ナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）機能障害及びその生物学的用途
本発明は、被験者における好ましくない、又は逆に、好ましい癌の予後を評価する方法に関し、その方法が、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常な相対量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常なナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常な相対量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現もしくは活性の存在は、被験者における癌の予後を示している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、遺伝学、免疫学、及び医薬の分野に関する。本発明者らは、特に、被験者において癌の予後を決定するために使用することができるヒト遺伝子の同定、任意の処置前での癌の処置に対する被験者の感受性、又は所定の期間後での癌の処置の有効性を開示する。ヒト遺伝子を、さらに、癌の予防又は処置において、ならびに治療活性薬物のスクリーニングのために使用してよい。
本開示は、より具体的には、特に異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０受容体（ＮＫｐ３０タンパク質）アイソフォームの発現又は活性をもたらす変化したＮＣＲ３又はＮＫｐ３０の遺伝子発現に関与する変化した又は異常な細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）遺伝子に関し、前記の異常な遺伝子、転写物アイソフォーム、及びタンパク質アイソフォームが治療介入のための新規標的を表わす。
【０００２】
背景
癌と効率的に戦うことは、腫瘍細胞を直接標的とする、又は、細胞に対する宿主防衛を高める医薬的化合物に依存する。いくつかの抗癌治療が提示されており、とりわけ特徴的なのは、化学療法［アントラサイクリン、例えばドキシサイクリン（ＤＯＸ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）（本明細書においてＰＬＡＴと呼ぶ）及びシスプラチン（本明細書においてＰＬＡＴと呼ぶ）、ならびにチロシンキナーゼ阻害剤などが腫瘍学者の武器である最も効率的な細胞毒性薬剤であると考えられている］及び放射線療法［Ｘ線（ＸＲ）］であるが、前記処置の利益は依然として不十分な傾向がある。上記治療が抗癌治療の７０%までの基礎を表わすため、処置に対する低下反応に関与する機能障害の検出が、患者管理のために不可欠であるように思われる。
腫瘍の治療耐性という出現する問題は、第一に、腫瘍での処置の有効性、そして、第二に、腫瘍細胞の根絶における免疫宿主系の有効性を考慮する重要性を強調する。本発明者らは、本明細書において、内因性（免疫）腫瘍抑制機構が、癌処置により誘導される外因性腫瘍抑制機構と相乗的に作用すること、及び、免疫反応に関与する遺伝子中の突然変異がこれらの外因性腫瘍抑制機構に影響を与えることを実証する。遺伝子の突然変異及び転写状態は、癌処置に対する臨床反応を予測する新たな因子を構成する。
【０００３】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は、消化管の最もよく見られる間葉性腫瘍である１。ＧＩＳＴは、カハールの間質細胞、腸ペースメーカー細胞の腫瘍性形質転換に起因すると考えられる。ＧＩＳＴの真の発生率は未知のままであるが、しかし、臨床試験からの経験によって米国における１年当たり４５００〜６０００の新症例の発生率が示唆される２。診断時の年齢中央値は約５８歳である。
歴史的には、ＧＩＳＴは、３つの従来の癌治療モダリティーにより標的にされてきた：外科手術、化学療法、及び放射線療法。外科手術は、切除可能な疾患を伴う患者に有効であるが、しかし、疾患は５０%もの個人において再発しうる。化学療法及び放射線療法ではほとんど有効性が示されていない３。大きな進展が、ＧＩＳＴにおけるＫＩＴオンコジーン中の「機能獲得」突然変異の発見と共に１９９８年に起きた４。ＫＩＴは膜貫通ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ（ＣＤ１１７）をコードし、それは、そのリガンドによる結合を介して活性化される場合、細胞内情報伝達プロセスを調節する。突然変異による構成的なチロシンキナーゼの活性化は、無調節な細胞増殖及び悪性形質転換をもたらす。ＧＩＳＴの９０%超が、活性化ＫＩＴ突然変異を持つ５。これらの突然変異は、共通して、症例の５７〜７１%においてエクソン１１（膜近傍ドメイン）、症例の１０〜１８%においてエクソン９（細胞外ドメイン）、症例の１〜４%においてエクソン１３（チロシンキナーゼドメインＩ）、及び症例の１〜４%においてエクソン１７（チロシンキナーゼドメインＩＩ）において起こる１。ＫＩＴ突然変異を欠くＧＩＳＴの約３５%が、関連する受容体チロシンキナーゼ、小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲＡ）をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する６。ＰＤＧＦＲＡ突然変異は、エクソン１２（ＧＩＳＴの１〜２%）、エクソン１８（２〜６%）、及びエクソン１４（＜１%）において同定されている７。ＫＩＴ及びＰＤＧＦＲＡ突然変異の同定は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いた特異的な標的治療の開発を導いた。ＴＫＩイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１、Gleevec-Novartis）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８、Sutent-Pfizer）を用いた治療は、切除不可能な転移性及び再発性疾患に有効である８。イマチニブは、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲＡ、及びＡＢＬを含むいくつかのチロシンキナーゼを選択的に阻害する。第ＩＩ相イマチニブ試験からのデータによって、ＫＩＴの突然変異状態がイマチニブに対する臨床反応を予測する最も重要な因子であることが明らかになった８。イマチニブを受けたエクソン１１ＫＩＴ突然変異体を発現するＧＩＳＴを伴う患者は、実質的により高い部分反応率、より長い生存期間中央値、及び野生型又はエクソン９ＫＩＴ突然変異体を発現するＧＩＳＴを伴う患者よりも進行するより低い可能性を有した。イマチニブは劇的に有効な薬剤であるが、しかし、その利益の持続時間は有限である。第２の標的チロシンキナーゼ阻害剤であるスニチニブマレートは、近年の励みになる結果の後に、イマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のために承認されている９。しかし、前に説明された通り、薬物耐性はますますよく見られる現象である１０。
【０００４】
小児における全ての癌関連死亡の１５%に関与し、神経芽細胞腫は、小児集団に影響を与える、最もよく見られる頭蓋外悪性腫瘍であり、そして２番目に最もよく見られる充実性腫瘍である１１。末梢交感神経系のこの癌は、提示のその二又パターンのために周知である。小児の約半分が、外科手術単独で治癒することができる局在化腫瘍を有する。肝臓、皮膚、リンパ節、又は骨髄を含む疾患を示す年齢１歳未満の小児の小さな部分集合は、それらの疾患の範囲にも関わらず良好な予後を有する。残りの小児は、広範囲にわたる転移性疾患又は非常に大きい、侵襲性の局在化腫瘍を有する。これらの小児は、約３０%の不良な長期生存率を有する。神経芽細胞腫を伴う小児を処置する課題は、低リスク疾患を伴う患者での過剰処置を回避しながら、高リスク患者の生存率を増加させることである。神経芽細胞腫における転帰の標準的な予後指標は、年齢、病期、及び組織病理である。追加の染色体マーカー及び分子マーカーが存在し、リスク群割り当て及び転帰予測の正確性が改善し始めている１２。
【０００５】
抗腫瘍反応の役者の内、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞標的を直ぐに殺し、そしてサイトカイン、例えばＴＮＦα及びＩＦＮγなどを産生する強力な能力によって腫瘍に対する先天的防御を提供する１３。
【０００６】
ＮＫ細胞は、マウスにおいて転移性腫瘍の播種を予防することにより腫瘍増殖を制御する１４。ヒト悪性腫瘍におけるＮＫ細胞の関連性は、Nature Immunolのために書かれた最近のＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅにおいて本発明者らにより考察されている１５。本発明者らにより得られた最近発表されたデータによって、ＧＩＳＴ患者において、ＧＩＳＴ腫瘍が、イマチニブメシレート（ＩＭ）を用いた代表的標準治療の間にＮＫ細胞により制御されうることが確立された。実際に、ＩＭはｃ−ｋｉｔ依存性ＤＣ／ＮＫ細胞クロストークを促進し、マウス及びヒトの両方においてＮＫ細胞のＩＦＮγ産生に導くことができる１６。重要なことには、２ヶ月のＩＭ後でのＮＫ細胞のＩＦＮγ産生が、ＩＭで処置された進行性ＧＩＳＴにおける長期生存の独立予測因子を表した１７。精製ＮＫ細胞でのそのような増強されたＩＦＮγ産生が、成熟ＤＣを用いた短期間のエクスビボでの再刺激後に達成され、「免疫学的レスポンダー」からのＮＫ細胞がＧＩＳＴ発生の間にインビボで予備刺激されていたことを示唆する１８、１９。ヒトの癌に対するそれらの有効な役割に関する進行中の疑問にも関わらず、ＮＫ活性化又はサイトカイン受容体の生理学的連結及び／又は阻害受容体の遮断は、ＮＫ細胞の増殖、輸送、細胞傷害性、ケモカイン及びサイトカインの産生、ならびに血液学的悪性腫瘍及び一部の充実性腫瘍を抑えるために利用することができる樹状細胞誘発をもたらしうる。
【０００７】
ヒトの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、高密度の多型遺伝子により特徴付けられた、染色体領域６ｐ２１．３内に約４メガベースのＤＮＡを包含する２０、２１。クラスＩＩＩ ＭＨＣのテロメア末端は、クラスＩＶ領域と指定されている。なぜなら、それが、炎症機能をコードする遺伝子、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、同種移植炎症因子１（ＡＩＦ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）、リンホトキシン−α ＬＴＡ）及び−β（ＬＴＢ）、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３（ＢＡＴ３）、白血球特異的転写物１（ＬＳＴ１）、ならびに細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３／１Ｃ７／ＣＤ３３７／ＮＫｐ３０）などを含むからである２２（図１を参照のこと）。ＮＣＲ３遺伝子は、いくつかのｍＲＮＡスプライスバリアントに転写され、その大部分が免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面分子に翻訳される２３−２５。ＮＣＲ３遺伝子産物の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を生成することにより、Morettaのグループは、ＮＣＲ３遺伝子産物の細胞分布を定義し、腫瘍細胞及び樹状細胞の殺傷に関与する新規ＮＫ細胞受容体としてＮＫｐ３０を特徴付けることに成功した２６、２７。それは、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＮＫｐ８０も含むいわゆる細胞傷害受容体（ＮＣＲ）の一部である２８。ＮＫ細胞中でのその発現を超えて、ＮＫｐ３０を、ＩＬ−１５刺激された臍帯Ｔリンパ球２９及び子宮内膜上皮細胞３０の表面上に暴露させることができる。しかし、成人の抹消血においては、循環ＮＫｐ３０発現細胞だけがＮＫ細胞である。ＮＫｐ４６とは対照的に、ＮＫｐ３０のマウスオルソログは偽遺伝子（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）において、しかし、Ｍｕｓ ｃａｒｏｌｉではない）であり２５、３１、３２、ＮＫｐ３０の探索のための適したマウスモデルがないことを意味する。しかし、ラットは、ＮＫｐ３０に対するオルソログタンパク質をコードする遺伝子ＮＣＲ３を発現し３３、転写物がマカク（Ｍ． ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において検出される３２。
【０００８】
ヒトＮＫｐ３０は、２つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含む細胞外可変型Ｉｇ様ドメインを伴う１９０のアミノ酸の膜貫通タンパク質である２６。３つの選択的スプライシングは、それらがいずれの特定のエクソン４を利用するかに依存して、３つの異なる細胞内ドメイン（３６、２５、及び１２のアミノ酸を有する）を産生することができる２４。追加の選択的スプライシングは、細胞外ドメインにおける２５ＡＡの欠失を誘導し、可変型Ｉｇ様ドメインの代わりに、予測される定常型Ｉｇ様ドメインの形成に導くことができる２４、３２。ＮＫ細胞の細胞表面での複数の形態のＮＫｐ３０の存在を受けて、ＮＫｐ３０に対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによって、恐らくはグリコシル化における差に、しかし、また、最終的には代替タンパク質コアに対応する約１０kDの広いバンドが明らかになる２６。これらの代替形態のＮＫｐ３０が記載されたが、この観察の機能的関連性はまだ明らかではない。
【０００９】
腫瘍環境におけるＮＫｐ３０の役割に関して、ＮＫｐ３０は、種々の腫瘍（癌腫、神経芽細胞腫、骨髄及びリンパ芽球性白血病を含む）のインビトロでの溶解及びまた種々の細胞株の溶解に関与してきた２６、３４、３５。ＮＫｐ３０は、免疫反応（標的を攻撃する）のエフェクター段階だけでなく、同種免疫の予備刺激段階でも要である。実際に、ＮＫｐ３０は、ＤＣ細胞及びＮＫ細胞の間のクロストークを調節している。本発明者らはマウスにおいてＮＫ細胞活性化を誘発するＤＣの能力を記載した最初であり３６、そして続く研究によってこれらの細胞型の間での双方向性の調節が明確に確立された２７、３７、３８。ＤＣ／ＮＫ比率及びＮＫ細胞側でのＫＩＲ／ＮＫＧ２Ａ発現に依存して、活性化ＮＫ細胞が未熟ＤＣの活性化を弱める又は促進しうる。両方の場合において、ＮＫｐ３０がＮＫ細胞によるＤＣの認識に直接的に関与する。後者の場合において（活性化ＮＫ細胞が未熟ＤＣを活性化する場合）、ＮＫｐ３０誘発がＮＫ細胞によるＴＮＦα及びＩＦＮγの放出を導き、両方のサイトカインがＤＣ成熟プロセスに参加する３９。故に、ＤＣ／ＮＫ細胞のクロストークが、Ｔｈ１分化を調節するために不可欠であるように思われる４０、４１。従って、ＮＫｐ３０誘発は、リンパ節における適応免疫反応のマスターレギュレーターを表わしうる。
【００１０】
最近の試験によって、ヒトのマラリア感染におけるＮＫｐ３０の役割が実証されている４２、４３。結果は、ＮＫｐ３０が、ＮＫ細胞−熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が寄生した赤血球細胞の相互作用に関与することを示唆する４２。この相互作用は、直接的、特異的、及び機能的であり、パーフォリン産生及びグランザイムＢ放出に導く。さらに、関連性が、軽度マラリアとＮＣＲ３プロモーター内に位置付けられる突然変異の間で実証されている（ＮＣＲ３−４１２ Ｇ／Ｃ − ｒｓ２７３６１９１）４３。これは、ＮＫｐ３０における遺伝的変異が熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球に対するヒトＮＫ細胞の反応性の不均一性を説明しうることを示唆する４４。
【００１１】
ＮＫｐ３０が、標的細胞（腫瘍細胞又は樹状細胞）の細胞膜上の硫酸ヘパリン残基を識別しうることが示唆されている４５。しかし、これらの結果は、Warren et al.により批判された４６。Angel Porgadorのグループは、これらの試験において使用された種々のＮＫｐ３０Ｆｃ組換えタンパク質を比較することによりこの論争に決着をつけようと試みた。彼らの知見は、Ｆｃタンパク質上でのグリコシル化がＮＫｐ３０リガンドの認識において重要であることであり、及び、彼らは、硫酸ヘパリンがインビトロアッセイにおいて組換えＮＫｐ３０に結合するとの彼らの最初の知見を確認している４７。Pogge et al.は、白血球抗原−Ｂ−関連転写物３（ＢＡＴ３）が腫瘍細胞により放出され、そしてＮＫｐ３０と会合すると主張している４８。Byrd et al.は、ＮＫｐ３０リガンドが大半の細胞株において細胞内で、恐らくは、初期エンドソームコンパートメントにおいて発現することを実証した４９。
【００１２】
要約すると、強い証拠が、特に腫瘍環境及びインビボモデルにおけるＮＫｐ３０リガンドの厳密な性質に関して欠けている。
【００１３】
要約
本明細書において開示する第１の目的は、被験者において癌の予後を評価する方法にあり、この方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を、被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は、前記被験者における癌の好ましくない予後を示している。
【００１４】
被験者において癌の予後を評価する特定の方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、（相対）量のＮＫＰ３０ ＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質アイソフォーム、特に中間、短い、及び／又は長いＮＫｐ３０アイソフォームを測定することを含み、そのような量は、癌の経過を示しており、前記被験者における癌の予後の評価を可能にする。
【００１５】
本明細書において開示する別の目的は、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を評価する方法にあり、特にインビトロ又はエクスビボで、（相対）量のＮＫＰ３０ ＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質アイソフォーム、特に中間、短い、及び／又は長いＮＫｐ３０アイソフォームを測定することを含み、そのような量は、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を示している。
【００１６】
異常なＮＫｐ３０タンパク質発現は、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）タンパク質アイソフォーム、好ましくは中間ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの結果でありうるが、前記アイソフォームは定常又は可変Ｉｇ様ドメインを有する。
【００１７】
特定の実施態様において、検出量もしくは測定量、発現又は活性を、それぞれ、コントロール条件もしくは参照値もしくは平均値、又はコントロールサンプルにおいて検出又は測定されたものと比較する。
【００１８】
上に記載する方法の特定の実施態様に従い、決定されたアイソフォーム相対量は、短い／中間ＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、短い／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、中間／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、及び短い／中間／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量からなる群よりを選択されうる。
本明細書において提供される結果により明らかにされる通り（実験セクションのパートＢを参照のこと）、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの量の（相対的）増加及び／又はＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの量における減少が、被験者のサンプルにおいて測定され、被験者（本明細書において「プロファイルＢ」として特定される群に含まれる被験者）における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
特に、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対的）増加ならびにＮＫｐ３０の短い及び長いアイソフォームにおける減少は、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
逆に、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対的）減少ならびにＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームにおける増加が、被験者（本明細書において「プロファイルＡ」として特定される群に含まれる被験者）における癌の好ましい予後又は癌の処置に対する被験者のポジティブな反応を示している。
【００１９】
機能的ＮＫｐ３０発現は、典型的には、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルに関連しており、被験者において、参照値又は平均値と比較した場合、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的な発現又は量が減少しており、そしてＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの相対的な発現又は量が増加していることが、本発明者らにより実際に本明細書において実証されている。
特定の実施態様において、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルは、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対）量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対）量よりも低いプロファイルである。
【００２０】
これは、そのような保護的なＮＫｐ３０プロファイルを示す被験者が、異常なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイル、特にＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が、参照値もしくは平均値、又はＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対）量よりも高いプロファイルを示す被験者よりも、癌の致死的進化に対するより高い自然保護の利益を得ることを意味する。
【００２１】
ＮＣＲ３遺伝子及び発現産物における特定の突然変異が本明細書においてさらに記載される。これらの突然変異は、被験者における癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性、又は、被験者において、癌の処置の有効性を評価する方法において使用可能である。前記突然変異を含む対立遺伝子は、治療介入のための新規標的を表す。
【００２２】
一実施態様において、本記載は、このように、被験者において癌の予後を評価する方法を提供し、この方法は、被験者からのサンプルにおいて、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常なＮＫｐ３０の発現アイソフォームプロファイル又は状態、特に異常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物の発現アイソフォームプロファイル又は状態、又は異常なＮＫｐ３０タンパク質のアイソフォーム発現もしくは活性の存在を検出することを含む。
【００２３】
被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）の置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）より選択されるＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３配列の存在の、被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
【００２４】
さらなる実施態様において、本記載は、被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する方法を提供し、この方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）の置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３核酸配列の存在の検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、実験セクションのパートＢにおいて明らかにする通り、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の好ましくないネガティブな反応を示している。
【００２５】
本願は、さらに以下の使用を記載する：
− 被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、（ｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、（ｉｉ）（ａ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム及び／又は（ｉｉｉ）（ａ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写を回復することが可能である化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟に導く化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＮＫ細胞の活性化に導く化合物又は物質；
及び、処置の対応する方法。
【００２６】
この記載は、さらに、上で定義する有効量の化合物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者において癌を処置又は予防する方法を提供する。
好ましい実施態様において、被験者は、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する。
【００２７】
特定の実施態様において、それを必要とする被験者において癌を処置又は予防する方法は、ＮＣＲ３転写（選択的スプライシング）の調節及び／又は特に少なくとも１つの機能的ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性、好ましくはＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの調節、特に活性化を含む。
【００２８】
特に、異常なＮＣＲ３遺伝子、特にＮＣＲ３遺伝子の突然変異した対立遺伝子を持つ被験者を処置する方法（その方法では併用治療を用いることを含む）を本明細書において提供する。被険者は、このように、例えば、遺伝子治療、タンパク質置換治療を通じて、又は、ＮＫｐ３０タンパク質模倣剤、アクチベーター及び／又は阻害剤（上で定義するものなど）の投与を通じて処置してよい。前記方法の少なくとも１つは、例えば、癌治療、例えば、アルキル化剤の投与を意味する化学療法、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の投与を意味する治療、ＰＫＣ阻害剤（例えばＧｏ６９８３など）５０の投与を意味する治療、又は放射線療法などと組み合わせてよい。
【００２９】
癌を予防又は処置するために有用な化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法も記載されている。特定の方法は、試験化合物又は物質が、ＮＣＲ３の発現、又はＮＫｐ３０、好ましくは特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォーム、又は特定のＮＫｐ３０アイソフォームの発現又は活性を調節する能力を決定することを含む。別の特定の方法は、試験化合物又は物質が、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、ＮＫｐ３０のリガンド、好ましくは特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォーム、又は特定のＮＫｐ３０アイソフォームの発現又は活性を模倣、誘導、増加、もしくは刺激する、又は逆に、減少させる能力を決定することを含む。
【００３０】
この記載は、さらに、特定の実施態様において、以下を提供する：
− 特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの（特異的）増幅を可能にする、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする核酸プライマー；
− 特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームと（特異的に）ハイブリダイズする、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする核酸プローブ；
− 特定のアイソフォームのＮＫｐ３０タンパク質に（特異的に）結合する、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする抗体（その派生物及び前記抗体を産生するハイブリドーマを含む）。
【００３１】
この記載は、また、上で定義する、プライマー、プローブ、及び／又は抗体を含むキットを提供する。そのようなキットは、増幅、ハイブリダイゼーション、又は結合反応を実施するための容器もしくはサポート、及び／又は試薬を含みうる。
【００３２】
本発明の特定の局面は、プライマー、プローブ、及び／又は抗体を含む物質の組成物にあり、それらは、可変Ｉｇ様細胞外ドメイン又は定常Ｉｇ様細胞外ドメインを有する短い、中間の、及び長いＮＫｐ３０アイソフォームからなる群より選択される少なくとも１つのアイソフォームを特異的に検出するようにデザインされている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＮＣＲ３遺伝子の局在化及び構造；ＮＣＲ３：ナチュラル細胞傷害誘発受容体３；ＬＳＴ１：白血球特異的転写物１；ＬＴＢ：リンホトキシンβ；ＴＮＦ：腫瘍壊死因子；ＬＴＡ：リンホトキシンα；ＵＴＲ：非翻訳領域；ＳＮＰ：一塩基多型
【図２】ＮＫＰ３０受容体の６つの選択的スプライシング形態
【図３】ＧＩＳＴ患者及び健常ボランティアにおけるＮＫＰ３０アイソフォームの割合の比較（実験セクションのパートＡ）：（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、４１人のＧＩＳＴ患者（Ｐ）と３７人の健常ボランティア（ＨＶ）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアの間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図４】処置の経過中での４人のＧＩＳＴ患者におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの個人内安定性の表示；６つのアイソフォームの割合を、４人のＧＩＳＴ患者におけるＧＬＥＥＶＥＣ［イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）］処置の経過中に比較し、ＮＫＰ３０転写プロファイルの個人内安定性を評価した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。各患者について、括弧中の数字は処置後時間（ヶ月）を表す。
【図５】ＮＫｐ３０転写プロファイルのクラスタリングによるＧＩＳＴ患者と健常ボランティアの識別（実験セクションのパートＡ）；教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは患者（Ｐ）又は健常ボランティア（ＨＶ）を表す。括弧中の数字は、再発までの時間（ヶ月）を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。
【図６】４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアのクラスタリングにより得られたＡ群及びＢ群におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの特性付け（実験セクションのパートＡ）；６つのアイソフォームの割合を、ＧＩＳＴ患者（Ａ）及び健常ボランティア（Ｃ）においてＡ群（好ましいＮＫｐ３０プロファイル）とＢ群（好ましくないＮＫｐ３０プロファイル）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧテールアイソフォームの割合を、ＧＩＳＴ患者（Ｂ）及び健常ボランティア（Ｄ）においてＡ群とＢ群の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図７】３７人の健常ボランティア（ＨＶ）及び４１人のＧＩＳＴ患者（Ｐ）におけるＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群とＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群の間でのＮＫｐ３０表面発現の比較（実験セクションのパートＡ）；ＮＫ細胞を、ＣＤ３−ＡＰＣ（クローンＵＣＨＴ）、ＮＫｐ３０−ＰＥ（クローンＡＦ２９−４Ｄ１２）、ＣＤ５６−ＰＣ５（クローンＮ９０１）を用いて免疫染色した。細胞表面分析を、FACScaliburサイトメーター及びCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を使用したフローサイトメトリーを通じて実施した。
【図８】ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群及びＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群におけるＮＫ細胞（ＮＫｐ３０架橋±ＩＬ−２後）からのＩＦＮｇの産生（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）ＩＦＮｇの産生を、Ａ群及びＢ群における健常ボランティア（ＨＶ）及びＧＩＳＴ患者（Ｐ）の刺激されたＮＫ細胞からの上清におけるＥＬＩＳＡにより評価した。ＮＫ細胞を、ＮＫｐ３０（２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０）の架橋により２０時間刺激した。有意差は、各群内のＨＶとＰの間で検出されなかった。（Ｂ）ＨＶ及びＰを一緒に考慮したＡ群及びＢ群におけるＮＫＰ３０架橋後のＩＦＮｇ産生の表示。（Ｃ）ＩＦＮｇの産生を、２０時間にわたるＮＫｐ３０及びＩＬ−２の架橋によるＨＶ及びＰ（１０００UI/ml）の刺激されたＮＫ細胞からの上清におけるＥＬＩＳＡにより評価した。有意差は、各群内のＨＶとＰの間で検出されなかった。（Ｄ）ＨＶ及びＰを一緒に考慮したＡ群及びＢ群におけるＮＫＰ３０架橋＋ＩＬ−２後のＩＦＮｇ産生の表示。バーは中央値を表す。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊＊：Ｐ＜０．０１
【図９】ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群及びＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群におけるＮＣＲ３＊３５７１及びＮＣＲ３＊３７９０候補突然変異の頻度（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）Ｂ群のＮＫｐ３０転写プロファイルは、非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異に関連する（Ｂにおける１３%対Ａにおける０%）。（Ｂ）Ａ群のＮＫｐ３０転写プロファイルは、ＮＣＲ３遺伝子の３’非翻訳領域に局在化されるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異に関連する（Ａにおける５８%対Ｂにおける３%）。
【図１０】ＮＣＲ３ヌクレオチド配列におけるＮＣＲ３＊３５７１及びＮＣＲ３＊３７９０候補突然変異の局在化；エクソン配列はボールド体である。終止コドン及びポリアデニル化部位がインフレームになっている。ＩＮＴＥＲアイソフォームの転写は、第１のポリアデニル化部位に依存する。ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの転写は、第２のポリアデニル化部位に依存する。非同義のＮＣＲ３＊３５７１突然変異は、ＬＯＮＧアイソフォームの細胞内ドメイン（エクソン４ＩＩＩ）に局在化される。ＮＣＲ３＊３７９０突然変異は、第２のポリアデニル化部位に局在化される。ＮＣＲ３＊３７９０ Ｃ対立遺伝子はポリアデニル化部位を破壊し、ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの転写を遮断する。ＥＣドメイン：細胞外ドメイン；ＴＭドメイン：膜貫通ドメイン；ＩＣドメイン：細胞内ドメイン；３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域。
【図１１】良好な又は不良な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者におけるＮＫＰ３０アイソフォームの割合の比較（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、良好な臨床予後を伴う７人の神経芽細胞腫患者と不良な臨床予後を伴う１２人の神経芽細胞腫患者の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、良好な臨床予後を伴う７人の神経芽細胞腫患者と不良な臨床予後を伴う１２人の神経芽細胞腫患者の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。
【図１２】ＮＫｐ３０転写プロファイルのクラスタリングによる良好な及び不良な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者の識別（実験セクションのパートＡ）；教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは良好な臨床予後（ＧＰ）又は不良な臨床予後（ＢＰ）を伴う神経芽細胞腫患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。
【図１３】１９人の神経芽細胞腫患者のクラスタリングにより得られた１群及び２群におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの特性付け（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、神経芽細胞腫患者において１群（好ましくないＮＫｐ３０プロファイル）と２群（好ましいＮＫｐ３０プロファイル）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、神経芽細胞腫患者において１群と２群の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図１４】ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いたＮＣＲ３遺伝子の選択的スプライシングの調節（実験セクションのパートＡ）；ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォーム）のＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ａ）ＹＴＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、トリコスタチンＡ（１００nM）（ＴＳＡ）と３７℃で４５時間インキュベートした。（Ｂ）ＮＫ９２細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、５−アザシチジン（２μM）（５ＡＺＡ）及びＩＬ−２（５０UI/ml）と３７℃で３６時間インキュベートした。
【図１５】ベクターにおけるＮＫｐ３０エクソン４Ｉ、エクソン４ＩＩ、及びエクソン４ＩＩＩの発現クローニングのスキーム；ＮＫ９２細胞株のＮＣＲ３遺伝子に由来する３つのｃＤＮＡ ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）（エクソン４ＩＩＩ）、ＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）（エクソン４ＩＩ）、及びＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）（エクソン４Ｉ）をｐＩＲＥＳバイシストロニック発現ベクター中にクローニングする。
【図１６】細胞株におけるＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃアイソフォームの発現；Ｊｕｒｋａｔ（Ａ）及びＮＫＬ細胞株（Ｂ）を、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃの種々のアイソフォームをコードするプラスミドｃＤＮＡを用いて、又はＧＦＰと共にトランスフェクトした。Ｇ４１８中での３週間の選択後、細胞株をフローサイトメトリーによりＧＦＰ及びＮＫｐ３０発現について調べた。代表的なドットプロットをＪｕｒｋａｔ（Ａ）及びＮＫＬ（Ｂ）について描写する。
【図１７】Ｇ４１８選択前後でのトランスフェクトされたＮＫＬ細胞株の表現型分析；別々のＮＫｐ３０アイソフォームをコードするｃＤＮＡを用いて安定的にトランスフェクトされたＮＫＬ細胞株上の異なるＮＫ細胞受容体のフローサイトメトリー分析。有意差は観察されなかった。
【図１８】ＮＫｐ３０ｃアイソフォームは、ＮＫｐ３０誘発時にサイトカイン分泌を媒介しない；ＰＭＡ−イオノマイシンを伴う（Ａ）もしくは伴わない（Ｂ）で、固定化したマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０ Ａｂ（クローン２１０８４７、２．５ｕg/ml）又はコントロールＩｇＧ（５ng/mL、０．１μg/mL）を使用し、全て３つのトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ（Ａ）又はＮＫＬ（Ｂ）を架橋した。また、トランスフェクトされたＮＫＬを、未熟ＤＣ（比率ＤＣ：ＮＫＬ １：３）（Ｃ）、又は種々の腫瘍細胞株（比率１：１）（Ｄ）を用いて２４時間刺激した。グラフは３つからの代表的な実験を描写し、上清中のＩＬ−２（Ａ）又はＩＦＮγ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）又はＴＮＦα（Ｃ）分泌レベルをモニターしている。実験を、３つの異なるＤＣドナー（Ｃ）を使用して、３回（Ａ、Ｂ、Ｄ）及び５回実施し、同一の結果を得た。＊ｐ＜０．０５
【図１９】ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）アイソフォームは、ＮＫＬの脱顆粒を選択的に誘導する；７時間のＮＫｐ３０架橋後での全ての３つのＮＫＬトランスフェクタント上でのＣＤ１０７ａ発現を示す（Ａ）。抗ＮＫｐ３０ ｍＡｂ（Ｂ）又はＫ５６２（Ｃ）でコーティングされたＰ８１５に対する３つのＮＫｐ３０トランスフェクトされたＮＫＬ細胞傷害を、標準的な４時間クロム放出アッセイにおいて実施した。実験を、種々のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率（５０：１、２５：１、１２．５：１、５：１）（Ｃ）及び５０：１（Ｂ）で３重で行った。３つからの代表的な実験を描写する。＊ｐ＜０．０５
【図２０】８０人のＧＩＳＴ患者のコホートにおけるＮＫｐ３０アイソフォームの発現；（Ａ）ＧＩＳＴのコホートにおける３つの別々のアイソフォームに基づくＮＫｐ３０プロファイルのクラスタリング。３つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合に基づくＮＫｐ３０プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ（β２ミクログロブリンで標準化）により実施し、ＮＫｐ３０プロファイルの教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン中央相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。（Ｂ）ＧＩＳＴとＨＶの間でのＮＫｐ３０の各アイソフォームの異なる割合。８０人のＧＩＳＴについて（Ａ）において提示されるデータを、２群（プロファイルＡ対プロファイルＢ ＧＩＳＴ）における別々のアイソフォームの割合としてグラフ中に描写し、そしてｎ＝５６のＨＶのコホートを用いて得られた結果と比較する。（Ｃ）プロファイルＡとＢは、フローサイトメトリーにおいて検出されたＮＫｐ３０発現において差がない。新鮮なＮＫ細胞を、ＩＭ治療中にＮＫｐ３０アイソフォームの転写分析の時点で調べた。２群間に有意差を見いだすことはできなかった。＊ｐ＜０．０５． ｎｓ：非有意
【図２１】バルクＰＢＭＣ及び精製ＮＫ細胞において得られたＮＫｐ３０の転写プロファイリングの比較。ＮＫｐ３０の各々の個々のスプライスバリアントの相対発現のＲＴ−ＰＣＲにおける決定を、プロファイルＡ（Ａ）を伴う１１のＧＩＳＴ及びプロファイルＢ（Ｂ）を伴う９のＧＩＳＴで、図２０Ａ及び２０Ｂに記載される手順に従い、フィコール後のＰＢＭＣ又は精製ＮＫ細胞から抽出されたｃＤＮＡから開始して実施した。有意差（ｎｓ）は、ＰＢＭＣ及びＮＫからのＮＫｐ３０プロファイルの間で観察されなかった。
【図２２】プロファイルＢの個人が、プロファイルＡホモログと比較し、ＮＫｐ３０依存的な機能的欠損を示す。（Ａ）ＧＩＳＴと一致されたＨＶの間での３つの別々のアイソフォームに基づくＮＫｐ３０プロファイルのクラスタリング。図２０ａと同一の設定であるが、しかし、ＨＶ由来のＮＫ細胞からのＮＫｐ３０を、５６の性別、年齢、及び地理を一致させたＨＶにおいて調べた。（Ｂ−Ｃ）プロファイルＢは、個人の全コホートにおけるＮＫｐ３０依存的なＴＮＦα産生の欠損に関連する。ｎ＝５６のＨＶ及びｎ＝８０のＧＩＳＴからの循環ＮＫ細胞でのＮＫｐ３０の架橋は、２４時間目にＥＬＩＳＡにおいて測定されたサイトカイン産生をもたらした。ＴＮＦα放出を、教師なしの階層的クラスタリングに従い、プロファイルＡ又はＢに分類される個人（（Ｂ）におけるＧＩＳＴ＋ＨＶ、（Ｃ）におけるＧＩＳＴ）の間で比較した（図２０Ａ）。（Ｄ）プロファイルＢは、ＮＫｐ３０依存的なＮＫ細胞の脱顆粒における欠損を示す。（Ｂ−Ｃ）と同一であるが、しかし、ＣＤ１０７ａ発現を、固定化された抗ＮＫｐ３０及び１０００IU/mlのｒｈＩＬ−２の存在において分析した。全ての実験を３重で実施し、２回は、２つの異なる時点での個人の大半についてであった。 ＊ｐ＜０．０５． ｎｓ：非有意
【図２３】ＮＫｐ３０アイソフォームがＧＩＳＴ患者の生存を決定する。（Ａ）プロファイルＡ（ｎ＝４４）対Ｂ（ｎ＝３６）のＧＩＳＴ患者における最初のイマチニブメシレート（ＩＭ）処置からの全生存。カプラン・マイアー方法を使用した単変量解析において、プロファイルＢの患者（図２０Ａにおいて定義される）が、劣った全生存を有することが見出された（生存の中央値：プロファイルＢにおける８０ヶ月対プロファイルＡにおいて中央値に達せず、ログランク検定：ｐ＝０．００１）。コックス回帰分析において、プロファイルＢのＧＩＳＴが、１３．１に等しい死の相対リスクを有した（９５% ＣＩ［４．９−３６．１］、ｐ＝０．０１）。（Ｂ）フローサイトメトリーにおけるＮＫｐ３０膜発現の機能としての全生存。転写プロファイルの決定時の循環ＮＫ細胞での（Ａ）と同様であるが、しかし、＜５６%（ｎ＝２６）又は＞及び５６%に等しい（ｎ＝２７）ＮＫｐ３０表面発現を提示するＧＩＳＴを考慮した分析（図２０Ａ）。ＮＫｐ３０表面発現の閾値（５６%）を、８０人のＧＩＳＴ患者の中央値として定義した（図２０Ｃ）。
【図２４】ＮＣＲ３＊ ３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰは、プロファイルＢ及び「一遺伝子性」チロシンキナーゼ駆動性の悪性腫瘍に関連する。（Ａ）プロファイルＡ及びＢの個人におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。材料及び方法において記載する手順に従った、図２０Ａにおいて詳述するＧＩＳＴコホート及び図２０Ｂ及び図２１Ａにおいて詳述するＨＶの患者の遺伝子型決定。（Ｂ）ＡＭＬのＦＬＴ３突然変異状態に従った、ＡＭＬを持つ患者におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。腫瘍の突然変異状態を、前に記載された通りに決定した５１。（Ｃ）ＧＩＳＴのＫＩＴ突然変異状態に従った、ＧＩＳＴを持つ患者におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。腫瘍の突然変異状態を、前に記載された通りに決定した５２。腫瘍の突然変異状態は、図２０に記載するＧＩＳＴのコホートにおける３２．５%の症例において未決定のままであった。
【００３４】
定義
種々の実施態様の概説を容易にするために、以下の用語の説明を提供する：
【００３５】
本明細書で使用する「癌」という用語は、任意の型の悪性腫瘍（一次又は転移）を指す。
典型的な癌は、Ｘ線、アントラサイクリン、シスプラチン、及び／又はオキサリプラチン感受性の癌、例えば乳癌、胃癌、肉腫（特に胃腸間質性腫瘍又はＧＩＳＴ）、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、直腸癌、結腸癌、肺癌、ＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形性膠芽腫）、リンパ腫、白血病（急性及び慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ及びＣＭＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ））、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液疾患などである。別の典型的な癌は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に感受性の癌、例えば胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）などである。
【００３６】
「処置に対する感受性」という用語は、処置に対する被験者の反応のレベルを指し、限定はされないが、個人における治療用化合物又は物質を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、薬物動態（吸収、分布、排泄）、及び薬物の薬力学（受容体関連）を含む。この処置は、化学療法、例えば、アルキル化剤又はアントラサイクリン、例えばドキシサイクリン（ＤＯＸ）、オキサリプラチン、もしくはシスプラチンなどの投与を含む化学療法；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を意味する治療でよい；及び／又は、処置は、例えばガンマ線又はＸ線（ＸＲ）を使用した放射線療法でよい。
【００３７】
本明細書で使用する「癌の予後」という用語は、疾患の経過、換言すると、疾患の推定される致死的な又はポジティブな健康転帰の評価からなる方法を指す。
典型的には、癌を発生する増加リスクを有する被験者が、ＮＫｐ３０アイソフォームの異常な状態又はプロファイルを有し、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの参照値もしくは平均値、又は（相対）量よりも相対的に高い。
【００３８】
検査されるサンプルは、核酸及び／又はポリペプチドを含む。そのようなサンプルの例は、液体、組織、細胞サンプル、器官、生検などを含む。
回収されたサンプルの性質は、特定の型の癌に必ずしも相関しない。回収された組織は、実際に、癌組織（好ましくは、パラフィン包埋よりむしろ凍結）又は健常組織（例えば、血液、皮膚、間質）でよい。
組織は、選択された癌組織から回収してよい。
サンプルは、また、例えば、血液、血漿、及び骨髄より選択された組織から、任意の異常な又は疾患状態の前記組織とは無関係に、得てよい。
好ましくは、サンプルは、ＮＫｐ３０を発現することが公知である細胞、例えば臍帯Ｔリンパ球及び子宮内膜上皮細胞、好ましくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、特定のＮＫ細胞などを含む。
特定の実施例において、アッセイを、小児腫瘍、例えば神経芽細胞腫及びＧＩＳＴより選択される癌に苦しむ被験者で実施する場合、血液（特にＰＢＭＣの集団を含むサンプル）、間質、皮膚、又は腫瘍組織のサンプルが提供されうる。
【００３９】
本発明を種々の被険者における、例えば、動物、特に哺乳動物、好ましくはヒト（成人、小児、及び胎児期を含む）において使用してよい。
「被験者」という用語は、一般的に、癌に苦しむ患者、又は癌を発症しうる被験者を指す。
【００４０】
被験者は、また、潜在的な骨髄ドナーである被験者でありうる。本発明を使用し、ドナー被験者が正常なＮＫｐ３０発現、特に正常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム状態もしくはプロファイル、又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現もしくは活性を有するか否かを決定してよい。
被験者は、さらに、同種骨髄移植のための候補者でありうる。
【００４１】
「異常」という用語は、本明細書において、正常な特徴からの逸脱である。正常な特徴が、集団のためのコントロール、標準などにおいて見出すことができる。例えば、異常状態が疾患状態、例えば癌などである場合、正常な特徴の２、３の適切な供給源は、癌を患っていない個人、癌を患っていないと考えられる個人の標準集団などを含みうる。
癌に苦しんでいるが、しかし、当業者に公知の好ましい臨床基準（個人の年齢、癌の病期、及び／又は癌の組織病理の病期など）に基づき好ましい予後を有すると考えられる個人の集団は、特定の実施態様において、コントロール集団又は参照集団と考えられうる。
「異常な」という用語は、通常、疾患に関連する状態を指す。例えば、特定の異常（ＮＣＲ３核酸又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現もしくは活性における異常など）が、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する耐性に関連すると記載することができる。
典型的には、「異常な」という用語をＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルを参照して使用してよく、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの参照値もしくは平均値、又は相対量よりも高い。ＮＫｐ３０中間アイソフォームの異常（相対）量は、例えば、可変細胞外ドメインを伴う長い、短い、及び中間のアイソフォーム含む全アイソフォーム量の好ましくは約１５%、好ましくは２０%、さらにより好ましくは１９%を超える量である。長いアイソフォームの対応するパーセンテージは、約２０%、好ましくは約１５%よりも劣り、短いアイソフォームの対応するパーセンテージは、短いアイソフォームについての約８０%、好ましくは７７%、さらにより好ましくは７０%よりも劣る。
