デサチュラーゼ遺伝子とその使用
【課題】糸状菌や肝臓、副腎等の哺乳動物組織に含まれているアラキドン酸、真菌類や魚油に含まれているＥＰＡは、デサチュラーゼにより生成される。Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ、これらの酵素をコードする各遺伝子、並びにこれらの酵素による組換え生産方法を提供する。
【解決手段】炭素５（即ち「Δ５−デサチュラーゼ」）及び炭素６（即ち「Δ６−デサチュラーゼ」）のポリ不飽和脂肪酸の不飽和化に関与する遺伝子。Δ５−デサチュラーゼは例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）からアラキドン酸（ＡＡ）への変換や２０：４ｎ−３からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）への変換に使用できる。Δ６−デサチュラーゼはリノレン酸（ＬＡ）からγ−リノレン酸（ＧＬＡ）への変換に使用できる。生産されるＡＡやポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができる。
【解決手段】炭素５（即ち「Δ５−デサチュラーゼ」）及び炭素６（即ち「Δ６−デサチュラーゼ」）のポリ不飽和脂肪酸の不飽和化に関与する遺伝子。Δ５−デサチュラーゼは例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）からアラキドン酸（ＡＡ）への変換や２０：４ｎ−３からエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）への変換に使用できる。Δ６−デサチュラーゼはリノレン酸（ＬＡ）からγ−リノレン酸（ＧＬＡ）への変換に使用できる。生産されるＡＡやポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａΔ５−デサチュラーゼ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼ及びＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａΔ５−デサチュラーゼ）をコードする遺伝子の同定と単離に関する。特に、Δ５−デサチュラーゼは例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）からアラキドン酸（ＡＡ）及び（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）からエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）への変換を触媒する。Δ６−デサチュラーゼは例えばα−リノレン酸（ＡＬＡ）からステアリドン酸（ＳＴＡ）への変換を触媒する。この変換産物はその後、他のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産における基質として利用することができる。この産物又は他のポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができる。
【背景技術】
【０００２】
デサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）は多数の重要な機能をもつ長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。例えばポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は細胞膜の主要成分であり、リン脂質形態で存在する。哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプスタグランジンの前駆物質としても機能する。更に、ＰＵＦＡは発育中の乳児脳の適正な発育と組織形成及び修復に必要である。ＰＵＦＡの生物学的意義に鑑み、ＰＵＦＡとその中間体を効率的に生産する試みがなされている。
【０００３】
ＰＵＦＡ生合成にはΔ５−デサチュラーゼとΔ６−デサチュラーゼ以外に多数の酵素が関与している。例えば、エロンガーゼ（ｅｌｏ）はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）への変換とステアリドン酸（１８：４ｎ−３）から（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。リノレン酸（ＬＡ，１８：２−Δ９，１２又は１８：２ｎ−６）はオレイン酸（１８：１−Δ９）からΔ１２−デサチュラーゼにより生産される。ＧＬＡ（１８：３−Δ６，９，１２）はリノレン酸からΔ６−デサチュラーゼにより生産される。
【０００４】
動物はΔ９位を越えて不飽和化することができないため、オレイン酸をリノレン酸に変換できないことに留意すべきである。同様に、α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３−Δ９，１２，１５）は哺乳動物により合成することができない。他方、α−リノレン酸は哺乳動物と藻類でΔ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４−Δ６，９，１２，１５）に変換され（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１３５９１とＴｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３０９３，ｐａｇｅ Ａ５３２（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９８，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ａｐｒｉｌ １８−２２，１９８８）参照、米国特許第５，５５２，３０６号も参照）、その後、（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４−Δ８，１１，１４，１７）まで伸長することができる。このポリ不飽和脂肪酸（即ち２０：４−Δ８，１１，１４，１７）はその後、本発明の酵素のようなΔ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５−Δ５，８，１１，１４，１７）に変換することができる。真菌類や植物等の他の真核生物は炭素１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１５１６及び米国特許第５，４４３，９７４号参照）と炭素１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１１２４５参照）で不飽和化する酵素をもつ。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食物及び／又はリノレン酸もしくはα−リノレン酸の不飽和化と伸長から誘導される。これらの問題に鑑み、これらの脂肪酸を天然に生産する種からＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離し、商業的量の１種以上のＰＵＦＡを生産できるように改変可能な微生物、植物又は動物系でこれらの遺伝子を発現させることは非常に有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１種はアラキドン酸（ＡＡ）である。ＡＡは糸状菌に含まれており、肝臓や副腎等の哺乳動物組織からも精製できる。上述したように、ジホモ−γ−リノレン酸からのＡＡ生産はΔ５−デサチュラーゼにより触媒される。ＥＰＡも重要な長鎖ＰＵＦＡである。ＥＰＡは真菌類に含まれ、魚油にも含まれている。上述したように、ＥＰＡは（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸から生産され、Δ５−デサチュラーゼにより触媒される。上記に鑑み、Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ酵素、これらの酵素をコードする各遺伝子、並びにこれらの酵素の組換え生産方法が明白に必要である。更に、天然濃度よりも高濃度のＰＵＦＡを含有する油類と、新規ＰＵＦＡを高度に含有する油類も必要である。このような油類はΔ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の単離と発現によってしか製造することができない。
【０００６】
本明細書に引用する全米国特許、優先権文献及び刊行物はその内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は配列番号１３（図２）、配列番号１９（図４）、配列番号２８（図６）、配列番号３０（図８）、配列番号３２（図１０）及び配列番号３４（図１４）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はフラグメントに関する。特に、単離ヌクレオチドは配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４により表すことができる。これらの配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードすることができる。
【０００８】
更に、本発明はデサチュラーゼ活性をもち、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の一致度又は類似度をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はフラグメントに関する。
【０００９】
ヌクレオチド配列は例えばＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（配列番号１３及び配列番号１９）もしくはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２）等の真菌類又はＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ（配列番号３４）等の藻類から得られる。
【００１０】
本発明は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質又はポリペプチド（配列番号１４（図３）、配列番号２０（図５）、配列番号２９（図７）、配列番号３１（図９）、配列番号３３（図１１）及び配列番号３５（図１５））にも関する。
【００１１】
更に、本発明は、炭素５又は炭素６のポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記精製蛋白質のアミノ酸配列（即ち配列番号１４、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５）に少なくとも約５０％のアミノ酸一致度又は類似度をもつ精製ポリペプチドにも関する。
【００１２】
更に、本発明はデサチュラーゼ（即ちΔ５又はΔ６）の製造方法にも関する。本方法はａ）配列番号１９、配列番号２８、配列番号１３、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４を適宜含むヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）ｉ）単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したｉｉ）プロモーター又は所定型の調節配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）適宜Δ５−デサチュラーゼ又はΔ６−デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階を含む。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。特に、原核細胞は例えば大腸菌、藍色細菌又は枯草菌とすることができる。真核細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＰｉｃｈｉａ種）とすることができる。
【００１３】
更に、本発明はａ）配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４により表されるヌクレオチド配列と、ｂ）これに作動的に連結したプロモーター又は調節配列を含むベクターにも関する。本発明はこのベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。利用可能な真核細胞及び原核細胞は上記に記載した通りである。
【００１４】
更に、本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、植物細胞、植物又は植物組織により少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばヌクレオチド配列がΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼのいずれをコードするかに応じて例えばＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡから構成される群から選択することができる。本発明は上記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は植物酸にも関する。
【００１５】
更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００１６】
更に、本発明は上記ベクターを含む哺乳動物細胞であって、例えばＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡから構成される群から選択される脂肪酸を含む培地で細胞を増殖させると、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、ＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及び／又はＳＴＡの生産レベルが変化する前記哺乳動物細胞にも関する。
【００１７】
本発明はプロモーター又は調節配列に作動的に連結したΔ５−デサチュラーゼ又はΔ６−デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関することにも留意すべきである。ＤＮＡ配列は配列番号１３（Δ６）、配列番号１９（Δ５）、配列番号２８（Δ５）、配列番号３０（Δ５）、配列番号３２（Δ６）及び配列番号３４（Δ５）により表すことができる。更に、本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくともΔ５−デサチュラーゼ又は少なくともΔ６−デサチュラーゼを適宜含む液体（例えば乳）にも関する。
【００１８】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法（即ち「第１」方法）として、ａ）例えば配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０又は配列番号３４により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）Δ５−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、ｄ）発現したヒトΔ５−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ又は２０：４ｎ−３とすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができる。本方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ又はデサチュラーゼに暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含むことができる（即ち「第２」方法）。追加の段階を含むこの方法（即ち「第２」方法）では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はアドレン酸又は（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸とすることができる。追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ又はエロンガーゼに暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる（即ち「第３」方法）。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えば（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）酸とすることができる。
【００１９】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、ａ）配列番号１３又は配列番号３３により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）Δ６−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、ｄ）発現したΔ６−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法に関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＬＡ又はＡＬＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ又はＳＴＡとすることができる。本方法は産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ（又はデサチュラーゼ）に暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。追加の段階を含むこの方法では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ又はＳＴＡとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ又はエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）とすることができる。追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ（又はエロンガーゼ）に暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができる。
【００２０】
本発明は上記方法により製造される産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により製造される別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により製造される最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸はΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡであり得る。別のポリ不飽和脂肪酸は同様にΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばアドレン酸、（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸、ＤＧＬＡ及びＥＰＡであり得る。最終ポリ不飽和脂肪酸は同様にΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えば（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸、ＤＨＡ、ＡＡ又はＥＰＡであり得る。
【００２１】
本発明は１）上記方法により製造される「産物」ＰＵＦＡ、上記方法により製造される「別の」ＰＵＦＡ及び上記方法により製造される「最終」ＰＵＦＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物にも関する。
【００２２】
更に、本発明は上記方法により製造される産物ＰＵＦＡ、上記方法により製造される別のＰＵＦＡ及び上記方法により製造される最終ＰＵＦＡから構成される群から選択される少なくとも１種のＰＵＦＡを含む動物飼料又は化粧品にも関する。これらのＰＵＦＡは上記に挙げた通りであり、図１に例示する。
【００２３】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する状態の予防又は治療方法として、予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与する方法にも関する。
【００２４】
本明細書に記載する各ヌクレオチド及びアミノ酸配列は特定配列番号で指定していることにも留意すべきである。（添付の）配列表はこれらの各配列とその対応番号を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明はＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来するΔ５−デサチュラーゼ遺伝子、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来するΔ６−デサチュラーゼ遺伝子、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍに由来する２種のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子及びＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａに由来するΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド及び翻訳アミノ酸配列に関する。更に、本発明はこれらの遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用にも関する。例えば、前記遺伝子と対応する酵素は医薬組成物、栄養組成物及び他の有価製品に添加可能なポリ不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸及び／又はアドレン酸）の製造に使用することができる。
【００２６】
Δ５−デサチュラーゼ遺伝子、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子及びそれらにコードされる酵素
上述のように、本発明のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は夫々炭素数２０及び１８を上回る長さをもつ高度に不飽和のポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子（ＡＴＣＣ３４３０４）のヌクレオチド配列を図６に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図７に示す。単離Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図４に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図５に示す。単離Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ Δ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図２に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図３に示す。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図８に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図９に示す。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ Δ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１０に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図１１に示す。最後に、単離Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１４に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図１５に示す。
【００２７】
本発明の遺伝子の重要性の１例として、単離Δ５−デサチュラーゼ遺伝子はＤＧＬＡをＡＡに変換し、又はエイコサテトラエン酸をＥＰＡに変換する。ＡＡは例えばΔ５−デサチュラーゼ遺伝子とそれによりコードされる酵素なしには合成することができない。本発明の単離Δ６−デサチュラーゼ遺伝子は例えばリノレン酸（１８：２ｎ−６）をγ−リノレン酸（ＧＬＡ）に変換し、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）をステアリドン酸（ＳＴＡ）に変換する。
【００２８】
本発明は本明細書に記載する配列番号１９（即ちＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号１３（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号２８（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号３０（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号３２（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子）及び配列番号３４（即ちＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子）のヌクレオチド配列の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％を含むか又はこれに相補的な（即ち配列一致度をもつ）ヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関することに留意すべきである。（一致度百分率に関して５０％〜１００％の全整数も本発明の範囲に含むものとする。）このような配列はヒト起源及び他の非ヒト起源とすることができる（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ又はマウス）。
【００２９】
更に、本発明は本発明のヌクレオチド配列（即ち配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３４）及び他の起源に由来し、上記相補性又は対応性をもつ配列のフラグメント及び誘導体にも関する。上記配列（即ち適宜Δ５−デサチュラーゼ活性又はΔ６−デサチュラーゼ活性をもつ配列）の機能的等価物も本発明に含まれる。
【００３０】
本発明は炭素５位又は炭素６位でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる上記蛋白質のアミノ酸配列（即ち配列番号１４（図３）、配列番号２０（図５）、配列番号２９（図７）、配列番号３１（図９）、配列番号３３（図１１）及び配列番号３５（図１５））に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似度又は一致度をもつ精製ポリペプチドにも関する。５０〜１００％の全整数の類似度又は一致度も本発明の範囲に含むものとする。
【００３１】
「一致度」なる用語は特定比較窓又はセグメントにわたる２種の配列のヌクレオチド間の関連度を表す。即ち、一致度は２種のＤＮＡセグメントの同一鎖（センス又はアンチセンス）間の同一、対応又は等価度として定義される。「配列一致度百分率」は２種の最適に整列させた配列を特定領域にわたって比較し、両者配列で塩基が一致する位置の数を測定して整合位置数を求め、このような位置数を比較するセグメントの合計位置数で割って１００を掛けることにより計算される。最適配列整列はＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法及び関連アルゴリズムを実施するコンピュータープログラム（例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｒｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＴＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により実施することができる。（米国特許第５，９１２，１２０号参照。）
本発明の趣旨では、「相補性」は２種のセグメント間の関連度として定義される。これは一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖と適当な条件下でハイブリ大豆して二重螺旋を形成する能力を測定することにより決定される。二重螺旋では一方の鎖にアデニンが現れ、他方の鎖にチミンが現れる。同様に、一方の鎖にグアニンが存在する場合には、他方にシトシンが存在する。２種のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連度が大きいほど、２種のＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドデュプレクスを形成する能力は高い。
【００３２】
２種のアミノ酸配列間の「類似度」は両者配列における一連の同一な保存アミノ酸残基の存在として定義される。２種のアミノ酸配列間の類似度が高いほど、２種の配列の対応、同一又は等価度は高い。（２種のアミノ酸配列間の「一致度」は両者配列における一連の厳密に同一又は不変のアミノ酸残基の存在として定義される。）「相補性」、「一致度」及び「類似度」の定義は当業者に周知である。
【００３３】
「〜によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列又はその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチドからのアミノ酸を少なくとも３個の、より好ましくは少なくとも８個、更に好ましくは少なくとも１５個含むアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明はＰＵＦＡデサチュラーゼ活性をもち、配列番号１３（図２）、配列番号１９（図４）、配列番号２８（図６）、配列番号３０（図８）、配列番号３２（図１０）又は配列番号３４（図１４）を含むヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に並のストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列にも関する。核酸分子の１本鎖形が適当な温度及びイオン強度条件下で別の核酸分子とアニールできるときに核酸分子は別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には２種の核酸が相補的配列を含んでいることが必要である。他方、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズするのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２種のヌクレオチド配列間の類似度又は相同度が高いほどこれらの配列をもつ核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きい。１００ヌクレオチド長を越えるハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。短い核酸とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。
【００３５】
本明細書で使用する「単離核酸フラグメント又は配列」とは場合により合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１個以上のセグメントから構成され得る（特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。）（通常はその５’−一リン酸形で存在する）ヌクレオチドはその１文字表記により次のように表す。「Ａ」はアデニル酸又はデオキシアデニル酸（夫々ＲＮＡ又はＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸又はデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸又はデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（Ａ又はＧ）、「Ｙ」はピリミジン（Ｃ又はＴ）、「Ｋ」はＧ又はＴ、「Ｈ」はＡ又はＣ又はＴ、「Ｉ」はイノシン、「Ｎ」は任意ヌクレオチドを表す。
【００３６】
「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価なフラグメント又はサブフラグメント」なる用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関係なく遺伝子発現を変更又は所定表現型を発現する能力を維持する単離核酸フラグメントの一部又はサブ配列を意味する。例えば、フラグメント又はサブフラグメントをキメラ構築物の設計に使用し、形質転換植物で所定表現型を発現させることができる。キメラ構築物は活性酵素をコードするか否かに関係なく植物プロモーター配列に対して適当な方向で核酸フラグメント又はサブフラグメントを連結することにより共抑制又はアンチセンスで使用するように設計することができる。
【００３７】
「相同度」、「相同」、「実質的に類似｜及び「実質的に対応」等の用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語は１個以上のヌクレオチド塩基が変異しても遺伝子発現を媒介又は所定表現型を発現する核酸フラグメントが能力が変わらないことを意味する。これらの用語は当初の未改変フラグメントに対して得られる核酸フラグメントの機能的性質を実質に変えない本発明の核酸フラグメントの変異（例えば１個以上のヌクレオチドの欠失又は挿入）を意味する。従って、当業者に自明の通り、本発明は特定の例示配列以外の配列にも関する。
【００３８】
「遺伝子」とはコーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）と後続する調節配列（３’非コーディング配列）を含めた特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを意味する。
【００３９】
「天然遺伝子」とはそれ自体の調節配列と共に天然に存在する遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは一般には天然に共存しない核酸フラグメントの組み合わせを意味する。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むか、又は同一起源に由来するが、通常天然に存在するとは異なる方法で配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる（「単離」なる用語は配列をその天然環境から取出すことを意味する。）
「外来」遺伝子とは宿主生物に通常存在しないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は非天然生物又はキメラ構築物に挿入した天然遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは形質転換法によりゲノムに導入した遺伝子である。
【００４０】
「コーディング配列」とは特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とはコーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、又は下流（３’非コーディング配列）に配置され、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性又は翻訳に作用するヌクレオチド配列を意味する。調節配列としてはプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「プロモーター」とはコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは近位及び遠位上流エレメントから構成され、これらのエレメントはエンハンサーと呼ぶことが多い。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの固有エレメント又はプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーター配列は遺伝子の転写部分の内部に配置してもよいし、及び／又は転写配列の下流に配列してもよい。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来するものでもよいし、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成してもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。当業者に自明の通り、種々のプロモーターは種々の組織もしくは細胞型で、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応答して遺伝子の発現を誘導することができる。殆どの細胞型で殆どの場合に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と言う。植物細胞で有用な種々の型の新規プロモーターが絶えず発見されつつあり、ＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｔ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２に多数の例が記載されている。更に、殆どの場合に調節配列の厳密な境界が完全に決定されているので、所定変形のＤＮＡフラグメントが同一プロモーター活性をもつこともあると考えられる。
【００４２】
「イントロン」は蛋白質配列の一部をコードしない遺伝子の介在配列である。従って、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切出されるので翻訳されない。この用語は切出されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は転写される遺伝子の配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡに存在するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部でなくてもよい。
【００４３】
「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に配置されたＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写産物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に作用し得る。翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．とＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００４４】
「３’非コーディング配列」とはコーディング配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列やｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節配列をコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般にｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することを特徴とする。種々の３’非コーディング配列の使用がＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０に例示されている。
【００４５】
「ＲＮＡ転写産物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるときには一次転写産物と言うが、一次産物の転写後プロセシングにより誘導されるＲＮＡ配列でもよく、その場合には成熟ＲＮＡと言う。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンをもたないＲＮＡであり、細胞により蛋白質に翻訳できるものを意味する。「ｃＤＮＡ」とはｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、逆転写酵素を使用してこの鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは１本鎖でもよいし、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して２本鎖に変換してもよい。「センス」ＲＮＡとはｍＲＮＡを含み、細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写産物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは標的一次転写産物又はｍＲＮＡの全部又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡは特異的遺伝子転写産物のどの部分と相補的でもよく、即ち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、又はコーディング配列のいずれでもよい。「機能的ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は翻訳できないが、細胞プロセスに作用する他のＲＮＡを意味する。「相補体」及び「逆相補体」なる用語は本明細書ではｍＲＮＡ転写産物に関して同義に使用し、メッセージのアンチセンスＲＮＡを意味する。
【００４６】
「内因性ＲＮＡ」なる用語は天然又は非天然即ち組換え手段、突然変異誘発等により導入されるかを問わずに本発明の組換え構築物による形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意核酸配列によりコードされる任意ＲＮＡを意味する。
【００４７】
「非天然」なる用語は通常天然に存在するものと一致しない人工を意味する。
【００４８】
「作動的に連結」なる用語は一方の核酸配列の機能が他方により調節されるように単一核酸フラグメントで核酸配列を結合することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき（即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にあるとき）にプロモーターはコーディング配列に作動的に連結している。コーディング配列はセンス又はアンチセンス方向のいずれで調節配列に作動的に連結してもよい。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域を標的ｍＲＮＡの５’又は標的ｍＲＮＡの３’又は標的ｍＲＮＡの内部に直接又は間接的に作動的に連結してもよいし、第１の相補領域を標的ｍＲＮＡの５’に作動的に連結し、その相補体を３’に作動的に連結してもよい。
【００４９】
本明細書で使用する「発現」なる用語は機能的終産物の生産を意味する。遺伝子の発現には遺伝子の転写とｍＲＮＡから前駆物質又は成熟蛋白質への翻訳が必要である。「アンチセンス阻害」とは標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する。「共抑制」とは同一又は実質的に類似する外来又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００５０】
「成熟」蛋白質とは翻訳後プロセシングしたポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在するプレ又はプロペブチドを除去したポリペプチドを意味する。「前駆物質」蛋白質とはｍＲＮＡの翻訳の一次産物、即ちプレ及びプロペブチドがまだ存在するものを意味する。プレ及びプレペブチドとしては細胞内局在シグナルが挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
「安定な形質転換」とは核ゲノムとオルガネラゲノムの両者を含む宿主生物のゲノムに核酸フラグメントを導入し、遺伝的に安定した遺伝を行うことを意味する。これに対して、「一過的形質転換」とは核酸フラグメントを宿主生物の核又はＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組込み又は安定な遺伝なしに遺伝子発現させることを意味する。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と言う。コメ、トウモロコシ及び他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は粒子加速又は「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、又はトランスジーンを含む適当なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム法（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書で使用する「形質転換」なる用語は安定な形質転換と一過的形質転換の両者を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と言う）により詳細に記載されている。
【００５３】
「組換え」なる用語は例えば化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、２つの分離配列セグメントの人工的組合せを意味する。
【００５４】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復サイクルから構成される（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。一般に、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーを低温でアニールした後、中温で伸長する。これらの連続３段階１組をサイクルと言う。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は短時間で鋳型の反復複製によりＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，ヨーロッパ特許出願第５０，４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４，７９６号；ヨーロッパ特許出願第２５８，０１７号；ヨーロッパ特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，ヨーロッパ特許出願第２０１，１８４号，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した特定オリゴヌクレオチドの組合せを利用してＤＮＡ合成を開始する。プライマーの設計は分析したいＤＮＡの配列に依存する。この方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回（通常は２０〜５０回）行うことにより実施される。
【００５６】
ＰＣＲ反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とＵＶ透照により分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加えて産物にラベルを加えてもよい。この場合には、ゲルをＸ線フィルムに露光することによりＰＣＲ産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物には個々の増幅産物レベルを定量できるという利点もある。
【００５７】
本明細書では「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」なる用語を同義に使用する。これらの用語は当業者に周知の標準方法を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝材料の機能単位を意味する。このような構築物をそのまま使用してもよいし、ベクターに組込んで使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は当業者に周知のように宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に配置する必要がある遺伝要素は当業者に周知である。個々の各種形質転換イベントの結果、各種レベル及びパターンの発現が生じる（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６）ので、所望発現レベル及びパターンを示す系列を得るためには多重イベントをスクリーニングしなければならないことも当業者に自明である。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析、又は表現型分析により実施することができる。
【００５８】
Δ５−デサチュラーゼ酵素とΔ６−デサチュラーゼ酵素の製造
デサチュラーゼ酵素のいずれか１種をコードする遺伝子を単離したら、その後、ベクター又は構築物を使用することにより原核又は真核宿主細胞に導入することができる。ベクター（例えばバクテリオファージ、コスミド又はプラスミド）はΔ５−デサチュラーゼ酵素又はΔ６−デサチュラーゼ酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞で機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘発することが可能な任意調節配列（例えばプロモーター）を含むことができる。調節配列はヌクレオチド配列に作動的に関連又は作動的に連結している。（上述のように、調節配列がコーディング配列の転写又は発現に作用する場合に調節配列はコーディング配列に「作動的に連結している」と言う。）利用可能なプロモーターとしては例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセル酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸蛋白質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するものや、ガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター（例えばＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）が挙げられる。更に、他の蛋白質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列と、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミン又はウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）等の他の調節配列もベクターに配置してもよい。構築物に配置する配列の選択は所望発現産物と宿主細胞の種類に依存する。
