デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属の予防的処置及び／又は治療的処置のための方法及びタンパク質
本発明は、医薬産業に関し、デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属により起こる感染の予防及び／又は治療に使用できる広範囲の分子の開発に使用できる、Ｅタンパク質の表面の保存領域を示す。本発明はさらに、ワクチンとしての使用を意図した、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属の予防的処置及び／又は治療的処置のためのキメラタンパク質に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬産業の分野に関し、デング熱ウイルス血清型１〜４及び他のフラビウイルス属が原因である感染の予防及び／又は治療に用いる、広範囲な抗ウイルス分子を開発するために使用できる、Ｅタンパク質表面の保存領域について記載する。本発明は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び、或いはまた他のフラビウイルス属の予防的処置及び／又は治療的処置のために有用な方法及びタンパク質について記載する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱ウイルス（ＤＶ）複合体はフラビウイルス科に属し、遺伝的及び抗原的に関連する４種の異なるウイルス又は血清型（ＤＶ１〜ＤＶ４）からなる。ＤＶは、蚊、おもにネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）を介して人に伝染する。感染は様々な臨床症状を起こし、無症状及び未分化型熱性症状などの良性症状から、デング出血熱（ＤＨＦ）及び生命にかかわるデング熱ショック症候群（ＤＳＳ）のようなより重篤な症状にまで及ぶ。より重篤な臨床症状は、通常２つの異なる血清型による連続感染を伴い（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デング熱ウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ」）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１−６７、４２１−４６７、２００３、Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイにおける小児の新型出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０−１５５）、この所見は疫学的研究により裏付けられている（Ｋｏｕｒｌ ＧＰ、Ｇｕｚｍａｎ ＭＧ、Ｂｒａｖｏ ＪＲ．「キューバのデング出血熱の解明２、積分解析（Ｗｈｙ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ Ｃｕｂａ？ ２．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｔｒａｎｓ Ｒｏｙ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １９８７；７２：８２１−８２３）。この現象は抗体依存性増強（ＡＤＥ）の理論から説明され、これらの場合この理論はウイルス−抗体複合体は標的（単球）に進入することにより増加し、これらの細胞上に存在するＦｃ受容体によって媒介されることで、ウイルスの感染性が増加すると主張している（Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ．「デング熱の発症機序：分子生物学への挑戦（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２３９：４７６−４８１）。
【０００３】
エンベロープ糖タンパク質（Ｅタンパク質）は、ウイルスのエンベロープの最も大きな構造タンパク質である。ＤＥＮ２及びＤＥＮ３ウイルスに由来するＥタンパク質の細胞外ドメイン断片の三次元構造は、Ｘ線回折技術により近年解明され（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「デング熱ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のリガンド結合ポケット（Ａ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １００、６９８６−６９９１、２００３、Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．、及びＨａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「デング熱ウイルス３型のエンベロープ糖タンパク質の結晶構造における可変表面エピトープ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ３ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３−１２３１、２００５）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）由来のＥタンパク質の結晶構造との高度の構造類似性が示された（Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、Ｍａｎｄｌ，Ｃ．、Ｋｕｎｚ，Ｃ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「２Å分解能におけるダニ媒介性脳炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質（Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｔ ２ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ ３７５、２９１−２９８、１９９５）。この構造類似性は、それらの配列相同性、６つのジスルフィド架橋の保存、及び他のフラビウイルス属においても機能的役割（抗原決定基の一部である、或いは突然変異の減衰又は回避に関与する、など）があらかじめ指定されている残基の配置の保存と一致する。
【０００４】
タンパク質Ｅは、以下の３つの構造ドメインによって形成される：ドメインＩ、配列のＮ末端部分に位置するが、３Ｄ構造の中央ドメインを形成する；ドメインＩＩ、二量体化ドメインとしても周知であり、フラビウイルス属全体に高度に保存された融合ペプチドを含む；及びドメインＩＩＩ、細胞受容体との相互作用に関与し、免疫グロブリン様のフォールディングを有する。
【０００５】
タンパク質Ｅは、ウイルスのライフサイクルのいくつかの段階において、中心的役割を果たす多機能糖タンパク質である。このタンパク質は、ウイルス中和抗体の主要な標的であり、細胞受容体との相互作用を媒介し、ウイルス膜と細胞膜との融合を動作するエンジンである（Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＳ．Ｌ．Ａｌｌｉｓｏｎ、２００３、（「フラビウイルス属の構造及び膜融合（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５９：６３−９７、Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｓ．Ｏｇａｔａ、Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、及びＳ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、２００４、「膜融合後のデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ ４２７：３１３−３１９、Ｒｅｙ ２００４、Ｃｈｅｎ，Ｙ．、Ｔ．Ｍａｇｕｉｒｅ、Ｒ．Ｅ．Ｈｉｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｆｒｏｍｍ、Ｊ．Ｄ．Ｅｓｋｏ、Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ、及びＲ．Ｍ．Ｍａｒｋｓ、１９９７、「標的細胞のヘパラン硫酸と結合したエンベロープタンパク質に依存するデング熱ウイルスの感染性（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８６６−８７１、Ｎａｖａｒｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｅ．、Ｒ．Ａｌｔｍｅｙｅｒ、Ａ．Ａｍａｒａ、Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｆ．Ｆｉｅｓｃｈｉ、Ｊ．Ｌ．Ｖｉｒｅｌｉｚｉｅｒ、Ｆ．Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ、及びＰ．Ｄｅｓｐｒｅｓ、２００３、「樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３−グラビング非−インテグリンは、蚊の細胞に由来するデング熱ウイルスによるヒト樹状細胞の増殖感染に必須である（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ３−ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｓｑｕｉｔｏ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．４：１−６、Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ，Ｂ．、Ｔ．Ｈ．Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ａ．Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ、Ｃ．Ｔｒｕｍｐｆｈｅｌｌｅｒ、Ｊ．Ｆｉｎｋｅ、Ｗ．Ｓｕｎ、Ｍ．Ａ．Ｅｌｌｅｒ、Ｋ．Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔ、Ｓ．Ｓａｒａｓｏｍｂａｔｈ、Ｄ．Ｌ．Ｂｉｒｘ、Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、及びＭ．Ａ．Ｍａｒｏｖｉｃｈ、２００３、「ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）は、ヒト樹状細胞のデング熱ウイルス感染を媒介する（ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）ｍｅｄｉａｔｅｓ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：８２３−８２９）。
【０００６】
このタンパク質はウイルス膜に固定され、その機能は三次構造及び四次構造の両方における立体配座の変化に大きく関与する。ウイルスの形成の細胞内段階で、ＥはｐｒｅＭタンパク質とのヘテロ二量体として見出される（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｋ．Ｓｔａｄｌｅｒ、Ｃ．Ｗ．Ｍａｎｄｌ、Ｃ．Ｋｕｎｚ、及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ、１９９５、「可溶性及び微粒子形態の組換えダニ媒介性脳炎ウイルスのタンパク質Ｅの合成及び分泌（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｉｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｆｏｒｍ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５８１６−５８２０、Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．１９９６、「フラビウイルス科：ウイルス及びそれらの複製（Ｆｉａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、ｐ．９３１−９５９、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｎ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｊ．Ｌ．Ｍｅ／ｎｉｃｋ、Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ、Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ、及びＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ（ｅｄ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ）。この段階の間、ビリオンは未成熟であると言われ、成熟細胞外ビリオンと比較した場合に、著しく低いインビボの感染性から明らかなように、膜融合の媒介には不完全である（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ．、Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｈ．＆ Ｋｕｎｚ，Ｃ．「フラビウイルス属の融合活性：成熟及び未成熟（含ｐｒｅＭ）なダニ媒介性脳炎ビリオン間の比較（Ｆｕｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ（ｐｒＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｇｅｎ．ＶｉｒｏＬ ７２、１３２３−１３２９、１９９１、Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．＆ Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．「マーレーバレー脳炎ウイルスｐｒＭタンパク質は、ウイルス粒子に酸耐性を与え、Ｅ糖タンパク質のＲ２ドメイン内のエピトープの発現を変化させる（Ｔｈｅ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｒ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１、９２１−９３１、１９９２）。ヘテロ二量体の役割は、ｐＨが酸性であるために膜融合過程を誘発できる細胞内コンパートメントを介してビリオンを運搬する間に、タンパク質Ｅが膜に結合することを防止することと仮定される。また、ｐｒｅＭタンパク質は、タンパク質Ｅのフォールディング及び集合に関するシャペロンとして機能することも可能である（Ｌｏｒｅｎｚ，Ｉ．Ｃ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．＆ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、「小胞体におけるダニ媒介性脳炎ウイルスのエンベロープタンパク質ｐｒＭ及びＥのフォールディング及び二量体化（Ａ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒＭ ａｎｄ Ｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、５４８０−５４９１、２００２）。ビリオンの細胞外への分泌の間、ｐｒｅＭは宿主のプロテアーゼ（フューリン）によって酵素的にプロセシングされ、Ｅはホモ二量体として結合するために自由にされ、したがって成熟ビリオンの形成で終了するウイルスのエンベロープの再構成を誘発する（Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｋ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｈａｌｉｃｈ，Ｊ．＆ Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．「フューリンによるダニ媒介性脳炎ウイルスのタンパク質分解活性（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｆｕｒｉｎ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、８４７５−８４８１、１９９７、Ｅｌｓｈｕｂｅｒ，Ｓ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．＆ Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ．「タンパク質ｐｒＭの切断は、ダニ媒介性脳炎ウイルスによるＢＨＫ−２１細胞の感染に必要である（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒＭ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ８４、１８３−１９１、２００３）。成熟ビリオンの構造は、９．５Åの分解能で電子低温顕微鏡法によって決定され（Ｚｈａｎｇ Ｗ、Ｃｈｉｐｍａｎ ＰＲ、Ｃｏｒｖｅｒ Ｊ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＲ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ Ｓ、Ｂａｋｅｒ ＴＳ、Ｓｔｒａｕｓｓ ＪＨ、Ｒｏｓｓｍａｎｎ ＭＧ、Ｋｕｈｎ ＲＪ、「低温顕微鏡法によるデング熱ウイルスの膜タンパク質ドメインの視覚化（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）」Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００３、１０：９０７−１２、Ｋｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．ら「デング熱ウイルスの構造：フラビウイルス属の構成、成熟及び融合に関する推測（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ）」Ｃｅｌｌ １０８、７１７−７２５、２００２）、未成熟ビリオンの構造は１２．５Åの分解能で電子低温顕微鏡法によって決定された（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら「未成熟フラビウイルス粒子の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．２２、２６０４−２６１３、２００３）。これらのビリオンは、Ｔ＝３の正２０面体対称を有する。成熟ビリオンにおいて、タンパク質Ｅの二量体はウイルス膜に並行な面上にあり、その表面をほぼ完全に覆っている。成熟ビリオンは完全に感染性であり、ウイルスが細胞受容体と相互作用し、抗体が宿主によって誘発されるのはこの立体配座においてである。ひとたびウイルスが細胞受容体と結び付くと、ウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスを介して内在化し、最終的にはエンドソームに達し、膜融合過程を開始するタンパク質Ｅの立体配座の変化が、エンドソームにおいて、弱酸性ｐＨにより誘発される（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら「酸性ｐＨにより誘発されるダニ媒介脳炎ウイルスエンベロープタンパク質のオリゴマー再構成（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ｐＨ）」Ｊ．Ｖｉｒａｌ．６９、６９５−７００、１９９５）。この過程において、タンパク質が二量体から三量体へ再構成される。タンパク質Ｅの融合後の構造が最近決定された（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「膜融合後のデング熱ウイルスのエンベロープタンパク質の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ ４２７、３１３−３１９（２００４））。Ｂｒｅｓｓａｎｅｌｌｉ，Ｓ．ら、「フラビウイルス属のエンベロープ糖タンパク質の低ｐＨ誘導性膜融合立体配座におけるその構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｌｏｗ−ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」ＥＭＢＯ Ｊ．２３、７２８−７３８（２００４）では、三量体の形成が三次構造における重要な再構成に関与し、融合ペプチドを含むドメインＩＩの先端が膜と相互作用するにもかかわらず、単量体が平行に結合していることが示されている。結晶構造及び解明されたビリオン構造を同時に解析することにより、ウイルスのライフサイクルを通してタンパク質Ｅが再構成され、その三次及び四次構造並びにビリオン自体が著しく変化することが明らかになる。
【０００７】
タンパク質Ｅは、ウイルス感染の間に産生される中和抗体の主要な標的である。単独の血清型による感染は、同種血清型のウイルスを中和する長寿命抗体を誘発する。感染後の数カ月間で、これらの抗体は異種の血清型もまた中和できるが、この活性は感染後約９カ月までに徐々に減衰する（Ｈａｌｓｔｅａｄ Ｓ．Ｂ．「デング熱ウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２００３；６０：４２１−６７．Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．１９５２、「第２次世界大戦時のデング熱に関する調査（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ Ｗａｒ ＩＩ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１：３０−５０）。
【０００８】
異なる血清型のウイルスと相互作用する場合、１種の血清型に対して産生された抗体は、一般に親和性の減少を示し、この現象は、ＤＶ血清型のタンパク質Ｅのアミノ酸配列における変化によって分子レベルで説明される。相互作用の親和性が十分に低いと中和を損なわせる抗体が生じる可能性があるが、それでもＦｃ受容体を担持する細胞内にウイルスを容易に内在化するために十分な量がウイルス表面に結合できる（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、及びＥ．Ｊ．Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ、１９７７、「デング熱ウイルス及び単核食細胞。１．非中和抗体による感染の増強（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：２０１−２１７、Ｌｉｔｔａｕａ，Ｒ、Ｉ．Ｋｕｒａｎｅ、及びＦ．Ａ．Ｅｎｎｉｓ、１９９０、「ヒトＩｇＧ Ｆｃ受容体ＩＩは、デング熱ウイルス感染の抗体依存性増強を媒介する（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３１８３−３１８６）。
【０００９】
さらに二次感染の間、ナイーブＢ細胞と比較して既存のメモリーＢ細胞及び血漿細胞の活性化がより速いため、低親和性抗体集団の力価は、進入するＤＶ血清型によって産生された新しい高親和性抗体の力価を上回る。二次感染からの回復期の抗体プロフィールは、一次ＤＶ感染の血清型によって大きく影響され、この事実はまさに「抗原原罪」として公知の現象の発現である（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｒｏｊａｎａｓｕｐｈｏｔ，Ｓ．、及びＳａｎｇｋａｗｉｂｈａ、Ｎ．１９８３、「デング熱における抗原原罪（Ｏｒｉｇｉｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｎ ｉｎ ｄｅｎｇｕｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３２：１５４−１５６）。
【００１０】
一方、極めて強力な中和モノクロナール抗体（ｍＡｂ）は、高希釈で免疫増幅を誘発できることが公知である（Ｂｒａｎｄｔ，Ｗ．Ｅ．、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｗｎ、Ｍ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ、及びＰ．Ｋ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９８２、「フラビウイルス属の交差反応性決定基に対する抗体による、Ｕ−９３７ヒト単球細胞系におけるデング熱２型ウイルスの感染増強（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ−９３７ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３６：１０３６−１０４１、Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｃ．Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈａｎ、Ｍ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ、及びＬ．Ｋ．Ｌａｒｓｅｎ、１９８４、「モノクロナール抗体によるデング熱２型株の感染増強の多様性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１３２：１５２９−１５３２、Ｍｏｒｅｎｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｓ．Ｂ．Ｈａｌｓｔｅａｄ、及びＮ．Ｊ．Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ、１９８７、「デング熱ウイルス２型感染の抗体依存性増強のプロフィール（Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３：２３１−２３７）。
【００１１】
フラビウイルスタンパク質Ｅの抗原構造は、マウスｍＡｂパネル及び競合アッセイ、ジスルフィド架橋の還元及びＳＤＳ処理などの手法に対する相互作用の感受性、タンパク質分解断片及び合成ペプチドに対する結合に関するアッセイ、ウイルスの中和又は赤血球凝集の阻害に関するアッセイ、エスケープ変異体の発生、血清検査などを含む、一連の生化学的分析及び生物学的分析を使用して、熱心に研究されてきた。（Ｈｅｉｎｚ．Ｔ．、Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．及びＫｅｌｌｙ，Ｒ．Ｇ．「デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のモノクロナール抗体マッピング（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｎｇｕｅ ２ Ｖｉｒｕｓ）」Ｊａｍａｉｃａ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２４６、３１７−３２８、１９９８、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＲｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．（１９９０）、「ウイルスの免疫化学ＩＩ。血清診断及びワクチンの基礎」中のフラビウイルス属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ“ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ．ＩＩ．Ｔｈｅ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”）」（Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ及びＡ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｅｄｓ）、ｐｐ．２８９−３０５、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ、Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．Ｇ．、Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｈ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＫｕｎｚ，Ｃ．（１９８９）、「モデルとしてダニ媒介性脳炎ウイルスを使用した、フラビウイルス属エンベロープタンパク質Ｅの分子レベルの抗原構造（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ，ｕｓｉｎｇ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、５６４−５７１．Ｉ．Ｌ．Ｓｅｒａｆｉｎ及びＪ．Ｇ．Ａａｓｋｏｖ．「モノクロナール抗体を使用した、デング熱２型及び３型ウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質のエピトープの特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ２ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ３ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００１）１４６：２４６９−２４７９）。それぞれ３種の構造ドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩに相当する、３種の抗原ドメインＡ、Ｂ及びＣが規定されている。特定のエピトープを認識する抗体は、普通非常によく似た機能的特徴を示す。ドメインＡ（構造ドメインＩＩに相当する）由来のエピトープの認識は、ジスルフィド架橋の還元により破壊され、これらのエピトープを認識するｍＡｂが赤血球凝集、ウイルス感染の中和を阻害し、ウイルス媒介膜融合を阻害する。特に、デング熱ウイルスに関して規定されたエピトープＡ１は、グループ型特異性を有するｍＡｂによって認識され、即ち、これらは異なるフラビウイルス属間で高度に交差反応性である。ｍＡｂｓ ４Ｇ２（抗−ＤＶ２）及び６Ｂ６Ｃ（抗−ＪＥＶ）は、このエピトープを認識する。このエピトープへの結合は、未成熟ビリオン中で桁違いに減少し、成熟ビリオンの酸性ｐＨ処理によっても増強しない（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｒ．Ａ．Ｂｏｌｉｎ、及びＪ．Ｔ．Ｒｏｅｈｒｉｇ、１９９２、「マーレーバレー脳炎ウイルスｐｒＭタンパク質は、ウイルス粒子に酸耐性を授け、Ｅ糖タンパク質のＲ２ドメイン内のエピトープの発現を変化させる（Ｔｈｅ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｒ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：９２１−９３１）。
【００１２】
ワクチン開発
ＤＶに対する特定の処置法はなく、最も重篤な兆候が現在存在する。蚊の駆除はコストがかかり、あまり有効ではない。ＤＨＦにより起こる血液量減少を修正するために、体液の適切な管理に基づいて臨床的な処置を行うことにより死亡率が減少しているが、これらの処置は多くの発展途上国において未だに問題がある。ＤＨＦによる死者が年間推定３００００人見積もられ、この疾患の罹患率及び関連コストは、公衆衛生支出の最優先目標を占める他の疾患の罹患率及び関連コストに匹敵する（Ｓｈｅｐａｒｄ ＤＳ、Ｓｕａｙａ ＪＡ、Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ、Ｎａｔｈａｎ ＭＢ、Ｇｕｂｌｅｒ ＤＪ、Ｍａｈｏｎｅｙ ＲＴ、Ｗａｎｇ ＤＮ、Ｍｅｌｔｚｅｒ ＭＩ、「小児用デング熱ワクチンの費用対効果（Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４、２２（９−９０）：１２７５−８０）。
【００１３】
デング熱に対するいくつかのワクチン候補が、現在開発の異なる段階にある（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｄ．２００１、「フラビウイルスワクチンの現状（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５１：２６２−２７１、Ｃｈａｎｇ ＧＪ、Ｋｕｎｏ Ｇ、Ｐｕｒｄｙ ＤＥ、Ｄａｖｉｓ ＢＳ．２００４「フラビウイルスワクチン開発の最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００４、３（２）：１９９−２２０）。今までのところ試された戦略は、弱毒化生ワクチン、キメラウイルス、プラスミドＤＮＡ及びサブユニットワクチンを含む。４種の血清型由来の弱毒化株が、イヌ及びサルの腎臓初代培養細胞においてウイルスを増殖させる標準的な手順を使用して開発された（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ，Ｎ．、及びＳｕｔｅｅ、Ｙ．２０００、「生弱毒化四価デング熱ワクチン（Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ．１８：４４−４７、Ｅｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．ら、２００３、「イヌ腎臓初代培養細胞の継代によるデング熱ウイルス株の改良：候補ワクチンの調製及びサルの免疫化（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｄｏｇ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｋｅｙｓ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６９：１２−１６、Ｉｎｎｉｓ，Ｂ．Ｌ．、及びＥｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．２００３、「米国陸軍衛星研究資材コマンドによる生弱毒化四価デング熱ウイルスワクチンの開発における前進（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉｅｌ Ｃｏｍｍａｎｄ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６９：１−４）。この戦略の進歩は、動物モデル及びヒトのためのインビトロ弱毒化マーカーが足りないために制限されている。この同じ研究手段において、ｃＤＮＡクローンを４種の血清型から得、その後処理を行い、理論的には有毒表現型への復帰変異の可能性を著しく減少する弱毒変異及び変化を導入する研究がある（Ｂｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．、Ｍａｎｉｐｏｎ，Ｇ．Ｇ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．、及びＷｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｓ．Ｓ．２００３、「デング熱ウイルス４型の非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５をコードする遺伝子の温度感受性突然変異は、マウスの脳において複製を制限する（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ＮＳ１，ＮＳ２Ａ，ＮＳ３，ａｎｄ ＮＳ５ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ４ ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）」Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４８：９９９−１００６、Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ら、２００１、「３’非翻訳領域において３０ヌクレオチドを削除した、生デング熱ウイルス４型ワクチン候補の、ヒトにおける弱毒化及び免疫原性（Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−４ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｗｉｔｈ ａ ３０ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｉｔｓ ３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：４０５−４１３、Ｐａｔｅｎｔ：Ｚｅｎｇ Ｌ、Ｍａｒｋｏｆｆ Ｌ、ＷＯ００１４２４５、１９９９）。
【００１４】
別の戦略は、１種のデング熱血清型由来のｐｒｅＭ及びＥ構造タンパク質を、コア及び他の非構造タンパク質を提供する、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ）（ＹＦＶ）、デング熱ウイルス又は他のウイルスの弱毒化バックグランドに導入する、４種の血清型に関するキメラフラビウイルス変異体を作製している（Ｇｕｉｒｋｈｏｏ Ｆ、Ａｒｒｏｙｏ Ｊ、Ｐｕｇａｃｈｅｖ ＫＶら「キメラ黄熱−デング熱ウイルス四価ワクチンのヒト以外の霊長類における構築、安全性及び免疫原性（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ−ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５：７２９０−３０４、Ｈｕａｎｇ ＣＹ、Ｂｕｔｒａｐｅｔ Ｓ、Ｐｉｅｒｒｏ ＤＪら「デング熱１型ウイルスワクチンの有力候補としてのデング熱２型（ワクチン株ＰＤＫ−５３）／デング熱１型キメラウイルス（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２（ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ＰＤＫ−５３）／ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００；７４：３０２０−２８、Ｍａｒｋｏｆｆ Ｌ、Ｐａｎｇ Ｘ、Ｈｏｕｎｇ ＨＳら「サルにおいて弱毒化された高度免疫原性のデング熱１型宿主範囲限定突然変異ウイルスの誘導及び特徴付け（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｎｇｕｅ １ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙｓ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２；７６：３３１８−２８、Ｐａｔｅｎｔ：Ｓｔｏｃｋｍａｉｒ及びｓｃｈｗａｎ Ｈａｕｅｓｓｅｒ、ＷＯ９８１３５００、１９９８．Ｐａｔｅｎｔ：Ｃｌａｒｋ及びＥｌｂｉｎｇ：ＷＯ９８３７９１１、１９９８、Ｐａｔｅｎｔ：Ｌａｉ ＣＪ、ＵＳ６１８４０２４、１９９４）。
【００１５】
