ナノバブルの形成方法
【課題】超音波造影剤を用いるナノバブルの形成方法の提供。
【解決手段】本発明はナノバブルの形成方法を開示するものであり、前記形成方法は公知技術に使用する油水乳化反応とは異なる特徴を持つ。本発明のナノバブルの形成方法は、無機粒子を中心核として、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子をコーティングして有機／無機複合粒子を形成する。次に、第一溶剤によって前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。最後に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【解決手段】本発明はナノバブルの形成方法を開示するものであり、前記形成方法は公知技術に使用する油水乳化反応とは異なる特徴を持つ。本発明のナノバブルの形成方法は、無機粒子を中心核として、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子をコーティングして有機／無機複合粒子を形成する。次に、第一溶剤によって前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。最後に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノバブルの形成方法に係り、特に超音波造影剤を用いるナノ級バブルの形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波造影剤（Ultrasound Contrast Agent:UCA）は超音波画像形成において画像のコントラスト強化をする為の物質である。一般にはミクロン級直径の包膜マイクロバブルであり、静脈注射が血液循環システムに進入し超音波の反射強度を増強することによって、超音波造影によって形成される画像の解析度を向上させる目的を達成する。
【０００３】
超音波造影剤を血管に注入した後、組織の超音波特性（背部方向散乱係数、減衰係数、音声スピード、及び非線形効果）が変化し造影効果が生まれる。増強効果は超音波造影剤の濃度、サイズ、及び超音波の発射周波率によって決まる。それの最も基本的性質は組織のエコー能力を増強できることにあり、超音波画像形成において画像の明晰度とコントラストを高めることが可能となる。前記非線形効果は一定エネルギーの調波量を生じさせ、調波画像形成技術は体内の微小血管血流と組織灌流を測定し、超音波造影剤を含まない組織がベースバンド上で運動し生成されるクラッタ信号を抑制することによりS/N比を大幅に向上させることが可能である。
【０００４】
超音波造影剤の研究と応用は1968年Gramiakらによる心臓内への塩水注入後の大動脈根部において雲状コントラストエコー効果が得られた研究に遡る。８０年代後期、超音波組織はある困難に遭遇した。それは、ある組織は病理上区別されているが、それらの超音波特性が類似していることにあった。これに対して、組織と血液のエコー能力を増強できる超音波造影剤は非常に大きな注目を浴びている。
【０００５】
造影剤は主にマイクロバブル内に含まれる気体の種類によって分類される。第一世代造影剤はマイクロバブル内に空気を含み、包膜は一般にアルブミンまたはガラクトース等の重合体である。第二世代超音波造影剤のマイクロバブルは主に高密度惰性気体（水や血液に溶け難い）を含むもので、その外膜は薄くて柔軟である。前記第一世代造影剤のマイクロバブルの包膜は比較的厚く、弾性に劣り、含まれる空気は水に溶け易い等から、前記第一世代造影剤は破裂し易くライフタイムも短く、臨床応用における観察及び診断時間が制限される。しかし第二世代造影剤のマイクロバブルの直径は2-5um前後にまで縮小することができ、安定時間を延長し、振動及びエコー特性を更に良好にする。
【０００６】
近年来、超音波造影剤は既に超音波治療領域で広く応用されている。超音波造影剤中のマイクロバブルにキャビテーション効果が強化され、更に超音波生物効果が促進される故、超音波造影剤は超音波血栓溶解療法、介在遺伝子転移、薬物デリバリー、高密度焦点式超音波療法（ＨＩＦＵ）等への応用にも既に研究が始められている。超音波造影剤の応用範囲は拡大を続け、応用価値もまた向上し続けている。よって、安定性が高く、サイズコントロール性を備え、生物分解性と生物適合性を備えるマイクロバブル超音波造影剤は業界において発展が大きく期待されるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はナノバブルの形成方法を提供することにあり、前記形成方法は公知の油水乳化反応とは異なるものである。本発明のナノバブルの形成方法は、無機粒子を中心核として、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子をコーティングして有機／無機複合粒子を形成する。次に、第一溶剤によって前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。最後に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１の発明は、無機粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセスを行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成し、
前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成し、前記溶剤型ナノ粒子の内部には前記第一溶剤を内含し、
冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去して前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させ、
溶解プロセスにおいて前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かしてナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項２の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記無機粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループの内から何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項３の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子は、ポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する高分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項４の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一溶剤は王水であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項５の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第二溶剤は、純水及び各種バッファ溶液のグループの何れか一つとすることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項６の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとすることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項７の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径は無機粒子のサイズによりコントロールされることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項８の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子層コーティングプロセスを行った後、更にバイオコンジュゲーションプロセスを行い、生物適応性を備える第二高分子を第一高分子層の表面に接合することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項９の発明は、請求項８記載のナノバブルの形成方法において、前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１０の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記溶解プロセスには、更に希望する気体気流を中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして希望する気体のナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１１の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルを真空にしてナノバブルの包覆する気体を除去し、希望の気体を充填することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１２の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１３の発明は、請求項１２記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１４の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルのライフタイムは２５〜３０分間であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１５の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のナノバブルは超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用できることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例に関するナノバブルの合成図である。
【図２】本発明の実施例に関するナノバブルの超音波画像である。
【図３】本発明の実施例に関するナノバブルの動的光散乱グラフである。
【図４】本発明の実施例に関するナノバブルのライフタイム（lifetime）の測定グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明はナノバブルの形成方法を開示する。本発明を徹底的に御理解戴く為に、下記の説明においてステップの詳細及びその構成を提供する。本発明の実施においては当該領域の技術者の熟知する特殊内容に制限されないことは顕著である。また、本発明が不必要に制限されるのを防ぐ為に、周知の組成もしくはステップを詳細内容中に説明しないこととする。本発明の実施例の詳細は次の通りであり、これらの詳細説明の他、本発明はその他実施例に広く応用することが可能であり、しかも本件の発明範囲は制限を受けることはなく、その範囲は下記の特許登録申請の範囲を基準とする。
【００１２】
本発明の実施例はナノバブルの形成方法を開示するものであり、前記形成方法は、まず、無機ナノ粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセス（polymer coating process）を行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成する。次に、前記第一高分子はポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する両性高分子とし、次に前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。前記溶剤型ナノ粒子には前記第一溶剤を内含する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。前記中空ナノ粒子には空気を内含する。更に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【００１３】
また、前記ナノバブルの形成方法には更に、前記第一高分子層コーティングプロセスの後、バイオコンジュゲーションプロセス（bioconjugation process）を含み、生物適合性を備える第二高分子を前記第一高分子層の表面に接合する。前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であり、例えば１−エチル基３−ジメチル基−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。
前記無機ナノ粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループから何れか一つを選択し、しかも第一溶剤は王水とし第一溶剤は純水と各種バッファ溶液とする。
前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとし、その粒径の大きさは無機粒子のサイズによりコントロールする。
【００１４】
本発明の実施例において前記溶解プロセスには更に、希望する気体気流を前記中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を前記第二溶剤で溶かし、希望する気体を含む前記ナノバブルの形成を便利にする。
本発明のもう一つの実施例において前記のナノバブルを真空にし前記ナノバブルが包覆する気体を取り除き、並びに希望する気体を充填する。
【００１５】
前記ナノバブルの含む気体は下記グループから何れの一つを選択する。即ち、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気である。その内良好であるのは、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6である。本発明に開示するナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することが可能である。並びに、前記ナノバブルは安定したライフタイムを備え、そのライフタイムは２５〜３０分に到達する。前記のナノバブルのライフタイムは、ナノバブルが特定超音波パラメータによる刺激の下、超音波エコー信号の時間を延長できることを指している。
【００１６】
下記に、ナノバブル合成方法を説明する。
