バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法
プリン生産性がＹｄｈＬタンパク質の活性を増大させることにより増強されたバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用することを含む、プリン塩基類似体、イノシン及び５’−イノシン酸などのプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドの製造方法が提供される。また、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸及び５’−グアニル酸の合成における原料として重要であるプリンヌクレオシドの製造方法に関する。本発明はまた、この製造方法で使用される新規微生物に関する。本発明はまた、該ＤＮＡを発現する細菌へ、プリン塩基類似体及びプリンヌクレオシドに対する耐性を付与する新規ＤＮＡ並びにタンパク質種に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イノシンのようなヌクレオシドは、アデニン栄養要求株、又は、プリン類似体及びスルファグアニジンのような様々な薬物に対する薬物耐性を付与された株を利用する発酵方法により工業的に生産されている。このような株の例としては、バチルス属（特公昭第５４−１７０３３号（１９７９年）、同第５５−２９５６号（１９８０年）及び同第５５−４５１９９号（１９８０年）、特開昭第５６−１６２９９８号（１９８１号）、特公昭第５７−１４１６０号（１９８２年）及び同第５７−４１９１５号（１９８２年）、並びに特開昭第５９−４２８９５号（１９８４年））、又はブレビバクテリウム属（特公昭第５１−５０７５号（１９７６年）及び同第５８−１７５９２号（１９７２年）、並びにAgric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)）、又はエシェリヒア属（ＷＯ９９／０３９８８号）等が挙げられる。
【０００３】
このような変異株の取得は通常、微生物を、例えば、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理のような変異誘発処理に供すること、及び適切な選択培地を介して所望の株を選択することを包含する。他方で、遺伝子工学技術を使用したこのような変異株の育種もまた、バチルス属（特開昭第５８−１５８１９７号（１９８３年）、同第５８−１７５４９３号（１９８３年）、同第５９−２８４７０号（１９８４年）、同第６０−１５６３８８号（１９８５年）、特開平第１−２７４７７号（１９８９年）、同第１−１７４３８５（１９８９年）、同第３−５８７８７号（１９９１年）、同第３−１６４１８５号（１９９１年）、同第５−８４０６７号（１９９３年）及び同第５−１９２１６４号（１９９３年））、又はブレビバクテリウム属（特開昭第６３−２４８３９４号（１９８８年））、又はエシェリヒア属（ＷＯ９９／０３９８８号）に属する株に関して実施されている。
【０００４】
これらのイノシン生産株の生産性は、イノシン分泌能を増大させることにより、さらに向上させることができる。現在では、細胞質細胞膜を介した代謝産物の通過は通常、特定の排出トランスポータータンパク質により媒介されることが一般的に認められている(Pao, S.S. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen, I.T. et al., J. Mol. Biol., 277, 573-592 (1998); Saier, M.H. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279 (1999))。本発明者らはこれまでに、エシェリヒア属又はバチルス属に属し、且つｒｈｔＡ（ｙｂｉＦ）遺伝子によりコードされるＲｈｔＡタンパク質の活性、ｙｉｊＥ遺伝子によりコードされるＹｉｊＥタンパク質の活性、及びｙｄｅＤ遺伝子によりコードされるＹｄｅＤタンパク質の活性が増強されたイノシン又はキサントシン生産株が、それらの各々の親株より多くのイノシン又はキサントシンを生産したことを示している（それぞれロシア国特許出願第２００２１０１６６６号、同第２００２１０４４６３号及び同第２００２１０４４６４号）。最近では、バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬが、プリン類似体である２−フルオロアデニンに対する感受性を低減させることが見出された。さらに、間接的な証拠により、ＹｄｈＬは、ヒポキサンチンの内部プールの量を減少させることが示されている(Johansen et al, J. Bacteriol., 185, 5200-5209, 2003)。しかしながら、ヌクレオシド分泌及び／又はヌクレオシド生産に対するＹｄｈＬ過
剰発現の影響は示されていない。
【０００５】
さらに、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬは全く報告されておらず、またヌクレオシド分泌及び／又はヌクレオシド生産に対するＹｄｈＬ過剰発現の影響も示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、イノシン生産株によるイノシンの生産を増強すること、並びにこれらの株を使用したイノシン及び５’−イノシン酸の製造方法を提供することである。
【０００７】
この目的は、多コピーベクター上に配置された遺伝子の野生型対立遺伝子が、E.coli株へ導入される場合に、８−アザアデニン、６−メチルプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、８−アザグアニンのようなプリン塩基類似体、並びにイノシン及びグアノシンのようなプリンヌクレオシドに対する耐性を付与する推定膜タンパク質をコードするバチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子を同定することにより達成された。また、バチルス・アミロリケファシエンス由来のこれまでに未知のｙｄｈＬ遺伝子が単離され、その塩基配列が決定された。さらに、バチルス・ズブチリス又はバチルス・アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子は、遺伝子のさらなるコピーが、バチルス属又はエシェリヒア属に属する各々のイノシン生産株の細胞へ導入されると、ヌクレオシド生産を増強することができることが確認された。このようにして、本発明は完成した。
【０００８】
したがって、本発明は、バチルス属又はエシェリヒア属に属し、且つイノシン生産能を有する微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、以下：
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、タンパク質の活性が細菌において増強されるときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質
から成る群から選択されるバチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬタンパク質を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、上述のようなタンパク質をコードするＤＮＡを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されるときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、上記ＤＮＡを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、上記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、プリン生産能を有し、かつ、
（Ａ）バチルス・アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬによりコードされるタンパク質、
（Ｂ）バチルス・ズブチリス由来のｙｄｈＬによりコードされるタンパク質、及び
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）における上記ｙｄｈＬ遺伝子のいずれかのオーソログによりコードされるタンパク質
から成る群から選択されるタンパク質の活性の増強を有する、
バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、プリンがイノシン又はグアノシンである、上記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、タンパク質の活性が、タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増大させること、或いは細菌の染色体上の上記ＤＮＡの発現調節配列の改変により増強される、上記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、低コピー数ベクターにより形質転換が実施される、上記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、上記プリンヌクレオシドを上記培地中へ分泌させること、及び上記プリンヌクレオシドを培地から回収することを含む、プリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、プリンヌクレオシドがイノシン、キサントシン又はグアノシンである、上記方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、細菌がプリンヌクレオシド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、上記方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、プリンヌクレオシドをリン酸化してプリンヌクレオチドを生成すること、プリンヌクレオチドを上記培地中へ分泌させること、及びプリンヌクレオチドを回収することを含む、プリンヌクレオチドの製造方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、プリンヌクレオチドが５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸である、上記方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、細菌がプリンヌクレオチド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、上記方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、培地中で請求項５に記載の細菌を培養すること、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成すること、５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成すること、及び５’−グアニル酸を回収することを含む、５’−グアニル酸の製造方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［好ましい実施形態の説明］
１．本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、
置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体又はイノシン及びグアノシンのようなプリンヌクレオシドに対して耐性にする活性を有するタンパク質を包含する。
【００２５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬタンパク質である。このタンパク質のアミノ酸配列及びｙｄｈＬ遺伝子の塩基配列は、本開示までは知られていなかった。
【００２６】
バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬタンパク質は、プリンヌクレオチドの生合成経路に関与せず、ＭＦＳ(Major Facilitator Surperfamily)(Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1):1-32, (1998))及びオーソロガスな基のアラビノース排出パーミアーゼクラスター（ＣＯＧ）２８１４(Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29:22-28 (2001))に属する。このファミリーに属するＥ．コリ タンパク質であるＡｒａＪ及びＹｄｅＡもまた、アラビノース輸送に関与している(Bost, S. et al, J. Bacteriol., 181:2185-2191 (1999))。バチルス・ズブチリスのゲノムは、ｙｄｈＬ遺伝子のホモログをコードする別の５個の遺伝子：ｙｂｃＬ、ｙｃｅＪ、ｙｆｈＩ、ｙｔｂＤ、ｙｗｆＡを含有する。バチルス・ズブチリスのＹｄｈＬタンパク質は、３８８個のアミノ酸から構成される高度に疎水的なタンパク質であり、未知の機能を有する１２個の推定膜貫通セグメントを含有する。ＹｄｈＬタンパク質は、ｙｄｈＬ遺伝子によりコードされる。バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株のｙｄｈＬ遺伝子（GenBankアクセッション番号ＣＡＢ１２３９９．２；ＧＩ：３２４６８７０５中の番号６２４６７５〜６２５８３８）は、染色体上でｙｄｈＫとｙｄｈＭ遺伝子との間で５３．５０°に位置する。
【００２７】
本発明のタンパク質において変更することができる「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置及び／又は種類に応じて異なる。数個のアミノ酸の数は、配列番号２又は４に示されるタンパク質に関して２〜４０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜５個であり得る。これは、数個のアミノ酸が互いに高度に相同であるという事実に起因しており、したがって、三次元構造又は活性は、このような変化により影響を受けない。したがって、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＹｄｈＬタンパク質の全長アミノ酸配列に関して少なくとも３０〜５０％、好ましくは５０〜７０％、最も好ましくは７０〜９０％の相同性を有し、またタンパク質の活性を保持するものでもよい。
【００２８】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有し、且つＹｄｈＬタンパク質の活性を保持するタンパク質は、本発明により包含され、最も好ましい。
【００２９】
相同性の度合いを評価するためには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索及びＣｒｕｓｔａｌＷのような幾つかの既知の算出方法を使用することができる。
【００３０】
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより使用される帰納的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、それらの所見に有意性を付与する（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68 (1990)、「分子配列における多数の高スコアリングセグメントに関する用途及び統計学」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-7 (1993)）。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより
記載されている（「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡによる迅速且つ高感度配列比較」, Methods in Enzymology, 183:63-98 (1990)）。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及び重みマトリックス選択による進行性多数配列アラインメントの感度の改善」, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)）。
【００３１】
上述のような本発明のタンパク質における変更は、通常、タンパク質の活性を維持するような保存的な変更である。置換変更は、アミノ酸配列において少なくとも一つの残基が取り除かれ、その位置に異なる残基が挿入されたものが挙げられる。上記のタンパク質において本来のアミノ酸と置換され、且つ保存的な置換として見なされるアミノ酸として、アラニンのセリン又はスレオニンへの置換；アルギニンのグルタミン、ヒスチジン又はリシンへの置換；アスパラギンのグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒスチジン又はアスパラギン酸への置換；アスパラギン酸のアスパラギン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換；システインのセリン又はアラニンへの置換；グルタミンのアスパラギン、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はアルギニンへの置換；グルタミン酸のアスパラギン、グルタミン、リシン又はアスパラギン酸への置換；グリシンのプロリンへの置換；ヒスチジンのアスパラギン、リシン、グルタミン、アルギニン又はチロシンへの置換；イソロイシンのロイシン、メチオニン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；ロイシンのイソロイシン、メチオニン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；リシンのアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアルギニンへの置換；メチオニンのイソロイシン、ロイシン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；フェニルアラニンのトリプトファン、チロシン、メチオニン、イソロイシン又はロイシンへの置換；セリンのスレオニン又はアラニンへの置換；スレオニンのセリン又はアラニンへの置換；トリプトファンのフェニルアラニン又はチロシンへの置換；チロシンのヒスチジン、フェニルアラニン又はトリプトファンへの置換；及びバリンのメチオニン、イソロイシン又はロイシンへの置換が挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質に関する「活性」は、該タンパク質を保有する細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニンのようなプリン塩基類似体に対して耐性、及び／又はイノシン及びグアノシンのようなヌクレオシドに対して耐性にする活性を意味する。
【００３３】
「プリン塩基類似体及び／又はプリンヌクレオシドに対して耐性」という語句は、野生型又は親株が類似の条件下では増殖することができない濃度で、８−アザアデニン、６−メチルプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、８−アザグアニンのようなプリン塩基類似体、又はイノシン若しくはグアノシンのようなプリンヌクレオシドを含有する最小培地上で増殖すること、或いは細菌の野生型若しくは親株よりも迅速に、プリン類似体又はプリンヌクレオシドを含有する培地上で増殖することを意味する。プリン塩基類似体の上述の濃度は、８−アザアデニンに関しては３００μｇ／ｍｌであり、２，６−ジアミノプリンの場合では４００μｇ／ｍｌであり、６−メルカプトプリンに関しては４００μｇ／ｍｌであり、プリン塩基ヌクレオシドに関して、上述の濃度は、イノシンに関しては３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１，０００μｇ／ｍｌであり、グアノシンに関しては１０μｇ／ｍｌである。
【００３４】
ＩＩ．本発明の細菌