一般的に生弱毒化ワクチンの潜在的利益についての多様な疑問が主張され、有毒な表現型への復帰変異、ウイルス性干渉及びゲノム間の組換えなどの現象の発生の可能性が述べられた（Ｓｅｌｉｇｍａｎ ＳＪ、Ｇｏｕｌｄ ＥＡ ２００４「生フラビウイルスワクチン：警告の理由（Ｌｉｖｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅａｓｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｕｔｉｏｎ）」Ｌａｎｃｅｔ．３６３（９４２６）：２０７３−５）。組換えタンパク質を発現するプラスミドＤＮＡに基づくワクチン、並びに組換え抗原に基づくワクチンは、まだ開発の初期段階にある。（Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｊ．、Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｓ．、Ｈｕｎｔ，Ａ．Ｒ．、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ａ．、及びＫｕｎｏ，Ｇ．２００１、「フラビウイルスＤＮＡワクチン：現状及び可能性（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｏｌ．９５１：２７２−２８５、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｓ．、Ｋｏｃｈｅｌ，Ｔ．、Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．、及びＨａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．２００１、「デング熱２型ＤＮＡ及びデング熱２型組換えサブユニットワクチンの組合せに対する抗体応答の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｄｅｎｇｕｅ−２ ＤＮＡ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ−２ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：４２０−４２６、Ｐａｔｅｎｔ：Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ；ＷＯ９９０６０６８ １９９８、Ｆｅｉｇｈｎｙ，Ｒ．、Ｂｏｒｒｏｕｓ，Ｊ．及びＰｕｔｎａｋ Ｒ．「組換えバキュロウイルスを使用して作製されたデング熱２型ウイルスのエンベロープタンパク質は、ウイルスチャレンジからマウスを保護する（Ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ−２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｄｅ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１９９４、５０（３）、３２２−３２８；Ｄｅｕｂｅｌ，Ｖ．、Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，Ｉ．、Ｍｅｇｒｅｔ，Ｆ．ら「親和性精製デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質が、マウスにおいて中和抗体及び防御免疫を誘導する（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｅｎｇｕｅ−２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５、１９４６−１９５４）。
【００１６】
上記の戦略に基づいたいくつかのワクチン候補は、動物モデルにおいて防御を示し、いくつかは臨床試験の初期段階において、安全且つ免疫原性であることが見出された。
【００１７】
しかし、ワクチン開発の主要なハードルは、４種の血清型に対して同等に有効な防御を達成する必要性である。１種のデング熱血清型への感染により、ヒトでは同じ血清型に対して長寿免疫が誘導されることが認められる。しかし、わずか１種の血清型に対する免疫化は、他の血清型（異型免疫）に対してわずか２から９カ月までの短期間の防御を達成するにすぎない（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．１９５２、「第２次世界大戦中のデング熱に関する調査（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ Ｗａｒ ＩＩ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１：３０−５０）。その上、特定の血清型に対する最適以下のレベルの防御により、ワクチン接種を受けた人が感作され、その血清型による後期感染において病理学的性質の異種免疫応答に付随する重篤な症状を発症する危険が増加する恐れがある（Ｒｏｔｈｍａｎ ＡＬ ２００４「デング熱：防御対病理免疫の規定（Ｄｅｎｇｕｅ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：９４６−９５１）。しかし、利用可能な生弱毒化ワクチン又は組換えサブユニットワクチンの有効な四価製剤の開発は困難な挑戦となり、複雑な反復投与免疫化スケジュールの使用を必要とする。
【００１８】
抗体：受動免疫化
デング熱感染に対する防御のためにワクチンを使用するための１つの選択肢は、受動免疫のために中和抗体を使用することである。デング熱４型を中和する５Ｈ２（Ｍｅｎ，Ｒ．、Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ、Ａ．Ｐ．Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ、Ｃ．Ｗｅｒｎｌｙ、Ｄ．Ｊ．Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、Ｓ．Ｕ．Ｅｍｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ｈ．Ｐｕｒｃｅｌｌ、及びＣ．Ｊ．Ｌａｉ．２００４、「デング熱４型ウイルスの中和に非常に有効な、完全長ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体のレパートリークローニング及び作製によるチンパンジーＦａｂ断片の特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ４ ｖｉｒｕｓ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：４６６５−４６７４）、及び４種の血清型に対して交差中和する１Ａ５（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ，Ａ．Ｐ．、Ｒ．Ｍｅｎ、Ｃ．Ｗｅｒｎｌｙ、Ｒ．Ｈ．Ｐｕｒｃｅｌｌ、及びＣ．Ｊ．Ｌａｉ、２００４、「デング熱１型及び２型ウイルスを効果的に交差中和する、チンパンジーＦａｂ断片及び派生ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体（Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１２９１０−１２９１８）を含むヒト化チンパンジー抗体を、この目的のために得ている。
【００１９】
ウイルス血症のレベルが疾患の重篤度を予測する上で重要であることを考慮に入れると、受動免疫の使用は、予防的手段及び治療的手段の両方にとって有用であり得る（Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｋ．Ｄ．Ｙ．Ｃｈａｏ、Ｃ．Ｌ．Ｋａｏ、Ｈ．Ｃ．Ｗｕ、Ｙ．Ｃ．Ｌｉｕ、Ｃ．Ｍ．Ｌｉ、Ｓ．Ｃ．Ｌｉｎ、Ｊ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ、及びＣ．Ｃ．Ｋｉｎｇ、２００３、「デング出血熱患者の解熱時における高レベルの血漿デング熱ウイルス量：発症に関する推測（Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｆｅｒｖｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅｎｇｕｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ．：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０５：３３０−３３８、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．、Ｋａｌａｙａｎａｒｏｏｊ，Ｓ．、Ｉｎｎｉｓ，Ｂ．Ｌ．、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ，Ｓ．、Ｓｕｎｔａｙａｋｏｒｎ，Ｓ．、Ｅｎｄｙ，Ｔ．Ｐ．、Ｒａｅｎｇｓａｋｕｌｒａｃｈ，Ｂ．、Ｒｏｔｈｍａｎ，Ａｌ．、Ｅｎｎｉｓ，Ｆ．Ａ．及びＮｉｓａｌａｋ，Ａ．「デング熱ウイルス血症力価、抗体応答パターン及びウイルス血清型は疾患の重篤度と相関する（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｅｍｉａ Ｔｉｔｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０００；１８１：２−９）。しかし、抗体の投与は潜在的な落とし穴と無縁ではない。抗体依存性増強（ＡＤＥ）理論によれば、中和抗体の濃度が中和レベル以下に減少した場合、ウイルス−抗体免疫複合体はＦｃ受容体を担持する細胞へのウイルスの進入を増幅でき、したがってウイルスの複製レベルが増加する。それ故、疾患の兆候がより重篤になるという危険に患者をさらすことを避けるために、抗体のレベルを高くする必要がある。
【００２０】
考えられる１つの解決策は、受容体との相互作用が有意に減少するような方法でＦｃが修飾された抗体分子の獲得である。この意味で特に興味を引く戦略は、ＦＣγＲ−Ｉ、ＦＣγＲ−ＩＩ及びＦＣγＲ−ＩＩＩとの相互作用に直接影響するが、ＦＣＲｎとの相互作用には影響しないＦｃにおいて残基を変異させることである。後者は抗体の再生に関与しているため、インビボにおいて抗体の半減期の決定に極めて重要だからである。
【００２１】
別の代替手段は、ＡＤＥを媒介できない中和抗体の特定である。これらの特徴を有する、少なくとも１種の抗体が記載されており（Ｐａｔｅｎｔ：Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．ＷＯ９９１５６９２、１９９８）、この抗体はインビボモデルにおいてＡＥＤを媒介せずにＤＶ２を中和する。しかし、他の血清型に対する類似の抗体の記載はなく、インビボモデルにおけるこの型の抗体の特徴についての利用可能なデータもない。さらなる障害は、利用可能な動物モデルが、ヒトにおける感染の経過及び特徴を忠実に再現しないという事実である。
【００２２】
抗体の使用に関する別の戦略は、抗デング熱と抗赤血球補体受容体１抗体との二重特異性複合体の獲得である。これらのヘテロポリマーはウイルスを赤血球に結合させ、したがって血液から組織へのウイルス排除率が非常に増加せしめる（Ｈａｈｎ ＣＳ、Ｆｒｅｎｃｈ ＯＧ、Ｆｏｌｅｙ Ｐ、Ｍａｒｔｉｎ ＥＮ、Ｔａｙｌｏｒ ＲＰ．２００１、「受動ウイルス血症のサルのモデルにおいて、二重特異性モノクロナール抗体は、デング熱ウイルスが赤血球へ結合することを媒介する（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｎｋｅｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ｖｉｒｅｍｉａ）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ １６６：１０５７−６５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属に対する予防的処置及び／又は治療的処置のための有効な分子を、フラビウイルス属において高度に保存されたＥタンパク質（「Ｅ」はエンベロープのＥ）表面の領域又はエピトープを前記分子の標的として使用することによって得る方法を示す。ワクチン設計のために使用すると、本発明は、Ｅタンパク質のこの領域に対する抗体応答を制限し、したがってこのタンパク質のさらなる可変領域に対する応答を除去することによって、４種のデング熱ウイルス血清型すべてに関して同等の中和効果及び防御効果の発生を可能にし、他の血清型による後期感染時の免疫増幅を導くことのできる、血清型又はサブ複合体に特異的な中和抗体を誘発できる。Ｅタンパク質の前記領域はトポグラフィー的エピトープであるため、本発明は、前述のエピトープを含むＥタンパク質のサブドメインの正確なフォールディング及び分泌を確実にする、変異体及び安定化連結の設計を含む。予防的又は治療的目的の受動免疫化のための薬剤開発に使用する場合、本発明はさらに成熟フラビウイルスビリオンの表面上にあるこのエピトープの２つ、３つ又は多数の対称的なコピーと結合できる組換え分子を規定し、前記組換え分子は、ウイルス複製回路の早期段階においてビリオンによりなされる構造変化に干渉するより高い親和力及びよりよい潜在能力のため、天然の抗体及び／又はこれらのＦＡｂ断片より優れた中和特性及び防御特性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
第１の態様において、本発明は上記のＥタンパク質エピトープの抗原的特徴及び構造的特徴を再現する組換えタンパク質の設計を示す。前記組換えタンパク質の１つはデング熱ウイルスの４種の血清型すべてを中和でき、さらに他のフラビウイルス属も認識するマウスのモノクロナール抗体によって認識される。このキメラ組換えタンパク質による免疫化は４種のデング熱ウイルス血清型並びに他のフラビウイルス属を中和し、防御する抗体応答を誘導する。本発明は、フラビウイルス属に共通の中和エピトープを含むＥタンパク質ドメインが、正確にフォールディングするような方法でキメラ組換えタンパク質を設計する方法を記載する。このエピトープは、天然にはトポグラフィー的であり、したがってその抗原性は分子の３Ｄ構造に依存する。本発明により得られた分子は、デング熱ウイルス及び他のフラビウイルス属に対するワクチン調製品の獲得、並びにこれらのタンパク質を含む診断体系の設計に関する医薬産業に使用できる。
【００２５】
本発明の第２の態様は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属に対する有力な中和プロフィールを有する他の組換えタンパク質の設計を示す。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、結合ドメイン、スペーサーセグメント及び多量体化ドメインを含む。結合ドメインは、すべてのフラビウイルス属に全体に、高度に保存されたＥタンパク質のエピトープに結合可能であり、結合ドメインは上記のこの発明の第１目的において述べたタンパク質中に含まれる。この態様の改変種において、結合ドメインは保存エピトープを認識する一本鎖抗体の断片である。スペーサーセグメントは、３〜２０のアミノ酸長の配列で、好ましくは親水性、極性で短い側鎖を有する残基中に多く存在し、したがってスペーサーに高度の可動性を与える。これらのスペーサーは、結合ドメイン及び多量体化ドメインのフォールディングに干渉してはならず、さらに血清プロテアーゼによる切断に対して耐性でなければならない。
【００２６】
本発明において述べる多量体化ドメインは、天然状態で好ましくは二量体又は三量体として会合したタンパク質又はタンパク質ドメインであるが、より高度な会合の四次構造も切り捨ててはいない。これらのドメインは、自己抗体誘導の可能性を避けるためにヒトの血清又は細胞外タンパク質から選択される。本発明において意図される多量体化ドメインの本質的な特性は、デング熱ウイルス感染の免疫増幅の抗体媒介過程に関与するＦｃ受容体との間にどのような相互作用もないことである。多量体化ドメインの四次構造は、共有結合性又は非共有結合性相互作用に依存してよい。
【００２７】
改変種の一つにおいて、多量体化ドメインは、二量体構造を安定化させる鎖内のジスルフィド架橋の形成を媒介するので、ヒンジ領域を含むヒト抗体由来のＦｃ断片に基づく。これらのＦｃ断片は、化学的又は酵素的脱クリコシル化のどちらかを経て、或いはバクテリア大腸菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの、タンパク質をグリコシル化しない宿主における産生を経て炭水化物鎖を欠いている。非グリコシル化Ｆｃドメインは、高等真核生物由来の細胞においてもまた得られ、それらの配列は修正され、ＮＸＴ／Ｓモチーフが除去されて提供される。非グリコシル化Ｆｃドメインは、もはやインビトロで免疫増幅を媒介するＦｃγＲ受容体Ｉ〜ＩＩＩに結合できない。しかし、それらはＦｃＲｎ受容体とは十分相互に作用する力を維持しているところ、これはインビボで長い半減期を得るための望ましい特性である。
【００２８】
別の改変種においては、多量体化ドメインは、らせん形の、ヒト母系の三量体形成断片である。
【００２９】
柔軟なスペーサーを介した結合ドメイン及び多量体化ドメインの連結により、フラビウイルス属の成熟ビリオンの２０面体構造上で、キメラタンパク質が複数の隣接したＥタンパク質単量体と同時に結合することが可能になる。このように、二量体タンパク質をもたらす［結合ドメイン］−［スペーサー］−［多量体化ドメイン］の配列改変種は、２つのＥタンパク質単量体に同時に結合可能になる。同様に、改変種が三量体タンパク質をもたらす場合、３つの単量体が同時に結合することになる。
【００３０】
本発明の第２の態様において記載したキメラタンパク質の中和力価は、ＦＡｂ断片及びさらに完全抗体により達せられる力価より高い。これらの組換えタンパク質は、より高い親和力でビリオンと結合し、いくつかのＥ単量体の同時結合は、膜融合の過程において四次構造に必要な変化に干渉する。本発明の実施により得られる分子は、デング熱ウイルス及び他のフラビウイルスに対する予防的及び／又は治療的薬剤の獲得、並びに前記分子を含む診断体系の開発のために医薬産業に使用できる。
【００３１】
ワクチンを目的としたキメラタンパク質の設計
有効なデング熱ワクチンは、４種のデング熱血清型に対する抗体応答の中和を誘導するものであるべきであるという見解は、現在認められている。しかし、ウイルスのエンベロープのＥ糖タンパク質は血清型の間で可変である。この配列可変性が、タンパク質に対する広範囲な抗体応答は同種の血清型に対しての中和であり、異種の血清型に対しての中和ではないことの原因であり、このように感染性免疫増強抗体が上昇する可能性が増加する。
【００３２】
本発明は、デング熱ウイルスに対するサブユニットワクチンの設計を目的とした方法を示し、このサブユニットワクチンは、４種の血清型に対して均一に中和的及び防御的に免疫応答を誘導する。第１に設計はタンパク質の表面に露出したパッチ又はエピトープの特定に基づき、血清型の間でこれらはすべて又は非常に高度に保存されており、成熟ビリオンの表面上にもまた露出されている。タンパク質について残基の保存分析を実施して、露出し保存された残基のクラスタを特定できた。（図１及び２、表１）。クラスタの全表面積は、４１７Å２であり、２５残基に属する。この面積は、タンパク質−抗体相互作用に関与する結合表面に対応する標準値に匹敵する。エピトープはトポグラフィー的であり、タンパク質の一時構造では遠く離れて位置するが、３次元構造においては近くに位置する残基を含む。
【００３３】
第２に本発明は、保存エピトープを含み、免疫系に提示される保存残基／可変残基の割合を最大にし、エピトープの三次元的構造の安定化を達成する組換えキメラタンパク質の、全Ｅタンパク質において出現するような同様の方法での設計を示す。２種の考えうるトポロジーを記載する：
Ｂ−Ｌ−Ｃ及びＣ−Ｌ−Ｂ、
ここで、Ｂはデング熱２型由来のＥ糖タンパク質のＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２のセグメントであり、ＣはＬｙｓ６４〜Ｔｈｒ１２０のセグメント、或いは他の血清型又は他のフラビウイルス属由来の相同セグメント、或いは上記セグメントのいずれかに関して８０％を超える配列同一性を示す類似タンパク質配列である。フラビウイルス属の配列に相当する相同セグメントＢ及びＣは、配列アライメントのコンピュータプログラムを使用して規定し、このプログラムはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ ｙ ＣＬＵＳＴＡＬのように配列ペア又は多重配列を並べる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．１９９０、「ベーシックローカルアライメントサーチツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０．Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ、Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．「生物学的配列比較のための改善されたツール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８８；８５：２４４４−８、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．、Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．、Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．１９９４；「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列の重み、位置特異的ギャップペナルティ及び重み行列法選択を介した進歩的多重配列アライメントの感度の改善（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。これらの配列アライメントは、フラビウイルスの配列において相同残基（等価残基又は相当残基とも称する）の規定もまた可能にし、この相同残基は、デング熱２型由来の配列の特定の事例に関する、実施例１の表１に特定された高度に保存された残基に相当する。
【００３４】
記載したトポロジーのいずれにおいても、Ｌは通常１個から１０個の残基までの大きさのリンカー配列であり、その役割はキメラタンパク質のフォールディングを安定化させ、エピトープの３Ｄ構造が全Ｅタンパク質に表された構造に類似であり得るような方法で、セグメントＢ及びＣを接続することである。キメラタンパク質のトポロジー改変種の両方に保存エピトープは完全に含まれるか、可変性がより大きい残りのＥタンパク質は除かれる。キメラタンパク質は、エンベロープ糖タンパク質の構造ドメインＩＩのサブドメインに相当する。このサブドメインは、ドメインＩＩの先端に位置し、２つの逆平行のβシートによって構造的に合致し、互いに包み合っている。大きいβシートは３本のβ鎖からなり（セグメントＣ）、小さいβシートはβヘアピンループ（セグメントＢ）である
【００３５】
サブドメインは、２つのジスルフィド架橋を含み、４か所で残りのＥ糖タンパク質と連結しているところ、これは保存エピトープのトポグラフィー的性質と一致する。しかし、サブドメインと残りのタンパク質の接触表面は１８４Å２であり、これは溶媒が接触可能であるサブドメイン全表面のわずか１２％にすぎない。この事実は、２つのトポロジーの変異体に関する上記の安定化連結又はリンカーを設計することによって、サブドメインの正確なフォールディングを達成することの実現可能性に一致する。本発明は、ビリオン表面に接触できず、したがって抗体との相互作用に関与しない残基を変異させることによって、キメラタンパク質の熱力学的安定性を増加させる可能性を含む。
【００３６】
本発明の本質的に優れている点は、４種のデング熱血清型に対して有効な、ユニークなタンパク質鎖に基づいたサブユニットワクチンの開発が可能であるという考えである。組換えタンパク質の候補に基づいた現在のアプローチは、４種（各血清型に関して１種ずつ）の組換えエンベロープタンパク質の使用からなり、これらをワクチン製剤中に混合する（Ｐａｔｅｎｔｅ：Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ；ＷＯ９９０６０６８、１９９８）。Ｅタンパク質断片もまた可能性のある候補として評価されているが、現在までの取り組みは、担体タンパク質との融合タンパク質として発現させたドメインＩＩＩに集中している（Ｐａｔｅｎｔｅ：Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ；ＷＯ／２００３／００８５７１、Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｍ、Ｍｕｒｐｈｙ ＧＳ、Ｈａｙｅｓ ＣＧ．Ｓｈｏｒｔ ｒｅｐｏｒｔ：「四価デング熱組換えタンパク質サブユニットワクチンにより免疫化したマウスの抗体反応（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２００１；６５：１５９−６１、Ｈｅｒｍｉｄａ Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ、Ｌａｚｏ Ｌ、Ｓｉｌｖａ Ｒ、Ｚｕｌｕｅｔａ Ａ，Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｌｏｐｅｚ Ｃ、Ｇｕｚｍａｎ ＭＧ、Ｇｕｉｌｌｅｎ Ｇ．「Ｐ６４ｋ髄膜炎菌性タンパク質担体の構造に挿入されたデング熱２型エンベロープ断片は、マウスにおいてウイルスに対する機能的免疫応答が可能である（Ａ ｄｅｎｇｕｅ−２ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ６４ｋ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｅｎａｂｌｅｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４ Ｊａｎ；１１５（１）：４１−９）。ドメインＩＩＩは、抗体応答の中和を誘導できるが、この応答は血清型特異的であり、したがってワクチン候補は４種の血清型由来の配列を含まなければならない。
【００３７】
本発明の実施例１のキメラタンパク質ＰＭＥＣ１は、トポロジーＢ−Ｌ−Ｃに相当し、デング熱２型由来の断片Ｂ及びＣの配列、並びに２つの残基Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカー配列を伴う。キメラタンパク質ＰＭＥＣ１をコード化する遺伝子もまた記載する。プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６は、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢと、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコード化する配列と融合するタンパク質ＰＭＥＣ１をコード化する（配列番号１２）。
【００３８】
バクテリア大腸菌のペリプラズムに可溶なキメラタンパク質ＰＭＥＣ１を得た。拡張が容易な精製方法を、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に基づいて開発し、これによりさらなる研究に適切な純粋タンパク質調製品を得ることができた。精製タンパク質を、質量分析法により分析し、ＰＭＥＣ１のアミノ酸配列から算出した理論値に相当する質量／ｚシグナルを得、２つのスルフィド架橋の形成を推測した。タンパク質ＰＭＥＣ１は、４種のデング熱ウイルス血清型に対して得られた高度免疫腹水により、及びｍＡｂ ４Ｇ２により、強く認識される。ジスルフィド架橋が正確に形成されることによってこのように認識されるということはタンパク質ＰＭＥＣ１が天然Ｅタンパク質の対応する領域が採る立体配座と同様の立体配座を有することを示唆している。
【００３９】
キメラタンパク質ＰＭＥＣ１を用いてマウスを免疫化することによって、４種のデング熱血清型に対する高力価を特徴とする、中和応答及び防御応答を得た。
【００４０】
さらにＩＨＡ検査を実施し、４種の血清型に対する陽性力価を得た。インビトロの中和試験において、４種の血清型に対する１：１２８０の力価を得た。最終的に、マウスにおいてプロテクションアッセイを実施し、８０〜９０％の動物が４種の血清型に対する防御を示した。
【００４１】
ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成される複合体のモデリング
実施例８は、ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成される複合体の構造のモデリングを示す。この抗体は、４種のデング熱血清型及び他のフラビウイルス属を認識し、中和する。
【００４２】
モデルを、ＣＬＵＳＰＲＯタンパク質−タンパク質ドッキング法（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｂｕ．ｅｄｕｌ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＰＰＤｏｃｋｉｎｇ／ｃｌｕｓｐｒｏ．ｈｔｍｌ）を使用して得た。この研究において、ＦＡｂ ４Ｇ２の結晶構造（ＰＤＢファイル １ｕｙｗ）並びにデング熱２型由来のＥタンパク質の二量体構造に対応するＰＤＢファイル１ｏａｎ及び１ｏａｍを、インプットファイルとして使用した。表８は、Ｅタンパク質−Ｆａｂインターフェースの特徴的な表面パラメータに相当する値を示し、モデル化した複合体に関して算出された値は、結晶構造が解明されているタンパク質−抗体複合体に関して得られた通常の値と同様である（表９）。
【００４３】
得られたモデルは、ｍＡｂ ４Ｇ２により認識されたエピトープが、本発明において特定された高度に保存された領域を含むことを示す。表１は、予測された構造エピトープに一致する一連の残基（抗体に接触する残基）及びそれらの残基が高度に保存された表面パッチに属することを示す。モデルによれば、予測された構造エピトープ由来の残基の７１％が高度保存領域に属する。
【００４４】
その後、成熟ビリオンを基にした複合体モデルを、デング熱２型ウイルスの低温電子顕微鏡法により構造をあらかじめ予測したモデルとドッキングさせることによって得た。こうして、ビリオン表面上でｍＡｂ ４Ｇ２によって認識されたすべてのエピトープ（１８０コピー）がＦＡｂ鎖により塞がれたモデルが得られた。
【００４５】
Ｅタンパク質二量体に結合したそれらＦＡｂの重鎖のＣ末端間の原子間距離は、１００Åである。二量体として会合していない、非対称ユニットの単量体に結合するＦＡｂに関して計算された同じ距離は１２０及び８０Åである。
【００４６】
これらの距離は、ＩｇＧ分子の配列及び構造に立体化学的に一致せず、ｍＡｂ ４Ｇ２が一価の状態でウイルスに結合することを示唆する。
【００４７】
この予測は、実施例１２に示した結果により裏付けられ、ＦＡｂ及びｍＡｂ ４Ｇ２が非常によく似た中和力価を有することを示す。この発見を他の抗ウイルス抗体に関して得られたデータと対比すると、それらの二価結合により中和能力が２〜３桁増加する（Ｄｒｅｗ ＰＤ、Ｍｏｓｓ ＭＴ、Ｐａｓｉｅｋａ ＴＪ、Ｇｒｏｓｅ Ｃ、Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ、Ｐｏｒｔｅｒ ＡＪ、「ｇＨに対する多量体ヒト化帯状疱疹ウイルス抗体断片は、ウイルスを中和するが、単量体断片は中和しない（Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｇＨ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｖｉｒｕｓ ｗｈｉｌｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｄｏ ｎｏｔ）」Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００１；８２：１９５９−６３、Ｌａｎｔｔｏ Ｊ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＪＭ、Ｏｈｌｉｎ Ｍ、「二価抗体フォーマットは、糖タンパク質Ｂの抗原性ドメイン２を介したヒトサイトメガウイルスの中和に必要である（Ａ ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖｉａ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎ ２ ｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）」Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００２；８３：２００１−５）。
【００４８】
チンパンジー抗体１Ａ５の場合と同様に、ｍＡｂ ４Ｇ２のこのプロパティは多様な抗フラビウイルス抗体に共通であり得、Ｅタンパク質のドメインＡにも位置するエピトープを認識する（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ ＡＰ、Ｍｅｎ Ｒ、Ｗｅｒｎｌｙ Ｃ、Ｐｕｒｃｅｌｌ ＲＨ、Ｌａｉ ＣＪ、「デング熱１型及び２型ウイルスを効果的に交差中和する、チンパンジーＦａｂ断片及び派生ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体（Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ １ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：１２９１０−８）。一般的に、ｍＡｂとそのＦＡｂとの中和能力のバランスはエピトープ、抗体の同一性及び複合体の立体化学の詳細に依存する。したがって、ドメインＢに位置するエピトープを認識するｍＡｂ ４Ｅ１１は、対応するＦＡｂより５０倍の中和能力である（Ｔｈｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．、Ｐ．Ｌａｆａｙｅ、Ｆ．Ｍｅｇｒｅｔ、Ｖ．Ｄｅｕｂｅｌ、Ａ．Ｊｏｕａｎ、及びＪ．Ｃ．Ｍａｚｉｅ、１９９９、「組換えＦａｂは、インビトロでデング熱ウイルスを中和する（Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｂ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」Ｊ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ ６９：１８３−１９０）。
【００４９】
多価中和分子の設計
本発明は、ビリオン表面に高度に保存されたエピトープの２つ又は３つのコピーと同時に結合できる分子の設計及び開発を示す。ビリオンは、本発明に記載の保存エピトープ全１８０コピーを露出している。それらは、Ｅタンパク質二量体に対応する、９０対のエピトープとして、又はビリオンの非対称ユニットに存在するＥタンパク質の３コピーに一致する６０のトリプレットとしてグループ化できた。本明細書中に記載の分子は、二価又は三価の結合ができ、ビリオンに対する改善された結合親和性及び本発明に記載の保存エピトープを認識する中和抗体と比較してより強力で多様な中和能力を示す。記載された分子は、４種のデング熱ウイルス血清型及び他のフラビウイルス属を中和し、したがってデング熱及び或いは他のフラビウイルス属の予防的及び／又は治療的処置に有用である。
【００５０】
本発明の二価又は三価タンパク質分子の配列は、下記の式により表される：
［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｄ］又は［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｔ］
式中、Ｓは一本鎖個体断片（ｓｃＦｖ）の配列であり、本発明に記載の保存エピトープを認識し、［Ｌ］は通常３〜２０アミノ酸長のリンカー配列であり、［Ｄ］は二量体を形成するタンパク質配列又はその断片であり、［Ｔ］は三量体を形成するタンパク質又はその断片である。セグメント［Ｄ］および［Ｔ］は、ウイルス感染の免疫増強を媒介する能力があるＦＣ受容体と相互作用しないタンパク質又はタンパク質ドメインである。このように、本発明の二価又は三価分子は中和濃度以下において、ＦＣ受容体を担った細胞のウイルス感染の増強を予防できる。したがって記載の分子は、ＡＤＥ様効果を媒介する能力がないことを考慮すると、抗体と比較して優れている。さらに、これらの分子は、ｓｃＦｖと比較してより大きく、したがってインビボにおいてより長い半減期を有する。
【００５１】
配列［Ｄ］及び［Ｔ］は、細胞外ヒトタンパク質、好ましくは血清由来のもの、に相当する。このようにすると、細胞内及び／又は異種タンパク質に対して出現し得る自己免疫応答の誘導を予防できる。
【００５２】
一般的に、多価結合を生じ得る適切なリンカー配列を選択した場合、ドメイン［Ｄ］及び［Ｔ］はより大きなオリゴマーを形成できる多量体化ドメインにより置き換え可能である。
【００５３】
設計された多量体化（二量体化及び三量体化を含む）により、断片の親和性を増加でき、それらの内在性の中和能力を改善できる。複数個所におけるウイルスの結合は、成熟ビリオンの構造をさらに安定化し、膜融合過程に伴う四次構造の変化を妨げる。さらに、分子サイズの増大は、インビボで半減期を向上させる。抗体Ｆｖ断片を含む、これらの組換えタンパク質は、集団発生を抑止するための、有効な治療的及び／又は予防的薬剤になり得る。
【００５４】
本発明は、ＴＢ４Ｇ２と称するキメラタンパク質をコード化する遺伝子を示す。プラスミドｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２−ＬＨは、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢに融合され、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコード化する配列に融合される、タンパク質ＴＢ４Ｇ２をコード化する（配列番号１６）。
【００５５】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、Ｎ末端からＣ末端に以下の要素を含む：（ａ）ｍＡｂ ４Ｇ２の軽鎖の可変ドメイン（配列番号２５）、（ｂ）柔軟なスペーサー配列（配列番号２６）、（ｃ）ｍＡｂ ４Ｇ２の重鎖の可変ドメイン（配列番号２７）、（ｄ）１５残基からなる柔軟なスペーサー配列（配列番号２８）、（ｅ）溶液中で分子の三量体化を可能にする、ヒト母系断片（配列番号５１）。
【００５６】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、トポロジー変異体［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｔ］に相当し、［Ｓ］がｍＡｂ ４Ｇ２のｓｃＦｖ断片であり、［Ｌ］がＧＬＹ及びＳＥＲ残基により構成される１５残基からなるスペーサー配列であり、［Ｔ］は並行立体配座に並べられたαへリックスによるらせん形コイルドコイル三量体構造を形成するヒト母系三量体化ドメインである（Ｄａｍｅｓ ＳＡ、Ｋａｍｍｅｒｅｒ ＲＡ、Ｗｉｌｔｓｃｈｅｃｋ Ｒ、Ｅｎｇｅｌ Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｒｅｓｃｕ ＡＴ、「並行ホモ三量体コイルドコイルのＮＭＲ構造（ＮＭＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ）」Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９８；５：６８７−９１）。
【００５７】
この母系断片は、へリックスのＮ末端に位置するシステイン間に形成されたジスルフィド架橋によって安定化された共有結合性三量体を形成する。シグナルペプチドｐｅｌＢは、タンパク質ＴＢ４Ｇ２がペリプラズムに位置することを可能にし、それ故インビボで結合ドメイン及び三量体化ドメインのジスルフィド架橋の正確な形成を含む、正確なフォールディングを可能にする。
【００５８】
ビリオンとＦｖ４Ｇ２の間に形成される複合体のモデルによれば、非対称ユニットの３つのＥタンパク質単量体に結合したＦｖ断片に相当する、Ｆｖ重鎖のＣ末端間を測定した距離は、３６、５８及び７０Åである。これら３つのＣ末端原子は、半径３５Åの球形に外接し、これはスペーサーセグメント［Ｌ］がこの距離に匹敵する立体配座を採らなければならないことを示す。
【００５９】
理論的には、伸長配座を採る１５残基からなるセグメントは、Ｎ末端からＣ末端まで５２Åの大きさを有する。しかし、このような立体配座は最も安定であるわけではなく、一般的にペプチドの構造的特性はそれらの配列によって決定される。ＧＬＹ及びＳＥＲが多いペプチドは、本質的に柔軟であり、溶液中で複数の立体配座を採ることができる。実施例９に示したように、ＰＲＥＬＵＤＥを使用したペプチドの立体配座の予測（Ｒｏｏｍａｎ ＭＪ、Ｋｏｃｈｅｒ ＪＰ、Ｗｏｄａｋ ＳＪ、「７つの構造配置に基づくタンパク質骨格立体配座の予測。局所的相互作用の影響（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｖｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９１；２２１：９６１−７９）により、配列［Ｌ］（配列番号２８）に関して予測された最も好ましい立体配座は、Ｎ末端とＣ末端との距離が約３５Åに相当することが示される。この発見は、キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２のこの設計が、ビリオンの非対称ユニットに存在する３つのＥタンパク質単量体に同時に結合することの達成能力に構造的に合っていることを指摘する。
