シロ−イノシトールの製造方法
NAD+非存在下でミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換する新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ、NADHまたはNADPH存在下でシロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、及びミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有するアセトバクター属またはバークホルデリア属に属する新規な微生物を提供する。これらの酵素又は微生物を用いてシロ−イノシトールを製造する。また、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液にホウ酸及び金属塩を加えてシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させ、前記複合体を混合液から分離し、分離した複合体を酸に溶解して酸性溶液又は酸性懸濁液を調製し、該酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを精製する。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項２】
前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
【請求項３】
培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、またはバークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物である請求項１〜３のいずれかの項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株である、請求項1〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株。
【請求項７】
少なくとも以下の理化学的性質を有するNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ
（ａ）作用：電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
（ｃ）補因子：1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
（ｄ）阻害剤：１ｍＭのＳｎ2+イオンにより酵素活性が１％以下に阻害される、
（ｅ）サブユニット構造：少なくとも分子量76kダルトンと46ｋダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
（ｆ）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
【請求項８】
NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項９】
前記微生物がアセトバクター・エスピーAB10253株 （FERM BP-10136）である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
【請求項１１】
ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項１２】
アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項１６】
下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
反応：下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
【化１】
【請求項１７】
さらに、下記の理化学的性質を有する、請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
（１）分子量および会合特性 ： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
（２）補酵素 ： NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
（３）活性化重金属 ： Co2+イオンの存在下で活性化される。
（４）阻害重金属 ： Sn2+イオンの存在下で阻害される。
（５）至適ｐH ： ｐH５〜９で活性を有する。
【請求項１８】
以下の（A）または（B）のタンパク質。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
以下の（A）または（B）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載のＤＮＡ、または請求項２１に記載のベクターを保持する形質転換微生物。
【請求項２３】
形質転換する宿主が大腸菌である請求項２２に記載の形質転換微生物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD+またはNADP+存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD+ またはNADP+存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
【請求項２６】
溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２７】
溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２８】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２９】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項３０】
溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22％になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項３１】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（Ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３２】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３３】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３４】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３５】
シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第１の工程、前記複合体を混合液から分離する第２の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第３の工程、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第４の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項３６】
前記第１の工程において、加えるホウ酸及び金属塩の量が、前記混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上、かつ３倍モル以下であることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３７】
前記第１の工程において、前記混合液のｐHを9.0〜10.0に調整することを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３８】
前記金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる１種または２種類以上の金属塩である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３９】
前記シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液が、シロ−イノソースを含有する溶液中でシロ−イノソースを還元することにより得られるミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４０】
前記第３の工程において、前記複合体を酸に溶解させて得られた溶液を0.1規定以上の酸性に調整し、かつ、前記第４の工程において、前記酸性溶液を強酸性イオン交換樹脂、及び強塩基性イオン交換樹脂又はホウ酸選択的吸着樹脂に接触させた後、該酸性溶液からシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４１】
前記第４の工程において、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に水溶性有機溶媒を加えてシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４２】
前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.3〜3倍容、又はメタノールを0.3〜5倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４３】
前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.6〜1.5倍容、またはメタノールを0.9容〜２倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４４】
シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第２の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第３の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項４５】
前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.2〜0.4倍容、メタノールを0.2〜0.8倍容、又は１−プロパノールを0.2〜0.4倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
【請求項４６】
前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.35〜0.45倍容、メタノールを0.45〜0.55倍容、又は１−プロパノールを0.35〜0.45倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
【請求項１】
アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項２】
前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
【請求項３】
培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
【請求項４】
前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、またはバークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物である請求項１〜３のいずれかの項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株である、請求項1〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株（FERM BP-10119）またはその変異株。
【請求項７】