本発明の細菌は、タンパク質の活性を増大させることにより、プリンヌクレオシド生産が増強された細菌である。より具体的には、本発明の細菌は、細菌において本発明のタンパク質の活性を増大させることにより、プリンヌクレオシド生産が増強された細菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、細菌内の染色体又はプラスミド上に、ｙｄｈＬ遺伝子又はそのオーソログのＤＮＡを保有する。ｙｄｈＬ遺伝子又はそのオーソログのＤＮ
Ａは過剰発現されて、結果として、細菌はより大量のプリンヌクレオシドを生産する能力を有する。
【００３５】
ｙｄｈＬ遺伝子発現の増強は、ノーザンハイブリダイゼーション又はＲＴ−ＰＣＲ(Molecular cloning: Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)により本発明の細菌におけるｙｄｈＬ遺伝子発現によるＲＮＡの量を測定すること、及びそれを野生型又は非改変株の量と比較することにより確認することができる。本発明の微生物におけるｙｄｈＬ遺伝子の発現は、野生型又は非改変株の発現よりも多く、好ましくは野生型又は非改変株の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍増強される。
【００３６】
本発明の細菌は、バチルス属又はエシェリヒア属のいずれかの属に属する細菌である。本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する微生物の例は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）である。本発明で使用することがバチルス属に属する微生物の例としては、バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株（B. subtilis １６８）又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．アミロリケファシエンス）が挙げられる。
【００３７】
バチルス属に属する細菌として、バチルス・リキニホルミス、バチルス・プミルス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ブレビス、バチルス・ポリミクサ、バチルス・ステアロサーモフィラスが挙げられる。
【００３８】
エシェリヒア・コリのような、Neidhardtら(Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により報告されたエシェリヒア属に属する細菌が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株として、Ｋ１２株及びその派生株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ番号４７０７６）及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ番号２７３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。それらの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, United States of America)から入手可能である。
【００３９】
すでに言及した特性のほかに、本発明の細菌は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性及び薬物依存性のような他の特性を有してもよい。
【００４０】
「プリンヌクレオシド」という語句は、本明細書中で使用する場合、イノシン、キサントシン、グアノシン及びアデノシンを包含し、好ましくはイノシンを包含する。
【００４１】
「プリンヌクレオシド生産能」という語句は、本明細書中で使用する場合、培地中でプリンヌクレオシドを生産して、その蓄積をもたらす能力を意味する。「プリン生産能を有する」という語句は、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物が、Ｅ．コリＷ３１１０及びＭＧ１６５５株のようなＥ．コリの野生株、或いはバチルス・ズブチリス１６８のようなバチルス・ズブチリスの野生株よりも大量に、培地中でプリンヌクレオシドなどのプリンを生産して、その蓄積をもたらすことが可能であることを意味する。好ましくは、この語句は、微生物が、少なくとも１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｌの量のイノシン、キサントシン、グアノシン又は／及びアデノシンを培地中で生産して、その蓄積をもたらすことが可能であることを意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、本発明のタンパク質の活性が細菌中で増強される場合、これは、細胞中のタンパク質の分子の量が増大されること、或いはタンパク質分子１個当た
りの活性が増大されることを意味する。
【００４３】
「オーソロガス遺伝子」又は「オーソログ」という用語は、共通祖先種を介して関連している別の種における遺伝子（相同遺伝子）に相当するが、他の種の遺伝子と異なるように進化したある種由来の遺伝子を意味する。オーソロガス遺伝子は、同じ機能を有してもよく、或いは同じ機能を有さなくてもよい。生物体の完全ゲノムが配列決定される場合、以下の方法を用いて、オーソログを検索することができる。ＢＬＡＳＴ検索は、ある生物体由来の遺伝子を用いて実施され、他の生物体における最良のホモログを見つけ出す。次いで、第２の逆行ＢＬＡＳＴ検索は、ＢＬＡＳＴ検索の第１ラウンドで見出された他の生物体由来の最良のホモログを使用して実施され、第１の生物体における最良のホモログ又はオーソログを見つけ出す。第１ラウンドで使用される遺伝子及び第２ラウンドの結果で見出された遺伝子が一致する場合、第１の生物体由来の遺伝子及び他の生物体における最良のホモログは、オーソログである。ＢＬＡＳＴ検索のプロセスにおいて、対象の遺伝子によりコードされるタンパク質の相同性が決定される。
【００４４】
本発明の目的で、オーソロガス遺伝子によりコードされるタンパク質は、同じ活性を有する相同タンパク質である。このようなオーソログに関する検索は、遺伝子及びタンパク質の配列、並びにタンパク質の活性を測定することにより実施される（例えば、図１及び実施例２を参照）。
【００４５】
バチルス・アミロリケファシエンスのＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子であるｙｄｈＬ遺伝子は、本発明の発明者等により配列決定されている（配列番号１）。バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子であるバチルス・ズブチリス
サブスピーシーズ ズブチリス１６８株のｙｄｈＬ遺伝子は同定されている（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｚ９９１０７中の番号１３０４２〜１４２０８）（配列番号３）。バチルス・ズブチリス由来のｙｄｈＬ遺伝子は、染色体上でｙｄｈＫとｙｄｈＭ遺伝子との間で５３．５０°に位置する。したがって、上記ｙｄｈＬ遺伝子は、遺伝子の塩基配列に基づいて調製されるプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J.,
et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。他の微生物由来のＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子は、類似の方法で得ることができる（実施例２を参照）。
【００４６】
バチルス・アミロリケファシエンスに由来するｙｄｈＬ遺伝子はまた、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を有し、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンに対して耐性にする活性を有するタンパク質などの本発明のタンパク質をコードするＤＮＡにより例示することができ、そのタンパク質の活性は、細菌中で増強される。
【００４７】
バチルス・ズブチリスに由来するｙｄｈＬ遺伝子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を有し、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンに対して耐性にする活性を有するタンパク質を含む本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００４８】
上述のＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、特定の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加されるように、例えば部位特異的変異誘発を用いて、ＹｄｈＬタンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列を改変することにより得ることができる。上述のように改変されるＤＮＡは、従来既知の変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸などの試薬によるＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００４９】
バチルス・アミロリケファシエンスに由来するＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞において上述のような変異を有するＤＮＡを発現させ、任意の発現した生成物の活性を調べることにより得ることができる。ＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、ＹｄｈＬタンパク質をコードする変異ＤＮＡから、或いは、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含有する塩基配列を有するプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、且つＹｄｈＬタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする変異体を保有する細胞から、ＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。任意の数値を使用することでこの条件を明確に表すことは困難である。しかしながら、例えば、ストリンジェントな条件としては、高度に相同なＤＮＡ、例えば、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが不可能である条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件は、ＤＮＡが、サザンハイブリダイゼーションにおける典型的な洗浄条件に等しい塩濃度、すなわち６０℃でおよそ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、ハイブリダイズすることが可能である条件により例示することができる。洗浄の持続期間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般に製造業者により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件下での、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）の洗浄の推奨持続期間は、１５分である。好ましくは、洗浄は、２〜３回実施することができる。
【００５０】
配列番号１の塩基配列の部分配列はまた、プローブとして使用することができる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製することができる。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、洗浄に関するハイブリッド形成条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳであり得る。
【００５１】
上記のすべてが、バチルス・ズブチリスに由来するＹｄｈＬタンパク質に適用可能である。
【００５２】
本発明のタンパク質の活性を増強するための方法、特に細菌細胞におけるタンパク質分子の数を増大させるための方法としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を変更させること、及び遺伝子のコピー数を増大させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変することは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを強力なプロモーターの制御下に置くことにより達成できる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ラムダファージのＰLプロモーターはすべて、Ｅ．コリに対する既知の強力なプロモーターである。特に、ｖｅｇプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌＥプロモーターは、バチルス属にとって強力なプロモーターとして既知である。あるいは、プロモーターの活性は、例えばプロモーターの下流にある遺伝子の転写レベルを増大させるようにプロモーターへ変
異を導入することにより増強することができる（ＷＯ００／１８９３５号）。さらに、ｍＲＮＡ翻訳能は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサーへ変異を導入することにより増強することができる。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの種類に応じて、発現レベルにおける２０倍の範囲が見出された(Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。
【００５４】
さらに、遺伝子の転写レベルを増大させるために、エンハンサーを新たに導入してもよい。遺伝子又はプロモーターのいずれかを含有するＤＮＡの染色体ＤＮＡへの導入は、例えば、特開平第１−２１５２８０号（１９８９年）に記載されている。
【００５５】
あるいは、遺伝子のコピー数は、多コピーベクターへ遺伝子を挿入して、組換えＤＮＡを形成すること、続いて微生物へ組換えＤＮＡを導入することにより増大させることができる。エシェリヒア・コリで自己複製可能なベクターの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ及びｐＡＣＹＣは、Takara Bioから入手可能である）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷは、Nippon Geneから入手可能である）等が挙げられる。バチルス属細菌で自己複製可能であるベクターの例としては、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４が挙げられる。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターの例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が挙げられるが、これらに限定されない。「低コピーベクター」という用語は、細胞１個当たり最大５個のコピー数しかもたらさないベクターに関して使用される。形質転換の方法としては、当該技術分野における任意の既知の方法が挙げられる。例えば、ＤＮＡに対する細胞の透過性を増大するようにレシピエント細胞を塩化カルシウムで処理する方法がエシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、これは、本発明で使用することができる。
【００５６】
遺伝子発現の増強はまた、例えば相同組換え、Ｍｕ組込み等による細菌染色体への遺伝子の多コピーの導入により達成することができる。例えば、Ｍｕ組込みの１回の操作は、遺伝子の最大３個のコピーを細菌染色体へ導入することが可能である。
【００５７】
強力なプロモーター又はエンハンサーを使用する上述の方法は、遺伝子のコピー数又は発現を増大させることに基づく方法と併用することができる。
【００５８】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等に関する当該技術分野で既知の方法が本発明で使用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., 「Molecular Clonig A Laboratory Manual, Third Edition」,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【００５９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増大するためにバチルス属に属する微生物を育種することに関して、遺伝子の必須領域は、主としてバチルス・ズブチリス遺伝子に関する入手可能な情報に基づいたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により得られる。例えば、トランスポーターをコードする遺伝子であると予想されるｙｄｈＬ遺伝子は、ＰＣＲを使用して、バチルス・ズブチリス株の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。これに使用される染色体ＤＮＡは、バチルス・ズブチリスの任意の他の株に由来してもよい。
【００６０】
これらの変異体、改変体又は相同タンパク質が、ＹｄｈＬタンパク質の機能的特性を示し、すなわちプリン塩基類似体、イノシン又はグアノシンに対する耐性を付与する限り、
本発明のタンパク質は、天然の多様性に起因して存在するＹｄｈＬタンパク質の変異体及び改変体、並びに異なる細菌中に存在するＹｄｈＬの相同タンパク質を包含する。
【００６１】
本発明の細菌は、イノシンなどのプリンヌクレオシドを生産する能力を本質的に有する細菌に本発明のタンパク質をコードする上述のＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、該ＤＮＡをすでに保有する細菌へ、イノシンなどのプリンヌクレオシド生産能を付与することにより得ることができる。
【００６２】
本発明で使用することができるバチルス属に属する親株の例は、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株である。この株は、ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ変異がｐｕｒＡ：：ｃａｔ変異へ変更された、イノシン生産株バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株の誘導体である。ここで、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株は、変異が、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に導入された既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２の誘導体である（ＵＳ２００４−０１６６５７Ａ号）。本発明で使用することができるバチルス属に属する他の親株としては、バチルス・ズブチリスＡＪ１２７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）（特公昭ＪＰ６１１３８７６Ａ２号）、バチルス・ズブチリスＡＪ３７７３株（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特公昭ＪＰ６２０１４７９４Ａ２号）、６−エトキシプリン耐性ＡＪ１３９３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８６６５）（ＵＳ２００４−０１６６５７５号）等が挙げられる。
【００６３】
Ｅ．コリ属に属するイノシン生産株の例は、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）である。この株は、変異が、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子に導入され（ＷＯ９９／０３９８８号）、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＱを含有し、且つＧＭＰに対して非感受性であるｐＭＷＫＱを保有する（ＷＯ９９／０３９８８号）、既知のＷ３１１０株の誘導体である。