[実施例１] 金ナノ粒子の合成
予め以下の溶液を配置する。
（ａ）ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）溶液：微量用電子天秤を使いＤＤＡＢ（ＭＷ=462.63）を4.63ｇ量り、それを１００ｍＬトルエンに加え、振動器で均等に混合する。
（ｂ）塩化金（AuCl3）溶液：微量用電子天秤を使いＡｕＣｌ３（ＭＷ=303.33）を0.15ｇ量り、それを２０ｍＬのＤＤＡＢに加え、振動器で均等に混合する。
（ｃ）ドデカニック酸（Dodecanic acid）溶液：微量用電子天秤を使いドデカニック酸（ＭＷ=172.26）を1.376ｇ量り、それを80ｍＬのトルエンに加え、振動器で均等に混合する。
（ｄ）テトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＢＡＢ）溶液：微量用電子天秤を使いテトラブチルアンモニウムブロマイド（ＭＷ=257.31）を0.15ｇ量り、それを1.08ｍＬのＤＤＡＢに加え、振動器で均等に混合する。
（ｅ）トリオクチルホスフィン（trioctylpyosphine：ＴＯＰ）溶液：0.17ｍＬのＴＯＰを3.8ｍＬのトルエンに加え振動器で均等に混合する。ＴＢＡＢ溶液は金ナノ粒子を合成した活性化剤である故、合成が必要な時にその場で配合する。
【００１７】
磁石を２０ｍＬの試料フラスコ中に入れ、2.5ｍＬのドデカニック酸溶液と１ｍＬのＴＢＡＢ溶液を２０ｍＬの試料フラスコ中に入れ、磁石攪拌器を使い適当な回転速度で持続的に攪拌し、続いて、0.8ｍＬのＡｕＣｌ３溶液を加え、２時間反応させる（先ず１０ｕＬ加え、更に素早く７９０ｕＬ加える）。次に、７０℃水浴で５分間加熱し、温度のバランスが取れた後４０ｕＬのＴＯＰ溶液を加えて５分間反応させる。その後、磁石を取り出し、メチルアルコールを溶液に混濁が出現するまで加える。更に、3000ｒｐｍの回転速度で５分間遠心し、小分子と小さな雑質を除去する。その後、上澄み液を取り除いた後にクロロホルム（chloroform）で沈殿した金ナノ粒子を再懸濁する。最後に、更に3000rpmの回転速度で５分間遠心させて比較的大きな金ナノ粒子と大きな雑質を除去し、並びに、上澄み液をきれいな試料フラスコ中に回収する。
【００１８】
[実施例２] 高分子コーティング（polymer coating）
先ず下記薬品を配置する。
（ａ）高分子溶液：3.084ｇ（20mmole）のポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）（Ｍｗ〜6,000）粉末を取り、丸底フラスコ中に置く。2.78ｇ（15mmole）のドデシルアミン（dodecylamine）を100ｍＬのトテラヒドロフラン（Tetrahydrofuran:ＴＨＦ）溶液中に溶かす。ドデシルアミン溶液とポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）の粉末を迅速に均等混合して混合溶液を作る。次に減圧濃縮器の温度を60℃に設定し、適当な回転速度で１０分間反応させて、前記の混合溶液を透明状態にする。続いて、圧力を２００ｍｂａｒに設定し２４時間反応させる。溶液を完全に抜き取った後、２５ｍＬのクロロホルムを加え、前記で合成した高分子溶液を溶解する。前記高分子溶液（monomer）濃度は0.8Ｍであり、各高分子単体は25％の無水マレイン酸グループ（maleic anhydride groups）及び75％の疎水性炭化水素鎖を含む。
（ｂ）ホウ酸ナトリウムバッファ液（Sodium borate buffer:SBB）：微量用電子天秤を使い3.09ｇのホウ酸（Boric Acid, ＭＷ＝61.83Ｄａ, 50ｍＭ）と19.07ｇの四ホウ酸ナトリウム十水和物（Sodium Tetraborate Decahydrate, Ｗ＝381.37Ｄａ, 50ｍＭ）を量り、続いて1000ｍＬの二次水（ｐＨ＝9.0）に溶解し室温下に保存する。
（ｃ）５×ＴＢＥバッファ液：微量用電子天秤を使い54ｇのトリス塩基（Tris Base）と27.5ｇのホウ酸を量った後、980ｍＬの二次水に溶かし、続いて20ｍＬのエチレンジアミン四酢酸（EDTA, 0.5M, pH=8.0）を加え、並びに磁石で均等攪拌した後、室温下で保存する。使用時は0.5×希釈した後に使用する。
（ｄ）2％のアガロースゲル（agarose gel）：ゲル製作トレイをゲルキャスティングトレイに入れ、並びに電気泳動コームをゲルキャスティングトレイ上に架設する。微量用電子天秤を使い2.4ｇのアガロースゲルを量り250ｍＬの三角フラスコに入れ、120ｍＬの0.5×ＴＢＥバッファを加え、続いてマイクロウェーブでアガロースが完全に溶解するまで加熱し、均等に揺らし、温度が若干下がった後、ゆっくり溶液を架設したゲルキャスティング槽に流し込み、その後、常温でアガロースが冷却凝固するまで静置し、最後に、電気泳動コームを抜き取り電気泳動槽に入れる。
（ｅ）ローディングバッファ（Loading buffer）：グリセリンと二次水を混合する（ｖ：ｖ＝1：10）。
【００１９】
光吸収スペクトル測定器を使い合成後の６ｎｍ金ナノ粒子の備える520ｎｍの吸収ピーク値を測定する。ベールの法則（Beer’s Law）：Ａ＝εｂｃを使って金ナノ粒子の濃度（６ｎｍの金ナノ粒子のモル吸収係数は2.905E7）を算出する。前記のＡは吸収値、εはモル吸収係数（L/mol cm）、ｂは光路径厚さ（cm）、ｃは容積モル濃度（mol/L）である。
【００２０】
金ナノ粒子外層の有機分子の厚さが1.1ｎｍであるなら、全金ナノ粒子の表面積が推測できる。１ｎｍ２が200個の高分子単体（monomer units）を必要とするのなら、高分子溶液に加える必要のある体積を算出可能である。実験の始めに計算後の高分子溶液と５ｍＬのクロロホルムを三角フラスコ中で均等混合し、続いて金ナノ粒子溶液を加えて手で５分間揺らし、金ナノ粒子溶液と高分子溶液を均等混合する。減圧濃縮器（200millibar 回転速度100rpm）を使用して溶液を全て抜き取る。溶液を全て抜き取った後、大気圧に戻し更に１ｍｂａｒまでエアを抜き取る。溶液を完全に抽出したことが確定した後、更に0.1Ｎの水酸化ナトリウム（NaOH）を加え、高分子改質を経た金ナノ粒子を迅速に溶解する。続いて、５ｍＬの注射器を使って0.2ｕｍの濾過膜に通し、更に100ＫＤａの分子ストッパーを使って小さい分子を除去し、溶剤をホウ酸ナトリウムバッファ液（ＳＢＢ）に置き換える。
【００２１】
アガロース純化によって高分子コーティングを経た金ナノ粒子をローディングバッファと混合をする（ｖ：ｖ＝10：1）。その内、2％のアガロースゲルを電気泳動槽のＴＢＥバッファ中に置いて純化を行い（電圧100Ｖ、所要時間１時間）、未反応の高分子を除去する。続いて金ナノ粒子をアガロースゲルから取り出し、透析膜中に置き、電圧100Ｖの電気泳動槽内で電場を使って金ナノ粒子とアガロースゲルを分離させる。試料を回収した後、0.22ｕｍの濾過膜で濾過し、更に100ＫＤａ分子ストッパーで試料を濃縮し、並びに純化した金ナノ粒子をホウ酸ナトリウムバッファ液中で保存する。最後に電気泳動で純化した両性高分子コーティングナノ金粒子を超高速の遠心機50000rpmで20分間遠心した後、上澄み液を除去し、更にホウ酸ナトリウムバッファ液で沈殿したナノ金粒子を再懸濁する（３回繰り返し）。
【００２２】
[実施例３] バイオコンジュゲーション（Biocompatible layer conjugation）
