シマグワからの抽出物およびクワノンＨ化合物の抗菌用途
【課題】シマグワの根皮から調製された抽出物を抗菌剤として提供。
【解決手段】シマグワの乾燥根皮を細かく砕き、エタノール水溶液で還流下抽出し得られた下記化学式（Ｉ）：
をクワノンＨとして、抗菌剤としての新規な用途を提供する。
【解決手段】シマグワの乾燥根皮を細かく砕き、エタノール水溶液で還流下抽出し得られた下記化学式（Ｉ）：
をクワノンＨとして、抗菌剤としての新規な用途を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ．）の根皮から調製された抽出物、および当該抽出物から分離されたクワノンＨ化合物の、細菌感染の治療時における新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ Ｋｏｉｄｚ）、マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、およびロソウ（Ｍｏｒｕｓ Ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ）などのクワの木の樹皮の抽出物から分離された５種の化合物、マルベロフランＣ、Ｄ、およびＧ、クワノールＡ並びにサンゲノンＧについて、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などに対する抗菌の用途が開示されている。
【０００３】
特許文献２には、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ Ｋｏｉｄｚ）、マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、およびロソウ（Ｍｏｒｕｓ Ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ）などのクワの木の根皮から調製された抽出物を分離して得られた、クワノンＧおよびＨの２種の化合物について、高血圧患者の血圧を低下させるための用途を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−００７５５５号公報
【特許文献２】特開昭５６−０１２３９７９号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、下記化学式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
【０００７】
で表されるクワノンＨまたは製剤上許容されうるその塩の抗菌用途、を提供することである。
【０００８】
前述した本発明の抗菌用途には、効果のある成分として、クワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物；細菌感染の患者の治療のための製剤の製造におけるクワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩の使用；および、クワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法も含まれる。
【０００９】
本発明の他の目的は、シマグワの根皮から調製された抽出物の抗菌用途を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、抽出物の抗菌用途は、効果のある成分として、本発明の抽出物を含んだ、細菌感染の治療のための医薬組成物；対象者の細菌感染の治療のための製剤の製造における本発明の抽出物の使用；および、本発明の抽出物の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法も含まれる。
【００１１】
本発明における「細菌感染を治療する」とは、広義には、細菌感染によって引き起こされるあらゆる障害を治療することを意味し、または狭義には、細菌の増殖を抑制することを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
「桑白皮（Ｓａｎ−Ｂａｉ−Ｐｉ）」は、伝統的な漢方薬、マグワの乾燥根皮のことであり、咳嗽および利尿を緩和する抗炎症の用途がある。マグワの植物は、台湾では希少である；しかしながら、シマグワは容易に見つけることができる。これをきっかけとし、本発明の発明者たちは、シマグワからの抽出物を調製し、産業的に潜在的有用性のある抽出物から化合物を単離するに至った。
【００１３】
本発明は、化学式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
で表されるクワノンＨまたは製剤上許容されうるその塩の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、シマグワの根皮から調製された抽出物の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者の治療方法を提供する。この際、抽出物は、以下の工程を含むプロセスによって調製されている。
ａ）シマグワの根皮を極性溶剤で抽出する；
ｂ）工程ａ）で得られた抽出溶液を濃縮する；
ｃ）工程ｂ）で得られた濃縮物を逆相クロマトグラフィカラムに導入し、順に、第一および第二の溶離液を用いてカラムを溶出する。この際、前記第一溶離液を約５０ｗｔ％エタノール水溶液（たとえば、４０〜７０ｗｔ％、好ましくは４５〜６０ｗｔ％エタノール水溶液）の極性、および前記第二溶離液を約９５ｗｔ％エタノール水溶液（たとえば、８０〜９８ｗｔ％、好ましくは８５〜９７ｗｔ％エタノール水溶液）の極性とする；並びに
ｄ）第二溶離液を用いてカラムから溶出する第二溶出液を回収し、第二溶出液から第二溶離液を減圧除去する。
【００１７】
好ましくは、細菌はグラム陽性菌である。
【００１８】
好ましくは、細菌は黄色ブドウ球菌（スミス株）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓｍｉｔｈ））または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。さらに好ましくは、細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）である。さらに好ましくは、細菌が肺炎連鎖球菌である。最も好ましくは、細菌がエリスロマイシンおよびアンピシリン耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）である。
【００１９】
好ましくは、本発明の抽出物は、化学式（Ｉ）の化合物に加えて、下記化学式（ＩＩ）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
で表されるサンゲノンＧを含む。
【００２２】
好ましくは、抽出物は、抽出物の重量に対して、化合物（Ｉ）１〜５％、化合物（ＩＩ）１〜５％を含む。より好ましくは、抽出物は、抽出物の重量に対して、化合物（Ｉ）３．７％、化合物（ＩＩ）２．３％を含む。
【００２３】
好ましくは、第一溶離液は、５０ｗｔ％エタノール水溶液であり、第二溶離液は、９５ｗｔ％エタノール水溶液である。
【００２４】
好ましくは、工程ａ）における極性溶剤は、水または９５ｗｔ％エタノール水溶液であり、より好ましくは、９５ｗｔ％エタノール水溶液である。
【実施例】
【００２５】
本発明において、以下の具体例は単に例示のためのものであって、本発明の範囲を制限するものではないと解釈されるべきである。
【００２６】
この明細書中で言及した百分率および他の総量は、他に指示のない限り重量によるものとする。百分率は、総計１００％まで、あらゆる範囲を選択することができる。
【００２７】
実施例１）抽出物ＥＸ−１の調製