【００６４】
さらに、例として、イノシン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、具体的にはこのような酵素のフィードバック阻害を解除する方法（ＷＯ９９／０３９８８号）も挙げられる。イノシン生合成に関与する上述のような酵素の調節を解除するための手段としては、例えば、プリンリプレッサーの欠失（米国特許第６，２８４，４９５号）が挙げられる。プリンリプレッサーを欠失させる方法の例としては、プリンリプレッサーをコードする遺伝子（ｐｕｒＲ、GenBankアクセッション番号Ｚ９９１０４）を破壊することが挙げられる。
【００６５】
さらに、イノシン生産能はまた、イノシン生合成から分岐し、且つ別の代謝産物を生成する反応を阻害することにより増大させることができる（ＷＯ９９／０３９８８号）。イノシン生合成から分岐し、且つ別の代謝産物を生じる反応の例としては、スクシニル−アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）シンターゼ、イノシン−グアノシンキナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ等により触媒される反応が挙げられる。スクシニル−アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）シンターゼは、ｐｕｒＡによりコードされる（GenBankアクセッション番号Ｚ９９１０４）。
【００６６】
さらに、イノシン生産能はまた、細胞へのイノシンの取り込みを弱めることにより増強することができる。細胞へのイノシンの取り込みは、細胞へのイノシンの取り込みに関与
する反応を阻害することにより弱めることができる。細胞へのイノシンの取り込みに関与する上述の反応の例としては、例えばヌクレオシドパーミアーゼにより触媒される反応が挙げられる。
本発明のタンパク質におけるタンパク質１分子当たりの活性を増大するために、タンパク質の構造遺伝子に変異を導入して、タンパク質の活性を増強することも可能である。遺伝子に変異を導入するためには、部位特異的変異誘発(Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))、組換えＰＣＲ(PCR Technology, Stockton Press (1989))、ＤＮＡの特定部分の化学合成、対象の遺伝子のヒドロキシルアミン処理、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン若しくは亜硝酸などの化学薬剤による対象の遺伝子を有する微生物株の処理等を使用することができる。
タンパク質の活性が増強される微生物は、表１に示す濃度で８−アザアデニン、又は６−メチルプリン、又は２，６−ジアミノプリン、又は６−メルカプトプリン、又は８−アザグアニン、又はイノシンを含有する最小培地中で増殖する株として選択することができる（下記を参照）。
【００６７】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つ又はそれ以上の遺伝子発現を増強することによりさらに改良することができる。このような遺伝子としては、Ｅ．コリのｐｕｒレギュロンが挙げられる(Esherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996)。ＡＤＰ及びＧＭＰによるフィードバック阻害が解除されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異ｐｕｒＦ遺伝子及びプリンヌクレオチド生合成系におけるリプレッサーをコードする不活性化ｐｕｒＲ遺伝子を有するイノシン生産性Ｅ．コリ株が記載されている（ＷＯ９９／０３９８８号）。
【００６８】
ＩＩＩ．プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、プリンヌクレオシドを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにプリンヌクレオシドを培地から回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、イノシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにイノシンを培地から回収する工程を含む、イノシンの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにキサントシンを培地から回収する工程を含む、キサントシンの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、グアノシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにグアノシンを培地から回収する工程を含む、グアノシンの製造方法を包含する。
【００６９】
本発明では、培養、培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、プリンヌクレオシドが微生物を使用して生産される従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。プリンヌクレオシド生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要であれば他の有機成分を含有する典型的な培地であり得る。炭素源としては、グルコース、ラクトース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース及びデンプンの加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトール及びソルビトールなどのアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸及びコハク酸などの有機酸等が使用できる。
【００７０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１などのビタミン類、アデニン及びＲＮＡなどの核酸である必要物質又は酵母抽出物等が、微量有機栄養分として適切な量で含有されることが望ましい。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム
、鉄イオン、マンガンイオン等を添加してもよい。
【００７１】
培養は、好ましくは好気性条件下で１６〜７２時間実施され、培養中の培養温度は、３０〜４５℃に、またｐＨは、５〜８に制御される。ｐＨは、無機酸若しくは有機酸又はアルカリ性物質並びにアンモニアガスを使用することにより調節することができる。
【００７２】
培養後、細胞などの固形分は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて、標的プリンヌクレオシドは、イオン交換樹脂及び沈殿などの従来の方法の組合せのいずれかにより、発酵液から回収することができる。
【００７３】
４．プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、所望のプリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオシドに対応するプリンヌクレオチドを生成する工程、細菌によりプリンヌクレオチドを上記培地へ分泌させる工程、及びプリンヌクレオチドを回収する工程を含む、プリンヌクレオチドの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、イノシンをリン酸化して５’−イノシン酸を生成する工程、細菌により５’−イノシン酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−イノシン酸を回収する工程を含む、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成する工程、細菌により５’−キサンチル酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−キサンチル酸を回収する工程を含む、５’−キサンチル酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、グアノシンをリン酸化して５’−グアニル酸を生成する工程、細菌により５’−グアニル酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−グアニル酸を回収する工程を含む、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。また、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成する工程、細菌により５’−キサンチル酸を上記培地へ分泌させる工程、５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成する工程、及び５’−グアニル酸を回収する工程を含む、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。
【００７４】
本発明では、培養、培地からのイノシンの回収及び精製等は、イノシンを微生物を使用して製造する従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。さらに、本発明では、イノシンをリン酸化する工程、細菌により培地へ分泌させる工程、及び５’−イノシン酸を回収する工程は、５’−イノシン酸のようなプリンヌクレオチドをイノシンなどのプリンヌクレオシドから製造する従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。
【００７５】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々のホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ又はヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に、或いはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を使用して化学的に実施することができる。ピロリン酸塩のホスホリル基のヌクレオシドへのＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能であるホスファターゼ（Mihara ら、 「モルガネラ・モルガニイ由来の変異酸ホスファターゼによるヌクレオシドのリン酸化」、Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816 (2000))又はリン酸供与体としてポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）又はカルバミルリン酸（塩）を利用する酸ホスファターゼ（ＷＯ９６／３７６０３Ａ１号）等を使用することができる。また、ホスファターゼの例として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩(Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964))、無機リン酸（特公昭又は特開昭第４２−１１８６号）又はアセチルリン酸塩（特公昭又は特開昭第６１−４１５５５号）を利用してヌクレオシドのＣ−２’、３’又は５’位へホスホリル基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等が使用することができる。ヌクレオシドキナーゼの例として、Ｅ．コリ由来
のグアノシン／イノシンキナーゼ等を使用することができる（Mori, H. ら、「エシェリヒア・コリのグアノシン−イノシンキナーゼ遺伝子のクローニング及び精製遺伝子産物の特徴付け」、J, Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995)；ＷＯ９１／０８２８６号）。ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hammer-Jespersen, K.（Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen(ed.)、 「微生物におけるヌクレオチド、ヌクレオシド及び核酸塩基の代謝」、 1980, Academic Press, New York)に記載のヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用することができる。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3などのリン酸化剤を使用して実施することができる（Yoshikawa, K. 他、「リン酸化の研究．ＩＩＩ．保護されていないヌクレオシドの選択的リン酸化」、Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969))。
【００７６】
５’−キサンチル酸のアミノ化は、例えば、Ｅ．コリ由来のＧＭＰシンテターゼを使用して酵素的に実施することができる。（Fujioら、「エシェリヒア・コリにおけるＸＭＰアミナーゼの高レベルの発現及び５’−グアニル酸の工業生産のためのその適用」、 Biosci, Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845；ＥＰ０２５１４８９Ｂ１号）。
【実施例】
【００７７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、以下でより具体的に説明する。
【００７８】
実施例１．バチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子のクローニング
バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株の全長塩基配列は決定されている(Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997))。報告された塩基配列に基づいて、プライマーｙｄｈＬ＿Ｎ（配列番号５）及びｙｄｈＬ＿Ｃ（配列番号６）を合成して、ＰＣＲによってバチルス・ズブチリス１６８株由来のｙｄｈＬ遺伝子を増幅するために使用した。プライマーｙｄｈＬ＿Ｎは、ｙｄｈＬ遺伝子の開始コドンの４８９〜４６７ｂｐ上流の配列に一致しており、その５’末端に制限酵素ＳａｌＩ認識部位が導入されている。プライマーｙｄｈＬ＿Ｃは、ｙｄｈＬ遺伝子の終結コドンの５８〜８０ｂｐ下流の配列に相補的であり、その５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位が導入されている。
【００７９】
バチルス・ズブチリス１６８株の染色体ＤＮＡは、常法により調製された。ＰＣＲは、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００」で、ＰｆｕＩポリメラーゼ(Fermentas)を用いて、以下の条件下で実施した：９４℃で３０秒、６１℃で４５秒、７２℃で３分を２５サイクル。ｙｄｈＬ遺伝子およびそのプロモーターを含有する得られたＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩで処理して、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で予め処理した低コピー数ベクターｐＭＷ１１８に挿入した。このようにして、プラスミドｐＹＤＨＬ１が得られた。
【００８０】
ｐＹＤＨＬ１プラスミド及びベクターを使用して、標準的な方法によりＥ．コリＴＧ１株(Amersham Pharmacia Biotech)を形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬブロス寒天プレート上で選択した。このようにして、Ｅ．コリＴＧ１（ｐＹＤＨＬ１）及びＴＧ１（ｐＭＷ１１８）株が得られた。続いて、これらの株のプリン塩基類似体の存在下での増殖能を、段階的濃度の阻害剤を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート上で決定した。プレートに、最小培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した）中で一晩増殖させた培養液からの１０5〜１０6個の細胞をスポットした。増殖は、３７℃で４４時間のインキュベーション後に評価した。
【００８１】
結果を表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
表１からわかるように、ｙｄｈＬ遺伝子増幅は、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び８−アザアデニンに対する細菌の耐性を増大させた。
【００８４】
また、ｐＹＤＨＬ１プラスミド及びｐＭＷ１１８ベクターによって、Ｅ．コリＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株を形質転換した。Ｅ．コリＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株は、イノシン及びグアノシンに対する耐性を調べるために使用される特別に構築された親株である。この株は、プリン分解能に起因してイノシン及びグアノシンに対して耐性である既知のＴＧ１株（ＶＫＰＭ Ｂ−５３５７）へのファージＰ１媒介性形質導入を使用した、ＷＯ９９／０３９８８号に記載されるｄｅｏＤ変異及びPetersen C.(J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999)により記載されるｇｓｋ３変異の連続的な導入により得られた。ＴＧ１
ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株は、ｄｅｏＤ変異に起因してグアノシンおよびイノシンを分解できず（ＷＯ９９／０３９８８）、ｇｓｋ３変異に起因してヌクレオシドに感受性である(Petersen C.J. Biol. Chem., 274, 5348-5356,1999)。このようにして、ＴＧ１ ｄｅｏＤ
ｇｓｋ３（ｐＹＤＨＬ１）株及びＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３（ｐＭＷ１１８）株が得られた。続いて、これらの株のイノシン及びグアノシンの存在下での増殖能を上述のように決定した。
【００８５】
結果を表２に示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】
表２の結果より、ｙｄｈＬ遺伝子の過剰発現が、イノシンに対する高レベルの耐性及びグアノシンに対する低レベルの耐性を付与したことがわかる。したがって、ｙｄｈＬ遺伝子は、プリンヌクレオシドの分泌に、より具体的にはイノシンの分泌に関与すると予測することができる。
【００８８】
実施例２．バチルス・アミロリケファシエンスのｙｄｈＬ遺伝子のクローニング
実施例１で示したデータは、バチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子（以降、ｙｄｈＬBs）の過剰発現が、Ｍ９グルコース最小寒天へ同時に導入される場合に、２，６−ジアミ
ノプリン及び６−メルカプトプリンに対する耐性を細胞に付与したことを示す（表１）。この事実に基づいて、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬBs遺伝子のオーソログ（以降、ｙｄｈＬBa）のクローニングを実施した。Ｂ．アミロリケファシエンスＢＡ１（ＩＡＭ１５２３）株の染色体ＤＮＡは、常法により調製された。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、同じ酵素で予め処理したｐＭＷ１１８ベクターと連結させた。得られたＤＮＡを使用して、Ｅ．コリＴＧ１株を形質転換した。形質転換体は、４００μｇ／ｍｌの２，６−ジアミノプリン、４００μｇ／ｍｌの６−メルカプトプリン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する最小寒天上で選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離して分析した。この中から、約１．６ｋｂの最小挿入ＤＮＡフラグメントを含有するハイブリッドプラスミドｐＹＤＨＬ２を選択した。ｙｄｈＬBs遺伝子と対比して、それは、ＥｃｏＲＩ部位を含有しなかった。挿入フラグメントは、ユニバーサルプライマーにより配列決定し、ｙｄｈＬBs遺伝子と高い相同性（９０％を上回る）を有することがわかった（図１）。Ｂ．アミロリケファシエンス由来の新たな遺伝子をｙｄｈＬ遺伝子と称した（以降、ｙｄｈＬBa遺伝子とも呼ぶ）。ＴＧ１及びＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株へ導入される場合、ｐＹＤＨＬ２プラスミドは、ｐＹＤＨＬ１プラスミドと同様、それぞれプリン塩基類似体及びヌクレオシドに対する耐性を細胞に付与した。ｐＹＤＨＬ２プラスミドは確かにｙｄｈＬBa遺伝子を含有すると結論付けた。
