ヒトアンギオポエチン様タンパク質４に対するヒト抗体
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合して阻害する完全なヒト抗体またはヒト抗体の抗原結合フラグメントを提供する。ヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４に関連する疾患または障害（高脂血症、高リポタンパク質血症、および脂質異常症（高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症などが含まれる）など）の処置で有用である。さらに、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、異常な脂質代謝が危険因子である疾患または障害を防止または処置するために、必要な被験体に投与することができる。かかる疾患または障害には、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症および冠状動脈疾患など）、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合フラグメントならびに前記抗体の治療的使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の記述
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、リポタンパク質代謝において中心的役割を果たし、それによって正常な血中リポタンパク質レベルが維持され、その活性の組織特異的調節によって、いつ、どの組織トリグリセリド（ＴＧ）が取り除かれるのかが決定される。ヒトおよびげっ歯類において、ＡＮＧＰＴＬ４がＬＰＬを阻害してリポタンパク質の異化を遅延させると報告されている。ＡＮＧＰＴＬ４ヌルマウスは、血清ＴＧの有意な減少を示す。逆に、マウスへのＡＮＧＰＴＬ４注射によって循環脂質が迅速に増加し、これはアンギオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）注射よりも速い（非特許文献１）。ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイル領域（Ｃ末端フィブリノゲン様ドメインではない）は、ＬＰＬ活性阻害（したがって、高トリグリセリド血症を示す）で重要であることが公知である。これらの所見は、ＡＮＧＰＴＬ４阻害が脂質レベルの上昇によって特徴づけられる疾患（肥満、代謝症候群、ＩＩ型糖尿病などに関連する原発性脂質異常症および高トリグリセリド血症などが含まれる）の処置で有益であり得ることを示す。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、血管形成およびがんで役割を果たすことが示されている（非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４）。
【０００３】
ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４７５、および４７６に示す。ＡＮＧＰＴＬ４の抗体は、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７４２２８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１０９３０７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００２，４３：１７７０−１７７２
【非特許文献２】Ｇａｌａｕｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６，１０３（４９）：１８７２１−１８７２６
【非特許文献３】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０００，３４６：６０３−６１０
【非特許文献４】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３，６３（２０）：６６５１−６６５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合してその活性を中和する完全なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその抗原結合フラグメントを提供する。
【０００７】
抗体（Ａｂ）は、全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含むことができ、機能性に影響を及ぼす（例えば、残存するエフェクター機能を排除する）ように改変することができる（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【０００８】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４６６、４６８、および４８７、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２６、４２、４６、４８７、７４、９０、９４、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２、４８７、９０、１３８、または１６２を含むＨＣＶＲを含む。
【０００９】
１つの実施形態では、抗体または抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、および４５６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。別の実施形態では、抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号３４、４４、４８、８２、９２、９６、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４４、９２、１４０、または１６４を含むＬＣＶＲを含む。
【００１０】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、
【００１１】
【化１】
からなる群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６／３４、４２／４４、４８７／４４、４６／４８、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、および１６６／１６８のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、配列番号８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、および４６４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、および配列番号１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、および４４８、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３２／４０、８０／８８、１２８／１３６、または１５２／１６０を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３２／４０または８０／８８を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００１３】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、および４６０、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、および配列番号６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、および４６２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列をさらに含み、任意選択的に、配列番号１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、および４４４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、および／または配列番号１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、および４４６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列をさらに含む。
【００１４】
あるいは、本発明は、配列番号４／６／８、２８／３０／３２、５２／５４／５６、７６／７８／８０、１００／１０２／１０４、１２４／１２６／１２８、１４８／１５０／１５２、１７２／１７４／１７６、１９６／１９８／２００、２２０／２２２／２２４、２４４／２４６／２４８、２６８／２７０／２７２、２９２／２９４／２９６、３１６／３１８／３２０、３４０／３４２／３４４、３６４／３６６／３６８、３８８／３９０／３９２、４１２／４１４／４１６、４３６／４３８／４４０、および４６０／４６２／４６４からなる群より選択されるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ、および／または配列番号１２／１４／１６、３６／３８／４０、６０／６２／６４、８４／８６／８８、１０８／１１０／１１２、１３２／１３４／１３６、１５６／１５８／１６０、１８０／１８２／１８４、２０４／２０６／２０８、２２８／２３０／２３２、２５２／２５４／２５６、２７６／２７８／２８０、３００／３０２／３０４、３２４／３２６／３２８、３４８／３５０／３５２、３７２／３７４／３７６、３９６／３９８／４００、４２０／４２２／４２４、および４４４／４４６／４４８からなる群より選択されるＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００１５】
１つの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、配列番号２８／３０／３２、７６／７８／８０、１２４／１２６／１２８、および１４８／１５０／１５２からなる群より選択され、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号３６／３８／４０、８４／８６／８８、１３２／１３４／１３６、および１５６／１５８／１６０からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、および１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０からなる群より選択されるＣＤＲ配列組み合わせを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０または７６／７８／８０／８４／８６／８８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１６】
関連する実施形態では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、抗体またはそのフラグメントが、
【００１７】
【化２】
からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗体またはそのフラグメントを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は当該分野で公知であり、本明細書中に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲの同定に適用することができる。ＣＤＲの境界の同定に適用することができる従来の定義には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。大まかに言えば、Ｋａｂａｔ定義は配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列の同定に公共データベースも利用可能である。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６／３４、４２／４４、４８７／４４、４６／４８、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、および１６６／１６８のアミノ酸配列対からなる群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ対内に含まれるＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列対内に含まれるＣＤＲ配列を含む。
【００１８】
別の関連する実施形態では、本発明は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、または１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗体または抗原結合フラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ４への特異的結合を競合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む抗体とｈＡＮＧＰＴＬ４への特異的結合を競合する。
【００１９】
別の関連する実施形態では、本発明は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、または１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗体またはそのフラグメントによって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ４上の同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む抗体によって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ４上のエピトープを認識する。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメント（特に上記のもの）をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびかかるベクターが導入された宿主細胞（例えば、細菌細胞（大腸菌など）または哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞など））も本発明に含まれる。抗体を産生させる条件下での宿主細胞の培養および産生された抗体の取り出しによる抗体の産生方法も同様に含まれる。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４６５、４６７、および４８６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２５、４１、４５、７３、８９、９３、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、および４８６からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４１、８９、１３７、１６１、または４８６の核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。
【００２２】
１つの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７、４３１、４４１、４５１、および４５５、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３３、４３、４７、８１、９１、９５、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、および１６７からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４３、９１、１３９、または１６３の核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、
【００２４】
【化３】
からなる群より選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２５／３３、４１／４３、４８６／４３、４５／４７、７３／８１、８９／９１、９３／９５、１２１／１２９、１３７／１３９、１４１／１４３、１４５／１５３、１６１／１６３、および１６５／１６７からなる群より選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４１／４３、４８６／４３、８９／９１、１３７／１３９、または１６１／１６３の核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、および４６３、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン、および配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、および４４７、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１／３９、７９／８７、１２７／１３５、または１５１／１５９の核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列対を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１／３９または７９／８７の核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列対を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、および４５９、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン、および配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、および４６１、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメインをさらに含み、任意選択的に、配列番号１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、３９５、４１９、および４４３、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、および４４５、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００２７】
あるいは、本発明は、配列番号３／５／７、２７／２９／３１、５１／５３／５５、７５／７７／７９、９９／１０１／１０３、１２３／１２５／１２７、１４７／１４９／１５１、１７１／１７３／１７５、１９５／１９７／１９９、２１９／２２１／２２３、２４３／２４５／２４７、２６７／２６９／２７１、２９１／２９３／２９５、３１５／３１７／３１９、３３９／３４１／３４３、３６３／３６５／３６７、３８７／３８９／３９１、４１１／４１３／４１５、４３５／４３７／４３９、および４５９／４６１／４６３からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ、および／または配列番号１１／１３／１５、３５／３７／３９、５９／６１／６３、８３／８５／８７、１０７／１０９／１１１、１３１／１３３／１３５、１５５／１５７／１５９、１７９／１８１／１８３、２０３／２０５／２０７、２２７／２２９／２３１、２５１／２５３／２５５、２７５／２７７／２７９、２９９／３０１／３０３、３２３／３２５／３２７、３４７／３４９／３５１、３７１／３７３／３７５、３９５／３９７／３９９、４１９／４２１／４２３、および４４３／４４５／４４７からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされるＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００２８】
１つの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、配列番号２７／２９／３１、７５／７７／７９、１２３／１２５／１２７、および１４７／１４９／１５１からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされ、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号３５／３７／３９、８３／８５／８７、１３１／１３３／１３５、および１５５／１５７／１５９からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２７／２９／３１／３５／３７／３９、７５／７７／７９／８３／８５／８７、１２３／１２５／１２７／１３１／１３３／１３５、および１４７／１４９／１５１／１５５／１５７／１５９からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２７／２９／３１／３５／３７／３９または７５／７７／７９／８３／８５／８７のヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２９】
第４の態様では、本発明は、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ３が式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０（配列番号４７１）（式中、Ｘ１はＡｌａであり、Ｘ２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ３はＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ４はＧｌｙ、Ａｓｐ、または不在であり、Ｘ５はＡｓｐまたは不在であり、Ｘ６はＬｅｕ、Ａｒｇ、または不在であり、Ｘ７はＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｘ８はＰｈｅ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇであり、Ｘ９はＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎであり、Ｘ１０はＡｓｐ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ１１はＴｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ１３はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ１４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ１５はＴｙｒであり、Ｘ１６はＰｈｅまたはＧｌｙであり、Ｘ１７はＬｅｕまたは不在であり、Ｘ１８はＡｓｐであり、Ｘ１９はＴｙｒ、Ｖａｌ、またはＰｈｅであり、Ｘ２０はＴｒｐである）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号４７４）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ｘ３はＴｙｒまたはＬｅｕであり、Ｘ４はＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ７はＰｒｏ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ８はＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ９はＴｈｒであり、Ｘ１０はＰｈｅである）のアミノ酸配列を含む、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００３０】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４６９）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＰｈｅであり、Ｘ３はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｘ５はＳｅｒであり、Ｘ６はＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ７はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ８はＨｉｓ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４７０）（式中、Ｘ１はＩｌｅであり、Ｘ２はＡｓｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ３はＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、Ｘ４はＡｒｇ、Ａｓｐ、またはＡｌａであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＧｌｙまたは不在であり、Ｘ７はＳｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｓｐであり、Ｘ８はＴｈｒまたはＬｙｓである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（配列番号４７２）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＩｌｅであり、Ｘ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ６はＴｙｒまたはＴｒｐである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、および式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号４７３）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｘ２はＡｌａであり、Ｘ３はＳｅｒである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列をさらに含む。Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐモノクローナル抗体の配列アラインメントを図１（ＨＣＶＲ）および図２（ＬＣＶＲ）に示す。
【００３１】
第５の態様では、本発明は、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ生殖系列配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、およびＶＫおよびＪＫ生殖系列配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲが（ｉ）ＶＨ３−３０、ＤＨ５−１２、ＪＨ６、ＶＫ１−９、およびＪＫ４；（ｉｉ）ＶＨ４−３４、ＤＨ３−３、ＪＨ４、ＶＫ１−２７、およびＪＫ４、および（ｉｉｉ）ＶＨ３−１３、ＤＨ１−２６、ＪＨ４、ＶＫ１−５、およびＪＫ１からなる群より選択される生殖系列遺伝子組み合わせ由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる、ヒト抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって測定した場合に、約１ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。一定の実施形態では、本発明の抗体は、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約５０ｐＭ以下のＫＤを示す。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、本明細書中に記載のように、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴アッセイ、またはＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ＸＭＡＰ（登録商標）テクノロジーによって決定した場合、配列番号４７６のｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合するが、関連タンパク質（ヒトアンギオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３；配列番号４８５）など）と交差反応しない抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＬＰＬ活性を減少させることが公知であり、且つＮ末端コイルドコイル領域およびＣ末端フィブリノゲン様ドメインを有する別の分泌タンパク質である（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４３：４１８０４−４１８０９）。関連する実施形態では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合し、且つｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と交差反応する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一定の実施形態では、ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントのｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に対する結合親和性は、該抗体または該フラグメントのｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に対する結合親和性の約７５％以下または約５０％以下である。別の関連する実施形態では、本発明は、マウスＡＮＧＰＴＬ４（ｍＡＮＧＰＴＬ４：配列番号４７８）と交差反応しないが、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｎ末端１〜１４８残基のアミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号４９０および４８９として示す）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ；Ｎ末端１〜１４８残基のアミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４９２および４９１として示す）のＡＮＧＰＴＬ４と交差反応する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３４】
本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。いくつかの適用では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変（すなわち、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためのフコース部分の除去）は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用では、Ｎ−グリコシル化部位の除去により、治療抗体に対する望ましくない免疫反応を減少させるか、抗体の親和性を増加させることができる。さらに他の適用では、ガラクトシル化を改変して補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変することができる。
【００３５】
第８の態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を特徴とする。１つの実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。第２の治療薬は、１つ以上の任意の薬剤、例えば、（１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼインヒビター（セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなど）；（２）コレステロール取り込みおよび／または胆汁酸再吸収のインヒビター；（３）リポタンパク質の異化を増加させるナイアシン；（４）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを減少させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルおよびＴＧレベルを改善し、非致死性心臓発作数を減少させるフィブラートまたは両親媒性カルボン酸、および（５）コレステロール排除で役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベーター、例えば、２２−ヒドロキシコレステロール、またはエゼチミブ＋シンバスタチンなどの固定組み合わせ；スタチンと胆汁樹脂（ｂｉｌｅ ｒｅｓｉｎ）（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、ナイアシン＋スタチンの固定組み合わせ（例えば、ナイアシンとロバスタチン）；または他の脂質低下薬（ω−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）など）であり得る。さらに、第２の治療薬は、１つ以上のＡＮＧＰＴＬ４の他のインヒビター、ならびにＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（脂質代謝、特にコレステロールおよび／またはトリグリセリドホメオスタシスに関与する）などの他の分子のインヒビターであり得る。これらの分子のインヒビターには、これらの分子に特異的に結合してその活性を遮断する小分子および抗体が含まれる。
【００３６】
関連する実施形態では、第２の治療薬は、１つ以上の抗がん剤（化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬、およびがんまたは他の増殖性疾患もしくは障害を処置することが当該分野で周知の他の薬剤など）、および基礎をなすがん／腫瘍に伴う症状の回復および／または低下のための他の治療薬、例えば、鎮痛薬、抗炎症薬、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）であり得る。
【００３７】
第９の態様では、本発明は、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体の抗原結合部分を使用したｈＡＮＧＰＴＬ４活性の阻害方法であって、治療方法が、治療有効量の本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントおよび任意選択的に１つ以上の上記のさらなる治療薬を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法を特徴とする。処置される疾患または障害は、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体処置を使用しない処置と比較して、ＡＮＧＰＴＬ４活性の除去、阻害、または減少によって改善、回復、阻害、または防止されるか、その出現率が減少する任意の疾患または状態である（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害）。本発明の方法によって処置可能な疾患または障害の例には、脂質代謝に関与する疾患または障害（高脂血症、高リポタンパク質血症、および脂質異常症（アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症が含まれる）、高トリグリセリド血症（ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬの重症高トリグリセリド血症が含まれる）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合型脂質異常症（肥満、代謝症候群、糖尿病など）、脂肪異栄養症、および脂肪組織萎縮など（例えば、ＬＰＬ活性の減少および／またはＬＰＬ欠損、ＬＤＬ受容体活性の減少および／またはＬＤＬ受容体欠損、ＡｐｏＣ２の変化、ＡｐｏＥ欠損、ＡｐｏＢの増加、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増加および／または排除の減少、一定の薬物処置（例えば、糖質コルチコイド処置誘導性脂質異常症）、任意の遺伝的素因、食事、および生活様式などに起因する）など）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法はまた、高脂血症、高リポタンパク質血症、および／または脂質異常症に関連するかこれに起因する疾患または障害（例えば、心血管疾患または障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧症、アンギナ、卒中、脳血管疾患、鬱血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞、および末梢血管疾患、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、血糖障害（糖尿病など）、および肥満が含まれるが、これらに限定されない）を防止するか処置することができる。
【００３８】
本発明の方法によって処置可能な疾患または障害の他の例には、がん／腫瘍ならびに非新生物性血管形成関連疾患または障害（血管新生眼疾患または障害（加齢性黄斑変性、網膜中心静脈閉塞または網膜静脈分枝閉塞、糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症など）が含まれる）、炎症性疾患または障害（関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、および乾癬など）が含まれる。
【００３９】
他の実施形態は、次の詳細な説明の概観から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、抗体Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、抗体Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の配列アラインメントを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、野生型マウス（図３Ａ）およびヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＡｎｇｐｔｌ４（＋／＋）マウスまたは「ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウス」）（図３Ｂ）における抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態学的クリアランスを示す。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（□）、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ（▲）、およびｈＩｇＧ４コントロール（●）。