高分子コーティングを経た金ナノ粒子とポリエチレングリコール（Polyethyleneglycol:PEG）及び１−エチル基３−ジメチル基−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を混合して（[Au]/[PEG]=1/200,Au:PEG:EDC=v:v:v=1:1:1）２時間反応させる。その後100ＫＤａタンパク質濾過管（ＭＣＷＯ）で未反応のＰＥＧを除去し、並びに試料を１ｕＭまで濃縮し、ＳＢＢ（ｐＨ＝９）で保存する。
【００２３】
[実施例４]
実施例２、実施例３を経た試料中に溶液が無色透明状態になるまで王水を落とし、100ＫＤａタンパク質濾過管で溶液中の王水をＳＢＢ（ｐＨ＝９）に置き換え、更にＳＢＢを脱イオン水に置き換える。最後に冷凍乾燥機で溶液を完全に抜き取り、試料を白色固体にする。超音波で刺激する場合は、脱イオン水を加えて前記白色固体を直接溶解すればよく、これによりナノバブルが完成する。前記ナノバブルの合成図は図１に示す通りであり、エアコア（Air Core）中の気体は空気と各種惰性気体とし、良好なのはＣ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、ＳＦ６である。
【００２４】
超音波でナノバブルを刺激した超音波画像は図２に示す通りであり、バブル粒径は10μｍである。図３に示す通り、前記バブルは動的光散乱（Dynamic Light Scattering: DLS）を使用して測定したものである。更に、図４に示す通り、前記バブルのライフタイムは20分間である。超音波は25ＭＨｚのディテクターを使用してＢモード画像を形成し5900によって自動的に送受信する。
【００２５】
超音波パラメータ
PRT: EXT-BNC Gain: 40dB Energy:32μJ
Damping:50 Ohm High Pass: 10MHz
Low Pass:50 MHz Lab View インターフェースパラメータ
Sample Number:512 Scan
Sequence:512PRF:512
Mode: B-scan
Sample rate: 120M Vectors:4mm Dynamic range:1V Speed:slow
Delay time:0.0147 C scan Trig Type: positive swept
Depth: 1mm interval:1μm
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノバブルの形成方法に係り、特に超音波造影剤を用いるナノ級バブルの形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波造影剤（Ultrasound Contrast Agent:UCA）は超音波画像形成において画像のコントラスト強化をする為の物質である。一般にはミクロン級直径の包膜マイクロバブルであり、静脈注射が血液循環システムに進入し超音波の反射強度を増強することによって、超音波造影によって形成される画像の解析度を向上させる目的を達成する。
【０００３】
超音波造影剤を血管に注入した後、組織の超音波特性（背部方向散乱係数、減衰係数、音声スピード、及び非線形効果）が変化し造影効果が生まれる。増強効果は超音波造影剤の濃度、サイズ、及び超音波の発射周波率によって決まる。それの最も基本的性質は組織のエコー能力を増強できることにあり、超音波画像形成において画像の明晰度とコントラストを高めることが可能となる。前記非線形効果は一定エネルギーの調波量を生じさせ、調波画像形成技術は体内の微小血管血流と組織灌流を測定し、超音波造影剤を含まない組織がベースバンド上で運動し生成されるクラッタ信号を抑制することによりS/N比を大幅に向上させることが可能である。
【０００４】
超音波造影剤の研究と応用は1968年Gramiakらによる心臓内への塩水注入後の大動脈根部において雲状コントラストエコー効果が得られた研究に遡る。８０年代後期、超音波組織はある困難に遭遇した。それは、ある組織は病理上区別されているが、それらの超音波特性が類似していることにあった。これに対して、組織と血液のエコー能力を増強できる超音波造影剤は非常に大きな注目を浴びている。
【０００５】
造影剤は主にマイクロバブル内に含まれる気体の種類によって分類される。第一世代造影剤はマイクロバブル内に空気を含み、包膜は一般にアルブミンまたはガラクトース等の重合体である。第二世代超音波造影剤のマイクロバブルは主に高密度惰性気体（水や血液に溶け難い）を含むもので、その外膜は薄くて柔軟である。前記第一世代造影剤のマイクロバブルの包膜は比較的厚く、弾性に劣り、含まれる空気は水に溶け易い等から、前記第一世代造影剤は破裂し易くライフタイムも短く、臨床応用における観察及び診断時間が制限される。しかし第二世代造影剤のマイクロバブルの直径は2-5um前後にまで縮小することができ、安定時間を延長し、振動及びエコー特性を更に良好にする。
【０００６】
近年来、超音波造影剤は既に超音波治療領域で広く応用されている。超音波造影剤中のマイクロバブルにキャビテーション効果が強化され、更に超音波生物効果が促進される故、超音波造影剤は超音波血栓溶解療法、介在遺伝子転移、薬物デリバリー、高密度焦点式超音波療法（ＨＩＦＵ）等への応用にも既に研究が始められている。超音波造影剤の応用範囲は拡大を続け、応用価値もまた向上し続けている。よって、安定性が高く、サイズコントロール性を備え、生物分解性と生物適合性を備えるマイクロバブル超音波造影剤は業界において発展が大きく期待されるものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はナノバブルの形成方法を提供することにあり、前記形成方法は公知の油水乳化反応とは異なるものである。本発明のナノバブルの形成方法は、無機粒子を中心核として、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子をコーティングして有機／無機複合粒子を形成する。次に、第一溶剤によって前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。最後に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１の発明は、無機粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセスを行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成し、
前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成し、前記溶剤型ナノ粒子の内部には前記第一溶剤を内含し、
冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去して前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させ、