薄切りしたシマグワ（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の乾燥根皮を細かく砕き、ふるいで選別した。得られた粉体１００ｇを、丸底フラスコ中で９５ｗｔ％エタノール水溶液１０００ｍＬ（１０：１（ｖ／ｗ））と混合し、得られた混合物を１時間還流沸騰させ、メッシュナンバー３５０のふるいおよびろ紙（＃２）でろ過を行い、ろ液および残渣を得た。残渣を、前述した条件と同様にして、還流下で抽出し、ろ過を行った。得られた二つのろ液を混合し、その一部を減圧乾燥し、混合ろ液からの乾燥粉末重量を計算したところ、１０．２１ｇであり、粗抽出物の収率は１０．２１ｗｔ％であった。混合ろ液を元の重量の１／１０に濃縮し、得られた濃縮物と同重量の水を添加した。混合ろ液の濃縮物の３０倍の重量のポリスチレン吸収樹脂（Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０、三菱化学）を充填した逆相クロマトグラフィカラムに、得られた混合物を導入し、２ベッドボリューム（ベッドボリューム＝６００ｍＬ）の５０ｗｔ％エタノール水溶液（１２００ｍＬ）、続いて、２ベッドボリュームの９５ｗｔ％エタノール水溶液（１２００ｍＬ）を用いて溶出させた。９５ｗｔ％エタノール水溶液の溶出液を回収し、真空で濃縮し乾燥させた。乾燥した抽出物ＥＸ−１（コードネーム）は２．７３ｇ得られ、混合ろ液の濃縮物の乾燥重量に対して、収率２６．７％であり、乾燥根皮の重量に対して、収率２．７３％であった。
【００２８】
実施例２）抽出物ＥＸ−１の分離
２ｇのＥＸ−１をメタノール１０ｍＬに溶解させた均一溶液に、純水１０ｍＬを添加し、この混合物を激しく振とうし、沈殿を促進させ、続いて１５分間１００００ｒｐｍで遠心分離を行った。遠心分離によって得られた固形分を溶解、沈殿および遠心分離を行い、このサイクルを総計６回実施した。
【００２９】
６回の遠心分離により得られた６つの液体を混合し、真空で濃縮し乾燥した（重量１．３ｇ）。乾燥粉末の３０倍の重量のシリカゲル６０を充填したシリカゲルカラム（３．２ｃｍ×４８．５ｃｍ）に、得られた乾燥粉末を導入し、１５ベッドボリューム（ベッドボリューム＝２５０）の混合移動相トルエン：酢酸エチル＝７：３（３７５０ｍＬ）で溶出させた。溶出液を、事前に決めた番号のボトルに順に回収した。各容器の液体を、真空乾燥し、得られた乾燥粉末を少量のメタノールを加えて再溶解し、乾燥粉末の１００倍の重量のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０樹脂を充填したデキストランゲルカラム（１．５ｃｍ×４０ｃｍ）に導入した。カラムを、１ベッドボリュームのメタノール（３０ｍＬ）で溶出し、化合物Ｐ２−１、Ｐ２−２、Ｐ３−１、およびＰ３−２のフラクションを得た。それぞれのフラクションを真空で濃縮し乾燥した後、分取用ＨＰＬＣで精製し、化合物Ｐ２−１、Ｐ２−２、Ｐ３−１、およびＰ３−を得た。ＥＸ−１の重量に対して、Ｐ３−１の収率は２．３％（４６ｍｇ）であり、Ｐ３−２の収率は３．６５％（７３ｍｇ）であった。
【００３０】
遠心分離後の６つの残渣をメタノールに溶解し、この溶液を真空で濃縮し乾燥した。この乾燥粉末の３０倍の重量のシリカゲル６０の充填されたシリカゲルカラム（３．２ｃｍ×４８．５ｃｍ）に、乾燥粉末を導入し、２ベッドボリューム（ベッドボリューム＝２５０）の混合移動相トルエン：酢酸エチル＝９：１（５００ｍＬ）で溶出させた。溶出液は、事前に決めた番号のボトルに順に回収した。各容器の液体を真空で濃縮し乾燥させ、得られた乾燥粉末を少量のメタノールに再溶解させて、乾燥粉末の１００倍の重量のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０樹脂を充填したデキストランゲルカラム（１．５ｃｍ×４０ｃｍ）に導入した。カラムは、１ベッドボリュームのメタノール（３０ｍＬ）で溶出させて、化合物Ｐ３−３およびＰ３−４を得た。
【００３１】
【化４】
【００３２】
Ｐ２−１：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６０３．３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、ｍ／ｚ ５７９．２（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ２−１の化学式はＣ３４Ｈ２８Ｏ９であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ２−１はこの論文で報告されたマルベロフランＣであることを確認した。マルベロフランＣは、また、特開昭５７−１４４２２３号公報にも開示されている。
【００３３】
論文：Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｈａｎｏ，Ｙ．；Ｈｉｒａｋｕｒａ，Ｋ．；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｕｚａｗａ，Ｊ．；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｏｆｕｒａｎ Ｊ，ａ ２−ａｒｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８４，２２，１００７−１０１１.を参照。
【００３４】
Ｐ２−２：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７１５．３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、ｍ／ｚ ６９１．３（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ２−１の化学式はＣ４０Ｈ３６Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ２−２はこの論文で報告されたアルバニンＦ（クワノンＧ）であることを確認した。アルバニンＦ（クワノンＧ）は、また、大韓民国特許出願公開第２００２−００８７２２５号にも開示されている。
【００３５】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．，ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ，Ｋｕｗａｎｏｎ Ｈ，ａ ｎｅｗ ｆｌａｖｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｂａｒｋ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８０，１４，１９４３−１９５１.を参照。
【００３６】
Ｐ３−１：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６９５．４（［Ｍ＋Ｈ］＋）、ｍ／ｚ ６９３．７（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−１の化学式はＣ４０Ｈ３８Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−１はサンゲノンＧであることを確認した。サンゲノンＧは、また、特開平１０−００７５５５号公報にも開示されている。
【００３７】
論文：Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｈａｎｏ，Ｙ．；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓａｎｇｇｅｎｏｎ Ｇ，ａ ｎｅｗ Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ ａｄｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｒｕｄｅ ｄｒｕｇ ’’Ｓａｎｇ−Ｂａｉ−Ｐｉ’’（Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８３，２０，６１１−６１５.を参照。