【００４２】
異常な核酸、例えば異常なＮＣＲ３核酸などは、ある様式で、正常な（野性型）核酸とは異なる核酸である。そのような異常は、必ずしも限定されないが、コントロール又は標準と比較し、核酸における突然変異［例えば点突然変異など（例、一塩基多型、別名ＳＮＰ）又は２、３から数個のヌクレオチドの短い欠失、挿入又は重複など］を含む。これらの型の異常が、同じ核酸中に、又は同じ細胞もしくはサンプル中に共存することができることが理解されるであろう。また、核酸中の異常が、対応するタンパク質の発現において異常を起こしうることが理解される。
【００４３】
ＮＫｐ３０タンパク質は、本明細書において、ＮＣＲ３遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。
前に説明した通り、ＮＣＲ３遺伝子は、６つの異なるタンパク質（それぞれＮＫｐ３０Ａ、ＮＫｐ３０Ｂ、ＮＫｐ３０Ｃ、ＮＫｐ３０Ｄ、ＮＫｐ３０Ｅ、及びＮＫｐ３０Ｆと名付けられる）をコードする６つの異なる選択的スプライシング形態を提示する（図２）２４。アイソフォームの３つが、潜在的な可変Ｉｇ型又はＩｇ様ドメインをコードし、他の３つが潜在的な定常Ｉｇ型又はＩｇ様ドメイン（部分欠失させた可変Ｉｇ型ドメイン）をコードする。これらの２つの異なる細胞外ドメインを、いずれのエクソン４（図１）が発現されるかに依存して、３６のアミノ酸（「長いテール（tail）」ドメイン）、２５のアミノ酸（「中間テール」ドメイン）、及び１２のアミノ酸（「短いテール」ドメイン）の３つの異なる細胞内ドメインに連結することができる２４。
【００４４】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームは、このように、タンパク質アイソフォームであり、その配列、配置、成熟、又は発現は正常な野生型タンパク質アイソフォームとは異なる。好ましくは、異常タンパク質アイソフォームは機能的ではない、又は部分的にだけ機能的である。
この用語は、好ましくは、少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を含むが、しかし、また、例えば、正常なＮＫｐ３０タンパク質をコードするｍＲＮＡの異常転写に起因する、少なくとも１つの正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常発現を包含する（そのような異常転写は、例えば、異常な選択的スプライシングにより、癌処置により、及び／又は癌自体により誘導され得、コントロール又は標準のレベル又は量と比較して、減少されうる、又は逆に、増加されうる）。同様に、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性レベルは、少なくとも１つの正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常発現、又は、少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を反映しうる。
【００４５】
ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性、例えば異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現は、コントロール又は標準と比較した場合、ある様式で、以下でさらに説明する正常な（野生型）状況におけるタンパク質の発現又は活性とは異なる発現又は活性を指す。
それは、特に、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、恐らくは、ＮＣＲ３によりコードされる６つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの２つ、３つ、４つ、５つの又は全てのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの被験者における発現又は活性を指し、コントロール又は標準と比較した場合、ある様式で、正常な（野生型）状況におけるタンパク質の発現又は活性とは異なる。
【００４６】
異常の決定のための、サンプルとの比較に適切なコントロール又は標準は、正常であると考えられる（例えば、健常被験者のサンプル）又は癌を患っているが、しかし、前に説明された好ましい臨床基準、ならびに、恐らくは任意のセット（そのような値が検査室から検査室で変動しうることを念頭に置く）であるとしても、検査値から良い結果を得ている患者の集団に対応するサンプルを含む。
検査室の標準及び値は、公知の又は決定された集団値に基づいて設定してよいが、測定された、実験的に決定された値の容易な比較を可能にするグラフ又は表のフォーマットにおいて提供してよい。
【００４７】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームという用語は、必ずしも限定されないが、以下を含む：（１）１つ又は複数のアミノ酸残基が異なるようタンパク質の配列における潜在的な変異又は突然変異；（２）タンパク質の配列に対する１つ又は２、３のアミノ酸残基の短い欠失又は付加；（３）全タンパク質ドメイン又はサブドメインが除去又は付加されるような、アミノ酸残基のより長い欠失又は付加；（４）コントロール又は標準の量と比較し、減少した、又は逆に、増加した量の機能的なタンパク質アイソフォームの発現；（５）タンパク質アイソフォームの細胞局在又は標的化の変化；（６）時間的に調節されたタンパク質アイソフォームの発現の変化（タンパク質が、それが正常ではない場合に発現し、あるいは、それが正常である場合に発現しないようにする）；及び（７）各々をコントロール又は標準と比較し、局在化した（例、器官又は組織特異的）タンパク質アイソフォームの発現の変化（タンパク質が、それが正常に発現する場合に発現せず、又は、それが正常に発現しない場合に発現するように）。
【００４８】
「ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性」という用語は、その天然のリガンドの１つに対するＮＫｐ３０の任意の直接的結合、ＮＫｐ３０により媒介される又は好まれる任意の間接的結合、ならび顕著にはＮＫｐ３０経路の下流エフェクター、例えばＣＤ３ζ、ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、ＦｃＲγなどにおける直接的又は間接的な結合の効果を包含する。
【００４９】
本願において使用される通り、「ＮＣＲ３遺伝子」という用語は、ＴＮＦ遺伝子、ならびにそのバリアント、アナログ、及びフラグメント（癌に対する感受性に関連するその対立遺伝子（例、生殖細胞系列突然変異）を含む）に近接する、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩＩ領域中のヒト染色体６ｐ２１．３上のナチュラル細胞傷害誘発受容体３を指す。ＮＣＲ３遺伝子は、また、ＮＫｐ３０遺伝子と呼んでよい。
【００５０】
組換え核酸を、化学合成、遺伝子操作、酵素技術、又はその組み合わせを含む、従来技術により調製してよい。適したＮＣＲ３遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＮＣＢＩ（参照アセンブリー： ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８７４０−３１６６４６５０）；ＲｅｆＳｅｑ ＤＮＡ： ＮＭ １４７１３０；ＧｅｎｅＩＤ：２５９１９７）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００２０４４７５）などで見出されうる。対応するポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンク中の参照ＮＰ＿６６７３４１．１（ＲｅｆＳｅｑペプチド）の下で見いだされる。
【００５１】
「ＮＣＲ３遺伝子」という用語は、配列番号：１ ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）又は上で特定した任意のコード配列の任意のバリアント、フラグメント、又はアナログを含む。
【００５２】
ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドの特定の例は、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４５［“短いテール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号２］、Ｖｅｇａ ペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４６［“中間テール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号３］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４４［“長いテール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号４］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：無し［“短いテール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号５］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４７［“中間テール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号６］、及びＶｅｇａペプチドＩＤ：無し［“長いテール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号７］からなる群より選択されるペプチドの全て又は部分を含む。
【００５３】
多型は、例えば、変異が存在するヌクレオチド位置により、ヌクレオチド変異により起こされるアミノ酸における変化により、又は変異に関連づけられる核酸分子の何らかの他の特徴における変化（例、二次構造、例えばステム−ループなどの変化、又は、関連分子、例えばポリメラーゼ、ＲＮａｓｅなどについての核酸の結合親和性の変化）により言及することができる。例として、ＮＣＲ３遺伝子の領域において本明細書で開示する多型は、ＮＣＲ３遺伝子におけるその位置により［例、バリアント残基３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ： ｒｓ３１７９００３）又は３７９０ Ｔ／Ｃ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ： ｒｓ９８６４７５）の数値位置に基づく］（ＮＫｐ３０ポリペプチドにおけるバリアントアミノ酸の数値位置に基づく）、それがＮＣＲ３ ｍＲＮＡの二次構造に有する効果により、又は、それがＮＫｐ３０ポリペプチドの三次構造に有する効果（例、リガンド、例えば硫酸ヘパリン及びＢＡＴ３などのポリペプチドの結合親和性の変化）により言及することができる。
【００５４】
検出／診断
上記の観察を使用して、本発明者らは、本明細書において、被験者におけるＮＣＲ３遺伝子座の分析及び／又は被験者におけるＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォームのモニタリングに基づく方法を提供する。
本発明の関連内で、「診断」という用語は、上で定義する被験者における、種々の病期（早期の発症前段階及び後期を含む）での検出、投薬、比較などを含む。診断は、典型的には、最も適切な処置（薬理遺伝学）などを定義するための被験者の予後及び特性付けを含む。
【００５５】
本明細書において記載する一般的な目的は、被験者において癌の予後を評価する方法にあり、この方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現もしくは活性の存在は前記被験者における癌の好ましくない予後を示している。
【００５６】
本明細書において記載する別の一般的な目的は、癌、例えば小児腫瘍など、特に神経芽細胞腫の処置に対する被験者の感受性を評価する方法にあり、その方法が、インビトロ又はエクスビボで、（ｉ）突然変異したＮＣＲ３核酸、（ｉｉ）異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は前記処置に対する耐性を示している。被験者において癌の処置の有効性を評価する方法の検出工程は、理想的には、前記処置の前、間、及び／又は後に実施される。
【００５７】
本明細書において記載するさらなる一般的な目的は、被験者における癌、例えばＧＩＳＴなどの処置の有効性を評価する方法にあり、その方法が、前記処置の前、間、及び／又は後に、（ｉ）突然変異したＮＣＲ３核酸、（ｉｉ）異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は前記処置に対する耐性を示している。
【００５８】
さらなる目的は、被験者からのサンプルを提供する第１工程を含む、上に記載する方法である。
【００５９】
本発明に従い、被験者の感受性を評価することができる処置は、好ましくは、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、例えばＤＯＸ（ドキソルビシン、イダルビシン、４エピルビシン、ミトキサントロン）、オキサリプラチン及びシスプラチン（ＰＬＡＴ）などの投与を含む化学療法；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）又はスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を含む治療；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の投与を含む治療；及び、例えばＸ線（ＸＲ）を意味する放射線療法の少なくとも１つより選択される。
【００６０】
診断方法は、上記の処置又は薬物に対する感受性もしくは反応、又は処置もしくは薬物に対する副作用を分析及び予測し、被験者を特定の処置薬を用いて処置すべきか否かを決定するために使用してよい。例えば、この方法が、被験者、特に正常なＮＫｐ３０アイソフォーム発現プロファイル、特に正常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームプロファイルを伴う被験者が、ＴＫＩ、ＦＴＩ、及び／又はアントラサイクリン、ＰＬＡＴ及び／又はＸＲに対してポジティブに反応する可能性を示す場合、前記処置を個人に施してよい。逆に、この方法が、個人又は被験者、特に異常なＮＫｐ３０アイソフォーム発現プロファイルを伴う被験者が、前記処置に対してネガティブに反応する可能性が高い場合、代替方向の処置を処方してよい。
【００６１】
ネガティブな反応は、効果的な反応の非存在又は有毒な副作用の存在と定義してよい。これは、この処置が、癌を予防又は処置するために非効率的であるように思われることを意味する。換言すると、処置を必要とする被験者、又は癌自体が、前記処置に対して耐性であると思われる。不良な反応は、野生型ＮＣＲ３を持つ又は機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームを発現する患者において観察される反応よりも有意に劣る反応である。
【００６２】
突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は、耐性、即ち、癌の処置に対する被験者のネガティブな又は不良な反応を示しており、又は、前に説明した通り、有毒な副作用の存在を示している。
【００６３】
ＮＣＲ３突然変異は、ＮＣＲ３ゲノム配列において又はＲＮＡにおいて決定されうる。
【００６４】
検出された突然変異は、先天的な又は獲得された突然変異でありうる。
【００６５】
ＮＣＲ３遺伝子座における突然変異は、単独で又は種々の組み合わせで、遺伝子座のコード及び／又は非コード領域中の任意の形態の突然変異、欠失、再配列、及び／又は挿入でありうる。突然変異は、より具体的には、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコード又は非コード部分において１、２又はそれ以上の残基の任意の領域、例えば１つの残基から全遺伝子又は遺伝子座までを包含しうる。例えば約２０未満の連続塩基対のドメイン（イントロン）又は反復配列又はフラグメントなどの典型的な欠失は、より小さな領域に影響を与えるが、より大きな欠失も起こりうる。挿入は、遺伝子座のコード又は非コード部分における１つ又は数個の残基の付加を包含しうる。挿入は、典型的には、遺伝子座における１〜２０の塩基対の付加を含みうる。再配列は配列の逆位を含む。ＮＣＲ３遺伝子座の突然変異は、終止コドン、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡのスプライシング又はプロセシング、産物の不安定性、切断ポリペプチドの産生などをもたらしうる。この変化は、機能、安定性、標的化、又は構造が変化した、少なくとも１、恐らくは２、３、４、５、又は６つのＮＫｐ３０スプライシングバリアント（又はスプライシング形態）の産生をもたらしうる。この変化は、また、タンパク質アイソフォーム発現における減少、又は、代わりに前記産生の増加を起こしうる。
【００６６】
本発明に従った方法の特定の実施態様において、ＮＣＲ３遺伝子における変化は、ＮＣＲ３遺伝子又は対応する発現産物における点突然変異、欠失及び挿入、より好ましくは点突然変異、さらにより好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）より選択される。
【００６７】
本発明は、特に、突然変異したＮＣＲ３ヒト核酸配列を開示する。
突然変異したＮＣＲ３ヒト核酸配列の特定の例は、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１），（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ：ｒｓ３１７９００３）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）、及び、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１），（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ：ｒｓ９８６４７５）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰより選択されるＳＮＰを含む。
【００６８】
被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）より選択されるＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３配列の存在の被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
【００６９】
さらなる実施態様において、本記載は、被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法を提供し、この方法は、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０ （３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３核酸配列の存在の被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の好ましくない又はネガティブな反応を示している。
【００７０】
本明細書において記載する方法は、さらに、その目的が、被験者が多型についてホモ接合性又はヘテロ接合性であるかを決定することである工程を含みうる。
【００７１】
本発明の方法において、ＮＣＲ３遺伝子における任意の突然変異又は変化は、他のマーカー、例えば他の任意の遺伝子又はタンパク質における他の突然変異又は変化などとの組み合わせで評価してよい。
【００７２】
サンプル中での突然変異したＮＣＲ３核酸の存在は、サンプルの遺伝子型決定を通じて検出することができる。検出は、ＮＣＲ３遺伝子の全て又は部分の選択的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅を使用し、ＮＣＲ３遺伝子の全て又は部分のシークエンシングにより実施することができる。より好ましくは、ＮＣＲ３遺伝子の特異的増幅は、突然変異の特定工程の前に行う。
本明細書において記載する特定の実施態様において、突然変異したＮＣＲ３核酸の存在を、制限酵素消化、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーション（特に、核酸プローブ、例えば、浮遊状態の又は核酸アレイ上に存在する核酸プローブを用いて）、及び／又は選択的増幅を使用することにより検出する。
特定の実施態様は、被験者のＮＣＲ３遺伝子配列における少なくとも１つのＳＮＰの存在の検出を含む。
【００７３】
特定の実施態様において、本明細書において記載する方法は、異常なＮＣＲ３ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。異常なＮＣＲ３発現は、突然変異したＲＮＡ配列の存在、異常なＲＮＡスプライシング又はプロセシングの存在、異常量のＲＮＡの存在などを含む。これらは、例えば、制限酵素消化、ＮＣＲ３ ＲＮＡの全て又は部分のシークエンシング、前記ＲＮＡ又は対応する合成ｃＤＮＡの全て又は部分の選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅を含む、当技術分野において公知の種々の技術により検出されうる。
異常なＲＮＡスプライシングは、図２及び１５に現れるスプライシング形態より選択される１つ又は複数の特定のスプライシングバリアント（又は、本明細書において「スプライシング形態」もしくは「ＲＮＡ転写物アイソフォーム」と呼ぶ）のＮＫｐ３０をコードする異常量のＲＮＡの転写を誘導することができ、及び／又は、本明細書において定義する異常な形態の前記バリアントの少なくとも１つ、恐らくは、前記バリアント又はＲＮＡ転写物アイソフォームの２、３、４、５、又は全ての転写を誘導することができる。
【００７４】
本明細書において記載する方法は、被験者のサンプルにおいて、以下：
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン、中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン、及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
の相対量を測定及び比較することによる、
又は、各量の特定のアイソフォーム又は各相対量の少なくとも２つの、好ましくは３つの別々のアイソフォームを、コントロール値、参照値、又は平均相対値と比較することによる、ＮＫｐ３０タンパク質発現又は活性を決定する工程を含みうる。
【００７５】
特に、コントロール相対値と比較し、増加（相対）量のＮＫｐ３０の中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物及び減少（相対）量のＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物及び／又は短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物は、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する耐性を示している。
【００７６】
さらなる実施態様において、この方法は、少なくとも１つのＮＫｐ３０ポリペプチド又はタンパク質アイソフォームの異常発現の存在を検出することを含む。異常発現は、突然変異したポリペプチドアイソフォーム配列の存在、異常（相対）量のＮＫｐ３０ポリペプチド又はタンパク質アイソフォームの存在、異常な組織分布の存在などを指す。
これらは、例えば、増幅及び／又は特異的リガンド（例えば抗体など）に対する結合を含む、当技術分野において公知の種々の技術により検出されうる。
他の適した方法を使用し、異常なＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ発現又は配列を検出又は定量化してよい。それらは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット（ＤＮＡについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡについて）、一本鎖高次構造分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動、ヘテロデュプレックス分析、ＲＮａｓｅ保護、化学的ミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００７７】
前に説明した通り、特定の実施態様において、この方法は、被験者からのサンプルにおける異常なＮＣＲ３核酸の存在を検出又は決定することを含む。これは、前に説明した通り、前記サンプル中に存在する核酸の制限酵素消化、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーション、及び／又は選択的増幅を使用することにより達成することができる。
【００７８】
制限酵素消化は、当技術分野において周知の技術及び酵素を使用して行うことができる。
【００７９】
シークエンシングは、自動シーケンサーを使用し、当技術分野において周知の技術を使用して行うことができる。シークエンシングは、完全なＮＣＲ３遺伝子又は、より好ましくは、その特定のドメイン、典型的には、有害な突然変異又は他の変化を持つことが公知である又は疑われるもので実施してよい。
【００８０】
増幅は、核酸複製を開始させる役割を果たす相補的な核酸配列の間での特定のハイブリッドの形成に基づく。
【００８１】
増幅が、当技術分野における公知の種々の技術に従って、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）により実施してよい。
【００８２】
これらの技術は、市販の試薬及びプロトコールを使用して実施することができる。好ましい技術では対立遺伝子特異的ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常、反応を開始するために特異的な核酸プライマーの使用を要求する。
【００８３】
本明細書において記載する核酸プライマーは、周囲領域を含む、ＮＣＲ３コード配列（例、遺伝子、又は遺伝子座、又はＲＮＡ）から配列を増幅するために有用である。
ＮＣＲ３標的領域を増幅するために使用することができるプライマーは、ＮＣＲ３のゲノム配列又はＲＮＡ配列及び、特に、配列番号１の配列に基づいてデザインしてよい。
【００８４】
特定のプライマーは、ＮＣＲ３コード配列の標的領域に隣接するＮＣＲ３遺伝子座の部分と相補的であり、それに特異的にハイブリダイズすることができる。
【００８５】
標的領域は、癌に対する素因又は癌を発生する増加した可能性を有する特定の被険者において変更された領域でありうる。
この点について、本発明の特定のプライマーは、ＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ中の突然変異した配列に特異的である。そのようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＮＣＲ３遺伝子座における突然変異の存在を示す。対照的に、増幅産物の非存在は、特定の突然変異がサンプル中に存在しないことを示す。
【００８６】
本明細書において開示する方法において使用可能な典型的な核酸プライマーは、点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列、典型的には、点突然変異、好ましくは、前に定義した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む野生型ＮＣＲ３配列に対して相補的であり、特異的にハイブリダイズするプライマーである。
【００８７】
本発明に関連して使用可能な特異的核酸プライマーを以下に開示する。
【００８８】
３５７１ Ｇ／Ｔ多型を含む領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１】
これらの配列を使用し、４７１bpのフラグメントを増幅してよい。
【００８９】
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿２５６３０８６５＿１０を使用し、３５７１ Ｇ／Ｔ多型を遺伝子型決定することができる。
【００９０】
３７９０ Ｔ／Ｃ多型を含む領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表２】
これらの配列を使用し、４７１bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９１】
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿７５１４９０８＿１０を使用し、３７９０ Ｔ／Ｃ多型を遺伝子型決定することができる。
【００９２】
標的領域は、さらに、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物をコードする領域でありうる。
そのような標的領域を増幅する核酸プライマーの例を、実験セクションにおいて開示している（配列番号２０〜３０及び４８）。
【００９３】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの存在を、本明細書において開示する方法において、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする核酸プライマーを用いた選択的増幅を使用することにより検出してよい。
【００９４】
特定のＲＮＡ転写物アイソフォームを増幅する特異的プライマーの例を以下に記載する：
【００９５】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表３】
これらの配列を使用し、３２３bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９６】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表４】
これらの配列を使用し、２６６bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９７】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表５】
これらの配列を使用し、３１９bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９８】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表６】
これらの配列を使用し、２６２bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９９】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表７】
これらの配列を使用し、３２１bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１００】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表８】
これらの配列を使用し、２６４bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０１】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表９】
これらの配列を使用し、２６６bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０２】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１０】
これらの配列を使用し、２６３bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０３】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１１】
これらの配列を使用し、２６３bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０４】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１２】
これらの配列を使用し、２６０bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０５】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１３】
これらの配列を使用し、２６４bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０６】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１４】
これらの配列を使用し、２６１bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション検出方法は、特定の配列、特にＮＣＲ３核酸配列突然変異又は特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームを検出する役割を果たす相補的な核酸配列の間での特定のハイブリッドの形成に基づく。
【０１０８】
特定の検出技術は、野生型の又は突然変異したＮＣＲ３遺伝子又はＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームに特異的な核酸プローブの使用を含み、ハイブリッドの存在の検出が続く。プローブは、浮遊状態に、又は、基材もしくは支持体に固定してよい（核酸アレイ技術と同様に）。プローブは典型的には標識され、ハイブリッドの検出を容易にする。そのような核酸プローブを本明細書において開示する。
【０１０９】
典型的なハイブリダイゼーション検出方法は、以下の、被験者からのサンプルを、ＮＣＲ３核酸（好ましくは遺伝子座）、特に突然変異したＮＣＲ３核酸に特異的な核酸プローブと接触させ、そしてハイブリッドの形成を評価する工程を含む。
特に好ましい実施態様において、この方法は、同時に、サンプルを、野生型ＮＣＲ３遺伝子座及びその種々の異常な又は突然変異した形態にそれぞれ特異的であるプローブのセットと接触させることを含む。この実施態様において、サンプル中でＮＣＲ３遺伝子座における種々の形態の突然変異の存在を直接的に検出することが可能である。また、種々の被険者からの種々のサンプルを並行して処理してよい。
【０１１０】
突然変異したＮＣＲ３核酸の存在を、このように、本明細書において開示する方法において、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームにハイブリダイズする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする、少なくとも１つの核酸プローブ、特に、浮遊状態の又はヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブとの選択的ハイブリダイゼーションにより検出してよい。
【０１１１】
本明細書において開示する特定の方法は、その目的が、癌の処置に対する被験者の感受性／反応を評価すること、又は、被験者における癌の予後を評価することであり、被験者から、ＤＮＡの試験サンプル、好ましくはＮＣＲ３配列を含むことが疑われる又は公知であるＤＮＡのサンプルを得る工程を含みうる。この方法は、好ましくは、以下の工程を含む：（ａ）被験者からの試験ＤＮＡサンプルを、少なくとも１つの核酸プローブと接触させ、それにおいて、前記核酸プローブは、突然変異したＮＣＲ３配列（例えば本明細書において記載するものの１つ）と相補的であり、それに特異的にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションサンプルを形成し、（ｂ）ハイブリダイゼーションサンプルを、ＮＣＲ３配列と少なくとも１つの核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じることを可能にするのに適した条件下で維持し、及び（ｃ）ＮＣＲ３配列と少なくとも１つの核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションが存在するか否かを検出する。
【０１１２】
ＮＣＲ３配列と核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションを使用し、被験者における好ましくない、又は逆に、好ましい癌の予後を示してよい。
【０１１３】
ＮＣＲ３配列と核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションをさらに使用し、被験者に施された処置に対する癌の反応（耐性又は感受性）を特定してよい。
【０１１４】
前に説明した通り、特定の突然変異したＮＣＲ３配列、特に非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異を含むＮＣＲ３配列は、癌の好ましくない予後、及び特定の癌の処置に対する耐性、ならびに他の突然変異したＮＣＲ３配列、特にＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異を含むＮＣＲ３配列に関連する。
【０１１５】
この処置は、好ましくは、化学療法、特に、アルキル化剤又はアントラサイクリン、例えばＤＯＸ、及び／又はオキサリプラチンもしくはシスプラチン（ＰＬＡＴ）などの投与を含む化学療法；ＴＫＩ、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を含む治療；ＦＴＩの投与を含む治療；及び好ましくはＸ線（ＸＲ）を含む放射線療法より選択される。
【０１１６】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃を上回る、好ましくは３５℃を上回る、より好ましくは４２℃を超過する温度、及び／又は約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度、及び／又は他の試薬、例えばＳＤＳ、ＳＳＣなどの濃度を改変することにより、当業者により調整されうる。
本開示の目的について、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間に２５%未満のミスマッチがある場合にだけハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。
【０１１７】
本発明の関連内で、プローブは、ＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ（の標的部分）と相補的であり、それとの特異的なハイブリダイゼーションが可能であるポリヌクレオチド配列を指し、それは前に記載したＮＣＲ３対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多型の検出に適する。プローブは、好ましくは、ＮＣＲ３遺伝子、ＲＮＡ、又はその標的部分に完全に相補的である。プローブは、典型的には、１５〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは２０〜５０ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸を含む。より長いプローブを使用してもよいことを理解すべきである。本発明の好ましいプローブは、２０〜３０ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸分子であり、それは、変化を持つＮＣＲ３核酸の領域（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１１８】
異常な（例、突然変異した）ＮＣＲ３配列（特に、遺伝子又はＲＮＡ）に特異的な核酸プローブ、即ち、前記の異常なＮＣＲ３配列に特異的にハイブリダイズし、正常な（参照）ＮＣＲ３配列にはハイブリダイズしない核酸プローブを、本明細書において使用可能である。特異性は、標的配列に対するハイブリダイゼーションが、特異的なシグナルを生成することを示し、それは非特異的なハイブリダイゼーションを通じて生成されたシグナルから区別できる。完全に相補的な配列が本明細書において好ましい。しかし、特異的なシグナルが非特異的なハイブリダイゼーションから区別されうる限り、特定のミスマッチを許容してよいことを理解すべきである。
【０１１９】
プローブの配列は、癌の処置に対する被験者の感受性、又は被験者における癌の好ましい予後に関連する、突然変異、特に点突然変異、例えばＳＮＰなどを持つＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡの任意の配列に基づいて容易に調製することができる。
また、これらの核酸分子のフラグメント又は部分、例えばＮＣＲ３配列における上で特定された多型を包含する領域に基づいてプローブ及びプライマーを生成することが適切である。
【０１２０】
本明細書において記載する方法において実際に使用可能な典型的な突然変異したＮＣＲ３配列は、ＮＣＲ３の野生型配列及び点突然変異、好ましくは前に記載した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【０１２１】
ヌクレオチド置換、ならびにプローブの化学修飾を実施してよい。そのような化学修飾を達成し、ハイブリッドの安定性を増加させる（例、挿入基）、又はプローブを標識してよい。標識の典型的な例は、限定なしに、ラジオアイソトープ、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を含む。標識のための方法及び種々の目的に適切な標識の選択におけるガイダンスが、例えば、Sambrook et al.（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989）及びAusubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998）において考察されている。
【０１２２】
本発明は、また、癌の処置に対する被験者の感受性を評価する方法、又は、被験者における癌の予後を評価する方法における、本明細書において記載する核酸プローブ又はプライマーの使用に関する。
【０１２３】
癌の処置に対する被験者の感受性を評価し、癌の処置の有効性を評価し、又は被験者における癌の予後を評価する本明細書において開示する方法を、さらに、上に示す通りに、先天的又は獲得された少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を、被験者からのサンプルにおいて、そのような異常なＮＫｐ３０タンパク質に対する結合について同定されたリガンドを使用して検出することにより実施してよい。
【０１２４】
本発明の好ましい方法は、被験者からのサンプルを、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム（正常なＮＫｐ３０、例、野生型ＮＫｐ３０、又は異常なＮＫｐ３０）に対する結合について同定されたリガンドと接触させ、結合が被験ＮＫｐ３０と前記ＮＫｐ３０リガンドの間で生じるか否かを、例えば、前記被験ＮＫｐ３０と前記ＮＫｐ３０リガンドの間での複合体の形成を決定することにより評価する工程を含む。
【０１２５】
本明細書において開示する特に好ましい方法は、被験者からのサンプルを、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドと接触させることにより、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの存在を決定する工程を含む。
【０１２６】
リガンドは、定義された標的に対して特異的に結合する薬剤である。
「特異的に」という用語は、薬剤の１０%未満、好ましくは５%未満が、前記の定義された標的とは異なる標的に結合することを意味する。このように、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム特異的リガンドは、ＮＫｐ３０タンパク質だけに、即ち、本発明に関連して、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに実質的に結合する。異なる型のリガンド、例えばＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームだけに実質的に結合する特異的な抗体及び他の薬剤（及びその機能的フラグメント）などを使用してよい。
【０１２７】
本明細書において開示する好ましいリガンドは、特定の正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドである。
【０１２８】
抗ＮＫｐ３０タンパク質抗体、特に、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに特異的な抗体が本明細書において開示されており、Harlow and Lane（Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含む、多くのテキストに記載される標準手順を使用して産生されうる。特定のリガンドが、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又は特定のＮＫｐ３０スプライシングバリアント、スプライシング形態又はＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームだけに実質的に結合することは、通常の手順を使用又は適応することにより容易に決定されうる。１つの適したインビトロアッセイではウエスタンブロッティングの手順を使用する（Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含む、多くの標準的なテキストに記載されている）。ウエスタンブロッティングを使用し、所定のＮＫｐ３０タンパク質結合剤、例えば抗ＮＫｐ３０タンパク質モノクローナル抗体などが、特定のＮＫｐ３０タンパク質、即ち、本発明に関連して、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームだけに実質的に結合することが決定されうる。
【０１２９】
本発明の関連内で、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメント又は派生物を指す。
抗体のより短いフラグメントも特異的な結合剤としての役割を果たすことができる。例えば、特定のＮＫｐ３０に結合するＦＡｂ、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＮＫｐ３０特異的な結合リガンドでありうる。
【０１３０】
これらの抗体フラグメントを以下の通りに定義する：（１）ＦＡｂ（無傷な軽鎖及び１つの重鎖の部分を産生するための酵素パパインを用いた全抗体の消化により産生される抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント）；（２）ＦＡｂ’（無傷な軽鎖及び１つの重鎖の部分を産生するためのペプシンを用いた全抗体の処理、続く還元により得られる抗体分子のフラグメント）；２つのＦＡｂ’フラグメントが１つの抗体分子当たり得られる；（３）（ＦＡｂ’）２（続く還元なしに、酵素ペプシンを用いた全抗体の処理により得られる抗体のフラグメント）；（４）Ｆ（Ａｂ’）２（２つのジスルフィド結合により一緒に保持された２つのＦＡｂ’フラグメントの二量体）；（５）Ｆｖ（２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント）；及び（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）（適したポリペプチドリンカーにより連結された、遺伝的に融合された一本鎖分子としての、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子）。これらのフラグメントを作る方法は通常通りである。
【０１３１】
本明細書において提示する特定の抗体は、前に定義され、本明細書において例示される、ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチド、典型的にＮＫｐ３０ポリペプチドに特異的である。
【０１３２】
本発明において使用可能な特定の抗体は、また、各々の特定の野生型ＮＫｐ３０ポリペプチドアイソフォームに特異的でありうる。好ましくは、抗体は、ＮＫｐ３０（配列番号３８及び３９）の細胞外ドメイン及びＮＫｐ３０（配列番号４０〜４２）の細胞内ドメインより選択される配列の全て又は特有の部分を含む。ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメインを配列番号３８に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４３に描写する。ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメインを配列番号３９に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４４に描写する。ＮＫｐ３０の短い細胞内ドメインを配列番号４０に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の短い細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４５に描写する。ＮＫｐ３０の中間細胞内ドメインを配列番号４１に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の中間細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４６に描写する。ＮＫｐ３０の長い細胞内ドメインを配列番号４２に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の長い細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４７に描写する。
そのような配列を、さらに、担体ペプチドとしてＫＬＨに抱合してよい。
【０１３３】
このように、特定の実施態様において、サンプルを、異常なＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための種々の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などを使用することができる。
【０１３４】
特定のＮＫｐ３０タンパク質に対する結合について同定された他のリガンドは、例えば、ヘパラン硫酸及びＢＡＴ３である。
【０１３５】
リガンドは、特に、プローブを使用して検出されうる。プローブには好ましくはタグが付けられる。
【０１３６】
特定の実施態様において、本発明は、このように、本明細書において、ＮＫｐ３０経路を介した腫瘍細胞の免疫原性の欠如を検出するための方法を開示し、この方法は、ＴＫＩ、アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチン、又はＸ線で処理された、ＮＫｐ３０リガンドを発現する自己腫瘍細胞の接触を含み、前記リガンドの結合の非存在は腫瘍細胞の免疫原性の欠如と相関している。
【０１３７】
当業者に周知の技術、例えばＥＬＩＳＡ結合アッセイ又はウエスタンブロット（ＷＢ）などを、上に記載する方法において適用してよい。
【０１３８】
非特異的な結合が起こりうるが、標的ＮＫｐ３０ポリペプチドアイソフォームに対する結合が、より高い親和性で起こり、非特異的な結合から確実に識別することができる。
【０１３９】
サンプルの核酸又はタンパク質と前に記載したリガンド又はプローブの間での接触を、任意の適したデバイス、例えばプレート、チューブ、ウェル、ガラスなどにおいて実施してよい。特定の実施態様において、接触は、核酸アレイ上又は特定のプローブ又はリガンドアレイ上で実施する（例えばヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブなど）。
【０１４０】
リガンドは、前に記載したプローブとちょうど同じように、浮遊状態で又は基材もしくは支持体上に固定してよい。
基材は、固形又は半固形の基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の支持体でよい。基材は、種々の形態及びサイズ、例えばスライド、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲルなどでよい。
接触は、複合体が、試薬（リガンド又はプローブ）とサンプルの核酸又はポリペプチドの間で形成されるために適した任意の条件の下で行ってよい。
サンプルは、このように、同時に、又は並行して、又は連続的に、ＮＣＲ３核酸、ＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、又はＮＫｐ３０タンパク質もしくはポリペプチドの異なる形態、例えば野生型の正常なアイソフォーム及びその種々の異常な形態に特異的な種々のリガンド又はプローブと接触させてよい。
【０１４１】
本発明では、さらに、ＮＫｐ３０活性を決定する工程を含む方法を開示する。
【０１４２】
ＮＫｐ３０は、主に、３つの可能な発現レベルを考慮することにより、ＮＫ細胞においてインビボで発現される：（ｉ）クローンレベル、（ｉｉ）亜集団レベル、及び（ｉｉｉ）全末梢血集団のレベル。ＮＫｐ３０シグナル伝達は、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮγ）の分泌の誘発及びＤＣ成熟の加速のために不可欠である。
【０１４３】
本願において、異常なＮＫｐ３０タンパク質活性は、このように、例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮγより選択される化合物の分泌の非存在又は存在、又はその細胞レベルにおける変化とも相関しうる。そのような細胞レベル、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞レベルを、ＮＫｐ３０タンパク質活性を決定する工程を含む、本明細書において開示する方法において本発明者により測定してよい。そのような測定を、さらに、正常レベルと比較してよい。
異常なＮＫｐ３０活性を、ＮＫ細胞及びコーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を含む培養において、ＩＬ−２の存在又は非存在において、ＩＦＮγ（精製されたＮＫ細胞に由来する）の細胞レベルを測定することにより検出してよい。測定レベルを、好ましくは、ＩＬ−２の存在又は非存在において、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中のＮＫ細胞の培養から測定された参照レベルと比較する。
【０１４４】
異常なＮＫｐ３０活性を、さらに、ＴＫＩにより条件付けられた未熟な樹状細胞（ＤＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む共培養中の（精製されたＮＫ細胞に由来する）ＩＦＮγの細胞レベルを測定することにより検出してよい。ＤＣは、試験される被験者からの自己細胞又は同種細胞である。ＮＫ細胞は、好ましくは、自己細胞である。共培養は、並行して、ＮＫｐ３０リガンド及びモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０より選択される少なくとも１つの化合物の存在において、及び前記化合物のいずれかの非存在において実現されうる。
