デクチン−１を介したヒト抗原提示細胞の活性化の治療への応用
本発明は、免疫細胞を活性化できる抗デクチン−１特異的抗体又はその断片と、免疫細胞上のデクチン−１とを結合させるための組成物及び方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、抗原提示及び免疫細胞活性化の分野に関し、より特定すれば、デクチン−１を介して免疫細胞を活性化するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を樹状細胞活性化に関連して説明する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性の細胞内シグナルを出した後、病原体を認識することにより、先天性及び後天性免疫の境界を制御する上で枢要な役割を果たす。ＤＣのこうした機能は、最も顕著にはトール様受容体（ＴＬＲ）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ）によって代表される、特殊表面受容体である「パターン認識受容体」（ＰＲＲ）の発現に依存するところが大きい（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84、Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251、Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。
【０００４】
現在のパラダイムでは、ＴＬＲの主たる役割は、免疫応答を開始するためにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）及び他の炎症性サイトカインを産生するように、ＤＣに警報を発することである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉・取込機構の成分として作動する（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84）。しかし、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞移動（Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357）及び細胞内相互作用（Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585）を含めた広範囲の生物学的機能を有するものとも思われる。ＬＬＲのこうした多重機能は、ＴＬＲと異なり、ＬＬＲが自己、非自己の双方を認識できるという事実によるものとも思われる。しかし、免疫細胞中に発現される多数のＬＬＲの重複性を含め、ＬＬＲの複雑さが、個々のＬＬＲの詳細な機能を理解する際の主要な障害の１つとなっている。それに加え、こうした受容体の大多数に対する天然リガンドは、未だ同定されていないままである。とは言え、最近の研究からの証拠によって、ＬＬＲは、ＴＬＲと協力して、細菌感染中に免疫細胞の活性化に寄与し得ることが示唆されている（d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674、Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398、Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538、Netea, M. G., J. W. Meer, I. Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463、Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901、Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516、Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127、Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17、Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327）。他のＬＬＲと比較して、デクチン−１は、デクチン−１を発現する細胞を活性化するために、シグナルを送達するＩＴＡＭモチーフを有することが知られている。しかし、その研究の多くはマウスモデルにおいて行われてきており、ＤＣ、単球及びＢ細胞を含むヒト抗原提示細胞上に発現したデクチン−１の生物機能は、十分に特徴付けられていない。マウスと人間との間には、ＬＬＲの多くについて厳密な一致がないので、これは特に重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84
【非特許文献２】Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251
【非特許文献３】Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43
【非特許文献４】Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357
【非特許文献５】Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585
【非特許文献６】d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674
【非特許文献７】Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398
【非特許文献８】Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538
【非特許文献９】Netea, M. G., J. W. Meer, I.Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463
【非特許文献１０】Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901
【非特許文献１１】Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516
【非特許文献１２】Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127
【非特許文献１３】Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17
【非特許文献１４】Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗原に対する強力で広範な免疫応答を誘発する目的のために、抗原提示細胞に抗原を特異的に差し向ける（送達する）ワクチンを作製し、使用するための組成物及び方法を包含する。この目的は、主として、抗原が由来した作用剤（病原体又は癌）に対して、防御的又は治療的免疫応答を惹起することである。それに加え、本発明は、抗原提示細胞上に発現するデクチン−１と呼ぶ受容体への特異的な関与を介して、直接に、又は他の作用剤と協調して治療性を示す作用剤を包含する。
【０００７】
本発明者等は、ヒト細胞におけるデクチン−１の発現が、ＤＣ、単球及びＢ細胞を含む抗原提示細胞に限られることを示している。マウス細胞（マクロファージ）上に発現されるデクチン−１は、ＴＬＲ４リガンド及びＩＬ−１０により下方調節されることが知られているが、本発明者等は、本明細書で、ＴＬＲ４リガンドだけが、ヒトＤＣ上でのデクチン−１発現を下方調節することができ、ＩＬ−１０は、デクチン−１の発現を若干増加させることを示している。より興味深いことに、ヒトＤＣ上に発現したデクチン−１は、ＴＬＲ２より遥かに効果的にＴＬＲ４と相乗作用を示し、デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、サイトカイン及びケモカイン、特に、マウスモデルではこれまで認められなかったＩＬ−１２の産生を激増させる。ヒト扁桃腺Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋デクチン−１＋及びＣＤ１９＋デクチン−１−の２群に分類することができる。こうした知見は、抗デクチン−１抗体剤に基づく治療用及び防御用試薬において使用することもできる。
【０００８】
したがって、ヒトデクチン−１を介したシグナル伝達は、細胞（ＤＣを含む）活性化から観て、単独又は他の細胞シグナルとの共同のいずれかで、独特であり、機能的であることが、本発明において判明した。デクチン−１媒介細胞活性化は、特定の抗デクチン−１ ｍＡｂで誘発され、したがってこのような抗ヒトデクチン−１ ｍＡｂは、疾患に対処する試薬の開発に有用となろう。
【０００９】
本発明は、当該抗原提示細胞を活性化できる抗デクチン−１特異的抗体又はその断片と、抗原提示細胞を接触させ、抗原提示細胞を活性化することにより、デクチン−１発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高めるための組成物及び方法を包含する。抗原提示細胞の例には、樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せが挙げられる。抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養し得る。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４並びにデクチン−１特異的抗体又は断片と接触させた抗原提示細胞を活性化すると、抗原提示細胞上におけるＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増加が実現される。インターフェロンα及びデクチン−１特異的抗体又はその断片で抗原提示細胞を活性化した際、該細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる。
【００１０】
本発明の更に別の方法は、樹状細胞を活性化するために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を接触させるステップであって、活性化された樹状細胞が、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させるステップを含む。樹状細胞を活性化するために、デクチン−１特異的抗体又はその断片並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞の場合、活性化された樹状細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａ、並びにそれらの組合せの分泌を増加させる。樹状細胞を活性化する更に別の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させるステップを含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片は、ＣＤ４０を介したシグナル伝達と連携してその活性化を増加させる。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンα並びにデクチン−１特異的抗体又はその断片と接触した樹状細胞は、樹状細胞によるＢ細胞及びＴ細胞の共刺激活性を増加させることが判明した。
【００１１】
更に別の方法は、抗原提示細胞を抗デクチン−１特異的抗体と接触させるステップ、及びＴＬＲ４受容体を介した活性化により、抗原提示細胞を共活性化するステップを含み、該細胞が、サイトカイン及びケモカインの産生を増加させることを含む。ＴＬＲ４受容体を介した活性化による抗原提示細胞の共活性化では、該細胞が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びそれらの組合せの分泌を増加させる。
【００１２】
ＴＬＲ４リガンド、抗ＴＬＲ４抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１ハイブリッド抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１リガンドコンジュゲートの少なくとも１つを用いる、ＴＬＲ４受容体を介した活性化により、抗原提示細胞を共活性化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。デクチン−１特異的抗体又は断片は、１５Ｅ２．５、１１Ｂ６．４、１５Ｆ４．７、１４Ｄ６．３及び９Ｈ７．６、並びにそれらの組合せから選択されるクローンの１又は複数でもよい。樹状細胞は、デクチン−１受容体を介してデクチン−１特異的抗体又はその断片で活性化することにより、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化し得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片は、コヘシン／ドッケリン対の半分に結合し得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合しているとき、その対の他の半分は、１又は複数の抗原や、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性なアナログ、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、サイトカインに結合し得る。
【００１３】
本発明は、抗原提示細胞を活性化して、新たな細胞マーカーを発現し、１若しくは複数のサイトカインを分泌し、又はその双方を行う、デクチン−１特異的抗体又はその断片を発現したハイブリドーマ及びそれから単離された抗体を包含する。該ハイブリドーマは、クローンのＰＡＢ１、ＰＡＢ４、ＰＡＢ５、ＰＡＢ８、ＰＡＢ１０及びそれらの組合せから選択し得る。
【００１４】
抗原とＴＬＲ９のアクチベーターとの存在下、デクチン−１特異的抗体又はその断片で樹状細胞上のデクチン−１受容体を誘発させるステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、デクチン−１／ＴＬＲ９活性化樹状細胞と接触しているＢ細胞が、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌し、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させ、及びそれらの組合せを行う方法。こうした樹状細胞を用いて活性化されたＢ細胞は、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６及びそれらの組合せを分泌する。Ｂ細胞の例には、デクチン−１も発現し得る、及び／又はＩｇＭの産生を高める形質細胞が含まれる。
【００１５】
本発明は、デクチン−１特異的抗体又はその断片でＢ細胞上のデクチン−１受容体を誘発させるステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、Ｂ細胞が抗体産生を増加させる方法も包含する。本発明を用いて活性化されたＢ細胞は、分泌されるＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、及びそれらの組合せの産生を増加させ、並びに／又はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びそれらの組合せの産生を増加させる。
【００１６】
本発明は、樹状細胞上のデクチン−１受容体をデクチン−１特異的抗体又はその断片及びＴＬＲ４受容体で誘発させ、デクチン−１／ＴＬＲ４活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させることにより、Ｔ細胞の活性化を増強することによって、Ｔ細胞の活性化を増強する方法も包含する。活性化に用いる樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せと接触させ得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片は、Ｔ細胞によるＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びそれらの組合せの分泌を増加させる。樹状細胞で活性化されたＴ細胞は、４−１ＢＢＬの表面発現を増加させ、及び／又はそれを増殖させ得る。
【００１７】
本発明は、哺乳動物細胞から分泌される抗デクチン−１免疫グロブリン又はその部分と、該免疫グロブリンに結合した抗原とをも包含し、免疫グロブリンが抗原を抗原提示細胞に差し向ける。抗原特異的ドメインには、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片が挙げられる。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態は、デクチン−１特異的抗体又はその断片で活性化された樹状細胞を含んだワクチンを含む。本発明は、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片で直接活性化されている、及び／或いは、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片の単独で、又は他の免疫細胞と組み合わさって活性化され終えた、樹状細胞などの抗原提示細胞で活性化されている、Ｂ細胞、Ｔ細胞又は他の免疫細胞も包含する。例えば、併用療法には、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片で活性化され終えた、抗原負荷可能な抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を含み得るが、それらは一緒になってワクチンを形成する。
【００１９】
本発明はまた、単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のデクチン−１受容体と会合する作用剤であって、前記組合せでは、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる作用剤の使用；活性化剤の有無に関わらない、免疫細胞上における、１又は複数の抗原に連結されたデクチン−１結合剤のワクチン作製を目的とした使用；免疫細胞上に発現されるデクチン−１以外の細胞表面受容体を介して指示される、免疫応答の増強を目的とした、免疫細胞の共活性化剤としての抗デクチン−１抗体剤の使用；デクチン−１受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗デクチン−１抗体Ｖ領域配列の使用、並びに／或いは、デクチン−１を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はデクチン−１を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤に連結されたデクチン−１結合剤の使用も包含する。
【００２０】
本発明の更に別の実施形態は、コヘシン−ドッケリン結合対の半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、デクチン−１特異的抗体結合ドメインを含むモジュール構成ｒＡｂ担体を包含する。抗原特異的結合ドメインは、抗体の少なくとも一部分、及び／又はコヘシン−ドッケリン結合対の半分との融合タンパク質中の抗体の少なくとも一部分であり得る。該ｒＡｂはまた、モジュール構成ｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分、及び／又は抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分であり得る。該抗原特異的ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片でもよい。
【００２１】
本発明の特徴及び利点に関するより完全な理解のために、添付の図と共に、本発明の詳細な説明に以下に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（図１Ａ及び１Ｂ）健常ドナーのＰＢＭＣ上におけるデクチン−１の発現量を示す図である。
【図２】ＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ３リガンド（１００ｎＭ）、ＴＬＲ４リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮα（５００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、２４時間培養したインビトロ培養のＩＬ−４ＤＣの結果を示す図である。
【図３】抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す図である。
【図４】（図４Ａ及び４Ｂ）デクチン−１を介したシグナル伝達が、ＩＬ−４ＤＣ、ＩＦＮＤＣ双方を活性化できることを示す図である。抗デクチン−１ ｍＡｂはＤＣを活性化する。ＩＦＮＤＣ（図４Ａ）及びＩＬ−４ＤＣ（図４Ｂ）を２４時間、抗デクチン−１抗体で刺激し、次いで細胞を抗ＣＤ８６、８０、４０、８３、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。
【図５】デクチン−１及びＴＬＲが相乗的に作用して、ＤＣを活性化することを示す図である。ＩＬ−４ＤＣ（２×１０５個／２００μｌ／ウェル）を、可溶性のＴＬＲ４リガンド（１．５ｎｇ／ｍｌ）又はＴＬＲ２リガンド（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下、抗デクチン−１抗体で被覆した９６ウェルプレート中、１８時間培養した。対照ｍＡｂも試験した。１８時間後、培養上清の分析で、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【図６】（図６Ａ及び６Ｂ）Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ４リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ４リガンドで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す図である（図６Ａ）。精製した自己Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。図６Ｂは、Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ２リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ２リガンドで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す。精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。
【図７】Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ４リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ４リガンド、ザイモサンで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す図である。抗ＩＬ−１０中和抗体（５μｇ／ｍｌ）を、抗デクチン−１抗体及びＴＬＲ４リガンド並びにザイモサンで刺激したＤＣ中に添加した。抗ＩＬ−１０抗体に対する対照抗体も試験したが、有意差は認められなかった（データは示していない）。精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。
【図８】抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化したＤＣが、ＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬの増加量を発現することを示す図である。ＩＦＮＤＣ（２×１０５個／２００μｌ／ウェル）を、抗デクチン−１抗体又は対照Ｉｇで被覆した９６ウェルプレート中、１８時間培養した。１８時間後、細胞を抗ＩＬ−１５抗体及び抗４−１ＢＢＬ抗体で染色した。
【図９】（図９Ａ及び９Ｂ）ＤＣ上に発現したデクチン−１が、体液性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。６日目のＩＬ−４ ＤＣ、５×１０３個／ウェルを、抗デクチン−１抗体又は対照ｍＡｂで被覆した９６ウェルプレート中、１６〜１８時間インキュベートし、次いで、ＣＦＳＥで染色した２×１０４個の自己ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＣＤ４０Ｌを５０ｎｇ／ｍｌの存在下（図９Ａ）、又はＣｐＧ ５０ｎＭの存在下（図９Ｂ）で共培養した。６日目に、細胞を蛍光標識抗ＣＤ３８抗体で染色した。１３日目の培養上清の総免疫グロブリンをサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。
【図１０】（図１０Ａ及び１０Ｂ）Ｂ細胞上に発現したデクチン−１が、Ｂ細胞の活性化及び免疫グロブリンの産生に寄与することを示す図である。図１０Ａ．精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２００００細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＣｐＧを５０ｎＭ及びＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの存在下、抗デクチン−１抗体又は対照ＩｇいずれかのｍＡｂで被覆したプレート中、６日間培養した。細胞を抗ＣＤ３８抗体で染色し、細胞増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。図１０Ｂ．培養１３日目に、産生総免疫グロブリンを測定するために、培養上清をＥＬＩＳＡで分析した。
【図１１】（図１１Ａ〜１１Ｃ）ＤＣ上に発現したデクチン−１が、細胞性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。図１１Ａ．ＩＦＮＤＣ、５×１０３個を、抗デクチン−１抗体又は対照ｍＡｂで被覆したプレート中、組換えＦｌｕ Ｍ１タンパク質１００ｎＭの存在下、１６〜１８時間培養し、次いで、精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下、７日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体、及びＨＬＡ−Ａ２のＦｌｕ Ｍ１ペプチドエピトープに対する四量体で染色した。図１１Ｂ及び１１Ｃ．ＩＦＮＤＣに、Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭ（図１１Ｂ）又はＣｏｈ−Ｍａｒｔ−１組換えタンパク質１００ｎＭを負荷し、次いで図１１Ａに表示するように、抗デクチン−１抗体又は対照抗体で刺激した。１０日間の培養後、細胞を抗ＣＤ８抗体及び四量体（ＨＬＡ−Ａ２−ｍａｒｔ−１ペプチド）で染色した。各線は、個々のドナーから生成したデータを表す。この試験に使用した全ての細胞は、ＨＬＡ−Ａ２０１陽性健常ドナーに由来した。
【図１２】可溶型の抗デクチン−１ ｍＡｂが、ＤＣを活性化して、Ｍａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強することを示す図である。ＩＦＮＤＣ、５×１０３個を、抗デクチン−１抗体、抗ＣＤ４０抗体又は対照ｍＡｂの０．５μｇ／ｍｌ存在下、１６時間培養した。精製した自己Ｔ細胞（２×１０５個／ウェル）を培養物中に添加する前に、Ｍａｒｔ−１ペプチド２０μＭを添加した。１０日後、細胞を抗ＣＤ８抗体及び四量体（ＨＬＡ−Ａ２−ｍａｒｔ−１ペプチド）で染色した。この試験に使用した全ての細胞は、ＨＬＡ−Ａ２０１陽性健常ドナーに由来した。
【図１３】健常ドナーの扁桃腺を取得し、ＤＮＡｓｅ非含有III型コラゲナーゼを用いて細胞浮遊液を調製したことを示す図である。細胞を５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで激しく洗浄した後、抗デクチン−１ ｍＡｂと共に抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ１９抗体で染色した。イソタイプ合致対照ｍＡｂを使用した。
【図１４】（図１４Ａ及び１４Ｂ）健常ドナーからの人体皮膚（図１４Ａ）及びリンパ節（図１４Ｂ）の組織切片を調製し、ＤＡＰＩ（青色）及びこの試験で調製した抗デクチン−１抗体（赤色）で染色したことを示す図である。
【図１５】非ヒト霊長類（カニクイザル）のＰＢＭＣを抗デクチン−１ ｍＡｂ及び細胞表面マーカーに対する抗体で染色したことを示す図である。
【図１６】これまでに示し又は言及した抗原の多くを保持する、典型的なｒＡｂ．抗原融合タンパク質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の各種実施形態の作成及び使用を以下に詳細に考察するが、本発明は、多種多様な特定の関係において具体化できる適用可能な多くの発明概念を提供することを理解されたい。本明細書に考察する特定の実施形態は、本発明を作成し、使用する特定の方法を例示しているに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２４】
本発明の理解を深めるために、幾つもの用語を以下に定義する。本明細書に定義する用語は、本発明関連の分野の当業者が通常理解している意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、単一体だけを指すことを意図しているのではなく、例示のために具体例で使用し得る部類一般を包含する。本発明における専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用するが、その用法は、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明を制限するものではない。
【００２５】
本発明は、防御抗原をコードすることが知られている、又は疑われている抗原に、Ａｂ重鎖を介して融合している組換えヒト化ｍＡｂ（特異的なヒト樹状細胞受容体デクチン−１に対する）も包含する。こうした抗原には、各種作用剤に対するワクチン接種用の例として、インフルエンザＨ５Ｎ１のヘマグルチニン；リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ毒素からの弱毒化毒素のＨＩＶ ｇａｇ；メラノーマ抗原からの「一連」の抗原ペプチドなどが挙げられる。本発明は、危険に瀕した又は感染した人々の予防用又は治療用ワクチン接種に用途を見出すことになろう。本発明は、多くの疾患及び癌に対する、人間、動物両用のワクチン接種に対して広範な適用性を有する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「モジュール構成ｒＡｂ担体」とは、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、本例では抗デクチン−１モノクローナル抗体に対して、多様な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の制御されたモジュール式付加を行うように操作・作製された、組換え抗体系を記述するために使用される。該ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレーを用いて作製したモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体などでよい。モジュール構成ｒＡｂ担体は、例えば、多重抗原、及び／又は抗原と活性化サイトカインを、（細胞内取込性受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）標的とする樹状細胞（ＤＣ）に向けるために使用することができる。モジュール構成ｒＡｂ担体は、異なる２種の組換えｍＡｂを制御し、規定した様式で末端間で結合するためにも使用し得る。
【００２７】
「モジュール構成ｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメインと第１定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片でもよく、Ｆｃドメインの前記複数部分に対しては、同族性のモジュール構成結合部分が、アミノ酸配列に付加しており、及び／又は結合している。モジュール構成ｒＡｂ担体に使用する抗体は、任意のイソ型若しくはクラス、サブクラスでもよく、又は任意の供給源からでもよい（動物及び／又は組換え）。
【００２８】
非限定的な一例では、モジュール構成ｒＡｂ担体は、操作組換えｍＡｂに関し、特異的で規定されたタンパク質複合体を作製するために、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを有するように操作されている。該ｍＡｂは、該ｍＡｂの抗原結合ドメインからのカルボキシと共に、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部分である。コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインは、翻訳後に、例えば、化学的な架橋剤及び／又はジスルフィド結合の使用によってさえ、結合してもよい。
【００２９】
本明細書で使用する場合の用語「抗原」とは、抗原の受容者において体液性及び／又は細胞性の免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明を用いた異なる２つの状況で、即ち、抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインに対する標的として、或いはモジュール構成ｒＡｂ担体に対するドッケリン／コヘシン−分子相補体の一部として、ｒＡｂにより細胞又は標的へ及び／又はその中へ運搬される当該分子として、使用し得る。抗原は、普通、ワクチン接種が有利な治療になると思われる疾患を起こす作用剤である。抗原がＭＨＣ上に提示されるとき、そのペプチドはしばしば約８〜約２５アミノ酸である。抗原には、例えば、単純な中間代謝物、糖類、脂質及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、タンパク質などの高分子を含めた、任意種の生体分子が含まれる。抗原の一般的種類には、それだけに限らないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関わる抗原、並びに他の種々の抗原が挙げられる。
【００３０】
モジュール構成ｒＡｂ担体は、任意数の活性剤、例えば、抗生物質、感染症治療剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症用治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝固剤、多糖類、コラーゲン、細胞、及び前記活性剤の２種以上の組合せを運搬することができる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、限定はしないが、テトラサイクリン、アミノ糖、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、イミダゾールカルボキサミドなどが挙げられる。
【００３１】
本発明を用いて送達する抗腫瘍剤の例には、限定はしないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、メソトレキセートなどが挙げられる。解熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロシン、アセトアミノフェンなどが挙げられる。
【００３２】
本発明を用いて送達する抗炎症剤の例には、限定はしないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロン、ジクロフェナックＮａなどが挙げられる。
【００３３】
本発明を用いて送達する、骨粗鬆症治療の治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定はしないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド、並びにそれらの変異体、誘導体及び類縁体が挙げられる。