溶解プロセスにおいて前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かしてナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項２の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記無機粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループの内から何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項３の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子は、ポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する高分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項４の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一溶剤は王水であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項５の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第二溶剤は、純水及び各種バッファ溶液のグループの何れか一つとすることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項６の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとすることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項７の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径は無機粒子のサイズによりコントロールされることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項８の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子層コーティングプロセスを行った後、更にバイオコンジュゲーションプロセスを行い、生物適応性を備える第二高分子を第一高分子層の表面に接合することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項９の発明は、請求項８記載のナノバブルの形成方法において、前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１０の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記溶解プロセスには、更に希望する気体気流を中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして希望する気体のナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１１の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルを真空にしてナノバブルの包覆する気体を除去し、希望の気体を充填することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１２の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１３の発明は、請求項１２記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１４の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルのライフタイムは２５〜３０分間であることを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
請求項１５の発明は、請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することを特徴とするナノバブルの形成方法としている。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のナノバブルは超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用できることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例に関するナノバブルの合成図である。
【図２】本発明の実施例に関するナノバブルの超音波画像である。
【図３】本発明の実施例に関するナノバブルの動的光散乱グラフである。
【図４】本発明の実施例に関するナノバブルのライフタイム（lifetime）の測定グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明はナノバブルの形成方法を開示する。本発明を徹底的に御理解戴く為に、下記の説明においてステップの詳細及びその構成を提供する。本発明の実施においては当該領域の技術者の熟知する特殊内容に制限されないことは顕著である。また、本発明が不必要に制限されるのを防ぐ為に、周知の組成もしくはステップを詳細内容中に説明しないこととする。本発明の実施例の詳細は次の通りであり、これらの詳細説明の他、本発明はその他実施例に広く応用することが可能であり、しかも本件の発明範囲は制限を受けることはなく、その範囲は下記の特許登録申請の範囲を基準とする。
【００１２】
本発明の実施例はナノバブルの形成方法を開示するものであり、前記形成方法は、まず、無機ナノ粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセス（polymer coating process）を行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成する。次に、前記第一高分子はポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する両性高分子とし、次に前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成する。前記溶剤型ナノ粒子には前記第一溶剤を内含する。続いて冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去し前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させる。前記中空ナノ粒子には空気を内含する。更に前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして前記ナノバブルを形成する。
【００１３】
また、前記ナノバブルの形成方法には更に、前記第一高分子層コーティングプロセスの後、バイオコンジュゲーションプロセス（bioconjugation process）を含み、生物適合性を備える第二高分子を前記第一高分子層の表面に接合する。前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であり、例えば１−エチル基３−ジメチル基−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）である。
前記無機ナノ粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループから何れか一つを選択し、しかも第一溶剤は王水とし第一溶剤は純水と各種バッファ溶液とする。