【００３８】
Ｐ３−２：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７６１（［Ｍ＋Ｈ］＋），７８３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、７５９（［Ｍ−Ｈ］−）。Ｐ３−２の分子量は７６０として計算した。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−２の化学式はＣ４５Ｈ４４Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−２はクワノンＨ（アルバニンＡ、またはモラセニンＡとも称される。）であることを確認した。また、特開昭５６−１２３９７９号公報には、クワノンＨが高血圧患者の血圧を下げるのに有効であることが開示されている。
【００３９】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．；Ｔｅｒａｄａ，Ｓ．；Ｕｚａｗａ，Ｊ．；Ｉｉｔａｋａ，Ｙ．；Ｔａｋａｓｕｇｉ，Ｍ．；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．Ｉ．；Ｎａｇａｏ，Ｓ．；Ｍａｓａｍｕｎｅ，Ｔ．，Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｋｕｗａｎｏｎｓ Ｇ ａｎｄ Ｈ（ａｌｂａｎｉｎｓ Ｆ ａｎｄ Ｇ） ｂｙ ｐａｒｔｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８１，２２，２１９５−２１９８；Ｏｓｈｉｍａ，Ｙ．；Ｋｏｎｎｏ，Ｃ．；Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｒａｃｅｎｉｎ Ａ，ａ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８０，１４，１２８７−１２９０；を参照。
【００４０】
論文：Ｏｓｈｉｍａ，Ｙ．；Ｋｏｎｎｏ，Ｃ．；Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｒａｃｅｎｉｎ Ｂ，ａ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８０，２１，３３８１−３３８４.を参照。
【００４１】
Ｐ３−３：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４２１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−３の化学式はＣ２５Ｈ２４Ｏ６であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−３はモルシンであることを確認した。また、モルシンは、米国特許出願公開第２００８／０２８６２１３号にも開示されている。
【００４２】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｙａｍａｄａ，Ｓ．；Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，２４，２８９８−２９００．を参照。
【００４３】
Ｐ３−４：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４４７．０（［Ｍ＋Ｈ］＋）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−３の化学式はＣ２９Ｈ３４Ｏ４であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−４はマルベロフランＤであることを確認した。また、マルベロフランＤは、特開平１０−００７５５５号公報にも開示されている。
【００４４】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｉ．−Ｓ．，Ｍｕｌｂｅｒｒｏｆｕｒａｎ Ｄ，ａ ｎｅｗ ２−ａｒｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９８２，１９，１８５５−１８６０.を参照。
【００４５】
抗菌テスト
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの菌：黄色ブドウ球菌（スミス株）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）
黄色ブドウ球菌（スミス株）およびメチシリン耐性ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）のサンプルの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、液体培地希釈法［Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＭ−７３３８，ａ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３３：ｐｐ．２１５−２２２，１９８９］により求めた。試験物質は（一般的には１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒中で希釈した。４８ウェルプレートに、それぞれの試験濃度について０．０１ｍＬ（最終ＤＭＳＯ濃度１％）を分取した後、１〜５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの黄色ブドウ球菌（スミス株）またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）を含んだ０．９９ｍＬの培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ、ＵＳＡ））を添加した。以上のように、最終的なＤＭＳＯ最大濃度は１％、初期の試験物質濃度は１００μｇ／ｍＬまたは３０μＭであった。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした後、増殖すなわち濁度が抑制されたものを陽性（＋）とし、増殖または濁度への影響がないものを陰性（−）として肉眼で評価を行った。媒体対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ）および活性参照剤（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔｓ）をブランクおよびポジティブコントロールとして用いた。各濃度について二回ずつ評価を行った。結果は表１に示す。
【００４６】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの菌：肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性、臨床分離株）
肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性、臨床分離株）のサンプルの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、液体培地希釈法［Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＭ−７３３８，ａ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３３：ｐｐ．２１５−２２２，１９８９］により求めた。試験物質は（一般的に１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒中で希釈した。試験物質は（一般的には１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒に希釈した。４８ウェルプレートに、それぞれの試験濃度について０．０１ｍＬ（最終ＤＭＳＯ濃度１％）を分取した後、１〜５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性臨床分離株）を含んだ７％ウシ胎児血清含有培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ、ＵＳＡ））０．９９ｍＬを添加した。以上のように、最終的なＤＭＳＯ最大濃度は１％、初期の試験物質濃度は１００μｇ／ｍＬまたは３０μＭであった。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした後、増殖すなわち濁度が抑制されたものを陽性（＋）とし、増殖または濁度への影響がないものを陰性（−）として肉眼で評価を行った。媒体対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ）および活性参照剤（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔｓ）をブランクおよびポジティブコントロールとして用いた。各濃度について二回ずつ評価を行った。結果は表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１を参照すると、化合物Ｐ３−２は、０．３μｇ／ｍＬの濃度でＳＡ（スミス株）およびＭＲＳＡの増殖抑制に有効であることがわかる。対照的に、ゲンタマイシンのＭＲＳＡへのＭＩＣはＳＡ（スミス株）の１０倍である。
【００４９】
化合物Ｐ３−１は、ＳＡ（スミス株）およびＭＲＳＡに対するＭＩＣがそれぞれ１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬであり、増殖抑制に有効なことが示された。化合物Ｐ３−１は、ＳＰおよびＳＰ（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性）に対するＭＩＣが、それぞれ、３０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬであり、相対的に増殖抑制の作用が低い。
【００５０】
Ｐ３−２およびＰ３−１をそれぞれ３．６５ｗｔ％および２．３ｗｔ％を含有していることを考慮すると、驚いたことに、本発明の抽出物ＥＸ−１は、ＳＡおよびＭＲＳＡに対するＭＩＣが０．３μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬであり、増殖抑制に非常に有効であることが示された。抽出物ＥＸ−１に含まれている成分は、ＳＡおよびＭＲＳＡの増殖抑制において相乗的に作用していることは明らかであり、そのために抽出物ＥＸ−１のＳＡおよびＭＲＳＡに対するＭＩＣ値は非常に低くなっている。
【００５１】
本発明について、本明細書にいくつかの実施例を用いて詳細に記載したが、本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲に制限されることがない。前述した開示に照らして、種々の変更及び修飾が可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シマグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ．）の根皮から調製された抽出物、および当該抽出物から分離されたクワノンＨ化合物の、細菌感染の治療時における新規な用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ Ｋｏｉｄｚ）、マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、およびロソウ（Ｍｏｒｕｓ Ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ）などのクワの木の樹皮の抽出物から分離された５種の化合物、マルベロフランＣ、Ｄ、およびＧ、クワノールＡ並びにサンゲノンＧについて、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）やメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などに対する抗菌の用途が開示されている。
【０００３】
特許文献２には、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ ｂｏｍｂｙｃｉｓ Ｋｏｉｄｚ）、マグワ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．）、およびロソウ（Ｍｏｒｕｓ Ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ）などのクワの木の根皮から調製された抽出物を分離して得られた、クワノンＧおよびＨの２種の化合物について、高血圧患者の血圧を低下させるための用途を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−００７５５５号公報
【特許文献２】特開昭５６−０１２３９７９号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、下記化学式（Ｉ）：
【０００６】
【化１】
【０００７】
で表されるクワノンＨまたは製剤上許容されうるその塩の抗菌用途、を提供することである。
【０００８】
前述した本発明の抗菌用途には、効果のある成分として、クワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物；細菌感染の患者の治療のための製剤の製造におけるクワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩の使用；および、クワノンＨ、または製剤上許容されうるその塩の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法も含まれる。
【０００９】
本発明の他の目的は、シマグワの根皮から調製された抽出物の抗菌用途を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、抽出物の抗菌用途は、効果のある成分として、本発明の抽出物を含んだ、細菌感染の治療のための医薬組成物；対象者の細菌感染の治療のための製剤の製造における本発明の抽出物の使用；および、本発明の抽出物の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法も含まれる。
【００１１】
本発明における「細菌感染を治療する」とは、広義には、細菌感染によって引き起こされるあらゆる障害を治療することを意味し、または狭義には、細菌の増殖を抑制することを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
「桑白皮（Ｓａｎ−Ｂａｉ−Ｐｉ）」は、伝統的な漢方薬、マグワの乾燥根皮のことであり、咳嗽および利尿を緩和する抗炎症の用途がある。マグワの植物は、台湾では希少である；しかしながら、シマグワは容易に見つけることができる。これをきっかけとし、本発明の発明者たちは、シマグワからの抽出物を調製し、産業的に潜在的有用性のある抽出物から化合物を単離するに至った。
