ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法
【課題】安全性の高いジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法を提供すること。
【解決手段】コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程をさらに有する。プロテアーゼはプロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上が好ましい。
【解決手段】コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程をさらに有する。プロテアーゼはプロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上が好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来から食材として用いられてきたコラーゲンあるいはゼラチン由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、全世界において糖尿病が爆発的に増加している。日本では糖尿病患者600万人、その予備軍は1200万人〜1500万人といわれている。糖尿病では高血糖が続くことによって血管が徐々に障害を受け、さまざまな臓器に異常が生じる。糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症が三大合併症として以前から知られているが、近年では動脈硬化症発症のリスクが高くなることも知られている。糖尿病には「膵β細胞の破壊的病変でインスリンの欠乏が生じて起こる」Ｉ型糖尿病と「膵β細胞の機能異常によるインスリン分泌能低下と肝、筋、脂肪組織等の標的臓器におけるインスリン感受性低下が併発することによって発症する」ＩＩ型糖尿病がある。昨今激増する糖尿病はＩＩ型に由来するものであり、糖尿病の90〜95%を占めていると考えられている。ＩＩ型糖尿病は「生活習慣病」といわれているように、ストレス、肥満、運動不足による基礎代謝能低下と、それに加えての高カロリー食摂取等、現代型社会生活によって引き起こされている。
【０００３】
このような糖尿病に関する研究分野において、消化管ホルモンであるインクレチンが注目されつつある。インクレチンはインスリン分泌を増強する消化管ホルモンの総称で、GIP(グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド(glucose-dependent insulinotropic polypeptide))やGLP-1(グルカゴン様ペプチド‐1(glucagon-like peptide-1))等が知られている。これらは、膵β細胞に発現する受容体を介したグルコース応答性インスリン分泌を促進し、食後の血糖上昇を抑制する。また、インスリン分泌促進以外に、膵β細胞の保護および増殖作用といった活性を持っている。しかしながら、インクレチンの問題点として、安定性が挙げられる。すなわち、インクレチンは体内に普遍的に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに不活性なものへと分解され、数分間で半減してしまう。そこで、ＤＰＰＩＶ阻害剤の開発が進められている（たとえば特許文献1参照）。しかしながら、医薬品として開発されているＤＰＰＩＶ阻害剤は非天然物の化学合成物であり、摂取する際の安全性に問題がある。
【０００４】
コラーゲンは従来から食品として利用されており、コラーゲンを摂取することにより新陳代謝が促進されること（特許文献２）や頭髪の直径が太くなること（非特許文献１）、関節症治療用薬剤として利用可能なこと（特許文献３）等が報告されている。また、コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取による皮膚の新陳代謝促進に関する特許（特許文献２）や生体内でのコラーゲン合成の促進に関する特許（特許文献４）も開示され、主に美容向けの健康食品が多数販売されている。
【０００５】
コラーゲンおよびその熱変性体であるゼラチンは粘性が高く凝固し易い性質を持つため、加工適性を向上させるため、タンパク質分解酵素を用いて処理したもの、あるいは酸‐塩基分解により部分加水分解処理したものを使用することが多い。また、タンパク質であるため抗原性を有し、アレルギー体質のヒトの摂取には問題がある。そのため、コラーゲンをコラゲナーゼによって、低分子化することにより抗原性をなくしアレルギー患者向けのタンパク質源あるいは輸液製剤成分としての利用が開示されている（特許文献５）。また、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解物の生理活性については、フィブリン凝集阻害活性（特許文献６）、麻酔作用（非特許文献２）が知られている。しかしながら、コラーゲンあるいはその分解物にＤＰＰＩＶの阻害活性があるといった報告はない。
【０００６】
一方で、ペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告がいくつかある（非特許文献３〜６）。しかしながら、これらのペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤は、食品由来ではないため、摂取する際の安全性の点で充分とはいえない。また、食品由来のペプチドによるＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告もある（特許文献７）が、コラーゲンあるいはゼラチン由来のペプチドによるＤＰＰＩＶ阻害に関する報告はない。
【特許文献１】特許第３６８１１１０号号公報
【特許文献２】特開平７−２７８０１２号公報
【特許文献３】特開昭６３−３９８２１号公報
【特許文献４】特許第３８０２７２１号号公報
【特許文献５】特開平７−８２２９９号公報
【特許文献６】特開平６−４６８７５号公報
【特許文献７】特開２００７−０３９４２４号公報
【非特許文献１】Nutrition Reports International,13巻,579頁,1976年
【非特許文献２】Br.J.Pharmacol.,69巻,551頁,1980年
【非特許文献３】Arch.Biochem.Biophys., 218巻,156頁, 1982年
【非特許文献４】Biochem.J., 252巻,723頁, 1988年
【非特許文献５】Biol.Chem.Hoppe-Seyler., 372巻, 305頁, 1991年
【非特許文献６】J.Antibiot., 37巻, 422頁, 1984年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、阻害活性が高くかつ安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、安全性の観点から、食材として用いられているコラーゲンあるいはゼラチン由来のペプチドに着目し、研究を行った結果、コラーゲンあるいはゼラチン由来のＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法を見出し、本発明の完成に至った。すなわち、本発明は、以下から構成される。