【００６０】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２をバクテリア大腸菌のペリプラズムに可溶な形態で得た。拡張が容易な精製方法を、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に基づき開発し、この方法により純粋タンパク質調製品を得ることができた。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。非還元条件下で処理した場合、還元条件下であらかじめ処理したタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、単量体及び三量体の質量に相当するバンドに移行する。
【００６１】
最終的に、タンパク質ＴＢ４Ｇ２の中和能力をｍＡｂ ４Ｇ２並びにその断片のＦＡｂ及び（ＦＡｂ’）２と比較するために、ＢＨＫ−２１細胞において４種のデング熱ウイルス血清型に対する中和試験を実施した。タンパク質ＴＢ４Ｇ２は、４種の血清型に対して同様の中和力価を示し、抗体及びその断片と比較して２〜３オーダー強力であった。
【００６２】
本発明は、ＭＡ４Ｇ２と称するキメラタンパク質をコード化する遺伝子（配列番号１７）を示す。キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２（配列番号５６）は、以下の要素をＮ末端からＣ末端までに含む：ａ）ｍＡｂ ４Ｇ２の軽鎖の可変ドメイン（配列番号２５）、（ｂ）柔軟なスペーサー配列（配列番号２６）、（ｃ）ｍＡｂ ４Ｇ２の重鎖の可変ドメイン（配列番号２７）、（ｄ）３残基（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）からなる柔軟なスペーサー配列、（ｅ）ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン分子のヒンジセグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおいて、タンパク質はＡＳＮ２９７がＧＬＮに変異している。
【００６３】
キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２は、本発明中で規定されたトポロジー変異体［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｄ］に相当し、［Ｓ］がｍＡｂ ４Ｇ２の一本鎖ｓｃＦｖ断片であり、［Ｌ］が配列ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹの３残基のスペーサーセグメントであり、［Ｄ］はヒトＩｇＧ１免疫グロブリン分子のヒンジセグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むセグメントである。ヒンジセグメントは２つの同一タンパク質鎖間の分子間ジスルフィド架橋の形成を媒介し、安定な二量体構造をもたらす。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおいて、ＡＳＮ２９７がＧＬＮへ変異することにより、真核生物におけるタンパク質のグリコシル化が妨げられ、ＦｃγＲ Ｉ〜ＩＩＩへの結合を不可能にする。これらの受容体は、インビトロでＡＤＥ現象を媒介する。このように、思いがけなく設計されたタンパク質であるｍＡｂ ４Ｇ２は、中和濃度以下においてＡＤＥを伴う危険がない。しかし、キメラタンパク質はＦｃＲｎ受容体と相互作用する能力、インビボでより長い半減期を達成するために好ましい特性を、抗体分子に対する類似の手法で維持する。
【００６４】
プラスミドｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２−ＬＨ（配列番号２０）は、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢ（配列番号２４）に、Ｃ末端で６個のヒスチジンの尾部に融合された、タンパク質ＭＡ４Ｇ２をコード化する。シグナルペプチドｐｅｌＢは、タンパク質ＭＡ４Ｇ２がペリプラズムに位置することを可能にし、ペリプラズムにおいて分子内ジスルフィド架橋（結合ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３）及びヒンジセグメント間（分子間架橋）の正確な形成が起こる。ヒスチジン尾部により、金属キレートクロマトグラフィーによるタンパク質の精製が可能になる。
【００６５】
タンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体とによって形成される複合体の３Ｄモデル（実施例９）、並びに中和試験の結果（実施例１２）は、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２が、成熟ビリオンの構造において二量体として会合する単量体に同時に結合するために適していることを示す。このように、二価性がタンパク質の生物活性の有意な増加をもたらす。
【００６６】
本発明の本質的な側面は、本明細書中に記載の高度に保存されたＥタンパク質の表面パッチに結合できる分子が、このタンパク質の生物学的機能に干渉し、このような分子がフラビウイルス属に対する幅広い抗ウイルス薬の潜在的な候補を構成するという発見にある。実施例１２に示すように、ｓｃＦｖを含むｍＡｂ ４Ｇ２の断片は、全ｍＡｂ ４Ｇ２と同等の中和活性を示し、抗ウイルス活性に二価性は必要ではないことを示す。これらの結果はさらに、断片の抗ウイルス活性はＥタンパク質の生物活性への干渉に左右され、この干渉が前記のタンパク質の高度の保存された領域に結合することによって媒介されることを示す。さらに、フラビウイルス属に対する広範囲の抗ウイルス活性が観察された。したがって、これらの特性を有する抗ウイルス分子の特定のための興味深い方法は、タンパク質、ペプチド及び前記の高度の保存された表面領域に結合する薬剤様分子の特定を可能にする方法である。このような方法は、高度保存表面領域を認識する、ｍＡｂ ４Ｇ２、その対応するＦＡｂ及び（Ｆａｂ’）２断片又は本発明に記載のキメラタンパク質などの抗体が、Ｅタンパク質に結合することを遮断することに基づく方法である。それらの方法は、免疫酵素法、放射免疫測定、蛍光色素を用いた試験に基づくことができ、これらの試験はＥタンパク質、ビリオン又は本明細書中に記載の、高度保存表面領域を示すキメラタンパク質に対する分子の結合を定量化できる。
【００６７】
これらのアッセイは、コンビナトリアルケミストリーの方法によって生成したキメラ化合物を含む、キメラ化合物のライブラリのインビトロのスクリーニングを用いた、広範囲のフラビウイルス属に対して有効で強力な抗ウイルス分子の特定に有用であり得る。
【００６８】
候補分子の特定は、コンピュータ支援ウイルススクリーニング法を使用して実施できた。これらの方法は、キメラ化合物の分子ドッキングのような、コンピュータを使用した手法に基づく。これらの方法を使用して、タンパク質に対するキメラ化合物の結合をモデル化し、相互作用の強さ又は結合エネルギーを定量化することが可能であり、これらはスコア関数を用いて、モデル化複合体の座標から予測又は算出される。
【００６９】
分子ドッキングのコンピュータ手法の例は、プログラムＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．ｙ ｃｏｌｓ．、１９９７、「柔軟なドッキングのための遺伝的アルゴリズムの開発及び検証（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｄｏｃｋｉｎｇ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７、７２７−７４８）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ｙ ｃｏｌｓ．、１９８２「巨大分子−リガンドの相互作用に対する幾何学的アプローチ（Ａ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１、２６９−２８８）及びＦＬＥＸＸ（Ｏｌｅｎｄｅｒ，Ｒ．及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．、２００１、「巨大ヴァーチャルコンビナトリアルライブラリにおける、活性基を含む分子の検索のための高速アルゴリズム（Ａ ｆａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ ｉｎ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｖｉｒｔｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｃｉ．４１、７３１−７３８）である。これらの方法は、ＺＩＮＣデータベースのような、分子の大型ヴァーチャルライブラリ（Ｉｒｗｉｎｇ，Ｊ．Ｊ．及びＳｃｏｉｃｈｅｔ，Ｂ．Ｋ．、２００５、「Ｚｉｎｃ−ヴァーチャルスクリーニングのための市販化合物の無料データベース（Ｚｉｎｃ − Ａ ｆｒｅｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｖｉｒｔｕａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．４５、１７７−１８２）が、どの分子が受容体タンパク質上の選択された活性部位に結合することが期待されるかをスクリーニングし、決定することを可能にする。本発明に関して、結合部位は前記の高度保存表領域である。ＰＤＢデータベースにおいて利用可能なＥタンパク質の結晶構造が、原子座標のための情報源として使用でき、又は代替としてコンピュータモデルが使用でき、コンピュータモデルはホモロジーによるタンパク質のモデリングのような方法を用いて得られる。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
キメラタンパク質ＰＭＥＣの設計
Ｅタンパク質の表面上の保存パッチを特定する目的で、ＣＵＮＳＵＲＦ法を使用して保存分析を実施した（「ＣｏｎＳｕｒｆ：系統発生情報の表面マッピングによるタンパク質の機能的領域の特定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ−ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｇｌａｓｅｒ，Ｆ．、Ｐｕｐｋｏ，Ｔ．、Ｐａｚ，Ｉ．、Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｅ．、Ｂｅｃｈｏｒ−Ｓｈｅｎｔａｌ，Ｄ．、Ｍａｒｔｚ，Ｅ．及びＢｅｎ−Ｔａｌ，Ｎ．；２００３；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：１６３−１６４）。高度保存表面パッチはドメインＩＩの先端に見られ、これは４種のデング熱ウイルス血清型及び残りのフラビウイルス属にも保存されている（図１及び２）。
【００７１】
高度保存表面パッチはトポグラフィー的エピトープを規定し、三次元構造において近くに位置するが、Ｅタンパク質の配列からは離れて位置する残基により適合する。この表面領域は、ドメインＩＩの端に位置する構造サブドメイン上に含まれ、Ｅタンパク質の２つの直系のセグメントであるＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２６２（セグメントＢ）及びＬｙｓ６４〜Ｔｈｒ１２０（セグメントＣ）により適合する。表１は、ビリオンの外面に位置し、したがって抗体との相互作用に接近可能な、サブドメインの残基のリストを示す。高度保存残基は、本発明により規定される領域又はエピトープを規定する。
【００７２】
Ｅタンパク質のドメインＩＩの構造の検討により、サブドメインが構造的に独立した、ドメインのような特性を示すことが示される。残りのタンパク質に対する接触表面は１８４Å２であり、これは溶媒が接触可能であるサブドメインの全表面積のわずか１２％である。さらに、構造のこの部分がＣＡＴＨデータベースにおいて構造ドメインとして規定された（ＣＡＴＨ ｄｏｍａｉｎ Ｉｓｖｂ０３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｃａｔｈ／ｃａｔｈ．ｈｔｍｌ）。
【００７３】
【表１】
【００７４】
独立してフォールディングされたサブドメインを得るために、まずユニークなポリペプチド鎖において２つのセグメントを接触させることが必要である。２種の考えられる連結又はトポロジーが可能である：
Ｂ−Ｌ−Ｃ ｙ Ｃ−Ｌ−Ｂ
式中Ｌはリンカー又はスペーサーセグメントである。リンカーはサブドメインの三次元的構造に立体化学的に適合する必要があり、最良の場合キメラタンパク質の熱力学的安定性に安定化効果を提供する。残基のＶａｌ２５２及びＬｙｓ６４のα炭素間の距離は６．６Åであり、したがってトポロジーＢ−Ｌ−Ｃを１つ又は複数の残基のリンカーを使用して得られた。アンカーセグメントの構造に適合するターンを捜す、ＰＤＢデータベースによる考えられる連結ターンの構造分析（ＷＨＡＴＩＦプログラムパッケージのＤＧＬＯＯＰメニューのＤＧＩＮＳコマンド）は、２つの残基の連結が１つの残基による連結より一般的であることを示す。トポロジーＣ−Ｌ−Ｂの場合、残基のＴｈｒ１２０及びＬｅｕ２３７のα炭素間の距離は１１．１Åであり、３〜４残基又はそれを超える残基の連結に一致する。
【００７５】
本発明のキメラタンパク質ＰＭＥＣ１（配列１４）は、トポロジーＢ−Ｌ−Ｃに相当し、断片Ｂ及びＣはデング熱２型ウイルス由来の配列及び２つの残基Ｇｌｙ−Ｇｌｙのリンカー配列に相当する。
【００７６】
Ｂ及びＣセグメント配列はＤＥＮ２ウイルスに相当する配列のみではなく、限定するものではないがＤＥＮ１、ＤＥＮＳ、ＤＥＮ４を含む他のフラビウイルス属、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、マリーバーレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴ ウイルス（ＬＡＮＧＡＴ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）（配列２９〜４２）由来の相同配列から選択できるだろう。
【００７７】
さらに、上記の方法により設計されたキメラタンパク質は、タンパク質の熱力学的安定性、又はフォールディング過程の効率を高める目的で、１個又は複数個の残基を変異させることができた。ビリオン表面及び抗体との相互作用に接近できない、表１に記載された残基を変異させることが可能であった。変異させやすい残基は、タンパク質の３Ｄ構造に埋もれている、及び／又は成熟ビリオンに存在するＥタンパク質の３Ｄ／４Ｄ構造の側面又は内面に位置する残基である。
【００７８】
変異させたタンパク質は、線状ファージライブラリのような実験的コンビナトリアル法によって得られた。タンパク質は、ＦＯＬＤＸ、ＰＯＰＭＵＳＩＣ及びＲｏｓｓｅｔａのような理論的方法を使用して設計できた。
【００７９】
配列４３〜５０は、複数位置で変異させたキメラタンパク質ＰＭＥＣ１の類似体に相当する。このタンパク質の三次元モデルは、良好なパッキング及び性質を示す。これらの変異はＥタンパク質の保存サブドメインを認識する防御及び中和抗体との相互作用に影響を与えてはいけないという条件で、タンパク質の露出面における、特にデング熱血清型及び他のフラビウイルス属に厳重には保存されていない残基における変異もまた可能である。
【００８０】
（実施例２）
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１の構築
タンパク質ＰＭＥＣ１（配列番号１）をコードする組換え遺伝子、ＤＥＮ２ウイルス由来のＥタンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子を得るために、プラスミドｐ３０−ＶＤ２に存在する、１４０９株、遺伝型ジャマイカ（Ｄｅｕｂｅｌ Ｖ．、Ｋｉｎｎｅｙ Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｔ Ｄ．Ｗ．；「デング熱２型ウイルス、遺伝型ジャマイカの構造タンパク質のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ、Ｊａｍａｉｃａ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５（２）：３６５−３７７、１９８６）を使用した。この遺伝子は、配列番号３に示されるタンパク質をコードする。Ａｇａｒｗａｌらの方法を使用し（Ａｇａｒｗａｌ ＫＬ、Ｂｕｃｈｉ Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｇｕｐｔａ Ｎ、Ｋｈｏｒａｎａ ＨＧ、Ｋｕｍａｓ Ａ、Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ、Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｙ ＵＬ、ｖａｎ ｄｅ Ｓａｎｄｅ ＪＨ、Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ Ｖ、Ｗｅｂｅｒ Ｈ、Ｙａｍａｄａ Ｔ、「酵母由来のアラニン転移リボ核酸の遺伝子の全合成（Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａｎ ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ）」、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７、２７−３４）、ホスホアミダイド法によって固相で化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから開始し（Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、「デオキシリボ核酸ホスホアミダイド法：新規な一連の鍵がデオキシリボヌクレオチドの合成を媒介する（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ− Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８１、２２、１８５９）、ＰＭＥＣ１タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を得た（配列番号４）。このＤＮＡ分子の配列は以下の要素を有する：１）アミノ酸のメチオニン（Ｍ）をコードする開始コドンその後にアミノ酸アラニンをコードするコドン（Ａ）（配列番号５）を含む、ＮｃｏＩ制限酵素の認識部位；２）デング熱２型ウイルス株ジャマイカ１４０９（配列番号６）のタンパク質Ｅに関する遺伝子の、７０９位から７５６位までの配列に相当し、配列番号７に示されるペプチド配列をコードする、配列番号３の２３７位から２５２位までに相当するターンに存在する断片；３）２つの連続するグリシンをコードするリンカーセグメント（配列番号８）；４）配列番号２の１９０位から３６０位にわたる配列に相当する断片であり、配列番号９（配列番号３の６４〜１２０位に相当する）に示されるペプチド配列をコードし、前記配列（配列番号１０）の２８４〜２８９位に存在するＮｃｏＩ制限部位を誘発するサイレント変異が導入される；及び５）アミノ酸ロイシン（Ｌ）及びグルタミン酸（Ｅ）をそれぞれコードする２つのコドンを含むＸｈｏＩ制限酵素の認識部位（配列番号１１）。この合成分子を、製造業者により指定された条件でＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて消化し、製造業者により指定の条件でＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、あらかじめ完全に同じように消化したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に連結した。反応物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従って、大腸菌株ＸＬ−１ブルー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ｓｔｒａｉｎ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）（Ｂｕｌｌｏｃｋ ＷＯ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭ、Ｓｈｏｒｔ ＪＭ．ＸＬ−ｌＢｌｕｅ：「βガラクトシダーゼ選択によるｒｅｃＡ大腸菌Ｋ１２株の高性能プラスミド形質転換（Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｃＡ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８７；５：３７６−８）に組み込み、選択培地で生き残ったコロニーに存在するプラスミドを制限分析によってスクリーニングした。得られた組換えプラスミドの１つをｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１と命名し（図４）、その配列（配列番号１２）を、自動的サンガー配列決定を介して検証した。
【００８１】
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１は、Ｎ末端でｐｅｌＢリーダーペプチドに、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコードする配列に融合されたタンパク質ＰＭＥＣ１をコードする（配列番号１３）。この構成により、一方では、リーダーペプチドの切断を介した宿主におけるこのタンパク質のプロセシング、並びに一般的酸化条件によりＰＭＥＣ１の正確なフォールディング及びジスルフィド架橋の形成が促進される、大腸菌のペリプラズムへの分泌が可能になり、さらに他方では固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介したこのタンパク質の精製を容易にすることができる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．（１９８５）「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３、１−７）。ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６と命名した、プロセシング及びペリプラズムへの分泌後のタンパク質の最終配列を、配列番号１４に示した。
【００８２】
（実施例３）
ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の発現及び精製
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．及びＢ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ、「クローン化遺伝子の直接的、選択的な高レベルの発現に対するバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９．１（１９８６）：１１３−３０）に組み込み、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｆｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加した５０ｍｌのルリア−ベルターニ培地（ＬＢＡ）の培養液に単一の、単離されたコロニーを接種し、３５０ｒ．ｐ．ｍで３０℃において１２時間成長させた。１ＬのＬＢＡ培地にこの培養液を接種し、６２０ｎｍにおける開始吸光度（ＯＤ６２０）は０．０５であり、次いで後期指数増殖期まで、２８℃で８時間成長させた。この培養液を、その後イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導し、さらに５時間同じ条件で成長させた。
【００８３】
上記のようにして得た培養液を、４℃において５０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．及びＳｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９８９）ｉｎ「分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して、得られたバイオマスからペリプラズム画分を抽出した。この画分を、１０００Ｄａカットオフの膜を使用して、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７／２０ｍＭイミダゾールに対して透析し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｅｎｅｌｕｘ Ｂ．Ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ １９８５、「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）によって透析物からタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６を得た。
【００８４】
（実施例４）
キメラタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の物理的及び化学的特徴付け
ＩＭＡＣにより精製されたＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の調製品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてこのタンパク質に関して予想される質量（およそ９５００Ｄａ）に相当する見かけの質量まで移動した太いバンドを示し（図７）、調製品の精製度が高いことの証拠となった。同じ図は、還元し、カルバミドメチル化したＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６（レーン２、図７Ａ）に対応するバンドが、還元していない試料（レーン１、図７Ａ）と比較した場合に、電気泳動での移動がわずかに減少していることを示す。この挙動は、システインが分子間ジスルフィド架橋に関与し、タンパク質が適切にフォールディングされたことを示す。
【００８５】
ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の８０μｇアリコートを、Ｃ４ ４．６×２５０ｍｍ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＵＳＡ）の逆相ＨＰＬＣカラムで分析した。クロマトグラフィーの作動は、２つのポンプとコントローラーとを取り付けた高圧クロマトグラフィー系を使用して、３７℃において実施した。タンパク質の溶出は、１０から６０％（ｖ／ｖ）までの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中の線形勾配のアセトニトリルにより、流速０．８ｍＬ／分で、検出フィルターを２２６ｎｍにセットして達成した。クロマトグラムは、単一のピークを示したため、調製品の均一性が高いことが裏付けられた（図７Ｂ）。
【００８６】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるピークを、質量分析法により、さらに高い精度でタンパク質の分子質量を測定し、ジスルフィド架橋の酸化状態を確認する目的で分析した。スペクトルを、Ｚ−スプレー電子噴霧イオン化源を取り付けた、オクタゴナルジオメトリＱＴＯＦ−２ＴＭ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）を用いたハイブリッドマススペクトロメーターで得た。得られたスペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘ バージョン３．５（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）ソフトウェアアプリケーションを使用して処理した。ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６調製品の主要な種類の質量スペクトルは、９２１９．５１Ｄａの分子質量を有し（図７Ｃ）、この値は遺伝子配列による予測値より０．０５Ｄａ少ないだけである。この分析により、分子のシステイン残基はジスルフィド架橋に関わっており、Ｎ末端及びＣ末端の分解又は影響を受けやすいアミノ酸の修飾などの、望ましくない翻訳後の修飾の存在が消失したことが裏付けられた。
【００８７】
（実施例５）
ＰＭＥＣ１の抗原的特徴
精製ＰＭＥＣ１タンパク質を、モノクロナールマウス抗体及びポリクロナールマウス抗体並びにデング熱反応性ヒト血清を使用してドットブロットにより特徴付けした（表２及び３）。陰性対照として、ヘキサヒスチジンタグに融合した、Ｄｅｎ−２ウイルス（遺伝型ジャマイカ）のＥタンパク質のドメインＩＩＩにある、組換えタンパク質ＤＩＩＩｅ２を用いた。ＰＭＥＣ１と異なり、ＤＩＩＩｅ２はＥタンパク質のより高度な配列可変領域に対応する。組換えドメインＩＩＩは抗Ｄｅｎ高度免疫腹水（ＨＩＡＦ）により強く認識され、同種血清型に顕著な特異性を示し、このドメインのジスルフィド結合の還元に関する反応性をほとんどなくしている。ドメインＩＩＩに対する抗体反応性におけるこの血清型特異性は、さらにヒトの抗体応答においても発見されている。Ｍａｂ ３Ｈ５もまた、試験の対照として含まれていた。Ｍａｂ ４Ｇ２と異なり、３Ｈ５はＤｅｎ−２のドメインＩＩＩ内で血清型特異的エピトープを認識する。これらの２つのＭａｂの反応性に還元剤を用いた処理によって、影響を受ける（Ｒｏｅｈｒｉｇ ＪＴ、Ｖｏｌｐｅ ＫＥ、Ｓｑｕｉｒｅｓ Ｊ、Ｈｕｎｔ ＡＲ、Ｄａｖｉｓ ＢＳ、Ｃｈａｎｇ ＧＪ、「デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のエピトープ発現に対するジスルフィド架橋の構築（Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｔｏ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：２６４８−５２）。
【００８８】
【表２】
【００８９】
ＰＭＥＣ１は、Ｄｅｎの４種の血清型に対して並びにＭａｂ ４Ｇ２に関して得られたＨＩＡＦによって認識された。評価された異なるフラビウイルス属に対して得られたＨＩＡＦの残りのうち、抗ＳＬＥが、抗ＤｅｎのＨＩＡＦに対して得られた同じシグナル強度を有するＰＭＥＣ１に最も高い反応性を示した。抗ＴＢＥ及び抗ＹＦのＨＩＡＦもまた、強度は前述のものより低いがＰＭＥＣ１を認識した。異なるＨＩＡＦの反応性は、ウイルスのＥタンパク質の天然構造と同様の立体配座でタンパク質が正確にフォールディングされたことを示す、ＰＭＥＣ１のジスルフィド結合の存在に強く依存した。
【００９０】
ＰＭＥＣ１タンパク質を、異なる疫学的状態でＤｅｎに感染したことがある人間に由来する、ヒトの血清との反応性を介して、さらにドットブロットで特徴付けした。このアッセイにおいて、４種のウイルス血清型（即ち、Ｄｅｎ１、Ｄｅｎ２、Ｄｅｎ３及びＤｅｎ４）に一次感染した回復期にある患者からの血清も含んだ。Ｄｅｎ２又はＤｅｎ３に二次感染した個人由来の血清もまた使用した。ヒトの抗体は、同じ疫病に感染し、同様の臨床症状を経験し、同様の血清学的結果を有する３例の個人に由来する血清をプールとして用いた。各血清を、ウイルス性抗原及びＰＭＥＣ１タンパク質に対するＩｇＭ抗体の存在に関して評価した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
異なるウイルス血清型に感染した個人由来のヒト血清は、同等の強度を有するＰＭＥＣ１を認識した。最も強いシグナルは、二次感染に苦しむ個人由来の血清で得られ、ＥＬＩＳＡによっても、より高い抗ウイルス力価は一致した。
【００９３】
（実施例６）
ＰＭＥＣ１タンパク質を用いた免疫化により得た抗体応答の特徴付け
８０Ｂａｌｂ／ｃマウスの一群に、腹腔内（ｉ．ｐ）経路で、フロインドアジュバントを用いて乳化した２０μｇの精製ＰＭＥＣ１を注入した。４回目の投与の後で、１０匹のマウスを出血させ、さらなる血清学的分析のために血清を収集した。ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｄｅｎ抗体力価は、ウイルスの４種の血清型と同様に高かった（表４）。同時に、誘発されたＡｂｓの機能性を赤血球凝集の阻害（ＩＨＡ）及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって測定した。ＩＨＡ試験において、抗ＰＭＥＣ１抗体は、４種のＤｅｎ血清型に対して陽性の力価を得た（表５）。さらに、１／１２８０の中和力価を、４種のウイルスに対して得た（表６）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【００９６】
【表６】
【００９７】
（実施例７）
プロテクションアッセイ
出血させた後に残った、ＰＭＥＣ１を用いて免疫化した動物をいくつかの群に分け、チャレンジ研究の実施に使用した。１５匹の動物からなる４群に、ｉ．ｃ．注入によって、ウイルスの４種うちの１種の血清型の生神経適応株の１００ＬＤ５０を接種し、２１日間観察した。１０匹の動物からなる５番目の群には、ウイルスのチャレンジをしなかった。１５匹の動物の群からなる陽性対照を、免疫化し、その後ウイルスの同じ血清型（即ち、Ｄｅｎ１、Ｄｅｎ２、Ｄｅｎ３及びＤｅｎ４）によりチャレンジした。１５匹のマウスからなる別の４群を、それぞれ実験の陰性対照として用いた；これらの動物にはＰＢＳを免疫原として与え、異なるウイルス血清型によりチャレンジした。ＰＢＳにより免疫化したマウスが、ウイルス接種後７〜１１日で脳炎症状を発症し、２１日までに死亡したのに対して、ＰＭＥＣ１により免疫化した動物群は、８０％〜９０％が生存した（表７）。ウイルスにより免疫化した群の動物は、１００％防御された。
【００９８】
【表７】
【００９９】
（実施例８）
ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成された複合体の構造予測
抗原−抗体複合体の構造をモデリングするために、分子ドッキング研究を、ｍＡｂ ４Ｇ２のＦＡｂ断片の結晶構造（１ｕｙｗ）とデング熱２型ウイルス由来のエンベロープＥタンパク質の２つの結晶構造（ＰＤＢファイル、１ｏａｎ及び１ｏａｍ）とを使用して実施した。可能性のある複合体構造の作成のための２つの異なるプログラム：ＤＯＴ及びＺＤＯＣＫ（Ｍａｎｄｅｌｌ ＪＧ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＶＡ、Ｐｉｑｕｅ ＭＥ、Ｋｏｔｌｏｖｙｉ Ｖ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＪＣ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｅ、Ｔｓｉｇｅｌｎｙ Ｉ、Ｔｅｎ Ｅｙｃｋ ＬＦ、（２００１）「連続した静電気的及び幾何学的適性を使用したタンパク質ドッキング（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｃｋｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｆｉｔ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １４：１０５−１３、Ｃｈｅｎ Ｒ、Ｌｉ Ｌ、Ｗｅｎｇ Ｚ（２００３）「ＺＤＯＣＫ：初期段階のタンパク質ドッキングアルゴリズム（ＺＤＯＣＫ：Ａｎ Ｉｎｉｔｉａｌ−ｓｔａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｏｃｋｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」５２：８０−８７）を含む、ＣＬＵＳＰＲＯ法を予測のために使用した（ｈｔｔｐ：／／ｎｒｃ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｃｌｕｓｔｅｒ／、Ｓ．Ｒ．Ｃｏｍｅａｕ、Ｄ．Ｗ．Ｇａｔｃｈｅｌｌ、Ｓ．Ｖａｊｄａ、Ｃ．Ｊ．Ｃａｍａｃｈｏ．「ＣｌｕｓＰｒｏ：タンパク質複合体を予測するための自動的ドッキング及び識別の方法（ＣｌｕｓＰｒｏ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０、４５−５０）。
【０１００】
以下のパラメータを変えながら、全部で１３の分子ドッキングシミュレーションを実施した：ドッキングプログラム（ＤＯＴ又はＺＤＯＣＫ）、リガンド及び受容体の規定（Ｆｖ断片又はＥタンパク質）、Ｅタンパク質の結晶構造（１ｏａｎ又は１ｏａｍ）、Ｅタンパク質の四次構造（単量体又は二量体）、Ｅタンパク質のＦｖ断片又はＮ末端セグメント（１〜１２０残基）の結合部位に関与する解のフィルタリングの抑止の使用（ＤＯＴの魅力的なオプション）。図７は、シミュレーションの結果を要約したスキームを示す。それらの複合体は可能性のある解であると思われ、Ｅタンパク質のドメインＩＩに位置するエピトープを予測し、このエピトープはビリオン構造に従った抗体とも相互作用に接近可能であり、パラトープは抗体の高度可変領域である。ドメインＩＩのエピトープＡ１（ｍＡｂ ４Ｇ２おり認識されるエピトープ）の位置は、実験データにより裏付けられ、同じエピトープに対する関連抗体がＥタンパク質のアミノ酸１〜１２０にあるタンパク質分解断片を認識することもまた判定されている（Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．，Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．及びＫｅｌｌｙ，Ｒ．Ｇ．「デング熱２型、ジャマイカのエンベロープ糖タンパク質のモノクロナール抗体マッピング（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｎｇｕｅ ２ Ｖｉｒｕｓ、Ｊａｍａｉｃａ）」１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４６：３１７−３２８）。
【０１０１】
６個の可能性のある解を得、これらは構造的に非常に似ていた。表８は、予測Ｅタンパク質−Ｆｖ複合体のインターフェースパラメータに対応する値を示し、予測複合体に関して算出された値は、結晶構造があらかじめ実験的に決定されているタンパク質−抗体複合体に関して算出された値と同様である（表９）。
【０１０２】
抗体に接触するＥタンパク質の表面パッチは、タンパク質配列の４つのセグメントを含む。この発見は、エピトープのトポグラフィー的性質と一致し、その認識は、タンパク質の正確なフォールディングに依存し、ジスルフィド架橋の減少の影響を受けやすい。三次元モデルにより規定された構造エピトープは、フラビウイルス属に高度に保存された領域を含み、このことは、実施例５に示される抗体の広い交差反応性及びキメラタンパク質ＰＭＥＣ１の認識に一致する。該モデルはさらに、この抗体の中和機序がＥタンパク質が膜に結合することへの干渉、及び／又は融合過程に伴う三量体化に関与することを示唆する。
【０１０３】
さらに、未成熟ビリオンの低温電子顕微鏡研究でのｐｒｅＭに対応する電子密度から推論されるように、抗体により認識されるエピトープは、Ｅタンパク質とｐｒｅＭとの相互作用に関与する領域に一致する。相互作用面の保存に関する進化的圧力により、Ｅタンパク質のこのエピトープが高度に保存されたことが説明可能であろう。しかも、このような変異は、ｐｒｅ−Ｍの表面上の同時変異が安定化されることによって補正されるべきであるから、この表面パッチのエスケープ変異体の出現は可能性が低い。実際に、この抗体に対して得られたエスケープ変異体は、ドメインＩとＩＩの間のヒンジ領域に位置し、変異ウイルスは、高度の弱毒化を示し、膜に融合する能力を失う。このことは、フラビウイルス属に対する組換えワクチン候補としての、本発明のＰＭＥＣキメラタンパク質の好ましいプロパティを構成する。