【図４】図４は、ＡｐｏＥヌルマウスと交配させたヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける血清トリグリセリド（ＴＧ）レベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）の影響を示す。無関係の特異性を有するコントロール抗体と比較した、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２による血清ＴＧレベルの変化率（％）を示す。コントロールＡｂ（白丸）およびＨ４Ｈ２６８Ｐ２（黒四角）。
【図５】図５は、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）およびＴＧ低下薬フェノフィブラートの単独または組み合わせの影響を示す。
【図６】図６は、肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）における、脂質のなかでも、特に絶食血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の影響についての第Ｉ相パイロット研究の結果を示す。全てのサルに、−５日目にビヒクル（１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６）を静脈内（ＩＶ）注入し、０日目にＨ４Ｈ２６８Ｐ２（ｎ＝３）（●）またはＨ４Ｈ２８４Ｐ（ｎ＝３）（□）のいずれかを１０ｍｇ／ｋｇＩＶ注入した。血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取した。各動物についての平均ベースラインを、−７、−５、および０日目に採取したサンプルに基づいて決定し、ベースラインからの血清ＴＧレベルの変化率（％）を決定し、各Ａｂ群について平均化した。
【図７】図７は、ビヒクル注入工程を省略したこと以外は図６に記載したものと同様の、肥満サルにおける絶食血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）の影響についての第ＩＩ相パイロット研究の結果を示す。−７、−３、および０日目に採取したサンプルに基づいて、各サルについての平均ベースラインを得た。サルをそのベースラインに基づいて以下の群に分けた：Ａ．ＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝３；□）、Ｂ．１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４；●）、およびＣ．ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝１；▽）。ベースラインからの絶食ＴＧレベルの変化率（％）を、各サルについて決定し、各群について平均化した。
【００４１】
全グラフ中のエラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、記載の特定の方法および実験条件は変化し得るので、本発明がこれらに制限されないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書中で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことも理解すべきである。
【００４３】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。
【００４４】
定義
用語「ヒトアンギオポエチン様タンパク質４」または「ｈＡＮＧＰＴＬ４」は、本明細書中で使用する場合、配列番号４７５に示す核酸配列および配列番号４７６のアミノ酸配列を有するｈＡＮＧＰＴＬ４、またはその生物学的に活性なフラグメントをいう。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書中で使用する場合、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される免疫グロブリン分子をいうことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および重鎖定常領域（ＣＨ；ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域（これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在している）にさらに分類することができる。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。
【００４６】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。結合に関して、１つまたは２つのＣＤＲを省くことができる抗体が科学文献中に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９）は、公開された結晶構造に基づいて抗体とその抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基のわずか約１／５から１／３しか抗原に実際に接触していないと結論づけた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが抗原に接触しているアミノ酸を持たない抗体を多数見い出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５−４２８も参照のこと）。
【００４７】
抗原に接触しないＣＤＲ残基を、以前の研究（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５はしばしば必要でない）に基づいて、分子モデリングおよび／または経験的にＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔＣＤＲ領域から同定することができる。ＣＤＲまたはその残基を省く場合、通常、別のヒト抗体配列またはかかる配列のコンセンサス中の対応する位置を占めるアミノ酸に置換する。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するためのアミノ酸も経験的に選択することができる。経験的置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【００４８】
用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体が含まれることを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用する場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されているｍＡｂが含まれることを意図しない。
【００４９】
本明細書中に開示の完全なヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体は、対応する生殖系列配列と比較して重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域中および／またはＣＤＲ領域中に１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含むことができる。かかる変異を、本明細書中に開示のアミノ酸配列を、例えば、公的な抗体配列データベースから利用可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書中に開示の任意のアミノ酸配列に由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸が、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基、別のヒト生殖系列配列の対応する残基へと変異しているか、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換がおきている（かかる配列の変化を、本明細書中で集合的に「生殖系列変異」という）。当業者は、本明細書中に開示の重鎖および軽鎖可変領域の配列から開始して、１つ以上の個別の生殖系列の復帰変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。一定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内の全てのフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基を、抗体が由来する元の生殖系列配列で見い出される残基に復帰変異させる。他の実施形態では、一定の残基のみ（例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内またはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見い出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見い出される変異残基のみ）を元の生殖系列配列に復帰変異させる。他の実施形態では、１つ以上のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基を、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体がもともと由来する生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異させる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含むことができる（例えば、一定の個別の残基を特定の生殖系列配列の対応する残基に変異させ、元の生殖系列配列と異なる一定の他の残基を維持するか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異させる）。一旦得られると、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントを、１つ以上の所望の性質（結合特異性の改善、結合親和性の増加、拮抗的または作動的（場合による）な生物学的性質の改善または増強、免疫原性の減少など）について容易に試験することができる。この一般的様式で得た抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に含まれる。
【００５０】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書中に開示の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のバリアントを含む抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書中に開示の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列と比較して１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、２個、または１個の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。１つの実施形態では、ＨＣＶＲは、１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＨＣＶＲは、２または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ＬＣＶＲは、１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＬＣＶＲは、２または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
特に記載されない限り、用語「抗体」は、本明細書中で使用する場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、およびその抗原結合フラグメントを含むと理解されるものとする。用語、抗体の「抗原結合部分」および抗体の「抗原結合フラグメント」などは、本明細書中で使用する場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在するか、酵素的に得ることができるか、合成であるか、遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、任意の適切な標準的技術（タンパク質分解消化または組換え遺伝子操作技術（抗体可変ドメインおよび（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む）など）を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。かかるＤＮＡは公知であり、そして／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージディスプレイ抗体ライブラリーが含まれる）から容易に得ることができるか、合成することができる。化学的または分子生物学技術の使用によってＤＮＡを配列決定し、操作して、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な立体配置に配置するか、コドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を改変、付加、または欠失することなどができる。
【００５２】
抗原結合フラグメントの非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が含まれる。他の操作された分子（二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、およびミニボディなど）はまた、本明細書中で使用する場合、表現「抗原結合フラグメント」内に含まれる。
【００５３】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するかインフレームで存在する少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインを、任意の適切な配置で相互に関連させて配置することができる。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含むことができる。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含むことができる。
【００５４】
一定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含むことができる。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見い出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置（上記列挙の任意の例示的な立体配置が含まれる）では、可変ドメインおよび定常ドメインを、相互に直接連結することができるか、完全なまたは部分的なヒンジ領域またはリンカー領域によって連結することができる。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に柔軟性または半柔軟性の連結が得られる少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個、またはそれを超える）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、相互に非共有結合した、および／または１つ以上の単量体ＶＨドメインまたはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）、上記列挙の任意の可変ドメインおよび定常ドメインの立体配置のホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
【００５５】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメイン（ここで、各可変ドメインは別々の抗原または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる）を含むであろう。任意の多重特異性抗体形式（本明細書中に開示の例示的な二重特異性抗体形式が含まれる）を、当該分野で利用可能な日常的技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントに関連する使用に適応させることができる。
【００５６】
一定の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントを、治療部分（細胞毒素、化学療法剤、免疫抑制薬、または放射性同位体など）に結合体化することができる（「免疫結合体」）。
【００５７】
用語「特異的に結合する」などは、抗体またはその抗原結合フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合を、約１×１０−６Ｍ以下（すなわち、ＫＤが小さいほど結合が緊密であることを示す）の平衡解離定数（ＫＤ）によって特徴づけることができる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当該分野で周知であり、例えば、平衡透析および表面プラズモン共鳴などが含まれる。しかし、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種由来のＡＮＧＰＴＬ４分子（例えば、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）および／または配列番号４８５のアミノ酸配列を有するｈＡＮＧＰＴＬ３など）に交差反応性を示し得る。さらに、ｈＡＮＧＰＴＬ４および１つ以上のさらなる抗原に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、それにもかかわらず、本明細書中で使用する場合、ｈＡＮＧＰＴＬ４に「特異的に結合する」抗体と見なされる。
【００５８】
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定した場合、ｈＡＮＧＰＴＬ４に対する結合親和性（ＫＤとして示す）が約１×１０−９Ｍ以下、約０．５×１０−９Ｍ以下、約０．２５×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、または約０．５×１０−１０Ｍ以下である抗体をいう。
【００５９】
用語「ＫＤ」は、本明細書中で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいうことが意図される。
【００６０】
用語「スローオフレート（ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ）」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって決定した場合、１×１０−３ｓ−１以下、好ましくは１×１０−４ｓ−１以下の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ４から解離する抗体を意味する。
【００６１】
用語「内因性親和性定数」または「ｋａ」は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって決定した場合、約１×１０３Ｍ−１ｓ−１以上の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ４に会合する抗体を意味する。
【００６２】
「単離された抗体」は、本明細書中で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他のｍＡｂを実質的に含まない抗体をいうことが意図される（例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、ｈＡＮＧＰＴＬ４以外の抗原に特異的に結合するｍＡｂを実質的に含まない）。しかし、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種（カニクイザルなど）由来のＡＮＧＰＴＬ４分子および／または他の関連するタンパク質（ヒトＡＮＧＰＴＬ３など）など）に交差反応性を有し得る。
【００６３】
「中和抗体」は、本明細書中で使用する場合（または「ＡＮＧＰＴＬ４活性を中和する抗体」）、ＡＮＧＰＴＬ４への結合によってＡＮＧＰＴＬ４の少なくとも１つの生物学的活性を阻害する抗体をいうことが意図される。ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的活性の阻害を、当該分野で公知のいくつかの標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（以下の実施例も参照のこと）のうちの１つ以上によるＡＮＧＰＴＬ４生物学的活性の１つ以上の指標の測定によって評価することができる。
【００６４】
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書中で使用する場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用したバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの生体特異的相互作用を分析することができる光学的現象をいう。
【００６５】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の領域である。エピトープを、構造的エピトープまたは機能的エピトープと定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーションエピトープでもあり得る（すなわち、非線状アミノ酸から構成される）。一定の実施形態では、エピトープは、分子の化学的に活性な表面群（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など）である決定基を含むことができ、一定の実施形態では、特異的な三次元構造特性および／または特異的な電荷特性を有し得る。
【００６６】
用語「実質的同一性」または「実質的に同一な」は、核酸またはそのフラグメントをいう場合、以下に考察のように、任意の周知の配列同一性アルゴリズム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなど）によって測定したときに、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を使用して最適にアラインメントした場合にヌクレオチド配列同一性がヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを示す。
【００６７】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似の」は、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、類似率または類似度は、置換の保存性について補正するために、増加するように調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミン。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示のＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有する任意の変化である。
【００６８】
ポリペプチドの配列類似性を、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変（保存的アミノ酸置換が含まれる）に割り当てられた類似性の基準を使用して類似の配列を対応させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、密接に関連するポリペプチド（生物の異なる種由来の相同ポリペプチドなど）の間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するための、デフォルトパラメーターと共に使用することができるプログラム（ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなど）を含む。例えば、ＧＣＧ バージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列を、デフォルトパラメーターまたは推奨されるパラメーターを使用するＦＡＳＴＡ（ＧＣＧバージョン６．１中のプログラム）を使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一率を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前出）。本発明の配列を異なる種由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用したコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ ４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ４０２を参照のこと。
【００６９】
語句「治療有効量」は、所望の効果が得られる投与量を意味する。正確な量は処置目的、処置される被験体の年齢およびサイズ、および投与経路などに依存し、公知の技術を使用して当業者が確認可能であろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【００７０】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウス中でのヒト抗体の生成方法は、当該分野で公知である。任意のかかる公知の方法を、本発明に照らして使用して、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【００７１】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥＴＭテクノロジーまたは任意の他の公知のモノクローナル抗体生成方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＡＮＧＰＴＬ４に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験の部にあるように、抗体を特徴付け、所望の特徴（親和性、選択性、およびエピトープなどが含まれる）について選択する。
【００７２】
一般に、本発明の抗体は、固相上に固定されているか液相中の抗原への結合によって測定した場合、典型的には約１０−１２Ｍ〜約１０−９ＭのＫＤを有する非常に高い親和性を有する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域（例えば、野生型のＩｇＧ１（配列番号４８１）もしくはＩｇＧ４（配列番号４８２）または改変されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４（例えば、配列番号４８３））と置換して、本発明の完全なヒト抗体を生成する。特定の用途にしたがって選択した定常領域が変化し得る一方で、抗体の高親和性抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域内に存在する。
【００７３】
エピトープマッピングおよび関連テクノロジー
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、日常的な交差ブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載のアッセイなど）を行うことができる。他の方法には、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−６３）、またはペプチド切断分析が含まれる。さらに、エピトープ切り出し（ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。
【００７４】
用語「エピトープ」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。Ｂ細胞エピトープを、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露した状態で保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒での処理によって喪失する。エピトープは、典型的には固有の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３、より通常には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００７５】
改変支援プロファイリング（ＭＡＰ）（抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロフィールの類似性にしたがって同一抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリーに分ける方法である（ＵＳ ２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって示されたエピトープと明らかに異なるか部分的に重複する固有のエピトープを反映し得る。このテクノロジーにより、遺伝的に同一のｍＡｂを迅速にフィルタリングすることが可能となり、これにより特徴付けを遺伝的に異なるｍＡｂに集中させることができるようになる。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を容易にすることができる。ＭＡＰを使用して、本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４ｍＡｂを異なるエピトープに結合するｍＡｂ群に分類することができる。
【００７６】
ＡＮＧＰＴＬ４はアミノ末端コイルドコイルドメインおよびカルボキシル末端フィブリノゲン様ドメインを含み、全長ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質は分子間ジスルフィド結合によって保持されたオリゴマーを形成する（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７９（３）：２０３８−２０４５）。Ｎ末端コイルドコイルドメインがＡＮＧＰＴＬ４のオリゴマー化を媒介し（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，前出）、ＬＰＬ活性の阻害で重要でもあると報告されている（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６：１４８４−１４９０およびＯｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４１８０４−４１８０９）。したがって、一定の実施形態では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体の抗原結合フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６）のＮ末端コイルドコイルドメイン（残基１〜１２３）内のエピトープに結合する。一定の実施形態では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６）の約残基１〜約残基２５、約残基２５〜約残基５０、約残基５０〜約残基７５、約残基７５〜約残基１００、約残基１００〜約残基１２５、約残基１２５〜約残基１５０の領域内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメイン内の１つを超える列挙したエピトープを含むエピトープに結合する。他の実施形態では、ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントは、１つ以上のｈＡＮＧＰＴＬ４のフラグメント（例えば、配列番号４７６の残基２６〜４０６、残基２６〜１４８、残基３４〜６６、および／または残基１６５〜４０６のフラグメント）に結合する。
【００７７】
本発明は、本明細書中に記載の抗体の具体例のいずれかと同一のエピトープに結合するｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書中に記載の抗体の具体例のいずれかとｈＡＮＧＰＴＬ４またはｈＡＮＧＰＴＬ４フラグメントへの結合を競合する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。
【００７８】
当該分野で公知の日常的方法の使用によって抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と同一のエピトープと結合するか否か、または結合を競合するか否かを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と同一のエピトープに結合するか否かを決定するために、参照抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、試験抗体がｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合する能力を評価する。試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ４に結合することができる場合、試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。他方では、試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体によって結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することができる。
【００７９】
抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と結合を競合するか否かを決定するために、上記結合方法を、以下の２つの方向性で行う。第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４分子と結合させ、その後に試験抗体のｈＡＮＧＰＴＬ４分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合させ、その後に参照抗体のＡＮＧＰＴＬ４分子への結合を評価する。両方の方向性で第１の（飽和）抗体のみがＡＮＧＰＴＬ４分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体がｈＡＮＧＰＴＬ４への結合を競合すると結論づける。当業者に認識されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、参照抗体と同一のエピトープに必ずしも結合しなくてもよいが、重複エピトープまたは隣接エピトープへの結合によって参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【００８０】
それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、２つの抗体は同一または重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合に、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の一方の抗体が、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を減少または排除させる抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少または排除させる場合、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または排除させるいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少または排除させる場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【００８１】
次いで、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を行って、認められた試験抗体結合の欠如が実際に参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するか否か、または立体的遮断（または別の現象）が認められた結合の欠如に関与するか否かを確認することができる。この種の実験を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
【００８２】
免疫結合体
本発明は、治療部分（細胞毒素、化学療法剤、免疫抑制薬、または放射性同位体など）に結合体化したヒト抗ＡＮＧＰＴＬ４モノクローナル抗体（「免疫結合体」）を含む。細胞毒素薬には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫結合体形成に適切な細胞毒素薬および化学療法薬の例は、当該分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１号を参照のこと）。
【００８３】
二重特異性
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性ｍＡｂは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、１つを超える標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照のこと。ヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４ｍＡｂを、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結するか、またはこれらと共に発現することができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはその他によって）１つ以上の他の分子的実体（別の抗体または抗体フラグメントなど）に機能的に連結させて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。
【００８４】
本発明と関連して使用することができる例示的な二重特異性抗体形式は第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは相互に少なくとも１つのアミノ酸が異なり、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して少なくとも１つのアミノ酸の相違によって二重特異性抗体のプロテインＡへの結合が減少する。１つの実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡ結合を減少させるか無効にする変異（Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）など）を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含むことができる。第２のＣＨ３内で見い出すことができるさらなる修飾には、以下が含まれる：Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ１抗体の場合）；Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ２抗体の場合）；およびＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ４抗体の場合）。上記の二重特異性抗体形式の変形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００８５】