【００８９】
実施例３．Ｅ．コリ イノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBs及びｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
イノシン生産Ｅ．コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）株をそれぞれ、ｐＭＷ１８ベクター、ＹＤＨＬ１及びｐＹＤＨＬ２プラスミドで形質転換した。形質転換体は、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬ寒天上で選択した。このようにして、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＭＷ１８）株、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＹＤＨＬ１）株及びＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＹＤＨＬ２）株が得られた。これらの株はそれぞれ、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬ−ブロス中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌ中に接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【００９０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【００９１】
グルコース及び硫酸マグネシウムは、個々に滅菌した。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌した。ｐＨは、７．０に調節した。抗生物質は、滅菌後に培地へ導入した。
【００９２】
培養後、培地中に蓄積したイノシンの量をＨＰＬＣにより定量した。培地のサンプル（５００μｌ）を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清をＨ2Ｏで４倍に希釈して、ＨＰＬＣで分析した。
【００９３】
ＨＰＬＣ分析に関する条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ(Phennomenex, USA)。緩衝液：
２％ｖ／ｖＣ2Ｈ5ＯＨ；０．８％ｖ／ｖトリエチルアミン；０．５％ｖ／ｖ酢酸（氷酢酸）；ｐＨ ４．５。温度：３０℃。流速：０．３ｍｌ／分。注入容量：５μｌ。検出：ＵＮ ２５０ｎｍ。
【００９４】
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
ヒポキサンチン ５．２
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００９５】
結果を表３に示す。
【００９６】
【表３】
【００９７】
表３からわかるように、ｙｄｈＬBs及びｙｄｈＬBa遺伝子の過剰発現は、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱＡｐ）株のイノシン生産性を改善した。
【００９８】
実施例４．低コピー数シャトルベクターｐＭＷＭＸ１へのｙｄｈＬBsのクローニング
それ自身のプロモーターの制御下でｙｄｈＬBs遺伝子を含有するＰＣＲフラグメント（実施例１で得られた）をＢｇｌＩ及びＳａｌＩで処理して、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で予め処理した低コピー数シャトルベクターｐＭＷＭＸ１へ挿入した。このようにして、プラスミドｐＹＤＨＬ３が得られた。ｐＭＷＭＸ１ベクター（図２）は、２つの低コピー数プラスミド：ｐＭＷ１１８及びｐＭＸ３０の誘導体である。ここで、ｐＭＸ３０プラスミド(Rabinovich et al., Mol. Biol (Moscow), 18, 189-196, 1984)は、ｉｎｃ１８ファミリーの宿主広範囲プラスミドであるｐＳＭ１９０３５の欠失誘導体である(Brantl et al., Nucleic Acids Res., 18, 4783-4790)。ｐＭＷ１１８及びｐＭＷＸ３０プラスミドそれぞれを、ＥｃｏＲＩで切断して、連結させた。このようにして、ベクターｐＭＷＭＸ１が得られた。
【００９９】
実施例５．ｙｄｈＬBa遺伝子を含有する低コピー数シャトルプラスミドｐＹＤＨＬ３の構築
ｐＹＤＨＬ２プラスミドをＥｃｏＲＩで部分的に切断して、単一フラグメントを得て、同じ酵素で切断したｐＭＸ３０と連結させた。このようにして、ｙｄｈＬBa遺伝子を含有するシャトルプラスミドｐＹＤＨＬ４が得られた。したがって、ｐＹＤＨＬ４プラスミドは、ｙｄｈＬBsを含有するｐＭＷＭＸ１ベクターのｙｄｈＬBa遺伝子との置換を除いて、ｐＹＤＨＬ３プラスミドと同等である。
【０１００】
実施例６．プリン塩基類似体に対するバチルス・ズブチリス１６８株の耐性に対するｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
ｐＹＤＨＬ３、ｐＹＤＨＬ４プラスミド及びｐＭＷＭＸ１ベクターを使用して、標準的な方法により野生型バチルス・ズブチリス１６８株を形質転換した。形質転換体は、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを有するＬブロス寒天プレート上で選択した。このようにして、バチルス・ズブチリス１６８（ｐＭＷＭＸ１）株、バチルス・ズブチリス１６８（ｐＹＤＨＬ３）株及びバチルス・ズブチリス１６８（ｐＹＤＨＬ４）株が得られた。続い
て、これらの株のプリン塩基類似体の存在下での増殖能を、段階的な濃度のプリン類似体を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート（最小培地Ｍ９、グルコース−２％、ビタミンアッセイカザミノ酸(Difco)−０．１％、トリプトファン−１００μｇ／ｍｌ）上で決定した。プレートに、類似体なしの寒天プレート上で一晩増殖させた培養液からの１０5〜１０6個の細胞をスポットした。増殖は、３４℃で４８時間のインキュベーション後に評価した。
【０１０１】
結果を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４からわかるように、ｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子の増幅は、８−アザグアニン、６−メチルプリン及び８−アザアデニンに対する細菌の耐性を増大した。
【０１０４】
実施例７：バチルス・ズブチリスイノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
イノシン生産バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株をｐＭＷＭＸ１ベクター、ｐＹＤＨＬ３又はｐＹＤＨＬ４プラスミドで形質転換した。このようにして、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＭＷＭＸ１）株、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＹＤＨＬ３）株及びバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＹＤＨＬ４）株が得られた。これらの株はそれぞれ、１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを有するＬブロス中で３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含有するバチルス属発酵培地３ｍｌへ接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【０１０５】
発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ ＴＮ（総窒素）の１．３５
（ダイズ加水分解物）
ＤＬ−メチオニン ０．３
ＮＨ4Ｃｌ ３２．０
アデニン ０．１
トリプトファン ０．０２
ＣａＣＯ3 ５０．０
【０１０６】
培養後、培地中に蓄積したイノシンの量を、上述のようにＨＰＬＣで定量した。結果を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５からわかるように、ｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子のいずれかの増幅が、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株のイノシン生産性を改善した。
【０１０９】
実施例８：Ｂ．アミロリケファシエンスｙｄｈＬ遺伝子の調節領域の改変
バチルス・ズブチリスｙｄｈＬ調節領域の改変、すなわち５’非翻訳ＲＮＡ領域のＧボックスにおける改変は、遺伝子の発現を増大させ得ることが既知である(Mandal, M. and Breaker, R.R., Nat. Struct. Mol. Biol., 11(1), 29-35 (2004))。したがって、ｙｄｈＬ遺伝子発現レベルを増強するために、同変異（ＣによるＴの置換）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発(Stratagene)を使用して、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子の調節領域（遺伝子の開始点の位置「−７７」）に導入した。その目的で、２つのプライマー１及び２（それぞれ、配列番号７及び８）を、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子の調節領域のＤＮＡ配列に基づいて設計した。ＤＮＡプラスミドｐＹＤＨＬ２（ｐＭＷ１１８−ｙｄｈＬBA）を鋳型として使用した。全プラスミドを上述のプライマーで増幅して、ｙｄｈＬ遺伝子を含有する幾つかのプラスミドが得られた。これらのプラスミドは、プライマー３（配列番号９）を使用して配列決定し、所望のＴからＣへの置換の存在が確認された。調節領域への変異を有するＢ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子を含有する新たなｐＭＷ１１８誘導体プラスミドをｐＹＤＨＬ５とした。ｐＹＤＨＬ５プラスミドは、ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断することにより直鎖化して、同じ制限酵素で予め直鎖化したｐＭＸ３０と連結させた。このようにして、発現レベルを増強する変異を有するｙｄｈＬBa遺伝子を含有するシャトルプラスミドｐＹＤＨＬ６が得られた。
【０１１０】
実施例９．Ｂ．アミロリケファシエンスイノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBa遺伝子の発現増強の影響
ｐＹＤＨＬ６プラスミド及びｐＭＷＭＸ１シャトルベクターをそれぞれ、既知の方法によりバチルス・ズブチリス１６８株へ形質転換した(Spizizen, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072-1078 (1958))。得られたバチルス・ズブチリス（ｐＹＤＨＬ６）株及びバチルス・ズブチリス（ｐＭＷＭＸ１）株を、ファージＥ４０媒介性形質導入におけるドナーとして使用して、ｐＹＤＨＬ６及びｐＭＷＭＸ１プラスミドを、イノシン及びグアノシンを生産するバチルス・ズブチリスＧ１１３６Ａ株（ＡＪ１９９１、ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４、ＡＴＣＣ１９２２２）（米国特許第３，５７５，８０９号）へ導入した。バチルス・ズブチリスＧ１１３６Ａ株は、All-Russian National Collection of Industrial Microorganisms（ＶＫＰＭ）(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)により、バチルス・アミロリケファシエンスとして再同定されており、アクセッション番号（Ｖ
ＫＰＭ Ｂ−８９９４）の下で寄託されている。したがって、この株はこれ以降、バチルス・アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａと称する。ファージＥ４０は、バチルス・ズブチリス及びＢ．アミロリケファシエンス細胞上で増殖することが可能なＰＢＳ１様ファージ(Takanishi, R., J. Gen. Microbiol., 31, 211-217, (1963))である。形質導入後、Ｂ．アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａ（ｐＭＷＭＸ１）株及びＢ．アミロファシエンスＧ１１３６Ａ（ｐＹＤＨＬ６）株が得られた。
【０１１１】
これらの株はそれぞれ、１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを有するＬブロス中で３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含有するバチルス属発酵培地３ｍｌへ接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【０１１２】
発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
ＮＨ4Ｃｌ １５．０
アデニン ０．３
総窒素（Ｍａｍｅｎｏ形態で） ０．８
ＣａＣＯ3 ２５．０
【０１１３】
培養後、培地中に蓄積したイノシン及びグアノシンの量を、上述のようにＨＰＬＣにより定量した。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
表６からわかるように、調節性変異に起因するｙｄｈＬBa遺伝子の発現の増強は、Ｂ．アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａ株のイノシン生産性を改善した。
【０１１６】
本発明は、それらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また等価体を用いることができることは、当業者に明らかであろう。上述の文書はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ｐＹＤＨＬ４プラスミド中に含有されるＤＮＡフラグメントによりコードされるＢ．アミロリケファシエンスＹｄｈＬタンパク質（ＹＤＨＬ＿ＢＡ、配列番号２）及びｐＹＤＨＬ１プラスミド中に含有されるＤＮＡフラグメントによりコードされるバチルス・ズブチリスＹｄｈＬタンパク質（ＹＤＨＬ＿ＢＳ、配列番号４）のアラインメントを示す図である。記号「＊」は、ＹＤＨＬ＿ＢＡとＹＤＨＬ＿ＢＳとの間の共通アミノ酸を意味する。記号「：」は、ＹＤＨＬ＿ＢＡとＹＤＨＬ＿ＢＳとの間の類似アミノ酸を意味する。
【図２】ｐＭＷＭＸ１プラスミドの構造を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸及び５’−グアニル酸の合成における原料として重要であるプリンヌクレオシドの製造方法に関する。本発明はまた、この製造方法で使用される新規微生物に関する。本発明はまた、該ＤＮＡを発現する細菌へ、プリン塩基類似体及びプリンヌクレオシドに対する耐性を付与する新規ＤＮＡ並びにタンパク質種に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イノシンのようなヌクレオシドは、アデニン栄養要求株、又は、プリン類似体及びスルファグアニジンのような様々な薬物に対する薬物耐性を付与された株を利用する発酵方法により工業的に生産されている。このような株の例としては、バチルス属（特公昭第５４−１７０３３号（１９７９年）、同第５５−２９５６号（１９８０年）及び同第５５−４５１９９号（１９８０年）、特開昭第５６−１６２９９８号（１９８１号）、特公昭第５７−１４１６０号（１９８２年）及び同第５７−４１９１５号（１９８２年）、並びに特開昭第５９−４２８９５号（１９８４年））、又はブレビバクテリウム属（特公昭第５１−５０７５号（１９７６年）及び同第５８−１７５９２号（１９７２年）、並びにAgric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)）、又はエシェリヒア属（ＷＯ９９／０３９８８号）等が挙げられる。
【０００３】
このような変異株の取得は通常、微生物を、例えば、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理のような変異誘発処理に供すること、及び適切な選択培地を介して所望の株を選択することを包含する。他方で、遺伝子工学技術を使用したこのような変異株の育種もまた、バチルス属（特開昭第５８−１５８１９７号（１９８３年）、同第５８−１７５４９３号（１９８３年）、同第５９−２８４７０号（１９８４年）、同第６０−１５６３８８号（１９８５年）、特開平第１−２７４７７号（１９８９年）、同第１−１７４３８５（１９８９年）、同第３−５８７８７号（１９９１年）、同第３−１６４１８５号（１９９１年）、同第５−８４０６７号（１９９３年）及び同第５−１９２１６４号（１９９３年））、又はブレビバクテリウム属（特開昭第６３−２４８３９４号（１９８８年））、又はエシェリヒア属（ＷＯ９９／０３９８８号）に属する株に関して実施されている。
【０００４】
これらのイノシン生産株の生産性は、イノシン分泌能を増大させることにより、さらに向上させることができる。現在では、細胞質細胞膜を介した代謝産物の通過は通常、特定の排出トランスポータータンパク質により媒介されることが一般的に認められている(Pao, S.S. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen, I.T. et al., J. Mol. Biol., 277, 573-592 (1998); Saier, M.H. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279 (1999))。本発明者らはこれまでに、エシェリヒア属又はバチルス属に属し、且つｒｈｔＡ（ｙｂｉＦ）遺伝子によりコードされるＲｈｔＡタンパク質の活性、ｙｉｊＥ遺伝子によりコードされるＹｉｊＥタンパク質の活性、及びｙｄｅＤ遺伝子によりコードされるＹｄｅＤタンパク質の活性が増強されたイノシン又はキサントシン生産株が、それらの各々の親株より多くのイノシン又はキサントシンを生産したことを示している（それぞれロシア国特許出願第２００２１０１６６６号、同第２００２１０４４６３号及び同第２００２１０４４６４号）。最近では、バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬが、プリン類似体である２−フルオロアデニンに対する感受性を低減させることが見出された。さらに、間接的な証拠により、ＹｄｈＬは、ヒポキサンチンの内部プールの量を減少させることが示されている(Johansen et al, J. Bacteriol., 185, 5200-5209, 2003)。しかしながら、ヌクレオシド分泌及び／又はヌクレオシド生産に対するＹｄｈＬ過
剰発現の影響は示されていない。
【０００５】
さらに、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬは全く報告されておらず、またヌクレオシド分泌及び／又はヌクレオシド生産に対するＹｄｈＬ過剰発現の影響も示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、イノシン生産株によるイノシンの生産を増強すること、並びにこれらの株を使用したイノシン及び５’−イノシン酸の製造方法を提供することである。