【０１４５】
異常なＮＫｐ３０活性を、さらに、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びコーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を含む培養中の（ＰＢＭＣに由来する）ＩＦＮγ又はＴＮＦαの細胞レベルを測定することにより検出してよい。測定レベルを、好ましくは、コーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を伴わないＰＢＭＣの培養から測定された参照レベルと比較する。
被験ＩＦＮγ又はＴＮＦαの測定レベルを、さらに、それぞれの参照レベルと比較してよい。
本発明者らは、実際に、異常なＩＦＮγ又はＴＮＦαレベル（特に、公知の標準と比較した減少値）が、異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームプロファイル、特に、ＮＫｐ３０の中間アイソフォームの相対的な高発現及びＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの減少した発現と相関することを発見した。
【０１４６】
ＴＮＦα及びＩＦＮγ分泌を、当技術分野において周知の技術、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーにおける細胞内サイトカイン染色、又はサイトカイン分泌アッセイにより決定してよい。
【０１４７】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性は、また、正常なＮＫｐ３０転写物アイソフォームの異常転写に相関しうる。異常転写は、コントロール又は標準の量もしくはレベルと比較して増加した発現でありうる。それは、また、例えば、癌処置により又は癌自体により誘導された、コントロール又は標準の量もしくはレベルと比較して増加した発現でありうる。
本発明は、ＮＫｐ３０をコードするｍＲＮＡの細胞のレベルを測定することによるＮＫｐ３０タンパク質発現又は活性の決定を含む方法を提供し、コントロールレベルと比較した増加レベルは、異常なＮＫｐ３０タンパク質発現と相関する。ｍＲＮＡレベルは、エクスビボで又はインビトロで、例えば、患者の単離ＰＢＭＣで、又は患者の単離ＮＫ細胞で測定してよい。
そのような方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖転写）の使用を含む工程を含むことができる。
【０１４８】
本願に記載されている方法は、このように、前に示す通り、好ましくは、正常状態においてＮＫｐ３０を発現する細胞（好ましくは、自己ＰＢＭＣ及び／又はＮＫ細胞より選択される）を含むサンプルで実施する。
【０１４９】
本発明者らは、さらに、本明細書において、潜在的なＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄のドナーの被験者であり、そのためＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する必要がある被験者のＮＣＲ３突然変異状態及び／又はＮＫｐ３０アイソフォーム状態又はプロファイルの決定を含む診断方法を記載する。
そのような診断方法は、また、ＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄移植のための候補において実施してよい。
【０１５０】
前に定義した、癌の処置に対する被験者の感受性又は被験者における癌の処置の有効性を評価する方法において使用される、又は被験者における癌の予後を評価する方法において使用されるキットが、さらに、本明細書において提供される。キットは、前に記載した、核酸プローブ、プライマー、及び／又はリガンド、例えば抗体などを含む。
キットは、また、ハイブリダイゼーション、増幅、又は結合反応、例えば、抗原−抗体免疫反応を実施するための容器又は支持体、試薬、及び／又はプロトコールを含みうる。
【０１５１】
本明細書において記載する方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで実施してよい。それらは、好ましくは、インビトロ又はエクスビボで実施される。
【０１５２】
スクリーニング方法
本願は、また、特に、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において、癌を予防又は処置するために有用な、化合物又は物質、好ましくは薬物候補又はリードをスクリーニングするための新規方法を提供し、試験化合物又は物質が、ＮＣＲ３遺伝子の発現、及び／又は特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１５３】
上に記載する方法を使用してスクリーニングされる好ましい試験化合物又は物質は、ＮＣＲ３遺伝子の機能的な転写及び／又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、特に、少なくとも１つの突然変異した又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復又は増強することが可能である。
【０１５４】
ＮＫｐ３０中間（ＩＮＴＥＲ）タンパク質アイソフォーム発現を減少させる、好ましくは、ＮＫｐ３０の短い（ＳＨＯＲＴ）及び／又は長い（ＬＯＮＧ）タンパク質アイソフォーム発現をさらに増強又は増加させる化合物が好ましい。換言すると、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的発現が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの発現よりも低い、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームプロファイルを支持する化合物が、特に好ましい。
【０１５５】
本明細書において開示するスクリーニング方法では、好ましくは、ＮＣＲ３核酸又はＮＫｐ３０ポリペプチドもしくはタンパク質アイソフォーム、ならびにＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子を、新たな標的として使用する。そのような成熟は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡＤＲの上方調節により特定されうる。この方法は、結合アッセイ及び／又は機能アッセイを含み、インビトロ、細胞系、又は動物などにおいて実施してよい。
【０１５６】
本発明者らは、特に、生物学的に活性な化合物又は物質、特に、癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質を選択する方法を開示し、前記方法は、インビトロで試験化合物又は物質を、ＮＣＲ３核酸（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）、ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドアイソフォーム、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子、及び、その任意のフラグメントより選択される産物と接触させること、及び前記化合物又は物質が前記産物に結合する能力を決定することを含む。
【０１５７】
さらなる特定の実施態様において、この方法は、本発明のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子を発現する組換え宿主細胞を、試験化合物又は物質と接触させること、及び、前記化合物又は物質がそれぞれ前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する前記分子に結合し、その活性を調節する能力を決定することを含む。
特定の実施態様において、前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームは、ＮＫｐ３０の異常な状態又はプロファイルに関与する、異常な、好ましくは突然変異したＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はそのフラグメントでありうる。
【０１５８】
前記核酸、ポリペプチド、又は分子に対する結合は、試験化合物又は物質が前記標的の活性を調節し、このようにして被験者において癌に導く経路に影響を与える能力としての指標を提供する。
【０１５９】
結合の決定は、当業者に公知の種々の技術により実施してよく、その一部は、本明細書において前に記載しており、例えば試験化合物又は物質の標識により、特定のＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチド（野生型又は異常なＮＫｐ３０）、例えば特にＮＫｐ３０アイソフォーム、又は特にＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドなどに対する結合について公知である、又は同定されている標識されたコントロール又は参照リガンドとの競合による。
【０１６０】
本明細書において記載するさらなる目的は、生物学的に活性な化合物又は物質、特に癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法にあり、前記方法が、インビトロで、試験化合物又は物質を、本明細書において記載するＮＣＲ３遺伝子、特に野生型又は突然変異したＮＣＲ３遺伝子と接触させること、及び、前記化合物又は物質が前記ＮＣＲ３遺伝子の発現を調節する、特にその選択的スプライシングを調節する能力を決定することを含む。
【０１６１】
生物学的に活性な化合物又は物質は、ＮＣＲ３の機能的な転写及び／又は特定のＮＣＲ３タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である化合物でありうる。
【０１６２】
本明細書において、本発明者らにより（実験セクションを参照のこと）、特にトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及び５−アザシチジン（５ＡＺＡ）が、参照値又は平均発現値と比較し、ＮＫｐ３０ ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過少発現量に関連するＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な（相対的な）過剰発現量を誘導するために、野生型ＮＣＲ３遺伝子スプライシングを調節することができることが実証されている。
本発明者らは、さらに、本明細書において、特に、組み合わせで使用される配列番号４９〜５１に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド５３が、参照値又は平均発現値と比較し、ＮＫｐ３０ ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの相対的な過剰発現量に関連するＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な（相対的な）過少発現量を誘導するために、野生型ＮＣＲ３遺伝子スプライシングを調節することができることを開示する。
【０１６３】
生物学的に活性な化合物又は物質を選択する別の方法が、さらに提供され、それにおいて、前記方法は、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子と接触させること、及び、前記化合物又は物質がそれぞれ前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する前記分子の活性を調節する能力を決定することの工程を含む。
【０１６４】
本明細書で開示する方法において使用可能であるＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く特定の分子は、ＴＬＲ３リガンド、例えば二本鎖ＲＮＡ（例えば、ポリＡ：Ｕ及びポリＩ：Ｃ）及び／又は低メチル化Ｃ及びＧに富むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）などより選択してよい。
【０１６５】
本明細書の別の特定の目的は、癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法にあり、前記方法が、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０の活性の調節に関与するポリペプチド、例えばＩＬ−１５、ｓｕｓｈｉ ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−１５ポリペプチド、又はその結合部位を含むフラグメントと接触させること、及び、前記化合物又は物質が前記ポリペプチド又はそのフラグメントに結合する能力を決定することを含む。
【０１６６】
さらなる特定の実施態様において、方法は、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性の調節に関与するポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を、試験化合物又は物質と接触させること、及び、前記試験化合物又は物質が前記タンパク質に結合し、前記タンパク質の活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１６７】
本明細書において開示するさらなる方法は、生物学的に活性な化合物又は物質、特に癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質を選択する工程を含み、前記方法は、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０の活性の調節に関与する遺伝子と接触させること、及び、前記試験化合物又は物質が前記遺伝子の発現を調節する能力を決定することを含む。
【０１６８】
スクリーニングの方法の特定の実施態様において、調節は活性化である。スクリーニングの方法の別の特定の実施態様において、調節は阻害である。
【０１６９】
本発明の方法は、多くの化合物又は物質のスクリーニングに適する。これらの化合物又は物質は、種々の由来、性質、及び組成でありうる。試験化合物又は物質は、単離された又は他の物質との混合物中の、任意の有機又は無機物質、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などでありうる。化合物又は物質は、例えば、産物のコンビナトリアルライブラリーの全て又は部分でありうる。
【０１７０】
特定の実施態様において、本発明は、また、癌の処置のために有用な化合物又は物質、好ましくは突然変異した又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現及び／又はＮＣＲ３遺伝子の機能的な転写を回復することが可能である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法を開示し、前記方法は、試験化合物又は物質が、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はそのリガンドの発現又は活性を調節する、特に誘導もしくは増加させる、又は逆に、減少させる能力を決定することを含む。
【０１７１】
本発明者らは、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームのリガンドならびにＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する分子が、前に定義した通りに、癌治療に対する被験者の感受性を増加することができることを実証している。
【０１７２】
好ましいリガンドを使用して、正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質の長い及び短いアイソフォームプロファイル発現を、比較的に、中間アイソフォームプロファイルｂ発現まで上方調節する、及び／又は、前に定義した通りに、癌治療に対する被験者の感受性を増加させてよい。
【０１７３】
本明細書において特定される、正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現を上方調節する、及び／又は、癌治療に対する被験者の感受性を増加させるために使用できる、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する好ましい分子は、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する被験者のＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄上のＴＲＡＩＬに対する抗体より選択されうる。
【０１７４】
上のスクリーニング方法を、任意の適したデバイス、例えばプレート、例えば、マルチウェルプレート、チューブ、ディッシュ、フラスコなどにおいて実施してよい。いくつかの試験化合物又は物質を、並行してアッセイすることができる。
【０１７５】
組成物及び使用
公知の、又は、前に記載したスクリーニング方法を用いて単離され、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は活性を回復又は増強、即ち、増加又は支持することが可能である、被験者において癌、特に小児癌、例えば神経芽細胞腫、又は肉腫、特にＧＩＳＴ、又は白血病、特にＡＭＬを処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、本明細書に記載されている。
【０１７６】
被験者は、好ましくは、前に説明した、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者である。
【０１７７】
機能的ＮＫｐ３０発現は、典型的には、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルに関連しており、被験者において、参照値又は平均値と比較した場合、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が減少しており、そして、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの相対的な発現が増加していることが、本発明者らにより本明細書において実証されている。
特定の実施態様において、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルは、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対）量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの量よりも低いプロファイルである。
【０１７８】
記載したスクリーニング方法により得られる物質を使用して、前に定義した通り、癌治療に対する被験者（前に定義した）の感受性を増強するための医薬的組成物を調製することもできる。
【０１７９】
化合物又は物質は、公知の化合物もしくは物質又は本発明のスクリーニング方法を使用して選択される化合物又は物質でありうる。
【０１８０】
被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するために使用可能な本明細書における化合物の例は、さらに、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、又はそのようなベクター又は核酸を含む組換え宿主細胞より選択することができる。
【０１８１】
機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現もしくは活性を回復することが可能である化合物又は物質をさらに使用して、前に定義した通りに、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製してよい。
【０１８２】
そのような化合物は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばバルプロ酸（ＶＰＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、アクラルビシン、バナジン酸ナトリウム；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）など；ＰＫＣ阻害剤、例えばＧｏ６９８３など；イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）；サイトカイニンキネチン；シクロヘキシミド；デキサメタゾン；オレイン酸ナトリウム；エストロゲン；プロゲステロン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ＦＫ５０６；サイクロスポリンＡ；スタウロスポリン及びその任意の組み合わせからなる群において選択してよい。
【０１８３】
配列番号４９−５１のアンチセンスオリゴヌクレオチドも、前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するために組み合わせで使用可能な化合物の例である。
【０１８４】
正常なＮＫｐ３０タンパク質発現又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性を有する被験者のＮＫ細胞、骨髄、及び幹細胞は、そのような被験者において癌を処置又は予防するために使用することができる物質の例である。
【０１８５】
前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するためのＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟に導く生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、本明細書において開示される。
【０１８６】
そのような化合物は、好ましくは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びその組み合わせからなる群において選択される。
【０１８７】
前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するためのＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に導く生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、さらに本明細書において開示される。
そのような化合物は、好ましくは、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＮＫＧ２Ｄ、及びＴＬＲ３リガンドからなる群より選択される。
ＴＬＲ３リガンドは、好ましくは、例えばポリＡ：Ｕ及びポリＩ：Ｃより選択してよい二本鎖ＲＮＡである。
【０１８８】
本発明者らは、さらに本明細書において、公知の又は本発明の方法を用いて選択される、及び、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を回復又は増強することが可能である上に記載する化合物又は産物の少なくとも１つを含む医薬的化合物を提供する。
【０１８９】
医薬的組成物は、本明細書において、さらに有利には、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及び／又はスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）及びアントラサイクリン、例えばＤＯＸ、オキサリプラチン、及び／又はシスプラチン（ＰＬＡＴ）などを、組み合わせ調製物として、前記癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含んでよい。
【０１９０】
本明細書において記載する特定の組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、ＰＫＣ阻害剤及び／又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤を、単独で又は組み合わせ調製物として、前記癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含む。
【０１９１】
本明細書において開示する医薬的組成物は、さらに、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。
【０１９２】
好ましい実施態様において、本明細書において記載する医薬的組成物、特に、化学療法産物を含まない医薬的組成物を、ＮＫｐ３０が突然変異した個人において、化学療法又は放射線療法の施行を含む任意の処置前に投与する。医薬的組成物の投与は、単回投与又は反復投与において、任意の続く処置の前及び／又は間に、例えば、任意の続く処置の１日前及び前記処置の間の３週間おきに実施してよい。
【０１９３】
ＴＬＲ３リガンドを含む医薬的組成物は、好ましくは、任意の化学療法又は放射線療法の前及び／又は間に投与される。
【０１９４】
本明細書において提供する医薬的組成物の投与は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは経口経路により又は注射により（全身経路を介して）実施してよい。投与用量は、当業者により適応されうる。
【０１９５】
典型的には、処置の観点で、投与用量は例えば以下でありうる：
− ４−エピルビシン（アントラサイクリン）について：３週間おきに１００mg/m2；
− オキサリプラチンについて：３週間おきに約６００−１０００mg/m2；
− 核酸化合物について、用量は、例えば、ポリＡ：Ｕについて、６週間で３０−５０mg/週に及ぶ。
【０１９６】
予防的処置に関連して、本発明の医薬的組成物は、好ましくは、３週間おきに投与される。
【０１９７】
反復処置は、恐らくは他の活性薬剤、治療、又は任意の医薬的に許容可能な賦形剤（例、バッファー、等張生理食塩水、安定化剤の存在においてなど）との組み合わせで実施してよいことが理解される。
【０１９８】
本発明は、また、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性の活性化を通じた、被験者において癌を処置又は予防する方法にある。
【０１９９】
特に、ＮＣＲ３遺伝子の突然変異した対立遺伝子を持ち、異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームを発現し、又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性を示す被験者を処置する方法（併用療法を含む）が本明細書において提供される。
被験者は、このように、例えば、遺伝子治療、タンパク質置換治療を通じて、又は、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム模倣剤及び／又は正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム状態又はプロファイルのアクチベーターの投与を通じて処置してよく、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的発現は、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対的）発現より低い。前記方法の少なくとも１つを、さらに、前に定義した通りに、癌治療に組み合わせてよい。
【０２００】
本発明は、また、本明細書において前に記載した通り、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性の活性化を通じた、被験者において癌を処置又は予防する方法にある。
【０２０１】
診断方法は、本明細書において記載する通り、癌の処置に対する被験者の感受性を評価し、又は、癌患者において先天的な又は獲得されたＮＫｐ３０の定性的又は定量的な欠損を検出することを目的とし、そのような処置のために選択可能な被験者、特に、癌処置、特に化学療法処置、及び／又は同種骨髄移植の候補である、又は、それを受けるであろう被験者に適用してよい。同種骨髄移植の候補である、又は、それを受けるであろう被験者に関して、ＮＫｐ３０アイソフォーム発現の状態又はプロファイルに関して適切な骨髄ドナー被験者を選択することが好ましい。適切な骨髄ドナー被験者は、実際には、本明細書において定義するＮＫｐ３０アイソフォームの機能的な又は正常な発現又は活性を有する被験者である。
【０２０２】
本発明の他の特徴及び利点を、以下の実験セクション（図１〜２４を参照のこと）において与えており、それは例示的であり、本願の範囲を限定しないと見なすべきである。
【０２０３】
実験セクション
Ａ．予備アッセイ（４１人の患者／３７人の健常ボランティアのコホート）
本発明者らは、本明細書において、ＮＣＲ３遺伝子の転写調節（ＮＫ細胞表面でのＮＫｐ３０アイソフォームの発現の定量的及び定性的な調節）における欠損が、長期間のＴ細胞依存的な抗腫瘍反応の確立に必要である、ＮＫｐ３０及びＩＦＮγの産生を通じたＮＫ細胞によるＤＣ活性化の減少を介した腫瘍増殖の制御に影響を与えることを実証している４１。
本発明者らは、最初に、４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアにおいてＮＣＲ３遺伝子中に分布する２１の一塩基多型（ＳＮＰ）を遺伝子型決定している。予備結果は、ＮＣＲ３遺伝子中の２つの突然変異がＧＩＳＴの制御に関連することを明らかにした。
【０２０４】
材料及び方法
患者及び健常ボランティア（ＨＶ）
コホートは、最初に、ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）により処置された４１人のＧＩＳＴ患者から成り、Institut Gustave Roussy（ＩＧＲ）において経過観察された。ＧＩＳＴ患者は、ＥＯＲＴＣ第ＩＩＩ相試験６２００５又はFrench Sarcoma Group（大半がＩＧＲ及びＣＬＢ）第ＩＩＩ相臨床試験（ＢＦＲ１４）に登録され、それぞれイマチニブメシレート（ＩＭ）の用量及び持続時間を評価した。ＢＲＦ１４は、再発中の転移性又は切除不能な悪性ＧＩＳＴを伴う患者における、３年後に（実際には最初の１年間）処置介入対継続を無作為化した非盲検多施設試験であった５４。ＥＯＲＴＣ６２００５試験は、ＧＩＳＴ患者におけるＩＭの１日４００mg対８００mgを比較する無作為化試験であった５５。
書面のインフォームドコンセントが、臨床試験及び免疫学的試験のための地域倫理委員会（Comite Consultatif de Protection des Personnes se pretant a la Recherche Biomedicale, Kremlin-Bicetre）に従って患者から得られた。
ヘパリン添加血液を、イマチニブメシレート（ＩＭ）治療から２、６、１２ヶ月後に患者から採取した。約３７人の健常ボランティアを、免疫学的パラメーターについてのコントロールとして使用した。
年齢、性別、リンパ球及びＮＫ細胞の数、ＩＭを用いた治療での用量及び持続時間を含む患者の特徴が記載されている（Menard et al.４２）。
腫瘍反応をコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより評価し、そして反応を処置の開始から３ヶ月後ごとにＲＥＣＩＳＴ基準に従って分類した。非進行性疾患には、安定疾患及び客観的な部分的又は完全な反応が包含された。患者の経過観察の中央値は４７ヶ月（範囲６−７５ヶ月）であった。
ＩＧＲ、Center Leon Berard及び周辺の抗癌センターで管理された１９人の神経芽細胞腫患者の予備コホートは、転移性腫瘍及び限局性腫瘍から成った。良好な又は不良な臨床予後を伴う患者の分類は、疾患の病期、年齢、及びＭＹＣＮオンコジーン増幅に基づいた１２。
【０２０５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
全細胞ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen）を用いてＰＢＭＣ及びＮＫ細胞株から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、５μgの全ＲＮＡから、SuperScript（商標）II Reverse Transcriptase及びランダムプライマー（Promega）を使用し、Invitrogenの取扱説明書に従って合成した。
【０２０６】
「ＧＩＳＴ患者及び健常ボランティア」コホートについて、リアルタイム定量的ＰＣＲ増幅を、FastStart DNA Master SYBRGreen I Mixを使用し、製造業者の取扱説明書に従って、０．３μMのプライマー、２mMのＭｇＣｌ２、及びｃＤＮＡを用いて、２０μlの最終反応容積中で行った。サーマルサイクリングをLightCycler（Roche Molecular System）を使用して実施し、９５℃での１０分間のインキュベーションにより開始し、３８サイクル（９５℃、１秒；６５℃、１０秒；７２℃、２０秒）が続いた。ＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現レベルを、対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量を用いて、その相対的ｍＲＮＡ量を割ることにより標準化した。
リアルタイム定量的ＰＣＲにおいて使用される特異的プライマーは、Primer3(v.0.4.0)ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu/）を用いてデザインした。
以下のプライマーを使用した：ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２：５’−ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号２０）；ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ：５’−ＧＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２１）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ：５’−ＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２２又は２７）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ：５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴ−３’（配列番号２３）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２４）。プライマー対”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ”を使用し、ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅した；ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ”；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ”；ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ”；ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物については“ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ”；ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物については“ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ”。
パートＢにおいて以下に説明される通り、本発明者らは、後に、使用されているプライマー対（上で特定される）は、ＮＫｐ３０特異的であるが、ＬＯＮＧ、ＳＨＯＲＴ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥアイソフォーム（即ち、それらのそれぞれの細胞内ドメインに従って区別されるＮＫｐ３０アイソフォーム）間だけを識別でき、定常（”ＤＥＬ”）と可変（”ＷＴ”）アイソフォーム（即ち、それらのそれぞれの細胞外ドメインに従って区別されるＮＫｐ３０アイソフォーム）間はできない。明らかな通り、上の結果によって、特に被験者における癌の予後を評価するための重要なアイソフォームとしてのＮＫｐ３０中間アイソフォームの特定が可能になる。上に記載した試験（パートＡ）は、しかし、二回目に（パートＢ）、患者数を二倍にし、前記ＮＫｐ３０中間アイソフォームの戦略的価値を確認するコホートで、本発明者らにより完成されている。TagMan方法を使用して加えた記載結果は、しかし、より具体的であり、パートＢにおいて以下で説明する通りである。
【０２０７】
神経芽細胞腫コホートについて、より実用的な定量化システムを使用した。６つのＮＫＰ３０転写物及びβ２Ｍハウスキーピング転写物のためのＰＣＲプライマー及びTaqManプローブをPrimer Expressソフトウェアｖ１．０（Applied Biosystems）を用いてデザインした。
以下のプライマー及びプローブを使用した：ＮＫＰ３０ ＥＣ−ＷＴ：５’−ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２５）；ＮＫＰ３０ ＥＣ−ＤＥＬ：５’−ＧＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号２６）；ＮＫＰ３０ ＥＸ４Ｉ：５’−ＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２７又は２２）；ＮＫＰ３０ＥＸ４ＩＩ：５’−ＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴ−３’（配列番号２８）；ＮＫＰ３０ＥＸ４ＩＩＩ：５’−ＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２９）；ＮＫＰ３０Ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：５’−ＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣ−３’（配列番号３０）；Ｂ２ＭＦｏｒ：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴ−３’（配列番号３１）；Ｂ２ＭＲｅｖ：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧ−３’（配列番号３２）；Ｂ２ＭＰｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：５’−ＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡ−３’（配列番号３３）。
１マイクロリットルの第１鎖ｃＤＮＡを、１２．５μLの２×TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）及び０．７５μLのＮＫＰ３０プライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）又は０．５μLのβ２Ｍプライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）と最終容積２５μL中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、ABI prism 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を使用して行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：最初のインキュベーション５０℃で２分、変性９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、そして６０℃（ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−ＷＴ、ならびにβ２Ｍ転写物について）又は６２℃（ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物について）で１分間の４５サイクル。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）データを、２-ΔΔＣＴ方法を使用し、製造業者の指示に従って分析した。
【０２０８】
本発明者らは、さらに、シグナル出現を可能にする別のＮＫＰ３０Ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）を産生しており、前記プローブは、上に記載する配列番号３０に対応するプローブよりも特異的であり、即ち、上に記載した適用されるＲＴ−ＰＣＲ方法に関連して、潜在的なＤＮＡ混入物とｃＤＮＡの間で識別できることに注目すべきである。前記の新たなプローブが、本明細書において配列番号４８として特定されており、拡大コホートで使用されており、下の実験パートの記載から明らかである（パートＢ）。
【０２０９】
クローニング
合成された第１鎖ＮＫ９２ ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、HotStarTAQ DNAポリメラーゼ（Qiagen）を用いて５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して増幅した。
クローニングシステムのために使用されるＨＰＬＣ精製プライマーを、Primer3 v0.4.0ソフトウェアを用いてデザインした：ＳＨＯＲＴ−ＷＴ及びＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０ ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号３４）及びＥｃｏＲＩ−ＳＨＯＲＴ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３５）；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ及びＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＩＮＴＥＲ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３６）；ＬＯＮＧ−ＷＴ及びＬＯＮＧ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＬＯＮＧ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３７）。
下線を引いた配列は、発現プラスミドベクター中のＤＮＡクローニング用の制限酵素認識部位である。サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で１５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、ＳＨＯＲＴ、ＩＮＴＥＲ、及びＬＯＮＧプライマーについてアニーリング（６７℃で３０秒）、及び伸長（７２℃で１分）の３０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで単離し、QIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を使用して精製し、そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ（Ozyme）を用いて消化した。消化されたフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）に、そして後にｐＩＲＥＳ２哺乳動物バイシストロニック発現ベクター（CLONTECH）にも連結した。ヌクレオチド配列をABI PRISM 310遺伝子アナライザー（Applied Biosystems）により分析した。
【０２１０】
遺伝子型決定
ＤＮＡを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配により分離された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出した。ＮＣＲ３突然変異を同定するために、本発明者らは３つの定義されたＰＣＲ産物のシークエンシング分析を実施した。
３つのプライマー対を、ＰＲＩＭＥＲ３プログラムを用いてデザインした：ＮＣＲ３Ｆｒａｇ１：５’−ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１４）及び５’−ＧＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）；ＮＣＲ３Ｆｒａｇ２：５’−ＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１６）及び５’−ＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号１７）；ＮＣＲ３Ｆｒａｇ３：５’−ＣＴＧＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１８）及び５’−ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１９）。
ＰＣＲ増幅を、AmpliTaq（PE Biosystems）を用いて、５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して行った。サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、アニーリング３０秒（ＮＣＲ３Ｆｒａｇ１プライマーについて６４℃、ＮＣＲ３Ｆｒａｇ２プライマーについて６０℃、及びＮＣＲ３Ｆｒａｇ３プライマーについて６４℃）、及び伸長（７２℃で１０秒）の４０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。シークエンシング反応を開始する前に、ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製し、そして２%アガロースゲル電気泳動により定量化した。シークエンシング反応を、CEQ8000キット及びCEQ8000自動化蛍光シークエンサー（Beckman Coulter）を用いて実施した。
【０２１１】
クラスタリング分析
研究された教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した５６。
【０２１２】
ＨＤＡＣ及び脱メチル化剤によるＮＣＲ３選択的スプライシングの調節
ＮＫ９２細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、５−アザシチジン（２μM）及びＩＬ−２（５０UI/ml）と３７℃で３６時間インキュベートした。
ＹＴＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、トリコスタチンＡ（１００nM）と３７℃で４５時間インキュベートした。
【０２１３】
ＮＫ細胞フローサイトメトリー分析
ＮＫ細胞を以下の抗体を用いて染色した：BD Pharmingenから購入したＣＤ３−ＡＰＣ（クローンＵＣＨＴ）、MiltenyiからのＮＫｐ３０−ＰＥ（クローンＡＦ２９−４Ｄ１２）、Beckman-CoulterからのＣＤ５６−ＰＣ５（クローンＮ９０１）。蛍光をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーターで取得し、そして続いてCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
【０２１４】
インビトロＮＫ細胞エフェクター機能の評価
ＮＫｐ３０架橋実験では、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞Easy Sepキット（Stem Cell Technologies, Paris, France）を用いて精製し（純度＞９５%）、２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０（クローン２１０８４７、R&D Systems、Lille、France）又はアイソタイプコントロールを用いて７時間コーティングした９６ウェル−Maxisorpプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中に播種した。２０時間のＮＫｐ３０架橋後、上清を回収し、−８０℃で保存し、そして次に市販のＥＬＩＳＡキットを使用し、製造業者の取扱説明書（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）に従って評価した。あるいは、ＮＫ細胞を、１０μMモネンシンを添加したＡＩＭＶ中で２μlの抗ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（クローンＨ４Ａ３，Pharmingen）と７時間インキュベートし、ＣＤ３／ＣＤ５６染色を架橋の終わりに実施した。
【０２１５】
統計分析
ノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定を異なる群の比較のために使用した。結果は、ｐ＜０．０５の場合、９５%の信頼で有意であると考えられた。全ての統計分析を、GraphPad Prismソフトウエアバージョン５を用いて実施した。
【０２１６】
予備試験での特定の目的
目的１：ＧＩＳＴ患者における処置に対する反応におけるＮＫｐ３０アイソフォームの保有率及び予測値。
イマチニブメシレートで処置された一連の＞４０人の消化管肉腫（ＧＩＳＴ）を持つ患者及び＞３０人の年齢及び性別を一致させた健常ボランティア（ＨＶ）を、個々のＮＫｐ３０アイソフォームの各々の発現のそれらの転写パターンについて検証した。
【０２１７】
並行して、精製された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でのＮＫｐ３０発現レベル及び機能（抗ＮＫｐ３０抗体を用いた架橋時での脱顆粒及びＩＦＮγ／ＴＮＦα産生）をアッセイしている。
ＮＫｐ３０のｍＲＮＡプロファイリング、タンパク質発現、及び機能の間の相関を、ｉ）ＨＶ患者及びＧＩＳＴ患者の間、ｉｉ）イマチニブメシレートを用いて処置された患者における進行性及び非進行性の間で検証した。
【０２１８】
目的２：神経芽細胞腫患者におけるＮＫｐ３０アイソフォームの予後値
特定のヒト悪性腫瘍（例えば神経芽細胞腫など）が、ＮＫ細胞により制御されうる。この仮定に基づき、本発明者らは、ＧＩＳＴ患者において立証されたＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現の保護的パターンも、従来の処置で処置された他の悪性腫瘍に適用されるか否かを研究している。１９人の神経芽細胞腫患者の予備コホートを試験した（良好な臨床予後を伴う患者対不良な臨床予後を伴う患者におけるＰＢＭＣ細胞中のＮＫｐ３０ ｍＲＮＡのプロファイリング）。
【０２１９】
目的３：ＮＫｐ３０アイソフォームの薬理学的調節
エピジェネティック調節によって選択的スプライシングの調節が可能になる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を使用し、本発明者らは、定義されたパターンを伴うＮＫ細胞株で、インビトロでの種々の割合の各々の個々のＮＫｐ３０スプライシングバリアントにおける潜在的な変化を試験している。
【０２２０】
結果
１．ＧＩＳＴ患者における処置に対する反応におけるＮＫｐ３０アイソフォームの保有率及び予測値
利用可能なデータベースに従い、ヒトＮＣＲ３遺伝子は、６つの異なってスプライシングされる転写物として発現される：２つの型の細胞外ドメインが存在する（可変Ｉｇ様ドメイン及び定常Ｉｇ様ドメイン）、それらの各々が３つの別々の細胞内ドメイン（短い、中間、及び長いテール）の１つに連結されている２４（図１）。
６つのＮＫｐ３０アイソフォームの臨床的及び機能的関連性を研究するために、本発明者らは、最初に、４１人のＧＩＳＴ患者（全員が少なくとも２ヶ月間にわたりイマチニブメシレートを用いて処置される−標準的ケア−）及び３７人のＨＶのＮＫｐ３０転写プロファイルを分析した。
特異的プライマーを、ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して６つの転写物を定量化するために、各ＮＫｐ３０アイソフォームについて設計した（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／短いテール；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／中間テール；ＬＯＮＧ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／長いテール；ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／短いテール；ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／中間テール；ＬＯＮＧ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／長いテール）（図２）。上で説明した通り、２回目において、SYBRGreenアッセイにおいて使用される上に記載したプライマーは、実際に、３つの別々の細胞内ドメインに特異的であるが、しかし、可変及び定常細胞外ドメインアイソフォームの間を識別することはできないと思われた。以下に加えた結果によって、ＬＯＮＧ、ＳＨＯＲＴ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥアイソフォームの間を識別するための第１の使用したプライマーの関連性が確認される。本発明者らは、また、第１の使用した抗体が、ＮＫｐ３０特異的であるが、定常ドメインアイソフォームを確実に特定することができず、しかし、可変細胞外ドメインアイソフォームを確実に検出することができることを発見した。以下に加えた結果は、本明細書においてより関連している。なぜなら、それらは、配列番号２５、２７（又は２２）、２８、２９、３１、３２、３３、及び４８により特定される上に記載するプライマーを使用して得られ、それらは、ＳＨＯＲＴ、ＬＯＮＧ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ可変細胞外ドメイン（“ＷＴ”）アイソフォームを特異的に特定することができる。それらは非常に重要な（二重）患者コホートで使用されたため、それらは本明細書で、特に被験者における癌の予後を評価するために、各アイソフォームの正確な相対量を制御するために使用可能である。
ＮＫｐ３０アイソフォームの発現を、ＰＢＭＣのｃＤＮＡから評価した。ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおける６つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合の比較によって、４１人の患者の第１コホートで、ＧＩＳＴ患者におけるＩＮＴＥＲ−ＤＥＬアイソフォームの過少発現量に関連するＳＨＯＲＴ−ＤＥＬアイソフォームの過剰発現量が明らかになった（図３Ａ）。
細胞内ドメイン［３つのＳＨＯＲＴ、ＩＮＴＥＲ、及びＬＯＮＧ細胞内ドメインについてのＷＴ（可変Ｉｇ様ドメイン）バリアント及びＤＥＬ（定常Ｉｇ様ドメイン）バリアントの合計］を考慮することにより、ＧＩＳＴ患者プロファイルは、最初に、ＨＶと比較した、ＳＨＯＲＴアイソフォームの過剰発現量及びＩＮＴＥＲアイソフォームの過少発現量により特徴付けられた（図３Ｂ）。
