セルロースの酵素加水分解のための上向流沈殿反応器
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法が提供される。該方法は、加水分解反応器の底部で前処理されたセルロース原料の水性スラリーを注入することを含む。非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、混合を避け１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持することにより、反応器中の軸方向分散は制限される。セルラーゼ酵素は、注入の段階の前または該段階中に、水性スラリーに添加される。加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流は、加水分解反応器から除去される。該方法で使用するためセルラーゼ酵素および凝集剤を含む酵素組成物も提供される。さらに、セルラーゼ酵素および凝集剤を含むキットが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース原料の転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、効率性を改善したセルロース原料の酵素転化の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
燃料エタノールは現在、コーンスターチ、サトウキビおよびサトウダイコンなどの原料から生産される。しかしながらこれらの原料からのエタノールの生産は、それらの穀物の生産に適した農地の限界および人間と動物の食物連鎖の利益の競合により、これ以上大きく拡大することはできない。最終的に、転化過程において二酸化炭素およびその他の生成物の放出を伴う化石燃料の使用は、それらの原料の使用の有害な環境に対する影響である。
【０００３】
農業廃棄物、草および林業廃棄物などのセルロースを含む原料からエタノールを生産する可能性は、それらの安価な原料を大量に利用可能であること、セルロース廃棄物の燃焼または埋立てを避けるのが望ましいこと、およびエタノールがガソリンに比較して燃料として清浄であることにより大きく注目されてきた。さらにセルロース転化過程の副産物であるリグニンは、セルロース転化過程を促進する燃料として使用することができ、それにより化石燃料の使用が避けられる。研究は、サイクル全体を考慮すると、セルロースから生産されるエタノールの使用による温室効果ガスの発生がほぼ零であることを示している。
【０００４】
エタノール生産のため使用することができるセルロース原料は、（１）トウモロコシ茎葉、コムギわら、オオムギわら、エンバクわら、エンバク殻、カノーラわらおよびダイズ茎葉などの農業廃棄物、（２）スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、ミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）およびクサヨシなどの草、（３）ポプラ木材およびおがくずなどの林業廃棄物、ならびに（４）残渣（バガス）およびビート・パルプなどの砂糖加工の残留物草を含む。
【０００５】
セルロースは、セルロース原料の２番目に主要な成分であるヘミセルロースと同様、分解に対し非常に耐性がある結晶構造からなる。セルロース繊維からエタノールへの転化は、以下を必要とする：１）リグニンからセルロースおよびヘミセルロースを遊離させること、またはセルロース原料内のセルロースおよびヘミセルロースのセルラーゼ酵素への接近可能性を増加させること、２）糖を解放するためヘミセルロースおよびセルロース炭水化物ポリマーを解重合すること、ならびに３）混合されたヘキソースおよびペントース糖を発酵させエタノールとすること。
【０００６】
セルロースを糖に転化するために使用されるよく知られた方法には、セルロースをグルコースに加水分解するのに十分な温度、酸濃度および時間の長さでの蒸気および酸の使用を伴う酸加水分解法がある（グレスレイン（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎ）、１９７８年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９６−３０８）。次にグルコースは、酵母を使用して発酵させエタノールとし、エタノールは、蒸留により回収され純化される。
【０００７】
セルロース加水分解の代替的な方法は、酸による前加水分解（または前処理）とそれに続く酵素加水分解である。この順序においてセルロース材料はまず、上記で説明した酸加水分解法を使用して、しかしより穏やかな温度、酸濃度および処理時間で前処理される。この前処理方法は、次の酵素転化段階のためのセルロース繊維内のセルロースの接近可能性を増大させるが、セルロースのグルコース自体への転化をほとんどもたらさない。次の段階において、前処理された原料は適切な温度およびｐＨに調整され、次にセルラーゼ酵素による酵素転化にかけられる。
【０００８】
酸によるかセルラーゼ酵素によるかを問わず、セルロースの加水分解の後に糖が発酵によりエタノールとなり、次にエタノールが蒸留により回収される。
【０００９】
セルロース材料からの糖へのセルロースの効率的な転化およびそれに続く糖のエタノールへの発酵は、商業的可能性に関して大きな課題に直面している。特に、酸による予備加水分解は、大量の酸を必要とする。洗浄された硬材などの清浄な原料にとって、硫酸の必要量は、原料の乾燥重量の０．５％から１％である；土壌からの高水準の二酸化珪素、塩およびアルカリ・カリウム化合物を含む可能性がある農業繊維にとって、酸必要量は約１０倍、原料の５重量％から７重量％に達する可能性がある。このことは、方法に著しい費用を加える。前加水分解法において大量の酸を使用する２つ目の不利益は、セルラーゼ酵素を用いた酵素加水分解の前に、酸性化した原料を約４．５と約５の間のｐＨ（ペーハー）まで中和しなければならないことである。酸性化した原料を中和するために使用される苛性ソーダの量は、原料を酸性化するために使用される酸の量に比例する。従って、高度の酸の使用は高度の苛性ソーダの使用をもたらし、これはさらに、セルロース原料をエタノールに加工する費用を増大させる。さらに、前処理にもかかわらずセルロースは加水分解に対し依然として耐性を有するままであり、このことは必要となる酵素投与量を増大させるため、酵素加水分解の費用は高額である。該必要量の増大は、加水分解の時間（９０−２００時間）を増大させることにより解消することができるが、今度は非常に大きな反応器を必要とし、これがまた全体の費用に加わる。
【００１０】
高水準のセルロース転化を維持しながら酵素投与量を減少させる方法が、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）である。この種類のシステムにおいて、酵素加水分解は、反応容器中のグルコースのエタノールへの酵母発酵と同時に行われる。ＳＳＦの間、酵母は、グルコースをエタノールに発酵させることにより反応器からグルコースを除去し、このことは、グルコースによるセルラーゼの阻害を減少させる。しかしながら、セルラーゼ酵素は、なおエタノールにより阻害される。ＳＳＦは、通常３５−３８℃の温度で行われ、これは、セルラーゼにとっての最適条件の５０℃と酵母にとっての最適条件の２８℃との間の中間である。この中間の温度は、セルラーゼ酵素と酵母の両方による標準以下の性能をもたらす。従って、非能率的な触媒作用は、非常に長い反応時間と非常に巨大な反応容器を必要とし、両方とも高価である。
【００１１】
より高い容量生産性のための方法は、アメリカ特許第５，２５８，２９３号で開示されている（リンド）。この方法は、反応容器中に継続的に注入される微生物に加えてリグノセルロース原料を利用する。流体は反応容器の底部からも継続的に添加されるが、スラリーの機械的な攪拌は行われない。反応が進行するにつれて、消化されつつあるリグノセルロース原料は、空間的に不均質な層に蓄積する傾向がある一方、エタノール生成物は、最上部の層に上昇し、そこで除去される。不溶性の基質は、底部の層に蓄積し、容器から回収することができる。この配置は、発酵基質の特異な滞留をもたらし、これにより反応容器中の滞留時間の増大の余地がある。
【００１２】
Ｕ．Ｓ．５，８３７，５０６（リンド）で開示されたもう１つの方法において、エタノールは、断続的に攪拌され恒常的に原料が供給されるバイオリアクタを使用して生産される。リグノセルローススラリーおよび微生物が、反応器に添加される；混合物は次いで、特定の時間間隔で、機械的な手段または流体再循環のいずれかにより攪拌され、その後沈殿することが可能となる。エタノールは次いで、反応器の最上部から除去され、追加の基質が添加され、循環が継続する。同様の方法において、Ｋｌｅｉｊｎｔｊｅｎｓおよびその他（１９８６年、バイオテクノロジー・レターズ、８：６６７−６７２）は、Ｃ・サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の存在下でセルロースを含む基質を発酵させるために上向流反応器を利用している。基質スラリーは沈殿し、凝集した繊維の層を形成し、これは、緩慢な機械的攪拌により加速する。基質が定期的に添加される一方で、液体が継続的に反応器に供給される。エタノール生成物は最上部の層に蓄積し、そこで反応器から除去される。Ｕ．Ｓ．５，８３７，５０６、Ｕ．Ｓ．５，２５８，２９３ならびにＫｌｅｉｊｎｔｊｅｎｓおよびその他で開示された方法は、反応容器中の原料の滞留時間の増加をもたらす。しかしながら、３つの全ての方法は、ＳＳＦ法の不利益を被る。
【００１３】
Ｕ．Ｓ．５，３４８，８７１；Ｕ．Ｓ．５，５０８；１８３、Ｕ．Ｓ．５，２４８，４８４；およびＵ．Ｓ．５，６３７，５０２（スコット）は、攪拌された反応容器と関連した磨砕機の使用により、酵素加水分解における転化効率を改善する方法を教えている。攪拌器は、セルロース原料中の固体粒子の粒経縮小のための高剪断領域を作り出し、これがセルラーゼ酵素のための新しい表面積を継続的に提供する。これにより反応効率が増大し、酵素必要量が減少する。しかしながら、高剪断はしばしば、酵素を不活性化する。さらに、磨砕装置の費用は、酵素投与量の減少による節約額よりもはるかに大きい。
【００１４】
Ｕ．Ｓ．５，８８８，８０６およびＵ．Ｓ．５，７３３，７５８（グエン（Ｎｇｕｙｅｎ））は、交互に混合および非混合の領域からなるタワー型加水分解反応器を使用し、それにより混合の動力消費および費用を減少させる代替的な方法を教えている。スラリーは、反応器を通じて栓流中を上部に移動し、混合領域において断続的に混合され、それにより液体のチャネリングが妨げられ、均一な熱および物質の移動が確保される。Ｕ．Ｓ．５，８８８，８０６およびＵ．Ｓ．５，７３３，７５８で開示された方法は剪断および酵素の変性を減少させる一方、混合装置の費用は実質的である。さらに、酵素の動的性能は、バッチ加水分解方式で達成できるのと同程度である。
【００１５】
現在のところ、費用の低下を維持しながら高い転化効率を達成するには、多大の技術的な困難が存在する。酵素の投与量を増大させることによる費用の増加を防ぐため加水分解の回数を増やすことは、より大きな反応器を必要とし、これが今度は装置の費用を増大させる。加水分解中の原料の混合および断続的な混合は、酵素の効率を増加させ得るが、装置の費用はさらに増加し、剪断力は酵素の変性をもたらす。他のシステムは、最適な酵素の活性を弱め、酵素の効率を減少させる。
【００１６】
発明の要約
本発明は、セルロース原料の生成物への転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、効率性を改善したセルロース原料の酵素転化の方法に関する。
【００１７】
本発明に従って、セルロースの酵素加水分解のための上向流沈殿反応器が提供される。
【００１８】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法も提供し、該方法は以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００１９】
本発明は、注入の段階（段階ｉｉ）において、水性スラリーが、均一な放射状分布で加水分解反応器の底部に注入される、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法に関する。
【００２０】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、一つまたは複数の凝集剤が、セルラーゼ酵素とは別に、もしくはセルラーゼ酵素とともに、またはそれらの組合せにより水性スラリーに添加される、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法を指向する。さらに、一つまたは複数の凝集剤は、注入の段階（段階ｉｉ）の前もしくは該段階中に、またはそれらの組合せにより、添加することができる。
【００２１】
本発明は、提供の段階（段階ｉ）において、スラリーが約５重量％から約２０重量％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が、約２５重量％から約７０重量％のセルロースを含む、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法に関する。
【００２２】
本発明は、前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、上記で説明した方法を指向する。さらに、前処理されたセルロース原料は、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で約３秒から約３０分間の前処理にかけられていてもよい。酸は、硫酸、亜硫酸および二酸化硫黄からなる群から選択することができる。選択的に、糖を含む液体流は、注入の段階（段階ｉｉ）の前に、前処理されたセルロース原料から分離することができる。液体流は、濾過、遠心分離、洗浄などの方法または当技術分野で知られているであろう、その他の適切な方法を使用して、原料から分離することができる。洗浄が分離のために使用される場合、洗浄は、水、再利用されたプロセス流、処理された流出物などの適切な洗浄媒体またはそれらの組合せを使用して行うことができる。
【００２３】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、上記で説明した方法も提供する。
【００２４】
さらに本発明は、除去の段階（段階ｉｖ）において、少なくとも一部の加水分解生成物の流れが、非混合の加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、上記で説明した方法を提供する。加水分解生成物および非加水分解固体は、別の場所で浄化器領域から除去することができる。代替的に、少なくとも一部の加水分解生成物の流れは、固体−液体分離器を使用して、非加水分解固体から分離される。
【００２５】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素が、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを生産するよう選択される、上記で説明した方法を指向する。
【００２６】
本発明は、提供の段階（段階ｉ）において、スラリーのｐＨが約４．０から約６．０、好ましくは約４．５から約５．５に調整される、上記で説明した方法も提供する。さらに温度は、約４５℃から約７０℃、好ましくは約４５℃から約６５℃でもよい。
【００２７】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において一つまたは複数の凝集剤が使用される、上記で説明した方法に関する。凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、例えばポリアクリルアミド、だがこれに限定されないカチオン性ポリマーである。凝集剤は、固体１トンあたり約０．１から約４ｋｇの投与量で添加することができる。
【００２８】
本発明は、平均スラリー流速が、１時間あたり約０．１と約１２フィートの間、より好ましくは１時間あたり約０．１と約４フィートの間である、上記で説明した方法にも関する。
【００２９】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物も提供する。好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される。さらに、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。
【００３０】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も指向する。
【００３１】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するセルロースの酵素加水分解のためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も指向し、該酵素組成物の使用は、以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３２】
好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産され、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。
【００３３】
本発明では、加水分解は以下により行われる、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物も提供する：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；および
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３４】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためにセルロースを加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤ならびに指示からなるキットを提供し、該指示は以下からなる。
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素混合物および一つまたは複数の凝集剤を水性スラリーに添加すること；ならびに、
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３５】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためにセルロースを加水分解するにあたり使用するための酵素組成物を調製する方法も提供し、該方法は、植物、菌または微生物の入手源から一つまたは複数のセルラーゼ酵素を獲得すること、および酵素組成物を生産するためセルラーゼ酵素と一つまたは複数の凝集剤を組み合わせることからなる。
【００３６】
本発明は、セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）により生産される、上記で説明した酵素組成物を調製する方法も提供する。
【００３７】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムを提供し、該システムは、上向流加水分解反応器への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管、上向流加水分解反応器と流体連通状態にある固体−液体分離器を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物は、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該上向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該上向流加水分解反応器の両方は、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含む。
【００３８】
本発明は、原料供給配管が、使用されるときに、前処理された原料を含む、上記で説明したシステムも提供する。固体−液体分離器は、沈殿タンク、浄化器、浄化器領域、遠心分離機または濾過器でもよい。システムが使用されるとき、セルラーゼ酵素は、前処理された原料のセルロース１グラムあたり、約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在してもよく、一つまたは複数の凝集剤は、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在してもよい。
【００３９】
本書中で説明するように、上向流沈殿反応器内のセルロースの加水分解の作用は、一つまたは複数の凝集剤の添加により向上させることができる。凝集剤は、セルロース固体の大きさを増大させ、それにより、セルロース固体の沈殿の速度を増大させる。このことは、より長い時間反応器中に固体を保持するのに役立ち、それにより、セルロースの転化の程度を増大させる。さらに、本書中で説明する方法は、加水分解タンク内において回転翼、ポンプまたは同種のものの使用によるスラリーの激しい混合が要求されないという点で混合が不在の加水分解反応器内における原料スラリーの加水分解を提供する。
【００４０】
上向流沈殿加水分解反応器の使用は、先行技術の欠点のいくつかに対処する。本発明は、セルロースの酵素加水分解の効率を改善する。このことは、セルロースのグルコースへの転化の程度の向上をもたらす。代替的に、上向流沈殿反応器は、従来の加水分解システムよりも低いセルラーゼ酵素の必要量をもたらす。改善された酵素加水分解は、加水分解反応器内のスラリーの混合の費用なしに、またシステムに激しい剪断を加えることなしに達成される。上向流加水分解反応器の使用に伴う改善は、凝集剤の使用により向上させることができる。
【００４１】
図の簡単な説明
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴は、添付された図を参照する以下の説明からより一層明らかとなる：
【００４２】
図１は、本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図を示す。図１Ａは、上向流反応器および沈殿タンクを含むシステムを示す。図１Ｂは、図１Ａの上向流反応器を示す。図１Ｃは、上向流反応器が浄化器領域を含む場合のシステムの一部を示す。
【００４３】
図２は、凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【００４４】