少なくとも以下の理化学的性質を有するNAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ
（ａ）作用：電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
（ｂ）至適ｐＨ：ｐＨ4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
（ｃ）補因子：1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
（ｄ）阻害剤：１ｍＭのＳｎ2+イオンにより酵素活性が１％以下に阻害される、
（ｅ）サブユニット構造：少なくとも分子量76kダルトンと46ｋダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
（ｆ）基質特異性：Ｄ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、Ｄ−キロ−1−イノソース、Ｌ−キロ−２−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
【請求項８】
NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項９】
前記微生物がアセトバクター・エスピーAB10253株 （FERM BP-10136）である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
【請求項１１】
ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項１２】
アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
【請求項１３】
微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
【請求項１５】
請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項１６】
下記の理化学的性質を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
反応：下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
【化１】
【請求項１７】
さらに、下記の理化学的性質を有する、請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ。
（１）分子量および会合特性 ： 38〜46ｋダルトン、２または３量体を形成する。
（２）補酵素 ： NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
（３）活性化重金属 ： Co2+イオンの存在下で活性化される。
（４）阻害重金属 ： Sn2+イオンの存在下で阻害される。
（５）至適ｐH ： ｐH５〜９で活性を有する。
【請求項１８】
以下の（A）または（B）のタンパク質。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
以下の（A）または（B）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（A）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（B）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２０】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載のＤＮＡ、または請求項２１に記載のベクターを保持する形質転換微生物。
【請求項２３】
形質転換する宿主が大腸菌である請求項２２に記載の形質転換微生物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD+またはNADP+存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール２−デヒドロゲナーゼ（EC1.1.1.18）とを共存させた溶液中、ｐH6.0〜8.5で、かつNAD+ またはNADP+存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
【請求項２６】
溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２７】
溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5％になるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２８】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項２９】
溶液中に、Co塩および／または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項３０】
溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22％になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、請求項２５に記載のシローイノシトールの製造方法。
【請求項３１】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ａ）または（Ｂ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（Ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３２】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（ａ）配列番号２７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｂ）配列番号２７に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項３３】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（Ｃ）または（Ｄ）のタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（Ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３４】
シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡによってコードされるタンパク質である請求項２５に記載の製造方法。
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１、３、５、７、９、１１または１３に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３５】
シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のｐＨを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第１の工程、前記複合体を混合液から分離する第２の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第３の工程、第３の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第４の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項３６】
前記第１の工程において、加えるホウ酸及び金属塩の量が、前記混合液中に溶解したシロ−イノシトールの２倍モル以上、かつ３倍モル以下であることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３７】
前記第１の工程において、前記混合液のｐHを9.0〜10.0に調整することを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３８】
前記金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる１種または２種類以上の金属塩である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項３９】
前記シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液が、シロ−イノソースを含有する溶液中でシロ−イノソースを還元することにより得られるミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液である、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４０】
前記第３の工程において、前記複合体を酸に溶解させて得られた溶液を0.1規定以上の酸性に調整し、かつ、前記第４の工程において、前記酸性溶液を強酸性イオン交換樹脂、及び強塩基性イオン交換樹脂又はホウ酸選択的吸着樹脂に接触させた後、該酸性溶液からシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４１】
前記第４の工程において、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に水溶性有機溶媒を加えてシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、請求項３５に記載の製造方法。
【請求項４２】
前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.3〜3倍容、又はメタノールを0.3〜5倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４３】
前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.6〜1.5倍容、またはメタノールを0.9容〜２倍容加えることを特徴とする、請求項４１に記載の製造方法。
【請求項４４】
シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第２の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第３の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
【請求項４５】
前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.2〜0.4倍容、メタノールを0.2〜0.8倍容、又は１−プロパノールを0.2〜0.4倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
【請求項４６】
前記第３の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は１−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.35〜0.45倍容、メタノールを0.45〜0.55倍容、又は１−プロパノールを0.35〜0.45倍容加えることを特徴とする、請求項４４に記載の製造方法。
【図１】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５７７４
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４６５１（Ｐ２００５−５１４６５１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５１７４
【国際出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５１７４
【国際出願日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]