生物学的等価性
本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗体フラグメントは、記載のｍＡｂと異なるが、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。かかるバリアントｍＡｂおよび抗体フラグメントは、親配列と比較した場合に１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載のｍＡｂと本質的に等価な生物学的活性を示す。同様に、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示の配列と比較した場合に１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体フラグメントに本質的に生物学的に等価な抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体のフラグメントをコードする配列を含む。かかるバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記で考察されている。
【００８６】
２つの抗原結合タンパク質（すなわち、抗体）は、例えば、類似の実験条件下にて単回用量または複数回用量のいずれかで同一のモル用量で投与した場合にその吸収速度および吸収程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的に等価と見なされる。いくつかの抗体は、その吸収程度が等価であるが、吸収速度が等価でない場合に等価物または薬学的代替物と見なされ、依然として生物学的に等価と見なすことができる。なぜならば、かかる吸収速度の相違は意図的なものであり、標識に反映され、例えば、慢性使用における有効な体内薬物濃度の達成に不可欠ではなく、且つ研究した特定の薬物製品に関して医学的に些細なことであると見なされるからである。１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、および効力において臨床的に有意義な相違が存在しない場合、生物学的に等価である。
【００８７】
１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、かかる切り換えを使用しないで治療を継続した場合と比較して、有害作用（免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減少が含まれる）のリスクの予想される増加を伴わずに、患者が参照生成物と生物学的製剤とを１回以上切り換えることができる場合に生物学的に等価である。
【００８８】
１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、使用の条件に関して共通の作用機構によって、かかる機構が公知である範囲で両方とも作用する場合に生物学的に等価である。
【００８９】
生物学的等価性を、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって示すことができる。生物学的等価性の測定には、例えば、（ａ）血液中、血漿中、血清中、または他の体液中の抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験、（ｂ）ヒトのｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的利用能データと相関しており、且つ合理的に予想されるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な薬理学的急性効果を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、生物学的利用能、または生物学的等価性を確立する十分に制御された臨床試験が含まれる。
【００９０】
本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の生物学的に等価なバリアントを、例えば、生物学的活性に必要のない残基または配列の種々の置換、または末端または内部の残基または配列の欠失によって構築することができる。例えば、生物学的活性に不可欠ではないシステイン残基を欠失させるか他のアミノ酸と置換して、復元の際の不必要か不正確な分子内ジスルフィド結合架橋の形成を防止することができる。
【００９１】
治療的投与および処方物
本発明は、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物、およびこれらの治療的使用方法を提供する。本発明の治療組成物を、適切なキャリア、賦形剤、および処方物に組み込まれる他の薬剤と共に投与することで、伝達、送達、および耐性などが改善されるであろう。多数の適切な処方物を、全ての薬剤師に公知の処方集（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）中に見い出すことができる。これらの処方物には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（リポフェクチンＴＭなど）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型のエマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【００９２】
用量は、投与すべき被験体の年齢およびサイズ、標的疾患、処置の目的、状態、および投与経路などに応じて変化し得る。本発明の抗体を成人患者におけるＡＮＧＰＴＬ４に直接または間接的に関連する種々の状態および疾患（高コレステロール血症、ＬＤＬおよびアポリポタンパク質Ｂに関連する障害、および脂質代謝障害などが含まれる）の処置のために使用する場合、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内または皮下に投与することが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および継続時間を調整することができる。一定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを、初回量として少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇまで、または約５０ｍｇまで投与することができる。一定の実施形態では、初回量の後に、初回量とほぼ同量または初回量より少量であり得る量において、第２または複数のその後の抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を施すことができ、その後の投与は、少なくとも１〜３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間の間隔をあける。
【００９３】
種々の送達系が公知であり、送達系を使用して本発明の薬学的組成物（例えば、リポソーム中の被包、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス）を投与することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物を、任意の都合の良い経路（例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を介した吸収）によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。
【００９４】
小胞、特にリポソーム中の薬学的組成物を送達させることもできる（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと；一般に同書を参照のこと）。
【００９５】
一定の状況では、薬学的組成物を、制御放出系で送達させることができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）を参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって、全身用量の一部のみが必要である（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８，１９８４を参照のこと）。
【００９６】
注射用調製物には、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴注入などのための投薬形態が含まれ得る。これらの注射用調製物を、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物を、例えば、従来より注射のために使用されている滅菌水性媒質または油性媒質への上記の抗体またはその塩の溶解、懸濁、または乳化によって調製することができる。注射用水性媒質として、例えば、生理学的食塩水、グルコースおよび他の助剤を含む等張液などが存在し、これらを、適切な可溶化剤（アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物））など）と組み合わせて使用することができる。油性媒質として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、これらを、可溶化剤（安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど）と組み合わせて使用することができる。このようにして調製した注射剤を、好ましくは、適切なアンプルに充填する。本発明の薬学的組成物を、標準的な針およびシリンジを使用して皮下または静脈内に送達させることができる。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の送達に容易に適用される。かかるペン送達デバイスは、再利用可能であるか、使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換式カートリッジを使用する。一旦カートリッジ内の全ての薬学的組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを、容易に破棄して薬学的組成物を含む新規のカートリッジと交換することができる。次いで、ペン送達デバイスを再利用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換式カートリッジが存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、あらかじめ充填された薬学的組成物がデバイス内のリザーバ中に保持されている。一旦リザーバ中の薬学的組成物が空になると、デバイス全体を破棄する。
【００９７】
多数の再利用可能なペンおよび自動注入送達デバイスが、本発明の薬学的組成物の皮下送達で適用される。ほんの数例を挙げれば、ＡＵＴＯＰＥＮＴＭ（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣＴＭペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５ＴＭペン、ＨＵＭＡＬＯＧＴＭペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０ＴＭペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮＴＭＩ，ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤＴＭペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴＴＭ、およびＯＰＴＩＣＬＩＫＴＭ（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などがあるが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達で適用される使い捨てペン送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲＴＭペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮＴＭ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００９８】
有利には、上記の経口または非経口用の薬学的組成物を、活性成分の用量にふさわしい適切な単位用量の投薬形態に調製する。単位用量のかかる投薬形態には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。前述の抗体の含有量は、一般に、単位用量の投薬形態（特に注射形態）あたり約０．１〜約８００ｍｇであり、前述の抗体は、他の投薬形態のために約１〜約５００ｍｇ、約５〜３００ｍｇ、約８〜２００ｍｇ、および約１０〜約１００ｍｇで含まれる。
【００９９】
組み合わせ療法
本発明は、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせた本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントの投与によるｈＡＮＧＰＴＬ４に直接または間接的に関連する疾患または障害の処置のための治療方法をさらに提供する。さらなる治療薬は、本発明の抗体またはそのフラグメントと有利に組み合わせられる１つ以上の任意の薬剤、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（セリバスタチン（ｃｅｒｏｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン（ｐｉｔａｖａｓｔｉｎ）、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなど）；ナイアシン；種々のフィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、およびゲムフィブロジルなど）；およびＬＸＲ転写因子アクチベーターであり得る。さらに、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントを、他のＡＮＧＰＴＬ４インヒビターならびにＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（脂質代謝、特にコレステロールおよび／またはトリグリセリドホメオスタシスに関与する）などの他の分子のインヒビターと共投与することができる。これらの分子のインヒビターには、これらの分子に特異的に結合してその活性を遮断する小分子および抗体が含まれる（例えば、ＵＳ ２０１０／０１６６７６８Ａ１に開示の抗ＰＣＳＫ９抗体を参照のこと）。
【０１００】
さらに、さらなる治療薬は、１つ以上の抗がん剤（化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬など）およびがんまたは他の増殖性疾患または障害を処置するための当該分野で周知の他の薬剤であり得る。抗がん剤の例には、抗有糸分裂剤（ドセタキセルおよびパクリタキセルなど）、プラチナベースの化学療法化合物（シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、およびオキサリプラチンなど）、または他の従来の細胞毒性薬（５−フルオロウラシル、カペシタビン、イリノテカン、ロイコボリン、およびゲムシタビンなど）、および抗血管新生薬、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および受容体ベースのＶＥＧＦ遮断薬、例えば、米国特許第７，０７０，９５９号明細書中に記載の「ＶＥＧＦトラップ」、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）アンタゴニスト（米国特許出願公開第２００８／０１８１８９９号明細書中に記載の抗Ｄｌｌ４抗体など）、およびＤｌｌ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１０７６４８号明細書中に記載のＤｌｌ４−Ｆｃ）；受容体チロシンキナーゼおよび／または血管形成のインヒビター（ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）、スニチニブ（スーテント（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、パゾパニブ（ボトリエントＴＭ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、トセラニブ（パラディアＴＭ、Ｐｆｉｚｅｒ）、バンデタニブ（ザクチマＴＭ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、セジラニブ（レセンチン（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ ７３−４５０６、Ｂａｙｅｒ）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６、Ｐｆｉｚｅｒ）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ゲフィチニブ（イレッサＴＭ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＩＢＷ２９９２（トボックＴＭ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ラパチニブ（タイカーブ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、およびネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ）などが含まれる）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、他の治療薬（鎮痛薬、および抗炎症薬（非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）が含まれる）など）を本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントと共投与して、基礎をなすがん／腫瘍に伴う症状を回復および／または低下させることもできる。
【０１０１】
本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントおよびさらなる治療薬を、一緒に、または別々に共投与することができる。別々の投薬処方物を使用する場合、本発明の抗体またはそのフラグメントおよびさらなる薬剤を、同時投与してもよく、または交互に（すなわち、逐次）適切な順序で別々に投与してもよい。
【０１０２】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を使用して、例えば、診断目的のためにサンプル中のＡＮＧＰＴＬ４を検出および／または測定することもできる。例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂまたはそのフラグメントを使用して、ＡＮＧＰＴＬ４の異常な発現（例えば、過剰発現、低発現、発現の欠如など）によって特徴づけられる状態または疾患を診断することができる。例示的なＡＮＧＰＴＬ４の診断的アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂと接触させる工程を含むことができ、ここで、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されているか、またはこの抗体を使用して患者サンプルからＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を選択的に捕捉し、単離する。あるいは、非標識の抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂを、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断的適用で使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３１Ｉ、または１２５Ｉなど）、蛍光部分または化学発光部分（フルオレセインイソチオシアナートまたはローダミンなど）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはルシフェラーゼなど）であり得る。サンプル中のＡＮＧＰＴＬ４を検出または測定するために使用することができるアッセイには、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）などが含まれる。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例を、当業者に本発明の方法および組成物の作製および使用方法を完全に開示および説明するために示し、発明者らが発明者らの発明と見なす範囲を制限することを意図しない。使用した数値に関して正確さを保証する努力をしているが、いくつかの実験上のエラーおよび偏りが存在するはずである。他で示さない限り、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１０４】
実施例１：ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対するヒト抗体の生成
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥＴＭマウスを、ヒトＡＮＧＰＴＬ４を使用して免疫化し、これらのマウスから得た血清を使用した抗原特異的免疫アッセイによって抗体免疫応答をモニタリングした。抗ｈＡＮＧＰＴＬ４発現Ｂ細胞を、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体力価の上昇が認められた免疫化マウスの脾臓から採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させた。下記のアッセイを使用して、ハイブリドーマをスクリーニングおよび選択し、ｈＡＮＧＰＴＬ４特異的抗体を発現する細胞株を同定した。アッセイによってキメラ抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を産生したいくつかの細胞株が同定され、これらを、Ｈ１Ｍ２２２、Ｈ１Ｍ２２３、Ｈ１Ｍ２２４、Ｈ１Ｍ２２５、Ｈ１Ｍ２３４、およびＨ１Ｍ２３６と命名した。
【０１０５】
ＵＳ ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載のように、ヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的抗体も、骨髄腫細胞に融合しない抗原免疫化Ｂ細胞から直接単離した。重鎖および軽鎖可変領域をクローン化して、完全なヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ１Ｈ２５７、Ｈ１Ｈ２６８、Ｈ１Ｈ２８３、Ｈ１Ｈ２８４、Ｈ１Ｈ２８５、Ｈ１Ｈ２９１、Ｈ１Ｈ２９２、Ｈ１Ｈ２９５、Ｈ１Ｈ６２４、Ｈ１Ｈ６３７、Ｈ１Ｈ６３８、Ｈ１Ｈ６４４、およびＨ１Ｈ６５３と命名）を生成した。安定な組換え抗体発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。
【０１０６】
実施例２．可変遺伝子利用分析
産生された抗体の構造を分析するために、抗体の可変領域をコードする核酸をクローン化し、配列決定した。抗体の核酸配列および推定アミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の遺伝子使用を同定した。表１は、選択した本発明の抗体についての遺伝子使用を示す。
【０１０７】
【表１】
表２は、選択された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列対およびその対応する抗体識別名を示す。Ｎ、Ｐ、およびＬの表記は、同一のＣＤＲ配列を有するが、ＣＤＲ配列の外側の領域中（すなわち、フレームワーク領域中）に配列変形を有する重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。したがって、特定の抗体のＮ、Ｐ、およびＬバリアントは、その重鎖および軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域内が改変されている。
【０１０８】
【表２】
実施例３．ｈＡＮＧＰＴＬ４結合親和性の決定
マウスＩｇＧ２ａに直列に融合したヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ；配列番号４８０）のアミノ酸残基２６〜１４８に結合する選択された抗体への抗原結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ１００）を使用して表面動態によって決定した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを、遊離アミノ基を介してＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップに化学的にカップリングしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉した。種々の濃度（１２．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲）の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を、捕捉された抗原表面上に９０秒間注入した。抗原−抗体結合および解離を、２５℃および３７℃にてリアルタイムでモニタリングした。動態分析を行って、抗原／抗体複合体解離のＫＤおよび半減期を計算した。結果を表３に示す。ヒト抗ＥＧＦＲ抗体を、捕捉したｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃに結合しないネガティブコントロールとして使用した。
【０１０９】
【表３】
Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐについて、Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって調製し、標準的な精製方法によって精製し、本質的に上記の方法にしたがって、ｈＡＮＧＰＴＬ４に対するその結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムを使用して２５℃、ｐＨ７．２およびｐＨ５．７５で測定した。簡潔に述べれば、種々の濃度（３．１２５ｎＭ〜１００ｎＭ）の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（すなわち、Ｈ１Ｈ２６８Ｆａｂ、全Ｈ１Ｈ２６８ｍＡｂ、Ｈ１Ｈ２８４Ｆａｂ、および全Ｈ１Ｈ２８４ｍＡｂ）を、低密度抗ｍＦｃ捕捉したｈＡＮＧＰＴＬ４（２６−１４８）−ｍＦｃ（約６８±４ＲＵ）表面上、またはアミノカップリングしたｈＡＮＧＰＴＬ４（２６−４０６）−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（４５０ＲＵ）またはアミノカップリングしたＣ末端ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるカニクイザルＮ末端領域（配列番号４９０のアミノ酸残基１〜１３０）（ＭｆＡＮＧＰＴＬ４（１−１３０）−Ｈｉｓ）（１，０２８ＲＵ）の表面上に注入した。動態分析を行ってｋａおよびｋｄを測定し、抗原／抗体複合体解離のＫＤ値および半減期を計算した。結果を表４（Ｈ１Ｈ２６８Ｐ）および表５（Ｈ１Ｈ２８４Ｐ）に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
【表５】
両Ｆａｂフラグメントは、抗体分子全体よりも低い親和性ではあるが、全てのＡＮＧＰＴＬ４形態に結合することができた。
【０１１２】
実施例４．抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体交差反応の決定
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の関連タンパク質（すなわち、ｈＡＮＧＰＴＬ３、ヒトアンギオポエチン様タンパク質５（ｈＡＮＧＰＴＬ５）、およびマウスＡＮＧＰＴＬ４（ｍＡＮＧＰＴＬ４））に対する交差反応の可能性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムを使用して、選択した抗体（すなわち、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐ）について試験した。簡潔に述べれば、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体および任意のＡＮＧＰＴＬタンパク質に対する結合物質ではないネガティブコントロール（すなわち、２つのモノクローナル抗体（コントロールａおよびコントロールｂ））を、３．１２５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬで、それぞれ、ｈＡＮＧＰＴＬ３−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３８２９−ＡＮ）（５２２８ＲＵ）、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８７−ＡＮ）（６２４７ＲＵ）、ｈＡＮＧＰＴＬ５−Ｈｉｓ（Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号Ｈ００２５３９３５−Ｐ０１）（５２６５ＲＵ）、およびｍＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ（ＡＳリンカーを用いてＣ末端６−ヒスチジンタグと融合したｍＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７８）のＲ２６−Ｓ４１０）（５２３３ＲＵ）のアミンカップリングしたチップ表面に注入した。ｈＡＮＧＰＴＬ３に特異的なポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＢＡＦ３４８５）も試験した。各抗体の結合（比ＲＵ値として示す）を決定し、結果を表６に示す。
【０１１３】
【表６】
Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４ＰはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓのみと特異的に結合したが、いずれの他の関連ＡＮＧＰＴＬタンパク質とも結合しなかった。
【０１１４】
さらに、種々のＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４ペプチドに対するＨ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐの結合親和性も、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムによって決定した。簡潔に述べれば、Ｈ１Ｈ２６８Ｐ（１３４８±１１ＲＵ）およびＨ１Ｈ２８４Ｐ（８６８±１３ＲＵ）を抗ヒトＦｃ表面上に捕捉し、種々の濃度（６２．５ｎＭ〜５００ｎＭ）のｈＡＮＧＰＴＬ３およびｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドを注入した。試験したペプチドは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６のＲ３４〜Ｌ６６）、Ｎ末端ビオチン化ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６のＲ３４〜Ｌ６６）、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号４８５のＲ３６〜Ｉ６８）、およびＮ末端ビオチン化ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号４８５のＲ３６〜Ｉ６８）であった。動態分析を行ってｋａおよびｋｄを測定し、抗原／抗体複合体解離のＫＤ値および半減期を計算した。結果を表７に示す。ＮＢ：記載の実験条件下で結合なし。
【０１１５】
【表７】
ｈＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合した抗体はなかった。さらに、Ｈ１Ｈ２８４Ｐは、最高のペプチド試験濃度（５００ｎＭ）においてさえもいかなるｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドにも結合しない一方で、Ｈ１Ｈ２６８Ｐは両方のｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドに結合することができた。これは、Ｈ１Ｈ２６８Ｐが３４〜６６領域内の線状エピトープを認識することを示唆している。対照的に、Ｈ１Ｈ２８４Ｐは、この領域の外側に結合するか、この領域内の線状エピトープを認識しない。
【０１１６】
実施例５．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ４の阻害
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、ヒトにおける脂質代謝で重要な役割を果たす。ＬＰＬはトリグリセリドの加水分解を触媒し、代謝されることになる脂肪酸を放出する。ＡＮＧＰＴＬ４は、ＬＰＬ活性を阻害して脂質レベルを増加させる（Ｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１（１０）：４７３−４７９）。ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイル領域は、独立で、およびＣ末端フィブリノゲン様領域に連結した場合の両方で、ホモ多量体化する。Ｎ末端領域はまた、Ｃ末端フィブリノゲン領域を伴わずに発現した場合にＬＰＬを阻害する。無細胞バイオアッセイを開発して、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ４誘導性の減少を阻害する能力を決定した。
【０１１７】
選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ４活性の阻害を、ＣＯＮＦＬＵＯＬＩＰＴＭ連続蛍光分析リパーゼ試験（Ｐｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、以下の２つのｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用して決定した：Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグを有する全長ｈＡＮＧＰＴＬ４（すなわち、配列番号４７６のアミノ酸残基２６〜４０６）（ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）およびＮ末端コイルドコイル領域を含むｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）。
【０１１８】
簡潔に述べれば、２ｎＭウシＬＰＬ、０．２５μＭヒトＡｐｏＣＩＩ（ＬＰＬの補因子）、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、および１．６ｍＭ ＣａＣｌ２を、９６ウェルアッセイプレート中であらかじめ混合した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓタンパク質またはｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質のいずれかを、Ａｐｏ／ＬＰＬ混合物にそれぞれ最終濃度１０ｎＭおよび２ｎＭまで添加した。次いで、Ａｐｏ／ＬＰＬ／ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質混合物に、出発濃度３００ｎＭ（ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ阻害用）または１００ｎＭ（ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ阻害用）で連続希釈した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートした（最終容積５０μｌ）。インキュベーション後、２００μｌの再構成リパーゼ基質（１−トリニトロフェニル−アミノ−ドデカノイル−２−ピレンデカノイル−３−０−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール（ＬＳ−Ａ，Ｐｒｏｇｅｎ））を抗体混合物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を使用して３４２ｎｍ／４００ｎｍ（励起／発光）で測定した。蛍光は、ＬＰＬ活性に比例する。結果を表８に示す。コントロールＩ：ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）。コントロールＩＩ：ｈＡＮＧＰＴＬ４に結合しない無関係のヒト抗体。ＮＴ：試験せず。全阻害（すなわち、１００％阻害）を、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体およびＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の非存在下で２ｎＭウシＬＰＬ、０．２５μＭヒトＡｐｏＣＩＩ、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、および１．６ｍＭ ＣａＣｌ２を使用したアッセイの相対蛍光単位（ＲＦＵ）から決定した。
【０１１９】
【表８】
抗体Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐは、試験した抗体（ポリクローナルｈＡＮＧＰＴＬ４抗体コントロールが含まれる）のうちでＬＰＬに対するＡＮＧＰＴＬ４阻害活性の最高の阻害を示した。抗体Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐについて、２ｎＭ ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃの５０％最大阻害に必要な抗体濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ０．８ｎＭおよび１．２ｎＭと決定された。さらに、１０ｎＭ ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓの５０％最大阻害に必要な抗体濃度は、それぞれ０．５ｎＭおよび０．２ｎＭと決定された。