図３は、凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでのサンプリングにより測定されたセルロース転化の百分率を示す。
【００４５】
図４は、凝集剤がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【００４６】
図５は、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた、転化されたセルロースの量を示す。
【００４７】
図６は、凝集剤がない場合と比較して、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内から出た生成物におけるセルロース転化の効率の増加を示す。
【００４８】
好ましい実施形態の説明
本発明は、セルロース原料の生成物への転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、セルロース原料の酵素転化のための効率を改善した方法に関する。
【００４９】
以下の説明は、実施例のみによる好ましい実施形態に関するものであり、本発明を実施するために必要な特徴の組合せに限定されない。
【００５０】
本発明は、セルロースを、例えばグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せ、だがそれらに限定されない生成物に分解するためのセルロースの酵素転化の方法に関する。本発明の１つの態様において、該方法は、非混合の加水分解反応器において上方へセルラーゼとともにセルロース水性スラリーを汲み上げることを含む。スラリーの上昇速度は緩慢であり、その結果固体粒子は、スラリー本体よりも密度が高く、液体よりも緩慢に上方に流れる傾向がある。セルラーゼ酵素が強固かつ選択的にセルロースに結合することは、よく知られている。セルロースを含む固体粒子の緩慢な上昇流は、液体よりも長い時間、セルロースを含む固体および結合したセルラーゼ酵素を反応器中に滞留させる。セルロースおよび結合したセルラーゼの滞留は、生成物、例えばグルコースへのセルロースの転化を増大させる。反応器の最上部の近辺で、含水した生成物すなわち糖の流れおよび非加水分解固体は回収される。生成物がグルコースの場合、含水した糖の流れは、エタノールへの発酵およびその他の追加の処理のため回収される。本書中で説明する方法は、他の方法において液体および固体の栓流に要求されるのと比べて、より小さい反応器内でより長いセルロース加水分解時間を達成する。代替的に、本書中で説明する方法は、他の方法において要求されるのと比べて、より少ないセルラーゼ酵素により、より高水準のセルロース転化を達成する。
【００５１】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法を提供し、該方法は以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００５２】
さらに、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、凝集剤は、スラリーに対して直接、またはスラリーに添加されるセルラーゼ酵素とともに、スラリーに添加することもできる。
【００５３】
グルコースは次いで、例えばエタノール、だがそれに限定されない関心のある生成物を生産する追加の処理のため使用することができる。
【００５４】
上方沈殿反応器、および本書中で説明する方法が、セルロースのグルコースへの酵素転化に適しているにもかかわらず、この反応器および関連する方法は、セロビオース（好ましくは、酵素、［ベータ］―グルコシダーゼ（［ベータ］Ｇ）がセルラーゼから抜けている場合）およびグルコース・オリゴマー（好ましくは、セロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）酵素（ＣＢＨ）および［ベータ］Ｇがセルラーゼから抜けている場合）を含むがそれらに限定されないその他の生成物にセルロースを転化するため使用することもできる。本発明をさらに例示するため、セルロースをグルコースに転化する方法を説明する。しかしながら、この方法は、原料の加水分解中に異なるセルラーゼ酵素混合物を組み込むことにより、代替的な生成物の生産のため使用することができると理解すべきである。
【００５５】
「セルロース原料」または「セルロース材料」という用語により、非木材植物バイオマス、農業廃棄物および林業残留物ならびに砂糖加工の残留物など、だがそれらに限定されないセルロースを含むあらゆる種類のバイオマスが意味される。例えば、セルロース原料は、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、ホソムギ、ミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）などの草もしくはそれらの組合せ；サトウキビ残渣（バガス）およびサトウダイコン・パルプなど、だがそれらに限定されない砂糖加工の残留物；ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、エンバクわら、イネわら、イネ殻、オオムギわら、トウモロコシの穂軸、コムギわら、カノーラわら、エンバク殻およびトウモロコシ繊維など、だがそれらに限定されない農業廃棄物；ならびに、再使用される木材パルプ繊維、おがくず、硬材、軟材またはそれらの組合せなど、だがそれらに限定されない林業廃棄物を含み得るがそれらに限定されない。さらにセルロース原料は、新聞紙、厚紙および同種のものなど、だがそれらに限定されないセルロース廃棄物または林業廃材を含み得る。セルロース原料は、１種類の繊維を含む場合があり、または代替的に、セルロース原料は、異なるセルロース原料に由来する繊維の混合物を含み得る。コムギわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、サトウキビ残渣（バガス）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプおよびミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）は、それらの広い利用可能性および低費用によりセルロース原料として特に有利である。
【００５６】
原則として、実質的な量のセルロースを含む材料は、本発明の方法に適している。実際上、セルロース材料は、実質的な量のグルコースを生産するために、約２０％（ｗ／ｗ）超の量のセルロースを含む。セルロース材料は、例えば、少なくとも約３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）またはそれを超える量のより高いセルロース含有量を有してもよい。従って、セルロース材料は、約２０％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、もしくは約２５％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、もしくは約３５％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、またはそれを超える量、あるいはその間の量、例えば２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０％（ｗ／ｗ）、だがそれらに限定されない量のセルロースを含み得る。
【００５７】
本発明は、加工または前処理された天然のセルロース原料またはセルロース材料を用いて実施することができる。加工および前処理の方法は、繊維構造を崩壊させ、セルラーゼ酵素に接近可能な原料の表面積を増大させるよう、機械的および化学的作用の十分な組合せを提供することを意図する。機械的作用は通常、圧力、破砕、粉砕、攪拌、裁断、圧縮／拡張またはその他の種類の機械的作用の使用を含むがそれらに限定されない。化学的作用は、熱（しばしば蒸気）、酸および溶媒の使用を含み得るがそれらに限定されない。いくつかの化学的および機械的な前処理の方法は、当技術分野でよく知られている。
【００５８】
原料の前処理の１つの方法は、Ｕ．Ｓ．４，４６１，６４８およびＵ．Ｓ．４，２３７，２２６（これらは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたプロセス条件を使用する蒸気爆発である。この方法において、リグノセルロース・バイオマスは、０％から５％（Ｖ／Ｖ）またはそれらの間の量の硫酸またはその他の適切な酸の存在下でスチーム・ガンに装填される。スチーム・ガンは次いで、約１６０℃から約２８０℃、またはその間の量の温度までの蒸気により急速に満たされ、約３秒から約３０分の間またはその間の量の加熱時間、高圧に保たれる。容器は次いで、前処理されたバイオマスを放出するため急速に減圧される。例えばフーディーおよびその他（最終報告、蒸気爆発前処理の最適化、米国エネルギー省報告ＥＴ２３０５０１、１９８０年４月；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたもの、だがそれに限定されない蒸気爆発前処理を実施するための先行技術で知られたあらゆるパラメータも、本発明の方法で使用することができる。蒸気爆発のために選択される条件は、原料の性質および酵素の感受性の望ましい程度に依存する。しかしながら、当技術分野内で知られたその他の方法は、前処理された原料の調製のため必要に応じ使用することができ、例えば、ＵＳ５，８４６，７８７（ラディッシュ（Ｌａｄｉｓｃｈ））、ＵＳ５，１９８，０７４（ヴィラヴィセンシオ（Ｖｉｌｌａｖｉｃｅｎｃｉｏ））、ＵＳ４，８５７，１４５（ヴィラヴィセンシオ（Ｖｉｌｌａｖｉｃｅｎｃｉｏ））またはＵＳ４，５５６，４３０（コンヴァース（Ｃｏｎｖｅｒｓｅ）；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で開示されたもの、アンモニア冷凍爆発（米国特許５，１７１，５９２、ホルツァップル（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ））および濃縮アルカリ処理であるが、それらに限定されない。
【００５９】
前処理段階が行われるかどうかにかかわらず、セルロース原料は、酵素加水分解の前に、例えばＷＯ０２／０７０７５３（グリフィンおよびその他。これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で開示されたように、選択的に、水で洗浄しまたは水で濾しとることができる。前処理されたセルロース原料の洗浄により、溶解した糖、糖分解生成物、溶解したリグニンおよびフェノール化合物、ならびにシステム中のその他の有機化合物などのセルラーゼ酵素の阻害物質を除去することができる。洗浄され前処理された原料内のセルロースの濃度は通常、例えば約５０％−７０％の水準まで増大する。
【００６０】
セルロース材料は、高密度であり、依然汲み上げることができる濃度の液体中でスラリーとされる。例えば、しかし限定的であることを希望せず、液体は、水、再利用されたプロセス流または処理された流出物でもよい。スラリー中のセルロース原料の濃度は材料に依存するが、約３％から約３０％（ｗ／ｗ）の非溶解固体、またはその間の濃度、例えば約５％から約２０％もしくは約１０％から約２０％の非溶解固体またはそれらの間の量でもよい。例えば、スラリー中のセルロース原料の濃度は、３、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０％の非溶解固体（ｗ／ｗ）でもよい。当技術分野でよく知られているように、懸濁または非溶解の固体の濃度は、ガラス・マイクロファイバー濾過紙を使用してスラリーのサンプルを濾過し、濾過ケーキを水で洗浄し、かつ１０５℃で一晩中ケーキを乾燥させることにより、決定することができる。
【００６１】
スラリーのｐＨは一般的に、使用されるセルラーゼ酵素のための最適ｐＨ（ペーハー）の範囲内に調整される。一般的にスラリーのｐＨは、約３．０から約７．０もしくは約４．０から約６．０またはそれらの間のｐＨの範囲内、好ましくは約４．５から約５．５の範囲内に調整される。例えばｐＨは、約３．０、３．５、４．０、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、６．０、６．５または７．０でもよい。スラリーのｐＨは、当技術分野で知られている適切な酸または塩基を使用して調整することができる。例えば、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムもしくはその他の適切な塩基（スラリーが酸性の場合）、または硫酸もしくはその他の適切な酸（スラリーがアルカリ性の場合）を使用することができる。しかしながら、スラリーのｐＨは、使用されるセルラーゼ酵素が好アルカリ性または好酸性である場合それぞれ、約４．５から約５．５より高くまたは低くすることができる。スラリーのｐＨは、使用される酵素のための最適ｐＨの範囲内に調整すべきである。
【００６２】
スラリーの温度は、セルラーゼ酵素の活性にとって最適な範囲内にある点まで調整される。一般的に、約４５℃から約７０℃もしくは約４５℃から約６５℃の温度またはそれらの間の温度は、ほとんどのセルラーゼ酵素に適している。例えばスラリーの温度は、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０℃に調整することができる。しかしながら、スラリーの温度は、好熱性のセルラーゼ酵素について、より高くすることができる。
【００６３】
セルラーゼ酵素は次いで、スラリーに添加される。「セルラーゼ酵素」、「セルラーゼ」または「酵素」という用語により、セルロースの加水分解に触媒作用を起こし、グルコース、セロビオースおよびその他のセロオリゴ糖などの生成物を作る酵素が意味される。セルラーゼは、多くの植物および微生物により生産され得るエクソ−セロビオハイドロラーゼ（ｅｘｏ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）（ＥＧ）および［ベータ］―グルコシダーゼ（［ベータ］Ｇ）を含む多酵素混合物を表す一般名である。本発明の方法は、それらの入手源にかかわらず、いかなる種類のセルラーゼ酵素によっても行うことができる；しかしながら、微生物のセルラーゼは一般的に、植物のものより低費用で入手可能である。最も広く研究され、特徴付けられ、かつ商業的に生産されているセルラーゼの中には、アスペルギルス、フミコーラおよびトリコデルマ属の菌ならびにバチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の細菌から得られるものがある。糸状体菌トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から生産されるセルラーゼは、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩと名付けられた少なくとも２個のセロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）ならびに少なくとも４個のＥＧ酵素を含む。
【００６４】
セルラーゼ酵素は、相乗的に作用してセルロースをグルコースに分解する。ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩは一般的に、セロビオースを遊離させるセルロース・ミクロフィブリル中のグルコース・ポリマーの末端で作用する（テレマン（Ｔｅｌｅｍａｎ）およびその他、１９９５年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３１：２５０−２５８）一方、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）は、セルロース上の任意の場所で作用する。これらとともに、酵素は、セルロースをセロビオースなどのより小さいセロオリゴ糖に加水分解する。セロビオースは、［ベータ］―グルコシダーゼによりグルコースに加水分解される。
【００６５】
スラリーに添加されるセルラーゼ酵素の投与量は、過剰投与なしに、十分に高い水準のセルロース転化を達成するよう選択される。例えば、適切なセルラーゼ投与量は、セルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵまたはそれらの間の量でもよい。例えば、セルラーゼ投与量は、１グラムあたり約１．０、３．０、５．０、８．０、１０．０、１２．０、１５．０、１８．０、２０．０、２２．０、２５．０、２８．０、３０．０、３２．０、３５．０、３８．０もしくは４０．０ＦＰＵまたはそれらの間の量でもよい。ＦＰＵ（濾紙単位）は、当業者によく知られた標準の測定法であり、ゴーセ（１９８７年、Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８）に従い定義および測定される。グルコースへの完全な転化のため、セルラーゼが適切な量のβ―グルコシダーゼ（セロビオース）活性を含むことが好ましい。β―グルコシダーゼの投与量水準は、セルロース１グラムあたり約５から約６００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量である。β―グルコシダーゼの通常の投与量水準は、セルロース１グラムあたり約１０から約４００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量である；例えば投与量は、セルロース１グラムあたり１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８７、９０、９２、９５、９７、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０および４００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量でもよい。β―グルコシダーゼ単位は、ゴーセの方法（１９８７年、Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ． ５９：２５７−２６８）に従い測定される。
【００６６】
セルラーゼ酵素は、粉末または顆粒として水溶液中で取り扱うことができる。酵素は、反応容器（加水分解塔または加水分解反応器ともいう；１１０または１１０’、図１）へのスラリーの投入の前の時点でスラリーに添加することができる。例えば、しかし限定的であることを希望せず、セルラーゼ酵素は、加水分解タワーに入る直前にスラリーに添加することができる。酵素は、当業者によく知られている混合装置を使用してスラリー中に混合することができる。非限定的な実施例において、主要な加水分解反応器（１１０または１１０’）の上流に位置する小さな補給タンク（９０、図１Ａ）は、酵素をスラリーに添加し、ｐＨを調整し、かつスラリーの望ましい温度を達成するために使用することができる。
【００６７】
図１Ａを参照して、原料１０は、上記で説明したとおり前処理される。この流れは、生成物の流れ３０またはその他の適切な流体に接触して交換する熱交換器２０を使用して冷やされる。スラリー４０は次いで、熱交換器５０において、２番目の流体、例えば冷水４５を使用して、さらに冷やされる。スラリーは次いで、ｐＨを調整するため、セルラーゼ酵素７０および水酸化アンモニウム８０とともに、加水分解補給タンク９０の中に汲み入れることができる。この実施例において、加水分解補給タンク９０の内容物は、混合され、補給タンク９０から、配管１００に沿って、加水分解タンク１１０へ汲み入れられる。しかしながら、セルラーゼ酵素は、他の場所、例えば１９０、１９５または１９７、あるいは配管１０、４０もしくは１００またはそれらの組合せを含むがそれらに限定されない加水分解反応器に原料を供給する配管内で、原料と混合することができる。
【００６８】
「加水分解塔」、「上向流加水分解反応器」、「加水分解反応器」、「加水分解タンク」または「上向流沈殿反応器」という用語により、セルラーゼ酵素によりセルローススラリーの加水分解を促進する適切な構造の反応容器（タワー）、例えば１１０（図１Ｂ）または１１０’（図１Ｃ）が意味される。加水分解タンクは、望ましい温度を維持するため、絶縁体、蒸気、温水、電気的な熱追跡、またはその他の熱源を用いて保温することができる。本出願において、加水分解反応器は、反応器の内容物の混合が加水分解反応中に起こらないという意味で、非混合加水分解反応器である。以下に示すとおり、反応器の内容物の一定の少ない量の局所的な混合が、システムからの固体および液体の添加および回収に伴う少量の動力投入により起こり得る。スラリーおよびセルラーゼ混合物は、底部で直接に上向流沈殿反応器に入り、加水分解タワー中で上方へと汲み上げられ得る；代替的に、スラリーは、反応器の中央（例えば１０５）に配置された配管を通じて下方へ汲み出され、反応器の底部で現れ配管を囲み上方へと流れ得る。後者の配置は、スラリーからの熱を加水分解反応器において捉えることができるという点で有利である。一旦スラリーが加水分解タンク１１０または１１０’の底部に到達すると、スラリーは上方に移動し、加水分解タンクの幅を横切って分散する；軸方向の分散（すなわち、タンクの高さに沿った分散）は、混合を避けることにより最小化される。スラリーの流速は、スラリーの液体成分が非溶解固体の速度より速い速度で上方に流れるよう選択される。加水分解タワーは、スラリーの内容物が特定の高さにおいて半径方向で比較的均一であるように設計される。均一な分配は、分配器（例えば１２０）または当技術分野においてよく知られているその他の装置を使用して達成することができる。これは、フラクタル分配器（例えば、アマルガメイテッド・リサーチ・インク（Ａｍａｌｇａｍａｔｅｄ ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．）が製造するローン・ハース・アドバンスド・アマーパック（Ｒｏｈｎ Ｈａａｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｍｅｒｐａｃｋ）（登録商標））または回転ワンドを含み得る。例えば、図１Ｂにおいて、垂直の制御軸は、反応器１１０の底部における１対の一端が飛び出たトラス・アームおよび反応器の最上部における別の１対を支える。アームは、容器の底部で生成物を分配し、最上部で生成物を回収するためのノズルの付いたヘッダー・システムを組み込む。２個の出入口のある回転継手が、中央軸からの原料投入および排出のために使用される。加水分解タンク内のスラリーの分配は、回転翼またはポンプによる激しい混合なしに達成される。
【００６９】