【０１０４】
その後、本発明者らは、成熟ビリオンの構造を基にして、ＦＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質との間の相互作用をモデル化した。この目的のもとに、本発明者らはあらかじめモデル化した複合体を、成熟ビリオンの低温電子顕微鏡による構造にドッキングさせた。モデルを得るために本発明者らは以下を使用した：１）低温電子顕微鏡により得られたビリオンの構造に対応するＰＤＢファイル１ＴＨＤ、２）分子ドッキングによってあらかじめモデル化された、ＦＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質単量体とにより形成された複合体の座標、３）ファイル１ＴＨＤに対応する正二十面体対称操作を、分子ドッキングによりあらかじめモデル化した複合体に適用した。
【０１０５】
このようにモデルを得、該モデルにおいて、ビリオン上に存在するｍＡｂ ４Ｇ２により認識されるエピトープのすべてのコピー（１８０）は、ＦＡｂにより占められている（図９）。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
ＦＡｂ断片の重鎖のＣ末端残基間の距離の調査により、抗体の二価結合はビリオンの構造に大きな変化が起こらなければ不可能であることが示される。この観察は、等モル量のＦＡｂ及びｍＡｂが非常によく似た中和力価を見せることを示す、実施例１２において得た結果と一致する。この発見は、二価結合形態に期待される２〜３桁の増加とは対照をなす。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
（実施例９）
キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２（二価）及びＴＢ４Ｇ２（三価）の設計
この実施例において、本発明者らは、成熟ビリオンにおいて提示されるＥタンパク質単量体の２つ又は３つのコピーと同時に結合できる、ｍＡｂ ４Ｇ２結合部位に関するキメラタンパク質の設計を示す。実施例８のモデリング研究は、ビリオンの非対称ユニットに位置するＥタンパク質単量体に付随するＦＡｂの重鎖のＣ末端残基を隔てる距離が、それぞれ８０、１００及び１２０Åであることを示す。これらの値は、大きすぎて抗体はビリオンに二価結合できない（図９）。異なる非対称ユニットに由来するＥタンパク質単量体に結合するＦａｂに対応するＣ末端残基間で算出された距離もまだ大きすぎる。しかし、非対称ユニットに結合したＦｖ断片の重鎖のＣ末端残基間で算出された距離はそれぞれ３６、５８及び７０Åである。これらの３つの原子は半径３５Åの円に囲まれ１０〜１５残基のリンカーセグメントを介して三量体化ドメインに融合することによって三価の結合が可能であることを示す。
【０１１０】
同様に、Ｅタンパク質二量体に結合するＦｖ断片の重鎖のＣ末端間の距離は、３６Åであり、５〜１０残基からなる小型のリンカーセグメントを用いて二量体化ドメインに融合することによって二価の結合が可能であることを示す。
【０１１１】
ミニ抗体型分子（二価結合）の設計
二価結合分子の例として、本発明者らは、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２を設計した。その配列は、Ｎ末端からＣ末端までに以下のセグメントを含む：
１− ｓｃＦｖ、ＶＬ−リンカー−ＶＨ型（配列番号２５、２６及び２７）のｍＡｂ４Ｇ２の一本鎖Ｆｖ断片で、ＶＬはｍＡｂ４Ｇ２の軽鎖の可変領域であり、ＶＨは同じ抗体の重鎖の可変領域である。
２− ＧＧＧ、３個のグリシン残基リンカーセグメント、
３− ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジセグメント配列と、ヒトＩｇＧＩ分子の定常ドメイン２及び３とに対応し、グリコシル化部位Ｎ２９７がグリシンに変異している（配列番号５２）
【０１１２】
タンパク質ＭＡ４Ｇ２は、真核生物及び原核生物において発現でき、ヒンジ領域に位置するシステイン残基間の分子間ジスルフィド架橋の形成のため、二量体として会合し、こうして分子のＣ末端部分でヒトＦＣドメインを提示する。ヒンジ領域は、適切な空間と柔軟性を示し、それ故三個の残基のリンカー（ＧＧＧ）は、ｓｃＦｖドメインとヒンジＦＣセグメントとの間の連結器として十分である。図１０は、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体により形成される複合体の３Ｄ構造のモデルを示し、ビリオンに対する二価結合の実現可能性を示す。
【０１１３】
グリコシル化部位での突然変異の存在により、真核生物において非グリコシル化ＦＣ担持分子を得ることができる。非グリコシル化ＦＣドメインは、受容体ＦｃγＲＩ〜ＩＩＩに結合せず、インビトロで感染性免疫増強を媒介できる（Ｌｕｎｄ，Ｊ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｏｏｄａｌｌ，Ｍ．、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、４９６３−４９６９、Ｌｕｎｄ，Ｊ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｏｏｄａｌｌ，Ｍ．、Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．１９９５、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．９、１１５−１１９）。このように、元の抗体分子と異なり、設計されたタンパク質は中和濃度以下でＡＤＥを媒介する危険がない。さらに、キメラタンパク質は、天然抗体と同様に、インビボで長期の半減期を表すために望ましいＦｃＲｎ受容体結合プロパティを維持する。
【０１１４】
キメラ三価タンパク質ＴＢ４Ｇ２
三価結合分子の例として、本発明者らはキメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２を設計し、それらの配列を以下の構造として記載する。
ｓｃＦｖ−リンカー−Ｔ
ここで、
１− ｓｃＦｖ、ＶＬ−リンカー−ＶＨ型（配列番号２５、２６及び２７）のｍＡｂ４Ｇ２の一本鎖Ｆｖ断片で、ＶＬはｍＡｂ４Ｇ２の軽鎖の可変領域であり、ＶＨは同じ抗体の重鎖の可変領域である、
２− リンカー、は（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧ（配列番号２８）の配列のリンカーセグメントである
３− Ｔは、ヒト母系らせん型三量体化ドメイン（配列番号５１）。
【０１１５】
母系の三量体化ドメインは、並行コイルドコイル構造として三量体化されたαへリックスである。該三量体は、各単量体のＮ末端に近接して位置する２個のシステインにより形成される、６個の分子間ジスルフィド架橋を含む。この三量体らせん型構造は高度に安定しており、５０℃においてｄＧ＝７ｋｃａｌ／ｍｏｌである（Ｗｉｌｔｓｃｈｅｃｋ Ｒ、Ｋａｍｍｅｒｅｒ ＲＡ、Ｄａｍｅｓ ＳＡ、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｓｓ Ｔ、Ｂｌｏｍｍｅｒｓ ＭＪ、Ｅｎｇｅｌ Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｒｅｓｃｕ ＡＴ、「酸化及び還元形態の軟骨基質タンパク質由来のコイルドコイル三量体ドメインの異核ＮＭＲ帰属及び二次構造（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＮＭＲ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７；６：１７３４−４５）。ジスルフィド架橋により、非常に低い濃度でも共有結合により連結された三量体の四次構造が確保され、この三量体は非共有結合相互作用のみに基づく三量体に好ましく匹敵する。
【０１１６】
リンカーセグメントはアミノ酸のＧｌｙ及びＳｅｒにより構成されており、非常に柔軟性がある。類似の構成のアミノ酸配列は、タンパク質工学においてリンカー配列として非常に多く使用されている。１０個の残基からなるセグメントは、ビリオンに対する三価の結合に必要な３５Åの空間を提供できるが、セグメントが十分に伸長した立体配座を採った場合にのみ当てはまる。溶液中でリンカーセグメントは、熱力学平衡状態において複数の立体配座を表すことができ、唯一の伸長配座を採ることは、有意なエントロピーエネルギーの損失を示唆する。リンカーセグメントの構造プロパティを調査するために、本発明者らは１５残基の（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧ配列の構造予測を、準備プログラムを使用して、実施した。この方法は、局所的相互作用を記載する統計ポテンシャルに基づき、ペプチド構造予測のためにあらかじめ使用されている。図１１は、予測されたより好ましい立体配座に関する、エネルギー値対Ｎ末端とＣ末端との距離のプロットを示す。３５Åの範囲に対応するエネルギー最小値及び最も伸長した立体配座（４０Åを超える）は非常に好ましくない。したがって、計算結果は、リンカーセグメントとして選択された配列は三価の結合分子の設計に適切であることを示す。
【０１１７】
（実施例１０）
抗体４Ｇ２由来の可変領域を有する、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ４Ｇ２）、三価分子（ＴＢ４Ｇ２）及び一本鎖ミニ抗体（ＭＡ４Ｇ２）をコードするプラスミドの獲得。
モノクロナール抗体４Ｇ２由来の可変領域を有する、一本鎖抗体断片、多量体タンパク質及び一本鎖ミニ抗体（ＭＡ４Ｇ２）を得るために、Ａｇａｒｗａｌらの方法（Ａｇａｒｗａｌ ＫＬ、Ｂｔｉｃｈｉ Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｇｕｐｔａ Ｎ、Ｋｈｏｒａｎａ ＨＧ、Ｋｕｍａｓ Ａ、Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ、Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｙ ＵＬ、ｖａｎ ｄｅ Ｓａｎｄｅ ＪＨ、Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ Ｖ、Ｗｅｂｅｒ Ｈ、Ｙａｍａｄａ Ｔ、「酵母由来のアラニン転移核酸に関する遺伝子の全合成（Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａｎ ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ）」、（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ ２２７、２７−３４）を合成のために使用し、ホスホアミダイド化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ−「新規な一連の鍵がデオキシポリヌクレオチド合成を媒介する（Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、（１９８１）、２２、１８５９）を介して固相で合成したオリゴヌクレオチドから開始し、二本鎖ＤＮＡ分子（配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７）それぞれを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により、製造業者により指定された条件で消化した。各消化分子をその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者の指定した条件下で、あらかじめ同じ酵素で消化したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に連結した。連結物を大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ ＷＯ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭ、Ｓｈｏｒｔ ＪＭ．ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ：「βガラクトシダーゼ選択によるｒｅｃＡ大腸菌Ｋ１２株の高性能プラスミド形質転換（Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｃＡ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ Ｋ１２ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８７；５：３７６−８）に組み込み、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載された条件に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）、選択培地で成長させて得られたコロニーに存在するプラスミドを、限定解析を使用してスクリーニングした。各形質転換からのいくつかの組換えプラスミドの配列を、自動的サンガーの配列決定によって検証し、各反応に関して予測配列と配列が一致する代表的分子を選択した。これらのプラスミドを、一本鎖抗体断片の発現に関してｐＥＴ−ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨ（図５、配列１８）、多量体化配列の発現に関してｐＥＴＴＢ４Ｇ２ ＬＨ（図６Ａ、配列番号１９）及び抗体４Ｇ２由来の可変領域を担持する一本鎖ミニ抗体の発現に関してｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２ ＬＨ（図６Ｂ、配列番号２０）と命名した。
【０１１８】
これらのプラスミドは、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導を介して、Ｔ７プロモーターの存在下で、前述の合成バンドによりコードされるタンパク質（配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７）の大腸菌における発現に使用でき、それらの未成熟で、プロセシングされていない形態（配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３）のそれぞれにおいて、以下の構成要素をＮ末端からＣ末端の方向に含む：非プロセシングタンパク質ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨに関しては、ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｇ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント；非プロセシングタンパク質ＴＢ４Ｇ２ ＬＨに関しては：ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２８）、ｇ）溶液中で三量体化できる分子プロパティを与えるヒト母系由来の断片（配列番号５１）、ｈ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｅ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント；並びに非プロセシングＭＡ４Ｇ２ ＬＨタンパク質に関しては：ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）３個の連続したグリシン（Ｇ）からなる柔軟なスペーサー（リンカー）、ｇ）ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１ヒト免疫グロブリンの定常領域の断片であり、ヒンジのアミノ酸Ｃ（システイン）が変異生成によりＳ（セリン）に変化し、ＣＨ２ドメイン部位の潜在的グリコシル化部位が、Ｎ（アスパラギン）がＱ（グルタミン）に変異することによって除去されている（配列番号５２）、ｈ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｅ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント。
【０１１９】
これらの要素により、リーダーペプチドの切断、大腸菌ペリプラズムへの分泌を介したこれらのタンパク質（ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２）のプロセシングが可能になり、この時一般的酸化条件によりそれらの正確なフォールディング及びジスルフィド架橋の形成が可能になり、さらに固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用した精製が容易になる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．（１９８５）「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）。翻訳後のプロセシング及び分泌の後の、ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２の最終的な配列を、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示す。
【０１２０】
（実施例１１）
ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２の発現及び精製
プラスミドｐＥＴ−ｓｃＦｖ４Ｇ２ ＬＨ、ｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２ ＬＨ ｙ ｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２から、それぞれｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２を精製するために、以下に記載の方法を使用した：対応するプラスミドをＳａｍｂｒｏｏｋらの指示（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従ってＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株に組み込み（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．及びＢ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ．「クローン化した遺伝子の直接的、選択的高レベル発現のための、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９．１（１９８６）：１１３−３０）、単離したコロニーを使用し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したルリア−ベルターニ培地（ＬＢＡ）の５０ｍｌ培養液に接種し、３５０ｒ．ｐ．ｍ．において３０℃で１２時間成長させた。この培養液を開始時の６２０ｎｍによる吸光度（ＯＤ６２０）が０．０５である１ＬのＬＢＡ培地に接種し、後期対数増殖期まで２８℃で８時間成長させた。この培養液を、イソプロピルチオガラクシトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘導し、同じ条件下でさらに５時間成長させた。
【０１２１】
上記のように得た培養液を、５０００×ｇにおいて４℃で３０分間遠心分離機にかけ、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．及びＳｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９８９）ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して得たバイオマスから、ペリプラズム画分を抽出した。この画分を、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７／２０ｍＭイミダゾールに対して、１００Ｄａカットオフの膜を使用して透析し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｅｎｅｌｕｘ Ｂ．Ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．１９８５、「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）によって、製造業者の指示に従って、透析物からタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６を得た。
【０１２２】
（実施例１２）
ＭＡＧ４Ｇ２タンパク質及びＴＢ４Ｇ２タンパク質によるウイルス感染の中和
ＭＡ４Ｇ２ ｙ ＴＢ４Ｇ２キメラタンパク質の生物活性の特徴付けを、ＢＨＫ−２１細胞においてプラーク減少中和試験を使用して実施した（表１０）。この同じアッセイを用いて、キメラタンパク質とＭａｂ ４Ｇ２、そのＦａｂ及びＦａｂ２断片並びにｓｃＦｖ４Ｇ２との生物活性を比較した（表１０）。
【０１２３】
Ｆａｂ及びＦａｂ２断片は、Ｍａｂ ４Ｇ２をパパイン及びペプシンで消化することによって得た。プロテアーゼ消化の後で、Ｆａｂ及びＦａｂ２を、固定化タンパク質Ａを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、Ｆｃ断片から分離した。Ｆａｂ及びＦａｂ２のイソ型を、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。中和力価を、ウイルスプラーク数が５０％減少する分子希釈として規定した。異なる分子の希釈は、試験で等モル濃度を得るために調整した。
【０１２４】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】フラビウイルス属のＥタンパク質の表面残基に対応する保存プロフィールを表した図である。保存はグレースケール値で表され、フラビウイルス属の配列の中でより高い保存を示す残基ほど濃く表される。ドメインＩＩの高度保存表面パッチを丸で囲んである。保存値を、プログラムＣＯＮＳＵＲＦを使用し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで利用可能なそれらのフラビウイルス属配列の多重配列アライメントを考慮して、算出した。保存値は、Ｐｙｍｏｌを使用してタンパク質表面にマッピングした。
【図２】デング熱ウイルス由来のＥタンパク質の表面残基に対応する保存プロフィールを表した図である。保存はグレースケール値で表され、フラビウイルス属の配列の中でより高い保存を示す残基ほど濃く表される。ドメインＩＩの高度保存表面パッチを丸で囲んである。保存値を、プログラムＣＯＮＳＵＲＦを使用し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで利用可能な４種のデング熱ウイルス血清型に対応する配列の多重配列アライメントを考慮して、算出した。保存値は、Ｐｙｍｏｌを使用してタンパク質表面にマッピングした。
【図３】キメラタンパク質ＰＭＥＣ１の三次元構造モデルの図である。Ｂは、デング熱２型ウイルスのＥ糖タンパク質のセグメントＬｅｕ２３７−Ｖａｌ２５２であり、ＣはセグメントＬｙｓ６４−Ｔｈｒ１２６である。Ｌは２つの残基からなるリンカーセグメントである。タンパク質の３Ｄモデルは、ＷＨＡＴＩＦプログラムパッケージを使用して得、図形はＰｙｍｏｌを使用して作成した。
【図４】プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１の図である。
【図５】プラスミドｐＥＴ−ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図６Ａ】プラスミドｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図６Ｂ】プラスミドｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図７】キメラタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の物理化学的特徴を示した図である。Ａ：固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製したタンパク質（レーン１）及び還元し、カルバミドメチル化したタンパク質（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動である。Ｂ：タンパク質のＲＰ−Ｃ４逆相クロマトグラフィー分析であり、矢印は主要ピークの位置を示す。Ｃ：逆相クロマトグラフィーにより収集した主要ピークに対応する質量スペクトルである。
【図８】ｍＡｂ ４Ｇ２のＦｖ断片とデング熱２型由来のＥタンパク質とにより形成される複合体の構造を予測するために実施した、分子ドッキング（ＣＬＵＳＰＲＯプログラムを使用）の１３のコンピュータシミュレーションで得られた結果の略図である。カラムは、各シミュレーションで得られた初めの３０の解（クラスタ）の構造的特性をグレースケールで示した。解は、３つの特性を表す。第１のプロパティは、結合に関与するＥタンパク質のドメイン（それぞれドメインＩＩ、Ｉ及びＩＩＩに対応する明るいグレーから濃いグレーまで）を示す。２つの色は、２つのドメインへの同時結合を意味する。Ｌ及びＴは、ドメインＩ及びＩＩＩに接触するリンカーを含むエピトープ又は融合ペプチド（ドメインＩＩの先端）をそれぞれ意味する。第２の特性は、３色で表され、白はビリオンの内面への結合を意味し、グレーはビリオンの側面への結合及び黒はビリオンの外面への結合を意味する。第３の場合は、抗体の結合はビリオンの構造の大きな構造変化に依存しないという、生物学的に関連した仮定である。第３の特性は抗体パラトープに対応し、グレーは結合が抗体のＣＤＲを含むことを意味し（関連する解）、白は結合がＣＤＲを含まないことを示す（関連しない解）。利用可能な実験データと一致する解を、矢印を使用して示した。それらの特性は明るいグレー−黒−グレーの色に対応する。図の上端に位置する初めの２列は、シミュレーションに使用したリガンド及び受容体の規定を示し、シミュレーションに使用したＥタンパク質の結晶構造に対応するＰＤＢファイルの識別子を含む。各シミュレーションに使用したタンパク質−タンパク質ドッキングプログラム（ｄｏｔ又はｚｄｏｃｋ）は各カラムの下に示す。
【図９】デング熱２型ウイルス由来の成熟ビリオンとＦＡｂ ４Ｇ２の１８０コピーとで形成される複合体のモデリングの図である。モデルは、ＦＡｂ４Ｇ２−Ｅタンパク質複合体のあらかじめ予測した構造を、低温電子顕微鏡法により得た成熟ビリオンの構造にドッキングさせることによって得た（１ＴＨＤ）。非対称ユニットに見出されたＥタンパク質の３つの単量体に結合したＦＡｂの重鎖のＣ末端間の距離を算出した。
【図１０】キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体とによって形成された複合体のコンピュータモデルの図である。図はプログラムＰｙｍｏｌを使用して得た。
【図１１】ペプチド配列（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧに相当する、配座異性体安定性の予測の図である。配座異性体のエネルギーをＮ末端とＣ末端との間の距離の関数として示す。予測は、プログラムＰＲＥＬＵＤＥｗｐ使用して実施した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬産業の分野に関し、デング熱ウイルス血清型１〜４及び他のフラビウイルス属が原因である感染の予防及び／又は治療に用いる、広範囲な抗ウイルス分子を開発するために使用できる、Ｅタンパク質表面の保存領域について記載する。本発明は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び、或いはまた他のフラビウイルス属の予防的処置及び／又は治療的処置のために有用な方法及びタンパク質について記載する。
【背景技術】
【０００２】
デング熱ウイルス（ＤＶ）複合体はフラビウイルス科に属し、遺伝的及び抗原的に関連する４種の異なるウイルス又は血清型（ＤＶ１〜ＤＶ４）からなる。ＤＶは、蚊、おもにネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）を介して人に伝染する。感染は様々な臨床症状を起こし、無症状及び未分化型熱性症状などの良性症状から、デング出血熱（ＤＨＦ）及び生命にかかわるデング熱ショック症候群（ＤＳＳ）のようなより重篤な症状にまで及ぶ。より重篤な臨床症状は、通常２つの異なる血清型による連続感染を伴い（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．「デング熱ウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ」）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．６０：４２１−６７、４２１−４６７、２００３、Ｈａｍｍｏｎ ＷＭｃ．「フィリピン及びタイにおける小児の新型出血熱（Ｎｅｗ ｈａｅｍｏｒｒａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈａｉｌａｎｄ）」Ｔｒａｎｓ Ａｓｓｏｃ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １９６０；７３：１４０−１５５）、この所見は疫学的研究により裏付けられている（Ｋｏｕｒｌ ＧＰ、Ｇｕｚｍａｎ ＭＧ、Ｂｒａｖｏ ＪＲ．「キューバのデング出血熱の解明２、積分解析（Ｗｈｙ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ Ｃｕｂａ？ ２．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｔｒａｎｓ Ｒｏｙ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １９８７；７２：８２１−８２３）。この現象は抗体依存性増強（ＡＤＥ）の理論から説明され、これらの場合この理論はウイルス−抗体複合体は標的（単球）に進入することにより増加し、これらの細胞上に存在するＦｃ受容体によって媒介されることで、ウイルスの感染性が増加すると主張している（Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ．「デング熱の発症機序：分子生物学への挑戦（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２３９：４７６−４８１）。
【０００３】
エンベロープ糖タンパク質（Ｅタンパク質）は、ウイルスのエンベロープの最も大きな構造タンパク質である。ＤＥＮ２及びＤＥＮ３ウイルスに由来するＥタンパク質の細胞外ドメイン断片の三次元構造は、Ｘ線回折技術により近年解明され（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「デング熱ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のリガンド結合ポケット（Ａ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ １００、６９８６−６９９１、２００３、Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．、及びＨａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「デング熱ウイルス３型のエンベロープ糖タンパク質の結晶構造における可変表面エピトープ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ３ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９、１２２３−１２３１、２００５）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）由来のＥタンパク質の結晶構造との高度の構造類似性が示された（Ｒｅｙ，Ｆ．Ａ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、Ｍａｎｄｌ，Ｃ．、Ｋｕｎｚ，Ｃ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「２Å分解能におけるダニ媒介性脳炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質（Ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｔ ２ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ ３７５、２９１−２９８、１９９５）。この構造類似性は、それらの配列相同性、６つのジスルフィド架橋の保存、及び他のフラビウイルス属においても機能的役割（抗原決定基の一部である、或いは突然変異の減衰又は回避に関与する、など）があらかじめ指定されている残基の配置の保存と一致する。
【０００４】
タンパク質Ｅは、以下の３つの構造ドメインによって形成される：ドメインＩ、配列のＮ末端部分に位置するが、３Ｄ構造の中央ドメインを形成する；ドメインＩＩ、二量体化ドメインとしても周知であり、フラビウイルス属全体に高度に保存された融合ペプチドを含む；及びドメインＩＩＩ、細胞受容体との相互作用に関与し、免疫グロブリン様のフォールディングを有する。
【０００５】
タンパク質Ｅは、ウイルスのライフサイクルのいくつかの段階において、中心的役割を果たす多機能糖タンパク質である。このタンパク質は、ウイルス中和抗体の主要な標的であり、細胞受容体との相互作用を媒介し、ウイルス膜と細胞膜との融合を動作するエンジンである（Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＳ．Ｌ．Ａｌｌｉｓｏｎ、２００３、（「フラビウイルス属の構造及び膜融合（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）」Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５９：６３−９７、Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｓ．Ｏｇａｔａ、Ｄ．Ｃｌｅｍｅｎｔｓ、及びＳ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、２００４、「膜融合後のデング熱ウイルスエンベロープタンパク質の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）Ｎａｔｕｒｅ ４２７：３１３−３１９、Ｒｅｙ ２００４、Ｃｈｅｎ，Ｙ．、Ｔ．Ｍａｇｕｉｒｅ、Ｒ．Ｅ．Ｈｉｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｒ．Ｆｒｏｍｍ、Ｊ．Ｄ．Ｅｓｋｏ、Ｒ．Ｊ．Ｌｉｎｈａｒｄｔ、及びＲ．Ｍ．Ｍａｒｋｓ、１９９７、「標的細胞のヘパラン硫酸と結合したエンベロープタンパク質に依存するデング熱ウイルスの感染性（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８６６−８７１、Ｎａｖａｒｒｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｅ．、Ｒ．Ａｌｔｍｅｙｅｒ、Ａ．Ａｍａｒａ、Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｆ．Ｆｉｅｓｃｈｉ、Ｊ．Ｌ．Ｖｉｒｅｌｉｚｉｅｒ、Ｆ．Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ、及びＰ．Ｄｅｓｐｒｅｓ、２００３、「樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３−グラビング非−インテグリンは、蚊の細胞に由来するデング熱ウイルスによるヒト樹状細胞の増殖感染に必須である（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ３−ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｏｓｑｕｉｔｏ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．４：１−６、Ｔａｓｓａｎｅｅｔｒｉｔｈｅｐ，Ｂ．、Ｔ．Ｈ．Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ａ．Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ、Ｃ．Ｔｒｕｍｐｆｈｅｌｌｅｒ、Ｊ．Ｆｉｎｋｅ、Ｗ．Ｓｕｎ、Ｍ．Ａ．Ｅｌｌｅｒ、Ｋ．Ｐａｔｔａｎａｐａｎｙａｓａｔ、Ｓ．Ｓａｒａｓｏｍｂａｔｈ、Ｄ．Ｌ．Ｂｉｒｘ、Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｓ．Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、及びＭ．Ａ．Ｍａｒｏｖｉｃｈ、２００３、「ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）は、ヒト樹状細胞のデング熱ウイルス感染を媒介する（ＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）ｍｅｄｉａｔｅｓ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：８２３−８２９）。
【０００６】