【０１２０】
同様に、Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐを、ＬＰＬバイオアッセイにて以下の異種間オルソログを阻害する能力について試験した：Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグと共に発現するカニクイザルＮ末端領域（アミノ酸残基２６〜１４８）（Ｈｉｓ−ＭｆＡＮＧＰＴＬ４；配列番号４８８）およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグを有するマウス全長オルソログ（配列番号４７８のアミノ酸残基２６〜４１０）（ｍＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ）。表９に示すように、ＬＰＬアッセイにおいてＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用した全用量−応答を最初に実施して各実験についてのＡＮＧＰＴＬ４ ＥＣ５０を決定し、一定濃度のＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用して各抗体のＩＣ５０を決定した。抗体濃度は、０〜１００ｎＭの範囲であった。ＮＢ：遮断なし。
【０１２１】
【表９】
両抗体は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（全長およびＮ末端）およびサルＡＮＧＰＴＬ４（Ｎ末端）両方のタンパク質活性をＩＣ５０約０．３〜０．５ｎＭで阻害したが、いずれの抗体も最高の抗体試験濃度（すなわち、１００ｎＭ）でマウスＡＮＧＰＴＬ４（全長）を阻害しなかった。
【０１２２】
実施例６．血漿脂質レベルに及ぼすＡＮＧＰＴＬ４のｉｎ Ｖｉｖｏでの影響
ｈＡＮＧＰＴＬ４をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与して、血漿脂質レベルに及ぼすｈＡＮＧＰＴＬ４の生物学的影響を決定した。簡潔に述べれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５匹の動物の４つの群に分け、各群に異なる量のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質（配列番号４８０）：マウスあたり２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、および３００μｇを投与した。コントロール群にＰＢＳを注射した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質およびＰＢＳを、尾静脈を介した静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって投与した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃまたはＰＢＳ送達から１５分、３０分、６０分、および１２０分後にマウスから採血し、血漿脂質レベルを、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１６５０化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各用量群についてトリグリセリド、全コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ−Ｃ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を決定した。全コレステロール、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬの測定値は、注射後の各時点で各用量群間で有意差はなかった。２５μｇ／マウスのｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃの注射により、注射３０分後のコントロールマウス（ＰＢＳ）と比較して２倍を超えて循環トリグリセリドが増加した。したがって、下記のように、２５μｇ用量のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体による、血清トリグリセリドレベルのＡＮＧＰＴＬ４誘導性増加の阻害の分析のための可能な最小投薬量として選択した。
【０１２３】
実施例７．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体によるＡＮＧＰＴＬ４のｉｎ Ｖｉｖｏ阻害
別の実験セットでは、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、ｈＡＮＧＰＴＬ４誘導性のトリグリセリドレベルの増加を阻害する能力について試験した。全コレステロール（全−Ｃ）、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬも測定した。簡潔に述べれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、各試験抗体について５匹のマウス群に分けた。５ｍｇ／ｋｇ用量の抗体を皮下注射によって投与した。コントロール群Ｉ（すなわち、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体やｈＡＮＧＰＴＬ４を投与されていないマウス）にＰＢＳを投与した。抗体注射の２４時間後、ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）を、２５μｇ／マウスの用量で各抗体群に投与した（ｉ．ｖ．）。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ注射の３０分後にマウスから採血し、脂質レベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１６５０化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各抗体群またはコントロール群についてのトリグリセリド、全コレステロール、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬの各測定値の平均を計算した。標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、循環抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（血清Ａｂ）レベルも決定した。簡潔に述べれば、血清Ａｂを捕捉するためにヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレートをコーティングした。次いで、血清をプレートに添加し、捕捉された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して化学発光によって検出した。結果（血清脂質濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を、表１０〜１２に示す。コントロールＩ：ＰＢＳを投与したが、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体やｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを投与しなかったマウス。コントロールＩＩ：ＣＤ２０に特異的なヒト抗体（すなわち、ＵＳ ２００８／０２６０６４１に開示の２Ｆ２クローン配列を有するｍＡｂ）およびｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを投与したマウス。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
【表１２】
ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（２５μｇ）の注射後、多くの試験した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（表１０〜１２に示す）は、無関係の抗体（コントロールＩＩ）で処置したマウスと比較して、血清トリグリセリドレベルの有意な減少を示した。
【０１２７】
実施例８．ｈＩｇＧ４アイソタイプを有する抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の調製
ｈＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐを、各定常領域をヒンジ領域内にＳ１０８Ｐ変異を含む配列番号４８３のｈＩｇＧ４アミノ酸配列で置換することによってｈＩｇＧ４アイソタイプに変換した。さらに、単一アミノ酸置換をＨ１Ｈ２６８Ｐ（配列番号４２）のフレームワーク領域１中に導入してＩｇＧ４バージョンのＨ４Ｈ２６８Ｐ２（配列番号４８７）を形成させた。それぞれＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐと命名されたＩｇＧ４抗体のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）結合についてのＫＤ（ｐＭ）値およびｔ１／２値を、上記実施例３のプロトコールにしたがってｐＨ７．４および２５℃でのＢｉａｃｏｒｅによって得た。結果を以下の表１３に示す。
【０１２８】
【表１３】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐを、対応するＩｇＧ１バージョン（それぞれ、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐ）と共に、上記実施例５に記載のようにＬＰＬ阻害アッセイで試験して、ＩＣ５０値を決定した。結果を表１４に示す。ＮＢ：遮断なし。
【０１２９】
【表１４】
このアッセイでは、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐは全長およびＮ末端ｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質について約０．２〜０．７ｎＭの範囲のＩＣ５０を示し、一方で、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４ＰのＩＣ５０は約１．０〜２．０ｎＭの範囲であった。
【０１３０】
実施例９．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態研究
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐの薬物動態学的クリアランス速度を、野生型マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウス）において決定した。野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの両方の系統バックグラウンドは、Ｃ５７ＢＬ６（７５％）および１２９Ｓｖ（２５％）であった。野生型マウスまたはｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウスのいずれかの５匹のマウスからなる個別のコホートに、１ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、または無関係の特異性を有するアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）コントロールを皮下（ｓ．ｃ．）投与した。血液サンプルを、注射０時間後、６時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後、１０日後、および１５日後、２２日後、および３０日後に採取した。ヒト抗体の血清レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べれば、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ）で９６ウェルプレートをコーティングし（濃度１μｇ／ｍＬ）、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＢＳＡでブロッキングした後、６ポイント連続希釈の血清サンプルおよび１２ポイント連続希釈の各抗体の参照標準物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。適切な洗浄緩衝液での洗浄後、捕捉されたヒト抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化した同一のヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ）を使用して検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用した標準的な比色反応によって発色させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。血清中のヒト抗体濃度を、同一のサンプルプレートについて作成した参照標準物曲線を使用して決定した。結果を表１５ならびに図３Ａおよび３Ｂに示す。
【０１３１】
【表１５】
表１５に示すように、それぞれ、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、およびｈＩｇＧ４コントロールについて３０日間にわたって計算した曲線下面積（ＡＵＣ）（約３１８、２００、および１９９（ｈｒ＊μｇ／ｍＬ））に反映されるように、両抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体は、野生型マウスにおいてアイソタイプ適合コントロール抗体に類似のクリアランス速度を示した（図３Ａも参照のこと）。ヒトＡＮＧＰＴＬ４のみを発現するトランスジェニックマウス（ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋））では、ＡＵＣで反映されるクリアランス速度は、野生型マウスにおけるクリアランス速度（それぞれ、３１８および２００ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）と比較して、およびｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウス（１６８ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）または野生型マウス（１９９ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）のいずれかにおけるアイソタイプ適合コントロール抗体のクリアランス速度と比較して、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（３７．０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）およびＨ４Ｈ２８４Ｐ（７．６０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）についてより速かった（図３Ｂも参照のこと）。ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウスでは、Ｈ４Ｈ２８４Ｐについての３０日間ＡＵＣ（７．６０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）は、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（３７．０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）の約１／５であった。まとめると、これらの結果は、両抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するマウスにおいて標的媒介クリアランスを示し、Ｈ４Ｈ２８４ＰがＨ４Ｈ２６８Ｐ２よりクリアランス速度が実質的に速いことを示唆している。
【０１３２】
実施例１０．ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける循環ＴＧレベルに及ぼすＩｇＧ１抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの影響
血清ＴＧレベルに及ぼす抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐの影響を、ヒトＮ末端コイル−コイル領域を含むＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現するマウス（「ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウス」）において決定した。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスを、Ｃ５７ＢＬ６／１２９（Ｆ１Ｈ４）胚性幹細胞中でマウスＡｎｇｐｔｌ４遺伝子の最初の３つのエクソン（Ｎ末端コイル−コイル領域）を対応するヒトＮ末端コイル−コイルＡＮＧＰＬＴ４配列で置換することによって作製した。生殖系列移行の確立後、ヘテロ接合体マウス（ＡＮＧＰＴＬ４ｈｕｍ／＋）を交配させてＣ５７ＢＬ６バックグラウンドでホモ接合体マウス（ＡＮＧＰＴＬ４ｈｕｍ／ｈｕｍまたはｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋））を作製した。実験７日前（−７日目）にヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスから予め採血し、各試験抗体についてそれぞれ６匹のマウスの群に分けた。抗体（Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、およびマウス抗原に対する交差反応が知られていないアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ１）コントロール）を、用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、および１１日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清ＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各時点の各抗体についての平均ＴＧレベルを計算した。結果（血清ＴＧ濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１６に示す。
【０１３３】
【表１６】
循環抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（「血清ヒトＡｂ」）レベルも、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。簡潔に述べれば、血清ヒトＡｂを捕捉するためにプレートをヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。次いで、血清をプレートに添加し、捕捉された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した化学発光によって検出した。結果（血清ヒトＡｂの（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１７に示す。
【０１３４】
【表１７】
Ｈ１Ｈ２６８Ｐのヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスへの投与により、アイソタイプ適合コントロール抗体を投与したマウスと比較して、抗体投与の４〜１１日後に循環ＴＧが約２５〜３０％減少した。Ｈ１Ｈ２８４Ｐ投与に起因するＴＧ減少は、抗体注射４日後で最も有効であったが（ＴＧ減少約３４％）、１１日目までにＴＧレベルはコントロールレベルまで増加して戻った。これは、おそらく抗体の迅速なクリアランス速度に起因するであろう。
【０１３５】
実施例１１．ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける循環ＴＧレベルに及ぼすＩｇＧ４抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの影響
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐの血清ＴＧレベルに及ぼす影響を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおいて決定した。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスから、実験７日前に予め採血し、各試験抗体についてそれぞれ６匹のマウス群に分けた。抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、およびマウス抗原に対する交差反応が知られていないアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）コントロール）を、用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、および１１日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各時点の各抗体についての平均ＴＧレベルを計算した。結果（血清ＴＧ濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１８に示す。
【０１３６】
【表１８】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐのヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスへの投与により、アイソタイプ適合コントロール抗体を投与したマウスと比較して、抗体投与１日後（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）および４日後（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐ）の循環ＴＧが有意に減少した。
【０１３７】
循環ＴＧレベルに及ぼすＨ４Ｈ２６８Ｐ２の影響を、ＡｐｏＥヌルマウスと交配したヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスでさらに研究した。ＡｐｏＥヌルマウスモデルは、ＶＬＤＬレムナントクリアランス障害に起因して大部分のコレステロールおよびＴＧがＶＬＤＬ粒子において循環する高アテローム生成性および高脂血性モデルとして公知である。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４×ＡｐｏＥヌルマウスから実験７日前に予め採血し、各６匹のマウスの２群に分けた。抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびコントロールＡｂを、１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、１１、および１７日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。図４に示したＴＧ減少を、コントロールＡｂと比較したＴＧレベルの比率として示す。
【０１３８】
コントロールＡｂを投与したマウスと比較して、ＴＧレベルは全１７日間で有意に減少し（４２％超）、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２投与７日後に最も減少した（約５０％）。
【０１３９】
実施例１２．フェノフィブラートと組み合わせた抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の血清ＴＧレベルに及ぼすｉｎ ｖｉｖｏでの影響
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＴＧ低下薬フェノフィブラートの単独または組み合わせの血清ＴＧレベルに及ぼす影響を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスで評価した。実験７日前に絶食４時間後のマウスから予め採血し、各６匹のマウスの４群に分けた。群２および４に、０日目に１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２を皮下注射によって投与し、群１（コントロール群）および２に、一般飼料（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）を与えた。群３および４に、０．０５％（ｗ／ｗ）のフェノフィブラート（パイロット研究において投薬レベルを実験的に決定した）を補充した飼料を与えた。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２および／またはフェノフィブラート投与後７日目に、終末の採血から血清を収集し（絶食４時間後）、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって分析した。結果を図５に示す。
【０１４０】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみおよびフェノフィブラートとの組み合わせの投与により、投与７日後の循環ＴＧレベルが有意に減少した。ＴＧレベルは、飼料で処置したコントロール群と比較して、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみの投与７日後に約４０％（平均）、フェノフィブラート処置のみの後に約２５％、ならびにＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびフェノフィブラートの組み合わせの処置後に約５０％減少した。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２は、マウスモデルにおける循環ＴＧレベルの減少においてフェノフィブラートより有効であった。組み合わせ処置により、ＴＧレベルに対するＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびフェノフィブラートの相乗効果が認められた。注目すべきことに、７日間フェノフィブラートを消費したマウス（群３および４）から採取した肝臓は、コントロール飼料を消費したマウス（群１および２）と比較して、有意に大きくなった（１．８倍、肝臓重量／体重）（データ示さず）。
【０１４１】
実施例１３．肥満アカゲザルにおける抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態学／薬力学についてのパイロット研究
第Ｉ相：パイロット非ＧＬＰ薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐを、単回ボーラス静脈内（ＩＶ）注射として肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に投与した。アカゲザルを選択したのは、この種が系統学的および生理学的にヒトと密接に関連し、非臨床的毒性評価のために一般に使用される種であるからである。典型的に中程度に上昇したＴＧレベル（すなわち、平均＞１００ｍｇ／ｄＬ；超ＴＧ）を示すので、高脂肪食を６ヶ月超与えた肥満サルを選択した。８匹の健康が確認された雄性サルを馴化させ、投与前７日間のベースライン評価研究に割り当てた。−５日目に全動物にビヒクル（１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６）をＩＶ注入によって投与し、その後、０日目にＩＶで１０ｍｇ／ｋｇにてその内の４匹にＨ４Ｈ２６８Ｐ２を投与し、別の４匹にＨ４Ｈ２８４Ｐを投与した。注入後のいかなる時点においても注射部位の反応や他の有害作用は認められなかった。
【０１４２】
血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取し、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって血清脂質レベルについて評価した。各動物についての平均ベースラインを、−７、−５、および０日目に採取したサンプルに基づいて決定した。ビヒクル投与後に採取したサンプルの予備分析により、各群由来の３匹の肥満動物が絶食時ＴＧレベルの上昇を示し（すなわち、ＴＧ＞１００ｍｇ／ｄＬ）、一方で、各群由来の１匹の動物が十分に正常範囲内の平均ＴＧレベル（すなわち、平均絶食ＴＧレベル４２ｍｇ／ｄＬおよび８４ｍｇ／ｄＬ）を示すことが明らかとなった。したがって、各群の３匹の動物を使用してデータ分析を行った。ベースラインからの血清ＴＧレベルの変化率（％）を各動物について決定し、各Ａｂ群について平均化した。結果を図６に示す。
【０１４３】
３匹の軽度の超ＴＧ動物へのＨ４Ｈ２６８Ｐ２の投与により、投与後４日目に５７％の最大減少を示した。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２処置後のこれらの動物についての平均血清ＴＧレベルは、ほぼ２５日目まで１００ｍｇ／ｄＬ以下に維持された。さらなる脂質（ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）およびＨＤＬ−Ｃなど）に対する中程度の影響が認められたが、全−Ｃは不変であった（データ示さず）。低ＴＧレベルの単一の肥満動物へのＨ４Ｈ２６８Ｐ２の投与により、絶食時ＴＧや任意の他の脂質パラメーターを低下させるいかなる有意な影響も得られず（データ示さず）、抗体によるＴＧレベルの減少の下限が示唆された。
【０１４４】
第ＩＩ相：第２の非ＧＬＰ薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみを単回ボーラス静脈内（ＩＶ）注射として８匹の肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に投与した。本研究では、投与前（ｐｒｅ−ｄｏｓｉｎｇ）ビヒクル注射工程を省略した。研究−７、−３、および０日目に３つのベースライン評価を行い、０日目に８匹全てのサルに１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２をＩＶで投与した。血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取し、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって血清脂質レベルについて評価した。あらかじめ影響を予想するために、平均ベースラインＴＧレベルにしたがってデータ分析のために動物を以下のように分類した：Ａ．ＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝３）、Ｂ．１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４）、およびＣ．ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝１）。
【０１４５】
図７は、３つのベースラインＴＧ値の平均からのＴＧレベルの変化率として示した３群のＴＧレベルを示す。前臨床データに基づいて予想されるように、基礎血清ＴＧレベルが高い動物ほど、より高い絶食ＴＧレベルの減少が認められた。ベースラインＴＧレベルが１０００ｍｇ／ｄＬ超であった個別の動物において、特に劇的且つ迅速なＴＧレベルの低下が認められた。ベースライン１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬの動物についてＴＧレベルの堅調な減少（５０〜６８％）が認められた。この肥満サル群では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２の投与によってＨＤＬ−Ｃが増加したが、ＬＤＬ−Ｃや全−Ｃに影響を及ぼさなかった（データ示さず）。ベースラインＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（正常ＴＧレベル）の動物は、大部分がＨ４Ｈ２６８Ｐ２に無反応であった。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合フラグメントならびに前記抗体の治療的使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連分野の記述
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、リポタンパク質代謝において中心的役割を果たし、それによって正常な血中リポタンパク質レベルが維持され、その活性の組織特異的調節によって、いつ、どの組織トリグリセリド（ＴＧ）が取り除かれるのかが決定される。ヒトおよびげっ歯類において、ＡＮＧＰＴＬ４がＬＰＬを阻害してリポタンパク質の異化を遅延させると報告されている。ＡＮＧＰＴＬ４ヌルマウスは、血清ＴＧの有意な減少を示す。逆に、マウスへのＡＮＧＰＴＬ４注射によって循環脂質が迅速に増加し、これはアンギオポエチン様タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）注射よりも速い（非特許文献１）。ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイル領域（Ｃ末端フィブリノゲン様ドメインではない）は、ＬＰＬ活性阻害（したがって、高トリグリセリド血症を示す）で重要であることが公知である。これらの所見は、ＡＮＧＰＴＬ４阻害が脂質レベルの上昇によって特徴づけられる疾患（肥満、代謝症候群、ＩＩ型糖尿病などに関連する原発性脂質異常症および高トリグリセリド血症などが含まれる）の処置で有益であり得ることを示す。ＡＮＧＰＴＬ４はまた、血管形成およびがんで役割を果たすことが示されている（非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４）。
【０００３】
ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４７５、および４７６に示す。ＡＮＧＰＴＬ４の抗体は、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／０７４２２８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１０９３０７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００２，４３：１７７０−１７７２
【非特許文献２】Ｇａｌａｕｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００６，１０３（４９）：１８７２１−１８７２６
【非特許文献３】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０００，３４６：６０３−６１０
【非特許文献４】Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３，６３（２０）：６６５１−６６５７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
第１の態様では、本発明は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合してその活性を中和する完全なヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその抗原結合フラグメントを提供する。
【０００７】
抗体（Ａｂ）は、全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含むことができ、機能性に影響を及ぼす（例えば、残存するエフェクター機能を排除する）ように改変することができる（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。
【０００８】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４６６、４６８、および４８７、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２６、４２、４６、４８７、７４、９０、９４、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２、４８７、９０、１３８、または１６２を含むＨＣＶＲを含む。
【０００９】
１つの実施形態では、抗体または抗体の抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、および４５６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。別の実施形態では、抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号３４、４４、４８、８２、９２、９６、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４４、９２、１４０、または１６４を含むＬＣＶＲを含む。
【００１０】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、
【００１１】
【化１】
からなる群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６／３４、４２／４４、４８７／４４、４６／４８、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、および１６６／１６８のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、配列番号８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、および４６４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、および配列番号１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、および４４８、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３２／４０、８０／８８、１２８／１３６、または１５２／１６０を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３２／４０または８０／８８を含むＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００１３】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、および４６０、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列、および配列番号６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、および４６２、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列をさらに含み、任意選択的に、配列番号１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、および４４４、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列、および／または配列番号１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、および４４６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列をさらに含む。