図１Ｃは、タンクの最上部に配置された浄化器領域１３５を含む代替的な加水分解タワー１１０’を示す。以下でより詳細に説明するとおり、固体の大部分は、領域１３０の最上部で回収される。過剰の、浄化された液体は、領域１３５で上方に流れ続け、透明な液体として回収される。
【００７０】
加水分解反応器１１０または１１０’は、説明したように反応器を横切って比較的均一なスラリー濃度を維持するいかなる寸法でもよい。限定的であることを希望せず、加水分解タワーは、約１０フィートから約１３０フィート（３から４０ｍ）の間またはそれらの間の量の直径を有してもよい；例えば反応器の直径は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５もしくは１３０フィートまたはそれらの間の量でもよい。加水分解反応器の高さは、反応器が本書中で説明した目的を達成することを条件として、いかなる高さでもよい。限定的であることを希望せず、反応器の高さは、約５から約７５フィートもしくは約５から約６５フィート（１．５から２３ｍ）またはそれらの間の量、好ましくは約２０から約６５フィートでもよい；例えば反応器の高さは、約５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５または６５フィートでもよい。加水分解反応器の高さと直径の比率は、約０．５から約１０の間またはそれらの間の比率でよい；好ましくは、高さと直径の比率は、約０．５から約３である。反応器の全体の寸法は、反応器が水で満たされたときに、反応器を支える土台上に過度の負荷をかけることを避けるよう選択すべきである。限定されない実施例において、１１０フィートの直径および６５フィートの高さを有する加水分解反応器は、４．６０百万ガロンの容量を有するだろう。
【００７１】
スラリーは、液体が反応器の上部へ均一に流れることを可能とする平均スラリー流速で反応器１１０または１１０’内に上方へと汲み上げられる一方、セルロースを含む粒子は、液体よりも高密度であり、液体よりも緩慢に反応器の上部へ流れ、沈殿し、原料固体の濃度よりも高い一定の固体濃度で固まる。スラリーの「平均流速」または「スラリー流速」は、反応器の容量および反応器へのスラリー流速に基づく、名目的なスラリーの滞留時間で除した加水分解反応器の高さである。例えば、３０フィートの高さである１２０，０００ガロンの加水分解反応器への１時間あたり１０，０００ガロンのスラリー投入速度は、１２０，０００ガロン／（１０，０００ガロン／時間）＝１２時間の名目的なスラリー滞留時間および３０フィート／１２時間＝２．５フィート／時間の平均スラリー流速を有する。平均流速は、固体が平均スラリー流速よりも緩慢な速度で上方に流れることが可能となるよう選択される。このことは、固体が名目スラリー滞留時間よりも長い加水分解反応器中の平均滞留時間を有することを可能とする。これは、反応器中の液体と固体の流速および滞留時間が実質的に同一であるスラリー栓流反応器とは異なる。これが達成される流速は、原料およびスラリー中の固体粒子の大きさ、ならびに添加される凝集剤の存在に依存する。凝集剤の使用は、より高い平均流速の使用を可能とし得る。一般的に、平均流速は、１時間あたり約０．１から約２０フィートまたはそれらの間の速度である。好ましくは、平均流速は、１時間あたり約０．１から約１２フィートの間またはそれらの間の量である。より好ましくは、平均流速は、１時間あたり約０．１から約４．０フィートの間またはそれらの間の量である。例えば、平均スラリー流速は、１時間あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０フィートでよい。加水分解反応器中の名目的なスラリー滞留時間は、通常４−１２０時間、好ましくは１２−１００時間、最も好ましくは２０−１００時間である。
【００７２】
本発明の方法を使用して、スラリーの性質は、セルロースの加水分解が進行するにつれ変化する。理論に拘束されることを希望せず、加水分解反応の間、セルラーゼ酵素はセルロースに結合し、これにより、スラリー中のセルロースを含む固体粒子に結合したままである。スラリーの平均上昇速度は緩慢であり、その結果固体粒子は、スラリー全体よりも高密度であり、液体よりも緩慢に上方に流れる傾向がある。セルロースを含む固体粒子の緩慢な上昇流は、液体よりも長い時間、セルロースを含む固体および結合したセルラーゼ酵素を反応器中に滞留させる。結合した酵素がセルロースを消化しグルコースを溶液中に放出するにつれ、セルロースの量および固体粒子の密度は変化する。変化した密度により、より小さい粒子は、液体とともに上方に流れるか、または反応器の底部に沈殿する。セルロースを含む粒子の液体と比較して特異な滞留により、セルロースの濃度は、加水分解反応器の底部から最上部へと減少する一方、グルコースの濃度は、反応器の底部から上部へと増大する。セルロースの濃度の減少およびグルコースの濃度の増大は、加水分解反応器１１０（図１Ａおよび１Ｂを参照）の「加水分解領域」１３０で起こる。含水した糖の流れ、非加水分解固体および近接するセルロースを含む粒子は、反応器１１０の加水分解領域の最上部１４０の付近１５０で回収される。固体の少なくとも一部は次いで、例えば固体―液体分離器を使用してグルコースの流れから分離され、例えば、沈殿タンク１６０および生成物の流れ３０は、エタノールへの発酵およびその他の追加の処理（１７０）のために送られる。加水分解タワー内のセルロースのより長い滞留は、セルロースからグルコースへの転化の程度を増大させ、それにより、混合反応器内で達成される場合よりも、より小さな反応器内でより長いセルロース加水分解時間を達成する。代替的に、より高度のセルロース転化は、その他の場合に要求されるよりも低い酵素投与量で達成される。
【００７３】
「非加水分解固体」、「非転化固体」という用語により、セルラーゼ酵素により消化されないセルロース、ならびに原料中に存在するセルラーゼに対して不活性の非セルロースまたはその他の材料が意味される。例えば、しかしいかなる形でも限定的となることを希望せず、非転化固体は、リグニン、二酸化珪素またはその他の固体材料を含み得る。原料中のセルロースが加水分解されるにつれ、セルロースを含む固体粒子内の非転化固体の濃度は増大する。密度および粒経により、非転化固体は、１５０で生成物とともに除去されるか、または底部で沈殿物もしくはスラッジ１８０中に沈殿し得る。非常に重い粒子によりスラッジ層が反応器の底部で形成されるとき、当技術分野で知られるいかなる方法も、スラッジまたは沈殿物を除去するために用いることができる。非限定的な実施例において、スラッジを除去するためにスクレーパーを使用することができる。追加の実施例において、反応器の底部は、最も重い固体が沈殿し、除去され（例えば配管１６７）、リグニン処理１６５のために送ることができる通路を提供するため、先細とすることができる。
【００７４】
加水分解反応器１１０の最上部１４０の付近に認められる含水グルコース、非転化固体およびその他の粒子は、流れ１５０として除去することができる。反応器の最上部からの回収に続いて、非転化固体の少なくとも一部は、可溶性の糖の流れから分離することができる。非転化固体の除去は、固体−液体分離器を使用して、例えば、濾過（例えば、フィルタープレス、ベルト・フィルター、ドラム・フィルター、真空フィルターまたは膜フィルター）、遠心分離、沈殿、例えば、沈殿タンク１６０、傾斜のある沈殿器（例えば、クヌートセン（Ｋｎｕｔｓｅｎ）およびデイヴィス、２００２年、Ａｐｐｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、９８−１００：１１６１−１１７２、ならびにムーアおよびその他、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９１−９３：２９７−３０９。両者は、参照により本明細書の一部に組み込まれる。）、浄化器、または当技術分野において知られているであろう、その他の適切な方法により、達成することができる。浄化器は、固体と液体との分離を促進する多数の傾いた板、または固体−液体分離の技術分野において知られているその他の特徴を含み得る。本質的に非溶解固体を含まない可溶性のグルコースは、そのときエタノールへの発酵（１７０）に適している。非転化固体は主にリグニンであり、これは工場の燃料として燃焼および使用することができる。
【００７５】
代替的に、含水グルコースの流れは、非転化固体の回収から離れた場所で回収される。グルコースから非転化固体を分離する代替的な方法は、加水分解タワーの底部から上方に約６５％から約８５％の高さまで延びる加水分解領域１３０および加水分解領域の真上の「浄化器領域」１３５を有する、図１Ｃ中の反応器１１０’を使用することである。加水分解の流れは、加水分解領域１３０の最上部から浄化器領域１３５内へ汲み上げられる。固体の大部分は、加水分解領域１３０の最上部で回収される。例えば、しかしいかなる形でも限定的となることを希望せず、ノズルを有する水平ワンドは、ある時間間隔で反応器の最上部を横切って前後に通過し、固体を多く含む流れは、ワンド中へ回収され、反応器から汲み上げられる（１６２）。過剰の、浄化された液体は、浄化器領域１３５内へと上方に流れ続ける。浄化器領域１３５において、固体は一般的にワンドの高さで沈殿する一方、本質的に固体を含まない含水した糖の流れは、最上部から除去される（３０）。浄化器領域は、固体と液体との分離を促進する多数の傾いた板、および固体−液体分離の技術分野において知られているその他の特徴を含み得る。非転化固体（または非加水分解固体）は、非加水分解固体から加水分解生成物の少なくとも一部を分離するため、固体−液体分離器に運ぶことができる。
【００７６】
それが望ましい場合、グルコースの流れからの分離により得られるセルロースを含む固体は、グルコースへの追加の転化のために投入される原料とともに、上方沈殿反応器または加水分解領域中に再使用のため戻すことができる。
【００７７】
反応器の内容物の一定の少ない量の局所的な混合が、システムからの固体および液体の添加および回収に伴う少量の動力投入により、起こり得ると理解されたい。例えば、局所的な混合は、加水分解反応器中にスラリーを投入する分配器１２０、ワンドまたはポンプの作用により起こり得る。最善の操作のため、加水分解反応器の操作に関連した固体および液体の添加および回収を行うために必要となる動力は、０．１ＨＰ／１０００ガロンを超えない。これらの上向流反応器の機能に関連した動力は、０．００１と０．１ＨＰ／１０００ガロンの間またはそれらの間の範囲でよい。例えば、これらの上向流反応器の機能に関連した動力は、０．００１、０．００３、０．００８、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９または０．１ＨＰ／１０００ガロンでもよい。スラリーを混合するため特に設計された、反応器中の回転翼、攪拌器、排出装置またはその他の装置は存在しない。
【００７８】
複数の加水分解反応器が使用される場合、反応器は、一連の２個以上の反応器において作動し、この場合、第１の反応器の出口が第２の反応器の入口に原料を供給する。代替的に、反応器は、並行して作動させることができる。さらに、連続する反応器のいくつかを連続して作動させることができる一方で、他のものを並行して作動させることができる。
【００７９】
上向流反応器に追加して一つまたは複数の他の反応器の種類、例えば一つまたは複数のバッチまたは連続的な攪拌される反応器などを利用することができるとも理解されたい。非限定的な実施例において、連続的な攪拌される反応器の出口は、上向流反応器の入口に原料を供給する。当業者にとって明白なように、反応器の種類の他の組合せを本発明において使用することができる。
【００８０】
本発明の代替的な態様において、凝集剤は、本発明の能率を高めるためスラリーに添加することができる。凝集剤は通常、カチオン性、非イオン性、アニオン性もしくは両性（荷電群の混合物を含む）であるポリマー、または明礬などの塩である。理論に拘束されることを希望せず、凝集剤は、酵素混合物に対する一層完全な曝露を確実とするため、加水分解反応器内で固体を凝集させるのに役立つ。
【００８１】
本発明を実施するにあたり、１個の凝集剤または複数の凝集剤を含む混合物を使用することができる。凝集剤は、スラリーへの添加に適したあらゆる形態で提供することができる；例えば、凝集剤は、粉末、液体または分散液でもよい；例えば、分散液は、油または水溶液中で懸濁された凝集剤でもよい。適切な凝集剤の非限定的な実施例は、カチオン性ポリマー、より具体的にはポリアクリルアミドである。該凝集剤は、ＣＡ４５００（フランス、ＳＮＦフロエルジェ（Ｆｌｏｅｒｇｅｒ）（登録商標））およびゼタック（Ｚｅｔａｇ）（登録商標）７６５１（カナダ、チバ（登録商標）・スペシャリティー・ケミカルズ）を含むがそれらに限定されない。
【００８２】
使用される凝集剤の量は、上向流反応器中で固体を凝集させるのに必要な量により決定される。当業者は、方法全体に望ましくない費用を加えることなく固体の凝集に役立つであろう、添加する凝集剤の量を決定することができるだろう。例えば、しかし限定的であることを希望せず、添加される凝集剤の量は、固体１トンあたり約０．１から４．０ｋｇの範囲の量もしくはそれらの間の量、または固体１トンあたり約０．５から約２．０ｋｇもしくはそれらの間の量でもよい。例えば、添加される凝集剤の量は、固体１トンあたり約０．１、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．５、３．０、３．５または４．０ｋｇでもよい。
【００８３】
凝集剤は、スラリーに直接添加し、またはスラリーへの添加の前に水中で分散および希釈することができる。凝集剤は、スラリーへの添加の前にセルラーゼ酵素と混合することもできる。凝集剤の分散は、システム中の凝集剤の均一な適用を確実とするのに役立つ場合がある。本発明の非限定的な実施例において、凝集剤は、約０．０１重量％から約２５重量％またはそれらの間の量の濃度で水中で分散させることができる；例えば、凝集剤の濃度は、０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、７．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０もしくは２５．０重量％でもよい。凝集剤は、適切な時間、例えば約１分から約１時間、混合によりこの濃度で分散させることができる。分散した凝集剤は次いで、セルローススラリーに直接添加し、または加水分解反応器への添加の前に、約０．０１重量％から約１．０重量％もしくはそれらの間の量の濃度まで、水中でさらに希釈することができる。例えば、さらに希釈した凝集剤の濃度は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０重量％でもよい。
【００８４】
従って本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムを提供し、該システムは、向流加水分解反応器（例えば、１１０または１１０’）への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管（例えば１０、４０、１００）、向流加水分解反応器と流体連通状態にある固体−液体分離器（例えば１６０または１３５）を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物は、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該向流加水分解反応器の両方は、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含む。好ましくは、原料供給配管は、上記で概略を述べたとおり調製された、前処理された原料を含む。さらに、システム内のセルラーゼ酵素は、前処理された原料のセルロース１グラムあたり、約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在し、一つまたは複数の凝集剤は、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在する。
【００８５】
本発明は、本書中で説明するように、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用にも関する。このシステムが約６０から約９８％のセルロースからグルコースへの転化をもたらすので、グルコースは、エタノールの生産に使用することができる。好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される。一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。本書中で説明するセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するための酵素組成物の調製にも使用することができる。従って本発明は、エタノールの生産のため、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も提供する。
【００８６】
凝集剤または希釈した凝集剤は、スラリーへの酵素添加の地点の前（１９５；図１Ａ）、酵素添加の地点（１９０）、酵素添加の地点の後（１９７）、またはこれらの場所の組合せにおいて、添加することができる。さらに凝集剤は、加水分解反応器（１９２；図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）の底部もしくはその付近、加水分解反応器の中間部（１９１）、反応器の最上部（１９３）、反応器の外部の場所（１９５、１９７）、またはこれらの場所の組合せにおいて、スラリーに添加することができる。非限定的な実施例として、凝集剤は、反応器の底部（１９２）およびその中間部（１９１）で添加することができる。凝集剤が酵素の活性を阻害し、または酵素の活性に消極的な影響を与える場合、凝集剤は、スラリーまたは加水分解タンクへの添加の前に酵素に有害となる可能性がある方法で、酵素に直接接触すべきではない。
【００８７】
凝集剤は、一連のバルブおよび肘継手を通じて、汲上げにより添加することができる。該配置は、凝集剤とスラリーとの混合を改善し、システムへの混合物の逆流を防ぐことができる。代替的な実施例において、凝集剤に乱流を与えそれにより分散を向上させるため、直列の混合装置を使用することができる。代替的に、凝集剤は、補給タンク９０においてスラリーに添加され（例えば１９０で）、次いで、スラリーおよびセルラーゼ酵素４０とともに加水分解反応器１１０または１１０’に汲み上げることができる。
【００８８】
一旦加水分解反応器１１０または１１０’に入ると、凝集剤は、固体粒子と結合し始め、加水分解領域１３０における凝集に役立つ。理論に拘束されることを希望せず、このことは、反応器中にセルロースを含む粒子を懸濁させておくことにより、該粒子が、反応器の最上部から除去され、スラッジ層に沈殿し、またはそれらの組合せの状態になることを防ぐのに役立つ。固体粒子を結合させることは、加水分解領域（１３０）内のセルロースを含む粒子により一層長い滞留時間を許容し、酵素によるセルロースのより完全で効率的な消化をもたらす。上向流反応器１４０の最上部において、凝集剤は、主として非転化固体に結合し、粒子とともに反応器から出る（１５０；図１Ａ）。
【００８９】
配管３０を通じて反応器１１０または１１０’から出る前処理された原料からのセルロースの加水分解により生産されるグルコースは、発酵してエタノールとなる（１７０）と予想される。グルコースおよびその他の糖のエタノールへの発酵は、当業者に知られた従来の方法により行うことができ、例えば、ＷＯ９５／１３３６２、ＷＯ９７／４２３０７またはセルロース・バイオマスからのアルコール生産：アイオジェン（Ｉｏｇｅｎ）・プロセス（所収：アルコール・テキストブック、ノッティンガム大学新聞、２０００年；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたもの、だがそれらに限定されない、酵母および細菌を含む多様な微生物または遺伝子組換えが行われた微生物により実施することができる。エタノールの生産および回収は、アルコール産業の技術者に知られた十分に確立した方法を使用して行われる。
【００９０】
前記で示したとおり、上向流沈殿反応器は、セルロースのグルコースへの酵素転化に適している。しかしながら、この種類のシステムは、セロビオース（好ましくは、βＧがセルラーゼから抜けている場合）およびグルコース・オリゴマー（好ましくは、ＣＢＨおよびβＧがセルラーゼから抜けている場合）を含む、その他の生成物にセルロースを転化するために使用することができる。
【００９１】
本発明の方法は、固体が反応器中に存在する時間の長さを増大させ、このことは、酵素がセルロースに結合し続けるため、セルラーゼ酵素とセルロースとの間の接触時間を増大させる。このことは次に、所定の寸法の加水分解反応器で得られるセルロース転化の程度を増大させることにより、加水分解過程の効率を増大させる。従って、酵素加水分解の費用は最小化される。さらに上向流沈殿法は、反応器内の攪拌を必要とせず、混合に伴う動力および装置の費用を節約する。
【００９２】
上記の説明は、いかなる形でも、請求される発明を限定することを意図しない。さらに、論じられた特徴の組合せは、発明の説明にとって不可欠でないかもしれない。本発明は、以下の実施例でさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は説明のみを目的とし、いかなる形でも本発明の範囲を限定するために使用すべきでないと理解されるべきである。
【実施例１】
【００９３】
大型上向流加水分解反応器
前処理されたコムギわらは、ＵＳ４，４６１，６４８（フーディー、参照により本明細書の一部に組み込まれる）の方法を使用して調製される。前処理された材料は、７．８％の非溶解固体、７０℃の温度、および５５３ｔ／時間の質量流速の水性スラリーである。この水性スラリーは、生成物の流れ（３０）に接触して、熱交換器（２０）で６０℃まで冷やされる。６０℃のスラリーは次いで、熱交換器中の冷水（４５）により最終温度の５０℃まで冷やされる。スラリーは、ｐＨ（ペーハー）を４．５から５．０に調整するため、セルラーゼ酵素（７０；５ＦＰＵ／ｇセルロース）およびアンモニア（８０；湿式スラリー１トンあたり１２００グラム）とともに、加水分解補給タンク（９０；容量８６，０００ガロン）中に汲み入れられる。加水分解補給タンクの内容物は、４０分の滞留時間中に混合され、次いで結合流（１００）は、補給タンクから加水分解タンク（１１０）の中央（１０５）を通じる配管を下って汲み出される。加水分解タンクは、５０℃に維持するため使用される１５ｐｓｉｇの蒸気で保温されている。加水分解タンクの底部で、スラリーは、上方に汲み上げられ、加水分解タンクの幅を横切って分散する（１２０）。
【００９４】