【００３４】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、限定はしないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などが挙げられる。
【００３５】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、限定はしないが、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体が挙げられる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せでもよい。他のサイトカインには、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた、形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーの構成員が挙げられる。
【００３６】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、限定はしないが、哺乳動物細胞などの自然源若しくは天然源から単離できる成長因子、又は組換えＤＮＡ技法若しくは各種化学法などにより合成で調製できる成長因子が挙げられる。それに加え、こうした因子の類縁体、断片又は誘導体も、その自然分子の生物活性の少なくとも一部を示す限り、使用することができる。例えば、部位特異的変異誘発又は他の遺伝子工学技法で改変した遺伝子の発現により、類縁体を調製することができる。
【００３７】
本発明を用いて送達する抗凝固剤の例には、限定はしないが、ワルファリン、ヘパリン、ヒルジンなどが挙げられる。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、限定はしないが、化学走性ペプチド、ブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を抑制する因子、並びに感染性微生物を攻撃する因子が挙げられる。
【００３８】
ウイルス抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来レトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬプロテイン、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；プロテインＥ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２プロテイン、及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分などの呼吸器合胞体ウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、及び他の単純疱疹ウイルス抗原成分などの単純疱疹ウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水疱瘡ウイルス抗原成分などの水疱瘡ウイルス抗原；プロテインＥ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原の追加例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３９】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを用いて送達し得る抗原性標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビルウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、及び海綿状ウイルスが挙げられる。他のウイルス標的には、インフルエンザ、１型及び２型単純疱疹ウイルス、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ又はＨＩＶが挙げられる。病原体には、トリパノゾーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリアが挙げられる。胎児性抗原や前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーは、このようにして標的とし得る。他の例には、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種用に本発明によるベクターを投与するには、強い免疫応答が望ましいと思われる移入遺伝子の長期発現を可能とするに十分に、ベクター関連抗原が非免疫原性である必要があろう。幾つかの事例では、個人へのワクチン接種は、毎年又は２年毎など、まれにしか必要とされず、感染体から長期の免疫防御を与え得る。本発明と共にベクター中に使用し、最終的には抗原として使用する微生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸の配列の具体例は、米国特許第６５４１０１１号明細書に見出し得るが、その関連部分、特に、本発明と共に使用し得る微生物及び特定の配列に適合する各表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用する細菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸サイクラーゼ、及び他の百日咳菌抗原成分などの細菌抗原；ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア細菌抗原成分などのジフテリア細菌抗原；破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風菌抗原成分などの破傷風菌抗原；Ｍプロテイン及び他の連鎖球菌抗原成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖類及び他のグラム陰性細菌抗原成分などのグラム陰性バチルス菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、及び他のマイコバクテリア抗原成分などの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類、及び他の肺炎球菌抗原成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖類、及び他のインフルエンザ菌（haemophilus influenza）抗原成分などのインフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、及び他の炭疽菌抗原成分などの炭疽菌抗原；ロンプＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などのリケッチア細菌抗原が挙げられる。他の任意の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア又はクラミジアの抗原も、本明細書に記載の細菌抗原と共に含まれる。部分又は完全病原体としては、インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎、日本脳炎、ライム病、ペスト菌（Yersinia pestis）、西ナイルウイルス、黄熱病、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス、天然痘、アレルギー並びに癌も該当し得る。
【００４１】
本発明の組成物及び方法と共に使用する真菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラズマ真菌抗原成分などのヒストプラズマ真菌抗原；莢膜多糖類及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分などのクリプトコッカス真菌抗原；小球抗原及び他のコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原成分などのコクシジオデス真菌抗原；並びにトリコフィチン及び他のコクシジオデス真菌抗原成分などの白癬真菌抗原が挙げられる。
【００４２】
原虫抗原及び他の寄生虫抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、及び他のプラスモジウム抗原成分などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、及び他の住血吸虫抗原成分などの住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リン脂質グリカン及びその付随タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分などのリーシュマニア主要抗原及び他のリーシュマニア抗原；更に７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ抗原成分などのトリパノゾーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原が挙げられる。
【００４３】
本発明のｒＡｂを用いて標的にできる抗原は、細胞内取込みの見込み、免疫細胞の特異性レベル、標的とする免疫細胞の型、免疫細胞の成熟度及び／又は活性化度などを含めた多数の要因に基づいて、一般に選択されよう。樹状細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＤＥＣＴＩＮ−１などが挙げられるが、同時に幾つかの事例では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７が存在しないこともある。抗原提示細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、及び／又はＦｃγ受容体が挙げられる。Ｔ細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。
【００４４】
腫瘍抗原に特徴的な標的抗原を含めた、送達対象となる細胞表面上の標的抗原は、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来することになろう。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定はしないが、白血病、リンパ腫などの血液癌、星状細胞種やグリア芽腫などの神経腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌や結腸癌などの消化器癌、肝癌、膵臓癌、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、睾丸癌、前立腺癌若しくは陰茎癌などの泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び他の神経系部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病が挙げられる。
【００４５】
本発明を用いた抗原提示のために免疫細胞へ、単独又は組み合わせて送達し得る抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば変異した癌遺伝子；腫瘍に付随するウイルスタンパク質；並びに腫瘍のムチン及び糖脂質が挙げられる。腫瘍に付随するウイルスタンパク質とし得る抗原は、上記した部類のウイルスに由来するものとなろう。ある種の抗原は、腫瘍に特徴的なこともあり（腫瘍前駆細胞が普通発現しないタンパク質の１サブセット）、又は、腫瘍前駆細胞中で通常発現するが、腫瘍に特徴的な変異を有するタンパク質のこともある。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば、腫瘍抗原を生じる遺伝子の変異を有する、正常タンパク質の変異体（複数も）が含まれる。
【００４６】
腫瘍抗原の非限定的な具体例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶのイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶのイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマの遍在性変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が挙げられる。それに加え、免疫原性分子には、自己免疫疾患の開始及び／又は展開に関与する自己抗原がなることができ、その病状は、関連する標的の器官、組織又は細胞、例えばＳＬＥ若しくはＭＧが発現する分子に特異的な抗体の活性に起因するところが大きい。このような疾患では、当該自己抗原に対する進行中の抗体媒介（即ち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（即ち、Ｔｈ１型）免疫応答へ誘導することが望ましいこともある。或いは、当該自己免疫疾患に罹ってはいないが、罹り易いと疑われる対象において、適当な自己抗原に対してＴｈ１応答を予防的に誘発することにより、自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を予防し、又はその応答レベルを低下させることが望ましいこともある。所望の自己抗原には、限定はしないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Smithタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質と、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体とが挙げられる。１又は複数種の自己免疫応答に関与する他の種々の抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどの内因性ホルモンが挙げられる。
【００４７】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法において使用することができる。例えば、以下の自己免疫疾患又は障害のいずれか１又は複数に関与する抗原は、本発明において使用することができる。即ち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬症、ショーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むショーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物虫刺され反応によるアレルギー応答、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼球症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症である。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。アレルギーに関与する抗原の例には、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が挙げられる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経の移植片成分などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原性成分が挙げられる。この抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドの場合もある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ（複数も）」とは、病原性ＤＮＡ又はＲＮＡがコードする多数の病原性ポリペプチドのいずれか内にあるエピトープに類似の一次、二次又は三次構造を含む、ペプチド又はタンパク質の抗原を指す。その類似度は、このようなポリペプチドに差し向けられたモノクローナル又はポリクローナル抗体も、そのペプチド又はタンパク質抗原に結合し、その抗原と反応し、又はそれ以外の方法でその抗原を認識する程度に、一般にはなろう。各種の免疫アッセイ法、例えば、全て当業者に公知のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどが、このような抗体と共に使用し得る。ワクチンでの使用に適した病原性エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。単離し、同定してしまえば、機能的等価物を容易に取得し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４５５４１０１号明細書中で教示され、親水性に基づいてアミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示するHoppの方法を採用してもよい。エピトープコア配列を同定するために、他の数件の論文に記載の方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムも使用することができる（例えば、Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 米国特許第４５５４１０１号明細書を参照されたい）。次いで、こうした「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成、組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチド中に容易に取り込み得る。
【００４９】
活性成分として本発明の抗原をコードする核酸を含んだワクチン組成物の製剤は、溶液、懸濁液いずれかの注射剤として調製し得るが、感染前の液中溶解又は懸濁に適した固形も、調製することができる。該製剤は、乳化してもよく、リポソーム中に封入してもよい。免疫原性活性成分は、薬学的に許容され、その活性成分と適合する担体と混合することがしばしばある。
【００５０】
用語「薬学的に許容される担体」とは、投与される対象においてアレルギー反応又は他の有害作用を起こさない担体を指す。薬学的に許容される適切な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せの１又は複数が挙げられる。それに加え、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有することができる。有効になり得るアジュバントの例には、それだけに限らないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、並びに細菌から抽出した３成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Tween 80乳濁液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、フロイントの完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが挙げられる。それに加え、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用することができる。
【００５１】
医薬品は、本発明中に記載するように、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで有する裸のポリヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチドは、生物活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードすることもあり、生理学的に許容される投与形態で与えられよう。本発明から生じ得る別の医薬品は、本明細書に記載の手順に従って、患者の血液又は他の供給源から単離した高精製度の血漿リポタンパク質分画と、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有し、該精製リポタンパク質分画に予め結合させたポリヌクレオチドとを生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５２】
更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５３】
投与すべき用量は、治療する対象の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療頻度に大いに依存する。高精製度のリポタンパク質分画に予め結合させた裸の該ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。
【００５４】
患者に対するｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与は、ベクターの毒性が仮にあればそれを考慮して、化学療法剤を投与するための一般手順に従うことになろう。必要な場合、治療サイクルを繰り返すことになると予想される。各種の標準療法並びに外科的介入を、上記遺伝子療法と組み合わせて適用し得ることも想定される。
【００５５】
遺伝子療法の臨床的適用を想定する場合、意図した適用に適当な医薬組成物として、該複合体を調製することが必要となろう。一般に、これには、発熱物質、並びに人間や動物に有害な恐れがある他の任意の不純物を本質的に含まない医薬組成物の調製が伴われよう。複合体を安定化させ、複合体の標的細胞による取込みを可能とするために、適当な塩及び緩衝剤を使用することも一般に望まれよう。
【００５６】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。このような組成物は、接種液と呼ぶこともできる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び作用剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用剤が、活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分も、組成物中に取り込むことができる。本発明の組成物は、古典的な医薬製剤を包含し得る。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有している。
【００５７】
疾患状態。治療する特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、最大の（又は、幾つかの症例では最小の）免疫応答を受ける部位へ抗原の送達量を最大化させるために、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を介することになろう。投与は、一般に、同所的な皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内の注射によるものとなろう。他の送達域には、経口、鼻腔、口腔、直腸、膣又は局所が挙げられる。局所投与は、皮膚癌の治療には特に有利となろう。このような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含んだ、薬学的に許容される組成物として通常投与されよう。
【００５８】
本発明のワクチン又は治療組成物は、非経口的に、例えば、皮下又は筋肉内いずれかの注射により投与し得る。他の投与方式に適した追加の製剤には、坐剤、及び一部の症例では、経口製剤、又はエアロゾルとしての分配に適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを用いたＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は個々のサイトカインの各種製剤への添加により、免疫応答が最適化された改良型経口ワクチンを生じる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、例えば、各医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。こうした組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取り、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。
【００５９】
本発明の抗原コード核酸は、中性又は塩形態としてワクチン又は治療組成物に製剤化し得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸やリン酸などの無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄の水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００６０】
ワクチン又は治療組成物は、投与製剤に合致した様式、並びに予防的及び／又は治療的に有効と見込まれるような量で投与される。投与すべき量は、例えば、対象の免疫系の抗体合成能を含めた治療される対象、及び所望する防御又は治療の程度に依存する。適切な用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲、好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲などの約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種当たり、活性成分がほぼ数百μｇ程度である。初回投与及び追加抗原注射に対する適切な投与計画も変化し得るが、初回投与に続き、後続の接種又は他の投与を行うのが代表的である。投与が必要な活性成分の厳密な量は、担当医の判断次第であり、対象毎に特異的な量となり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与する抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドを他の治療剤と組み合わせて投与するか否か、受容者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性に依存すると見込まれることは、当業者には明らかであろう。
【００６１】
該組成物は、単回用量スケジュール又は多回用量スケジュールで投与することができる。多回用量スケジュールは、ワクチン接種の一次クールが、例えば１〜１０回の個別用量を含み、続いて免疫応答の維持及び／又は強化に必要なその後の間隔で、例えば第２用量に対して１〜４カ月に、必要であれば数カ月後にその後の用量（複数も）に対して、他の用量を投与し得るスケジュールである。１〜５年、普通は３年の間隔での周期的な追加抗原注射が、防御免疫の所望レベルを維持するために望ましい。免疫接種の期間後、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養するインビトロ増殖アッセイ、及び抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γ量の測定を行うことができる。該アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光標識などの従来の標識を用いて行い得る。こうした技法は、当業者に公知であり、関連部分が参照により組み込まれる米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号の各明細書に見出すことができる。
【００６２】
モジュール構成ｒＡｂ担体、並びに／或いはコンジュゲートｒＡｂ担体−（コヘション／ドッケリン及び／又はドッケリン−コヘシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるか否か、最終的な精製済みタンパク質又は最終的なワクチン形態が使用されるか否かに応じて、１又は複数の「単位用量」で与え得る。単位用量は、投与、即ち適当な経路及び治療計画に伴って所望の応答を生じると計算された、治療組成物の所定量を含有するものと定義される。投与すべき量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術者の技術に含まれる。治療を受ける対象も、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御について評価を受け得る。単位用量は、単回注射として投与する必要はなく、設定した期間に亘る連続注入を包含し得る。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／Ｋｇ）体重に換算して都合よく表現し得るが、ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重で約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ、又はそれより多量の間の範囲が投与される。同様に、ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの送達量は、約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重で変化することができる。したがって、特定の実施形態では、ワクチン０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇをインビボで個体へ送達し得る。投与すべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び体調、並びに投与経路及び治療頻度に大いに左右される。リポソーム又はウイルス送達ベクターに予め結合した裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ乃至タンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。したがって、特定の組成物は、ポリヌクレオチド又はタンパク質約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ又は１０００μｇの間を、ベクター１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇに独立に結合した状態で含み得る。
【００６３】
本発明は、Ｆｌｕ抗原の標的となった樹状細胞によるヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験した。本明細書に示す結果は、この系でそれ自体は無効である抗原の用量における、このような抗原特異的細胞の特異的増殖を示している。
【００６４】
本発明は、例えば、リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ型エンテロトキシン由来の防御抗原と複合した組換えヒト化ｍＡｂ（ヒト樹状細胞の特異的受容体へ導かれる）である、モジュール構成ｒＡｂ担体を作製するためにも使用し得る。この構成体の潜在的市場は、全軍人のワクチン接種、及びこうした作用剤に関わる任意の生物的脅威に応じて大きな人口中核へ投与するために蓄えられる貯蔵ワクチンである。本発明は、人間、動物双方で使用するためのワクチン一般の設計に対して、広い用途を有する。所望の産業には、製薬産業及び生物工学産業が含まれる。
【００６５】
本発明は、抗原に対する効力ある広範な免疫応答を誘発するために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的に差し向ける（送達する）組成物及び方法を、ワクチンを含めて包含する。こうした組成物は、抗原が由来した作用剤（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的な免疫応答を誘発する。それに加え、本発明は、抗原提示細胞上に発現したＤＣ−ＡＳＧＰＲと呼ばれる受容体への特異的な会合を介して、直接的に又は他の作用剤と協調して、治療性を示す作用剤も創出する。
【００６６】
デクチン−１（ＣＬＥＣ７Ａ；（Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43））は、当初、Ｔ細胞共刺激能を有する（N. Kanazawaet al., J Biol Chem 278 (2003), pp.32645-32652）樹状細胞（ＤＣ）特異的な分子として報告されたが、後にその発現は、単球、マクロファージ及び好中球ではより強く、Ｔ細胞のあるサブセットでは弱く、人間ではＢ細胞及び好酸球において見出された。最も重要なことには、デクチン−１は、主要非オプソニン受容体として真菌β−グルカンを認識し、β−グルカンの生物作用にとって肝要であると判定された（Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。マクロファージ上でのデクチン−１の発現は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３により上方調節され、ＬＰＳ並びにＩＬ−１０及びデキサメタゾンにより下方調節される。デクチン−１は、その細胞質領域中に独特なことにＩＴＡＭを含有し、アダプター分子の非存在下で活性化受容体として実際に働く。ＩＴＡＭの構造も独特である。ＹｘｘＬ／Ｉ（チロシン−任意−任意−ロイシン又はイソロイシン）（S. J. van Vlieut et al., Int Immunol 17 (2005), pp.661-669）の繰返し２つを含有するコンセンサス配列と比較して、第１のチロシンと、それぞれマウス又はヒトのデクチン−１において次のロイシン又はイソロイシン（ＹｘｘｘＬ／Ｉ）との間に、３個のアミノ酸残基が挿入されている。実際には、Ｓｙｋの補充、及び食作用の誘発、反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生、核因子（ＮＦ）−κＢが媒介するサイトカイン産生などのデクチン−１の各種活性化作用にとって、第２のチロシンだけのリン酸化で十分であると報告された。しかし、Ｓｙｋは、ある種の細胞型（マクロファージ又はＤＣ）におけるこうした作用の幾つかだけに必要とされた。それに加え、こうした作用の幾つかは、ＭｙＤ８８媒介ＴＬＲシグナル伝達との協力を必要とした。注目すべきことに、ＤＣ中のデクチン−１シグナルは、Ｓｙｋ依存的にＩＬ−１０の産生も誘発した。興味深いことに、β−グルカンは、幾つかの特定の条件下だけに酵母細胞表面上に露出し、デクチン−１シグナルの喪失は、一部の真菌が宿主免疫監視系を逃れる訳を説明し得ると思われる（S. E. Heinsbrock et al., Trends Immunol 26 (2005), pp.352-354）。それに加え、デクチン−１媒介シグナルは、遺伝素因のある（ＺＡＰ−７０変異）ＳＫＧマウスにおいて自己免疫性関節炎の誘発を促進すると報告された（H. Yoshitomi et al., J Exp Med 201 (2005), pp.949-960）。カンジダ抗原が、各種の自己免疫疾患モデルの誘発に広く使用されてきた（E. C. Keystone et al., Arthritis Rheum 20 (1977), pp.1396-1401）ことを考慮すると、デクチン−１は、自己寛容の破壊において役割を演じ得る。しかし、デクチン−２（E. P. McGeal, M. Rosas, G. D. Brown, S. Zamze, S. Y. Wong and S. Gordon et al., Glycobiology 16 (2006), pp.422-430）と同様な、調節Ｔ細胞との考え得るその結合は、未だ解明されていない。
【００６７】
ＤＣはタンパク質抗原を交差提示することができる（Rock KL Immunol Rev. 2005 Oct;207:166-83）。インビボで、ＤＣは、多くの受容体により抗原を取り込み、クラスＩ及びII両方の抗原を提示する。これに関しては、パターン認識受容体としてのＤＣレクチンが、抗原の効率的取込み並びに抗原の交差提示に寄与する。
【００６８】
本発明は、抗ヒトデクチン−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発、特性決定及び使用を包含し、抗デクチン−１ ｍＡｂ及びその代替物の見込みある治療用途の発見に繋がる生物機能を特徴付けた。本発明の開示は、デクチン−１を保持する細胞を活性化することができる独特な作用剤を開発する手段、並びにこうしたシグナルを受ける際に起こる細胞の変化が、免疫系の他の細胞に対する作用に関して示す効果を明らかにする。こうした効果（単独、又は他のシグナル（即ち、共刺激）との協調のいずれかで）は、ある種の疾患状態に対する治療結果を高度に予測し、又はワクチン接種に関わる防御結果を増強するためになる。
【００６９】
材料及び方法