〔１〕コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔２〕プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程を有する、前記〔１〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔３〕プロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上である、前記〔１〕または〔２〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔４〕有機溶媒沈殿法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物をエタノールと混合し、沈殿画分と上清画分を分離して上清画分を回収する工程である、前記〔２〕または〔３〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔５〕樹脂精製法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を合成吸着剤に吸着させて、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水により溶出する画分を回収する工程である、前記〔２〕または〔３〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法によって製造されたＤＰＰＩＶ阻害剤は、ＤＰＰＩＶに対して高い阻害活性を有し、かつ、コラーゲン、ゼラチン等の食品由来のため安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の製造方法は、コラゲナーゼ処理されたコラーゲンやゼラチン由来の分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する点に特徴があり、かかる特徴を有することで、活性が高く安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害剤を製造することができる。
【００１１】
原料となるコラーゲンは、特に限定されず、Ｉ型からXIII型のコラーゲンのいずれをも用いることが可能であり、これらの混合物である混合型のコラーゲンを用いることもできる。現実的には、コラーゲンは、各種の動物や魚類から得られる、混合型のコラーゲンを用いることが想定されるが、このコラーゲンの出所となる動物（例えば、牛、豚等）や魚類（例えば、ヒラメ、サケ、イワシ、マグロ等）の種類や、コラーゲンの抽出部位も、骨、皮、腱、ウキブクロ（魚類）等が可能である。
【００１２】
これらの成分からのコラーゲンの抽出・精製は、通常公知の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、骨、皮、腱、ウキブクロ等のコラーゲンを含有する組織を粉砕した後、水洗、希塩溶液による抽出、酸あるいはアルカリ溶液による抽出、ペプシン，トリプシンやヒアルロニダーゼ等の酵素による抽出を行い、塩析や透析等の公知の精製手段を施して、コラーゲンを精製して得ることができる。また、通常公知の方法により、「再生コラーゲン」として得ることも可能である。また、市販のコラーゲンを、原料として用いることも可能である。
【００１３】
そして、ゼラチンは、上述のコラーゲンを、水で加熱抽出して得られる水溶性タンパク質である。本発明においては、通常公知の方法により製造したゼラチンを原料として用いることも可能であり、市販品を用いることも可能である。
【００１４】
本発明に用いるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、上述のようにして得られるコラーゲンまたはゼラチンに、コラゲナーゼを作用させて製造することができる。
【００１５】
コラゲナーゼとしては、特に限定されないが、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）、ストレプトミセス・パルブラス（Streptomyces parvulus）等の細菌、放線菌または真菌等由来で、コラーゲン特有のアミノ酸配列〔（Ｇｌｙ−Ａ−Ｂ）n（式中、Ａ，Ｂは、グリシン残基を除くアミノ酸残基を表し、互いに同一であっても、異なってもよく、ｎは、正の整数を表す）：以下、このアミノ酸配列を、「特有アミノ酸配列」ともいう）〕のグリシン残基のアミノ基末端側を、特異的に切断するコラゲナーゼを用いることで、この特有アミノ酸配列のペプチドを豊富に含むコラゲナーゼ分解物を得ることが可能であり、好ましい。また、ここで用いるコラゲナーゼは、天然物として得られるコラゲナーゼは勿論のこと、例えば、タンパク工学的な手法で改変して得られる、上記の特異性を有する改変コラゲナーゼであってもよい。
【００１６】
上記のＡ，Ｂが採り得る、グリシン残基を除くアミノ酸残基の種類は、特に限定されず、通常は、天然に存在するアミノ酸（グリシンを除く）のアミノ酸残基、具体的には、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、セリン残基、トレオニン残基、システイン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基のいずれのアミノ酸残基であってもよい。
【００１７】
また、本発明に用いられるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、通常公知の方法、例えば、特開平７−８２２９９号公報や特開平９−１７６１９６号公報に記載されている方法に準じて、遊離またはキトバール等の固定化担体に固定化されたコラゲナーゼを、バッチ法、カラム法またはこれらの方法を組み合わせ、好ましくは、反応温度を４０〜４５℃に設定して、前記コラーゲンまたはゼラチンと接触させることで製造することができる。
【００１８】
また、コラゲナーゼ分解物として市販品、例えば、商品名コラーゲン・トリペプチドHACP（ゼライス社製）等を用いることも可能である。
【００１９】
本発明の製造方法では、上述の方法に従い製造したまたは市販されているコラゲナーゼ分解物を、プロテアーゼを用いて分解することによって、ＤＰＰＩＶ阻害活性を高めることができる。
【００２０】
プロテアーゼとしては、特に限定されないが、微生物由来及び植物由来のものが挙げられる。例えば、バチルス属（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロザー・モフィルス（Bacillus stearother mophilus）等）、アスペルギルス属（アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）等）等の細菌、放線菌または真菌等由来のプロテアーゼ、パインアップル（Ananas comosus)由来のプロテアーゼ等を用いると、阻害活性を高めたＤＰＰＩＶ阻害剤を効率的に得ることができるので好ましい。中でも、阻害活性向上作用が高い観点から、バチルス属由来、アスペルギルス属由来およびパインアップル由来のプロテアーゼがより好ましい。
なお、前記プロテアーゼは粗製品であっても、精製されたものであってもよい。又、これらの酵素を生産する菌体も利用できる。
【００２１】
前記プロテアーゼ処理の条件は、プロテアーゼの特性に合せて適宜選択すればよい。処理時間については、特に限定はない。なお、プロテアーゼ処理は、加熱等により酵素を失活させることで終了させることができる。
【００２２】
前記プロテアーゼ処理で得られたプロテアーゼ分解物は、そのまま公知の手段でろ過、濃縮等の処理を施すことでＤＰＰＩＶ阻害剤として使用することができるが、さらに各種の精製方法に供することで、ＤＰＰＩＶの阻害活性をより高めた画分を得ることもできる。中でも、収率よく高活性のＤＰＰＩＶ阻害剤が得られる観点から、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製することが好ましい。
【００２３】
前記有機溶媒沈殿法で使用する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。また、これらの有機溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよく、有機溶媒と水あるいは酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、エタノール水溶液を用いて精製するのが好ましい。
【００２４】
前記有機溶媒沈殿法として、前記有機溶媒中に前記プロテアーゼ分解物を混合し、沈殿画分と上清画分を分離して、上清画分を回収することで阻害活性の高いＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。沈殿画分と上清画分とが分離するまでは有機溶媒混合物を静置することが好ましい。なお、静置温度は低温で行うことが好ましい。
また、回収した上清画分は減圧または限外ろ過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。
【００２５】