【０００７】
この目的は、多コピーベクター上に配置された遺伝子の野生型対立遺伝子が、E.coli株へ導入される場合に、８−アザアデニン、６−メチルプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、８−アザグアニンのようなプリン塩基類似体、並びにイノシン及びグアノシンのようなプリンヌクレオシドに対する耐性を付与する推定膜タンパク質をコードするバチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子を同定することにより達成された。また、バチルス・アミロリケファシエンス由来のこれまでに未知のｙｄｈＬ遺伝子が単離され、その塩基配列が決定された。さらに、バチルス・ズブチリス又はバチルス・アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子は、遺伝子のさらなるコピーが、バチルス属又はエシェリヒア属に属する各々のイノシン生産株の細胞へ導入されると、ヌクレオシド生産を増強することができることが確認された。このようにして、本発明は完成した。
【０００８】
したがって、本発明は、バチルス属又はエシェリヒア属に属し、且つイノシン生産能を有する微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、以下：
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、タンパク質の活性が細菌において増強されるときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質
から成る群から選択されるバチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬタンパク質を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、上述のようなタンパク質をコードするＤＮＡを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されるときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、上記ＤＮＡを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、上記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、プリン生産能を有し、かつ、
（Ａ）バチルス・アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬによりコードされるタンパク質、
（Ｂ）バチルス・ズブチリス由来のｙｄｈＬによりコードされるタンパク質、及び
（Ｃ）（Ａ）又は（Ｂ）における上記ｙｄｈＬ遺伝子のいずれかのオーソログによりコードされるタンパク質
から成る群から選択されるタンパク質の活性の増強を有する、
バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、プリンがイノシン又はグアノシンである、上記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、タンパク質の活性が、タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増大させること、或いは細菌の染色体上の上記ＤＮＡの発現調節配列の改変により増強される、上記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、低コピー数ベクターにより形質転換が実施される、上記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、上記プリンヌクレオシドを上記培地中へ分泌させること、及び上記プリンヌクレオシドを培地から回収することを含む、プリンヌクレオシドの製造方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、プリンヌクレオシドがイノシン、キサントシン又はグアノシンである、上記方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、細菌がプリンヌクレオシド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、上記方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、プリンヌクレオシドをリン酸化してプリンヌクレオチドを生成すること、プリンヌクレオチドを上記培地中へ分泌させること、及びプリンヌクレオチドを回収することを含む、プリンヌクレオチドの製造方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、プリンヌクレオチドが５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸である、上記方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、細菌がプリンヌクレオチド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、上記方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、培地中で請求項５に記載の細菌を培養すること、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成すること、５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成すること、及び５’−グアニル酸を回収することを含む、５’−グアニル酸の製造方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
［好ましい実施形態の説明］
１．本発明のタンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、
置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体又はイノシン及びグアノシンのようなプリンヌクレオシドに対して耐性にする活性を有するタンパク質を包含する。
【００２５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＹｄｈＬタンパク質である。このタンパク質のアミノ酸配列及びｙｄｈＬ遺伝子の塩基配列は、本開示までは知られていなかった。
【００２６】
バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬタンパク質は、プリンヌクレオチドの生合成経路に関与せず、ＭＦＳ(Major Facilitator Surperfamily)(Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1):1-32, (1998))及びオーソロガスな基のアラビノース排出パーミアーゼクラスター（ＣＯＧ）２８１４(Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29:22-28 (2001))に属する。このファミリーに属するＥ．コリ タンパク質であるＡｒａＪ及びＹｄｅＡもまた、アラビノース輸送に関与している(Bost, S. et al, J. Bacteriol., 181:2185-2191 (1999))。バチルス・ズブチリスのゲノムは、ｙｄｈＬ遺伝子のホモログをコードする別の５個の遺伝子：ｙｂｃＬ、ｙｃｅＪ、ｙｆｈＩ、ｙｔｂＤ、ｙｗｆＡを含有する。バチルス・ズブチリスのＹｄｈＬタンパク質は、３８８個のアミノ酸から構成される高度に疎水的なタンパク質であり、未知の機能を有する１２個の推定膜貫通セグメントを含有する。ＹｄｈＬタンパク質は、ｙｄｈＬ遺伝子によりコードされる。バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株のｙｄｈＬ遺伝子（GenBankアクセッション番号ＣＡＢ１２３９９．２；ＧＩ：３２４６８７０５中の番号６２４６７５〜６２５８３８）は、染色体上でｙｄｈＫとｙｄｈＭ遺伝子との間で５３．５０°に位置する。
【００２７】
本発明のタンパク質において変更することができる「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置及び／又は種類に応じて異なる。数個のアミノ酸の数は、配列番号２又は４に示されるタンパク質に関して２〜４０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜５個であり得る。これは、数個のアミノ酸が互いに高度に相同であるという事実に起因しており、したがって、三次元構造又は活性は、このような変化により影響を受けない。したがって、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を包含するアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＹｄｈＬタンパク質の全長アミノ酸配列に関して少なくとも３０〜５０％、好ましくは５０〜７０％、最も好ましくは７０〜９０％の相同性を有し、またタンパク質の活性を保持するものでもよい。
【００２８】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有し、且つＹｄｈＬタンパク質の活性を保持するタンパク質は、本発明により包含され、最も好ましい。
【００２９】
相同性の度合いを評価するためには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索及びＣｒｕｓｔａｌＷのような幾つかの既知の算出方法を使用することができる。
【００３０】
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより使用される帰納的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、それらの所見に有意性を付与する（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68 (1990)、「分子配列における多数の高スコアリングセグメントに関する用途及び統計学」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-7 (1993)）。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより
記載されている（「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡによる迅速且つ高感度配列比較」, Methods in Enzymology, 183:63-98 (1990)）。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及び重みマトリックス選択による進行性多数配列アラインメントの感度の改善」, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)）。
【００３１】
上述のような本発明のタンパク質における変更は、通常、タンパク質の活性を維持するような保存的な変更である。置換変更は、アミノ酸配列において少なくとも一つの残基が取り除かれ、その位置に異なる残基が挿入されたものが挙げられる。上記のタンパク質において本来のアミノ酸と置換され、且つ保存的な置換として見なされるアミノ酸として、アラニンのセリン又はスレオニンへの置換；アルギニンのグルタミン、ヒスチジン又はリシンへの置換；アスパラギンのグルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒスチジン又はアスパラギン酸への置換；アスパラギン酸のアスパラギン、グルタミン酸又はグルタミンへの置換；システインのセリン又はアラニンへの置換；グルタミンのアスパラギン、グルタミン酸、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はアルギニンへの置換；グルタミン酸のアスパラギン、グルタミン、リシン又はアスパラギン酸への置換；グリシンのプロリンへの置換；ヒスチジンのアスパラギン、リシン、グルタミン、アルギニン又はチロシンへの置換；イソロイシンのロイシン、メチオニン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；ロイシンのイソロイシン、メチオニン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；リシンのアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン又はアルギニンへの置換；メチオニンのイソロイシン、ロイシン、バリン又はフェニルアラニンへの置換；フェニルアラニンのトリプトファン、チロシン、メチオニン、イソロイシン又はロイシンへの置換；セリンのスレオニン又はアラニンへの置換；スレオニンのセリン又はアラニンへの置換；トリプトファンのフェニルアラニン又はチロシンへの置換；チロシンのヒスチジン、フェニルアラニン又はトリプトファンへの置換；及びバリンのメチオニン、イソロイシン又はロイシンへの置換が挙げられる。
【００３２】
本発明のタンパク質に関する「活性」は、該タンパク質を保有する細菌を、８−アザアデニン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニンのようなプリン塩基類似体に対して耐性、及び／又はイノシン及びグアノシンのようなヌクレオシドに対して耐性にする活性を意味する。
【００３３】
「プリン塩基類似体及び／又はプリンヌクレオシドに対して耐性」という語句は、野生型又は親株が類似の条件下では増殖することができない濃度で、８−アザアデニン、６−メチルプリン、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン、８−アザグアニンのようなプリン塩基類似体、又はイノシン若しくはグアノシンのようなプリンヌクレオシドを含有する最小培地上で増殖すること、或いは細菌の野生型若しくは親株よりも迅速に、プリン類似体又はプリンヌクレオシドを含有する培地上で増殖することを意味する。プリン塩基類似体の上述の濃度は、８−アザアデニンに関しては３００μｇ／ｍｌであり、２，６−ジアミノプリンの場合では４００μｇ／ｍｌであり、６−メルカプトプリンに関しては４００μｇ／ｍｌであり、プリン塩基ヌクレオシドに関して、上述の濃度は、イノシンに関しては３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１，０００μｇ／ｍｌであり、グアノシンに関しては１０μｇ／ｍｌである。
【００３４】
ＩＩ．本発明の細菌
本発明の細菌は、タンパク質の活性を増大させることにより、プリンヌクレオシド生産が増強された細菌である。より具体的には、本発明の細菌は、細菌において本発明のタンパク質の活性を増大させることにより、プリンヌクレオシド生産が増強された細菌である。さらに具体的には、本発明の細菌は、細菌内の染色体又はプラスミド上に、ｙｄｈＬ遺伝子又はそのオーソログのＤＮＡを保有する。ｙｄｈＬ遺伝子又はそのオーソログのＤＮ
Ａは過剰発現されて、結果として、細菌はより大量のプリンヌクレオシドを生産する能力を有する。
【００３５】
ｙｄｈＬ遺伝子発現の増強は、ノーザンハイブリダイゼーション又はＲＴ−ＰＣＲ(Molecular cloning: Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)により本発明の細菌におけるｙｄｈＬ遺伝子発現によるＲＮＡの量を測定すること、及びそれを野生型又は非改変株の量と比較することにより確認することができる。本発明の微生物におけるｙｄｈＬ遺伝子の発現は、野生型又は非改変株の発現よりも多く、好ましくは野生型又は非改変株の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍増強される。
【００３６】
本発明の細菌は、バチルス属又はエシェリヒア属のいずれかの属に属する細菌である。本発明で使用することができるエシェリヒア属に属する微生物の例は、エシェリヒア・コリ（Ｅ．コリ）である。本発明で使用することがバチルス属に属する微生物の例としては、バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株（B. subtilis １６８）又はバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．アミロリケファシエンス）が挙げられる。
【００３７】
バチルス属に属する細菌として、バチルス・リキニホルミス、バチルス・プミルス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ブレビス、バチルス・ポリミクサ、バチルス・ステアロサーモフィラスが挙げられる。
【００３８】
エシェリヒア・コリのような、Neidhardtら(Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)により報告されたエシェリヒア属に属する細菌が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株として、Ｋ１２株及びその派生株、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ番号４７０７６）及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ番号２７３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。それらの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, United States of America)から入手可能である。
【００３９】
すでに言及した特性のほかに、本発明の細菌は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な栄養要求性、薬物耐性、薬物感受性及び薬物依存性のような他の特性を有してもよい。
【００４０】
「プリンヌクレオシド」という語句は、本明細書中で使用する場合、イノシン、キサントシン、グアノシン及びアデノシンを包含し、好ましくはイノシンを包含する。
【００４１】
「プリンヌクレオシド生産能」という語句は、本明細書中で使用する場合、培地中でプリンヌクレオシドを生産して、その蓄積をもたらす能力を意味する。「プリン生産能を有する」という語句は、エシェリヒア属又はバチルス属に属する微生物が、Ｅ．コリＷ３１１０及びＭＧ１６５５株のようなＥ．コリの野生株、或いはバチルス・ズブチリス１６８のようなバチルス・ズブチリスの野生株よりも大量に、培地中でプリンヌクレオシドなどのプリンを生産して、その蓄積をもたらすことが可能であることを意味する。好ましくは、この語句は、微生物が、少なくとも１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｇ／ｌの量のイノシン、キサントシン、グアノシン又は／及びアデノシンを培地中で生産して、その蓄積をもたらすことが可能であることを意味する。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、本発明のタンパク質の活性が細菌中で増強される場合、これは、細胞中のタンパク質の分子の量が増大されること、或いはタンパク質分子１個当た
りの活性が増大されることを意味する。
【００４３】
「オーソロガス遺伝子」又は「オーソログ」という用語は、共通祖先種を介して関連している別の種における遺伝子（相同遺伝子）に相当するが、他の種の遺伝子と異なるように進化したある種由来の遺伝子を意味する。オーソロガス遺伝子は、同じ機能を有してもよく、或いは同じ機能を有さなくてもよい。生物体の完全ゲノムが配列決定される場合、以下の方法を用いて、オーソログを検索することができる。ＢＬＡＳＴ検索は、ある生物体由来の遺伝子を用いて実施され、他の生物体における最良のホモログを見つけ出す。次いで、第２の逆行ＢＬＡＳＴ検索は、ＢＬＡＳＴ検索の第１ラウンドで見出された他の生物体由来の最良のホモログを使用して実施され、第１の生物体における最良のホモログ又はオーソログを見つけ出す。第１ラウンドで使用される遺伝子及び第２ラウンドの結果で見出された遺伝子が一致する場合、第１の生物体由来の遺伝子及び他の生物体における最良のホモログは、オーソログである。ＢＬＡＳＴ検索のプロセスにおいて、対象の遺伝子によりコードされるタンパク質の相同性が決定される。