【００５９】
上述のように、ベクターを構築したら、次に例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーション等の当業者に公知の方法により選択宿主細胞に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、遺伝子の発現を可能にする適当な条件下で宿主細胞を培養して所望ＰＵＦＡを生産させた後、回収し、精製する。
【００６０】
利用可能な原核宿主細胞の例としては例えば大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリア（例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ種、即ち藍藻）等の細菌類が挙げられる。利用可能な真核宿主細胞の例としては例えば哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えばＹａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＨａｎｓｅｎｕｌａ種）、又は真菌細胞（例えば糸状菌細胞、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）細胞を利用するのが好ましい。
【００６１】
宿主細胞での発現は一過的又は安定的に行うことができる。一過的発現は導入構築物が宿主細胞で機能的な発現シグナルを含むが、複製しないので宿主細胞に殆ど組込まれないか又は宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。一過的発現は目的遺伝子に作動的に連結した調節プロモーターの活性を誘導することによっても実施できるが、このような誘導系は基底発現レベルが低いことが多い。安定的発現は宿主ゲノムに組込むことができるか又は宿主細胞で自律複製する構築物を導入することにより達成することができる。発現構築物に配置するか又は発現構築物をトランスフェクトする選択マーカーを使用して目的遺伝子の安定的発現を選択した後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。安定的発現が組込みの結果である場合には、構築物の組込み部位は宿主ゲノム内でランダムでもよいし、宿主遺伝子部位との組換えをターゲットするために十分な宿主ゲノムとの相同領域を含む構築物を使用してターゲットしてもよい。内在部位に構築物をターゲットする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在部位により提供することができる。
【００６２】
トランスジェニック哺乳動物を使用して目的酵素（即ちΔ５−デサチュラーゼの１種以上、Δ６−デサチュラーゼの１種以上、又はその組合せ）を発現させ、最終的に目的ＰＵＦＡを発現させることもできる。より具体的に言うと、上記構築物を作出したら、胚の前核に挿入すればよい。その後、胚をレシピエント雌に移植する。あるいは、核導入法も利用できる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠と出産が可能である（例えば米国特許第５，７５０，１７６号及び米国特許第５，７００，６７１号参照）。その後、子孫からの乳汁、組織又は他の体液試料は非トランスジェニック動物に通常検出される濃度とは異なる濃度のＰＵＦＡを含有しているはずである。後続世代をモニターし、変化又は増加濃度のＰＵＦＡが生産されているかどうかを調べ、従って所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子がそのゲノムが組込まれているかどうかを調べる。宿主として利用する哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシから構成される群から選択することができる。但し、目的酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組込む能力がある限り任意哺乳動物を使用することができる。
【００６３】
デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、デサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的転写及び翻訳開始及び終結領域を作動的に連結する。転写及び翻訳開始及び終結領域は発現させようとするＤＮＡ、所望系で発現できることが知られているか又はその可能性がある遺伝子、発現ベクター、化学合成、又は宿主細胞における内在部位から等の種々の非排他的起源に由来する。植物組織及び／又は植物部分における発現は特に組織又は部分が種子、葉、果実、花、根等の早期回収されるものである場合にある程度の効率を示す。米国特許第５，４６３，１７４号、４，９４３，６７４号、５，１０６，７３９号、５，１７５，０９５号、５，４２０，０３４号、５，１８８，９５８号及び５，５８９，３７９号に記載されているような特定調節配列を利用することにより植物でその位置に発現をターゲットすることができる。あるいは、発現される蛋白質は直接又は更に改変後に宿主植物から液体フラクションに組込むことができる産物を生産する酵素でもよい。デサチュラーゼ遺伝子又はアンチセンスデサチュラーゼ転写産物が発現すると、植物部分及び／又は植物組織に含まれる特定ＰＵＦＡ又はその誘導体の濃度が変化し得る。デサチュラーゼポリペプチドコーディング領域を単独又は他の遺伝子と共に発現させ、より高濃度の所望ＰＵＦＡを含有するか又はＰＵＦＡ組成が人乳により近似する組織及び／又は植物部分を生産することもできる（Ｐｒｉｅｔｏら，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２４４９４）。終結領域は開始領域を得た遺伝子の３’領域又は別の遺伝子に由来するものとすることができる。多数の終結領域が同一及び異なる属及び種から種々の宿主で満足できるとして知られており、見出されている。終結領域は特定性質よりもむしろ便宜上から選択するのが一般的である。
【００６４】
上述のように、植物（例えばＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）又はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ））又は植物組織を夫々宿主又は宿主細胞として利用してデサチュラーゼ酵素を発現させ、ポリ不飽和脂肪酸の生産に利用してもよい。より具体的に言うと、所望ＰＵＦＡを種子で発現させることができる。種子油の分離方法は当分野で公知である。即ち、ＰＵＦＡ源の提供に加え、デサチュラーゼ遺伝子と恐らく他のデサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作すると、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加可能な種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに作動的に連結したデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターをデサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間と条件下に植物組織又は植物に導入する。ベクターは更に他の酵素（例えばΔ４−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ及び／又はΔ１９−デサチュラーゼ）をコードする１種以上の遺伝子も含んでいてもよい。酵素が作用する該当基質（例えばＤＧＬＡ（Δ５−デサチュラーゼの場合）、ＡＬＡ（Δ６−デサチュラーゼの場合）等）を植物組織又は植物で生産してもよいし、このような基質を生産する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞又は植物に導入してもよい。更に、適当な酵素を発現する植物組織に基質を噴霧してもよい。これらの種々の技術を使用して、植物細胞、植物組織又は植物の使用によりＰＵＦＡ（例えばｎ−６不飽和脂肪酸（例えばＡＡ）又はｎ−３脂肪酸（例えばＥＰＡ又はＳＴＡ））を生産することもできる。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物として、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として例えばトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸を生産する植物にも関することにも留意すべきである。
【００６５】
単一植物プロトプラスト形質転換体又は種々の形質転換外植片から植物を再生、発生及び培養することも当分野で周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９８８））。この再生及び増殖法は一般に形質転換細胞を選択する段階と、通常の胚発生〜挿し木苗段階で個体化細胞を培養する段階を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗をその後、土壌等の適当な植物成長媒質に植え付ける。
【００６６】
目的蛋白質をコードする外来外因性遺伝子を含む植物の発生又は再生は当分野で周知である。再生した植物を自家受粉させて同型トランスジェニック植物を提供することが好ましい。あるいは。再生植物から得た花粉を栽培学的に重要な系列の種子成長植物と交配する。逆に言うと、これらの重要系列の植物からの花粉を使用して再生植物に受粉させる。当業者に周知の方法を使用して所望ポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を栽培する。
【００６７】
植物組織から植物を再生させる方法は種々のものがある。特定再生方法は出発植物組織と再生させようとする特定植物種によって異なる
主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法がワタ（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）、大豆（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３（１９８８），Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））、アブラナ属（米国特許第５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６），ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））、パパイヤ及びエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について報告されている。
【００６８】
エレクトロポレーション、粒子衝撃及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する単子葉植物の形質転換も報告されている。形質転換と植物再生はアスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４，（１９８７））、オオムギ（ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７（１９９４））、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４（１９８８），Ｂｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０），Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３（１９９０），Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１；１９４，（１９９３），Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５：５５０−５５７（１９９５））、オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９（１９９２））、オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８６））、コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ＺｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅ．７：３７９，（１９８８）；ＢａｔｔｒａｗとＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１））、ライ麦（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：２７４（１９８７））、サトウキビ（ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））、ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｔ １０：６９１（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号）で達成されている。
【００６９】
クローニングした核酸構築物の一過的発現に基づく遺伝子発現アッセイはポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション又は粒子衝撃により核酸分子を植物細胞に導入することにより開発されている（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７０】
一過的発現系を使用して遺伝子構築物を機能的に分析することができる（一般にＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。当然のことながら、本発明の核酸分子の任意のものをベクター、プロモーター、エンハンサー等の他の遺伝子エレメントと共に永久的又は一過的に植物細胞に導入できる。
【００７１】
上記方法に加え、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及び単離、組換え生物の作成並びにクローンのスクリーニングと単離に関する特定条件及び手順を記載した標準資料は当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７））。
【００７２】
天然又は組換えにより宿主細胞により生産され得る基質と、後から宿主細胞に導入するベクターに存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【００７３】
上記に鑑み、本発明はデサチュラーゼ酵素（即ちΔ５又はΔ６）の製造方法として、１）デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を単離する段階と、２）前記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、３）デサチュラーゼ酵素の生産に十分な時間及び条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含む方法に関する。
【００７４】
本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、デサチュラーゼが酸をポリ不飽和脂肪酸に変換するように酸を酵素に暴露する段階を含む方法にも関する。例えば２０：３ｎ−６をΔ５−デサチュラーゼ酵素に暴露すると、ＡＡに変換される。その後、ＡＡをエロンガーゼに暴露し、ＡＡをアドレン酸（即ち２２：４ｎ−６）に伸長する。あるいは、Δ５−デサチュラーゼを利用して２０：４ｎ−３を２０：５ｎ−３に変換してからエロンガーゼに暴露して（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸に変換してもよい。その後、Δ４−デサチュラーゼを使用することにより（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸をＤＨＡに変換することができる。即ち、Δ５−デサチュラーゼは特定有効目的に使用可能なポリ不飽和脂肪酸の製造に使用することができる。
【００７５】
Δ６−デサチュラーゼの役割については、酵素が酸をＧＬＡに変換するようにリノレン酸を酵素に暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用してＧＬＡをＤＧＬＡに変換することができる。その後、ＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに暴露することによりＤＧＬＡをＡＡに変換することができる。別例として、ＡＬＡをＳＴＡに変換するためにはＡＬＡをΔ６−デサチュラーゼに暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用することによりＳＴＡを２０：４ｎ−３に変換することができる。その後、２０：４ｎ−３をΔ５−デサチュラーゼに暴露することによりＥＰＡに変換することができる。即ち、Δ６−デサチュラーゼは有利な性質をもつＰＵＦＡの製造や、他のＰＵＦＡの製造に使用することができる。
【００７６】
Δ５−デサチュラーゼ遺伝子、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子、及びこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用
上述のように、単離デサチュラーゼ遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途がある。例えば、遺伝子と対応する酵素はポリ不飽和脂肪酸の製造に間接又は直接的に使用することができ、例えば、Δ５−デサチュラーゼはＡＡ、アドレン酸又はＥＰＡの製造に使用することができる。Δ６−デサチュラーゼはＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＴＡ又は２０：４ｎ−３の製造に間接又は直接的に使用することができる。（「直接」とは酵素が酸を組成物で利用する別の酸に直接変換する状況（例えばＤＧＬＡからＡＡへの変換）を意味する。「間接」とは酸がデサチュラーゼにより別の酸（即ち中間経路）に変換（例えばＤＧＬＡからＡＡ）された後、後者酸が非デサチュラーゼ酵素の使用（例えばエロンガーゼによりＡＡからアドレン酸）又は別のデサチュラーゼ酵素の使用（例えばΔ１７−デサチュラーゼによりＡＡからＥＰＡ）に変換される状況を意味する）。これらのポリ不飽和脂肪酸（即ちデサチュラーゼ酵素の活性により直接又は間接的に製造されたポリ不飽和脂肪酸）は例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に含まれる。これらの使用について以下に詳述する。
【００７７】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。このような組成物は本発明の目的では体内に取込まれると、（ａ）組織を強化又はエネルギーを供給し、及び／又は（ｂ）十分な栄養状態又は代謝機能を維持、回復又は補助するにように作用するヒト消費用（胃又は腸消費用を含む）任意食品又は調製物を含む。
【００７８】
本発明の栄養組成物は本発明によるデサチュラーゼ遺伝子の使用により直接又は間接的に製造された少なくとも１種の油又は酸を含み、固体形態でも液体形態でもよい。更に、組成物は特定用途に必要な量の食用多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。このような成分の量は組成物を健常乳児、幼児又は成人に使用するのかあるいは所定代謝状態（例えば代謝障害）を伴う等の特殊な要求のあるものに使用するのかによって広い範囲をとる。
【００７９】
組成物に添加でかる多量養素の例としては食用脂肪、炭水化物及び蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。このような食用脂肪の例としてはヤシ油、大豆油並びにモノ及びジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。このような炭水化物の例としては蔗糖、食用乳糖及び加水分解澱粉が挙げられるが、これらに限定されない。更に、本発明の栄養組成物で利用可能な蛋白質の例としては大豆蛋白質、電気透析ホエイ、電気透析脱脂乳、ホエイ、又はこれらの蛋白質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ビタミンとミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＥ複合体を本発明の栄養組成物に添加できる。
【００８１】
本発明の栄養組成物で利用する成分は半精製又は精製物に由来する。半精製又は精製とは、天然材料に精製又は合成により製造した材料を意味する。
【００８２】
本発明の栄養組成物の例としては乳児用調製乳、栄養補助食品、代用食品及び再水和組成物が挙げられるが、これらに限定されない。特に有利な栄養組成物としては経腸及び非経腸乳児用補給剤、特殊乳児用調製乳、高齢者用補給剤、及び胃腸障害及び／又は吸収不良者用補給剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の栄養組成物は食事の補充を必要としない場合にも食品に添加できる。例えば、組成物は任意種の食品に添加することができ、例えばマーガリン、調製バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック菓子、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉類、魚肉及び飲料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の好適態様では、栄養組成物は経腸栄養製品であり、成人又は小児経腸栄養製品がより好ましい。この組成物は慢性又は急性疾患状態によりストレスを受けていたり、特殊処置が必要な成人又は小児に投与することができる。組成物は本発明により製造されるポリ不飽和脂肪酸に加え、上記のような多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。多量養素は人乳に含まれると等価の量又はエネルギー換算即ちカロリー当たりの換算で添加することができる。
【００８５】
液体又は固体経腸及び非経腸栄養製剤の処方方法は当分野で周知である（下記実施例も参照されたい）。
【００８６】
経腸製剤は例えば滅菌後に即使用（ＲＴＦ）式で利用してもよいし、濃縮液体又は粉末で保存してもよい。粉末は上記のように調製した製剤を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和して再構成することにより製造することができる。成人及び小児栄養製剤は当分野で周知であり、市販されている（例えばＲｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ製品Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明により製造した油又は酸はこれらの製剤の任意のものに添加することができる。
【００８７】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には約０．６Ｋｃａｌ〜約３Ｋｃａｌ／ｍｌとすることができる。固体又は粉末形態の場合には、栄養補給剤に約１．２〜＞９Ｋｃａｌ／ｇ、好ましくは約３〜７Ｋｃａｌ／ｇを加えることができる。一般に、液体製品の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満とする。
【００８８】
栄養製剤には本発明により製造したＰＵＦＡ以外に上記のように多量養素、ビタミン及びミネラルを加えることができる。これらの付加成分の存在は個体がこれらの成分の最小１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡ提供に加え、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に加えると望ましい場合もある。これらの物質はストレス下の免疫系を強化するので、組成物を投与する個体に更に有利である。これらの成分は医薬組成物にも添加できる。
【００８９】
より好ましい態様では、栄養組成物は酸化防止剤と少なくとも１種のＰＵＦＡに加えて炭水化物源を含み、炭水化物の少なくとも５重量％は食用オリゴ糖である。より好ましい態様では、栄養組成物は更に蛋白質、タウリン及びカルニチンを含む。
【００９０】
上述のように、本発明により製造したＰＵＦＡ又はその誘導体は代用食品又は補助食品、特に乳児用調製乳に添加し、点滴栄養患者や、栄養不良又は他の状態もしくは疾患状態の予防又は治療に用いることができる。背景として、人乳の脂肪酸プロフィルはＤＨＡ約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡ約０．０３％〜約０．１３％、ＡＡ約０．３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡ約０．２２％〜約０．６７％、及びＧＬＡ約０．２７％〜約１．０４％であることに留意すべきである。即ち、本発明により製造されるＡＡ、ＥＰＡ及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の脂肪酸は例えば人乳のＰＵＦＡ濃度を良好に増すように乳児用調製乳の組成を変更したり、非ヒト哺乳動物母乳に通常含まれるＰＵＦＡ濃度を変えるために使用することができる。特に、医薬又は食品補給剤、特に母乳代用剤又は補給剤に使用する組成はＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含むことが好ましい。油はＡＡ約０．３〜３０％、ＤＧＬＡ約０．２〜３０％及び／又はＧＬＡ約０．２〜約３０％を含むことがより好ましい。
【００９１】
本発明はトリグリセリドとして計算した場合に脂肪酸約２〜約３０重量％を含む非経腸栄養組成物に関する。好適組成物はＧＬＡとして全ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％を含む（米国特許第５，１９６，１９８号）。場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン（例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ）やＬ−カルニチンも加えてもよい。所望により、α−トコフェロール等の防腐剤を約０．１重量％加えてもよい。
【００９２】
更に、ＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの比は特定所期最終用途に合わせて調節することができる。母乳補給剤又は代用剤として処方する場合には、夫々約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比でＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡを含む組成物が提供される。例えば、動物の母乳は１：１９：３０〜６：１：０．２のＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡ比をとることができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間比をとることが好ましい。宿主細胞で同時に製造する場合には、ＧＬＡやＤＧＬＡ等の前駆物質基質からＡＡへの変換率を調節してＰＵＦＡ比を厳密に制御することが好ましい。例えば、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約１：１９にするにはＤＧＬＡからＡＡへの変換率として５％〜１０％を使用することができ、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約６：１にするには変換率約７５％〜８０％を使用することができる。従って、細胞培養系であるか宿主動物中であるかに関係なく、デサチュラーゼ発現のタイミング、程度及び特異性と、他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの発現を調節することにより、ＰＵＦＡ濃度及び比を調節することができる。本発明により生産されるＰＵＦＡ／酸（例えばＡＡ及びＥＰＡ）をその後、所望濃度及び比で他のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と配合してもよい。
【００９３】
更に、本発明により製造したＰＵＦＡ又はこれを含む宿主細胞を動物飼料補給剤として使用し、動物の組織又は乳脂肪酸組成をヒト又は動物消費により望ましいものに変えることもできる。
【００９４】
医薬組成物
本発明は本明細書に記載するデサチュラーゼ遺伝子を使用して本明細書に記載する方法により製造した酸及び／又は油の１種以上を含む医薬組成物にも関する。より具体的には、このような医薬組成物は酸及び／又は油の１種以上と医薬的に許容可能な標準周知非毒性キャリヤー、アジュバント又はビヒクル、例えばリン酸緩衝塩類溶液、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤又はエマルション（例えば水／油エマルション）を含むことができる。組成物は液体形態でも固体形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、飲用液剤もしくは粉末剤、注射剤、又は局所軟膏もしくはクリームの形態とすることができる。例えば分散剤の場合には所望粒度を維持し、界面活性剤を使用することにより適正な流動性を維持することができる。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えると望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味料、調味料及び香料等のアジュバントを組成物に加えてもよい。
【００９５】
懸濁液は活性化合物以外に例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカントガム又はこれらの物質の混合物等の懸濁剤を含むことができる。
【００９６】
錠剤やカプセル剤等の固体剤形は当分野で周知の技術を使用して製造することができる。例えば、本発明により製造したＰＵＦＡを乳糖、蔗糖及びコーンスターチ等の慣用錠剤基剤に結合剤（例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン）、崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉又はアルギン酸）及び滑剤（例えばステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム）を加えて錠剤化することができる。カプセル剤は酸化防止剤及び該当ＰＵＦＡと共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに封入することにより製造することができる。酸化防止剤とＰＵＦＡ成分は上記基準に合うようにする。
【００９７】
静脈内投与には、本発明により生産したＰＵＦＡ又はその誘導体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（登録商標）等の市販製剤に配合すればよい。典型的な健常成人血漿脂肪酸プロフィルはＡＡ６．６４〜９．４６％、ＤＧＬＡ１．４５〜３．１１％、及びＧＬＡ０．０２〜０．０８％である。患者で正常脂肪酸プロフィルに達するようにこれらのＰＵＦＡ又はその代謝前駆物質を単独又は他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分を単一又は多重使用可能なキット形態で個々に提供してもよい。特定脂肪酸の典型的な用量は０．１ｍｇ〜２０ｇ（１００ｇまで）／日であり、１０ｍｇ〜１、２、５又は１０ｇ／日が好ましい。
【００９８】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては例えば経腸（例えば経口及び直腸）と非経腸が挙げられる。例えば、液体製剤を例えば経口又は直腸投与することができる。更に、均一混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下に生理的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合し、スプレー又は吸入剤を形成することができる。投与経路は当然のことながら所望効果に依存する。例えば、肌荒れ、乾燥又は老化の治療や、皮膚損傷又は火傷の治療や、疾病又は障害により損傷した皮膚又は毛髪の治療に組成物を利用する場合には、局所塗布すればよいと思われる。
【００９９】
組成物の患者投与量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子により異なる。
【０１００】
剤形としては、組成物は例えば液剤、分散液、懸濁液、エマルション又は後で再構成する滅菌粉末とすることができる。
【０１０１】
本発明は更に本明細書に記載する医薬及び／又は栄養組成物の使用による各種疾患の治療にも関する。特に、本発明の組成物は血管形成後再狭窄の治療に使用することができる。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。ＰＵＦＡはカルシウム代謝に関与していることも分かっているので、本発明の組成物は恐らく骨粗鬆症や腎臓又は尿管結石の治療又は予防にも利用できると思われる。
【０１０２】
更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用できる。悪性細胞は脂肪酸組成の変化が示されている。脂肪酸を加えるとその増殖が抑制され、細胞死を生じ、化学治療剤感受性を増すことが分かっている。更に、本発明の組成物は癌に伴う悪液質の治療にも有用であると思われる。
【０１０３】
本発明の組成物は糖尿病の治療にも使用することができる（例えば米国特許第４，８２６，８７７号とＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。糖尿病動物では脂肪酸代謝及び組成の変化が示されている。
【０１０４】
更に、デサチュラーゼ酵素の使用により直接又は間接的に製造したＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹治療、血圧降下及び検査数値の改善にも使用できる。更に、本発明の組成物は血小板凝固、血管拡張の誘導、コレステロールレベル低下、血管平滑筋及び繊維組織の増殖抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血及び非ステロイド抗炎症薬の他の副作用（米国特許第４，６６６，７０１号参照）の緩和又は予防、子宮内膜症や月経前症候群（米国特許第４，７５８，５９２号参照）の予防又は治療、並びにウイルス感染後の筋肉痛、脳脊髄炎及び慢性疲労（米国特許第５，１１６，８７１号参照）の治療にも使用できる。
【０１０５】
本発明の組成物の他の用途としてはＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療と、健康維持が挙げられる。
【０１０６】
更に、本発明の組成物は化粧目的にも利用できる。混合物を形成するように既存化粧品組成物に添加してもよいし、単独組成物として使用してもよい。
【０１０７】
獣医用途
動物は要求及び条件の多くがヒトと同一であるので、上記医薬及び栄養組成物は動物（即ち家畜又は非家畜）でもヒトと同様に利用できる。例えば、本発明の油又は酸は動物又は水産養殖飼料添加物、動物代用飼料、動物ビタミン又は動物局所軟膏に利用することができる。
【０１０８】
以下、実施例により本発明を説明するが、これにより発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０９】
真菌からのデサチュラーゼ単離とｃＤＮＡライブラリー構築のための縮重オリゴヌクレオチドの設計
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ５６８５１）の脂肪酸組成物を分析した処、相当量のアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）が存在することが判明した。そこで、この生物はリノレン酸（ＬＡ，１８：２ｎ−６）をγ−リノレン酸（ＧＬＡ，１８：３ｎ−６）に変換することが可能な活性Δ６−デサチュラーゼとジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ ｎ−６）をアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）に変換する活性Δ５−デサチュラーゼを含有していると思われた（図１）。更に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａはＡＲＡをＥＰＡに不飽和化することが可能なΔ１７−デサチュラーゼも含有していると思われた。
【０１１０】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ３４３０４）の脂肪酸組成物を分析した処、ＡＲＡとＥＰＡのみならずアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）、ω６−ドコサペンタエン酸（ω６−ＤＰＡ，２２：５ｎ−６）、ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）等の長鎖ＰＵＦＡも検出された。従って、Δ６、Δ５及びΔ１７−デサチュラーゼに加え、Ｔ．ａｕｒｅｕｍはＡＤＡをω３−ＤＰＡ又はω６−ＤＰＡをＤＨＡに変換するΔ１９−デサチュラーゼ及び／又はＡＤＡをω６−ＤＰＡ又はω３−ＤＰＡをＤＨＡに変換するΔ４−デサチュラーゼを恐らく含有していると思われた。そこで、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａとＴ．ａｕｒｅｕｍからこれらの推定デサチュラーゼ遺伝子を単離し、最終的に代替宿主で発現させることにより機能を確認することを目的にした。
【０１１１】
機能的デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、生物毎にｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）をジャガイモデキストロース培地Ｄｆｃｏ＃３３６（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で室温で４日間絶えず撹拌しながら培養した。チーズクロス数層で濾過することにより菌糸体を回収し、乳鉢乳棒を使用して液体窒素中で培養物を粉砕した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用して全ＲＮＡを精製した。
【０１１２】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）細胞を光照射下にＢＹ＋培地（Ｄｉｆｃｏ＃７９０）で室温で４日間絶えず撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら培養し、最大バイオマスを得た。これらの細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離により回収し、ＲＮアーゼを含まない氷冷水で濯いだ。これらの細胞を次にフレンチプレスで１０，０００ｐｓｉで溶解させ、溶解細胞をＴＥ緩衝フェノールに直接集めた。フェノール：クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）抽出の反復後にクロロホルム抽出により細胞溶解液から蛋白質を取出した。０．３Ｍ（終濃度）酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）とイソプロパノール１容量を使用して水相から核酸を−７０℃で３０分間沈殿させた。沈殿した核酸を１５，０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離して集め、５分間減圧乾燥した後、１×ＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中ＤＮアーゼＩ（無ＲＮアーゼ）で１５分間室温で処理した。５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用してＲＮＡを更に精製した。
【０１１３】
オリゴｄＴセルロース樹脂を使用して各生物の全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＸＲライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して２本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターに指向性クローニングした（５’ＥｃｏＲＩ／３’ＸｈｏＩ）。Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ及びＴ．ａｕｒｅｕｍライブラリーは各平均インサート寸法約７００ｂｐのクローン約２．５×１０６個を含んでいた。液体窒素中で培養物を粉砕することによりＳ．ｄｉｃｌｉｎａとＴ．ａｕｒｅｕｍの培養物を生産するＰＵＦＡからのゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０１１４】
採用したアプローチは公知デサチュラーゼで保存されているアミノ酸モチーフを示す縮重オリゴヌクレオチド（即ちプライマー）を設計することであった。これらのプライマーをＰＣＲ反応で使用すると、真菌から推定デサチュラーゼ遺伝子に保存領域を含むフラグメントを同定することができた。真菌デサチュラーゼとしてはＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａからΔ５及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子（夫々Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５０、ＡＢ０２００３２）しか同定されていないので、これらの縮重プライマーの設計時には植物だけでなく動物からのデサチュラーゼ配列も考慮した。これらの縮重プライマーの設計には以下の生物からの公知Δ５及びΔ６−デサチュラーゼ配列を使用した。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及びＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ。使用した縮重プライマーは以下の通りであり、ＣＯＤＥＨＯＰ Ｂｌｏｃｋｍａｋｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を使用した。
【０１１５】
【化１】
【０１１６】
更に、公知Δ６−デサチュラーゼに存在する第２及び第３の保存「ヒスチジンボックス」に基づいて他の２種のプライマーを設計した。
【０１１７】
【化２】
【０１１８】
オリゴヌクレオチド配列の縮重コードはＢ＝Ｃ，Ｇ，Ｔ；Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｔ；Ｓ＝Ｃ，Ｇ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｄ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，又はＴ／Ｕ，不明又はその他とした。
【実施例２】
【０１１９】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
塩化リチウム法（Ｈｏｇｅら，Ｅｘｐ．Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（１９８２）６：２２５−２３２）を使用してＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）から全ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とキットに付属のオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを使用して全ＲＮＡ５μｇを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。
【０１２０】
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、上記縮重オリゴヌクレオチドの各種順列と組合せをＰＣＲ反応で使用した。試験した各種プライマー組合せのうちで明白なバンドを生じたプライマーはＲＯ８３４／ＦＯ８３８のみであった。第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ及び各プライマー２ｐｍｏｌを含有する１００μｌ容量中でＰＣＲ増幅を実施した。４２℃と４５℃の２種の異なるアニール温度で熱サイクルを実施し、これらの２種のＰＣＲ反応を組合せ、１．０％アガロースゲル上で分解し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して〜１００ｂｐバンドをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の仕様通りに使用してこれらのフラグメントの突出末端を「充填」し、これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０１２１】
こうして従来同定されているΔ６−デサチュラーゼに配列相同を示すクローン２個を単離した。これらのクローンは次のように説明される。
【０１２２】
ａ．クローン＃２０−２を部分配列決定した処、７０２ｂｐからの推定アミノ酸配列はＴｆａｓｔＡ検索における最高得点としてＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａからのΔ６−デサチュラーゼと３０．２％の一致を示した。
【０１２３】
ｂ．クローン＃３０−１を部分配列決定した処、６８７ｂｐの推定アミノ酸配列はＴｆａｓｔＡ検索における最高得点としてＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａのΔ６−デサチュラーゼと４８．５％の一致を示した。これらの２種の配列は相互にオーバーラップしており、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの単一推定Δ６−デサチュラーゼに属すると思われた。次にこの新規Δ６−デサチュラーゼ配列を使用し、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから全長Δ６−デサチュラーゼ遺伝子の３’及び５’末端を検索するためのプライマーを設計した。
【０１２４】
３’末端を単離するために、鋳型としてｃＤＮＡライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡとオリゴヌクレオチドＲＯ９２３（配列番号７）（５’−ＣＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。オリゴヌクレオチドＲＯ９２３はこの推定Δ６−デサチュラーゼの＃２０−２フラグメントに基づいて設計し、オリゴヌクレオチドＲＯ８９９はｃＤＮＡライブラリーの作製に使用したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターからの配列に対応する。各プライマー１０ｐｍｏｌとＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して増幅を実施した。試料をまず９４℃で３分間変性した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクル実施した。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。ＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分解し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の仕様通りに使用してこれらのフラグメントの末端を「充填」し、これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。クローンｓｄ２−２は９５８ｂｐインサートを含んでおり、公知Δ６−デサチュラーゼとの配列相同に基づいて推定Δ６−遺伝子の３’末端を含み、更に「ＴＡＡ」停止コドンとＰｏｌｙ Ａテールを含むことが確認された。
【０１２５】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａからこのΔ６−デサチュラーゼの５’末端を単離するために、先に同定した＃３０−１フラグメントの配列に基づいてオリゴヌクレオチドＲＴＯ９３９（配列番号９）（５’−ＣＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＣＣＧ−３’）を設計した。このオリゴヌクレオチドを（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターの配列に基づいて設計した）ＲＯ８９８（配列番号１０）（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）と併用し、ｃＤＮＡライブラリーからのΔ６−デサチュラーゼの５’末端をＰＣＲ増幅した。この場合には、このΔ６−デサチュラーゼの５’末端に存在すると予想されるＧＣリッチ領域が生じるというＰＣＲ増幅問題を解決するためにＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。ＰＣＲ熱サイクル条件は以下の通りとした。まず鋳型を９４℃で１分間変性した後、［９４℃で３０秒間、６８℃で３分間］３０サイクルを実施し、最後に６８℃で５分間の伸長サイクルを実施した。こうして得られたＰＣＲ産物を上記と同一のプロトコールに従ってＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。こうして新規Δ６−デサチュラーゼの「ＡＴＧ」開始部位を含む３６０ｂｐインサートを含むクローンｓｄ２１−２が得られた。このフラグメントの推定アミノ酸配列を公知Δ６−デサチュラーゼと整列させると、３７〜４５％の一致度を示した。
【０１２６】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ ｃＤＮＡライブラリー又はＳ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅によりこの新規Δ６−デサチュラーゼ遺伝子全体を単離した。
【０１２７】
【化３】
クローンｓｄ２１−２の５’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングを助長するためのＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド。
【０１２８】
【化４】
停止コドンを含むｓｄ２−２の３’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリープラスミド鋳型２００ｎｇと、各プライマー１０ｐｍｏｌと、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、又はゲノムＤＮＡ２００ｎｇと、各プライマー１０ｐｍｏｌと、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。熱サイクル条件は以下の通りとした。まず鋳型を９４℃で１分間変性した後、［９４℃で３０秒間、６８℃で３分間］３０サイクルを実施し、最後に６８℃で５分間の伸長サイクルを実施した。こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングしてクローンｐＲＳＰ１（ゲノムＤＮＡ由来）及びｐＲＳＰ２（ライブラリー由来）を作製した後、配列決定し、発現試験に使用した。