処置の経過中での４人のＧＩＳＴ患者におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの安定性を制御した（図４）。患者の大半が、安定なＮＫｐ３０プロファイルを示した。
６つのＮＫＰ３０アイソフォームに基づく階層的クラスタリングアプローチを使用し、本発明者らは、最初に、２群における患者のコホートを分離した（図５）。Ｂ群の患者は、進行までの加速時間（４５ヶ月で３５%の再発）を示した。対照的に、Ａ群の患者のわずか１６%がイマチニブメシレートの４５ヶ月後に再発した。興味深いことに、ＨＶの５０%が、好ましくないＢ群において分離された。
本発明者らは、Ａ群及びＢ群に関連するＮＫＰ３０転写プロファイルを特徴付けた（図６）：Ａ群は、この特定の例において、ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイル（「プロファイルＡ」と呼ぶ）により特徴付けられ、Ｂ群は、ＧＩＳＴ患者（図６Ａ−Ｂ）についてと同様に健常ボランティアについて、ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高プロファイル（「プロファイルＢ」と呼ぶ）により特徴付けられた（図６Ｃ−Ｄ）。
【０２２１】
２．ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおけるＮＫｐ３０アイソフォームの転写プロファイルの機能的関連性
ＨＶ及びＧＩＳＴ患者から精製されたＮＫ細胞でのＦＡＣＳ分析におけるＮＫｐ３０細胞表面発現の比較では、プロファイルＡ対プロファイルＢを示し、有意差は明らかにならなかった（図７）。興味深いことに、これらの２つのプロファイルの機能的な特徴付けによって、ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高プロファイルＢと、インビトロでのＮＫｐ３０架橋時のＮＫ細胞による（精製ＮＫ細胞上での）ＩＦＮγの低産生の間の関連が明らかになった（図８）。
関連性は、これらのＮＫ細胞の細胞毒性機能とＮＫｐ３０プロファイルの間で検出されなかった（データ示さず）。
【０２２２】
３．ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおけるＮＣＲ３突然変異とＮＫｐ３０アイソフォームの転写プロファイルの間での関連性
Ｂ群のＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高転写プロファイルは、非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異に関連する（Ｂ群の突然変異した個人の１３%対Ａ群の０%）。
Ａ群のＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイルは、ＮＣＲ３遺伝子の３’非翻訳領域中に位置付けられるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異に関連する（Ａ群の突然変異した個人の５８%対Ｂ群の３%）（図９）。興味深いことに、ＮＣＲ３＊３７９０ Ｃ突然変異は、ＮＣＲ３遺伝子中のポリアデニル化部位を破壊する（図１０）。ＮＣＲ３＊３７９０ ＣＣ患者での結果は、ＩＮＴＥＲアイソフォームの排他的な転写である（データ示さず）。
【０２２３】
４．神経芽細胞腫患者におけるＮＫｐ３０アイソフォームの予後値
神経芽細胞腫における６つのＮＫｐ３０アイソフォームの臨床的な関連性を研究するために、本発明者らは、良好な又は不良な臨床予後を伴う診断時の１９人の患者でのＮＫｐ３０転写プロファイルを分析した。
ＮＫｐ３０アイソフォームの発現を、ＰＢＭＣのｃＤＮＡから評価した。神経芽細胞腫患者における６つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合の比較によって、良好な予後を伴う神経芽細胞腫患者と比較し、不良な予後を伴う神経芽細胞腫患者におけるＩＮＴＥＲアイソフォームの過少発現量に関連するＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過剰発現量の傾向が明らかになった（図１１）。
６つのＮＫＰ３０アイソフォームに基づく階層的クラスタリングアプローチを使用し、本発明者らは、２群における患者のコホートを分離した（図１２）。良好な臨床予後を伴う７人の患者の５人が、ＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイルにより特徴付けられる２群において分離された（図１３）。この特定の例において、非進行性ＧＩＳＴ患者（プロファイルＡ）において立証されたＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現の保護的パターンが、良好な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者に適用されると思われた。
【０２２４】
５．薬物を用いたＮＣＲ３遺伝子の選択的スプライシングの調節
選択的スプライシングを調節するいくつかのアプローチを使用し、ＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高（本試験（パートＡ）において得られた最初の結果後にプロファイルＢとして特定された）からＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低（本試験（パートＡ）において得られた最初の結果後にプロファイルＡとして特定された）へのスイッチを操作してよい。
本発明者らは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤に属する薬物のいくつかのファミリーを試験している。
ＹＴＳ細胞株及びＮＫ９２ ＮＫ細胞株をモデルとして使用した。なぜなら、両方がＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高（パートＡにおいてプロファイルＢとして特定された）を示すからである。予備結果によって、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及び５−アザシチジン（５ＡＺＡ）が、ＹＴＳ細胞株及びＮＫ９２細胞株においてそれぞれＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過少発現量に関連するＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な過剰発現量を誘導できることが示された（図１４）。
【０２２５】
Ｂ．追加試験（８０人の患者／５６人の健常ボランティアのコホート）
材料及び方法
発現ベクターにおけるスプライセオソームのクローニング及びトランスフェクション
合成された第１鎖ＮＫ９２ ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、HotStarTAQ DNAポリメラーゼ（Qiagen）を用いて５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して増幅した。クローニングシステムのために使用されるＨＰＬＣ精製プライマーを、Primer3 v0.4.0ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu/）を用いてデザインした：ＮＫｐ３０ｂ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０ ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡ ＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号３４）及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ｂ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡ ＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３５）；ＮＫｐ３０ｃ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ｃ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡ ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３６）；ＮＫｐ３０ａ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ａ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３７）。下線を引いた配列は、発現プラスミドベクター中のＤＮＡクローニング用の制限酵素認識部位である。
【０２２６】
サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で１５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、及びｃプライマーについてアニーリング（６７℃で３０秒）、及び伸長（７２℃で１分）の３０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで単離し、QIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を使用して精製し、そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ（Ozyme）を用いて消化した。消化されたフラグメントをｐＩＲＥＳバイシストロニック哺乳動物発現ベクター（Clontech）に連結した。ヌクレオチド配列をABI PRISM 310遺伝子アナライザー（Applied Biosystems）により分析した。
【０２２７】
ＮＫＬクローンを使用した機能試験
ＤＣ／ＮＫクロストーク。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４中で培養された０．５×１０５個の未熟単球由来ＤＣを、前に記載された通りに１７、ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、又はｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）アイソフォームのいずれかを発現する１．５×１０５個のＮＫＬクローンと２４時間、１：３の比率で混合した。上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡヒトＩＦＮγ、ヒトＴＮＦαキット（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）を使用してサイトカインレベルをモニターした。腫瘍／ＮＫ混合培養。１０５個のＨＥＫ ２９３（E. Vivier, CIML, Marseille, Franceの好意により提供）又はＧＩＳＴ ８８２（J. A. Fletcher, Harvard Medical School, Boston, MAの好意により提供）又はＭｅｌ ８８８を、ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、又はｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）アイソフォームのいずれかを発現する１０５個のＮＫＬクローンと２４時間、１：１の比率で混合した。上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡ（上に記載）を使用してサイトカインレベルをモニターした。架橋ＮＫｐ３０及び脱顆粒測定及びサイトカイン産生。以下の説明を参照のこと。
【０２２８】
患者及び健常ボランティアのコホート
ＮＫ細胞反応の免疫モニタリング試験によって、EORTC Phase III試験６２００５に登録されたＧＩＳＴ患者及びFrench Sarcoma Group Phase III臨床試験（ＢＦＲ１４）に含まれたＧＩＳＴ患者が前向きに検証され、ＩＭの用量及び持続時間がそれぞれ評価された（ｎ＝８０）。書面のインフォームドコンセントが、臨床試験及び免疫学的試験のための地域倫理委員会に従って患者から得られた。ヘパリン添加血液を処置中に（ＩＭ治療の２−９４ヶ月の間、平均＝２８±３ヶ月）患者から採取した。患者の特徴を表１に描写している。
【０２２９】
【表１５】
【０２３０】
腫瘍反応をコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより評価し、そして反応を処置の開始から３ヶ月後ごとにＲＥＣＩＳＴ基準に従って分類した。非進行性疾患には、安定疾患及び部分的又は完全な反応が包含された。
Ｎ＝５６の健常ボランティア（性別及び年齢を一致させたＧＩＳＴ患者）を免疫学的パラメーターのためのコントロールとして使用した。
【０２３１】
ＡＭＬ患者のコホート
標準的ＦＡＢ５７及びＷＨＯ基準５８に従いデノボＡＭＬを伴う年齢４５歳（±１２．６）の２１８人の患者について、利用可能なＦＬＴ３突然変異状態を分析した。腫瘍の突然変異状態を、前に記載した通りに決定した５１。全てを、ダウノルビシン又はイダルビシン及びアラシチン（ａｒａｃｙｔｉｎ）と組み合わせた導入化学療法により処置した。６０歳以下の患者（ｎ＝１９３）を自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）又は高用量のアラシチンを用いた集中化学療法に、他（ｎ＝２５）を中間用量のアラシチンを用いた化学療法に割り当てた。
【０２３２】
ＮＫｐ３０依存的サイトカイン分泌及びバルクＮＫ細胞上での脱顆粒の評価
ＧＩＳＴ患者及びＨＶのＰＢＭＣをFicoll-Hypaque（Amersham Pharmacia, Orsay, France）密度緩衝遠心分離により得た。ＮＫｐ３０架橋実験では、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞Easy Sepキット（Ｓtem Cell Technologies, Paris, France）を用いて精製し（純度＞９５%）、２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０（クローン２１０８４７、R&D Systems、Lille、France）又はアイソタイプコントロールを用いて７時間コーティングした９６ウェル−Maxisorpプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中に播種した。別の方法では、ＮＫ細胞を１０００IUのｒＩＬ−２（Chiron, USA）を用いて４０時間活性化した。次に、ＮＫ細胞の上清を、市販のＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）を使用し、それらのＴＮＦａレベルについて評価した。脱顆粒を、前に記載した通りに、フローサイトメトリーにより評価した１７。簡単に説明すると、ＮＫ細胞を、１０μMモネンシンを添加したＡＩＭＶ中で２μlの抗ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（クローンＨ４Ａ３，Pharmingen）と７時間インキュベートし、ＣＤ３／ＣＤ５６染色を架橋の終わりに実施した。
【０２３３】
アイソフォームのＲＴ−ＰＣＲ及び非階層的クラスタリング
全細胞ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen）を用いてＰＢＭＣ及びＮＫ細胞株から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、５μgの全ＲＮＡから、SuperScript（商標）II Reverse Transcriptase及びランダムプライマー（Promega）を使用し、Invitrogenの取扱説明書に従って合成した。６つのＮＫＰ３０転写物及びβ２Ｍハウスキーピング転写物のためのＰＣＲプライマー及びTaqManプローブをPrimer Expressソフトウェアｖ１．０（Applied Biosystems）を用いてデザインした。以下のプライマー及びプローブを使用した：
【表１６】
１マイクロリットルの第１鎖ｃＤＮＡを、１２．５μLの２×TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）及び０．７５μLのＮＫＰ３０プライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）又は０．５μLのβ２Ｍプライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）と最終容積２５μL中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、StepOnePlus System(Applied Biosystems）を使用して行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：最初のインキュベーション５０℃で２分、変性９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、そして６０℃（ＮＫＰ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、及びｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）、ならびにβ２Ｍ転写物について）で１分間の４５サイクル。リアルタイムＰＣＲデータを、２−ΔＣＴ方法を使用し、製造業者の指示に従って分析した。別々のＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と３つのａ、ｂ、及びｃアイソフォームの総量の比率として決定した。教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン中央相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した５６。
【０２３４】
ＮＣＲ３エクソン４の３’ＵＴＲ領域の遺伝子型決定
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿７５１４９０８＿１０を使用し、３７９０ Ｔ／Ｃ多型を遺伝子型決定することができる。簡単に説明すると、１０ngのゲノムＤＮＡを、５μlの２×TaqMan Genotyping Master Mix（Applied Biosystems）及び０．２５μlの４０×genotyping assayと最終容積１０μl中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、StepOnePlus System（Applied Biosystems）を使用して行った。
【０２３５】
統計分析。フィッシャー直接確率法及びノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定を異なる群の比較のために使用した。全ての統計分析を、GraphPad Prismソフトウエアバージョン５を用いて実施した。生存曲線をカプラン−マイアー方法に従ってプロットし、そしてログランク検定を使用して比較した。全生存率及び無増悪生存率についての独立危険因子を、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して決定した。生存分析のために、SPSS17.0ソフトウェアを使用した。
【０２３６】
結果
３つのＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４アイソフォームの発現クローニング
ＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４によりコードされる別々のアイソフォームの潜在的な機能を解明するために（図１）、本発明者らは、ｐＩＲＥＳ発現ベクター中に３つの別々のＮＣＲ３／ＮＫｐ３０スプライスバリアントをクローニングした（図１５）。これらの３つの転写物は、エクソン４Ｉ、４ＩＩ、及び４ＩＩＩを使用し、それぞれＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）、ＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）、及びＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）と名付けられている２３（配列番号８、９、及び１０）。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂの転写物は３’末端に２７６ｎｔを共有し、しかしながら、それらの最後のエクソンの５’スプラス部位で分岐し、ＮＫｐ３０ｂの４番目のエクソン（エクソン４ＩＩ）がＮＫｐ３０ａのイントロン３に５５ｎｔだけ伸びている。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂの転写物は、それぞれ位置３１６６４８２５及び３１６６４９５２に終止コドンを持ち、そしてＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００６．１０（配列番号１）を使用し、位置３１６６４６９０に共通のポリアデニル化シグナル（ポリアデニル化シグナル２）及び位置３１６６４６７１に共通のポリアデニル化部位を共有する。ＮＫｐ３０ｃの４番目のエクソン（エクソン４Ｉ）は、ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂのイントロン３に伸び、そして位置３１６６５０７０に別個の終止コドンを、そして位置３１６６５０４９及び３１６６５０３１にそれぞれポリアデニル化シグナル及び部位を持つ２４。３つの別々のＮＫｐ３０スプライスバリアントをコードするｃＤＮＡ構築物（配列番号８、９、及び１０で示す）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞株又はＮＫＬ細胞株に、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードするポリシストロニックレポーター遺伝子の５’に安定的にトランスフェクトした。Ｇ４１８中での選択後、表面ＮＫｐ３０発現を免疫蛍光法及び細胞蛍光測定により決定し、それをＧＦＰ蛍光又は非トランスフェクト細胞と比較した。全てのトランスフェクト細胞が、同程度のレベルのＧＦＰ及びＮＫｐ３０を発現した（図１６）。また、３つのＮＫｐ３０トランスフェクト細胞株は、他のＮＫ細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＣＤ２５、図１７）の発現において親細胞とは異ならず、それらの続く機能比較を可能にした。
【０２３７】
各ＮＫｐ３０アイソフォームの異なる機能を分析するために、本発明者らは、ＮＫｐ３０会合後にトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞及びＮＫＬ細胞からのサイトカイン放出をモニターした。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂのいずれかを発現する細胞が、それぞれ多量のＩＬ−２（図１８Ａ）及びＩＦＮγ（図１８Ｂ）を産生したのに対し、ＮＫｐ３０ｃアイソフォームを発現する細胞はＮＫｐ３０誘発に反応してサイトカインを分泌しなかった（図１８Ａ及びＢ）。ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｃ細胞は、また、未熟樹状細胞（ＤＣ）を認識しなかった。それは、ＤＣとの共培養において容易にＩＦＮγ及びＴＮＦαを分泌したＮＫＬ−ＮＫｐ３０ａ細胞又はＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｂ細胞とは対照的である３９（図１８Ｃ）。同様の結果が、可変レベルのＮＫｐ３０リガンドを発現するＨＥＫ２９３、Ｍｅｌ８８８、及びＧＩＳＴ８８２腫瘍細胞を使用して得られた（データ示さず）（図１８Ｄ）。細胞毒性アッセイによって、ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ａ（しかし、ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｂやＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｃではない）細胞が直接的な又は再指令された殺傷アッセイにおいて脱顆粒を示すことが明らかになった（図１９）。このように、ＮＫｐ３０ａが、細胞毒性レベルでＮＫエフェクター機能を誘発すことができる唯一のアイソフォームであると思われる。全体で、発現クローニングによって、このように、ＮＫｐ３０アイソフォームがインビトロでそれらのエフェクター機能において有意に異なること、及び、ＮＫｐ３０ｃが機能的に欠損したアイソフォームを構成することが、この後者の分子が細胞表面で安定に見え、正確に発現されることができるという事実にもかかわらず、明らかになった。
【０２３８】
８０人のＧＩＳＴ患者のコホートにおけるＮＣＲ３／ＮＫｐ３０遺伝子の異なる発現パターン
末梢ＮＫ細胞における３つのＮＫｐ３０アイソフォームの異なる発現プロファイルを研究するために、本発明者らは、ＧＩＳＴ患者又は健常ボランティア（ＨＶ）からのバルク抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）上のβ２ミクログロブリンに対して標準化された、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃ用の特異的プライマーを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムを使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。図２０において、各列は１つのＮＫｐ３０アイソフォームを表し、そして各カラムは１人のＧＩＳＴ患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。ＧＩＳＴ患者の８０人中４４人（５５%）が、ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂが最も主なアイソフォームである転写プロファイルを示した（<<プロファイルＡ>>と指定）（図２０Ａ及び２０Ｂ）。逆に、<<プロファイルＢ>>の個人は、高い割合のＮＫｐ３０ｃアイソフォームを提示した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。ＮＫｐ３０発現の細胞分布の高い特異性から予測される通り２６、各ＮＫｐ３０アイソフォームの異なる発現プロファイルを明らかにするＲＴ−ＰＣＲの結果が、ＰＢＭＣ対バルクＮＫ細胞において同程度であった（図２１）。経時的な個人内変動が有意に思われなかったことは注目に値する（４人の代表的な個人での疾患経過中の３〜４の異なる時間点で示されている、図４）。
【０２３９】
患者において得られた２つのプロファイルを解釈するために、本発明者らは、それらを、性別、年齢、及び地理的由来において一致された５６人のＨＶのコホートにおいて得られた各アイソフォームの相対的な転写収量と比較した。明らかに、ＨＶからのＰＢＭＣ又はＮＫ細胞が、プロファイルＡ ＧＩＳＴのような、ＮＫｐ３０ａ及びｂアイソフォームを主に発現する（図２０Ｂ）。
【０２４０】
さらに、プロファイルＡ及びプロファイルＢの個人が、同程度のレベルのＮＫｐ３０膜発現を示し、ＮＫｐ３０の共通する細胞外部分に特異的な抗体を用いて染色されたＮＫ細胞の比較細胞蛍光分析により決定された通りである（図２０Ｃ）。
【０２４１】
ＧＩＳＴ患者について確立されたクラスタリングを使用した５６人のＨＶからのＮＫｐ３０発現プロファイルの分類は、ＧＩＳＴ患者とＨＶが、主なＮＫｐ３０ｃ発現を伴う個人の割合において異なることを示す。ＧＩＳＴ患者の５３%がプロファイルＢを持ち、わずか３０%のＨＶがこのカテゴリーに入る（フィッシャー直接確率法：ｐ＝０．０２）（図２２Ａ）。
【０２４２】
全体で、これらの結果は、ＮＫｐ３０の優先的なエクソン４の使用における安定した表現型の存在、及び、非機能的なＮＫｐ３０ｃアイソフォーム（プロファイルＢ）の主な発現が、コントロールコホートよりもＧＩＳＴにおいてより高頻度であることを示す。
【０２４３】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）ＧＩＳＴ患者からのＮＫ細胞によるＴＮＦαの分泌欠損
次に、本発明者らは、ＮＫｐ３０のインビトロ架橋後に、<<プロファイルＡ>>（ｎ＝７６）対<<プロファイルＢ>>（ｎ＝６０）を示す個人からの精製ＮＫ細胞によるＴＮＦα放出を比較的に評価した。プロファイルＢを伴うＧＩＳＴ患者及びＨＶからのＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０ｃを過剰発現するトランスフェクトＮＫＬ細胞株において観察される機能的な欠損に従い、プロファイルＡの個人と比較し（図２２Ｂ）、ＴＮＦα産生における有意な減少を示す（上を参照のこと）。この異なる反応は、ＩＬ−２の非存在又は存在の両方において、ＮＫｐ３０の誘発時に得られた（図２２Ｂ）。しかし、それらのＮＫ細胞をＩＬ−２単独で刺激し（ＮＫｐ３０特異的抗体の非存在において）、ＴＮＦα分泌を測定した場合、プロファイルＡとプロファイルＢの個人の間で差は存在しなかった（図２２Ｂ）。ＮＫｐ３０依存的な反応における同様の差が、ＨＶを分析から除き、プロファイルＡ及びＢを伴うＧＩＳＴ患者だけを互いに比較した場合に得られた（図２２Ｃ）。重要なことに、プロファイルＢの患者からのＮＫ細胞が、プロファイルＡの患者と比較し、低下したＮＫｐ３０促進性の脱顆粒を示した（図２２Ｄ）。故に、ＮＫｐ３０スプライシングにおける個人内変動は、ＴＮＦα分泌及びＮＫ細胞脱顆粒に影響を与える。非機能的ＮＫｐ３０ｃアイソフォームを主に発現するプロファイルＢを伴う個人は、ＮＫｐ３０駆動性のＮＫエフェクター機能における明白で、しかしながら選択的な欠損を示す。
【０２４４】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）ＧＩＳＴ患者の不良な予後
本発明者らは、ＧＩＳＴ患者での全生存率の前向き分析を実施し、それらは全てＫＩＴチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブメシレート（ＩＭ）を用いて処理された。８０人のＧＩＳＴ患者での臨床経過観察の平均は５１ヶ月（±２４）であった。プロファイルＡ及びＢは、ＧＩＳＴ予後を決定する古典的なパラメーターのいずれかにおいて有意に異ならなかった（表１）。このように、長期生存に関連するｃ−ＫＩＴプロトオンコジーンのエクソン１１突然変異を持つ腫瘍を伴う患者の割合は、プロファイルＡ及びプロファイルＢにおいてそれぞれ５５%及び５３%であった（フィッシャー直接確率法：ｐ＝ｎｓ）８。プロファイルＢの患者は、単変量解析において最初のＩＭ処置から劣る全生存率を有することが見出された（生存の中央値：プロファイルＢにおける８０ヶ月対プロファイルＡにおいて中央値に達せず、ログランク検定：ｐ＝０．００１）（図２３Ａ）。Ｃｏｘモデルを使用した多変量解析において、プロファイルＢが、全生存率についての唯一の独立予後因子として保持された（ＲＲ＝１３．１、９５% ＣＩ［４．９−３６．１］、ｐ＝０．０１）。対照的に、ＮＫ細胞のＮＫｐ３０発現レベルが同じコホートの患者内での全生存率に影響を有した（図２３Ｂ）。全体で、これらデータは、機能異常ＮＫｐ３０ｃアイソフォーム（プロファイルＢ）の優先的な発現がＧＩＳＴ患者における憂うつな治療の転帰を予測することを示す。
【０２４５】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）患者に関連するＮＣＲ３＊３７９０Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）
次に、本発明者らは、ＮＫｐ３０スプライスバリアントの優先的な発現をこの遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型に関連付けることを試みた。スプライシング変異は、ＮＫｐ３０ａ／ｂの転写を可能にするポリアデニル化シグナル２の喪失を導き、選択的ＮＫｐ３０ｃ転写を駆動することが提示されている。実際に、ＮＣＲ３遺伝子のポリアデニル化シグナル２における位置するＳＮＰ（ＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ、ｒｓ９８６４７５）（図１）が、ＡＡＵＡＡＡモチーフ内の一塩基置換に起因するＮＫｐ３０ａ／ｂの転写を除去しうる。それは次にポリアデニル化及び切断効率に影響を与える５９。従って、本発明者らのデータは、ＮＣＲ３＊３７９０がＮＫｐ３０エクソン４の選択的スプライシングを制御することができることを示す。実際に、プロファイルＢパターン（ＮＫｐ３０ｃ過剰発現）を提示するそれらの患者の５１%が、ＮＣＲ３＊３７９０ ＴＣ又はＣＣ遺伝子型を示した（対プロファイルＡを示すＧＩＳＴ患者における０%、フィッシャー直接確率法：ｐ＜０．０００１）（図２４Ａ）。同様に、プロファイルＢパターンを提示するＨＶの約５８%が、ＮＣＲ３＊３７９０ ＴＣ又はＣＣ遺伝子型を持った（図２４Ｂ）。結論として、ＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃは、欠損ＮＫｐ３０ｃアイソフォームの発現を上昇させるエクソン４Ｉの異常な使用に導くことができる因子の１つである。
【０２４６】
ｃ−ＫＩＴ及びＦＬＴ３における機能獲得突然変異は、ＧＩＳＴ及びＡＭＬ患者においてＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃに関連する
オンコジーン駆動性のＤＮＡ損傷反応は、ＮＫ細胞認識のために要求されるＮＣＲリガンドの膜発現を誘発し、そしてこれは免疫媒介性の腫瘍抑制の機構を構成しうる６０。従って、欠損したＮＫ細胞機能が、特定の悪性腫瘍の発生の素因となりうる。軽微なＮＫ細胞機能障害を、定義されたオンコジーン駆動性の悪性腫瘍と一致させる試みにおいて、本発明者らは、別々のｃ−ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα突然変異を持つＧＩＳＴ患者（ＧＩＳＴ患者の約１４%がｃ−ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲαにおける突然変異を持たないことに注意すること）ならびにＦＬＴ３内部タンデム重複遺伝子バリアント（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を持つ急性骨髄白血病（ＡＭＬ）を伴う患者（ＡＭＬの約１５%において発癌を駆動させる）におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度を決定することを選んだ６１。本発明者らは、ＡＭＬにおいてＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの存在とＦＬＴ３−ＩＴＤの間に有意な関連性を見いだした。ＮＣＲ３＊３７９０突然変異バリアントを提示するＦＬＴ３−ＩＴＤを持つＡＭＬの３４．６%（１８／５２）対ＦＬＴ３−ＩＴＤオンコジーンを欠くＡＭＬにおける１８．７%（３１／１６６）（フィッシャー直接確率法：ｐ＝０．０１）（図２４Ｃ）。ＧＩＳＴについては、検出可能なｃ−ｋｉｔ又はＰＤＧＦＲα突然変異を持つＧＩＳＴの２１%（ｎ＝４３）がＮＣＲ３＊３７９０ＳＮＰを提示したが、検出可能なｃ−ｋｉｔ又はＰＤＧＦＲα突然変異を欠くＧＩＳＴ患者の０%（ｎ＝６）がこのＮＣＲ３＊３７９０ＳＮＰを示した（図２４Ｄ）。これらの結果は、ＮＫｐ３０アイソフォーム発現（及び、拡大すると、ＮＫ細胞機能）に影響を与える多型が、オンコジーン受容体チロシンキナーゼの活性化突然変異により駆動される２つの悪性腫瘍において遺伝的に相互作用しうることを示唆する。
【０２４７】
考察
１９９９年に記載されたが２４、ＮＫｐ３０のスプライセオソーム（spliceoform）は決して研究の題材になることはなかった。本明細書において、本発明者らは、初めて、８０人の患者及び５６人の健常ボランティアの重要なコホートで、消化管肉腫の発生中でのＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４スプライセオソームの病理生理学的関連性を記載しており、標的処置の経過中でのＮＫｐ３０ａ／ｂアイソフォームの保護機能を強調している。
【０２４８】
選択的スプライシングが、ヒトゲノムにおいて、具体的には神経遺伝子及び免疫関連遺伝子についての機能調節の主要な機構として現れている。選択的スプライシングの使用は、発生、組織特異的、又は病理依存的な方法で細胞により制御されることができる。細胞は、公知のリン酸化経路、選択的スプライシングパターンを調節するためのスプライシング因子の再局在化及び合成を使用する６２、６３。ヒトＮＣＲ３遺伝子は、少なくとも３つのユニークなカルボキシ末端を伴うタンパク質をコードしうるいくつかの選択的スプライシング形態を有する。
ｃＤＮＡ選択、それに続くヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリースのクリーニングによって、ヒトＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４の３つの選択的形態が明らかになり、そのｃＤＮＡがシークエンシングされ、ＧｅｎＢａｎｋに提出された（受入番号ＡＦ０３１１３６−３８）２４、２５。初期の試験によって、ＮＫｐ３０ ｍＲＮＡが脾臓、扁桃腺、Ｂ細胞株、及びＮＫ細胞株において、そして肝臓における異なるスプライシングパターンを伴い発現されることが明らかになった。実際に、ＮＣＲ３／ＮＫｐ３０の全ての３つの主なスプライス形態、即ち、ｈＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）（ＡＦ０３１１３７）、ｈＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）（ＡＦ０３１１３６）、ｈＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）（ＡＦ０３１１３８）がヒト扁桃腺及びＮＫ細胞において発現され、完全なエクソン２を含んだ。しかし、ヒト肝臓でのＲＴ−ＰＣＲによって、エクソン２（完全なエクソン２又は７５bp欠失エクソン２）のレベルでの２つのアイソフォームにおけるｈＮＫｐ３０ａの非存在、しかし、ｈＮＫｐ３０ｂの存在を示すユニークなパターンが明らかになった。抗ＮＫｐ３０ペプチド抗体を用いた免疫染色を使用し、Sivakamasundari et al.(2000)は、ヒトＮＫ細胞と適合性がある扁桃腺中でのリンパ濾胞の胚中心におけるＮＫｐ３０タンパク質の存在を明らかにすることができた２５。２００５年に、ヒトＮＫｐ３０遺伝子の６つのアイソフォームの詳細な転写分析が、胎児及び成人の両方の組織において実施されている３２。Ｖ型Ｉｇドメイン含有形態（ＮＫｐ３０ａ、ｂ、及びｃ）がより高度に発現されている形態であり、ＮＫｐ３０ｃが最も遍在し、豊富な形態である（胎児脳を除く）ことは注目に値する。興味深いことに、ＮＫｐ３０ａ及びｂが、脳の主なスプライセオソームであった３２。
【０２４９】
ＮＫ細胞における種々のＮＫｐ３０アイソフォームの協調発現を制御する機構は不明確なままである。興味深いことに、この発現パターンは、ＣＤ５６発現レベル及びＣＤ２７に基づいて区別される異なるＮＫ細胞サブセットにおいて同様であることが見出された（ＮＤ、示さず）。さらに、イマチニブメシレートを用いたＧＩＳＴ治療が、ある場合において、数年に及び、経時的にＮＫｐ３０発現のパターンを調節するようには思われなかった（図４）。薬理学的化合物、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤（トリコスタチンＡ、バルプロ酸、酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、配列番号４９〜５１に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（前に説明した）、又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン）は、遺伝子の選択的スプライシングにおいて干渉することが公知であり、ＮＫ細胞の欠損機能に関連するパターンを制御する／切り替える貴重なツールを表わしうる。
【０２５０】
目的の配列
− ＮＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）
＞ｒｅｆ｜ＮＣ＿０００００６．１０｜ＮＣ＿０００００６：ｃ３１６６８９３３−３１６６４６５１ホモサピエンス染色体６、参照アセンブリー、完全配列
【表１７】
注意：エクソン配列はボールド体である。開始コドン及び終止コドンに下線を引いている。エクソン２における欠失はイタリック体である。
【０２５１】
− ６つのＮＫＰ３０アイソフォームのペプチド配列：
「短いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号２（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６３）
【表１８】
「中間テール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号３（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６４）
【表１９】
「長いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号４（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６２）
【表２０】
「短いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号５（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２１】
「中間テール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号６（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６５）
【表２２】
「長いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号７（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２３】
注意：太字のアミノ酸は以下のドメインに隣接する：（左から右へ）シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン。
可変Ｉｇ様ドメインを含むアイソフォームにおいて、定常Ｉｇ様ドメインを特徴とする欠失した細胞外領域に下線を引いている。
【０２５２】
− ６つのＮＫＰ３０転写物のヌクレオチド配列：
「短いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号８
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１１）
【表２４】
「中間テール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号９
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１２）
【表２５】
「長いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号１０
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１０）
【表２６】
「短いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号１１
（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２７】
「中間テール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号１２
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１３）
【表２８】
「長いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号１３
（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２９】
注意：開始コドンに下線を引いている。元の終止コドンはボールド体である。
【０２５３】
プライマー配列
− ３５７１Ｇ／Ｔ及び３７９０Ｔ／Ｃの多型を含むＮＣＲ３遺伝子の３つの領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマー：
【表３０】
【０２５４】
− ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のための６つのＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物を増幅する特異的プライマー：
【表３１】
【０２５５】
− ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のための６つのＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物を増幅する特異的プライマー：
【表３２】
【０２５６】
− ６つのＮＫＰ３０アイソフォームのクローニングのために使用したＨＰＬＣ精製プライマー：
【表３３】
【０２５７】
− 特異的な抗ＮＫｐ３０抗体を得るために使用したＮＫｐ３０細胞外及び細胞内ドメインならびにアミノ酸ペプチドのペプチド配列：
ＮＫｐ３０アイソフォームの可変Ｉｇ様細胞外ドメイン−配列番号３８
【表３４】
ＮＫｐ３０アイソフォームの定常Ｉｇ様細胞外ドメイン−配列番号３９
【表３５】
ＮＫｐ３０アイソフォームの短い細胞内ドメイン−配列番号４０
【表３６】
ＮＫｐ３０アイソフォームの中間細胞内ドメイン−配列番号４１
【表３７】
ＮＫｐ３０アイソフォームの長い細胞内ドメイン−配列番号４２
【表３８】
特異的な抗ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４３
【表３９】
特異的な抗ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４４
【表４０】
特異的な抗ＮＫｐ３０短いＩｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４５
【表４１】
特異的な抗ＮＫｐ３０中間Ｉｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４６
【表４２】
特異的な抗ＮＫｐ３０長いＩｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４７
【表４３】
注意：定常Ｉｇ様ドメインを特徴とする欠失した細胞外領域を、可変Ｉｇ様ドメインにおいて下線を引く。特異的な抗ＮＫｐ３０抗体を得るために使用したペプチドの配列は、ＮＫｐ３０細胞外及び細胞内ドメインの配列においてボールド体である。
ＮＫＰ３０プローブ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：
【表４４】
配列（標的：ポリアデニル化シグナル１）
【表４５】
配列（標的：ポリアデニル化部位１）
【表４６】
配列ＩＮＴＥＲを遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【表４７】
【０２５８】
【表４８】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、遺伝学、免疫学、及び医薬の分野に関する。本発明者らは、特に、被験者において癌の予後を決定するために使用することができるヒト遺伝子の同定、任意の処置前での癌の処置に対する被験者の感受性、又は所定の期間後での癌の処置の有効性を開示する。ヒト遺伝子を、さらに、癌の予防又は処置において、ならびに治療活性薬物のスクリーニングのために使用してよい。
本開示は、より具体的には、特に異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０受容体（ＮＫｐ３０タンパク質）アイソフォームの発現又は活性をもたらす変化したＮＣＲ３又はＮＫｐ３０の遺伝子発現に関与する変化した又は異常な細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）遺伝子に関し、前記の異常な遺伝子、転写物アイソフォーム、及びタンパク質アイソフォームが治療介入のための新規標的を表わす。
【０００２】
背景
癌と効率的に戦うことは、腫瘍細胞を直接標的とする、又は、細胞に対する宿主防衛を高める医薬的化合物に依存する。いくつかの抗癌治療が提示されており、とりわけ特徴的なのは、化学療法［アントラサイクリン、例えばドキシサイクリン（ＤＯＸ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）（本明細書においてＰＬＡＴと呼ぶ）及びシスプラチン（本明細書においてＰＬＡＴと呼ぶ）、ならびにチロシンキナーゼ阻害剤などが腫瘍学者の武器である最も効率的な細胞毒性薬剤であると考えられている］及び放射線療法［Ｘ線（ＸＲ）］であるが、前記処置の利益は依然として不十分な傾向がある。上記治療が抗癌治療の７０%までの基礎を表わすため、処置に対する低下反応に関与する機能障害の検出が、患者管理のために不可欠であるように思われる。
腫瘍の治療耐性という出現する問題は、第一に、腫瘍での処置の有効性、そして、第二に、腫瘍細胞の根絶における免疫宿主系の有効性を考慮する重要性を強調する。本発明者らは、本明細書において、内因性（免疫）腫瘍抑制機構が、癌処置により誘導される外因性腫瘍抑制機構と相乗的に作用すること、及び、免疫反応に関与する遺伝子中の突然変異がこれらの外因性腫瘍抑制機構に影響を与えることを実証する。遺伝子の突然変異及び転写状態は、癌処置に対する臨床反応を予測する新たな因子を構成する。
【０００３】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は、消化管の最もよく見られる間葉性腫瘍である１。ＧＩＳＴは、カハールの間質細胞、腸ペースメーカー細胞の腫瘍性形質転換に起因すると考えられる。ＧＩＳＴの真の発生率は未知のままであるが、しかし、臨床試験からの経験によって米国における１年当たり４５００〜６０００の新症例の発生率が示唆される２。診断時の年齢中央値は約５８歳である。
歴史的には、ＧＩＳＴは、３つの従来の癌治療モダリティーにより標的にされてきた：外科手術、化学療法、及び放射線療法。外科手術は、切除可能な疾患を伴う患者に有効であるが、しかし、疾患は５０%もの個人において再発しうる。化学療法及び放射線療法ではほとんど有効性が示されていない３。大きな進展が、ＧＩＳＴにおけるＫＩＴオンコジーン中の「機能獲得」突然変異の発見と共に１９９８年に起きた４。ＫＩＴは膜貫通ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ（ＣＤ１１７）をコードし、それは、そのリガンドによる結合を介して活性化される場合、細胞内情報伝達プロセスを調節する。突然変異による構成的なチロシンキナーゼの活性化は、無調節な細胞増殖及び悪性形質転換をもたらす。ＧＩＳＴの９０%超が、活性化ＫＩＴ突然変異を持つ５。これらの突然変異は、共通して、症例の５７〜７１%においてエクソン１１（膜近傍ドメイン）、症例の１０〜１８%においてエクソン９（細胞外ドメイン）、症例の１〜４%においてエクソン１３（チロシンキナーゼドメインＩ）、及び症例の１〜４%においてエクソン１７（チロシンキナーゼドメインＩＩ）において起こる１。ＫＩＴ突然変異を欠くＧＩＳＴの約３５%が、関連する受容体チロシンキナーゼ、小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲＡ）をコードする遺伝子において活性化突然変異を有する６。ＰＤＧＦＲＡ突然変異は、エクソン１２（ＧＩＳＴの１〜２%）、エクソン１８（２〜６%）、及びエクソン１４（＜１%）において同定されている７。ＫＩＴ及びＰＤＧＦＲＡ突然変異の同定は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いた特異的な標的治療の開発を導いた。ＴＫＩイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１、Gleevec-Novartis）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８、Sutent-Pfizer）を用いた治療は、切除不可能な転移性及び再発性疾患に有効である８。イマチニブは、ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲＡ、及びＡＢＬを含むいくつかのチロシンキナーゼを選択的に阻害する。第ＩＩ相イマチニブ試験からのデータによって、ＫＩＴの突然変異状態がイマチニブに対する臨床反応を予測する最も重要な因子であることが明らかになった８。イマチニブを受けたエクソン１１ＫＩＴ突然変異体を発現するＧＩＳＴを伴う患者は、実質的により高い部分反応率、より長い生存期間中央値、及び野生型又はエクソン９ＫＩＴ突然変異体を発現するＧＩＳＴを伴う患者よりも進行するより低い可能性を有した。イマチニブは劇的に有効な薬剤であるが、しかし、その利益の持続時間は有限である。第２の標的チロシンキナーゼ阻害剤であるスニチニブマレートは、近年の励みになる結果の後に、イマチニブ耐性ＧＩＳＴの処置のために承認されている９。しかし、前に説明された通り、薬物耐性はますますよく見られる現象である１０。
【０００４】
小児における全ての癌関連死亡の１５%に関与し、神経芽細胞腫は、小児集団に影響を与える、最もよく見られる頭蓋外悪性腫瘍であり、そして２番目に最もよく見られる充実性腫瘍である１１。末梢交感神経系のこの癌は、提示のその二又パターンのために周知である。小児の約半分が、外科手術単独で治癒することができる局在化腫瘍を有する。肝臓、皮膚、リンパ節、又は骨髄を含む疾患を示す年齢１歳未満の小児の小さな部分集合は、それらの疾患の範囲にも関わらず良好な予後を有する。残りの小児は、広範囲にわたる転移性疾患又は非常に大きい、侵襲性の局在化腫瘍を有する。これらの小児は、約３０%の不良な長期生存率を有する。神経芽細胞腫を伴う小児を処置する課題は、低リスク疾患を伴う患者での過剰処置を回避しながら、高リスク患者の生存率を増加させることである。神経芽細胞腫における転帰の標準的な予後指標は、年齢、病期、及び組織病理である。追加の染色体マーカー及び分子マーカーが存在し、リスク群割り当て及び転帰予測の正確性が改善し始めている１２。
【０００５】
抗腫瘍反応の役者の内、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞標的を直ぐに殺し、そしてサイトカイン、例えばＴＮＦα及びＩＦＮγなどを産生する強力な能力によって腫瘍に対する先天的防御を提供する１３。
【０００６】