【００１３】
本発明は、化学式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
【００１５】
で表されるクワノンＨまたは製剤上許容されうるその塩の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者を治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、シマグワの根皮から調製された抽出物の治療上有効量を、細菌感染を有した対象者に投与することを含む、前記対象者の治療方法を提供する。この際、抽出物は、以下の工程を含むプロセスによって調製されている。
ａ）シマグワの根皮を極性溶剤で抽出する；
ｂ）工程ａ）で得られた抽出溶液を濃縮する；
ｃ）工程ｂ）で得られた濃縮物を逆相クロマトグラフィカラムに導入し、順に、第一および第二の溶離液を用いてカラムを溶出する。この際、前記第一溶離液を約５０ｗｔ％エタノール水溶液（たとえば、４０〜７０ｗｔ％、好ましくは４５〜６０ｗｔ％エタノール水溶液）の極性、および前記第二溶離液を約９５ｗｔ％エタノール水溶液（たとえば、８０〜９８ｗｔ％、好ましくは８５〜９７ｗｔ％エタノール水溶液）の極性とする；並びに
ｄ）第二溶離液を用いてカラムから溶出する第二溶出液を回収し、第二溶出液から第二溶離液を減圧除去する。
【００１７】
好ましくは、細菌はグラム陽性菌である。
【００１８】
好ましくは、細菌は黄色ブドウ球菌（スミス株）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓｍｉｔｈ））または肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。さらに好ましくは、細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）である。さらに好ましくは、細菌が肺炎連鎖球菌である。最も好ましくは、細菌がエリスロマイシンおよびアンピシリン耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）である。
【００１９】
好ましくは、本発明の抽出物は、化学式（Ｉ）の化合物に加えて、下記化学式（ＩＩ）：
【００２０】
【化３】
【００２１】
で表されるサンゲノンＧを含む。
【００２２】
好ましくは、抽出物は、抽出物の重量に対して、化合物（Ｉ）１〜５％、化合物（ＩＩ）１〜５％を含む。より好ましくは、抽出物は、抽出物の重量に対して、化合物（Ｉ）３．７％、化合物（ＩＩ）２．３％を含む。
【００２３】
好ましくは、第一溶離液は、５０ｗｔ％エタノール水溶液であり、第二溶離液は、９５ｗｔ％エタノール水溶液である。
【００２４】
好ましくは、工程ａ）における極性溶剤は、水または９５ｗｔ％エタノール水溶液であり、より好ましくは、９５ｗｔ％エタノール水溶液である。
【実施例】
【００２５】
本発明において、以下の具体例は単に例示のためのものであって、本発明の範囲を制限するものではないと解釈されるべきである。
【００２６】
この明細書中で言及した百分率および他の総量は、他に指示のない限り重量によるものとする。百分率は、総計１００％まで、あらゆる範囲を選択することができる。
【００２７】
実施例１）抽出物ＥＸ−１の調製
薄切りしたシマグワ（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の乾燥根皮を細かく砕き、ふるいで選別した。得られた粉体１００ｇを、丸底フラスコ中で９５ｗｔ％エタノール水溶液１０００ｍＬ（１０：１（ｖ／ｗ））と混合し、得られた混合物を１時間還流沸騰させ、メッシュナンバー３５０のふるいおよびろ紙（＃２）でろ過を行い、ろ液および残渣を得た。残渣を、前述した条件と同様にして、還流下で抽出し、ろ過を行った。得られた二つのろ液を混合し、その一部を減圧乾燥し、混合ろ液からの乾燥粉末重量を計算したところ、１０．２１ｇであり、粗抽出物の収率は１０．２１ｗｔ％であった。混合ろ液を元の重量の１／１０に濃縮し、得られた濃縮物と同重量の水を添加した。混合ろ液の濃縮物の３０倍の重量のポリスチレン吸収樹脂（Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０、三菱化学）を充填した逆相クロマトグラフィカラムに、得られた混合物を導入し、２ベッドボリューム（ベッドボリューム＝６００ｍＬ）の５０ｗｔ％エタノール水溶液（１２００ｍＬ）、続いて、２ベッドボリュームの９５ｗｔ％エタノール水溶液（１２００ｍＬ）を用いて溶出させた。９５ｗｔ％エタノール水溶液の溶出液を回収し、真空で濃縮し乾燥させた。乾燥した抽出物ＥＸ−１（コードネーム）は２．７３ｇ得られ、混合ろ液の濃縮物の乾燥重量に対して、収率２６．７％であり、乾燥根皮の重量に対して、収率２．７３％であった。
【００２８】
実施例２）抽出物ＥＸ−１の分離
２ｇのＥＸ−１をメタノール１０ｍＬに溶解させた均一溶液に、純水１０ｍＬを添加し、この混合物を激しく振とうし、沈殿を促進させ、続いて１５分間１００００ｒｐｍで遠心分離を行った。遠心分離によって得られた固形分を溶解、沈殿および遠心分離を行い、このサイクルを総計６回実施した。
【００２９】
６回の遠心分離により得られた６つの液体を混合し、真空で濃縮し乾燥した（重量１．３ｇ）。乾燥粉末の３０倍の重量のシリカゲル６０を充填したシリカゲルカラム（３．２ｃｍ×４８．５ｃｍ）に、得られた乾燥粉末を導入し、１５ベッドボリューム（ベッドボリューム＝２５０）の混合移動相トルエン：酢酸エチル＝７：３（３７５０ｍＬ）で溶出させた。溶出液を、事前に決めた番号のボトルに順に回収した。各容器の液体を、真空乾燥し、得られた乾燥粉末を少量のメタノールを加えて再溶解し、乾燥粉末の１００倍の重量のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０樹脂を充填したデキストランゲルカラム（１．５ｃｍ×４０ｃｍ）に導入した。カラムを、１ベッドボリュームのメタノール（３０ｍＬ）で溶出し、化合物Ｐ２−１、Ｐ２−２、Ｐ３−１、およびＰ３−２のフラクションを得た。それぞれのフラクションを真空で濃縮し乾燥した後、分取用ＨＰＬＣで精製し、化合物Ｐ２−１、Ｐ２−２、Ｐ３−１、およびＰ３−を得た。ＥＸ−１の重量に対して、Ｐ３−１の収率は２．３％（４６ｍｇ）であり、Ｐ３−２の収率は３．６５％（７３ｍｇ）であった。
【００３０】
遠心分離後の６つの残渣をメタノールに溶解し、この溶液を真空で濃縮し乾燥した。この乾燥粉末の３０倍の重量のシリカゲル６０の充填されたシリカゲルカラム（３．２ｃｍ×４８．５ｃｍ）に、乾燥粉末を導入し、２ベッドボリューム（ベッドボリューム＝２５０）の混合移動相トルエン：酢酸エチル＝９：１（５００ｍＬ）で溶出させた。溶出液は、事前に決めた番号のボトルに順に回収した。各容器の液体を真空で濃縮し乾燥させ、得られた乾燥粉末を少量のメタノールに再溶解させて、乾燥粉末の１００倍の重量のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０樹脂を充填したデキストランゲルカラム（１．５ｃｍ×４０ｃｍ）に導入した。カラムは、１ベッドボリュームのメタノール（３０ｍＬ）で溶出させて、化合物Ｐ３−３およびＰ３−４を得た。
【００３１】
【化４】
【００３２】