抗体及び四量体：イソタイプ対照Ａｂを含め、ＤＣ及びＢ細胞を表面染色する抗体（Ａｂ）は、BD Biosciences（CA）から購入した。ＥＬＩＳＡ用Ａｂは、Bethyl（TX）から購入した。抗ＢＬｙＳ抗体及び抗ＡＰＲＩＬ抗体は、PeproTech（NJ）から得た。四量体のＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（Ｆｌｕ Ｍ１）及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍａｒｔ−１）は、Beckman Coulter（CA）から購入した。
【００７０】
細胞及び培養物：健常ドナーの単球（１×１０６個／ｍｌ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）（R & D, CA）を含有するCellgenics（フランス）培地中で培養した。３日目及び６日目のために、ＤＣ、同量の各サイトカインをそれぞれ１日目及び３日目に培地中に補給した。Ｂ細胞はネガティブ単離キット（BD）で精製した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞は、抗ＣＤ４又はＣＤ８抗体（Milteniy, CA）で被覆した磁気ビーズで精製した。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によりPercoll（商標）勾配（GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK）を用いて軟膜から単離された。ＤＣ活性化のために、１×１０５個のＤＣをｍＡｂ被覆９６ウェルプレート中で１６〜１８時間培養した。炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４中のｍＡｂ（１〜２μｇ／ウェル）を少なくとも３時間、３７℃でインキュベートした。培養上清を採集し、サイトカイン／ケモカインをLuminex（Biorad, CA）で測定した。遺伝子分析のために、ＤＣをｍＡｂで被覆したプレート中で８時間培養した。幾つかの研究では、可溶性のＣＤ４０Ｌ（R & D, CA）５０ｎｇ／ｍｌ又はＣｐＧ（InVivogen, CA）５０ｎＭを培養物中に添加した。ＤＣ及びＢ細胞の共培養では、１０％ＦＣＳ及び抗体（Biosource, CA）入りのＲＰＭＩ１６４０に再浮遊した５×１０３個のＤＣを、ｍＡｂで被覆したプレート中で少なくとも６時間先ず培養し、次いでＣＦＳＥ（Molecular Probes, OR）で標識した精製自己Ｂ細胞１×１０５個を添加した。幾つかの研究では、ＤＣに熱不活化インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８Ｈ１Ｎ１）を５モイ（感染多重度）、２時間でパルス接種した後、Ｂ細胞と混合した。ＤＣ及びＴ細胞の共培養では、５×１０３個のＤＣを、１×１０５個の精製自己ＣＤ８ Ｔ細胞又は混合同種Ｔ細胞と共に培養した。同種Ｔ細胞には、インキュベーションの最後１８時間に１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンをパルス投与した後、ｃｐｍをγ線カウンター（Wallac, MN）で測定した。５×１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを、ｍＡｂで被覆したプレート中で培養した。Ｍａｒｔ−１及びＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、それぞれ培養の１０日目及び７日目に抗ＣＤ８抗体及び四量体で細胞を染色することにより、測定した。Ｍａｒｔ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）１０μＭ、及びＭａｒｔ−１ペプチドを含有する組換えタンパク質（下記を参照）２０ｎＭを、ＤＣ及びＣＤ８ Ｔ細胞培養物に添加した。精製組換えＦｌｕ Ｍ１タンパク質（下記を参照）２０ｎＭをＰＢＭＣ培養物に添加した。
【００７１】
モノクローナル抗体：マウスｍＡｂを従来技術により生成した。手短に言うと、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇでＲｉｂｉアジュバントと共に腹腔内で免疫した後、１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫する。３カ月後に、マウスを再び追加免疫した後、脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞と融合した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングによって、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するＡｂを、その融合相手単独、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインと比較して分析した（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性ウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、CELLineフラスコ（Integra, CA）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００７２】
ＥＬＩＳＡ：ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの総量、並びにフル（flu）特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。既知量のＩｇを含有する標準ヒト血清（Bethyl）及びヒトＡＢ血清を、それぞれ総Ｉｇ及びフル特異的Ｉｇの標準として使用した。試料中のフル特異的Ａｂ力価（単位）は、同一の光学密度を示すＡＢ血清の希釈倍率と定義した。ＢＡＦＦ及びＢＬｙＳの量は、ＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystem, CA）で測定した。
【００７３】
ＲＮＡの精製及び遺伝子分析：総ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen）で抽出し、2100 Bioanalyzer（Agilent）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion）を用いて調製し、Sentrix Human6 BeadChip（４６Ｋ転写物）とハイブリッドを形成させた。これらのマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングしたマイクロウェル中に留置した、３μｍビーズに結合した５０量体オリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色後、Illuminaにより製造されたサブミクロン分解能スキャナー（Beadstation 500X）を用いてアレイ表面を結像させる。遺伝子発現分析用ソフトウェアプログラムのGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いてデータ解析を行った。
【００７４】
組換えＦｌｕ Ｍ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製：開始コドンに対して遠位にあるNhe I部位、及び終止コドンに対して遠位にあるNot I部位を取り込みながら、ＰＣＲを用いてInfluenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅させた。切断したその断片をpET28b(+)（Novagen）中にクローニングする際に、Ｍ１ ＯＲＦをＨｉｓ６タグとインフレームに配置し、したがってＨｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をコードした。Nco I及びNhe I部位の間に挿入した、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）由来のＮ末端１６９残基のコヘシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体（未公表）は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヘシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓを発現させるために、上記ベクターのNhe I及びXho I部位の間に、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号１）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号２）をコードし、陰影付き残基は免疫支配的なＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであり、そのペプチドを囲む下線付き残基はＭＡＲＴ−１由来である）を挿入した。該タンパク質は、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）により選択し、ＩＰＴＧ１２０ｍｇ／Ｌを添加した対数増殖期中期まで２００回／分で振とうすることにより、ＬＢ中３７℃で増殖させた大腸菌（E. coli）BL21株（DE3）（Novagen）又はT7 Express株（NEB）中に発現させた。３時間後、細胞を遠心分離により採集し、−８０℃で保存した。各１Ｌの発酵で得た大腸菌細胞を、プロテアーゼ阻害剤Cocktail II（Calbiochem, CA）０．１ｍｌ入りの氷冷した５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（バッファーＢ）３０ｍｌ中に再浮遊させた。その細胞を設定１８（Fisher Sonic Dismembrator 60）で休止期間５分を入れて、氷上２×５分超音波処理し、次いで１７０００ｒｐｍで４℃、２０分間遠心した（Sorvall SA-600）。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１精製のために、細胞溶解上清５０ｍｌ分画をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。この液を、Ｎｉ＋＋を投入した５ｍｌのHiTrapキレートＨＰカラム上へ４ｍｌ／分で添加した。カラム結合タンパク質を２０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（バッファーＤ）で洗浄した後、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でもう１回洗浄した。結合タンパク質を１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で溶出した。ピーク分画をプールし、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ５．５で平衡化した５ｍｌのHiTrap Sカラム上へ４ｍｌ／分で添加し、平衡緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ５．５中の勾配０〜１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。約５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出するピーク分画をプールした。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓ精製のために、培養物２Ｌの細胞を上記のように溶解した。遠心分離後、２．５ｍｌのTriton X114を上清へ添加し、氷上で５分間インキュベーションを行った。２５℃で５分間更にインキュベーションした後、２５℃での遠心分離後、上清をTriton X114から分離した。この抽出を繰り返し、上清をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。次いで、そのタンパク質を上記のようにＮｉ＋＋キレートクロマトグラフィーで精製し、バッファーＤ中の０〜５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００７５】
抗デクチン−１ ｍＡｂ：本発明は、治療又は防御製品の望ましい成分（例えば、ヒト化組換え抗体に関して）である抗ＬＯＸ−１モノクローナル抗体に対応する、以下に示す特定のアミノ酸配列を包含する。以下の配列は、マウスＶ領域（下線）−ヒトＣ領域（太字）の組換えキメラ抗体に関するそのような配列である。これらのマウスＶ領域は、熟練した当業者なら誰にも容易に「ヒト化」することができる、即ち、そのＬＯＸ−１結合領域は、ヒトのＶ領域枠組み構造配列上にグラフトすることができる。更に、該配列は、抗体機能性を保持しているが、所望の治療用途のために、例えば抗原、サイトカイン又は毒素を付加している融合タンパク質に関しても、発現することができる。
【００７６】
【表１】
【００７７】
該Ｖ領域配列及び関連配列は、例えば、デクチン−１に対する親和性を高めるために、当業者によって改変し、及び／又は、抗原提示細胞上でデクチン−１に結合できるタンパク質形態の発現を指示するために、発現ベクター中に操作・作製されるようにヒトＶ領域枠組み配列に組み込むことができる。更に、本発明に開示される（又は、本明細書に開示される独特な生物学のための同様な方法及び篩を用いて誘導される）その他のｍＡｂは、同様な手段を介して（始めに、マウスハイブリドーマＶ領域のＰＣＲクローニング及び配列決定を介して）、同様な組換え抗体（ｒＡｂ）をコードする発現構築物にすることができる。このような抗デクチン−１ Ｖ領域は、治療用ｒＡｂの潜在的な免疫反応性を最小限とするように、熟練した当業者により更に「ヒト化」することができる（即ち、マウス特異的結合配列をヒトＶ領域枠組み構造配列上にグラフトすることができる）。
【００７８】
作製した組換え抗デクチン−１組換え抗体−抗原融合タンパク質（ｒＡｂ．抗原）は、インビトロで有効な試作ワクチンであり、発現ベクターは、例えばＨ鎖コード配列にインフレームで融合した、多様なタンパク質コード配列で構築することができる。例えば、インフルエンザＨＡ５、インフルエンザＭ１、ＨＩＶ ｇａｇ若しくは癌抗原由来の免疫支配的ペプチドなどの抗原、又はサイトカインは、ｒＡｂ．抗原又はｒＡｂ．サイトカインの融合タンパク質として後に発現できるが、こうしたものは、本発明に関しては、抗デクチン−１ Ｖ領域配列の使用により、デクチン−１を保持する抗原提示細胞へ抗原又はサイトカイン（又は毒素）を直接連れ込むことから得られる有用性をもつことができる。これにより、受容体の活性化を時々伴う、例えば抗原の細胞内取込み、及び治療又は防御作用のそれに続く開始（例えば、有効な免疫応答の開始、又は標的細胞の殺滅を介して）が可能となる。この概念に基づく例示的な試作ワクチンは、マウスｍＡｂ Ｈ鎖Ｖ領域（下線）−ヒトＩｇＧ４ Ｃ領域（太字）−Ｆｌｕ ＨＡ１−１（イタリック）融合タンパク質の合成を指示する、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍ抗デクチン＿１＿１１Ｂ６．４＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ１−１−６ｘＨｉｓ］などのＨ鎖ベクターを使用することができよう。類似の軽鎖発現プラスミド（上記に示す配列をコードする）と同時発現すると、これは、デクチン−１に結合し、細胞表面へＦｌｕ ＨＡ１−１抗原を送達することにより、ＤＣの活性化、抗原の細胞内取込み、抗原のプロセシング、抗原の提示、並びに特異的な抗Ｆｌｕ ＨＡ１−１性Ｂ及びＴ細胞の馴化及び増殖を起こす、多機能組換え抗体（ｒＡｂ）を産生する。ＦｌｕＨＡ５−１、ＨＩＶウイルスｇａｇ ｐ２４及びＰＳＡ（前立腺特異的抗原）に対する融合物を有する同様なＨ鎖構築物も、以下のように示される。
【００７９】
【表２】
【００８０】
同様に、下記に示すｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍ抗デクチン＿１＿１１Ｂ６．４＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ドッケリン］は、ドッケリンと融合した抗デクチン−１ Ｈ鎖（下記に示す配列）をコードする。ドッケリンは、コヘシン−抗原（ｃｏｈ．抗原）融合タンパク質との強力で特異的な非共有結合性相互作用を可能にし、したがってＤＣ及び他の抗原提示細胞へ抗原を送達する代替手段を提供する。
【００８１】
【表３】
【００８２】
組換え抗体（ｒＡｂ）及びｒＡｂ．抗原のクローニング及び発現に関する方法
マウス／ヒトキメラｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現：総ＲＮＡをハイブリドーマ細胞（RNeasy kit, Qiagen）から調製し、ｃＤＮＡ合成、並びに受給５’プライマー及び遺伝子特異的３’プライマー
（ｍＩｇＧκ、5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'（配列番号１４）、
ｍＩｇＧλ、5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3'（配列番号１５）、
ｍＩｇＧ１、5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3'（配列番号１６）、
ｍＩｇＧ２ａ、5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3'（配列番号１７）、及び
ｍＩｇＧ２ｂ、5'ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3'（配列番号１８））
を用いたＰＣＲ（SMART RACE kit, BD Biosciences）のために使用した。
【００８３】
ＰＣＲ産物をクローニング（pCR2.1 TA kit, Invitrogen）し、ＤＮＡの配列決定で特徴付けた。マウスＨ及びＬ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡに対する誘導配列を用いて、特異的プライマーの使用により、下流のヒトＩｇＧκ又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクター中にクローニングするための隣接制限酵素部位を取り込みながら、シグナルペプチド及びＶ領域のＰＣＲ増幅を行った。キメラｍＶκ−ｈＩｇκの発現用ベクターは、Xho I及びNot I部位に挟まれた４０１〜７３１残基（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、pIRES2-DsRed2（BD Biosciences）のXho I−Not I間隔中にこれを挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ Ｖｋ領域を増幅し、Nhe I又はSpe I部位、次いでCACCを（例えば、ｇｉ｜７６７７９２９４｜の１２６残基）をコードする領域に付け足し、Xho I部位を付け足した。次いで、そのＰＣＲ断片を上記ベクターのNhe I−Not I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶκ−ｈＩｇκ用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3'（配列番号１９）を上記ベクターのNhe I−Xho I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドン（SignalP3.0 Serverを用いて確定した）（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）とｍＶκ領域の末端（上記で確定したもの）との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びXho Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。対照ｈＩｇκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜の２６〜８５残基及びｇｉ｜２１６６９４０２｜の６７〜７０９残基に対応する。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、ジスルフィド結合を安定化し、残存ＦｃＲ結合性を廃棄した（Reddy, M. P., C. A. Kinney, M. A. Chaikin, A. Payne, J. Fishman-Lobell, P. Tsui, P. R. Dal Monte, M. L. Doyle, M. R. Brigham-Burke, D. Anderson, M. Reff, R. Newman, N. Hanna, R. W. Sweet, and A. Truneh. 2000. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol 164:1925-1933）Ｓ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅの置換を有する、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の１２〜１４７３残基であって、ｐＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ２ベクターのBg1 II及びNot I部位の間に、終止コドンの代わりに配列5'gctagctgattaattaa3'（配列番号２０）を付加しながら挿入したものに対応する。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ ＶＨ領域を増幅し、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の４７３残基をコードする領域にCACCを、次いでBg1 II部位を付け足した。次いで、ＰＣＲ断片を上記ベクターのBg1 II−Apa I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaag ggccc3'（配列番号２２）を上記ベクターのNhe I−Apa I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドンとｍＶＨ領域の末端との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びApa Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。補遺２は、本研究に用いた各種のｍＶκ及びｍＶＨ領域のヌクレオチド配列を詳述している。
【００８４】
近位Nhe I部位及び遠位Not I部位に挟まれ、終止コドンに続く各種の抗原コード配列を、Ｈ鎖ベクターのNhe I−Pac I−Not I間隔中に挿入した。Ｆｌｕ ＨＡ１−１は、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'（配列番号２３）（ｃｉｐＡコヘシン−コヘシンリンカー残基をコードする配列が後続するNhe I部位）、並びに遠位配列5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'（配列番号２４）（Ｈｉｓ６、終止コドン及びNot I部位をコードする）を有する、Ａ型インフルエンザウイルス（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）ヘマグルチニンｇｉ｜２１６９３１６８｜の８２〜１０２５残基（Ｃ９８２Ｔの変換あり）によりコードされていた。Ｆｌｕ ＨＡ５−１は、Ｆｌｕ ＨＡ１−１と同じ各配列が結合した、ｇｉ｜５０２９６０５２｜Ａ型インフルエンザウイルス（A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)）のヘマグルチニンの４９〜９９０残基によりコードされていた。Ｄｏｃは、近位Nhe I及び遠位Not I部位を有するｇｉ｜４０６７１｜ｃｅｌＤの１９２３〜２１５０残基によりコードされていた。ＰＳＡは、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc3'（配列番号２５）（Nhe I部位及びｃｉｐＡスペーサー）、並びに遠位Not I部位を有する、前立腺特異的抗原ｇｉ｜３４７８４８１２｜の１０１〜８３２残基によりコードされていた。Ｆｌｕ Ｍ１−ＰＥＰは、5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc3'（配列番号２６）によりコードされていた。これ及び他の全てのペプチドコード配列は、Nhe I及びNot I制限Ｈ鎖ベクター、又はNhe I−Xho I制限Ｃｏｈ．Ｈｉｓベクター中へのクローニングに末端が適合する、相補的な合成ＤＮＡ断片の混合物を介して創製された。制限酵素部位を組み込む必要がある場合、又はＣｉｐＡスペーサー配列中を除いて、好ましいヒトコドンを常に使用した。
【００８５】
ｒＡｂ発現構築物の産生量は、Ｌ鎖及びＨ鎖構築物を各々約２．５μｇ並びに上記の手順を用いた、一過性トランスフェクション体５ｍｌ中で試験した。上清は、抗ｈＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ（AffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Jackson ImmunoResearch）で分析した。この手順の試験では、分泌ｒＡｂの産生量は、Ｈ鎖及びＬ鎖ベクター濃度に対して、各ＤＮＡ濃度の約２倍範囲に亘り依存性がなかった（即ち、この系はＤＮＡ飽和をしていた）。
【００８６】
新規な抗デクチン−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原提示細胞上に見出されるこの細胞表面受容体に関連するこれまで未知の生物学を明らかにするために、開発され、使用された。この新規な生物学は、多様な治療及び防御用途のために、この受容体を活性化する抗デクチン−１抗体作用剤の応用を高度に予測する。以下に提示するデータは、当初の予測を強く支持し、この場での発見を臨床的応用に変換する道筋を示した。
【００８７】
ヒトデクチン−１に対する高親和性モノクローナル抗体の開発：受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）の融合タンパク質を、それぞれマウスの免疫及びｍＡｂのスクリーニングのために生成した。ＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧのための発現構築物は、以前に記載されており（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）、マウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドを用いて分泌を誘導した（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）。ＤＣＩＲ外部ドメイン．ＡＰのための発現構築物も、ＡＰの１３３〜１５８１残基（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅すると同時に、近位のインフレームXho I部位、並びに遠位のＴＧＡ終止コドン及びNot I部位を付加するために、ＰＣＲを用いて生成した。このXho I−Not I断片は、上記のＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧベクターにおけるＩｇＧコード配列を置き換えた。同じＩｇ及びＡＰベクターシリーズ中のデクチン−１外部ドメイン構築物は、（ｂｐ３９７〜６０３、ｇｉ｜８８９９９５９１｜をコードする挿入配列を含有していた。デクチン−１融合タンパク質は、FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用い、製造業者の手順書（トランスフェクション１Ｌ当たり総プラスミドＤＮＡ１ｍｇを293 Fectin試薬１．３ｍｌと共用）に従って生成した。ｒＡｂ産生のために、Ｈ及びＬ鎖をコードするベクターを同量、同時にトランスフェクトした。トランスフェクト済み細胞を３日間培養し、培養上清を採集し、新鮮培地を添加してインキュベーションを２日間継続した。プールした上清はろ過により清澄化した。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧは、HiTrapプロテインＡアフィニティクロマトグラフイーにより、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７による溶出を用いて精製し、次いでＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂ（後述する組換え抗体）は、HiTrap MabSelect（商標）カラムを使用して同様に精製した。マウスｍＡｂは、従来の細胞融合技術によって生成した。手短に言うと、６週齢のマウスの腹腔内に、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇをＲｉｂｉアジュバントと共に免疫接種し、次いで１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫した。３カ月後、マウスを再度追加免疫してから３日後に脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞（Shulman, M., C. D. Wilde, G. Kohler, M. J. Shulman, N. S. Rees, D. Atefi, J. T. Horney, S. B. Eaton, W. Whaley, J. T. Galambos, H. Hengartner, L. R. Shapiro, and L. Zemek. 1978. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 276:269-270）と従来技法を用いて融合した。ＥＬＩＳＡを用いて、当該融合相手単独と比較して、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインに比して、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングした（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性のウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、無血清培地に適応させ、CELLineフラスコ（Integra）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００８８】
精製抗デクチン−１モノクローナル抗体の直接ＥＬＩＳＡによる特性決定。ＥＬＩＳＡによる数種の抗デクチン−１ｍＡｂの相対的親和性（即ち、デクチン−１．Ｉｇタンパク質をマイクロタイタープレート表面上に固定化し、デクチン−１．Ｉｇに対する結合能（抗マウスＩｇＧ．ＨＲＰコンジュゲート試薬で検出した場合）について用量滴定系列において、該抗体を試験する）。各パネルは、（左）デクチン−１．Ｉｇタンパク質に対するｍＡｂ反応性、及び（右）ｈＩｇＧＦｃタンパク質に対するｍＡｂ反応性である。該パネルから、抗デクチン−１ ｍＡｂがデクチン−１に特異的に反応することが示される。結合の変化は、様々な抗体について認められた。
【００８９】
インビボのＤＣ及びインビトロ培養のＤＣは共にデクチン−１を発現する：図１Ａ及び１Ｂは、健常ドナーのＰＢＭＣ上におけるデクチン−１の発現量を示す。下記の図１Ａに示すように、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ１４＋単球、及びＣＤ１９＋Ｂ細胞を含めた抗原提示細胞は、デクチン−１を発現する。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、検知し得る表面デクチン−１を発現しない。インビトロ培養のＤＣ、ＩＦＮＤＣ及びＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１１の発現量が、図１ｂに示されている。ＩＬ−４及びＩＮＦＤＣは共に、この研究で作製した以上３種の抗デクチン−１抗体で染色した。
【００９０】
インビボ及びインビトロ両培養のＤＣはデクチン−１を発現する。図１Ａ．健常ドナーのＰＢＭＣを、抗デクチン−１ｍＡｂと共に抗ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ３抗体で染色した。個々の抗体で染色した細胞は、デクチン−１の発現量を測定するためにゲート選別した。図１Ｂ．健常ドナーの単球は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でＩＬ−４（ＩＬ−４ＤＣ）又はＩＦＮａ（ＩＦＮＤＣ）と共に培養し、細胞を抗デクチン−１ｍＡｂで染色した。細胞は、対照抗体及びＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス抗体でも染色した。
【００９１】
ＤＣ上のデクチン−１の発現量は、ＴＬＲリガンド及びサイトカインで調節される：ＤＣ表面分子の発現量は、様々な刺激因子で調節することができる。デクチン−１の発現がＤＣの活性化により制御されるか否かを確かめるために、ＩＬ−４ＤＣをＴＬＲリガンド及びサイトカインで刺激した。図２のデータは、ＴＬＲ４リガンド（大腸菌のＬＰＳ）がデクチン−１の発現量を低下させたが、ＩＬ−１０は、ＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１の発現を若干増強した。繰返し試験において、ＩＬ−１５はデクチン−１を若干下方調節した。ＩＦＮａ及びＴＬＲ３リガンドを含む他の刺激因子は、ＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１の発現量を変化させなかった。
【００９２】
図２．インビトロ培養のＩＬ−４ＤＣを、ＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ３リガンド（１００ｎＭ）、ＴＬＲ４リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮａ（５００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間培養した。細胞を抗デクチン−１又は対照ｍＡｂで染色した。点線は、イソタイプ対照抗体で染色した細胞を示す。灰色及び白抜きのヒストグラムは、それぞれ刺激因子なし及び刺激因子入りの培地中で培養した細胞を表す。
【００９３】
デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＤＣを刺激してサイトカイン及びケモカインを産生する：樹状細胞は、活性化に応じて免疫応答の結果、誘発又は耐容のいずれかを決定する、一次免疫細胞である（Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Y. J. Liu, B. Pulendran, and K. Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767-811）。ヒトＤＣの活性化におけるデクチン−１の役割は、十分には研究されていなかった。マウス抗ｈデクチン−１ ｍＡｂを産生するハイブリドーマクローンを８種生成し、個々のｍＡｂがＤＣを活性化するか否かを、ＤＣから分泌されるサイトカイン及びケモカインの測定により試験した。図３のデータは、特にＰＡＢ４７及びＰＡＢ４９が、ＤＣを活性化することにより、有意量のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａを産生できたことを示す。ＰＡＢ１８７は、ＤＣを活性化することが知られている抗ＣＤ４０ ｍＡｂである。ＰＡＢ８５は対照抗体である。
【００９４】
図３は、抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す。１×１０５個／２００μｌのＩＦＮＤＣを、異なるクローンのｍＡｂで被覆したプレート中で１８時間培養した。培養上清を分析して、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【００９５】
図４は、デクチン−１を介したシグナル伝達が、ＩＬ−４ＤＣ、ＩＦＮＤＣ双方を活性化できることを示す。ＩＦＮＤＣの場合、抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを刺激して、有意な増加量のＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲを発現する（図４Ａ）。抗デクチン−１ ｍＡｂは、ＩＬ−４ＤＣも活性化して、増加量のＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲを発現した（図４Ｂ）。