前記樹脂精製法で使用する樹脂としては、例えば、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、多孔性樹脂、特殊樹脂（キレート樹脂、合成吸着剤、蛋白分離剤）等が挙げられるが、回収した画分の脱塩処理工程が不要であることから、合成吸着剤を用いるのが好ましい。
前記合成吸着剤としては、例えば、芳香族（スチレン‐ビニルベンゼン）系、芳香族系修飾型、アクリル（メタクリル）系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
前記樹脂精製法において、ＤＰＰＩＶ阻害剤を含むプロテアーゼ分解物の前記樹脂への吸着は、公知の手法により行えばよい。次いで、吸着したプロテアーゼ分解物の溶離には、酸、アルカリまたは種々の有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。また、これらの有機溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよく、これらと水あるいは酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水を用いて溶離するのが好ましい。前記樹脂精製法は、バッチ法あるいはカラム法にて行うことができる。回収した画分は減圧または限外ろ過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。
【００２７】
以上のようにして得られたＤＰＰＩＶ阻害剤は、安全性に優れたものであり、しかもコラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物に比べて、高いＤＰＰＩＶ阻害活性を有する。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
コラゲナーゼ分解物をプロテアーゼ処理によりさらに分解した。コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）50gとプロテアーゼN「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）0.5gを水に溶解し、55℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、80℃以上で30分間加熱して酵素を失活させた。この酵素処理溶液の一部を凍結乾燥し、ペプチド粉末（プロテアーゼ分解物：HACP-01-N）を得た。
【００３０】
（実施例２）
プロテアーゼ分解物を合成吸着剤を用いたカラム法により分画した。実施例1で得られた酵素処理溶液50mlを合成吸着剤SEPABEADS SP850（三菱化学社製）25gを充填したオープンカラムに流し、水、エタノール濃度20％水溶液、エタノール濃度50％水溶液、エタノールをそれぞれ150ml流して、各画分（HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、HACP-01-N-50、HACP-01-N-100）を回収し、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノールを除去した後、凍結乾燥を行ってペプチド粉末を得た。
【００３１】
（実施例３）
プロテアーゼ分解物をエタノールを用いた沈殿法により分画した。実施例1で得られた酵素処理溶液30mlとエタノール170mlをよく混合し、4℃で一晩静置した後、10,000rpm、４℃で5分間遠心した。上清および沈殿画分（HACP-01-N-S、 HACP-01-N-P）を回収し、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノールを除去した後、凍結乾燥してペプチド粉末を得た。
【００３２】
（実施例４）
実施例１〜３で得られたペプチドのＤＰＰＩＶ阻害活性を調べた。HACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-50、HACP-01-N-100、HACP-01-N-S 、HACP-01-N-ＰおよびHACP-01をそれぞれ25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に20mg/mlとなるように溶解した。
【００３３】
ＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験は以下の方法に従った。25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）20μl、バッファーもしくはサンプル溶液5μl、希釈したＤＰＰＩＶ溶液（1ng/μl）5μlを混合し、室温で5分間インキュベートした。酵素反応開始は25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に溶かした基質溶液（0.25mMのグリシルプロリン−４−メチルクマリル−７−アミド（Gly-Pro-MCA））を20μl添加することによって行った。室温で20分間反応後、96ウェルプレート対応蛍光検出器（フルオロスキャンアセント：サーモエレクトロン社製）で、ＤＰＰＩＶによって遊離される7−アミノ−4−メチルクマリン（AMC）量を測定した。なお、励起波長は390nm、測定波長460nmで行った。対照区はＤＰＰＩＶ溶液の代わりに25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）を用いて同様に行った。
【００３４】
ＤＰＰＩＶ阻害率の計算は、サンプル溶液を含んでいない場合の活性を100とし、ペプチド溶液を添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)とした。サンプル自体の擬似阻害効果を補正して阻害率を求めた。その結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率はサンプル終濃度が2.0mg/mlのときHACP-01-Nで32.3%、HACP-01-N-0で50.5%、HACP-01-N-20で48.5%、HACP-01-N-50で16.9%、 HACP-01-N-100で19.9%、HACP-01-N-Sで55.7%、HACP-01-N-Pで25.5%、HACP-01で16.0%であった（結果を図１にまとめる）。
以上の結果より、コラゲナーゼ処理されたコラーゲン分解物（HACP-01）に対して、さらにプロテアーゼ処理を施して得られたペプチド（HACP-01-N）ではＤＰＰＩＶ阻害活性が顕著に向上していることがわかる。また、HACP-01-Nを合成吸着剤で樹脂精製したＨＡＣＰ-01-Ｎ-0、ＨＡＣＰ-01-Ｎ-20、HACP-01-Nを有機溶媒沈殿法で精製したＨＡＣＰ-01-Ｎ-ＰはＤＰＰＩＶ阻害活性が顕著に向上していることがわかる。
【００３５】
（実施例５）
HACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-SおよびHACP-01、HACP-01を合成吸着剤（SEPABEADS SP850）にて分画したエタノール濃度20％画分（HACP-01-20）、HACP-01をエタノールによる沈殿法にて分画した上清画分（HACP-01-Ｓ）をそれぞれ25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に12.5, 25, 50, 100mg/mlとなるように溶解した。
【００３６】