【０１３０】
Δ６−デサチュラーゼ全長遺伝子インサートは長さ１３６２ｂｐ（配列番号１３、図２）であり、最初のＡＴＧから開始し、４５３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。（Δ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０にプラスミドｐＲＳＰ１として寄託し、受託番号ＰＴＡ−２８２９を付与された。）全長遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１４、図３）はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ及びＢｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからのΔ６−デサチュラーゼに相同の領域を含んでいた。更に、全公知膜結合デサチュラーゼに存在する３個の保存「ヒスチジンボックス」（Ｏｄｕｌｅｙら，（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１４７−１５８）も含んでいた。これらはアミノ酸位置１７１〜１７６、２０８〜２１２及び３９１〜３９５に位置していた。他の膜結合Δ６−デサチュラーゼと同様に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼにおける第３のヒスチジンボックスモチーフ（ＨＸＸＨＨ）はＱＸＸＨＨであることが判明した。この配列は５’末端にシトクロムｂ５ドメインも含んでいた。このシトクロムｂ５ドメインは多数の膜結合デサチュラーゼ酵素に存在しており、シトクロムｂ５はこれらの酵素で電子供与体として機能すると考えられる。このドメインの存在はＰＵＦＡ生産のために異種系でデサチュラーゼを発現させるときに有利であると思われる。この遺伝子は植物でＰＵＦＡ生合成経路の再構成に使用することが提案されているので、この遺伝子の塩基組成は重要であると思われる。（組換え遺伝子のうちには宿主と塩基組成が異なるために発現しにくいものがあることは公知である。この遺伝子の総Ｇ＋Ｃ含量は５９％であり、植物での発現に成功しているＭ．ａｌｐｉｎａデサチュラーゼに近似する。）
【実施例３】
【０１３１】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）はアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ ｎ−３）の両者を生産するので、恐らくジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）をアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）に変換することが可能なΔ５−デサチュラーゼをもつと考えられた。
【０１３２】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからΔ５−デサチュラーゼを単離するには、Δ６−デサチュラーゼ単離と同様に第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として使用して縮重プライマーの各種組合せをＰＣＲ反応で使用した。最終反応容量５０μｌ中、第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ、各プライマー２ｐｍｏｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）１ＵのＰＣＲ条件を使用してプライマー対ＲＯ７５３及びＲＯ７５４で明白な５８８ｂｐバンドが得られた。熱サイクルは次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で１分間伸長を３５サイクル実施した。この後、７２℃で７分間の最終伸長を実施し、４℃で反応を終了した。こうして作製したこのフラグメントをクローニングし（クローン＃１８−１）、配列決定し、翻訳すると、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５４）とのアミノ酸一致度４３％と、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度３８．７％を示した。二次ＰＣＲフラグメントは実施例２に記載した反応でプライマーＲＯ８３４とＲＯ８３８を使用して同定した。約１０００ｂｐ長のこのフラグメントをクローニングした処（クローン＃２０−８）、７７５ｂｐに由来する推定アミノ酸配列はＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度４２％を示した。これらの２種の配列＃１８−１及び＃２０−８は相互にオーバーラップしており、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの単一推定Δ５−デサチュラーゼに属すると思われた。次にこれらの配列を使用し、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから新規Δ５−デサチュラーゼの３’及び５’末端を検索するためのプライマーを設計した。
【０１３３】
この推定Δ５−デサチュラーゼの３’末端を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチドＲＯ８５１（配列番号１５）（５’−ＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＴＧＣＧＡＴＣ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドＲＯ８５１はこの推定Δ５−デサチュラーゼの＃１８−１フラグメントに基づいて設計し、オリゴヌクレオチドＲＯ８９９はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターからの配列に対応する。鋳型プラスミドＤＮＡ２００ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌ及びＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して増幅を実施した。試料をまず９４℃で３分間変性した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３５サイクルを実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。ＰＣＲフラグメントを実施例２に記載したプロトコールに従ってＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。クローンｓｄ１２−１１は公知Δ５−デサチュラーゼとの配列相同に基づいて推定Δ５−遺伝子の３’末端を含み、更に「ＴＡＡ」停止コドンとポリＡテールを含む６４８ｂｐインサートを含んでいた。
【０１３５】
プライマーＲＯ９４１及びＲＯ８９８を使用してＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａからこのΔ５−デサチュラーゼの５’末端を単離した。このオリゴヌクレオチドＲＯ９４１（配列番号１６）（５’−ＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＣＧＡＡＣＧＴＧ−３’）は先に同定した＃２０−８フラグメントの配列に基づいて設計した。ｃＤＮＡライブラリープラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターの配列に基づいて設計した）ＲＯ８９８（配列番号１０）（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）と併用した。ここではＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用し、熱サイクル条件は以下の通りとした。初期変性を９４℃で１分間実施した後、［９４℃で３０秒間変性、６８℃で３分間アニーリング及び伸長］３０サイクルを実施し、６８℃で５分間の最終伸長サイクルを実施した。これらのＰＣＲ産物を上記と同様に精製し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、配列決定した。クローンｓｄ２４−１は新規Δ５−デサチュラーゼの推定「ＡＴＧ」開始部位を含む２９５ｂｐインサートを含むことが確認された。このフラグメントの推定アミノ酸配列を分析した処、公知Δ５−デサチュラーゼと相同性の高い領域を示し、シトクロムｂ５ドメインも存在することが判明した。
【０１３６】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅により全長Δ５−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。
【０１３７】
ａ．クローンｓｄ２４−１の５’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングを助長するためのＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含むＲＯ９５３（配列番号１７）（５’−ＡＣＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣ−３’）、及び
ｂ．停止コドンを含むｓｄ１２−１１の３’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングのためのＸｈｏＩ部位（下線部）を含むＲＯ９５６（配列番号１８）（５’−ＡＡＡＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣ−３’）。
【０１３８】
「全長」遺伝子のＰＣＲ増幅条件はゲノムＤＮＡからのΔ６−デサチュラーゼの増幅について記載したと同様とした（実施例２）。こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。クローンｐＲＳＰ３（ゲノムＤＮＡ由来）は１４１３ｂｐインサートを含むことが判明したので発現試験に使用した。
【０１３９】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの推定Δ５−デサチュラーゼの１４１３ｂｐ全長遺伝子（配列番号１９、図４）は４７１アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた（配列番号２０、図５）。（Δ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１月２３日付けで（プラスミドｐＲＳＰ３として）寄託し、受託番号ＰＴＡ−２９２８を付与された。）この翻訳蛋白質はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５４）とのアミノ酸一致度４０．５％と、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度３９．５％を示した。更に、アミノ酸位置１８６〜１９０、２２３〜２２８、４０６〜４１０に３個の保存「ヒスチジンボックス」も含んでいた。Δ６−デサチュラーゼと同様に、この配列は５’末端にシトクロムｂ５ドメインも含んでいた。この遺伝子の総Ｇ＋Ｃ含量は６１．５％であった。
【実施例４】
【０１４０】
パン酵母におけるＳ．ｄｉｃｌｉｎａデサチュラーゼ遺伝子の発現
ｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした全長Δ６−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＳＰ２と、ｐＹＸ２４２にクローニングした全長Δ５−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＳＰ３をコンピテントＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株３３４に形質転換した。酵母形質転換はＡｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を製造業者の指定した条件に従って使用して実施した。ロイシンを欠失する培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。これらのクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質５０μＭの存在下に形質転換体を増殖させた。
【０１４１】
ａ．ステアリン酸（１８：０）（オレイン酸への変換はΔ９−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４２】
ｂ．オレイン酸（１８：１）（リノレン酸への変換はΔ１２−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４３】
ｃ．リノレン酸（１８：２ ｎ−６）（α−リノレン酸への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４４】
ｄ．α−リノレン酸（１８：３ ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４５】
ｅ．ジホモγ−リノレン酸（２０：３ ｎ−３）（アラキドン酸への変換はΔ５−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４６】
陰性対照株は未変異ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４とし、同時に増殖させた。培養液を激しく撹拌し（２５０ｒｐｍ）、各種基質５０μＭ（終濃度）の存在下に２４℃で４８時間増殖させた。細胞をペレット化し、メタノール中でボルテックスし、クロロホルムと（内部標準として）トリトリデカノインを加えた。これらの混合物を室温で少なくとも１時間又は４℃で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウム１ｇを使用してＷｈａｔｍａｎフィルターで濾過し、粒状物と残留水を除去した。有機溶媒を窒素流下に４０℃で蒸発させた。次に、メタノール中０．５Ｎ水酸化カリウム２ｍｌを密閉管に加えることによりガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）に備えて抽出した脂質を脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。試料を９５℃〜１００℃まで３０分間加熱し、室温まで冷却した。メタノール中１４％三弗化ホウ素約２ｍｌを加え、加熱を繰返した。抽出した脂質混合物が冷却した後、水２ｍｌとヘキサン１ｍｌを加え、ＧＣ分析のためにＦＡＭＥを抽出した。産物を（産物＋添加基質）の和で割って１００を掛けることにより変換率を計算した。
【０１４７】
表１は添加基質の変換率に基づく単離遺伝子の酵素活性を示す。Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＰ１クローンは１８：２ｎ−６基質の２８％を１８：３ｎ−３に変換すると共に、１８：３ｎ−３基質の３７％を１８：４ｎ−３に変換した。これは遺伝子がΔ６−デサチュラーゼをコードすることを裏付けている。この場合にはバックグラウンド（基質の非特異的変換）はなかった。（本明細書に引用する表は末尾にまとめて示す。）
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＰ３クローンは加えた２０：３ｎ−６基質の２７％を２０：４ｎ−６に変換することができ、この遺伝子によりコードされる酵素がΔ５−デサチュラーゼであることを示している。この場合もバックグラウンド基質変換は検出されなかった。このデータは種々の基質特異性をもつデサチュラーゼを異種系で発現させることができ、更にポリ不飽和脂肪酸を生産するために使用できることを示している。
【０１４８】
表２は指定プラスミドを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４から抽出した全脂質の百分率として目的脂肪酸を示す。増殖培地にグルコースは加えなかった。アフィニティガスクロマトグラフィーを使用して各脂質を分離した。ＧＣ／ＭＳを利用して生成物を同定した。この表から明らかなように、外部から加えた基質は遊離形態で加えた場合には組換え酵母により取込まれ、その膜に取込まれる。Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を含む酵母クローン（ｐＲＳＰ１）では、ＬＡ（１８：２）を基質として加えた場合にＧＬＡ（γ−１８：３）が新規ＰＵＦＡとして同定され、ＤＧＬＡ（２０：３）を基質として加えた場合にはΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を含む酵母（ｐＲＳＰ３）でアラキドン酸が検出された。
【実施例５】
【０１４９】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母である酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にヒトエロンガーゼ遺伝子（配列番号２１）を含むクローンであるｐＲＡＥ７３−Ａ３でプラスミドｐＲＳＰ１（６Δ）及びｐＲＳＰ３（Δ５）を夫々同時形質転換した。このエロンガーゼ遺伝子はＰＵＦＡ経路の伸長段階の一部を触媒する。ロイシンとウラシルを欠失する最少培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］）で同時形質転換体を選択した。
【０１５０】
表３は基質ＬＡ（１８：２ ｎ−６）５０μＭを加えた場合にΔ６−デサチュラーゼがこの基質をＧＬＡ（１８：３ ｎ−６）に変換し、エロンガーゼがＧＬＡに炭素２個を加えてＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）を生産できることを示す。これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は２６．４％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。同様に、同時形質転換酵素はＡＬＡ（１８：３ｎ−３）に作用して最終的に変換率３４．３９％で（２０：４ｎ−３）を形成することができる。従って、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができた。
【０１５１】
表４はｐＲＳＰ３（Δ５）／ヒトエロンガーゼ同時形質転換実験の結果を示す。この場合には、基質ＧＬＡ（１８：３ ｎ−６）をヒトエロンガーゼによりＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換し、これをＳ．ｄｉｃｌｉｎａΔ５−デサチュラーゼの作用により更にＡＲＡ（２０：４ｎ−６）に変換した。これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は３８．６％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。
【０１５２】
この場合に試験した他の基質はＳＴＡ（１８：４ｎ−３）であり、２種の酵素の共同作用により最終的にＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換された。ｐＲＳＰ１とｐＲＳＰ３をＭ．ａｌｐｉｎａに由来するエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＳＰ２）（配列番号２２）で同時形質転換した場合にも同様の結果が観察され、両者遺伝子は相互の存在下に機能的であることが判明した（表３及び表４参照）。
【実施例６】
【０１５３】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
推定デサチュラーゼを単離するために、実施例２に記載したように全ＲＮＡを単離した。実施例２に示したようなＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して全ＲＮＡ約５μｇを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。５０μｌ反応でｂｌｏｃｋ ｍａｋｅｒプログラムで設計した縮重プライマーＲＯ８３４（配列番号１）及び８３８（配列番号４）を使用し、第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ、各プライマー２ｐｍｏｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を併用した。熱サイクルは次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で１分間伸長を３５サイクル実施した。この後、７２℃で７分間の最終伸長を実施した。１％アガロースゲル上で約１０００ｂｐの２つの弱いバンドを分離し、切出し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。実施例２に記載したように末端にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを充填し、平滑末端フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。得られたクローンを配列決定した処、クローン３０−９からの６８０ｂｐの部分配列が確認され、その２２６アミノ酸の翻訳はゼブラフィッシュ成魚からのΔ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＷ２８１２３８）とのアミノ酸一致度３１．５％であった。ヒトΔ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１２６７９９）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（コケ）Δ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２２２９８０）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）Δ８−スフィンゴ脂質デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２２４１６０）及びヒトΔ５−デサチュラーゼ（ＡＴＣＣ受託番号２０３５５７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９９５９６）とも同程度のアミノ酸相同度（２９．６％〜２８．７％）が認められた。公知デサチュラーゼと相当程度のアミノ酸相同度があったので、推定デサチュラーゼをコードする全長遺伝子について酵母発現時のその活性を求めた。
【０１５４】
遺伝子の３’末端を単離するために、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中反応容量１００μｌでＴ．ａｕｒｅｕｍ ｃＤＮＡライブラリーからの精製プラスミド１００ｎｇとの反応でプライマーＲＯ９３６（配列番号２３）（５’−ＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）１０ｐｍｏｌを併用した。熱サイクル条件は次のように実施した。９４℃で３分間の初期溶融後に９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で３分間を３０サイクル実施した。この後、７２℃で１０分間の伸長段階を実施した。１．２ｋｂの予想寸法を含む数個のバンドを上述のように１％アガロースゲル上で分離し、精製した。同じく上述のように、フラグメントの末端を平滑にし、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した。約１．２ｋｂのフラグメント＃７０−２を配列決定した処、フラグメント３０−９とオーバーラップするオープンリーディングフレームと停止コドンを含んでいた。
【０１５５】
遺伝子の５’末端を単離するために、ＲＯ９３７（配列番号２４）（５’−ＡＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）を５０μｌ ＰＣＲ反応で使用し、ライブラリーからの精製プラスミドＤＮＡ１００ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用した。熱サイクル条件は以下の通りとした。初期変性を９４℃で１分間実施した後、［９４℃で３０秒間変性、６８℃で３分間アニーリング及び伸長］３０サイクルを実施し、６８℃で５分間の最終伸長サイクルを実施した。予想寸法範囲にある約５００ｂｐのバンドを上述のようにゲル精製し、平滑末端化し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングした。クローン９５−２はオープンリーディングフレームと出発コドンを含んでいた。このフラグメントもクローン３０−９とオーバーラップしており、確かに同一遺伝子の部分であると思われた。
【０１５６】
全長遺伝子を単離するために、夫々ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断される制限部位３’及び５’（下線部）をもつ以下のプライマー、即ち５’プライマーＲＯ９７２（配列番号２５）（５’−ＡＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣ−３’）、３’プライマーＲＯ９４９（配列番号２６）（５’−ＣＴＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣ−３’）及び３’プライマーＲＯ９５０（配列番号２７）（５’−ＣＴＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＧＴＧＧＣ−３’）を設計した。停止コドンを含むプライマーＲＯ９４９はＧＣ含量６６％であるが、停止コドンの外側の別のプライマーＲＯ９５０はＧＣ含量が５６％しかないので、初期単離の試みでは遺伝子の３’末端に２種のプライマーを使用した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を前項で記載したと同一条件下で使用してＲＯ９７２／ＲＯ９４９及びＲＯ９７２／９５０により５０μｌ ＰＣＲ反応を実施した。ＲＯ９７２／９５０プライマー対のみが約１．６ｋｂのバンドを生じた。（標的１００ｎｇと同一条件で）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した場合にも同様の寸法のバンドが得られた。フラグメントを上述のようにアガロースゲル上で分離し、ゲル精製し、平滑末端化し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングした。フラグメントを配列決定により評価し、多数のクローンをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断して全長遺伝子を切出し、Ｒａｐｉｄライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で予め処理しておいたｐＹＸ２４２ ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩに連結した。クローン９９−３（ｐＲＴＡ４と言う）は１３１７ｂｐの全長遺伝子（配列番号２８、図６）と４３９ａａのオープンリーディングフレーム（配列番号２９、図７）を含んでいた。（Δ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１月２３日付けで寄託し、受託番号ＰＴＡ−２９２７を付与された。）この遺伝子はアミノ酸番号１７１〜１７５、２０８〜２１２、及び３７６〜３８０に３個のヒスチジンボックスを含んでいた。この遺伝子の５’末端を翻訳すると、シトクロムｂ５との相同を示す。
【実施例７】
【０１５７】
パン酵母におけるＴ．ａｕｒｅｕｍデサチュラーゼ遺伝子の発現
全長遺伝子を含むクローンｐＲＴＡ４を実施例４に記載したように酵母宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４に形質転換し、選択培地にプレーティングした。ロイシンを欠失する最少培地に基質として表５に示すように外因遊離脂肪酸５０μＭを加え、培養液を２４℃で４８時間増殖させた。基質変換はＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＡＲＡ（２０：４ｎ−６）のみであった。添加したＤＧＬＡの２３．７％が変換され、この遺伝子はΔ５−デサチュラーゼをコードすることがわかる。
【０１５８】
表６は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。Δ５−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド（酵母発現プラスミドＰＹＸ２４２を含む陰性対照で観察されるＡＲＡの検出）はなかった。
【実施例８】
【０１５９】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母発現ベクターｐＹＥＳ２に、ＰＵＦＡ経路の更なる酵素、ヒトエロンガーゼ遺伝子を含むｐＲＡＥ７３−Ａ３、でプラスミドｐＲＴＡ４を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。
【０１６０】
表７は基質ＤＧＬＡ１００μＭを加えた場合にΔ５−デサチュラーゼがＡＬＡを生産し、エロンガーゼがＡＬＡに炭素２個を加えてＡＤＡを生産できることを示す。ＡＲＡとＡＤＡ（産物）の両者から構成されるＴ．ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼの変換率は１６．７％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。
【０１６１】
以上の結果、Ｔ．ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができる。
【実施例９】
【０１６２】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｔ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマー対ＲＯ８３４／ＲＯ８３６を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｂｉｃｏｎ Ｉｎｄｉａ Ｌｔｄ．，Ｂａｎｇｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）からゲノムＤＮＡを調製した。プライマーＲＯ８３４（５’−ＧＴＢ ＴＡＹ ＧＡＹＧＴＢ ＡＣＣ ＧＡＲ ＴＧＧ ＧＴＢ ＡＡＧ ＣＧＹ ＣＡＹ ＣＣＢ ＧＧＨ ＧＧＨ−３’）（配列番号１）及びＲＯ８３８（５’−ＣＡＴ ＧＧＴ ＶＧＧ ＲＡＡ ＳＡＧ ＲＴＧ ＲＴＧ ＹＴＣ ＲＡＴ ＣＴＧ ＲＴＡ ＧＴＴ−３’）（配列番号３６）を使用してＴ７０９１ ｇＤＮＡを増幅した。単離Ｔ７０９１ ｇＤＮＡ ５μｌ、０．２ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液１０μｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕを含む１００μｌ容量中でＰＣＲ増幅を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加伸長段階を実施した。ＰＣＲ増幅混合物を１％アガロースゲル上で泳動させ、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して約１．２Ｋｂ及び１．４Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してこれらのフラグメントの突出末端を「充填」し、単離フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
【０１６３】
２４個のクローンを調製し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。翻訳配列をクエリーとして使用し、ｔＦａｓｔＡアルゴリズム（蛋白質クエリー配列と任意群のヌクレオチド配列の類似性に関するＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ検索）を使用してＧｅｎＥｍｂ１データベース（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を検索した。遺伝子フラグメントＴ７０９１Ｂ２は公知データベースと一致があったので更に調べた。Ｔ７０９１Ｂ２はヒトΔ５−デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２２５２７３）と３６２アミノ酸で一致度２６．８％であった。
【０１６４】
３’及び５’末端を単離するために、Ｔ７０９１Ｂ２内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。新規プライマーとベクタープライマーを使用して平均インサート寸法１Ｋｂのクローン約２×１０７個を含むＴ７０９１ ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ増幅した。ベクタープライマーＲＯ８９８（５’−ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ Ｇ−３’）（配列番号１０）及びＲＯ８９９（５’−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ−３’）（配列番号８）と併用した場合にクローンＴ７０９１Ｂ２でより多量の５’及び３’配列を生産したプライマーは夫々ＲＯ１０６５（５’−ＣＧＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＣＡ ＡＡＴ Ｃ−３’）（配列番号３７）及びＲＯ１０６４（５’−ＣＧＣＣＴＴ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＡＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＧＧ−３’）（配列番号３８）であった。Ｔ７０９１Ｂ２ ５’及び３’配列に基づいて２種の新規プライマーを設計した。
【０１６５】
ａ．付加ＮｃｏＩ制限部位（下線部）をもつＲＯ１０９７（５’−ＣＴＴ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＧＡＧ−３’）（配列番号３９）。
【０１６６】
ｂ．ＲＯ１０９８（５’−ＴＧＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＣＣ−３’）（配列番号４０）。
【０１６７】
この新規Δ５−デサチュラーゼはＴ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１ ｇＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅により全体を単離した。単離Ｔ７０９１ ｇＤＮＡ １μｌ、０．２μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを含む５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９５℃で４５秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で２分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ増幅混合物をゲル上で泳動させ、約１．３Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）ベクターにクローニングした。２個のクローンｐＲＡＴ−２ａ及び２ｃを作製し、配列決定した。（プラスミドｐＲＡＴ−２ｃはブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、受託番号を付与された。）配列は４アミノ酸が異なり（図１２）、翻訳配列はＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）Δ５−デサチュラーゼ（実施例６参照）と４３６アミノ酸で６７．４％一致度であった。
【実施例１０】
【０１６８】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｔ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Ｔ７０９１ ｃＤＮＡライブラリーからの３７３個の鋳型を配列決定し、ライブラリーの生存性を調べた。翻訳配列をクエリーとして使用し、ｔＦａｓｔＡアルゴリズムを使用してＧｅｎＥｍｂ１データベースを検索した。クローン６０２１８７２８１Ｒ１（又はクローン２８１と短縮）は数種の公知デサチュラーゼと一致していた。増幅用プライマーを設計するためにＥＳＴクローンの５’及び３’末端を配列決定した。付加ＮｃｏＩ制限部位（下線部）をもつプライマーＲＯ１１０７（５’−ＴＴＴ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＡＧ−３’）（配列番号４１）と、付加ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線部）をもつＲＯ１１０８（５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＴＧ−３’）（配列番号４２）を使用してＴ７０９１ ｇＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
【０１６９】
ＰＣＲは上述のようなＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む５０μｌ容量中で実施した。ＰＣＲ増幅混合物をゲル上で泳動させ、約１．３Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）ベクターにクローニングした。２個のクローンｐＲＡＴ−１ａ及び１ｂを作製し、配列決定した。配列は１アミノ酸が異なり（図１３）、翻訳配列はヒトΔ５−デサチュラーゼと４３０アミノ酸で２５％一致度であった。（プラスミドｐＲＡＴ−１ａはブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、ＡＴＣＣ受託番号―――を付与された。）
【実施例１１】
【０１７０】
パン酵母におけるＴ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１デサチュラーゼ遺伝子の発現
ｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした全長ヒトΔ５−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＡＴ−２ａ及びｐＲＡＴ−２ｃと、ｐＹＸ２４２にクローニングした全長ヒトΔ６−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂをコンピテントＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株３３４に形質転換した。酵母形質転換はＡｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して実施した。ロイシンを欠失する培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。ｐＲＡＴ−１ ｃＤＮＡの翻訳配列はどの特定公知デサチュラーゼとも強い一致がないので、数種の脂肪酸基質を試験して発現酵素の活性を調べた。ｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質１００μＭの存在下に形質転換体を増殖させた。
【０１７１】
ａ．リノレン酸（ＬＡ，１８：２ ｎ−６）（α−リノレン酸への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７２】
ｂ．α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７３】
ｃ．ω６−エシコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２ｎ−６）（ジホモγ−リノレン酸）への変換はΔ８−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７４】
ｄ．ジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−３）（アラキドン酸への変換はΔ５−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７５】
ｐＲＡＴ−２クローンの基質は１００μＭ ＤＧＬＡであった。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４を陰性対照として使用した。ｐＲＡＥ−７３−Ａ３（即ち１８Ｃ脂肪酸を２０Ｃ脂肪酸に変換するヒトエロンガーゼ酵素を含むベクター、配列番号２１）（実施例５参照）を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４にもｐＲＡＴ−１ａとｐＲＡＴ−２ｃの両者を同時形質転換した。ｐＲＡＴ−１ａ／ｐＲＡＥ−７３−Ａ３クローンの基質はＬＡとＡＬＡであり、ｐＲＡＴ−２ｃ／ｐＲＡＩ−７３−Ａ３クローンの基質はＬＡ、ＡＬＡ及びＧＬＡであった。培養液を特定基質の存在下に選択培地で４８時間２４℃で増殖させた。実施例４に要約したように脂肪酸分析を実施した。
【０１７６】
表８は株３３４（ｐＲＡＴ−２ｃ）によるＡＡ生産を対照株３３４（ｐＹＸ２４２）によるＡＡ生産と比較した例である。ＡＡ生産量は２２．９８％であったが、対照株では検出可能な量ではなかった。３３４（ｐＲＡＴ−２ａ）株も検出可能な量のＡＡを生産しなかった（データは示さず）。２個のクローン間の４個のアミノ酸の相違により（図１２、下線部参照）３３４（ｐＲＡＴ−２ａ）株から発現される酵素は不活性になった。ＧＬＡの存在下にｐＲＡＥ−７３−Ａ３と同時発現させると、更にクローンｐＲＡＴ−２ｃからのΔ５−デサチュラーゼ活性が検出された。
【０１７７】
表９は基質ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ及びＤＧＬＡの存在下に発現させた３３４（ｐＲＡＴ−１ａ）及び３３４（ｐＹＸ２４２）株の脂肪酸分析結果である。ＬＡのΔ６−不飽和化はＧＬＡを生産し、ＥＤＡのΔ８−不飽和化はＤＧＬＡを生産し、ＤＧＬＡのΔ５−不飽和化はＡＡを生産する。対照株に比較してＴ７０９１遺伝子を含む株ではどちらからも全３種の活性が検出された。変換率によると、この酵素は基質が適正であればΔ５又はΔ８−デサチュラーゼと同様に機能することができる活性なΔ６−デサチュラーゼである。しかし、これらから夫々の不飽和化脂肪酸への変換率はΔ６−不飽和化基質に比較すると低い。２個のクローン間の単一アミノ酸変異（図１３、下線部参照）は酵素活性に影響なかった（データは示さず）。変換率を表９の下欄に示す。更にｐＲＡＴ−１ａをＬＡ又はＡＬＡの存在下にｐＲＡＥ−７３−Ａ３と同時発現させた場合にもΔ６−デサチュラーゼ活性は検出された。新規脂肪酸の生産がデサチュラーゼの活性によるのかエロンガーゼの活性によるのか、あるいは２種の酵素の組合せによるのかを調べるのは困難であるので、同時発現実験では変換率を計算しなかった。
【０１７８】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１からデサチュラーゼ遺伝子を同定するために、２種の新規遺伝子単離方法が開発されている。これらの方法でＴ７０９１Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。これらの遺伝子と適当な基質の存在質に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは対照株よりも著しく高レベルの不飽和脂肪酸を生産した。Ｔ７０９１Ｂ２遺伝子（ｐＲＡＴ−２ｃ）とヒトエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＡＥ−７３−Ａ３）を含む構築物を酵母に同時軽質転換すると、基質ＧＬＡはＡＡに変換された。本実験の結果、ｐＲＡＴ−２ｃから発現した酵素は（エロンガーゼにより生産された）ＤＧＬＡをＡＡに不飽和化することが確認された。「２８１」遺伝子（ｐＲＡＴ−１ａ）とヒトエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＡＥ−７３−Ａ３）を含む構築物を酵母に同時軽質転換すると、基質ＬＡはＤＧＬＡに変換された。本実験の結果、ｐＲＡＴ−１ａから発現した酵素はＬＡをＧＬＡに不飽和化することが確認された。
【実施例１２】
【０１７９】
Ｉｓｏｃｈｒｙｓ ｇａｌｂａｎａ １３２３からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマー対ＲＯ８３４／ＲＯ８３６を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＩｓｏｃｈｒｙｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（ＣＣＭＰ），Ｗｅｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）からゲノムＤＮＡを調製した。プライマーＲＯ８３４（５’−ＧＴＢ ＴＡＹ ＧＡＹＧＴＢ ＡＣＣ ＧＡＲ ＴＧＧ ＧＴＢ ＡＡＧ ＣＧＹ ＣＡＹ ＣＣＢ ＧＧＨ ＧＧＨ−３’）（配列番号１）及びＲＯ８３８（５’−ＣＡＴ ＧＧＴ ＶＧＧ ＲＡＡ ＳＡＧ ＲＴＧ ＲＴＧ ＹＴＣ ＲＡＴ ＣＴＧ ＲＴＡ ＧＴＴ−３’）（配列番号１０）を使用してＩ．ｇａｌｂａｎａ ｇＤＮＡを増幅した。単離Ｉ．ｇａｌｂａｎａ ｇＤＮＡ １μｌ、０．２μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを含む５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９５℃で４５秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で２分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ増幅混合物を１．０％アガロースゲル上で泳動させ、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して約１．１Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してフラグメントの突出末端を「充填」し、単離フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
【０１８０】
６個のクローンを調製し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。全配列は同一であった。翻訳配列はクローンｐＲＴＡ４（実施例６）でＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）Δ５−デサチュラーゼと３３５アミノ酸で４７．５％一致度であり、クローンｐＲＡＴ−２ｃ（実施例９）でＴ．ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１Δ５−デサチュラーゼと２７８アミノ酸で一致度４５．３％であった。
【０１８１】
５’及び３’末端を単離するために、単離Ｉ．ｇａｌｂａｎａフラグメントの内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。遺伝子の５’末端にはＲＯ１２３５（５’−ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＧ−３’）（配列番号４３）を使用し、遺伝子の３’末端にはＲＯ１２３２（５’−ＧＡＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＧＴ−３’）（配列番号４４）を使用した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（登録商標）酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に付属のｃＤＮＡ末端の迅速増幅又はＲＡＣＥと供に全ＲＮＡ約１．４μｇを製造業者の指示に従って使用して逆転写し、ｃＤＮＡターゲットを生産した。末端の初期増幅には、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクルプロトコールを実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で３０秒間と７２℃で３分間を１０サイクル、更に９４℃で３０秒間と６８℃で３０秒間と７２℃で３分間を２０サイクル実施した後、７２℃で１０分間の伸長を実施した。この一次ＰＣＲ反応は１０ｐｍｏｌＲＯ１２３５又はＲＯ１２３２と、夫々ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）５’プライマー（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号４５）又はＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）３’プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号４６）と、Ｔｈｅｒｍｏｚｙｍｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１ｌと、ｃＤＮＡ１μｌを最終容量５０μｌ中で製造業者の指示に従って使用して実施した。
【０１８２】
初期反応物２μｌ、入れ子プライマーＲＯ１２３４（５’−ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＧＣ ＡＧ−３’）（配列番号４７）又はＲＯ１２３３（５’−ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ−３’）（配列番号４８）１０ｐｍｏｌと夫々ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）入れ子５’プライマー（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号４９）及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）入れ子３’プライマー（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号５０）３０ｐｍｏｌと、ＭｇＳＯ４を使用するＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（登録商標）ＰＣＲｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して入れ子反応を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクルパラメーターを実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で２分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で２分間を５サイクル、更に９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と６８℃で２分間を２０サイクル実施した後、６８℃で１０分間の伸長を実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル分析した処、５’反応で約８００ｂｐのバンドと３’反応で約１．２ｋｂのバンドが検出された。次いでＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、Ｔｏｐ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、配列決定した処、開始コドンと停止コドンの両者をもつオープンリーディングフレームが検出された。