【００４４】
本発明の目的で、オーソロガス遺伝子によりコードされるタンパク質は、同じ活性を有する相同タンパク質である。このようなオーソログに関する検索は、遺伝子及びタンパク質の配列、並びにタンパク質の活性を測定することにより実施される（例えば、図１及び実施例２を参照）。
【００４５】
バチルス・アミロリケファシエンスのＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子であるｙｄｈＬ遺伝子は、本発明の発明者等により配列決定されている（配列番号１）。バチルス・ズブチリス由来のＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子であるバチルス・ズブチリス
サブスピーシーズ ズブチリス１６８株のｙｄｈＬ遺伝子は同定されている（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｚ９９１０７中の番号１３０４２〜１４２０８）（配列番号３）。バチルス・ズブチリス由来のｙｄｈＬ遺伝子は、染色体上でｙｄｈＫとｙｄｈＭ遺伝子との間で５３．５０°に位置する。したがって、上記ｙｄｈＬ遺伝子は、遺伝子の塩基配列に基づいて調製されるプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J.,
et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。他の微生物由来のＹｄｈＬタンパク質をコードする遺伝子は、類似の方法で得ることができる（実施例２を参照）。
【００４６】
バチルス・アミロリケファシエンスに由来するｙｄｈＬ遺伝子はまた、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を有し、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンに対して耐性にする活性を有するタンパク質などの本発明のタンパク質をコードするＤＮＡにより例示することができ、そのタンパク質の活性は、細菌中で増強される。
【００４７】
バチルス・ズブチリスに由来するｙｄｈＬ遺伝子は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を有し、且つバチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を、プリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンに対して耐性にする活性を有するタンパク質を含む本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。
【００４８】
上述のＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、特定の部位で１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加されるように、例えば部位特異的変異誘発を用いて、ＹｄｈＬタンパク質をコードするＤＮＡの塩基
配列を改変することにより得ることができる。上述のように改変されるＤＮＡは、従来既知の変異処理により得ることができる。このような処理としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミン処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸などの試薬によるＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００４９】
バチルス・アミロリケファシエンスに由来するＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、適切な細胞において上述のような変異を有するＤＮＡを発現させ、任意の発現した生成物の活性を調べることにより得ることができる。ＹｄｈＬタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡはまた、ＹｄｈＬタンパク質をコードする変異ＤＮＡから、或いは、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含有する塩基配列を有するプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、且つＹｄｈＬタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする変異体を保有する細胞から、ＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。任意の数値を使用することでこの条件を明確に表すことは困難である。しかしながら、例えば、ストリンジェントな条件としては、高度に相同なＤＮＡ、例えば、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが可能であるが、上記未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズすることが不可能である条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件は、ＤＮＡが、サザンハイブリダイゼーションにおける典型的な洗浄条件に等しい塩濃度、すなわち６０℃でおよそ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、ハイブリダイズすることが可能である条件により例示することができる。洗浄の持続期間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般に製造業者により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件下での、Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）の洗浄の推奨持続期間は、１５分である。好ましくは、洗浄は、２〜３回実施することができる。
【００５０】
配列番号１の塩基配列の部分配列はまた、プローブとして使用することができる。プローブは、配列番号１の塩基配列に基づいたプライマー、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製することができる。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、洗浄に関するハイブリッド形成条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳであり得る。
【００５１】
上記のすべてが、バチルス・ズブチリスに由来するＹｄｈＬタンパク質に適用可能である。
【００５２】
本発明のタンパク質の活性を増強するための方法、特に細菌細胞におけるタンパク質分子の数を増大させるための方法としては、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を変更させること、及び遺伝子のコピー数を増大させることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現調節配列を改変することは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを強力なプロモーターの制御下に置くことにより達成できる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ラムダファージのＰLプロモーターはすべて、Ｅ．コリに対する既知の強力なプロモーターである。特に、ｖｅｇプロモーター、ｓｐａｃプロモーター、ｘｙｌＥプロモーターは、バチルス属にとって強力なプロモーターとして既知である。あるいは、プロモーターの活性は、例えばプロモーターの下流にある遺伝子の転写レベルを増大させるようにプロモーターへ変
異を導入することにより増強することができる（ＷＯ００／１８９３５号）。さらに、ｍＲＮＡ翻訳能は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサーへ変異を導入することにより増強することができる。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの種類に応じて、発現レベルにおける２０倍の範囲が見出された(Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984)。
【００５４】
さらに、遺伝子の転写レベルを増大させるために、エンハンサーを新たに導入してもよい。遺伝子又はプロモーターのいずれかを含有するＤＮＡの染色体ＤＮＡへの導入は、例えば、特開平第１−２１５２８０号（１９８９年）に記載されている。
【００５５】
あるいは、遺伝子のコピー数は、多コピーベクターへ遺伝子を挿入して、組換えＤＮＡを形成すること、続いて微生物へ組換えＤＮＡを導入することにより増大させることができる。エシェリヒア・コリで自己複製可能なベクターの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ及びｐＡＣＹＣは、Takara Bioから入手可能である）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷは、Nippon Geneから入手可能である）等が挙げられる。バチルス属細菌で自己複製可能であるベクターの例としては、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４が挙げられる。好ましくは、低コピーベクターが使用される。低コピーベクターの例としては、ｐＳＣ１０１、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９等が挙げられるが、これらに限定されない。「低コピーベクター」という用語は、細胞１個当たり最大５個のコピー数しかもたらさないベクターに関して使用される。形質転換の方法としては、当該技術分野における任意の既知の方法が挙げられる。例えば、ＤＮＡに対する細胞の透過性を増大するようにレシピエント細胞を塩化カルシウムで処理する方法がエシェリヒア・コリＫ−１２に関して報告されており(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、これは、本発明で使用することができる。
【００５６】
遺伝子発現の増強はまた、例えば相同組換え、Ｍｕ組込み等による細菌染色体への遺伝子の多コピーの導入により達成することができる。例えば、Ｍｕ組込みの１回の操作は、遺伝子の最大３個のコピーを細菌染色体へ導入することが可能である。
【００５７】
強力なプロモーター又はエンハンサーを使用する上述の方法は、遺伝子のコピー数又は発現を増大させることに基づく方法と併用することができる。
【００５８】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等に関する当該技術分野で既知の方法が本発明で使用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D., 「Molecular Clonig A Laboratory Manual, Third Edition」,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【００５９】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増大するためにバチルス属に属する微生物を育種することに関して、遺伝子の必須領域は、主としてバチルス・ズブチリス遺伝子に関する入手可能な情報に基づいたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により得られる。例えば、トランスポーターをコードする遺伝子であると予想されるｙｄｈＬ遺伝子は、ＰＣＲを使用して、バチルス・ズブチリス株の染色体ＤＮＡからクローニングすることができる。これに使用される染色体ＤＮＡは、バチルス・ズブチリスの任意の他の株に由来してもよい。
【００６０】
これらの変異体、改変体又は相同タンパク質が、ＹｄｈＬタンパク質の機能的特性を示し、すなわちプリン塩基類似体、イノシン又はグアノシンに対する耐性を付与する限り、
本発明のタンパク質は、天然の多様性に起因して存在するＹｄｈＬタンパク質の変異体及び改変体、並びに異なる細菌中に存在するＹｄｈＬの相同タンパク質を包含する。
【００６１】
本発明の細菌は、イノシンなどのプリンヌクレオシドを生産する能力を本質的に有する細菌に本発明のタンパク質をコードする上述のＤＮＡを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、該ＤＮＡをすでに保有する細菌へ、イノシンなどのプリンヌクレオシド生産能を付与することにより得ることができる。
【００６２】
本発明で使用することができるバチルス属に属する親株の例は、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株である。この株は、ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ変異がｐｕｒＡ：：ｃａｔ変異へ変更された、イノシン生産株バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株の誘導体である。ここで、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株は、変異が、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子（ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子（ｄｅｏＤ：：ｋａｎ）に導入された既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２の誘導体である（ＵＳ２００４−０１６６５７Ａ号）。本発明で使用することができるバチルス属に属する他の親株としては、バチルス・ズブチリスＡＪ１２７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９５１）（特公昭ＪＰ６１１３８７６Ａ２号）、バチルス・ズブチリスＡＪ３７７３株（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特公昭ＪＰ６２０１４７９４Ａ２号）、６−エトキシプリン耐性ＡＪ１３９３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１８６６５）（ＵＳ２００４−０１６６５７５号）等が挙げられる。
【００６３】
Ｅ．コリ属に属するイノシン生産株の例は、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）である。この株は、変異が、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦ遺伝子、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子、アデノシンデアミナーゼをコードするａｄｄ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼをコードするｅｄｄ遺伝子に導入され（ＷＯ９９／０３９８８号）、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードするｐｕｒＦＫＱを含有し、且つＧＭＰに対して非感受性であるｐＭＷＫＱを保有する（ＷＯ９９／０３９８８号）、既知のＷ３１１０株の誘導体である。
【００６４】
さらに、例として、イノシン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、具体的にはこのような酵素のフィードバック阻害を解除する方法（ＷＯ９９／０３９８８号）も挙げられる。イノシン生合成に関与する上述のような酵素の調節を解除するための手段としては、例えば、プリンリプレッサーの欠失（米国特許第６，２８４，４９５号）が挙げられる。プリンリプレッサーを欠失させる方法の例としては、プリンリプレッサーをコードする遺伝子（ｐｕｒＲ、GenBankアクセッション番号Ｚ９９１０４）を破壊することが挙げられる。
【００６５】
さらに、イノシン生産能はまた、イノシン生合成から分岐し、且つ別の代謝産物を生成する反応を阻害することにより増大させることができる（ＷＯ９９／０３９８８号）。イノシン生合成から分岐し、且つ別の代謝産物を生じる反応の例としては、スクシニル−アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）シンターゼ、イノシン−グアノシンキナーゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドラーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ等により触媒される反応が挙げられる。スクシニル−アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）シンターゼは、ｐｕｒＡによりコードされる（GenBankアクセッション番号Ｚ９９１０４）。
【００６６】
さらに、イノシン生産能はまた、細胞へのイノシンの取り込みを弱めることにより増強することができる。細胞へのイノシンの取り込みは、細胞へのイノシンの取り込みに関与
する反応を阻害することにより弱めることができる。細胞へのイノシンの取り込みに関与する上述の反応の例としては、例えばヌクレオシドパーミアーゼにより触媒される反応が挙げられる。
本発明のタンパク質におけるタンパク質１分子当たりの活性を増大するために、タンパク質の構造遺伝子に変異を導入して、タンパク質の活性を増強することも可能である。遺伝子に変異を導入するためには、部位特異的変異誘発(Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987))、組換えＰＣＲ(PCR Technology, Stockton Press (1989))、ＤＮＡの特定部分の化学合成、対象の遺伝子のヒドロキシルアミン処理、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン若しくは亜硝酸などの化学薬剤による対象の遺伝子を有する微生物株の処理等を使用することができる。
タンパク質の活性が増強される微生物は、表１に示す濃度で８−アザアデニン、又は６−メチルプリン、又は２，６−ジアミノプリン、又は６−メルカプトプリン、又は８−アザグアニン、又はイノシンを含有する最小培地中で増殖する株として選択することができる（下記を参照）。
【００６７】
本発明の細菌は、プリン生合成に関与する１つ又はそれ以上の遺伝子発現を増強することによりさらに改良することができる。このような遺伝子としては、Ｅ．コリのｐｕｒレギュロンが挙げられる(Esherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996)。ＡＤＰ及びＧＭＰによるフィードバック阻害が解除されたＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする変異ｐｕｒＦ遺伝子及びプリンヌクレオチド生合成系におけるリプレッサーをコードする不活性化ｐｕｒＲ遺伝子を有するイノシン生産性Ｅ．コリ株が記載されている（ＷＯ９９／０３９８８号）。
【００６８】
ＩＩＩ．プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、プリンヌクレオシドを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにプリンヌクレオシドを培地から回収する工程を含む、プリンヌクレオシドの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、イノシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにイノシンを培地から回収する工程を含む、イノシンの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにキサントシンを培地から回収する工程を含む、キサントシンの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、グアノシンを上記細菌により生産及び分泌させる工程、並びにグアノシンを培地から回収する工程を含む、グアノシンの製造方法を包含する。