実施例４と同様にＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験を行った。実施例４と同様にＤＰＰＩＶ阻害率を求めたところ、その結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率はサンプル終濃度が1.25mg/mlのときHACP-01-Nで21.0%、HACP-01-N-0で37.5%、HACP-01-N-20で33.56%、 HACP-01-N-Sで35.0%、HACP-01で6.3%、HACP-01-20で25.9%、HACP-01-Ｓで30.2%であった。サンプル終濃度が2.5mg/mlのときHACP-01-Nで39.5%、HACP-01-N-0で55.5%、HACP-01-N-20で53.7%、 HACP-01-N-Sで51.8%、HACP-01で25.9%、HACP-01-20で40.5%、HACP-01-Ｓで45.7%であった。サンプル終濃度が5.0mg/mlのときHACP-01-Nで53.0%、HACP-01-N-0で67.3%、HACP-01-N-20で67.9%、 HACP-01-N-Sで66.9%、HACP-01で43.7%、HACP-01-20で55.0%、HACP-01-Ｓで53.4%であった。サンプル終濃度が10mg/mlのときHACP-01-Nで60.0%、HACP-01-N-0で76.9%、HACP-01-N-20で79.5%、 HACP-01-N-Sで73.3%、HACP-01で54.0%、HACP-01-20で63.0%、HACP-01-Ｓで58.8%であった。
【００３７】
また、近似曲線を引いてＤＰＰＩＶの活性を50％阻害するときの濃度（IC50）を求めたところ、HACP-01-Nで4.23mg/ml、HACP-01-N-0で2.13mg/ml、HACP-01-N-20で2.33mg/ml、 HACP-01-N-Sで2.37mg/ml、HACP-01で6.25mg/ml、HACP-01-20で3.94mg/ml、HACP-01-Ｓで3.77mg/mlであった（表1を参照）。
【００３８】
また、HACP-01をプロテアーゼ処理、合成吸着剤による分画あるいはエタノール沈殿法による分画をした際の出発時のHACP-01の量を100％とした場合のそれぞれの画分の回収率を求めたところ、HACP-01-Nで100%、HACP-01-N-0で36.5%、HACP-01-N-20で51.5%、 HACP-01-N-Sで49.0%、HACP-01-20で43.6%、HACP-01-Ｓで14.4%であった（表1を参照）。
表１に示すように、阻害活性の高い画分を収率よく回収できていることがわかる。例えば、ＨＡＣＰ01-Ｎ-0とＨＡＣＰ-01-Ｎ−20の回収率は合計で８８％であり、回収率が極めて高いことがわかる。
【００３９】
以上の結果から、プロテアーゼ処理、合成吸着剤による分画あるいはエタノール沈殿法による分画によりコラーゲンペプチドHACP-01のＤＰＰＩＶの阻害活性をさらに高め、かつ低分子のペプチドを多く含有する画分を得ることができる。すなわち、これらの方法で得られるペプチドは消化管にて吸収されやすいと思われる低分子であり、ＤＰＰＩＶ阻害活性も高いことから、精製前のHACP-01と比べて摂取量が少なくて済むと考えられる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（実施例６）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼP「アマノ」3G（天野エンザイム社製、Aspergillus melleus由来）、ウマミザイムG（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、45℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４２】
（実施例７）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼN「アマノ」G（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）、プロテアーゼA「アマノ」G（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）、プロテアーゼM「アマノ」G（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）、プロレザーFG-F（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、55℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４３】
（実施例８）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼS「アマノ」G（天野エンザイム社製、Bacillus stearother mophilus由来）、ブロメラインF（天野エンザイム社製、パインアップル（Ananas comosus M.由来））をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、65℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４４】
（実施例９）
実施例６〜８で得られた酵素処理ペプチド水溶液を水で2分の1濃度に希釈したサンプルを用いて、実施例4と同様にＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験を行った。実施例4と同様にＤＰＰＩＶ阻害率を求めた結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率は酵素処理していないHACP-01で23.3%、プロテアーゼPを用いて酵素処理したHACP-01で28.0%、ウマミザイムGを用いて酵素処理したHACP-01で31.0%、プロテアーゼNを用いて酵素処理したHACP-01で35.5%、プロテアーゼAを用いて酵素処理したHACP-01で29.9%、プロテアーゼMを用いて酵素処理したHACP-01で29.2%、プロレザーFG-Fを用いて酵素処理したHACP-01で31.4%、プロテアーゼSを用いて酵素処理したHACP-01で36.4%、ブロメラインFを用いて酵素処理したHACP-01で36.6%であった（図２を参照）。
図２に示す結果より、種々のプロテアーゼを用いることで、ＤＰＰＩＶの阻害活性が向上することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の製造方法により製造されたジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、哺乳動物の糖尿病予防・治療剤として使用できる。また、安全性に優れるため、食品、菓子等に有効量を配合することができる。また、これらの食品、菓子等を継続的に摂取することで糖尿病の発症を予防し得る食品、菓子等の開発も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１〜３で得られたHACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-50、HACP-01-N-100、HACP-01-N-S 、HACP-01-N-ＰおよびHACP-01を用いてＤＰＰＩＶ阻害実験を行って、分析した結果を示すグラフである。縦軸は、サンプルを含んでいない場合の活性を100とし、サンプルを添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)として相対的に表したものである。
【図２】図２は、実施例６〜８にて酵素処理したHACP-01を用いてＤＰＰＩＶ阻害実験を行って、分析した結果を示すグラフである。縦軸は、サンプルを含んでいない場合の活性を100とし、サンプルを添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)として相対的に表したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来から食材として用いられてきたコラーゲンあるいはゼラチン由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、全世界において糖尿病が爆発的に増加している。日本では糖尿病患者600万人、その予備軍は1200万人〜1500万人といわれている。糖尿病では高血糖が続くことによって血管が徐々に障害を受け、さまざまな臓器に異常が生じる。糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症が三大合併症として以前から知られているが、近年では動脈硬化症発症のリスクが高くなることも知られている。糖尿病には「膵β細胞の破壊的病変でインスリンの欠乏が生じて起こる」Ｉ型糖尿病と「膵β細胞の機能異常によるインスリン分泌能低下と肝、筋、脂肪組織等の標的臓器におけるインスリン感受性低下が併発することによって発症する」ＩＩ型糖尿病がある。昨今激増する糖尿病はＩＩ型に由来するものであり、糖尿病の90〜95%を占めていると考えられている。ＩＩ型糖尿病は「生活習慣病」といわれているように、ストレス、肥満、運動不足による基礎代謝能低下と、それに加えての高カロリー食摂取等、現代型社会生活によって引き起こされている。