ＮＫ細胞は、マウスにおいて転移性腫瘍の播種を予防することにより腫瘍増殖を制御する１４。ヒト悪性腫瘍におけるＮＫ細胞の関連性は、Nature Immunolのために書かれた最近のＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅにおいて本発明者らにより考察されている１５。本発明者らにより得られた最近発表されたデータによって、ＧＩＳＴ患者において、ＧＩＳＴ腫瘍が、イマチニブメシレート（ＩＭ）を用いた代表的標準治療の間にＮＫ細胞により制御されうることが確立された。実際に、ＩＭはｃ−ｋｉｔ依存性ＤＣ／ＮＫ細胞クロストークを促進し、マウス及びヒトの両方においてＮＫ細胞のＩＦＮγ産生に導くことができる１６。重要なことには、２ヶ月のＩＭ後でのＮＫ細胞のＩＦＮγ産生が、ＩＭで処置された進行性ＧＩＳＴにおける長期生存の独立予測因子を表した１７。精製ＮＫ細胞でのそのような増強されたＩＦＮγ産生が、成熟ＤＣを用いた短期間のエクスビボでの再刺激後に達成され、「免疫学的レスポンダー」からのＮＫ細胞がＧＩＳＴ発生の間にインビボで予備刺激されていたことを示唆する１８、１９。ヒトの癌に対するそれらの有効な役割に関する進行中の疑問にも関わらず、ＮＫ活性化又はサイトカイン受容体の生理学的連結及び／又は阻害受容体の遮断は、ＮＫ細胞の増殖、輸送、細胞傷害性、ケモカイン及びサイトカインの産生、ならびに血液学的悪性腫瘍及び一部の充実性腫瘍を抑えるために利用することができる樹状細胞誘発をもたらしうる。
【０００７】
ヒトの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、高密度の多型遺伝子により特徴付けられた、染色体領域６ｐ２１．３内に約４メガベースのＤＮＡを包含する２０、２１。クラスＩＩＩ ＭＨＣのテロメア末端は、クラスＩＶ領域と指定されている。なぜなら、それが、炎症機能をコードする遺伝子、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、同種移植炎症因子１（ＡＩＦ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）、リンホトキシン−α ＬＴＡ）及び−β（ＬＴＢ）、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３（ＢＡＴ３）、白血球特異的転写物１（ＬＳＴ１）、ならびに細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３／１Ｃ７／ＣＤ３３７／ＮＫｐ３０）などを含むからである２２（図１を参照のこと）。ＮＣＲ３遺伝子は、いくつかのｍＲＮＡスプライスバリアントに転写され、その大部分が免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面分子に翻訳される２３−２５。ＮＣＲ３遺伝子産物の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を生成することにより、Morettaのグループは、ＮＣＲ３遺伝子産物の細胞分布を定義し、腫瘍細胞及び樹状細胞の殺傷に関与する新規ＮＫ細胞受容体としてＮＫｐ３０を特徴付けることに成功した２６、２７。それは、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＮＫｐ８０も含むいわゆる細胞傷害受容体（ＮＣＲ）の一部である２８。ＮＫ細胞中でのその発現を超えて、ＮＫｐ３０を、ＩＬ−１５刺激された臍帯Ｔリンパ球２９及び子宮内膜上皮細胞３０の表面上に暴露させることができる。しかし、成人の抹消血においては、循環ＮＫｐ３０発現細胞だけがＮＫ細胞である。ＮＫｐ４６とは対照的に、ＮＫｐ３０のマウスオルソログは偽遺伝子（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）において、しかし、Ｍｕｓ ｃａｒｏｌｉではない）であり２５、３１、３２、ＮＫｐ３０の探索のための適したマウスモデルがないことを意味する。しかし、ラットは、ＮＫｐ３０に対するオルソログタンパク質をコードする遺伝子ＮＣＲ３を発現し３３、転写物がマカク（Ｍ． ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において検出される３２。
【０００８】
ヒトＮＫｐ３０は、２つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含む細胞外可変型Ｉｇ様ドメインを伴う１９０のアミノ酸の膜貫通タンパク質である２６。３つの選択的スプライシングは、それらがいずれの特定のエクソン４を利用するかに依存して、３つの異なる細胞内ドメイン（３６、２５、及び１２のアミノ酸を有する）を産生することができる２４。追加の選択的スプライシングは、細胞外ドメインにおける２５ＡＡの欠失を誘導し、可変型Ｉｇ様ドメインの代わりに、予測される定常型Ｉｇ様ドメインの形成に導くことができる２４、３２。ＮＫ細胞の細胞表面での複数の形態のＮＫｐ３０の存在を受けて、ＮＫｐ３０に対するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによって、恐らくはグリコシル化における差に、しかし、また、最終的には代替タンパク質コアに対応する約１０kDの広いバンドが明らかになる２６。これらの代替形態のＮＫｐ３０が記載されたが、この観察の機能的関連性はまだ明らかではない。
【０００９】
腫瘍環境におけるＮＫｐ３０の役割に関して、ＮＫｐ３０は、種々の腫瘍（癌腫、神経芽細胞腫、骨髄及びリンパ芽球性白血病を含む）のインビトロでの溶解及びまた種々の細胞株の溶解に関与してきた２６、３４、３５。ＮＫｐ３０は、免疫反応（標的を攻撃する）のエフェクター段階だけでなく、同種免疫の予備刺激段階でも要である。実際に、ＮＫｐ３０は、ＤＣ細胞及びＮＫ細胞の間のクロストークを調節している。本発明者らはマウスにおいてＮＫ細胞活性化を誘発するＤＣの能力を記載した最初であり３６、そして続く研究によってこれらの細胞型の間での双方向性の調節が明確に確立された２７、３７、３８。ＤＣ／ＮＫ比率及びＮＫ細胞側でのＫＩＲ／ＮＫＧ２Ａ発現に依存して、活性化ＮＫ細胞が未熟ＤＣの活性化を弱める又は促進しうる。両方の場合において、ＮＫｐ３０がＮＫ細胞によるＤＣの認識に直接的に関与する。後者の場合において（活性化ＮＫ細胞が未熟ＤＣを活性化する場合）、ＮＫｐ３０誘発がＮＫ細胞によるＴＮＦα及びＩＦＮγの放出を導き、両方のサイトカインがＤＣ成熟プロセスに参加する３９。故に、ＤＣ／ＮＫ細胞のクロストークが、Ｔｈ１分化を調節するために不可欠であるように思われる４０、４１。従って、ＮＫｐ３０誘発は、リンパ節における適応免疫反応のマスターレギュレーターを表わしうる。
【００１０】
最近の試験によって、ヒトのマラリア感染におけるＮＫｐ３０の役割が実証されている４２、４３。結果は、ＮＫｐ３０が、ＮＫ細胞−熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が寄生した赤血球細胞の相互作用に関与することを示唆する４２。この相互作用は、直接的、特異的、及び機能的であり、パーフォリン産生及びグランザイムＢ放出に導く。さらに、関連性が、軽度マラリアとＮＣＲ３プロモーター内に位置付けられる突然変異の間で実証されている（ＮＣＲ３−４１２ Ｇ／Ｃ − ｒｓ２７３６１９１）４３。これは、ＮＫｐ３０における遺伝的変異が熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球に対するヒトＮＫ細胞の反応性の不均一性を説明しうることを示唆する４４。
【００１１】
ＮＫｐ３０が、標的細胞（腫瘍細胞又は樹状細胞）の細胞膜上の硫酸ヘパリン残基を識別しうることが示唆されている４５。しかし、これらの結果は、Warren et al.により批判された４６。Angel Porgadorのグループは、これらの試験において使用された種々のＮＫｐ３０Ｆｃ組換えタンパク質を比較することによりこの論争に決着をつけようと試みた。彼らの知見は、Ｆｃタンパク質上でのグリコシル化がＮＫｐ３０リガンドの認識において重要であることであり、及び、彼らは、硫酸ヘパリンがインビトロアッセイにおいて組換えＮＫｐ３０に結合するとの彼らの最初の知見を確認している４７。Pogge et al.は、白血球抗原−Ｂ−関連転写物３（ＢＡＴ３）が腫瘍細胞により放出され、そしてＮＫｐ３０と会合すると主張している４８。Byrd et al.は、ＮＫｐ３０リガンドが大半の細胞株において細胞内で、恐らくは、初期エンドソームコンパートメントにおいて発現することを実証した４９。
【００１２】
要約すると、強い証拠が、特に腫瘍環境及びインビボモデルにおけるＮＫｐ３０リガンドの厳密な性質に関して欠けている。
【００１３】
要約
本明細書において開示する第１の目的は、被験者において癌の予後を評価する方法にあり、この方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を、被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は、前記被験者における癌の好ましくない予後を示している。
【００１４】
被験者において癌の予後を評価する特定の方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、（相対）量のＮＫＰ３０ ＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質アイソフォーム、特に中間、短い、及び／又は長いＮＫｐ３０アイソフォームを測定することを含み、そのような量は、癌の経過を示しており、前記被験者における癌の予後の評価を可能にする。
【００１５】
本明細書において開示する別の目的は、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を評価する方法にあり、特にインビトロ又はエクスビボで、（相対）量のＮＫＰ３０ ＲＮＡ転写物及び／又はタンパク質アイソフォーム、特に中間、短い、及び／又は長いＮＫｐ３０アイソフォームを測定することを含み、そのような量は、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を示している。
【００１６】
異常なＮＫｐ３０タンパク質発現は、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）タンパク質アイソフォーム、好ましくは中間ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの結果でありうるが、前記アイソフォームは定常又は可変Ｉｇ様ドメインを有する。
【００１７】
特定の実施態様において、検出量もしくは測定量、発現又は活性を、それぞれ、コントロール条件もしくは参照値もしくは平均値、又はコントロールサンプルにおいて検出又は測定されたものと比較する。
【００１８】
上に記載する方法の特定の実施態様に従い、決定されたアイソフォーム相対量は、短い／中間ＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、短い／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、中間／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量、及び短い／中間／長いＮＫｐ３０アイソフォーム相対量からなる群よりを選択されうる。
本明細書において提供される結果により明らかにされる通り（実験セクションのパートＢを参照のこと）、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの量の（相対的）増加及び／又はＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの量における減少が、被験者のサンプルにおいて測定され、被験者（本明細書において「プロファイルＢ」として特定される群に含まれる被験者）における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
特に、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対的）増加ならびにＮＫｐ３０の短い及び長いアイソフォームにおける減少は、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
逆に、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対的）減少ならびにＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームにおける増加が、被験者（本明細書において「プロファイルＡ」として特定される群に含まれる被験者）における癌の好ましい予後又は癌の処置に対する被験者のポジティブな反応を示している。
【００１９】
機能的ＮＫｐ３０発現は、典型的には、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルに関連しており、被験者において、参照値又は平均値と比較した場合、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的な発現又は量が減少しており、そしてＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの相対的な発現又は量が増加していることが、本発明者らにより実際に本明細書において実証されている。
特定の実施態様において、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルは、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対）量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対）量よりも低いプロファイルである。
【００２０】
これは、そのような保護的なＮＫｐ３０プロファイルを示す被験者が、異常なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイル、特にＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が、参照値もしくは平均値、又はＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対）量よりも高いプロファイルを示す被験者よりも、癌の致死的進化に対するより高い自然保護の利益を得ることを意味する。
【００２１】
ＮＣＲ３遺伝子及び発現産物における特定の突然変異が本明細書においてさらに記載される。これらの突然変異は、被験者における癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性、又は、被験者において、癌の処置の有効性を評価する方法において使用可能である。前記突然変異を含む対立遺伝子は、治療介入のための新規標的を表す。
【００２２】
一実施態様において、本記載は、このように、被験者において癌の予後を評価する方法を提供し、この方法は、被験者からのサンプルにおいて、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常なＮＫｐ３０の発現アイソフォームプロファイル又は状態、特に異常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物の発現アイソフォームプロファイル又は状態、又は異常なＮＫｐ３０タンパク質のアイソフォーム発現もしくは活性の存在を検出することを含む。
【００２３】
被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）の置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）より選択されるＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３配列の存在の、被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
【００２４】
さらなる実施態様において、本記載は、被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する方法を提供し、この方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）の置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３核酸配列の存在の検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、実験セクションのパートＢにおいて明らかにする通り、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の好ましくないネガティブな反応を示している。
【００２５】
本願は、さらに以下の使用を記載する：
− 被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、（ｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、（ｉｉ）（ａ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム及び／又は（ｉｉｉ）（ａ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写を回復することが可能である化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟に導く化合物又は物質；
− 突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＮＫ細胞の活性化に導く化合物又は物質；
及び、処置の対応する方法。
【００２６】
この記載は、さらに、上で定義する有効量の化合物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者において癌を処置又は予防する方法を提供する。
好ましい実施態様において、被験者は、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する。
【００２７】
特定の実施態様において、それを必要とする被験者において癌を処置又は予防する方法は、ＮＣＲ３転写（選択的スプライシング）の調節及び／又は特に少なくとも１つの機能的ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性、好ましくはＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの調節、特に活性化を含む。
【００２８】
特に、異常なＮＣＲ３遺伝子、特にＮＣＲ３遺伝子の突然変異した対立遺伝子を持つ被験者を処置する方法（その方法では併用治療を用いることを含む）を本明細書において提供する。被険者は、このように、例えば、遺伝子治療、タンパク質置換治療を通じて、又は、ＮＫｐ３０タンパク質模倣剤、アクチベーター及び／又は阻害剤（上で定義するものなど）の投与を通じて処置してよい。前記方法の少なくとも１つは、例えば、癌治療、例えば、アルキル化剤の投与を意味する化学療法、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の投与を意味する治療、ＰＫＣ阻害剤（例えばＧｏ６９８３など）５０の投与を意味する治療、又は放射線療法などと組み合わせてよい。
【００２９】
癌を予防又は処置するために有用な化合物をスクリーニングするためのインビトロでの方法も記載されている。特定の方法は、試験化合物又は物質が、ＮＣＲ３の発現、又はＮＫｐ３０、好ましくは特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォーム、又は特定のＮＫｐ３０アイソフォームの発現又は活性を調節する能力を決定することを含む。別の特定の方法は、試験化合物又は物質が、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、ＮＫｐ３０のリガンド、好ましくは特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォーム、又は特定のＮＫｐ３０アイソフォームの発現又は活性を模倣、誘導、増加、もしくは刺激する、又は逆に、減少させる能力を決定することを含む。
【００３０】
この記載は、さらに、特定の実施態様において、以下を提供する：
− 特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの（特異的）増幅を可能にする、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする核酸プライマー；
− 特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームと（特異的に）ハイブリダイズする、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする核酸プローブ；
− 特定のアイソフォームのＮＫｐ３０タンパク質に（特異的に）結合する、又は、短い、中間の、及び長いアイソフォームの間、好ましくは、また、定常Ｉｇ様ドメインアイソフォームと可変Ｉｇ様ドメインアイソフォームの間の識別を可能にする抗体（その派生物及び前記抗体を産生するハイブリドーマを含む）。
【００３１】
この記載は、また、上で定義する、プライマー、プローブ、及び／又は抗体を含むキットを提供する。そのようなキットは、増幅、ハイブリダイゼーション、又は結合反応を実施するための容器もしくはサポート、及び／又は試薬を含みうる。
【００３２】
本発明の特定の局面は、プライマー、プローブ、及び／又は抗体を含む物質の組成物にあり、それらは、可変Ｉｇ様細胞外ドメイン又は定常Ｉｇ様細胞外ドメインを有する短い、中間の、及び長いＮＫｐ３０アイソフォームからなる群より選択される少なくとも１つのアイソフォームを特異的に検出するようにデザインされている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＮＣＲ３遺伝子の局在化及び構造；ＮＣＲ３：ナチュラル細胞傷害誘発受容体３；ＬＳＴ１：白血球特異的転写物１；ＬＴＢ：リンホトキシンβ；ＴＮＦ：腫瘍壊死因子；ＬＴＡ：リンホトキシンα；ＵＴＲ：非翻訳領域；ＳＮＰ：一塩基多型
【図２】ＮＫＰ３０受容体の６つの選択的スプライシング形態
【図３】ＧＩＳＴ患者及び健常ボランティアにおけるＮＫＰ３０アイソフォームの割合の比較（実験セクションのパートＡ）：（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、４１人のＧＩＳＴ患者（Ｐ）と３７人の健常ボランティア（ＨＶ）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアの間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図４】処置の経過中での４人のＧＩＳＴ患者におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの個人内安定性の表示；６つのアイソフォームの割合を、４人のＧＩＳＴ患者におけるＧＬＥＥＶＥＣ［イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）］処置の経過中に比較し、ＮＫＰ３０転写プロファイルの個人内安定性を評価した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。各患者について、括弧中の数字は処置後時間（ヶ月）を表す。
【図５】ＮＫｐ３０転写プロファイルのクラスタリングによるＧＩＳＴ患者と健常ボランティアの識別（実験セクションのパートＡ）；教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは患者（Ｐ）又は健常ボランティア（ＨＶ）を表す。括弧中の数字は、再発までの時間（ヶ月）を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。
【図６】４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアのクラスタリングにより得られたＡ群及びＢ群におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの特性付け（実験セクションのパートＡ）；６つのアイソフォームの割合を、ＧＩＳＴ患者（Ａ）及び健常ボランティア（Ｃ）においてＡ群（好ましいＮＫｐ３０プロファイル）とＢ群（好ましくないＮＫｐ３０プロファイル）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧテールアイソフォームの割合を、ＧＩＳＴ患者（Ｂ）及び健常ボランティア（Ｄ）においてＡ群とＢ群の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図７】３７人の健常ボランティア（ＨＶ）及び４１人のＧＩＳＴ患者（Ｐ）におけるＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群とＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群の間でのＮＫｐ３０表面発現の比較（実験セクションのパートＡ）；ＮＫ細胞を、ＣＤ３−ＡＰＣ（クローンＵＣＨＴ）、ＮＫｐ３０−ＰＥ（クローンＡＦ２９−４Ｄ１２）、ＣＤ５６−ＰＣ５（クローンＮ９０１）を用いて免疫染色した。細胞表面分析を、FACScaliburサイトメーター及びCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を使用したフローサイトメトリーを通じて実施した。
【図８】ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群及びＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群におけるＮＫ細胞（ＮＫｐ３０架橋±ＩＬ−２後）からのＩＦＮｇの産生（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）ＩＦＮｇの産生を、Ａ群及びＢ群における健常ボランティア（ＨＶ）及びＧＩＳＴ患者（Ｐ）の刺激されたＮＫ細胞からの上清におけるＥＬＩＳＡにより評価した。ＮＫ細胞を、ＮＫｐ３０（２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０）の架橋により２０時間刺激した。有意差は、各群内のＨＶとＰの間で検出されなかった。（Ｂ）ＨＶ及びＰを一緒に考慮したＡ群及びＢ群におけるＮＫＰ３０架橋後のＩＦＮｇ産生の表示。（Ｃ）ＩＦＮｇの産生を、２０時間にわたるＮＫｐ３０及びＩＬ−２の架橋によるＨＶ及びＰ（１０００UI/ml）の刺激されたＮＫ細胞からの上清におけるＥＬＩＳＡにより評価した。有意差は、各群内のＨＶとＰの間で検出されなかった。（Ｄ）ＨＶ及びＰを一緒に考慮したＡ群及びＢ群におけるＮＫＰ３０架橋＋ＩＬ−２後のＩＦＮｇ産生の表示。バーは中央値を表す。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊＊：Ｐ＜０．０１
【図９】ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低のＡ群及びＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高のＢ群におけるＮＣＲ３＊３５７１及びＮＣＲ３＊３７９０候補突然変異の頻度（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）Ｂ群のＮＫｐ３０転写プロファイルは、非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異に関連する（Ｂにおける１３%対Ａにおける０%）。（Ｂ）Ａ群のＮＫｐ３０転写プロファイルは、ＮＣＲ３遺伝子の３’非翻訳領域に局在化されるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異に関連する（Ａにおける５８%対Ｂにおける３%）。
【図１０】ＮＣＲ３ヌクレオチド配列におけるＮＣＲ３＊３５７１及びＮＣＲ３＊３７９０候補突然変異の局在化；エクソン配列はボールド体である。終止コドン及びポリアデニル化部位がインフレームになっている。ＩＮＴＥＲアイソフォームの転写は、第１のポリアデニル化部位に依存する。ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの転写は、第２のポリアデニル化部位に依存する。非同義のＮＣＲ３＊３５７１突然変異は、ＬＯＮＧアイソフォームの細胞内ドメイン（エクソン４ＩＩＩ）に局在化される。ＮＣＲ３＊３７９０突然変異は、第２のポリアデニル化部位に局在化される。ＮＣＲ３＊３７９０ Ｃ対立遺伝子はポリアデニル化部位を破壊し、ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの転写を遮断する。ＥＣドメイン：細胞外ドメイン；ＴＭドメイン：膜貫通ドメイン；ＩＣドメイン：細胞内ドメイン；３’ＵＴＲ：３’非翻訳領域。
【図１１】良好な又は不良な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者におけるＮＫＰ３０アイソフォームの割合の比較（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、良好な臨床予後を伴う７人の神経芽細胞腫患者と不良な臨床予後を伴う１２人の神経芽細胞腫患者の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、良好な臨床予後を伴う７人の神経芽細胞腫患者と不良な臨床予後を伴う１２人の神経芽細胞腫患者の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。
【図１２】ＮＫｐ３０転写プロファイルのクラスタリングによる良好な及び不良な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者の識別（実験セクションのパートＡ）；教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは良好な臨床予後（ＧＰ）又は不良な臨床予後（ＢＰ）を伴う神経芽細胞腫患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。
【図１３】１９人の神経芽細胞腫患者のクラスタリングにより得られた１群及び２群におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの特性付け（実験セクションのパートＡ）；（Ａ）６つのアイソフォームの割合を、神経芽細胞腫患者において１群（好ましくないＮＫｐ３０プロファイル）と２群（好ましいＮＫｐ３０プロファイル）の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ｂ）ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォームの割合を、神経芽細胞腫患者において１群と２群の間で比較した。ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各細胞内ドメインについてのＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。中央値±標準誤差を表わした。マンホイットニー検定を統計分析のために使用した。＊：Ｐ＜０．０５− ＊＊：Ｐ＜０．０１− ＊＊＊：Ｐ＜０．００１
【図１４】ヒストンデアセチラーゼ阻害剤及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いたＮＣＲ３遺伝子の選択的スプライシングの調節（実験セクションのパートＡ）；ＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−テールアイソフォーム）のＷＴ−（可変Ｉｇ様）及びＤＥＬ−（定常Ｉｇ様）細胞外ドメインの相対量の合計と６つのアイソフォームの総量の比率として示す。（Ａ）ＹＴＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、トリコスタチンＡ（１００nM）（ＴＳＡ）と３７℃で４５時間インキュベートした。（Ｂ）ＮＫ９２細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、５−アザシチジン（２μM）（５ＡＺＡ）及びＩＬ−２（５０UI/ml）と３７℃で３６時間インキュベートした。
【図１５】ベクターにおけるＮＫｐ３０エクソン４Ｉ、エクソン４ＩＩ、及びエクソン４ＩＩＩの発現クローニングのスキーム；ＮＫ９２細胞株のＮＣＲ３遺伝子に由来する３つのｃＤＮＡ ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）（エクソン４ＩＩＩ）、ＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）（エクソン４ＩＩ）、及びＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）（エクソン４Ｉ）をｐＩＲＥＳバイシストロニック発現ベクター中にクローニングする。
【図１６】細胞株におけるＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃアイソフォームの発現；Ｊｕｒｋａｔ（Ａ）及びＮＫＬ細胞株（Ｂ）を、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃの種々のアイソフォームをコードするプラスミドｃＤＮＡを用いて、又はＧＦＰと共にトランスフェクトした。Ｇ４１８中での３週間の選択後、細胞株をフローサイトメトリーによりＧＦＰ及びＮＫｐ３０発現について調べた。代表的なドットプロットをＪｕｒｋａｔ（Ａ）及びＮＫＬ（Ｂ）について描写する。
【図１７】Ｇ４１８選択前後でのトランスフェクトされたＮＫＬ細胞株の表現型分析；別々のＮＫｐ３０アイソフォームをコードするｃＤＮＡを用いて安定的にトランスフェクトされたＮＫＬ細胞株上の異なるＮＫ細胞受容体のフローサイトメトリー分析。有意差は観察されなかった。
【図１８】ＮＫｐ３０ｃアイソフォームは、ＮＫｐ３０誘発時にサイトカイン分泌を媒介しない；ＰＭＡ−イオノマイシンを伴う（Ａ）もしくは伴わない（Ｂ）で、固定化したマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０ Ａｂ（クローン２１０８４７、２．５ｕg/ml）又はコントロールＩｇＧ（５ng/mL、０．１μg/mL）を使用し、全て３つのトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ（Ａ）又はＮＫＬ（Ｂ）を架橋した。また、トランスフェクトされたＮＫＬを、未熟ＤＣ（比率ＤＣ：ＮＫＬ １：３）（Ｃ）、又は種々の腫瘍細胞株（比率１：１）（Ｄ）を用いて２４時間刺激した。グラフは３つからの代表的な実験を描写し、上清中のＩＬ−２（Ａ）又はＩＦＮγ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）又はＴＮＦα（Ｃ）分泌レベルをモニターしている。実験を、３つの異なるＤＣドナー（Ｃ）を使用して、３回（Ａ、Ｂ、Ｄ）及び５回実施し、同一の結果を得た。＊ｐ＜０．０５
【図１９】ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）アイソフォームは、ＮＫＬの脱顆粒を選択的に誘導する；７時間のＮＫｐ３０架橋後での全ての３つのＮＫＬトランスフェクタント上でのＣＤ１０７ａ発現を示す（Ａ）。抗ＮＫｐ３０ ｍＡｂ（Ｂ）又はＫ５６２（Ｃ）でコーティングされたＰ８１５に対する３つのＮＫｐ３０トランスフェクトされたＮＫＬ細胞傷害を、標準的な４時間クロム放出アッセイにおいて実施した。実験を、種々のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比率（５０：１、２５：１、１２．５：１、５：１）（Ｃ）及び５０：１（Ｂ）で３重で行った。３つからの代表的な実験を描写する。＊ｐ＜０．０５
【図２０】８０人のＧＩＳＴ患者のコホートにおけるＮＫｐ３０アイソフォームの発現；（Ａ）ＧＩＳＴのコホートにおける３つの別々のアイソフォームに基づくＮＫｐ３０プロファイルのクラスタリング。３つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合に基づくＮＫｐ３０プロファイルをＲＴ−ＰＣＲ（β２ミクログロブリンで標準化）により実施し、ＮＫｐ３０プロファイルの教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン中央相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。各列はＮＫＰ３０アイソフォームを表し、各カラムは患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。（Ｂ）ＧＩＳＴとＨＶの間でのＮＫｐ３０の各アイソフォームの異なる割合。８０人のＧＩＳＴについて（Ａ）において提示されるデータを、２群（プロファイルＡ対プロファイルＢ ＧＩＳＴ）における別々のアイソフォームの割合としてグラフ中に描写し、そしてｎ＝５６のＨＶのコホートを用いて得られた結果と比較する。（Ｃ）プロファイルＡとＢは、フローサイトメトリーにおいて検出されたＮＫｐ３０発現において差がない。新鮮なＮＫ細胞を、ＩＭ治療中にＮＫｐ３０アイソフォームの転写分析の時点で調べた。２群間に有意差を見いだすことはできなかった。＊ｐ＜０．０５． ｎｓ：非有意
【図２１】バルクＰＢＭＣ及び精製ＮＫ細胞において得られたＮＫｐ３０の転写プロファイリングの比較。ＮＫｐ３０の各々の個々のスプライスバリアントの相対発現のＲＴ−ＰＣＲにおける決定を、プロファイルＡ（Ａ）を伴う１１のＧＩＳＴ及びプロファイルＢ（Ｂ）を伴う９のＧＩＳＴで、図２０Ａ及び２０Ｂに記載される手順に従い、フィコール後のＰＢＭＣ又は精製ＮＫ細胞から抽出されたｃＤＮＡから開始して実施した。有意差（ｎｓ）は、ＰＢＭＣ及びＮＫからのＮＫｐ３０プロファイルの間で観察されなかった。
【図２２】プロファイルＢの個人が、プロファイルＡホモログと比較し、ＮＫｐ３０依存的な機能的欠損を示す。（Ａ）ＧＩＳＴと一致されたＨＶの間での３つの別々のアイソフォームに基づくＮＫｐ３０プロファイルのクラスタリング。図２０ａと同一の設定であるが、しかし、ＨＶ由来のＮＫ細胞からのＮＫｐ３０を、５６の性別、年齢、及び地理を一致させたＨＶにおいて調べた。（Ｂ−Ｃ）プロファイルＢは、個人の全コホートにおけるＮＫｐ３０依存的なＴＮＦα産生の欠損に関連する。ｎ＝５６のＨＶ及びｎ＝８０のＧＩＳＴからの循環ＮＫ細胞でのＮＫｐ３０の架橋は、２４時間目にＥＬＩＳＡにおいて測定されたサイトカイン産生をもたらした。ＴＮＦα放出を、教師なしの階層的クラスタリングに従い、プロファイルＡ又はＢに分類される個人（（Ｂ）におけるＧＩＳＴ＋ＨＶ、（Ｃ）におけるＧＩＳＴ）の間で比較した（図２０Ａ）。（Ｄ）プロファイルＢは、ＮＫｐ３０依存的なＮＫ細胞の脱顆粒における欠損を示す。（Ｂ−Ｃ）と同一であるが、しかし、ＣＤ１０７ａ発現を、固定化された抗ＮＫｐ３０及び１０００IU/mlのｒｈＩＬ−２の存在において分析した。全ての実験を３重で実施し、２回は、２つの異なる時点での個人の大半についてであった。 ＊ｐ＜０．０５． ｎｓ：非有意
【図２３】ＮＫｐ３０アイソフォームがＧＩＳＴ患者の生存を決定する。（Ａ）プロファイルＡ（ｎ＝４４）対Ｂ（ｎ＝３６）のＧＩＳＴ患者における最初のイマチニブメシレート（ＩＭ）処置からの全生存。カプラン・マイアー方法を使用した単変量解析において、プロファイルＢの患者（図２０Ａにおいて定義される）が、劣った全生存を有することが見出された（生存の中央値：プロファイルＢにおける８０ヶ月対プロファイルＡにおいて中央値に達せず、ログランク検定：ｐ＝０．００１）。コックス回帰分析において、プロファイルＢのＧＩＳＴが、１３．１に等しい死の相対リスクを有した（９５% ＣＩ［４．９−３６．１］、ｐ＝０．０１）。（Ｂ）フローサイトメトリーにおけるＮＫｐ３０膜発現の機能としての全生存。転写プロファイルの決定時の循環ＮＫ細胞での（Ａ）と同様であるが、しかし、＜５６%（ｎ＝２６）又は＞及び５６%に等しい（ｎ＝２７）ＮＫｐ３０表面発現を提示するＧＩＳＴを考慮した分析（図２０Ａ）。ＮＫｐ３０表面発現の閾値（５６%）を、８０人のＧＩＳＴ患者の中央値として定義した（図２０Ｃ）。
【図２４】ＮＣＲ３＊ ３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰは、プロファイルＢ及び「一遺伝子性」チロシンキナーゼ駆動性の悪性腫瘍に関連する。（Ａ）プロファイルＡ及びＢの個人におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。材料及び方法において記載する手順に従った、図２０Ａにおいて詳述するＧＩＳＴコホート及び図２０Ｂ及び図２１Ａにおいて詳述するＨＶの患者の遺伝子型決定。（Ｂ）ＡＭＬのＦＬＴ３突然変異状態に従った、ＡＭＬを持つ患者におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。腫瘍の突然変異状態を、前に記載された通りに決定した５１。（Ｃ）ＧＩＳＴのＫＩＴ突然変異状態に従った、ＧＩＳＴを持つ患者におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度。腫瘍の突然変異状態を、前に記載された通りに決定した５２。腫瘍の突然変異状態は、図２０に記載するＧＩＳＴのコホートにおける３２．５%の症例において未決定のままであった。
【００３４】
定義
種々の実施態様の概説を容易にするために、以下の用語の説明を提供する：
【００３５】
本明細書で使用する「癌」という用語は、任意の型の悪性腫瘍（一次又は転移）を指す。
典型的な癌は、Ｘ線、アントラサイクリン、シスプラチン、及び／又はオキサリプラチン感受性の癌、例えば乳癌、胃癌、肉腫（特に胃腸間質性腫瘍又はＧＩＳＴ）、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、直腸癌、結腸癌、肺癌、ＯＲＬ癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、多形性膠芽腫）、リンパ腫、白血病（急性及び慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ及びＣＭＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ））、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液疾患などである。別の典型的な癌は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に感受性の癌、例えば胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）などである。
【００３６】
「処置に対する感受性」という用語は、処置に対する被験者の反応のレベルを指し、限定はされないが、個人における治療用化合物又は物質を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、薬物動態（吸収、分布、排泄）、及び薬物の薬力学（受容体関連）を含む。この処置は、化学療法、例えば、アルキル化剤又はアントラサイクリン、例えばドキシサイクリン（ＤＯＸ）、オキサリプラチン、もしくはシスプラチンなどの投与を含む化学療法；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を意味する治療でよい；及び／又は、処置は、例えばガンマ線又はＸ線（ＸＲ）を使用した放射線療法でよい。
【００３７】
本明細書で使用する「癌の予後」という用語は、疾患の経過、換言すると、疾患の推定される致死的な又はポジティブな健康転帰の評価からなる方法を指す。
典型的には、癌を発生する増加リスクを有する被験者が、ＮＫｐ３０アイソフォームの異常な状態又はプロファイルを有し、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの参照値もしくは平均値、又は（相対）量よりも相対的に高い。
【００３８】
検査されるサンプルは、核酸及び／又はポリペプチドを含む。そのようなサンプルの例は、液体、組織、細胞サンプル、器官、生検などを含む。
回収されたサンプルの性質は、特定の型の癌に必ずしも相関しない。回収された組織は、実際に、癌組織（好ましくは、パラフィン包埋よりむしろ凍結）又は健常組織（例えば、血液、皮膚、間質）でよい。
組織は、選択された癌組織から回収してよい。
サンプルは、また、例えば、血液、血漿、及び骨髄より選択された組織から、任意の異常な又は疾患状態の前記組織とは無関係に、得てよい。
好ましくは、サンプルは、ＮＫｐ３０を発現することが公知である細胞、例えば臍帯Ｔリンパ球及び子宮内膜上皮細胞、好ましくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、特定のＮＫ細胞などを含む。
特定の実施例において、アッセイを、小児腫瘍、例えば神経芽細胞腫及びＧＩＳＴより選択される癌に苦しむ被験者で実施する場合、血液（特にＰＢＭＣの集団を含むサンプル）、間質、皮膚、又は腫瘍組織のサンプルが提供されうる。
【００３９】
本発明を種々の被険者における、例えば、動物、特に哺乳動物、好ましくはヒト（成人、小児、及び胎児期を含む）において使用してよい。
「被験者」という用語は、一般的に、癌に苦しむ患者、又は癌を発症しうる被験者を指す。
【００４０】
被験者は、また、潜在的な骨髄ドナーである被験者でありうる。本発明を使用し、ドナー被験者が正常なＮＫｐ３０発現、特に正常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム状態もしくはプロファイル、又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現もしくは活性を有するか否かを決定してよい。
被験者は、さらに、同種骨髄移植のための候補者でありうる。
【００４１】
「異常」という用語は、本明細書において、正常な特徴からの逸脱である。正常な特徴が、集団のためのコントロール、標準などにおいて見出すことができる。例えば、異常状態が疾患状態、例えば癌などである場合、正常な特徴の２、３の適切な供給源は、癌を患っていない個人、癌を患っていないと考えられる個人の標準集団などを含みうる。
癌に苦しんでいるが、しかし、当業者に公知の好ましい臨床基準（個人の年齢、癌の病期、及び／又は癌の組織病理の病期など）に基づき好ましい予後を有すると考えられる個人の集団は、特定の実施態様において、コントロール集団又は参照集団と考えられうる。
「異常な」という用語は、通常、疾患に関連する状態を指す。例えば、特定の異常（ＮＣＲ３核酸又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現もしくは活性における異常など）が、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する耐性に関連すると記載することができる。
典型的には、「異常な」という用語をＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルを参照して使用してよく、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの参照値もしくは平均値、又は相対量よりも高い。ＮＫｐ３０中間アイソフォームの異常（相対）量は、例えば、可変細胞外ドメインを伴う長い、短い、及び中間のアイソフォーム含む全アイソフォーム量の好ましくは約１５%、好ましくは２０%、さらにより好ましくは１９%を超える量である。長いアイソフォームの対応するパーセンテージは、約２０%、好ましくは約１５%よりも劣り、短いアイソフォームの対応するパーセンテージは、短いアイソフォームについての約８０%、好ましくは７７%、さらにより好ましくは７０%よりも劣る。
【００４２】
異常な核酸、例えば異常なＮＣＲ３核酸などは、ある様式で、正常な（野性型）核酸とは異なる核酸である。そのような異常は、必ずしも限定されないが、コントロール又は標準と比較し、核酸における突然変異［例えば点突然変異など（例、一塩基多型、別名ＳＮＰ）又は２、３から数個のヌクレオチドの短い欠失、挿入又は重複など］を含む。これらの型の異常が、同じ核酸中に、又は同じ細胞もしくはサンプル中に共存することができることが理解されるであろう。また、核酸中の異常が、対応するタンパク質の発現において異常を起こしうることが理解される。
【００４３】
ＮＫｐ３０タンパク質は、本明細書において、ＮＣＲ３遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。
前に説明した通り、ＮＣＲ３遺伝子は、６つの異なるタンパク質（それぞれＮＫｐ３０Ａ、ＮＫｐ３０Ｂ、ＮＫｐ３０Ｃ、ＮＫｐ３０Ｄ、ＮＫｐ３０Ｅ、及びＮＫｐ３０Ｆと名付けられる）をコードする６つの異なる選択的スプライシング形態を提示する（図２）２４。アイソフォームの３つが、潜在的な可変Ｉｇ型又はＩｇ様ドメインをコードし、他の３つが潜在的な定常Ｉｇ型又はＩｇ様ドメイン（部分欠失させた可変Ｉｇ型ドメイン）をコードする。これらの２つの異なる細胞外ドメインを、いずれのエクソン４（図１）が発現されるかに依存して、３６のアミノ酸（「長いテール（tail）」ドメイン）、２５のアミノ酸（「中間テール」ドメイン）、及び１２のアミノ酸（「短いテール」ドメイン）の３つの異なる細胞内ドメインに連結することができる２４。
【００４４】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームは、このように、タンパク質アイソフォームであり、その配列、配置、成熟、又は発現は正常な野生型タンパク質アイソフォームとは異なる。好ましくは、異常タンパク質アイソフォームは機能的ではない、又は部分的にだけ機能的である。
この用語は、好ましくは、少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を含むが、しかし、また、例えば、正常なＮＫｐ３０タンパク質をコードするｍＲＮＡの異常転写に起因する、少なくとも１つの正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常発現を包含する（そのような異常転写は、例えば、異常な選択的スプライシングにより、癌処置により、及び／又は癌自体により誘導され得、コントロール又は標準のレベル又は量と比較して、減少されうる、又は逆に、増加されうる）。同様に、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性レベルは、少なくとも１つの正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常発現、又は、少なくとも１つの異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を反映しうる。
【００４５】
ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性、例えば異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現は、コントロール又は標準と比較した場合、ある様式で、以下でさらに説明する正常な（野生型）状況におけるタンパク質の発現又は活性とは異なる発現又は活性を指す。
それは、特に、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、恐らくは、ＮＣＲ３によりコードされる６つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの２つ、３つ、４つ、５つの又は全てのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの被験者における発現又は活性を指し、コントロール又は標準と比較した場合、ある様式で、正常な（野生型）状況におけるタンパク質の発現又は活性とは異なる。
【００４６】
異常の決定のための、サンプルとの比較に適切なコントロール又は標準は、正常であると考えられる（例えば、健常被験者のサンプル）又は癌を患っているが、しかし、前に説明された好ましい臨床基準、ならびに、恐らくは任意のセット（そのような値が検査室から検査室で変動しうることを念頭に置く）であるとしても、検査値から良い結果を得ている患者の集団に対応するサンプルを含む。
検査室の標準及び値は、公知の又は決定された集団値に基づいて設定してよいが、測定された、実験的に決定された値の容易な比較を可能にするグラフ又は表のフォーマットにおいて提供してよい。
【００４７】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームという用語は、必ずしも限定されないが、以下を含む：（１）１つ又は複数のアミノ酸残基が異なるようタンパク質の配列における潜在的な変異又は突然変異；（２）タンパク質の配列に対する１つ又は２、３のアミノ酸残基の短い欠失又は付加；（３）全タンパク質ドメイン又はサブドメインが除去又は付加されるような、アミノ酸残基のより長い欠失又は付加；（４）コントロール又は標準の量と比較し、減少した、又は逆に、増加した量の機能的なタンパク質アイソフォームの発現；（５）タンパク質アイソフォームの細胞局在又は標的化の変化；（６）時間的に調節されたタンパク質アイソフォームの発現の変化（タンパク質が、それが正常ではない場合に発現し、あるいは、それが正常である場合に発現しないようにする）；及び（７）各々をコントロール又は標準と比較し、局在化した（例、器官又は組織特異的）タンパク質アイソフォームの発現の変化（タンパク質が、それが正常に発現する場合に発現せず、又は、それが正常に発現しない場合に発現するように）。
【００４８】
「ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性」という用語は、その天然のリガンドの１つに対するＮＫｐ３０の任意の直接的結合、ＮＫｐ３０により媒介される又は好まれる任意の間接的結合、ならび顕著にはＮＫｐ３０経路の下流エフェクター、例えばＣＤ３ζ、ＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、ＦｃＲγなどにおける直接的又は間接的な結合の効果を包含する。
【００４９】
本願において使用される通り、「ＮＣＲ３遺伝子」という用語は、ＴＮＦ遺伝子、ならびにそのバリアント、アナログ、及びフラグメント（癌に対する感受性に関連するその対立遺伝子（例、生殖細胞系列突然変異）を含む）に近接する、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩＩ領域中のヒト染色体６ｐ２１．３上のナチュラル細胞傷害誘発受容体３を指す。ＮＣＲ３遺伝子は、また、ＮＫｐ３０遺伝子と呼んでよい。
【００５０】
組換え核酸を、化学合成、遺伝子操作、酵素技術、又はその組み合わせを含む、従来技術により調製してよい。適したＮＣＲ３遺伝子配列は、遺伝子バンク、例えばＮＣＢＩ（参照アセンブリー： ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８７４０−３１６６４６５０）；ＲｅｆＳｅｑ ＤＮＡ： ＮＭ １４７１３０；ＧｅｎｅＩＤ：２５９１９７）、Ｅｎｓｅｍｂｌ（Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅ ＩＤ：ＥＮＳＧ０００００２０４４７５）などで見出されうる。対応するポリペプチド配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンク中の参照ＮＰ＿６６７３４１．１（ＲｅｆＳｅｑペプチド）の下で見いだされる。
【００５１】
「ＮＣＲ３遺伝子」という用語は、配列番号：１ ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）又は上で特定した任意のコード配列の任意のバリアント、フラグメント、又はアナログを含む。
【００５２】
ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドの特定の例は、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４５［“短いテール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号２］、Ｖｅｇａ ペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４６［“中間テール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号３］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４４［“長いテール可変Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号４］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：無し［“短いテール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号５］、ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１４８４７［“中間テール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号６］、及びＶｅｇａペプチドＩＤ：無し［“長いテール定常Ｉｇ様ドメイン”アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号７］からなる群より選択されるペプチドの全て又は部分を含む。
【００５３】
多型は、例えば、変異が存在するヌクレオチド位置により、ヌクレオチド変異により起こされるアミノ酸における変化により、又は変異に関連づけられる核酸分子の何らかの他の特徴における変化（例、二次構造、例えばステム−ループなどの変化、又は、関連分子、例えばポリメラーゼ、ＲＮａｓｅなどについての核酸の結合親和性の変化）により言及することができる。例として、ＮＣＲ３遺伝子の領域において本明細書で開示する多型は、ＮＣＲ３遺伝子におけるその位置により［例、バリアント残基３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ： ｒｓ３１７９００３）又は３７９０ Ｔ／Ｃ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ： ｒｓ９８６４７５）の数値位置に基づく］（ＮＫｐ３０ポリペプチドにおけるバリアントアミノ酸の数値位置に基づく）、それがＮＣＲ３ ｍＲＮＡの二次構造に有する効果により、又は、それがＮＫｐ３０ポリペプチドの三次構造に有する効果（例、リガンド、例えば硫酸ヘパリン及びＢＡＴ３などのポリペプチドの結合親和性の変化）により言及することができる。
【００５４】
検出／診断
上記の観察を使用して、本発明者らは、本明細書において、被験者におけるＮＣＲ３遺伝子座の分析及び／又は被験者におけるＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物もしくはタンパク質アイソフォームのモニタリングに基づく方法を提供する。
本発明の関連内で、「診断」という用語は、上で定義する被験者における、種々の病期（早期の発症前段階及び後期を含む）での検出、投薬、比較などを含む。診断は、典型的には、最も適切な処置（薬理遺伝学）などを定義するための被験者の予後及び特性付けを含む。
【００５５】
本明細書において記載する一般的な目的は、被験者において癌の予後を評価する方法にあり、この方法は、特にインビトロ又はエクスビボで、突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現もしくは活性の存在は前記被験者における癌の好ましくない予後を示している。
【００５６】
本明細書において記載する別の一般的な目的は、癌、例えば小児腫瘍など、特に神経芽細胞腫の処置に対する被験者の感受性を評価する方法にあり、その方法が、インビトロ又はエクスビボで、（ｉ）突然変異したＮＣＲ３核酸、（ｉｉ）異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は前記処置に対する耐性を示している。被験者において癌の処置の有効性を評価する方法の検出工程は、理想的には、前記処置の前、間、及び／又は後に実施される。
【００５７】
本明細書において記載するさらなる一般的な目的は、被験者における癌、例えばＧＩＳＴなどの処置の有効性を評価する方法にあり、その方法が、前記処置の前、間、及び／又は後に、（ｉ）突然変異したＮＣＲ３核酸、（ｉｉ）異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、前記の突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は前記処置に対する耐性を示している。
【００５８】
さらなる目的は、被験者からのサンプルを提供する第１工程を含む、上に記載する方法である。
【００５９】
本発明に従い、被験者の感受性を評価することができる処置は、好ましくは、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン、例えばＤＯＸ（ドキソルビシン、イダルビシン、４エピルビシン、ミトキサントロン）、オキサリプラチン及びシスプラチン（ＰＬＡＴ）などの投与を含む化学療法；チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）又はスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を含む治療；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）の投与を含む治療；及び、例えばＸ線（ＸＲ）を意味する放射線療法の少なくとも１つより選択される。
【００６０】
診断方法は、上記の処置又は薬物に対する感受性もしくは反応、又は処置もしくは薬物に対する副作用を分析及び予測し、被験者を特定の処置薬を用いて処置すべきか否かを決定するために使用してよい。例えば、この方法が、被験者、特に正常なＮＫｐ３０アイソフォーム発現プロファイル、特に正常なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームプロファイルを伴う被験者が、ＴＫＩ、ＦＴＩ、及び／又はアントラサイクリン、ＰＬＡＴ及び／又はＸＲに対してポジティブに反応する可能性を示す場合、前記処置を個人に施してよい。逆に、この方法が、個人又は被験者、特に異常なＮＫｐ３０アイソフォーム発現プロファイルを伴う被験者が、前記処置に対してネガティブに反応する可能性が高い場合、代替方向の処置を処方してよい。
【００６１】
ネガティブな反応は、効果的な反応の非存在又は有毒な副作用の存在と定義してよい。これは、この処置が、癌を予防又は処置するために非効率的であるように思われることを意味する。換言すると、処置を必要とする被験者、又は癌自体が、前記処置に対して耐性であると思われる。不良な反応は、野生型ＮＣＲ３を持つ又は機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームを発現する患者において観察される反応よりも有意に劣る反応である。
【００６２】
突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在は、耐性、即ち、癌の処置に対する被験者のネガティブな又は不良な反応を示しており、又は、前に説明した通り、有毒な副作用の存在を示している。
【００６３】
ＮＣＲ３突然変異は、ＮＣＲ３ゲノム配列において又はＲＮＡにおいて決定されうる。
【００６４】
検出された突然変異は、先天的な又は獲得された突然変異でありうる。
【００６５】
ＮＣＲ３遺伝子座における突然変異は、単独で又は種々の組み合わせで、遺伝子座のコード及び／又は非コード領域中の任意の形態の突然変異、欠失、再配列、及び／又は挿入でありうる。突然変異は、より具体的には、点突然変異を含む。欠失は、遺伝子座のコード又は非コード部分において１、２又はそれ以上の残基の任意の領域、例えば１つの残基から全遺伝子又は遺伝子座までを包含しうる。例えば約２０未満の連続塩基対のドメイン（イントロン）又は反復配列又はフラグメントなどの典型的な欠失は、より小さな領域に影響を与えるが、より大きな欠失も起こりうる。挿入は、遺伝子座のコード又は非コード部分における１つ又は数個の残基の付加を包含しうる。挿入は、典型的には、遺伝子座における１〜２０の塩基対の付加を含みうる。再配列は配列の逆位を含む。ＮＣＲ３遺伝子座の突然変異は、終止コドン、フレームシフト突然変異、アミノ酸置換、特定のＲＮＡのスプライシング又はプロセシング、産物の不安定性、切断ポリペプチドの産生などをもたらしうる。この変化は、機能、安定性、標的化、又は構造が変化した、少なくとも１、恐らくは２、３、４、５、又は６つのＮＫｐ３０スプライシングバリアント（又はスプライシング形態）の産生をもたらしうる。この変化は、また、タンパク質アイソフォーム発現における減少、又は、代わりに前記産生の増加を起こしうる。
【００６６】
本発明に従った方法の特定の実施態様において、ＮＣＲ３遺伝子における変化は、ＮＣＲ３遺伝子又は対応する発現産物における点突然変異、欠失及び挿入、より好ましくは点突然変異、さらにより好ましくは一塩基多型（ＳＮＰ）より選択される。
【００６７】
本発明は、特に、突然変異したＮＣＲ３ヒト核酸配列を開示する。
突然変異したＮＣＲ３ヒト核酸配列の特定の例は、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１），（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ：ｒｓ３１７９００３）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）、及び、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１），（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＳＮＰ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔ：ｒｓ９８６４７５）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰより選択されるＳＮＰを含む。
【００６８】
被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法は、被験者からのサンプルにおいて、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０（３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３５７１でのグアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換（３５７１ Ｇ／Ｔ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導く一塩基多型（ＳＮＰ）より選択されるＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３配列の存在の被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の耐性を示している。
【００６９】
さらなる実施態様において、本記載は、被験者において癌の予後、癌の処置に対する被験者の感受性又は、被験者における、癌の処置の有効性を決定又は評価する特定の方法を提供し、この方法は、点突然変異、好ましくは、配列番号１［ＮＣ＿０００００６．１０ （３１６６８９３３−３１６６４６５１）］の位置３７９０でのシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換（３７９０ Ｔ／Ｃ）（ＡＴＧ開始コドンに対する位置）に導くＳＮＰを含む、突然変異したＮＣＲ３核酸配列の存在の被験者からのサンプルにおける検出を含み、そのような点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列の存在の検出は、前記被験者における癌の好ましくない予後、又は癌の処置に対する被験者の好ましくない又はネガティブな反応を示している。
【００７０】
本明細書において記載する方法は、さらに、その目的が、被験者が多型についてホモ接合性又はヘテロ接合性であるかを決定することである工程を含みうる。
【００７１】
本発明の方法において、ＮＣＲ３遺伝子における任意の突然変異又は変化は、他のマーカー、例えば他の任意の遺伝子又はタンパク質における他の突然変異又は変化などとの組み合わせで評価してよい。
【００７２】
サンプル中での突然変異したＮＣＲ３核酸の存在は、サンプルの遺伝子型決定を通じて検出することができる。検出は、ＮＣＲ３遺伝子の全て又は部分の選択的ハイブリダイゼーション及び／又は増幅を使用し、ＮＣＲ３遺伝子の全て又は部分のシークエンシングにより実施することができる。より好ましくは、ＮＣＲ３遺伝子の特異的増幅は、突然変異の特定工程の前に行う。
本明細書において記載する特定の実施態様において、突然変異したＮＣＲ３核酸の存在を、制限酵素消化、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーション（特に、核酸プローブ、例えば、浮遊状態の又は核酸アレイ上に存在する核酸プローブを用いて）、及び／又は選択的増幅を使用することにより検出する。
特定の実施態様は、被験者のＮＣＲ３遺伝子配列における少なくとも１つのＳＮＰの存在の検出を含む。
【００７３】
特定の実施態様において、本明細書において記載する方法は、異常なＮＣＲ３ＲＮＡ発現の存在を検出することを含む。異常なＮＣＲ３発現は、突然変異したＲＮＡ配列の存在、異常なＲＮＡスプライシング又はプロセシングの存在、異常量のＲＮＡの存在などを含む。これらは、例えば、制限酵素消化、ＮＣＲ３ ＲＮＡの全て又は部分のシークエンシング、前記ＲＮＡ又は対応する合成ｃＤＮＡの全て又は部分の選択的ハイブリダイゼーション又は選択的増幅を含む、当技術分野において公知の種々の技術により検出されうる。
異常なＲＮＡスプライシングは、図２及び１５に現れるスプライシング形態より選択される１つ又は複数の特定のスプライシングバリアント（又は、本明細書において「スプライシング形態」もしくは「ＲＮＡ転写物アイソフォーム」と呼ぶ）のＮＫｐ３０をコードする異常量のＲＮＡの転写を誘導することができ、及び／又は、本明細書において定義する異常な形態の前記バリアントの少なくとも１つ、恐らくは、前記バリアント又はＲＮＡ転写物アイソフォームの２、３、４、５、又は全ての転写を誘導することができる。
【００７４】
本明細書において記載する方法は、被験者のサンプルにおいて、以下：
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
− ＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン、中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメイン、及び短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物、
の相対量を測定及び比較することによる、
又は、各量の特定のアイソフォーム又は各相対量の少なくとも２つの、好ましくは３つの別々のアイソフォームを、コントロール値、参照値、又は平均相対値と比較することによる、ＮＫｐ３０タンパク質発現又は活性を決定する工程を含みうる。
【００７５】
特に、コントロール相対値と比較し、増加（相対）量のＮＫｐ３０の中間テール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物及び減少（相対）量のＮＫｐ３０の長いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物及び／又は短いテール定常又はテール可変Ｉｇ様ドメインＲＮＡ転写物は、被験者における癌の好ましくない予後又は癌の処置に対する耐性を示している。
【００７６】
さらなる実施態様において、この方法は、少なくとも１つのＮＫｐ３０ポリペプチド又はタンパク質アイソフォームの異常発現の存在を検出することを含む。異常発現は、突然変異したポリペプチドアイソフォーム配列の存在、異常（相対）量のＮＫｐ３０ポリペプチド又はタンパク質アイソフォームの存在、異常な組織分布の存在などを指す。
これらは、例えば、増幅及び／又は特異的リガンド（例えば抗体など）に対する結合を含む、当技術分野において公知の種々の技術により検出されうる。
他の適した方法を使用し、異常なＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ発現又は配列を検出又は定量化してよい。それらは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット（ＤＮＡについて）、ノーザンブロット（ＲＮＡについて）、一本鎖高次構造分析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動、ヘテロデュプレックス分析、ＲＮａｓｅ保護、化学的ミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。
【００７７】
前に説明した通り、特定の実施態様において、この方法は、被験者からのサンプルにおける異常なＮＣＲ３核酸の存在を検出又は決定することを含む。これは、前に説明した通り、前記サンプル中に存在する核酸の制限酵素消化、シークエンシング、選択的ハイブリダイゼーション、及び／又は選択的増幅を使用することにより達成することができる。
【００７８】
制限酵素消化は、当技術分野において周知の技術及び酵素を使用して行うことができる。
【００７９】
シークエンシングは、自動シーケンサーを使用し、当技術分野において周知の技術を使用して行うことができる。シークエンシングは、完全なＮＣＲ３遺伝子又は、より好ましくは、その特定のドメイン、典型的には、有害な突然変異又は他の変化を持つことが公知である又は疑われるもので実施してよい。
【００８０】
増幅は、核酸複製を開始させる役割を果たす相補的な核酸配列の間での特定のハイブリッドの形成に基づく。
【００８１】
増幅が、当技術分野における公知の種々の技術に従って、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）により実施してよい。
【００８２】
これらの技術は、市販の試薬及びプロトコールを使用して実施することができる。好ましい技術では対立遺伝子特異的ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＳＳＣＰを使用する。増幅は、通常、反応を開始するために特異的な核酸プライマーの使用を要求する。
【００８３】
本明細書において記載する核酸プライマーは、周囲領域を含む、ＮＣＲ３コード配列（例、遺伝子、又は遺伝子座、又はＲＮＡ）から配列を増幅するために有用である。
ＮＣＲ３標的領域を増幅するために使用することができるプライマーは、ＮＣＲ３のゲノム配列又はＲＮＡ配列及び、特に、配列番号１の配列に基づいてデザインしてよい。
【００８４】
特定のプライマーは、ＮＣＲ３コード配列の標的領域に隣接するＮＣＲ３遺伝子座の部分と相補的であり、それに特異的にハイブリダイズすることができる。
【００８５】
標的領域は、癌に対する素因又は癌を発生する増加した可能性を有する特定の被険者において変更された領域でありうる。
この点について、本発明の特定のプライマーは、ＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ中の突然変異した配列に特異的である。そのようなプライマーを使用することにより、増幅産物の検出は、ＮＣＲ３遺伝子座における突然変異の存在を示す。対照的に、増幅産物の非存在は、特定の突然変異がサンプル中に存在しないことを示す。
【００８６】
本明細書において開示する方法において使用可能な典型的な核酸プライマーは、点突然変異を含む突然変異したＮＣＲ３配列、典型的には、点突然変異、好ましくは、前に定義した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む野生型ＮＣＲ３配列に対して相補的であり、特異的にハイブリダイズするプライマーである。
【００８７】
本発明に関連して使用可能な特異的核酸プライマーを以下に開示する。
【００８８】
３５７１ Ｇ／Ｔ多型を含む領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１】
これらの配列を使用し、４７１bpのフラグメントを増幅してよい。
【００８９】
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿２５６３０８６５＿１０を使用し、３５７１ Ｇ／Ｔ多型を遺伝子型決定することができる。
【００９０】
３７９０ Ｔ／Ｃ多型を含む領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表２】
これらの配列を使用し、４７１bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９１】
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿７５１４９０８＿１０を使用し、３７９０ Ｔ／Ｃ多型を遺伝子型決定することができる。
【００９２】
標的領域は、さらに、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物をコードする領域でありうる。
そのような標的領域を増幅する核酸プライマーの例を、実験セクションにおいて開示している（配列番号２０〜３０及び４８）。
【００９３】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの存在を、本明細書において開示する方法において、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする核酸プライマーを用いた選択的増幅を使用することにより検出してよい。
【００９４】
特定のＲＮＡ転写物アイソフォームを増幅する特異的プライマーの例を以下に記載する：
【００９５】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表３】
これらの配列を使用し、３２３bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９６】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表４】
これらの配列を使用し、２６６bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９７】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表５】
これらの配列を使用し、３１９bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９８】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表６】
これらの配列を使用し、２６２bpのフラグメントを増幅してよい。
【００９９】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表７】
これらの配列を使用し、３２１bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１００】
ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表８】
これらの配列を使用し、２６４bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０１】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表９】
これらの配列を使用し、２６６bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０２】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１０】
これらの配列を使用し、２６３bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０３】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１１】
これらの配列を使用し、２６３bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０４】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１２】
これらの配列を使用し、２６０bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０５】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１３】
これらの配列を使用し、２６４bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０６】
ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のためにＮＫｐ３０ ＲＮＡ ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物を増幅する特異的プライマーの例を本明細書において提供する：
【表１４】
これらの配列を使用し、２６１bpのフラグメントを増幅してよい。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション検出方法は、特定の配列、特にＮＣＲ３核酸配列突然変異又は特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームを検出する役割を果たす相補的な核酸配列の間での特定のハイブリッドの形成に基づく。
【０１０８】
特定の検出技術は、野生型の又は突然変異したＮＣＲ３遺伝子又はＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームに特異的な核酸プローブの使用を含み、ハイブリッドの存在の検出が続く。プローブは、浮遊状態に、又は、基材もしくは支持体に固定してよい（核酸アレイ技術と同様に）。プローブは典型的には標識され、ハイブリッドの検出を容易にする。そのような核酸プローブを本明細書において開示する。
【０１０９】
典型的なハイブリダイゼーション検出方法は、以下の、被験者からのサンプルを、ＮＣＲ３核酸（好ましくは遺伝子座）、特に突然変異したＮＣＲ３核酸に特異的な核酸プローブと接触させ、そしてハイブリッドの形成を評価する工程を含む。
特に好ましい実施態様において、この方法は、同時に、サンプルを、野生型ＮＣＲ３遺伝子座及びその種々の異常な又は突然変異した形態にそれぞれ特異的であるプローブのセットと接触させることを含む。この実施態様において、サンプル中でＮＣＲ３遺伝子座における種々の形態の突然変異の存在を直接的に検出することが可能である。また、種々の被険者からの種々のサンプルを並行して処理してよい。
【０１１０】
突然変異したＮＣＲ３核酸の存在を、このように、本明細書において開示する方法において、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームにハイブリダイズする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする、少なくとも１つの核酸プローブ、特に、浮遊状態の又はヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブとの選択的ハイブリダイゼーションにより検出してよい。
【０１１１】
本明細書において開示する特定の方法は、その目的が、癌の処置に対する被験者の感受性／反応を評価すること、又は、被験者における癌の予後を評価することであり、被験者から、ＤＮＡの試験サンプル、好ましくはＮＣＲ３配列を含むことが疑われる又は公知であるＤＮＡのサンプルを得る工程を含みうる。この方法は、好ましくは、以下の工程を含む：（ａ）被験者からの試験ＤＮＡサンプルを、少なくとも１つの核酸プローブと接触させ、それにおいて、前記核酸プローブは、突然変異したＮＣＲ３配列（例えば本明細書において記載するものの１つ）と相補的であり、それに特異的にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションサンプルを形成し、（ｂ）ハイブリダイゼーションサンプルを、ＮＣＲ３配列と少なくとも１つの核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションが生じることを可能にするのに適した条件下で維持し、及び（ｃ）ＮＣＲ３配列と少なくとも１つの核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションが存在するか否かを検出する。
【０１１２】
ＮＣＲ３配列と核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションを使用し、被験者における好ましくない、又は逆に、好ましい癌の予後を示してよい。
【０１１３】
ＮＣＲ３配列と核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションをさらに使用し、被験者に施された処置に対する癌の反応（耐性又は感受性）を特定してよい。
【０１１４】
前に説明した通り、特定の突然変異したＮＣＲ３配列、特に非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異を含むＮＣＲ３配列は、癌の好ましくない予後、及び特定の癌の処置に対する耐性、ならびに他の突然変異したＮＣＲ３配列、特にＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異を含むＮＣＲ３配列に関連する。
【０１１５】
この処置は、好ましくは、化学療法、特に、アルキル化剤又はアントラサイクリン、例えばＤＯＸ、及び／又はオキサリプラチンもしくはシスプラチン（ＰＬＡＴ）などの投与を含む化学療法；ＴＫＩ、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及びスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）などの投与を含む治療；ＦＴＩの投与を含む治療；及び好ましくはＸ線（ＸＲ）を含む放射線療法より選択される。
【０１１６】
典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、３０℃を上回る、好ましくは３５℃を上回る、より好ましくは４２℃を超過する温度、及び／又は約５００mM未満、好ましくは２００mM未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度、及び／又は他の試薬、例えばＳＤＳ、ＳＳＣなどの濃度を改変することにより、当業者により調整されうる。
本開示の目的について、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間に２５%未満のミスマッチがある場合にだけハイブリダイゼーションが生じる条件を包含する。
【０１１７】
本発明の関連内で、プローブは、ＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡ（の標的部分）と相補的であり、それとの特異的なハイブリダイゼーションが可能であるポリヌクレオチド配列を指し、それは前に記載したＮＣＲ３対立遺伝子に関連するポリヌクレオチド多型の検出に適する。プローブは、好ましくは、ＮＣＲ３遺伝子、ＲＮＡ、又はその標的部分に完全に相補的である。プローブは、典型的には、１５〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは２０〜５０ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸を含む。より長いプローブを使用してもよいことを理解すべきである。本発明の好ましいプローブは、２０〜３０ヌクレオチドの長さの一本鎖核酸分子であり、それは、変化を持つＮＣＲ３核酸の領域（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１１８】
異常な（例、突然変異した）ＮＣＲ３配列（特に、遺伝子又はＲＮＡ）に特異的な核酸プローブ、即ち、前記の異常なＮＣＲ３配列に特異的にハイブリダイズし、正常な（参照）ＮＣＲ３配列にはハイブリダイズしない核酸プローブを、本明細書において使用可能である。特異性は、標的配列に対するハイブリダイゼーションが、特異的なシグナルを生成することを示し、それは非特異的なハイブリダイゼーションを通じて生成されたシグナルから区別できる。完全に相補的な配列が本明細書において好ましい。しかし、特異的なシグナルが非特異的なハイブリダイゼーションから区別されうる限り、特定のミスマッチを許容してよいことを理解すべきである。
【０１１９】
プローブの配列は、癌の処置に対する被験者の感受性、又は被験者における癌の好ましい予後に関連する、突然変異、特に点突然変異、例えばＳＮＰなどを持つＮＣＲ３遺伝子又はＲＮＡの任意の配列に基づいて容易に調製することができる。
また、これらの核酸分子のフラグメント又は部分、例えばＮＣＲ３配列における上で特定された多型を包含する領域に基づいてプローブ及びプライマーを生成することが適切である。
【０１２０】
本明細書において記載する方法において実際に使用可能な典型的な突然変異したＮＣＲ３配列は、ＮＣＲ３の野生型配列及び点突然変異、好ましくは前に記載した一塩基多型（ＳＮＰ）を含む。
【０１２１】
ヌクレオチド置換、ならびにプローブの化学修飾を実施してよい。そのような化学修飾を達成し、ハイブリッドの安定性を増加させる（例、挿入基）、又はプローブを標識してよい。標識の典型的な例は、限定なしに、ラジオアイソトープ、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤又は蛍光剤、ハプテン、及び酵素を含む。標識のための方法及び種々の目的に適切な標識の選択におけるガイダンスが、例えば、Sambrook et al.（Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989）及びAusubel et al.（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998）において考察されている。
【０１２２】
本発明は、また、癌の処置に対する被験者の感受性を評価する方法、又は、被験者における癌の予後を評価する方法における、本明細書において記載する核酸プローブ又はプライマーの使用に関する。
【０１２３】
癌の処置に対する被験者の感受性を評価し、癌の処置の有効性を評価し、又は被験者における癌の予後を評価する本明細書において開示する方法を、さらに、上に示す通りに、先天的又は獲得された少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を、被験者からのサンプルにおいて、そのような異常なＮＫｐ３０タンパク質に対する結合について同定されたリガンドを使用して検出することにより実施してよい。
【０１２４】
本発明の好ましい方法は、被験者からのサンプルを、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム（正常なＮＫｐ３０、例、野生型ＮＫｐ３０、又は異常なＮＫｐ３０）に対する結合について同定されたリガンドと接触させ、結合が被験ＮＫｐ３０と前記ＮＫｐ３０リガンドの間で生じるか否かを、例えば、前記被験ＮＫｐ３０と前記ＮＫｐ３０リガンドの間での複合体の形成を決定することにより評価する工程を含む。
【０１２５】
本明細書において開示する特に好ましい方法は、被験者からのサンプルを、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドと接触させることにより、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの存在を決定する工程を含む。
【０１２６】
リガンドは、定義された標的に対して特異的に結合する薬剤である。
「特異的に」という用語は、薬剤の１０%未満、好ましくは５%未満が、前記の定義された標的とは異なる標的に結合することを意味する。このように、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム特異的リガンドは、ＮＫｐ３０タンパク質だけに、即ち、本発明に関連して、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに実質的に結合する。異なる型のリガンド、例えばＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームだけに実質的に結合する特異的な抗体及び他の薬剤（及びその機能的フラグメント）などを使用してよい。
【０１２７】
本明細書において開示する好ましいリガンドは、特定の正常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドである。
【０１２８】
抗ＮＫｐ３０タンパク質抗体、特に、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに特異的な抗体が本明細書において開示されており、Harlow and Lane（Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含む、多くのテキストに記載される標準手順を使用して産生されうる。特定のリガンドが、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又は特定のＮＫｐ３０スプライシングバリアント、スプライシング形態又はＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームだけに実質的に結合することは、通常の手順を使用又は適応することにより容易に決定されうる。１つの適したインビトロアッセイではウエスタンブロッティングの手順を使用する（Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988）を含む、多くの標準的なテキストに記載されている）。ウエスタンブロッティングを使用し、所定のＮＫｐ３０タンパク質結合剤、例えば抗ＮＫｐ３０タンパク質モノクローナル抗体などが、特定のＮＫｐ３０タンパク質、即ち、本発明に関連して、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームだけに実質的に結合することが決定されうる。
【０１２９】
本発明の関連内で、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメント又は派生物を指す。
抗体のより短いフラグメントも特異的な結合剤としての役割を果たすことができる。例えば、特定のＮＫｐ３０に結合するＦＡｂ、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＮＫｐ３０特異的な結合リガンドでありうる。
【０１３０】
これらの抗体フラグメントを以下の通りに定義する：（１）ＦＡｂ（無傷な軽鎖及び１つの重鎖の部分を産生するための酵素パパインを用いた全抗体の消化により産生される抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント）；（２）ＦＡｂ’（無傷な軽鎖及び１つの重鎖の部分を産生するためのペプシンを用いた全抗体の処理、続く還元により得られる抗体分子のフラグメント）；２つのＦＡｂ’フラグメントが１つの抗体分子当たり得られる；（３）（ＦＡｂ’）２（続く還元なしに、酵素ペプシンを用いた全抗体の処理により得られる抗体のフラグメント）；（４）Ｆ（Ａｂ’）２（２つのジスルフィド結合により一緒に保持された２つのＦＡｂ’フラグメントの二量体）；（５）Ｆｖ（２つの鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメント）；及び（６）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）（適したポリペプチドリンカーにより連結された、遺伝的に融合された一本鎖分子としての、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子）。これらのフラグメントを作る方法は通常通りである。
【０１３１】
本明細書において提示する特定の抗体は、前に定義され、本明細書において例示される、ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチド、典型的にＮＫｐ３０ポリペプチドに特異的である。
【０１３２】
本発明において使用可能な特定の抗体は、また、各々の特定の野生型ＮＫｐ３０ポリペプチドアイソフォームに特異的でありうる。好ましくは、抗体は、ＮＫｐ３０（配列番号３８及び３９）の細胞外ドメイン及びＮＫｐ３０（配列番号４０〜４２）の細胞内ドメインより選択される配列の全て又は特有の部分を含む。ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメインを配列番号３８に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４３に描写する。ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメインを配列番号３９に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４４に描写する。ＮＫｐ３０の短い細胞内ドメインを配列番号４０に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の短い細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４５に描写する。ＮＫｐ３０の中間細胞内ドメインを配列番号４１に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の中間細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４６に描写する。ＮＫｐ３０の長い細胞内ドメインを配列番号４２に描写する。特異的な抗ＮＫｐ３０の長い細胞内ドメイン抗体を得るために使用されるアミノ酸ペプチドを配列番号４７に描写する。
そのような配列を、さらに、担体ペプチドとしてＫＬＨに抱合してよい。
【０１３３】
このように、特定の実施態様において、サンプルを、異常なＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドに特異的な抗体と接触させ、免疫複合体の形成を決定する。免疫複合体を検出するための種々の方法、例えばＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）などを使用することができる。
【０１３４】
特定のＮＫｐ３０タンパク質に対する結合について同定された他のリガンドは、例えば、ヘパラン硫酸及びＢＡＴ３である。
【０１３５】
リガンドは、特に、プローブを使用して検出されうる。プローブには好ましくはタグが付けられる。
【０１３６】
特定の実施態様において、本発明は、このように、本明細書において、ＮＫｐ３０経路を介した腫瘍細胞の免疫原性の欠如を検出するための方法を開示し、この方法は、ＴＫＩ、アントラサイクリン、シスプラチン、オキサリプラチン、又はＸ線で処理された、ＮＫｐ３０リガンドを発現する自己腫瘍細胞の接触を含み、前記リガンドの結合の非存在は腫瘍細胞の免疫原性の欠如と相関している。
【０１３７】
当業者に周知の技術、例えばＥＬＩＳＡ結合アッセイ又はウエスタンブロット（ＷＢ）などを、上に記載する方法において適用してよい。
【０１３８】
非特異的な結合が起こりうるが、標的ＮＫｐ３０ポリペプチドアイソフォームに対する結合が、より高い親和性で起こり、非特異的な結合から確実に識別することができる。
【０１３９】
サンプルの核酸又はタンパク質と前に記載したリガンド又はプローブの間での接触を、任意の適したデバイス、例えばプレート、チューブ、ウェル、ガラスなどにおいて実施してよい。特定の実施態様において、接触は、核酸アレイ上又は特定のプローブ又はリガンドアレイ上で実施する（例えばヌクレオチドアレイ上に存在する核酸プローブなど）。
【０１４０】
リガンドは、前に記載したプローブとちょうど同じように、浮遊状態で又は基材もしくは支持体上に固定してよい。
基材は、固形又は半固形の基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の支持体でよい。基材は、種々の形態及びサイズ、例えばスライド、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲルなどでよい。
接触は、複合体が、試薬（リガンド又はプローブ）とサンプルの核酸又はポリペプチドの間で形成されるために適した任意の条件の下で行ってよい。
サンプルは、このように、同時に、又は並行して、又は連続的に、ＮＣＲ３核酸、ＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、又はＮＫｐ３０タンパク質もしくはポリペプチドの異なる形態、例えば野生型の正常なアイソフォーム及びその種々の異常な形態に特異的な種々のリガンド又はプローブと接触させてよい。
【０１４１】
本発明では、さらに、ＮＫｐ３０活性を決定する工程を含む方法を開示する。
【０１４２】
ＮＫｐ３０は、主に、３つの可能な発現レベルを考慮することにより、ＮＫ細胞においてインビボで発現される：（ｉ）クローンレベル、（ｉｉ）亜集団レベル、及び（ｉｉｉ）全末梢血集団のレベル。ＮＫｐ３０シグナル伝達は、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮγ）の分泌の誘発及びＤＣ成熟の加速のために不可欠である。
【０１４３】
本願において、異常なＮＫｐ３０タンパク質活性は、このように、例えば、ＴＮＦα及びＩＦＮγより選択される化合物の分泌の非存在又は存在、又はその細胞レベルにおける変化とも相関しうる。そのような細胞レベル、特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞レベルを、ＮＫｐ３０タンパク質活性を決定する工程を含む、本明細書において開示する方法において本発明者により測定してよい。そのような測定を、さらに、正常レベルと比較してよい。
異常なＮＫｐ３０活性を、ＮＫ細胞及びコーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を含む培養において、ＩＬ−２の存在又は非存在において、ＩＦＮγ（精製されたＮＫ細胞に由来する）の細胞レベルを測定することにより検出してよい。測定レベルを、好ましくは、ＩＬ−２の存在又は非存在において、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中のＮＫ細胞の培養から測定された参照レベルと比較する。
【０１４４】
異常なＮＫｐ３０活性を、さらに、ＴＫＩにより条件付けられた未熟な樹状細胞（ＤＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む共培養中の（精製されたＮＫ細胞に由来する）ＩＦＮγの細胞レベルを測定することにより検出してよい。ＤＣは、試験される被験者からの自己細胞又は同種細胞である。ＮＫ細胞は、好ましくは、自己細胞である。共培養は、並行して、ＮＫｐ３０リガンド及びモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０より選択される少なくとも１つの化合物の存在において、及び前記化合物のいずれかの非存在において実現されうる。
【０１４５】
異常なＮＫｐ３０活性を、さらに、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びコーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を含む培養中の（ＰＢＭＣに由来する）ＩＦＮγ又はＴＮＦαの細胞レベルを測定することにより検出してよい。測定レベルを、好ましくは、コーティングされたモノクローナル抗体抗ＮＫｐ３０を伴わないＰＢＭＣの培養から測定された参照レベルと比較する。
被験ＩＦＮγ又はＴＮＦαの測定レベルを、さらに、それぞれの参照レベルと比較してよい。
本発明者らは、実際に、異常なＩＦＮγ又はＴＮＦαレベル（特に、公知の標準と比較した減少値）が、異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームプロファイル、特に、ＮＫｐ３０の中間アイソフォームの相対的な高発現及びＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの減少した発現と相関することを発見した。
【０１４６】
ＴＮＦα及びＩＦＮγ分泌を、当技術分野において周知の技術、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーにおける細胞内サイトカイン染色、又はサイトカイン分泌アッセイにより決定してよい。
【０１４７】
異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性は、また、正常なＮＫｐ３０転写物アイソフォームの異常転写に相関しうる。異常転写は、コントロール又は標準の量もしくはレベルと比較して増加した発現でありうる。それは、また、例えば、癌処置により又は癌自体により誘導された、コントロール又は標準の量もしくはレベルと比較して増加した発現でありうる。
本発明は、ＮＫｐ３０をコードするｍＲＮＡの細胞のレベルを測定することによるＮＫｐ３０タンパク質発現又は活性の決定を含む方法を提供し、コントロールレベルと比較した増加レベルは、異常なＮＫｐ３０タンパク質発現と相関する。ｍＲＮＡレベルは、エクスビボで又はインビトロで、例えば、患者の単離ＰＢＭＣで、又は患者の単離ＮＫ細胞で測定してよい。
そのような方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖転写）の使用を含む工程を含むことができる。
【０１４８】
本願に記載されている方法は、このように、前に示す通り、好ましくは、正常状態においてＮＫｐ３０を発現する細胞（好ましくは、自己ＰＢＭＣ及び／又はＮＫ細胞より選択される）を含むサンプルで実施する。
【０１４９】
本発明者らは、さらに、本明細書において、潜在的なＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄のドナーの被験者であり、そのためＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する必要がある被験者のＮＣＲ３突然変異状態及び／又はＮＫｐ３０アイソフォーム状態又はプロファイルの決定を含む診断方法を記載する。
そのような診断方法は、また、ＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄移植のための候補において実施してよい。
【０１５０】
前に定義した、癌の処置に対する被験者の感受性又は被験者における癌の処置の有効性を評価する方法において使用される、又は被験者における癌の予後を評価する方法において使用されるキットが、さらに、本明細書において提供される。キットは、前に記載した、核酸プローブ、プライマー、及び／又はリガンド、例えば抗体などを含む。
キットは、また、ハイブリダイゼーション、増幅、又は結合反応、例えば、抗原−抗体免疫反応を実施するための容器又は支持体、試薬、及び／又はプロトコールを含みうる。
【０１５１】
本明細書において記載する方法は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで実施してよい。それらは、好ましくは、インビトロ又はエクスビボで実施される。
【０１５２】
スクリーニング方法
本願は、また、特に、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において、癌を予防又は処置するために有用な、化合物又は物質、好ましくは薬物候補又はリードをスクリーニングするための新規方法を提供し、試験化合物又は物質が、ＮＣＲ３遺伝子の発現、及び／又は特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現又は活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１５３】
上に記載する方法を使用してスクリーニングされる好ましい試験化合物又は物質は、ＮＣＲ３遺伝子の機能的な転写及び／又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、特に、少なくとも１つの突然変異した又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復又は増強することが可能である。
【０１５４】
ＮＫｐ３０中間（ＩＮＴＥＲ）タンパク質アイソフォーム発現を減少させる、好ましくは、ＮＫｐ３０の短い（ＳＨＯＲＴ）及び／又は長い（ＬＯＮＧ）タンパク質アイソフォーム発現をさらに増強又は増加させる化合物が好ましい。換言すると、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的発現が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの発現よりも低い、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームプロファイルを支持する化合物が、特に好ましい。
【０１５５】
本明細書において開示するスクリーニング方法では、好ましくは、ＮＣＲ３核酸又はＮＫｐ３０ポリペプチドもしくはタンパク質アイソフォーム、ならびにＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子を、新たな標的として使用する。そのような成熟は、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡＤＲの上方調節により特定されうる。この方法は、結合アッセイ及び／又は機能アッセイを含み、インビトロ、細胞系、又は動物などにおいて実施してよい。
【０１５６】
本発明者らは、特に、生物学的に活性な化合物又は物質、特に、癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質を選択する方法を開示し、前記方法は、インビトロで試験化合物又は物質を、ＮＣＲ３核酸（例えば、遺伝子又はＲＮＡ）、ＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドアイソフォーム、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子、及び、その任意のフラグメントより選択される産物と接触させること、及び前記化合物又は物質が前記産物に結合する能力を決定することを含む。
【０１５７】
さらなる特定の実施態様において、この方法は、本発明のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子を発現する組換え宿主細胞を、試験化合物又は物質と接触させること、及び、前記化合物又は物質がそれぞれ前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する前記分子に結合し、その活性を調節する能力を決定することを含む。
特定の実施態様において、前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームは、ＮＫｐ３０の異常な状態又はプロファイルに関与する、異常な、好ましくは突然変異したＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はそのフラグメントでありうる。
【０１５８】
前記核酸、ポリペプチド、又は分子に対する結合は、試験化合物又は物質が前記標的の活性を調節し、このようにして被験者において癌に導く経路に影響を与える能力としての指標を提供する。