【００１４】
あるいは、本発明は、配列番号４／６／８、２８／３０／３２、５２／５４／５６、７６／７８／８０、１００／１０２／１０４、１２４／１２６／１２８、１４８／１５０／１５２、１７２／１７４／１７６、１９６／１９８／２００、２２０／２２２／２２４、２４４／２４６／２４８、２６８／２７０／２７２、２９２／２９４／２９６、３１６／３１８／３２０、３４０／３４２／３４４、３６４／３６６／３６８、３８８／３９０／３９２、４１２／４１４／４１６、４３６／４３８／４４０、および４６０／４６２／４６４からなる群より選択されるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ、および／または配列番号１２／１４／１６、３６／３８／４０、６０／６２／６４、８４／８６／８８、１０８／１１０／１１２、１３２／１３４／１３６、１５６／１５８／１６０、１８０／１８２／１８４、２０４／２０６／２０８、２２８／２３０／２３２、２５２／２５４／２５６、２７６／２７８／２８０、３００／３０２／３０４、３２４／３２６／３２８、３４８／３５０／３５２、３７２／３７４／３７６、３９６／３９８／４００、４２０／４２２／４２４、および４４４／４４６／４４８からなる群より選択されるＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００１５】
１つの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、配列番号２８／３０／３２、７６／７８／８０、１２４／１２６／１２８、および１４８／１５０／１５２からなる群より選択され、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号３６／３８／４０、８４／８６／８８、１３２／１３４／１３６、および１５６／１５８／１６０からなる群より選択される。さらに別の実施形態では、重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、および１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０からなる群より選択されるＣＤＲ配列組み合わせを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０または７６／７８／８０／８４／８６／８８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００１６】
関連する実施形態では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、抗体またはそのフラグメントが、
【００１７】
【化２】
からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む、抗体またはそのフラグメントを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は当該分野で公知であり、本明細書中に開示の特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲの同定に適用することができる。ＣＤＲの境界の同定に適用することができる従来の定義には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。大まかに言えば、Ｋａｂａｔ定義は配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の折衷物である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列の同定に公共データベースも利用可能である。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６／３４、４２／４４、４８７／４４、４６／４８、７４／８２、９０／９２、９４／９６、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、および１６６／１６８のアミノ酸配列対からなる群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ対内に含まれるＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列対内に含まれるＣＤＲ配列を含む。
【００１８】
別の関連する実施形態では、本発明は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、または１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗体または抗原結合フラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ４への特異的結合を競合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む抗体とｈＡＮＧＰＴＬ４への特異的結合を競合する。
【００１９】
別の関連する実施形態では、本発明は、配列番号２８／３０／３２／３６／３８／４０、７６／７８／８０／８４／８６／８８、１２４／１２６／１２８／１３２／１３４／１３６、または１４８／１５０／１５２／１５６／１５８／１６０の重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む抗体またはそのフラグメントによって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ４上の同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。１つの実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号４２／４４、４８７／４４、９０／９２、１３８／１４０、または１６２／１６４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む抗体によって認識されるｈＡＮＧＰＴＬ４上のエピトープを認識する。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメント（特に上記のもの）をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびかかるベクターが導入された宿主細胞（例えば、細菌細胞（大腸菌など）または哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞など））も本発明に含まれる。抗体を産生させる条件下での宿主細胞の培養および産生された抗体の取り出しによる抗体の産生方法も同様に含まれる。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４６５、４６７、および４８６、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２５、４１、４５、７３、８９、９３、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、および４８６からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４１、８９、１３７、１６１、または４８６の核酸配列によってコードされるＨＣＶＲを含む。
【００２２】
１つの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７、４３１、４４１、４５１、および４５５、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３３、４３、４７、８１、９１、９５、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、および１６７からなる群より選択される核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４３、９１、１３９、または１６３の核酸配列によってコードされるＬＣＶＲを含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、
【００２４】
【化３】
からなる群より選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む。１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２５／３３、４１／４３、４８６／４３、４５／４７、７３／８１、８９／９１、９３／９５、１２１／１２９、１３７／１３９、１４１／１４３、１４５／１５３、１６１／１６３、および１６５／１６７からなる群より選択される核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号４１／４３、４８６／４３、８９／９１、１３７／１３９、または１６１／１６３の核酸配列対によってコードされるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対を含む。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、および４６３、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン、および配列番号１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、および４４７、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１／３９、７９／８７、１２７／１３５、または１５１／１５９の核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列対を含む。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３１／３９または７９／８７の核酸配列対によってコードされるＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列対を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、および４５９、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン、および配列番号５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、および４６１、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメインをさらに含み、任意選択的に、配列番号１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、３９５、４１９、および４４３、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン、および／または配列番号１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、および４４５、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む。
【００２７】
あるいは、本発明は、配列番号３／５／７、２７／２９／３１、５１／５３／５５、７５／７７／７９、９９／１０１／１０３、１２３／１２５／１２７、１４７／１４９／１５１、１７１／１７３／１７５、１９５／１９７／１９９、２１９／２２１／２２３、２４３／２４５／２４７、２６７／２６９／２７１、２９１／２９３／２９５、３１５／３１７／３１９、３３９／３４１／３４３、３６３／３６５／３６７、３８７／３８９／３９１、４１１／４１３／４１５、４３５／４３７／４３９、および４５９／４６１／４６３からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせ、および／または配列番号１１／１３／１５、３５／３７／３９、５９／６１／６３、８３／８５／８７、１０７／１０９／１１１、１３１／１３３／１３５、１５５／１５７／１５９、１７９／１８１／１８３、２０３／２０５／２０７、２２７／２２９／２３１、２５１／２５３／２５５、２７５／２７７／２７９、２９９／３０１／３０３、３２３／３２５／３２７、３４７／３４９／３５１、３７１／３７３／３７５、３９５／３９７／３９９、４１９／４２１／４２３、および４４３／４４５／４４７からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされるＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００２８】
１つの実施形態では、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、配列番号２７／２９／３１、７５／７７／７９、１２３／１２５／１２７、および１４７／１４９／１５１からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされ、および／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、配列番号３５／３７／３９、８３／８５／８７、１３１／１３３／１３５、および１５５／１５７／１５９からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる。さらに別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２７／２９／３１／３５／３７／３９、７５／７７／７９／８３／８５／８７、１２３／１２５／１２７／１３１／１３３／１３５、および１４７／１４９／１５１／１５５／１５７／１５９からなる群より選択されるヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２７／２９／３１／３５／３７／３９または７５／７７／７９／８３／８５／８７のヌクレオチド配列組み合わせによってコードされる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【００２９】
第４の態様では、本発明は、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ３が式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０（配列番号４７１）（式中、Ｘ１はＡｌａであり、Ｘ２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ３はＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ４はＧｌｙ、Ａｓｐ、または不在であり、Ｘ５はＡｓｐまたは不在であり、Ｘ６はＬｅｕ、Ａｒｇ、または不在であり、Ｘ７はＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｘ８はＰｈｅ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇであり、Ｘ９はＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎであり、Ｘ１０はＡｓｐ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ１１はＴｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ１３はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ１４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ１５はＴｙｒであり、Ｘ１６はＰｈｅまたはＧｌｙであり、Ｘ１７はＬｅｕまたは不在であり、Ｘ１８はＡｓｐであり、Ｘ１９はＴｙｒ、Ｖａｌ、またはＰｈｅであり、Ｘ２０はＴｒｐである）のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号４７４）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ｘ３はＴｙｒまたはＬｅｕであり、Ｘ４はＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ７はＰｒｏ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ８はＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ９はＴｈｒであり、Ｘ１０はＰｈｅである）のアミノ酸配列を含む、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離抗体または抗体の抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００３０】
さらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４６９）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＰｈｅであり、Ｘ３はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｘ５はＳｅｒであり、Ｘ６はＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ７はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ８はＨｉｓ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１配列、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４７０）（式中、Ｘ１はＩｌｅであり、Ｘ２はＡｓｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ３はＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、Ｘ４はＡｒｇ、Ａｓｐ、またはＡｌａであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＧｌｙまたは不在であり、Ｘ７はＳｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｓｐであり、Ｘ８はＴｈｒまたはＬｙｓである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２配列、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（配列番号４７２）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＩｌｅであり、Ｘ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ６はＴｙｒまたはＴｒｐである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１配列、および式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号４７３）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｘ２はＡｌａであり、Ｘ３はＳｅｒである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２配列をさらに含む。Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐモノクローナル抗体の配列アラインメントを図１（ＨＣＶＲ）および図２（ＬＣＶＲ）に示す。
【００３１】
第５の態様では、本発明は、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ生殖系列配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、およびＶＫおよびＪＫ生殖系列配列由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲが（ｉ）ＶＨ３−３０、ＤＨ５−１２、ＪＨ６、ＶＫ１−９、およびＪＫ４；（ｉｉ）ＶＨ４−３４、ＤＨ３−３、ＪＨ４、ＶＫ１−２７、およびＪＫ４、および（ｉｉｉ）ＶＨ３−１３、ＤＨ１−２６、ＪＨ４、ＶＫ１−５、およびＪＫ１からなる群より選択される生殖系列遺伝子組み合わせ由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる、ヒト抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。
【００３２】
第６の態様では、本発明は、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって測定した場合に、約１ｎＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）でｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。一定の実施形態では、本発明の抗体は、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１５０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、または約５０ｐＭ以下のＫＤを示す。
【００３３】
第７の態様では、本発明は、本明細書中に記載のように、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴アッセイ、またはＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）ＸＭＡＰ（登録商標）テクノロジーによって決定した場合、配列番号４７６のｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合するが、関連タンパク質（ヒトアンギオポエチン様タンパク質３（ｈＡＮＧＰＴＬ３；配列番号４８５）など）と交差反応しない抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＬＰＬ活性を減少させることが公知であり、且つＮ末端コイルドコイル領域およびＣ末端フィブリノゲン様ドメインを有する別の分泌タンパク質である（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ４３：４１８０４−４１８０９）。関連する実施形態では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に結合し、且つｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と交差反応する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一定の実施形態では、ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントのｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に対する結合親和性は、該抗体または該フラグメントのｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質に対する結合親和性の約７５％以下または約５０％以下である。別の関連する実施形態では、本発明は、マウスＡＮＧＰＴＬ４（ｍＡＮＧＰＴＬ４：配列番号４７８）と交差反応しないが、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；Ｎ末端１〜１４８残基のアミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号４９０および４８９として示す）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ；Ｎ末端１〜１４８残基のアミノ酸配列およびコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号４９２および４９１として示す）のＡＮＧＰＴＬ４と交差反応する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３４】
本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。いくつかの適用では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための改変（すなわち、例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増加させるためのフコース部分の除去）は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用では、Ｎ−グリコシル化部位の除去により、治療抗体に対する望ましくない免疫反応を減少させるか、抗体の親和性を増加させることができる。さらに他の適用では、ガラクトシル化を改変して補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変することができる。
【００３５】
第８の態様では、本発明は、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を特徴とする。１つの実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと第２の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。第２の治療薬は、１つ以上の任意の薬剤、例えば、（１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼインヒビター（セリバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなど）；（２）コレステロール取り込みおよび／または胆汁酸再吸収のインヒビター；（３）リポタンパク質の異化を増加させるナイアシン；（４）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを減少させ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルおよびＴＧレベルを改善し、非致死性心臓発作数を減少させるフィブラートまたは両親媒性カルボン酸、および（５）コレステロール排除で役割を果たすＬＸＲ転写因子のアクチベーター、例えば、２２−ヒドロキシコレステロール、またはエゼチミブ＋シンバスタチンなどの固定組み合わせ；スタチンと胆汁樹脂（ｂｉｌｅ ｒｅｓｉｎ）（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレセベラム）、ナイアシン＋スタチンの固定組み合わせ（例えば、ナイアシンとロバスタチン）；または他の脂質低下薬（ω−３−脂肪酸エチルエステル（例えば、オマコール）など）であり得る。さらに、第２の治療薬は、１つ以上のＡＮＧＰＴＬ４の他のインヒビター、ならびにＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（脂質代謝、特にコレステロールおよび／またはトリグリセリドホメオスタシスに関与する）などの他の分子のインヒビターであり得る。これらの分子のインヒビターには、これらの分子に特異的に結合してその活性を遮断する小分子および抗体が含まれる。
【００３６】
関連する実施形態では、第２の治療薬は、１つ以上の抗がん剤（化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬、およびがんまたは他の増殖性疾患もしくは障害を処置することが当該分野で周知の他の薬剤など）、および基礎をなすがん／腫瘍に伴う症状の回復および／または低下のための他の治療薬、例えば、鎮痛薬、抗炎症薬、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）であり得る。
【００３７】
第９の態様では、本発明は、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体の抗原結合部分を使用したｈＡＮＧＰＴＬ４活性の阻害方法であって、治療方法が、治療有効量の本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントおよび任意選択的に１つ以上の上記のさらなる治療薬を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法を特徴とする。処置される疾患または障害は、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体処置を使用しない処置と比較して、ＡＮＧＰＴＬ４活性の除去、阻害、または減少によって改善、回復、阻害、または防止されるか、その出現率が減少する任意の疾患または状態である（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害）。本発明の方法によって処置可能な疾患または障害の例には、脂質代謝に関与する疾患または障害（高脂血症、高リポタンパク質血症、および脂質異常症（アテローム性脂質異常症、糖尿病性脂質異常症が含まれる）、高トリグリセリド血症（ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬの重症高トリグリセリド血症が含まれる）、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、混合型脂質異常症（肥満、代謝症候群、糖尿病など）、脂肪異栄養症、および脂肪組織萎縮など（例えば、ＬＰＬ活性の減少および／またはＬＰＬ欠損、ＬＤＬ受容体活性の減少および／またはＬＤＬ受容体欠損、ＡｐｏＣ２の変化、ＡｐｏＥ欠損、ＡｐｏＢの増加、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の産生の増加および／または排除の減少、一定の薬物処置（例えば、糖質コルチコイド処置誘導性脂質異常症）、任意の遺伝的素因、食事、および生活様式などに起因する）など）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法はまた、高脂血症、高リポタンパク質血症、および／または脂質異常症に関連するかこれに起因する疾患または障害（例えば、心血管疾患または障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、高血圧症、アンギナ、卒中、脳血管疾患、鬱血性心不全、冠状動脈疾患、心筋梗塞、および末梢血管疾患、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、血糖障害（糖尿病など）、および肥満が含まれるが、これらに限定されない）を防止するか処置することができる。
【００３８】
本発明の方法によって処置可能な疾患または障害の他の例には、がん／腫瘍ならびに非新生物性血管形成関連疾患または障害（血管新生眼疾患または障害（加齢性黄斑変性、網膜中心静脈閉塞または網膜静脈分枝閉塞、糖尿病性網膜症、および未熟児網膜症など）が含まれる）、炎症性疾患または障害（関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）、および乾癬など）が含まれる。
【００３９】
他の実施形態は、次の詳細な説明の概観から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、抗体Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐの重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の配列アラインメントを示す。
【図２】図２は、抗体Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ２９１Ｐ、およびＨ１Ｈ２９２Ｐの軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の配列アラインメントを示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、野生型マウス（図３Ａ）およびヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＡｎｇｐｔｌ４（＋／＋）マウスまたは「ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウス」）（図３Ｂ）における抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態学的クリアランスを示す。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（□）、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ（▲）、およびｈＩｇＧ４コントロール（●）。
【図４】図４は、ＡｐｏＥヌルマウスと交配させたヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける血清トリグリセリド（ＴＧ）レベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）の影響を示す。無関係の特異性を有するコントロール抗体と比較した、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２による血清ＴＧレベルの変化率（％）を示す。コントロールＡｂ（白丸）およびＨ４Ｈ２６８Ｐ２（黒四角）。
【図５】図５は、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）およびＴＧ低下薬フェノフィブラートの単独または組み合わせの影響を示す。
【図６】図６は、肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）における、脂質のなかでも、特に絶食血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の影響についての第Ｉ相パイロット研究の結果を示す。全てのサルに、−５日目にビヒクル（１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６）を静脈内（ＩＶ）注入し、０日目にＨ４Ｈ２６８Ｐ２（ｎ＝３）（●）またはＨ４Ｈ２８４Ｐ（ｎ＝３）（□）のいずれかを１０ｍｇ／ｋｇＩＶ注入した。血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取した。各動物についての平均ベースラインを、−７、−５、および０日目に採取したサンプルに基づいて決定し、ベースラインからの血清ＴＧレベルの変化率（％）を決定し、各Ａｂ群について平均化した。
【図７】図７は、ビヒクル注入工程を省略したこと以外は図６に記載したものと同様の、肥満サルにおける絶食血清ＴＧレベルに及ぼす抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）の影響についての第ＩＩ相パイロット研究の結果を示す。−７、−３、および０日目に採取したサンプルに基づいて、各サルについての平均ベースラインを得た。サルをそのベースラインに基づいて以下の群に分けた：Ａ．ＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝３；□）、Ｂ．１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４；●）、およびＣ．ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝１；▽）。ベースラインからの絶食ＴＧレベルの変化率（％）を、各サルについて決定し、各群について平均化した。
【００４１】
全グラフ中のエラーバーは、平均±ＳＥＭを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、記載の特定の方法および実験条件は変化し得るので、本発明がこれらに制限されないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるので、本明細書中で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限することを意図しないことも理解すべきである。
【００４３】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。
【００４４】
定義
用語「ヒトアンギオポエチン様タンパク質４」または「ｈＡＮＧＰＴＬ４」は、本明細書中で使用する場合、配列番号４７５に示す核酸配列および配列番号４７６のアミノ酸配列を有するｈＡＮＧＰＴＬ４、またはその生物学的に活性なフラグメントをいう。
【００４５】
用語「抗体」は、本明細書中で使用する場合、４つのポリペプチド鎖（ジスルフィド結合によって相互接続した２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）から構成される免疫グロブリン分子をいうことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および重鎖定常領域（ＣＨ；ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域（これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在している）にさらに分類することができる。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。
【００４６】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。結合に関して、１つまたは２つのＣＤＲを省くことができる抗体が科学文献中に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−１３９）は、公開された結晶構造に基づいて抗体とその抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基のわずか約１／５から１／３しか抗原に実際に接触していないと結論づけた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが抗原に接触しているアミノ酸を持たない抗体を多数見い出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５−４２８も参照のこと）。
【００４７】