このタンパク質はウイルス膜に固定され、その機能は三次構造及び四次構造の両方における立体配座の変化に大きく関与する。ウイルスの形成の細胞内段階で、ＥはｐｒｅＭタンパク質とのヘテロ二量体として見出される（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｋ．Ｓｔａｄｌｅｒ、Ｃ．Ｗ．Ｍａｎｄｌ、Ｃ．Ｋｕｎｚ、及びＦ．Ｘ．Ｈｅｉｎｚ、１９９５、「可溶性及び微粒子形態の組換えダニ媒介性脳炎ウイルスのタンパク質Ｅの合成及び分泌（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｉｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｆｏｒｍ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５８１６−５８２０、Ｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．１９９６、「フラビウイルス科：ウイルス及びそれらの複製（Ｆｉａｖｉｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」、ｐ．９３１−９５９、Ｉｎ Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｎ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｊ．Ｌ．Ｍｅ／ｎｉｃｋ、Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ、Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ、及びＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ（ｅｄ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３ｒｄ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ）。この段階の間、ビリオンは未成熟であると言われ、成熟細胞外ビリオンと比較した場合に、著しく低いインビボの感染性から明らかなように、膜融合の媒介には不完全である（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ．、Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｈ．＆ Ｋｕｎｚ，Ｃ．「フラビウイルス属の融合活性：成熟及び未成熟（含ｐｒｅＭ）なダニ媒介性脳炎ビリオン間の比較（Ｆｕｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｍｍａｔｕｒｅ（ｐｒＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｇｅｎ．ＶｉｒｏＬ ７２、１３２３−１３２９、１９９１、Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．＆ Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．「マーレーバレー脳炎ウイルスｐｒＭタンパク質は、ウイルス粒子に酸耐性を与え、Ｅ糖タンパク質のＲ２ドメイン内のエピトープの発現を変化させる（Ｔｈｅ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｒ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１、９２１−９３１、１９９２）。ヘテロ二量体の役割は、ｐＨが酸性であるために膜融合過程を誘発できる細胞内コンパートメントを介してビリオンを運搬する間に、タンパク質Ｅが膜に結合することを防止することと仮定される。また、ｐｒｅＭタンパク質は、タンパク質Ｅのフォールディング及び集合に関するシャペロンとして機能することも可能である（Ｌｏｒｅｎｚ，Ｉ．Ｃ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．＆ Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、「小胞体におけるダニ媒介性脳炎ウイルスのエンベロープタンパク質ｐｒＭ及びＥのフォールディング及び二量体化（Ａ．Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒＭ ａｎｄ Ｅ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６、５４８０−５４９１、２００２）。ビリオンの細胞外への分泌の間、ｐｒｅＭは宿主のプロテアーゼ（フューリン）によって酵素的にプロセシングされ、Ｅはホモ二量体として結合するために自由にされ、したがって成熟ビリオンの形成で終了するウイルスのエンベロープの再構成を誘発する（Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｋ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｈａｌｉｃｈ，Ｊ．＆ Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．「フューリンによるダニ媒介性脳炎ウイルスのタンパク質分解活性（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｆｕｒｉｎ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、８４７５−８４８１、１９９７、Ｅｌｓｈｕｂｅｒ，Ｓ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．＆ Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ．「タンパク質ｐｒＭの切断は、ダニ媒介性脳炎ウイルスによるＢＨＫ−２１細胞の感染に必要である（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒＭ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＢＨＫ−２１ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ８４、１８３−１９１、２００３）。成熟ビリオンの構造は、９．５Åの分解能で電子低温顕微鏡法によって決定され（Ｚｈａｎｇ Ｗ、Ｃｈｉｐｍａｎ ＰＲ、Ｃｏｒｖｅｒ Ｊ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＰＲ、Ｚｈａｎｇ Ｙ、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ Ｓ、Ｂａｋｅｒ ＴＳ、Ｓｔｒａｕｓｓ ＪＨ、Ｒｏｓｓｍａｎｎ ＭＧ、Ｋｕｈｎ ＲＪ、「低温顕微鏡法によるデング熱ウイルスの膜タンパク質ドメインの視覚化（Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｙ ｃｒｙｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）」Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．２００３、１０：９０７−１２、Ｋｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．ら「デング熱ウイルスの構造：フラビウイルス属の構成、成熟及び融合に関する推測（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ）」Ｃｅｌｌ １０８、７１７−７２５、２００２）、未成熟ビリオンの構造は１２．５Åの分解能で電子低温顕微鏡法によって決定された（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら「未成熟フラビウイルス粒子の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」ＥＭＢＯ Ｊ．２２、２６０４−２６１３、２００３）。これらのビリオンは、Ｔ＝３の正２０面体対称を有する。成熟ビリオンにおいて、タンパク質Ｅの二量体はウイルス膜に並行な面上にあり、その表面をほぼ完全に覆っている。成熟ビリオンは完全に感染性であり、ウイルスが細胞受容体と相互作用し、抗体が宿主によって誘発されるのはこの立体配座においてである。ひとたびウイルスが細胞受容体と結び付くと、ウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスを介して内在化し、最終的にはエンドソームに達し、膜融合過程を開始するタンパク質Ｅの立体配座の変化が、エンドソームにおいて、弱酸性ｐＨにより誘発される（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら「酸性ｐＨにより誘発されるダニ媒介脳炎ウイルスエンベロープタンパク質のオリゴマー再構成（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｉｃｋ ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ ａｃｉｄｉｃ ｐＨ）」Ｊ．Ｖｉｒａｌ．６９、６９５−７００、１９９５）。この過程において、タンパク質が二量体から三量体へ再構成される。タンパク質Ｅの融合後の構造が最近決定された（Ｍｏｄｉｓ，Ｙ．、Ｏｇａｔａ，Ｓ．、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．「膜融合後のデング熱ウイルスのエンベロープタンパク質の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｆｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）」Ｎａｔｕｒｅ ４２７、３１３−３１９（２００４））。Ｂｒｅｓｓａｎｅｌｌｉ，Ｓ．ら、「フラビウイルス属のエンベロープ糖タンパク質の低ｐＨ誘導性膜融合立体配座におけるその構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｌｏｗ−ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」ＥＭＢＯ Ｊ．２３、７２８−７３８（２００４）では、三量体の形成が三次構造における重要な再構成に関与し、融合ペプチドを含むドメインＩＩの先端が膜と相互作用するにもかかわらず、単量体が平行に結合していることが示されている。結晶構造及び解明されたビリオン構造を同時に解析することにより、ウイルスのライフサイクルを通してタンパク質Ｅが再構成され、その三次及び四次構造並びにビリオン自体が著しく変化することが明らかになる。
【０００７】
タンパク質Ｅは、ウイルス感染の間に産生される中和抗体の主要な標的である。単独の血清型による感染は、同種血清型のウイルスを中和する長寿命抗体を誘発する。感染後の数カ月間で、これらの抗体は異種の血清型もまた中和できるが、この活性は感染後約９カ月までに徐々に減衰する（Ｈａｌｓｔｅａｄ Ｓ．Ｂ．「デング熱ウイルスの中和及び抗体依存性増強（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ａｄｖ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２００３；６０：４２１−６７．Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．１９５２、「第２次世界大戦時のデング熱に関する調査（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ Ｗａｒ ＩＩ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１：３０−５０）。
【０００８】
異なる血清型のウイルスと相互作用する場合、１種の血清型に対して産生された抗体は、一般に親和性の減少を示し、この現象は、ＤＶ血清型のタンパク質Ｅのアミノ酸配列における変化によって分子レベルで説明される。相互作用の親和性が十分に低いと中和を損なわせる抗体が生じる可能性があるが、それでもＦｃ受容体を担持する細胞内にウイルスを容易に内在化するために十分な量がウイルス表面に結合できる（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、及びＥ．Ｊ．Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ、１９７７、「デング熱ウイルス及び単核食細胞。１．非中和抗体による感染の増強（Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ．１．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｎｏｎ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：２０１−２１７、Ｌｉｔｔａｕａ，Ｒ、Ｉ．Ｋｕｒａｎｅ、及びＦ．Ａ．Ｅｎｎｉｓ、１９９０、「ヒトＩｇＧ Ｆｃ受容体ＩＩは、デング熱ウイルス感染の抗体依存性増強を媒介する（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３１８３−３１８６）。
【０００９】
さらに二次感染の間、ナイーブＢ細胞と比較して既存のメモリーＢ細胞及び血漿細胞の活性化がより速いため、低親和性抗体集団の力価は、進入するＤＶ血清型によって産生された新しい高親和性抗体の力価を上回る。二次感染からの回復期の抗体プロフィールは、一次ＤＶ感染の血清型によって大きく影響され、この事実はまさに「抗原原罪」として公知の現象の発現である（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｒｏｊａｎａｓｕｐｈｏｔ，Ｓ．、及びＳａｎｇｋａｗｉｂｈａ、Ｎ．１９８３、「デング熱における抗原原罪（Ｏｒｉｇｉｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｎ ｉｎ ｄｅｎｇｕｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．３２：１５４−１５６）。
【００１０】
一方、極めて強力な中和モノクロナール抗体（ｍＡｂ）は、高希釈で免疫増幅を誘発できることが公知である（Ｂｒａｎｄｔ，Ｗ．Ｅ．、Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｗｎ、Ｍ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ、及びＰ．Ｋ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９８２、「フラビウイルス属の交差反応性決定基に対する抗体による、Ｕ−９３７ヒト単球細胞系におけるデング熱２型ウイルスの感染増強（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕ−９３７ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）」Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３６：１０３６−１０４１、Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．、Ｃ．Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈａｎ、Ｍ．Ｋ．Ｇｅｎｔｒｙ、及びＬ．Ｋ．Ｌａｒｓｅｎ、１９８４、「モノクロナール抗体によるデング熱２型株の感染増強の多様性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１３２：１５２９−１５３２、Ｍｏｒｅｎｓ，Ｄ．Ｍ．、Ｓ．Ｂ．Ｈａｌｓｔｅａｄ、及びＮ．Ｊ．Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ、１９８７、「デング熱ウイルス２型感染の抗体依存性増強のプロフィール（Ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３：２３１−２３７）。
【００１１】
フラビウイルスタンパク質Ｅの抗原構造は、マウスｍＡｂパネル及び競合アッセイ、ジスルフィド架橋の還元及びＳＤＳ処理などの手法に対する相互作用の感受性、タンパク質分解断片及び合成ペプチドに対する結合に関するアッセイ、ウイルスの中和又は赤血球凝集の阻害に関するアッセイ、エスケープ変異体の発生、血清検査などを含む、一連の生化学的分析及び生物学的分析を使用して、熱心に研究されてきた。（Ｈｅｉｎｚ．Ｔ．、Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．及びＫｅｌｌｙ，Ｒ．Ｇ．「デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のモノクロナール抗体マッピング（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｎｇｕｅ ２ Ｖｉｒｕｓ）」Ｊａｍａｉｃａ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２４６、３１７−３２８、１９９８、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＲｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．（１９９０）、「ウイルスの免疫化学ＩＩ。血清診断及びワクチンの基礎」中のフラビウイルス属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ“ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ．ＩＩ．Ｔｈｅ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”）」（Ｍ．Ｈ．Ｖ．Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ及びＡ．Ｒ．Ｎｅｕｒａｔｈ、Ｅｄｓ）、ｐｐ．２８９−３０５、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．Ｍａｎｄｌ，Ｃ．Ｗ、Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．Ｇ．、Ｈｏｌｚｍａｎｎ，Ｈ．、Ｈｅｉｎｚ，Ｆ．Ｘ．、及びＫｕｎｚ，Ｃ．（１９８９）、「モデルとしてダニ媒介性脳炎ウイルスを使用した、フラビウイルス属エンベロープタンパク質Ｅの分子レベルの抗原構造（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ａｔ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ，ｕｓｉｎｇ ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３、５６４−５７１．Ｉ．Ｌ．Ｓｅｒａｆｉｎ及びＪ．Ｇ．Ａａｓｋｏｖ．「モノクロナール抗体を使用した、デング熱２型及び３型ウイルスのエンベロープ（Ｅ）タンパク質のエピトープの特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ２ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ３ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（２００１）１４６：２４６９−２４７９）。それぞれ３種の構造ドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩに相当する、３種の抗原ドメインＡ、Ｂ及びＣが規定されている。特定のエピトープを認識する抗体は、普通非常によく似た機能的特徴を示す。ドメインＡ（構造ドメインＩＩに相当する）由来のエピトープの認識は、ジスルフィド架橋の還元により破壊され、これらのエピトープを認識するｍＡｂが赤血球凝集、ウイルス感染の中和を阻害し、ウイルス媒介膜融合を阻害する。特に、デング熱ウイルスに関して規定されたエピトープＡ１は、グループ型特異性を有するｍＡｂによって認識され、即ち、これらは異なるフラビウイルス属間で高度に交差反応性である。ｍＡｂｓ ４Ｇ２（抗−ＤＶ２）及び６Ｂ６Ｃ（抗−ＪＥＶ）は、このエピトープを認識する。このエピトープへの結合は、未成熟ビリオン中で桁違いに減少し、成熟ビリオンの酸性ｐＨ処理によっても増強しない（Ｇｕｉｒａｋｈｏｏ，Ｆ．、Ｒ．Ａ．Ｂｏｌｉｎ、及びＪ．Ｔ．Ｒｏｅｈｒｉｇ、１９９２、「マーレーバレー脳炎ウイルスｐｒＭタンパク質は、ウイルス粒子に酸耐性を授け、Ｅ糖タンパク質のＲ２ドメイン内のエピトープの発現を変化させる（Ｔｈｅ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｒＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｒ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９１：９２１−９３１）。
【００１２】
ワクチン開発
ＤＶに対する特定の処置法はなく、最も重篤な兆候が現在存在する。蚊の駆除はコストがかかり、あまり有効ではない。ＤＨＦにより起こる血液量減少を修正するために、体液の適切な管理に基づいて臨床的な処置を行うことにより死亡率が減少しているが、これらの処置は多くの発展途上国において未だに問題がある。ＤＨＦによる死者が年間推定３００００人見積もられ、この疾患の罹患率及び関連コストは、公衆衛生支出の最優先目標を占める他の疾患の罹患率及び関連コストに匹敵する（Ｓｈｅｐａｒｄ ＤＳ、Ｓｕａｙａ ＪＡ、Ｈａｌｓｔｅａｄ ＳＢ、Ｎａｔｈａｎ ＭＢ、Ｇｕｂｌｅｒ ＤＪ、Ｍａｈｏｎｅｙ ＲＴ、Ｗａｎｇ ＤＮ、Ｍｅｌｔｚｅｒ ＭＩ、「小児用デング熱ワクチンの費用対効果（Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、２００４、２２（９−９０）：１２７５−８０）。
【００１３】
デング熱に対するいくつかのワクチン候補が、現在開発の異なる段階にある（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｄ．２００１、「フラビウイルスワクチンの現状（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５１：２６２−２７１、Ｃｈａｎｇ ＧＪ、Ｋｕｎｏ Ｇ、Ｐｕｒｄｙ ＤＥ、Ｄａｖｉｓ ＢＳ．２００４「フラビウイルスワクチン開発の最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２００４、３（２）：１９９−２２０）。今までのところ試された戦略は、弱毒化生ワクチン、キメラウイルス、プラスミドＤＮＡ及びサブユニットワクチンを含む。４種の血清型由来の弱毒化株が、イヌ及びサルの腎臓初代培養細胞においてウイルスを増殖させる標準的な手順を使用して開発された（Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ，Ｎ．、及びＳｕｔｅｅ、Ｙ．２０００、「生弱毒化四価デング熱ワクチン（Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ．１８：４４−４７、Ｅｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．ら、２００３、「イヌ腎臓初代培養細胞の継代によるデング熱ウイルス株の改良：候補ワクチンの調製及びサルの免疫化（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｐａｓｓａｇｅ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｄｏｇ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ：ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｋｅｙｓ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６９：１２−１６、Ｉｎｎｉｓ，Ｂ．Ｌ．、及びＥｃｋｅｌｓ，Ｋ．Ｈ．２００３、「米国陸軍衛星研究資材コマンドによる生弱毒化四価デング熱ウイルスワクチンの開発における前進（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ，ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉｅｌ Ｃｏｍｍａｎｄ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６９：１−４）。この戦略の進歩は、動物モデル及びヒトのためのインビトロ弱毒化マーカーが足りないために制限されている。この同じ研究手段において、ｃＤＮＡクローンを４種の血清型から得、その後処理を行い、理論的には有毒表現型への復帰変異の可能性を著しく減少する弱毒変異及び変化を導入する研究がある（Ｂｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｊｒ．、Ｍａｎｉｐｏｎ，Ｇ．Ｇ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．、及びＷｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｓ．Ｓ．２００３、「デング熱ウイルス４型の非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５をコードする遺伝子の温度感受性突然変異は、マウスの脳において複製を制限する（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ＮＳ１，ＮＳ２Ａ，ＮＳ３，ａｎｄ ＮＳ５ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ４ ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）」Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４８：９９９−１００６、Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ら、２００１、「３’非翻訳領域において３０ヌクレオチドを削除した、生デング熱ウイルス４型ワクチン候補の、ヒトにおける弱毒化及び免疫原性（Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｏｆ ａ ｌｉｖｅ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−４ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｗｉｔｈ ａ ３０ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｉｔｓ ３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：４０５−４１３、Ｐａｔｅｎｔ：Ｚｅｎｇ Ｌ、Ｍａｒｋｏｆｆ Ｌ、ＷＯ００１４２４５、１９９９）。
【００１４】
別の戦略は、１種のデング熱血清型由来のｐｒｅＭ及びＥ構造タンパク質を、コア及び他の非構造タンパク質を提供する、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ）（ＹＦＶ）、デング熱ウイルス又は他のウイルスの弱毒化バックグランドに導入する、４種の血清型に関するキメラフラビウイルス変異体を作製している（Ｇｕｉｒｋｈｏｏ Ｆ、Ａｒｒｏｙｏ Ｊ、Ｐｕｇａｃｈｅｖ ＫＶら「キメラ黄熱−デング熱ウイルス四価ワクチンのヒト以外の霊長類における構築、安全性及び免疫原性（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ−ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００１；７５：７２９０−３０４、Ｈｕａｎｇ ＣＹ、Ｂｕｔｒａｐｅｔ Ｓ、Ｐｉｅｒｒｏ ＤＪら「デング熱１型ウイルスワクチンの有力候補としてのデング熱２型（ワクチン株ＰＤＫ−５３）／デング熱１型キメラウイルス（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２（ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ ＰＤＫ−５３）／ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２０００；７４：３０２０−２８、Ｍａｒｋｏｆｆ Ｌ、Ｐａｎｇ Ｘ、Ｈｏｕｎｇ ＨＳら「サルにおいて弱毒化された高度免疫原性のデング熱１型宿主範囲限定突然変異ウイルスの誘導及び特徴付け（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｎｇｕｅ １ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｉｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙｓ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２；７６：３３１８−２８、Ｐａｔｅｎｔ：Ｓｔｏｃｋｍａｉｒ及びｓｃｈｗａｎ Ｈａｕｅｓｓｅｒ、ＷＯ９８１３５００、１９９８．Ｐａｔｅｎｔ：Ｃｌａｒｋ及びＥｌｂｉｎｇ：ＷＯ９８３７９１１、１９９８、Ｐａｔｅｎｔ：Ｌａｉ ＣＪ、ＵＳ６１８４０２４、１９９４）。
【００１５】
一般的に生弱毒化ワクチンの潜在的利益についての多様な疑問が主張され、有毒な表現型への復帰変異、ウイルス性干渉及びゲノム間の組換えなどの現象の発生の可能性が述べられた（Ｓｅｌｉｇｍａｎ ＳＪ、Ｇｏｕｌｄ ＥＡ ２００４「生フラビウイルスワクチン：警告の理由（Ｌｉｖｅ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅａｓｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｕｔｉｏｎ）」Ｌａｎｃｅｔ．３６３（９４２６）：２０７３−５）。組換えタンパク質を発現するプラスミドＤＮＡに基づくワクチン、並びに組換え抗原に基づくワクチンは、まだ開発の初期段階にある。（Ｃｈａｎｇ，Ｇ．Ｊ．、Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｓ．、Ｈｕｎｔ，Ａ．Ｒ．、Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ａ．、及びＫｕｎｏ，Ｇ．２００１、「フラビウイルスＤＮＡワクチン：現状及び可能性（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｏｌ．９５１：２７２−２８５、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｍ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．Ｓ．、Ｋｏｃｈｅｌ，Ｔ．、Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．、及びＨａｙｅｓ，Ｃ．Ｇ．２００１、「デング熱２型ＤＮＡ及びデング熱２型組換えサブユニットワクチンの組合せに対する抗体応答の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｄｅｎｇｕｅ−２ ＤＮＡ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ−２ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．６５：４２０−４２６、Ｐａｔｅｎｔ：Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ；ＷＯ９９０６０６８ １９９８、Ｆｅｉｇｈｎｙ，Ｒ．、Ｂｏｒｒｏｕｓ，Ｊ．及びＰｕｔｎａｋ Ｒ．「組換えバキュロウイルスを使用して作製されたデング熱２型ウイルスのエンベロープタンパク質は、ウイルスチャレンジからマウスを保護する（Ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ−２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｄｅ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１９９４、５０（３）、３２２−３２８；Ｄｅｕｂｅｌ，Ｖ．、Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，Ｉ．、Ｍｅｇｒｅｔ，Ｆ．ら「親和性精製デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質が、マウスにおいて中和抗体及び防御免疫を誘導する（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｄｅｎｇｕｅ−２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ）」Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５、１９４６−１９５４）。
【００１６】
上記の戦略に基づいたいくつかのワクチン候補は、動物モデルにおいて防御を示し、いくつかは臨床試験の初期段階において、安全且つ免疫原性であることが見出された。
【００１７】
しかし、ワクチン開発の主要なハードルは、４種の血清型に対して同等に有効な防御を達成する必要性である。１種のデング熱血清型への感染により、ヒトでは同じ血清型に対して長寿免疫が誘導されることが認められる。しかし、わずか１種の血清型に対する免疫化は、他の血清型（異型免疫）に対してわずか２から９カ月までの短期間の防御を達成するにすぎない（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．１９５２、「第２次世界大戦中のデング熱に関する調査（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｄｅｎｇｕｅ ｄｕｒｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ Ｗａｒ ＩＩ）」Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．１：３０−５０）。その上、特定の血清型に対する最適以下のレベルの防御により、ワクチン接種を受けた人が感作され、その血清型による後期感染において病理学的性質の異種免疫応答に付随する重篤な症状を発症する危険が増加する恐れがある（Ｒｏｔｈｍａｎ ＡＬ ２００４「デング熱：防御対病理免疫の規定（Ｄｅｎｇｕｅ：ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：９４６−９５１）。しかし、利用可能な生弱毒化ワクチン又は組換えサブユニットワクチンの有効な四価製剤の開発は困難な挑戦となり、複雑な反復投与免疫化スケジュールの使用を必要とする。
【００１８】
抗体：受動免疫化
デング熱感染に対する防御のためにワクチンを使用するための１つの選択肢は、受動免疫のために中和抗体を使用することである。デング熱４型を中和する５Ｈ２（Ｍｅｎ，Ｒ．、Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ、Ａ．Ｐ．Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ、Ｃ．Ｗｅｒｎｌｙ、Ｄ．Ｊ．Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、Ｓ．Ｕ．Ｅｍｅｒｓｏｎ、Ｒ．Ｈ．Ｐｕｒｃｅｌｌ、及びＣ．Ｊ．Ｌａｉ．２００４、「デング熱４型ウイルスの中和に非常に有効な、完全長ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体のレパートリークローニング及び作製によるチンパンジーＦａｂ断片の特定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ４ ｖｉｒｕｓ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：４６６５−４６７４）、及び４種の血清型に対して交差中和する１Ａ５（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ，Ａ．Ｐ．、Ｒ．Ｍｅｎ、Ｃ．Ｗｅｒｎｌｙ、Ｒ．Ｈ．Ｐｕｒｃｅｌｌ、及びＣ．Ｊ．Ｌａｉ、２００４、「デング熱１型及び２型ウイルスを効果的に交差中和する、チンパンジーＦａｂ断片及び派生ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体（Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：１２９１０−１２９１８）を含むヒト化チンパンジー抗体を、この目的のために得ている。
【００１９】
ウイルス血症のレベルが疾患の重篤度を予測する上で重要であることを考慮に入れると、受動免疫の使用は、予防的手段及び治療的手段の両方にとって有用であり得る（Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｋ．Ｄ．Ｙ．Ｃｈａｏ、Ｃ．Ｌ．Ｋａｏ、Ｈ．Ｃ．Ｗｕ、Ｙ．Ｃ．Ｌｉｕ、Ｃ．Ｍ．Ｌｉ、Ｓ．Ｃ．Ｌｉｎ、Ｊ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ、及びＣ．Ｃ．Ｋｉｎｇ、２００３、「デング出血熱患者の解熱時における高レベルの血漿デング熱ウイルス量：発症に関する推測（Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｆｅｒｖｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｅｎｇｕｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ．：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０５：３３０−３３８、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｗ．、Ｇｒｅｅｎ，Ｓ．、Ｋａｌａｙａｎａｒｏｏｊ，Ｓ．、Ｉｎｎｉｓ，Ｂ．Ｌ．、Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ，Ｓ．、Ｓｕｎｔａｙａｋｏｒｎ，Ｓ．、Ｅｎｄｙ，Ｔ．Ｐ．、Ｒａｅｎｇｓａｋｕｌｒａｃｈ，Ｂ．、Ｒｏｔｈｍａｎ，Ａｌ．、Ｅｎｎｉｓ，Ｆ．Ａ．及びＮｉｓａｌａｋ，Ａ．「デング熱ウイルス血症力価、抗体応答パターン及びウイルス血清型は疾患の重篤度と相関する（Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｅｍｉａ Ｔｉｔｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｐａｔｔｅｒｎ，ａｎｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０００；１８１：２−９）。しかし、抗体の投与は潜在的な落とし穴と無縁ではない。抗体依存性増強（ＡＤＥ）理論によれば、中和抗体の濃度が中和レベル以下に減少した場合、ウイルス−抗体免疫複合体はＦｃ受容体を担持する細胞へのウイルスの進入を増幅でき、したがってウイルスの複製レベルが増加する。それ故、疾患の兆候がより重篤になるという危険に患者をさらすことを避けるために、抗体のレベルを高くする必要がある。
【００２０】
考えられる１つの解決策は、受容体との相互作用が有意に減少するような方法でＦｃが修飾された抗体分子の獲得である。この意味で特に興味を引く戦略は、ＦＣγＲ−Ｉ、ＦＣγＲ−ＩＩ及びＦＣγＲ−ＩＩＩとの相互作用に直接影響するが、ＦＣＲｎとの相互作用には影響しないＦｃにおいて残基を変異させることである。後者は抗体の再生に関与しているため、インビボにおいて抗体の半減期の決定に極めて重要だからである。
【００２１】
別の代替手段は、ＡＤＥを媒介できない中和抗体の特定である。これらの特徴を有する、少なくとも１種の抗体が記載されており（Ｐａｔｅｎｔ：Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔ．ＷＯ９９１５６９２、１９９８）、この抗体はインビボモデルにおいてＡＥＤを媒介せずにＤＶ２を中和する。しかし、他の血清型に対する類似の抗体の記載はなく、インビボモデルにおけるこの型の抗体の特徴についての利用可能なデータもない。さらなる障害は、利用可能な動物モデルが、ヒトにおける感染の経過及び特徴を忠実に再現しないという事実である。
【００２２】
抗体の使用に関する別の戦略は、抗デング熱と抗赤血球補体受容体１抗体との二重特異性複合体の獲得である。これらのヘテロポリマーはウイルスを赤血球に結合させ、したがって血液から組織へのウイルス排除率が非常に増加せしめる（Ｈａｈｎ ＣＳ、Ｆｒｅｎｃｈ ＯＧ、Ｆｏｌｅｙ Ｐ、Ｍａｒｔｉｎ ＥＮ、Ｔａｙｌｏｒ ＲＰ．２００１、「受動ウイルス血症のサルのモデルにおいて、二重特異性モノクロナール抗体は、デング熱ウイルスが赤血球へ結合することを媒介する（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｎｋｅｙ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ｖｉｒｅｍｉａ）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ １６６：１０５７−６５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属に対する予防的処置及び／又は治療的処置のための有効な分子を、フラビウイルス属において高度に保存されたＥタンパク質（「Ｅ」はエンベロープのＥ）表面の領域又はエピトープを前記分子の標的として使用することによって得る方法を示す。ワクチン設計のために使用すると、本発明は、Ｅタンパク質のこの領域に対する抗体応答を制限し、したがってこのタンパク質のさらなる可変領域に対する応答を除去することによって、４種のデング熱ウイルス血清型すべてに関して同等の中和効果及び防御効果の発生を可能にし、他の血清型による後期感染時の免疫増幅を導くことのできる、血清型又はサブ複合体に特異的な中和抗体を誘発できる。Ｅタンパク質の前記領域はトポグラフィー的エピトープであるため、本発明は、前述のエピトープを含むＥタンパク質のサブドメインの正確なフォールディング及び分泌を確実にする、変異体及び安定化連結の設計を含む。予防的又は治療的目的の受動免疫化のための薬剤開発に使用する場合、本発明はさらに成熟フラビウイルスビリオンの表面上にあるこのエピトープの２つ、３つ又は多数の対称的なコピーと結合できる組換え分子を規定し、前記組換え分子は、ウイルス複製回路の早期段階においてビリオンによりなされる構造変化に干渉するより高い親和力及びよりよい潜在能力のため、天然の抗体及び／又はこれらのＦＡｂ断片より優れた中和特性及び防御特性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