【０１５９】
結合の決定は、当業者に公知の種々の技術により実施してよく、その一部は、本明細書において前に記載しており、例えば試験化合物又は物質の標識により、特定のＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチド（野生型又は異常なＮＫｐ３０）、例えば特にＮＫｐ３０アイソフォーム、又は特にＮＫｐ３０タンパク質又はポリペプチドなどに対する結合について公知である、又は同定されている標識されたコントロール又は参照リガンドとの競合による。
【０１６０】
本明細書において記載するさらなる目的は、生物学的に活性な化合物又は物質、特に癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法にあり、前記方法が、インビトロで、試験化合物又は物質を、本明細書において記載するＮＣＲ３遺伝子、特に野生型又は突然変異したＮＣＲ３遺伝子と接触させること、及び、前記化合物又は物質が前記ＮＣＲ３遺伝子の発現を調節する、特にその選択的スプライシングを調節する能力を決定することを含む。
【０１６１】
生物学的に活性な化合物又は物質は、ＮＣＲ３の機能的な転写及び／又は特定のＮＣＲ３タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である化合物でありうる。
【０１６２】
本明細書において、本発明者らにより（実験セクションを参照のこと）、特にトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及び５−アザシチジン（５ＡＺＡ）が、参照値又は平均発現値と比較し、ＮＫｐ３０ ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過少発現量に関連するＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な（相対的な）過剰発現量を誘導するために、野生型ＮＣＲ３遺伝子スプライシングを調節することができることが実証されている。
本発明者らは、さらに、本明細書において、特に、組み合わせで使用される配列番号４９〜５１に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド５３が、参照値又は平均発現値と比較し、ＮＫｐ３０ ＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの相対的な過剰発現量に関連するＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な（相対的な）過少発現量を誘導するために、野生型ＮＣＲ３遺伝子スプライシングを調節することができることを開示する。
【０１６３】
生物学的に活性な化合物又は物質を選択する別の方法が、さらに提供され、それにおいて、前記方法は、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く分子と接触させること、及び、前記化合物又は物質がそれぞれ前記ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する前記分子の活性を調節する能力を決定することの工程を含む。
【０１６４】
本明細書で開示する方法において使用可能であるＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ＤＣ成熟に導く特定の分子は、ＴＬＲ３リガンド、例えば二本鎖ＲＮＡ（例えば、ポリＡ：Ｕ及びポリＩ：Ｃ）及び／又は低メチル化Ｃ及びＧに富むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）などより選択してよい。
【０１６５】
本明細書の別の特定の目的は、癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法にあり、前記方法が、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０の活性の調節に関与するポリペプチド、例えばＩＬ−１５、ｓｕｓｈｉ ＩＬ−１５Ｒα−ＩＬ−１５ポリペプチド、又はその結合部位を含むフラグメントと接触させること、及び、前記化合物又は物質が前記ポリペプチド又はそのフラグメントに結合する能力を決定することを含む。
【０１６６】
さらなる特定の実施態様において、方法は、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性の調節に関与するポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を、試験化合物又は物質と接触させること、及び、前記試験化合物又は物質が前記タンパク質に結合し、前記タンパク質の活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１６７】
本明細書において開示するさらなる方法は、生物学的に活性な化合物又は物質、特に癌の予防又は処置において活性である化合物又は物質を選択する工程を含み、前記方法は、インビトロで、試験化合物又は物質を、ＮＫｐ３０の活性の調節に関与する遺伝子と接触させること、及び、前記試験化合物又は物質が前記遺伝子の発現を調節する能力を決定することを含む。
【０１６８】
スクリーニングの方法の特定の実施態様において、調節は活性化である。スクリーニングの方法の別の特定の実施態様において、調節は阻害である。
【０１６９】
本発明の方法は、多くの化合物又は物質のスクリーニングに適する。これらの化合物又は物質は、種々の由来、性質、及び組成でありうる。試験化合物又は物質は、単離された又は他の物質との混合物中の、任意の有機又は無機物質、例えば脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などでありうる。化合物又は物質は、例えば、産物のコンビナトリアルライブラリーの全て又は部分でありうる。
【０１７０】
特定の実施態様において、本発明は、また、癌の処置のために有用な化合物又は物質、好ましくは突然変異した又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現及び／又はＮＣＲ３遺伝子の機能的な転写を回復することが可能である化合物又は物質をスクリーニング又は選択する方法を開示し、前記方法は、試験化合物又は物質が、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム又はそのリガンドの発現又は活性を調節する、特に誘導もしくは増加させる、又は逆に、減少させる能力を決定することを含む。
【０１７１】
本発明者らは、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームのリガンドならびにＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する分子が、前に定義した通りに、癌治療に対する被験者の感受性を増加することができることを実証している。
【０１７２】
好ましいリガンドを使用して、正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質の長い及び短いアイソフォームプロファイル発現を、比較的に、中間アイソフォームプロファイルｂ発現まで上方調節する、及び／又は、前に定義した通りに、癌治療に対する被験者の感受性を増加させてよい。
【０１７３】
本明細書において特定される、正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現を上方調節する、及び／又は、癌治療に対する被験者の感受性を増加させるために使用できる、ＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回する好ましい分子は、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する被験者のＮＫ細胞、幹細胞、又は骨髄上のＴＲＡＩＬに対する抗体より選択されうる。
【０１７４】
上のスクリーニング方法を、任意の適したデバイス、例えばプレート、例えば、マルチウェルプレート、チューブ、ディッシュ、フラスコなどにおいて実施してよい。いくつかの試験化合物又は物質を、並行してアッセイすることができる。
【０１７５】
組成物及び使用
公知の、又は、前に記載したスクリーニング方法を用いて単離され、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は活性を回復又は増強、即ち、増加又は支持することが可能である、被験者において癌、特に小児癌、例えば神経芽細胞腫、又は肉腫、特にＧＩＳＴ、又は白血病、特にＡＭＬを処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、本明細書に記載されている。
【０１７６】
被験者は、好ましくは、前に説明した、突然変異したＮＣＲ３核酸、異常（相対）量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は、少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者である。
【０１７７】
機能的ＮＫｐ３０発現は、典型的には、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルに関連しており、被験者において、参照値又は平均値と比較した場合、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対量が減少しており、そして、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの相対的な発現が増加していることが、本発明者らにより本明細書において実証されている。
特定の実施態様において、正常な又は保護的なＮＫｐ３０アイソフォームの状態又はプロファイルは、ＮＫｐ３０中間アイソフォームの（相対）量が、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの量よりも低いプロファイルである。
【０１７８】
記載したスクリーニング方法により得られる物質を使用して、前に定義した通り、癌治療に対する被験者（前に定義した）の感受性を増強するための医薬的組成物を調製することもできる。
【０１７９】
化合物又は物質は、公知の化合物もしくは物質又は本発明のスクリーニング方法を使用して選択される化合物又は物質でありうる。
【０１８０】
被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するために使用可能な本明細書における化合物の例は、さらに、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、又はそのようなベクター又は核酸を含む組換え宿主細胞より選択することができる。
【０１８１】
機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現もしくは活性を回復することが可能である化合物又は物質をさらに使用して、前に定義した通りに、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製してよい。
【０１８２】
そのような化合物は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばバルプロ酸（ＶＰＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、アクラルビシン、バナジン酸ナトリウム；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）など；ＰＫＣ阻害剤、例えばＧｏ６９８３など；イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）；サイトカイニンキネチン；シクロヘキシミド；デキサメタゾン；オレイン酸ナトリウム；エストロゲン；プロゲステロン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ＦＫ５０６；サイクロスポリンＡ；スタウロスポリン及びその任意の組み合わせからなる群において選択してよい。
【０１８３】
配列番号４９−５１のアンチセンスオリゴヌクレオチドも、前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するために組み合わせで使用可能な化合物の例である。
【０１８４】
正常なＮＫｐ３０タンパク質発現又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの活性を有する被験者のＮＫ細胞、骨髄、及び幹細胞は、そのような被験者において癌を処置又は予防するために使用することができる物質の例である。
【０１８５】
前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するためのＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、樹状細胞（ＤＣ）の成熟に導く生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、本明細書において開示される。
【０１８６】
そのような化合物は、好ましくは、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びその組み合わせからなる群において選択される。
【０１８７】
前に定義した通り、被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するためのＮＫｐ３０シグナル伝達経路を迂回し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に導く生物学的に活性な化合物又は物質の使用が、さらに本明細書において開示される。
そのような化合物は、好ましくは、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩＡ）、ＮＫＧ２Ｄ、及びＴＬＲ３リガンドからなる群より選択される。
ＴＬＲ３リガンドは、好ましくは、例えばポリＡ：Ｕ及びポリＩ：Ｃより選択してよい二本鎖ＲＮＡである。
【０１８８】
本発明者らは、さらに本明細書において、公知の又は本発明の方法を用いて選択される、及び、機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現を回復又は増強することが可能である上に記載する化合物又は産物の少なくとも１つを含む医薬的化合物を提供する。
【０１８９】
医薬的組成物は、本明細書において、さらに有利には、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばイマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）及び／又はスニチニブマレート（ＳＵ１１２４８）；ファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）及びアントラサイクリン、例えばＤＯＸ、オキサリプラチン、及び／又はシスプラチン（ＰＬＡＴ）などを、組み合わせ調製物として、前記癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含んでよい。
【０１９０】
本明細書において記載する特定の組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、ＰＫＣ阻害剤及び／又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤を、単独で又は組み合わせ調製物として、前記癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含む。
【０１９１】
本明細書において開示する医薬的組成物は、さらに、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。
【０１９２】
好ましい実施態様において、本明細書において記載する医薬的組成物、特に、化学療法産物を含まない医薬的組成物を、ＮＫｐ３０が突然変異した個人において、化学療法又は放射線療法の施行を含む任意の処置前に投与する。医薬的組成物の投与は、単回投与又は反復投与において、任意の続く処置の前及び／又は間に、例えば、任意の続く処置の１日前及び前記処置の間の３週間おきに実施してよい。
【０１９３】
ＴＬＲ３リガンドを含む医薬的組成物は、好ましくは、任意の化学療法又は放射線療法の前及び／又は間に投与される。
【０１９４】
本明細書において提供する医薬的組成物の投与は、当業者に公知の任意の方法により、好ましくは経口経路により又は注射により（全身経路を介して）実施してよい。投与用量は、当業者により適応されうる。
【０１９５】
典型的には、処置の観点で、投与用量は例えば以下でありうる：
− ４−エピルビシン（アントラサイクリン）について：３週間おきに１００mg/m2；
− オキサリプラチンについて：３週間おきに約６００−１０００mg/m2；
− 核酸化合物について、用量は、例えば、ポリＡ：Ｕについて、６週間で３０−５０mg/週に及ぶ。
【０１９６】
予防的処置に関連して、本発明の医薬的組成物は、好ましくは、３週間おきに投与される。
【０１９７】
反復処置は、恐らくは他の活性薬剤、治療、又は任意の医薬的に許容可能な賦形剤（例、バッファー、等張生理食塩水、安定化剤の存在においてなど）との組み合わせで実施してよいことが理解される。
【０１９８】
本発明は、また、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性の活性化を通じた、被験者において癌を処置又は予防する方法にある。
【０１９９】
特に、ＮＣＲ３遺伝子の突然変異した対立遺伝子を持ち、異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームを発現し、又は異常なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性を示す被験者を処置する方法（併用療法を含む）が本明細書において提供される。
被験者は、このように、例えば、遺伝子治療、タンパク質置換治療を通じて、又は、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム模倣剤及び／又は正常な又は保護的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム状態又はプロファイルのアクチベーターの投与を通じて処置してよく、それにおいてＮＫｐ３０中間アイソフォームの相対的発現は、ＮＫｐ３０の短い及び／又は長いアイソフォームの（相対的）発現より低い。前記方法の少なくとも１つを、さらに、前に定義した通りに、癌治療に組み合わせてよい。
【０２００】
本発明は、また、本明細書において前に記載した通り、少なくとも１つのＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性の活性化を通じた、被験者において癌を処置又は予防する方法にある。
【０２０１】
診断方法は、本明細書において記載する通り、癌の処置に対する被験者の感受性を評価し、又は、癌患者において先天的な又は獲得されたＮＫｐ３０の定性的又は定量的な欠損を検出することを目的とし、そのような処置のために選択可能な被験者、特に、癌処置、特に化学療法処置、及び／又は同種骨髄移植の候補である、又は、それを受けるであろう被験者に適用してよい。同種骨髄移植の候補である、又は、それを受けるであろう被験者に関して、ＮＫｐ３０アイソフォーム発現の状態又はプロファイルに関して適切な骨髄ドナー被験者を選択することが好ましい。適切な骨髄ドナー被験者は、実際には、本明細書において定義するＮＫｐ３０アイソフォームの機能的な又は正常な発現又は活性を有する被験者である。
【０２０２】
本発明の他の特徴及び利点を、以下の実験セクション（図１〜２４を参照のこと）において与えており、それは例示的であり、本願の範囲を限定しないと見なすべきである。
【０２０３】
実験セクション
Ａ．予備アッセイ（４１人の患者／３７人の健常ボランティアのコホート）
本発明者らは、本明細書において、ＮＣＲ３遺伝子の転写調節（ＮＫ細胞表面でのＮＫｐ３０アイソフォームの発現の定量的及び定性的な調節）における欠損が、長期間のＴ細胞依存的な抗腫瘍反応の確立に必要である、ＮＫｐ３０及びＩＦＮγの産生を通じたＮＫ細胞によるＤＣ活性化の減少を介した腫瘍増殖の制御に影響を与えることを実証している４１。
本発明者らは、最初に、４１人のＧＩＳＴ患者及び３７人の健常ボランティアにおいてＮＣＲ３遺伝子中に分布する２１の一塩基多型（ＳＮＰ）を遺伝子型決定している。予備結果は、ＮＣＲ３遺伝子中の２つの突然変異がＧＩＳＴの制御に関連することを明らかにした。
【０２０４】
材料及び方法
患者及び健常ボランティア（ＨＶ）
コホートは、最初に、ＴＫＩ（チロシンキナーゼ阻害剤）により処置された４１人のＧＩＳＴ患者から成り、Institut Gustave Roussy（ＩＧＲ）において経過観察された。ＧＩＳＴ患者は、ＥＯＲＴＣ第ＩＩＩ相試験６２００５又はFrench Sarcoma Group（大半がＩＧＲ及びＣＬＢ）第ＩＩＩ相臨床試験（ＢＦＲ１４）に登録され、それぞれイマチニブメシレート（ＩＭ）の用量及び持続時間を評価した。ＢＲＦ１４は、再発中の転移性又は切除不能な悪性ＧＩＳＴを伴う患者における、３年後に（実際には最初の１年間）処置介入対継続を無作為化した非盲検多施設試験であった５４。ＥＯＲＴＣ６２００５試験は、ＧＩＳＴ患者におけるＩＭの１日４００mg対８００mgを比較する無作為化試験であった５５。
書面のインフォームドコンセントが、臨床試験及び免疫学的試験のための地域倫理委員会（Comite Consultatif de Protection des Personnes se pretant a la Recherche Biomedicale, Kremlin-Bicetre）に従って患者から得られた。
ヘパリン添加血液を、イマチニブメシレート（ＩＭ）治療から２、６、１２ヶ月後に患者から採取した。約３７人の健常ボランティアを、免疫学的パラメーターについてのコントロールとして使用した。
年齢、性別、リンパ球及びＮＫ細胞の数、ＩＭを用いた治療での用量及び持続時間を含む患者の特徴が記載されている（Menard et al.４２）。
腫瘍反応をコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより評価し、そして反応を処置の開始から３ヶ月後ごとにＲＥＣＩＳＴ基準に従って分類した。非進行性疾患には、安定疾患及び客観的な部分的又は完全な反応が包含された。患者の経過観察の中央値は４７ヶ月（範囲６−７５ヶ月）であった。
ＩＧＲ、Center Leon Berard及び周辺の抗癌センターで管理された１９人の神経芽細胞腫患者の予備コホートは、転移性腫瘍及び限局性腫瘍から成った。良好な又は不良な臨床予後を伴う患者の分類は、疾患の病期、年齢、及びＭＹＣＮオンコジーン増幅に基づいた１２。
【０２０５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
全細胞ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen）を用いてＰＢＭＣ及びＮＫ細胞株から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、５μgの全ＲＮＡから、SuperScript（商標）II Reverse Transcriptase及びランダムプライマー（Promega）を使用し、Invitrogenの取扱説明書に従って合成した。
【０２０６】
「ＧＩＳＴ患者及び健常ボランティア」コホートについて、リアルタイム定量的ＰＣＲ増幅を、FastStart DNA Master SYBRGreen I Mixを使用し、製造業者の取扱説明書に従って、０．３μMのプライマー、２mMのＭｇＣｌ２、及びｃＤＮＡを用いて、２０μlの最終反応容積中で行った。サーマルサイクリングをLightCycler（Roche Molecular System）を使用して実施し、９５℃での１０分間のインキュベーションにより開始し、３８サイクル（９５℃、１秒；６５℃、１０秒；７２℃、２０秒）が続いた。ＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現レベルを、対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量を用いて、その相対的ｍＲＮＡ量を割ることにより標準化した。
リアルタイム定量的ＰＣＲにおいて使用される特異的プライマーは、Primer3(v.0.4.0)ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu/）を用いてデザインした。
以下のプライマーを使用した：ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２：５’−ＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴ−３’（配列番号２０）；ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ：５’−ＧＴＧＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号２１）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ：５’−ＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２２又は２７）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ：５’−ＣＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴ−３’（配列番号２３）；ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ：５’−ＴＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２４）。プライマー対”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ”を使用し、ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−ＷＴ転写物を増幅した；ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩ”；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ”；ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ転写物については”ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４Ｉ”；ＬＯＮＧ−ＷＴ転写物については“ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ”；ＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物については“ＮＫｐ３０Ｆｅｘ２ｄｅｌ／ＮＫｐ３０Ｒｅｘ４ＩＩＩ”。
パートＢにおいて以下に説明される通り、本発明者らは、後に、使用されているプライマー対（上で特定される）は、ＮＫｐ３０特異的であるが、ＬＯＮＧ、ＳＨＯＲＴ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥアイソフォーム（即ち、それらのそれぞれの細胞内ドメインに従って区別されるＮＫｐ３０アイソフォーム）間だけを識別でき、定常（”ＤＥＬ”）と可変（”ＷＴ”）アイソフォーム（即ち、それらのそれぞれの細胞外ドメインに従って区別されるＮＫｐ３０アイソフォーム）間はできない。明らかな通り、上の結果によって、特に被験者における癌の予後を評価するための重要なアイソフォームとしてのＮＫｐ３０中間アイソフォームの特定が可能になる。上に記載した試験（パートＡ）は、しかし、二回目に（パートＢ）、患者数を二倍にし、前記ＮＫｐ３０中間アイソフォームの戦略的価値を確認するコホートで、本発明者らにより完成されている。TagMan方法を使用して加えた記載結果は、しかし、より具体的であり、パートＢにおいて以下で説明する通りである。
【０２０７】
神経芽細胞腫コホートについて、より実用的な定量化システムを使用した。６つのＮＫＰ３０転写物及びβ２Ｍハウスキーピング転写物のためのＰＣＲプライマー及びTaqManプローブをPrimer Expressソフトウェアｖ１．０（Applied Biosystems）を用いてデザインした。
以下のプライマー及びプローブを使用した：ＮＫＰ３０ ＥＣ−ＷＴ：５’−ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２５）；ＮＫＰ３０ ＥＣ−ＤＥＬ：５’−ＧＧＴＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号２６）；ＮＫＰ３０ ＥＸ４Ｉ：５’−ＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号２７又は２２）；ＮＫＰ３０ＥＸ４ＩＩ：５’−ＣＧＧＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＡＴＴ−３’（配列番号２８）；ＮＫＰ３０ＥＸ４ＩＩＩ：５’−ＧＧＡＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２９）；ＮＫＰ３０Ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：５’−ＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＧＡＣＧＴＧＣ−３’（配列番号３０）；Ｂ２ＭＦｏｒ：５’−ＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴ−３’（配列番号３１）；Ｂ２ＭＲｅｖ：５’−ＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧＣＧ−３’（配列番号３２）；Ｂ２ＭＰｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：５’−ＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡ−３’（配列番号３３）。
１マイクロリットルの第１鎖ｃＤＮＡを、１２．５μLの２×TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）及び０．７５μLのＮＫＰ３０プライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）又は０．５μLのβ２Ｍプライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）と最終容積２５μL中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、ABI prism 7700 Sequence Detection System（Applied Biosystems）を使用して行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：最初のインキュベーション５０℃で２分、変性９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、そして６０℃（ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−ＷＴ、ならびにβ２Ｍ転写物について）又は６２℃（ＮＫＰ３０ ＳＨＯＲＴ−、ＩＮＴＥＲ−、及びＬＯＮＧ−ＤＥＬ転写物について）で１分間の４５サイクル。リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）データを、２-ΔΔＣＴ方法を使用し、製造業者の指示に従って分析した。
【０２０８】
本発明者らは、さらに、シグナル出現を可能にする別のＮＫＰ３０Ｐｒｏｂｅ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）を産生しており、前記プローブは、上に記載する配列番号３０に対応するプローブよりも特異的であり、即ち、上に記載した適用されるＲＴ−ＰＣＲ方法に関連して、潜在的なＤＮＡ混入物とｃＤＮＡの間で識別できることに注目すべきである。前記の新たなプローブが、本明細書において配列番号４８として特定されており、拡大コホートで使用されており、下の実験パートの記載から明らかである（パートＢ）。
【０２０９】
クローニング
合成された第１鎖ＮＫ９２ ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、HotStarTAQ DNAポリメラーゼ（Qiagen）を用いて５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して増幅した。
クローニングシステムのために使用されるＨＰＬＣ精製プライマーを、Primer3 v0.4.0ソフトウェアを用いてデザインした：ＳＨＯＲＴ−ＷＴ及びＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０ ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号３４）及びＥｃｏＲＩ−ＳＨＯＲＴ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３５）；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ及びＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＩＮＴＥＲ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３６）；ＬＯＮＧ−ＷＴ及びＬＯＮＧ−ＤＥＬ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＬＯＮＧ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３７）。
下線を引いた配列は、発現プラスミドベクター中のＤＮＡクローニング用の制限酵素認識部位である。サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で１５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、ＳＨＯＲＴ、ＩＮＴＥＲ、及びＬＯＮＧプライマーについてアニーリング（６７℃で３０秒）、及び伸長（７２℃で１分）の３０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで単離し、QIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を使用して精製し、そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ（Ozyme）を用いて消化した。消化されたフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現ベクター（Invitrogen）に、そして後にｐＩＲＥＳ２哺乳動物バイシストロニック発現ベクター（CLONTECH）にも連結した。ヌクレオチド配列をABI PRISM 310遺伝子アナライザー（Applied Biosystems）により分析した。
【０２１０】
遺伝子型決定
ＤＮＡを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配により分離された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出した。ＮＣＲ３突然変異を同定するために、本発明者らは３つの定義されたＰＣＲ産物のシークエンシング分析を実施した。
３つのプライマー対を、ＰＲＩＭＥＲ３プログラムを用いてデザインした：ＮＣＲ３Ｆｒａｇ１：５’−ＧＡＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１４）及び５’−ＧＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）；ＮＣＲ３Ｆｒａｇ２：５’−ＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１６）及び５’−ＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＴＧＡ−３’（配列番号１７）；ＮＣＲ３Ｆｒａｇ３：５’−ＣＴＧＡＡＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１８）及び５’−ＧＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１９）。
ＰＣＲ増幅を、AmpliTaq（PE Biosystems）を用いて、５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して行った。サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、アニーリング３０秒（ＮＣＲ３Ｆｒａｇ１プライマーについて６４℃、ＮＣＲ３Ｆｒａｇ２プライマーについて６０℃、及びＮＣＲ３Ｆｒａｇ３プライマーについて６４℃）、及び伸長（７２℃で１０秒）の４０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。シークエンシング反応を開始する前に、ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製し、そして２%アガロースゲル電気泳動により定量化した。シークエンシング反応を、CEQ8000キット及びCEQ8000自動化蛍光シークエンサー（Beckman Coulter）を用いて実施した。
【０２１１】
クラスタリング分析
研究された教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した５６。
【０２１２】
ＨＤＡＣ及び脱メチル化剤によるＮＣＲ３選択的スプライシングの調節
ＮＫ９２細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、５−アザシチジン（２μM）及びＩＬ−２（５０UI/ml）と３７℃で３６時間インキュベートした。
ＹＴＳ細胞を９６ウェルプレート中に播種し（５．１０５個NK/ウェル）、トリコスタチンＡ（１００nM）と３７℃で４５時間インキュベートした。
【０２１３】
ＮＫ細胞フローサイトメトリー分析
ＮＫ細胞を以下の抗体を用いて染色した：BD Pharmingenから購入したＣＤ３−ＡＰＣ（クローンＵＣＨＴ）、MiltenyiからのＮＫｐ３０−ＰＥ（クローンＡＦ２９−４Ｄ１２）、Beckman-CoulterからのＣＤ５６−ＰＣ５（クローンＮ９０１）。蛍光をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーターで取得し、そして続いてCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
【０２１４】
インビトロＮＫ細胞エフェクター機能の評価
ＮＫｐ３０架橋実験では、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞Easy Sepキット（Stem Cell Technologies, Paris, France）を用いて精製し（純度＞９５%）、２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０（クローン２１０８４７、R&D Systems、Lille、France）又はアイソタイプコントロールを用いて７時間コーティングした９６ウェル−Maxisorpプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中に播種した。２０時間のＮＫｐ３０架橋後、上清を回収し、−８０℃で保存し、そして次に市販のＥＬＩＳＡキットを使用し、製造業者の取扱説明書（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）に従って評価した。あるいは、ＮＫ細胞を、１０μMモネンシンを添加したＡＩＭＶ中で２μlの抗ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（クローンＨ４Ａ３，Pharmingen）と７時間インキュベートし、ＣＤ３／ＣＤ５６染色を架橋の終わりに実施した。
【０２１５】
統計分析
ノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定を異なる群の比較のために使用した。結果は、ｐ＜０．０５の場合、９５%の信頼で有意であると考えられた。全ての統計分析を、GraphPad Prismソフトウエアバージョン５を用いて実施した。
【０２１６】
予備試験での特定の目的
目的１：ＧＩＳＴ患者における処置に対する反応におけるＮＫｐ３０アイソフォームの保有率及び予測値。
イマチニブメシレートで処置された一連の＞４０人の消化管肉腫（ＧＩＳＴ）を持つ患者及び＞３０人の年齢及び性別を一致させた健常ボランティア（ＨＶ）を、個々のＮＫｐ３０アイソフォームの各々の発現のそれらの転写パターンについて検証した。
【０２１７】
並行して、精製された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でのＮＫｐ３０発現レベル及び機能（抗ＮＫｐ３０抗体を用いた架橋時での脱顆粒及びＩＦＮγ／ＴＮＦα産生）をアッセイしている。
ＮＫｐ３０のｍＲＮＡプロファイリング、タンパク質発現、及び機能の間の相関を、ｉ）ＨＶ患者及びＧＩＳＴ患者の間、ｉｉ）イマチニブメシレートを用いて処置された患者における進行性及び非進行性の間で検証した。
【０２１８】
目的２：神経芽細胞腫患者におけるＮＫｐ３０アイソフォームの予後値
特定のヒト悪性腫瘍（例えば神経芽細胞腫など）が、ＮＫ細胞により制御されうる。この仮定に基づき、本発明者らは、ＧＩＳＴ患者において立証されたＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現の保護的パターンも、従来の処置で処置された他の悪性腫瘍に適用されるか否かを研究している。１９人の神経芽細胞腫患者の予備コホートを試験した（良好な臨床予後を伴う患者対不良な臨床予後を伴う患者におけるＰＢＭＣ細胞中のＮＫｐ３０ ｍＲＮＡのプロファイリング）。
【０２１９】
目的３：ＮＫｐ３０アイソフォームの薬理学的調節
エピジェネティック調節によって選択的スプライシングの調節が可能になる。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を使用し、本発明者らは、定義されたパターンを伴うＮＫ細胞株で、インビトロでの種々の割合の各々の個々のＮＫｐ３０スプライシングバリアントにおける潜在的な変化を試験している。
【０２２０】
結果
１．ＧＩＳＴ患者における処置に対する反応におけるＮＫｐ３０アイソフォームの保有率及び予測値
利用可能なデータベースに従い、ヒトＮＣＲ３遺伝子は、６つの異なってスプライシングされる転写物として発現される：２つの型の細胞外ドメインが存在する（可変Ｉｇ様ドメイン及び定常Ｉｇ様ドメイン）、それらの各々が３つの別々の細胞内ドメイン（短い、中間、及び長いテール）の１つに連結されている２４（図１）。
６つのＮＫｐ３０アイソフォームの臨床的及び機能的関連性を研究するために、本発明者らは、最初に、４１人のＧＩＳＴ患者（全員が少なくとも２ヶ月間にわたりイマチニブメシレートを用いて処置される−標準的ケア−）及び３７人のＨＶのＮＫｐ３０転写プロファイルを分析した。
特異的プライマーを、ＲＴ−ＰＣＲ方法を使用して６つの転写物を定量化するために、各ＮＫｐ３０アイソフォームについて設計した（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／短いテール；ＩＮＴＥＲ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／中間テール；ＬＯＮＧ−ＷＴ：可変Ｉｇ様ドメイン／長いテール；ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／短いテール；ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／中間テール；ＬＯＮＧ−ＤＥＬ：定常Ｉｇ様ドメイン／長いテール）（図２）。上で説明した通り、２回目において、SYBRGreenアッセイにおいて使用される上に記載したプライマーは、実際に、３つの別々の細胞内ドメインに特異的であるが、しかし、可変及び定常細胞外ドメインアイソフォームの間を識別することはできないと思われた。以下に加えた結果によって、ＬＯＮＧ、ＳＨＯＲＴ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥアイソフォームの間を識別するための第１の使用したプライマーの関連性が確認される。本発明者らは、また、第１の使用した抗体が、ＮＫｐ３０特異的であるが、定常ドメインアイソフォームを確実に特定することができず、しかし、可変細胞外ドメインアイソフォームを確実に検出することができることを発見した。以下に加えた結果は、本明細書においてより関連している。なぜなら、それらは、配列番号２５、２７（又は２２）、２８、２９、３１、３２、３３、及び４８により特定される上に記載するプライマーを使用して得られ、それらは、ＳＨＯＲＴ、ＬＯＮＧ、及びＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ可変細胞外ドメイン（“ＷＴ”）アイソフォームを特異的に特定することができる。それらは非常に重要な（二重）患者コホートで使用されたため、それらは本明細書で、特に被験者における癌の予後を評価するために、各アイソフォームの正確な相対量を制御するために使用可能である。
ＮＫｐ３０アイソフォームの発現を、ＰＢＭＣのｃＤＮＡから評価した。ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおける６つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合の比較によって、４１人の患者の第１コホートで、ＧＩＳＴ患者におけるＩＮＴＥＲ−ＤＥＬアイソフォームの過少発現量に関連するＳＨＯＲＴ−ＤＥＬアイソフォームの過剰発現量が明らかになった（図３Ａ）。
細胞内ドメイン［３つのＳＨＯＲＴ、ＩＮＴＥＲ、及びＬＯＮＧ細胞内ドメインについてのＷＴ（可変Ｉｇ様ドメイン）バリアント及びＤＥＬ（定常Ｉｇ様ドメイン）バリアントの合計］を考慮することにより、ＧＩＳＴ患者プロファイルは、最初に、ＨＶと比較した、ＳＨＯＲＴアイソフォームの過剰発現量及びＩＮＴＥＲアイソフォームの過少発現量により特徴付けられた（図３Ｂ）。
処置の経過中での４人のＧＩＳＴ患者におけるＮＫｐ３０転写プロファイルの安定性を制御した（図４）。患者の大半が、安定なＮＫｐ３０プロファイルを示した。
６つのＮＫＰ３０アイソフォームに基づく階層的クラスタリングアプローチを使用し、本発明者らは、最初に、２群における患者のコホートを分離した（図５）。Ｂ群の患者は、進行までの加速時間（４５ヶ月で３５%の再発）を示した。対照的に、Ａ群の患者のわずか１６%がイマチニブメシレートの４５ヶ月後に再発した。興味深いことに、ＨＶの５０%が、好ましくないＢ群において分離された。
本発明者らは、Ａ群及びＢ群に関連するＮＫＰ３０転写プロファイルを特徴付けた（図６）：Ａ群は、この特定の例において、ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイル（「プロファイルＡ」と呼ぶ）により特徴付けられ、Ｂ群は、ＧＩＳＴ患者（図６Ａ−Ｂ）についてと同様に健常ボランティアについて、ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高プロファイル（「プロファイルＢ」と呼ぶ）により特徴付けられた（図６Ｃ−Ｄ）。
【０２２１】
２．ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおけるＮＫｐ３０アイソフォームの転写プロファイルの機能的関連性
ＨＶ及びＧＩＳＴ患者から精製されたＮＫ細胞でのＦＡＣＳ分析におけるＮＫｐ３０細胞表面発現の比較では、プロファイルＡ対プロファイルＢを示し、有意差は明らかにならなかった（図７）。興味深いことに、これらの２つのプロファイルの機能的な特徴付けによって、ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高プロファイルＢと、インビトロでのＮＫｐ３０架橋時のＮＫ細胞による（精製ＮＫ細胞上での）ＩＦＮγの低産生の間の関連が明らかになった（図８）。
関連性は、これらのＮＫ細胞の細胞毒性機能とＮＫｐ３０プロファイルの間で検出されなかった（データ示さず）。
【０２２２】
３．ＧＩＳＴ患者及びＨＶにおけるＮＣＲ３突然変異とＮＫｐ３０アイソフォームの転写プロファイルの間での関連性
Ｂ群のＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高転写プロファイルは、非同義のＮＣＲ３＊３５７１ Ｇ／Ｔ（Ｒ１７４Ｓ − ｒｓ３１７９００３）突然変異に関連する（Ｂ群の突然変異した個人の１３%対Ａ群の０%）。
Ａ群のＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイルは、ＮＣＲ３遺伝子の３’非翻訳領域中に位置付けられるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）突然変異に関連する（Ａ群の突然変異した個人の５８%対Ｂ群の３%）（図９）。興味深いことに、ＮＣＲ３＊３７９０ Ｃ突然変異は、ＮＣＲ３遺伝子中のポリアデニル化部位を破壊する（図１０）。ＮＣＲ３＊３７９０ ＣＣ患者での結果は、ＩＮＴＥＲアイソフォームの排他的な転写である（データ示さず）。
【０２２３】
４．神経芽細胞腫患者におけるＮＫｐ３０アイソフォームの予後値
神経芽細胞腫における６つのＮＫｐ３０アイソフォームの臨床的な関連性を研究するために、本発明者らは、良好な又は不良な臨床予後を伴う診断時の１９人の患者でのＮＫｐ３０転写プロファイルを分析した。
ＮＫｐ３０アイソフォームの発現を、ＰＢＭＣのｃＤＮＡから評価した。神経芽細胞腫患者における６つのＮＫｐ３０アイソフォームの割合の比較によって、良好な予後を伴う神経芽細胞腫患者と比較し、不良な予後を伴う神経芽細胞腫患者におけるＩＮＴＥＲアイソフォームの過少発現量に関連するＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過剰発現量の傾向が明らかになった（図１１）。
６つのＮＫＰ３０アイソフォームに基づく階層的クラスタリングアプローチを使用し、本発明者らは、２群における患者のコホートを分離した（図１２）。良好な臨床予後を伴う７人の患者の５人が、ＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低プロファイルにより特徴付けられる２群において分離された（図１３）。この特定の例において、非進行性ＧＩＳＴ患者（プロファイルＡ）において立証されたＮＫｐ３０ ｍＲＮＡ発現の保護的パターンが、良好な臨床予後を伴う神経芽細胞腫患者に適用されると思われた。
【０２２４】
５．薬物を用いたＮＣＲ３遺伝子の選択的スプライシングの調節
選択的スプライシングを調節するいくつかのアプローチを使用し、ＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高（本試験（パートＡ）において得られた最初の結果後にプロファイルＢとして特定された）からＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ高／ＳＨＯＲＴ低／ＬＯＮＧ低（本試験（パートＡ）において得られた最初の結果後にプロファイルＡとして特定された）へのスイッチを操作してよい。
本発明者らは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤に属する薬物のいくつかのファミリーを試験している。
ＹＴＳ細胞株及びＮＫ９２ ＮＫ細胞株をモデルとして使用した。なぜなら、両方がＮＫｐ３０ ＩＮＴＥＲ低／ＳＨＯＲＴ高／ＬＯＮＧ高（パートＡにおいてプロファイルＢとして特定された）を示すからである。予備結果によって、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及び５−アザシチジン（５ＡＺＡ）が、ＹＴＳ細胞株及びＮＫ９２細胞株においてそれぞれＳＨＯＲＴ及びＬＯＮＧアイソフォームの過少発現量に関連するＩＮＴＥＲアイソフォームの有意な過剰発現量を誘導できることが示された（図１４）。
【０２２５】
Ｂ．追加試験（８０人の患者／５６人の健常ボランティアのコホート）
材料及び方法
発現ベクターにおけるスプライセオソームのクローニング及びトランスフェクション
合成された第１鎖ＮＫ９２ ｃＤＮＡを、ＰＣＲにより、HotStarTAQ DNAポリメラーゼ（Qiagen）を用いて５０μl反応中で、Hybaid装置を使用して増幅した。クローニングシステムのために使用されるＨＰＬＣ精製プライマーを、Primer3 v0.4.0ソフトウェア（http://frodo.wi.mit.edu/）を用いてデザインした：ＮＫｐ３０ｂ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０ ５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＣＡ ＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号３４）及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ｂ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡ ＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号３５）；ＮＫｐ３０ｃ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ｃ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡ ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号３６）；ＮＫｐ３０ａ用：ＫＰＮＩ−ＮＫｐ３０及びＥｃｏＲＩ−ＮＫｐ３０ａ ５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号３７）。下線を引いた配列は、発現プラスミドベクター中のＤＮＡクローニング用の制限酵素認識部位である。
【０２２６】
サーマルサイクリングは１回の変性工程（９５℃で１５分）で開始し、変性（９５℃で４０秒）、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、及びｃプライマーについてアニーリング（６７℃で３０秒）、及び伸長（７２℃で１分）の３０サイクルが続く。１回の最終伸長工程（７２℃で１０分）を加えた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで単離し、QIAquick Gel Extractionキット（Qiagen）を使用して精製し、そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ（Ozyme）を用いて消化した。消化されたフラグメントをｐＩＲＥＳバイシストロニック哺乳動物発現ベクター（Clontech）に連結した。ヌクレオチド配列をABI PRISM 310遺伝子アナライザー（Applied Biosystems）により分析した。