抗原に接触しないＣＤＲ残基を、以前の研究（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５はしばしば必要でない）に基づいて、分子モデリングおよび／または経験的にＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの外側に存在するＫａｂａｔＣＤＲ領域から同定することができる。ＣＤＲまたはその残基を省く場合、通常、別のヒト抗体配列またはかかる配列のコンセンサス中の対応する位置を占めるアミノ酸に置換する。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するためのアミノ酸も経験的に選択することができる。経験的置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【００４８】
用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体が含まれることを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３中に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用する場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されているｍＡｂが含まれることを意図しない。
【００４９】
本明細書中に開示の完全なヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体は、対応する生殖系列配列と比較して重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域中および／またはＣＤＲ領域中に１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含むことができる。かかる変異を、本明細書中に開示のアミノ酸配列を、例えば、公的な抗体配列データベースから利用可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書中に開示の任意のアミノ酸配列に由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸が、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基、別のヒト生殖系列配列の対応する残基へと変異しているか、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換がおきている（かかる配列の変化を、本明細書中で集合的に「生殖系列変異」という）。当業者は、本明細書中に開示の重鎖および軽鎖可変領域の配列から開始して、１つ以上の個別の生殖系列の復帰変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗体結合フラグメントを容易に産生することができる。一定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内の全てのフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基を、抗体が由来する元の生殖系列配列で見い出される残基に復帰変異させる。他の実施形態では、一定の残基のみ（例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内またはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見い出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見い出される変異残基のみ）を元の生殖系列配列に復帰変異させる。他の実施形態では、１つ以上のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基を、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体がもともと由来する生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基に変異させる。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含むことができる（例えば、一定の個別の残基を特定の生殖系列配列の対応する残基に変異させ、元の生殖系列配列と異なる一定の他の残基を維持するか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に変異させる）。一旦得られると、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合フラグメントを、１つ以上の所望の性質（結合特異性の改善、結合親和性の増加、拮抗的または作動的（場合による）な生物学的性質の改善または増強、免疫原性の減少など）について容易に試験することができる。この一般的様式で得た抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に含まれる。
【００５０】
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書中に開示の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のバリアントを含む抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書中に開示の任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列と比較して１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下、２個、または１個の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。１つの実施形態では、ＨＣＶＲは、１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＨＣＶＲは、４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＨＣＶＲは、２または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４８７のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ＬＣＶＲは、１０個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、８個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、６個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＬＣＶＲは、４個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＬＣＶＲは、２または１個の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４４のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
特に記載されない限り、用語「抗体」は、本明細書中で使用する場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全な抗体分子」）、およびその抗原結合フラグメントを含むと理解されるものとする。用語、抗体の「抗原結合部分」および抗体の「抗原結合フラグメント」などは、本明細書中で使用する場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在するか、酵素的に得ることができるか、合成であるか、遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、任意の適切な標準的技術（タンパク質分解消化または組換え遺伝子操作技術（抗体可変ドメインおよび（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む）など）を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。かかるＤＮＡは公知であり、そして／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージディスプレイ抗体ライブラリーが含まれる）から容易に得ることができるか、合成することができる。化学的または分子生物学技術の使用によってＤＮＡを配列決定し、操作して、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／または定常ドメインを適切な立体配置に配置するか、コドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を改変、付加、または欠失することなどができる。
【００５２】
抗原結合フラグメントの非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が含まれる。他の操作された分子（二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、およびミニボディなど）はまた、本明細書中で使用する場合、表現「抗原結合フラグメント」内に含まれる。
【００５３】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であってよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するかインフレームで存在する少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントでは、ＶＨおよびＶＬドメインを、任意の適切な配置で相互に関連させて配置することができる。例えば、可変領域は二量体であってよく、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含むことができる。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含むことができる。
【００５４】
一定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含むことができる。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見い出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置には、以下が含まれる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置（上記列挙の任意の例示的な立体配置が含まれる）では、可変ドメインおよび定常ドメインを、相互に直接連結することができるか、完全なまたは部分的なヒンジ領域またはリンカー領域によって連結することができる。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間に柔軟性または半柔軟性の連結が得られる少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個、またはそれを超える）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、相互に非共有結合した、および／または１つ以上の単量体ＶＨドメインまたはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）、上記列挙の任意の可変ドメインおよび定常ドメインの立体配置のホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
【００５５】
完全な抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメイン（ここで、各可変ドメインは別々の抗原または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる）を含むであろう。任意の多重特異性抗体形式（本明細書中に開示の例示的な二重特異性抗体形式が含まれる）を、当該分野で利用可能な日常的技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントに関連する使用に適応させることができる。
【００５６】
一定の実施形態では、本発明の抗体または抗体フラグメントを、治療部分（細胞毒素、化学療法剤、免疫抑制薬、または放射性同位体など）に結合体化することができる（「免疫結合体」）。
【００５７】
用語「特異的に結合する」などは、抗体またはその抗原結合フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合を、約１×１０−６Ｍ以下（すなわち、ＫＤが小さいほど結合が緊密であることを示す）の平衡解離定数（ＫＤ）によって特徴づけることができる。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当該分野で周知であり、例えば、平衡透析および表面プラズモン共鳴などが含まれる。しかし、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種由来のＡＮＧＰＴＬ４分子（例えば、カニクイザルＡＮＧＰＴＬ４）および／または配列番号４８５のアミノ酸配列を有するｈＡＮＧＰＴＬ３など）に交差反応性を示し得る。さらに、ｈＡＮＧＰＴＬ４および１つ以上のさらなる抗原に結合する多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、それにもかかわらず、本明細書中で使用する場合、ｈＡＮＧＰＴＬ４に「特異的に結合する」抗体と見なされる。
【００５８】
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定した場合、ｈＡＮＧＰＴＬ４に対する結合親和性（ＫＤとして示す）が約１×１０−９Ｍ以下、約０．５×１０−９Ｍ以下、約０．２５×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、または約０．５×１０−１０Ｍ以下である抗体をいう。
【００５９】
用語「ＫＤ」は、本明細書中で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいうことが意図される。
【００６０】
用語「スローオフレート（ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ）」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって決定した場合、１×１０−３ｓ−１以下、好ましくは１×１０−４ｓ−１以下の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ４から解離する抗体を意味する。
【００６１】
用語「内因性親和性定数」または「ｋａ」は、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ）によって決定した場合、約１×１０３Ｍ−１ｓ−１以上の速度定数でｈＡＮＧＰＴＬ４に会合する抗体を意味する。
【００６２】
「単離された抗体」は、本明細書中で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他のｍＡｂを実質的に含まない抗体をいうことが意図される（例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、ｈＡＮＧＰＴＬ４以外の抗原に特異的に結合するｍＡｂを実質的に含まない）。しかし、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（他の種（カニクイザルなど）由来のＡＮＧＰＴＬ４分子および／または他の関連するタンパク質（ヒトＡＮＧＰＴＬ３など）など）に交差反応性を有し得る。
【００６３】
「中和抗体」は、本明細書中で使用する場合（または「ＡＮＧＰＴＬ４活性を中和する抗体」）、ＡＮＧＰＴＬ４への結合によってＡＮＧＰＴＬ４の少なくとも１つの生物学的活性を阻害する抗体をいうことが意図される。ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的活性の阻害を、当該分野で公知のいくつかの標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（以下の実施例も参照のこと）のうちの１つ以上によるＡＮＧＰＴＬ４生物学的活性の１つ以上の指標の測定によって評価することができる。
【００６４】
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書中で使用する場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用したバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって、リアルタイムの生体特異的相互作用を分析することができる光学的現象をいう。
【００６５】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の領域である。エピトープを、構造的エピトープまたは機能的エピトープと定義することができる。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーションエピトープでもあり得る（すなわち、非線状アミノ酸から構成される）。一定の実施形態では、エピトープは、分子の化学的に活性な表面群（アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など）である決定基を含むことができ、一定の実施形態では、特異的な三次元構造特性および／または特異的な電荷特性を有し得る。
【００６６】
用語「実質的同一性」または「実質的に同一な」は、核酸またはそのフラグメントをいう場合、以下に考察のように、任意の周知の配列同一性アルゴリズム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなど）によって測定したときに、別の核酸（またはその相補鎖）と、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を使用して最適にアラインメントした場合にヌクレオチド配列同一性がヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを示す。
【００６７】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似の」は、デフォルトギャップウェイトを使用したプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアラインメントした場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互に異なる場合、類似率または類似度は、置換の保存性について補正するために、増加するように調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、および７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミン。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示のＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて非負値を有する任意の変化である。
【００６８】
ポリペプチドの配列類似性を、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変（保存的アミノ酸置換が含まれる）に割り当てられた類似性の基準を使用して類似の配列を対応させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、密接に関連するポリペプチド（生物の異なる種由来の相同ポリペプチドなど）の間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するための、デフォルトパラメーターと共に使用することができるプログラム（ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなど）を含む。例えば、ＧＣＧ バージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列を、デフォルトパラメーターまたは推奨されるパラメーターを使用するＦＡＳＴＡ（ＧＣＧバージョン６．１中のプログラム）を使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良の重複領域のアラインメントおよび配列同一率を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前出）。本発明の配列を異なる種由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用したコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ ４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ４０２を参照のこと。
【００６９】
語句「治療有効量」は、所望の効果が得られる投与量を意味する。正確な量は処置目的、処置される被験体の年齢およびサイズ、および投与経路などに依存し、公知の技術を使用して当業者が確認可能であろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【００７０】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウス中でのヒト抗体の生成方法は、当該分野で公知である。任意のかかる公知の方法を、本発明に照らして使用して、ＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【００７１】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥＴＭテクノロジーまたは任意の他の公知のモノクローナル抗体生成方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＡＮＧＰＴＬ４に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験の部にあるように、抗体を特徴付け、所望の特徴（親和性、選択性、およびエピトープなどが含まれる）について選択する。
【００７２】
一般に、本発明の抗体は、固相上に固定されているか液相中の抗原への結合によって測定した場合、典型的には約１０−１２Ｍ〜約１０−９ＭのＫＤを有する非常に高い親和性を有する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域（例えば、野生型のＩｇＧ１（配列番号４８１）もしくはＩｇＧ４（配列番号４８２）または改変されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４（例えば、配列番号４８３））と置換して、本発明の完全なヒト抗体を生成する。特定の用途にしたがって選択した定常領域が変化し得る一方で、抗体の高親和性抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域内に存在する。
【００７３】
エピトープマッピングおよび関連テクノロジー
特定のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、日常的な交差ブロッキングアッセイ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載のアッセイなど）を行うことができる。他の方法には、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−６３）、またはペプチド切断分析が含まれる。さらに、エピトープ切り出し（ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。
【００７４】
用語「エピトープ」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位をいう。Ｂ細胞エピトープを、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次折り畳みによって並置された非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に曝露した状態で保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒での処理によって喪失する。エピトープは、典型的には固有の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３、より通常には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００７５】
改変支援プロファイリング（ＭＡＰ）（抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面に対する各抗体の結合プロフィールの類似性にしたがって同一抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリーに分ける方法である（ＵＳ ２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって示されたエピトープと明らかに異なるか部分的に重複する固有のエピトープを反映し得る。このテクノロジーにより、遺伝的に同一のｍＡｂを迅速にフィルタリングすることが可能となり、これにより特徴付けを遺伝的に異なるｍＡｂに集中させることができるようになる。ハイブリドーマスクリーニングに適用する場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を容易にすることができる。ＭＡＰを使用して、本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４ｍＡｂを異なるエピトープに結合するｍＡｂ群に分類することができる。
【００７６】
ＡＮＧＰＴＬ４はアミノ末端コイルドコイルドメインおよびカルボキシル末端フィブリノゲン様ドメインを含み、全長ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質は分子間ジスルフィド結合によって保持されたオリゴマーを形成する（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７９（３）：２０３８−２０４５）。Ｎ末端コイルドコイルドメインがＡＮＧＰＴＬ４のオリゴマー化を媒介し（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，前出）、ＬＰＬ活性の阻害で重要でもあると報告されている（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４６：１４８４−１４９０およびＯｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：４１８０４−４１８０９）。したがって、一定の実施形態では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体の抗原結合フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６）のＮ末端コイルドコイルドメイン（残基１〜１２３）内のエピトープに結合する。一定の実施形態では、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６）の約残基１〜約残基２５、約残基２５〜約残基５０、約残基５０〜約残基７５、約残基７５〜約残基１００、約残基１００〜約残基１２５、約残基１２５〜約残基１５０の領域内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ｈＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイルドメイン内の１つを超える列挙したエピトープを含むエピトープに結合する。他の実施形態では、ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントは、１つ以上のｈＡＮＧＰＴＬ４のフラグメント（例えば、配列番号４７６の残基２６〜４０６、残基２６〜１４８、残基３４〜６６、および／または残基１６５〜４０６のフラグメント）に結合する。
【００７７】
本発明は、本明細書中に記載の抗体の具体例のいずれかと同一のエピトープに結合するｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。同様に、本発明はまた、本明細書中に記載の抗体の具体例のいずれかとｈＡＮＧＰＴＬ４またはｈＡＮＧＰＴＬ４フラグメントへの結合を競合する抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を含む。
【００７８】
当該分野で公知の日常的方法の使用によって抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と同一のエピトープと結合するか否か、または結合を競合するか否かを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と同一のエピトープに結合するか否かを決定するために、参照抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、試験抗体がｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合する能力を評価する。試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ４に結合することができる場合、試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。他方では、試験抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体との飽和結合後にｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体によって結合されたエピトープと同一のエピトープに結合することができる。
【００７９】
抗体が参照抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体と結合を競合するか否かを決定するために、上記結合方法を、以下の２つの方向性で行う。第１の方向性では、参照抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４分子と結合させ、その後に試験抗体のｈＡＮＧＰＴＬ４分子への結合を評価する。第２の方向性では、試験抗体を飽和条件下でｈＡＮＧＰＴＬ４分子に結合させ、その後に参照抗体のＡＮＧＰＴＬ４分子への結合を評価する。両方の方向性で第１の（飽和）抗体のみがＡＮＧＰＴＬ４分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体がｈＡＮＧＰＴＬ４への結合を競合すると結論づける。当業者に認識されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、参照抗体と同一のエピトープに必ずしも結合しなくてもよいが、重複エピトープまたは隣接エピトープへの結合によって参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【００８０】
それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、２つの抗体は同一または重複するエピトープに結合する。すなわち、競合結合アッセイで測定した場合に、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の一方の抗体が、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を減少または排除させる抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少または排除させる場合、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または排除させるいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少または排除させる場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【００８１】
次いで、さらなる日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を行って、認められた試験抗体結合の欠如が実際に参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するか否か、または立体的遮断（または別の現象）が認められた結合の欠如に関与するか否かを確認することができる。この種の実験を、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
【００８２】
免疫結合体
本発明は、治療部分（細胞毒素、化学療法剤、免疫抑制薬、または放射性同位体など）に結合体化したヒト抗ＡＮＧＰＴＬ４モノクローナル抗体（「免疫結合体」）を含む。細胞毒素薬には、細胞に有害な任意の薬剤が含まれる。免疫結合体形成に適切な細胞毒素薬および化学療法薬の例は、当該分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１号を参照のこと）。
【００８３】
二重特異性
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性ｍＡｂは、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、１つを超える標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含むことができる。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９を参照のこと。ヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４ｍＡｂを、別の機能的分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結するか、またはこれらと共に発現することができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合、またはその他によって）１つ以上の他の分子的実体（別の抗体または抗体フラグメントなど）に機能的に連結させて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体を産生することができる。
【００８４】
本発明と関連して使用することができる例示的な二重特異性抗体形式は第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは相互に少なくとも１つのアミノ酸が異なり、アミノ酸の相違を欠く二重特異性抗体と比較して少なくとも１つのアミノ酸の相違によって二重特異性抗体のプロテインＡへの結合が減少する。１つの実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡ結合を減少させるか無効にする変異（Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）など）を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含むことができる。第２のＣＨ３内で見い出すことができるさらなる修飾には、以下が含まれる：Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ１抗体の場合）；Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ２抗体の場合）；およびＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）（ＩｇＧ４抗体の場合）。上記の二重特異性抗体形式の変形は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００８５】
生物学的等価性
本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗体フラグメントは、記載のｍＡｂと異なるが、ヒトＡＮＧＰＴＬ４に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。かかるバリアントｍＡｂおよび抗体フラグメントは、親配列と比較した場合に１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載のｍＡｂと本質的に等価な生物学的活性を示す。同様に、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示の配列と比較した場合に１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体フラグメントに本質的に生物学的に等価な抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗体のフラグメントをコードする配列を含む。かかるバリアントアミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記で考察されている。
【００８６】
２つの抗原結合タンパク質（すなわち、抗体）は、例えば、類似の実験条件下にて単回用量または複数回用量のいずれかで同一のモル用量で投与した場合にその吸収速度および吸収程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的に等価と見なされる。いくつかの抗体は、その吸収程度が等価であるが、吸収速度が等価でない場合に等価物または薬学的代替物と見なされ、依然として生物学的に等価と見なすことができる。なぜならば、かかる吸収速度の相違は意図的なものであり、標識に反映され、例えば、慢性使用における有効な体内薬物濃度の達成に不可欠ではなく、且つ研究した特定の薬物製品に関して医学的に些細なことであると見なされるからである。１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度、および効力において臨床的に有意義な相違が存在しない場合、生物学的に等価である。
【００８７】
１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、かかる切り換えを使用しないで治療を継続した場合と比較して、有害作用（免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減少が含まれる）のリスクの予想される増加を伴わずに、患者が参照生成物と生物学的製剤とを１回以上切り換えることができる場合に生物学的に等価である。
【００８８】
１つの実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、使用の条件に関して共通の作用機構によって、かかる機構が公知である範囲で両方とも作用する場合に生物学的に等価である。