【０００３】
このような糖尿病に関する研究分野において、消化管ホルモンであるインクレチンが注目されつつある。インクレチンはインスリン分泌を増強する消化管ホルモンの総称で、GIP(グルコース依存性インスリン分泌ポリペプチド(glucose-dependent insulinotropic polypeptide))やGLP-1(グルカゴン様ペプチド‐1(glucagon-like peptide-1))等が知られている。これらは、膵β細胞に発現する受容体を介したグルコース応答性インスリン分泌を促進し、食後の血糖上昇を抑制する。また、インスリン分泌促進以外に、膵β細胞の保護および増殖作用といった活性を持っている。しかしながら、インクレチンの問題点として、安定性が挙げられる。すなわち、インクレチンは体内に普遍的に存在するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）によって速やかに不活性なものへと分解され、数分間で半減してしまう。そこで、ＤＰＰＩＶ阻害剤の開発が進められている（たとえば特許文献1参照）。しかしながら、医薬品として開発されているＤＰＰＩＶ阻害剤は非天然物の化学合成物であり、摂取する際の安全性に問題がある。
【０００４】
コラーゲンは従来から食品として利用されており、コラーゲンを摂取することにより新陳代謝が促進されること（特許文献２）や頭髪の直径が太くなること（非特許文献１）、関節症治療用薬剤として利用可能なこと（特許文献３）等が報告されている。また、コラーゲンタンパクもしくはその加水分解物の経口摂取による皮膚の新陳代謝促進に関する特許（特許文献２）や生体内でのコラーゲン合成の促進に関する特許（特許文献４）も開示され、主に美容向けの健康食品が多数販売されている。
【０００５】
コラーゲンおよびその熱変性体であるゼラチンは粘性が高く凝固し易い性質を持つため、加工適性を向上させるため、タンパク質分解酵素を用いて処理したもの、あるいは酸‐塩基分解により部分加水分解処理したものを使用することが多い。また、タンパク質であるため抗原性を有し、アレルギー体質のヒトの摂取には問題がある。そのため、コラーゲンをコラゲナーゼによって、低分子化することにより抗原性をなくしアレルギー患者向けのタンパク質源あるいは輸液製剤成分としての利用が開示されている（特許文献５）。また、コラゲナーゼによるコラーゲンの分解物の生理活性については、フィブリン凝集阻害活性（特許文献６）、麻酔作用（非特許文献２）が知られている。しかしながら、コラーゲンあるいはその分解物にＤＰＰＩＶの阻害活性があるといった報告はない。
【０００６】
一方で、ペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告がいくつかある（非特許文献３〜６）。しかしながら、これらのペプチド性のＤＰＰＩＶ阻害剤は、食品由来ではないため、摂取する際の安全性の点で充分とはいえない。また、食品由来のペプチドによるＤＰＰＩＶ阻害剤に関する報告もある（特許文献７）が、コラーゲンあるいはゼラチン由来のペプチドによるＤＰＰＩＶ阻害に関する報告はない。
【特許文献１】特許第３６８１１１０号号公報
【特許文献２】特開平７−２７８０１２号公報
【特許文献３】特開昭６３−３９８２１号公報
【特許文献４】特許第３８０２７２１号号公報
【特許文献５】特開平７−８２２９９号公報
【特許文献６】特開平６−４６８７５号公報
【特許文献７】特開２００７−０３９４２４号公報
【非特許文献１】Nutrition Reports International,13巻,579頁,1976年
【非特許文献２】Br.J.Pharmacol.,69巻,551頁,1980年
【非特許文献３】Arch.Biochem.Biophys., 218巻,156頁, 1982年
【非特許文献４】Biochem.J., 252巻,723頁, 1988年
【非特許文献５】Biol.Chem.Hoppe-Seyler., 372巻, 305頁, 1991年
【非特許文献６】J.Antibiot., 37巻, 422頁, 1984年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、阻害活性が高くかつ安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、安全性の観点から、食材として用いられているコラーゲンあるいはゼラチン由来のペプチドに着目し、研究を行った結果、コラーゲンあるいはゼラチン由来のＤＰＰＩＶ阻害剤の製造方法を見出し、本発明の完成に至った。すなわち、本発明は、以下から構成される。
〔１〕コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔２〕プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程を有する、前記〔１〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔３〕プロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上である、前記〔１〕または〔２〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔４〕有機溶媒沈殿法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物をエタノールと混合し、沈殿画分と上清画分を分離して上清画分を回収する工程である、前記〔２〕または〔３〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
〔５〕樹脂精製法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を合成吸着剤に吸着させて、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水により溶出する画分を回収する工程である、前記〔２〕または〔３〕記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の製造方法によって製造されたＤＰＰＩＶ阻害剤は、ＤＰＰＩＶに対して高い阻害活性を有し、かつ、コラーゲン、ゼラチン等の食品由来のため安全性が高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の製造方法は、コラゲナーゼ処理されたコラーゲンやゼラチン由来の分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する点に特徴があり、かかる特徴を有することで、活性が高く安全性に優れたＤＰＰＩＶ阻害剤を製造することができる。
【００１１】
原料となるコラーゲンは、特に限定されず、Ｉ型からXIII型のコラーゲンのいずれをも用いることが可能であり、これらの混合物である混合型のコラーゲンを用いることもできる。現実的には、コラーゲンは、各種の動物や魚類から得られる、混合型のコラーゲンを用いることが想定されるが、このコラーゲンの出所となる動物（例えば、牛、豚等）や魚類（例えば、ヒラメ、サケ、イワシ、マグロ等）の種類や、コラーゲンの抽出部位も、骨、皮、腱、ウキブクロ（魚類）等が可能である。
【００１２】
これらの成分からのコラーゲンの抽出・精製は、通常公知の方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、骨、皮、腱、ウキブクロ等のコラーゲンを含有する組織を粉砕した後、水洗、希塩溶液による抽出、酸あるいはアルカリ溶液による抽出、ペプシン，トリプシンやヒアルロニダーゼ等の酵素による抽出を行い、塩析や透析等の公知の精製手段を施して、コラーゲンを精製して得ることができる。また、通常公知の方法により、「再生コラーゲン」として得ることも可能である。また、市販のコラーゲンを、原料として用いることも可能である。