【０１８３】
クローニング用制限部位（夫々下線で示したＥｃｏＲＩとＳａｌＩ）を付加したプライマーＲＯ１３０９（５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＣ−３’）（配列番号５１）及びＲＯ１３１０（５’−ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＡ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧ−３’）（配列番号５２）を使用して全長遺伝子を単離した。上述のように、ｃＤＮＡ２μｌをターゲットとしてＭｇＳＯ４を使用するＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（登録商標）ＰＣＲｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って１０ｐｍｏｌのプライマーＲＯ１３０９及び１３１０と共に使用した。熱サイクルパラメーターは以下の通りで実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で２分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で２分間を５サイクル、更に９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と６８℃で２分間を２０サイクル実施した後、６８℃で１０分間の伸長を実施した。ＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して反応の単一生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、Ｒａｐｉｄライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してｐＹＸ２４２ ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ直鎖化ＤＮＡに連結し、ｐＲＩＧ−１と命名した。クローンｐＲＩＧ−１は１３２９ｂｐの全長遺伝子（配列番号３４、図１４）と４４２アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号３５、図１５）を含んでいた。（プラスミドｐＲＩＧ−１はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、ＡＴＣＣ受託番号―――を付与された。）
【実施例１３】
【０１８４】
パン酵母におけるＩ．ｇａｌｂａｎａデサチュラーゼ遺伝子の発現
全長遺伝子を含むクローンｐＲＩＧ−１を実施例４に記載したように酵母宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４に形質転換し、選択培地にプレーティングした。ロイシンを欠失する最少培地に基質として表１０に示すように外来遊離脂肪酸５０μＭを加え、培養液を２４℃で４８時間増殖させた。基質変換はＥＴＡ（２０：４ｎ−３）からＥＰＡ（２０：５ｎ−３）とＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＡＡ（２０：４ｎ−６）であった。ＡＲＡへの変換率４５．４％、ＥＰＡへの変換率５９．７５％であり、この遺伝子はΔ５−デサチュラーゼをコードすることがわかる。表１０は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。Δ５−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド（酵母発現プラスミドｐＹＸ２４２を含む陰性対照で観察されるＡＲＡ又はＥＰＡの検出）は殆ど又は全くなかった。
【実施例１４】
【０１８５】
Ｉ．ｇａｌｂａｎａデサチュラーゼ遺伝子とエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にヒトエロンガーゼ遺伝子を含むＰＵＦＡ経路付加酵素ｐＲＡＥ７３−Ａ３でプラスミドｐＲＩＧ−１を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。ＤＧＬＡやＥＴＡ等の基質を加えると、Δ５−デサチュラーゼは活発にＡＲＡ又はＥＰＡを生成し、エロンガーゼが炭素２個を加えてＡＤＡ又は３−ＤＰＡを生産できる。従って、Ｉ．ｇａｌｂａｎａΔ５−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができる。
【０１８６】
栄養組成物
詳細な説明に記載したＰＵＦＡは種々の栄養補給剤、乳児用調製粉乳、代用栄養剤及び他の栄養溶液で利用することができる。
【０１８７】
Ｉ．乳児用調製粉乳
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合調製豆乳：
用途：牛乳アレルギー又は過敏症の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖を避けなければならない疾患（ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症及びガラクトース血症）の患者への栄養。
【０１８８】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０１８９】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、０第三リン酸カルシウム．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９０】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用調製豆乳：
用途：乳幼児の下痢の食物管理用短期摂取食。
【０１９１】
特徴：
−特に下痢管理用として大豆繊維からの食物繊維を加えた最初の乳児用調製乳である。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に判明した。
−乳児の栄養要件を満足するように栄養学的に完全である。
−Ｌ−メチオニンを添加した大豆蛋白単離物は乳児の全必須アミノ酸の必要値を満足するか又はこれを上回る。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−米国小児科学会栄養委員会により推奨され、乳児用調製乳法に規定されるビタミン及びミネラル値を満足するか又はこれを上回る。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
【０１９２】
成分：（パルベ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖質（蔗糖）２．５％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９３】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦ鉄分入り無蔗糖調製豆乳：
用途：牛乳蛋白アレルギーもしくは過敏症又は蔗糖不耐の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖と蔗糖を避けなければならない疾患の患者への栄養。
【０１９４】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした（炭水化物源はＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）グルコースポリマーである）。
−蔗糖不耐患者のために無蔗糖とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（１８０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０１９５】
成分：（パルベ）水７５％、加水分解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆蛋白単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラギナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９６】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０即製鉄分配合調製豆乳、２０Ｃａｌ／液量オンス：
用途：大豆摂取を必要とする場合。
【０１９７】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９８】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用調製乳：
用途：乳児用調製乳を必要とする場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、又は授乳を採用しない際の日常食として。
【０１９９】
特徴：
−良好な成長に適した品質と量の蛋白質を使用すると共に、熱変性により乳関連腸内失血の危険を減らした。
−（二重均質化）植物油ブレンドに由来する脂肪を使用し、吸収し易い必須リノレン酸を提供する。
−人乳に似た割合の乳糖としての炭水化物を配合した。
−成長中の臓器へのストレスを最小限にするために低腎溶質負荷とした。
−粉末、濃厚液及び即製形態。
【０２００】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、乳糖、大豆油、ヤシ油、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラギナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２０１】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ鉄分入り早産児用調製乳：
用途：退院後の早産児の特殊栄養要件を満たす。Ｓｉｍｉｌａｃ ＮｅｏＣａｒｅは成長の遅れを取り戻し、成長を助けるために必要な付加熱量、蛋白質、ビタミン及びミネラルを提供するために開発された栄養学的に完全な処方である。
【０２０２】
特徴：
−熱量とビタミン補給の必要を減らす。標準処方（２０Ｃａｌ／液量オンス）よりも高熱量（２２Ｃａｌ／液量オンス）。
−早産児の特殊消化要件を満足し易くするために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を加えた高吸収脂肪ブレンドを使用した。
−入院中に開始した栄養補給を延長するためにより高値の１００カロリー当たり蛋白質、ビタミン及びミネラルを配合した。
−骨無鉱化を改善するためにカルシウム及びリン濃度を高くした。
【０２０３】
成分：−Ｄコーンシロップ固形分、脱脂乳、乳糖、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、高オレイン酸サフラワー油、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、βカロチン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２０４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ即製低鉄分母乳強化剤、２４Ｃａｌ／液量オンス：
用途：母乳と混合するか又は出産時体重の少ない乳児に母乳の代用として与える。
【０２０５】
成分：−Ｄ水、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、乳糖、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム及びシアノコバラミン。
【０２０６】
本発明の種々のＰＵＦＡは上記乳児用調製乳及び当分野で公知の他の乳児用調製乳に代用及び／又は添加することができる。
【０２０７】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。主に経口補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２０８】
患者状態：
−調整食摂取患者、
−危険な栄養状態にある高齢者、
−不随意体重減少患者、
−病気又は手術から回復中の患者、
−低残渣食が必要な患者。
【０２０９】
成分：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム。
【０２１０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは食間又は食事と共に補充する完全にバランスのとれた補助栄養である。他のスナック菓子に代用する美味しく栄養分の高い代用食である。ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは１本当たり乳糖含有量が＜１ｇであり、チョコレートファッジブラウニーフレーバーは無グルテンである。（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含む。）
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者。
−十分な熱量と栄養を取込めない者に特に有用である。
−噛む能力と飲込む能力のある者。
−落花生アレルギー又は任意型のナッツアレルギーのある者には使用できない。
【０２１１】
成分：ハニーグラハムクランチ−高果糖コーンシロップ、大豆蛋白単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（トウモロコシ）、クリスプライス（米粉、糖質［蔗糖］、食塩［塩化ナトリウム］及び麦芽）、オート麦ぬか、部分加水分解解綿実油及び大豆油、大豆多糖、グリセリン、濃縮ホエイ蛋白、ポリデキストロース、果糖、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、大豆レシチン及びコーン油。ナッツを加工する施設で製造。
【０２１２】
ビタミン及びミネラル：第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、食塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、βカロチン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２１３】
蛋白質：ハニーグラハムクランチ−蛋白源は大豆蛋白単離物と乳蛋白のブレンドである。
大豆蛋白単離物 ７４％
乳蛋白 ２６％。
【０２１４】
脂肪：ハニーグラハムクランチ−脂肪源は部分加水分解綿実油、大豆油、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油及び大豆レシチンのブレンドである。
部分加水分解綿実油及び大豆油 ７６％
キャノーラ油 ８％
高オレイン酸サフラワー油 ８％
コーン油 ４％
大豆レシチン ４％。
【０２１５】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ−炭水化物源は高果糖コーンシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖及びオート麦ぬかの組合せである。
高果糖コーンシロップ ２４％
ブラウンシュガー ２１％
マルトデキストリン １２％
蜂蜜 １１％
クリスプライス ９％
グリセリン ９％
大豆多糖 ７％
オート麦ぬか ７％。
【０２１６】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは食事に付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする者のための濃縮高蛋白液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは無乳糖無グルテンであり、一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者や、ストレス潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０２１７】
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者、例えば一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者、ストレス潰瘍の危険のある患者及び低コレステロール食患者。
【０２１８】
特徴：
−低飽和脂肪、
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−濃厚でクリーミーな食感、
−優良な蛋白、カルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源、
−低コレステロール食用、
−無乳糖で消化し易い。
【０２１９】
成分：
バニラシュプリーム：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２２０】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８５％
大豆蛋白単離物 １５％。
【０２２１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及び大豆油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
キャノーラ油 ３０％
大豆油 ３０％。
【０２２２】
ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪６ｇは総熱量の２４％に相当し、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸に由来し、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２２３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラシュプリーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー及びバナナ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２２４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ６０％
マルトデキストリン ４０％。
【０２２５】
チョコレート：
蔗糖 ７０％
マルトデキストリン ３０％。
【０２２６】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを目的とする低脂肪液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２２７】
患者状態：
−ＥＮＳＵＲＥよりも脂肪が５０％少なく、熱量が２０％少ない補給剤で付加栄養を必要とする正常体重又は超過体重患者。
−食事が適正ではなく、付加栄養を必要とする健康な成人。
【０２２８】
特徴：
−低脂肪及び低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪３ｇ、コレステロール＜５ｍｇ。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良なカルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２２９】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラギナン、食塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３０】
蛋白質：蛋白源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム １００％。
【０２３１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油とキャノーラ油の２種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ７０％
キャノーラ油 ３０％。
【０２３２】
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の脂肪３ｇは総熱量の１３．５％に相当し、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸に由来し、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２３３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２３４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ５１％
マルトデキストリン ４９％。
【０２３５】
チョコレート：
蔗糖 ４７．０％
コーンシロップ ２６．５％
マルトデキストリン ２６．５％。
【０２３６】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴの１回分８液量オンスは２４種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも２５％を提供する。
【０２３７】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン２．１ｍｇを含有している。
【０２３８】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする場合に使用する高熱量低残渣液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは無乳糖無グルテンである。主に経口栄養補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２３９】
患者状態：
−量を制限しながら通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする患者。
−体重増加又は健康体重の維持を必要とする患者。
【０２４０】
特徴：
−濃厚でクリーミーな食感、
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
【０２４１】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２４２】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高２い種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８４％
大豆蛋白単離物 １６％。
【０２４３】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油 １００％。
【０２４４】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、ストロベリー、コーヒー、バターピーカン及びエッグノッグ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２４５】
バニラ、ストロベリー、バターピーカン、及びコーヒーフレーバー：
コーンシロップ ３９％
マルトデキストリン ３８％
蔗糖 ２３％。
【０２４６】
チョコレート及びエッグノッグフレーバー：
コーンシロップ ３６％
マルトデキストリン ３４％
蔗糖 ３０％。
【０２４７】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳの１回分８液量オンスは２５種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも１５％を提供する。
【０２４８】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン３．１ｍｇを含有している。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含有している。
【０２４９】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは熱量及び蛋白必要値が高いか又は耐容量の低い者を対象とした栄養学的に完全な高熱量高窒素液体食品である。経口補充用として使用してもよいし、完全経管栄養補充用として使用してもよい。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは無乳糖無グルテンである。
【０２５０】
患者状態：
−手術又は怪我後のように熱量及び蛋白必要値 が高い患者。
−耐容量が低い早期満腹患者。
【０２５１】
特徴：
−補助又は完全栄養、
−経口又は経管供給、
−１．５ＣａＶｍＬ、
−高窒素、
−高熱量密度。
【０２５２】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、カラギナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２５３】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成）は経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２５４】
患者状態：
−調整食摂取患者、
−危険な栄養状態にある高齢者、
−病気／手術から回復中の患者、
−低残渣食が必要な患者。
【０２５５】
特徴：
−混合し易く簡便、
−低飽和脂肪、
−１回分当たり総脂肪９ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−高ビタミン及びミネラル、
−低コレステロール食用、
−無乳糖で消化し易い。
【０２５６】
成分：−Ｄコーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、大豆蛋白単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２５７】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８４％
大豆蛋白単離物 １６％。
【０２５８】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油 １００％。
【０２５９】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲはコーンシロップとマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲのマイルドな甘味にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２６０】
バニラ：
コーンシロップ ３５％
マルトデキストリン ３５％
蔗糖 ３０％。
【０２６１】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは食事と共にもしくは食間に使用する非液体形態でバランスのとれた栄養を提供する濃厚栄養補給剤である。コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）や、飲込み障害のある者に適している。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは無グルテンである。
【０２６２】
患者状態：
−コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）摂取患者、
−飲込み障害のある患者。
【０２６３】
特徴：
−濃厚でクリーミーな良好な食感、
−良好な必須ビタミン及びミネラル源、
−冷蔵不要で簡便、
−無グルテン。
【０２６４】
５オンス当たり栄養プロフィル：熱量２５０、蛋白１０．９％、総脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０２６５】
成分：
バニラ：−Ｄ脱脂乳、水、糖質（蔗糖）、部分水素化大豆油、改質食物澱粉、硫酸マグネシウム、ラクチル酸ステアロイルナトリウム、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２６６】
蛋白質：蛋白源は脱脂乳である。
脱脂乳 １００％。
【０２６７】
脂肪：脂肪源は水素化大豆油である。
水素化大豆油 １００％。
【０２６８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは蔗糖と改質食物澱粉の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、バタースコッチ及びタピオカ）で風味低下を防止する。製品は１回分当たり乳糖９．２ｇを含有している。
【０２６９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ５６％
乳糖 ２７％
改質食物澱粉 １７％。
【０２７０】
チョコレート：
蔗糖 ５８％
乳糖 ２６％
改質食物澱粉 １６％。
【０２７１】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは強化食物繊維及び栄養を利用できる者を対象とした栄養学的に完全な繊維含有液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは低残渣食を必要としない者に適している。経口又は経管供給することができ、通常食の栄養補給剤として又は適量を代用食として使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２７２】
患者状態：
−強化食物繊維及び栄養を利用できる患者。
【０２７３】
特徴：
−低飽和脂肪、高ビタミン及びミネラルの新規改良処方、
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−濃厚でクリーミーな食感、
−良好な繊維源、
−優良な必須ビタミン及びミネラル源、
−低コレステロール食用、
−無乳糖無グルテン。
【０２７４】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、オート麦繊維、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、大豆蛋白単離物、大豆油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然及び人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラギナン、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７５】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８０％
大豆蛋白単離物 ２０％。
【０２７６】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及びコーン油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
キャノーラ油 ４０％
コーン油 ２０％。
【０２７７】
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の脂肪６ｇは総熱量の２２％に相当し、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸に由来し、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量≦３０％、飽和脂肪酸由来熱量≦１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２７８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート及びバターピーカン）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２７９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン ６６％
蔗糖 ２５％
オート麦繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０２８０】
チョコレート：
マルトデキストリン ５５％
蔗糖 ３６％
オート麦繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０２８１】
繊維：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲで使用している繊維ブレンドはオート麦繊維と大豆多糖から構成される。このブレンドの結果、８液量オンス缶当たり総食物繊維約４ｇである。不溶性繊維と可溶性繊維の比は９５：５である。
【０２８２】
上記各種栄養補給剤は当業者に公知であり、本発明により製造したＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０２８３】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤
ＯｘｅｐａはＡＲＤＳ患者又はその危険のある患者の食事管理を目的とする低炭水化物高密度熱量経腸栄養製剤である。エイコサペンタエン酸（魚油由来ＥＰＡ）、γ−リノレン酸（リルヂサ油由来ＧＬＡ）及び高濃度酸化防止剤を含有する特許油ブレンドを含む特殊な成分組合せをもつ。
【０２８４】
熱量分布：熱量密度はエネルギー要求を満たすために必要な容量を最小にするように高く、１．５Ｃａｌ／ｍＬ（３５５Ｃａｌ／８液量オンス）である。Ｏｘｅｐａの熱量分布を表Ａに示す。
【０２８５】
【表１】
【０２８６】
脂肪：
−Ｏｘｅｐａは１回分８液量オンス当たり脂肪含有量２２．２ｇ（９３．７ｇ／Ｌ）である。
−脂肪源はキャノーラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ボレージ油２０％、魚油２０％、及び大豆レシチン３．２％からなる油ブレンドである。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィルを表Ｂに示す。
−Ｏｘｅｐａは表ＶＩに示すようにバランスのとれた量のポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸を提供する。
−脂肪ブレンドの２５％に相当する中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されずに腸管に吸収されるので胃を空にし易い。
【０２８７】
Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製品の各種脂肪酸成分は本発明により製造したＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０２８８】
【表２】
脂肪酸は総脂肪の約９５％である。
【０２８９】
表Ｃ．Ｏｘｅｐａの脂肪プロフィル
脂肪由来総熱量％ ５５．２
ポリ不飽和脂肪酸 ３１．４４ｇ／Ｌ
モノ不飽和脂肪酸 ２５．５３ｇ／Ｌ
飽和脂肪酸 ３２．３８ｇ／Ｌ
ｎ−６対ｎ−３比 １．７５：１
コレステロール ９．４９ｍｇ／８液量オンス
４０．１ｍｇ／Ｌ。
【０２９０】
炭水化物：
−炭水化物含量は１回分８液量オンス当たり２５．０ｇ（１０５．５ｇ／Ｌ）である。
−炭水化物源はマルトデキストリン（複合炭水化物）４５％と蔗糖質（単糖）５５％であり、いずれも消化吸収し易い。
−Ｏｘｅｐａは二酸化炭素（ＣＯ２）生産を最小にするように高脂肪低炭水化物である。ＣＯ２濃度が高いと、人工呼吸器依存患者の離乳が難しくなる可能性がある。低炭水化物濃度はストレス性高血糖症患者にも有用であると思われる。
−Ｏｘｅｐａは無乳糖である。
【０２９１】
食物炭水化物、蛋白由来アミノ酸及び脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換することができる。この過程を通してグルコース依存組織（例えば中枢神経系や赤血球）の炭水化物必要量は満たされる。しかし、炭水化物を除去した食事では組織蛋白の過剰異化であるケトーシスや、水分及び電解質低下を生じる恐れがある。これらの影響は熱量摂取量が適切であるならば、食用炭水化物を毎日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。エネルギー必要量を満足しているならばＯｘｅｐａの炭水化物値は糖新生を最小にするにも十分である。
【０２９２】
蛋白：
−Ｏｘｅｐａは１回分８液量オンス当たり１４．８ｇ（６２．５ｇ／Ｌ）の蛋白を含有している。
−総熱量窒素比（１５０：１）はストレス患者の必要量を満たす。
−Ｏｘｅｐａは呼吸問題を悪化せずに同化と除脂肪体重の維持を助長するために十分な蛋白を提供する。高蛋白摂取量は呼吸不全患者で問題となる。蛋白はＣＯ２生産に殆ど影響しないが、高蛋白食は換気欲求を増す。
−Ｏｘｅｐａの蛋白源はカゼイン酸ナトリウム８６．８％とカゼイン酸カルシウム１３．２％である。
−Ｏｘｅｐａの蛋白系のアミノ酸プロフィルは米国科学アカデミーにより設定された高品質蛋白標準を満たすか又はそれを上回る。
【０２９３】
＊Ｏｘｅｐａは無グルテンである。
【０２９４】
【表３】
【０２９５】
【表４】
【０２９６】
【表５】
【０２９７】
【表６】
【０２９８】
【表７】
【０２９９】
【表８】
【０３００】
【表９】
【０３０１】
【表１０】
【０３０２】
【表１１】
【０３０３】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【０３０４】
【図１】脂肪酸生合成経路と、この経路におけるΔ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼの役割を示す。
【図２】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図３】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ６−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図４】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
【図５】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ５−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図６】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。
【図７】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図８】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図９】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼの翻訳アミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図１０】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。
【図１１】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼの翻訳アミノ酸配列（配列番号３３）を示す。
【図１２】ｐＲＡＴ−２ａ及びｐＲＡＴ−２ｃクローン間のΔ５−デサチュラーゼアミノ酸配列一致度を示す。
【図１３】ｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂクローン間のΔ６−デサチュラーゼアミノ酸配列一致度を示す。
【図１４】Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３からのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す。
【図１５】Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３からのΔ５−デサチュラーゼからの翻訳アミノ酸配列（配列番号３５）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａΔ５−デサチュラーゼ、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼ及びＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａΔ５−デサチュラーゼ）をコードする遺伝子の同定と単離に関する。特に、Δ５−デサチュラーゼは例えばジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）からアラキドン酸（ＡＡ）及び（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）からエイコサペンタエン酸（２０：５ｎ−３）への変換を触媒する。Δ６−デサチュラーゼは例えばα−リノレン酸（ＡＬＡ）からステアリドン酸（ＳＴＡ）への変換を触媒する。この変換産物はその後、他のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の生産における基質として利用することができる。この産物又は他のポリ不飽和脂肪酸は医薬組成物、栄養組成物、動物飼料及び他の製品（例えば化粧品）に添加することができる。
【背景技術】
【０００２】
デサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）は多数の重要な機能をもつ長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。例えばポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は細胞膜の主要成分であり、リン脂質形態で存在する。哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン及びプスタグランジンの前駆物質としても機能する。更に、ＰＵＦＡは発育中の乳児脳の適正な発育と組織形成及び修復に必要である。ＰＵＦＡの生物学的意義に鑑み、ＰＵＦＡとその中間体を効率的に生産する試みがなされている。
【０００３】
ＰＵＦＡ生合成にはΔ５−デサチュラーゼとΔ６−デサチュラーゼ以外に多数の酵素が関与している。例えば、エロンガーゼ（ｅｌｏ）はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）からジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）への変換とステアリドン酸（１８：４ｎ−３）から（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。リノレン酸（ＬＡ，１８：２−Δ９，１２又は１８：２ｎ−６）はオレイン酸（１８：１−Δ９）からΔ１２−デサチュラーゼにより生産される。ＧＬＡ（１８：３−Δ６，９，１２）はリノレン酸からΔ６−デサチュラーゼにより生産される。
【０００４】
動物はΔ９位を越えて不飽和化することができないため、オレイン酸をリノレン酸に変換できないことに留意すべきである。同様に、α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３−Δ９，１２，１５）は哺乳動物により合成することができない。他方、α−リノレン酸は哺乳動物と藻類でΔ６−デサチュラーゼによりステアリドン酸（ＳＴＡ，１８：４−Δ６，９，１２，１５）に変換され（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１３５９１とＴｈｅ Ｆａｓｅｂ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ３０９３，ｐａｇｅ Ａ５３２（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９８，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ａｐｒｉｌ １８−２２，１９８８）参照、米国特許第５，５５２，３０６号も参照）、その後、（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（２０：４−Δ８，１１，１４，１７）まで伸長することができる。このポリ不飽和脂肪酸（即ち２０：４−Δ８，１１，１４，１７）はその後、本発明の酵素のようなΔ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５−Δ５，８，１１，１４，１７）に変換することができる。真菌類や植物等の他の真核生物は炭素１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１５１６及び米国特許第５，４４３，９７４号参照）と炭素１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１１２４５参照）で不飽和化する酵素をもつ。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食物及び／又はリノレン酸もしくはα−リノレン酸の不飽和化と伸長から誘導される。これらの問題に鑑み、これらの脂肪酸を天然に生産する種からＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離し、商業的量の１種以上のＰＵＦＡを生産できるように改変可能な微生物、植物又は動物系でこれらの遺伝子を発現させることは非常に有益である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した最も重要な長鎖ＰＵＦＡの１種はアラキドン酸（ＡＡ）である。ＡＡは糸状菌に含まれており、肝臓や副腎等の哺乳動物組織からも精製できる。上述したように、ジホモ−γ−リノレン酸からのＡＡ生産はΔ５−デサチュラーゼにより触媒される。ＥＰＡも重要な長鎖ＰＵＦＡである。ＥＰＡは真菌類に含まれ、魚油にも含まれている。上述したように、ＥＰＡは（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸から生産され、Δ５−デサチュラーゼにより触媒される。上記に鑑み、Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ酵素、これらの酵素をコードする各遺伝子、並びにこれらの酵素の組換え生産方法が明白に必要である。更に、天然濃度よりも高濃度のＰＵＦＡを含有する油類と、新規ＰＵＦＡを高度に含有する油類も必要である。このような油類はΔ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の単離と発現によってしか製造することができない。
【０００６】
本明細書に引用する全米国特許、優先権文献及び刊行物はその内容全体を参考資料として本明細書に組込む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は配列番号１３（図２）、配列番号１９（図４）、配列番号２８（図６）、配列番号３０（図８）、配列番号３２（図１０）及び配列番号３４（図１４）を含むヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はフラグメントに関する。特に、単離ヌクレオチドは配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４により表すことができる。これらの配列はポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードすることができる。
【０００８】
更に、本発明はデサチュラーゼ活性をもち、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５から構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の一致度又は類似度をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列又はフラグメントに関する。
【０００９】
ヌクレオチド配列は例えばＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（配列番号１３及び配列番号１９）もしくはＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（配列番号２８、配列番号３０及び配列番号３２）等の真菌類又はＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ（配列番号３４）等の藻類から得られる。
【００１０】
本発明は上記ヌクレオチド配列によりコードされる精製蛋白質又はポリペプチド（配列番号１４（図３）、配列番号２０（図５）、配列番号２９（図７）、配列番号３１（図９）、配列番号３３（図１１）及び配列番号３５（図１５））にも関する。
【００１１】
更に、本発明は、炭素５又は炭素６のポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記精製蛋白質のアミノ酸配列（即ち配列番号１４、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５）に少なくとも約５０％のアミノ酸一致度又は類似度をもつ精製ポリペプチドにも関する。
【００１２】
更に、本発明はデサチュラーゼ（即ちΔ５又はΔ６）の製造方法にも関する。本方法はａ）配列番号１９、配列番号２８、配列番号１３、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４を適宜含むヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）ｉ）単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したｉｉ）プロモーター又は所定型の調節配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）適宜Δ５−デサチュラーゼ又はΔ６−デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階を含む。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。特に、原核細胞は例えば大腸菌、藍色細菌又は枯草菌とすることができる。真核細胞は例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＰｉｃｈｉａ種）とすることができる。
【００１３】
更に、本発明はａ）配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４により表されるヌクレオチド配列と、ｂ）これに作動的に連結したプロモーター又は調節配列を含むベクターにも関する。本発明はこのベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は例えば真核細胞又は原核細胞とすることができる。利用可能な真核細胞及び原核細胞は上記に記載した通りである。