【００８９】
生物学的等価性を、ｉｎ ｖｉｖｏ法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって示すことができる。生物学的等価性の測定には、例えば、（ａ）血液中、血漿中、血清中、または他の体液中の抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験、（ｂ）ヒトのｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的利用能データと相関しており、且つ合理的に予想されるｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な薬理学的急性効果を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、生物学的利用能、または生物学的等価性を確立する十分に制御された臨床試験が含まれる。
【００９０】
本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の生物学的に等価なバリアントを、例えば、生物学的活性に必要のない残基または配列の種々の置換、または末端または内部の残基または配列の欠失によって構築することができる。例えば、生物学的活性に不可欠ではないシステイン残基を欠失させるか他のアミノ酸と置換して、復元の際の不必要か不正確な分子内ジスルフィド結合架橋の形成を防止することができる。
【００９１】
治療的投与および処方物
本発明は、本発明の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物、およびこれらの治療的使用方法を提供する。本発明の治療組成物を、適切なキャリア、賦形剤、および処方物に組み込まれる他の薬剤と共に投与することで、伝達、送達、および耐性などが改善されるであろう。多数の適切な処方物を、全ての薬剤師に公知の処方集（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）中に見い出すことができる。これらの処方物には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、小胞を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（リポフェクチンＴＭなど）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型のエマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【００９２】
用量は、投与すべき被験体の年齢およびサイズ、標的疾患、処置の目的、状態、および投与経路などに応じて変化し得る。本発明の抗体を成人患者におけるＡＮＧＰＴＬ４に直接または間接的に関連する種々の状態および疾患（高コレステロール血症、ＬＤＬおよびアポリポタンパク質Ｂに関連する障害、および脂質代謝障害などが含まれる）の処置のために使用する場合、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で本発明の抗体を静脈内または皮下に投与することが有利である。状態の重症度に応じて、処置の頻度および継続時間を調整することができる。一定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを、初回量として少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇまで、または約５０ｍｇまで投与することができる。一定の実施形態では、初回量の後に、初回量とほぼ同量または初回量より少量であり得る量において、第２または複数のその後の抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を施すことができ、その後の投与は、少なくとも１〜３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間の間隔をあける。
【００９３】
種々の送達系が公知であり、送達系を使用して本発明の薬学的組成物（例えば、リポソーム中の被包、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス）を投与することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物を、任意の都合の良い経路（例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚の内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を介した吸収）によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。
【００９４】
小胞、特にリポソーム中の薬学的組成物を送達させることもできる（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと；一般に同書を参照のこと）。
【００９５】
一定の状況では、薬学的組成物を、制御放出系で送達させることができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）を参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって、全身用量の一部のみが必要である（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８，１９８４を参照のこと）。
【００９６】
注射用調製物には、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴注入などのための投薬形態が含まれ得る。これらの注射用調製物を、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物を、例えば、従来より注射のために使用されている滅菌水性媒質または油性媒質への上記の抗体またはその塩の溶解、懸濁、または乳化によって調製することができる。注射用水性媒質として、例えば、生理学的食塩水、グルコースおよび他の助剤を含む等張液などが存在し、これらを、適切な可溶化剤（アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物））など）と組み合わせて使用することができる。油性媒質として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、これらを、可溶化剤（安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなど）と組み合わせて使用することができる。このようにして調製した注射剤を、好ましくは、適切なアンプルに充填する。本発明の薬学的組成物を、標準的な針およびシリンジを使用して皮下または静脈内に送達させることができる。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の送達に容易に適用される。かかるペン送達デバイスは、再利用可能であるか、使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換式カートリッジを使用する。一旦カートリッジ内の全ての薬学的組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを、容易に破棄して薬学的組成物を含む新規のカートリッジと交換することができる。次いで、ペン送達デバイスを再利用することができる。使い捨てペン送達デバイスでは、交換式カートリッジが存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、あらかじめ充填された薬学的組成物がデバイス内のリザーバ中に保持されている。一旦リザーバ中の薬学的組成物が空になると、デバイス全体を破棄する。
【００９７】
多数の再利用可能なペンおよび自動注入送達デバイスが、本発明の薬学的組成物の皮下送達で適用される。ほんの数例を挙げれば、ＡＵＴＯＰＥＮＴＭ（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣＴＭペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５ＴＭペン、ＨＵＭＡＬＯＧＴＭペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０ＴＭペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮＴＭＩ，ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤＴＭペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴＴＭ、およびＯＰＴＩＣＬＩＫＴＭ（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などがあるが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達で適用される使い捨てペン送達デバイスの例には、ＳＯＬＯＳＴＡＲＴＭペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮＴＭ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００９８】
有利には、上記の経口または非経口用の薬学的組成物を、活性成分の用量にふさわしい適切な単位用量の投薬形態に調製する。単位用量のかかる投薬形態には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。前述の抗体の含有量は、一般に、単位用量の投薬形態（特に注射形態）あたり約０．１〜約８００ｍｇであり、前述の抗体は、他の投薬形態のために約１〜約５００ｍｇ、約５〜３００ｍｇ、約８〜２００ｍｇ、および約１０〜約１００ｍｇで含まれる。
【００９９】
組み合わせ療法
本発明は、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせた本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントの投与によるｈＡＮＧＰＴＬ４に直接または間接的に関連する疾患または障害の処置のための治療方法をさらに提供する。さらなる治療薬は、本発明の抗体またはそのフラグメントと有利に組み合わせられる１つ以上の任意の薬剤、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（セリバスタチン（ｃｅｒｏｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン（ｐｉｔａｖａｓｔｉｎ）、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、およびプラバスタチンなど）；ナイアシン；種々のフィブラート（フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、およびゲムフィブロジルなど）；およびＬＸＲ転写因子アクチベーターであり得る。さらに、本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントを、他のＡＮＧＰＴＬ４インヒビターならびにＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ５、ＡＮＧＰＴＬ６、およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（脂質代謝、特にコレステロールおよび／またはトリグリセリドホメオスタシスに関与する）などの他の分子のインヒビターと共投与することができる。これらの分子のインヒビターには、これらの分子に特異的に結合してその活性を遮断する小分子および抗体が含まれる（例えば、ＵＳ ２０１０／０１６６７６８Ａ１に開示の抗ＰＣＳＫ９抗体を参照のこと）。
【０１００】
さらに、さらなる治療薬は、１つ以上の抗がん剤（化学療法薬、抗血管新生薬、増殖阻害剤、細胞毒性薬、アポトーシス薬など）およびがんまたは他の増殖性疾患または障害を処置するための当該分野で周知の他の薬剤であり得る。抗がん剤の例には、抗有糸分裂剤（ドセタキセルおよびパクリタキセルなど）、プラチナベースの化学療法化合物（シスプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、およびオキサリプラチンなど）、または他の従来の細胞毒性薬（５−フルオロウラシル、カペシタビン、イリノテカン、ロイコボリン、およびゲムシタビンなど）、および抗血管新生薬、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）および受容体ベースのＶＥＧＦ遮断薬、例えば、米国特許第７，０７０，９５９号明細書中に記載の「ＶＥＧＦトラップ」、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）アンタゴニスト（米国特許出願公開第２００８／０１８１８９９号明細書中に記載の抗Ｄｌｌ４抗体など）、およびＤｌｌ４の細胞外ドメインを含む融合タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２００８／０１０７６４８号明細書中に記載のＤｌｌ４−Ｆｃ）；受容体チロシンキナーゼおよび／または血管形成のインヒビター（ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標）、Ｂａｙｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）、スニチニブ（スーテント（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、パゾパニブ（ボトリエントＴＭ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、トセラニブ（パラディアＴＭ、Ｐｆｉｚｅｒ）、バンデタニブ（ザクチマＴＭ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、セジラニブ（レセンチン（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、レゴラフェニブ（ＢＡＹ ７３−４５０６、Ｂａｙｅｒ）、アキシチニブ（ＡＧ０１３７３６、Ｐｆｉｚｅｒ）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１、Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ゲフィチニブ（イレッサＴＭ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＩＢＷ２９９２（トボックＴＭ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ラパチニブ（タイカーブ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、およびネラチニブ（ＨＫＩ−２７２、Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ）などが含まれる）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、他の治療薬（鎮痛薬、および抗炎症薬（非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）が含まれる）など）を本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントと共投与して、基礎をなすがん／腫瘍に伴う症状を回復および／または低下させることもできる。
【０１０１】
本発明のｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはそのフラグメントおよびさらなる治療薬を、一緒に、または別々に共投与することができる。別々の投薬処方物を使用する場合、本発明の抗体またはそのフラグメントおよびさらなる薬剤を、同時投与してもよく、または交互に（すなわち、逐次）適切な順序で別々に投与してもよい。
【０１０２】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を使用して、例えば、診断目的のためにサンプル中のＡＮＧＰＴＬ４を検出および／または測定することもできる。例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂまたはそのフラグメントを使用して、ＡＮＧＰＴＬ４の異常な発現（例えば、過剰発現、低発現、発現の欠如など）によって特徴づけられる状態または疾患を診断することができる。例示的なＡＮＧＰＴＬ４の診断的アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂと接触させる工程を含むことができ、ここで、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されているか、またはこの抗体を使用して患者サンプルからＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を選択的に捕捉し、単離する。あるいは、非標識の抗ＡＮＧＰＴＬ４Ａｂを、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断的適用で使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３１Ｉ、または１２５Ｉなど）、蛍光部分または化学発光部分（フルオレセインイソチオシアナートまたはローダミンなど）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはルシフェラーゼなど）であり得る。サンプル中のＡＮＧＰＴＬ４を検出または測定するために使用することができるアッセイには、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）などが含まれる。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例を、当業者に本発明の方法および組成物の作製および使用方法を完全に開示および説明するために示し、発明者らが発明者らの発明と見なす範囲を制限することを意図しない。使用した数値に関して正確さを保証する努力をしているが、いくつかの実験上のエラーおよび偏りが存在するはずである。他で示さない限り、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１０４】
実施例１：ヒトＡＮＧＰＴＬ４に対するヒト抗体の生成
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥＴＭマウスを、ヒトＡＮＧＰＴＬ４を使用して免疫化し、これらのマウスから得た血清を使用した抗原特異的免疫アッセイによって抗体免疫応答をモニタリングした。抗ｈＡＮＧＰＴＬ４発現Ｂ細胞を、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体力価の上昇が認められた免疫化マウスの脾臓から採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させた。下記のアッセイを使用して、ハイブリドーマをスクリーニングおよび選択し、ｈＡＮＧＰＴＬ４特異的抗体を発現する細胞株を同定した。アッセイによってキメラ抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を産生したいくつかの細胞株が同定され、これらを、Ｈ１Ｍ２２２、Ｈ１Ｍ２２３、Ｈ１Ｍ２２４、Ｈ１Ｍ２２５、Ｈ１Ｍ２３４、およびＨ１Ｍ２３６と命名した。
【０１０５】
ＵＳ ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載のように、ヒトＡＮＧＰＴＬ４特異的抗体も、骨髄腫細胞に融合しない抗原免疫化Ｂ細胞から直接単離した。重鎖および軽鎖可変領域をクローン化して、完全なヒト抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（Ｈ１Ｈ２５７、Ｈ１Ｈ２６８、Ｈ１Ｈ２８３、Ｈ１Ｈ２８４、Ｈ１Ｈ２８５、Ｈ１Ｈ２９１、Ｈ１Ｈ２９２、Ｈ１Ｈ２９５、Ｈ１Ｈ６２４、Ｈ１Ｈ６３７、Ｈ１Ｈ６３８、Ｈ１Ｈ６４４、およびＨ１Ｈ６５３と命名）を生成した。安定な組換え抗体発現ＣＨＯ細胞株を樹立した。
【０１０６】
実施例２．可変遺伝子利用分析
産生された抗体の構造を分析するために、抗体の可変領域をコードする核酸をクローン化し、配列決定した。抗体の核酸配列および推定アミノ酸配列から、各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の遺伝子使用を同定した。表１は、選択した本発明の抗体についての遺伝子使用を示す。
【０１０７】
【表１】
表２は、選択された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列対およびその対応する抗体識別名を示す。Ｎ、Ｐ、およびＬの表記は、同一のＣＤＲ配列を有するが、ＣＤＲ配列の外側の領域中（すなわち、フレームワーク領域中）に配列変形を有する重鎖および軽鎖を有する抗体を指す。したがって、特定の抗体のＮ、Ｐ、およびＬバリアントは、その重鎖および軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、フレームワーク領域内が改変されている。
【０１０８】
【表２】
実施例３．ｈＡＮＧＰＴＬ４結合親和性の決定
マウスＩｇＧ２ａに直列に融合したヒトＡＮＧＰＴＬ４（ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ；配列番号４８０）のアミノ酸残基２６〜１４８に結合する選択された抗体への抗原結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、リアルタイムバイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ１００）を使用して表面動態によって決定した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを、遊離アミノ基を介してＢＩＡＣＯＲＥＴＭチップに化学的にカップリングしたヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して捕捉した。種々の濃度（１２．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲）の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体を、捕捉された抗原表面上に９０秒間注入した。抗原−抗体結合および解離を、２５℃および３７℃にてリアルタイムでモニタリングした。動態分析を行って、抗原／抗体複合体解離のＫＤおよび半減期を計算した。結果を表３に示す。ヒト抗ＥＧＦＲ抗体を、捕捉したｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃに結合しないネガティブコントロールとして使用した。
【０１０９】
【表３】
Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐについて、Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって調製し、標準的な精製方法によって精製し、本質的に上記の方法にしたがって、ｈＡＮＧＰＴＬ４に対するその結合親和性をＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムを使用して２５℃、ｐＨ７．２およびｐＨ５．７５で測定した。簡潔に述べれば、種々の濃度（３．１２５ｎＭ〜１００ｎＭ）の抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（すなわち、Ｈ１Ｈ２６８Ｆａｂ、全Ｈ１Ｈ２６８ｍＡｂ、Ｈ１Ｈ２８４Ｆａｂ、および全Ｈ１Ｈ２８４ｍＡｂ）を、低密度抗ｍＦｃ捕捉したｈＡＮＧＰＴＬ４（２６−１４８）−ｍＦｃ（約６８±４ＲＵ）表面上、またはアミノカップリングしたｈＡＮＧＰＴＬ４（２６−４０６）−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（４５０ＲＵ）またはアミノカップリングしたＣ末端ヘキサヒスチジンタグと共に発現されるカニクイザルＮ末端領域（配列番号４９０のアミノ酸残基１〜１３０）（ＭｆＡＮＧＰＴＬ４（１−１３０）−Ｈｉｓ）（１，０２８ＲＵ）の表面上に注入した。動態分析を行ってｋａおよびｋｄを測定し、抗原／抗体複合体解離のＫＤ値および半減期を計算した。結果を表４（Ｈ１Ｈ２６８Ｐ）および表５（Ｈ１Ｈ２８４Ｐ）に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
【表５】
両Ｆａｂフラグメントは、抗体分子全体よりも低い親和性ではあるが、全てのＡＮＧＰＴＬ４形態に結合することができた。
【０１１２】
実施例４．抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体交差反応の決定
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の関連タンパク質（すなわち、ｈＡＮＧＰＴＬ３、ヒトアンギオポエチン様タンパク質５（ｈＡＮＧＰＴＬ５）、およびマウスＡＮＧＰＴＬ４（ｍＡＮＧＰＴＬ４））に対する交差反応の可能性を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムを使用して、選択した抗体（すなわち、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐ）について試験した。簡潔に述べれば、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体および任意のＡＮＧＰＴＬタンパク質に対する結合物質ではないネガティブコントロール（すなわち、２つのモノクローナル抗体（コントロールａおよびコントロールｂ））を、３．１２５μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬで、それぞれ、ｈＡＮＧＰＴＬ３−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３８２９−ＡＮ）（５２２８ＲＵ）、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４４８７−ＡＮ）（６２４７ＲＵ）、ｈＡＮＧＰＴＬ５−Ｈｉｓ（Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号Ｈ００２５３９３５−Ｐ０１）（５２６５ＲＵ）、およびｍＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ（ＡＳリンカーを用いてＣ末端６−ヒスチジンタグと融合したｍＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７８）のＲ２６−Ｓ４１０）（５２３３ＲＵ）のアミンカップリングしたチップ表面に注入した。ｈＡＮＧＰＴＬ３に特異的なポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号ＢＡＦ３４８５）も試験した。各抗体の結合（比ＲＵ値として示す）を決定し、結果を表６に示す。
【０１１３】
【表６】
Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４ＰはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓのみと特異的に結合したが、いずれの他の関連ＡＮＧＰＴＬタンパク質とも結合しなかった。
【０１１４】
さらに、種々のＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４ペプチドに対するＨ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐの結合親和性も、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステムによって決定した。簡潔に述べれば、Ｈ１Ｈ２６８Ｐ（１３４８±１１ＲＵ）およびＨ１Ｈ２８４Ｐ（８６８±１３ＲＵ）を抗ヒトＦｃ表面上に捕捉し、種々の濃度（６２．５ｎＭ〜５００ｎＭ）のｈＡＮＧＰＴＬ３およびｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドを注入した。試験したペプチドは、ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６のＲ３４〜Ｌ６６）、Ｎ末端ビオチン化ｈＡＮＧＰＴＬ４（配列番号４７６のＲ３４〜Ｌ６６）、ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号４８５のＲ３６〜Ｉ６８）、およびＮ末端ビオチン化ｈＡＮＧＰＴＬ３（配列番号４８５のＲ３６〜Ｉ６８）であった。動態分析を行ってｋａおよびｋｄを測定し、抗原／抗体複合体解離のＫＤ値および半減期を計算した。結果を表７に示す。ＮＢ：記載の実験条件下で結合なし。
【０１１５】
【表７】
ｈＡＮＧＰＴＬ３ペプチドに結合した抗体はなかった。さらに、Ｈ１Ｈ２８４Ｐは、最高のペプチド試験濃度（５００ｎＭ）においてさえもいかなるｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドにも結合しない一方で、Ｈ１Ｈ２６８Ｐは両方のｈＡＮＧＰＴＬ４ペプチドに結合することができた。これは、Ｈ１Ｈ２６８Ｐが３４〜６６領域内の線状エピトープを認識することを示唆している。対照的に、Ｈ１Ｈ２８４Ｐは、この領域の外側に結合するか、この領域内の線状エピトープを認識しない。
【０１１６】
実施例５．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ４の阻害
リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、ヒトにおける脂質代謝で重要な役割を果たす。ＬＰＬはトリグリセリドの加水分解を触媒し、代謝されることになる脂肪酸を放出する。ＡＮＧＰＴＬ４は、ＬＰＬ活性を阻害して脂質レベルを増加させる（Ｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１（１０）：４７３−４７９）。ＡＮＧＰＴＬ４のＮ末端コイルドコイル領域は、独立で、およびＣ末端フィブリノゲン様領域に連結した場合の両方で、ホモ多量体化する。Ｎ末端領域はまた、Ｃ末端フィブリノゲン領域を伴わずに発現した場合にＬＰＬを阻害する。無細胞バイオアッセイを開発して、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がＬＰＬ活性のＡＮＧＰＴＬ４誘導性の減少を阻害する能力を決定した。
【０１１７】
選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体によるｈＡＮＧＰＴＬ４活性の阻害を、ＣＯＮＦＬＵＯＬＩＰＴＭ連続蛍光分析リパーゼ試験（Ｐｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、以下の２つのｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用して決定した：Ｃ末端ヘキサ−ヒスチジンタグを有する全長ｈＡＮＧＰＴＬ４（すなわち、配列番号４７６のアミノ酸残基２６〜４０６）（ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）およびＮ末端コイルドコイル領域を含むｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）。
【０１１８】
簡潔に述べれば、２ｎＭウシＬＰＬ、０．２５μＭヒトＡｐｏＣＩＩ（ＬＰＬの補因子）、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、および１．６ｍＭ ＣａＣｌ２を、９６ウェルアッセイプレート中であらかじめ混合した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓタンパク質またはｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質のいずれかを、Ａｐｏ／ＬＰＬ混合物にそれぞれ最終濃度１０ｎＭおよび２ｎＭまで添加した。次いで、Ａｐｏ／ＬＰＬ／ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質混合物に、出発濃度３００ｎＭ（ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ阻害用）または１００ｎＭ（ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ阻害用）で連続希釈した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を添加し、室温で３０分間インキュベートした（最終容積５０μｌ）。インキュベーション後、２００μｌの再構成リパーゼ基質（１−トリニトロフェニル−アミノ−ドデカノイル−２−ピレンデカノイル−３−０−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロール（ＬＳ−Ａ，Ｐｒｏｇｅｎ））を抗体混合物に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）を使用して３４２ｎｍ／４００ｎｍ（励起／発光）で測定した。蛍光は、ＬＰＬ活性に比例する。結果を表８に示す。コントロールＩ：ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）。コントロールＩＩ：ｈＡＮＧＰＴＬ４に結合しない無関係のヒト抗体。ＮＴ：試験せず。全阻害（すなわち、１００％阻害）を、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体およびＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の非存在下で２ｎＭウシＬＰＬ、０．２５μＭヒトＡｐｏＣＩＩ、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、および１．６ｍＭ ＣａＣｌ２を使用したアッセイの相対蛍光単位（ＲＦＵ）から決定した。
【０１１９】
【表８】
抗体Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐは、試験した抗体（ポリクローナルｈＡＮＧＰＴＬ４抗体コントロールが含まれる）のうちでＬＰＬに対するＡＮＧＰＴＬ４阻害活性の最高の阻害を示した。抗体Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐについて、２ｎＭ ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃの５０％最大阻害に必要な抗体濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ０．８ｎＭおよび１．２ｎＭと決定された。さらに、１０ｎＭ ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓの５０％最大阻害に必要な抗体濃度は、それぞれ０．５ｎＭおよび０．２ｎＭと決定された。
【０１２０】
同様に、Ｈ１Ｈ２８４ＰおよびＨ１Ｈ２６８Ｐを、ＬＰＬバイオアッセイにて以下の異種間オルソログを阻害する能力について試験した：Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグと共に発現するカニクイザルＮ末端領域（アミノ酸残基２６〜１４８）（Ｈｉｓ−ＭｆＡＮＧＰＴＬ４；配列番号４８８）およびＣ末端ヘキサ−ヒスチジンタグを有するマウス全長オルソログ（配列番号４７８のアミノ酸残基２６〜４１０）（ｍＡＮＧＰＴＬ４−Ｈｉｓ）。表９に示すように、ＬＰＬアッセイにおいてＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用した全用量−応答を最初に実施して各実験についてのＡＮＧＰＴＬ４ ＥＣ５０を決定し、一定濃度のＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を使用して各抗体のＩＣ５０を決定した。抗体濃度は、０〜１００ｎＭの範囲であった。ＮＢ：遮断なし。
【０１２１】
【表９】
両抗体は、ヒトＡＮＧＰＴＬ４（全長およびＮ末端）およびサルＡＮＧＰＴＬ４（Ｎ末端）両方のタンパク質活性をＩＣ５０約０．３〜０．５ｎＭで阻害したが、いずれの抗体も最高の抗体試験濃度（すなわち、１００ｎＭ）でマウスＡＮＧＰＴＬ４（全長）を阻害しなかった。
【０１２２】
実施例６．血漿脂質レベルに及ぼすＡＮＧＰＴＬ４のｉｎ Ｖｉｖｏでの影響
ｈＡＮＧＰＴＬ４をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与して、血漿脂質レベルに及ぼすｈＡＮＧＰＴＬ４の生物学的影響を決定した。簡潔に述べれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを５匹の動物の４つの群に分け、各群に異なる量のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質（配列番号４８０）：マウスあたり２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、および３００μｇを投与した。コントロール群にＰＢＳを注射した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃタンパク質およびＰＢＳを、尾静脈を介した静脈内注射（ｉ．ｖ．）によって投与した。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃまたはＰＢＳ送達から１５分、３０分、６０分、および１２０分後にマウスから採血し、血漿脂質レベルを、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１６５０化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各用量群についてトリグリセリド、全コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ−Ｃ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を決定した。全コレステロール、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬの測定値は、注射後の各時点で各用量群間で有意差はなかった。２５μｇ／マウスのｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃの注射により、注射３０分後のコントロールマウス（ＰＢＳ）と比較して２倍を超えて循環トリグリセリドが増加した。したがって、下記のように、２５μｇ用量のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体による、血清トリグリセリドレベルのＡＮＧＰＴＬ４誘導性増加の阻害の分析のための可能な最小投薬量として選択した。