【００９６】
デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＴＬＲを介したシグナル伝達を増強する：デクチン−１を介したシグナルは、ＴＬＲを介したシグナルと相乗的に作用して、ＤＣの活性化を増強することができる（図５）。デクチン−１がＴＬＲ２と相乗的に作用することは、知られていた。しかし、この試験では、デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、ＤＣの活性化に対して、デクチン−１とＴＬＲ２との相乗作用より強いことを示している。デクチン−１とＴＬＲ４とのこの相乗作用は、ＤＣからのＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０の産生を激増させた。本発明者等は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ４０を含む、抗共刺激性分子抗体でも細胞を染色した。この相乗作用は、試験した共刺激性分子の発現を増加させなかった。
【００９７】
デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的応答を増強した：デクチン−１とＴＬＲ媒介シグナル伝達との相乗作用が、免疫応答を増強するか否かを試験するために、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を初回抗原刺激するＤＣの能力を試験した（図６）。図６Ａに示すように、デクチン−１とＴＬＲ４Ｌとの相乗作用は、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の応答数を５倍超増加させた。デクチン−１とＴＬＲ２との相乗作用が、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めることも認めることができた。図６のデータは、今後のワクチン開発にとって有用となろう。
【００９８】
デクチン−１を介して刺激されたＤＣから産生されるＩＬ−１０は、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激の向上に寄与する：図３及び図５に示すように、デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の阻害性サイトカインであるＩＬ−１０をＤＣから有意な量で生じた。ＩＬ−１０の量は、デクチン−１がＴＬＲリガンドと相乗的に作用すると有意に増加した。しかし、ＤＣが産生するＩＬ−１０とは関係なく、抗デクチン−１抗体単独、又は抗デクチン−１抗体及びＴＬＲリガンドのいずれかで刺激したＤＣは、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めた（図６）。したがって、初回抗原刺激中のＩＬ−１０は、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的な初回抗原刺激に寄与し得る可能性がある。この仮説を試験するために、培養物中に抗ＩＬ−１０抗体を添加したところ、図７のデータは、抗デクチン−１抗体及びＴＬＲリガンドで刺激したＤＣからのＩＬ−１０が、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めることを示している。ＤＣをザイモサンで刺激した場合、同様な結果が観察された。同じＤＣをザイモサンで刺激したとき、ＤＣは有意量のＩＬ−１０（１×１０５個のＤＣから１０００ｐｇ／ｍｌ超）を産生した（データは示していない）。抗デクチン−１ ｍＡｂで刺激したＤＣが有意量のＩＬ−１０を産生するので、ＩＬ−１０で媒介されるこの抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激の向上は、今後のワクチン開発にとって有用となろう。
【００９９】
抗デクチン−１抗体で活性化されたＤＣは、増加量のＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬを発現する：ＤＣ活性化における抗デクチン−１抗体の役割を更に分析するために、ＩＦＮ ＤＣを抗デクチン−１抗体で刺激した後、細胞を抗ＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬ抗体で染色した。図８のデータは、デクチン−１を介したシグナル伝達が、体液性及び細胞性免疫応答の向上に寄与し得る、ＩＬ−１５、４−１ＢＢＬ双方の発現増加を誘発することを示す。ＩＬ−１５は、ＣＤ８ Ｔ細胞の応答並びにＢ細胞の増殖及び抗体産生において、重要な役割を演じることが知られている。４−１ＢＢＬは、ＤＣ媒介ＣＤ８ Ｔ細胞応答に寄与する共刺激性分子であるが、ヒト４−１ＢＢＬは、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ及びそれ自体の両方を介してシグナル伝達する。その細胞質内尾部は、Ｔ細胞のアポトーシス及び単球によるサイトカイン分泌（ＩＬ−６、ＴＮＦα）を誘発する、逆方向シグナル伝達に関与する。ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する４−１ＢＢＬ結合は、多くの効果を生み、Ｔ細胞の想起応答において鍵となる役割を演じる。それは、一次応答の最後にＴ細胞数を維持し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、増殖し、ＣＤ４＋細胞ではＩＬ−２、ＩＦＮ−γなどのサイトカイン、ＣＤ８細胞ではＩＦＮ−γを分泌するように誘発する。
【０１００】
デクチン−１を介して刺激されたＤＣは有効な体液性免疫応答を誘発する：ＤＣは、Ｔ依存性、Ｔ非依存性双方のＢ細胞応答のためにシグナルを与えること（Wykes, M., and G. MacPherson. 2000. Dendritic cell-B-cell interaction: dendritic cells provide B cells with CD40-independent proliferation signals and CD40-dependent survival signals. Immunology 100:1-3、Balazs, M., F. Martin, T. Zhou, and J. Kearney. 2002. Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T-independent immune responses. Immunity 17:341-352、Kikuchi, T., S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, and R. G. Crystal. 2000. Dendritic cells genetically modified to express CD40 ligand and pulsed with antigen can initiate antigen-specific humoral immunity independent of CD4+ T cells. Nat Med 6:1154-1159、Dubois, B., J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau, C. Caux, and F. Briere. 1999. Dendritic cells directly modulate B cell growth and differentiation. J Leukoc Biol 66:224-230）、及びＢ細胞へ抗原を移すこと（Qi, H., J. G. Egen, A. Y. Huang, and R. N. Germain. 2006. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science 312:1672-1676、Bergtold, A., D. D. Desai, A. Gavhane, and R. Clynes. 2005. Cell surface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. Immunity 23:503-514）により、体液性免疫応答において重要な役割を演じる。ＤＣ以外に、第３シグナルとしてのＴＬＲ９を介したシグナル伝達が、効率的なＢ細胞応答のために必要である（Ruprecht, C. R., and A. Lanzavecchia. 2006. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur J Immunol 36:810-816、Bernasconi, N. L., E. Traggiai, and A. Lanzavecchia. 2002. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science 298:2199-2202）。デクチン−１は、ＴＬＲ９リガンドのＣｐＧの存在下で、ＤＣ媒介体液性免疫応答に影響することができる。６日目のＩＬ−４ ＤＣを抗デクチン−１ ｍＡｂで刺激した後、ＣＤ４０Ｌ又はＣｐＧの存在下、精製Ｂ細胞を共培養した。図９ａ及び９ｂに示すように、抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化したＤＣは、対照ｍＡｂで刺激したＤＣと比較して、高められたＢ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈を経て見られる）及び形質細胞の分化（ＣＤ３８＋の増加）を起こす。
【０１０１】
総免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生量は、ＥＬＩＳＡにより測定した（図９ａ及び９ｂ）。Ｂ細胞の増殖及び形質細胞の分化と一貫して、抗デクチン−１ ｍＡｂ刺激ＤＣと共に培養したＢ細胞は、ＣＤ４０Ｌ又はＣｐＧの存在下で総免疫グロブリンの産生量を有意に増加させる。
【０１０２】
本発明は、デクチン−１を介して特異的に活性化する作用剤の、例えば、ワクチン接種におけるアジュバントとして、又は免疫低下した個体に対する免疫系刺激剤としての治療用途に使用し得る。又、この発見は、デクチン−１を介する自然な又は異常調節された活性化の阻止が、適用性を有する（例えば、移植状況における耐性の惹起、又は自己免疫疾患の改善のため）ことができることも予測している。
【０１０３】
抗デクチン−１ ｍＡｂはＢ細胞を活性化する：ＣＤ１９＋Ｂ細胞はデクチン−１を発現する（図１）が、これから、Ｂ細胞上に発現するデクチン−１の可能性ある役割が予測される。図１０Ａのデータは、Ｂ細胞上におけるデクチン−１の誘発が、ＣｐＧの存在下でＢ細胞の増殖及び形質細胞の分化を増強することを示す。それと一貫して、図１０Ｂは、抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化されたＢ細胞が、増加量の総ＩｇＭを分泌するが、ＩｇＧ及びＩｇＡの分泌は増加しないことを示す。
【０１０４】
デクチン−１の関与によるＢ細胞に対する直接効果に関する上記発見は、デクチン−１を介して又はそれに対抗して作用する作用剤のこれまで概説した治療用途の範囲を強化する。
【０１０５】
Ｔ細胞の応答におけるデクチン−１の役割：デクチン−１を介して刺激されたＤＣは、共刺激性分子の増強量を発現し、サイトカイン及びケモカインの増加量を産生する（図３及び４）が、このことは、デクチン−１が、体液性免疫応答だけでなく細胞性免疫応答にも寄与することを示唆している。抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の応答を測定してこれを試験した（図１１）。図１１のデータは、デクチン−１を介して活性化されたＤＣが、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質に特異的な記憶ＣＤ８ Ｔ細胞の応答を増強することを示している（図１１ａ）。より重要なことには、デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＤＣがＣＤ８ Ｔ細胞のＭａｒｔ−１ペプチドによる初回抗原刺激及び交差初回抗原刺激をすることを可能にする（図１１ｂ及びｃ）。これは、デクチン−１が、ＤＣ機能の増強に重要な役割を演じており、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原による初回刺激及び交差初回刺激を改善することを示している。したがって、抗デクチン−１ ｍＡｂ及び抗原融合タンパク質は、頑健で抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発すると見込まれるため、抗デクチン−１ ｍＡｂからなる試薬が、癌及び感染症に対するワクチン開発にとって有用となることを示唆している。
【０１０６】
可溶型の抗デクチン−１ ｍＡｂは、ＤＣを活性化して、健常ドナーからのＭａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強する。本発明者等は、可溶性抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化できることを示したので、可溶性抗デクチン−１抗体で刺激したＤＣが、抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を増強できるか否かを試験した。図１２のデータは、可溶性抗デクチン−１抗体で活性化したＤＣが、健常ドナーからのＭａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強したことを示している。この試験で作製した抗ＣＤ４０抗体の可溶型も、ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強した。
【０１０７】
デクチン−１発現に基づいて２群に分割したヒト扁桃腺Ｂ細胞：ヒト扁桃腺の細胞を抗デクチン−１抗体及び他の抗体で染色した。図１３に示すように、ＣＤ３＋Ｔ細胞はデクチン−１を発現しない（左側パネル）。しかし、ＣＤ１９＋Ｂ細胞には２群があった。即ち、一方はデクチン−１を発現せず、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の他方の群は、健常ドナーのＰＢＭＣからのＣＤ１９＋Ｂ細胞と同様に、デクチン−１を発現する。このことは、癌及びワクチン用の新たな抗デクチン−１抗体系治療試薬の開発に関わりをもち得るものと思われる。
【０１０８】
人間の皮膚及びリンパ節における細胞はデクチン−１を発現する：デクチン−１を発現する細胞は、ＩＨＣにより人間の皮膚及びリンパ節で検出できる。組織切片を核染料ＤＡＰＩ（青色）及び抗デクチン−１抗体（赤色）で染色した。図１４は、人間の皮膚及びリンパ節は共に、有意量のデクチン−１を発現することを示している。これは、例えば、抗デクチン−１抗体による標的指向抗原の投与に好ましい部位と思われる、正にその箇所（皮膚）に、インビボの細胞がデクチン−１を発現することを明らかにしているので、重要な観察結果である。
【０１０９】
非ヒト霊長類におけるインビボＤＣはデクチン−１を発現する：非ヒト霊長類（カニクイザル）の血中ＤＣ、サルのＰＢＭＣを、抗デクチン−１ ｍＡｂ、並びに他の細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ１６に対する抗体で染色した。図１５のデータは、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｃ＋細胞が共に、抗ヒトデクチン−１ ｍＡｂで染色されたことを示す。ＣＤ１４＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞と異なり、ＣＤ３＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ２７＋及びＣＤ５６＋細胞はデクチン−１を発現しなかった（データは示していない）。このデータは、サル抗原提示細胞に対するある種の抗ヒトデクチン−１−１ ｍＡｂの交差反応性を実証している。サルは、想定される人間治療に関する有効性、安全性双方の試験用の妥当なモデルとして、使用できるので、これは、本明細書に記載の発明の実用化を大いに促進する。
【０１１０】
上に示した発見は、デクチン−１を介して作用する作用剤の治療用途の範囲を強化もし、広げもする。ＤＣのデクチン−１活性化は、隣接するＴ細胞に影響し、増殖量を増加させるようにＴ細胞に指示する。更に、この相互作用中に抗原が存在する場合、デクチン−１活性化ＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を強化する。これは、例えばワクチン環境におけるデクチン−１活性化が、抗原特異的なナイーブＴ細胞の選択的増殖を指示できることを示しており、したがって、これと、Ｂ細胞に対するデクチン−１活性化の上記直接及び間接効果とが相俟って、抗原特異的Ｂ細胞の増殖、そのため抗原特異的抗体の産生が明白に予測される。
【０１１１】
本明細書で考察した任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、その逆もできることを企図している。更に、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１１２】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示しており、本発明の限定として示しているのでないことは理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに多様な実施形態で使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の手順に等価な多数の手順を認識し、又は単なる日常的実験を用いて確認することができよう。このような等価な手順は、本発明の範囲に入ると考えられ、特許請求の範囲で網羅されている。
【０１１３】
本明細書で言及した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する技術分野における技術者の技術水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願の各々が、参照により組み込まれると明確に個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、用語「含む（comprising）」と共に使用される場合の単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は２以上」の意味とも合致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物だけを指すことを明確に示していない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物だけ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法の固有の誤差変化、又は試験対象の間に存在する変動を包含することを示すために、使用される。
【０１１５】
本明細書及び請求項（複数も）で使用する場合、単語「含む（comprising）」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（having）」（及び「ｈａｖｅ」、「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（including）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、包括的又は非制限的であり、挙げられていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。
【０１１６】
本明細書で使用する場合の用語「又はそれらの組合せ」は、その用語に先立つ列挙項目のあらゆる順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことも意図している。この例を続ければ、１又は複数の項目又は用語の繰返しを含有する、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの組合せも、明らかに含まれる。当業者であれば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、任意の組合せにおいて項目又は用語の数に制限が通常ないことは理解されよう。
【０１１７】
本明細書に開示し、主張する組成物及び／又は方法は全て、本開示に照らせば過度の実験をせずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、組成物及び／又は方法に対して、並びに本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに変更を加え得ることは、当業者には明らかとなろう。当業者には明らかなそのような全ての類似した代用及び改変は、付随する特許請求の範囲に規定するような本発明の趣旨、範囲及び概念に入ると見なされる。
【０１１８】
（参考文献）
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、抗原提示及び免疫細胞活性化の分野に関し、より特定すれば、デクチン−１を介して免疫細胞を活性化するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定せずに、その背景を樹状細胞活性化に関連して説明する。
【０００３】
樹状細胞は、可溶性の細胞内シグナルを出した後、病原体を認識することにより、先天性及び後天性免疫の境界を制御する上で枢要な役割を果たす。ＤＣのこうした機能は、最も顕著にはトール様受容体（ＴＬＲ）及びＣ型レクチン又はレクチン様受容体（ＬＬＲ）によって代表される、特殊表面受容体である「パターン認識受容体」（ＰＲＲ）の発現に依存するところが大きい（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84、Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251、Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。
【０００４】
現在のパラダイムでは、ＴＬＲの主たる役割は、免疫応答を開始するためにインターロイキン１２（ＩＬ−１２）及び他の炎症性サイトカインを産生するように、ＤＣに警報を発することである。Ｃ型ＬＬＲは、マクロファージ及びＤＣの強力な抗原捕捉・取込機構の成分として作動する（Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84）。しかし、ＬＬＲは、ＴＬＲと比較して、細胞移動（Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357）及び細胞内相互作用（Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585）を含めた広範囲の生物学的機能を有するものとも思われる。ＬＬＲのこうした多重機能は、ＴＬＲと異なり、ＬＬＲが自己、非自己の双方を認識できるという事実によるものとも思われる。しかし、免疫細胞中に発現される多数のＬＬＲの重複性を含め、ＬＬＲの複雑さが、個々のＬＬＲの詳細な機能を理解する際の主要な障害の１つとなっている。それに加え、こうした受容体の大多数に対する天然リガンドは、未だ同定されていないままである。とは言え、最近の研究からの証拠によって、ＬＬＲは、ＴＬＲと協力して、細菌感染中に免疫細胞の活性化に寄与し得ることが示唆されている（d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674、Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398、Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538、Netea, M. G., J. W. Meer, I. Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463、Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901、Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516、Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127、Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17、Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327）。他のＬＬＲと比較して、デクチン−１は、デクチン−１を発現する細胞を活性化するために、シグナルを送達するＩＴＡＭモチーフを有することが知られている。しかし、その研究の多くはマウスモデルにおいて行われてきており、ＤＣ、単球及びＢ細胞を含むヒト抗原提示細胞上に発現したデクチン−１の生物機能は、十分に特徴付けられていない。マウスと人間との間には、ＬＬＲの多くについて厳密な一致がないので、これは特に重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Figdor, C. G., Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2:77-84
【非特許文献２】Pyz, E., A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-type lectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38:242-251
【非特許文献３】Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43
【非特許文献４】Geijtenbeek, T. B., D. J. Krooshoop, D. A. Bleijs, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alon, C. G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357
【非特許文献５】Geijtenbeek, T. B., R. Torensma, S. J. van Vliet, G. C. van Duijnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585
【非特許文献６】d'Ostiani, C. F., G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli, A. Spreca, A. Mencacci, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic cells discriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo. J Exp Med 191:1661-1674
【非特許文献７】Fradin, C., D. Poulain, and T. Jouault. 2000. beta-1,2-linked oligomannosides from Candida albicans bind to a 32-kilodalton macrophage membrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun 68:4391-4398
【非特許文献８】Cambi, A., K. Gijzen, J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten, G. J. Adema, M. G. Netea, B. J. Kullberg, L. Romani, and C. G. Figdor. 2003. The C-type lectin DC-SIGN (CD209) is an antigen-uptake receptor for Candida albicans on dendritic cells. Eur J Immunol 33:532-538
【非特許文献９】Netea, M. G., J. W. Meer, I.Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD40 ligand interactions in the host defense against disseminated Candida albicans infection: the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol 32:1455-1463
【非特許文献１０】Lee, S. J., S. Evers, D. Roeder, A. F. Parlow, J. Risteli, L. Risteli, Y. C. Lee, T. Feizi, H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannose receptor-mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science 295:1898-1901
【非特許文献１１】Maeda, N., J. Nigou, J. L. Herrmann, M. Jackson, A. Amara, P. H. Lagrange, G. Puzo, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. The cell surface receptor DC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through selective recognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem 278:5513-5516
【非特許文献１２】Tailleux, L., O. Schwartz, J. L. Herrmann, E. Pivert, M. Jackson, A. Amara, L. Legres, D. Dreher, L. P. Nicod, J. C. Gluckman, P. H. Lagrange, B. Gicquel, and O. Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197:121-127
【非特許文献１３】Geijtenbeek, T. B., S. J. Van Vliet, E. A. Koppel, M. Sanchez-Hernandez, C. M. Vandenbroucke-Grauls, B. Appelmelk, and Y. Van Kooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. J Exp Med 197:7-17
【非特許文献１４】Cooper, A. M., A. Kipnis, J. Turner, J. Magram, J. Ferrante, and I. M. Orme. 2002. Mice lacking bioactive IL-12 can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL-12 p40 subunit is present. J Immunol 168:1322-1327
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗原に対する強力で広範な免疫応答を誘発する目的のために、抗原提示細胞に抗原を特異的に差し向ける（送達する）ワクチンを作製し、使用するための組成物及び方法を包含する。この目的は、主として、抗原が由来した作用剤（病原体又は癌）に対して、防御的又は治療的免疫応答を惹起することである。それに加え、本発明は、抗原提示細胞上に発現するデクチン−１と呼ぶ受容体への特異的な関与を介して、直接に、又は他の作用剤と協調して治療性を示す作用剤を包含する。
【０００７】
本発明者等は、ヒト細胞におけるデクチン−１の発現が、ＤＣ、単球及びＢ細胞を含む抗原提示細胞に限られることを示している。マウス細胞（マクロファージ）上に発現されるデクチン−１は、ＴＬＲ４リガンド及びＩＬ−１０により下方調節されることが知られているが、本発明者等は、本明細書で、ＴＬＲ４リガンドだけが、ヒトＤＣ上でのデクチン−１発現を下方調節することができ、ＩＬ−１０は、デクチン−１の発現を若干増加させることを示している。より興味深いことに、ヒトＤＣ上に発現したデクチン−１は、ＴＬＲ２より遥かに効果的にＴＬＲ４と相乗作用を示し、デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、サイトカイン及びケモカイン、特に、マウスモデルではこれまで認められなかったＩＬ−１２の産生を激増させる。ヒト扁桃腺Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋デクチン−１＋及びＣＤ１９＋デクチン−１−の２群に分類することができる。こうした知見は、抗デクチン−１抗体剤に基づく治療用及び防御用試薬において使用することもできる。
【０００８】
したがって、ヒトデクチン−１を介したシグナル伝達は、細胞（ＤＣを含む）活性化から観て、単独又は他の細胞シグナルとの共同のいずれかで、独特であり、機能的であることが、本発明において判明した。デクチン−１媒介細胞活性化は、特定の抗デクチン−１ ｍＡｂで誘発され、したがってこのような抗ヒトデクチン−１ ｍＡｂは、疾患に対処する試薬の開発に有用となろう。
【０００９】
本発明は、当該抗原提示細胞を活性化できる抗デクチン−１特異的抗体又はその断片と、抗原提示細胞を接触させ、抗原提示細胞を活性化することにより、デクチン−１発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高めるための組成物及び方法を包含する。抗原提示細胞の例には、樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せが挙げられる。抗原提示細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養し得る。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４並びにデクチン−１特異的抗体又は断片と接触させた抗原提示細胞を活性化すると、抗原提示細胞上におけるＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現の増加が実現される。インターフェロンα及びデクチン−１特異的抗体又はその断片で抗原提示細胞を活性化した際、該細胞は、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる。
【００１０】
本発明の更に別の方法は、樹状細胞を活性化するために、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を接触させるステップであって、活性化された樹状細胞が、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させるステップを含む。樹状細胞を活性化するために、デクチン−１特異的抗体又はその断片並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞の場合、活性化された樹状細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａ、並びにそれらの組合せの分泌を増加させる。樹状細胞を活性化する更に別の方法は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させるステップを含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片は、ＣＤ４０を介したシグナル伝達と連携してその活性化を増加させる。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンα並びにデクチン−１特異的抗体又はその断片と接触した樹状細胞は、樹状細胞によるＢ細胞及びＴ細胞の共刺激活性を増加させることが判明した。