【００１３】
そして、ゼラチンは、上述のコラーゲンを、水で加熱抽出して得られる水溶性タンパク質である。本発明においては、通常公知の方法により製造したゼラチンを原料として用いることも可能であり、市販品を用いることも可能である。
【００１４】
本発明に用いるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、上述のようにして得られるコラーゲンまたはゼラチンに、コラゲナーゼを作用させて製造することができる。
【００１５】
コラゲナーゼとしては、特に限定されないが、クロストリジウム・ヒストリティカム（Clostridium histolyticum）、ストレプトミセス・パルブラス（Streptomyces parvulus）等の細菌、放線菌または真菌等由来で、コラーゲン特有のアミノ酸配列〔（Ｇｌｙ−Ａ−Ｂ）n（式中、Ａ，Ｂは、グリシン残基を除くアミノ酸残基を表し、互いに同一であっても、異なってもよく、ｎは、正の整数を表す）：以下、このアミノ酸配列を、「特有アミノ酸配列」ともいう）〕のグリシン残基のアミノ基末端側を、特異的に切断するコラゲナーゼを用いることで、この特有アミノ酸配列のペプチドを豊富に含むコラゲナーゼ分解物を得ることが可能であり、好ましい。また、ここで用いるコラゲナーゼは、天然物として得られるコラゲナーゼは勿論のこと、例えば、タンパク工学的な手法で改変して得られる、上記の特異性を有する改変コラゲナーゼであってもよい。
【００１６】
上記のＡ，Ｂが採り得る、グリシン残基を除くアミノ酸残基の種類は、特に限定されず、通常は、天然に存在するアミノ酸（グリシンを除く）のアミノ酸残基、具体的には、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、メチオニン残基、セリン残基、トレオニン残基、システイン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、チロシン残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基のいずれのアミノ酸残基であってもよい。
【００１７】
また、本発明に用いられるコラーゲンまたはゼラチンの分解物は、通常公知の方法、例えば、特開平７−８２２９９号公報や特開平９−１７６１９６号公報に記載されている方法に準じて、遊離またはキトバール等の固定化担体に固定化されたコラゲナーゼを、バッチ法、カラム法またはこれらの方法を組み合わせ、好ましくは、反応温度を４０〜４５℃に設定して、前記コラーゲンまたはゼラチンと接触させることで製造することができる。
【００１８】
また、コラゲナーゼ分解物として市販品、例えば、商品名コラーゲン・トリペプチドHACP（ゼライス社製）等を用いることも可能である。
【００１９】
本発明の製造方法では、上述の方法に従い製造したまたは市販されているコラゲナーゼ分解物を、プロテアーゼを用いて分解することによって、ＤＰＰＩＶ阻害活性を高めることができる。
【００２０】
プロテアーゼとしては、特に限定されないが、微生物由来及び植物由来のものが挙げられる。例えば、バチルス属（バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ステアロザー・モフィルス（Bacillus stearother mophilus）等）、アスペルギルス属（アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus）等）等の細菌、放線菌または真菌等由来のプロテアーゼ、パインアップル（Ananas comosus)由来のプロテアーゼ等を用いると、阻害活性を高めたＤＰＰＩＶ阻害剤を効率的に得ることができるので好ましい。中でも、阻害活性向上作用が高い観点から、バチルス属由来、アスペルギルス属由来およびパインアップル由来のプロテアーゼがより好ましい。
なお、前記プロテアーゼは粗製品であっても、精製されたものであってもよい。又、これらの酵素を生産する菌体も利用できる。
【００２１】
前記プロテアーゼ処理の条件は、プロテアーゼの特性に合せて適宜選択すればよい。処理時間については、特に限定はない。なお、プロテアーゼ処理は、加熱等により酵素を失活させることで終了させることができる。
【００２２】
前記プロテアーゼ処理で得られたプロテアーゼ分解物は、そのまま公知の手段でろ過、濃縮等の処理を施すことでＤＰＰＩＶ阻害剤として使用することができるが、さらに各種の精製方法に供することで、ＤＰＰＩＶの阻害活性をより高めた画分を得ることもできる。中でも、収率よく高活性のＤＰＰＩＶ阻害剤が得られる観点から、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製することが好ましい。
【００２３】
前記有機溶媒沈殿法で使用する有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。また、これらの有機溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよく、有機溶媒と水あるいは酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、エタノール水溶液を用いて精製するのが好ましい。
【００２４】
前記有機溶媒沈殿法として、前記有機溶媒中に前記プロテアーゼ分解物を混合し、沈殿画分と上清画分を分離して、上清画分を回収することで阻害活性の高いＤＰＰＩＶ阻害剤を得ることができる。沈殿画分と上清画分とが分離するまでは有機溶媒混合物を静置することが好ましい。なお、静置温度は低温で行うことが好ましい。
また、回収した上清画分は減圧または限外ろ過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。
【００２５】
前記樹脂精製法で使用する樹脂としては、例えば、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、多孔性樹脂、特殊樹脂（キレート樹脂、合成吸着剤、蛋白分離剤）等が挙げられるが、回収した画分の脱塩処理工程が不要であることから、合成吸着剤を用いるのが好ましい。
前記合成吸着剤としては、例えば、芳香族（スチレン‐ビニルベンゼン）系、芳香族系修飾型、アクリル（メタクリル）系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
前記樹脂精製法において、ＤＰＰＩＶ阻害剤を含むプロテアーゼ分解物の前記樹脂への吸着は、公知の手法により行えばよい。次いで、吸着したプロテアーゼ分解物の溶離には、酸、アルカリまたは種々の有機溶媒、たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。また、これらの有機溶媒は単独または２種類以上を混合して用いてもよく、これらと水あるいは酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水を用いて溶離するのが好ましい。前記樹脂精製法は、バッチ法あるいはカラム法にて行うことができる。回収した画分は減圧または限外ろ過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。
【００２７】
以上のようにして得られたＤＰＰＩＶ阻害剤は、安全性に優れたものであり、しかもコラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物に比べて、高いＤＰＰＩＶ阻害活性を有する。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
【００２９】
（実施例１）
コラゲナーゼ分解物をプロテアーゼ処理によりさらに分解した。コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）50gとプロテアーゼN「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）0.5gを水に溶解し、55℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、80℃以上で30分間加熱して酵素を失活させた。この酵素処理溶液の一部を凍結乾燥し、ペプチド粉末（プロテアーゼ分解物：HACP-01-N）を得た。