第１の態様において、本発明は上記のＥタンパク質エピトープの抗原的特徴及び構造的特徴を再現する組換えタンパク質の設計を示す。前記組換えタンパク質の１つはデング熱ウイルスの４種の血清型すべてを中和でき、さらに他のフラビウイルス属も認識するマウスのモノクロナール抗体によって認識される。このキメラ組換えタンパク質による免疫化は４種のデング熱ウイルス血清型並びに他のフラビウイルス属を中和し、防御する抗体応答を誘導する。本発明は、フラビウイルス属に共通の中和エピトープを含むＥタンパク質ドメインが、正確にフォールディングするような方法でキメラ組換えタンパク質を設計する方法を記載する。このエピトープは、天然にはトポグラフィー的であり、したがってその抗原性は分子の３Ｄ構造に依存する。本発明により得られた分子は、デング熱ウイルス及び他のフラビウイルス属に対するワクチン調製品の獲得、並びにこれらのタンパク質を含む診断体系の設計に関する医薬産業に使用できる。
【００２５】
本発明の第２の態様は、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属に対する有力な中和プロフィールを有する他の組換えタンパク質の設計を示す。これらのタンパク質のアミノ酸配列は、結合ドメイン、スペーサーセグメント及び多量体化ドメインを含む。結合ドメインは、すべてのフラビウイルス属に全体に、高度に保存されたＥタンパク質のエピトープに結合可能であり、結合ドメインは上記のこの発明の第１目的において述べたタンパク質中に含まれる。この態様の改変種において、結合ドメインは保存エピトープを認識する一本鎖抗体の断片である。スペーサーセグメントは、３〜２０のアミノ酸長の配列で、好ましくは親水性、極性で短い側鎖を有する残基中に多く存在し、したがってスペーサーに高度の可動性を与える。これらのスペーサーは、結合ドメイン及び多量体化ドメインのフォールディングに干渉してはならず、さらに血清プロテアーゼによる切断に対して耐性でなければならない。
【００２６】
本発明において述べる多量体化ドメインは、天然状態で好ましくは二量体又は三量体として会合したタンパク質又はタンパク質ドメインであるが、より高度な会合の四次構造も切り捨ててはいない。これらのドメインは、自己抗体誘導の可能性を避けるためにヒトの血清又は細胞外タンパク質から選択される。本発明において意図される多量体化ドメインの本質的な特性は、デング熱ウイルス感染の免疫増幅の抗体媒介過程に関与するＦｃ受容体との間にどのような相互作用もないことである。多量体化ドメインの四次構造は、共有結合性又は非共有結合性相互作用に依存してよい。
【００２７】
改変種の一つにおいて、多量体化ドメインは、二量体構造を安定化させる鎖内のジスルフィド架橋の形成を媒介するので、ヒンジ領域を含むヒト抗体由来のＦｃ断片に基づく。これらのＦｃ断片は、化学的又は酵素的脱クリコシル化のどちらかを経て、或いはバクテリア大腸菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの、タンパク質をグリコシル化しない宿主における産生を経て炭水化物鎖を欠いている。非グリコシル化Ｆｃドメインは、高等真核生物由来の細胞においてもまた得られ、それらの配列は修正され、ＮＸＴ／Ｓモチーフが除去されて提供される。非グリコシル化Ｆｃドメインは、もはやインビトロで免疫増幅を媒介するＦｃγＲ受容体Ｉ〜ＩＩＩに結合できない。しかし、それらはＦｃＲｎ受容体とは十分相互に作用する力を維持しているところ、これはインビボで長い半減期を得るための望ましい特性である。
【００２８】
別の改変種においては、多量体化ドメインは、らせん形の、ヒト母系の三量体形成断片である。
【００２９】
柔軟なスペーサーを介した結合ドメイン及び多量体化ドメインの連結により、フラビウイルス属の成熟ビリオンの２０面体構造上で、キメラタンパク質が複数の隣接したＥタンパク質単量体と同時に結合することが可能になる。このように、二量体タンパク質をもたらす［結合ドメイン］−［スペーサー］−［多量体化ドメイン］の配列改変種は、２つのＥタンパク質単量体に同時に結合可能になる。同様に、改変種が三量体タンパク質をもたらす場合、３つの単量体が同時に結合することになる。
【００３０】
本発明の第２の態様において記載したキメラタンパク質の中和力価は、ＦＡｂ断片及びさらに完全抗体により達せられる力価より高い。これらの組換えタンパク質は、より高い親和力でビリオンと結合し、いくつかのＥ単量体の同時結合は、膜融合の過程において四次構造に必要な変化に干渉する。本発明の実施により得られる分子は、デング熱ウイルス及び他のフラビウイルスに対する予防的及び／又は治療的薬剤の獲得、並びに前記分子を含む診断体系の開発のために医薬産業に使用できる。
【００３１】
ワクチンを目的としたキメラタンパク質の設計
有効なデング熱ワクチンは、４種のデング熱血清型に対する抗体応答の中和を誘導するものであるべきであるという見解は、現在認められている。しかし、ウイルスのエンベロープのＥ糖タンパク質は血清型の間で可変である。この配列可変性が、タンパク質に対する広範囲な抗体応答は同種の血清型に対しての中和であり、異種の血清型に対しての中和ではないことの原因であり、このように感染性免疫増強抗体が上昇する可能性が増加する。
【００３２】
本発明は、デング熱ウイルスに対するサブユニットワクチンの設計を目的とした方法を示し、このサブユニットワクチンは、４種の血清型に対して均一に中和的及び防御的に免疫応答を誘導する。第１に設計はタンパク質の表面に露出したパッチ又はエピトープの特定に基づき、血清型の間でこれらはすべて又は非常に高度に保存されており、成熟ビリオンの表面上にもまた露出されている。タンパク質について残基の保存分析を実施して、露出し保存された残基のクラスタを特定できた。（図１及び２、表１）。クラスタの全表面積は、４１７Å２であり、２５残基に属する。この面積は、タンパク質−抗体相互作用に関与する結合表面に対応する標準値に匹敵する。エピトープはトポグラフィー的であり、タンパク質の一時構造では遠く離れて位置するが、３次元構造においては近くに位置する残基を含む。
【００３３】
第２に本発明は、保存エピトープを含み、免疫系に提示される保存残基／可変残基の割合を最大にし、エピトープの三次元的構造の安定化を達成する組換えキメラタンパク質の、全Ｅタンパク質において出現するような同様の方法での設計を示す。２種の考えうるトポロジーを記載する：
Ｂ−Ｌ−Ｃ及びＣ−Ｌ−Ｂ、
ここで、Ｂはデング熱２型由来のＥ糖タンパク質のＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２のセグメントであり、ＣはＬｙｓ６４〜Ｔｈｒ１２０のセグメント、或いは他の血清型又は他のフラビウイルス属由来の相同セグメント、或いは上記セグメントのいずれかに関して８０％を超える配列同一性を示す類似タンパク質配列である。フラビウイルス属の配列に相当する相同セグメントＢ及びＣは、配列アライメントのコンピュータプログラムを使用して規定し、このプログラムはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ ｙ ＣＬＵＳＴＡＬのように配列ペア又は多重配列を並べる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．１９９０、「ベーシックローカルアライメントサーチツール（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０．Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲ、Ｌｉｐｍａｎ ＤＪ．「生物学的配列比較のための改善されたツール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８８；８５：２４４４−８、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．、Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．、Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．１９９４；「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列の重み、位置特異的ギャップペナルティ及び重み行列法選択を介した進歩的多重配列アライメントの感度の改善（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）。これらの配列アライメントは、フラビウイルスの配列において相同残基（等価残基又は相当残基とも称する）の規定もまた可能にし、この相同残基は、デング熱２型由来の配列の特定の事例に関する、実施例１の表１に特定された高度に保存された残基に相当する。
【００３４】
記載したトポロジーのいずれにおいても、Ｌは通常１個から１０個の残基までの大きさのリンカー配列であり、その役割はキメラタンパク質のフォールディングを安定化させ、エピトープの３Ｄ構造が全Ｅタンパク質に表された構造に類似であり得るような方法で、セグメントＢ及びＣを接続することである。キメラタンパク質のトポロジー改変種の両方に保存エピトープは完全に含まれるか、可変性がより大きい残りのＥタンパク質は除かれる。キメラタンパク質は、エンベロープ糖タンパク質の構造ドメインＩＩのサブドメインに相当する。このサブドメインは、ドメインＩＩの先端に位置し、２つの逆平行のβシートによって構造的に合致し、互いに包み合っている。大きいβシートは３本のβ鎖からなり（セグメントＣ）、小さいβシートはβヘアピンループ（セグメントＢ）である
【００３５】
サブドメインは、２つのジスルフィド架橋を含み、４か所で残りのＥ糖タンパク質と連結しているところ、これは保存エピトープのトポグラフィー的性質と一致する。しかし、サブドメインと残りのタンパク質の接触表面は１８４Å２であり、これは溶媒が接触可能であるサブドメイン全表面のわずか１２％にすぎない。この事実は、２つのトポロジーの変異体に関する上記の安定化連結又はリンカーを設計することによって、サブドメインの正確なフォールディングを達成することの実現可能性に一致する。本発明は、ビリオン表面に接触できず、したがって抗体との相互作用に関与しない残基を変異させることによって、キメラタンパク質の熱力学的安定性を増加させる可能性を含む。
【００３６】
本発明の本質的に優れている点は、４種のデング熱血清型に対して有効な、ユニークなタンパク質鎖に基づいたサブユニットワクチンの開発が可能であるという考えである。組換えタンパク質の候補に基づいた現在のアプローチは、４種（各血清型に関して１種ずつ）の組換えエンベロープタンパク質の使用からなり、これらをワクチン製剤中に混合する（Ｐａｔｅｎｔｅ：Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ；ＷＯ９９０６０６８、１９９８）。Ｅタンパク質断片もまた可能性のある候補として評価されているが、現在までの取り組みは、担体タンパク質との融合タンパク質として発現させたドメインＩＩＩに集中している（Ｐａｔｅｎｔｅ：Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｇｅｎｉｅｒｉａ Ｇｅｎｅｔｉｃａ ｙ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ；ＷＯ／２００３／００８５７１、Ｓｉｍｍｏｎｓ Ｍ、Ｍｕｒｐｈｙ ＧＳ、Ｈａｙｅｓ ＣＧ．Ｓｈｏｒｔ ｒｅｐｏｒｔ：「四価デング熱組換えタンパク質サブユニットワクチンにより免疫化したマウスの抗体反応（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ ｄｅｎｇｕｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．２００１；６５：１５９−６１、Ｈｅｒｍｉｄａ Ｌ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｒ、Ｌａｚｏ Ｌ、Ｓｉｌｖａ Ｒ、Ｚｕｌｕｅｔａ Ａ，Ｃｈｉｎｅａ Ｇ、Ｌｏｐｅｚ Ｃ、Ｇｕｚｍａｎ ＭＧ、Ｇｕｉｌｌｅｎ Ｇ．「Ｐ６４ｋ髄膜炎菌性タンパク質担体の構造に挿入されたデング熱２型エンベロープ断片は、マウスにおいてウイルスに対する機能的免疫応答が可能である（Ａ ｄｅｎｇｕｅ−２ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐ６４ｋ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｅｎａｂｌｅｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｉｃｅ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４ Ｊａｎ；１１５（１）：４１−９）。ドメインＩＩＩは、抗体応答の中和を誘導できるが、この応答は血清型特異的であり、したがってワクチン候補は４種の血清型由来の配列を含まなければならない。
【００３７】
本発明の実施例１のキメラタンパク質ＰＭＥＣ１は、トポロジーＢ−Ｌ−Ｃに相当し、デング熱２型由来の断片Ｂ及びＣの配列、並びに２つの残基Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカー配列を伴う。キメラタンパク質ＰＭＥＣ１をコード化する遺伝子もまた記載する。プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６は、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢと、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコード化する配列と融合するタンパク質ＰＭＥＣ１をコード化する（配列番号１２）。
【００３８】
バクテリア大腸菌のペリプラズムに可溶なキメラタンパク質ＰＭＥＣ１を得た。拡張が容易な精製方法を、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に基づいて開発し、これによりさらなる研究に適切な純粋タンパク質調製品を得ることができた。精製タンパク質を、質量分析法により分析し、ＰＭＥＣ１のアミノ酸配列から算出した理論値に相当する質量／ｚシグナルを得、２つのスルフィド架橋の形成を推測した。タンパク質ＰＭＥＣ１は、４種のデング熱ウイルス血清型に対して得られた高度免疫腹水により、及びｍＡｂ ４Ｇ２により、強く認識される。ジスルフィド架橋が正確に形成されることによってこのように認識されるということはタンパク質ＰＭＥＣ１が天然Ｅタンパク質の対応する領域が採る立体配座と同様の立体配座を有することを示唆している。
【００３９】
キメラタンパク質ＰＭＥＣ１を用いてマウスを免疫化することによって、４種のデング熱血清型に対する高力価を特徴とする、中和応答及び防御応答を得た。
【００４０】
さらにＩＨＡ検査を実施し、４種の血清型に対する陽性力価を得た。インビトロの中和試験において、４種の血清型に対する１：１２８０の力価を得た。最終的に、マウスにおいてプロテクションアッセイを実施し、８０〜９０％の動物が４種の血清型に対する防御を示した。
【００４１】
ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成される複合体のモデリング
実施例８は、ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成される複合体の構造のモデリングを示す。この抗体は、４種のデング熱血清型及び他のフラビウイルス属を認識し、中和する。
【００４２】
モデルを、ＣＬＵＳＰＲＯタンパク質−タンパク質ドッキング法（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ｂｕ．ｅｄｕｌ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＰＰＤｏｃｋｉｎｇ／ｃｌｕｓｐｒｏ．ｈｔｍｌ）を使用して得た。この研究において、ＦＡｂ ４Ｇ２の結晶構造（ＰＤＢファイル １ｕｙｗ）並びにデング熱２型由来のＥタンパク質の二量体構造に対応するＰＤＢファイル１ｏａｎ及び１ｏａｍを、インプットファイルとして使用した。表８は、Ｅタンパク質−Ｆａｂインターフェースの特徴的な表面パラメータに相当する値を示し、モデル化した複合体に関して算出された値は、結晶構造が解明されているタンパク質−抗体複合体に関して得られた通常の値と同様である（表９）。
【００４３】
得られたモデルは、ｍＡｂ ４Ｇ２により認識されたエピトープが、本発明において特定された高度に保存された領域を含むことを示す。表１は、予測された構造エピトープに一致する一連の残基（抗体に接触する残基）及びそれらの残基が高度に保存された表面パッチに属することを示す。モデルによれば、予測された構造エピトープ由来の残基の７１％が高度保存領域に属する。
【００４４】
その後、成熟ビリオンを基にした複合体モデルを、デング熱２型ウイルスの低温電子顕微鏡法により構造をあらかじめ予測したモデルとドッキングさせることによって得た。こうして、ビリオン表面上でｍＡｂ ４Ｇ２によって認識されたすべてのエピトープ（１８０コピー）がＦＡｂ鎖により塞がれたモデルが得られた。
【００４５】
Ｅタンパク質二量体に結合したそれらＦＡｂの重鎖のＣ末端間の原子間距離は、１００Åである。二量体として会合していない、非対称ユニットの単量体に結合するＦＡｂに関して計算された同じ距離は１２０及び８０Åである。
【００４６】
これらの距離は、ＩｇＧ分子の配列及び構造に立体化学的に一致せず、ｍＡｂ ４Ｇ２が一価の状態でウイルスに結合することを示唆する。
【００４７】
この予測は、実施例１２に示した結果により裏付けられ、ＦＡｂ及びｍＡｂ ４Ｇ２が非常によく似た中和力価を有することを示す。この発見を他の抗ウイルス抗体に関して得られたデータと対比すると、それらの二価結合により中和能力が２〜３桁増加する（Ｄｒｅｗ ＰＤ、Ｍｏｓｓ ＭＴ、Ｐａｓｉｅｋａ ＴＪ、Ｇｒｏｓｅ Ｃ、Ｈａｒｒｉｓ ＷＪ、Ｐｏｒｔｅｒ ＡＪ、「ｇＨに対する多量体ヒト化帯状疱疹ウイルス抗体断片は、ウイルスを中和するが、単量体断片は中和しない（Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｏ ｇＨ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｖｉｒｕｓ ｗｈｉｌｅ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｄｏ ｎｏｔ）」Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００１；８２：１９５９−６３、Ｌａｎｔｔｏ Ｊ、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ ＪＭ、Ｏｈｌｉｎ Ｍ、「二価抗体フォーマットは、糖タンパク質Ｂの抗原性ドメイン２を介したヒトサイトメガウイルスの中和に必要である（Ａ ｄｉｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｖｉａ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎ ２ ｏｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ）」Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００２；８３：２００１−５）。
【００４８】
チンパンジー抗体１Ａ５の場合と同様に、ｍＡｂ ４Ｇ２のこのプロパティは多様な抗フラビウイルス抗体に共通であり得、Ｅタンパク質のドメインＡにも位置するエピトープを認識する（Ｇｏｎｃａｌｖｅｚ ＡＰ、Ｍｅｎ Ｒ、Ｗｅｒｎｌｙ Ｃ、Ｐｕｒｃｅｌｌ ＲＨ、Ｌａｉ ＣＪ、「デング熱１型及び２型ウイルスを効果的に交差中和する、チンパンジーＦａｂ断片及び派生ヒト化免疫グロブリンＧ１抗体（Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ １ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｒｏｓｓ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓｅｓ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：１２９１０−８）。一般的に、ｍＡｂとそのＦＡｂとの中和能力のバランスはエピトープ、抗体の同一性及び複合体の立体化学の詳細に依存する。したがって、ドメインＢに位置するエピトープを認識するｍＡｂ ４Ｅ１１は、対応するＦＡｂより５０倍の中和能力である（Ｔｈｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．、Ｐ．Ｌａｆａｙｅ、Ｆ．Ｍｅｇｒｅｔ、Ｖ．Ｄｅｕｂｅｌ、Ａ．Ｊｏｕａｎ、及びＪ．Ｃ．Ｍａｚｉｅ、１９９９、「組換えＦａｂは、インビトロでデング熱ウイルスを中和する（Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｂ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」Ｊ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ ６９：１８３−１９０）。
【００４９】
多価中和分子の設計
本発明は、ビリオン表面に高度に保存されたエピトープの２つ又は３つのコピーと同時に結合できる分子の設計及び開発を示す。ビリオンは、本発明に記載の保存エピトープ全１８０コピーを露出している。それらは、Ｅタンパク質二量体に対応する、９０対のエピトープとして、又はビリオンの非対称ユニットに存在するＥタンパク質の３コピーに一致する６０のトリプレットとしてグループ化できた。本明細書中に記載の分子は、二価又は三価の結合ができ、ビリオンに対する改善された結合親和性及び本発明に記載の保存エピトープを認識する中和抗体と比較してより強力で多様な中和能力を示す。記載された分子は、４種のデング熱ウイルス血清型及び他のフラビウイルス属を中和し、したがってデング熱及び或いは他のフラビウイルス属の予防的及び／又は治療的処置に有用である。
【００５０】
本発明の二価又は三価タンパク質分子の配列は、下記の式により表される：
［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｄ］又は［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｔ］
式中、Ｓは一本鎖個体断片（ｓｃＦｖ）の配列であり、本発明に記載の保存エピトープを認識し、［Ｌ］は通常３〜２０アミノ酸長のリンカー配列であり、［Ｄ］は二量体を形成するタンパク質配列又はその断片であり、［Ｔ］は三量体を形成するタンパク質又はその断片である。セグメント［Ｄ］および［Ｔ］は、ウイルス感染の免疫増強を媒介する能力があるＦＣ受容体と相互作用しないタンパク質又はタンパク質ドメインである。このように、本発明の二価又は三価分子は中和濃度以下において、ＦＣ受容体を担った細胞のウイルス感染の増強を予防できる。したがって記載の分子は、ＡＤＥ様効果を媒介する能力がないことを考慮すると、抗体と比較して優れている。さらに、これらの分子は、ｓｃＦｖと比較してより大きく、したがってインビボにおいてより長い半減期を有する。
【００５１】
配列［Ｄ］及び［Ｔ］は、細胞外ヒトタンパク質、好ましくは血清由来のもの、に相当する。このようにすると、細胞内及び／又は異種タンパク質に対して出現し得る自己免疫応答の誘導を予防できる。
【００５２】
一般的に、多価結合を生じ得る適切なリンカー配列を選択した場合、ドメイン［Ｄ］及び［Ｔ］はより大きなオリゴマーを形成できる多量体化ドメインにより置き換え可能である。
【００５３】
設計された多量体化（二量体化及び三量体化を含む）により、断片の親和性を増加でき、それらの内在性の中和能力を改善できる。複数個所におけるウイルスの結合は、成熟ビリオンの構造をさらに安定化し、膜融合過程に伴う四次構造の変化を妨げる。さらに、分子サイズの増大は、インビボで半減期を向上させる。抗体Ｆｖ断片を含む、これらの組換えタンパク質は、集団発生を抑止するための、有効な治療的及び／又は予防的薬剤になり得る。
【００５４】
本発明は、ＴＢ４Ｇ２と称するキメラタンパク質をコード化する遺伝子を示す。プラスミドｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２−ＬＨは、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢに融合され、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコード化する配列に融合される、タンパク質ＴＢ４Ｇ２をコード化する（配列番号１６）。
【００５５】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、Ｎ末端からＣ末端に以下の要素を含む：（ａ）ｍＡｂ ４Ｇ２の軽鎖の可変ドメイン（配列番号２５）、（ｂ）柔軟なスペーサー配列（配列番号２６）、（ｃ）ｍＡｂ ４Ｇ２の重鎖の可変ドメイン（配列番号２７）、（ｄ）１５残基からなる柔軟なスペーサー配列（配列番号２８）、（ｅ）溶液中で分子の三量体化を可能にする、ヒト母系断片（配列番号５１）。
【００５６】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、トポロジー変異体［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｔ］に相当し、［Ｓ］がｍＡｂ ４Ｇ２のｓｃＦｖ断片であり、［Ｌ］がＧＬＹ及びＳＥＲ残基により構成される１５残基からなるスペーサー配列であり、［Ｔ］は並行立体配座に並べられたαへリックスによるらせん形コイルドコイル三量体構造を形成するヒト母系三量体化ドメインである（Ｄａｍｅｓ ＳＡ、Ｋａｍｍｅｒｅｒ ＲＡ、Ｗｉｌｔｓｃｈｅｃｋ Ｒ、Ｅｎｇｅｌ Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｒｅｓｃｕ ＡＴ、「並行ホモ三量体コイルドコイルのＮＭＲ構造（ＮＭＲ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐａｒａｌｌｅｌ ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒｉｃ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ）」Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９８；５：６８７−９１）。
【００５７】
この母系断片は、へリックスのＮ末端に位置するシステイン間に形成されたジスルフィド架橋によって安定化された共有結合性三量体を形成する。シグナルペプチドｐｅｌＢは、タンパク質ＴＢ４Ｇ２がペリプラズムに位置することを可能にし、それ故インビボで結合ドメイン及び三量体化ドメインのジスルフィド架橋の正確な形成を含む、正確なフォールディングを可能にする。
【００５８】
ビリオンとＦｖ４Ｇ２の間に形成される複合体のモデルによれば、非対称ユニットの３つのＥタンパク質単量体に結合したＦｖ断片に相当する、Ｆｖ重鎖のＣ末端間を測定した距離は、３６、５８及び７０Åである。これら３つのＣ末端原子は、半径３５Åの球形に外接し、これはスペーサーセグメント［Ｌ］がこの距離に匹敵する立体配座を採らなければならないことを示す。
【００５９】
理論的には、伸長配座を採る１５残基からなるセグメントは、Ｎ末端からＣ末端まで５２Åの大きさを有する。しかし、このような立体配座は最も安定であるわけではなく、一般的にペプチドの構造的特性はそれらの配列によって決定される。ＧＬＹ及びＳＥＲが多いペプチドは、本質的に柔軟であり、溶液中で複数の立体配座を採ることができる。実施例９に示したように、ＰＲＥＬＵＤＥを使用したペプチドの立体配座の予測（Ｒｏｏｍａｎ ＭＪ、Ｋｏｃｈｅｒ ＪＰ、Ｗｏｄａｋ ＳＪ、「７つの構造配置に基づくタンパク質骨格立体配座の予測。局所的相互作用の影響（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｖｅｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９１；２２１：９６１−７９）により、配列［Ｌ］（配列番号２８）に関して予測された最も好ましい立体配座は、Ｎ末端とＣ末端との距離が約３５Åに相当することが示される。この発見は、キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２のこの設計が、ビリオンの非対称ユニットに存在する３つのＥタンパク質単量体に同時に結合することの達成能力に構造的に合っていることを指摘する。
【００６０】
キメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２をバクテリア大腸菌のペリプラズムに可溶な形態で得た。拡張が容易な精製方法を、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に基づき開発し、この方法により純粋タンパク質調製品を得ることができた。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。非還元条件下で処理した場合、還元条件下であらかじめ処理したタンパク質ＴＢ４Ｇ２は、単量体及び三量体の質量に相当するバンドに移行する。
【００６１】
最終的に、タンパク質ＴＢ４Ｇ２の中和能力をｍＡｂ ４Ｇ２並びにその断片のＦＡｂ及び（ＦＡｂ’）２と比較するために、ＢＨＫ−２１細胞において４種のデング熱ウイルス血清型に対する中和試験を実施した。タンパク質ＴＢ４Ｇ２は、４種の血清型に対して同様の中和力価を示し、抗体及びその断片と比較して２〜３オーダー強力であった。
【００６２】
本発明は、ＭＡ４Ｇ２と称するキメラタンパク質をコード化する遺伝子（配列番号１７）を示す。キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２（配列番号５６）は、以下の要素をＮ末端からＣ末端までに含む：ａ）ｍＡｂ ４Ｇ２の軽鎖の可変ドメイン（配列番号２５）、（ｂ）柔軟なスペーサー配列（配列番号２６）、（ｃ）ｍＡｂ ４Ｇ２の重鎖の可変ドメイン（配列番号２７）、（ｄ）３残基（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）からなる柔軟なスペーサー配列、（ｅ）ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン分子のヒンジセグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおいて、タンパク質はＡＳＮ２９７がＧＬＮに変異している。
【００６３】
キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２は、本発明中で規定されたトポロジー変異体［Ｓ］−［Ｌ］−［Ｄ］に相当し、［Ｓ］がｍＡｂ ４Ｇ２の一本鎖ｓｃＦｖ断片であり、［Ｌ］が配列ＧＬＹ−ＧＬＹ−ＧＬＹの３残基のスペーサーセグメントであり、［Ｄ］はヒトＩｇＧ１免疫グロブリン分子のヒンジセグメント、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むセグメントである。ヒンジセグメントは２つの同一タンパク質鎖間の分子間ジスルフィド架橋の形成を媒介し、安定な二量体構造をもたらす。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインにおいて、ＡＳＮ２９７がＧＬＮへ変異することにより、真核生物におけるタンパク質のグリコシル化が妨げられ、ＦｃγＲ Ｉ〜ＩＩＩへの結合を不可能にする。これらの受容体は、インビトロでＡＤＥ現象を媒介する。このように、思いがけなく設計されたタンパク質であるｍＡｂ ４Ｇ２は、中和濃度以下においてＡＤＥを伴う危険がない。しかし、キメラタンパク質はＦｃＲｎ受容体と相互作用する能力、インビボでより長い半減期を達成するために好ましい特性を、抗体分子に対する類似の手法で維持する。
【００６４】
プラスミドｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２−ＬＨ（配列番号２０）は、Ｎ末端でシグナルペプチドｐｅｌＢ（配列番号２４）に、Ｃ末端で６個のヒスチジンの尾部に融合された、タンパク質ＭＡ４Ｇ２をコード化する。シグナルペプチドｐｅｌＢは、タンパク質ＭＡ４Ｇ２がペリプラズムに位置することを可能にし、ペリプラズムにおいて分子内ジスルフィド架橋（結合ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３）及びヒンジセグメント間（分子間架橋）の正確な形成が起こる。ヒスチジン尾部により、金属キレートクロマトグラフィーによるタンパク質の精製が可能になる。
【００６５】
タンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体とによって形成される複合体の３Ｄモデル（実施例９）、並びに中和試験の結果（実施例１２）は、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２が、成熟ビリオンの構造において二量体として会合する単量体に同時に結合するために適していることを示す。このように、二価性がタンパク質の生物活性の有意な増加をもたらす。
【００６６】
本発明の本質的な側面は、本明細書中に記載の高度に保存されたＥタンパク質の表面パッチに結合できる分子が、このタンパク質の生物学的機能に干渉し、このような分子がフラビウイルス属に対する幅広い抗ウイルス薬の潜在的な候補を構成するという発見にある。実施例１２に示すように、ｓｃＦｖを含むｍＡｂ ４Ｇ２の断片は、全ｍＡｂ ４Ｇ２と同等の中和活性を示し、抗ウイルス活性に二価性は必要ではないことを示す。これらの結果はさらに、断片の抗ウイルス活性はＥタンパク質の生物活性への干渉に左右され、この干渉が前記のタンパク質の高度の保存された領域に結合することによって媒介されることを示す。さらに、フラビウイルス属に対する広範囲の抗ウイルス活性が観察された。したがって、これらの特性を有する抗ウイルス分子の特定のための興味深い方法は、タンパク質、ペプチド及び前記の高度の保存された表面領域に結合する薬剤様分子の特定を可能にする方法である。このような方法は、高度保存表面領域を認識する、ｍＡｂ ４Ｇ２、その対応するＦＡｂ及び（Ｆａｂ’）２断片又は本発明に記載のキメラタンパク質などの抗体が、Ｅタンパク質に結合することを遮断することに基づく方法である。それらの方法は、免疫酵素法、放射免疫測定、蛍光色素を用いた試験に基づくことができ、これらの試験はＥタンパク質、ビリオン又は本明細書中に記載の、高度保存表面領域を示すキメラタンパク質に対する分子の結合を定量化できる。
【００６７】
これらのアッセイは、コンビナトリアルケミストリーの方法によって生成したキメラ化合物を含む、キメラ化合物のライブラリのインビトロのスクリーニングを用いた、広範囲のフラビウイルス属に対して有効で強力な抗ウイルス分子の特定に有用であり得る。
【００６８】
候補分子の特定は、コンピュータ支援ウイルススクリーニング法を使用して実施できた。これらの方法は、キメラ化合物の分子ドッキングのような、コンピュータを使用した手法に基づく。これらの方法を使用して、タンパク質に対するキメラ化合物の結合をモデル化し、相互作用の強さ又は結合エネルギーを定量化することが可能であり、これらはスコア関数を用いて、モデル化複合体の座標から予測又は算出される。
【００６９】
分子ドッキングのコンピュータ手法の例は、プログラムＧＯＬＤ（Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．ｙ ｃｏｌｓ．、１９９７、「柔軟なドッキングのための遺伝的アルゴリズムの開発及び検証（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｄｏｃｋｉｎｇ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７、７２７−７４８）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ｙ ｃｏｌｓ．、１９８２「巨大分子−リガンドの相互作用に対する幾何学的アプローチ（Ａ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１、２６９−２８８）及びＦＬＥＸＸ（Ｏｌｅｎｄｅｒ，Ｒ．及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．、２００１、「巨大ヴァーチャルコンビナトリアルライブラリにおける、活性基を含む分子の検索のための高速アルゴリズム（Ａ ｆａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ ｉｎ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｖｉｒｔｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｃｉ．４１、７３１−７３８）である。これらの方法は、ＺＩＮＣデータベースのような、分子の大型ヴァーチャルライブラリ（Ｉｒｗｉｎｇ，Ｊ．Ｊ．及びＳｃｏｉｃｈｅｔ，Ｂ．Ｋ．、２００５、「Ｚｉｎｃ−ヴァーチャルスクリーニングのための市販化合物の無料データベース（Ｚｉｎｃ − Ａ ｆｒｅｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｖｉｒｔｕａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．４５、１７７−１８２）が、どの分子が受容体タンパク質上の選択された活性部位に結合することが期待されるかをスクリーニングし、決定することを可能にする。本発明に関して、結合部位は前記の高度保存表領域である。ＰＤＢデータベースにおいて利用可能なＥタンパク質の結晶構造が、原子座標のための情報源として使用でき、又は代替としてコンピュータモデルが使用でき、コンピュータモデルはホモロジーによるタンパク質のモデリングのような方法を用いて得られる。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）
キメラタンパク質ＰＭＥＣの設計
Ｅタンパク質の表面上の保存パッチを特定する目的で、ＣＵＮＳＵＲＦ法を使用して保存分析を実施した（「ＣｏｎＳｕｒｆ：系統発生情報の表面マッピングによるタンパク質の機能的領域の特定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ−ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」Ｇｌａｓｅｒ，Ｆ．、Ｐｕｐｋｏ，Ｔ．、Ｐａｚ，Ｉ．、Ｂｅｌｌ，Ｒ．Ｅ．、Ｂｅｃｈｏｒ−Ｓｈｅｎｔａｌ，Ｄ．、Ｍａｒｔｚ，Ｅ．及びＢｅｎ−Ｔａｌ，Ｎ．；２００３；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９：１６３−１６４）。高度保存表面パッチはドメインＩＩの先端に見られ、これは４種のデング熱ウイルス血清型及び残りのフラビウイルス属にも保存されている（図１及び２）。
【００７１】
高度保存表面パッチはトポグラフィー的エピトープを規定し、三次元構造において近くに位置するが、Ｅタンパク質の配列からは離れて位置する残基により適合する。この表面領域は、ドメインＩＩの端に位置する構造サブドメイン上に含まれ、Ｅタンパク質の２つの直系のセグメントであるＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２６２（セグメントＢ）及びＬｙｓ６４〜Ｔｈｒ１２０（セグメントＣ）により適合する。表１は、ビリオンの外面に位置し、したがって抗体との相互作用に接近可能な、サブドメインの残基のリストを示す。高度保存残基は、本発明により規定される領域又はエピトープを規定する。