【００６９】
本発明では、培養、培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、プリンヌクレオシドが微生物を使用して生産される従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。プリンヌクレオシド生産用の培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要であれば他の有機成分を含有する典型的な培地であり得る。炭素源としては、グルコース、ラクトース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース及びデンプンの加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトール及びソルビトールなどのアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸及びコハク酸などの有機酸等が使用できる。
【００７０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１などのビタミン類、アデニン及びＲＮＡなどの核酸である必要物質又は酵母抽出物等が、微量有機栄養分として適切な量で含有されることが望ましい。これら以外に、必要であれば、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム
、鉄イオン、マンガンイオン等を添加してもよい。
【００７１】
培養は、好ましくは好気性条件下で１６〜７２時間実施され、培養中の培養温度は、３０〜４５℃に、またｐＨは、５〜８に制御される。ｐＨは、無機酸若しくは有機酸又はアルカリ性物質並びにアンモニアガスを使用することにより調節することができる。
【００７２】
培養後、細胞などの固形分は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて、標的プリンヌクレオシドは、イオン交換樹脂及び沈殿などの従来の方法の組合せのいずれかにより、発酵液から回収することができる。
【００７３】
４．プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、所望のプリンヌクレオシドをリン酸化して、プリンヌクレオシドに対応するプリンヌクレオチドを生成する工程、細菌によりプリンヌクレオチドを上記培地へ分泌させる工程、及びプリンヌクレオチドを回収する工程を含む、プリンヌクレオチドの製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、イノシンをリン酸化して５’−イノシン酸を生成する工程、細菌により５’−イノシン酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−イノシン酸を回収する工程を含む、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成する工程、細菌により５’−キサンチル酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−キサンチル酸を回収する工程を含む、５’−キサンチル酸の製造方法を包含する。さらに、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、グアノシンをリン酸化して５’−グアニル酸を生成する工程、細菌により５’−グアニル酸を上記培地へ分泌させる工程、及び５’−グアニル酸を回収する工程を含む、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。また、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養する工程、キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成する工程、細菌により５’−キサンチル酸を上記培地へ分泌させる工程、５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成する工程、及び５’−グアニル酸を回収する工程を含む、５’−グアニル酸の製造方法を包含する。
【００７４】
本発明では、培養、培地からのイノシンの回収及び精製等は、イノシンを微生物を使用して製造する従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。さらに、本発明では、イノシンをリン酸化する工程、細菌により培地へ分泌させる工程、及び５’−イノシン酸を回収する工程は、５’−イノシン酸のようなプリンヌクレオチドをイノシンなどのプリンヌクレオシドから製造する従来の発酵方法に類似した様式で実施することができる。
【００７５】
プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々のホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ又はヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に、或いはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を使用して化学的に実施することができる。ピロリン酸塩のホスホリル基のヌクレオシドへのＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能であるホスファターゼ（Mihara ら、 「モルガネラ・モルガニイ由来の変異酸ホスファターゼによるヌクレオシドのリン酸化」、Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816 (2000))又はリン酸供与体としてポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）又はカルバミルリン酸（塩）を利用する酸ホスファターゼ（ＷＯ９６／３７６０３Ａ１号）等を使用することができる。また、ホスファターゼの例として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩(Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964))、無機リン酸（特公昭又は特開昭第４２−１１８６号）又はアセチルリン酸塩（特公昭又は特開昭第６１−４１５５５号）を利用してヌクレオシドのＣ−２’、３’又は５’位へホスホリル基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等が使用することができる。ヌクレオシドキナーゼの例として、Ｅ．コリ由来
のグアノシン／イノシンキナーゼ等を使用することができる（Mori, H. ら、「エシェリヒア・コリのグアノシン−イノシンキナーゼ遺伝子のクローニング及び精製遺伝子産物の特徴付け」、J, Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995)；ＷＯ９１／０８２８６号）。ヌクレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hammer-Jespersen, K.（Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen(ed.)、 「微生物におけるヌクレオチド、ヌクレオシド及び核酸塩基の代謝」、 1980, Academic Press, New York)に記載のヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用することができる。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ3などのリン酸化剤を使用して実施することができる（Yoshikawa, K. 他、「リン酸化の研究．ＩＩＩ．保護されていないヌクレオシドの選択的リン酸化」、Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969))。
【００７６】
５’−キサンチル酸のアミノ化は、例えば、Ｅ．コリ由来のＧＭＰシンテターゼを使用して酵素的に実施することができる。（Fujioら、「エシェリヒア・コリにおけるＸＭＰアミナーゼの高レベルの発現及び５’−グアニル酸の工業生産のためのその適用」、 Biosci, Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845；ＥＰ０２５１４８９Ｂ１号）。
【実施例】
【００７７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、以下でより具体的に説明する。
【００７８】
実施例１．バチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子のクローニング
バチルス・ズブチリス サブスピーシーズ ズブチリス１６８株の全長塩基配列は決定されている(Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997))。報告された塩基配列に基づいて、プライマーｙｄｈＬ＿Ｎ（配列番号５）及びｙｄｈＬ＿Ｃ（配列番号６）を合成して、ＰＣＲによってバチルス・ズブチリス１６８株由来のｙｄｈＬ遺伝子を増幅するために使用した。プライマーｙｄｈＬ＿Ｎは、ｙｄｈＬ遺伝子の開始コドンの４８９〜４６７ｂｐ上流の配列に一致しており、その５’末端に制限酵素ＳａｌＩ認識部位が導入されている。プライマーｙｄｈＬ＿Ｃは、ｙｄｈＬ遺伝子の終結コドンの５８〜８０ｂｐ下流の配列に相補的であり、その５’末端に制限酵素ＢｇｌＩＩ認識部位が導入されている。
【００７９】
バチルス・ズブチリス１６８株の染色体ＤＮＡは、常法により調製された。ＰＣＲは、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００」で、ＰｆｕＩポリメラーゼ(Fermentas)を用いて、以下の条件下で実施した：９４℃で３０秒、６１℃で４５秒、７２℃で３分を２５サイクル。ｙｄｈＬ遺伝子およびそのプロモーターを含有する得られたＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩで処理して、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で予め処理した低コピー数ベクターｐＭＷ１１８に挿入した。このようにして、プラスミドｐＹＤＨＬ１が得られた。
【００８０】
ｐＹＤＨＬ１プラスミド及びベクターを使用して、標準的な方法によりＥ．コリＴＧ１株(Amersham Pharmacia Biotech)を形質転換した。形質転換体は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬブロス寒天プレート上で選択した。このようにして、Ｅ．コリＴＧ１（ｐＹＤＨＬ１）及びＴＧ１（ｐＭＷ１１８）株が得られた。続いて、これらの株のプリン塩基類似体の存在下での増殖能を、段階的濃度の阻害剤を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート上で決定した。プレートに、最小培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充した）中で一晩増殖させた培養液からの１０5〜１０6個の細胞をスポットした。増殖は、３７℃で４４時間のインキュベーション後に評価した。
【００８１】
結果を表１に示す。
【００８２】
【表１】
【００８３】
表１からわかるように、ｙｄｈＬ遺伝子増幅は、２，６−ジアミノプリン、６−メルカプトプリン及び８−アザアデニンに対する細菌の耐性を増大させた。
【００８４】
また、ｐＹＤＨＬ１プラスミド及びｐＭＷ１１８ベクターによって、Ｅ．コリＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株を形質転換した。Ｅ．コリＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株は、イノシン及びグアノシンに対する耐性を調べるために使用される特別に構築された親株である。この株は、プリン分解能に起因してイノシン及びグアノシンに対して耐性である既知のＴＧ１株（ＶＫＰＭ Ｂ−５３５７）へのファージＰ１媒介性形質導入を使用した、ＷＯ９９／０３９８８号に記載されるｄｅｏＤ変異及びPetersen C.(J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999)により記載されるｇｓｋ３変異の連続的な導入により得られた。ＴＧ１
ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株は、ｄｅｏＤ変異に起因してグアノシンおよびイノシンを分解できず（ＷＯ９９／０３９８８）、ｇｓｋ３変異に起因してヌクレオシドに感受性である(Petersen C.J. Biol. Chem., 274, 5348-5356,1999)。このようにして、ＴＧ１ ｄｅｏＤ
ｇｓｋ３（ｐＹＤＨＬ１）株及びＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３（ｐＭＷ１１８）株が得られた。続いて、これらの株のイノシン及びグアノシンの存在下での増殖能を上述のように決定した。
【００８５】
結果を表２に示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】
表２の結果より、ｙｄｈＬ遺伝子の過剰発現が、イノシンに対する高レベルの耐性及びグアノシンに対する低レベルの耐性を付与したことがわかる。したがって、ｙｄｈＬ遺伝子は、プリンヌクレオシドの分泌に、より具体的にはイノシンの分泌に関与すると予測することができる。
【００８８】
実施例２．バチルス・アミロリケファシエンスのｙｄｈＬ遺伝子のクローニング
実施例１で示したデータは、バチルス・ズブチリスのｙｄｈＬ遺伝子（以降、ｙｄｈＬBs）の過剰発現が、Ｍ９グルコース最小寒天へ同時に導入される場合に、２，６−ジアミ
ノプリン及び６−メルカプトプリンに対する耐性を細胞に付与したことを示す（表１）。この事実に基づいて、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬBs遺伝子のオーソログ（以降、ｙｄｈＬBa）のクローニングを実施した。Ｂ．アミロリケファシエンスＢＡ１（ＩＡＭ１５２３）株の染色体ＤＮＡは、常法により調製された。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して、同じ酵素で予め処理したｐＭＷ１１８ベクターと連結させた。得られたＤＮＡを使用して、Ｅ．コリＴＧ１株を形質転換した。形質転換体は、４００μｇ／ｍｌの２，６−ジアミノプリン、４００μｇ／ｍｌの６−メルカプトプリン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する最小寒天上で選択した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離して分析した。この中から、約１．６ｋｂの最小挿入ＤＮＡフラグメントを含有するハイブリッドプラスミドｐＹＤＨＬ２を選択した。ｙｄｈＬBs遺伝子と対比して、それは、ＥｃｏＲＩ部位を含有しなかった。挿入フラグメントは、ユニバーサルプライマーにより配列決定し、ｙｄｈＬBs遺伝子と高い相同性（９０％を上回る）を有することがわかった（図１）。Ｂ．アミロリケファシエンス由来の新たな遺伝子をｙｄｈＬ遺伝子と称した（以降、ｙｄｈＬBa遺伝子とも呼ぶ）。ＴＧ１及びＴＧ１ ｄｅｏＤ ｇｓｋ３株へ導入される場合、ｐＹＤＨＬ２プラスミドは、ｐＹＤＨＬ１プラスミドと同様、それぞれプリン塩基類似体及びヌクレオシドに対する耐性を細胞に付与した。ｐＹＤＨＬ２プラスミドは確かにｙｄｈＬBa遺伝子を含有すると結論付けた。
【００８９】
実施例３．Ｅ．コリ イノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBs及びｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
イノシン生産Ｅ．コリＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ）株をそれぞれ、ｐＭＷ１８ベクター、ＹＤＨＬ１及びｐＹＤＨＬ２プラスミドで形質転換した。形質転換体は、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有するＬ寒天上で選択した。このようにして、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＭＷ１８）株、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＹＤＨＬ１）株及びＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱ，ｐＹＤＨＬ２）株が得られた。これらの株はそれぞれ、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬ−ブロス中で３７℃で１８時間培養し、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び７５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する発酵培地３ｍｌ中に接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【００９０】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
酵母抽出物 ８．０
ＣａＣＯ3 ３０．０
【００９１】
グルコース及び硫酸マグネシウムは、個々に滅菌した。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌した。ｐＨは、７．０に調節した。抗生物質は、滅菌後に培地へ導入した。
【００９２】
培養後、培地中に蓄積したイノシンの量をＨＰＬＣにより定量した。培地のサンプル（５００μｌ）を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清をＨ2Ｏで４倍に希釈して、ＨＰＬＣで分析した。
【００９３】
ＨＰＬＣ分析に関する条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５ｕ(Phennomenex, USA)。緩衝液：
２％ｖ／ｖＣ2Ｈ5ＯＨ；０．８％ｖ／ｖトリエチルアミン；０．５％ｖ／ｖ酢酸（氷酢酸）；ｐＨ ４．５。温度：３０℃。流速：０．３ｍｌ／分。注入容量：５μｌ。検出：ＵＮ ２５０ｎｍ。
【００９４】
保持時間（分）：
キサントシン １３．７
イノシン ９．６
ヒポキサンチン ５．２
グアノシン １１．４
アデノシン ２８．２
【００９５】
結果を表３に示す。
【００９６】
【表３】
【００９７】
表３からわかるように、ｙｄｈＬBs及びｙｄｈＬBa遺伝子の過剰発現は、ＦＡＤＲａｄｄｅｄｄ（ｐＭＷＫＱＡｐ）株のイノシン生産性を改善した。
【００９８】
実施例４．低コピー数シャトルベクターｐＭＷＭＸ１へのｙｄｈＬBsのクローニング
それ自身のプロモーターの制御下でｙｄｈＬBs遺伝子を含有するＰＣＲフラグメント（実施例１で得られた）をＢｇｌＩ及びＳａｌＩで処理して、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ酵素で予め処理した低コピー数シャトルベクターｐＭＷＭＸ１へ挿入した。このようにして、プラスミドｐＹＤＨＬ３が得られた。ｐＭＷＭＸ１ベクター（図２）は、２つの低コピー数プラスミド：ｐＭＷ１１８及びｐＭＸ３０の誘導体である。ここで、ｐＭＸ３０プラスミド(Rabinovich et al., Mol. Biol (Moscow), 18, 189-196, 1984)は、ｉｎｃ１８ファミリーの宿主広範囲プラスミドであるｐＳＭ１９０３５の欠失誘導体である(Brantl et al., Nucleic Acids Res., 18, 4783-4790)。ｐＭＷ１１８及びｐＭＷＸ３０プラスミドそれぞれを、ＥｃｏＲＩで切断して、連結させた。このようにして、ベクターｐＭＷＭＸ１が得られた。