【００３０】
（実施例２）
プロテアーゼ分解物を合成吸着剤を用いたカラム法により分画した。実施例1で得られた酵素処理溶液50mlを合成吸着剤SEPABEADS SP850（三菱化学社製）25gを充填したオープンカラムに流し、水、エタノール濃度20％水溶液、エタノール濃度50％水溶液、エタノールをそれぞれ150ml流して、各画分（HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、HACP-01-N-50、HACP-01-N-100）を回収し、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノールを除去した後、凍結乾燥を行ってペプチド粉末を得た。
【００３１】
（実施例３）
プロテアーゼ分解物をエタノールを用いた沈殿法により分画した。実施例1で得られた酵素処理溶液30mlとエタノール170mlをよく混合し、4℃で一晩静置した後、10,000rpm、４℃で5分間遠心した。上清および沈殿画分（HACP-01-N-S、 HACP-01-N-P）を回収し、減圧下のロータリーエバポレーターで濃縮し、エタノールを除去した後、凍結乾燥してペプチド粉末を得た。
【００３２】
（実施例４）
実施例１〜３で得られたペプチドのＤＰＰＩＶ阻害活性を調べた。HACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-50、HACP-01-N-100、HACP-01-N-S 、HACP-01-N-ＰおよびHACP-01をそれぞれ25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に20mg/mlとなるように溶解した。
【００３３】
ＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験は以下の方法に従った。25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）20μl、バッファーもしくはサンプル溶液5μl、希釈したＤＰＰＩＶ溶液（1ng/μl）5μlを混合し、室温で5分間インキュベートした。酵素反応開始は25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に溶かした基質溶液（0.25mMのグリシルプロリン−４−メチルクマリル−７−アミド（Gly-Pro-MCA））を20μl添加することによって行った。室温で20分間反応後、96ウェルプレート対応蛍光検出器（フルオロスキャンアセント：サーモエレクトロン社製）で、ＤＰＰＩＶによって遊離される7−アミノ−4−メチルクマリン（AMC）量を測定した。なお、励起波長は390nm、測定波長460nmで行った。対照区はＤＰＰＩＶ溶液の代わりに25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）を用いて同様に行った。
【００３４】
ＤＰＰＩＶ阻害率の計算は、サンプル溶液を含んでいない場合の活性を100とし、ペプチド溶液を添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)とした。サンプル自体の擬似阻害効果を補正して阻害率を求めた。その結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率はサンプル終濃度が2.0mg/mlのときHACP-01-Nで32.3%、HACP-01-N-0で50.5%、HACP-01-N-20で48.5%、HACP-01-N-50で16.9%、 HACP-01-N-100で19.9%、HACP-01-N-Sで55.7%、HACP-01-N-Pで25.5%、HACP-01で16.0%であった（結果を図１にまとめる）。
以上の結果より、コラゲナーゼ処理されたコラーゲン分解物（HACP-01）に対して、さらにプロテアーゼ処理を施して得られたペプチド（HACP-01-N）ではＤＰＰＩＶ阻害活性が顕著に向上していることがわかる。また、HACP-01-Nを合成吸着剤で樹脂精製したＨＡＣＰ-01-Ｎ-0、ＨＡＣＰ-01-Ｎ-20、HACP-01-Nを有機溶媒沈殿法で精製したＨＡＣＰ-01-Ｎ-ＰはＤＰＰＩＶ阻害活性が顕著に向上していることがわかる。
【００３５】
（実施例５）
HACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-SおよびHACP-01、HACP-01を合成吸着剤（SEPABEADS SP850）にて分画したエタノール濃度20％画分（HACP-01-20）、HACP-01をエタノールによる沈殿法にて分画した上清画分（HACP-01-Ｓ）をそれぞれ25mMのトリス‐塩酸バッファー（pH 8.0）に12.5, 25, 50, 100mg/mlとなるように溶解した。
【００３６】
実施例４と同様にＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験を行った。実施例４と同様にＤＰＰＩＶ阻害率を求めたところ、その結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率はサンプル終濃度が1.25mg/mlのときHACP-01-Nで21.0%、HACP-01-N-0で37.5%、HACP-01-N-20で33.56%、 HACP-01-N-Sで35.0%、HACP-01で6.3%、HACP-01-20で25.9%、HACP-01-Ｓで30.2%であった。サンプル終濃度が2.5mg/mlのときHACP-01-Nで39.5%、HACP-01-N-0で55.5%、HACP-01-N-20で53.7%、 HACP-01-N-Sで51.8%、HACP-01で25.9%、HACP-01-20で40.5%、HACP-01-Ｓで45.7%であった。サンプル終濃度が5.0mg/mlのときHACP-01-Nで53.0%、HACP-01-N-0で67.3%、HACP-01-N-20で67.9%、 HACP-01-N-Sで66.9%、HACP-01で43.7%、HACP-01-20で55.0%、HACP-01-Ｓで53.4%であった。サンプル終濃度が10mg/mlのときHACP-01-Nで60.0%、HACP-01-N-0で76.9%、HACP-01-N-20で79.5%、 HACP-01-N-Sで73.3%、HACP-01で54.0%、HACP-01-20で63.0%、HACP-01-Ｓで58.8%であった。
【００３７】
また、近似曲線を引いてＤＰＰＩＶの活性を50％阻害するときの濃度（IC50）を求めたところ、HACP-01-Nで4.23mg/ml、HACP-01-N-0で2.13mg/ml、HACP-01-N-20で2.33mg/ml、 HACP-01-N-Sで2.37mg/ml、HACP-01で6.25mg/ml、HACP-01-20で3.94mg/ml、HACP-01-Ｓで3.77mg/mlであった（表1を参照）。
【００３８】
また、HACP-01をプロテアーゼ処理、合成吸着剤による分画あるいはエタノール沈殿法による分画をした際の出発時のHACP-01の量を100％とした場合のそれぞれの画分の回収率を求めたところ、HACP-01-Nで100%、HACP-01-N-0で36.5%、HACP-01-N-20で51.5%、 HACP-01-N-Sで49.0%、HACP-01-20で43.6%、HACP-01-Ｓで14.4%であった（表1を参照）。
表１に示すように、阻害活性の高い画分を収率よく回収できていることがわかる。例えば、ＨＡＣＰ01-Ｎ-0とＨＡＣＰ-01-Ｎ−20の回収率は合計で８８％であり、回収率が極めて高いことがわかる。
【００３９】
以上の結果から、プロテアーゼ処理、合成吸着剤による分画あるいはエタノール沈殿法による分画によりコラーゲンペプチドHACP-01のＤＰＰＩＶの阻害活性をさらに高め、かつ低分子のペプチドを多く含有する画分を得ることができる。すなわち、これらの方法で得られるペプチドは消化管にて吸収されやすいと思われる低分子であり、ＤＰＰＩＶ阻害活性も高いことから、精製前のHACP-01と比べて摂取量が少なくて済むと考えられる。
