
１又は複数のアジュバントをさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
１又は複数の型の細菌に対する免疫応答の誘導方法であって、その必要のある対象に、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項３４】
細菌感染症を治療又は予防する必要のある対象における、細菌感染症の治療又は予防方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５３２７９３（Ｐ２０１０−５３２７９３Ａ）
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３３７５（Ｐ２０１０−５１３３７５）
【出願日】平成２０年６月１８日（２００８．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７５９０
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０８２１１５８０）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１８日（２００８．６．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６７３１５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５７５９０
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０８２１１５８０）バクスター ヘルスケア エス．エイ． (2)
【Ｆターム（参考）】
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