Ｐ２−１：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６０３．３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、ｍ／ｚ ５７９．２（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ２−１の化学式はＣ３４Ｈ２８Ｏ９であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ２−１はこの論文で報告されたマルベロフランＣであることを確認した。マルベロフランＣは、また、特開昭５７−１４４２２３号公報にも開示されている。
【００３３】
論文：Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｈａｎｏ，Ｙ．；Ｈｉｒａｋｕｒａ，Ｋ．；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｕｚａｗａ，Ｊ．；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｏｆｕｒａｎ Ｊ，ａ ２−ａｒｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ｌｈｏｕ Ｋｏｉｄｚ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８４，２２，１００７−１０１１.を参照。
【００３４】
Ｐ２−２：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７１５．３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、ｍ／ｚ ６９１．３（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ２−１の化学式はＣ４０Ｈ３６Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ２−２はこの論文で報告されたアルバニンＦ（クワノンＧ）であることを確認した。アルバニンＦ（クワノンＧ）は、また、大韓民国特許出願公開第２００２−００８７２２５号にも開示されている。
【００３５】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．，ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ，Ｋｕｗａｎｏｎ Ｈ，ａ ｎｅｗ ｆｌａｖｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｂａｒｋ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８０，１４，１９４３−１９５１.を参照。
【００３６】
Ｐ３−１：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ６９５．４（［Ｍ＋Ｈ］＋）、ｍ／ｚ ６９３．７（［Ｍ−Ｈ］−）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−１の化学式はＣ４０Ｈ３８Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−１はサンゲノンＧであることを確認した。サンゲノンＧは、また、特開平１０−００７５５５号公報にも開示されている。
【００３７】
論文：Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｈａｎｏ，Ｙ．；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．；Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓａｎｇｇｅｎｏｎ Ｇ，ａ ｎｅｗ Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ ａｄｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃｒｕｄｅ ｄｒｕｇ ’’Ｓａｎｇ−Ｂａｉ−Ｐｉ’’（Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８３，２０，６１１−６１５.を参照。
【００３８】
Ｐ３−２：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ７６１（［Ｍ＋Ｈ］＋），７８３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）、７５９（［Ｍ−Ｈ］−）。Ｐ３−２の分子量は７６０として計算した。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−２の化学式はＣ４５Ｈ４４Ｏ１１であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−２はクワノンＨ（アルバニンＡ、またはモラセニンＡとも称される。）であることを確認した。また、特開昭５６−１２３９７９号公報には、クワノンＨが高血圧患者の血圧を下げるのに有効であることが開示されている。
【００３９】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｎａｒｉｔａ，Ｔ．；Ｔｅｒａｄａ，Ｓ．；Ｕｚａｗａ，Ｊ．；Ｉｉｔａｋａ，Ｙ．；Ｔａｋａｓｕｇｉ，Ｍ．；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．Ｉ．；Ｎａｇａｏ，Ｓ．；Ｍａｓａｍｕｎｅ，Ｔ．，Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｋｕｗａｎｏｎｓ Ｇ ａｎｄ Ｈ（ａｌｂａｎｉｎｓ Ｆ ａｎｄ Ｇ） ｂｙ ｐａｒｔｉａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８１，２２，２１９５−２１９８；Ｏｓｈｉｍａ，Ｙ．；Ｋｏｎｎｏ，Ｃ．；Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｒａｃｅｎｉｎ Ａ，ａ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ １９８０，１４，１２８７−１２９０；を参照。
【００４０】
論文：Ｏｓｈｉｍａ，Ｙ．；Ｋｏｎｎｏ，Ｃ．；Ｈｉｋｉｎｏ，Ｈ．；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｒａｃｅｎｉｎ Ｂ，ａ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｍｏｒｕｓ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８０，２１，３３８１−３３８４.を参照。
【００４１】
Ｐ３−３：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４２１（［Ｍ＋Ｈ］＋）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−３の化学式はＣ２５Ｈ２４Ｏ６であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−３はモルシンであることを確認した。また、モルシンは、米国特許出願公開第２００８／０２８６２１３号にも開示されている。
【００４２】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｙａｍａｄａ，Ｓ．；Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｌｂａ Ｌ．），Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９７６，２４，２８９８−２９００．を参照。