【００４０】
【表１】
【００４１】
（実施例６）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼP「アマノ」3G（天野エンザイム社製、Aspergillus melleus由来）、ウマミザイムG（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、45℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４２】
（実施例７）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼN「アマノ」G（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）、プロテアーゼA「アマノ」G（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）、プロテアーゼM「アマノ」G（天野エンザイム社製、Aspergillus oryzae由来）、プロレザーFG-F（天野エンザイム社製、Bacillus subtilis由来）をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、55℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４３】
（実施例８）
コラーゲンペプチドHACP-01（ゼライス社製、コラゲナーゼ分解物）水溶液各1ml（50mg/ml）に、プロテアーゼS「アマノ」G（天野エンザイム社製、Bacillus stearother mophilus由来）、ブロメラインF（天野エンザイム社製、パインアップル（Ananas comosus M.由来））をそれぞれ0.5mg/mlとなるように加え、65℃で1時間加熱し酵素処理を行った後、100℃で30分間加熱して酵素を失活させた。これらの水溶液を15,000rpmで5分間遠心した後、上清を0.22μmのフィルターでろ過して、酵素処理ペプチド水溶液を得た。
【００４４】
（実施例９）
実施例６〜８で得られた酵素処理ペプチド水溶液を水で2分の1濃度に希釈したサンプルを用いて、実施例4と同様にＤＰＰＩＶに対する活性阻害実験を行った。実施例4と同様にＤＰＰＩＶ阻害率を求めた結果、各サンプルのＤＰＰＩＶ阻害率は酵素処理していないHACP-01で23.3%、プロテアーゼPを用いて酵素処理したHACP-01で28.0%、ウマミザイムGを用いて酵素処理したHACP-01で31.0%、プロテアーゼNを用いて酵素処理したHACP-01で35.5%、プロテアーゼAを用いて酵素処理したHACP-01で29.9%、プロテアーゼMを用いて酵素処理したHACP-01で29.2%、プロレザーFG-Fを用いて酵素処理したHACP-01で31.4%、プロテアーゼSを用いて酵素処理したHACP-01で36.4%、ブロメラインFを用いて酵素処理したHACP-01で36.6%であった（図２を参照）。
図２に示す結果より、種々のプロテアーゼを用いることで、ＤＰＰＩＶの阻害活性が向上することがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の製造方法により製造されたジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、哺乳動物の糖尿病予防・治療剤として使用できる。また、安全性に優れるため、食品、菓子等に有効量を配合することができる。また、これらの食品、菓子等を継続的に摂取することで糖尿病の発症を予防し得る食品、菓子等の開発も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１〜３で得られたHACP-01-N、HACP-01-N-0、HACP-01-N-20、 HACP-01-N-50、HACP-01-N-100、HACP-01-N-S 、HACP-01-N-ＰおよびHACP-01を用いてＤＰＰＩＶ阻害実験を行って、分析した結果を示すグラフである。縦軸は、サンプルを含んでいない場合の活性を100とし、サンプルを添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)として相対的に表したものである。
【図２】図２は、実施例６〜８にて酵素処理したHACP-01を用いてＤＰＰＩＶ阻害実験を行って、分析した結果を示すグラフである。縦軸は、サンプルを含んでいない場合の活性を100とし、サンプルを添加した場合の活性を100から差し引いた分を阻害率(％)として相対的に表したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項２】
プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程を有する、請求項１記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項３】
プロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１または２記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項４】
有機溶媒沈殿法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を有機溶媒と混合し、沈殿画分と上清画分を分離して上清画分を回収する工程である、請求項２または３記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
樹脂精製法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を合成吸着剤に吸着させて、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水により溶出する画分を回収する工程である、請求項２または３記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項１】
コラゲナーゼ処理されたコラーゲンまたはゼラチンの分解物をプロテアーゼ処理する工程を有する、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項２】
プロテアーゼ処理後に得られたプロテアーゼ分解物を、有機溶媒沈殿法あるいは樹脂精製法のいずれかもしくは両方を組み合わせて精製する工程を有する、請求項１記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項３】
プロテアーゼがバチルス属由来プロテアーゼ、アスペルギルス属由来プロテアーゼおよびパインアップル由来プロテアーゼからなる群より選ばれる１種以上である、請求項１または２記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項４】
有機溶媒沈殿法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を有機溶媒と混合し、沈殿画分と上清画分を分離して上清画分を回収する工程である、請求項２または３記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
樹脂精製法を用いる精製工程が、プロテアーゼ分解物を合成吸着剤に吸着させて、濃度５０％未満のエタノール水溶液または水により溶出する画分を回収する工程である、請求項２または３記載のジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２８４７９８（Ｐ２００９−２８４７９８Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３９７９７（Ｐ２００８−１３９７９７）
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２８日（２００８．５．２８）
【出願人】（３９００２０１８９）ユーハ味覚糖株式会社 (242)
【Ｆターム（参考）】
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