加水分解タンクは、４．６百万ガロンの容量を有する。液体は、固体より速く加水分解タンク中を上方へ流れ、固体は、タンク全域で約１０％の濃度まで沈殿する。セルロースは、１８８時間タンク中に維持され、これは、９２％のセルロースをグルコースに転化するのに十分な長さである。含水した糖の流れおよび非加水分解固体（１５０）は、タンクの最上部から流れ出し、沈殿タンク（１６０）に汲み入れられる。１．１２百万ガロンの容量を有した沈殿タンクにおいて、固体は、１０％の濃度まで底部に沈殿し、圧搾および洗浄により固体から糖を回収するため、配管１６２を経由してリグニン・フィルタープレス１６５へ汲み出される。この流れからの糖は、沈殿器の最上部からの糖の流れと結合し、これは次いで、エタノールへの発酵（１７０）のため送られる。
【実施例２】
【００９５】
トリコデルマ・セルラーゼ酵素を用いた上向流加水分解
コムギわらは、ＵＳ４，４６１，６４８（フーディー、参照により本明細書の一部に組み込まれる）の方法を使用して前処理された。前処理された原料は、３．７％非溶解固体の濃度により水中でスラリーとされ、ｐＨ（ペーハー）は、３０％水酸化ナトリウムを用いて５．５に調整された。非溶解固体は、５５％がセルロースであった。スラリーは、垂直の加水分解反応器（１１０；図１Ｃ）の底部へ毎分４０リットルの速度で汲み入れられた。これは、０．７フィート／時間の上昇流速に相当する。タワーの容量は１４４，７００リットルであり、このうち加水分解領域（１３０）は下方の１１５，０００リットル（３４．４フィートの高さ）であり、最上部の２９，７００リットルは浄化器（１３５）であった。タワーの直径は、３．８メートルであり、高さは１３．５メートル（４４．３フィート）であった。スラリーの温度は、反応器の入口で５５℃であり、反応器の最上部付近で約５０℃まで徐々に低下した。トリコデルマ（オタワ、アイオジェン（Ｉｏｇｅｎ）・バイオプロダクツから入手可能）から得られたセルラーゼ酵素は、セルロース１グラムあたり３６ＦＰＵの投与量で加水分解補給タンク（９０；図１Ａ）中のスラリーに添加され、実施例１と同様にタワーに投入される前に配管に添加された。
【００９６】
前処理された固体およびセルラーゼを含むスラリーは、タワー１０５の底部に汲み入れられ、スラリーがタワーの上方に流れるにつれ加水分解が起きた。タワーの容量の７９％である加水分解領域の最上部において、スラリーは浄化器領域１３５に移された。沈殿した固体を含む流れは、加水分解領域および浄化器領域の接触面で回収された（１６２；図１Ｃ）。非溶解固体のほとんどない水相にあるグルコースを含む第２の流れ３０は、浄化器領域の最上部で回収された。
【００９７】
運転の過程を通じた反応器中の固体の分析結果を図２に示す。底部の上１フィートの高さで、非溶解固体は、８重量％から１４重量％の濃度まで沈殿した。これは、３．７％の非溶解固体の原料濃度に比べて著しく濃度が高い。これより高い地点において、固体濃度はより低い。
【００９８】
セルロース転化の分析結果を図３に示す。セルロース転化の程度は、１５フィートおよび２４フィートの高さにおいて、運転の初期に７３％から８３％であり、終了までに９５％であった。上向流反応器から流れ出る流れの中のグルコース濃度は、２５ｇ／Ｌであった。これは、反応器の混合、剪断の提供、またはタワーの上方に緩慢に汲み上げる以外に原料を他の方法で移動させることなしに、良好な水準のセルロース転化およびグルコース生産が得られたことを示す。
【実施例３】
【００９９】
凝集剤の存在下でトリコデルマ・セルラーゼ酵素を用いた上向流加水分解
前処理されたコムギわらの加水分解が、４．４％の非溶解固体を用いて実施例２で説明したとおり行われた。但し、凝集剤が固体の沈殿を改善するために添加された。カチオン性ポリマー、ＣＡ４５００（フランス、ＳＮＦフロエルジェ（Ｆｌｏｅｒｇｅｒ）（登録商標））が非溶解固体１トンあたり２ｋｇの投与量で添加され、スラリーへの酵素添加の地点後の添加と同時に、インラインで分散された。
【０１００】
運転の過程を通じた反応器中の固体の分析結果を図４に示す。底部の上１フィートの高さで、非溶解固体は、実施例２で観察されたのと同様に、６重量％から１０重量％の濃度まで沈殿し、４．４％の非溶解固体の原料濃度に比べ、著しく濃度が高かった。反応器内のこれより高い地点において、固体濃度は、５．５％から８％であった。これは、凝集剤が固体を凝集させ沈殿させるのに効果的であることを示した。
【０１０１】
セルロース転化の分析結果を図５に示す。セルロース転化の程度は、１５フィートおよび２４フィートの高さにおいて、運転の初期に６５％から８５％であり、終了までに８５％から９２％であった。反応器から流れ出る流れの中のグルコース濃度は、２７ｇ／Ｌであった。これは、反応器の混合、剪断の提供、またはタワーの上方に緩慢に汲み上げる以外に原料を他の方法で移動させることなしに、良好な水準のセルロース転化が得られたことを示す。
【実施例４】
【０１０２】
凝集剤の存在下および不在下における様々の酵素水準でのセルロース転化
実施例２および３で説明した加水分解反応は、同様の最終的なグルコース濃度を示したが、これは、酵素の過剰の存在による可能性がある。加水分解の効率に対する凝集剤の効果を決定するため、加水分解が、様々の酵素投与量において凝集剤の存在および不在下で行われた。
【０１０３】
前処理されたコムギわらの加水分解が、実施例２および３で説明したとおり行われた。但し、添加されるセルラーゼ酵素の量は、変更された。８、１２、１６、２０、２４、２８、３２および３６ＦＰＵの酵素による加水分解が、４８時間、凝集剤の存在および不在下で行われた。セルロース転化（単位：％）が測定され、これを図６に示す。
【０１０４】
図６に示すように、より低い酵素投与量において、凝集剤の使用は、セルロース転化の増大をもたらす。このことは、セルロース転化の費用の全体的な節約を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で上向流反応器および沈殿タンクを含むシステムを示す。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で図１Ａの上向流反応器を示す。
【図１Ｃ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で上向流反応器が浄化器領域を含む場合のシステムの一部を示す。
【図２】凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【図３】凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでのサンプリングにより測定されたセルロース転化の百分率を示す。
【図４】凝集剤がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【図５】凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた、転化されたセルロースの量を示す。
【図６】凝集剤がない場合と比較して、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内から出た生成物におけるセルロース転化の効率の増加を示す。
【符号の説明】
【０１０６】
１０ 配管
２０ 熱交換器
３０ 生成物の流れ
４０ 配管
４５ 冷水
５０ 熱交換器
７０ セルラーゼ酵素
８０ 水酸化アンモニウム
９０ 加水分解補給タンク
１１０、１１０’ 加水分解タンク
１２０ 分配器
１３０ 加水分解領域
１３５ 加水分解領域
１４０ 加水分解領域
１５０ 沈殿タンク
１６２ 配管
１７０ エタノールへの発酵
１９１ 加水分解反応器の中間部
１９２ 反応器の底部
１９３ 反応器の最上部
１９５，１９７ 反応器の外部の場所
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース原料の転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、効率性を改善したセルロース原料の酵素転化の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
燃料エタノールは現在、コーンスターチ、サトウキビおよびサトウダイコンなどの原料から生産される。しかしながらこれらの原料からのエタノールの生産は、それらの穀物の生産に適した農地の限界および人間と動物の食物連鎖の利益の競合により、これ以上大きく拡大することはできない。最終的に、転化過程において二酸化炭素およびその他の生成物の放出を伴う化石燃料の使用は、それらの原料の使用の有害な環境に対する影響である。
【０００３】
農業廃棄物、草および林業廃棄物などのセルロースを含む原料からエタノールを生産する可能性は、それらの安価な原料を大量に利用可能であること、セルロース廃棄物の燃焼または埋立てを避けるのが望ましいこと、およびエタノールがガソリンに比較して燃料として清浄であることにより大きく注目されてきた。さらにセルロース転化過程の副産物であるリグニンは、セルロース転化過程を促進する燃料として使用することができ、それにより化石燃料の使用が避けられる。研究は、サイクル全体を考慮すると、セルロースから生産されるエタノールの使用による温室効果ガスの発生がほぼ零であることを示している。
【０００４】
エタノール生産のため使用することができるセルロース原料は、（１）トウモロコシ茎葉、コムギわら、オオムギわら、エンバクわら、エンバク殻、カノーラわらおよびダイズ茎葉などの農業廃棄物、（２）スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、ミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）およびクサヨシなどの草、（３）ポプラ木材およびおがくずなどの林業廃棄物、ならびに（４）残渣（バガス）およびビート・パルプなどの砂糖加工の残留物草を含む。
【０００５】
セルロースは、セルロース原料の２番目に主要な成分であるヘミセルロースと同様、分解に対し非常に耐性がある結晶構造からなる。セルロース繊維からエタノールへの転化は、以下を必要とする：１）リグニンからセルロースおよびヘミセルロースを遊離させること、またはセルロース原料内のセルロースおよびヘミセルロースのセルラーゼ酵素への接近可能性を増加させること、２）糖を解放するためヘミセルロースおよびセルロース炭水化物ポリマーを解重合すること、ならびに３）混合されたヘキソースおよびペントース糖を発酵させエタノールとすること。
【０００６】
セルロースを糖に転化するために使用されるよく知られた方法には、セルロースをグルコースに加水分解するのに十分な温度、酸濃度および時間の長さでの蒸気および酸の使用を伴う酸加水分解法がある（グレスレイン（Ｇｒｅｔｈｌｅｉｎ）、１９７８年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２９６−３０８）。次にグルコースは、酵母を使用して発酵させエタノールとし、エタノールは、蒸留により回収され純化される。
【０００７】
セルロース加水分解の代替的な方法は、酸による前加水分解（または前処理）とそれに続く酵素加水分解である。この順序においてセルロース材料はまず、上記で説明した酸加水分解法を使用して、しかしより穏やかな温度、酸濃度および処理時間で前処理される。この前処理方法は、次の酵素転化段階のためのセルロース繊維内のセルロースの接近可能性を増大させるが、セルロースのグルコース自体への転化をほとんどもたらさない。次の段階において、前処理された原料は適切な温度およびｐＨに調整され、次にセルラーゼ酵素による酵素転化にかけられる。
【０００８】
酸によるかセルラーゼ酵素によるかを問わず、セルロースの加水分解の後に糖が発酵によりエタノールとなり、次にエタノールが蒸留により回収される。
【０００９】
セルロース材料からの糖へのセルロースの効率的な転化およびそれに続く糖のエタノールへの発酵は、商業的可能性に関して大きな課題に直面している。特に、酸による予備加水分解は、大量の酸を必要とする。洗浄された硬材などの清浄な原料にとって、硫酸の必要量は、原料の乾燥重量の０．５％から１％である；土壌からの高水準の二酸化珪素、塩およびアルカリ・カリウム化合物を含む可能性がある農業繊維にとって、酸必要量は約１０倍、原料の５重量％から７重量％に達する可能性がある。このことは、方法に著しい費用を加える。前加水分解法において大量の酸を使用する２つ目の不利益は、セルラーゼ酵素を用いた酵素加水分解の前に、酸性化した原料を約４．５と約５の間のｐＨ（ペーハー）まで中和しなければならないことである。酸性化した原料を中和するために使用される苛性ソーダの量は、原料を酸性化するために使用される酸の量に比例する。従って、高度の酸の使用は高度の苛性ソーダの使用をもたらし、これはさらに、セルロース原料をエタノールに加工する費用を増大させる。さらに、前処理にもかかわらずセルロースは加水分解に対し依然として耐性を有するままであり、このことは必要となる酵素投与量を増大させるため、酵素加水分解の費用は高額である。該必要量の増大は、加水分解の時間（９０−２００時間）を増大させることにより解消することができるが、今度は非常に大きな反応器を必要とし、これがまた全体の費用に加わる。
【００１０】
高水準のセルロース転化を維持しながら酵素投与量を減少させる方法が、同時糖化発酵法（ＳＳＦ）である。この種類のシステムにおいて、酵素加水分解は、反応容器中のグルコースのエタノールへの酵母発酵と同時に行われる。ＳＳＦの間、酵母は、グルコースをエタノールに発酵させることにより反応器からグルコースを除去し、このことは、グルコースによるセルラーゼの阻害を減少させる。しかしながら、セルラーゼ酵素は、なおエタノールにより阻害される。ＳＳＦは、通常３５−３８℃の温度で行われ、これは、セルラーゼにとっての最適条件の５０℃と酵母にとっての最適条件の２８℃との間の中間である。この中間の温度は、セルラーゼ酵素と酵母の両方による標準以下の性能をもたらす。従って、非能率的な触媒作用は、非常に長い反応時間と非常に巨大な反応容器を必要とし、両方とも高価である。
【００１１】
より高い容量生産性のための方法は、アメリカ特許第５，２５８，２９３号で開示されている（リンド）。この方法は、反応容器中に継続的に注入される微生物に加えてリグノセルロース原料を利用する。流体は反応容器の底部からも継続的に添加されるが、スラリーの機械的な攪拌は行われない。反応が進行するにつれて、消化されつつあるリグノセルロース原料は、空間的に不均質な層に蓄積する傾向がある一方、エタノール生成物は、最上部の層に上昇し、そこで除去される。不溶性の基質は、底部の層に蓄積し、容器から回収することができる。この配置は、発酵基質の特異な滞留をもたらし、これにより反応容器中の滞留時間の増大の余地がある。
【００１２】
Ｕ．Ｓ．５，８３７，５０６（リンド）で開示されたもう１つの方法において、エタノールは、断続的に攪拌され恒常的に原料が供給されるバイオリアクタを使用して生産される。リグノセルローススラリーおよび微生物が、反応器に添加される；混合物は次いで、特定の時間間隔で、機械的な手段または流体再循環のいずれかにより攪拌され、その後沈殿することが可能となる。エタノールは次いで、反応器の最上部から除去され、追加の基質が添加され、循環が継続する。同様の方法において、Ｋｌｅｉｊｎｔｊｅｎｓおよびその他（１９８６年、バイオテクノロジー・レターズ、８：６６７−６７２）は、Ｃ・サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の存在下でセルロースを含む基質を発酵させるために上向流反応器を利用している。基質スラリーは沈殿し、凝集した繊維の層を形成し、これは、緩慢な機械的攪拌により加速する。基質が定期的に添加される一方で、液体が継続的に反応器に供給される。エタノール生成物は最上部の層に蓄積し、そこで反応器から除去される。Ｕ．Ｓ．５，８３７，５０６、Ｕ．Ｓ．５，２５８，２９３ならびにＫｌｅｉｊｎｔｊｅｎｓおよびその他で開示された方法は、反応容器中の原料の滞留時間の増加をもたらす。しかしながら、３つの全ての方法は、ＳＳＦ法の不利益を被る。
【００１３】
Ｕ．Ｓ．５，３４８，８７１；Ｕ．Ｓ．５，５０８；１８３、Ｕ．Ｓ．５，２４８，４８４；およびＵ．Ｓ．５，６３７，５０２（スコット）は、攪拌された反応容器と関連した磨砕機の使用により、酵素加水分解における転化効率を改善する方法を教えている。攪拌器は、セルロース原料中の固体粒子の粒経縮小のための高剪断領域を作り出し、これがセルラーゼ酵素のための新しい表面積を継続的に提供する。これにより反応効率が増大し、酵素必要量が減少する。しかしながら、高剪断はしばしば、酵素を不活性化する。さらに、磨砕装置の費用は、酵素投与量の減少による節約額よりもはるかに大きい。
【００１４】
Ｕ．Ｓ．５，８８８，８０６およびＵ．Ｓ．５，７３３，７５８（グエン（Ｎｇｕｙｅｎ））は、交互に混合および非混合の領域からなるタワー型加水分解反応器を使用し、それにより混合の動力消費および費用を減少させる代替的な方法を教えている。スラリーは、反応器を通じて栓流中を上部に移動し、混合領域において断続的に混合され、それにより液体のチャネリングが妨げられ、均一な熱および物質の移動が確保される。Ｕ．Ｓ．５，８８８，８０６およびＵ．Ｓ．５，７３３，７５８で開示された方法は剪断および酵素の変性を減少させる一方、混合装置の費用は実質的である。さらに、酵素の動的性能は、バッチ加水分解方式で達成できるのと同程度である。
【００１５】
現在のところ、費用の低下を維持しながら高い転化効率を達成するには、多大の技術的な困難が存在する。酵素の投与量を増大させることによる費用の増加を防ぐため加水分解の回数を増やすことは、より大きな反応器を必要とし、これが今度は装置の費用を増大させる。加水分解中の原料の混合および断続的な混合は、酵素の効率を増加させ得るが、装置の費用はさらに増加し、剪断力は酵素の変性をもたらす。他のシステムは、最適な酵素の活性を弱め、酵素の効率を減少させる。
【００１６】
発明の要約
本発明は、セルロース原料の生成物への転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、効率性を改善したセルロース原料の酵素転化の方法に関する。
【００１７】
本発明に従って、セルロースの酵素加水分解のための上向流沈殿反応器が提供される。
【００１８】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法も提供し、該方法は以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００１９】
本発明は、注入の段階（段階ｉｉ）において、水性スラリーが、均一な放射状分布で加水分解反応器の底部に注入される、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法に関する。
【００２０】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、一つまたは複数の凝集剤が、セルラーゼ酵素とは別に、もしくはセルラーゼ酵素とともに、またはそれらの組合せにより水性スラリーに添加される、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法を指向する。さらに、一つまたは複数の凝集剤は、注入の段階（段階ｉｉ）の前もしくは該段階中に、またはそれらの組合せにより、添加することができる。
【００２１】
本発明は、提供の段階（段階ｉ）において、スラリーが約５重量％から約２０重量％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が、約２５重量％から約７０重量％のセルロースを含む、上記で定義されたセルロースの酵素加水分解の方法に関する。
【００２２】
本発明は、前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、上記で説明した方法を指向する。さらに、前処理されたセルロース原料は、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で約３秒から約３０分間の前処理にかけられていてもよい。酸は、硫酸、亜硫酸および二酸化硫黄からなる群から選択することができる。選択的に、糖を含む液体流は、注入の段階（段階ｉｉ）の前に、前処理されたセルロース原料から分離することができる。液体流は、濾過、遠心分離、洗浄などの方法または当技術分野で知られているであろう、その他の適切な方法を使用して、原料から分離することができる。洗浄が分離のために使用される場合、洗浄は、水、再利用されたプロセス流、処理された流出物などの適切な洗浄媒体またはそれらの組合せを使用して行うことができる。
【００２３】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、上記で説明した方法も提供する。
【００２４】
さらに本発明は、除去の段階（段階ｉｖ）において、少なくとも一部の加水分解生成物の流れが、非混合の加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、上記で説明した方法を提供する。加水分解生成物および非加水分解固体は、別の場所で浄化器領域から除去することができる。代替的に、少なくとも一部の加水分解生成物の流れは、固体−液体分離器を使用して、非加水分解固体から分離される。
【００２５】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素が、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを生産するよう選択される、上記で説明した方法を指向する。
【００２６】
本発明は、提供の段階（段階ｉ）において、スラリーのｐＨが約４．０から約６．０、好ましくは約４．５から約５．５に調整される、上記で説明した方法も提供する。さらに温度は、約４５℃から約７０℃、好ましくは約４５℃から約６５℃でもよい。
【００２７】
本発明は、添加の段階（段階ｉｉｉ）において一つまたは複数の凝集剤が使用される、上記で説明した方法に関する。凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、例えばポリアクリルアミド、だがこれに限定されないカチオン性ポリマーである。凝集剤は、固体１トンあたり約０．１から約４ｋｇの投与量で添加することができる。
【００２８】
本発明は、平均スラリー流速が、１時間あたり約０．１と約１２フィートの間、より好ましくは１時間あたり約０．１と約４フィートの間である、上記で説明した方法にも関する。