【００４３】
Ｐ３−４：ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４４７．０（［Ｍ＋Ｈ］＋）。ＮＭＲ解析も実施した。ＥＳＩ−ＭＳおよびＮＭＲデータにより、Ｐ３−３の化学式はＣ２９Ｈ３４Ｏ４であることが示された。ＮＭＲデータを下記の論文と比較し、Ｐ３−４はマルベロフランＤであることを確認した。また、マルベロフランＤは、特開平１０−００７５５５号公報にも開示されている。
【００４４】
論文：Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．；Ｆｕｋａｉ，Ｔ．；Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．；Ｃｈｅｎ，Ｉ．−Ｓ．，Ｍｕｌｂｅｒｒｏｆｕｒａｎ Ｄ，ａ ｎｅｗ ２−ａｒｙｌｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｂａｒｋｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｔｒｅｅ（Ｍｏｒｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ Ｐｏｉｒ．），Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９８２，１９，１８５５−１８６０.を参照。
【００４５】
抗菌テスト
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの菌：黄色ブドウ球菌（スミス株）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）
黄色ブドウ球菌（スミス株）およびメチシリン耐性ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）のサンプルの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、液体培地希釈法［Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＭ−７３３８，ａ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３３：ｐｐ．２１５−２２２，１９８９］により求めた。試験物質は（一般的には１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒中で希釈した。４８ウェルプレートに、それぞれの試験濃度について０．０１ｍＬ（最終ＤＭＳＯ濃度１％）を分取した後、１〜５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの黄色ブドウ球菌（スミス株）またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ３３５９１）を含んだ０．９９ｍＬの培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ、ＵＳＡ））を添加した。以上のように、最終的なＤＭＳＯ最大濃度は１％、初期の試験物質濃度は１００μｇ／ｍＬまたは３０μＭであった。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした後、増殖すなわち濁度が抑制されたものを陽性（＋）とし、増殖または濁度への影響がないものを陰性（−）として肉眼で評価を行った。媒体対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ）および活性参照剤（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔｓ）をブランクおよびポジティブコントロールとして用いた。各濃度について二回ずつ評価を行った。結果は表１に示す。
【００４６】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏの菌：肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性、臨床分離株）
肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性、臨床分離株）のサンプルの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、液体培地希釈法［Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＭ−７３３８，ａ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｈｙｄｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｉ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３３：ｐｐ．２１５−２２２，１９８９］により求めた。試験物質は（一般的に１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒中で希釈した。試験物質は（一般的には１００％ＤＭＳＯに）溶解させ、逐次、所定の濃度に溶媒に希釈した。４８ウェルプレートに、それぞれの試験濃度について０．０１ｍＬ（最終ＤＭＳＯ濃度１％）を分取した後、１〜５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの肺炎連鎖球菌（ＡＴＣＣ６３０１）および肺炎連鎖球菌（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性臨床分離株）を含んだ７％ウシ胎児血清含有培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ、ＵＳＡ））０．９９ｍＬを添加した。以上のように、最終的なＤＭＳＯ最大濃度は１％、初期の試験物質濃度は１００μｇ／ｍＬまたは３０μＭであった。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした後、増殖すなわち濁度が抑制されたものを陽性（＋）とし、増殖または濁度への影響がないものを陰性（−）として肉眼で評価を行った。媒体対照（Ｖｅｈｉｃｌｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ）および活性参照剤（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ａｇｅｎｔｓ）をブランクおよびポジティブコントロールとして用いた。各濃度について二回ずつ評価を行った。結果は表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１を参照すると、化合物Ｐ３−２は、０．３μｇ／ｍＬの濃度でＳＡ（スミス株）およびＭＲＳＡの増殖抑制に有効であることがわかる。対照的に、ゲンタマイシンのＭＲＳＡへのＭＩＣはＳＡ（スミス株）の１０倍である。
【００４９】
化合物Ｐ３−１は、ＳＡ（スミス株）およびＭＲＳＡに対するＭＩＣがそれぞれ１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬであり、増殖抑制に有効なことが示された。化合物Ｐ３−１は、ＳＰおよびＳＰ（エリスロマイシンおよびアンピシリン耐性）に対するＭＩＣが、それぞれ、３０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬであり、相対的に増殖抑制の作用が低い。
【００５０】