【００１４】
更に、本発明は上記ベクターを含む植物細胞、植物又は植物組織であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、植物細胞、植物又は植物組織により少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸が生産される前記植物細胞、植物又は植物組織にも関する。ポリ不飽和脂肪酸は例えばヌクレオチド配列がΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼのいずれをコードするかに応じて例えばＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡから構成される群から選択することができる。本発明は上記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は植物酸にも関する。
【００１５】
更に、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物であって、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、トランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸が生産される前記トランスジェニック植物にも関する。
【００１６】
更に、本発明は上記ベクターを含む哺乳動物細胞であって、例えばＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡから構成される群から選択される脂肪酸を含む培地で細胞を増殖させると、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果、ＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及び／又はＳＴＡの生産レベルが変化する前記哺乳動物細胞にも関する。
【００１７】
本発明はプロモーター又は調節配列に作動的に連結したΔ５−デサチュラーゼ又はΔ６−デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関することにも留意すべきである。ＤＮＡ配列は配列番号１３（Δ６）、配列番号１９（Δ５）、配列番号２８（Δ５）、配列番号３０（Δ５）、配列番号３２（Δ６）及び配列番号３４（Δ５）により表すことができる。更に、本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物により生産され、検出可能な濃度の少なくともΔ５−デサチュラーゼ又は少なくともΔ６−デサチュラーゼを適宜含む液体（例えば乳）にも関する。
【００１８】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法（即ち「第１」方法）として、ａ）例えば配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０又は配列番号３４により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）Δ５−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、ｄ）発現したヒトΔ５−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法にも関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＤＧＬＡ又は２０：４ｎ−３とすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができる。本方法は更に産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ又はデサチュラーゼに暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含むことができる（即ち「第２」方法）。追加の段階を含むこの方法（即ち「第２」方法）では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はアドレン酸又は（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸とすることができる。追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ又はエロンガーゼに暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる（即ち「第３」方法）。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えば（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）酸とすることができる。
【００１９】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、ａ）配列番号１３又は配列番号３３により表されるヌクレオチド配列を単離する段階と、ｂ）単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、ｃ）Δ６−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下にベクターを宿主細胞に導入する段階と、ｄ）発現したΔ６−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を含む方法に関する。夫々基質ポリ不飽和脂肪酸は例えばＬＡ又はＡＬＡとすることができ、産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ又はＳＴＡとすることができる。本方法は産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼ（又はデサチュラーゼ）に暴露し、産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。追加の段階を含むこの方法では、夫々産物ポリ不飽和脂肪酸は例えばＧＬＡ又はＳＴＡとすることができ、「別の」ポリ不飽和脂肪酸はＤＧＬＡ又はエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）とすることができる。追加の段階を含む方法は別のポリ不飽和脂肪酸を付加デサチュラーゼ（又はエロンガーゼ）に暴露して別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含むことができる。最終ポリ不飽和脂肪酸は例えばＡＡ又はＥＰＡとすることができる。
【００２０】
本発明は上記方法により製造される産物ポリ不飽和脂肪酸、上記方法により製造される別のポリ不飽和脂肪酸及び上記方法により製造される最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む栄養組成物にも関する。産物ポリ不飽和脂肪酸はΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡであり得る。別のポリ不飽和脂肪酸は同様にΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えばアドレン酸、（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸、ＤＧＬＡ及びＥＰＡであり得る。最終ポリ不飽和脂肪酸は同様にΔ５−又はΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列のいずれを使用しているかに応じて例えば（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸、ＤＨＡ、ＡＡ又はＥＰＡであり得る。
【００２１】
本発明は１）上記方法により製造される「産物」ＰＵＦＡ、上記方法により製造される「別の」ＰＵＦＡ及び上記方法により製造される「最終」ＰＵＦＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と、２）医薬的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物にも関する。
【００２２】
更に、本発明は上記方法により製造される産物ＰＵＦＡ、上記方法により製造される別のＰＵＦＡ及び上記方法により製造される最終ＰＵＦＡから構成される群から選択される少なくとも１種のＰＵＦＡを含む動物飼料又は化粧品にも関する。これらのＰＵＦＡは上記に挙げた通りであり、図１に例示する。
【００２３】
更に、本発明はポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する状態の予防又は治療方法として、予防又は治療を行うために十分な量の上記栄養組成物を患者に投与する方法にも関する。
【００２４】
本明細書に記載する各ヌクレオチド及びアミノ酸配列は特定配列番号で指定していることにも留意すべきである。（添付の）配列表はこれらの各配列とその対応番号を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明はＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来するΔ５−デサチュラーゼ遺伝子、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来するΔ６−デサチュラーゼ遺伝子、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍに由来する２種のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子及びＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａに由来するΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド及び翻訳アミノ酸配列に関する。更に、本発明はこれらの遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用にも関する。例えば、前記遺伝子と対応する酵素は医薬組成物、栄養組成物及び他の有価製品に添加可能なポリ不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸、エイコサペンタエン酸及び／又はアドレン酸）の製造に使用することができる。
【００２６】
Δ５−デサチュラーゼ遺伝子、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子及びそれらにコードされる酵素
上述のように、本発明のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は夫々炭素数２０及び１８を上回る長さをもつ高度に不飽和のポリ不飽和脂肪酸の生産に不可欠である。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子（ＡＴＣＣ３４３０４）のヌクレオチド配列を図６に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図７に示す。単離Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図４に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図５に示す。単離Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ Δ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図２に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図３に示す。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図８に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図９に示す。単離Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ Δ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１０に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図１１に示す。最後に、単離Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ Δ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を図１４に示し、対応する精製蛋白質のアミノ酸配列を図１５に示す。
【００２７】
本発明の遺伝子の重要性の１例として、単離Δ５−デサチュラーゼ遺伝子はＤＧＬＡをＡＡに変換し、又はエイコサテトラエン酸をＥＰＡに変換する。ＡＡは例えばΔ５−デサチュラーゼ遺伝子とそれによりコードされる酵素なしには合成することができない。本発明の単離Δ６−デサチュラーゼ遺伝子は例えばリノレン酸（１８：２ｎ−６）をγ−リノレン酸（ＧＬＡ）に変換し、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）をステアリドン酸（ＳＴＡ）に変換する。
【００２８】
本発明は本明細書に記載する配列番号１９（即ちＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号１３（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号２８（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号３０（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）のΔ５−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号３２（即ちＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子）及び配列番号３４（即ちＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子）のヌクレオチド配列の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％を含むか又はこれに相補的な（即ち配列一致度をもつ）ヌクレオチド配列（及びこれによりコードされる対応する蛋白質）にも関することに留意すべきである。（一致度百分率に関して５０％〜１００％の全整数も本発明の範囲に含むものとする。）このような配列はヒト起源及び他の非ヒト起源とすることができる（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ又はマウス）。
【００２９】
更に、本発明は本発明のヌクレオチド配列（即ち配列番号１３、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３４）及び他の起源に由来し、上記相補性又は対応性をもつ配列のフラグメント及び誘導体にも関する。上記配列（即ち適宜Δ５−デサチュラーゼ活性又はΔ６−デサチュラーゼ活性をもつ配列）の機能的等価物も本発明に含まれる。
【００３０】
本発明は炭素５位又は炭素６位でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる上記蛋白質のアミノ酸配列（即ち配列番号１４（図３）、配列番号２０（図５）、配列番号２９（図７）、配列番号３１（図９）、配列番号３３（図１１）及び配列番号３５（図１５））に対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、更に好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似度又は一致度をもつ精製ポリペプチドにも関する。５０〜１００％の全整数の類似度又は一致度も本発明の範囲に含むものとする。
【００３１】
「一致度」なる用語は特定比較窓又はセグメントにわたる２種の配列のヌクレオチド間の関連度を表す。即ち、一致度は２種のＤＮＡセグメントの同一鎖（センス又はアンチセンス）間の同一、対応又は等価度として定義される。「配列一致度百分率」は２種の最適に整列させた配列を特定領域にわたって比較し、両者配列で塩基が一致する位置の数を測定して整合位置数を求め、このような位置数を比較するセグメントの合計位置数で割って１００を掛けることにより計算される。最適配列整列はＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２４４４（１９８８）の方法及び関連アルゴリズムを実施するコンピュータープログラム（例えばＣｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら，ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３（１９８９））、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｒｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３３８９−３４０２（１９９７））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はＴＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により実施することができる。（米国特許第５，９１２，１２０号参照。）
本発明の趣旨では、「相補性」は２種のセグメント間の関連度として定義される。これは一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖と適当な条件下でハイブリ大豆して二重螺旋を形成する能力を測定することにより決定される。二重螺旋では一方の鎖にアデニンが現れ、他方の鎖にチミンが現れる。同様に、一方の鎖にグアニンが存在する場合には、他方にシトシンが存在する。２種のＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連度が大きいほど、２種のＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドデュプレクスを形成する能力は高い。
【００３２】
２種のアミノ酸配列間の「類似度」は両者配列における一連の同一な保存アミノ酸残基の存在として定義される。２種のアミノ酸配列間の類似度が高いほど、２種の配列の対応、同一又は等価度は高い。（２種のアミノ酸配列間の「一致度」は両者配列における一連の厳密に同一又は不変のアミノ酸残基の存在として定義される。）「相補性」、「一致度」及び「類似度」の定義は当業者に周知である。
【００３３】
「〜によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列又はその一部は核酸配列によりコードされるポリペプチドからのアミノ酸を少なくとも３個の、より好ましくは少なくとも８個、更に好ましくは少なくとも１５個含むアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明はＰＵＦＡデサチュラーゼ活性をもち、配列番号１３（図２）、配列番号１９（図４）、配列番号２８（図６）、配列番号３０（図８）、配列番号３２（図１０）又は配列番号３４（図１４）を含むヌクレオチド配列を含むか又はこれに相補的なヌクレオチド配列をもつ核酸に並のストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列にも関する。核酸分子の１本鎖形が適当な温度及びイオン強度条件下で別の核酸分子とアニールできるときに核酸分子は別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。温度及びイオン強度条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。「ハイブリダイゼーション」には２種の核酸が相補的配列を含んでいることが必要である。他方、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間にミスマッチが生じる場合がある。核酸をハイブリダイズするのに適したストリンジェンシーは核酸の長さと相補度に依存する。このような変数は当業者に周知である。より具体的には、２種のヌクレオチド配列間の類似度又は相同度が高いほどこれらの配列をもつ核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きい。１００ヌクレオチド長を越えるハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。短い核酸とのハイブリダイゼーションではミスマッチの位置が重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照）。
【００３５】
本明細書で使用する「単離核酸フラグメント又は配列」とは場合により合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含む１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１個以上のセグメントから構成され得る（特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは特定ヌクレオチド配列のある領域に同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。）（通常はその５’−一リン酸形で存在する）ヌクレオチドはその１文字表記により次のように表す。「Ａ」はアデニル酸又はデオキシアデニル酸（夫々ＲＮＡ又はＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸又はデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸又はデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（Ａ又はＧ）、「Ｙ」はピリミジン（Ｃ又はＴ）、「Ｋ」はＧ又はＴ、「Ｈ」はＡ又はＣ又はＴ、「Ｉ」はイノシン、「Ｎ」は任意ヌクレオチドを表す。
【００３６】
「機能的に等価であるフラグメント又はサブフラグメント」及び「機能的に等価なフラグメント又はサブフラグメント」なる用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語はフラグメント又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関係なく遺伝子発現を変更又は所定表現型を発現する能力を維持する単離核酸フラグメントの一部又はサブ配列を意味する。例えば、フラグメント又はサブフラグメントをキメラ構築物の設計に使用し、形質転換植物で所定表現型を発現させることができる。キメラ構築物は活性酵素をコードするか否かに関係なく植物プロモーター配列に対して適当な方向で核酸フラグメント又はサブフラグメントを連結することにより共抑制又はアンチセンスで使用するように設計することができる。
【００３７】
「相同度」、「相同」、「実質的に類似｜及び「実質的に対応」等の用語は本明細書では同義に使用する。これらの用語は１個以上のヌクレオチド塩基が変異しても遺伝子発現を媒介又は所定表現型を発現する核酸フラグメントが能力が変わらないことを意味する。これらの用語は当初の未改変フラグメントに対して得られる核酸フラグメントの機能的性質を実質に変えない本発明の核酸フラグメントの変異（例えば１個以上のヌクレオチドの欠失又は挿入）を意味する。従って、当業者に自明の通り、本発明は特定の例示配列以外の配列にも関する。
【００３８】
「遺伝子」とはコーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）と後続する調節配列（３’非コーディング配列）を含めた特定蛋白質を発現する核酸フラグメントを意味する。
【００３９】
「天然遺伝子」とはそれ自体の調節配列と共に天然に存在する遺伝子を意味する。これに対して「キメラ構築物」とは一般には天然に共存しない核酸フラグメントの組み合わせを意味する。従って、キメラ構築物は異なる起源に由来する調節配列とコーディング配列を含むか、又は同一起源に由来するが、通常天然に存在するとは異なる方法で配置された調節配列とコーディング配列を含むことができる（「単離」なる用語は配列をその天然環境から取出すことを意味する。）
「外来」遺伝子とは宿主生物に通常存在しないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は非天然生物又はキメラ構築物に挿入した天然遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは形質転換法によりゲノムに導入した遺伝子である。
【００４０】
「コーディング配列」とは特定アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「調節配列」とはコーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、又は下流（３’非コーディング配列）に配置され、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性又は翻訳に作用するヌクレオチド配列を意味する。調節配列としてはプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化認識配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「プロモーター」とはコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を意味する。プロモーターは近位及び遠位上流エレメントから構成され、これらのエレメントはエンハンサーと呼ぶことが多い。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの固有エレメント又はプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーター配列は遺伝子の転写部分の内部に配置してもよいし、及び／又は転写配列の下流に配列してもよい。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来するものでもよいし、天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成してもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含むものでもよい。当業者に自明の通り、種々のプロモーターは種々の組織もしくは細胞型で、又は種々の発生段階で、又は種々の環境条件に応答して遺伝子の発現を誘導することができる。殆どの細胞型で殆どの場合に遺伝子を発現させるプロモーターを一般に「構成的プロモーター」と言う。植物細胞で有用な種々の型の新規プロモーターが絶えず発見されつつあり、ＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｔ，（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２に多数の例が記載されている。更に、殆どの場合に調節配列の厳密な境界が完全に決定されているので、所定変形のＤＮＡフラグメントが同一プロモーター活性をもつこともあると考えられる。
【００４２】
「イントロン」は蛋白質配列の一部をコードしない遺伝子の介在配列である。従って、このような配列はＲＮＡに転写されるが、その後、切出されるので翻訳されない。この用語は切出されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は転写される遺伝子の配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡに存在するが、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部でなくてもよい。
【００４３】
「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に配置されたＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセスされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は一次転写産物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性又は翻訳効率に作用し得る。翻訳リーダー配列の例は文献に記載されている（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．とＦｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。
【００４４】
「３’非コーディング配列」とはコーディング配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列やｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節配列をコードする他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは一般にｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に作用することを特徴とする。種々の３’非コーディング配列の使用がＩｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０に例示されている。
【００４５】
「ＲＮＡ転写産物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるときには一次転写産物と言うが、一次産物の転写後プロセシングにより誘導されるＲＮＡ配列でもよく、その場合には成熟ＲＮＡと言う。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とはイントロンをもたないＲＮＡであり、細胞により蛋白質に翻訳できるものを意味する。「ｃＤＮＡ」とはｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、逆転写酵素を使用してこの鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは１本鎖でもよいし、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントを使用して２本鎖に変換してもよい。「センス」ＲＮＡとはｍＲＮＡを含み、細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏで蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写産物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは標的一次転写産物又はｍＲＮＡの全部又は一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡは特異的遺伝子転写産物のどの部分と相補的でもよく、即ち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、又はコーディング配列のいずれでもよい。「機能的ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ又は翻訳できないが、細胞プロセスに作用する他のＲＮＡを意味する。「相補体」及び「逆相補体」なる用語は本明細書ではｍＲＮＡ転写産物に関して同義に使用し、メッセージのアンチセンスＲＮＡを意味する。
【００４６】
「内因性ＲＮＡ」なる用語は天然又は非天然即ち組換え手段、突然変異誘発等により導入されるかを問わずに本発明の組換え構築物による形質転換前に宿主のゲノムに存在する任意核酸配列によりコードされる任意ＲＮＡを意味する。
【００４７】
「非天然」なる用語は通常天然に存在するものと一致しない人工を意味する。
【００４８】
「作動的に連結」なる用語は一方の核酸配列の機能が他方により調節されるように単一核酸フラグメントで核酸配列を結合することを意味する。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を調節できるとき（即ちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にあるとき）にプロモーターはコーディング配列に作動的に連結している。コーディング配列はセンス又はアンチセンス方向のいずれで調節配列に作動的に連結してもよい。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域を標的ｍＲＮＡの５’又は標的ｍＲＮＡの３’又は標的ｍＲＮＡの内部に直接又は間接的に作動的に連結してもよいし、第１の相補領域を標的ｍＲＮＡの５’に作動的に連結し、その相補体を３’に作動的に連結してもよい。
【００４９】
本明細書で使用する「発現」なる用語は機能的終産物の生産を意味する。遺伝子の発現には遺伝子の転写とｍＲＮＡから前駆物質又は成熟蛋白質への翻訳が必要である。「アンチセンス阻害」とは標的蛋白質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する。「共抑制」とは同一又は実質的に類似する外来又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生産を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００５０】
「成熟」蛋白質とは翻訳後プロセシングしたポリペプチド、即ち一次翻訳産物に存在するプレ又はプロペブチドを除去したポリペプチドを意味する。「前駆物質」蛋白質とはｍＲＮＡの翻訳の一次産物、即ちプレ及びプロペブチドがまだ存在するものを意味する。プレ及びプレペブチドとしては細胞内局在シグナルが挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
「安定な形質転換」とは核ゲノムとオルガネラゲノムの両者を含む宿主生物のゲノムに核酸フラグメントを導入し、遺伝的に安定した遺伝を行うことを意味する。これに対して、「一過的形質転換」とは核酸フラグメントを宿主生物の核又はＤＮＡ含有オルガネラに導入し、組込み又は安定な遺伝なしに遺伝子発現させることを意味する。形質転換核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と言う。コメ、トウモロコシ及び他の単子葉植物の好ましい細胞形質転換法は粒子加速又は「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号）、又はトランスジーンを含む適当なＴｉプラスミドを使用するアグロバクテリウム法（Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．ら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５−７５０）の使用である。本明細書で使用する「形質転換」なる用語は安定な形質転換と一過的形質転換の両者を意味する。
【００５２】
本明細書で使用する標準組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と言う）により詳細に記載されている。
【００５３】
「組換え」なる用語は例えば化学合成又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により、２つの分離配列セグメントの人工的組合せを意味する。
【００５４】
「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は大量の特定ＤＮＡセグメントの合成技術であり、一連の反復サイクルから構成される（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）。一般に、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーを低温でアニールした後、中温で伸長する。これらの連続３段階１組をサイクルと言う。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は短時間で鋳型の反復複製によりＤＮＡを数百万倍に増幅するために使用される強力な技術である。（Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｅｒｌｉｃｈら，ヨーロッパ特許出願第５０，４２４号；ヨーロッパ特許出願第８４，７９６号；ヨーロッパ特許出願第２５８，０１７号；ヨーロッパ特許出願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓ，ヨーロッパ特許出願第２０１，１８４号，Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，２０２号；Ｅｒｌｉｃｈ，米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら，米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した特定オリゴヌクレオチドの組合せを利用してＤＮＡ合成を開始する。プライマーの設計は分析したいＤＮＡの配列に依存する。この方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを鋳型内の相補的配列にアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するサイクルを多数回（通常は２０〜５０回）行うことにより実施される。
【００５６】
ＰＣＲ反応産物はアガロースゲルで分離後に臭化エチジウム染色とＵＶ透照により分析される。あるいは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに加えて産物にラベルを加えてもよい。この場合には、ゲルをＸ線フィルムに露光することによりＰＣＲ産物を可視化する。放射性標識ＰＣＲ産物には個々の増幅産物レベルを定量できるという利点もある。
【００５７】
本明細書では「組換え構築物」、「発現構築物」及び「組換え発現構築物」なる用語を同義に使用する。これらの用語は当業者に周知の標準方法を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝材料の機能単位を意味する。このような構築物をそのまま使用してもよいし、ベクターに組込んで使用してもよい。ベクターを使用する場合には、ベクターの選択は当業者に周知のように宿主植物を形質転換するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を有効に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクター上に配置する必要がある遺伝要素は当業者に周知である。個々の各種形質転換イベントの結果、各種レベル及びパターンの発現が生じる（Ｊｏｎｅｓら，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８−８６）ので、所望発現レベル及びパターンを示す系列を得るためには多重イベントをスクリーニングしなければならないことも当業者に自明である。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析、又は表現型分析により実施することができる。
【００５８】
Δ５−デサチュラーゼ酵素とΔ６−デサチュラーゼ酵素の製造
デサチュラーゼ酵素のいずれか１種をコードする遺伝子を単離したら、その後、ベクター又は構築物を使用することにより原核又は真核宿主細胞に導入することができる。ベクター（例えばバクテリオファージ、コスミド又はプラスミド）はΔ５−デサチュラーゼ酵素又はΔ６−デサチュラーゼ酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列と、宿主細胞で機能的であり且つヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘発することが可能な任意調節配列（例えばプロモーター）を含むことができる。調節配列はヌクレオチド配列に作動的に関連又は作動的に連結している。（上述のように、調節配列がコーディング配列の転写又は発現に作用する場合に調節配列はコーディング配列に「作動的に連結している」と言う。）利用可能なプロモーターとしては例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセル酸キナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、サイトメロガロウイルス極初期、ホエイ酸蛋白質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子に由来するものや、ガラクトースの存在下に活性化されるプロモーター（例えばＧＡＬ１及びＧＡＬ１０）が挙げられる。更に、他の蛋白質、オリゴ糖、脂質等をコードするヌクレオチド配列と、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、オボアルブミン又はウシ成長ホルモンのポリＡシグナル）等の他の調節配列もベクターに配置してもよい。構築物に配置する配列の選択は所望発現産物と宿主細胞の種類に依存する。
【００５９】
上述のように、ベクターを構築したら、次に例えばトランスフェクション、形質転換及びエレクトロポレーション等の当業者に公知の方法により選択宿主細胞に導入することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｖｏｌ．１−３，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。その後、遺伝子の発現を可能にする適当な条件下で宿主細胞を培養して所望ＰＵＦＡを生産させた後、回収し、精製する。
【００６０】
利用可能な原核宿主細胞の例としては例えば大腸菌、枯草菌及びシアノバクテリア（例えばＳｐｉｒｕｌｉｎａ種、即ち藍藻）等の細菌類が挙げられる。利用可能な真核宿主細胞の例としては例えば哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ、Ｃａｎｄｉｄａ種（例えばＹａｒｒｏｗｉａ（Ｃａｎｄｉｄａ） ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種又はＨａｎｓｅｎｕｌａ種）、又は真菌細胞（例えば糸状菌細胞、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）細胞を利用するのが好ましい。
【００６１】
宿主細胞での発現は一過的又は安定的に行うことができる。一過的発現は導入構築物が宿主細胞で機能的な発現シグナルを含むが、複製しないので宿主細胞に殆ど組込まれないか又は宿主細胞が増殖していない場合に生じ得る。一過的発現は目的遺伝子に作動的に連結した調節プロモーターの活性を誘導することによっても実施できるが、このような誘導系は基底発現レベルが低いことが多い。安定的発現は宿主ゲノムに組込むことができるか又は宿主細胞で自律複製する構築物を導入することにより達成することができる。発現構築物に配置するか又は発現構築物をトランスフェクトする選択マーカーを使用して目的遺伝子の安定的発現を選択した後に、マーカーを発現する細胞を選択することができる。安定的発現が組込みの結果である場合には、構築物の組込み部位は宿主ゲノム内でランダムでもよいし、宿主遺伝子部位との組換えをターゲットするために十分な宿主ゲノムとの相同領域を含む構築物を使用してターゲットしてもよい。内在部位に構築物をターゲットする場合には、転写及び翻訳調節領域の全部又は一部を内在部位により提供することができる。
【００６２】
トランスジェニック哺乳動物を使用して目的酵素（即ちΔ５−デサチュラーゼの１種以上、Δ６−デサチュラーゼの１種以上、又はその組合せ）を発現させ、最終的に目的ＰＵＦＡを発現させることもできる。より具体的に言うと、上記構築物を作出したら、胚の前核に挿入すればよい。その後、胚をレシピエント雌に移植する。あるいは、核導入法も利用できる（Ｓｃｈｎｉｅｋｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２１３０−２１３３（１９７７））。その後、妊娠と出産が可能である（例えば米国特許第５，７５０，１７６号及び米国特許第５，７００，６７１号参照）。その後、子孫からの乳汁、組織又は他の体液試料は非トランスジェニック動物に通常検出される濃度とは異なる濃度のＰＵＦＡを含有しているはずである。後続世代をモニターし、変化又は増加濃度のＰＵＦＡが生産されているかどうかを調べ、従って所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子がそのゲノムが組込まれているかどうかを調べる。宿主として利用する哺乳動物は例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ及びウシから構成される群から選択することができる。但し、目的酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組込む能力がある限り任意哺乳動物を使用することができる。
【００６３】
デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、デサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに機能的転写及び翻訳開始及び終結領域を作動的に連結する。転写及び翻訳開始及び終結領域は発現させようとするＤＮＡ、所望系で発現できることが知られているか又はその可能性がある遺伝子、発現ベクター、化学合成、又は宿主細胞における内在部位から等の種々の非排他的起源に由来する。植物組織及び／又は植物部分における発現は特に組織又は部分が種子、葉、果実、花、根等の早期回収されるものである場合にある程度の効率を示す。米国特許第５，４６３，１７４号、４，９４３，６７４号、５，１０６，７３９号、５，１７５，０９５号、５，４２０，０３４号、５，１８８，９５８号及び５，５８９，３７９号に記載されているような特定調節配列を利用することにより植物でその位置に発現をターゲットすることができる。あるいは、発現される蛋白質は直接又は更に改変後に宿主植物から液体フラクションに組込むことができる産物を生産する酵素でもよい。デサチュラーゼ遺伝子又はアンチセンスデサチュラーゼ転写産物が発現すると、植物部分及び／又は植物組織に含まれる特定ＰＵＦＡ又はその誘導体の濃度が変化し得る。デサチュラーゼポリペプチドコーディング領域を単独又は他の遺伝子と共に発現させ、より高濃度の所望ＰＵＦＡを含有するか又はＰＵＦＡ組成が人乳により近似する組織及び／又は植物部分を生産することもできる（Ｐｒｉｅｔｏら，ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２４４９４）。終結領域は開始領域を得た遺伝子の３’領域又は別の遺伝子に由来するものとすることができる。多数の終結領域が同一及び異なる属及び種から種々の宿主で満足できるとして知られており、見出されている。終結領域は特定性質よりもむしろ便宜上から選択するのが一般的である。
【００６４】
上述のように、植物（例えばＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（大豆）又はＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ））又は植物組織を夫々宿主又は宿主細胞として利用してデサチュラーゼ酵素を発現させ、ポリ不飽和脂肪酸の生産に利用してもよい。より具体的に言うと、所望ＰＵＦＡを種子で発現させることができる。種子油の分離方法は当分野で公知である。即ち、ＰＵＦＡ源の提供に加え、デサチュラーゼ遺伝子と恐らく他のデサチュラーゼ遺伝子及びエロンガーゼ遺伝子の発現により種子油成分を操作すると、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料及び化粧品に添加可能な種子油を提供することができる。この場合にも、プロモーターに作動的に連結したデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターをデサチュラーゼ遺伝子の発現に十分な時間と条件下に植物組織又は植物に導入する。ベクターは更に他の酵素（例えばΔ４−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼ及び／又はΔ１９−デサチュラーゼ）をコードする１種以上の遺伝子も含んでいてもよい。酵素が作用する該当基質（例えばＤＧＬＡ（Δ５−デサチュラーゼの場合）、ＡＬＡ（Δ６−デサチュラーゼの場合）等）を植物組織又は植物で生産してもよいし、このような基質を生産する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞又は植物に導入してもよい。更に、適当な酵素を発現する植物組織に基質を噴霧してもよい。これらの種々の技術を使用して、植物細胞、植物組織又は植物の使用によりＰＵＦＡ（例えばｎ−６不飽和脂肪酸（例えばＡＡ）又はｎ−３脂肪酸（例えばＥＰＡ又はＳＴＡ））を生産することもできる。本発明は更に上記ベクターを含むトランスジェニック植物として、ベクターのヌクレオチド配列の発現の結果として例えばトランスジェニック植物の種子でポリ不飽和脂肪酸を生産する植物にも関することにも留意すべきである。
【００６５】
単一植物プロトプラスト形質転換体又は種々の形質転換外植片から植物を再生、発生及び培養することも当分野で周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（１９８８））。この再生及び増殖法は一般に形質転換細胞を選択する段階と、通常の胚発生〜挿し木苗段階で個体化細胞を培養する段階を含む。トランスジェニック胚及び種子も同様に再生させる。得られたトランスジェニック挿し木苗をその後、土壌等の適当な植物成長媒質に植え付ける。
【００６６】
目的蛋白質をコードする外来外因性遺伝子を含む植物の発生又は再生は当分野で周知である。再生した植物を自家受粉させて同型トランスジェニック植物を提供することが好ましい。あるいは。再生植物から得た花粉を栽培学的に重要な系列の種子成長植物と交配する。逆に言うと、これらの重要系列の植物からの花粉を使用して再生植物に受粉させる。当業者に周知の方法を使用して所望ポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を栽培する。
【００６７】
植物組織から植物を再生させる方法は種々のものがある。特定再生方法は出発植物組織と再生させようとする特定植物種によって異なる
主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法がワタ（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）、大豆（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、ＭｃＣａｂｅら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９２３（１９８８），Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（１９８８））、アブラナ属（米国特許第５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：６５３−６５７（１９９６），ＭｃＫｅｎｔｌｙら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：６９９−７０３（１９９５））、パパイヤ及びエンドウ（Ｇｒａｎｔら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１５：２５４−２５８，（１９９５））について報告されている。