【００２９】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物も提供する。好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される。さらに、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。
【００３０】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も指向する。
【００３１】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するセルロースの酵素加水分解のためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も指向し、該酵素組成物の使用は、以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３２】
好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産され、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。
【００３３】
本発明では、加水分解は以下により行われる、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物も提供する：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；および
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３４】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためにセルロースを加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤ならびに指示からなるキットを提供し、該指示は以下からなる。
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素混合物および一つまたは複数の凝集剤を水性スラリーに添加すること；ならびに、
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００３５】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためにセルロースを加水分解するにあたり使用するための酵素組成物を調製する方法も提供し、該方法は、植物、菌または微生物の入手源から一つまたは複数のセルラーゼ酵素を獲得すること、および酵素組成物を生産するためセルラーゼ酵素と一つまたは複数の凝集剤を組み合わせることからなる。
【００３６】
本発明は、セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）により生産される、上記で説明した酵素組成物を調製する方法も提供する。
【００３７】
本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムを提供し、該システムは、上向流加水分解反応器への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管、上向流加水分解反応器と流体連通状態にある固体−液体分離器を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物は、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該上向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該上向流加水分解反応器の両方は、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含む。
【００３８】
本発明は、原料供給配管が、使用されるときに、前処理された原料を含む、上記で説明したシステムも提供する。固体−液体分離器は、沈殿タンク、浄化器、浄化器領域、遠心分離機または濾過器でもよい。システムが使用されるとき、セルラーゼ酵素は、前処理された原料のセルロース１グラムあたり、約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在してもよく、一つまたは複数の凝集剤は、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在してもよい。
【００３９】
本書中で説明するように、上向流沈殿反応器内のセルロースの加水分解の作用は、一つまたは複数の凝集剤の添加により向上させることができる。凝集剤は、セルロース固体の大きさを増大させ、それにより、セルロース固体の沈殿の速度を増大させる。このことは、より長い時間反応器中に固体を保持するのに役立ち、それにより、セルロースの転化の程度を増大させる。さらに、本書中で説明する方法は、加水分解タンク内において回転翼、ポンプまたは同種のものの使用によるスラリーの激しい混合が要求されないという点で混合が不在の加水分解反応器内における原料スラリーの加水分解を提供する。
【００４０】
上向流沈殿加水分解反応器の使用は、先行技術の欠点のいくつかに対処する。本発明は、セルロースの酵素加水分解の効率を改善する。このことは、セルロースのグルコースへの転化の程度の向上をもたらす。代替的に、上向流沈殿反応器は、従来の加水分解システムよりも低いセルラーゼ酵素の必要量をもたらす。改善された酵素加水分解は、加水分解反応器内のスラリーの混合の費用なしに、またシステムに激しい剪断を加えることなしに達成される。上向流加水分解反応器の使用に伴う改善は、凝集剤の使用により向上させることができる。
【００４１】
図の簡単な説明
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴は、添付された図を参照する以下の説明からより一層明らかとなる：
【００４２】
図１は、本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図を示す。図１Ａは、上向流反応器および沈殿タンクを含むシステムを示す。図１Ｂは、図１Ａの上向流反応器を示す。図１Ｃは、上向流反応器が浄化器領域を含む場合のシステムの一部を示す。
【００４３】
図２は、凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【００４４】
図３は、凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでのサンプリングにより測定されたセルロース転化の百分率を示す。
【００４５】
図４は、凝集剤がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【００４６】
図５は、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた、転化されたセルロースの量を示す。
【００４７】
図６は、凝集剤がない場合と比較して、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内から出た生成物におけるセルロース転化の効率の増加を示す。
【００４８】
好ましい実施形態の説明
本発明は、セルロース原料の生成物への転化の方法に関する。さらに具体的には、本発明は、セルロース原料の酵素転化のための効率を改善した方法に関する。
【００４９】
以下の説明は、実施例のみによる好ましい実施形態に関するものであり、本発明を実施するために必要な特徴の組合せに限定されない。
【００５０】
本発明は、セルロースを、例えばグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せ、だがそれらに限定されない生成物に分解するためのセルロースの酵素転化の方法に関する。本発明の１つの態様において、該方法は、非混合の加水分解反応器において上方へセルラーゼとともにセルロース水性スラリーを汲み上げることを含む。スラリーの上昇速度は緩慢であり、その結果固体粒子は、スラリー本体よりも密度が高く、液体よりも緩慢に上方に流れる傾向がある。セルラーゼ酵素が強固かつ選択的にセルロースに結合することは、よく知られている。セルロースを含む固体粒子の緩慢な上昇流は、液体よりも長い時間、セルロースを含む固体および結合したセルラーゼ酵素を反応器中に滞留させる。セルロースおよび結合したセルラーゼの滞留は、生成物、例えばグルコースへのセルロースの転化を増大させる。反応器の最上部の近辺で、含水した生成物すなわち糖の流れおよび非加水分解固体は回収される。生成物がグルコースの場合、含水した糖の流れは、エタノールへの発酵およびその他の追加の処理のため回収される。本書中で説明する方法は、他の方法において液体および固体の栓流に要求されるのと比べて、より小さい反応器内でより長いセルロース加水分解時間を達成する。代替的に、本書中で説明する方法は、他の方法において要求されるのと比べて、より少ないセルラーゼ酵素により、より高水準のセルロース転化を達成する。
【００５１】
本発明は、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法を提供し、該方法は以下からなる：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【００５２】
さらに、添加の段階（段階ｉｉｉ）において、凝集剤は、スラリーに対して直接、またはスラリーに添加されるセルラーゼ酵素とともに、スラリーに添加することもできる。
【００５３】
グルコースは次いで、例えばエタノール、だがそれに限定されない関心のある生成物を生産する追加の処理のため使用することができる。
【００５４】
上方沈殿反応器、および本書中で説明する方法が、セルロースのグルコースへの酵素転化に適しているにもかかわらず、この反応器および関連する方法は、セロビオース（好ましくは、酵素、［ベータ］―グルコシダーゼ（［ベータ］Ｇ）がセルラーゼから抜けている場合）およびグルコース・オリゴマー（好ましくは、セロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）酵素（ＣＢＨ）および［ベータ］Ｇがセルラーゼから抜けている場合）を含むがそれらに限定されないその他の生成物にセルロースを転化するため使用することもできる。本発明をさらに例示するため、セルロースをグルコースに転化する方法を説明する。しかしながら、この方法は、原料の加水分解中に異なるセルラーゼ酵素混合物を組み込むことにより、代替的な生成物の生産のため使用することができると理解すべきである。
【００５５】
「セルロース原料」または「セルロース材料」という用語により、非木材植物バイオマス、農業廃棄物および林業残留物ならびに砂糖加工の残留物など、だがそれらに限定されないセルロースを含むあらゆる種類のバイオマスが意味される。例えば、セルロース原料は、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、ホソムギ、ミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）などの草もしくはそれらの組合せ；サトウキビ残渣（バガス）およびサトウダイコン・パルプなど、だがそれらに限定されない砂糖加工の残留物；ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、エンバクわら、イネわら、イネ殻、オオムギわら、トウモロコシの穂軸、コムギわら、カノーラわら、エンバク殻およびトウモロコシ繊維など、だがそれらに限定されない農業廃棄物；ならびに、再使用される木材パルプ繊維、おがくず、硬材、軟材またはそれらの組合せなど、だがそれらに限定されない林業廃棄物を含み得るがそれらに限定されない。さらにセルロース原料は、新聞紙、厚紙および同種のものなど、だがそれらに限定されないセルロース廃棄物または林業廃材を含み得る。セルロース原料は、１種類の繊維を含む場合があり、または代替的に、セルロース原料は、異なるセルロース原料に由来する繊維の混合物を含み得る。コムギわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、サトウキビ残渣（バガス）、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプおよびミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）は、それらの広い利用可能性および低費用によりセルロース原料として特に有利である。
【００５６】
原則として、実質的な量のセルロースを含む材料は、本発明の方法に適している。実際上、セルロース材料は、実質的な量のグルコースを生産するために、約２０％（ｗ／ｗ）超の量のセルロースを含む。セルロース材料は、例えば、少なくとも約３０％（ｗ／ｗ）、３５％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）またはそれを超える量のより高いセルロース含有量を有してもよい。従って、セルロース材料は、約２０％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、もしくは約２５％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、もしくは約３５％から約７０％（ｗ／ｗ）のセルロース、またはそれを超える量、あるいはその間の量、例えば２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０％（ｗ／ｗ）、だがそれらに限定されない量のセルロースを含み得る。
【００５７】
本発明は、加工または前処理された天然のセルロース原料またはセルロース材料を用いて実施することができる。加工および前処理の方法は、繊維構造を崩壊させ、セルラーゼ酵素に接近可能な原料の表面積を増大させるよう、機械的および化学的作用の十分な組合せを提供することを意図する。機械的作用は通常、圧力、破砕、粉砕、攪拌、裁断、圧縮／拡張またはその他の種類の機械的作用の使用を含むがそれらに限定されない。化学的作用は、熱（しばしば蒸気）、酸および溶媒の使用を含み得るがそれらに限定されない。いくつかの化学的および機械的な前処理の方法は、当技術分野でよく知られている。
【００５８】
原料の前処理の１つの方法は、Ｕ．Ｓ．４，４６１，６４８およびＵ．Ｓ．４，２３７，２２６（これらは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたプロセス条件を使用する蒸気爆発である。この方法において、リグノセルロース・バイオマスは、０％から５％（Ｖ／Ｖ）またはそれらの間の量の硫酸またはその他の適切な酸の存在下でスチーム・ガンに装填される。スチーム・ガンは次いで、約１６０℃から約２８０℃、またはその間の量の温度までの蒸気により急速に満たされ、約３秒から約３０分の間またはその間の量の加熱時間、高圧に保たれる。容器は次いで、前処理されたバイオマスを放出するため急速に減圧される。例えばフーディーおよびその他（最終報告、蒸気爆発前処理の最適化、米国エネルギー省報告ＥＴ２３０５０１、１９８０年４月；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたもの、だがそれに限定されない蒸気爆発前処理を実施するための先行技術で知られたあらゆるパラメータも、本発明の方法で使用することができる。蒸気爆発のために選択される条件は、原料の性質および酵素の感受性の望ましい程度に依存する。しかしながら、当技術分野内で知られたその他の方法は、前処理された原料の調製のため必要に応じ使用することができ、例えば、ＵＳ５，８４６，７８７（ラディッシュ（Ｌａｄｉｓｃｈ））、ＵＳ５，１９８，０７４（ヴィラヴィセンシオ（Ｖｉｌｌａｖｉｃｅｎｃｉｏ））、ＵＳ４，８５７，１４５（ヴィラヴィセンシオ（Ｖｉｌｌａｖｉｃｅｎｃｉｏ））またはＵＳ４，５５６，４３０（コンヴァース（Ｃｏｎｖｅｒｓｅ）；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で開示されたもの、アンモニア冷凍爆発（米国特許５，１７１，５９２、ホルツァップル（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ））および濃縮アルカリ処理であるが、それらに限定されない。
【００５９】
前処理段階が行われるかどうかにかかわらず、セルロース原料は、酵素加水分解の前に、例えばＷＯ０２／０７０７５３（グリフィンおよびその他。これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で開示されたように、選択的に、水で洗浄しまたは水で濾しとることができる。前処理されたセルロース原料の洗浄により、溶解した糖、糖分解生成物、溶解したリグニンおよびフェノール化合物、ならびにシステム中のその他の有機化合物などのセルラーゼ酵素の阻害物質を除去することができる。洗浄され前処理された原料内のセルロースの濃度は通常、例えば約５０％−７０％の水準まで増大する。
【００６０】
セルロース材料は、高密度であり、依然汲み上げることができる濃度の液体中でスラリーとされる。例えば、しかし限定的であることを希望せず、液体は、水、再利用されたプロセス流または処理された流出物でもよい。スラリー中のセルロース原料の濃度は材料に依存するが、約３％から約３０％（ｗ／ｗ）の非溶解固体、またはその間の濃度、例えば約５％から約２０％もしくは約１０％から約２０％の非溶解固体またはそれらの間の量でもよい。例えば、スラリー中のセルロース原料の濃度は、３、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０％の非溶解固体（ｗ／ｗ）でもよい。当技術分野でよく知られているように、懸濁または非溶解の固体の濃度は、ガラス・マイクロファイバー濾過紙を使用してスラリーのサンプルを濾過し、濾過ケーキを水で洗浄し、かつ１０５℃で一晩中ケーキを乾燥させることにより、決定することができる。
【００６１】
スラリーのｐＨは一般的に、使用されるセルラーゼ酵素のための最適ｐＨ（ペーハー）の範囲内に調整される。一般的にスラリーのｐＨは、約３．０から約７．０もしくは約４．０から約６．０またはそれらの間のｐＨの範囲内、好ましくは約４．５から約５．５の範囲内に調整される。例えばｐＨは、約３．０、３．５、４．０、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、６．０、６．５または７．０でもよい。スラリーのｐＨは、当技術分野で知られている適切な酸または塩基を使用して調整することができる。例えば、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムもしくはその他の適切な塩基（スラリーが酸性の場合）、または硫酸もしくはその他の適切な酸（スラリーがアルカリ性の場合）を使用することができる。しかしながら、スラリーのｐＨは、使用されるセルラーゼ酵素が好アルカリ性または好酸性である場合それぞれ、約４．５から約５．５より高くまたは低くすることができる。スラリーのｐＨは、使用される酵素のための最適ｐＨの範囲内に調整すべきである。
【００６２】
スラリーの温度は、セルラーゼ酵素の活性にとって最適な範囲内にある点まで調整される。一般的に、約４５℃から約７０℃もしくは約４５℃から約６５℃の温度またはそれらの間の温度は、ほとんどのセルラーゼ酵素に適している。例えばスラリーの温度は、約４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０℃に調整することができる。しかしながら、スラリーの温度は、好熱性のセルラーゼ酵素について、より高くすることができる。
【００６３】
セルラーゼ酵素は次いで、スラリーに添加される。「セルラーゼ酵素」、「セルラーゼ」または「酵素」という用語により、セルロースの加水分解に触媒作用を起こし、グルコース、セロビオースおよびその他のセロオリゴ糖などの生成物を作る酵素が意味される。セルラーゼは、多くの植物および微生物により生産され得るエクソ−セロビオハイドロラーゼ（ｅｘｏ−ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）（ＥＧ）および［ベータ］―グルコシダーゼ（［ベータ］Ｇ）を含む多酵素混合物を表す一般名である。本発明の方法は、それらの入手源にかかわらず、いかなる種類のセルラーゼ酵素によっても行うことができる；しかしながら、微生物のセルラーゼは一般的に、植物のものより低費用で入手可能である。最も広く研究され、特徴付けられ、かつ商業的に生産されているセルラーゼの中には、アスペルギルス、フミコーラおよびトリコデルマ属の菌ならびにバチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の細菌から得られるものがある。糸状体菌トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）から生産されるセルラーゼは、ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩと名付けられた少なくとも２個のセロビオハイドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）ならびに少なくとも４個のＥＧ酵素を含む。
【００６４】
セルラーゼ酵素は、相乗的に作用してセルロースをグルコースに分解する。ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩは一般的に、セロビオースを遊離させるセルロース・ミクロフィブリル中のグルコース・ポリマーの末端で作用する（テレマン（Ｔｅｌｅｍａｎ）およびその他、１９９５年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３１：２５０−２５８）一方、エンドグルカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｓ）は、セルロース上の任意の場所で作用する。これらとともに、酵素は、セルロースをセロビオースなどのより小さいセロオリゴ糖に加水分解する。セロビオースは、［ベータ］―グルコシダーゼによりグルコースに加水分解される。
【００６５】