【００７２】
Ｅタンパク質のドメインＩＩの構造の検討により、サブドメインが構造的に独立した、ドメインのような特性を示すことが示される。残りのタンパク質に対する接触表面は１８４Å２であり、これは溶媒が接触可能であるサブドメインの全表面積のわずか１２％である。さらに、構造のこの部分がＣＡＴＨデータベースにおいて構造ドメインとして規定された（ＣＡＴＨ ｄｏｍａｉｎ Ｉｓｖｂ０３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｃａｔｈ／ｃａｔｈ．ｈｔｍｌ）。
【００７３】
【表１】
【００７４】
独立してフォールディングされたサブドメインを得るために、まずユニークなポリペプチド鎖において２つのセグメントを接触させることが必要である。２種の考えられる連結又はトポロジーが可能である：
Ｂ−Ｌ−Ｃ ｙ Ｃ−Ｌ−Ｂ
式中Ｌはリンカー又はスペーサーセグメントである。リンカーはサブドメインの三次元的構造に立体化学的に適合する必要があり、最良の場合キメラタンパク質の熱力学的安定性に安定化効果を提供する。残基のＶａｌ２５２及びＬｙｓ６４のα炭素間の距離は６．６Åであり、したがってトポロジーＢ−Ｌ−Ｃを１つ又は複数の残基のリンカーを使用して得られた。アンカーセグメントの構造に適合するターンを捜す、ＰＤＢデータベースによる考えられる連結ターンの構造分析（ＷＨＡＴＩＦプログラムパッケージのＤＧＬＯＯＰメニューのＤＧＩＮＳコマンド）は、２つの残基の連結が１つの残基による連結より一般的であることを示す。トポロジーＣ−Ｌ−Ｂの場合、残基のＴｈｒ１２０及びＬｅｕ２３７のα炭素間の距離は１１．１Åであり、３〜４残基又はそれを超える残基の連結に一致する。
【００７５】
本発明のキメラタンパク質ＰＭＥＣ１（配列１４）は、トポロジーＢ−Ｌ−Ｃに相当し、断片Ｂ及びＣはデング熱２型ウイルス由来の配列及び２つの残基Ｇｌｙ−Ｇｌｙのリンカー配列に相当する。
【００７６】
Ｂ及びＣセグメント配列はＤＥＮ２ウイルスに相当する配列のみではなく、限定するものではないがＤＥＮ１、ＤＥＮＳ、ＤＥＮ４を含む他のフラビウイルス属、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）、マリーバーレー脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴ ウイルス（ＬＡＮＧＡＴ ｖｉｒｕｓ）、黄熱病ウイルス（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、ポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）（配列２９〜４２）由来の相同配列から選択できるだろう。
【００７７】
さらに、上記の方法により設計されたキメラタンパク質は、タンパク質の熱力学的安定性、又はフォールディング過程の効率を高める目的で、１個又は複数個の残基を変異させることができた。ビリオン表面及び抗体との相互作用に接近できない、表１に記載された残基を変異させることが可能であった。変異させやすい残基は、タンパク質の３Ｄ構造に埋もれている、及び／又は成熟ビリオンに存在するＥタンパク質の３Ｄ／４Ｄ構造の側面又は内面に位置する残基である。
【００７８】
変異させたタンパク質は、線状ファージライブラリのような実験的コンビナトリアル法によって得られた。タンパク質は、ＦＯＬＤＸ、ＰＯＰＭＵＳＩＣ及びＲｏｓｓｅｔａのような理論的方法を使用して設計できた。
【００７９】
配列４３〜５０は、複数位置で変異させたキメラタンパク質ＰＭＥＣ１の類似体に相当する。このタンパク質の三次元モデルは、良好なパッキング及び性質を示す。これらの変異はＥタンパク質の保存サブドメインを認識する防御及び中和抗体との相互作用に影響を与えてはいけないという条件で、タンパク質の露出面における、特にデング熱血清型及び他のフラビウイルス属に厳重には保存されていない残基における変異もまた可能である。
【００８０】
（実施例２）
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１の構築
タンパク質ＰＭＥＣ１（配列番号１）をコードする組換え遺伝子、ＤＥＮ２ウイルス由来のＥタンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子を得るために、プラスミドｐ３０−ＶＤ２に存在する、１４０９株、遺伝型ジャマイカ（Ｄｅｕｂｅｌ Ｖ．、Ｋｉｎｎｅｙ Ｒ．Ｍ．、Ｔｒｅｎｔ Ｄ．Ｗ．；「デング熱２型ウイルス、遺伝型ジャマイカの構造タンパク質のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ、Ｊａｍａｉｃａ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５（２）：３６５−３７７、１９８６）を使用した。この遺伝子は、配列番号３に示されるタンパク質をコードする。Ａｇａｒｗａｌらの方法を使用し（Ａｇａｒｗａｌ ＫＬ、Ｂｕｃｈｉ Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｇｕｐｔａ Ｎ、Ｋｈｏｒａｎａ ＨＧ、Ｋｕｍａｓ Ａ、Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ、Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｙ ＵＬ、ｖａｎ ｄｅ Ｓａｎｄｅ ＪＨ、Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ Ｖ、Ｗｅｂｅｒ Ｈ、Ｙａｍａｄａ Ｔ、「酵母由来のアラニン転移リボ核酸の遺伝子の全合成（Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａｎ ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ）」、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ ２２７、２７−３４）、ホスホアミダイド法によって固相で化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから開始し（Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、「デオキシリボ核酸ホスホアミダイド法：新規な一連の鍵がデオキシリボヌクレオチドの合成を媒介する（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ− Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８１、２２、１８５９）、ＰＭＥＣ１タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を得た（配列番号４）。このＤＮＡ分子の配列は以下の要素を有する：１）アミノ酸のメチオニン（Ｍ）をコードする開始コドンその後にアミノ酸アラニンをコードするコドン（Ａ）（配列番号５）を含む、ＮｃｏＩ制限酵素の認識部位；２）デング熱２型ウイルス株ジャマイカ１４０９（配列番号６）のタンパク質Ｅに関する遺伝子の、７０９位から７５６位までの配列に相当し、配列番号７に示されるペプチド配列をコードする、配列番号３の２３７位から２５２位までに相当するターンに存在する断片；３）２つの連続するグリシンをコードするリンカーセグメント（配列番号８）；４）配列番号２の１９０位から３６０位にわたる配列に相当する断片であり、配列番号９（配列番号３の６４〜１２０位に相当する）に示されるペプチド配列をコードし、前記配列（配列番号１０）の２８４〜２８９位に存在するＮｃｏＩ制限部位を誘発するサイレント変異が導入される；及び５）アミノ酸ロイシン（Ｌ）及びグルタミン酸（Ｅ）をそれぞれコードする２つのコドンを含むＸｈｏＩ制限酵素の認識部位（配列番号１１）。この合成分子を、製造業者により指定された条件でＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて消化し、製造業者により指定の条件でＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、あらかじめ完全に同じように消化したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に連結した。反応物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従って、大腸菌株ＸＬ−１ブルー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ｓｔｒａｉｎ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）（Ｂｕｌｌｏｃｋ ＷＯ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭ、Ｓｈｏｒｔ ＪＭ．ＸＬ−ｌＢｌｕｅ：「βガラクトシダーゼ選択によるｒｅｃＡ大腸菌Ｋ１２株の高性能プラスミド形質転換（Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｃＡ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８７；５：３７６−８）に組み込み、選択培地で生き残ったコロニーに存在するプラスミドを制限分析によってスクリーニングした。得られた組換えプラスミドの１つをｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１と命名し（図４）、その配列（配列番号１２）を、自動的サンガー配列決定を介して検証した。
【００８１】
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１は、Ｎ末端でｐｅｌＢリーダーペプチドに、Ｃ末端で６個のヒスチジンをコードする配列に融合されたタンパク質ＰＭＥＣ１をコードする（配列番号１３）。この構成により、一方では、リーダーペプチドの切断を介した宿主におけるこのタンパク質のプロセシング、並びに一般的酸化条件によりＰＭＥＣ１の正確なフォールディング及びジスルフィド架橋の形成が促進される、大腸菌のペリプラズムへの分泌が可能になり、さらに他方では固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を介したこのタンパク質の精製を容易にすることができる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．（１９８５）「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３、１−７）。ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６と命名した、プロセシング及びペリプラズムへの分泌後のタンパク質の最終配列を、配列番号１４に示した。
【００８２】
（実施例３）
ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の発現及び精製
プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１を大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．及びＢ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ、「クローン化遺伝子の直接的、選択的な高レベルの発現に対するバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９．１（１９８６）：１１３−３０）に組み込み、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｆｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加した５０ｍｌのルリア−ベルターニ培地（ＬＢＡ）の培養液に単一の、単離されたコロニーを接種し、３５０ｒ．ｐ．ｍで３０℃において１２時間成長させた。１ＬのＬＢＡ培地にこの培養液を接種し、６２０ｎｍにおける開始吸光度（ＯＤ６２０）は０．０５であり、次いで後期指数増殖期まで、２８℃で８時間成長させた。この培養液を、その後イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導し、さらに５時間同じ条件で成長させた。
【００８３】
上記のようにして得た培養液を、４℃において５０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．及びＳｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９８９）ｉｎ「分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して、得られたバイオマスからペリプラズム画分を抽出した。この画分を、１０００Ｄａカットオフの膜を使用して、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７／２０ｍＭイミダゾールに対して透析し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｅｎｅｌｕｘ Ｂ．Ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ １９８５、「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）によって透析物からタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６を得た。
【００８４】
（実施例４）
キメラタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の物理的及び化学的特徴付け
ＩＭＡＣにより精製されたＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の調製品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてこのタンパク質に関して予想される質量（およそ９５００Ｄａ）に相当する見かけの質量まで移動した太いバンドを示し（図７）、調製品の精製度が高いことの証拠となった。同じ図は、還元し、カルバミドメチル化したＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６（レーン２、図７Ａ）に対応するバンドが、還元していない試料（レーン１、図７Ａ）と比較した場合に、電気泳動での移動がわずかに減少していることを示す。この挙動は、システインが分子間ジスルフィド架橋に関与し、タンパク質が適切にフォールディングされたことを示す。
【００８５】
ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の８０μｇアリコートを、Ｃ４ ４．６×２５０ｍｍ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ＵＳＡ）の逆相ＨＰＬＣカラムで分析した。クロマトグラフィーの作動は、２つのポンプとコントローラーとを取り付けた高圧クロマトグラフィー系を使用して、３７℃において実施した。タンパク質の溶出は、１０から６０％（ｖ／ｖ）までの０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸中の線形勾配のアセトニトリルにより、流速０．８ｍＬ／分で、検出フィルターを２２６ｎｍにセットして達成した。クロマトグラムは、単一のピークを示したため、調製品の均一性が高いことが裏付けられた（図７Ｂ）。
【００８６】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるピークを、質量分析法により、さらに高い精度でタンパク質の分子質量を測定し、ジスルフィド架橋の酸化状態を確認する目的で分析した。スペクトルを、Ｚ−スプレー電子噴霧イオン化源を取り付けた、オクタゴナルジオメトリＱＴＯＦ−２ＴＭ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）を用いたハイブリッドマススペクトロメーターで得た。得られたスペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘ バージョン３．５（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、ＵＫ）ソフトウェアアプリケーションを使用して処理した。ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６調製品の主要な種類の質量スペクトルは、９２１９．５１Ｄａの分子質量を有し（図７Ｃ）、この値は遺伝子配列による予測値より０．０５Ｄａ少ないだけである。この分析により、分子のシステイン残基はジスルフィド架橋に関わっており、Ｎ末端及びＣ末端の分解又は影響を受けやすいアミノ酸の修飾などの、望ましくない翻訳後の修飾の存在が消失したことが裏付けられた。
【００８７】
（実施例５）
ＰＭＥＣ１の抗原的特徴
精製ＰＭＥＣ１タンパク質を、モノクロナールマウス抗体及びポリクロナールマウス抗体並びにデング熱反応性ヒト血清を使用してドットブロットにより特徴付けした（表２及び３）。陰性対照として、ヘキサヒスチジンタグに融合した、Ｄｅｎ−２ウイルス（遺伝型ジャマイカ）のＥタンパク質のドメインＩＩＩにある、組換えタンパク質ＤＩＩＩｅ２を用いた。ＰＭＥＣ１と異なり、ＤＩＩＩｅ２はＥタンパク質のより高度な配列可変領域に対応する。組換えドメインＩＩＩは抗Ｄｅｎ高度免疫腹水（ＨＩＡＦ）により強く認識され、同種血清型に顕著な特異性を示し、このドメインのジスルフィド結合の還元に関する反応性をほとんどなくしている。ドメインＩＩＩに対する抗体反応性におけるこの血清型特異性は、さらにヒトの抗体応答においても発見されている。Ｍａｂ ３Ｈ５もまた、試験の対照として含まれていた。Ｍａｂ ４Ｇ２と異なり、３Ｈ５はＤｅｎ−２のドメインＩＩＩ内で血清型特異的エピトープを認識する。これらの２つのＭａｂの反応性に還元剤を用いた処理によって、影響を受ける（Ｒｏｅｈｒｉｇ ＪＴ、Ｖｏｌｐｅ ＫＥ、Ｓｑｕｉｒｅｓ Ｊ、Ｈｕｎｔ ＡＲ、Ｄａｖｉｓ ＢＳ、Ｃｈａｎｇ ＧＪ、「デング熱２型ウイルスのエンベロープ糖タンパク質のエピトープ発現に対するジスルフィド架橋の構築（Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｔｏ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：２６４８−５２）。
【００８８】
【表２】
【００８９】
ＰＭＥＣ１は、Ｄｅｎの４種の血清型に対して並びにＭａｂ ４Ｇ２に関して得られたＨＩＡＦによって認識された。評価された異なるフラビウイルス属に対して得られたＨＩＡＦの残りのうち、抗ＳＬＥが、抗ＤｅｎのＨＩＡＦに対して得られた同じシグナル強度を有するＰＭＥＣ１に最も高い反応性を示した。抗ＴＢＥ及び抗ＹＦのＨＩＡＦもまた、強度は前述のものより低いがＰＭＥＣ１を認識した。異なるＨＩＡＦの反応性は、ウイルスのＥタンパク質の天然構造と同様の立体配座でタンパク質が正確にフォールディングされたことを示す、ＰＭＥＣ１のジスルフィド結合の存在に強く依存した。
【００９０】
ＰＭＥＣ１タンパク質を、異なる疫学的状態でＤｅｎに感染したことがある人間に由来する、ヒトの血清との反応性を介して、さらにドットブロットで特徴付けした。このアッセイにおいて、４種のウイルス血清型（即ち、Ｄｅｎ１、Ｄｅｎ２、Ｄｅｎ３及びＤｅｎ４）に一次感染した回復期にある患者からの血清も含んだ。Ｄｅｎ２又はＤｅｎ３に二次感染した個人由来の血清もまた使用した。ヒトの抗体は、同じ疫病に感染し、同様の臨床症状を経験し、同様の血清学的結果を有する３例の個人に由来する血清をプールとして用いた。各血清を、ウイルス性抗原及びＰＭＥＣ１タンパク質に対するＩｇＭ抗体の存在に関して評価した。
【００９１】
【表３】
【００９２】
異なるウイルス血清型に感染した個人由来のヒト血清は、同等の強度を有するＰＭＥＣ１を認識した。最も強いシグナルは、二次感染に苦しむ個人由来の血清で得られ、ＥＬＩＳＡによっても、より高い抗ウイルス力価は一致した。
【００９３】
（実施例６）
ＰＭＥＣ１タンパク質を用いた免疫化により得た抗体応答の特徴付け
８０Ｂａｌｂ／ｃマウスの一群に、腹腔内（ｉ．ｐ）経路で、フロインドアジュバントを用いて乳化した２０μｇの精製ＰＭＥＣ１を注入した。４回目の投与の後で、１０匹のマウスを出血させ、さらなる血清学的分析のために血清を収集した。ＥＬＩＳＡで測定した抗Ｄｅｎ抗体力価は、ウイルスの４種の血清型と同様に高かった（表４）。同時に、誘発されたＡｂｓの機能性を赤血球凝集の阻害（ＩＨＡ）及びプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって測定した。ＩＨＡ試験において、抗ＰＭＥＣ１抗体は、４種のＤｅｎ血清型に対して陽性の力価を得た（表５）。さらに、１／１２８０の中和力価を、４種のウイルスに対して得た（表６）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
【表５】
【００９６】
【表６】
【００９７】
（実施例７）
プロテクションアッセイ
出血させた後に残った、ＰＭＥＣ１を用いて免疫化した動物をいくつかの群に分け、チャレンジ研究の実施に使用した。１５匹の動物からなる４群に、ｉ．ｃ．注入によって、ウイルスの４種うちの１種の血清型の生神経適応株の１００ＬＤ５０を接種し、２１日間観察した。１０匹の動物からなる５番目の群には、ウイルスのチャレンジをしなかった。１５匹の動物の群からなる陽性対照を、免疫化し、その後ウイルスの同じ血清型（即ち、Ｄｅｎ１、Ｄｅｎ２、Ｄｅｎ３及びＤｅｎ４）によりチャレンジした。１５匹のマウスからなる別の４群を、それぞれ実験の陰性対照として用いた；これらの動物にはＰＢＳを免疫原として与え、異なるウイルス血清型によりチャレンジした。ＰＢＳにより免疫化したマウスが、ウイルス接種後７〜１１日で脳炎症状を発症し、２１日までに死亡したのに対して、ＰＭＥＣ１により免疫化した動物群は、８０％〜９０％が生存した（表７）。ウイルスにより免疫化した群の動物は、１００％防御された。
【００９８】
【表７】
【００９９】
（実施例８）
ｍＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質とにより形成された複合体の構造予測
抗原−抗体複合体の構造をモデリングするために、分子ドッキング研究を、ｍＡｂ ４Ｇ２のＦＡｂ断片の結晶構造（１ｕｙｗ）とデング熱２型ウイルス由来のエンベロープＥタンパク質の２つの結晶構造（ＰＤＢファイル、１ｏａｎ及び１ｏａｍ）とを使用して実施した。可能性のある複合体構造の作成のための２つの異なるプログラム：ＤＯＴ及びＺＤＯＣＫ（Ｍａｎｄｅｌｌ ＪＧ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＶＡ、Ｐｉｑｕｅ ＭＥ、Ｋｏｔｌｏｖｙｉ Ｖ、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＪＣ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｅ、Ｔｓｉｇｅｌｎｙ Ｉ、Ｔｅｎ Ｅｙｃｋ ＬＦ、（２００１）「連続した静電気的及び幾何学的適性を使用したタンパク質ドッキング（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｃｋｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｆｉｔ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １４：１０５−１３、Ｃｈｅｎ Ｒ、Ｌｉ Ｌ、Ｗｅｎｇ Ｚ（２００３）「ＺＤＯＣＫ：初期段階のタンパク質ドッキングアルゴリズム（ＺＤＯＣＫ：Ａｎ Ｉｎｉｔｉａｌ−ｓｔａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｏｃｋｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」５２：８０−８７）を含む、ＣＬＵＳＰＲＯ法を予測のために使用した（ｈｔｔｐ：／／ｎｒｃ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｃｌｕｓｔｅｒ／、Ｓ．Ｒ．Ｃｏｍｅａｕ、Ｄ．Ｗ．Ｇａｔｃｈｅｌｌ、Ｓ．Ｖａｊｄａ、Ｃ．Ｊ．Ｃａｍａｃｈｏ．「ＣｌｕｓＰｒｏ：タンパク質複合体を予測するための自動的ドッキング及び識別の方法（ＣｌｕｓＰｒｏ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」（２００４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０、４５−５０）。
【０１００】
以下のパラメータを変えながら、全部で１３の分子ドッキングシミュレーションを実施した：ドッキングプログラム（ＤＯＴ又はＺＤＯＣＫ）、リガンド及び受容体の規定（Ｆｖ断片又はＥタンパク質）、Ｅタンパク質の結晶構造（１ｏａｎ又は１ｏａｍ）、Ｅタンパク質の四次構造（単量体又は二量体）、Ｅタンパク質のＦｖ断片又はＮ末端セグメント（１〜１２０残基）の結合部位に関与する解のフィルタリングの抑止の使用（ＤＯＴの魅力的なオプション）。図７は、シミュレーションの結果を要約したスキームを示す。それらの複合体は可能性のある解であると思われ、Ｅタンパク質のドメインＩＩに位置するエピトープを予測し、このエピトープはビリオン構造に従った抗体とも相互作用に接近可能であり、パラトープは抗体の高度可変領域である。ドメインＩＩのエピトープＡ１（ｍＡｂ ４Ｇ２おり認識されるエピトープ）の位置は、実験データにより裏付けられ、同じエピトープに対する関連抗体がＥタンパク質のアミノ酸１〜１２０にあるタンパク質分解断片を認識することもまた判定されている（Ｒｏｅｈｒｉｇ，Ｊ．Ｔ．，Ｂｏｌｉｎ，Ｒ．Ａ．及びＫｅｌｌｙ，Ｒ．Ｇ．「デング熱２型、ジャマイカのエンベロープ糖タンパク質のモノクロナール抗体マッピング（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｎｇｕｅ ２ Ｖｉｒｕｓ、Ｊａｍａｉｃａ）」１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４６：３１７−３２８）。
【０１０１】
６個の可能性のある解を得、これらは構造的に非常に似ていた。表８は、予測Ｅタンパク質−Ｆｖ複合体のインターフェースパラメータに対応する値を示し、予測複合体に関して算出された値は、結晶構造があらかじめ実験的に決定されているタンパク質−抗体複合体に関して算出された値と同様である（表９）。
【０１０２】
抗体に接触するＥタンパク質の表面パッチは、タンパク質配列の４つのセグメントを含む。この発見は、エピトープのトポグラフィー的性質と一致し、その認識は、タンパク質の正確なフォールディングに依存し、ジスルフィド架橋の減少の影響を受けやすい。三次元モデルにより規定された構造エピトープは、フラビウイルス属に高度に保存された領域を含み、このことは、実施例５に示される抗体の広い交差反応性及びキメラタンパク質ＰＭＥＣ１の認識に一致する。該モデルはさらに、この抗体の中和機序がＥタンパク質が膜に結合することへの干渉、及び／又は融合過程に伴う三量体化に関与することを示唆する。
【０１０３】
さらに、未成熟ビリオンの低温電子顕微鏡研究でのｐｒｅＭに対応する電子密度から推論されるように、抗体により認識されるエピトープは、Ｅタンパク質とｐｒｅＭとの相互作用に関与する領域に一致する。相互作用面の保存に関する進化的圧力により、Ｅタンパク質のこのエピトープが高度に保存されたことが説明可能であろう。しかも、このような変異は、ｐｒｅ−Ｍの表面上の同時変異が安定化されることによって補正されるべきであるから、この表面パッチのエスケープ変異体の出現は可能性が低い。実際に、この抗体に対して得られたエスケープ変異体は、ドメインＩとＩＩの間のヒンジ領域に位置し、変異ウイルスは、高度の弱毒化を示し、膜に融合する能力を失う。このことは、フラビウイルス属に対する組換えワクチン候補としての、本発明のＰＭＥＣキメラタンパク質の好ましいプロパティを構成する。
【０１０４】
その後、本発明者らは、成熟ビリオンの構造を基にして、ＦＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質との間の相互作用をモデル化した。この目的のもとに、本発明者らはあらかじめモデル化した複合体を、成熟ビリオンの低温電子顕微鏡による構造にドッキングさせた。モデルを得るために本発明者らは以下を使用した：１）低温電子顕微鏡により得られたビリオンの構造に対応するＰＤＢファイル１ＴＨＤ、２）分子ドッキングによってあらかじめモデル化された、ＦＡｂ ４Ｇ２とＥタンパク質単量体とにより形成された複合体の座標、３）ファイル１ＴＨＤに対応する正二十面体対称操作を、分子ドッキングによりあらかじめモデル化した複合体に適用した。
【０１０５】
このようにモデルを得、該モデルにおいて、ビリオン上に存在するｍＡｂ ４Ｇ２により認識されるエピトープのすべてのコピー（１８０）は、ＦＡｂにより占められている（図９）。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
ＦＡｂ断片の重鎖のＣ末端残基間の距離の調査により、抗体の二価結合はビリオンの構造に大きな変化が起こらなければ不可能であることが示される。この観察は、等モル量のＦＡｂ及びｍＡｂが非常によく似た中和力価を見せることを示す、実施例１２において得た結果と一致する。この発見は、二価結合形態に期待される２〜３桁の増加とは対照をなす。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
（実施例９）
キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２（二価）及びＴＢ４Ｇ２（三価）の設計
この実施例において、本発明者らは、成熟ビリオンにおいて提示されるＥタンパク質単量体の２つ又は３つのコピーと同時に結合できる、ｍＡｂ ４Ｇ２結合部位に関するキメラタンパク質の設計を示す。実施例８のモデリング研究は、ビリオンの非対称ユニットに位置するＥタンパク質単量体に付随するＦＡｂの重鎖のＣ末端残基を隔てる距離が、それぞれ８０、１００及び１２０Åであることを示す。これらの値は、大きすぎて抗体はビリオンに二価結合できない（図９）。異なる非対称ユニットに由来するＥタンパク質単量体に結合するＦａｂに対応するＣ末端残基間で算出された距離もまだ大きすぎる。しかし、非対称ユニットに結合したＦｖ断片の重鎖のＣ末端残基間で算出された距離はそれぞれ３６、５８及び７０Åである。これらの３つの原子は半径３５Åの円に囲まれ１０〜１５残基のリンカーセグメントを介して三量体化ドメインに融合することによって三価の結合が可能であることを示す。
【０１１０】
同様に、Ｅタンパク質二量体に結合するＦｖ断片の重鎖のＣ末端間の距離は、３６Åであり、５〜１０残基からなる小型のリンカーセグメントを用いて二量体化ドメインに融合することによって二価の結合が可能であることを示す。
【０１１１】
ミニ抗体型分子（二価結合）の設計
二価結合分子の例として、本発明者らは、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２を設計した。その配列は、Ｎ末端からＣ末端までに以下のセグメントを含む：
１− ｓｃＦｖ、ＶＬ−リンカー−ＶＨ型（配列番号２５、２６及び２７）のｍＡｂ４Ｇ２の一本鎖Ｆｖ断片で、ＶＬはｍＡｂ４Ｇ２の軽鎖の可変領域であり、ＶＨは同じ抗体の重鎖の可変領域である。
２− ＧＧＧ、３個のグリシン残基リンカーセグメント、
３− ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、ヒンジセグメント配列と、ヒトＩｇＧＩ分子の定常ドメイン２及び３とに対応し、グリコシル化部位Ｎ２９７がグリシンに変異している（配列番号５２）
【０１１２】
タンパク質ＭＡ４Ｇ２は、真核生物及び原核生物において発現でき、ヒンジ領域に位置するシステイン残基間の分子間ジスルフィド架橋の形成のため、二量体として会合し、こうして分子のＣ末端部分でヒトＦＣドメインを提示する。ヒンジ領域は、適切な空間と柔軟性を示し、それ故三個の残基のリンカー（ＧＧＧ）は、ｓｃＦｖドメインとヒンジＦＣセグメントとの間の連結器として十分である。図１０は、キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体により形成される複合体の３Ｄ構造のモデルを示し、ビリオンに対する二価結合の実現可能性を示す。
【０１１３】
グリコシル化部位での突然変異の存在により、真核生物において非グリコシル化ＦＣ担持分子を得ることができる。非グリコシル化ＦＣドメインは、受容体ＦｃγＲＩ〜ＩＩＩに結合せず、インビトロで感染性免疫増強を媒介できる（Ｌｕｎｄ，Ｊ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｏｏｄａｌｌ，Ｍ．、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、４９６３−４９６９、Ｌｕｎｄ，Ｊ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．、Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｏｏｄａｌｌ，Ｍ．、Ｎａｋａｇａｗａ，Ｈ．、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．１９９５、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．９、１１５−１１９）。このように、元の抗体分子と異なり、設計されたタンパク質は中和濃度以下でＡＤＥを媒介する危険がない。さらに、キメラタンパク質は、天然抗体と同様に、インビボで長期の半減期を表すために望ましいＦｃＲｎ受容体結合プロパティを維持する。
【０１１４】
キメラ三価タンパク質ＴＢ４Ｇ２
三価結合分子の例として、本発明者らはキメラタンパク質ＴＢ４Ｇ２を設計し、それらの配列を以下の構造として記載する。
ｓｃＦｖ−リンカー−Ｔ
ここで、
１− ｓｃＦｖ、ＶＬ−リンカー−ＶＨ型（配列番号２５、２６及び２７）のｍＡｂ４Ｇ２の一本鎖Ｆｖ断片で、ＶＬはｍＡｂ４Ｇ２の軽鎖の可変領域であり、ＶＨは同じ抗体の重鎖の可変領域である、
２− リンカー、は（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧ（配列番号２８）の配列のリンカーセグメントである
３− Ｔは、ヒト母系らせん型三量体化ドメイン（配列番号５１）。
【０１１５】
母系の三量体化ドメインは、並行コイルドコイル構造として三量体化されたαへリックスである。該三量体は、各単量体のＮ末端に近接して位置する２個のシステインにより形成される、６個の分子間ジスルフィド架橋を含む。この三量体らせん型構造は高度に安定しており、５０℃においてｄＧ＝７ｋｃａｌ／ｍｏｌである（Ｗｉｌｔｓｃｈｅｃｋ Ｒ、Ｋａｍｍｅｒｅｒ ＲＡ、Ｄａｍｅｓ ＳＡ、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｓｓ Ｔ、Ｂｌｏｍｍｅｒｓ ＭＪ、Ｅｎｇｅｌ Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｒｅｓｃｕ ＡＴ、「酸化及び還元形態の軟骨基質タンパク質由来のコイルドコイル三量体ドメインの異核ＮＭＲ帰属及び二次構造（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ＮＭＲ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９７；６：１７３４−４５）。ジスルフィド架橋により、非常に低い濃度でも共有結合により連結された三量体の四次構造が確保され、この三量体は非共有結合相互作用のみに基づく三量体に好ましく匹敵する。
【０１１６】
リンカーセグメントはアミノ酸のＧｌｙ及びＳｅｒにより構成されており、非常に柔軟性がある。類似の構成のアミノ酸配列は、タンパク質工学においてリンカー配列として非常に多く使用されている。１０個の残基からなるセグメントは、ビリオンに対する三価の結合に必要な３５Åの空間を提供できるが、セグメントが十分に伸長した立体配座を採った場合にのみ当てはまる。溶液中でリンカーセグメントは、熱力学平衡状態において複数の立体配座を表すことができ、唯一の伸長配座を採ることは、有意なエントロピーエネルギーの損失を示唆する。リンカーセグメントの構造プロパティを調査するために、本発明者らは１５残基の（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧ配列の構造予測を、準備プログラムを使用して、実施した。この方法は、局所的相互作用を記載する統計ポテンシャルに基づき、ペプチド構造予測のためにあらかじめ使用されている。図１１は、予測されたより好ましい立体配座に関する、エネルギー値対Ｎ末端とＣ末端との距離のプロットを示す。３５Åの範囲に対応するエネルギー最小値及び最も伸長した立体配座（４０Åを超える）は非常に好ましくない。したがって、計算結果は、リンカーセグメントとして選択された配列は三価の結合分子の設計に適切であることを示す。
【０１１７】
（実施例１０）
抗体４Ｇ２由来の可変領域を有する、一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ４Ｇ２）、三価分子（ＴＢ４Ｇ２）及び一本鎖ミニ抗体（ＭＡ４Ｇ２）をコードするプラスミドの獲得。
モノクロナール抗体４Ｇ２由来の可変領域を有する、一本鎖抗体断片、多量体タンパク質及び一本鎖ミニ抗体（ＭＡ４Ｇ２）を得るために、Ａｇａｒｗａｌらの方法（Ａｇａｒｗａｌ ＫＬ、Ｂｔｉｃｈｉ Ｈ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｇｕｐｔａ Ｎ、Ｋｈｏｒａｎａ ＨＧ、Ｋｕｍａｓ Ａ、Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ、Ｒａｊｂｈａｎｄａｒｙ ＵＬ、ｖａｎ ｄｅ Ｓａｎｄｅ ＪＨ、Ｓｇａｒａｍｅｌｌａ Ｖ、Ｗｅｂｅｒ Ｈ、Ｙａｍａｄａ Ｔ、「酵母由来のアラニン転移核酸に関する遺伝子の全合成（Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ ａｎ ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ）」、（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ ２２７、２７−３４）を合成のために使用し、ホスホアミダイド化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ、Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ−「新規な一連の鍵がデオキシポリヌクレオチド合成を媒介する（Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、（１９８１）、２２、１８５９）を介して固相で合成したオリゴヌクレオチドから開始し、二本鎖ＤＮＡ分子（配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７）それぞれを制限酵素ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により、製造業者により指定された条件で消化した。各消化分子をその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｅｎｅｌｕｘ，ｂ．ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、製造業者の指定した条件下で、あらかじめ同じ酵素で消化したプラスミドｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に連結した。連結物を大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃｋ ＷＯ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ＪＭ、Ｓｈｏｒｔ ＪＭ．ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ：「βガラクトシダーゼ選択によるｒｅｃＡ大腸菌Ｋ１２株の高性能プラスミド形質転換（Ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｌａｓｍｉｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅｃＡ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ Ｋ１２ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９８７；５：３７６−８）に組み込み、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載された条件に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）、選択培地で成長させて得られたコロニーに存在するプラスミドを、限定解析を使用してスクリーニングした。各形質転換からのいくつかの組換えプラスミドの配列を、自動的サンガーの配列決定によって検証し、各反応に関して予測配列と配列が一致する代表的分子を選択した。これらのプラスミドを、一本鎖抗体断片の発現に関してｐＥＴ−ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨ（図５、配列１８）、多量体化配列の発現に関してｐＥＴＴＢ４Ｇ２ ＬＨ（図６Ａ、配列番号１９）及び抗体４Ｇ２由来の可変領域を担持する一本鎖ミニ抗体の発現に関してｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２ ＬＨ（図６Ｂ、配列番号２０）と命名した。