【００６８】
エレクトロポレーション、粒子衝撃及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用する単子葉植物の形質転換も報告されている。形質転換と植物再生はアスパラガス（Ｂｙｔｅｂｉｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：５３５４，（１９８７））、オオムギ（ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７（１９９４））、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：２０４（１９８８），Ｂｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８（１９９０），Ｆｒｏｍｍら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３（１９９０），Ｋｏｚｉｅｌら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１；１９４，（１９９３），Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５：５５０−５５７（１９９５））、オート麦（Ｓｏｍｅｒｓら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１５８９（１９９２））、オーチャードグラス（Ｈｏｒｎら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．７：４６９（１９８６））、コメ（Ｔｏｒｉｙａｍａら，ＴｈｅｏｒＡｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０５：３４，（１９８６）；Ｐａｒｔら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：１１３５−１１４８，（１９９６）；Ａｂｅｄｉｎｉａら，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４：１３３−１４１（１９９７）；ＺｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７６：８３５（１９８８）；Ｚｈａｎｇら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅ．７：３７９，（１９８８）；ＢａｔｔｒａｗとＨａｌｌ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．８６：１９１−２０２（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７（１９９１））、ライ麦（Ｄｅ ｌａ Ｐｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：２７４（１９８７））、サトウキビ（ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：４０９（１９９２））、ヒロハノウシノケグサ（Ｗａｎｇら，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｔ １０：６９１（１９９２）；米国特許第５，６３１，１５２号）で達成されている。
【００６９】
クローニングした核酸構築物の一過的発現に基づく遺伝子発現アッセイはポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション又は粒子衝撃により核酸分子を植物細胞に導入することにより開発されている（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：４５４−４５７（１９８８）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）；ＭｃＣａｒｔｙら，Ｃｅｌｌ ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，ＥＭＢＯ Ｊ．９：２５１７−２５２２（１９９０））。
【００７０】
一過的発現系を使用して遺伝子構築物を機能的に分析することができる（一般にＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。当然のことながら、本発明の核酸分子の任意のものをベクター、プロモーター、エンハンサー等の他の遺伝子エレメントと共に永久的又は一過的に植物細胞に導入できる。
【００７１】
上記方法に加え、巨大分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作及び単離、組換え生物の作成並びにクローンのスクリーニングと単離に関する特定条件及び手順を記載した標準資料は当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｍａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ，１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ，２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌａｒｋ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７））。
【００７２】
天然又は組換えにより宿主細胞により生産され得る基質と、後から宿主細胞に導入するベクターに存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【００７３】
上記に鑑み、本発明はデサチュラーゼ酵素（即ちΔ５又はΔ６）の製造方法として、１）デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を単離する段階と、２）前記ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、３）デサチュラーゼ酵素の生産に十分な時間及び条件で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含む方法に関する。
【００７４】
本発明はポリ不飽和脂肪酸の製造方法として、デサチュラーゼが酸をポリ不飽和脂肪酸に変換するように酸を酵素に暴露する段階を含む方法にも関する。例えば２０：３ｎ−６をΔ５−デサチュラーゼ酵素に暴露すると、ＡＡに変換される。その後、ＡＡをエロンガーゼに暴露し、ＡＡをアドレン酸（即ち２２：４ｎ−６）に伸長する。あるいは、Δ５−デサチュラーゼを利用して２０：４ｎ−３を２０：５ｎ−３に変換してからエロンガーゼに暴露して（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸に変換してもよい。その後、Δ４−デサチュラーゼを使用することにより（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸をＤＨＡに変換することができる。即ち、Δ５−デサチュラーゼは特定有効目的に使用可能なポリ不飽和脂肪酸の製造に使用することができる。
【００７５】
Δ６−デサチュラーゼの役割については、酵素が酸をＧＬＡに変換するようにリノレン酸を酵素に暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用してＧＬＡをＤＧＬＡに変換することができる。その後、ＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに暴露することによりＤＧＬＡをＡＡに変換することができる。別例として、ＡＬＡをＳＴＡに変換するためにはＡＬＡをΔ６−デサチュラーゼに暴露することができる。その後、エロンガーゼを使用することによりＳＴＡを２０：４ｎ−３に変換することができる。その後、２０：４ｎ−３をΔ５−デサチュラーゼに暴露することによりＥＰＡに変換することができる。即ち、Δ６−デサチュラーゼは有利な性質をもつＰＵＦＡの製造や、他のＰＵＦＡの製造に使用することができる。
【００７６】
Δ５−デサチュラーゼ遺伝子、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子、及びこれらの遺伝子によりコードされる酵素の使用
上述のように、単離デサチュラーゼ遺伝子とこれらの遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途がある。例えば、遺伝子と対応する酵素はポリ不飽和脂肪酸の製造に間接又は直接的に使用することができ、例えば、Δ５−デサチュラーゼはＡＡ、アドレン酸又はＥＰＡの製造に使用することができる。Δ６−デサチュラーゼはＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＴＡ又は２０：４ｎ−３の製造に間接又は直接的に使用することができる。（「直接」とは酵素が酸を組成物で利用する別の酸に直接変換する状況（例えばＤＧＬＡからＡＡへの変換）を意味する。「間接」とは酸がデサチュラーゼにより別の酸（即ち中間経路）に変換（例えばＤＧＬＡからＡＡ）された後、後者酸が非デサチュラーゼ酵素の使用（例えばエロンガーゼによりＡＡからアドレン酸）又は別のデサチュラーゼ酵素の使用（例えばΔ１７−デサチュラーゼによりＡＡからＥＰＡ）に変換される状況を意味する）。これらのポリ不飽和脂肪酸（即ちデサチュラーゼ酵素の活性により直接又は間接的に製造されたポリ不飽和脂肪酸）は例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品及び動物飼料に添加することができ、これらのいずれも本発明に含まれる。これらの使用について以下に詳述する。
【００７７】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を含む。このような組成物は本発明の目的では体内に取込まれると、（ａ）組織を強化又はエネルギーを供給し、及び／又は（ｂ）十分な栄養状態又は代謝機能を維持、回復又は補助するにように作用するヒト消費用（胃又は腸消費用を含む）任意食品又は調製物を含む。
【００７８】
本発明の栄養組成物は本発明によるデサチュラーゼ遺伝子の使用により直接又は間接的に製造された少なくとも１種の油又は酸を含み、固体形態でも液体形態でもよい。更に、組成物は特定用途に必要な量の食用多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。このような成分の量は組成物を健常乳児、幼児又は成人に使用するのかあるいは所定代謝状態（例えば代謝障害）を伴う等の特殊な要求のあるものに使用するのかによって広い範囲をとる。
【００７９】
組成物に添加でかる多量養素の例としては食用脂肪、炭水化物及び蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。このような食用脂肪の例としてはヤシ油、大豆油並びにモノ及びジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。このような炭水化物の例としては蔗糖、食用乳糖及び加水分解澱粉が挙げられるが、これらに限定されない。更に、本発明の栄養組成物で利用可能な蛋白質の例としては大豆蛋白質、電気透析ホエイ、電気透析脱脂乳、ホエイ、又はこれらの蛋白質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ビタミンとミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ及びＥ複合体を本発明の栄養組成物に添加できる。
【００８１】
本発明の栄養組成物で利用する成分は半精製又は精製物に由来する。半精製又は精製とは、天然材料に精製又は合成により製造した材料を意味する。
【００８２】
本発明の栄養組成物の例としては乳児用調製乳、栄養補助食品、代用食品及び再水和組成物が挙げられるが、これらに限定されない。特に有利な栄養組成物としては経腸及び非経腸乳児用補給剤、特殊乳児用調製乳、高齢者用補給剤、及び胃腸障害及び／又は吸収不良者用補給剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本発明の栄養組成物は食事の補充を必要としない場合にも食品に添加できる。例えば、組成物は任意種の食品に添加することができ、例えばマーガリン、調製バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック菓子、サラダ油、調理用油、調理用脂肪、肉類、魚肉及び飲料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の好適態様では、栄養組成物は経腸栄養製品であり、成人又は小児経腸栄養製品がより好ましい。この組成物は慢性又は急性疾患状態によりストレスを受けていたり、特殊処置が必要な成人又は小児に投与することができる。組成物は本発明により製造されるポリ不飽和脂肪酸に加え、上記のような多量養素、ビタミン及びミネラルを加えてもよい。多量養素は人乳に含まれると等価の量又はエネルギー換算即ちカロリー当たりの換算で添加することができる。
【００８５】
液体又は固体経腸及び非経腸栄養製剤の処方方法は当分野で周知である（下記実施例も参照されたい）。
【００８６】
経腸製剤は例えば滅菌後に即使用（ＲＴＦ）式で利用してもよいし、濃縮液体又は粉末で保存してもよい。粉末は上記のように調製した製剤を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和して再構成することにより製造することができる。成人及び小児栄養製剤は当分野で周知であり、市販されている（例えばＲｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ製品Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）及びＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。本発明により製造した油又は酸はこれらの製剤の任意のものに添加することができる。
【００８７】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態の場合には約０．６Ｋｃａｌ〜約３Ｋｃａｌ／ｍｌとすることができる。固体又は粉末形態の場合には、栄養補給剤に約１．２〜＞９Ｋｃａｌ／ｇ、好ましくは約３〜７Ｋｃａｌ／ｇを加えることができる。一般に、液体製品の浸透圧は７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満とする。
【００８８】
栄養製剤には本発明により製造したＰＵＦＡ以外に上記のように多量養素、ビタミン及びミネラルを加えることができる。これらの付加成分の存在は個体がこれらの成分の最小１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡ提供に加え、亜鉛、銅、葉酸及び酸化防止剤を組成物に加えると望ましい場合もある。これらの物質はストレス下の免疫系を強化するので、組成物を投与する個体に更に有利である。これらの成分は医薬組成物にも添加できる。
【００８９】
より好ましい態様では、栄養組成物は酸化防止剤と少なくとも１種のＰＵＦＡに加えて炭水化物源を含み、炭水化物の少なくとも５重量％は食用オリゴ糖である。より好ましい態様では、栄養組成物は更に蛋白質、タウリン及びカルニチンを含む。
【００９０】
上述のように、本発明により製造したＰＵＦＡ又はその誘導体は代用食品又は補助食品、特に乳児用調製乳に添加し、点滴栄養患者や、栄養不良又は他の状態もしくは疾患状態の予防又は治療に用いることができる。背景として、人乳の脂肪酸プロフィルはＤＨＡ約０．１５％〜約０．３６％、ＥＰＡ約０．０３％〜約０．１３％、ＡＡ約０．３０％〜約０．８８％、ＤＧＬＡ約０．２２％〜約０．６７％、及びＧＬＡ約０．２７％〜約１．０４％であることに留意すべきである。即ち、本発明により製造されるＡＡ、ＥＰＡ及び／又はドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の脂肪酸は例えば人乳のＰＵＦＡ濃度を良好に増すように乳児用調製乳の組成を変更したり、非ヒト哺乳動物母乳に通常含まれるＰＵＦＡ濃度を変えるために使用することができる。特に、医薬又は食品補給剤、特に母乳代用剤又は補給剤に使用する組成はＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの１種以上を含むことが好ましい。油はＡＡ約０．３〜３０％、ＤＧＬＡ約０．２〜３０％及び／又はＧＬＡ約０．２〜約３０％を含むことがより好ましい。
【００９１】
本発明はトリグリセリドとして計算した場合に脂肪酸約２〜約３０重量％を含む非経腸栄養組成物に関する。好適組成物はＧＬＡとして全ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％を含む（米国特許第５，１９６，１９８号）。場合により、他のビタミン、特に脂溶性ビタミン（例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ）やＬ−カルニチンも加えてもよい。所望により、α−トコフェロール等の防腐剤を約０．１重量％加えてもよい。
【００９２】
更に、ＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡの比は特定所期最終用途に合わせて調節することができる。母乳補給剤又は代用剤として処方する場合には、夫々約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比でＡＡ、ＤＧＬＡ及びＧＬＡを含む組成物が提供される。例えば、動物の母乳は１：１９：３０〜６：１：０．２のＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡ比をとることができ、約１：１：１、１：２：１、１：１：４の中間比をとることが好ましい。宿主細胞で同時に製造する場合には、ＧＬＡやＤＧＬＡ等の前駆物質基質からＡＡへの変換率を調節してＰＵＦＡ比を厳密に制御することが好ましい。例えば、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約１：１９にするにはＤＧＬＡからＡＡへの変換率として５％〜１０％を使用することができ、ＡＡ対ＤＧＬＡ比を約６：１にするには変換率約７５％〜８０％を使用することができる。従って、細胞培養系であるか宿主動物中であるかに関係なく、デサチュラーゼ発現のタイミング、程度及び特異性と、他のデサチュラーゼ及びエロンガーゼの発現を調節することにより、ＰＵＦＡ濃度及び比を調節することができる。本発明により生産されるＰＵＦＡ／酸（例えばＡＡ及びＥＰＡ）をその後、所望濃度及び比で他のＰＵＦＡ／酸（例えばＧＬＡ）と配合してもよい。
【００９３】
更に、本発明により製造したＰＵＦＡ又はこれを含む宿主細胞を動物飼料補給剤として使用し、動物の組織又は乳脂肪酸組成をヒト又は動物消費により望ましいものに変えることもできる。
【００９４】
医薬組成物
本発明は本明細書に記載するデサチュラーゼ遺伝子を使用して本明細書に記載する方法により製造した酸及び／又は油の１種以上を含む医薬組成物にも関する。より具体的には、このような医薬組成物は酸及び／又は油の１種以上と医薬的に許容可能な標準周知非毒性キャリヤー、アジュバント又はビヒクル、例えばリン酸緩衝塩類溶液、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤又はエマルション（例えば水／油エマルション）を含むことができる。組成物は液体形態でも固体形態でもよい。例えば、組成物は錠剤、カプセル剤、飲用液剤もしくは粉末剤、注射剤、又は局所軟膏もしくはクリームの形態とすることができる。例えば分散剤の場合には所望粒度を維持し、界面活性剤を使用することにより適正な流動性を維持することができる。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えると望ましい場合もある。このような不活性希釈剤以外に、湿潤剤、乳化懸濁剤、甘味料、調味料及び香料等のアジュバントを組成物に加えてもよい。
【００９５】
懸濁液は活性化合物以外に例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天及びトラガカントガム又はこれらの物質の混合物等の懸濁剤を含むことができる。
【００９６】
錠剤やカプセル剤等の固体剤形は当分野で周知の技術を使用して製造することができる。例えば、本発明により製造したＰＵＦＡを乳糖、蔗糖及びコーンスターチ等の慣用錠剤基剤に結合剤（例えばアラビアガム、コーンスターチ又はゼラチン）、崩壊剤（例えばジャガイモ澱粉又はアルギン酸）及び滑剤（例えばステアリン酸又はステアリン酸マグネシウム）を加えて錠剤化することができる。カプセル剤は酸化防止剤及び該当ＰＵＦＡと共にこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに封入することにより製造することができる。酸化防止剤とＰＵＦＡ成分は上記基準に合うようにする。
【００９７】
静脈内投与には、本発明により生産したＰＵＦＡ又はその誘導体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ（登録商標）等の市販製剤に配合すればよい。典型的な健常成人血漿脂肪酸プロフィルはＡＡ６．６４〜９．４６％、ＤＧＬＡ１．４５〜３．１１％、及びＧＬＡ０．０２〜０．０８％である。患者で正常脂肪酸プロフィルに達するようにこれらのＰＵＦＡ又はその代謝前駆物質を単独又は他のＰＵＦＡと併用して投与することができる。所望により、製剤の各成分を単一又は多重使用可能なキット形態で個々に提供してもよい。特定脂肪酸の典型的な用量は０．１ｍｇ〜２０ｇ（１００ｇまで）／日であり、１０ｍｇ〜１、２、５又は１０ｇ／日が好ましい。
【００９８】
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては例えば経腸（例えば経口及び直腸）と非経腸が挙げられる。例えば、液体製剤を例えば経口又は直腸投与することができる。更に、均一混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下に生理的に許容可能な希釈剤、防腐剤、緩衝液又は推進剤と混合し、スプレー又は吸入剤を形成することができる。投与経路は当然のことながら所望効果に依存する。例えば、肌荒れ、乾燥又は老化の治療や、皮膚損傷又は火傷の治療や、疾病又は障害により損傷した皮膚又は毛髪の治療に組成物を利用する場合には、局所塗布すればよいと思われる。
【００９９】
組成物の患者投与量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年齢、患者の免疫状態等の種々の因子により異なる。
【０１００】
剤形としては、組成物は例えば液剤、分散液、懸濁液、エマルション又は後で再構成する滅菌粉末とすることができる。
【０１０１】
本発明は更に本明細書に記載する医薬及び／又は栄養組成物の使用による各種疾患の治療にも関する。特に、本発明の組成物は血管形成後再狭窄の治療に使用することができる。更に、炎症、関節リウマチ、喘息及び乾癬の症状も本発明の組成物で治療することができる。ＰＵＦＡはカルシウム代謝に関与していることも分かっているので、本発明の組成物は恐らく骨粗鬆症や腎臓又は尿管結石の治療又は予防にも利用できると思われる。
【０１０２】
更に、本発明の組成物は癌の治療にも使用できる。悪性細胞は脂肪酸組成の変化が示されている。脂肪酸を加えるとその増殖が抑制され、細胞死を生じ、化学治療剤感受性を増すことが分かっている。更に、本発明の組成物は癌に伴う悪液質の治療にも有用であると思われる。
【０１０３】
本発明の組成物は糖尿病の治療にも使用することができる（例えば米国特許第４，８２６，８７７号とＨｏｒｒｏｂｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｖｏｌ．５７（Ｓｕｐｐｌ．）７３２Ｓ−７３７Ｓ参照）。糖尿病動物では脂肪酸代謝及び組成の変化が示されている。
【０１０４】
更に、デサチュラーゼ酵素の使用により直接又は間接的に製造したＰＵＦＡを含む本発明の組成物は湿疹治療、血圧降下及び検査数値の改善にも使用できる。更に、本発明の組成物は血小板凝固、血管拡張の誘導、コレステロールレベル低下、血管平滑筋及び繊維組織の増殖抑制（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｐ．８５−１０１，１９７６）、胃腸出血及び非ステロイド抗炎症薬の他の副作用（米国特許第４，６６６，７０１号参照）の緩和又は予防、子宮内膜症や月経前症候群（米国特許第４，７５８，５９２号参照）の予防又は治療、並びにウイルス感染後の筋肉痛、脳脊髄炎及び慢性疲労（米国特許第５，１１６，８７１号参照）の治療にも使用できる。
【０１０５】
本発明の組成物の他の用途としてはＡＩＤＳ、多発性硬化症及び炎症性皮膚疾患の治療と、健康維持が挙げられる。
【０１０６】
更に、本発明の組成物は化粧目的にも利用できる。混合物を形成するように既存化粧品組成物に添加してもよいし、単独組成物として使用してもよい。
【０１０７】
獣医用途
動物は要求及び条件の多くがヒトと同一であるので、上記医薬及び栄養組成物は動物（即ち家畜又は非家畜）でもヒトと同様に利用できる。例えば、本発明の油又は酸は動物又は水産養殖飼料添加物、動物代用飼料、動物ビタミン又は動物局所軟膏に利用することができる。
【０１０８】
以下、実施例により本発明を説明するが、これにより発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０９】
真菌からのデサチュラーゼ単離とｃＤＮＡライブラリー構築のための縮重オリゴヌクレオチドの設計
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ）（ＡＴＣＣ５６８５１）の脂肪酸組成物を分析した処、相当量のアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ｎ−３）が存在することが判明した。そこで、この生物はリノレン酸（ＬＡ，１８：２ｎ−６）をγ−リノレン酸（ＧＬＡ，１８：３ｎ−６）に変換することが可能な活性Δ６−デサチュラーゼとジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ ｎ−６）をアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）に変換する活性Δ５−デサチュラーゼを含有していると思われた（図１）。更に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａはＡＲＡをＥＰＡに不飽和化することが可能なΔ１７−デサチュラーゼも含有していると思われた。
【０１１０】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）（ＡＴＣＣ３４３０４）の脂肪酸組成物を分析した処、ＡＲＡとＥＰＡのみならずアドレン酸（ＡＤＡ，２２：４ｎ−６）、ω６−ドコサペンタエン酸（ω６−ＤＰＡ，２２：５ｎ−６）、ω３−ドコサペンタエン酸（ω３−ＤＰＡ，２２：５ｎ−３）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ｎ−３）等の長鎖ＰＵＦＡも検出された。従って、Δ６、Δ５及びΔ１７−デサチュラーゼに加え、Ｔ．ａｕｒｅｕｍはＡＤＡをω３−ＤＰＡ又はω６−ＤＰＡをＤＨＡに変換するΔ１９−デサチュラーゼ及び／又はＡＤＡをω６−ＤＰＡ又はω３−ＤＰＡをＤＨＡに変換するΔ４−デサチュラーゼを恐らく含有していると思われた。そこで、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａとＴ．ａｕｒｅｕｍからこれらの推定デサチュラーゼ遺伝子を単離し、最終的に代替宿主で発現させることにより機能を確認することを目的にした。
【０１１１】
機能的デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するために、生物毎にｃＤＮＡライブラリーを構築した。Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）をジャガイモデキストロース培地Ｄｆｃｏ＃３３６（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）で室温で４日間絶えず撹拌しながら培養した。チーズクロス数層で濾過することにより菌糸体を回収し、乳鉢乳棒を使用して液体窒素中で培養物を粉砕した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用して全ＲＮＡを精製した。
【０１１２】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）細胞を光照射下にＢＹ＋培地（Ｄｉｆｃｏ＃７９０）で室温で４日間絶えず撹拌（２５０ｒｐｍ）しながら培養し、最大バイオマスを得た。これらの細胞を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離により回収し、ＲＮアーゼを含まない氷冷水で濯いだ。これらの細胞を次にフレンチプレスで１０，０００ｐｓｉで溶解させ、溶解細胞をＴＥ緩衝フェノールに直接集めた。フェノール：クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）抽出の反復後にクロロホルム抽出により細胞溶解液から蛋白質を取出した。０．３Ｍ（終濃度）酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）とイソプロパノール１容量を使用して水相から核酸を−７０℃で３０分間沈殿させた。沈殿した核酸を１５，０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離して集め、５分間減圧乾燥した後、１×ＤＮアーゼ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０；５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中ＤＮアーゼＩ（無ＲＮアーゼ）で１５分間室温で処理した。５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用してＲＮＡを更に精製した。
【０１１３】
オリゴｄＴセルロース樹脂を使用して各生物の全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＸＲライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して２本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターに指向性クローニングした（５’ＥｃｏＲＩ／３’ＸｈｏＩ）。Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ及びＴ．ａｕｒｅｕｍライブラリーは各平均インサート寸法約７００ｂｐのクローン約２．５×１０６個を含んでいた。液体窒素中で培養物を粉砕することによりＳ．ｄｉｃｌｉｎａとＴ．ａｕｒｅｕｍの培養物を生産するＰＵＦＡからのゲノムＤＮＡを単離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。
【０１１４】
採用したアプローチは公知デサチュラーゼで保存されているアミノ酸モチーフを示す縮重オリゴヌクレオチド（即ちプライマー）を設計することであった。これらのプライマーをＰＣＲ反応で使用すると、真菌から推定デサチュラーゼ遺伝子に保存領域を含むフラグメントを同定することができた。真菌デサチュラーゼとしてはＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａからΔ５及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子（夫々Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５０、ＡＢ０２００３２）しか同定されていないので、これらの縮重プライマーの設計時には植物だけでなく動物からのデサチュラーゼ配列も考慮した。これらの縮重プライマーの設計には以下の生物からの公知Δ５及びΔ６−デサチュラーゼ配列を使用した。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ及びＲｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ。使用した縮重プライマーは以下の通りであり、ＣＯＤＥＨＯＰ Ｂｌｏｃｋｍａｋｅｒプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ／ｃｏｄｅｈｏｐ．ｈｔｍｌ）を使用した。
【０１１５】
【化１】
【０１１６】
更に、公知Δ６−デサチュラーゼに存在する第２及び第３の保存「ヒスチジンボックス」に基づいて他の２種のプライマーを設計した。
【０１１７】
【化２】
【０１１８】
オリゴヌクレオチド配列の縮重コードはＢ＝Ｃ，Ｇ，Ｔ；Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｔ；Ｓ＝Ｃ，Ｇ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｙ＝Ｃ，Ｔ；Ｄ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，又はＴ／Ｕ，不明又はその他とした。
【実施例２】
【０１１９】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
塩化リチウム法（Ｈｏｇｅら，Ｅｘｐ．Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（１９８２）６：２２５−２３２）を使用してＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）から全ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）とキットに付属のオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを使用して全ＲＮＡ５μｇを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。
【０１２０】
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を単離するために、上記縮重オリゴヌクレオチドの各種順列と組合せをＰＣＲ反応で使用した。試験した各種プライマー組合せのうちで明白なバンドを生じたプライマーはＲＯ８３４／ＦＯ８３８のみであった。第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ及び各プライマー２ｐｍｏｌを含有する１００μｌ容量中でＰＣＲ増幅を実施した。４２℃と４５℃の２種の異なるアニール温度で熱サイクルを実施し、これらの２種のＰＣＲ反応を組合せ、１．０％アガロースゲル上で分解し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して〜１００ｂｐバンドをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の仕様通りに使用してこれらのフラグメントの突出末端を「充填」し、これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。
【０１２１】
こうして従来同定されているΔ６−デサチュラーゼに配列相同を示すクローン２個を単離した。これらのクローンは次のように説明される。
【０１２２】
ａ．クローン＃２０−２を部分配列決定した処、７０２ｂｐからの推定アミノ酸配列はＴｆａｓｔＡ検索における最高得点としてＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａからのΔ６−デサチュラーゼと３０．２％の一致を示した。
【０１２３】
ｂ．クローン＃３０−１を部分配列決定した処、６８７ｂｐの推定アミノ酸配列はＴｆａｓｔＡ検索における最高得点としてＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａのΔ６−デサチュラーゼと４８．５％の一致を示した。これらの２種の配列は相互にオーバーラップしており、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの単一推定Δ６−デサチュラーゼに属すると思われた。次にこの新規Δ６−デサチュラーゼ配列を使用し、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから全長Δ６−デサチュラーゼ遺伝子の３’及び５’末端を検索するためのプライマーを設計した。
【０１２４】
３’末端を単離するために、鋳型としてｃＤＮＡライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡとオリゴヌクレオチドＲＯ９２３（配列番号７）（５’−ＣＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＣ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。オリゴヌクレオチドＲＯ９２３はこの推定Δ６−デサチュラーゼの＃２０−２フラグメントに基づいて設計し、オリゴヌクレオチドＲＯ８９９はｃＤＮＡライブラリーの作製に使用したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターからの配列に対応する。各プライマー１０ｐｍｏｌとＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して増幅を実施した。試料をまず９４℃で３分間変性した後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間を３０サイクル実施した。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。ＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分解し、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して精製した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の仕様通りに使用してこれらのフラグメントの末端を「充填」し、これらのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。クローンｓｄ２−２は９５８ｂｐインサートを含んでおり、公知Δ６−デサチュラーゼとの配列相同に基づいて推定Δ６−遺伝子の３’末端を含み、更に「ＴＡＡ」停止コドンとＰｏｌｙ Ａテールを含むことが確認された。
【０１２５】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａからこのΔ６−デサチュラーゼの５’末端を単離するために、先に同定した＃３０−１フラグメントの配列に基づいてオリゴヌクレオチドＲＴＯ９３９（配列番号９）（５’−ＣＧＴＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＴＧＡＧＣＧＣＣＧ−３’）を設計した。このオリゴヌクレオチドを（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターの配列に基づいて設計した）ＲＯ８９８（配列番号１０）（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）と併用し、ｃＤＮＡライブラリーからのΔ６−デサチュラーゼの５’末端をＰＣＲ増幅した。この場合には、このΔ６−デサチュラーゼの５’末端に存在すると予想されるＧＣリッチ領域が生じるというＰＣＲ増幅問題を解決するためにＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用した。ＰＣＲ熱サイクル条件は以下の通りとした。まず鋳型を９４℃で１分間変性した後、［９４℃で３０秒間、６８℃で３分間］３０サイクルを実施し、最後に６８℃で５分間の伸長サイクルを実施した。こうして得られたＰＣＲ産物を上記と同一のプロトコールに従ってＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。こうして新規Δ６−デサチュラーゼの「ＡＴＧ」開始部位を含む３６０ｂｐインサートを含むクローンｓｄ２１−２が得られた。このフラグメントの推定アミノ酸配列を公知Δ６−デサチュラーゼと整列させると、３７〜４５％の一致度を示した。
【０１２６】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａ ｃＤＮＡライブラリー又はＳ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅によりこの新規Δ６−デサチュラーゼ遺伝子全体を単離した。
【０１２７】
【化３】
クローンｓｄ２１−２の５’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングを助長するためのＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド。
【０１２８】
【化４】
停止コドンを含むｓｄ２−２の３’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線部）を含むオリゴヌクレオチド。
【０１２９】
ｃＤＮＡライブラリープラスミド鋳型２００ｎｇと、各プライマー１０ｐｍｏｌと、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、又はゲノムＤＮＡ２００ｎｇと、各プライマー１０ｐｍｏｌと、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。熱サイクル条件は以下の通りとした。まず鋳型を９４℃で１分間変性した後、［９４℃で３０秒間、６８℃で３分間］３０サイクルを実施し、最後に６８℃で５分間の伸長サイクルを実施した。こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングしてクローンｐＲＳＰ１（ゲノムＤＮＡ由来）及びｐＲＳＰ２（ライブラリー由来）を作製した後、配列決定し、発現試験に使用した。
【０１３０】
Δ６−デサチュラーゼ全長遺伝子インサートは長さ１３６２ｂｐ（配列番号１３、図２）であり、最初のＡＴＧから開始し、４５３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた。（Δ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０にプラスミドｐＲＳＰ１として寄託し、受託番号ＰＴＡ−２８２９を付与された。）全長遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１４、図３）はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ及びＢｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからのΔ６−デサチュラーゼに相同の領域を含んでいた。更に、全公知膜結合デサチュラーゼに存在する３個の保存「ヒスチジンボックス」（Ｏｄｕｌｅｙら，（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１４７−１５８）も含んでいた。これらはアミノ酸位置１７１〜１７６、２０８〜２１２及び３９１〜３９５に位置していた。他の膜結合Δ６−デサチュラーゼと同様に、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼにおける第３のヒスチジンボックスモチーフ（ＨＸＸＨＨ）はＱＸＸＨＨであることが判明した。この配列は５’末端にシトクロムｂ５ドメインも含んでいた。このシトクロムｂ５ドメインは多数の膜結合デサチュラーゼ酵素に存在しており、シトクロムｂ５はこれらの酵素で電子供与体として機能すると考えられる。このドメインの存在はＰＵＦＡ生産のために異種系でデサチュラーゼを発現させるときに有利であると思われる。この遺伝子は植物でＰＵＦＡ生合成経路の再構成に使用することが提案されているので、この遺伝子の塩基組成は重要であると思われる。（組換え遺伝子のうちには宿主と塩基組成が異なるために発現しにくいものがあることは公知である。この遺伝子の総Ｇ＋Ｃ含量は５９％であり、植物での発現に成功しているＭ．ａｌｐｉｎａデサチュラーゼに近似する。）
【実施例３】
【０１３１】
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）はアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ ｎ−３）の両者を生産するので、恐らくジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−６）をアラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ ｎ−６）に変換することが可能なΔ５−デサチュラーゼをもつと考えられた。
【０１３２】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからΔ５−デサチュラーゼを単離するには、Δ６−デサチュラーゼ単離と同様に第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として使用して縮重プライマーの各種組合せをＰＣＲ反応で使用した。最終反応容量５０μｌ中、第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ、各プライマー２ｐｍｏｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）１ＵのＰＣＲ条件を使用してプライマー対ＲＯ７５３及びＲＯ７５４で明白な５８８ｂｐバンドが得られた。熱サイクルは次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で１分間伸長を３５サイクル実施した。この後、７２℃で７分間の最終伸長を実施し、４℃で反応を終了した。こうして作製したこのフラグメントをクローニングし（クローン＃１８−１）、配列決定し、翻訳すると、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５４）とのアミノ酸一致度４３％と、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度３８．７％を示した。二次ＰＣＲフラグメントは実施例２に記載した反応でプライマーＲＯ８３４とＲＯ８３８を使用して同定した。約１０００ｂｐ長のこのフラグメントをクローニングした処（クローン＃２０−８）、７７５ｂｐに由来する推定アミノ酸配列はＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度４２％を示した。これらの２種の配列＃１８−１及び＃２０−８は相互にオーバーラップしており、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの単一推定Δ５−デサチュラーゼに属すると思われた。次にこれらの配列を使用し、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａのｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから新規Δ５−デサチュラーゼの３’及び５’末端を検索するためのプライマーを設計した。
【０１３３】
この推定Δ５−デサチュラーゼの３’末端を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーから精製したプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、オリゴヌクレオチドＲＯ８５１（配列番号１５）（５’−ＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＧＴＡＣＣＴＴＧＣＧＡＴＣ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅を実施した。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドＲＯ８５１はこの推定Δ５−デサチュラーゼの＃１８−１フラグメントに基づいて設計し、オリゴヌクレオチドＲＯ８９９はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）ベクターからの配列に対応する。鋳型プラスミドＤＮＡ２００ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌ及びＴａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して増幅を実施した。試料をまず９４℃で３分間変性した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３５サイクルを実施した。７２℃で７分間の最終伸長サイクルを実施した後に反応を終了した。ＰＣＲフラグメントを実施例２に記載したプロトコールに従ってＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、クローンを配列決定した。クローンｓｄ１２−１１は公知Δ５−デサチュラーゼとの配列相同に基づいて推定Δ５−遺伝子の３’末端を含み、更に「ＴＡＡ」停止コドンとポリＡテールを含む６４８ｂｐインサートを含んでいた。
【０１３５】
プライマーＲＯ９４１及びＲＯ８９８を使用してＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａからこのΔ５−デサチュラーゼの５’末端を単離した。このオリゴヌクレオチドＲＯ９４１（配列番号１６）（５’−ＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＴＧＧＴＡＣＧＡＧＴＣＧＡＡＣＧＴＧ−３’）は先に同定した＃２０−８フラグメントの配列に基づいて設計した。ｃＤＮＡライブラリープラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、このオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクターの配列に基づいて設計した）ＲＯ８９８（配列番号１０）（５’−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’）と併用した。ここではＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用し、熱サイクル条件は以下の通りとした。初期変性を９４℃で１分間実施した後、［９４℃で３０秒間変性、６８℃で３分間アニーリング及び伸長］３０サイクルを実施し、６８℃で５分間の最終伸長サイクルを実施した。これらのＰＣＲ産物を上記と同様に精製し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、配列決定した。クローンｓｄ２４−１は新規Δ５−デサチュラーゼの推定「ＡＴＧ」開始部位を含む２９５ｂｐインサートを含むことが確認された。このフラグメントの推定アミノ酸配列を分析した処、公知Δ５−デサチュラーゼと相同性の高い領域を示し、シトクロムｂ５ドメインも存在することが判明した。