【００１１】
更に別の方法は、抗原提示細胞を抗デクチン−１特異的抗体と接触させるステップ、及びＴＬＲ４受容体を介した活性化により、抗原提示細胞を共活性化するステップを含み、該細胞が、サイトカイン及びケモカインの産生を増加させることを含む。ＴＬＲ４受容体を介した活性化による抗原提示細胞の共活性化では、該細胞が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びそれらの組合せの分泌を増加させる。
【００１２】
ＴＬＲ４リガンド、抗ＴＬＲ４抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１ハイブリッド抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１リガンドコンジュゲートの少なくとも１つを用いる、ＴＬＲ４受容体を介した活性化により、抗原提示細胞を共活性化するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。デクチン−１特異的抗体又は断片は、１５Ｅ２．５、１１Ｂ６．４、１５Ｆ４．７、１４Ｄ６．３及び９Ｈ７．６、並びにそれらの組合せから選択されるクローンの１又は複数でもよい。樹状細胞は、デクチン−１受容体を介してデクチン−１特異的抗体又はその断片で活性化することにより、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化し得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片は、コヘシン／ドッケリン対の半分に結合し得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合しているとき、その対の他の半分は、１又は複数の抗原や、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性なアナログ、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、サイトカインに結合し得る。
【００１３】
本発明は、抗原提示細胞を活性化して、新たな細胞マーカーを発現し、１若しくは複数のサイトカインを分泌し、又はその双方を行う、デクチン−１特異的抗体又はその断片を発現したハイブリドーマ及びそれから単離された抗体を包含する。該ハイブリドーマは、クローンのＰＡＢ１、ＰＡＢ４、ＰＡＢ５、ＰＡＢ８、ＰＡＢ１０及びそれらの組合せから選択し得る。
【００１４】
抗原とＴＬＲ９のアクチベーターとの存在下、デクチン−１特異的抗体又はその断片で樹状細胞上のデクチン−１受容体を誘発させるステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、デクチン−１／ＴＬＲ９活性化樹状細胞と接触しているＢ細胞が、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌し、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させ、及びそれらの組合せを行う方法。こうした樹状細胞を用いて活性化されたＢ細胞は、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６及びそれらの組合せを分泌する。Ｂ細胞の例には、デクチン−１も発現し得る、及び／又はＩｇＭの産生を高める形質細胞が含まれる。
【００１５】
本発明は、デクチン−１特異的抗体又はその断片でＢ細胞上のデクチン−１受容体を誘発させるステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、Ｂ細胞が抗体産生を増加させる方法も包含する。本発明を用いて活性化されたＢ細胞は、分泌されるＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、及びそれらの組合せの産生を増加させ、並びに／又はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、及びそれらの組合せの産生を増加させる。
【００１６】
本発明は、樹状細胞上のデクチン−１受容体をデクチン−１特異的抗体又はその断片及びＴＬＲ４受容体で誘発させ、デクチン−１／ＴＬＲ４活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させることにより、Ｔ細胞の活性化を増強することによって、Ｔ細胞の活性化を増強する方法も包含する。活性化に用いる樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せと接触させ得る。デクチン−１特異的抗体又はその断片は、Ｔ細胞によるＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びそれらの組合せの分泌を増加させる。樹状細胞で活性化されたＴ細胞は、４−１ＢＢＬの表面発現を増加させ、及び／又はそれを増殖させ得る。
【００１７】
本発明は、哺乳動物細胞から分泌される抗デクチン−１免疫グロブリン又はその部分と、該免疫グロブリンに結合した抗原とをも包含し、免疫グロブリンが抗原を抗原提示細胞に差し向ける。抗原特異的ドメインには、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片が挙げられる。
【００１８】
本発明の更に別の実施形態は、デクチン−１特異的抗体又はその断片で活性化された樹状細胞を含んだワクチンを含む。本発明は、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片で直接活性化されている、及び／或いは、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片の単独で、又は他の免疫細胞と組み合わさって活性化され終えた、樹状細胞などの抗原提示細胞で活性化されている、Ｂ細胞、Ｔ細胞又は他の免疫細胞も包含する。例えば、併用療法には、デクチン−１特異的抗体若しくはその断片で活性化され終えた、抗原負荷可能な抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞を含み得るが、それらは一緒になってワクチンを形成する。
【００１９】
本発明はまた、単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のデクチン−１受容体と会合する作用剤であって、前記組合せでは、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる作用剤の使用；活性化剤の有無に関わらない、免疫細胞上における、１又は複数の抗原に連結されたデクチン−１結合剤のワクチン作製を目的とした使用；免疫細胞上に発現されるデクチン−１以外の細胞表面受容体を介して指示される、免疫応答の増強を目的とした、免疫細胞の共活性化剤としての抗デクチン−１抗体剤の使用；デクチン−１受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗デクチン−１抗体Ｖ領域配列の使用、並びに／或いは、デクチン−１を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はデクチン−１を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤に連結されたデクチン−１結合剤の使用も包含する。
【００２０】
本発明の更に別の実施形態は、コヘシン−ドッケリン結合対の半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、デクチン−１特異的抗体結合ドメインを含むモジュール構成ｒＡｂ担体を包含する。抗原特異的結合ドメインは、抗体の少なくとも一部分、及び／又はコヘシン−ドッケリン結合対の半分との融合タンパク質中の抗体の少なくとも一部分であり得る。該ｒＡｂはまた、モジュール構成ｒＡｂ担体と複合体を形成する抗原に結合した、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分、及び／又は抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分であり得る。該抗原特異的ドメインは、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片でもよい。
【００２１】
本発明の特徴及び利点に関するより完全な理解のために、添付の図と共に、本発明の詳細な説明に以下に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（図１Ａ及び１Ｂ）健常ドナーのＰＢＭＣ上におけるデクチン−１の発現量を示す図である。
【図２】ＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ３リガンド（１００ｎＭ）、ＴＬＲ４リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮα（５００Ｕ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、２４時間培養したインビトロ培養のＩＬ−４ＤＣの結果を示す図である。
【図３】抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す図である。
【図４】（図４Ａ及び４Ｂ）デクチン−１を介したシグナル伝達が、ＩＬ−４ＤＣ、ＩＦＮＤＣ双方を活性化できることを示す図である。抗デクチン−１ ｍＡｂはＤＣを活性化する。ＩＦＮＤＣ（図４Ａ）及びＩＬ−４ＤＣ（図４Ｂ）を２４時間、抗デクチン−１抗体で刺激し、次いで細胞を抗ＣＤ８６、８０、４０、８３、ＣＣＲ７及びＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色した。
【図５】デクチン−１及びＴＬＲが相乗的に作用して、ＤＣを活性化することを示す図である。ＩＬ−４ＤＣ（２×１０５個／２００μｌ／ウェル）を、可溶性のＴＬＲ４リガンド（１．５ｎｇ／ｍｌ）又はＴＬＲ２リガンド（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下、抗デクチン−１抗体で被覆した９６ウェルプレート中、１８時間培養した。対照ｍＡｂも試験した。１８時間後、培養上清の分析で、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【図６】（図６Ａ及び６Ｂ）Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ４リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ４リガンドで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す図である（図６Ａ）。精製した自己Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。図６Ｂは、Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ２リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ２リガンドで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す。精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。
【図７】Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭを負荷し、抗デクチン−１ ｍＡｂ、ＴＬＲ４リガンド、又は抗デクチン−１ ｍＡｂ及びＴＬＲ４リガンド、ザイモサンで１８時間活性化したＩＦＮＤＣ（５０００ＤＣ／ウェル／２００μｌ）の結果を示す図である。抗ＩＬ−１０中和抗体（５μｇ／ｍｌ）を、抗デクチン−１抗体及びＴＬＲ４リガンド並びにザイモサンで刺激したＤＣ中に添加した。抗ＩＬ−１０抗体に対する対照抗体も試験したが、有意差は認められなかった（データは示していない）。精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞（２×１０５細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下で１０日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体及びＭａｒｔ−１−ＨＬＡ−Ａ２四量体で染色した。
【図８】抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化したＤＣが、ＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬの増加量を発現することを示す図である。ＩＦＮＤＣ（２×１０５個／２００μｌ／ウェル）を、抗デクチン−１抗体又は対照Ｉｇで被覆した９６ウェルプレート中、１８時間培養した。１８時間後、細胞を抗ＩＬ−１５抗体及び抗４−１ＢＢＬ抗体で染色した。
【図９】（図９Ａ及び９Ｂ）ＤＣ上に発現したデクチン−１が、体液性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。６日目のＩＬ−４ ＤＣ、５×１０３個／ウェルを、抗デクチン−１抗体又は対照ｍＡｂで被覆した９６ウェルプレート中、１６〜１８時間インキュベートし、次いで、ＣＦＳＥで染色した２×１０４個の自己ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＣＤ４０Ｌを５０ｎｇ／ｍｌの存在下（図９Ａ）、又はＣｐＧ ５０ｎＭの存在下（図９Ｂ）で共培養した。６日目に、細胞を蛍光標識抗ＣＤ３８抗体で染色した。１３日目の培養上清の総免疫グロブリンをサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。
【図１０】（図１０Ａ及び１０Ｂ）Ｂ細胞上に発現したデクチン−１が、Ｂ細胞の活性化及び免疫グロブリンの産生に寄与することを示す図である。図１０Ａ．精製ＣＤ１９＋Ｂ細胞（２００００細胞／ウェル／２００μｌ）を、ＣｐＧを５０ｎＭ及びＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌの存在下、抗デクチン−１抗体又は対照ＩｇいずれかのｍＡｂで被覆したプレート中、６日間培養した。細胞を抗ＣＤ３８抗体で染色し、細胞増殖をＣＦＳＥ希釈により測定した。図１０Ｂ．培養１３日目に、産生総免疫グロブリンを測定するために、培養上清をＥＬＩＳＡで分析した。
【図１１】（図１１Ａ〜１１Ｃ）ＤＣ上に発現したデクチン−１が、細胞性免疫応答の増強に寄与することを示す図である。図１１Ａ．ＩＦＮＤＣ、５×１０３個を、抗デクチン−１抗体又は対照ｍＡｂで被覆したプレート中、組換えＦｌｕ Ｍ１タンパク質１００ｎＭの存在下、１６〜１８時間培養し、次いで、精製した自己ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＩＬ−２を２０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７を１０ｎｇ／ｍｌの存在下、７日間共培養した。細胞を抗ＣＤ８抗体、及びＨＬＡ−Ａ２のＦｌｕ Ｍ１ペプチドエピトープに対する四量体で染色した。図１１Ｂ及び１１Ｃ．ＩＦＮＤＣに、Ｍａｒｔ−１ペプチド１０μＭ（図１１Ｂ）又はＣｏｈ−Ｍａｒｔ−１組換えタンパク質１００ｎＭを負荷し、次いで図１１Ａに表示するように、抗デクチン−１抗体又は対照抗体で刺激した。１０日間の培養後、細胞を抗ＣＤ８抗体及び四量体（ＨＬＡ−Ａ２−ｍａｒｔ−１ペプチド）で染色した。各線は、個々のドナーから生成したデータを表す。この試験に使用した全ての細胞は、ＨＬＡ−Ａ２０１陽性健常ドナーに由来した。
【図１２】可溶型の抗デクチン−１ ｍＡｂが、ＤＣを活性化して、Ｍａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強することを示す図である。ＩＦＮＤＣ、５×１０３個を、抗デクチン−１抗体、抗ＣＤ４０抗体又は対照ｍＡｂの０．５μｇ／ｍｌ存在下、１６時間培養した。精製した自己Ｔ細胞（２×１０５個／ウェル）を培養物中に添加する前に、Ｍａｒｔ−１ペプチド２０μＭを添加した。１０日後、細胞を抗ＣＤ８抗体及び四量体（ＨＬＡ−Ａ２−ｍａｒｔ−１ペプチド）で染色した。この試験に使用した全ての細胞は、ＨＬＡ−Ａ２０１陽性健常ドナーに由来した。
【図１３】健常ドナーの扁桃腺を取得し、ＤＮＡｓｅ非含有III型コラゲナーゼを用いて細胞浮遊液を調製したことを示す図である。細胞を５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで激しく洗浄した後、抗デクチン−１ ｍＡｂと共に抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ１９抗体で染色した。イソタイプ合致対照ｍＡｂを使用した。
【図１４】（図１４Ａ及び１４Ｂ）健常ドナーからの人体皮膚（図１４Ａ）及びリンパ節（図１４Ｂ）の組織切片を調製し、ＤＡＰＩ（青色）及びこの試験で調製した抗デクチン−１抗体（赤色）で染色したことを示す図である。
【図１５】非ヒト霊長類（カニクイザル）のＰＢＭＣを抗デクチン−１ ｍＡｂ及び細胞表面マーカーに対する抗体で染色したことを示す図である。
【図１６】これまでに示し又は言及した抗原の多くを保持する、典型的なｒＡｂ．抗原融合タンパク質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の各種実施形態の作成及び使用を以下に詳細に考察するが、本発明は、多種多様な特定の関係において具体化できる適用可能な多くの発明概念を提供することを理解されたい。本明細書に考察する特定の実施形態は、本発明を作成し、使用する特定の方法を例示しているに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２４】
本発明の理解を深めるために、幾つもの用語を以下に定義する。本明細書に定義する用語は、本発明関連の分野の当業者が通常理解している意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、単一体だけを指すことを意図しているのではなく、例示のために具体例で使用し得る部類一般を包含する。本発明における専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用するが、その用法は、特許請求の範囲で概説される場合を除き、本発明を制限するものではない。
【００２５】
本発明は、防御抗原をコードすることが知られている、又は疑われている抗原に、Ａｂ重鎖を介して融合している組換えヒト化ｍＡｂ（特異的なヒト樹状細胞受容体デクチン−１に対する）も包含する。こうした抗原には、各種作用剤に対するワクチン接種用の例として、インフルエンザＨ５Ｎ１のヘマグルチニン；リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ毒素からの弱毒化毒素のＨＩＶ ｇａｇ；メラノーマ抗原からの「一連」の抗原ペプチドなどが挙げられる。本発明は、危険に瀕した又は感染した人々の予防用又は治療用ワクチン接種に用途を見出すことになろう。本発明は、多くの疾患及び癌に対する、人間、動物両用のワクチン接種に対して広範な適用性を有する。
【００２６】
本明細書で使用する場合、用語「モジュール構成ｒＡｂ担体」とは、単一の組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、本例では抗デクチン−１モノクローナル抗体に対して、多様な抗原、活性化タンパク質又は他の抗体の制御されたモジュール式付加を行うように操作・作製された、組換え抗体系を記述するために使用される。該ｒＡｂは、標準的なハイブリドーマ技法、組換え抗体ディスプレーを用いて作製したモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体などでよい。モジュール構成ｒＡｂ担体は、例えば、多重抗原、及び／又は抗原と活性化サイトカインを、（細胞内取込性受容体、例えばヒト樹状細胞受容体に対する１つの一次組換え抗体を介して）標的とする樹状細胞（ＤＣ）に向けるために使用することができる。モジュール構成ｒＡｂ担体は、異なる２種の組換えｍＡｂを制御し、規定した様式で末端間で結合するためにも使用し得る。
【００２７】
「モジュール構成ｒＡｂ担体」の抗原結合部分は、１又は複数の可変ドメイン、１又は複数の可変ドメインと第１定常ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片でもよく、Ｆｃドメインの前記複数部分に対しては、同族性のモジュール構成結合部分が、アミノ酸配列に付加しており、及び／又は結合している。モジュール構成ｒＡｂ担体に使用する抗体は、任意のイソ型若しくはクラス、サブクラスでもよく、又は任意の供給源からでもよい（動物及び／又は組換え）。
【００２８】
非限定的な一例では、モジュール構成ｒＡｂ担体は、操作組換えｍＡｂに関し、特異的で規定されたタンパク質複合体を作製するために、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを有するように操作されている。該ｍＡｂは、該ｍＡｂの抗原結合ドメインからのカルボキシと共に、１又は複数のモジュール構成コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部分である。コヘシン−ドッケリンタンパク質ドメインは、翻訳後に、例えば、化学的な架橋剤及び／又はジスルフィド結合の使用によってさえ、結合してもよい。
【００２９】
本明細書で使用する場合の用語「抗原」とは、抗原の受容者において体液性及び／又は細胞性の免疫応答を開始できる分子を指す。抗原は、本発明を用いた異なる２つの状況で、即ち、抗体又はｒＡｂの他の抗原認識ドメインに対する標的として、或いはモジュール構成ｒＡｂ担体に対するドッケリン／コヘシン−分子相補体の一部として、ｒＡｂにより細胞又は標的へ及び／又はその中へ運搬される当該分子として、使用し得る。抗原は、普通、ワクチン接種が有利な治療になると思われる疾患を起こす作用剤である。抗原がＭＨＣ上に提示されるとき、そのペプチドはしばしば約８〜約２５アミノ酸である。抗原には、例えば、単純な中間代謝物、糖類、脂質及びホルモン、並びに複合炭水化物、リン脂質、核酸、タンパク質などの高分子を含めた、任意種の生体分子が含まれる。抗原の一般的種類には、それだけに限らないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫及び他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関わる抗原、並びに他の種々の抗原が挙げられる。
【００３０】
モジュール構成ｒＡｂ担体は、任意数の活性剤、例えば、抗生物質、感染症治療剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、骨粗鬆症用治療剤、酵素、サイトカイン、抗凝固剤、多糖類、コラーゲン、細胞、及び前記活性剤の２種以上の組合せを運搬することができる。本発明を用いて送達する抗生物質の例には、限定はしないが、テトラサイクリン、アミノ糖、ペニシリン、セファロスポリン、スルホンアミド薬、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、エリスロマイシン、バンコマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、ナイスタチン、アンホテリシンＢ、アマンチジン、イドクスウリジン、ｐ−アミノサリチル酸、イソニアジド、リファンピン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、ダウノマイシン、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、イミダゾールカルボキサミドなどが挙げられる。
【００３１】
本発明を用いて送達する抗腫瘍剤の例には、限定はしないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、メソトレキセートなどが挙げられる。解熱剤及び鎮痛剤の例には、アスピリン、Motrin（登録商標）、Ibuprofen（登録商標）、ナプロシン、アセトアミノフェンなどが挙げられる。
【００３２】
本発明を用いて送達する抗炎症剤の例には、限定はしないが、ＮＳＡＩＤ、アスピリン、ステロイド、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、プレドニゾロン、ジクロフェナックＮａなどが挙げられる。
【００３３】
本発明を用いて送達する、骨粗鬆症治療の治療剤並びに骨及び骨格に作用する他の因子の例には、限定はしないが、カルシウム、アレンドロネート、骨ＧＬａペプチド、甲状腺ホルモン及びその活性断片、ヒストンＨ４関連骨形成増殖ペプチド、並びにそれらの変異体、誘導体及び類縁体が挙げられる。
【００３４】
本発明を用いて送達する酵素及び酵素補因子の例には、限定はしないが、パンクレアーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、ｔＰＡ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、パンクレアチン、コラゲナーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲン、ストレプトキナーゼ、アデニルシクラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などが挙げられる。
【００３５】
本発明を用いて送達するサイトカインの例には、限定はしないが、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性な類縁体、断片及び誘導体が挙げられる。サイトカインは、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、又はそれらの任意の断片若しくは組合せでもよい。他のサイトカインには、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた、形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーの構成員が挙げられる。
【００３６】
本発明を用いて送達する成長因子の例には、限定はしないが、哺乳動物細胞などの自然源若しくは天然源から単離できる成長因子、又は組換えＤＮＡ技法若しくは各種化学法などにより合成で調製できる成長因子が挙げられる。それに加え、こうした因子の類縁体、断片又は誘導体も、その自然分子の生物活性の少なくとも一部を示す限り、使用することができる。例えば、部位特異的変異誘発又は他の遺伝子工学技法で改変した遺伝子の発現により、類縁体を調製することができる。
【００３７】
本発明を用いて送達する抗凝固剤の例には、限定はしないが、ワルファリン、ヘパリン、ヒルジンなどが挙げられる。本発明を用いて送達する、免疫系に作用する因子の例には、限定はしないが、化学走性ペプチド、ブラジキニンなど、炎症及び悪性新生物を抑制する因子、並びに感染性微生物を攻撃する因子が挙げられる。
【００３８】
ウイルス抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶ成分などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来レトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ及びＬプロテイン、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、並びにＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどの他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型及びＣ型肝炎のウイルス成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ並びに他のインフルエンザウイルス成分などのインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス融合タンパク質及び他の麻疹ウイルス成分などの麻疹ウイルス抗原；プロテインＥ１及びＥ２並びに他の風疹ウイルス成分などの風疹ウイルス抗原；ＶＰ７ｓｃ及び他のロタウイルス成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖タンパク質Ｂ及び他のサイトメガロウイルス抗原成分などのサイトメガロウイルス抗原；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２プロテイン、及び他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分などの呼吸器合胞体ウイルス抗原；前初期タンパク質、糖タンパク質Ｄ、及び他の単純疱疹ウイルス抗原成分などの単純疱疹ウイルス抗原；ｇｐＩ、ｇｐII及び他の水疱瘡ウイルス抗原成分などの水疱瘡ウイルス抗原；プロテインＥ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅ及び他の日本脳炎ウイルス抗原成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質及び他の狂犬病ウイルス抗原成分などの狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。ウイルス抗原の追加例については、Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)を参照されたい。
【００３９】
本発明のｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンを用いて送達し得る抗原性標的には、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は寄生虫抗原などの抗原をコードする遺伝子が含まれる。ウイルスには、ピコルナウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビルウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、及び海綿状ウイルスが挙げられる。他のウイルス標的には、インフルエンザ、１型及び２型単純疱疹ウイルス、麻疹、デング熱、天然痘、ポリオ又はＨＩＶが挙げられる。病原体には、トリパノゾーマ、サナダムシ、回虫、蠕虫、マラリアが挙げられる。胎児性抗原や前立腺特異的抗原などの腫瘍マーカーは、このようにして標的とし得る。他の例には、ＨＩＶのｅｎｖタンパク質及びＢ型肝炎表面抗原が含まれる。ワクチン接種用に本発明によるベクターを投与するには、強い免疫応答が望ましいと思われる移入遺伝子の長期発現を可能とするに十分に、ベクター関連抗原が非免疫原性である必要があろう。幾つかの事例では、個人へのワクチン接種は、毎年又は２年毎など、まれにしか必要とされず、感染体から長期の免疫防御を与え得る。本発明と共にベクター中に使用し、最終的には抗原として使用する微生物、アレルゲン、並びに核酸及びアミノ酸の配列の具体例は、米国特許第６５４１０１１号明細書に見出し得るが、その関連部分、特に、本発明と共に使用し得る微生物及び特定の配列に適合する各表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本明細書で開示するｒＡｂワクチンと共に使用する細菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、百日咳毒素、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸サイクラーゼ、及び他の百日咳菌抗原成分などの細菌抗原；ジフテリア毒素又はトキソイド、及び他のジフテリア細菌抗原成分などのジフテリア細菌抗原；破傷風毒素又はトキソイド、及び他の破傷風菌抗原成分などの破傷風菌抗原；Ｍプロテイン及び他の連鎖球菌抗原成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖類及び他のグラム陰性細菌抗原成分などのグラム陰性バチルス菌抗原；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主要分泌タンパク質、抗原８５Ａ、及び他のマイコバクテリア抗原成分などの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）抗原；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖類、及び他の肺炎球菌抗原成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖類、及び他のインフルエンザ菌（haemophilus influenza）抗原成分などのインフルエンザ菌抗原；炭疽菌防御抗原、及び他の炭疽菌抗原成分などの炭疽菌抗原；ロンプＡ及び他のリケッチア細菌抗原成分などのリケッチア細菌抗原が挙げられる。他の任意の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア又はクラミジアの抗原も、本明細書に記載の細菌抗原と共に含まれる。部分又は完全病原体としては、インフルエンザ菌、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、髄膜炎菌（neisseria meningitidis）、肺炎連鎖球菌（streptococcus pneumoniae）、淋菌（neisseria gonorrhoeae）、サルモネラ血清型チフス菌（salmonella serotype typhi）、赤痢菌（shigella）、コレラ菌（vibrio cholerae）、デング熱、脳炎、日本脳炎、ライム病、ペスト菌（Yersinia pestis）、西ナイルウイルス、黄熱病、野兎病（tularemia）、肝炎（ウイルス性、細菌性）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３、アデノウイルス、天然痘、アレルギー並びに癌も該当し得る。
【００４１】
本発明の組成物及び方法と共に使用する真菌抗原には、それだけに限らないが、例えば、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）及び他のヒストプラズマ真菌抗原成分などのヒストプラズマ真菌抗原；莢膜多糖類及び他のクリプトコッカス真菌抗原成分などのクリプトコッカス真菌抗原；小球抗原及び他のコクシジオデス（coccidiodes）真菌抗原成分などのコクシジオデス真菌抗原；並びにトリコフィチン及び他のコクシジオデス真菌抗原成分などの白癬真菌抗原が挙げられる。
【００４２】
原虫抗原及び他の寄生虫抗原の例には、それだけに限らないが、例えば、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、生殖母細胞／配偶子表面抗原、血液期抗原ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ、及び他のプラスモジウム抗原成分などの熱帯熱マラリア原虫抗原；ＳＡＧ−１、ｐ３０及び他のトキソプラズマ抗原成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシン、及び他の住血吸虫抗原成分などの住血吸虫抗原；ｇｐ６３、リン脂質グリカン及びその付随タンパク質、並びに他のリーシュマニア抗原成分などのリーシュマニア主要抗原及び他のリーシュマニア抗原；更に７５〜７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原及び他のトリパノソーマ抗原成分などのトリパノゾーマ・クルージ（trypanosoma cruzi）抗原が挙げられる。
【００４３】
本発明のｒＡｂを用いて標的にできる抗原は、細胞内取込みの見込み、免疫細胞の特異性レベル、標的とする免疫細胞の型、免疫細胞の成熟度及び／又は活性化度などを含めた多数の要因に基づいて、一般に選択されよう。樹状細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ及び／又はＤＥＣＴＩＮ−１などが挙げられるが、同時に幾つかの事例では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及び／又はＣＤ５７が存在しないこともある。抗原提示細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮ−γ受容体及びＩＬ−２受容体、ＩＣＡＭ−１、及び／又はＦｃγ受容体が挙げられる。Ｔ細胞にとっての細胞表面マーカーの例には、それだけに限らないが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲが挙げられる。