前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとし、その粒径の大きさは無機粒子のサイズによりコントロールする。
【００１４】
本発明の実施例において前記溶解プロセスには更に、希望する気体気流を前記中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を前記第二溶剤で溶かし、希望する気体を含む前記ナノバブルの形成を便利にする。
本発明のもう一つの実施例において前記のナノバブルを真空にし前記ナノバブルが包覆する気体を取り除き、並びに希望する気体を充填する。
【００１５】
前記ナノバブルの含む気体は下記グループから何れの一つを選択する。即ち、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気である。その内良好であるのは、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6である。本発明に開示するナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することが可能である。並びに、前記ナノバブルは安定したライフタイムを備え、そのライフタイムは２５〜３０分に到達する。前記のナノバブルのライフタイムは、ナノバブルが特定超音波パラメータによる刺激の下、超音波エコー信号の時間を延長できることを指している。
【００１６】
下記に、ナノバブル合成方法を説明する。
[実施例１] 金ナノ粒子の合成
予め以下の溶液を配置する。
（ａ）ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）溶液：微量用電子天秤を使いＤＤＡＢ（ＭＷ=462.63）を4.63ｇ量り、それを１００ｍＬトルエンに加え、振動器で均等に混合する。
（ｂ）塩化金（AuCl3）溶液：微量用電子天秤を使いＡｕＣｌ３（ＭＷ=303.33）を0.15ｇ量り、それを２０ｍＬのＤＤＡＢに加え、振動器で均等に混合する。
（ｃ）ドデカニック酸（Dodecanic acid）溶液：微量用電子天秤を使いドデカニック酸（ＭＷ=172.26）を1.376ｇ量り、それを80ｍＬのトルエンに加え、振動器で均等に混合する。
（ｄ）テトラブチルアンモニウムブロマイド（ＴＢＡＢ）溶液：微量用電子天秤を使いテトラブチルアンモニウムブロマイド（ＭＷ=257.31）を0.15ｇ量り、それを1.08ｍＬのＤＤＡＢに加え、振動器で均等に混合する。
（ｅ）トリオクチルホスフィン（trioctylpyosphine：ＴＯＰ）溶液：0.17ｍＬのＴＯＰを3.8ｍＬのトルエンに加え振動器で均等に混合する。ＴＢＡＢ溶液は金ナノ粒子を合成した活性化剤である故、合成が必要な時にその場で配合する。
【００１７】
磁石を２０ｍＬの試料フラスコ中に入れ、2.5ｍＬのドデカニック酸溶液と１ｍＬのＴＢＡＢ溶液を２０ｍＬの試料フラスコ中に入れ、磁石攪拌器を使い適当な回転速度で持続的に攪拌し、続いて、0.8ｍＬのＡｕＣｌ３溶液を加え、２時間反応させる（先ず１０ｕＬ加え、更に素早く７９０ｕＬ加える）。次に、７０℃水浴で５分間加熱し、温度のバランスが取れた後４０ｕＬのＴＯＰ溶液を加えて５分間反応させる。その後、磁石を取り出し、メチルアルコールを溶液に混濁が出現するまで加える。更に、3000ｒｐｍの回転速度で５分間遠心し、小分子と小さな雑質を除去する。その後、上澄み液を取り除いた後にクロロホルム（chloroform）で沈殿した金ナノ粒子を再懸濁する。最後に、更に3000rpmの回転速度で５分間遠心させて比較的大きな金ナノ粒子と大きな雑質を除去し、並びに、上澄み液をきれいな試料フラスコ中に回収する。
【００１８】
[実施例２] 高分子コーティング（polymer coating）
先ず下記薬品を配置する。
（ａ）高分子溶液：3.084ｇ（20mmole）のポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）（Ｍｗ〜6,000）粉末を取り、丸底フラスコ中に置く。2.78ｇ（15mmole）のドデシルアミン（dodecylamine）を100ｍＬのトテラヒドロフラン（Tetrahydrofuran:ＴＨＦ）溶液中に溶かす。ドデシルアミン溶液とポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）の粉末を迅速に均等混合して混合溶液を作る。次に減圧濃縮器の温度を60℃に設定し、適当な回転速度で１０分間反応させて、前記の混合溶液を透明状態にする。続いて、圧力を２００ｍｂａｒに設定し２４時間反応させる。溶液を完全に抜き取った後、２５ｍＬのクロロホルムを加え、前記で合成した高分子溶液を溶解する。前記高分子溶液（monomer）濃度は0.8Ｍであり、各高分子単体は25％の無水マレイン酸グループ（maleic anhydride groups）及び75％の疎水性炭化水素鎖を含む。
（ｂ）ホウ酸ナトリウムバッファ液（Sodium borate buffer:SBB）：微量用電子天秤を使い3.09ｇのホウ酸（Boric Acid, ＭＷ＝61.83Ｄａ, 50ｍＭ）と19.07ｇの四ホウ酸ナトリウム十水和物（Sodium Tetraborate Decahydrate, Ｗ＝381.37Ｄａ, 50ｍＭ）を量り、続いて1000ｍＬの二次水（ｐＨ＝9.0）に溶解し室温下に保存する。
（ｃ）５×ＴＢＥバッファ液：微量用電子天秤を使い54ｇのトリス塩基（Tris Base）と27.5ｇのホウ酸を量った後、980ｍＬの二次水に溶かし、続いて20ｍＬのエチレンジアミン四酢酸（EDTA, 0.5M, pH=8.0）を加え、並びに磁石で均等攪拌した後、室温下で保存する。使用時は0.5×希釈した後に使用する。
（ｄ）2％のアガロースゲル（agarose gel）：ゲル製作トレイをゲルキャスティングトレイに入れ、並びに電気泳動コームをゲルキャスティングトレイ上に架設する。微量用電子天秤を使い2.4ｇのアガロースゲルを量り250ｍＬの三角フラスコに入れ、120ｍＬの0.5×ＴＢＥバッファを加え、続いてマイクロウェーブでアガロースが完全に溶解するまで加熱し、均等に揺らし、温度が若干下がった後、ゆっくり溶液を架設したゲルキャスティング槽に流し込み、その後、常温でアガロースが冷却凝固するまで静置し、最後に、電気泳動コームを抜き取り電気泳動槽に入れる。
（ｅ）ローディングバッファ（Loading buffer）：グリセリンと二次水を混合する（ｖ：ｖ＝1：10）。
【００１９】
光吸収スペクトル測定器を使い合成後の６ｎｍ金ナノ粒子の備える520ｎｍの吸収ピーク値を測定する。ベールの法則（Beer’s Law）：Ａ＝εｂｃを使って金ナノ粒子の濃度（６ｎｍの金ナノ粒子のモル吸収係数は2.905E7）を算出する。前記のＡは吸収値、εはモル吸収係数（L/mol cm）、ｂは光路径厚さ（cm）、ｃは容積モル濃度（mol/L）である。
【００２０】