【０１３６】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａゲノムＤＮＡを鋳型として下記オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ増幅により全長Δ５−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。
【０１３７】
ａ．クローンｓｄ２４−１の５’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングを助長するためのＥｃｏＲＩ部位（下線部）を含むＲＯ９５３（配列番号１７）（５’−ＡＣＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＧＣＧＣ−３’）、及び
ｂ．停止コドンを含むｓｄ１２−１１の３’末端からの配列と酵母発現ベクターへのクローニングのためのＸｈｏＩ部位（下線部）を含むＲＯ９５６（配列番号１８）（５’−ＡＡＡＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＧＴＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣ−３’）。
【０１３８】
「全長」遺伝子のＰＣＲ増幅条件はゲノムＤＮＡからのΔ６−デサチュラーゼの増幅について記載したと同様とした（実施例２）。こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで消化し、酵母発現ベクターｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。クローンｐＲＳＰ３（ゲノムＤＮＡ由来）は１４１３ｂｐインサートを含むことが判明したので発現試験に使用した。
【０１３９】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからの推定Δ５−デサチュラーゼの１４１３ｂｐ全長遺伝子（配列番号１９、図４）は４７１アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた（配列番号２０、図５）。（Δ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１月２３日付けで（プラスミドｐＲＳＰ３として）寄託し、受託番号ＰＴＡ−２９２８を付与された。）この翻訳蛋白質はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５４）とのアミノ酸一致度４０．５％と、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍΔ５−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０２９３１１）との一致度３９．５％を示した。更に、アミノ酸位置１８６〜１９０、２２３〜２２８、４０６〜４１０に３個の保存「ヒスチジンボックス」も含んでいた。Δ６−デサチュラーゼと同様に、この配列は５’末端にシトクロムｂ５ドメインも含んでいた。この遺伝子の総Ｇ＋Ｃ含量は６１．５％であった。
【実施例４】
【０１４０】
パン酵母におけるＳ．ｄｉｃｌｉｎａデサチュラーゼ遺伝子の発現
ｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした全長Δ６−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＳＰ２と、ｐＹＸ２４２にクローニングした全長Δ５−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＳＰ３をコンピテントＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株３３４に形質転換した。酵母形質転換はＡｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を製造業者の指定した条件に従って使用して実施した。ロイシンを欠失する培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。これらのクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質５０μＭの存在下に形質転換体を増殖させた。
【０１４１】
ａ．ステアリン酸（１８：０）（オレイン酸への変換はΔ９−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４２】
ｂ．オレイン酸（１８：１）（リノレン酸への変換はΔ１２−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４３】
ｃ．リノレン酸（１８：２ ｎ−６）（α−リノレン酸への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４４】
ｄ．α−リノレン酸（１８：３ ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４５】
ｅ．ジホモγ−リノレン酸（２０：３ ｎ−３）（アラキドン酸への変換はΔ５−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１４６】
陰性対照株は未変異ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４とし、同時に増殖させた。培養液を激しく撹拌し（２５０ｒｐｍ）、各種基質５０μＭ（終濃度）の存在下に２４℃で４８時間増殖させた。細胞をペレット化し、メタノール中でボルテックスし、クロロホルムと（内部標準として）トリトリデカノインを加えた。これらの混合物を室温で少なくとも１時間又は４℃で一晩インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウム１ｇを使用してＷｈａｔｍａｎフィルターで濾過し、粒状物と残留水を除去した。有機溶媒を窒素流下に４０℃で蒸発させた。次に、メタノール中０．５Ｎ水酸化カリウム２ｍｌを密閉管に加えることによりガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）に備えて抽出した脂質を脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。試料を９５℃〜１００℃まで３０分間加熱し、室温まで冷却した。メタノール中１４％三弗化ホウ素約２ｍｌを加え、加熱を繰返した。抽出した脂質混合物が冷却した後、水２ｍｌとヘキサン１ｍｌを加え、ＧＣ分析のためにＦＡＭＥを抽出した。産物を（産物＋添加基質）の和で割って１００を掛けることにより変換率を計算した。
【０１４７】
表１は添加基質の変換率に基づく単離遺伝子の酵素活性を示す。Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＰ１クローンは１８：２ｎ−６基質の２８％を１８：３ｎ−３に変換すると共に、１８：３ｎ−３基質の３７％を１８：４ｎ−３に変換した。これは遺伝子がΔ６−デサチュラーゼをコードすることを裏付けている。この場合にはバックグラウンド（基質の非特異的変換）はなかった。（本明細書に引用する表は末尾にまとめて示す。）
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａからのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を含むｐＲＳＰ３クローンは加えた２０：３ｎ−６基質の２７％を２０：４ｎ−６に変換することができ、この遺伝子によりコードされる酵素がΔ５−デサチュラーゼであることを示している。この場合もバックグラウンド基質変換は検出されなかった。このデータは種々の基質特異性をもつデサチュラーゼを異種系で発現させることができ、更にポリ不飽和脂肪酸を生産するために使用できることを示している。
【０１４８】
表２は指定プラスミドを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４から抽出した全脂質の百分率として目的脂肪酸を示す。増殖培地にグルコースは加えなかった。アフィニティガスクロマトグラフィーを使用して各脂質を分離した。ＧＣ／ＭＳを利用して生成物を同定した。この表から明らかなように、外部から加えた基質は遊離形態で加えた場合には組換え酵母により取込まれ、その膜に取込まれる。Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を含む酵母クローン（ｐＲＳＰ１）では、ＬＡ（１８：２）を基質として加えた場合にＧＬＡ（γ−１８：３）が新規ＰＵＦＡとして同定され、ＤＧＬＡ（２０：３）を基質として加えた場合にはΔ５−デサチュラーゼ遺伝子を含む酵母（ｐＲＳＰ３）でアラキドン酸が検出された。
【実施例５】
【０１４９】
Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母である酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にヒトエロンガーゼ遺伝子（配列番号２１）を含むクローンであるｐＲＡＥ７３−Ａ３でプラスミドｐＲＳＰ１（６Δ）及びｐＲＳＰ３（Δ５）を夫々同時形質転換した。このエロンガーゼ遺伝子はＰＵＦＡ経路の伸長段階の一部を触媒する。ロイシンとウラシルを欠失する最少培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ−Ｕｒａ］）で同時形質転換体を選択した。
【０１５０】
表３は基質ＬＡ（１８：２ ｎ−６）５０μＭを加えた場合にΔ６−デサチュラーゼがこの基質をＧＬＡ（１８：３ ｎ−６）に変換し、エロンガーゼがＧＬＡに炭素２個を加えてＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）を生産できることを示す。これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は２６．４％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。同様に、同時形質転換酵素はＡＬＡ（１８：３ｎ−３）に作用して最終的に変換率３４．３９％で（２０：４ｎ−３）を形成することができる。従って、Ｓ．ｄｉｃｌｉｎａΔ６−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができた。
【０１５１】
表４はｐＲＳＰ３（Δ５）／ヒトエロンガーゼ同時形質転換実験の結果を示す。この場合には、基質ＧＬＡ（１８：３ ｎ−６）をヒトエロンガーゼによりＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）に変換し、これをＳ．ｄｉｃｌｉｎａΔ５−デサチュラーゼの作用により更にＡＲＡ（２０：４ｎ−６）に変換した。これらの同時形質転換酵素による基質から終産物への変換率は３８．６％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。
【０１５２】
この場合に試験した他の基質はＳＴＡ（１８：４ｎ−３）であり、２種の酵素の共同作用により最終的にＥＰＡ（２０：５ｎ−３）に変換された。ｐＲＳＰ１とｐＲＳＰ３をＭ．ａｌｐｉｎａに由来するエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＳＰ２）（配列番号２２）で同時形質転換した場合にも同様の結果が観察され、両者遺伝子は相互の存在下に機能的であることが判明した（表３及び表４参照）。
【実施例６】
【０１５３】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
推定デサチュラーゼを単離するために、実施例２に記載したように全ＲＮＡを単離した。実施例２に示したようなＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して全ＲＮＡ約５μｇを逆転写し、第１鎖ｃＤＮＡを作製した。５０μｌ反応でｂｌｏｃｋ ｍａｋｅｒプログラムで設計した縮重プライマーＲＯ８３４（配列番号１）及び８３８（配列番号４）を使用し、第１鎖ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸２００μＭ、各プライマー２ｐｍｏｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を併用した。熱サイクルは次のように実施した。９４℃で３分間の初期変性後に９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング及び７２℃で１分間伸長を３５サイクル実施した。この後、７２℃で７分間の最終伸長を実施した。１％アガロースゲル上で約１０００ｂｐの２つの弱いバンドを分離し、切出し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製した。実施例２に記載したように末端にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを充填し、平滑末端フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。得られたクローンを配列決定した処、クローン３０−９からの６８０ｂｐの部分配列が確認され、その２２６アミノ酸の翻訳はゼブラフィッシュ成魚からのΔ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＷ２８１２３８）とのアミノ酸一致度３１．５％であった。ヒトΔ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１２６７９９）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（コケ）Δ６−デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２２２９８０）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）Δ８−スフィンゴ脂質デサチュラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２２４１６０）及びヒトΔ５−デサチュラーゼ（ＡＴＣＣ受託番号２０３５５７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１９９５９６）とも同程度のアミノ酸相同度（２９．６％〜２８．７％）が認められた。公知デサチュラーゼと相当程度のアミノ酸相同度があったので、推定デサチュラーゼをコードする全長遺伝子について酵母発現時のその活性を求めた。
【０１５４】
遺伝子の３’末端を単離するために、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中反応容量１００μｌでＴ．ａｕｒｅｕｍ ｃＤＮＡライブラリーからの精製プラスミド１００ｎｇとの反応でプライマーＲＯ９３６（配列番号２３）（５’−ＧＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＡＧＡＧ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’）１０ｐｍｏｌを併用した。熱サイクル条件は次のように実施した。９４℃で３分間の初期溶融後に９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で３分間を３０サイクル実施した。この後、７２℃で１０分間の伸長段階を実施した。１．２ｋｂの予想寸法を含む数個のバンドを上述のように１％アガロースゲル上で分離し、精製した。同じく上述のように、フラグメントの末端を平滑にし、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングし、配列決定した。約１．２ｋｂのフラグメント＃７０−２を配列決定した処、フラグメント３０−９とオーバーラップするオープンリーディングフレームと停止コドンを含んでいた。
【０１５５】
遺伝子の５’末端を単離するために、ＲＯ９３７（配列番号２４）（５’−ＡＡＡＣＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧ−３’）及びＲＯ８９９（配列番号８）を５０μｌ ＰＣＲ反応で使用し、ライブラリーからの精製プラスミドＤＮＡ１００ｎｇと各プライマー１０ｐｍｏｌを使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコール通りに使用した。熱サイクル条件は以下の通りとした。初期変性を９４℃で１分間実施した後、［９４℃で３０秒間変性、６８℃で３分間アニーリング及び伸長］３０サイクルを実施し、６８℃で５分間の最終伸長サイクルを実施した。予想寸法範囲にある約５００ｂｐのバンドを上述のようにゲル精製し、平滑末端化し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングした。クローン９５−２はオープンリーディングフレームと出発コドンを含んでいた。このフラグメントもクローン３０−９とオーバーラップしており、確かに同一遺伝子の部分であると思われた。
【０１５６】
全長遺伝子を単離するために、夫々ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断される制限部位３’及び５’（下線部）をもつ以下のプライマー、即ち５’プライマーＲＯ９７２（配列番号２５）（５’−ＡＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣ−３’）、３’プライマーＲＯ９４９（配列番号２６）（５’−ＣＴＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣ−３’）及び３’プライマーＲＯ９５０（配列番号２７）（５’−ＣＴＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＧＧＣＴＣＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＡＧＴＧＧＣ−３’）を設計した。停止コドンを含むプライマーＲＯ９４９はＧＣ含量６６％であるが、停止コドンの外側の別のプライマーＲＯ９５０はＧＣ含量が５６％しかないので、初期単離の試みでは遺伝子の３’末端に２種のプライマーを使用した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を前項で記載したと同一条件下で使用してＲＯ９７２／ＲＯ９４９及びＲＯ９７２／９５０により５０μｌ ＰＣＲ反応を実施した。ＲＯ９７２／９５０プライマー対のみが約１．６ｋｂのバンドを生じた。（標的１００ｎｇと同一条件で）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した場合にも同様の寸法のバンドが得られた。フラグメントを上述のようにアガロースゲル上で分離し、ゲル精製し、平滑末端化し、ＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔにクローニングした。フラグメントを配列決定により評価し、多数のクローンをＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切断して全長遺伝子を切出し、Ｒａｐｉｄライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で予め処理しておいたｐＹＸ２４２ ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩに連結した。クローン９９−３（ｐＲＴＡ４と言う）は１３１７ｂｐの全長遺伝子（配列番号２８、図６）と４３９ａａのオープンリーディングフレーム（配列番号２９、図７）を含んでいた。（Δ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列はブダペスト条約に基づき、ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０に２００１年１月２３日付けで寄託し、受託番号ＰＴＡ−２９２７を付与された。）この遺伝子はアミノ酸番号１７１〜１７５、２０８〜２１２、及び３７６〜３８０に３個のヒスチジンボックスを含んでいた。この遺伝子の５’末端を翻訳すると、シトクロムｂ５との相同を示す。
【実施例７】
【０１５７】
パン酵母におけるＴ．ａｕｒｅｕｍデサチュラーゼ遺伝子の発現
全長遺伝子を含むクローンｐＲＴＡ４を実施例４に記載したように酵母宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４に形質転換し、選択培地にプレーティングした。ロイシンを欠失する最少培地に基質として表５に示すように外因遊離脂肪酸５０μＭを加え、培養液を２４℃で４８時間増殖させた。基質変換はＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＡＲＡ（２０：４ｎ−６）のみであった。添加したＤＧＬＡの２３．７％が変換され、この遺伝子はΔ５−デサチュラーゼをコードすることがわかる。
【０１５８】
表６は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。Δ５−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド（酵母発現プラスミドＰＹＸ２４２を含む陰性対照で観察されるＡＲＡの検出）はなかった。
【実施例８】
【０１５９】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍデサチュラーゼとエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母発現ベクターｐＹＥＳ２に、ＰＵＦＡ経路の更なる酵素、ヒトエロンガーゼ遺伝子を含むｐＲＡＥ７３−Ａ３、でプラスミドｐＲＴＡ４を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。
【０１６０】
表７は基質ＤＧＬＡ１００μＭを加えた場合にΔ５−デサチュラーゼがＡＬＡを生産し、エロンガーゼがＡＬＡに炭素２個を加えてＡＤＡを生産できることを示す。ＡＲＡとＡＤＡ（産物）の両者から構成されるＴ．ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼの変換率は１６．７％であり、陰性対照からバックグラウンドは観察されない。
【０１６１】
以上の結果、Ｔ．ａｕｒｅｕｍΔ５−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができる。
【実施例９】
【０１６２】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｔ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマー対ＲＯ８３４／ＲＯ８３６を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｂｉｃｏｎ Ｉｎｄｉａ Ｌｔｄ．，Ｂａｎｇｌｏｒｅ，Ｉｎｄｉａ）からゲノムＤＮＡを調製した。プライマーＲＯ８３４（５’−ＧＴＢ ＴＡＹ ＧＡＹＧＴＢ ＡＣＣ ＧＡＲ ＴＧＧ ＧＴＢ ＡＡＧ ＣＧＹ ＣＡＹ ＣＣＢ ＧＧＨ ＧＧＨ−３’）（配列番号１）及びＲＯ８３８（５’−ＣＡＴ ＧＧＴ ＶＧＧ ＲＡＡ ＳＡＧ ＲＴＧ ＲＴＧ ＹＴＣ ＲＡＴ ＣＴＧ ＲＴＡ ＧＴＴ−３’）（配列番号３６）を使用してＴ７０９１ ｇＤＮＡを増幅した。単離Ｔ７０９１ ｇＤＮＡ ５μｌ、０．２ｍ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液１０μｌ及びｃＤＮＡポリメラーゼ１．０Ｕを含む１００μｌ容量中でＰＣＲ増幅を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５サイクル実施した。ＰＣＲ後に７２℃で７分間の付加伸長段階を実施した。ＰＣＲ増幅混合物を１％アガロースゲル上で泳動させ、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して約１．２Ｋｂ及び１．４Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してこれらのフラグメントの突出末端を「充填」し、単離フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
【０１６３】
２４個のクローンを調製し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。翻訳配列をクエリーとして使用し、ｔＦａｓｔＡアルゴリズム（蛋白質クエリー配列と任意群のヌクレオチド配列の類似性に関するＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ検索）を使用してＧｅｎＥｍｂ１データベース（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を検索した。遺伝子フラグメントＴ７０９１Ｂ２は公知データベースと一致があったので更に調べた。Ｔ７０９１Ｂ２はヒトΔ５−デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２２５２７３）と３６２アミノ酸で一致度２６．８％であった。
【０１６４】
３’及び５’末端を単離するために、Ｔ７０９１Ｂ２内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。新規プライマーとベクタープライマーを使用して平均インサート寸法１Ｋｂのクローン約２×１０７個を含むＴ７０９１ ｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲ増幅した。ベクタープライマーＲＯ８９８（５’−ＣＣＣ ＡＧＴ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ Ｇ−３’）（配列番号１０）及びＲＯ８９９（５’−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ−３’）（配列番号８）と併用した場合にクローンＴ７０９１Ｂ２でより多量の５’及び３’配列を生産したプライマーは夫々ＲＯ１０６５（５’−ＣＧＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＧＴ ＣＣＡ ＡＡＴ Ｃ−３’）（配列番号３７）及びＲＯ１０６４（５’−ＣＧＣＣＴＴ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＴＡＣ ＧＧＡ ＡＴＴ ＧＧＧ−３’）（配列番号３８）であった。Ｔ７０９１Ｂ２ ５’及び３’配列に基づいて２種の新規プライマーを設計した。
【０１６５】
ａ．付加ＮｃｏＩ制限部位（下線部）をもつＲＯ１０９７（５’−ＣＴＴ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＧＧ ＧＡＧ−３’）（配列番号３９）。
【０１６６】
ｂ．ＲＯ１０９８（５’−ＴＧＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＣＣ−３’）（配列番号４０）。
【０１６７】
この新規Δ５−デサチュラーゼはＴ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１ ｇＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅により全体を単離した。単離Ｔ７０９１ ｇＤＮＡ １μｌ、０．２μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを含む５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９５℃で４５秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で２分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ増幅混合物をゲル上で泳動させ、約１．３Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）ベクターにクローニングした。２個のクローンｐＲＡＴ−２ａ及び２ｃを作製し、配列決定した。（プラスミドｐＲＡＴ−２ｃはブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、受託番号を付与された。）配列は４アミノ酸が異なり（図１２）、翻訳配列はＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）Δ５−デサチュラーゼ（実施例６参照）と４３６アミノ酸で６７．４％一致度であった。
【実施例１０】
【０１６８】
Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１（Ｔ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
Ｔ７０９１ ｃＤＮＡライブラリーからの３７３個の鋳型を配列決定し、ライブラリーの生存性を調べた。翻訳配列をクエリーとして使用し、ｔＦａｓｔＡアルゴリズムを使用してＧｅｎＥｍｂ１データベースを検索した。クローン６０２１８７２８１Ｒ１（又はクローン２８１と短縮）は数種の公知デサチュラーゼと一致していた。増幅用プライマーを設計するためにＥＳＴクローンの５’及び３’末端を配列決定した。付加ＮｃｏＩ制限部位（下線部）をもつプライマーＲＯ１１０７（５’−ＴＴＴ ＡＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ＧＡＡ ＡＡＧ−３’）（配列番号４１）と、付加ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線部）をもつＲＯ１１０８（５’−ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＡＣＴ ＧＣＧ ＣＣＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＴＧ−３’）（配列番号４２）を使用してＴ７０９１ ｇＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
【０１６９】
ＰＣＲは上述のようなＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む５０μｌ容量中で実施した。ＰＣＲ増幅混合物をゲル上で泳動させ、約１．３Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製し、単離フラグメントをｐＹＸ２４２（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＶ）ベクターにクローニングした。２個のクローンｐＲＡＴ−１ａ及び１ｂを作製し、配列決定した。配列は１アミノ酸が異なり（図１３）、翻訳配列はヒトΔ５−デサチュラーゼと４３０アミノ酸で２５％一致度であった。（プラスミドｐＲＡＴ−１ａはブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、ＡＴＣＣ受託番号―――を付与された。）
【実施例１１】
【０１７０】
パン酵母におけるＴ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１デサチュラーゼ遺伝子の発現
ｐＹＸ２４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした全長ヒトΔ５−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＡＴ−２ａ及びｐＲＡＴ−２ｃと、ｐＹＸ２４２にクローニングした全長ヒトΔ６−デサチュラーゼから構成されるクローンｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂをコンピテントＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株３３４に形質転換した。酵母形質転換はＡｌｋａｌｉ−Ｃａｔｉｏｎ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して実施した。ロイシンを欠失する培地（ＤＯＢ［−Ｌｅｕ］）で形質転換体をロイシン栄養要求性に関して選択した。ｐＲＡＴ−１ ｃＤＮＡの翻訳配列はどの特定公知デサチュラーゼとも強い一致がないので、数種の脂肪酸基質を試験して発現酵素の活性を調べた。ｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するために、下記特異的脂肪酸基質１００μＭの存在下に形質転換体を増殖させた。
【０１７１】
ａ．リノレン酸（ＬＡ，１８：２ ｎ−６）（α−リノレン酸への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示し、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７２】
ｂ．α−リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７３】
ｃ．ω６−エシコサジエン酸（ＥＤＡ，２０：２ｎ−６）（ジホモγ−リノレン酸）への変換はΔ８−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７４】
ｄ．ジホモγ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，２０：３ｎ−３）（アラキドン酸への変換はΔ５−デサチュラーゼ活性を示す）。
【０１７５】
ｐＲＡＴ−２クローンの基質は１００μＭ ＤＧＬＡであった。未改変ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４を陰性対照として使用した。ｐＲＡＥ−７３−Ａ３（即ち１８Ｃ脂肪酸を２０Ｃ脂肪酸に変換するヒトエロンガーゼ酵素を含むベクター、配列番号２１）（実施例５参照）を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４にもｐＲＡＴ−１ａとｐＲＡＴ−２ｃの両者を同時形質転換した。ｐＲＡＴ−１ａ／ｐＲＡＥ−７３−Ａ３クローンの基質はＬＡとＡＬＡであり、ｐＲＡＴ−２ｃ／ｐＲＡＩ−７３−Ａ３クローンの基質はＬＡ、ＡＬＡ及びＧＬＡであった。培養液を特定基質の存在下に選択培地で４８時間２４℃で増殖させた。実施例４に要約したように脂肪酸分析を実施した。
【０１７６】
表８は株３３４（ｐＲＡＴ−２ｃ）によるＡＡ生産を対照株３３４（ｐＹＸ２４２）によるＡＡ生産と比較した例である。ＡＡ生産量は２２．９８％であったが、対照株では検出可能な量ではなかった。３３４（ｐＲＡＴ−２ａ）株も検出可能な量のＡＡを生産しなかった（データは示さず）。２個のクローン間の４個のアミノ酸の相違により（図１２、下線部参照）３３４（ｐＲＡＴ−２ａ）株から発現される酵素は不活性になった。ＧＬＡの存在下にｐＲＡＥ−７３−Ａ３と同時発現させると、更にクローンｐＲＡＴ−２ｃからのΔ５−デサチュラーゼ活性が検出された。
【０１７７】
表９は基質ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ及びＤＧＬＡの存在下に発現させた３３４（ｐＲＡＴ−１ａ）及び３３４（ｐＹＸ２４２）株の脂肪酸分析結果である。ＬＡのΔ６−不飽和化はＧＬＡを生産し、ＥＤＡのΔ８−不飽和化はＤＧＬＡを生産し、ＤＧＬＡのΔ５−不飽和化はＡＡを生産する。対照株に比較してＴ７０９１遺伝子を含む株ではどちらからも全３種の活性が検出された。変換率によると、この酵素は基質が適正であればΔ５又はΔ８−デサチュラーゼと同様に機能することができる活性なΔ６−デサチュラーゼである。しかし、これらから夫々の不飽和化脂肪酸への変換率はΔ６−不飽和化基質に比較すると低い。２個のクローン間の単一アミノ酸変異（図１３、下線部参照）は酵素活性に影響なかった（データは示さず）。変換率を表９の下欄に示す。更にｐＲＡＴ−１ａをＬＡ又はＡＬＡの存在下にｐＲＡＥ−７３−Ａ３と同時発現させた場合にもΔ６−デサチュラーゼ活性は検出された。新規脂肪酸の生産がデサチュラーゼの活性によるのかエロンガーゼの活性によるのか、あるいは２種の酵素の組合せによるのかを調べるのは困難であるので、同時発現実験では変換率を計算しなかった。
【０１７８】
Ｔ．ａｕｒｅｕｍ ７０９１からデサチュラーゼ遺伝子を同定するために、２種の新規遺伝子単離方法が開発されている。これらの方法でＴ７０９１Δ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼ遺伝子を単離した。これらの遺伝子と適当な基質の存在質に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは対照株よりも著しく高レベルの不飽和脂肪酸を生産した。Ｔ７０９１Ｂ２遺伝子（ｐＲＡＴ−２ｃ）とヒトエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＡＥ−７３−Ａ３）を含む構築物を酵母に同時軽質転換すると、基質ＧＬＡはＡＡに変換された。本実験の結果、ｐＲＡＴ−２ｃから発現した酵素は（エロンガーゼにより生産された）ＤＧＬＡをＡＡに不飽和化することが確認された。「２８１」遺伝子（ｐＲＡＴ−１ａ）とヒトエロンガーゼ遺伝子（ｐＲＡＥ−７３−Ａ３）を含む構築物を酵母に同時軽質転換すると、基質ＬＡはＤＧＬＡに変換された。本実験の結果、ｐＲＡＴ−１ａから発現した酵素はＬＡをＧＬＡに不飽和化することが確認された。
【実施例１２】
【０１７９】
Ｉｓｏｃｈｒｙｓ ｇａｌｂａｎａ １３２３からのΔ５−デサチュラーゼヌクレオチド配列の単離
実施例１に記載した縮重プライマー対ＲＯ８３４／ＲＯ８３６を使用して部分デサチュラーゼ候補を単離した。ＤＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用してＩｓｏｃｈｒｙｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（ＣＣＭＰ），Ｗｅｓｔ Ｂｏｏｔｈｂａｙ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＡ）からゲノムＤＮＡを調製した。プライマーＲＯ８３４（５’−ＧＴＢ ＴＡＹ ＧＡＹＧＴＢ ＡＣＣ ＧＡＲ ＴＧＧ ＧＴＢ ＡＡＧ ＣＧＹ ＣＡＹ ＣＣＢ ＧＧＨ ＧＧＨ−３’）（配列番号１）及びＲＯ８３８（５’−ＣＡＴ ＧＧＴ ＶＧＧ ＲＡＡ ＳＡＧ ＲＴＧ ＲＴＧ ＹＴＣ ＲＡＴ ＣＴＧ ＲＴＡ ＧＴＴ−３’）（配列番号１０）を使用してＩ．ｇａｌｂａｎａ ｇＤＮＡを増幅した。単離Ｉ．ｇａｌｂａｎａ ｇＤＮＡ １μｌ、０．２μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、各プライマー５０ｐＭ、１０×緩衝液５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕを含む５０μｌ容量中でＰＣＲを実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクル条件を実施した。９４℃で３分間後に９５℃で４５秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で２分間を３０サイクル実施した。ＰＣＲ増幅混合物を１．０％アガロースゲル上で泳動させ、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して約１．１Ｋｂの増幅フラグメントをゲル精製した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してフラグメントの突出末端を「充填」し、単離フラグメントをＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、組換えプラスミドをＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
【０１８０】
６個のクローンを調製し、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して配列決定した。全配列は同一であった。翻訳配列はクローンｐＲＴＡ４（実施例６）でＴ．ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０３）Δ５−デサチュラーゼと３３５アミノ酸で４７．５％一致度であり、クローンｐＲＡＴ−２ｃ（実施例９）でＴ．ａｕｒｅｕｍ ＢＩＣＣ７０９１Δ５−デサチュラーゼと２７８アミノ酸で一致度４５．３％であった。
【０１８１】
５’及び３’末端を単離するために、単離Ｉ．ｇａｌｂａｎａフラグメントの内部配列に基づいて新規プライマーを設計した。遺伝子の５’末端にはＲＯ１２３５（５’−ＣＧＡ ＡＧＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＡＧＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＴＧＣ ＣＧ−３’）（配列番号４３）を使用し、遺伝子の３’末端にはＲＯ１２３２（５’−ＧＡＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＴＴ ＴＣＡ ＣＧＴ−３’）（配列番号４４）を使用した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（登録商標）酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に付属のｃＤＮＡ末端の迅速増幅又はＲＡＣＥと供に全ＲＮＡ約１．４μｇを製造業者の指示に従って使用して逆転写し、ｃＤＮＡターゲットを生産した。末端の初期増幅には、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクルプロトコールを実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で３０秒間と７２℃で３分間を１０サイクル、更に９４℃で３０秒間と６８℃で３０秒間と７２℃で３分間を２０サイクル実施した後、７２℃で１０分間の伸長を実施した。この一次ＰＣＲ反応は１０ｐｍｏｌＲＯ１２３５又はＲＯ１２３２と、夫々ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）５’プライマー（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’）（配列番号４５）又はＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）３’プライマー（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’）（配列番号４６）と、Ｔｈｅｒｍｏｚｙｍｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１ｌと、ｃＤＮＡ１μｌを最終容量５０μｌ中で製造業者の指示に従って使用して実施した。
【０１８２】
初期反応物２μｌ、入れ子プライマーＲＯ１２３４（５’−ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＴＴＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＧＣ ＡＧ−３’）（配列番号４７）又はＲＯ１２３３（５’−ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ−３’）（配列番号４８）１０ｐｍｏｌと夫々ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）入れ子５’プライマー（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’）（配列番号４９）及びＧｅｎｅＲａｃｅｒ（登録商標）入れ子３’プライマー（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’）（配列番号５０）３０ｐｍｏｌと、ＭｇＳＯ４を使用するＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（登録商標）ＰＣＲｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して入れ子反応を実施した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００で以下の熱サイクルパラメーターを実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で２分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で２分間を５サイクル、更に９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と６８℃で２分間を２０サイクル実施した後、６８℃で１０分間の伸長を実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル分析した処、５’反応で約８００ｂｐのバンドと３’反応で約１．２ｋｂのバンドが検出された。次いでＰＣＲ Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、Ｔｏｐ１０スーパーコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、配列決定した処、開始コドンと停止コドンの両者をもつオープンリーディングフレームが検出された。
【０１８３】
クローニング用制限部位（夫々下線で示したＥｃｏＲＩとＳａｌＩ）を付加したプライマーＲＯ１３０９（５’−ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＣ−３’）（配列番号５１）及びＲＯ１３１０（５’−ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＡ ＧＴＧ ＣＧＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧ−３’）（配列番号５２）を使用して全長遺伝子を単離した。上述のように、ｃＤＮＡ２μｌをターゲットとしてＭｇＳＯ４を使用するＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（登録商標）ＰＣＲｘ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って１０ｐｍｏｌのプライマーＲＯ１３０９及び１３１０と共に使用した。熱サイクルパラメーターは以下の通りで実施した。９４℃で２分間初期溶融後に９４℃で３０秒間と７２℃で２分間を５サイクル、９４℃で３０秒間と７０℃で２分間を５サイクル、更に９４℃で３０秒間と６５℃で３０秒間と６８℃で２分間を２０サイクル実施した後、６８℃で１０分間の伸長を実施した。ＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して反応の単一生成物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し、Ｒａｐｉｄライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してｐＹＸ２４２ ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ直鎖化ＤＮＡに連結し、ｐＲＩＧ−１と命名した。クローンｐＲＩＧ−１は１３２９ｂｐの全長遺伝子（配列番号３４、図１４）と４４２アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号３５、図１５）を含んでいた。（プラスミドｐＲＩＧ−１はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００２年１月付けで寄託し、ＡＴＣＣ受託番号―――を付与された。）
【実施例１３】
【０１８４】
パン酵母におけるＩ．ｇａｌｂａｎａデサチュラーゼ遺伝子の発現
全長遺伝子を含むクローンｐＲＩＧ−１を実施例４に記載したように酵母宿主Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３３４に形質転換し、選択培地にプレーティングした。ロイシンを欠失する最少培地に基質として表１０に示すように外来遊離脂肪酸５０μＭを加え、培養液を２４℃で４８時間増殖させた。基質変換はＥＴＡ（２０：４ｎ−３）からＥＰＡ（２０：５ｎ−３）とＤＧＬＡ（２０：３ｎ−６）からＡＡ（２０：４ｎ−６）であった。ＡＲＡへの変換率４５．４％、ＥＰＡへの変換率５９．７５％であり、この遺伝子はΔ５−デサチュラーゼをコードすることがわかる。表１０は酵母宿主から抽出した脂質の百分率として脂肪酸の一部を示す。Δ５−デサチュラーゼ活性についてはバックグラウンド（酵母発現プラスミドｐＹＸ２４２を含む陰性対照で観察されるＡＲＡ又はＥＰＡの検出）は殆ど又は全くなかった。
【実施例１４】
【０１８５】
Ｉ．ｇａｌｂａｎａデサチュラーゼ遺伝子とエロンガーゼの同時発現
実施例４に記載したような酵母発現ベクターｐＹＥＳ２にヒトエロンガーゼ遺伝子を含むＰＵＦＡ経路付加酵素ｐＲＡＥ７３−Ａ３でプラスミドｐＲＩＧ−１を同時形質転換し、ロイシンとウラシルを欠失する最少培地で同時形質転換体を選択した。ＤＧＬＡやＥＴＡ等の基質を加えると、Δ５−デサチュラーゼは活発にＡＲＡ又はＥＰＡを生成し、エロンガーゼが炭素２個を加えてＡＤＡ又は３−ＤＰＡを生産できる。従って、Ｉ．ｇａｌｂａｎａΔ５−デサチュラーゼは異種発現系で生成物を生産することができ、この発現系をＰＵＦＡ生合成経路からの別の異種酵素により更に利用すると予想ＰＵＦＡを生産することができる。
【０１８６】
栄養組成物
詳細な説明に記載したＰＵＦＡは種々の栄養補給剤、乳児用調製粉乳、代用栄養剤及び他の栄養溶液で利用することができる。
【０１８７】
Ｉ．乳児用調製粉乳
Ａ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）鉄分配合調製豆乳：
用途：牛乳アレルギー又は過敏症の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖を避けなければならない疾患（ラクターゼ欠乏症、乳糖不耐症及びガラクトース血症）の患者への栄養。
【０１８８】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０１８９】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、０第三リン酸カルシウム．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９０】
Ｂ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＤＦ下痢用調製豆乳：
用途：乳幼児の下痢の食物管理用短期摂取食。
【０１９１】
特徴：
−特に下痢管理用として大豆繊維からの食物繊維を加えた最初の乳児用調製乳である。
−乳児の軽度から重度の下痢期間に水状軟便期間を短くすることが臨床的に判明した。
−乳児の栄養要件を満足するように栄養学的に完全である。
−Ｌ−メチオニンを添加した大豆蛋白単離物は乳児の全必須アミノ酸の必要値を満足するか又はこれを上回る。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−炭水化物吸収を増進すると共に、損傷した消化管の吸収能を越える危険を減らすために複合炭水化物（コーンシロップと蔗糖）を使用。
−米国小児科学会栄養委員会により推奨され、乳児用調製乳法に規定されるビタミン及びミネラル値を満足するか又はこれを上回る。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