スラリーに添加されるセルラーゼ酵素の投与量は、過剰投与なしに、十分に高い水準のセルロース転化を達成するよう選択される。例えば、適切なセルラーゼ投与量は、セルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵまたはそれらの間の量でもよい。例えば、セルラーゼ投与量は、１グラムあたり約１．０、３．０、５．０、８．０、１０．０、１２．０、１５．０、１８．０、２０．０、２２．０、２５．０、２８．０、３０．０、３２．０、３５．０、３８．０もしくは４０．０ＦＰＵまたはそれらの間の量でもよい。ＦＰＵ（濾紙単位）は、当業者によく知られた標準の測定法であり、ゴーセ（１９８７年、Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−２６８）に従い定義および測定される。グルコースへの完全な転化のため、セルラーゼが適切な量のβ―グルコシダーゼ（セロビオース）活性を含むことが好ましい。β―グルコシダーゼの投与量水準は、セルロース１グラムあたり約５から約６００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量である。β―グルコシダーゼの通常の投与量水準は、セルロース１グラムあたり約１０から約４００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量である；例えば投与量は、セルロース１グラムあたり１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７、５０、５２、５５、５７、６０、６２、６５、６７、７０、７２、７５、７７、８０、８２、８５、８７、９０、９２、９５、９７、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０および４００β―グルコシダーゼ単位またはそれらの間の量でもよい。β―グルコシダーゼ単位は、ゴーセの方法（１９８７年、Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ． ５９：２５７−２６８）に従い測定される。
【００６６】
セルラーゼ酵素は、粉末または顆粒として水溶液中で取り扱うことができる。酵素は、反応容器（加水分解塔または加水分解反応器ともいう；１１０または１１０’、図１）へのスラリーの投入の前の時点でスラリーに添加することができる。例えば、しかし限定的であることを希望せず、セルラーゼ酵素は、加水分解タワーに入る直前にスラリーに添加することができる。酵素は、当業者によく知られている混合装置を使用してスラリー中に混合することができる。非限定的な実施例において、主要な加水分解反応器（１１０または１１０’）の上流に位置する小さな補給タンク（９０、図１Ａ）は、酵素をスラリーに添加し、ｐＨを調整し、かつスラリーの望ましい温度を達成するために使用することができる。
【００６７】
図１Ａを参照して、原料１０は、上記で説明したとおり前処理される。この流れは、生成物の流れ３０またはその他の適切な流体に接触して交換する熱交換器２０を使用して冷やされる。スラリー４０は次いで、熱交換器５０において、２番目の流体、例えば冷水４５を使用して、さらに冷やされる。スラリーは次いで、ｐＨを調整するため、セルラーゼ酵素７０および水酸化アンモニウム８０とともに、加水分解補給タンク９０の中に汲み入れることができる。この実施例において、加水分解補給タンク９０の内容物は、混合され、補給タンク９０から、配管１００に沿って、加水分解タンク１１０へ汲み入れられる。しかしながら、セルラーゼ酵素は、他の場所、例えば１９０、１９５または１９７、あるいは配管１０、４０もしくは１００またはそれらの組合せを含むがそれらに限定されない加水分解反応器に原料を供給する配管内で、原料と混合することができる。
【００６８】
「加水分解塔」、「上向流加水分解反応器」、「加水分解反応器」、「加水分解タンク」または「上向流沈殿反応器」という用語により、セルラーゼ酵素によりセルローススラリーの加水分解を促進する適切な構造の反応容器（タワー）、例えば１１０（図１Ｂ）または１１０’（図１Ｃ）が意味される。加水分解タンクは、望ましい温度を維持するため、絶縁体、蒸気、温水、電気的な熱追跡、またはその他の熱源を用いて保温することができる。本出願において、加水分解反応器は、反応器の内容物の混合が加水分解反応中に起こらないという意味で、非混合加水分解反応器である。以下に示すとおり、反応器の内容物の一定の少ない量の局所的な混合が、システムからの固体および液体の添加および回収に伴う少量の動力投入により起こり得る。スラリーおよびセルラーゼ混合物は、底部で直接に上向流沈殿反応器に入り、加水分解タワー中で上方へと汲み上げられ得る；代替的に、スラリーは、反応器の中央（例えば１０５）に配置された配管を通じて下方へ汲み出され、反応器の底部で現れ配管を囲み上方へと流れ得る。後者の配置は、スラリーからの熱を加水分解反応器において捉えることができるという点で有利である。一旦スラリーが加水分解タンク１１０または１１０’の底部に到達すると、スラリーは上方に移動し、加水分解タンクの幅を横切って分散する；軸方向の分散（すなわち、タンクの高さに沿った分散）は、混合を避けることにより最小化される。スラリーの流速は、スラリーの液体成分が非溶解固体の速度より速い速度で上方に流れるよう選択される。加水分解タワーは、スラリーの内容物が特定の高さにおいて半径方向で比較的均一であるように設計される。均一な分配は、分配器（例えば１２０）または当技術分野においてよく知られているその他の装置を使用して達成することができる。これは、フラクタル分配器（例えば、アマルガメイテッド・リサーチ・インク（Ａｍａｌｇａｍａｔｅｄ ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．）が製造するローン・ハース・アドバンスド・アマーパック（Ｒｏｈｎ Ｈａａｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｍｅｒｐａｃｋ）（登録商標））または回転ワンドを含み得る。例えば、図１Ｂにおいて、垂直の制御軸は、反応器１１０の底部における１対の一端が飛び出たトラス・アームおよび反応器の最上部における別の１対を支える。アームは、容器の底部で生成物を分配し、最上部で生成物を回収するためのノズルの付いたヘッダー・システムを組み込む。２個の出入口のある回転継手が、中央軸からの原料投入および排出のために使用される。加水分解タンク内のスラリーの分配は、回転翼またはポンプによる激しい混合なしに達成される。
【００６９】
図１Ｃは、タンクの最上部に配置された浄化器領域１３５を含む代替的な加水分解タワー１１０’を示す。以下でより詳細に説明するとおり、固体の大部分は、領域１３０の最上部で回収される。過剰の、浄化された液体は、領域１３５で上方に流れ続け、透明な液体として回収される。
【００７０】
加水分解反応器１１０または１１０’は、説明したように反応器を横切って比較的均一なスラリー濃度を維持するいかなる寸法でもよい。限定的であることを希望せず、加水分解タワーは、約１０フィートから約１３０フィート（３から４０ｍ）の間またはそれらの間の量の直径を有してもよい；例えば反応器の直径は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５もしくは１３０フィートまたはそれらの間の量でもよい。加水分解反応器の高さは、反応器が本書中で説明した目的を達成することを条件として、いかなる高さでもよい。限定的であることを希望せず、反応器の高さは、約５から約７５フィートもしくは約５から約６５フィート（１．５から２３ｍ）またはそれらの間の量、好ましくは約２０から約６５フィートでもよい；例えば反応器の高さは、約５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３２．５、３５、３７．５、４０、４２．５、４５、４７．５、５０、５２．５、５５、５７．５、６０、６２．５または６５フィートでもよい。加水分解反応器の高さと直径の比率は、約０．５から約１０の間またはそれらの間の比率でよい；好ましくは、高さと直径の比率は、約０．５から約３である。反応器の全体の寸法は、反応器が水で満たされたときに、反応器を支える土台上に過度の負荷をかけることを避けるよう選択すべきである。限定されない実施例において、１１０フィートの直径および６５フィートの高さを有する加水分解反応器は、４．６０百万ガロンの容量を有するだろう。
【００７１】
スラリーは、液体が反応器の上部へ均一に流れることを可能とする平均スラリー流速で反応器１１０または１１０’内に上方へと汲み上げられる一方、セルロースを含む粒子は、液体よりも高密度であり、液体よりも緩慢に反応器の上部へ流れ、沈殿し、原料固体の濃度よりも高い一定の固体濃度で固まる。スラリーの「平均流速」または「スラリー流速」は、反応器の容量および反応器へのスラリー流速に基づく、名目的なスラリーの滞留時間で除した加水分解反応器の高さである。例えば、３０フィートの高さである１２０，０００ガロンの加水分解反応器への１時間あたり１０，０００ガロンのスラリー投入速度は、１２０，０００ガロン／（１０，０００ガロン／時間）＝１２時間の名目的なスラリー滞留時間および３０フィート／１２時間＝２．５フィート／時間の平均スラリー流速を有する。平均流速は、固体が平均スラリー流速よりも緩慢な速度で上方に流れることが可能となるよう選択される。このことは、固体が名目スラリー滞留時間よりも長い加水分解反応器中の平均滞留時間を有することを可能とする。これは、反応器中の液体と固体の流速および滞留時間が実質的に同一であるスラリー栓流反応器とは異なる。これが達成される流速は、原料およびスラリー中の固体粒子の大きさ、ならびに添加される凝集剤の存在に依存する。凝集剤の使用は、より高い平均流速の使用を可能とし得る。一般的に、平均流速は、１時間あたり約０．１から約２０フィートまたはそれらの間の速度である。好ましくは、平均流速は、１時間あたり約０．１から約１２フィートの間またはそれらの間の量である。より好ましくは、平均流速は、１時間あたり約０．１から約４．０フィートの間またはそれらの間の量である。例えば、平均スラリー流速は、１時間あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５または２０．０フィートでよい。加水分解反応器中の名目的なスラリー滞留時間は、通常４−１２０時間、好ましくは１２−１００時間、最も好ましくは２０−１００時間である。
【００７２】
本発明の方法を使用して、スラリーの性質は、セルロースの加水分解が進行するにつれ変化する。理論に拘束されることを希望せず、加水分解反応の間、セルラーゼ酵素はセルロースに結合し、これにより、スラリー中のセルロースを含む固体粒子に結合したままである。スラリーの平均上昇速度は緩慢であり、その結果固体粒子は、スラリー全体よりも高密度であり、液体よりも緩慢に上方に流れる傾向がある。セルロースを含む固体粒子の緩慢な上昇流は、液体よりも長い時間、セルロースを含む固体および結合したセルラーゼ酵素を反応器中に滞留させる。結合した酵素がセルロースを消化しグルコースを溶液中に放出するにつれ、セルロースの量および固体粒子の密度は変化する。変化した密度により、より小さい粒子は、液体とともに上方に流れるか、または反応器の底部に沈殿する。セルロースを含む粒子の液体と比較して特異な滞留により、セルロースの濃度は、加水分解反応器の底部から最上部へと減少する一方、グルコースの濃度は、反応器の底部から上部へと増大する。セルロースの濃度の減少およびグルコースの濃度の増大は、加水分解反応器１１０（図１Ａおよび１Ｂを参照）の「加水分解領域」１３０で起こる。含水した糖の流れ、非加水分解固体および近接するセルロースを含む粒子は、反応器１１０の加水分解領域の最上部１４０の付近１５０で回収される。固体の少なくとも一部は次いで、例えば固体―液体分離器を使用してグルコースの流れから分離され、例えば、沈殿タンク１６０および生成物の流れ３０は、エタノールへの発酵およびその他の追加の処理（１７０）のために送られる。加水分解タワー内のセルロースのより長い滞留は、セルロースからグルコースへの転化の程度を増大させ、それにより、混合反応器内で達成される場合よりも、より小さな反応器内でより長いセルロース加水分解時間を達成する。代替的に、より高度のセルロース転化は、その他の場合に要求されるよりも低い酵素投与量で達成される。
【００７３】
「非加水分解固体」、「非転化固体」という用語により、セルラーゼ酵素により消化されないセルロース、ならびに原料中に存在するセルラーゼに対して不活性の非セルロースまたはその他の材料が意味される。例えば、しかしいかなる形でも限定的となることを希望せず、非転化固体は、リグニン、二酸化珪素またはその他の固体材料を含み得る。原料中のセルロースが加水分解されるにつれ、セルロースを含む固体粒子内の非転化固体の濃度は増大する。密度および粒経により、非転化固体は、１５０で生成物とともに除去されるか、または底部で沈殿物もしくはスラッジ１８０中に沈殿し得る。非常に重い粒子によりスラッジ層が反応器の底部で形成されるとき、当技術分野で知られるいかなる方法も、スラッジまたは沈殿物を除去するために用いることができる。非限定的な実施例において、スラッジを除去するためにスクレーパーを使用することができる。追加の実施例において、反応器の底部は、最も重い固体が沈殿し、除去され（例えば配管１６７）、リグニン処理１６５のために送ることができる通路を提供するため、先細とすることができる。
【００７４】
加水分解反応器１１０の最上部１４０の付近に認められる含水グルコース、非転化固体およびその他の粒子は、流れ１５０として除去することができる。反応器の最上部からの回収に続いて、非転化固体の少なくとも一部は、可溶性の糖の流れから分離することができる。非転化固体の除去は、固体−液体分離器を使用して、例えば、濾過（例えば、フィルタープレス、ベルト・フィルター、ドラム・フィルター、真空フィルターまたは膜フィルター）、遠心分離、沈殿、例えば、沈殿タンク１６０、傾斜のある沈殿器（例えば、クヌートセン（Ｋｎｕｔｓｅｎ）およびデイヴィス、２００２年、Ａｐｐｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、９８−１００：１１６１−１１７２、ならびにムーアおよびその他、２００１年、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９１−９３：２９７−３０９。両者は、参照により本明細書の一部に組み込まれる。）、浄化器、または当技術分野において知られているであろう、その他の適切な方法により、達成することができる。浄化器は、固体と液体との分離を促進する多数の傾いた板、または固体−液体分離の技術分野において知られているその他の特徴を含み得る。本質的に非溶解固体を含まない可溶性のグルコースは、そのときエタノールへの発酵（１７０）に適している。非転化固体は主にリグニンであり、これは工場の燃料として燃焼および使用することができる。
【００７５】
代替的に、含水グルコースの流れは、非転化固体の回収から離れた場所で回収される。グルコースから非転化固体を分離する代替的な方法は、加水分解タワーの底部から上方に約６５％から約８５％の高さまで延びる加水分解領域１３０および加水分解領域の真上の「浄化器領域」１３５を有する、図１Ｃ中の反応器１１０’を使用することである。加水分解の流れは、加水分解領域１３０の最上部から浄化器領域１３５内へ汲み上げられる。固体の大部分は、加水分解領域１３０の最上部で回収される。例えば、しかしいかなる形でも限定的となることを希望せず、ノズルを有する水平ワンドは、ある時間間隔で反応器の最上部を横切って前後に通過し、固体を多く含む流れは、ワンド中へ回収され、反応器から汲み上げられる（１６２）。過剰の、浄化された液体は、浄化器領域１３５内へと上方に流れ続ける。浄化器領域１３５において、固体は一般的にワンドの高さで沈殿する一方、本質的に固体を含まない含水した糖の流れは、最上部から除去される（３０）。浄化器領域は、固体と液体との分離を促進する多数の傾いた板、および固体−液体分離の技術分野において知られているその他の特徴を含み得る。非転化固体（または非加水分解固体）は、非加水分解固体から加水分解生成物の少なくとも一部を分離するため、固体−液体分離器に運ぶことができる。
【００７６】
それが望ましい場合、グルコースの流れからの分離により得られるセルロースを含む固体は、グルコースへの追加の転化のために投入される原料とともに、上方沈殿反応器または加水分解領域中に再使用のため戻すことができる。
【００７７】
反応器の内容物の一定の少ない量の局所的な混合が、システムからの固体および液体の添加および回収に伴う少量の動力投入により、起こり得ると理解されたい。例えば、局所的な混合は、加水分解反応器中にスラリーを投入する分配器１２０、ワンドまたはポンプの作用により起こり得る。最善の操作のため、加水分解反応器の操作に関連した固体および液体の添加および回収を行うために必要となる動力は、０．１ＨＰ／１０００ガロンを超えない。これらの上向流反応器の機能に関連した動力は、０．００１と０．１ＨＰ／１０００ガロンの間またはそれらの間の範囲でよい。例えば、これらの上向流反応器の機能に関連した動力は、０．００１、０．００３、０．００８、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９または０．１ＨＰ／１０００ガロンでもよい。スラリーを混合するため特に設計された、反応器中の回転翼、攪拌器、排出装置またはその他の装置は存在しない。
【００７８】
複数の加水分解反応器が使用される場合、反応器は、一連の２個以上の反応器において作動し、この場合、第１の反応器の出口が第２の反応器の入口に原料を供給する。代替的に、反応器は、並行して作動させることができる。さらに、連続する反応器のいくつかを連続して作動させることができる一方で、他のものを並行して作動させることができる。
【００７９】
上向流反応器に追加して一つまたは複数の他の反応器の種類、例えば一つまたは複数のバッチまたは連続的な攪拌される反応器などを利用することができるとも理解されたい。非限定的な実施例において、連続的な攪拌される反応器の出口は、上向流反応器の入口に原料を供給する。当業者にとって明白なように、反応器の種類の他の組合せを本発明において使用することができる。
【００８０】
本発明の代替的な態様において、凝集剤は、本発明の能率を高めるためスラリーに添加することができる。凝集剤は通常、カチオン性、非イオン性、アニオン性もしくは両性（荷電群の混合物を含む）であるポリマー、または明礬などの塩である。理論に拘束されることを希望せず、凝集剤は、酵素混合物に対する一層完全な曝露を確実とするため、加水分解反応器内で固体を凝集させるのに役立つ。
【００８１】
本発明を実施するにあたり、１個の凝集剤または複数の凝集剤を含む混合物を使用することができる。凝集剤は、スラリーへの添加に適したあらゆる形態で提供することができる；例えば、凝集剤は、粉末、液体または分散液でもよい；例えば、分散液は、油または水溶液中で懸濁された凝集剤でもよい。適切な凝集剤の非限定的な実施例は、カチオン性ポリマー、より具体的にはポリアクリルアミドである。該凝集剤は、ＣＡ４５００（フランス、ＳＮＦフロエルジェ（Ｆｌｏｅｒｇｅｒ）（登録商標））およびゼタック（Ｚｅｔａｇ）（登録商標）７６５１（カナダ、チバ（登録商標）・スペシャリティー・ケミカルズ）を含むがそれらに限定されない。
【００８２】
使用される凝集剤の量は、上向流反応器中で固体を凝集させるのに必要な量により決定される。当業者は、方法全体に望ましくない費用を加えることなく固体の凝集に役立つであろう、添加する凝集剤の量を決定することができるだろう。例えば、しかし限定的であることを希望せず、添加される凝集剤の量は、固体１トンあたり約０．１から４．０ｋｇの範囲の量もしくはそれらの間の量、または固体１トンあたり約０．５から約２．０ｋｇもしくはそれらの間の量でもよい。例えば、添加される凝集剤の量は、固体１トンあたり約０．１、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．５、３．０、３．５または４．０ｋｇでもよい。
【００８３】
凝集剤は、スラリーに直接添加し、またはスラリーへの添加の前に水中で分散および希釈することができる。凝集剤は、スラリーへの添加の前にセルラーゼ酵素と混合することもできる。凝集剤の分散は、システム中の凝集剤の均一な適用を確実とするのに役立つ場合がある。本発明の非限定的な実施例において、凝集剤は、約０．０１重量％から約２５重量％またはそれらの間の量の濃度で水中で分散させることができる；例えば、凝集剤の濃度は、０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、７．０、１０．０、１２．０、１４．０、１６．０、１８．０、２０．０、２２．０もしくは２５．０重量％でもよい。凝集剤は、適切な時間、例えば約１分から約１時間、混合によりこの濃度で分散させることができる。分散した凝集剤は次いで、セルローススラリーに直接添加し、または加水分解反応器への添加の前に、約０．０１重量％から約１．０重量％もしくはそれらの間の量の濃度まで、水中でさらに希釈することができる。例えば、さらに希釈した凝集剤の濃度は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０重量％でもよい。
【００８４】
従って本発明は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムを提供し、該システムは、向流加水分解反応器（例えば、１１０または１１０’）への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管（例えば１０、４０、１００）、向流加水分解反応器と流体連通状態にある固体−液体分離器（例えば１６０または１３５）を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物は、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該向流加水分解反応器の両方は、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含む。好ましくは、原料供給配管は、上記で概略を述べたとおり調製された、前処理された原料を含む。さらに、システム内のセルラーゼ酵素は、前処理された原料のセルロース１グラムあたり、約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在し、一つまたは複数の凝集剤は、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在する。
【００８５】