【０１１８】
これらのプラスミドは、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導を介して、Ｔ７プロモーターの存在下で、前述の合成バンドによりコードされるタンパク質（配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７）の大腸菌における発現に使用でき、それらの未成熟で、プロセシングされていない形態（配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３）のそれぞれにおいて、以下の構成要素をＮ末端からＣ末端の方向に含む：非プロセシングタンパク質ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨに関しては、ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｇ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント；非プロセシングタンパク質ＴＢ４Ｇ２ ＬＨに関しては：ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２８）、ｇ）溶液中で三量体化できる分子プロパティを与えるヒト母系由来の断片（配列番号５１）、ｈ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｅ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント；並びに非プロセシングＭＡ４Ｇ２ ＬＨタンパク質に関しては：ａ）ｐｅｌＢシグナルペプチド、（配列番号２４）、ｂ）Ｎｃｏ Ｉ部位の性質により導入されたアミノ酸Ｍ（メチオニン）及びＡ（アラニン）、ｃ）モノクロナール抗体４Ｇ２の軽鎖の可変領域（配列番号２５）、ｄ）柔軟なスペーサー（リンカー）（配列番号２６）、ｅ）モノクロナール抗体４Ｇ２の重鎖の可変領域（配列番号２７）、ｆ）３個の連続したグリシン（Ｇ）からなる柔軟なスペーサー（リンカー）、ｇ）ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１ヒト免疫グロブリンの定常領域の断片であり、ヒンジのアミノ酸Ｃ（システイン）が変異生成によりＳ（セリン）に変化し、ＣＨ２ドメイン部位の潜在的グリコシル化部位が、Ｎ（アスパラギン）がＱ（グルタミン）に変異することによって除去されている（配列番号５２）、ｈ）クローン化戦略により誘導されたアミノ酸Ｌ（ロイシン）及びＥ（グルタミン酸）、並びにｅ）６個のヒスチジンからなるＣ末端セグメント。
【０１１９】
これらの要素により、リーダーペプチドの切断、大腸菌ペリプラズムへの分泌を介したこれらのタンパク質（ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２）のプロセシングが可能になり、この時一般的酸化条件によりそれらの正確なフォールディング及びジスルフィド架橋の形成が可能になり、さらに固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を使用した精製が容易になる（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．（１９８５）「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）。翻訳後のプロセシング及び分泌の後の、ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２の最終的な配列を、配列番号５３、配列番号５４及び配列番号５５に示す。
【０１２０】
（実施例１１）
ｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２の発現及び精製
プラスミドｐＥＴ−ｓｃＦｖ４Ｇ２ ＬＨ、ｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２ ＬＨ ｙ ｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２から、それぞれｓｃＦｖ ４Ｇ２、ＴＢ４Ｇ２及びＭＡ４Ｇ２を精製するために、以下に記載の方法を使用した：対応するプラスミドをＳａｍｂｒｏｏｋらの指示（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従ってＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株に組み込み（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．及びＢ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ．「クローン化した遺伝子の直接的、選択的高レベル発現のための、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの使用（Ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９．１（１９８６）：１１３−３０）、単離したコロニーを使用し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを添加したルリア−ベルターニ培地（ＬＢＡ）の５０ｍｌ培養液に接種し、３５０ｒ．ｐ．ｍ．において３０℃で１２時間成長させた。この培養液を開始時の６２０ｎｍによる吸光度（ＯＤ６２０）が０．０５である１ＬのＬＢＡ培地に接種し、後期対数増殖期まで２８℃で８時間成長させた。この培養液を、イソプロピルチオガラクシトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘導し、同じ条件下でさらに５時間成長させた。
【０１２１】
上記のように得た培養液を、５０００×ｇにおいて４℃で３０分間遠心分離機にかけ、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．及びＳｔｒｕｈｌ，Ｋ（１９８９）ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して得たバイオマスから、ペリプラズム画分を抽出した。この画分を、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７／２０ｍＭイミダゾールに対して、１００Ｄａカットオフの膜を使用して透析し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ Ｂｅｎｅｌｕｘ Ｂ．Ｖ．、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用した固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ，Ｅ．１９８５、「ＩＭＡＣによるタンパク質の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＩＭＡＣ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３、１−７）によって、製造業者の指示に従って、透析物からタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６を得た。
【０１２２】
（実施例１２）
ＭＡＧ４Ｇ２タンパク質及びＴＢ４Ｇ２タンパク質によるウイルス感染の中和
ＭＡ４Ｇ２ ｙ ＴＢ４Ｇ２キメラタンパク質の生物活性の特徴付けを、ＢＨＫ−２１細胞においてプラーク減少中和試験を使用して実施した（表１０）。この同じアッセイを用いて、キメラタンパク質とＭａｂ ４Ｇ２、そのＦａｂ及びＦａｂ２断片並びにｓｃＦｖ４Ｇ２との生物活性を比較した（表１０）。
【０１２３】
Ｆａｂ及びＦａｂ２断片は、Ｍａｂ ４Ｇ２をパパイン及びペプシンで消化することによって得た。プロテアーゼ消化の後で、Ｆａｂ及びＦａｂ２を、固定化タンパク質Ａを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、Ｆｃ断片から分離した。Ｆａｂ及びＦａｂ２のイソ型を、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。中和力価を、ウイルスプラーク数が５０％減少する分子希釈として規定した。異なる分子の希釈は、試験で等モル濃度を得るために調整した。
【０１２４】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】フラビウイルス属のＥタンパク質の表面残基に対応する保存プロフィールを表した図である。保存はグレースケール値で表され、フラビウイルス属の配列の中でより高い保存を示す残基ほど濃く表される。ドメインＩＩの高度保存表面パッチを丸で囲んである。保存値を、プログラムＣＯＮＳＵＲＦを使用し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで利用可能なそれらのフラビウイルス属配列の多重配列アライメントを考慮して、算出した。保存値は、Ｐｙｍｏｌを使用してタンパク質表面にマッピングした。
【図２】デング熱ウイルス由来のＥタンパク質の表面残基に対応する保存プロフィールを表した図である。保存はグレースケール値で表され、フラビウイルス属の配列の中でより高い保存を示す残基ほど濃く表される。ドメインＩＩの高度保存表面パッチを丸で囲んである。保存値を、プログラムＣＯＮＳＵＲＦを使用し、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースで利用可能な４種のデング熱ウイルス血清型に対応する配列の多重配列アライメントを考慮して、算出した。保存値は、Ｐｙｍｏｌを使用してタンパク質表面にマッピングした。
【図３】キメラタンパク質ＰＭＥＣ１の三次元構造モデルの図である。Ｂは、デング熱２型ウイルスのＥ糖タンパク質のセグメントＬｅｕ２３７−Ｖａｌ２５２であり、ＣはセグメントＬｙｓ６４−Ｔｈｒ１２６である。Ｌは２つの残基からなるリンカーセグメントである。タンパク質の３Ｄモデルは、ＷＨＡＴＩＦプログラムパッケージを使用して得、図形はＰｙｍｏｌを使用して作成した。
【図４】プラスミドｐＥＴ−ｓＰＭＥＣ１の図である。
【図５】プラスミドｐＥＴ−ｓｃＦｖ ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図６Ａ】プラスミドｐＥＴ−ＴＢ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図６Ｂ】プラスミドｐＥＴ−ＭＡ４Ｇ２ ＬＨの図である。
【図７】キメラタンパク質ＰＭＥＣ１−Ｈｉｓ６の物理化学的特徴を示した図である。Ａ：固定化金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製したタンパク質（レーン１）及び還元し、カルバミドメチル化したタンパク質（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動である。Ｂ：タンパク質のＲＰ−Ｃ４逆相クロマトグラフィー分析であり、矢印は主要ピークの位置を示す。Ｃ：逆相クロマトグラフィーにより収集した主要ピークに対応する質量スペクトルである。
【図８】ｍＡｂ ４Ｇ２のＦｖ断片とデング熱２型由来のＥタンパク質とにより形成される複合体の構造を予測するために実施した、分子ドッキング（ＣＬＵＳＰＲＯプログラムを使用）の１３のコンピュータシミュレーションで得られた結果の略図である。カラムは、各シミュレーションで得られた初めの３０の解（クラスタ）の構造的特性をグレースケールで示した。解は、３つの特性を表す。第１のプロパティは、結合に関与するＥタンパク質のドメイン（それぞれドメインＩＩ、Ｉ及びＩＩＩに対応する明るいグレーから濃いグレーまで）を示す。２つの色は、２つのドメインへの同時結合を意味する。Ｌ及びＴは、ドメインＩ及びＩＩＩに接触するリンカーを含むエピトープ又は融合ペプチド（ドメインＩＩの先端）をそれぞれ意味する。第２の特性は、３色で表され、白はビリオンの内面への結合を意味し、グレーはビリオンの側面への結合及び黒はビリオンの外面への結合を意味する。第３の場合は、抗体の結合はビリオンの構造の大きな構造変化に依存しないという、生物学的に関連した仮定である。第３の特性は抗体パラトープに対応し、グレーは結合が抗体のＣＤＲを含むことを意味し（関連する解）、白は結合がＣＤＲを含まないことを示す（関連しない解）。利用可能な実験データと一致する解を、矢印を使用して示した。それらの特性は明るいグレー−黒−グレーの色に対応する。図の上端に位置する初めの２列は、シミュレーションに使用したリガンド及び受容体の規定を示し、シミュレーションに使用したＥタンパク質の結晶構造に対応するＰＤＢファイルの識別子を含む。各シミュレーションに使用したタンパク質−タンパク質ドッキングプログラム（ｄｏｔ又はｚｄｏｃｋ）は各カラムの下に示す。
【図９】デング熱２型ウイルス由来の成熟ビリオンとＦＡｂ ４Ｇ２の１８０コピーとで形成される複合体のモデリングの図である。モデルは、ＦＡｂ４Ｇ２−Ｅタンパク質複合体のあらかじめ予測した構造を、低温電子顕微鏡法により得た成熟ビリオンの構造にドッキングさせることによって得た（１ＴＨＤ）。非対称ユニットに見出されたＥタンパク質の３つの単量体に結合したＦＡｂの重鎖のＣ末端間の距離を算出した。
【図１０】キメラタンパク質ＭＡ４Ｇ２とＥタンパク質二量体とによって形成された複合体のコンピュータモデルの図である。図はプログラムＰｙｍｏｌを使用して得た。
【図１１】ペプチド配列（ＧＧＧＳ）３ＧＧＧに相当する、配座異性体安定性の予測の図である。配座異性体のエネルギーをＮ末端とＣ末端との間の距離の関数として示す。予測は、プログラムＰＲＥＬＵＤＥｗｐ使用して実施した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟ビリオン上に露出していることを特徴とし、フラビウイルス属の間で共有されるエピトープを示し、デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は治療のための広範囲な分子の開発に使用できるトポグラフィー的及び高度保存的領域。
【請求項２】
デング熱ウイルス２型由来のＥタンパク質又は他のフラビウイルス属由来の対応するエピトープの以下の残基：ＡＳＮ６７、ＴＨＲ６９、ＴＨＲ７０、ＳＥＲ７２、ＡＲＧ７３、ＣＹＳ７４、ＬＥＵ８２、ＧＬＵ８４、ＧＬＵ８５、ＡＳＰ８７、ＶＡＬ９７、ＡＲＧ９９、ＧＬＹ１００、ＴＲＰ１０１、ＧＬＹ１０２、ＡＳＮ１０３、ＧＬＹ１０４、ＣＹＳ１０５、ＧＬＹｌ０６、ＭＥＴ１１８、ＨＩＳ２４４、ＬＹＳ２４６、ＬＹＳ２４７、ＧＬＮ２４８、ＶＡＬ２５２により規定される、フラビウイルス属のエンベロープ由来のタンパク質Ｅのエピトープである、請求項１に記載のトポグラフィー的及び高度保存的領域。
【請求項３】
以下のフラビウイルス属：西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、デング熱１型（Ｄｅｎｇｕｅ１）、デング熱２型（Ｄｅｎｇｕｅ２）、デング熱３型（Ｄｅｎｇｕｅ３）、デング熱４型（Ｄｅｎｇｕｅ４）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ Ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、マリーバレーウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴウイルス（ＬＡＮＧＡＴ ｖｉｒｕｓ）、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ Ｉｌｌ Ｖｉｒｕｓ）及びポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）のＥタンパク質の表面上に露出していることを特徴とする、請求項１及び２に記載のトポグラフィー的領域。
【請求項４】
デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は治療に有用であり、請求項１から３までに記載のトポグラフィー的領域に基づき、請求項１に記載の分子により免疫化された個人において、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属と交差反応する中和抗体の応答を誘導する能力を特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項５】
配列番号１４及び２９から５０までの組換えタンパク質又はキメラペプチドである、請求項４に記載の分子。
【請求項６】
一次構造が配列Ａ−Ｂ−Ｌ−Ｃにより規定され、Ａは０から３０個のアミノ酸からなるペプチド配列であり、Ｂはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２断片の配列、或いはデング熱ウイルス１，３，４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列であり、Ｌは安定化リンカーとして作用する３から１０個のアミノ酸からなる配列であり、Ｃはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｙｓ６４〜Ｔｈｒｌ２０断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列である、請求項４に記載のタンパク質分子。
【請求項７】
一次構造が配列Ａ−Ｃ−Ｌ−Ｂにより規定され、Ａは０から３０個のアミノ酸からなるペプチド配列であり、Ｂはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列であり、Ｌは安定化リンカーとして作用する３から１０個のアミノ酸からなる配列であり、Ｃはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｙｓ６４〜Ｔｈｒｌ２０断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列である、請求項４に記載のタンパク質分子。
【請求項８】
Ａが細菌性シグナルペプチドである、請求項６及び７に記載のタンパク質。
【請求項９】
Ａが酵母又は哺乳動物のシグナルペプチドである、請求項６及び７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項４から９までに記載の分子により形成されること、及びＮ末端又はＣ末端の、予防効果又は治療効果を増強させ、並びに／或いはその精製及び／又はその検出を容易にする１つ又は複数のペプチド又はタンパク質断片との融合を特徴とする、合成又は組換えの融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端又はＣ末端の融合相手が、ヘルパーＴ細胞エピトープを含む１つ又は複数のペプチド又はタンパク質断片である、請求項１０に記載の組換え又は合成の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎ末端又はＣ末端の融合相手が、ヒスチジンタグである、請求項１０に記載の組換え又は合成の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項４から１２までに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項４から１２までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、デング熱ウイルス１〜４型と交差反応性である中和抗体又は防御抗体の免疫応答を、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項４から１２までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、他のフラビウイルスと交差反応性である中和抗体及び防御抗体の免疫応答を、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属と交差反応性である、中和抗体及び防御抗体の免疫応答を、請求項４から１２までに記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む生きたベクター又は裸ＤＮＡの使用に基づき、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
抗フラビウイルス抗体の検出用診断薬として有用な、請求項５から１２までに記載の合成又は組換えのタンパク質分子又はペプチド分子。
【請求項１９】
デング熱ウイルス１〜４及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は処置に有用であり、請求項１から３までに記載のトポグラフィー的領域に基づき、ウイルスと前記トポグラフィー的領域との相互作用によるウイルス感染を予防又は弱毒化する能力を特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項２０】
ヒト抗体又は他の種において産生される抗体である、請求項１９に記載の分子。
【請求項２１】
異なるフラビウイルス属に交差反応性であり、ウイルス感染を中和する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
デング熱ウイルス１〜４及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は処置に使用され、前記抗体の組換え又はタンパク質分解断片である、請求項１９から２１までに記載の分子。
【請求項２３】
前記抗体の組換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である、請求項２２に記載の分子。
【請求項２４】
成熟ビリオンに多価結合する分子として会合する能力を、前記分子に授けるタンパク質配列に、スペーサーを伴って又は伴わずに連結していることを特徴とする、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の分子であって、前記分子に連結したタンパク質配列が、スペーサー並びに、ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域（配列番号５５及び５６に指定される配列を有する）を含む分子。
【請求項２６】
請求項２４に記載の分子であって、前記分子に連結したタンパク質配列が、スペーサー及び三量体化ドメイン（配列番号５４に指定された配列を有する）を含む分子。
【請求項２７】
請求項１８から２６までに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１８から２６までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、デング熱ウイルス１〜４型による感染を予防又は弱毒化できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１８から２６までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、他のフラビウイルス属による感染を予防又は弱毒化できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
フラビウイルス属の検出用診断薬として有用な、請求項１８から２６までに記載の合成又は組換えのタンパク質分子又はペプチド分子。
【請求項３２】
フラビウイルス属に対する広範囲の治療用候補として有用な分子であって、該分子が請求項１から３までに記載のタンパク質Ｅの領域又は保存エピトープに接触することを含む方法により特定され、この接触又は結合により、広範囲の治療用候補であることが示される、分子。
【請求項３３】
以下の種類の化合物：タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物質及び小型分子より選択される、請求項３２に記載の分子。
【請求項３４】
前記分子が化合物のライブラリに含まれている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物のライブラリがコンビナトリアル法により作成されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
接触が、インビトロ試験によって測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイを、請求項１９から２４までに記載の分子の、請求項１から３までに記載の保存領域への結合を遮断することによって実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１９から２４までに記載の分子の、請求項４から７までに記載のタンパク質分子への結合を遮断することによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
結合を、インビボアッセイにより測定する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
コンピュータ支援法であり、以下を含む、請求項３２に記載の方法：１）請求項１から３までに記載のタンパク質Ｅの高度保存領域を形成する残基に対応する原子座標であり、タンパク質構造データベースを利用できるか、又はコンピュータ手段によりモデル化されるかもしくは実験的に決定されるもの、２）実験的に決定されたか、又はコンピュータ手段によりモデル化された、分子の原子座標、３）この分子が請求項１から３までに記載の高度保存領域に接触できるかどうかを判定できる分子ドッキングのコンピュータ手法。
【請求項１】
成熟ビリオン上に露出していることを特徴とし、フラビウイルス属の間で共有されるエピトープを示し、デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は治療のための広範囲な分子の開発に使用できるトポグラフィー的及び高度保存的領域。
【請求項２】
デング熱ウイルス２型由来のＥタンパク質又は他のフラビウイルス属由来の対応するエピトープの以下の残基：ＡＳＮ６７、ＴＨＲ６９、ＴＨＲ７０、ＳＥＲ７２、ＡＲＧ７３、ＣＹＳ７４、ＬＥＵ８２、ＧＬＵ８４、ＧＬＵ８５、ＡＳＰ８７、ＶＡＬ９７、ＡＲＧ９９、ＧＬＹ１００、ＴＲＰ１０１、ＧＬＹ１０２、ＡＳＮ１０３、ＧＬＹ１０４、ＣＹＳ１０５、ＧＬＹｌ０６、ＭＥＴ１１８、ＨＩＳ２４４、ＬＹＳ２４６、ＬＹＳ２４７、ＧＬＮ２４８、ＶＡＬ２５２により規定される、フラビウイルス属のエンベロープ由来のタンパク質Ｅのエピトープである、請求項１に記載のトポグラフィー的及び高度保存的領域。
【請求項３】
以下のフラビウイルス属：西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ）、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、デング熱１型（Ｄｅｎｇｕｅ１）、デング熱２型（Ｄｅｎｇｕｅ２）、デング熱３型（Ｄｅｎｇｕｅ３）、デング熱４型（Ｄｅｎｇｕｅ４）、日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、クンジンウイルス（Ｋｕｎｊｉｎ Ｖｉｒｕｓ）、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、マリーバレーウイルス（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ Ｖｉｒｕｓ）、ＬＡＮＧＡＴウイルス（ＬＡＮＧＡＴ ｖｉｒｕｓ）、跳躍病ウイルス（Ｌｏｕｐｉｎｇ Ｉｌｌ Ｖｉｒｕｓ）及びポワッサンウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ ｖｉｒｕｓ）のＥタンパク質の表面上に露出していることを特徴とする、請求項１及び２に記載のトポグラフィー的領域。
【請求項４】
デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は治療に有用であり、請求項１から３までに記載のトポグラフィー的領域に基づき、請求項１に記載の分子により免疫化された個人において、デング熱ウイルスの４種の血清型及び他のフラビウイルス属と交差反応する中和抗体の応答を誘導する能力を特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項５】
配列番号１４及び２９から５０までの組換えタンパク質又はキメラペプチドである、請求項４に記載の分子。
【請求項６】
一次構造が配列Ａ−Ｂ−Ｌ−Ｃにより規定され、Ａは０から３０個のアミノ酸からなるペプチド配列であり、Ｂはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２断片の配列、或いはデング熱ウイルス１，３，４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列であり、Ｌは安定化リンカーとして作用する３から１０個のアミノ酸からなる配列であり、Ｃはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｙｓ６４〜Ｔｈｒｌ２０断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列である、請求項４に記載のタンパク質分子。
【請求項７】
一次構造が配列Ａ−Ｃ−Ｌ−Ｂにより規定され、Ａは０から３０個のアミノ酸からなるペプチド配列であり、Ｂはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｅｕ２３７〜Ｖａｌ２５２断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列であり、Ｌは安定化リンカーとして作用する３から１０個のアミノ酸からなる配列であり、Ｃはデング熱ウイルス２型由来のタンパク質ＥのＬｙｓ６４〜Ｔｈｒｌ２０断片の配列、或いはデング熱ウイルス１、３、４型又は他の任意のフラビウイルス属由来の相同配列である、請求項４に記載のタンパク質分子。
【請求項８】
Ａが細菌性シグナルペプチドである、請求項６及び７に記載のタンパク質。
【請求項９】
Ａが酵母又は哺乳動物のシグナルペプチドである、請求項６及び７に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項４から９までに記載の分子により形成されること、及びＮ末端又はＣ末端の、予防効果又は治療効果を増強させ、並びに／或いはその精製及び／又はその検出を容易にする１つ又は複数のペプチド又はタンパク質断片との融合を特徴とする、合成又は組換えの融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端又はＣ末端の融合相手が、ヘルパーＴ細胞エピトープを含む１つ又は複数のペプチド又はタンパク質断片である、請求項１０に記載の組換え又は合成の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎ末端又はＣ末端の融合相手が、ヒスチジンタグである、請求項１０に記載の組換え又は合成の融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項４から１２までに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項１５】
請求項４から１２までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、デング熱ウイルス１〜４型と交差反応性である中和抗体又は防御抗体の免疫応答を、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
請求項４から１２までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、他のフラビウイルスと交差反応性である中和抗体及び防御抗体の免疫応答を、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１７】
デング熱ウイルス１〜４型及び他のフラビウイルス属と交差反応性である、中和抗体及び防御抗体の免疫応答を、請求項４から１２までに記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む生きたベクター又は裸ＤＮＡの使用に基づき、受入れ生物に誘導できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１８】
抗フラビウイルス抗体の検出用診断薬として有用な、請求項５から１２までに記載の合成又は組換えのタンパク質分子又はペプチド分子。
【請求項１９】
デング熱ウイルス１〜４及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は処置に有用であり、請求項１から３までに記載のトポグラフィー的領域に基づき、ウイルスと前記トポグラフィー的領域との相互作用によるウイルス感染を予防又は弱毒化する能力を特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項２０】
ヒト抗体又は他の種において産生される抗体である、請求項１９に記載の分子。
【請求項２１】
異なるフラビウイルス属に交差反応性であり、ウイルス感染を中和する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
デング熱ウイルス１〜４及び他のフラビウイルス属による感染の予防及び／又は処置に使用され、前記抗体の組換え又はタンパク質分解断片である、請求項１９から２１までに記載の分子。
【請求項２３】
前記抗体の組換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である、請求項２２に記載の分子。
【請求項２４】
成熟ビリオンに多価結合する分子として会合する能力を、前記分子に授けるタンパク質配列に、スペーサーを伴って又は伴わずに連結していることを特徴とする、請求項２３に記載の分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の分子であって、前記分子に連結したタンパク質配列が、スペーサー並びに、ヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域（配列番号５５及び５６に指定される配列を有する）を含む分子。
【請求項２６】
請求項２４に記載の分子であって、前記分子に連結したタンパク質配列が、スペーサー及び三量体化ドメイン（配列番号５４に指定された配列を有する）を含む分子。
【請求項２７】
請求項１８から２６までに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１８から２６までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、デング熱ウイルス１〜４型による感染を予防又は弱毒化できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１８から２６までに記載の１種又は複数種のタンパク質を含み、他のフラビウイルス属による感染を予防又は弱毒化できることを特徴とする医薬組成物。
【請求項３１】
フラビウイルス属の検出用診断薬として有用な、請求項１８から２６までに記載の合成又は組換えのタンパク質分子又はペプチド分子。
【請求項３２】
フラビウイルス属に対する広範囲の治療用候補として有用な分子であって、該分子が請求項１から３までに記載のタンパク質Ｅの領域又は保存エピトープに接触することを含む方法により特定され、この接触又は結合により、広範囲の治療用候補であることが示される、分子。
【請求項３３】
以下の種類の化合物：タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物質及び小型分子より選択される、請求項３２に記載の分子。
【請求項３４】
前記分子が化合物のライブラリに含まれている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物のライブラリがコンビナトリアル法により作成されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
接触が、インビトロ試験によって測定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイを、請求項１９から２４までに記載の分子の、請求項１から３までに記載の保存領域への結合を遮断することによって実施する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１９から２４までに記載の分子の、請求項４から７までに記載のタンパク質分子への結合を遮断することによって実施される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
結合を、インビボアッセイにより測定する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
コンピュータ支援法であり、以下を含む、請求項３２に記載の方法：１）請求項１から３までに記載のタンパク質Ｅの高度保存領域を形成する残基に対応する原子座標であり、タンパク質構造データベースを利用できるか、又はコンピュータ手段によりモデル化されるかもしくは実験的に決定されるもの、２）実験的に決定されたか、又はコンピュータ手段によりモデル化された、分子の原子座標、３）この分子が請求項１から３までに記載の高度保存領域に接触できるかどうかを判定できる分子ドッキングのコンピュータ手法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図１１】
【公表番号】特表２００９−５２４５８１（Ｐ２００９−５２４５８１Ａ）
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４１５７４（Ｐ２００８−５４１５７４）
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／００００１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５９７１５
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００６／００００１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５９７１５
【国際公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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