金ナノ粒子外層の有機分子の厚さが1.1ｎｍであるなら、全金ナノ粒子の表面積が推測できる。１ｎｍ２が200個の高分子単体（monomer units）を必要とするのなら、高分子溶液に加える必要のある体積を算出可能である。実験の始めに計算後の高分子溶液と５ｍＬのクロロホルムを三角フラスコ中で均等混合し、続いて金ナノ粒子溶液を加えて手で５分間揺らし、金ナノ粒子溶液と高分子溶液を均等混合する。減圧濃縮器（200millibar 回転速度100rpm）を使用して溶液を全て抜き取る。溶液を全て抜き取った後、大気圧に戻し更に１ｍｂａｒまでエアを抜き取る。溶液を完全に抽出したことが確定した後、更に0.1Ｎの水酸化ナトリウム（NaOH）を加え、高分子改質を経た金ナノ粒子を迅速に溶解する。続いて、５ｍＬの注射器を使って0.2ｕｍの濾過膜に通し、更に100ＫＤａの分子ストッパーを使って小さい分子を除去し、溶剤をホウ酸ナトリウムバッファ液（ＳＢＢ）に置き換える。
【００２１】
アガロース純化によって高分子コーティングを経た金ナノ粒子をローディングバッファと混合をする（ｖ：ｖ＝10：1）。その内、2％のアガロースゲルを電気泳動槽のＴＢＥバッファ中に置いて純化を行い（電圧100Ｖ、所要時間１時間）、未反応の高分子を除去する。続いて金ナノ粒子をアガロースゲルから取り出し、透析膜中に置き、電圧100Ｖの電気泳動槽内で電場を使って金ナノ粒子とアガロースゲルを分離させる。試料を回収した後、0.22ｕｍの濾過膜で濾過し、更に100ＫＤａ分子ストッパーで試料を濃縮し、並びに純化した金ナノ粒子をホウ酸ナトリウムバッファ液中で保存する。最後に電気泳動で純化した両性高分子コーティングナノ金粒子を超高速の遠心機50000rpmで20分間遠心した後、上澄み液を除去し、更にホウ酸ナトリウムバッファ液で沈殿したナノ金粒子を再懸濁する（３回繰り返し）。
【００２２】
[実施例３] バイオコンジュゲーション（Biocompatible layer conjugation）
高分子コーティングを経た金ナノ粒子とポリエチレングリコール（Polyethyleneglycol:PEG）及び１−エチル基３−ジメチル基−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を混合して（[Au]/[PEG]=1/200,Au:PEG:EDC=v:v:v=1:1:1）２時間反応させる。その後100ＫＤａタンパク質濾過管（ＭＣＷＯ）で未反応のＰＥＧを除去し、並びに試料を１ｕＭまで濃縮し、ＳＢＢ（ｐＨ＝９）で保存する。
【００２３】
[実施例４]
実施例２、実施例３を経た試料中に溶液が無色透明状態になるまで王水を落とし、100ＫＤａタンパク質濾過管で溶液中の王水をＳＢＢ（ｐＨ＝９）に置き換え、更にＳＢＢを脱イオン水に置き換える。最後に冷凍乾燥機で溶液を完全に抜き取り、試料を白色固体にする。超音波で刺激する場合は、脱イオン水を加えて前記白色固体を直接溶解すればよく、これによりナノバブルが完成する。前記ナノバブルの合成図は図１に示す通りであり、エアコア（Air Core）中の気体は空気と各種惰性気体とし、良好なのはＣ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、ＳＦ６である。
【００２４】
超音波でナノバブルを刺激した超音波画像は図２に示す通りであり、バブル粒径は10μｍである。図３に示す通り、前記バブルは動的光散乱（Dynamic Light Scattering: DLS）を使用して測定したものである。更に、図４に示す通り、前記バブルのライフタイムは20分間である。超音波は25ＭＨｚのディテクターを使用してＢモード画像を形成し5900によって自動的に送受信する。
【００２５】
超音波パラメータ
PRT: EXT-BNC Gain: 40dB Energy:32μJ
Damping:50 Ohm High Pass: 10MHz
Low Pass:50 MHz Lab View インターフェースパラメータ
Sample Number:512 Scan
Sequence:512PRF:512
Mode: B-scan
Sample rate: 120M Vectors:4mm Dynamic range:1V Speed:slow
Delay time:0.0147 C scan Trig Type: positive swept
Depth: 1mm interval:1μm
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセスを行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成し、
前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成し、前記溶剤型ナノ粒子の内部には前記第一溶剤を内含し、
冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去して前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させ、
溶解プロセスにおいて前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かしてナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項２】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記無機粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループの内から何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項３】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子は、ポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する高分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項４】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一溶剤は王水であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項５】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第二溶剤は、純水及び各種バッファ溶液のグループの何れか一つとすることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項６】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとすることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項７】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径は無機粒子のサイズによりコントロールされることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項８】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子層コーティングプロセスを行った後、更にバイオコンジュゲーションプロセスを行い、生物適応性を備える第二高分子を第一高分子層の表面に接合することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項９】