本発明は、本書中で説明するように、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用にも関する。このシステムが約６０から約９８％のセルロースからグルコースへの転化をもたらすので、グルコースは、エタノールの生産に使用することができる。好ましくは、セルラーゼ酵素は、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される。一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択することができる。好ましくは、一つまたは複数の凝集剤は、カチオン性ポリマー、例えばポリアクリルアミドである。本書中で説明するセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤は、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するための酵素組成物の調製にも使用することができる。従って本発明は、エタノールの生産のため、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用も提供する。
【００８６】
凝集剤または希釈した凝集剤は、スラリーへの酵素添加の地点の前（１９５；図１Ａ）、酵素添加の地点（１９０）、酵素添加の地点の後（１９７）、またはこれらの場所の組合せにおいて、添加することができる。さらに凝集剤は、加水分解反応器（１９２；図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）の底部もしくはその付近、加水分解反応器の中間部（１９１）、反応器の最上部（１９３）、反応器の外部の場所（１９５、１９７）、またはこれらの場所の組合せにおいて、スラリーに添加することができる。非限定的な実施例として、凝集剤は、反応器の底部（１９２）およびその中間部（１９１）で添加することができる。凝集剤が酵素の活性を阻害し、または酵素の活性に消極的な影響を与える場合、凝集剤は、スラリーまたは加水分解タンクへの添加の前に酵素に有害となる可能性がある方法で、酵素に直接接触すべきではない。
【００８７】
凝集剤は、一連のバルブおよび肘継手を通じて、汲上げにより添加することができる。該配置は、凝集剤とスラリーとの混合を改善し、システムへの混合物の逆流を防ぐことができる。代替的な実施例において、凝集剤に乱流を与えそれにより分散を向上させるため、直列の混合装置を使用することができる。代替的に、凝集剤は、補給タンク９０においてスラリーに添加され（例えば１９０で）、次いで、スラリーおよびセルラーゼ酵素４０とともに加水分解反応器１１０または１１０’に汲み上げることができる。
【００８８】
一旦加水分解反応器１１０または１１０’に入ると、凝集剤は、固体粒子と結合し始め、加水分解領域１３０における凝集に役立つ。理論に拘束されることを希望せず、このことは、反応器中にセルロースを含む粒子を懸濁させておくことにより、該粒子が、反応器の最上部から除去され、スラッジ層に沈殿し、またはそれらの組合せの状態になることを防ぐのに役立つ。固体粒子を結合させることは、加水分解領域（１３０）内のセルロースを含む粒子により一層長い滞留時間を許容し、酵素によるセルロースのより完全で効率的な消化をもたらす。上向流反応器１４０の最上部において、凝集剤は、主として非転化固体に結合し、粒子とともに反応器から出る（１５０；図１Ａ）。
【００８９】
配管３０を通じて反応器１１０または１１０’から出る前処理された原料からのセルロースの加水分解により生産されるグルコースは、発酵してエタノールとなる（１７０）と予想される。グルコースおよびその他の糖のエタノールへの発酵は、当業者に知られた従来の方法により行うことができ、例えば、ＷＯ９５／１３３６２、ＷＯ９７／４２３０７またはセルロース・バイオマスからのアルコール生産：アイオジェン（Ｉｏｇｅｎ）・プロセス（所収：アルコール・テキストブック、ノッティンガム大学新聞、２０００年；これは参照により本明細書の一部に組み込まれる）で説明されたもの、だがそれらに限定されない、酵母および細菌を含む多様な微生物または遺伝子組換えが行われた微生物により実施することができる。エタノールの生産および回収は、アルコール産業の技術者に知られた十分に確立した方法を使用して行われる。
【００９０】
前記で示したとおり、上向流沈殿反応器は、セルロースのグルコースへの酵素転化に適している。しかしながら、この種類のシステムは、セロビオース（好ましくは、βＧがセルラーゼから抜けている場合）およびグルコース・オリゴマー（好ましくは、ＣＢＨおよびβＧがセルラーゼから抜けている場合）を含む、その他の生成物にセルロースを転化するために使用することができる。
【００９１】
本発明の方法は、固体が反応器中に存在する時間の長さを増大させ、このことは、酵素がセルロースに結合し続けるため、セルラーゼ酵素とセルロースとの間の接触時間を増大させる。このことは次に、所定の寸法の加水分解反応器で得られるセルロース転化の程度を増大させることにより、加水分解過程の効率を増大させる。従って、酵素加水分解の費用は最小化される。さらに上向流沈殿法は、反応器内の攪拌を必要とせず、混合に伴う動力および装置の費用を節約する。
【００９２】
上記の説明は、いかなる形でも、請求される発明を限定することを意図しない。さらに、論じられた特徴の組合せは、発明の説明にとって不可欠でないかもしれない。本発明は、以下の実施例でさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は説明のみを目的とし、いかなる形でも本発明の範囲を限定するために使用すべきでないと理解されるべきである。
【実施例１】
【００９３】
大型上向流加水分解反応器
前処理されたコムギわらは、ＵＳ４，４６１，６４８（フーディー、参照により本明細書の一部に組み込まれる）の方法を使用して調製される。前処理された材料は、７．８％の非溶解固体、７０℃の温度、および５５３ｔ／時間の質量流速の水性スラリーである。この水性スラリーは、生成物の流れ（３０）に接触して、熱交換器（２０）で６０℃まで冷やされる。６０℃のスラリーは次いで、熱交換器中の冷水（４５）により最終温度の５０℃まで冷やされる。スラリーは、ｐＨ（ペーハー）を４．５から５．０に調整するため、セルラーゼ酵素（７０；５ＦＰＵ／ｇセルロース）およびアンモニア（８０；湿式スラリー１トンあたり１２００グラム）とともに、加水分解補給タンク（９０；容量８６，０００ガロン）中に汲み入れられる。加水分解補給タンクの内容物は、４０分の滞留時間中に混合され、次いで結合流（１００）は、補給タンクから加水分解タンク（１１０）の中央（１０５）を通じる配管を下って汲み出される。加水分解タンクは、５０℃に維持するため使用される１５ｐｓｉｇの蒸気で保温されている。加水分解タンクの底部で、スラリーは、上方に汲み上げられ、加水分解タンクの幅を横切って分散する（１２０）。
【００９４】
加水分解タンクは、４．６百万ガロンの容量を有する。液体は、固体より速く加水分解タンク中を上方へ流れ、固体は、タンク全域で約１０％の濃度まで沈殿する。セルロースは、１８８時間タンク中に維持され、これは、９２％のセルロースをグルコースに転化するのに十分な長さである。含水した糖の流れおよび非加水分解固体（１５０）は、タンクの最上部から流れ出し、沈殿タンク（１６０）に汲み入れられる。１．１２百万ガロンの容量を有した沈殿タンクにおいて、固体は、１０％の濃度まで底部に沈殿し、圧搾および洗浄により固体から糖を回収するため、配管１６２を経由してリグニン・フィルタープレス１６５へ汲み出される。この流れからの糖は、沈殿器の最上部からの糖の流れと結合し、これは次いで、エタノールへの発酵（１７０）のため送られる。
【実施例２】
【００９５】
トリコデルマ・セルラーゼ酵素を用いた上向流加水分解
コムギわらは、ＵＳ４，４６１，６４８（フーディー、参照により本明細書の一部に組み込まれる）の方法を使用して前処理された。前処理された原料は、３．７％非溶解固体の濃度により水中でスラリーとされ、ｐＨ（ペーハー）は、３０％水酸化ナトリウムを用いて５．５に調整された。非溶解固体は、５５％がセルロースであった。スラリーは、垂直の加水分解反応器（１１０；図１Ｃ）の底部へ毎分４０リットルの速度で汲み入れられた。これは、０．７フィート／時間の上昇流速に相当する。タワーの容量は１４４，７００リットルであり、このうち加水分解領域（１３０）は下方の１１５，０００リットル（３４．４フィートの高さ）であり、最上部の２９，７００リットルは浄化器（１３５）であった。タワーの直径は、３．８メートルであり、高さは１３．５メートル（４４．３フィート）であった。スラリーの温度は、反応器の入口で５５℃であり、反応器の最上部付近で約５０℃まで徐々に低下した。トリコデルマ（オタワ、アイオジェン（Ｉｏｇｅｎ）・バイオプロダクツから入手可能）から得られたセルラーゼ酵素は、セルロース１グラムあたり３６ＦＰＵの投与量で加水分解補給タンク（９０；図１Ａ）中のスラリーに添加され、実施例１と同様にタワーに投入される前に配管に添加された。
【００９６】
前処理された固体およびセルラーゼを含むスラリーは、タワー１０５の底部に汲み入れられ、スラリーがタワーの上方に流れるにつれ加水分解が起きた。タワーの容量の７９％である加水分解領域の最上部において、スラリーは浄化器領域１３５に移された。沈殿した固体を含む流れは、加水分解領域および浄化器領域の接触面で回収された（１６２；図１Ｃ）。非溶解固体のほとんどない水相にあるグルコースを含む第２の流れ３０は、浄化器領域の最上部で回収された。
【００９７】
運転の過程を通じた反応器中の固体の分析結果を図２に示す。底部の上１フィートの高さで、非溶解固体は、８重量％から１４重量％の濃度まで沈殿した。これは、３．７％の非溶解固体の原料濃度に比べて著しく濃度が高い。これより高い地点において、固体濃度はより低い。
【００９８】
セルロース転化の分析結果を図３に示す。セルロース転化の程度は、１５フィートおよび２４フィートの高さにおいて、運転の初期に７３％から８３％であり、終了までに９５％であった。上向流反応器から流れ出る流れの中のグルコース濃度は、２５ｇ／Ｌであった。これは、反応器の混合、剪断の提供、またはタワーの上方に緩慢に汲み上げる以外に原料を他の方法で移動させることなしに、良好な水準のセルロース転化およびグルコース生産が得られたことを示す。
【実施例３】
【００９９】
凝集剤の存在下でトリコデルマ・セルラーゼ酵素を用いた上向流加水分解
前処理されたコムギわらの加水分解が、４．４％の非溶解固体を用いて実施例２で説明したとおり行われた。但し、凝集剤が固体の沈殿を改善するために添加された。カチオン性ポリマー、ＣＡ４５００（フランス、ＳＮＦフロエルジェ（Ｆｌｏｅｒｇｅｒ）（登録商標））が非溶解固体１トンあたり２ｋｇの投与量で添加され、スラリーへの酵素添加の地点後の添加と同時に、インラインで分散された。
【０１００】
運転の過程を通じた反応器中の固体の分析結果を図４に示す。底部の上１フィートの高さで、非溶解固体は、実施例２で観察されたのと同様に、６重量％から１０重量％の濃度まで沈殿し、４．４％の非溶解固体の原料濃度に比べ、著しく濃度が高かった。反応器内のこれより高い地点において、固体濃度は、５．５％から８％であった。これは、凝集剤が固体を凝集させ沈殿させるのに効果的であることを示した。
【０１０１】
セルロース転化の分析結果を図５に示す。セルロース転化の程度は、１５フィートおよび２４フィートの高さにおいて、運転の初期に６５％から８５％であり、終了までに８５％から９２％であった。反応器から流れ出る流れの中のグルコース濃度は、２７ｇ／Ｌであった。これは、反応器の混合、剪断の提供、またはタワーの上方に緩慢に汲み上げる以外に原料を他の方法で移動させることなしに、良好な水準のセルロース転化が得られたことを示す。
【実施例４】
【０１０２】
凝集剤の存在下および不在下における様々の酵素水準でのセルロース転化
実施例２および３で説明した加水分解反応は、同様の最終的なグルコース濃度を示したが、これは、酵素の過剰の存在による可能性がある。加水分解の効率に対する凝集剤の効果を決定するため、加水分解が、様々の酵素投与量において凝集剤の存在および不在下で行われた。
【０１０３】
前処理されたコムギわらの加水分解が、実施例２および３で説明したとおり行われた。但し、添加されるセルラーゼ酵素の量は、変更された。８、１２、１６、２０、２４、２８、３２および３６ＦＰＵの酵素による加水分解が、４８時間、凝集剤の存在および不在下で行われた。セルロース転化（単位：％）が測定され、これを図６に示す。
【０１０４】
図６に示すように、より低い酵素投与量において、凝集剤の使用は、セルロース転化の増大をもたらす。このことは、セルロース転化の費用の全体的な節約を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１Ａ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で上向流反応器および沈殿タンクを含むシステムを示す。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で図１Ａの上向流反応器を示す。
【図１Ｃ】本発明の実施形態に従って使用することができる上向流反応器を含むシステムの概略図で上向流反応器が浄化器領域を含む場合のシステムの一部を示す。
【図２】凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【図３】凝集剤の添加がない場合に、加水分解反応器内の様々の高さでのサンプリングにより測定されたセルロース転化の百分率を示す。
【図４】凝集剤がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた非溶解の固形分を示す。
【図５】凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内の様々の高さでサンプリングされた、転化されたセルロースの量を示す。
【図６】凝集剤がない場合と比較して、凝集剤の添加がある場合に、加水分解反応器内から出た生成物におけるセルロース転化の効率の増加を示す。
【符号の説明】
【０１０６】
１０ 配管
２０ 熱交換器
３０ 生成物の流れ
４０ 配管
４５ 冷水
５０ 熱交換器
７０ セルラーゼ酵素
８０ 水酸化アンモニウム
９０ 加水分解補給タンク
１１０、１１０’ 加水分解タンク
１２０ 分配器
１３０ 加水分解領域
１３５ 加水分解領域
１４０ 加水分解領域
１５０ 沈殿タンク
１６２ 配管
１７０ エタノールへの発酵
１９１ 加水分解反応器の中間部
１９２ 反応器の底部
１９３ 反応器の最上部
１９５，１９７ 反応器の外部の場所
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ） 非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ） 注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に、またはその組合せにより、セルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；および
ｉｖ） 加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項２】
注入の段階（段階ｉｉ）において、水性スラリーが、均一な放射状分布で加水分解反応器の底部に注入される、請求項１に従う方法。
【請求項３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、一つまたは複数の凝集剤が、セルラーゼ酵素とは別に、もしくはセルラーゼ酵素とともに、またはそれらの組合せにより、水性スラリーに添加される、請求項１に従う方法。
【請求項４】
一つまたは複数の凝集剤が、注入の段階（段階ｉｉ）の前もしくは該段階中に、またはそれらの組合せにより添加される、請求項３に従う方法。
【請求項５】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項１に従う方法。
【請求項６】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項２に従う方法。
【請求項７】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項４に従う方法。
【請求項８】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項１に従う方法。
【請求項９】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項６に従う方法。
【請求項１０】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項７に従う方法。
【請求項１１】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、請求項１に従う方法。
【請求項１２】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、請求項９に従う方法。
【請求項１３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加され、一つまたは複数の凝集剤が固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で添加される、請求項１０に従う方法。
【請求項１４】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１に従う方法。
【請求項１５】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１２に従う方法。
【請求項１６】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１３に従う方法。
【請求項１７】
除去の段階（段階ｉｖ）において、加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流が、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１に従う方法。
【請求項１８】
除去の段階（段階ｉｖ）において、非加水分解固体を含む流れが、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１４に従う方法。
【請求項１９】
除去の段階（段階ｉｖ）において、非加水分解固体を含む流れが、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１６に従う方法。
【請求項２０】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１４に従う方法。
【請求項２１】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１５に従う方法。
【請求項２２】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１６に従う方法。
【請求項２３】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項２４】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１２に従う方法。
【請求項２５】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１３に従う方法。
【請求項２６】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項２７】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１２に従う方法。
【請求項２８】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１３に従う方法。
【請求項２９】
提供の段階（段階ｉ）においてスラリーのｐＨが約４．０から約６．０である、請求項１に従う方法。
【請求項３０】
スラリーのｐＨが約４．５から約５．５である、請求項２９に従う方法。
【請求項３１】
提供の段階（段階ｉ）において温度が約４５℃から約７０℃である、請求項１に従う方法。
【請求項３２】
温度が約４５℃から約６５℃である、請求項３１に従う方法。
【請求項３３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がアスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項１に従う方法。
【請求項３４】
一つまたは複数の凝集剤が、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に従う方法。
【請求項３５】
一つまたは複数の凝集剤がカチオン性ポリマーである、請求項３４に従う方法。
【請求項３６】
カチオン性ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項３５に従う方法。
【請求項３７】
セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤が同時にスラリーに添加される、請求項４に従う方法。
【請求項３８】
セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤が別々にスラリーに添加される、請求項４に従う方法。
【請求項３９】
提供の段階（段階ｉ）においてスラリーのｐＨが約４．０から約６．０である、請求項３に従う方法。
【請求項４０】
スラリーのｐＨが約４．５から約５．５である、請求項３９に従う方法。
【請求項４１】
提供の段階（段階ｉ）において温度が約４５℃から約７０℃である、請求項３に従う方法。
【請求項４２】
スラリーの温度が約４５℃から約６５℃である、請求項４１に従う方法。
【請求項４３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がアスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項３に従う方法。
【請求項４４】
提供の段階（段階ｉ）において、スラリーが約５重量％から約２０重量％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が、約２５重量％から約７０重量％のセルロースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項４５】
糖を含む液体流が、注入の段階（段階ｉｉ）の前に、段階ｉの前処理されたセルロース原料から分離される、請求項１に従う方法。
【請求項４６】
洗浄段階が原料からの液体流の分離の間に使用される、請求項４５に従う方法。
【請求項４７】
水、再利用されたプロセス流、処理された流出物およびそれらの組合せからなる群から選択される洗浄媒体が洗浄段階中に使用される、請求項４６に従う方法。