【００４４】
腫瘍抗原に特徴的な標的抗原を含めた、送達対象となる細胞表面上の標的抗原は、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などに由来することになろう。本発明の抗体部分に対する腫瘍標的の例には、限定はしないが、白血病、リンパ腫などの血液癌、星状細胞種やグリア芽腫などの神経腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頚部癌、胃癌や結腸癌などの消化器癌、肝癌、膵臓癌、子宮頚部癌、子宮癌、卵巣癌、膣癌、睾丸癌、前立腺癌若しくは陰茎癌などの泌尿生殖器腫瘍、骨腫瘍、血管腫瘍、又は口唇、鼻咽頭、咽頭及び口腔、食道、直腸、胆嚢、胆道系、喉頭、肺及び気管支、膀胱、腎臓、脳及び他の神経系部分、甲状腺の癌、ホジキン病、非ホジキン病リンパ腫、多発性骨髄腫及び白血病が挙げられる。
【００４５】
本発明を用いた抗原提示のために免疫細胞へ、単独又は組み合わせて送達し得る抗原の例には、腫瘍タンパク質、例えば変異した癌遺伝子；腫瘍に付随するウイルスタンパク質；並びに腫瘍のムチン及び糖脂質が挙げられる。腫瘍に付随するウイルスタンパク質とし得る抗原は、上記した部類のウイルスに由来するものとなろう。ある種の抗原は、腫瘍に特徴的なこともあり（腫瘍前駆細胞が普通発現しないタンパク質の１サブセット）、又は、腫瘍前駆細胞中で通常発現するが、腫瘍に特徴的な変異を有するタンパク質のこともある。他の抗原には、変化した活性又は細胞内分布、例えば、腫瘍抗原を生じる遺伝子の変異を有する、正常タンパク質の変異体（複数も）が含まれる。
【００４６】
腫瘍抗原の非限定的な具体例には、ＣＥＡ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＭＡＧＥ１〜４、６及び１２、ＭＵＣ（ムチン）（例えば、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２など）、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ｒａｓ、ｍｙｃ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ（メラノーマ抗原）、Ｐｍｅｌ１７（ｇｐ１００）、ＧｎＴ−ＶのイントロンＶ配列（Ｎ−アセチルグルコアミニルトランスフェラーゼＶのイントロンＶ配列）、前立腺Ｃａ ｐｓｍ、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ抗原）、β−カテニン、ＭＵＭ−１−Ｂ（メラノーマの遍在性変異遺伝子産物）、ＧＡＧＥ（メラノーマ抗原）１、ＢＡＧＥ（メラノーマ抗原）２〜１０、ｃ−ＥＲＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）１〜６、ｇｐ７５、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、Ｂｃｌ−２、並びにＫｉ−６７が挙げられる。それに加え、免疫原性分子には、自己免疫疾患の開始及び／又は展開に関与する自己抗原がなることができ、その病状は、関連する標的の器官、組織又は細胞、例えばＳＬＥ若しくはＭＧが発現する分子に特異的な抗体の活性に起因するところが大きい。このような疾患では、当該自己抗原に対する進行中の抗体媒介（即ち、Ｔｈ２型）免疫応答を、細胞性（即ち、Ｔｈ１型）免疫応答へ誘導することが望ましいこともある。或いは、当該自己免疫疾患に罹ってはいないが、罹り易いと疑われる対象において、適当な自己抗原に対してＴｈ１応答を予防的に誘発することにより、自己抗原に対するＴｈ２応答の開始を予防し、又はその応答レベルを低下させることが望ましいこともある。所望の自己抗原には、限定はしないが、（ａ）ＳＬＥに関しては、Smithタンパク質、ＲＮＰリボ核タンパク質、並びにＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂタンパク質と、（ｂ）ＭＧに関しては、アセチルコリン受容体とが挙げられる。１又は複数種の自己免疫応答に関与する他の種々の抗原の例には、例えば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン及び他のホルモンなどの内因性ホルモンが挙げられる。
【００４７】
自己免疫疾患、アレルギー及び移植片拒絶に関与する抗原は、本発明の組成物及び方法において使用することができる。例えば、以下の自己免疫疾患又は障害のいずれか１又は複数に関与する抗原は、本発明において使用することができる。即ち、糖尿病、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬症、ショーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含むショーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物虫刺され反応によるアレルギー応答、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病反転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、真正赤血球性貧血、特発性血小板減少、多発軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼球症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症である。自己免疫疾患に関与する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、自然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、サイログロブリン、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体が挙げられる。アレルギーに関与する抗原の例には、杉花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ホソムギ花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原及びネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、並びにペニシリン及び他の治療薬が挙げられる。移植片拒絶に関与する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、及び神経の移植片成分などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原性成分が挙げられる。この抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な改変ペプチドリガンドの場合もある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ（複数も）」とは、病原性ＤＮＡ又はＲＮＡがコードする多数の病原性ポリペプチドのいずれか内にあるエピトープに類似の一次、二次又は三次構造を含む、ペプチド又はタンパク質の抗原を指す。その類似度は、このようなポリペプチドに差し向けられたモノクローナル又はポリクローナル抗体も、そのペプチド又はタンパク質抗原に結合し、その抗原と反応し、又はそれ以外の方法でその抗原を認識する程度に、一般にはなろう。各種の免疫アッセイ法、例えば、全て当業者に公知のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどが、このような抗体と共に使用し得る。ワクチンでの使用に適した病原性エピトープ及び／又はそれらの機能的等価物の同定は、本発明の一部である。単離し、同定してしまえば、機能的等価物を容易に取得し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４５５４１０１号明細書中で教示され、親水性に基づいてアミノ酸配列からのエピトープの同定及び調製を教示するHoppの方法を採用してもよい。エピトープコア配列を同定するために、他の数件の論文に記載の方法、及びそれらに基づくソフトウェアプログラムも使用することができる（例えば、Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; 米国特許第４５５４１０１号明細書を参照されたい）。次いで、こうした「エピトープコア配列」のアミノ酸配列は、ペプチド合成、組換え技術のいずれかを適用することにより、ペプチド中に容易に取り込み得る。
【００４９】
活性成分として本発明の抗原をコードする核酸を含んだワクチン組成物の製剤は、溶液、懸濁液いずれかの注射剤として調製し得るが、感染前の液中溶解又は懸濁に適した固形も、調製することができる。該製剤は、乳化してもよく、リポソーム中に封入してもよい。免疫原性活性成分は、薬学的に許容され、その活性成分と適合する担体と混合することがしばしばある。
【００５０】
用語「薬学的に許容される担体」とは、投与される対象においてアレルギー反応又は他の有害作用を起こさない担体を指す。薬学的に許容される適切な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せの１又は複数が挙げられる。それに加え、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの少量の補助物質を含有することができる。有効になり得るアジュバントの例には、それだけに限らないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、ＭＴＰ−ＰＥ、並びに細菌から抽出した３成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Tween 80乳濁液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの他の例には、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、フロイントの完全及び不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡが挙げられる。それに加え、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）又はポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−γ誘導因子などの免疫調節物質も、本明細書に記載のアジュバントと併用することができる。
【００５１】
医薬品は、本発明中に記載するように、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで有する裸のポリヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチドは、生物活性ペプチド、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードすることもあり、生理学的に許容される投与形態で与えられよう。本発明から生じ得る別の医薬品は、本明細書に記載の手順に従って、患者の血液又は他の供給源から単離した高精製度の血漿リポタンパク質分画と、血漿リポタンパク質上に存在するアポリポタンパク質の特異的なＤＮＡ結合部位に結合する、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有し、該精製リポタンパク質分画に予め結合させたポリヌクレオチドとを生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５２】
更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。更に別の医薬品は、特定のヌクレオチド配列を単一又は多数コピーで含有するポリヌクレオチドに予め結合させた、特異的なＤＮＡ結合モチーフを単一又は多数コピーで含有する組換えアポリポタンパク質断片を含んだ、高精製度の血漿リポタンパク質分画を生理学的に許容される投与形態で含み得る。
【００５３】
投与すべき用量は、治療する対象の体重及び健康状態、並びに投与経路及び治療頻度に大いに依存する。高精製度のリポタンパク質分画に予め結合させた裸の該ポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ及びタンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。
【００５４】
患者に対するｒＡｂ及びｒＡｂ複合体の投与は、ベクターの毒性が仮にあればそれを考慮して、化学療法剤を投与するための一般手順に従うことになろう。必要な場合、治療サイクルを繰り返すことになると予想される。各種の標準療法並びに外科的介入を、上記遺伝子療法と組み合わせて適用し得ることも想定される。
【００５５】
遺伝子療法の臨床的適用を想定する場合、意図した適用に適当な医薬組成物として、該複合体を調製することが必要となろう。一般に、これには、発熱物質、並びに人間や動物に有害な恐れがある他の任意の不純物を本質的に含まない医薬組成物の調製が伴われよう。複合体を安定化させ、複合体の標的細胞による取込みを可能とするために、適当な塩及び緩衝剤を使用することも一般に望まれよう。
【００５６】
本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体又は水性媒体中に溶解又は分散された有効量の化合物を含み得る。このような組成物は、接種液と呼ぶこともできる。医薬活性物質に対するこのような媒体及び作用剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の任意の媒体又は作用剤が、活性成分と適合しない場合を除き、治療組成物におけるその使用が想定される。補助的な活性成分も、組成物中に取り込むことができる。本発明の組成物は、古典的な医薬製剤を包含し得る。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために防腐剤を含有している。
【００５７】
疾患状態。治療する特定の疾患に応じて、本発明による治療組成物の投与は、最大の（又は、幾つかの症例では最小の）免疫応答を受ける部位へ抗原の送達量を最大化させるために、標的組織がその経路を介して利用できる限り、任意の経路を介することになろう。投与は、一般に、同所的な皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内の注射によるものとなろう。他の送達域には、経口、鼻腔、口腔、直腸、膣又は局所が挙げられる。局所投与は、皮膚癌の治療には特に有利となろう。このような組成物は、生理学的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含んだ、薬学的に許容される組成物として通常投与されよう。
【００５８】
本発明のワクチン又は治療組成物は、非経口的に、例えば、皮下又は筋肉内いずれかの注射により投与し得る。他の投与方式に適した追加の製剤には、坐剤、及び一部の症例では、経口製剤、又はエアロゾルとしての分配に適した製剤が含まれる。経口製剤の場合、アジュバントを用いたＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、又は個々のサイトカインの各種製剤への添加により、免疫応答が最適化された改良型経口ワクチンを生じる。坐剤の場合、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得る。このような坐剤は、活性成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成し得る。経口製剤は、例えば、各医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。こうした組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態を取り、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。
【００５９】
本発明の抗原コード核酸は、中性又は塩形態としてワクチン又は治療組成物に製剤化し得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸やリン酸などの無機酸、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄の水酸化物などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
【００６０】
ワクチン又は治療組成物は、投与製剤に合致した様式、並びに予防的及び／又は治療的に有効と見込まれるような量で投与される。投与すべき量は、例えば、対象の免疫系の抗体合成能を含めた治療される対象、及び所望する防御又は治療の程度に依存する。適切な用量範囲は、約１ｍｇ〜３００ｍｇの範囲、好ましくは約１０ｍｇ〜５０ｍｇの範囲などの約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲のワクチン接種当たり、活性成分がほぼ数百μｇ程度である。初回投与及び追加抗原注射に対する適切な投与計画も変化し得るが、初回投与に続き、後続の接種又は他の投与を行うのが代表的である。投与が必要な活性成分の厳密な量は、担当医の判断次第であり、対象毎に特異的な量となり得る。本発明の核酸分子又は融合ポリペプチドの有効量が、とりわけ、投与スケジュール、投与する抗原の単位用量、核酸分子又は融合ポリペプチドを他の治療剤と組み合わせて投与するか否か、受容者の免疫状態及び健康状態、並びに特定の核酸分子又は融合ポリペプチドの治療活性に依存すると見込まれることは、当業者には明らかであろう。
【００６１】
該組成物は、単回用量スケジュール又は多回用量スケジュールで投与することができる。多回用量スケジュールは、ワクチン接種の一次クールが、例えば１〜１０回の個別用量を含み、続いて免疫応答の維持及び／又は強化に必要なその後の間隔で、例えば第２用量に対して１〜４カ月に、必要であれば数カ月後にその後の用量（複数も）に対して、他の用量を投与し得るスケジュールである。１〜５年、普通は３年の間隔での周期的な追加抗原注射が、防御免疫の所望レベルを維持するために望ましい。免疫接種の期間後、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＥＳＡＴ６又はＳＴ−ＣＦと共培養するインビトロ増殖アッセイ、及び抗原刺激を受けたリンパ球から放出されるＩＦＮ−γ量の測定を行うことができる。該アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光標識などの従来の標識を用いて行い得る。こうした技法は、当業者に公知であり、関連部分が参照により組み込まれる米国特許第３７９１９３２号、第４１７４３８４号及び第３９４９０６４号の各明細書に見出すことができる。
【００６２】
モジュール構成ｒＡｂ担体、並びに／或いはコンジュゲートｒＡｂ担体−（コヘション／ドッケリン及び／又はドッケリン−コヘシン）−抗原複合体（ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチン）は、核酸ベクターが使用されるか否か、最終的な精製済みタンパク質又は最終的なワクチン形態が使用されるか否かに応じて、１又は複数の「単位用量」で与え得る。単位用量は、投与、即ち適当な経路及び治療計画に伴って所望の応答を生じると計算された、治療組成物の所定量を含有するものと定義される。投与すべき量、並びに特定の経路及び製剤は、臨床技術者の技術に含まれる。治療を受ける対象も、特に、対象の免疫系の状態及び所望の防御について評価を受け得る。単位用量は、単回注射として投与する必要はなく、設定した期間に亘る連続注入を包含し得る。本発明の単位用量は、ＤＮＡ／ｋｇ（又はタンパク質／Ｋｇ）体重に換算して都合よく表現し得るが、ＤＮＡ又はタンパク質／ｋｇ体重で約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．５、１、１０、５０、１００、１０００ｍｇ、又はそれより多量の間の範囲が投与される。同様に、ｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの送達量は、約０．２〜約８．０ｍｇ／ｋｇ体重で変化することができる。したがって、特定の実施形態では、ワクチン０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．８ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、４．０ｍｇ、５．０ｍｇ、５．５ｍｇ、６．０ｍｇ、６．５ｍｇ、７．０ｍｇ及び７．５ｍｇをインビボで個体へ送達し得る。投与すべきｒＡｂ−ＤＣ／ＤＣ−抗原ワクチンの用量は、治療される対象の体重及び体調、並びに投与経路及び治療頻度に大いに左右される。リポソーム又はウイルス送達ベクターに予め結合した裸のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ポリヌクレオチド１μｇ〜１ｍｇ乃至タンパク質１μｇ〜１００ｍｇの範囲の量で投与し得る。したがって、特定の組成物は、ポリヌクレオチド又はタンパク質約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ又は１０００μｇの間を、ベクター１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２０μｇ、３．０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇに独立に結合した状態で含み得る。
【００６３】
本発明は、Ｆｌｕ抗原の標的となった樹状細胞によるヒトＦｌｕ特異的Ｔ細胞の免疫刺激を測定するインビトロ細胞系で試験した。本明細書に示す結果は、この系でそれ自体は無効である抗原の用量における、このような抗原特異的細胞の特異的増殖を示している。
【００６４】
本発明は、例えば、リシン、炭疽毒素及びブドウ球菌Ｂ型エンテロトキシン由来の防御抗原と複合した組換えヒト化ｍＡｂ（ヒト樹状細胞の特異的受容体へ導かれる）である、モジュール構成ｒＡｂ担体を作製するためにも使用し得る。この構成体の潜在的市場は、全軍人のワクチン接種、及びこうした作用剤に関わる任意の生物的脅威に応じて大きな人口中核へ投与するために蓄えられる貯蔵ワクチンである。本発明は、人間、動物双方で使用するためのワクチン一般の設計に対して、広い用途を有する。所望の産業には、製薬産業及び生物工学産業が含まれる。
【００６５】
本発明は、抗原に対する効力ある広範な免疫応答を誘発するために、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的に差し向ける（送達する）組成物及び方法を、ワクチンを含めて包含する。こうした組成物は、抗原が由来した作用剤（病原体又は癌）に対する防御的又は治療的な免疫応答を誘発する。それに加え、本発明は、抗原提示細胞上に発現したＤＣ−ＡＳＧＰＲと呼ばれる受容体への特異的な会合を介して、直接的に又は他の作用剤と協調して、治療性を示す作用剤も創出する。
【００６６】
デクチン−１（ＣＬＥＣ７Ａ；（Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43））は、当初、Ｔ細胞共刺激能を有する（N. Kanazawaet al., J Biol Chem 278 (2003), pp.32645-32652）樹状細胞（ＤＣ）特異的な分子として報告されたが、後にその発現は、単球、マクロファージ及び好中球ではより強く、Ｔ細胞のあるサブセットでは弱く、人間ではＢ細胞及び好酸球において見出された。最も重要なことには、デクチン−１は、主要非オプソニン受容体として真菌β−グルカンを認識し、β−グルカンの生物作用にとって肝要であると判定された（Brown, G. D. 2006. Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol 6:33-43）。マクロファージ上でのデクチン−１の発現は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３により上方調節され、ＬＰＳ並びにＩＬ−１０及びデキサメタゾンにより下方調節される。デクチン−１は、その細胞質領域中に独特なことにＩＴＡＭを含有し、アダプター分子の非存在下で活性化受容体として実際に働く。ＩＴＡＭの構造も独特である。ＹｘｘＬ／Ｉ（チロシン−任意−任意−ロイシン又はイソロイシン）（S. J. van Vlieut et al., Int Immunol 17 (2005), pp.661-669）の繰返し２つを含有するコンセンサス配列と比較して、第１のチロシンと、それぞれマウス又はヒトのデクチン−１において次のロイシン又はイソロイシン（ＹｘｘｘＬ／Ｉ）との間に、３個のアミノ酸残基が挿入されている。実際には、Ｓｙｋの補充、及び食作用の誘発、反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生、核因子（ＮＦ）−κＢが媒介するサイトカイン産生などのデクチン−１の各種活性化作用にとって、第２のチロシンだけのリン酸化で十分であると報告された。しかし、Ｓｙｋは、ある種の細胞型（マクロファージ又はＤＣ）におけるこうした作用の幾つかだけに必要とされた。それに加え、こうした作用の幾つかは、ＭｙＤ８８媒介ＴＬＲシグナル伝達との協力を必要とした。注目すべきことに、ＤＣ中のデクチン−１シグナルは、Ｓｙｋ依存的にＩＬ−１０の産生も誘発した。興味深いことに、β−グルカンは、幾つかの特定の条件下だけに酵母細胞表面上に露出し、デクチン−１シグナルの喪失は、一部の真菌が宿主免疫監視系を逃れる訳を説明し得ると思われる（S. E. Heinsbrock et al., Trends Immunol 26 (2005), pp.352-354）。それに加え、デクチン−１媒介シグナルは、遺伝素因のある（ＺＡＰ−７０変異）ＳＫＧマウスにおいて自己免疫性関節炎の誘発を促進すると報告された（H. Yoshitomi et al., J Exp Med 201 (2005), pp.949-960）。カンジダ抗原が、各種の自己免疫疾患モデルの誘発に広く使用されてきた（E. C. Keystone et al., Arthritis Rheum 20 (1977), pp.1396-1401）ことを考慮すると、デクチン−１は、自己寛容の破壊において役割を演じ得る。しかし、デクチン−２（E. P. McGeal, M. Rosas, G. D. Brown, S. Zamze, S. Y. Wong and S. Gordon et al., Glycobiology 16 (2006), pp.422-430）と同様な、調節Ｔ細胞との考え得るその結合は、未だ解明されていない。
【００６７】
ＤＣはタンパク質抗原を交差提示することができる（Rock KL Immunol Rev. 2005 Oct;207:166-83）。インビボで、ＤＣは、多くの受容体により抗原を取り込み、クラスＩ及びII両方の抗原を提示する。これに関しては、パターン認識受容体としてのＤＣレクチンが、抗原の効率的取込み並びに抗原の交差提示に寄与する。
【００６８】
本発明は、抗ヒトデクチン−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の開発、特性決定及び使用を包含し、抗デクチン−１ ｍＡｂ及びその代替物の見込みある治療用途の発見に繋がる生物機能を特徴付けた。本発明の開示は、デクチン−１を保持する細胞を活性化することができる独特な作用剤を開発する手段、並びにこうしたシグナルを受ける際に起こる細胞の変化が、免疫系の他の細胞に対する作用に関して示す効果を明らかにする。こうした効果（単独、又は他のシグナル（即ち、共刺激）との協調のいずれかで）は、ある種の疾患状態に対する治療結果を高度に予測し、又はワクチン接種に関わる防御結果を増強するためになる。
【００６９】
材料及び方法
抗体及び四量体：イソタイプ対照Ａｂを含め、ＤＣ及びＢ細胞を表面染色する抗体（Ａｂ）は、BD Biosciences（CA）から購入した。ＥＬＩＳＡ用Ａｂは、Bethyl（TX）から購入した。抗ＢＬｙＳ抗体及び抗ＡＰＲＩＬ抗体は、PeproTech（NJ）から得た。四量体のＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（Ｆｌｕ Ｍ１）及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（Ｍａｒｔ−１）は、Beckman Coulter（CA）から購入した。
【００７０】
細胞及び培養物：健常ドナーの単球（１×１０６個／ｍｌ）を、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）（R & D, CA）を含有するCellgenics（フランス）培地中で培養した。３日目及び６日目のために、ＤＣ、同量の各サイトカインをそれぞれ１日目及び３日目に培地中に補給した。Ｂ細胞はネガティブ単離キット（BD）で精製した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞は、抗ＣＤ４又はＣＤ８抗体（Milteniy, CA）で被覆した磁気ビーズで精製した。ＰＢＭＣは、密度勾配遠心分離によりPercoll（商標）勾配（GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK）を用いて軟膜から単離された。ＤＣ活性化のために、１×１０５個のＤＣをｍＡｂ被覆９６ウェルプレート中で１６〜１８時間培養した。炭酸塩緩衝液ｐＨ９．４中のｍＡｂ（１〜２μｇ／ウェル）を少なくとも３時間、３７℃でインキュベートした。培養上清を採集し、サイトカイン／ケモカインをLuminex（Biorad, CA）で測定した。遺伝子分析のために、ＤＣをｍＡｂで被覆したプレート中で８時間培養した。幾つかの研究では、可溶性のＣＤ４０Ｌ（R & D, CA）５０ｎｇ／ｍｌ又はＣｐＧ（InVivogen, CA）５０ｎＭを培養物中に添加した。ＤＣ及びＢ細胞の共培養では、１０％ＦＣＳ及び抗体（Biosource, CA）入りのＲＰＭＩ１６４０に再浮遊した５×１０３個のＤＣを、ｍＡｂで被覆したプレート中で少なくとも６時間先ず培養し、次いでＣＦＳＥ（Molecular Probes, OR）で標識した精製自己Ｂ細胞１×１０５個を添加した。幾つかの研究では、ＤＣに熱不活化インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８Ｈ１Ｎ１）を５モイ（感染多重度）、２時間でパルス接種した後、Ｂ細胞と混合した。ＤＣ及びＴ細胞の共培養では、５×１０３個のＤＣを、１×１０５個の精製自己ＣＤ８ Ｔ細胞又は混合同種Ｔ細胞と共に培養した。同種Ｔ細胞には、インキュベーションの最後１８時間に１μＣｉ／ウェルの３［Ｈ］−チミジンをパルス投与した後、ｃｐｍをγ線カウンター（Wallac, MN）で測定した。５×１０５個のＰＢＭＣ／ウェルを、ｍＡｂで被覆したプレート中で培養した。Ｍａｒｔ−１及びＦｌｕ Ｍ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度は、それぞれ培養の１０日目及び７日目に抗ＣＤ８抗体及び四量体で細胞を染色することにより、測定した。Ｍａｒｔ−１ペプチド（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）１０μＭ、及びＭａｒｔ−１ペプチドを含有する組換えタンパク質（下記を参照）２０ｎＭを、ＤＣ及びＣＤ８ Ｔ細胞培養物に添加した。精製組換えＦｌｕ Ｍ１タンパク質（下記を参照）２０ｎＭをＰＢＭＣ培養物に添加した。
【００７１】
モノクローナル抗体：マウスｍＡｂを従来技術により生成した。手短に言うと、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇでＲｉｂｉアジュバントと共に腹腔内で免疫した後、１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫する。３カ月後に、マウスを再び追加免疫した後、脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞と融合した。ハイブリドーマ上清のスクリーニングによって、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するＡｂを、その融合相手単独、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインと比較して分析した（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性ウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、CELLineフラスコ（Integra, CA）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００７２】
ＥＬＩＳＡ：ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡの総量、並びにフル（flu）特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）を測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。既知量のＩｇを含有する標準ヒト血清（Bethyl）及びヒトＡＢ血清を、それぞれ総Ｉｇ及びフル特異的Ｉｇの標準として使用した。試料中のフル特異的Ａｂ力価（単位）は、同一の光学密度を示すＡＢ血清の希釈倍率と定義した。ＢＡＦＦ及びＢＬｙＳの量は、ＥＬＩＳＡキット（Bender MedSystem, CA）で測定した。
【００７３】
ＲＮＡの精製及び遺伝子分析：総ＲＮＡは、RNeasyカラム（Qiagen）で抽出し、2100 Bioanalyzer（Agilent）で分析した。ビオチン標識ｃＲＮＡ標的は、Illumina totalprep標識キット（Ambion）を用いて調製し、Sentrix Human6 BeadChip（４６Ｋ転写物）とハイブリッドを形成させた。これらのマイクロアレイは、シリコンウェーハの表面にエッチングしたマイクロウェル中に留置した、３μｍビーズに結合した５０量体オリゴヌクレオチドプローブからなる。ストレプトアビジン−Ｃｙ３で染色後、Illuminaにより製造されたサブミクロン分解能スキャナー（Beadstation 500X）を用いてアレイ表面を結像させる。遺伝子発現分析用ソフトウェアプログラムのGeneSpring, Version 7.1（Agilent）を用いてデータ解析を行った。
【００７４】