【０２２７】
ＮＫＬクローンを使用した機能試験
ＤＣ／ＮＫクロストーク。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４中で培養された０．５×１０５個の未熟単球由来ＤＣを、前に記載された通りに１７、ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、又はｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）アイソフォームのいずれかを発現する１．５×１０５個のＮＫＬクローンと２４時間、１：３の比率で混合した。上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡヒトＩＦＮγ、ヒトＴＮＦαキット（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）を使用してサイトカインレベルをモニターした。腫瘍／ＮＫ混合培養。１０５個のＨＥＫ ２９３（E. Vivier, CIML, Marseille, Franceの好意により提供）又はＧＩＳＴ ８８２（J. A. Fletcher, Harvard Medical School, Boston, MAの好意により提供）又はＭｅｌ ８８８を、ＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、又はｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）アイソフォームのいずれかを発現する１０５個のＮＫＬクローンと２４時間、１：１の比率で混合した。上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡ（上に記載）を使用してサイトカインレベルをモニターした。架橋ＮＫｐ３０及び脱顆粒測定及びサイトカイン産生。以下の説明を参照のこと。
【０２２８】
患者及び健常ボランティアのコホート
ＮＫ細胞反応の免疫モニタリング試験によって、EORTC Phase III試験６２００５に登録されたＧＩＳＴ患者及びFrench Sarcoma Group Phase III臨床試験（ＢＦＲ１４）に含まれたＧＩＳＴ患者が前向きに検証され、ＩＭの用量及び持続時間がそれぞれ評価された（ｎ＝８０）。書面のインフォームドコンセントが、臨床試験及び免疫学的試験のための地域倫理委員会に従って患者から得られた。ヘパリン添加血液を処置中に（ＩＭ治療の２−９４ヶ月の間、平均＝２８±３ヶ月）患者から採取した。患者の特徴を表１に描写している。
【０２２９】
【表１５】
【０２３０】
腫瘍反応をコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより評価し、そして反応を処置の開始から３ヶ月後ごとにＲＥＣＩＳＴ基準に従って分類した。非進行性疾患には、安定疾患及び部分的又は完全な反応が包含された。
Ｎ＝５６の健常ボランティア（性別及び年齢を一致させたＧＩＳＴ患者）を免疫学的パラメーターのためのコントロールとして使用した。
【０２３１】
ＡＭＬ患者のコホート
標準的ＦＡＢ５７及びＷＨＯ基準５８に従いデノボＡＭＬを伴う年齢４５歳（±１２．６）の２１８人の患者について、利用可能なＦＬＴ３突然変異状態を分析した。腫瘍の突然変異状態を、前に記載した通りに決定した５１。全てを、ダウノルビシン又はイダルビシン及びアラシチン（ａｒａｃｙｔｉｎ）と組み合わせた導入化学療法により処置した。６０歳以下の患者（ｎ＝１９３）を自己幹細胞移植（ＡＳＣＴ）又は高用量のアラシチンを用いた集中化学療法に、他（ｎ＝２５）を中間用量のアラシチンを用いた化学療法に割り当てた。
【０２３２】
ＮＫｐ３０依存的サイトカイン分泌及びバルクＮＫ細胞上での脱顆粒の評価
ＧＩＳＴ患者及びＨＶのＰＢＭＣをFicoll-Hypaque（Amersham Pharmacia, Orsay, France）密度緩衝遠心分離により得た。ＮＫｐ３０架橋実験では、ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞Easy Sepキット（Ｓtem Cell Technologies, Paris, France）を用いて精製し（純度＞９５%）、２．５μg/mlのマウスＩｇＧ２ａ抗ＮＫｐ３０（クローン２１０８４７、R&D Systems、Lille、France）又はアイソタイプコントロールを用いて７時間コーティングした９６ウェル−Maxisorpプレート（Nunc, Roskilde, Denmark）中に播種した。別の方法では、ＮＫ細胞を１０００IUのｒＩＬ−２（Chiron, USA）を用いて４０時間活性化した。次に、ＮＫ細胞の上清を、市販のＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences/Pharmingen, Le Pont de Claix, France）を使用し、それらのＴＮＦａレベルについて評価した。脱顆粒を、前に記載した通りに、フローサイトメトリーにより評価した１７。簡単に説明すると、ＮＫ細胞を、１０μMモネンシンを添加したＡＩＭＶ中で２μlの抗ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（クローンＨ４Ａ３，Pharmingen）と７時間インキュベートし、ＣＤ３／ＣＤ５６染色を架橋の終わりに実施した。
【０２３３】
アイソフォームのＲＴ−ＰＣＲ及び非階層的クラスタリング
全細胞ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen）を用いてＰＢＭＣ及びＮＫ細胞株から単離した。第１鎖ｃＤＮＡを、５μgの全ＲＮＡから、SuperScript（商標）II Reverse Transcriptase及びランダムプライマー（Promega）を使用し、Invitrogenの取扱説明書に従って合成した。６つのＮＫＰ３０転写物及びβ２Ｍハウスキーピング転写物のためのＰＣＲプライマー及びTaqManプローブをPrimer Expressソフトウェアｖ１．０（Applied Biosystems）を用いてデザインした。以下のプライマー及びプローブを使用した：
【表１６】
１マイクロリットルの第１鎖ｃＤＮＡを、１２．５μLの２×TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）及び０．７５μLのＮＫＰ３０プライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）又は０．５μLのβ２Ｍプライマー（１０μM）及びプローブ（５μM）と最終容積２５μL中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、StepOnePlus System(Applied Biosystems）を使用して行った。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：最初のインキュベーション５０℃で２分、変性９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒、そして６０℃（ＮＫＰ３０ａ（ＬＯＮＧ）、ｂ（ＳＨＯＲＴ）、及びｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）、ならびにβ２Ｍ転写物について）で１分間の４５サイクル。リアルタイムＰＣＲデータを、２−ΔＣＴ方法を使用し、製造業者の指示に従って分析した。別々のＮＫｐ３０アイソフォームの割合を、各アイソフォームの相対量と３つのａ、ｂ、及びｃアイソフォームの総量の比率として決定した。教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラム（類似性の測定基準としてピアソン中央相関を使用した平均連結法クラスタリング）を使用して対数変換し、中央値で合わせた（ｍｅｄｉａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）データに適用した５６。
【０２３４】
ＮＣＲ３エクソン４の３’ＵＴＲ領域の遺伝子型決定
ＴＡＱＭＡＮ遺伝子型決定アッセイＩＤ：Ｃ＿７５１４９０８＿１０を使用し、３７９０ Ｔ／Ｃ多型を遺伝子型決定することができる。簡単に説明すると、１０ngのゲノムＤＮＡを、５μlの２×TaqMan Genotyping Master Mix（Applied Biosystems）及び０．２５μlの４０×genotyping assayと最終容積１０μl中で混合した。温度サイクリング及びリアルタイム蛍光測定を、StepOnePlus System（Applied Biosystems）を使用して行った。
【０２３５】
統計分析。フィッシャー直接確率法及びノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定を異なる群の比較のために使用した。全ての統計分析を、GraphPad Prismソフトウエアバージョン５を用いて実施した。生存曲線をカプラン−マイアー方法に従ってプロットし、そしてログランク検定を使用して比較した。全生存率及び無増悪生存率についての独立危険因子を、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを使用して決定した。生存分析のために、SPSS17.0ソフトウェアを使用した。
【０２３６】
結果
３つのＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４アイソフォームの発現クローニング
ＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４によりコードされる別々のアイソフォームの潜在的な機能を解明するために（図１）、本発明者らは、ｐＩＲＥＳ発現ベクター中に３つの別々のＮＣＲ３／ＮＫｐ３０スプライスバリアントをクローニングした（図１５）。これらの３つの転写物は、エクソン４Ｉ、４ＩＩ、及び４ＩＩＩを使用し、それぞれＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）、ＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）、及びＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）と名付けられている２３（配列番号８、９、及び１０）。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂの転写物は３’末端に２７６ｎｔを共有し、しかしながら、それらの最後のエクソンの５’スプラス部位で分岐し、ＮＫｐ３０ｂの４番目のエクソン（エクソン４ＩＩ）がＮＫｐ３０ａのイントロン３に５５ｎｔだけ伸びている。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂの転写物は、それぞれ位置３１６６４８２５及び３１６６４９５２に終止コドンを持ち、そしてＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００６．１０（配列番号１）を使用し、位置３１６６４６９０に共通のポリアデニル化シグナル（ポリアデニル化シグナル２）及び位置３１６６４６７１に共通のポリアデニル化部位を共有する。ＮＫｐ３０ｃの４番目のエクソン（エクソン４Ｉ）は、ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂのイントロン３に伸び、そして位置３１６６５０７０に別個の終止コドンを、そして位置３１６６５０４９及び３１６６５０３１にそれぞれポリアデニル化シグナル及び部位を持つ２４。３つの別々のＮＫｐ３０スプライスバリアントをコードするｃＤＮＡ構築物（配列番号８、９、及び１０で示す）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞株又はＮＫＬ細胞株に、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードするポリシストロニックレポーター遺伝子の５’に安定的にトランスフェクトした。Ｇ４１８中での選択後、表面ＮＫｐ３０発現を免疫蛍光法及び細胞蛍光測定により決定し、それをＧＦＰ蛍光又は非トランスフェクト細胞と比較した。全てのトランスフェクト細胞が、同程度のレベルのＧＦＰ及びＮＫｐ３０を発現した（図１６）。また、３つのＮＫｐ３０トランスフェクト細胞株は、他のＮＫ細胞受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＣＤ２５、図１７）の発現において親細胞とは異ならず、それらの続く機能比較を可能にした。
【０２３７】
各ＮＫｐ３０アイソフォームの異なる機能を分析するために、本発明者らは、ＮＫｐ３０会合後にトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞及びＮＫＬ細胞からのサイトカイン放出をモニターした。ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂのいずれかを発現する細胞が、それぞれ多量のＩＬ−２（図１８Ａ）及びＩＦＮγ（図１８Ｂ）を産生したのに対し、ＮＫｐ３０ｃアイソフォームを発現する細胞はＮＫｐ３０誘発に反応してサイトカインを分泌しなかった（図１８Ａ及びＢ）。ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｃ細胞は、また、未熟樹状細胞（ＤＣ）を認識しなかった。それは、ＤＣとの共培養において容易にＩＦＮγ及びＴＮＦαを分泌したＮＫＬ−ＮＫｐ３０ａ細胞又はＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｂ細胞とは対照的である３９（図１８Ｃ）。同様の結果が、可変レベルのＮＫｐ３０リガンドを発現するＨＥＫ２９３、Ｍｅｌ８８８、及びＧＩＳＴ８８２腫瘍細胞を使用して得られた（データ示さず）（図１８Ｄ）。細胞毒性アッセイによって、ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ａ（しかし、ＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｂやＮＫＬ−ＮＫｐ３０ｃではない）細胞が直接的な又は再指令された殺傷アッセイにおいて脱顆粒を示すことが明らかになった（図１９）。このように、ＮＫｐ３０ａが、細胞毒性レベルでＮＫエフェクター機能を誘発すことができる唯一のアイソフォームであると思われる。全体で、発現クローニングによって、このように、ＮＫｐ３０アイソフォームがインビトロでそれらのエフェクター機能において有意に異なること、及び、ＮＫｐ３０ｃが機能的に欠損したアイソフォームを構成することが、この後者の分子が細胞表面で安定に見え、正確に発現されることができるという事実にもかかわらず、明らかになった。
【０２３８】
８０人のＧＩＳＴ患者のコホートにおけるＮＣＲ３／ＮＫｐ３０遺伝子の異なる発現パターン
末梢ＮＫ細胞における３つのＮＫｐ３０アイソフォームの異なる発現プロファイルを研究するために、本発明者らは、ＧＩＳＴ患者又は健常ボランティア（ＨＶ）からのバルク抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）上のβ２ミクログロブリンに対して標準化された、ＮＫｐ３０ａ、ｂ、又はｃ用の特異的プライマーを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。教師なしの階層的クラスタリングを、Ｃｌｕｓｔｅｒ及びＴｒｅｅＶｉｅｗプログラムを使用して対数変換し、中央値で合わせたデータに適用した。図２０において、各列は１つのＮＫｐ３０アイソフォームを表し、そして各カラムは１人のＧＩＳＴ患者を表す。赤色及び緑色はそれぞれ中央値を上回る、下回る発現レベルを示す。ＧＩＳＴ患者の８０人中４４人（５５%）が、ＮＫｐ３０ａ及びＮＫｐ３０ｂが最も主なアイソフォームである転写プロファイルを示した（<<プロファイルＡ>>と指定）（図２０Ａ及び２０Ｂ）。逆に、<<プロファイルＢ>>の個人は、高い割合のＮＫｐ３０ｃアイソフォームを提示した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。ＮＫｐ３０発現の細胞分布の高い特異性から予測される通り２６、各ＮＫｐ３０アイソフォームの異なる発現プロファイルを明らかにするＲＴ−ＰＣＲの結果が、ＰＢＭＣ対バルクＮＫ細胞において同程度であった（図２１）。経時的な個人内変動が有意に思われなかったことは注目に値する（４人の代表的な個人での疾患経過中の３〜４の異なる時間点で示されている、図４）。
【０２３９】
患者において得られた２つのプロファイルを解釈するために、本発明者らは、それらを、性別、年齢、及び地理的由来において一致された５６人のＨＶのコホートにおいて得られた各アイソフォームの相対的な転写収量と比較した。明らかに、ＨＶからのＰＢＭＣ又はＮＫ細胞が、プロファイルＡ ＧＩＳＴのような、ＮＫｐ３０ａ及びｂアイソフォームを主に発現する（図２０Ｂ）。
【０２４０】
さらに、プロファイルＡ及びプロファイルＢの個人が、同程度のレベルのＮＫｐ３０膜発現を示し、ＮＫｐ３０の共通する細胞外部分に特異的な抗体を用いて染色されたＮＫ細胞の比較細胞蛍光分析により決定された通りである（図２０Ｃ）。
【０２４１】
ＧＩＳＴ患者について確立されたクラスタリングを使用した５６人のＨＶからのＮＫｐ３０発現プロファイルの分類は、ＧＩＳＴ患者とＨＶが、主なＮＫｐ３０ｃ発現を伴う個人の割合において異なることを示す。ＧＩＳＴ患者の５３%がプロファイルＢを持ち、わずか３０%のＨＶがこのカテゴリーに入る（フィッシャー直接確率法：ｐ＝０．０２）（図２２Ａ）。
【０２４２】
全体で、これらの結果は、ＮＫｐ３０の優先的なエクソン４の使用における安定した表現型の存在、及び、非機能的なＮＫｐ３０ｃアイソフォーム（プロファイルＢ）の主な発現が、コントロールコホートよりもＧＩＳＴにおいてより高頻度であることを示す。
【０２４３】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）ＧＩＳＴ患者からのＮＫ細胞によるＴＮＦαの分泌欠損
次に、本発明者らは、ＮＫｐ３０のインビトロ架橋後に、<<プロファイルＡ>>（ｎ＝７６）対<<プロファイルＢ>>（ｎ＝６０）を示す個人からの精製ＮＫ細胞によるＴＮＦα放出を比較的に評価した。プロファイルＢを伴うＧＩＳＴ患者及びＨＶからのＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０ｃを過剰発現するトランスフェクトＮＫＬ細胞株において観察される機能的な欠損に従い、プロファイルＡの個人と比較し（図２２Ｂ）、ＴＮＦα産生における有意な減少を示す（上を参照のこと）。この異なる反応は、ＩＬ−２の非存在又は存在の両方において、ＮＫｐ３０の誘発時に得られた（図２２Ｂ）。しかし、それらのＮＫ細胞をＩＬ−２単独で刺激し（ＮＫｐ３０特異的抗体の非存在において）、ＴＮＦα分泌を測定した場合、プロファイルＡとプロファイルＢの個人の間で差は存在しなかった（図２２Ｂ）。ＮＫｐ３０依存的な反応における同様の差が、ＨＶを分析から除き、プロファイルＡ及びＢを伴うＧＩＳＴ患者だけを互いに比較した場合に得られた（図２２Ｃ）。重要なことに、プロファイルＢの患者からのＮＫ細胞が、プロファイルＡの患者と比較し、低下したＮＫｐ３０促進性の脱顆粒を示した（図２２Ｄ）。故に、ＮＫｐ３０スプライシングにおける個人内変動は、ＴＮＦα分泌及びＮＫ細胞脱顆粒に影響を与える。非機能的ＮＫｐ３０ｃアイソフォームを主に発現するプロファイルＢを伴う個人は、ＮＫｐ３０駆動性のＮＫエフェクター機能における明白で、しかしながら選択的な欠損を示す。
【０２４４】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）ＧＩＳＴ患者の不良な予後
本発明者らは、ＧＩＳＴ患者での全生存率の前向き分析を実施し、それらは全てＫＩＴチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブメシレート（ＩＭ）を用いて処理された。８０人のＧＩＳＴ患者での臨床経過観察の平均は５１ヶ月（±２４）であった。プロファイルＡ及びＢは、ＧＩＳＴ予後を決定する古典的なパラメーターのいずれかにおいて有意に異ならなかった（表１）。このように、長期生存に関連するｃ−ＫＩＴプロトオンコジーンのエクソン１１突然変異を持つ腫瘍を伴う患者の割合は、プロファイルＡ及びプロファイルＢにおいてそれぞれ５５%及び５３%であった（フィッシャー直接確率法：ｐ＝ｎｓ）８。プロファイルＢの患者は、単変量解析において最初のＩＭ処置から劣る全生存率を有することが見出された（生存の中央値：プロファイルＢにおける８０ヶ月対プロファイルＡにおいて中央値に達せず、ログランク検定：ｐ＝０．００１）（図２３Ａ）。Ｃｏｘモデルを使用した多変量解析において、プロファイルＢが、全生存率についての唯一の独立予後因子として保持された（ＲＲ＝１３．１、９５% ＣＩ［４．９−３６．１］、ｐ＝０．０１）。対照的に、ＮＫ細胞のＮＫｐ３０発現レベルが同じコホートの患者内での全生存率に影響を有した（図２３Ｂ）。全体で、これらデータは、機能異常ＮＫｐ３０ｃアイソフォーム（プロファイルＢ）の優先的な発現がＧＩＳＴ患者における憂うつな治療の転帰を予測することを示す。
【０２４５】
プロファイルＢ（ＮＫｐ３０ｃ）患者に関連するＮＣＲ３＊３７９０Ｔ／Ｃ（ｒｓ９８６４７５）
次に、本発明者らは、ＮＫｐ３０スプライスバリアントの優先的な発現をこの遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型に関連付けることを試みた。スプライシング変異は、ＮＫｐ３０ａ／ｂの転写を可能にするポリアデニル化シグナル２の喪失を導き、選択的ＮＫｐ３０ｃ転写を駆動することが提示されている。実際に、ＮＣＲ３遺伝子のポリアデニル化シグナル２における位置するＳＮＰ（ＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ、ｒｓ９８６４７５）（図１）が、ＡＡＵＡＡＡモチーフ内の一塩基置換に起因するＮＫｐ３０ａ／ｂの転写を除去しうる。それは次にポリアデニル化及び切断効率に影響を与える５９。従って、本発明者らのデータは、ＮＣＲ３＊３７９０がＮＫｐ３０エクソン４の選択的スプライシングを制御することができることを示す。実際に、プロファイルＢパターン（ＮＫｐ３０ｃ過剰発現）を提示するそれらの患者の５１%が、ＮＣＲ３＊３７９０ ＴＣ又はＣＣ遺伝子型を示した（対プロファイルＡを示すＧＩＳＴ患者における０%、フィッシャー直接確率法：ｐ＜０．０００１）（図２４Ａ）。同様に、プロファイルＢパターンを提示するＨＶの約５８%が、ＮＣＲ３＊３７９０ ＴＣ又はＣＣ遺伝子型を持った（図２４Ｂ）。結論として、ＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃは、欠損ＮＫｐ３０ｃアイソフォームの発現を上昇させるエクソン４Ｉの異常な使用に導くことができる因子の１つである。
【０２４６】
ｃ−ＫＩＴ及びＦＬＴ３における機能獲得突然変異は、ＧＩＳＴ及びＡＭＬ患者においてＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃに関連する
オンコジーン駆動性のＤＮＡ損傷反応は、ＮＫ細胞認識のために要求されるＮＣＲリガンドの膜発現を誘発し、そしてこれは免疫媒介性の腫瘍抑制の機構を構成しうる６０。従って、欠損したＮＫ細胞機能が、特定の悪性腫瘍の発生の素因となりうる。軽微なＮＫ細胞機能障害を、定義されたオンコジーン駆動性の悪性腫瘍と一致させる試みにおいて、本発明者らは、別々のｃ−ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα突然変異を持つＧＩＳＴ患者（ＧＩＳＴ患者の約１４%がｃ−ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲαにおける突然変異を持たないことに注意すること）ならびにＦＬＴ３内部タンデム重複遺伝子バリアント（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を持つ急性骨髄白血病（ＡＭＬ）を伴う患者（ＡＭＬの約１５%において発癌を駆動させる）におけるＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの頻度を決定することを選んだ６１。本発明者らは、ＡＭＬにおいてＮＣＲ３＊３７９０ Ｔ／Ｃ ＳＮＰの存在とＦＬＴ３−ＩＴＤの間に有意な関連性を見いだした。ＮＣＲ３＊３７９０突然変異バリアントを提示するＦＬＴ３−ＩＴＤを持つＡＭＬの３４．６%（１８／５２）対ＦＬＴ３−ＩＴＤオンコジーンを欠くＡＭＬにおける１８．７%（３１／１６６）（フィッシャー直接確率法：ｐ＝０．０１）（図２４Ｃ）。ＧＩＳＴについては、検出可能なｃ−ｋｉｔ又はＰＤＧＦＲα突然変異を持つＧＩＳＴの２１%（ｎ＝４３）がＮＣＲ３＊３７９０ＳＮＰを提示したが、検出可能なｃ−ｋｉｔ又はＰＤＧＦＲα突然変異を欠くＧＩＳＴ患者の０%（ｎ＝６）がこのＮＣＲ３＊３７９０ＳＮＰを示した（図２４Ｄ）。これらの結果は、ＮＫｐ３０アイソフォーム発現（及び、拡大すると、ＮＫ細胞機能）に影響を与える多型が、オンコジーン受容体チロシンキナーゼの活性化突然変異により駆動される２つの悪性腫瘍において遺伝的に相互作用しうることを示唆する。
【０２４７】
考察
１９９９年に記載されたが２４、ＮＫｐ３０のスプライセオソーム（spliceoform）は決して研究の題材になることはなかった。本明細書において、本発明者らは、初めて、８０人の患者及び５６人の健常ボランティアの重要なコホートで、消化管肉腫の発生中でのＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４スプライセオソームの病理生理学的関連性を記載しており、標的処置の経過中でのＮＫｐ３０ａ／ｂアイソフォームの保護機能を強調している。
【０２４８】
選択的スプライシングが、ヒトゲノムにおいて、具体的には神経遺伝子及び免疫関連遺伝子についての機能調節の主要な機構として現れている。選択的スプライシングの使用は、発生、組織特異的、又は病理依存的な方法で細胞により制御されることができる。細胞は、公知のリン酸化経路、選択的スプライシングパターンを調節するためのスプライシング因子の再局在化及び合成を使用する６２、６３。ヒトＮＣＲ３遺伝子は、少なくとも３つのユニークなカルボキシ末端を伴うタンパク質をコードしうるいくつかの選択的スプライシング形態を有する。
ｃＤＮＡ選択、それに続くヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリースのクリーニングによって、ヒトＮＣＲ３／ＮＫｐ３０エクソン４の３つの選択的形態が明らかになり、そのｃＤＮＡがシークエンシングされ、ＧｅｎＢａｎｋに提出された（受入番号ＡＦ０３１１３６−３８）２４、２５。初期の試験によって、ＮＫｐ３０ ｍＲＮＡが脾臓、扁桃腺、Ｂ細胞株、及びＮＫ細胞株において、そして肝臓における異なるスプライシングパターンを伴い発現されることが明らかになった。実際に、ＮＣＲ３／ＮＫｐ３０の全ての３つの主なスプライス形態、即ち、ｈＮＫｐ３０ｃ（ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡＴＥ）（ＡＦ０３１１３７）、ｈＮＫｐ３０ｂ（ＳＨＯＲＴ）（ＡＦ０３１１３６）、ｈＮＫｐ３０ａ（ＬＯＮＧ）（ＡＦ０３１１３８）がヒト扁桃腺及びＮＫ細胞において発現され、完全なエクソン２を含んだ。しかし、ヒト肝臓でのＲＴ−ＰＣＲによって、エクソン２（完全なエクソン２又は７５bp欠失エクソン２）のレベルでの２つのアイソフォームにおけるｈＮＫｐ３０ａの非存在、しかし、ｈＮＫｐ３０ｂの存在を示すユニークなパターンが明らかになった。抗ＮＫｐ３０ペプチド抗体を用いた免疫染色を使用し、Sivakamasundari et al.(2000)は、ヒトＮＫ細胞と適合性がある扁桃腺中でのリンパ濾胞の胚中心におけるＮＫｐ３０タンパク質の存在を明らかにすることができた２５。２００５年に、ヒトＮＫｐ３０遺伝子の６つのアイソフォームの詳細な転写分析が、胎児及び成人の両方の組織において実施されている３２。Ｖ型Ｉｇドメイン含有形態（ＮＫｐ３０ａ、ｂ、及びｃ）がより高度に発現されている形態であり、ＮＫｐ３０ｃが最も遍在し、豊富な形態である（胎児脳を除く）ことは注目に値する。興味深いことに、ＮＫｐ３０ａ及びｂが、脳の主なスプライセオソームであった３２。
【０２４９】
ＮＫ細胞における種々のＮＫｐ３０アイソフォームの協調発現を制御する機構は不明確なままである。興味深いことに、この発現パターンは、ＣＤ５６発現レベル及びＣＤ２７に基づいて区別される異なるＮＫ細胞サブセットにおいて同様であることが見出された（ＮＤ、示さず）。さらに、イマチニブメシレートを用いたＧＩＳＴ治療が、ある場合において、数年に及び、経時的にＮＫｐ３０発現のパターンを調節するようには思われなかった（図４）。薬理学的化合物、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤（トリコスタチンＡ、バルプロ酸、酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸）、配列番号４９〜５１に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド（前に説明した）、又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン）は、遺伝子の選択的スプライシングにおいて干渉することが公知であり、ＮＫ細胞の欠損機能に関連するパターンを制御する／切り替える貴重なツールを表わしうる。
【０２５０】
目的の配列
− ＮＣＲ３遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）
＞ｒｅｆ｜ＮＣ＿０００００６．１０｜ＮＣ＿０００００６：ｃ３１６６８９３３−３１６６４６５１ホモサピエンス染色体６、参照アセンブリー、完全配列
【表１７】
注意：エクソン配列はボールド体である。開始コドン及び終止コドンに下線を引いている。エクソン２における欠失はイタリック体である。
【０２５１】
− ６つのＮＫＰ３０アイソフォームのペプチド配列：
「短いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号２（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６３）
【表１８】
「中間テール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号３（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６４）
【表１９】
「長いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号４（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６２）
【表２０】
「短いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号５（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２１】
「中間テール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号６（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＰ００００００２９１６５）
【表２２】
「長いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」アイソフォーム（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号７（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２３】
注意：太字のアミノ酸は以下のドメインに隣接する：（左から右へ）シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン。
可変Ｉｇ様ドメインを含むアイソフォームにおいて、定常Ｉｇ様ドメインを特徴とする欠失した細胞外領域に下線を引いている。
【０２５２】
− ６つのＮＫＰ３０転写物のヌクレオチド配列：
「短いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＳＨＯＲＴ−ＷＴ）−配列番号８
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１１）
【表２４】
「中間テール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＩＮＴＥＲ−ＷＴ）−配列番号９
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１２）
【表２５】
「長いテール−可変Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＬＯＮＧ−ＷＴ）−配列番号１０
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１０）
【表２６】
「短いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＳＨＯＲＴ−ＤＥＬ）−配列番号１１
（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２７】
「中間テール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＩＮＴＥＲ−ＤＥＬ）−配列番号１２
（ＶｅｇａペプチドＩＤ：ＯＴＴＨＵＭＴ００００００７６２１３）
【表２８】
「長いテール−定常Ｉｇ様ドメイン」転写物（ＬＯＮＧ−ＤＥＬ）−配列番号１３
（ＶｅｇａペプチドＩＤなし）
【表２９】
注意：開始コドンに下線を引いている。元の終止コドンはボールド体である。
【０２５３】
プライマー配列
− ３５７１Ｇ／Ｔ及び３７９０Ｔ／Ｃの多型を含むＮＣＲ３遺伝子の３つの領域を増幅し、シークエンシングによる遺伝子型決定を可能にする特異的プライマー：
【表３０】
【０２５４】
− ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ検出に基づく定量化のための６つのＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物を増幅する特異的プライマー：
【表３１】
【０２５５】
− ＴＡＱＭＡＮ ＰＲＯＢＥ検出に基づく定量化のための６つのＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物を増幅する特異的プライマー：
【表３２】
【０２５６】
− ６つのＮＫＰ３０アイソフォームのクローニングのために使用したＨＰＬＣ精製プライマー：
【表３３】
【０２５７】
− 特異的な抗ＮＫｐ３０抗体を得るために使用したＮＫｐ３０細胞外及び細胞内ドメインならびにアミノ酸ペプチドのペプチド配列：
ＮＫｐ３０アイソフォームの可変Ｉｇ様細胞外ドメイン−配列番号３８
【表３４】
ＮＫｐ３０アイソフォームの定常Ｉｇ様細胞外ドメイン−配列番号３９
【表３５】
ＮＫｐ３０アイソフォームの短い細胞内ドメイン−配列番号４０
【表３６】
ＮＫｐ３０アイソフォームの中間細胞内ドメイン−配列番号４１
【表３７】
ＮＫｐ３０アイソフォームの長い細胞内ドメイン−配列番号４２
【表３８】
特異的な抗ＮＫｐ３０可変Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４３
【表３９】
特異的な抗ＮＫｐ３０定常Ｉｇ様細胞外ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４４
【表４０】
特異的な抗ＮＫｐ３０短いＩｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４５
【表４１】
特異的な抗ＮＫｐ３０中間Ｉｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４６
【表４２】
特異的な抗ＮＫｐ３０長いＩｇ様細胞内ドメイン抗体を得るために使用したペプチド−配列番号４７
【表４３】
注意：定常Ｉｇ様ドメインを特徴とする欠失した細胞外領域を、可変Ｉｇ様ドメインにおいて下線を引く。特異的な抗ＮＫｐ３０抗体を得るために使用したペプチドの配列は、ＮＫｐ３０細胞外及び細胞内ドメインの配列においてボールド体である。
ＮＫＰ３０プローブ（６−ＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ）：
【表４４】
配列（標的：ポリアデニル化シグナル１）
【表４５】
配列（標的：ポリアデニル化部位１）
【表４６】
配列ＩＮＴＥＲを遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【表４７】
【０２５８】
【表４８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における癌の予後を評価する方法であって、（ｉ）突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、（ｉｉ）異常量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、突然変異した該ＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在が、該被験者における癌の好ましくない予後を示している方法。
【請求項２】
方法が、ＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物又はタンパク質の中間、短い、及び／又は長いアイソフォームの相対量を測定する及び参照値又は平均値と比較することによるＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は活性を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
参照値又は平均値と比較した相対的な増加量のＮＫｐ３０中間アイソフォーム及び相対的な減少量のＮＫｐ３０短い及び／又は長いアイソフォームが、被験者における癌の好ましくない予後を示している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異したＮＣＲ３核酸の存在が、ＮＣＲ３核酸の全て又は部分のシークエンシングにより又は特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームとハイブリダイズする、又は、長い、中間、及び短いＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメインＮＫｐ３０転写物アイソフォーム間の識別を可能にする、核酸プローブとの選択的ハイブリダイゼーションを使用することにより検出される請求項１記載の方法。
【請求項５】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの存在が、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする核酸プライマーを用いた選択的増幅を使用することにより検出される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
方法が、サンプルを、特定のＮＫｐ３０アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドと接触させることにより、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの存在を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
リガンドが、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに特異的な抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
方法が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαのレベルを測定することによるＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
癌が、肉腫、白血病、小児腫瘍、乳癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、直腸癌、結腸癌、肺癌、ＯＲＬ癌、リンパ腫、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液疾患からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
癌を処置するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、ＮＣＲ３の転写、又は特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現もしくは活性を調節するための試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１１】
試験化合物が、ＮＣＲ３の機能的な転写を回復することが可能である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試験化合物が、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
癌を処置するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームのリガンドの発現又は活性を誘導又は増加させるための試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１４】
被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための（ｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、（ｉｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸の使用。
【請求項１５】
突然変異したＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現もしくは活性を回復することが可能である化合物又は物質の使用。
【請求項１６】
物質が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばバルプロ酸（ＶＰＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、アクラルビシン、バナジン酸ナトリウム；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）など；ＰＫＣ阻害剤、例えばＧｏ６９８３など；イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）；サイトカイニンキネチン；シクロヘキシミド；デキサメタゾン；オレイン酸ナトリウム；エストロゲン；プロゲステロン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ＦＫ５０６；サイクロスポリンＡ；スタウロスポリン及びその任意の組み合わせから選択される、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
物質が、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する被験者のＮＫ細胞、骨髄、及び幹細胞より選択される、請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
組成物が、さらに、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、及び／又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を、組み合わせ調製物として、癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含む、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする核酸プライマー。
【請求項２０】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームにハイブリダイズする核酸プローブ。
【請求項２１】
請求項１９又は２０のいずれか一項記載のプライマー及び／又はプローブをそれぞれ含むキット。
【請求項１】
被験者における癌の予後を評価する方法であって、（ｉ）突然変異したナチュラル細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）核酸、（ｉｉ）異常量の少なくとも１つの特定のナチュラルキラーｐ３０（ＮＫｐ３０）ＲＮＡ転写物アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在を被験者からのサンプルにおいて検出することを含み、突然変異した該ＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性の存在が、該被験者における癌の好ましくない予後を示している方法。
【請求項２】
方法が、ＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物又はタンパク質の中間、短い、及び／又は長いアイソフォームの相対量を測定する及び参照値又は平均値と比較することによるＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム発現又は活性を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
参照値又は平均値と比較した相対的な増加量のＮＫｐ３０中間アイソフォーム及び相対的な減少量のＮＫｐ３０短い及び／又は長いアイソフォームが、被験者における癌の好ましくない予後を示している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
突然変異したＮＣＲ３核酸の存在が、ＮＣＲ３核酸の全て又は部分のシークエンシングにより又は特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームとハイブリダイズする、又は、長い、中間、及び短いＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメインＮＫｐ３０転写物アイソフォーム間の識別を可能にする、核酸プローブとの選択的ハイブリダイゼーションを使用することにより検出される請求項１記載の方法。
【請求項５】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの存在が、特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする、又は、ＮＫｐ３０の長い、中間、及び短いＲＮＡ転写物アイソフォーム間及び／又は定常及び可変Ｉｇ様ドメイン転写物アイソフォーム間の識別を可能にする核酸プライマーを用いた選択的増幅を使用することにより検出される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
方法が、サンプルを、特定のＮＫｐ３０アイソフォームに対する特異的な結合について同定されたリガンドと接触させることにより、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの存在を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
リガンドが、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームに特異的な抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
方法が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαのレベルを測定することによるＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム活性を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
癌が、肉腫、白血病、小児腫瘍、乳癌、胃癌、卵巣癌、子宮内膜癌、膀胱癌、子宮頸癌、前立腺癌、直腸癌、結腸癌、肺癌、ＯＲＬ癌、リンパ腫、ミエローマ、セミノーマ、ホジキン及び悪性血液疾患からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
癌を処置するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、ＮＣＲ３の転写、又は特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの発現もしくは活性を調節するための試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１１】
試験化合物が、ＮＣＲ３の機能的な転写を回復することが可能である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
試験化合物が、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現又は活性を回復することが可能である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
癌を処置するために有用な化合物をスクリーニングするための方法であって、特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームのリガンドの発現又は活性を誘導又は増加させるための試験化合物の能力を決定することを含む方法。
【請求項１４】
被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための（ｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードするＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物、（ｉｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォーム、及び／又は（ｉｉｉ）機能的なＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームをコードする核酸の使用。
【請求項１５】
突然変異したＮＣＲ３核酸、異常量の少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォーム、又は少なくとも１つの特定のＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの異常な発現又は活性を有する被験者において癌を処置又は予防するための医薬的組成物を調製するための、機能的なＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写又はＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの機能的な発現もしくは活性を回復することが可能である化合物又は物質の使用。
【請求項１６】
物質が、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばバルプロ酸（ＶＰＡ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム、ＭＳ−２７５、アクラルビシン、バナジン酸ナトリウム；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）など；ＰＫＣ阻害剤、例えばＧｏ６９８３など；イマチニブメシレート（ＳＴＩ５７１）；サイトカイニンキネチン；シクロヘキシミド；デキサメタゾン；オレイン酸ナトリウム；エストロゲン；プロゲステロン；オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；ＦＫ５０６；サイクロスポリンＡ；スタウロスポリン及びその任意の組み合わせから選択される、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
物質が、ＮＫｐ３０タンパク質アイソフォームの正常な発現又は活性を有する被験者のＮＫ細胞、骨髄、及び幹細胞より選択される、請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
組成物が、さらに、化学療法剤、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、及び／又はファルネシル−トランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）を、組み合わせ調製物として、癌の予防又は処置における同時、別々、又は連続使用のために含む、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の使用。
【請求項１９】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームの増幅を可能にする核酸プライマー。
【請求項２０】
特定のＮＫｐ３０ ＲＮＡ転写物アイソフォームにハイブリダイズする核酸プローブ。
【請求項２１】
請求項１９又は２０のいずれか一項記載のプライマー及び／又はプローブをそれぞれ含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２０１１−５２４７４３（Ｐ２０１１−５２４７４３Ａ）
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２０９５（Ｐ２０１１−５１２０９５）
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６７４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７１３７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９９０２９５４５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＧＵＳＴＡＶＥ ＲＯＵＳＳＹ
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６７４１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７１３７
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５９９０２９５４５）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＧＵＳＴＡＶＥ ＲＯＵＳＳＹ
【出願人】（５００３６６５９８）インセルム（アンスティチュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (17)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ（ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＳＡＮＴＥ ＥＴ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＭＥＤＩＣＡＬＥ）
【Ｆターム（参考）】
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