【００９９】
実施例５．ｙｄｈＬBa遺伝子を含有する低コピー数シャトルプラスミドｐＹＤＨＬ３の構築
ｐＹＤＨＬ２プラスミドをＥｃｏＲＩで部分的に切断して、単一フラグメントを得て、同じ酵素で切断したｐＭＸ３０と連結させた。このようにして、ｙｄｈＬBa遺伝子を含有するシャトルプラスミドｐＹＤＨＬ４が得られた。したがって、ｐＹＤＨＬ４プラスミドは、ｙｄｈＬBsを含有するｐＭＷＭＸ１ベクターのｙｄｈＬBa遺伝子との置換を除いて、ｐＹＤＨＬ３プラスミドと同等である。
【０１００】
実施例６．プリン塩基類似体に対するバチルス・ズブチリス１６８株の耐性に対するｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
ｐＹＤＨＬ３、ｐＹＤＨＬ４プラスミド及びｐＭＷＭＸ１ベクターを使用して、標準的な方法により野生型バチルス・ズブチリス１６８株を形質転換した。形質転換体は、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを有するＬブロス寒天プレート上で選択した。このようにして、バチルス・ズブチリス１６８（ｐＭＷＭＸ１）株、バチルス・ズブチリス１６８（ｐＹＤＨＬ３）株及びバチルス・ズブチリス１６８（ｐＹＤＨＬ４）株が得られた。続い
て、これらの株のプリン塩基類似体の存在下での増殖能を、段階的な濃度のプリン類似体を含有するＭ９グルコース最小寒天プレート（最小培地Ｍ９、グルコース−２％、ビタミンアッセイカザミノ酸(Difco)−０．１％、トリプトファン−１００μｇ／ｍｌ）上で決定した。プレートに、類似体なしの寒天プレート上で一晩増殖させた培養液からの１０5〜１０6個の細胞をスポットした。増殖は、３４℃で４８時間のインキュベーション後に評価した。
【０１０１】
結果を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４からわかるように、ｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子の増幅は、８−アザグアニン、６−メチルプリン及び８−アザアデニンに対する細菌の耐性を増大した。
【０１０４】
実施例７：バチルス・ズブチリスイノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子増幅の影響
イノシン生産バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株をｐＭＷＭＸ１ベクター、ｐＹＤＨＬ３又はｐＹＤＨＬ４プラスミドで形質転換した。このようにして、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＭＷＭＸ１）株、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＹＤＨＬ３）株及びバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１（ｐＹＤＨＬ４）株が得られた。これらの株はそれぞれ、１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを有するＬブロス中で３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含有するバチルス属発酵培地３ｍｌへ接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【０１０５】
発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ ＴＮ（総窒素）の１．３５
（ダイズ加水分解物）
ＤＬ−メチオニン ０．３
ＮＨ4Ｃｌ ３２．０
アデニン ０．１
トリプトファン ０．０２
ＣａＣＯ3 ５０．０
【０１０６】
培養後、培地中に蓄積したイノシンの量を、上述のようにＨＰＬＣで定量した。結果を表５に示す。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５からわかるように、ｙｄｈＬBs又はｙｄｈＬBa遺伝子のいずれかの増幅が、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６−１株のイノシン生産性を改善した。
【０１０９】
実施例８：Ｂ．アミロリケファシエンスｙｄｈＬ遺伝子の調節領域の改変
バチルス・ズブチリスｙｄｈＬ調節領域の改変、すなわち５’非翻訳ＲＮＡ領域のＧボックスにおける改変は、遺伝子の発現を増大させ得ることが既知である(Mandal, M. and Breaker, R.R., Nat. Struct. Mol. Biol., 11(1), 29-35 (2004))。したがって、ｙｄｈＬ遺伝子発現レベルを増強するために、同変異（ＣによるＴの置換）を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発(Stratagene)を使用して、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子の調節領域（遺伝子の開始点の位置「−７７」）に導入した。その目的で、２つのプライマー１及び２（それぞれ、配列番号７及び８）を、Ｂ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子の調節領域のＤＮＡ配列に基づいて設計した。ＤＮＡプラスミドｐＹＤＨＬ２（ｐＭＷ１１８−ｙｄｈＬBA）を鋳型として使用した。全プラスミドを上述のプライマーで増幅して、ｙｄｈＬ遺伝子を含有する幾つかのプラスミドが得られた。これらのプラスミドは、プライマー３（配列番号９）を使用して配列決定し、所望のＴからＣへの置換の存在が確認された。調節領域への変異を有するＢ．アミロリケファシエンス由来のｙｄｈＬ遺伝子を含有する新たなｐＭＷ１１８誘導体プラスミドをｐＹＤＨＬ５とした。ｐＹＤＨＬ５プラスミドは、ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断することにより直鎖化して、同じ制限酵素で予め直鎖化したｐＭＸ３０と連結させた。このようにして、発現レベルを増強する変異を有するｙｄｈＬBa遺伝子を含有するシャトルプラスミドｐＹＤＨＬ６が得られた。
【０１１０】
実施例９．Ｂ．アミロリケファシエンスイノシン生産株によるイノシン生産に対するｙｄｈＬBa遺伝子の発現増強の影響
ｐＹＤＨＬ６プラスミド及びｐＭＷＭＸ１シャトルベクターをそれぞれ、既知の方法によりバチルス・ズブチリス１６８株へ形質転換した(Spizizen, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072-1078 (1958))。得られたバチルス・ズブチリス（ｐＹＤＨＬ６）株及びバチルス・ズブチリス（ｐＭＷＭＸ１）株を、ファージＥ４０媒介性形質導入におけるドナーとして使用して、ｐＹＤＨＬ６及びｐＭＷＭＸ１プラスミドを、イノシン及びグアノシンを生産するバチルス・ズブチリスＧ１１３６Ａ株（ＡＪ１９９１、ＶＫＰＭ Ｂ−８９９４、ＡＴＣＣ１９２２２）（米国特許第３，５７５，８０９号）へ導入した。バチルス・ズブチリスＧ１１３６Ａ株は、All-Russian National Collection of Industrial Microorganisms（ＶＫＰＭ）(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)により、バチルス・アミロリケファシエンスとして再同定されており、アクセッション番号（Ｖ
ＫＰＭ Ｂ−８９９４）の下で寄託されている。したがって、この株はこれ以降、バチルス・アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａと称する。ファージＥ４０は、バチルス・ズブチリス及びＢ．アミロリケファシエンス細胞上で増殖することが可能なＰＢＳ１様ファージ(Takanishi, R., J. Gen. Microbiol., 31, 211-217, (1963))である。形質導入後、Ｂ．アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａ（ｐＭＷＭＸ１）株及びＢ．アミロファシエンスＧ１１３６Ａ（ｐＹＤＨＬ６）株が得られた。
【０１１１】
これらの株はそれぞれ、１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを有するＬブロス中で３７℃で１８時間培養した。得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管に入れた１０ｍｇ／ｌのエリスロマイシンを含有するバチルス属発酵培地３ｍｌへ接種して、回転振とう機により３７℃で７２時間培養した。
【０１１２】
発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
ＮＨ4Ｃｌ １５．０
アデニン ０．３
総窒素（Ｍａｍｅｎｏ形態で） ０．８
ＣａＣＯ3 ２５．０
【０１１３】
培養後、培地中に蓄積したイノシン及びグアノシンの量を、上述のようにＨＰＬＣにより定量した。結果を表６に示す。
【０１１４】
【表６】
【０１１５】
表６からわかるように、調節性変異に起因するｙｄｈＬBa遺伝子の発現の増強は、Ｂ．アミロリケファシエンスＧ１１３６Ａ株のイノシン生産性を改善した。
【０１１６】
本発明は、それらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また等価体を用いることができることは、当業者に明らかであろう。上述の文書はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ｐＹＤＨＬ４プラスミド中に含有されるＤＮＡフラグメントによりコードされるＢ．アミロリケファシエンスＹｄｈＬタンパク質（ＹＤＨＬ＿ＢＡ、配列番号２）及びｐＹＤＨＬ１プラスミド中に含有されるＤＮＡフラグメントによりコードされるバチルス・ズブチリスＹｄｈＬタンパク質（ＹＤＨＬ＿ＢＳ、配列番号４）のアラインメントを示す図である。記号「＊」は、ＹＤＨＬ＿ＢＡとＹＤＨＬ＿ＢＳとの間の共通アミノ酸を意味する。記号「：」は、ＹＤＨＬ＿ＢＡとＹＤＨＬ＿ＢＳとの間の類似アミノ酸を意味する。
【図２】ｐＭＷＭＸ１プラスミドの構造を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン生産能を有し、ＹｄｈＬタンパク質の活性が増強された、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌。
【請求項２】
前記ＹｄｈＬタンパク質の活性は、ｙｄｈＬ遺伝子のコピー数を増大させること、或いはｙｄｈＬ遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強される、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ｙｄｈＬ遺伝子は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は該配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されたときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記ストリンジェントな条件は、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
前記ｙｄｈＬ遺伝子は、以下：
（ａ）配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は該配列番号３の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されたときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記ストリンジェントな条件は、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記プリンは、イノシン、キサントシン及びグアノシンから成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
（ａ）培地中で請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）プリンヌクレオシドを該培地中へ分泌させること、及び
（ｃ）プリンヌクレオシドを該培地から回収すること
を含む、プリンヌクレオシドの製造方法。
【請求項９】
前記プリンヌクレオシドはイノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プリンヌクレオシドはキサントシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プリンヌクレオシドはグアノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌は、プリンヌクレオシド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
以下：
（ａ）培地中で請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）プリンヌクレオシドをリン酸化してプリンヌクレオチドを生成すること、
（ｃ）該プリンヌクレオチドを該培地中へ分泌させること、及び
（ｄ）該プリンヌクレオチドを該培地から回収すること
を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１４】
前記プリンヌクレオチドは、５’−イノシン酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プリンヌクレオチドは、５’−キサンチル酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記プリンヌクレオチドは、５’−グアニル酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
以下
（ａ）培地中で請求項１に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成すること、
（ｃ）５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成すること、及び
（ｄ）５’−グアニル酸を回収すること
を含む、５’−グアニル酸の製造方法。
【請求項１９】
前記細菌は、キサントシン生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１８に記載の方法。
【請求項１】
プリン生産能を有し、ＹｄｈＬタンパク質の活性が増強された、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌。
【請求項２】
前記ＹｄｈＬタンパク質の活性は、ｙｄｈＬ遺伝子のコピー数を増大させること、或いはｙｄｈＬ遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強される、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ｙｄｈＬ遺伝子は、
（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は該配列番号１の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されたときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記ストリンジェントな条件は、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
前記ｙｄｈＬ遺伝子は、以下：
（ａ）配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１の塩基配列又は該配列番号３の塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、タンパク質の活性が細菌において増強されたときに、バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌をプリン塩基類似体、イノシン及びグアノシンから成る群から選択されるプリンに対して耐性にする活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記ストリンジェントな条件は、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含む、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記プリンは、イノシン、キサントシン及びグアノシンから成る群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
（ａ）培地中で請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）プリンヌクレオシドを該培地中へ分泌させること、及び
（ｃ）プリンヌクレオシドを該培地から回収すること
を含む、プリンヌクレオシドの製造方法。
【請求項９】
前記プリンヌクレオシドはイノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プリンヌクレオシドはキサントシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記プリンヌクレオシドはグアノシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌は、プリンヌクレオシド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
以下：
（ａ）培地中で請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）プリンヌクレオシドをリン酸化してプリンヌクレオチドを生成すること、
（ｃ）該プリンヌクレオチドを該培地中へ分泌させること、及び
（ｄ）該プリンヌクレオチドを該培地から回収すること
を含む、プリンヌクレオチドの製造方法。
【請求項１４】
前記プリンヌクレオチドは、５’−イノシン酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プリンヌクレオチドは、５’−キサンチル酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記プリンヌクレオチドは、５’−グアニル酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌は、プリンヌクレオチド生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
以下
（ａ）培地中で請求項１に記載の細菌を培養すること、
（ｂ）キサントシンをリン酸化して５’−キサンチル酸を生成すること、
（ｃ）５’−キサンチル酸をアミノ化して５’−グアニル酸を生成すること、及び
（ｄ）５’−グアニル酸を回収すること
を含む、５’−グアニル酸の製造方法。
【請求項１９】
前記細菌は、キサントシン生合成遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項１８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５３００１１（Ｐ２００７−５３００１１Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３４５３１（Ｐ２００６−５３４５３１）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００６８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５６２７
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００６８３３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９５６２７
【国際公開日】平成１７年１０月１３日（２００５．１０．１３）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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