組換えＦｌｕ Ｍ１及びＭＡＲＴ−１タンパク質の発現及び精製：開始コドンに対して遠位にあるNhe I部位、及び終止コドンに対して遠位にあるNot I部位を取り込みながら、ＰＣＲを用いてInfluenza A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１遺伝子のＯＲＦを増幅させた。切断したその断片をpET28b(+)（Novagen）中にクローニングする際に、Ｍ１ ＯＲＦをＨｉｓ６タグとインフレームに配置し、したがってＨｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質をコードした。Nco I及びNhe I部位の間に挿入した、Ｃ．サーモセラム（C. thermocellum）由来のＮ末端１６９残基のコヘシンドメインをコードするpET28b(+)誘導体（未公表）は、Ｃｏｈ．Ｈｉｓを発現した。コヘシン−Ｆｌｅｘ−ｈＭＡＲＴ−１−ペプチドＡ−Ｈｉｓを発現させるために、上記ベクターのNhe I及びXho I部位の間に、配列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG（配列番号１）（DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP（配列番号２）をコードし、陰影付き残基は免疫支配的なＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドであり、そのペプチドを囲む下線付き残基はＭＡＲＴ−１由来である）を挿入した。該タンパク質は、カナマイシン耐性（４０μｇ／ｍｌ）により選択し、ＩＰＴＧ１２０ｍｇ／Ｌを添加した対数増殖期中期まで２００回／分で振とうすることにより、ＬＢ中３７℃で増殖させた大腸菌（E. coli）BL21株（DE3）（Novagen）又はT7 Express株（NEB）中に発現させた。３時間後、細胞を遠心分離により採集し、−８０℃で保存した。各１Ｌの発酵で得た大腸菌細胞を、プロテアーゼ阻害剤Cocktail II（Calbiochem, CA）０．１ｍｌ入りの氷冷した５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０（バッファーＢ）３０ｍｌ中に再浮遊させた。その細胞を設定１８（Fisher Sonic Dismembrator 60）で休止期間５分を入れて、氷上２×５分超音波処理し、次いで１７０００ｒｐｍで４℃、２０分間遠心した（Sorvall SA-600）。Ｈｉｓ．Ｆｌｕ Ｍ１精製のために、細胞溶解上清５０ｍｌ分画をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。この液を、Ｎｉ＋＋を投入した５ｍｌのHiTrapキレートＨＰカラム上へ４ｍｌ／分で添加した。カラム結合タンパク質を２０ｍＭ ＮａＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６（バッファーＤ）で洗浄した後、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０でもう１回洗浄した。結合タンパク質を１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ４．０で溶出した。ピーク分画をプールし、１００ｍＭ Ｈ３ＣＯＯＮａ ｐＨ５．５で平衡化した５ｍｌのHiTrap Sカラム上へ４ｍｌ／分で添加し、平衡緩衝液で洗浄後、５０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ５．５中の勾配０〜１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。約５００ｍＭ ＮａＣｌで溶出するピーク分画をプールした。Ｃｏｈ．Ｆｌｕ Ｍ１．Ｈｉｓ精製のために、培養物２Ｌの細胞を上記のように溶解した。遠心分離後、２．５ｍｌのTriton X114を上清へ添加し、氷上で５分間インキュベーションを行った。２５℃で５分間更にインキュベーションした後、２５℃での遠心分離後、上清をTriton X114から分離した。この抽出を繰り返し、上清をQ Sepharoseビーズ５ｍｌ中に通し、１６０ｍＭトリス、４０ｍＭイミダゾール、４Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．９の６．２５ｍｌをQ Sepharoseに添加して、流し通した。次いで、そのタンパク質を上記のようにＮｉ＋＋キレートクロマトグラフィーで精製し、バッファーＤ中の０〜５００ｍＭイミダゾールで溶出した。
【００７５】
抗デクチン−１ ｍＡｂ：本発明は、治療又は防御製品の望ましい成分（例えば、ヒト化組換え抗体に関して）である抗ＬＯＸ−１モノクローナル抗体に対応する、以下に示す特定のアミノ酸配列を包含する。以下の配列は、マウスＶ領域（下線）−ヒトＣ領域（太字）の組換えキメラ抗体に関するそのような配列である。これらのマウスＶ領域は、熟練した当業者なら誰にも容易に「ヒト化」することができる、即ち、そのＬＯＸ−１結合領域は、ヒトのＶ領域枠組み構造配列上にグラフトすることができる。更に、該配列は、抗体機能性を保持しているが、所望の治療用途のために、例えば抗原、サイトカイン又は毒素を付加している融合タンパク質に関しても、発現することができる。
【００７６】
【表１】
【００７７】
該Ｖ領域配列及び関連配列は、例えば、デクチン−１に対する親和性を高めるために、当業者によって改変し、及び／又は、抗原提示細胞上でデクチン−１に結合できるタンパク質形態の発現を指示するために、発現ベクター中に操作・作製されるようにヒトＶ領域枠組み配列に組み込むことができる。更に、本発明に開示される（又は、本明細書に開示される独特な生物学のための同様な方法及び篩を用いて誘導される）その他のｍＡｂは、同様な手段を介して（始めに、マウスハイブリドーマＶ領域のＰＣＲクローニング及び配列決定を介して）、同様な組換え抗体（ｒＡｂ）をコードする発現構築物にすることができる。このような抗デクチン−１ Ｖ領域は、治療用ｒＡｂの潜在的な免疫反応性を最小限とするように、熟練した当業者により更に「ヒト化」することができる（即ち、マウス特異的結合配列をヒトＶ領域枠組み構造配列上にグラフトすることができる）。
【００７８】
作製した組換え抗デクチン−１組換え抗体−抗原融合タンパク質（ｒＡｂ．抗原）は、インビトロで有効な試作ワクチンであり、発現ベクターは、例えばＨ鎖コード配列にインフレームで融合した、多様なタンパク質コード配列で構築することができる。例えば、インフルエンザＨＡ５、インフルエンザＭ１、ＨＩＶ ｇａｇ若しくは癌抗原由来の免疫支配的ペプチドなどの抗原、又はサイトカインは、ｒＡｂ．抗原又はｒＡｂ．サイトカインの融合タンパク質として後に発現できるが、こうしたものは、本発明に関しては、抗デクチン−１ Ｖ領域配列の使用により、デクチン−１を保持する抗原提示細胞へ抗原又はサイトカイン（又は毒素）を直接連れ込むことから得られる有用性をもつことができる。これにより、受容体の活性化を時々伴う、例えば抗原の細胞内取込み、及び治療又は防御作用のそれに続く開始（例えば、有効な免疫応答の開始、又は標的細胞の殺滅を介して）が可能となる。この概念に基づく例示的な試作ワクチンは、マウスｍＡｂ Ｈ鎖Ｖ領域（下線）−ヒトＩｇＧ４ Ｃ領域（太字）−Ｆｌｕ ＨＡ１−１（イタリック）融合タンパク質の合成を指示する、ｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍ抗デクチン＿１＿１１Ｂ６．４＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−Ｆｌｅｘ−ＦｌｕＨＡ１−１−６ｘＨｉｓ］などのＨ鎖ベクターを使用することができよう。類似の軽鎖発現プラスミド（上記に示す配列をコードする）と同時発現すると、これは、デクチン−１に結合し、細胞表面へＦｌｕ ＨＡ１−１抗原を送達することにより、ＤＣの活性化、抗原の細胞内取込み、抗原のプロセシング、抗原の提示、並びに特異的な抗Ｆｌｕ ＨＡ１−１性Ｂ及びＴ細胞の馴化及び増殖を起こす、多機能組換え抗体（ｒＡｂ）を産生する。ＦｌｕＨＡ５−１、ＨＩＶウイルスｇａｇ ｐ２４及びＰＳＡ（前立腺特異的抗原）に対する融合物を有する同様なＨ鎖構築物も、以下のように示される。
【００７９】
【表２】
【００８０】
同様に、下記に示すｒＡＢ−ｐＩＲＥＳ２［ｍ抗デクチン＿１＿１１Ｂ６．４＿Ｈ−ＬＶ−ｈＩｇＧ４Ｈ−Ｃ−ドッケリン］は、ドッケリンと融合した抗デクチン−１ Ｈ鎖（下記に示す配列）をコードする。ドッケリンは、コヘシン−抗原（ｃｏｈ．抗原）融合タンパク質との強力で特異的な非共有結合性相互作用を可能にし、したがってＤＣ及び他の抗原提示細胞へ抗原を送達する代替手段を提供する。
【００８１】
【表３】
【００８２】
組換え抗体（ｒＡｂ）及びｒＡｂ．抗原のクローニング及び発現に関する方法
マウス／ヒトキメラｍＡｂのｃＤＮＡクローニング及び発現：総ＲＮＡをハイブリドーマ細胞（RNeasy kit, Qiagen）から調製し、ｃＤＮＡ合成、並びに受給５’プライマー及び遺伝子特異的３’プライマー
（ｍＩｇＧκ、5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'（配列番号１４）、
ｍＩｇＧλ、5'ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3'（配列番号１５）、
ｍＩｇＧ１、5'gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3'（配列番号１６）、
ｍＩｇＧ２ａ、5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3'（配列番号１７）、及び
ｍＩｇＧ２ｂ、5'ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3'（配列番号１８））
を用いたＰＣＲ（SMART RACE kit, BD Biosciences）のために使用した。
【００８３】
ＰＣＲ産物をクローニング（pCR2.1 TA kit, Invitrogen）し、ＤＮＡの配列決定で特徴付けた。マウスＨ及びＬ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡに対する誘導配列を用いて、特異的プライマーの使用により、下流のヒトＩｇＧκ又はＩｇＧ４Ｈ領域をコードする発現ベクター中にクローニングするための隣接制限酵素部位を取り込みながら、シグナルペプチド及びＶ領域のＰＣＲ増幅を行った。キメラｍＶκ−ｈＩｇκの発現用ベクターは、Xho I及びNot I部位に挟まれた４０１〜７３１残基（ｇｉ｜６３１０１９３７｜）を増幅し、pIRES2-DsRed2（BD Biosciences）のXho I−Not I間隔中にこれを挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ Ｖｋ領域を増幅し、Nhe I又はSpe I部位、次いでCACCを（例えば、ｇｉ｜７６７７９２９４｜の１２６残基）をコードする領域に付け足し、Xho I部位を付け足した。次いで、そのＰＣＲ断片を上記ベクターのNhe I−Not I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶκ−ｈＩｇκ用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3'（配列番号１９）を上記ベクターのNhe I−Xho I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドン（SignalP3.0 Serverを用いて確定した）（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）とｍＶκ領域の末端（上記で確定したもの）との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びXho Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。対照ｈＩｇκ配列は、ｇｉ｜４９２５７８８７｜の２６〜８５残基及びｇｉ｜２１６６９４０２｜の６７〜７０９残基に対応する。対照ｈＩｇＧ４Ｈベクターは、ジスルフィド結合を安定化し、残存ＦｃＲ結合性を廃棄した（Reddy, M. P., C. A. Kinney, M. A. Chaikin, A. Payne, J. Fishman-Lobell, P. Tsui, P. R. Dal Monte, M. L. Doyle, M. R. Brigham-Burke, D. Anderson, M. Reff, R. Newman, N. Hanna, R. W. Sweet, and A. Truneh. 2000. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol 164:1925-1933）Ｓ２２９Ｐ及びＬ２３６Ｅの置換を有する、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の１２〜１４７３残基であって、ｐＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄ２ベクターのBg1 II及びNot I部位の間に、終止コドンの代わりに配列5'gctagctgattaattaa3'（配列番号２０）を付加しながら挿入したものに対応する。ＰＣＲを用いて開始コドンからｍＡｂ ＶＨ領域を増幅し、ｇｉ｜１９６８４０７２｜の４７３残基をコードする領域にCACCを、次いでBg1 II部位を付け足した。次いで、ＰＣＲ断片を上記ベクターのBg1 II−Apa I間隔中にクローニングした。ｍＳＬＡＭリーダー配列を用いたキメラｍＶＨ−ｈＩｇＧ４用ベクターは、配列5'ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaag ggccc3'（配列番号２２）を上記ベクターのNhe I−Apa I間隔中に挿入することにより、構築した。ＰＣＲを用いて、予測される成熟Ｎ末端コドンとｍＶＨ領域の末端との間隔を、5'tcgtacgga3'を付け足しながら増幅した。Bsi WI及びApa Iで切断した断片を上記ベクターの対応部位中に挿入した。補遺２は、本研究に用いた各種のｍＶκ及びｍＶＨ領域のヌクレオチド配列を詳述している。
【００８４】
近位Nhe I部位及び遠位Not I部位に挟まれ、終止コドンに続く各種の抗原コード配列を、Ｈ鎖ベクターのNhe I−Pac I−Not I間隔中に挿入した。Ｆｌｕ ＨＡ１−１は、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'（配列番号２３）（ｃｉｐＡコヘシン−コヘシンリンカー残基をコードする配列が後続するNhe I部位）、並びに遠位配列5'caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'（配列番号２４）（Ｈｉｓ６、終止コドン及びNot I部位をコードする）を有する、Ａ型インフルエンザウイルス（A/Puerto Rico/8/34(H1N1)）ヘマグルチニンｇｉ｜２１６９３１６８｜の８２〜１０２５残基（Ｃ９８２Ｔの変換あり）によりコードされていた。Ｆｌｕ ＨＡ５−１は、Ｆｌｕ ＨＡ１−１と同じ各配列が結合した、ｇｉ｜５０２９６０５２｜Ａ型インフルエンザウイルス（A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)）のヘマグルチニンの４９〜９９０残基によりコードされていた。Ｄｏｃは、近位Nhe I及び遠位Not I部位を有するｇｉ｜４０６７１｜ｃｅｌＤの１９２３〜２１５０残基によりコードされていた。ＰＳＡは、近位配列5'gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaacaccgacaacaacacttctagcgc3'（配列番号２５）（Nhe I部位及びｃｉｐＡスペーサー）、並びに遠位Not I部位を有する、前立腺特異的抗原ｇｉ｜３４７８４８１２｜の１０１〜８３２残基によりコードされていた。Ｆｌｕ Ｍ１−ＰＥＰは、5'gctagccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaagggtatacttggattcgttttcacacttacttaagcggccgc3'（配列番号２６）によりコードされていた。これ及び他の全てのペプチドコード配列は、Nhe I及びNot I制限Ｈ鎖ベクター、又はNhe I−Xho I制限Ｃｏｈ．Ｈｉｓベクター中へのクローニングに末端が適合する、相補的な合成ＤＮＡ断片の混合物を介して創製された。制限酵素部位を組み込む必要がある場合、又はＣｉｐＡスペーサー配列中を除いて、好ましいヒトコドンを常に使用した。
【００８５】
ｒＡｂ発現構築物の産生量は、Ｌ鎖及びＨ鎖構築物を各々約２．５μｇ並びに上記の手順を用いた、一過性トランスフェクション体５ｍｌ中で試験した。上清は、抗ｈＩｇＧ抗体ＥＬＩＳＡ（AffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Jackson ImmunoResearch）で分析した。この手順の試験では、分泌ｒＡｂの産生量は、Ｈ鎖及びＬ鎖ベクター濃度に対して、各ＤＮＡ濃度の約２倍範囲に亘り依存性がなかった（即ち、この系はＤＮＡ飽和をしていた）。
【００８６】
新規な抗デクチン−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗原提示細胞上に見出されるこの細胞表面受容体に関連するこれまで未知の生物学を明らかにするために、開発され、使用された。この新規な生物学は、多様な治療及び防御用途のために、この受容体を活性化する抗デクチン−１抗体作用剤の応用を高度に予測する。以下に提示するデータは、当初の予測を強く支持し、この場での発見を臨床的応用に変換する道筋を示した。
【００８７】
ヒトデクチン−１に対する高親和性モノクローナル抗体の開発：受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）及びＡＰ（ヒト胎盤アルカリホスファターゼ）の融合タンパク質を、それぞれマウスの免疫及びｍＡｂのスクリーニングのために生成した。ＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧのための発現構築物は、以前に記載されており（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）、マウスＳＬＡＭ（ｍＳＬＡＭ）シグナルペプチドを用いて分泌を誘導した（Bendtsen, J. D., H. Nielsen, G. von Heijne, and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J Mol Biol 340:783-795）。ＤＣＩＲ外部ドメイン．ＡＰのための発現構築物も、ＡＰの１３３〜１５８１残基（ｇｂ｜ＢＣ００９６４７｜）を増幅すると同時に、近位のインフレームXho I部位、並びに遠位のＴＧＡ終止コドン及びNot I部位を付加するために、ＰＣＲを用いて生成した。このXho I−Not I断片は、上記のＤＣＩＲ外部ドメイン．ＩｇＧベクターにおけるＩｇＧコード配列を置き換えた。同じＩｇ及びＡＰベクターシリーズ中のデクチン−１外部ドメイン構築物は、（ｂｐ３９７〜６０３、ｇｉ｜８８９９９５９１｜をコードする挿入配列を含有していた。デクチン−１融合タンパク質は、FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen）を用い、製造業者の手順書（トランスフェクション１Ｌ当たり総プラスミドＤＮＡ１ｍｇを293 Fectin試薬１．３ｍｌと共用）に従って生成した。ｒＡｂ産生のために、Ｈ及びＬ鎖をコードするベクターを同量、同時にトランスフェクトした。トランスフェクト済み細胞を３日間培養し、培養上清を採集し、新鮮培地を添加してインキュベーションを２日間継続した。プールした上清はろ過により清澄化した。受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧは、HiTrapプロテインＡアフィニティクロマトグラフイーにより、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７による溶出を用いて精製し、次いでＰＢＳに対して透析した。ｒＡｂ（後述する組換え抗体）は、HiTrap MabSelect（商標）カラムを使用して同様に精製した。マウスｍＡｂは、従来の細胞融合技術によって生成した。手短に言うと、６週齢のマウスの腹腔内に、受容体外部ドメイン．ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質２０μｇをＲｉｂｉアジュバントと共に免疫接種し、次いで１０日後及び１５日後に抗原２０μｇで追加免疫した。３カ月後、マウスを再度追加免疫してから３日後に脾臓を取り出した。代替として、マウスの足蹠に、Ｒｉｂｉアジュバント中の抗原１〜１０μｇを３０〜４０日の期間に亘り３〜４日毎に注射した。最終の追加免疫から３〜４日後、流入領域リンパ節を採集した。脾臓のＢ細胞又はリンパ節細胞をＳＰ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞（Shulman, M., C. D. Wilde, G. Kohler, M. J. Shulman, N. S. Rees, D. Atefi, J. T. Horney, S. B. Eaton, W. Whaley, J. T. Galambos, H. Hengartner, L. R. Shapiro, and L. Zemek. 1978. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 276:269-270）と従来技法を用いて融合した。ＥＬＩＳＡを用いて、当該融合相手単独と比較して、又はアルカリホスファターゼに融合した受容体外部ドメインに比して、受容体外部ドメイン融合タンパク質に対するハイブリドーマ上清をスクリーニングした（Bates, E. E., N. Fournier, E. Garcia, J. Valladeau, I. Durand, J. J. Pin, S. M. Zurawski, S. Patel, J. S. Abrams, S. Lebecque, P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163:1973-1983）。次いで、全長受容体ｃＤＮＡをコードする発現プラスミドを一過性にトランスフェクトした２９３Ｆ細胞を用いたＦＡＣＳにおいて、陽性のウェルをスクリーニングした。選択したハイブリドーマに単細胞クローニングを行い、無血清培地に適応させ、CELLineフラスコ（Integra）中で増殖させた。ハイブリドーマ上清を１．５Ｍグリシン、３Ｍ ＮａＣｌ、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．８の同容量と混合し、それをMabSelect樹脂と共に回転させた。その樹脂を結合緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７で溶出した。２Ｍトリスで中和後、ｍＡｂをＰＢＳに対して透析した。
【００８８】
精製抗デクチン−１モノクローナル抗体の直接ＥＬＩＳＡによる特性決定。ＥＬＩＳＡによる数種の抗デクチン−１ｍＡｂの相対的親和性（即ち、デクチン−１．Ｉｇタンパク質をマイクロタイタープレート表面上に固定化し、デクチン−１．Ｉｇに対する結合能（抗マウスＩｇＧ．ＨＲＰコンジュゲート試薬で検出した場合）について用量滴定系列において、該抗体を試験する）。各パネルは、（左）デクチン−１．Ｉｇタンパク質に対するｍＡｂ反応性、及び（右）ｈＩｇＧＦｃタンパク質に対するｍＡｂ反応性である。該パネルから、抗デクチン−１ ｍＡｂがデクチン−１に特異的に反応することが示される。結合の変化は、様々な抗体について認められた。
【００８９】
インビボのＤＣ及びインビトロ培養のＤＣは共にデクチン−１を発現する：図１Ａ及び１Ｂは、健常ドナーのＰＢＭＣ上におけるデクチン−１の発現量を示す。下記の図１Ａに示すように、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ１４＋単球、及びＣＤ１９＋Ｂ細胞を含めた抗原提示細胞は、デクチン−１を発現する。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、検知し得る表面デクチン−１を発現しない。インビトロ培養のＤＣ、ＩＦＮＤＣ及びＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１１の発現量が、図１ｂに示されている。ＩＬ−４及びＩＮＦＤＣは共に、この研究で作製した以上３種の抗デクチン−１抗体で染色した。
【００９０】
インビボ及びインビトロ両培養のＤＣはデクチン−１を発現する。図１Ａ．健常ドナーのＰＢＭＣを、抗デクチン−１ｍＡｂと共に抗ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９及びＣＤ３抗体で染色した。個々の抗体で染色した細胞は、デクチン−１の発現量を測定するためにゲート選別した。図１Ｂ．健常ドナーの単球は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下でＩＬ−４（ＩＬ−４ＤＣ）又はＩＦＮａ（ＩＦＮＤＣ）と共に培養し、細胞を抗デクチン−１ｍＡｂで染色した。細胞は、対照抗体及びＦＩＴＣで標識したヤギ抗マウス抗体でも染色した。
【００９１】
ＤＣ上のデクチン−１の発現量は、ＴＬＲリガンド及びサイトカインで調節される：ＤＣ表面分子の発現量は、様々な刺激因子で調節することができる。デクチン−１の発現がＤＣの活性化により制御されるか否かを確かめるために、ＩＬ−４ＤＣをＴＬＲリガンド及びサイトカインで刺激した。図２のデータは、ＴＬＲ４リガンド（大腸菌のＬＰＳ）がデクチン−１の発現量を低下させたが、ＩＬ−１０は、ＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１の発現を若干増強した。繰返し試験において、ＩＬ−１５はデクチン−１を若干下方調節した。ＩＦＮａ及びＴＬＲ３リガンドを含む他の刺激因子は、ＩＬ−４ＤＣ上のデクチン−１の発現量を変化させなかった。
【００９２】
図２．インビトロ培養のＩＬ−４ＤＣを、ＣＤ４０Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ３リガンド（１００ｎＭ）、ＴＬＲ４リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮａ（５００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間培養した。細胞を抗デクチン−１又は対照ｍＡｂで染色した。点線は、イソタイプ対照抗体で染色した細胞を示す。灰色及び白抜きのヒストグラムは、それぞれ刺激因子なし及び刺激因子入りの培地中で培養した細胞を表す。
【００９３】
デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＤＣを刺激してサイトカイン及びケモカインを産生する：樹状細胞は、活性化に応じて免疫応答の結果、誘発又は耐容のいずれかを決定する、一次免疫細胞である（Banchereau, J., F. Briere, C. Caux, J. Davoust, S. Lebecque, Y. J. Liu, B. Pulendran, and K. Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18:767-811）。ヒトＤＣの活性化におけるデクチン−１の役割は、十分には研究されていなかった。マウス抗ｈデクチン−１ ｍＡｂを産生するハイブリドーマクローンを８種生成し、個々のｍＡｂがＤＣを活性化するか否かを、ＤＣから分泌されるサイトカイン及びケモカインの測定により試験した。図３のデータは、特にＰＡＢ４７及びＰＡＢ４９が、ＤＣを活性化することにより、有意量のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａを産生できたことを示す。ＰＡＢ１８７は、ＤＣを活性化することが知られている抗ＣＤ４０ ｍＡｂである。ＰＡＢ８５は対照抗体である。
【００９４】
図３は、抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化することを示す。１×１０５個／２００μｌのＩＦＮＤＣを、異なるクローンのｍＡｂで被覆したプレート中で１８時間培養した。培養上清を分析して、Luminexによりサイトカイン及びケモカインを測定した。
【００９５】
図４は、デクチン−１を介したシグナル伝達が、ＩＬ−４ＤＣ、ＩＦＮＤＣ双方を活性化できることを示す。ＩＦＮＤＣの場合、抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを刺激して、有意な増加量のＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲを発現する（図４Ａ）。抗デクチン−１ ｍＡｂは、ＩＬ−４ＤＣも活性化して、増加量のＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲを発現した（図４Ｂ）。
【００９６】
デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＴＬＲを介したシグナル伝達を増強する：デクチン−１を介したシグナルは、ＴＬＲを介したシグナルと相乗的に作用して、ＤＣの活性化を増強することができる（図５）。デクチン−１がＴＬＲ２と相乗的に作用することは、知られていた。しかし、この試験では、デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、ＤＣの活性化に対して、デクチン−１とＴＬＲ２との相乗作用より強いことを示している。デクチン−１とＴＬＲ４とのこの相乗作用は、ＤＣからのＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα及びＩＬ−１２ｐ４０の産生を激増させた。本発明者等は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＣＤ４０を含む、抗共刺激性分子抗体でも細胞を染色した。この相乗作用は、試験した共刺激性分子の発現を増加させなかった。
【００９７】
デクチン−１とＴＬＲ４との相乗作用は、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的応答を増強した：デクチン−１とＴＬＲ媒介シグナル伝達との相乗作用が、免疫応答を増強するか否かを試験するために、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を初回抗原刺激するＤＣの能力を試験した（図６）。図６Ａに示すように、デクチン−１とＴＬＲ４Ｌとの相乗作用は、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の応答数を５倍超増加させた。デクチン−１とＴＬＲ２との相乗作用が、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めることも認めることができた。図６のデータは、今後のワクチン開発にとって有用となろう。
【００９８】
デクチン−１を介して刺激されたＤＣから産生されるＩＬ−１０は、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激の向上に寄与する：図３及び図５に示すように、デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の阻害性サイトカインであるＩＬ−１０をＤＣから有意な量で生じた。ＩＬ−１０の量は、デクチン−１がＴＬＲリガンドと相乗的に作用すると有意に増加した。しかし、ＤＣが産生するＩＬ−１０とは関係なく、抗デクチン−１抗体単独、又は抗デクチン−１抗体及びＴＬＲリガンドのいずれかで刺激したＤＣは、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めた（図６）。したがって、初回抗原刺激中のＩＬ−１０は、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原特異的な初回抗原刺激に寄与し得る可能性がある。この仮説を試験するために、培養物中に抗ＩＬ−１０抗体を添加したところ、図７のデータは、抗デクチン−１抗体及びＴＬＲリガンドで刺激したＤＣからのＩＬ−１０が、Ｍａｒｔ−１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を高めることを示している。ＤＣをザイモサンで刺激した場合、同様な結果が観察された。同じＤＣをザイモサンで刺激したとき、ＤＣは有意量のＩＬ−１０（１×１０５個のＤＣから１０００ｐｇ／ｍｌ超）を産生した（データは示していない）。抗デクチン−１ ｍＡｂで刺激したＤＣが有意量のＩＬ−１０を産生するので、ＩＬ−１０で媒介されるこの抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激の向上は、今後のワクチン開発にとって有用となろう。
【００９９】
抗デクチン−１抗体で活性化されたＤＣは、増加量のＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬを発現する：ＤＣ活性化における抗デクチン−１抗体の役割を更に分析するために、ＩＦＮ ＤＣを抗デクチン−１抗体で刺激した後、細胞を抗ＩＬ−１５及び４−１ＢＢＬ抗体で染色した。図８のデータは、デクチン−１を介したシグナル伝達が、体液性及び細胞性免疫応答の向上に寄与し得る、ＩＬ−１５、４−１ＢＢＬ双方の発現増加を誘発することを示す。ＩＬ−１５は、ＣＤ８ Ｔ細胞の応答並びにＢ細胞の増殖及び抗体産生において、重要な役割を演じることが知られている。４−１ＢＢＬは、ＤＣ媒介ＣＤ８ Ｔ細胞応答に寄与する共刺激性分子であるが、ヒト４−１ＢＢＬは、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ及びそれ自体の両方を介してシグナル伝達する。その細胞質内尾部は、Ｔ細胞のアポトーシス及び単球によるサイトカイン分泌（ＩＬ−６、ＴＮＦα）を誘発する、逆方向シグナル伝達に関与する。ＣＤ１３７／４−１ＢＢに対する４−１ＢＢＬ結合は、多くの効果を生み、Ｔ細胞の想起応答において鍵となる役割を演じる。それは、一次応答の最後にＴ細胞数を維持し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を、増殖し、ＣＤ４＋細胞ではＩＬ−２、ＩＦＮ−γなどのサイトカイン、ＣＤ８細胞ではＩＦＮ−γを分泌するように誘発する。
【０１００】
デクチン−１を介して刺激されたＤＣは有効な体液性免疫応答を誘発する：ＤＣは、Ｔ依存性、Ｔ非依存性双方のＢ細胞応答のためにシグナルを与えること（Wykes, M., and G. MacPherson. 2000. Dendritic cell-B-cell interaction: dendritic cells provide B cells with CD40-independent proliferation signals and CD40-dependent survival signals. Immunology 100:1-3、Balazs, M., F. Martin, T. Zhou, and J. Kearney. 2002. Blood dendritic cells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T-independent immune responses. Immunity 17:341-352、Kikuchi, T., S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, and R. G. Crystal. 2000. Dendritic cells genetically modified to express CD40 ligand and pulsed with antigen can initiate antigen-specific humoral immunity independent of CD4+ T cells. Nat Med 6:1154-1159、Dubois, B., J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau, C. Caux, and F. Briere. 1999. Dendritic cells directly modulate B cell growth and differentiation. J Leukoc Biol 66:224-230）、及びＢ細胞へ抗原を移すこと（Qi, H., J. G. Egen, A. Y. Huang, and R. N. Germain. 2006. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science 312:1672-1676、Bergtold, A., D. D. Desai, A. Gavhane, and R. Clynes. 2005. Cell surface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. Immunity 23:503-514）により、体液性免疫応答において重要な役割を演じる。ＤＣ以外に、第３シグナルとしてのＴＬＲ９を介したシグナル伝達が、効率的なＢ細胞応答のために必要である（Ruprecht, C. R., and A. Lanzavecchia. 2006. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur J Immunol 36:810-816、Bernasconi, N. L., E. Traggiai, and A. Lanzavecchia. 2002. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science 298:2199-2202）。デクチン−１は、ＴＬＲ９リガンドのＣｐＧの存在下で、ＤＣ媒介体液性免疫応答に影響することができる。６日目のＩＬ−４ ＤＣを抗デクチン−１ ｍＡｂで刺激した後、ＣＤ４０Ｌ又はＣｐＧの存在下、精製Ｂ細胞を共培養した。図９ａ及び９ｂに示すように、抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化したＤＣは、対照ｍＡｂで刺激したＤＣと比較して、高められたＢ細胞の増殖（ＣＦＳＥ希釈を経て見られる）及び形質細胞の分化（ＣＤ３８＋の増加）を起こす。
【０１０１】