請求項８記載のナノバブルの形成方法において、前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１０】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記溶解プロセスには、更に希望する気体気流を中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして希望する気体のナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１１】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルを真空にしてナノバブルの包覆する気体を除去し、希望の気体を充填することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１２】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１４】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルのライフタイムは２５〜３０分間であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１５】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１】
無機粒子を中心核として、高分子層コーティングプロセスを行い、前記中心核の表面に最低一つの第一高分子を被覆して有機／無機複合粒子を形成し、
前記有機／無機複合粒子は第一溶剤に接触し、前記第一溶剤で前記有機／無機複合粒子の中心核を溶解して除去し溶剤型ナノ粒子を形成し、前記溶剤型ナノ粒子の内部には前記第一溶剤を内含し、
冷凍乾燥プロセスにおいて前記第一溶剤を除去して前記溶剤型ナノ粒子に中空ナノ粒子を形成させ、
溶解プロセスにおいて前記中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かしてナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項２】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記無機粒子は、金、銀、鉄、及びその他無機材料のナノ粒子のグループの内から何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項３】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子は、ポリ（イソブチレン−アルト−無水マレイン酸）−グラフト−ドデシルアミン（poly(isobutylene-alt-maleic anhydride)-graft-dodecylamine）及びそれに類似する高分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項４】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一溶剤は王水であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項５】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第二溶剤は、純水及び各種バッファ溶液のグループの何れか一つとすることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項６】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径範囲は３０ｎｍ〜１００００ｎｍとすることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項７】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルの粒径は無機粒子のサイズによりコントロールされることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項８】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記第一高分子層コーティングプロセスを行った後、更にバイオコンジュゲーションプロセスを行い、生物適応性を備える第二高分子を第一高分子層の表面に接合することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項９】
請求項８記載のナノバブルの形成方法において、前記第二高分子はＮＨ2官能基グループを含む分子であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１０】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記溶解プロセスには、更に希望する気体気流を中空ナノ粒子上に施用し、並びに中空ナノ粒子を第二溶剤に溶かして希望する気体のナノバブルを形成することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１１】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルを真空にしてナノバブルの包覆する気体を除去し、希望の気体を充填することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１２】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、フッ素化気体、酸素、窒素、アルゴン、ネオン、キセノン、及び空気のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルに含まれる気体は、ＣＦ4、Ｃ2Ｆ6、Ｃ2Ｆ4、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8、Ｃ4Ｆ10、Ｃ3Ｆ6、ＳＦ6のグループから何れか一つを選択することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１４】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルのライフタイムは２５〜３０分間であることを特徴とするナノバブルの形成方法。
【請求項１５】
請求項１記載のナノバブルの形成方法において、前記ナノバブルは、超音波造影剤、薬物キャリア、遺伝子キャリア、及び臨床における診断と治療に応用することを特徴とするナノバブルの形成方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−１６３３９３（Ｐ２０１０−１６３３９３Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７２４１（Ｐ２００９−７２４１）
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【出願人】（５０６２５５９０２）私立中原大學 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【出願人】（５０６２５５９０２）私立中原大學 (14)
【Ｆターム（参考）】
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