【請求項４８】
平均スラリー流速が１時間あたり約０．１と約１２フィートの間である、請求項１に従う方法。
【請求項４９】
平均スラリー流速が１時間あたり約０．１と約４フィートの間である、請求項１に従う方法。
【請求項５０】
加水分解が以下により行われる、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５１】
セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項５０の酵素組成物。
【請求項５２】
一つまたは複数の凝集剤が、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５０の酵素組成物。
【請求項５３】
一つまたは複数の凝集剤がカチオン性ポリマーである、請求項５２の酵素組成物。
【請求項５４】
カチオン性ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項５３の酵素組成物。
【請求項５５】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用。
【請求項５６】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するセルロースの酵素加水分解のためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用であって、該酵素組成物の使用が以下からなるもの：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速で、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより軸方向分散を制限すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５７】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためセルロースを加水分解するためのセルラーゼ酵素、一つまたは複数の凝集剤および指示からなるキットであって、該指示が以下からなるもの：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ） 非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速で、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより軸方向分散を制限すること；
ｉｉｉ） 注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ） 加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５８】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムであって、該システムが、上向流加水分解反応器への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管、上向流加水分解反応器と流体連通状態にある固−液分離器を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物が、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該上向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該上向流加水分解反応器の両方が、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含むもの。
【請求項５９】
原料供給配管が前処理された原料を含む、請求項５８のシステム。
【請求項６０】
固体−液体分離器が沈殿タンク、浄化器、浄化器領域、遠心分離器および濾過器からなる群から選択される、請求項５８のシステム。
【請求項６１】
固体−液体分離器が沈殿タンクである、請求項６０のシステム。
【請求項６２】
固体−液体分離器が浄化器領域である、請求項６０のシステム。
【請求項６３】
固体−液体分離器が濾過器である、請求項６０のシステム。
【請求項６４】
セルラーゼ酵素が、前処理された原料のセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在する、請求項５８のシステム。
【請求項６５】
一つまたは複数の凝集剤が、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在する、請求項５８のシステム。
【請求項６６】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためセルロースを加水分解するにあたり使用するための酵素組成物を調製する方法であって、該方法が、植物、菌または微生物の入手源からセルラーゼ酵素を獲得すること、および酵素組成物を生産するためセルラーゼ酵素を一つまたは複数の凝集剤と組み合わせることからなるもの。
【請求項６７】
セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）により生産される、請求項６６に従う方法
【請求項６８】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物。
【請求項１】
以下からなる、前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためのセルロースの酵素加水分解の方法：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ） 非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ） 注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に、またはその組合せにより、セルラーゼ酵素を水性スラリーに添加すること；および
ｉｖ） 加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項２】
注入の段階（段階ｉｉ）において、水性スラリーが、均一な放射状分布で加水分解反応器の底部に注入される、請求項１に従う方法。
【請求項３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、一つまたは複数の凝集剤が、セルラーゼ酵素とは別に、もしくはセルラーゼ酵素とともに、またはそれらの組合せにより、水性スラリーに添加される、請求項１に従う方法。
【請求項４】
一つまたは複数の凝集剤が、注入の段階（段階ｉｉ）の前もしくは該段階中に、またはそれらの組合せにより添加される、請求項３に従う方法。
【請求項５】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項１に従う方法。
【請求項６】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項２に従う方法。
【請求項７】
前処理されたセルロース原料が、コムギわら、エンバクわら、オオムギわら、トウモロコシ茎葉、ダイズ茎葉、カノーラわら、サトウキビ残渣（バガス）、スイッチ・グラス（ｓｗｉｔｃｈ ｇｒａｓｓ）、クサヨシ、コード・グラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）、エンバク殻、サトウダイコン・パルプまたはミスカンサス（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）から得られる、請求項４に従う方法。
【請求項８】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項１に従う方法。
【請求項９】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項６に従う方法。
【請求項１０】
前処理されたセルロース原料が、酵素加水分解の前に、約０％から約５％の硫酸濃度で、約１６０℃から約２８０℃で、約３秒から約３０分間の前処理にかけられている、請求項７に従う方法。
【請求項１１】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、請求項１に従う方法。
【請求項１２】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加される、請求項９に従う方法。
【請求項１３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で添加され、一つまたは複数の凝集剤が固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で添加される、請求項１０に従う方法。
【請求項１４】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１に従う方法。
【請求項１５】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１２に従う方法。
【請求項１６】
除去の段階（段階ｉｖ）の前に、少なくとも一部の加水分解生成物が、加水分解反応器の最上部で浄化器領域を使用することにより非加水分解固体から分離される、請求項１３に従う方法。
【請求項１７】
除去の段階（段階ｉｖ）において、加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流が、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１に従う方法。
【請求項１８】
除去の段階（段階ｉｖ）において、非加水分解固体を含む流れが、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１４に従う方法。
【請求項１９】
除去の段階（段階ｉｖ）において、非加水分解固体を含む流れが、非加水分解固体から少なくとも一部の加水分解生成物を分離するため、固体−液体分離器に移される、請求項１６に従う方法。
【請求項２０】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１４に従う方法。
【請求項２１】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１５に従う方法。
【請求項２２】
加水分解生成物および非加水分解固体が別の場所で浄化器領域から除去される、請求項１６に従う方法。
【請求項２３】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項２４】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１２に従う方法。
【請求項２５】
加水分解生成物がグルコースを含む、請求項１３に従う方法。
【請求項２６】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項２７】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１２に従う方法。
【請求項２８】
加水分解生成物がグルコースおよびセロビオースを含む、請求項１３に従う方法。
【請求項２９】
提供の段階（段階ｉ）においてスラリーのｐＨが約４．０から約６．０である、請求項１に従う方法。
【請求項３０】
スラリーのｐＨが約４．５から約５．５である、請求項２９に従う方法。
【請求項３１】
提供の段階（段階ｉ）において温度が約４５℃から約７０℃である、請求項１に従う方法。
【請求項３２】
温度が約４５℃から約６５℃である、請求項３１に従う方法。
【請求項３３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がアスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項１に従う方法。
【請求項３４】
一つまたは複数の凝集剤が、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４に従う方法。
【請求項３５】
一つまたは複数の凝集剤がカチオン性ポリマーである、請求項３４に従う方法。
【請求項３６】
カチオン性ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項３５に従う方法。
【請求項３７】
セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤が同時にスラリーに添加される、請求項４に従う方法。
【請求項３８】
セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤が別々にスラリーに添加される、請求項４に従う方法。
【請求項３９】
提供の段階（段階ｉ）においてスラリーのｐＨが約４．０から約６．０である、請求項３に従う方法。
【請求項４０】
スラリーのｐＨが約４．５から約５．５である、請求項３９に従う方法。
【請求項４１】
提供の段階（段階ｉ）において温度が約４５℃から約７０℃である、請求項３に従う方法。
【請求項４２】
スラリーの温度が約４５℃から約６５℃である、請求項４１に従う方法。
【請求項４３】
添加の段階（段階ｉｉｉ）において、セルラーゼ酵素がアスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項３に従う方法。
【請求項４４】
提供の段階（段階ｉ）において、スラリーが約５重量％から約２０重量％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が、約２５重量％から約７０重量％のセルロースを含む、請求項１に従う方法。
【請求項４５】
糖を含む液体流が、注入の段階（段階ｉｉ）の前に、段階ｉの前処理されたセルロース原料から分離される、請求項１に従う方法。
【請求項４６】
洗浄段階が原料からの液体流の分離の間に使用される、請求項４５に従う方法。
【請求項４７】
水、再利用されたプロセス流、処理された流出物およびそれらの組合せからなる群から選択される洗浄媒体が洗浄段階中に使用される、請求項４６に従う方法。
【請求項４８】
平均スラリー流速が１時間あたり約０．１と約１２フィートの間である、請求項１に従う方法。
【請求項４９】
平均スラリー流速が１時間あたり約０．１と約４フィートの間である、請求項１に従う方法。
【請求項５０】
加水分解が以下により行われる、セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより反応器中の軸方向分散を制限し、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速を維持すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５１】
セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルス、テルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）またはそれらの組合せにより生産される、請求項５０の酵素組成物。
【請求項５２】
一つまたは複数の凝集剤が、カチオン性ポリマー、非イオン・ポリマー、アニオン・ポリマー、両性ポリマー、塩、明礬およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５０の酵素組成物。
【請求項５３】
一つまたは複数の凝集剤がカチオン性ポリマーである、請求項５２の酵素組成物。
【請求項５４】
カチオン性ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項５３の酵素組成物。
【請求項５５】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用。
【請求項５６】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するセルロースの酵素加水分解のためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物の使用であって、該酵素組成物の使用が以下からなるもの：
ｉ）前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ）非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速で、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより軸方向分散を制限すること；
ｉｉｉ）注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中に酵素組成物を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ）加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５７】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためセルロースを加水分解するためのセルラーゼ酵素、一つまたは複数の凝集剤および指示からなるキットであって、該指示が以下からなるもの：
ｉ） 前処理されたセルロース原料の水性スラリーを提供し、該スラリーが液体中に約３％から約３０％の非溶解固体を含み、該非溶解固体が少なくとも約２０％のセルロースを含むこと；
ｉｉ） 非溶解固体が液体の速度よりも緩慢な速度で上方に流れるよう、１時間あたり約０．１から約２０フィートの平均スラリー流速で、加水分解反応器の底部に水性スラリーを注入し、混合を避けることにより軸方向分散を制限すること；
ｉｉｉ） 注入の段階（段階ｉｉ）の前または該段階中にセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を水性スラリーに添加すること；ならびに
ｉｖ） 加水分解された生成物および非加水分解固体を含む水流を加水分解反応器から除去し、該加水分解生成物がグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含むこと。
【請求項５８】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するシステムであって、該システムが、上向流加水分解反応器への投入と流体連通状態にある原料スラリー供給配管、上向流加水分解反応器と流体連通状態にある固−液分離器を含み、また、非加水分解固体を含むスラリーを回収するための第１の排出および加水分解生成物を含む流れを回収するための第２の排出を含み、該加水分解生成物が、グルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せを含み、該原料供給配管、該上向流加水分解反応器、または該原料供給配管および該上向流加水分解反応器の両方が、セルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物を含むもの。
【請求項５９】
原料供給配管が前処理された原料を含む、請求項５８のシステム。
【請求項６０】
固体−液体分離器が沈殿タンク、浄化器、浄化器領域、遠心分離器および濾過器からなる群から選択される、請求項５８のシステム。
【請求項６１】
固体−液体分離器が沈殿タンクである、請求項６０のシステム。
【請求項６２】
固体−液体分離器が浄化器領域である、請求項６０のシステム。
【請求項６３】
固体−液体分離器が濾過器である、請求項６０のシステム。
【請求項６４】
セルラーゼ酵素が、前処理された原料のセルロース１グラムあたり約１．０から約４０．０ＦＰＵの投与量で存在する、請求項５８のシステム。
【請求項６５】
一つまたは複数の凝集剤が、前処理された原料の固体１トンあたり約０．１から約４．０ｋｇの投与量で存在する、請求項５８のシステム。
【請求項６６】
前処理されたセルロース原料から加水分解生成物を生産するためセルロースを加水分解するにあたり使用するための酵素組成物を調製する方法であって、該方法が、植物、菌または微生物の入手源からセルラーゼ酵素を獲得すること、および酵素組成物を生産するためセルラーゼ酵素を一つまたは複数の凝集剤と組み合わせることからなるもの。
【請求項６７】
セルラーゼ酵素が、アスペルギルス、フミコーラ、トリコデルマ、バチルスおよびテルモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）により生産される、請求項６６に従う方法
【請求項６８】
セルロースをグルコース、セロビオース、グルコース・オリゴマーまたはそれらの組合せに加水分解するためのセルラーゼ酵素および一つまたは複数の凝集剤を含む酵素組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５２３７８８（Ｐ２００８−５２３７８８Ａ）
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４５８０３（Ｐ２００７−５４５８０３）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１９２２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３４６７
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０６３４３１７３）アイオゲン エナジー コーポレイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＯＧＥＮ ＥＮＥＲＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００５／００１９２２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３４６７
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０６３４３１７３）アイオゲン エナジー コーポレイション (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＯＧＥＮ ＥＮＥＲＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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