【０１９２】
成分：（パルベ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖質（蔗糖）２．５％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９３】
Ｃ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）ＳＦ鉄分入り無蔗糖調製豆乳：
用途：牛乳蛋白アレルギーもしくは過敏症又は蔗糖不耐の乳児、幼児及び成人用飲料。乳糖と蔗糖を避けなければならない疾患の患者への栄養。
【０１９４】
特徴：
−牛乳蛋白アレルギー又は過敏症の症状を避けるために大豆蛋白単離物を使用。
−乳糖に関連する下痢を避けるために無乳糖処方とした（炭水化物源はＰｏｌｙｃｏｓｅ（登録商標）グルコースポリマーである）。
−蔗糖不耐患者のために無蔗糖とした。
−浸透圧性下痢の危険を減らすために低浸透圧（１８０ｍＯｓ／ｋｇ水）とした。
−鉄欠乏症の予防を助長するために１００カロリー当たり１．８ｍｇの鉄（硫酸鉄として）を配合。
−推奨値のビタミンとミネラルを配合。
−推奨値の必須脂肪酸を提供するために植物油を配合。
−乳白色、乳状コンシステンシー及びよい香り。
【０１９５】
成分：（パルベ）水７５％、加水分解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆蛋白単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラギナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９６】
Ｄ．Ｉｓｏｍｉｌ（登録商標）２０即製鉄分配合調製豆乳、２０Ｃａｌ／液量オンス：
用途：大豆摂取を必要とする場合。
【０１９７】
成分：（パルベ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖質（蔗糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆蛋白単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０１９８】
Ｅ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）乳児用調製乳：
用途：乳児用調製乳を必要とする場合：１歳未満で授乳の中断を決定した場合、授乳の補完が必要な場合、又は授乳を採用しない際の日常食として。
【０１９９】
特徴：
−良好な成長に適した品質と量の蛋白質を使用すると共に、熱変性により乳関連腸内失血の危険を減らした。
−（二重均質化）植物油ブレンドに由来する脂肪を使用し、吸収し易い必須リノレン酸を提供する。
−人乳に似た割合の乳糖としての炭水化物を配合した。
−成長中の臓器へのストレスを最小限にするために低腎溶質負荷とした。
−粉末、濃厚液及び即製形態。
【０２００】
成分：（−Ｄ）水、脱脂乳、乳糖、大豆油、ヤシ油、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラギナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２０１】
Ｆ．Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）ＮｅｏＣａｒｅ鉄分入り早産児用調製乳：
用途：退院後の早産児の特殊栄養要件を満たす。Ｓｉｍｉｌａｃ ＮｅｏＣａｒｅは成長の遅れを取り戻し、成長を助けるために必要な付加熱量、蛋白質、ビタミン及びミネラルを提供するために開発された栄養学的に完全な処方である。
【０２０２】
特徴：
−熱量とビタミン補給の必要を減らす。標準処方（２０Ｃａｌ／液量オンス）よりも高熱量（２２Ｃａｌ／液量オンス）。
−早産児の特殊消化要件を満足し易くするために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を加えた高吸収脂肪ブレンドを使用した。
−入院中に開始した栄養補給を延長するためにより高値の１００カロリー当たり蛋白質、ビタミン及びミネラルを配合した。
−骨無鉱化を改善するためにカルシウム及びリン濃度を高くした。
【０２０３】
成分：−Ｄコーンシロップ固形分、脱脂乳、乳糖、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、高オレイン酸サフラワー油、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、βカロチン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２０４】
Ｇ．Ｓｉｍｉｌａｃ Ｎａｔｕｒａｌ Ｃａｒｅ即製低鉄分母乳強化剤、２４Ｃａｌ／液量オンス：
用途：母乳と混合するか又は出産時体重の少ない乳児に母乳の代用として与える。
【０２０５】
成分：−Ｄ水、脱脂乳、加水分解コーンスターチ、乳糖、分留ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、濃縮ホエイ蛋白、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ及びジグリセリド、大豆レシチン、カラギナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ナイアシンアミド、Ｌ−カルニチン、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウム及びシアノコバラミン。
【０２０６】
本発明の種々のＰＵＦＡは上記乳児用調製乳及び当分野で公知の他の乳児用調製乳に代用及び／又は添加することができる。
【０２０７】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。主に経口補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２０８】
患者状態：
−調整食摂取患者、
−危険な栄養状態にある高齢者、
−不随意体重減少患者、
−病気又は手術から回復中の患者、
−低残渣食が必要な患者。
【０２０９】
成分：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム。
【０２１０】
Ｂ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＢＡＲＳ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは食間又は食事と共に補充する完全にバランスのとれた補助栄養である。他のスナック菓子に代用する美味しく栄養分の高い代用食である。ＥＮＳＵＲＥ ＢＡＲＳは１本当たり乳糖含有量が＜１ｇであり、チョコレートファッジブラウニーフレーバーは無グルテンである。（ハニーグラハムクランチフレーバーはグルテンを含む。）
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者。
−十分な熱量と栄養を取込めない者に特に有用である。
−噛む能力と飲込む能力のある者。
−落花生アレルギー又は任意型のナッツアレルギーのある者には使用できない。
【０２１１】
成分：ハニーグラハムクランチ−高果糖コーンシロップ、大豆蛋白単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（トウモロコシ）、クリスプライス（米粉、糖質［蔗糖］、食塩［塩化ナトリウム］及び麦芽）、オート麦ぬか、部分加水分解解綿実油及び大豆油、大豆多糖、グリセリン、濃縮ホエイ蛋白、ポリデキストロース、果糖、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油、脱脂粉乳、ホエイ粉末、大豆レシチン及びコーン油。ナッツを加工する施設で製造。
【０２１２】
ビタミン及びミネラル：第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、食塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、オルトリン酸第二鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、βカロチン、塩酸ピリドキシン、一硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２１３】
蛋白質：ハニーグラハムクランチ−蛋白源は大豆蛋白単離物と乳蛋白のブレンドである。
大豆蛋白単離物 ７４％
乳蛋白 ２６％。
【０２１４】
脂肪：ハニーグラハムクランチ−脂肪源は部分加水分解綿実油、大豆油、キャノーラ油、高オレイン酸サフラワー油及び大豆レシチンのブレンドである。
部分加水分解綿実油及び大豆油 ７６％
キャノーラ油 ８％
高オレイン酸サフラワー油 ８％
コーン油 ４％
大豆レシチン ４％。
【０２１５】
炭水化物：ハニーグラハムクランチ−炭水化物源は高果糖コーンシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖及びオート麦ぬかの組合せである。
高果糖コーンシロップ ２４％
ブラウンシュガー ２１％
マルトデキストリン １２％
蜂蜜 １１％
クリスプライス ９％
グリセリン ９％
大豆多糖 ７％
オート麦ぬか ７％。
【０２１６】
Ｃ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは食事に付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする者のための濃縮高蛋白液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮは無乳糖無グルテンであり、一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者や、ストレス潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０２１７】
患者状態：
−付加熱量、蛋白、ビタミン及びミネラルを必要とする患者、例えば一般外科手術又は股関節骨折から回復中の者、ストレス潰瘍の危険のある患者及び低コレステロール食患者。
【０２１８】
特徴：
−低飽和脂肪、
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−濃厚でクリーミーな食感、
−優良な蛋白、カルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源、
−低コレステロール食用、
−無乳糖で消化し易い。
【０２１９】
成分：
バニラシュプリーム：−Ｄ水、糖質（蔗糖）、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸カルシウム及びナトリウム、高オレイン酸サフラワー油、大豆蛋白単離物、大豆油、キャノーラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ゲランガム、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２２０】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８５％
大豆蛋白単離物 １５％。
【０２２１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及び大豆油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
キャノーラ油 ３０％
大豆油 ３０％。
【０２２２】
ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮ中の脂肪６ｇは総熱量の２４％に相当し、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸に由来し、７．９％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２２３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＨＩＧＨ ＰＲＯＴＥＩＮはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラシュプリーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリー及びバナナ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２２４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ６０％
マルトデキストリン ４０％。
【０２２５】
チョコレート：
蔗糖 ７０％
マルトデキストリン ３０％。
【０２２６】
Ｄ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＬＩＧＨＴ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを目的とする低脂肪液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２２７】
患者状態：
−ＥＮＳＵＲＥよりも脂肪が５０％少なく、熱量が２０％少ない補給剤で付加栄養を必要とする正常体重又は超過体重患者。
−食事が適正ではなく、付加栄養を必要とする健康な成人。
【０２２８】
特徴：
−低脂肪及び低飽和脂肪。
−１回分当たり総脂肪３ｇ、コレステロール＜５ｍｇ。
−濃厚でクリーミーな食感。
−優良なカルシウム並びに他の必須ビタミン及びミネラル源。
−低コレステロール食用。
−無乳糖で消化し易い。
【０２２９】
成分：
フレンチバニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然及び人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラギナン、食塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２３０】
蛋白質：蛋白源はカゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム １００％。
【０２３１】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油とキャノーラ油の２種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ７０％
キャノーラ油 ３０％。
【０２３２】
ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴ中の脂肪３ｇは総熱量の１３．５％に相当し、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸に由来し、２．６％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量＜３０％、飽和脂肪酸由来熱量＜１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２３３】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。チョコレートフレーバーはコーンシロップも含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（フレンチバニラ、チョコレートシュプリーム、ストロベリースワール）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２３４】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ５１％
マルトデキストリン ４９％。
【０２３５】
チョコレート：
蔗糖 ４７．０％
コーンシロップ ２６．５％
マルトデキストリン ２６．５％。
【０２３６】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ ＬＩＧＨＴの１回分８液量オンスは２４種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも２５％を提供する。
【０２３７】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン２．１ｍｇを含有している。
【０２３８】
Ｅ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする場合に使用する高熱量低残渣液体食品である。経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用するか又は代用食として適量を使用することを主目的とする。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳは無乳糖無グルテンである。主に経口栄養補給剤であるが、経管供給することもできる。
【０２３９】
患者状態：
−量を制限しながら通常蛋白濃度で付加熱量及び栄養を必要とする患者。
−体重増加又は健康体重の維持を必要とする患者。
【０２４０】
特徴：
−濃厚でクリーミーな食感、
−良好な必須ビタミン及びミネラル源。
【０２４１】
成分：
バニラ：−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラギナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２４２】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高２い種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８４％
大豆蛋白単離物 １６％。
【０２４３】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油 １００％。
【０２４４】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、ストロベリー、コーヒー、バターピーカン及びエッグノッグ）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２４５】
バニラ、ストロベリー、バターピーカン、及びコーヒーフレーバー：
コーンシロップ ３９％
マルトデキストリン ３８％
蔗糖 ２３％。
【０２４６】
チョコレート及びエッグノッグフレーバー：
コーンシロップ ３６％
マルトデキストリン ３４％
蔗糖 ３０％。
【０２４７】
ビタミン及びミネラル：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳの１回分８液量オンスは２５種の主要ビタミン及びミネラルのＲＤＩの少なくとも１５％を提供する。
【０２４８】
カフェイン：チョコレートフレーバーは８液量オンス当たりカフェイン３．１ｍｇを含有している。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含有している。
【０２４９】
Ｆ．ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ（登録商標）ＨＮ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは熱量及び蛋白必要値が高いか又は耐容量の低い者を対象とした栄養学的に完全な高熱量高窒素液体食品である。経口補充用として使用してもよいし、完全経管栄養補充用として使用してもよい。ＥＮＳＵＲＥ ＰＬＵＳ ＨＮは無乳糖無グルテンである。
【０２５０】
患者状態：
−手術又は怪我後のように熱量及び蛋白必要値 が高い患者。
−耐容量が低い早期満腹患者。
【０２５１】
特徴：
−補助又は完全栄養、
−経口又は経管供給、
−１．５ＣａＶｍＬ、
−高窒素、
−高熱量密度。
【０２５２】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、コーン油、糖質（蔗糖）、大豆蛋白単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然及び人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、カラギナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミン及びビタミンＤ３。
【０２５３】
Ｇ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＯＷＤＥＲ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲ（水で再構成）は経口栄養補給剤として食事と共にもしくは食間に使用することを主目的とする低残渣液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２５４】
患者状態：
−調整食摂取患者、
−危険な栄養状態にある高齢者、
−病気／手術から回復中の患者、
−低残渣食が必要な患者。
【０２５５】
特徴：
−混合し易く簡便、
−低飽和脂肪、
−１回分当たり総脂肪９ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−高ビタミン及びミネラル、
−低コレステロール食用、
−無乳糖で消化し易い。
【０２５６】
成分：−Ｄコーンシロップ、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、大豆蛋白単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、ナイアシンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２５７】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８４％
大豆蛋白単離物 １６％。
【０２５８】
脂肪：脂肪源はコーン油である。
コーン油 １００％。
【０２５９】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲはコーンシロップとマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。ＥＮＳＵＲＥ ＰＯＷＤＥＲのマイルドな甘味にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２６０】
バニラ：
コーンシロップ ３５％
マルトデキストリン ３５％
蔗糖 ３０％。
【０２６１】
Ｈ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＰＵＤＤＩＮＧ
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは食事と共にもしくは食間に使用する非液体形態でバランスのとれた栄養を提供する濃厚栄養補給剤である。コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）や、飲込み障害のある者に適している。ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは無グルテンである。
【０２６２】
患者状態：
−コンシステンシー調整食（例えば軟食、ピューレ又は全液）摂取患者、
−飲込み障害のある患者。
【０２６３】
特徴：
−濃厚でクリーミーな良好な食感、
−良好な必須ビタミン及びミネラル源、
−冷蔵不要で簡便、
−無グルテン。
【０２６４】
５オンス当たり栄養プロフィル：熱量２５０、蛋白１０．９％、総脂肪３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０２６５】
成分：
バニラ：−Ｄ脱脂乳、水、糖質（蔗糖）、部分水素化大豆油、改質食物澱粉、硫酸マグネシウム、ラクチル酸ステアロイルナトリウム、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、塩化コリン、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２６６】
蛋白質：蛋白源は脱脂乳である。
脱脂乳 １００％。
【０２６７】
脂肪：脂肪源は水素化大豆油である。
水素化大豆油 １００％。
【０２６８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＰＵＤＤＩＮＧは蔗糖と改質食物澱粉の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート、バタースコッチ及びタピオカ）で風味低下を防止する。製品は１回分当たり乳糖９．２ｇを含有している。
【０２６９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
蔗糖 ５６％
乳糖 ２７％
改質食物澱粉 １７％。
【０２７０】
チョコレート：
蔗糖 ５８％
乳糖 ２６％
改質食物澱粉 １６％。
【０２７１】
Ｉ．ＥＮＳＵＲＥ（登録商標）ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ：
用途：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは強化食物繊維及び栄養を利用できる者を対象とした栄養学的に完全な繊維含有液体食品である。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは低残渣食を必要としない者に適している。経口又は経管供給することができ、通常食の栄養補給剤として又は適量を代用食として使用することができる。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲは無乳糖無グルテンであり、低コレステロール食を含む調整食に使用するのに適している。
【０２７２】
患者状態：
−強化食物繊維及び栄養を利用できる患者。
【０２７３】
特徴：
−低飽和脂肪、高ビタミン及びミネラルの新規改良処方、
−１回分当たり総脂肪６ｇ、コレステロール＜５ｍｇ、
−濃厚でクリーミーな食感、
−良好な繊維源、
−優良な必須ビタミン及びミネラル源、
−低コレステロール食用、
−無乳糖無グルテン。
【０２７４】
成分：
バニラ：−Ｄ水、マルトデキストリン（トウモロコシ）、糖質（蔗糖）、カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム、オート麦繊維、高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油、大豆蛋白単離物、大豆油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースゲル、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然及び人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラギナン、硫酸第一鉄、酢酸α−トコフェリル、硫酸亜鉛、ナイアシンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３及びシアノコバラミン。
【０２７５】
蛋白質：蛋白源は生物学的価値の高い２種の蛋白であるカゼインと大豆のブレンドである。
カゼイン酸ナトリウム及びカルシウム ８０％
大豆蛋白単離物 ２０％。
【０２７６】
脂肪：脂肪源は高オレイン酸サフラワー油、キャノーラ油及びコーン油の３種の油のブレンドである。
高オレイン酸サフラワー油 ４０％
キャノーラ油 ４０％
コーン油 ２０％。
【０２７７】
ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲの脂肪値は米国心臓学会（ＡＨＡ）ガイドラインに合致する。ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲ中の脂肪６ｇは総熱量の２２％に相当し、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸に由来し、６．７％はポリ不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来総熱量≦３０％、飽和脂肪酸由来熱量≦１０％、及びポリ不飽和脂肪酸由来総熱量≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２７８】
炭水化物：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲはマルトデキストリンと蔗糖の組合わせを含有している。マイルドな甘味及びフレーバーバラエティ（バニラ、チョコレート及びバターピーカン）にピーカン、チェリー、イチゴ、レモン及びオレンジのＶＡＲＩ−ＦＬＡＢＯＲＳ（登録商標）フレーバーパックを加え、風味低下を防止すると共に、患者コンプライアンスを助長する。
【０２７９】
バニラ及び他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン ６６％
蔗糖 ２５％
オート麦繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０２８０】
チョコレート：
マルトデキストリン ５５％
蔗糖 ３６％
オート麦繊維 ７％
大豆繊維 ２％。
【０２８１】
繊維：ＥＮＳＵＲＥ ＷＩＴＨ ＦＩＢＥＲで使用している繊維ブレンドはオート麦繊維と大豆多糖から構成される。このブレンドの結果、８液量オンス缶当たり総食物繊維約４ｇである。不溶性繊維と可溶性繊維の比は９５：５である。
【０２８２】
上記各種栄養補給剤は当業者に公知であり、本発明により製造したＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０２８３】
Ｊ．Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製剤
ＯｘｅｐａはＡＲＤＳ患者又はその危険のある患者の食事管理を目的とする低炭水化物高密度熱量経腸栄養製剤である。エイコサペンタエン酸（魚油由来ＥＰＡ）、γ−リノレン酸（リルヂサ油由来ＧＬＡ）及び高濃度酸化防止剤を含有する特許油ブレンドを含む特殊な成分組合せをもつ。
【０２８４】
熱量分布：熱量密度はエネルギー要求を満たすために必要な容量を最小にするように高く、１．５Ｃａｌ／ｍＬ（３５５Ｃａｌ／８液量オンス）である。Ｏｘｅｐａの熱量分布を表Ａに示す。
【０２８５】
【表１】
【０２８６】
脂肪：
−Ｏｘｅｐａは１回分８液量オンス当たり脂肪含有量２２．２ｇ（９３．７ｇ／Ｌ）である。
−脂肪源はキャノーラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ボレージ油２０％、魚油２０％、及び大豆レシチン３．２％からなる油ブレンドである。Ｏｘｅｐａの典型的な脂肪酸プロフィルを表Ｂに示す。
−Ｏｘｅｐａは表ＶＩに示すようにバランスのとれた量のポリ不飽和脂肪酸、モノ不飽和脂肪酸及び飽和脂肪酸を提供する。
−脂肪ブレンドの２５％に相当する中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されずに腸管に吸収されるので胃を空にし易い。
【０２８７】
Ｏｘｅｐａ（登録商標）栄養製品の各種脂肪酸成分は本発明により製造したＰＵＦＡに代用及び／又は補充することができる。
【０２８８】
【表２】
脂肪酸は総脂肪の約９５％である。
【０２８９】
表Ｃ．Ｏｘｅｐａの脂肪プロフィル
脂肪由来総熱量％ ５５．２
ポリ不飽和脂肪酸 ３１．４４ｇ／Ｌ
モノ不飽和脂肪酸 ２５．５３ｇ／Ｌ
飽和脂肪酸 ３２．３８ｇ／Ｌ
ｎ−６対ｎ−３比 １．７５：１
コレステロール ９．４９ｍｇ／８液量オンス
４０．１ｍｇ／Ｌ。
【０２９０】
炭水化物：
−炭水化物含量は１回分８液量オンス当たり２５．０ｇ（１０５．５ｇ／Ｌ）である。
−炭水化物源はマルトデキストリン（複合炭水化物）４５％と蔗糖質（単糖）５５％であり、いずれも消化吸収し易い。
−Ｏｘｅｐａは二酸化炭素（ＣＯ２）生産を最小にするように高脂肪低炭水化物である。ＣＯ２濃度が高いと、人工呼吸器依存患者の離乳が難しくなる可能性がある。低炭水化物濃度はストレス性高血糖症患者にも有用であると思われる。
−Ｏｘｅｐａは無乳糖である。
【０２９１】
食物炭水化物、蛋白由来アミノ酸及び脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換することができる。この過程を通してグルコース依存組織（例えば中枢神経系や赤血球）の炭水化物必要量は満たされる。しかし、炭水化物を除去した食事では組織蛋白の過剰異化であるケトーシスや、水分及び電解質低下を生じる恐れがある。これらの影響は熱量摂取量が適切であるならば、食用炭水化物を毎日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。エネルギー必要量を満足しているならばＯｘｅｐａの炭水化物値は糖新生を最小にするにも十分である。
【０２９２】
蛋白：
−Ｏｘｅｐａは１回分８液量オンス当たり１４．８ｇ（６２．５ｇ／Ｌ）の蛋白を含有している。
−総熱量窒素比（１５０：１）はストレス患者の必要量を満たす。
−Ｏｘｅｐａは呼吸問題を悪化せずに同化と除脂肪体重の維持を助長するために十分な蛋白を提供する。高蛋白摂取量は呼吸不全患者で問題となる。蛋白はＣＯ２生産に殆ど影響しないが、高蛋白食は換気欲求を増す。
−Ｏｘｅｐａの蛋白源はカゼイン酸ナトリウム８６．８％とカゼイン酸カルシウム１３．２％である。
−Ｏｘｅｐａの蛋白系のアミノ酸プロフィルは米国科学アカデミーにより設定された高品質蛋白標準を満たすか又はそれを上回る。
【０２９３】
＊Ｏｘｅｐａは無グルテンである。
【０２９４】
【表３】
【０２９５】
【表４】
【０２９６】
【表５】
【０２９７】
【表６】
【０２９８】
【表７】
【０２９９】
【表８】
【０３００】
【表９】
【０３０１】
【表１０】
【０３０２】
【表１１】
【０３０３】
【表１２】
【図面の簡単な説明】
【０３０４】
【図１】脂肪酸生合成経路と、この経路におけるΔ５−デサチュラーゼ及びΔ６−デサチュラーゼの役割を示す。
【図２】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図３】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ６−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図４】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
【図５】Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａ（ＡＴＣＣ５６８５１）のΔ５−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図６】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を示す。
【図７】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＡＴＣＣ３４３０４）のΔ５−デサチュラーゼのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図８】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図９】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ５−デサチュラーゼの翻訳アミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図１０】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。
【図１１】Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ａｕｒｅｕｍ（ＢＩＣＣ７０９１）からのΔ６−デサチュラーゼの翻訳アミノ酸配列（配列番号３３）を示す。
【図１２】ｐＲＡＴ−２ａ及びｐＲＡＴ−２ｃクローン間のΔ５−デサチュラーゼアミノ酸配列一致度を示す。
【図１３】ｐＲＡＴ−１ａ及びｐＲＡＴ−１ｂクローン間のΔ６−デサチュラーゼアミノ酸配列一致度を示す。
【図１４】Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３からのΔ５−デサチュラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列（配列番号３４）を示す。
【図１５】Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ ＣＣＭＰ１３２３からのΔ５−デサチュラーゼからの翻訳アミノ酸配列（配列番号３５）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこのヌクレオチド配列に相補的な単離核酸フラグメントであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列一致度をもつ、前記単離核酸フラグメント。
【請求項２】
配列番号１９のヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記配列が配列番号１９のヌクレオチド配列である請求項２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記配列がポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求項２又は３に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
配列番号１９がＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来する請求項４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載の前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド。
【請求項７】
炭素５でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド。
【請求項８】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したｉｉ）調節配列を含むベクターを構築する段階と、
ｃ）デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階とを含む
デサチュラーゼの製造方法。
【請求項９】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列と、ｂ）これに作動的に連結した調節配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、ＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡ及びＥＳＰから構成される群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む培地で前記細胞を増殖させて、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、ＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡの生産レベルが変化する哺乳動物細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、ポリ不飽和脂肪酸を生産する植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１３】
前記ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及びＳＴＡから構成される群から選択される請求項１２に記載の植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１４】
請求項１２に記載の前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸。
【請求項１５】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、種子でポリ不飽和脂肪酸が生産されるトランスジェニック植物。
【請求項１６】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、
ｃ）Δ５−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、
ｄ）前記発現したΔ５−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、前記基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階とを含む、
ポリ不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１７】
夫々前記基質ポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡ又は２０：４ｎ−３であり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ又はＥＰＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼに暴露し、前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
夫々前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ又はＥＰＡであり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸又は（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記別のポリ不飽和脂肪酸をさらなるデサチュラーゼに暴露し、前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸が（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン（ＤＨＡ）酸である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法により製造される前記産物ポリ不飽和脂肪酸、請求項１８に記載の方法により製造される前記別のポリ不飽和脂肪酸、及び請求項２０に記載の方法により製造される前記最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項２３】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及びＳＴＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸、（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸、ＤＧＬＡ及びＥＰＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸が（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン（ＤＨＡ）酸、ＡＡ及びＥＰＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する患者の状態の予防又は治療方法であって、前記予防又は治療を行うために十分な量の請求項２２に記載の前記組成物を前記患者に投与する前記方法。
【請求項１】
デサチュラーゼ活性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又はこのヌクレオチド配列に相補的な単離核酸フラグメントであって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列一致度をもつ、前記単離核酸フラグメント。
【請求項２】
配列番号１９のヌクレオチド配列の少なくとも約５０％を含むか又はこれに相補的な単離ヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記配列が配列番号１９のヌクレオチド配列である請求項２に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記配列がポリ不飽和脂肪酸を基質として利用する機能的に活性なデサチュラーゼをコードする請求項２又は３に記載の単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
配列番号１９がＳａｐｒｏｌｅｇｎｉａ ｄｉｃｌｉｎａに由来する請求項４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項１、２又は３に記載の前記ヌクレオチド配列によりコードされる精製ポリペプチド。
【請求項７】
炭素５でポリ不飽和脂肪酸を不飽和化し、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％のアミノ酸一致度をもつ精製ポリペプチド。
【請求項８】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列とこれに作動的に連結したｉｉ）調節配列を含むベクターを構築する段階と、
ｃ）デサチュラーゼの発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階とを含む
デサチュラーゼの製造方法。
【請求項９】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列と、ｂ）これに作動的に連結した調節配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の前記ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、ＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡ及びＥＳＰから構成される群から選択される少なくとも１種の脂肪酸を含む培地で前記細胞を増殖させて、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、ＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ又はＳＴＡの生産レベルが変化する哺乳動物細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、ポリ不飽和脂肪酸を生産する植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１３】
前記ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及びＳＴＡから構成される群から選択される請求項１２に記載の植物細胞、植物又は植物組織。
【請求項１４】
請求項１２に記載の前記植物細胞、植物又は植物組織により発現される１種以上の植物油又は酸。
【請求項１５】
請求項９に記載の前記ベクターを含み、前記ベクターの前記ヌクレオチド配列が発現されると、種子でポリ不飽和脂肪酸が生産されるトランスジェニック植物。
【請求項１６】
ａ）配列番号１９のヌクレオチド配列を単離する段階と、
ｂ）前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階と、
ｃ）Δ５−デサチュラーゼ酵素の発現に十分な時間及び条件下に前記ベクターを宿主細胞に導入する段階と、
ｄ）前記発現したΔ５−デサチュラーゼ酵素を基質ポリ不飽和脂肪酸に暴露し、前記基質を産物ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階とを含む、
ポリ不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１７】
夫々前記基質ポリ不飽和脂肪酸がＤＧＬＡ又は２０：４ｎ−３であり、前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ又はＥＰＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸をエロンガーゼに暴露し、前記産物ポリ不飽和脂肪酸を別のポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
夫々前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ又はＥＰＡであり、前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸又は（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記別のポリ不飽和脂肪酸をさらなるデサチュラーゼに暴露し、前記別のポリ不飽和脂肪酸を最終ポリ不飽和脂肪酸に変換する段階を更に含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸が（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸又はドコサヘキサエン（ＤＨＡ）酸である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法により製造される前記産物ポリ不飽和脂肪酸、請求項１８に記載の方法により製造される前記別のポリ不飽和脂肪酸、及び請求項２０に記載の方法により製造される前記最終ポリ不飽和脂肪酸から構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸を含む組成物。
【請求項２３】
前記産物ポリ不飽和脂肪酸がＡＡ、ＥＰＡ、ＧＬＡ及びＳＴＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記別のポリ不飽和脂肪酸がアドレン酸、（ｎ−３）−ドコサペンタエン酸、ＤＧＬＡ及びＥＰＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記最終ポリ不飽和脂肪酸が（ｎ−６）−ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン（ＤＨＡ）酸、ＡＡ及びＥＰＡから構成される群から選択される少なくとも１種のポリ不飽和脂肪酸である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリ不飽和脂肪酸の摂取不全に起因する患者の状態の予防又は治療方法であって、前記予防又は治療を行うために十分な量の請求項２２に記載の前記組成物を前記患者に投与する前記方法。
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−２８９４９０（Ｐ２００８−２８９４９０Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５２８４４（Ｐ２００８−１５２８４４）
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【分割の表示】特願２００８−１２５５２３（Ｐ２００８−１２５５２３）の分割
【原出願日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２４）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１１日（２００８．６．１１）
【分割の表示】特願２００８−１２５５２３（Ｐ２００８−１２５５２３）の分割
【原出願日】平成１４年１月２４日（２００２．１．２４）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
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