総免疫グロブリン（Ｉｇ）の産生量は、ＥＬＩＳＡにより測定した（図９ａ及び９ｂ）。Ｂ細胞の増殖及び形質細胞の分化と一貫して、抗デクチン−１ ｍＡｂ刺激ＤＣと共に培養したＢ細胞は、ＣＤ４０Ｌ又はＣｐＧの存在下で総免疫グロブリンの産生量を有意に増加させる。
【０１０２】
本発明は、デクチン−１を介して特異的に活性化する作用剤の、例えば、ワクチン接種におけるアジュバントとして、又は免疫低下した個体に対する免疫系刺激剤としての治療用途に使用し得る。又、この発見は、デクチン−１を介する自然な又は異常調節された活性化の阻止が、適用性を有する（例えば、移植状況における耐性の惹起、又は自己免疫疾患の改善のため）ことができることも予測している。
【０１０３】
抗デクチン−１ ｍＡｂはＢ細胞を活性化する：ＣＤ１９＋Ｂ細胞はデクチン−１を発現する（図１）が、これから、Ｂ細胞上に発現するデクチン−１の可能性ある役割が予測される。図１０Ａのデータは、Ｂ細胞上におけるデクチン−１の誘発が、ＣｐＧの存在下でＢ細胞の増殖及び形質細胞の分化を増強することを示す。それと一貫して、図１０Ｂは、抗デクチン−１ ｍＡｂで活性化されたＢ細胞が、増加量の総ＩｇＭを分泌するが、ＩｇＧ及びＩｇＡの分泌は増加しないことを示す。
【０１０４】
デクチン−１の関与によるＢ細胞に対する直接効果に関する上記発見は、デクチン−１を介して又はそれに対抗して作用する作用剤のこれまで概説した治療用途の範囲を強化する。
【０１０５】
Ｔ細胞の応答におけるデクチン−１の役割：デクチン−１を介して刺激されたＤＣは、共刺激性分子の増強量を発現し、サイトカイン及びケモカインの増加量を産生する（図３及び４）が、このことは、デクチン−１が、体液性免疫応答だけでなく細胞性免疫応答にも寄与することを示唆している。抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の応答を測定してこれを試験した（図１１）。図１１のデータは、デクチン−１を介して活性化されたＤＣが、Ｆｌｕ Ｍ１タンパク質に特異的な記憶ＣＤ８ Ｔ細胞の応答を増強することを示している（図１１ａ）。より重要なことには、デクチン−１を介したシグナル伝達は、ＤＣがＣＤ８ Ｔ細胞のＭａｒｔ−１ペプチドによる初回抗原刺激及び交差初回抗原刺激をすることを可能にする（図１１ｂ及びｃ）。これは、デクチン−１が、ＤＣ機能の増強に重要な役割を演じており、ＣＤ８ Ｔ細胞の抗原による初回刺激及び交差初回刺激を改善することを示している。したがって、抗デクチン−１ ｍＡｂ及び抗原融合タンパク質は、頑健で抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発すると見込まれるため、抗デクチン−１ ｍＡｂからなる試薬が、癌及び感染症に対するワクチン開発にとって有用となることを示唆している。
【０１０６】
可溶型の抗デクチン−１ ｍＡｂは、ＤＣを活性化して、健常ドナーからのＭａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強する。本発明者等は、可溶性抗デクチン−１ ｍＡｂがＤＣを活性化できることを示したので、可溶性抗デクチン−１抗体で刺激したＤＣが、抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答を増強できるか否かを試験した。図１２のデータは、可溶性抗デクチン−１抗体で活性化したＤＣが、健常ドナーからのＭａｒｔ−１特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強したことを示している。この試験で作製した抗ＣＤ４０抗体の可溶型も、ＣＤ８ Ｔ細胞の初回抗原刺激を増強した。
【０１０７】
デクチン−１発現に基づいて２群に分割したヒト扁桃腺Ｂ細胞：ヒト扁桃腺の細胞を抗デクチン−１抗体及び他の抗体で染色した。図１３に示すように、ＣＤ３＋Ｔ細胞はデクチン−１を発現しない（左側パネル）。しかし、ＣＤ１９＋Ｂ細胞には２群があった。即ち、一方はデクチン−１を発現せず、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の他方の群は、健常ドナーのＰＢＭＣからのＣＤ１９＋Ｂ細胞と同様に、デクチン−１を発現する。このことは、癌及びワクチン用の新たな抗デクチン−１抗体系治療試薬の開発に関わりをもち得るものと思われる。
【０１０８】
人間の皮膚及びリンパ節における細胞はデクチン−１を発現する：デクチン−１を発現する細胞は、ＩＨＣにより人間の皮膚及びリンパ節で検出できる。組織切片を核染料ＤＡＰＩ（青色）及び抗デクチン−１抗体（赤色）で染色した。図１４は、人間の皮膚及びリンパ節は共に、有意量のデクチン−１を発現することを示している。これは、例えば、抗デクチン−１抗体による標的指向抗原の投与に好ましい部位と思われる、正にその箇所（皮膚）に、インビボの細胞がデクチン−１を発現することを明らかにしているので、重要な観察結果である。
【０１０９】
非ヒト霊長類におけるインビボＤＣはデクチン−１を発現する：非ヒト霊長類（カニクイザル）の血中ＤＣ、サルのＰＢＭＣを、抗デクチン−１ ｍＡｂ、並びに他の細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ５６及びＣＤ１６に対する抗体で染色した。図１５のデータは、ＣＤ１４及びＣＤ１１ｃ＋細胞が共に、抗ヒトデクチン−１ ｍＡｂで染色されたことを示す。ＣＤ１４＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞と異なり、ＣＤ３＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ２７＋及びＣＤ５６＋細胞はデクチン−１を発現しなかった（データは示していない）。このデータは、サル抗原提示細胞に対するある種の抗ヒトデクチン−１−１ ｍＡｂの交差反応性を実証している。サルは、想定される人間治療に関する有効性、安全性双方の試験用の妥当なモデルとして、使用できるので、これは、本明細書に記載の発明の実用化を大いに促進する。
【０１１０】
上に示した発見は、デクチン−１を介して作用する作用剤の治療用途の範囲を強化もし、広げもする。ＤＣのデクチン−１活性化は、隣接するＴ細胞に影響し、増殖量を増加させるようにＴ細胞に指示する。更に、この相互作用中に抗原が存在する場合、デクチン−１活性化ＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を強化する。これは、例えばワクチン環境におけるデクチン−１活性化が、抗原特異的なナイーブＴ細胞の選択的増殖を指示できることを示しており、したがって、これと、Ｂ細胞に対するデクチン−１活性化の上記直接及び間接効果とが相俟って、抗原特異的Ｂ細胞の増殖、そのため抗原特異的抗体の産生が明白に予測される。
【０１１１】
本明細書で考察した任意の実施形態は、本発明の任意の方法、キット、試薬又は組成物に関して実施することができ、その逆もできることを企図している。更に、本発明の組成物は、本発明の方法を実現するために使用することができる。
【０１１２】
本明細書に記載の特定の実施形態は、例示のために示しており、本発明の限定として示しているのでないことは理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱せずに多様な実施形態で使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の特定の手順に等価な多数の手順を認識し、又は単なる日常的実験を用いて確認することができよう。このような等価な手順は、本発明の範囲に入ると考えられ、特許請求の範囲で網羅されている。
【０１１３】
本明細書で言及した全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する技術分野における技術者の技術水準を示している。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願の各々が、参照により組み込まれると明確に個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、用語「含む（comprising）」と共に使用される場合の単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１」を意味し得るが、「１又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１又は２以上」の意味とも合致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物だけを指すことを明確に示していない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物だけ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用されている装置、方法の固有の誤差変化、又は試験対象の間に存在する変動を包含することを示すために、使用される。
【０１１５】
本明細書及び請求項（複数も）で使用する場合、単語「含む（comprising）」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態）、「有する（having）」（及び「ｈａｖｅ」、「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇの任意の形態）、「含む（including）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇの任意の形態）、又は「含有する（containing）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態）は、包括的又は非制限的であり、挙げられていない追加の要素又は方法ステップを排除しない。
【０１１６】
本明細書で使用する場合の用語「又はそれらの組合せ」は、その用語に先立つ列挙項目のあらゆる順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要な場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことも意図している。この例を続ければ、１又は複数の項目又は用語の繰返しを含有する、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの組合せも、明らかに含まれる。当業者であれば、文脈からそうではないことが明らかでない限り、任意の組合せにおいて項目又は用語の数に制限が通常ないことは理解されよう。
【０１１７】
本明細書に開示し、主張する組成物及び／又は方法は全て、本開示に照らせば過度の実験をせずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、組成物及び／又は方法に対して、並びに本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱せずに変更を加え得ることは、当業者には明らかとなろう。当業者には明らかなそのような全ての類似した代用及び改変は、付随する特許請求の範囲に規定するような本発明の趣旨、範囲及び概念に入ると見なされる。
【０１１８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デクチン−１発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高める方法であって、前記抗原提示細胞を、前記抗原提示細胞を活性化できる抗デクチン−１特異的抗体又はその断片と接触させるステップを含み、その際に前記抗原提示細胞が活性化される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が、単離された樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養された、単離された樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と接触させた抗原提示細胞を活性化するステップをさらに含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８０、及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インターフェロンαと接触させた抗原提示細胞を活性化するステップをさらに含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞が樹状細胞を含み、前記樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させることにより活性化され、前記活性化された樹状細胞がＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示細胞が樹状細胞を含み、前記樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させることにより活性化され、前記活性化された樹状細胞がＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａ、並びにそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、ＣＤ４０を介したシグナル伝達と関連して活性化を高める、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、樹状細胞の共刺激活性を増加させた、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含み、細胞が、サイトカイン及びケモカインの産生を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含み、細胞が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＬＲ４リガンド、抗ＴＬＲ４抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１ハイブリッド抗体又はその断片及び抗ＴＬＲ４抗デクチン−１リガンドコンジュゲートの少なくとも１つを用いる、ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、クローンの１５Ｅ２．５、１１Ｂ６．４、１５Ｆ４．７、１４Ｄ６．３及び９Ｈ７．６、並びにそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片によりデクチン−１受容体を介して活性化された樹状細胞が、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合しており、その対の他方の半分が、１又は複数の抗原や、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性のあるアナログ、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、１又は複数のサイトカインに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
デクチン−１特異的抗体又はその断片を発現したハイブリドーマであって、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、抗原提示細胞を活性化することにより、新たな表面マーカーを発現するか、１若しくは複数のサイトカインを分泌するか、又はその双方を行う、ハイブリドーマ。
【請求項１８】
クローンのＰＡＢ１、ＰＡＢ４、ＰＡＢ５、ＰＡＢ８、ＰＡＢ１０、及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１９】
抗原とＴＬＲ９アクチベーターとの存在下にデクチン−１特異的抗体又はその断片により樹状細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、デクチン−１／ＴＬＲ９活性化樹状細胞と接触するＢ細胞が、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌し、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させること、及びそれらの組合せを行う方法。
【請求項２０】
Ｂ細胞が、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びそれらの組合せを分泌する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂ細胞が形質細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
活性化されたＢ細胞がデクチン−１を発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂ細胞が、ＩｇＭの産生を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片によりＢ細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップを含み、Ｂ細胞が抗体産生を増加させる、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法。
【請求項２５】
Ｂ細胞が、分泌したＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びそれらの組合せの産生を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びそれらの組合せの産生を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
デクチン−１特異的抗体又はその断片及びＴＬＲ４受容体により樹状細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップ、及びデクチン−１／ＴＬＲ４活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させるステップとを含むＴ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞活性化が増強される方法。
【請求項２８】
樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとさらに接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、４−１ＢＢＬの表面発現を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
Ｔ細胞が、抗デクチン−１特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞に曝されると増殖する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
免疫グロブリンが、抗原を抗原提示細胞にターゲティングさせ、前記抗原提示細胞が、哺乳動物細胞から分泌される抗デクチン−１免疫グロブリン又はその一部分及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項３３】
抗原特異的ドメインが、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３２に記載の免疫グロブリン。
【請求項３４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞を含むワクチン。
【請求項３５】
配列番号１〜１３の少なくとも１つを含む、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
コヘシン−ドッケリン結合対の１つの半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、デクチン−１特異的抗体結合ドメインを含むモジュール構成リコンビナント抗体（ｒＡｂ）担体。
【請求項３７】
抗原特異的結合ドメインが抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項３８】
抗原特異的結合ドメインが、コヘシン−ドッケリン結合対の１つの半分との融合タンパク質中に、抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項３９】
抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分をさらに含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４０】
抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分をさらに含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４１】
抗原特異的ドメインが、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４２】
単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のデクチン−１受容体と会合する作用剤の使用であって、前記組合せが、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる使用。
【請求項４３】
活性化剤と共に、又は活性化剤なしに、免疫細胞上における、１又は複数の抗原に連結されたデクチン−１結合剤のワクチン作製を目的とした使用。
【請求項４４】
免疫細胞上に発現したデクチン−１以外の細胞表面受容体に対する免疫応答の増強を目的とした、免疫細胞の共活性化剤としての抗デクチン−１剤の使用。
【請求項４５】
デクチン−１受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗デクチン−１抗体Ｖ領域配列の使用。
【請求項４６】
デクチン−１を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はデクチン−１を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤に連結したＤＣ−デクチン−１結合剤の使用。
【請求項１】
デクチン−１発現性抗原提示細胞による抗原提示の有効性を高める方法であって、前記抗原提示細胞を、前記抗原提示細胞を活性化できる抗デクチン−１特異的抗体又はその断片と接触させるステップを含み、その際に前記抗原提示細胞が活性化される方法。
【請求項２】
抗原提示細胞が、単離された樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとインビトロで培養された、単離された樹状細胞、末梢血単核細胞、単球、Ｂ細胞、骨髄性樹状細胞、及びそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と接触させた抗原提示細胞を活性化するステップをさらに含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８０、及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インターフェロンαと接触させた抗原提示細胞を活性化するステップをさらに含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片との接触が、抗原提示細胞上にＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗原提示細胞が樹状細胞を含み、前記樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させることにより活性化され、前記活性化された樹状細胞がＣＤ８６、ＣＤ８０及びＨＬＡ−ＤＲの表面発現を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原提示細胞が樹状細胞を含み、前記樹状細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させることにより活性化され、前記活性化された樹状細胞がＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ−１０及びＭＩＰ−１ａ、並びにそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、ＣＤ４０を介したシグナル伝達と関連して活性化を高める、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗原提示細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４又はインターフェロンαと接触させた樹状細胞を含み、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、樹状細胞の共刺激活性を増加させた、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含み、細胞が、サイトカイン及びケモカインの産生を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含み、細胞が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ４０及びそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＴＬＲ４リガンド、抗ＴＬＲ４抗体又はその断片、抗ＴＬＲ４抗デクチン−１ハイブリッド抗体又はその断片及び抗ＴＬＲ４抗デクチン−１リガンドコンジュゲートの少なくとも１つを用いる、ＴＬＲ４受容体を介した活性化により抗原提示細胞を共活性化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、クローンの１５Ｅ２．５、１１Ｂ６．４、１５Ｆ４．７、１４Ｄ６．３及び９Ｈ７．６、並びにそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片によりデクチン−１受容体を介して活性化された樹状細胞が、単球、樹状細胞、末梢血単核細胞、Ｂ細胞、及びそれらの組合せを活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、コヘシン／ドッケリン対の１つの半分に結合しており、その対の他方の半分が、１又は複数の抗原や、インターロイキン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰ）、造骨因子、並びにこのような成長因子の生物活性のあるアナログ、断片及び誘導体、Ｂ／Ｔ細胞分化因子、Ｂ／Ｔ細胞増殖因子、マイトジェンサイトカイン、走化性サイトカイン及びケモカイン、コロニー刺激因子、血管形成因子、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８など、レプチン、ミオスタチン、マクロファージ刺激タンパク質、血小板由来成長因子、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＮＧＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ヒトリンホトキシンβ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ１−β、ＩＰ−１０、ＰＦ４、ＧＲＯ、９Ｅ３、エリスロポエチン、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＶＥＧＦ、β形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、骨形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９）、ヘパリン結合成長因子（線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ））、インヒビン（例えば、インヒビンＡ、インヒビンＢ）、増殖分化因子（例えば、ＧＤＦ−１）、及びアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ）を含めた形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパー遺伝子ファミリーから選択される、１又は複数のサイトカインに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
デクチン−１特異的抗体又はその断片を発現したハイブリドーマであって、デクチン−１特異的抗体又はその断片が、抗原提示細胞を活性化することにより、新たな表面マーカーを発現するか、１若しくは複数のサイトカインを分泌するか、又はその双方を行う、ハイブリドーマ。
【請求項１８】
クローンのＰＡＢ１、ＰＡＢ４、ＰＡＢ５、ＰＡＢ８、ＰＡＢ１０、及びそれらの組合せから選択される、請求項１７に記載のハイブリドーマ。
【請求項１９】
抗原とＴＬＲ９アクチベーターとの存在下にデクチン−１特異的抗体又はその断片により樹状細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップを含む、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法であって、デクチン−１／ＴＬＲ９活性化樹状細胞と接触するＢ細胞が、抗体産生を増加させ、サイトカインを分泌し、Ｂ細胞活性化表面マーカーの発現を増加させること、及びそれらの組合せを行う方法。
【請求項２０】
Ｂ細胞が、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びそれらの組合せを分泌する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｂ細胞が形質細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
活性化されたＢ細胞がデクチン−１を発現する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂ細胞が、ＩｇＭの産生を増加させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片によりＢ細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップを含み、Ｂ細胞が抗体産生を増加させる、Ｂ細胞免疫応答を増強する方法。
【請求項２５】
Ｂ細胞が、分泌したＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びそれらの組合せの産生を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｂ細胞が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びそれらの組合せの産生を増加させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
デクチン−１特異的抗体又はその断片及びＴＬＲ４受容体により樹状細胞上でデクチン−１受容体を誘発するステップ、及びデクチン−１／ＴＬＲ４活性化樹状細胞にＴ細胞を接触させるステップとを含むＴ細胞活性化を増強する方法であって、Ｔ細胞活性化が増強される方法。
【請求項２８】
樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４、インターフェロンα、抗原、並びにそれらの組合せとさらに接触させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５及びそれらの組合せの分泌を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
デクチン−１特異的抗体又はその断片が、４−１ＢＢＬの表面発現を増加させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
Ｔ細胞が、抗デクチン−１特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞に曝されると増殖する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
免疫グロブリンが、抗原を抗原提示細胞にターゲティングさせ、前記抗原提示細胞が、哺乳動物細胞から分泌される抗デクチン−１免疫グロブリン又はその一部分及び前記免疫グロブリンに結合した抗原。
【請求項３３】
抗原特異的ドメインが、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの複数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３２に記載の免疫グロブリン。
【請求項３４】
デクチン−１特異的抗体又はその断片により活性化された樹状細胞を含むワクチン。
【請求項３５】
配列番号１〜１３の少なくとも１つを含む、請求項３４に記載のワクチン。
【請求項３６】
コヘシン−ドッケリン結合対の１つの半分を含む１又は複数の抗原担体ドメインに連結した、デクチン−１特異的抗体結合ドメインを含むモジュール構成リコンビナント抗体（ｒＡｂ）担体。
【請求項３７】
抗原特異的結合ドメインが抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項３８】
抗原特異的結合ドメインが、コヘシン−ドッケリン結合対の１つの半分との融合タンパク質中に、抗体の少なくとも一部分を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項３９】
抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分をさらに含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４０】
抗原との融合タンパク質である、コヘシン−ドッケリン結合対の相補的半分をさらに含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４１】
抗原特異的ドメインが、全長抗体、抗体可変領域ドメイン、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片及びＦｖ断片、並びにＦａｂｃ断片及び／又はＦｃドメインの数部分を伴うＦａｂ断片を含む、請求項３６に記載のリコンビナント抗体。
【請求項４２】
単独で、又は共活性化剤と共に、免疫細胞上のデクチン−１受容体と会合する作用剤の使用であって、前記組合せが、治療用途のために抗原提示細胞を活性化させる使用。
【請求項４３】
活性化剤と共に、又は活性化剤なしに、免疫細胞上における、１又は複数の抗原に連結されたデクチン−１結合剤のワクチン作製を目的とした使用。
【請求項４４】
免疫細胞上に発現したデクチン−１以外の細胞表面受容体に対する免疫応答の増強を目的とした、免疫細胞の共活性化剤としての抗デクチン−１剤の使用。
【請求項４５】
デクチン−１受容体を介した免疫細胞への結合及びその活性化が可能な、抗デクチン−１抗体Ｖ領域配列の使用。
【請求項４６】
デクチン−１を介した免疫細胞の不適当な活性化から生じることが知られている、若しくは疑われている疾患に関する、又はデクチン−１を発現する病原性細胞若しくは組織に関する、治療用の１又は複数の毒性剤に連結したＤＣ−デクチン−１結合剤の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２０１０−５１９３１６（Ｐ２０１０−５１９３１６Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１０４８（Ｐ２００９−５５１０４８）
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４７９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１８５８７
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５４７９８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１８５８７
【国際公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【出願人】（５０９００４７１２）ベイラー リサーチ インスティテュート (38)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【Ｆターム（参考）】
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