Ｐ３−２およびＰ３−１をそれぞれ３．６５ｗｔ％および２．３ｗｔ％を含有していることを考慮すると、驚いたことに、本発明の抽出物ＥＸ−１は、ＳＡおよびＭＲＳＡに対するＭＩＣが０．３μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬであり、増殖抑制に非常に有効であることが示された。抽出物ＥＸ−１に含まれている成分は、ＳＡおよびＭＲＳＡの増殖抑制において相乗的に作用していることは明らかであり、そのために抽出物ＥＸ−１のＳＡおよびＭＲＳＡに対するＭＩＣ値は非常に低くなっている。
【００５１】
本発明について、本明細書にいくつかの実施例を用いて詳細に記載したが、本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲に制限されることがない。前述した開示に照らして、種々の変更及び修飾が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（Ｉ）：
【化１】
で表される化合物または製剤上許容されうるその塩を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
以下の工程：
ａ）シマグワの根皮を極性溶剤で抽出する；
ｂ）工程ａ）で得られた抽出溶液を濃縮する；
ｃ）工程ｂ）で得られた濃縮物を逆相クロマトグラフィカラムに導入し、第一溶離液および第二溶離液を順にカラムに充填し、この際、前記第一溶離液を約５０ｗｔ％エタノール水溶液の極性、および前記第二溶離液を約９５ｗｔ％エタノール水溶液の極性とする；並びに
ｄ）第二溶離液を用いてカラムから溶出する第二溶出液を回収し、第二溶出液から第二溶離液を減圧除去する、
を含むプロセスによって、シマグワの根皮から調製された抽出物を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、請求項１に記載の化学式（Ｉ）で表される化合物、および下記化学式（ＩＩ）：
【化２】
で表される化合物を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抽出物が、抽出物の重量に対して、前記化合物（Ｉ）を１〜５ｗｔ％、化合物（ＩＩ）を１〜５ｗｔ％含有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抽出物が、抽出物の重量に対して、前記化合物（Ｉ）を３．７ｗｔ％、前記化合物（ＩＩ）を２．３ｗｔ％含有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第一溶離液が５０ｗｔ％エタノール水溶液であり、前記第二溶離液が９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
工程ａ）における前記極性溶剤が、水または９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記極性溶剤が９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細菌がグラム陽性菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（スミス株）または肺炎連鎖球菌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細菌が黄色ブドウ球菌（スミス株）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細菌が肺炎連鎖球菌である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細菌がエリスロマイシンおよびアンピシリン耐性肺炎連鎖球菌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１】
下記化学式（Ｉ）：
【化１】
で表される化合物または製剤上許容されうるその塩を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
以下の工程：
ａ）シマグワの根皮を極性溶剤で抽出する；
ｂ）工程ａ）で得られた抽出溶液を濃縮する；
ｃ）工程ｂ）で得られた濃縮物を逆相クロマトグラフィカラムに導入し、第一溶離液および第二溶離液を順にカラムに充填し、この際、前記第一溶離液を約５０ｗｔ％エタノール水溶液の極性、および前記第二溶離液を約９５ｗｔ％エタノール水溶液の極性とする；並びに
ｄ）第二溶離液を用いてカラムから溶出する第二溶出液を回収し、第二溶出液から第二溶離液を減圧除去する、
を含むプロセスによって、シマグワの根皮から調製された抽出物を含む、細菌感染の治療のための医薬組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、請求項１に記載の化学式（Ｉ）で表される化合物、および下記化学式（ＩＩ）：
【化２】
で表される化合物を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抽出物が、抽出物の重量に対して、前記化合物（Ｉ）を１〜５ｗｔ％、化合物（ＩＩ）を１〜５ｗｔ％含有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抽出物が、抽出物の重量に対して、前記化合物（Ｉ）を３．７ｗｔ％、前記化合物（ＩＩ）を２．３ｗｔ％含有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記第一溶離液が５０ｗｔ％エタノール水溶液であり、前記第二溶離液が９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
工程ａ）における前記極性溶剤が、水または９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記極性溶剤が９５ｗｔ％エタノール水溶液である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記細菌がグラム陽性菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細菌が黄色ブドウ球菌（スミス株）または肺炎連鎖球菌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細菌が黄色ブドウ球菌（スミス株）である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
細菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
細菌が肺炎連鎖球菌である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細菌がエリスロマイシンおよびアンピシリン耐性肺炎連鎖球菌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【公開番号】特開２０１０−１５５８１９（Ｐ２０１０−１５５８１９Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１８３５２（Ｐ２００９−１１８３５２）
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【出願人】（５００３９００３２）財団法人醫藥工業技術發展中心 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１５日（２００９．５．１５）
【出願人】（５００３９００３２）財団法人醫藥工業技術發展中心 (3)
【Ｆターム（参考）】
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