【０１２３】
実施例７．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体によるＡＮＧＰＴＬ４のｉｎ Ｖｉｖｏ阻害
別の実験セットでは、選択した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、ｈＡＮＧＰＴＬ４誘導性のトリグリセリドレベルの増加を阻害する能力について試験した。全コレステロール（全−Ｃ）、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬも測定した。簡潔に述べれば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、各試験抗体について５匹のマウス群に分けた。５ｍｇ／ｋｇ用量の抗体を皮下注射によって投与した。コントロール群Ｉ（すなわち、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体やｈＡＮＧＰＴＬ４を投与されていないマウス）にＰＢＳを投与した。抗体注射の２４時間後、ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）を、２５μｇ／マウスの用量で各抗体群に投与した（ｉ．ｖ．）。ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ注射の３０分後にマウスから採血し、脂質レベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１６５０化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各抗体群またはコントロール群についてのトリグリセリド、全コレステロール、ＬＤＬ、ＮＥＦＡ−Ｃ、およびＨＤＬの各測定値の平均を計算した。標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して、循環抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（血清Ａｂ）レベルも決定した。簡潔に述べれば、血清Ａｂを捕捉するためにヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレートをコーティングした。次いで、血清をプレートに添加し、捕捉された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して化学発光によって検出した。結果（血清脂質濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を、表１０〜１２に示す。コントロールＩ：ＰＢＳを投与したが、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体やｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを投与しなかったマウス。コントロールＩＩ：ＣＤ２０に特異的なヒト抗体（すなわち、ＵＳ ２００８／０２６０６４１に開示の２Ｆ２クローン配列を有するｍＡｂ）およびｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃを投与したマウス。
【０１２４】
【表１０】
【０１２５】
【表１１】
【０１２６】
【表１２】
ｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（２５μｇ）の注射後、多くの試験した抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（表１０〜１２に示す）は、無関係の抗体（コントロールＩＩ）で処置したマウスと比較して、血清トリグリセリドレベルの有意な減少を示した。
【０１２７】
実施例８．ｈＩｇＧ４アイソタイプを有する抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の調製
ｈＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐを、各定常領域をヒンジ領域内にＳ１０８Ｐ変異を含む配列番号４８３のｈＩｇＧ４アミノ酸配列で置換することによってｈＩｇＧ４アイソタイプに変換した。さらに、単一アミノ酸置換をＨ１Ｈ２６８Ｐ（配列番号４２）のフレームワーク領域１中に導入してＩｇＧ４バージョンのＨ４Ｈ２６８Ｐ２（配列番号４８７）を形成させた。それぞれＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐと命名されたＩｇＧ４抗体のｈＡＮＧＰＴＬ４−ｍＦｃ（配列番号４８０）結合についてのＫＤ（ｐＭ）値およびｔ１／２値を、上記実施例３のプロトコールにしたがってｐＨ７．４および２５℃でのＢｉａｃｏｒｅによって得た。結果を以下の表１３に示す。
【０１２８】
【表１３】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐを、対応するＩｇＧ１バージョン（それぞれ、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐ）と共に、上記実施例５に記載のようにＬＰＬ阻害アッセイで試験して、ＩＣ５０値を決定した。結果を表１４に示す。ＮＢ：遮断なし。
【０１２９】
【表１４】
このアッセイでは、Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐは全長およびＮ末端ｈＡＮＧＰＴＬ４タンパク質について約０．２〜０．７ｎＭの範囲のＩＣ５０を示し、一方で、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４ＰのＩＣ５０は約１．０〜２．０ｎＭの範囲であった。
【０１３０】
実施例９．抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態研究
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐの薬物動態学的クリアランス速度を、野生型マウスおよびヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するトランスジェニックマウス（ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウス）において決定した。野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの両方の系統バックグラウンドは、Ｃ５７ＢＬ６（７５％）および１２９Ｓｖ（２５％）であった。野生型マウスまたはｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウスのいずれかの５匹のマウスからなる個別のコホートに、１ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、または無関係の特異性を有するアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）コントロールを皮下（ｓ．ｃ．）投与した。血液サンプルを、注射０時間後、６時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、７日後、１０日後、および１５日後、２２日後、および３０日後に採取した。ヒト抗体の血清レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に述べれば、ヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ）で９６ウェルプレートをコーティングし（濃度１μｇ／ｍＬ）、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＢＳＡでブロッキングした後、６ポイント連続希釈の血清サンプルおよび１２ポイント連続希釈の各抗体の参照標準物をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。適切な洗浄緩衝液での洗浄後、捕捉されたヒト抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合体化した同一のヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＰＡ）を使用して検出し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用した標準的な比色反応によって発色させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。血清中のヒト抗体濃度を、同一のサンプルプレートについて作成した参照標準物曲線を使用して決定した。結果を表１５ならびに図３Ａおよび３Ｂに示す。
【０１３１】
【表１５】
表１５に示すように、それぞれ、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、およびｈＩｇＧ４コントロールについて３０日間にわたって計算した曲線下面積（ＡＵＣ）（約３１８、２００、および１９９（ｈｒ＊μｇ／ｍＬ））に反映されるように、両抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体は、野生型マウスにおいてアイソタイプ適合コントロール抗体に類似のクリアランス速度を示した（図３Ａも参照のこと）。ヒトＡＮＧＰＴＬ４のみを発現するトランスジェニックマウス（ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋））では、ＡＵＣで反映されるクリアランス速度は、野生型マウスにおけるクリアランス速度（それぞれ、３１８および２００ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）と比較して、およびｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウス（１６８ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）または野生型マウス（１９９ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）のいずれかにおけるアイソタイプ適合コントロール抗体のクリアランス速度と比較して、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（３７．０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）およびＨ４Ｈ２８４Ｐ（７．６０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）についてより速かった（図３Ｂも参照のこと）。ｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋）マウスでは、Ｈ４Ｈ２８４Ｐについての３０日間ＡＵＣ（７．６０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）は、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２（３７．０ｈｒ＊μｇ／ｍＬ）の約１／５であった。まとめると、これらの結果は、両抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がヒトＡＮＧＰＴＬ４を発現するマウスにおいて標的媒介クリアランスを示し、Ｈ４Ｈ２８４ＰがＨ４Ｈ２６８Ｐ２よりクリアランス速度が実質的に速いことを示唆している。
【０１３２】
実施例１０．ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける循環ＴＧレベルに及ぼすＩｇＧ１抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの影響
血清ＴＧレベルに及ぼす抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ１Ｈ２６８ＰおよびＨ１Ｈ２８４Ｐの影響を、ヒトＮ末端コイル−コイル領域を含むＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を発現するマウス（「ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウス」）において決定した。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスを、Ｃ５７ＢＬ６／１２９（Ｆ１Ｈ４）胚性幹細胞中でマウスＡｎｇｐｔｌ４遺伝子の最初の３つのエクソン（Ｎ末端コイル−コイル領域）を対応するヒトＮ末端コイル−コイルＡＮＧＰＬＴ４配列で置換することによって作製した。生殖系列移行の確立後、ヘテロ接合体マウス（ＡＮＧＰＴＬ４ｈｕｍ／＋）を交配させてＣ５７ＢＬ６バックグラウンドでホモ接合体マウス（ＡＮＧＰＴＬ４ｈｕｍ／ｈｕｍまたはｈＡＮＧＰＴＬ４（＋／＋））を作製した。実験７日前（−７日目）にヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスから予め採血し、各試験抗体についてそれぞれ６匹のマウスの群に分けた。抗体（Ｈ１Ｈ２６８Ｐ、Ｈ１Ｈ２８４Ｐ、およびマウス抗原に対する交差反応が知られていないアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ１）コントロール）を、用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、および１１日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清ＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各時点の各抗体についての平均ＴＧレベルを計算した。結果（血清ＴＧ濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１６に示す。
【０１３３】
【表１６】
循環抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（「血清ヒトＡｂ」）レベルも、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。簡潔に述べれば、血清ヒトＡｂを捕捉するためにプレートをヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングした。次いで、血清をプレートに添加し、捕捉された抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した化学発光によって検出した。結果（血清ヒトＡｂの（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１７に示す。
【０１３４】
【表１７】
Ｈ１Ｈ２６８Ｐのヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスへの投与により、アイソタイプ適合コントロール抗体を投与したマウスと比較して、抗体投与の４〜１１日後に循環ＴＧが約２５〜３０％減少した。Ｈ１Ｈ２８４Ｐ投与に起因するＴＧ減少は、抗体注射４日後で最も有効であったが（ＴＧ減少約３４％）、１１日目までにＴＧレベルはコントロールレベルまで増加して戻った。これは、おそらく抗体の迅速なクリアランス速度に起因するであろう。
【０１３５】
実施例１１．ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおける循環ＴＧレベルに及ぼすＩｇＧ４抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの影響
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐの血清ＴＧレベルに及ぼす影響を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスにおいて決定した。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスから、実験７日前に予め採血し、各試験抗体についてそれぞれ６匹のマウス群に分けた。抗体（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２、Ｈ４Ｈ２８４Ｐ、およびマウス抗原に対する交差反応が知られていないアイソタイプ適合（ｈＩｇＧ４）コントロール）を、用量１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、および１１日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。各時点の各抗体についての平均ＴＧレベルを計算した。結果（血清ＴＧ濃度の（平均±ＳＥＭ）として示す）を表１８に示す。
【０１３６】
【表１８】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐのヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスへの投与により、アイソタイプ適合コントロール抗体を投与したマウスと比較して、抗体投与１日後（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２）および４日後（Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐ）の循環ＴＧが有意に減少した。
【０１３７】
循環ＴＧレベルに及ぼすＨ４Ｈ２６８Ｐ２の影響を、ＡｐｏＥヌルマウスと交配したヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスでさらに研究した。ＡｐｏＥヌルマウスモデルは、ＶＬＤＬレムナントクリアランス障害に起因して大部分のコレステロールおよびＴＧがＶＬＤＬ粒子において循環する高アテローム生成性および高脂血性モデルとして公知である。ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４×ＡｐｏＥヌルマウスから実験７日前に予め採血し、各６匹のマウスの２群に分けた。抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびコントロールＡｂを、１０ｍｇ／ｋｇで皮下注射によって投与した。抗体注射の１、４、７、１１、および１７日後に、絶食４時間後のマウスから採血し、血清中のＴＧレベルをＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって決定した。図４に示したＴＧ減少を、コントロールＡｂと比較したＴＧレベルの比率として示す。
【０１３８】
コントロールＡｂを投与したマウスと比較して、ＴＧレベルは全１７日間で有意に減少し（４２％超）、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２投与７日後に最も減少した（約５０％）。
【０１３９】
実施例１２．フェノフィブラートと組み合わせた抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体の血清ＴＧレベルに及ぼすｉｎ ｖｉｖｏでの影響
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＴＧ低下薬フェノフィブラートの単独または組み合わせの血清ＴＧレベルに及ぼす影響を、ヒト化ＡＮＧＰＴＬ４マウスで評価した。実験７日前に絶食４時間後のマウスから予め採血し、各６匹のマウスの４群に分けた。群２および４に、０日目に１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２を皮下注射によって投与し、群１（コントロール群）および２に、一般飼料（ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）を与えた。群３および４に、０．０５％（ｗ／ｗ）のフェノフィブラート（パイロット研究において投薬レベルを実験的に決定した）を補充した飼料を与えた。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２および／またはフェノフィブラート投与後７日目に、終末の採血から血清を収集し（絶食４時間後）、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって分析した。結果を図５に示す。
【０１４０】
Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみおよびフェノフィブラートとの組み合わせの投与により、投与７日後の循環ＴＧレベルが有意に減少した。ＴＧレベルは、飼料で処置したコントロール群と比較して、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみの投与７日後に約４０％（平均）、フェノフィブラート処置のみの後に約２５％、ならびにＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびフェノフィブラートの組み合わせの処置後に約５０％減少した。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２は、マウスモデルにおける循環ＴＧレベルの減少においてフェノフィブラートより有効であった。組み合わせ処置により、ＴＧレベルに対するＨ４Ｈ２６８Ｐ２およびフェノフィブラートの相乗効果が認められた。注目すべきことに、７日間フェノフィブラートを消費したマウス（群３および４）から採取した肝臓は、コントロール飼料を消費したマウス（群１および２）と比較して、有意に大きくなった（１．８倍、肝臓重量／体重）（データ示さず）。
【０１４１】
実施例１３．肥満アカゲザルにおける抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体の薬物動態学／薬力学についてのパイロット研究
第Ｉ相：パイロット非ＧＬＰ薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２およびＨ４Ｈ２８４Ｐを、単回ボーラス静脈内（ＩＶ）注射として肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に投与した。アカゲザルを選択したのは、この種が系統学的および生理学的にヒトと密接に関連し、非臨床的毒性評価のために一般に使用される種であるからである。典型的に中程度に上昇したＴＧレベル（すなわち、平均＞１００ｍｇ／ｄＬ；超ＴＧ）を示すので、高脂肪食を６ヶ月超与えた肥満サルを選択した。８匹の健康が確認された雄性サルを馴化させ、投与前７日間のベースライン評価研究に割り当てた。−５日目に全動物にビヒクル（１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６）をＩＶ注入によって投与し、その後、０日目にＩＶで１０ｍｇ／ｋｇにてその内の４匹にＨ４Ｈ２６８Ｐ２を投与し、別の４匹にＨ４Ｈ２８４Ｐを投与した。注入後のいかなる時点においても注射部位の反応や他の有害作用は認められなかった。
【０１４２】
血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取し、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって血清脂質レベルについて評価した。各動物についての平均ベースラインを、−７、−５、および０日目に採取したサンプルに基づいて決定した。ビヒクル投与後に採取したサンプルの予備分析により、各群由来の３匹の肥満動物が絶食時ＴＧレベルの上昇を示し（すなわち、ＴＧ＞１００ｍｇ／ｄＬ）、一方で、各群由来の１匹の動物が十分に正常範囲内の平均ＴＧレベル（すなわち、平均絶食ＴＧレベル４２ｍｇ／ｄＬおよび８４ｍｇ／ｄＬ）を示すことが明らかとなった。したがって、各群の３匹の動物を使用してデータ分析を行った。ベースラインからの血清ＴＧレベルの変化率（％）を各動物について決定し、各Ａｂ群について平均化した。結果を図６に示す。
【０１４３】
３匹の軽度の超ＴＧ動物へのＨ４Ｈ２６８Ｐ２の投与により、投与後４日目に５７％の最大減少を示した。Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２処置後のこれらの動物についての平均血清ＴＧレベルは、ほぼ２５日目まで１００ｍｇ／ｄＬ以下に維持された。さらなる脂質（ＬＤＬ−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）およびＨＤＬ−Ｃなど）に対する中程度の影響が認められたが、全−Ｃは不変であった（データ示さず）。低ＴＧレベルの単一の肥満動物へのＨ４Ｈ２６８Ｐ２の投与により、絶食時ＴＧや任意の他の脂質パラメーターを低下させるいかなる有意な影響も得られず（データ示さず）、抗体によるＴＧレベルの減少の下限が示唆された。
【０１４４】
第ＩＩ相：第２の非ＧＬＰ薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２のみを単回ボーラス静脈内（ＩＶ）注射として８匹の肥満アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）に投与した。本研究では、投与前（ｐｒｅ−ｄｏｓｉｎｇ）ビヒクル注射工程を省略した。研究−７、−３、および０日目に３つのベースライン評価を行い、０日目に８匹全てのサルに１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ２６８Ｐ２をＩＶで投与した。血清サンプルを、ベースライン期から投与後３５日目まで採取し、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１８００化学システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって血清脂質レベルについて評価した。あらかじめ影響を予想するために、平均ベースラインＴＧレベルにしたがってデータ分析のために動物を以下のように分類した：Ａ．ＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝３）、Ｂ．１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝４）、およびＣ．ＴＧ＞１０００ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝１）。
【０１４５】
図７は、３つのベースラインＴＧ値の平均からのＴＧレベルの変化率として示した３群のＴＧレベルを示す。前臨床データに基づいて予想されるように、基礎血清ＴＧレベルが高い動物ほど、より高い絶食ＴＧレベルの減少が認められた。ベースラインＴＧレベルが１０００ｍｇ／ｄＬ超であった個別の動物において、特に劇的且つ迅速なＴＧレベルの低下が認められた。ベースライン１５０ｍｇ／ｄＬ＜ＴＧ＜５００ｍｇ／ｄＬの動物についてＴＧレベルの堅調な減少（５０〜６８％）が認められた。この肥満サル群では、Ｈ４Ｈ２６８Ｐ２の投与によってＨＤＬ−Ｃが増加したが、ＬＤＬ−Ｃや全−Ｃに影響を及ぼさなかった（データ示さず）。ベースラインＴＧ＜１５０ｍｇ／ｄＬ（正常ＴＧレベル）の動物は、大部分がＨ４Ｈ２６８Ｐ２に無反応であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
【化４】
から選択される重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせを含む、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
【化５】
から選択される軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３を含み、該重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３は、
【化６】
から選択されるＣＤＲ配列組み合わせを含む、抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、
【化７】
から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離ヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項５】
【化８】
から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をさらに含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
【化９】
から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号４８７／４４または９０／９２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項６または７に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項３、６、および７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ４への結合を競合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項３、６、７、および９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項３、６、および７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントがカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４およびアカゲザルＡＮＧＰＴＬ４と交差反応する、抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０（配列番号４７１）（式中、Ｘ１はＡｌａであり、Ｘ２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ３はＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ４はＧｌｙ、Ａｓｐ、または不在であり、Ｘ５はＡｓｐまたは不在であり、Ｘ６はＬｅｕ、Ａｒｇ、または不在であり、Ｘ７はＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｘ８はＰｈｅ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇであり、Ｘ９はＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎであり、Ｘ１０はＡｓｐ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ１１はＴｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ１３はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ１４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ１５はＴｙｒであり、Ｘ１６はＰｈｅまたはＧｌｙであり、Ｘ１７はＬｅｕまたは不在であり、Ｘ１８はＡｓｐであり、Ｘ１９はＴｙｒ、Ｖａｌ、またはＰｈｅであり、Ｘ２０はＴｒｐである）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、および
（ｂ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号４７４）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ｘ３はＴｙｒまたはＬｅｕであり、Ｘ４はＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ７はＰｒｏ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ８はＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ９はＴｈｒであり、Ｘ１０はＰｈｅである）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
（ｃ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４６９）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＰｈｅであり、Ｘ３はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｘ５はＳｅｒであり、Ｘ６はＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ７はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ８はＨｉｓ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
（ｄ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４７０）（式中、Ｘ１はＩｌｅであり、Ｘ２はＡｓｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ３はＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、Ｘ４はＡｒｇ、Ａｓｐ、またはＡｌａであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＧｌｙまたは不在であり、Ｘ７はＳｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｓｐであり、Ｘ８はＴｈｒまたはＬｙｓである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
（ｅ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（配列番号４７２）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＩｌｅであり、Ｘ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ６はＴｙｒまたはＴｒｐである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、および
（ｆ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号４７３）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｘ２はＡｌａであり、Ｘ３はＳｅｒである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２
をさらに含む、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ生殖系列遺伝子セグメント由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ならびにＶＫおよびＪＫ生殖系列遺伝子セグメント由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、該ＨＣＶＲおよび該ＬＣＶＲは、（ｉ）ＶＨ４−３４、ＤＨ３−３、ＪＨ４、ＶＫ１−２７、およびＪＫ４、または（ｉｉ）ＶＨ３−３０、ＤＨ５−１２、ＪＨ６、ＶＫ１−９、およびＪＫ４の組み合わせ由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされている、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントの産生方法であって、該抗体またはそのフラグメントを産生させる条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を増殖させる工程、および産生された抗体またはそのフラグメントを取り出す工程を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項２０】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのインヒビター；コレステロール取り込みまたは胆汁酸再吸収またはその両方のインヒビター；リポタンパク質異化を増加させる薬剤、非致死性心臓発作数を減少させる薬剤；およびＬＸＲ転写因子のアクチベーターから選択される１つ以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
スタチン、ナイアシン、フィブラート、および抗ＰＣＳＫ９抗体から選択される１つ以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
ＡＮＧＰＴＬ４活性の減少または阻害によって防止、回復、改善、または阻害される疾患または障害を防止または処置するための方法であって、治療有効量の請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、該疾患または障害の防止または処置を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害の改善、回復、阻害、または防止に用いるための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害の改善、回復、阻害、または防止に用いるための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２７】
前記ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２６に記載の使用。
【請求項１】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
【化４】
から選択される重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３組み合わせを含む、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
【化５】
から選択される軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３組み合わせを含む、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３を含み、該重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列ＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３は、
【化６】
から選択されるＣＤＲ配列組み合わせを含む、抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、
【化７】
から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、単離ヒト抗体または抗体の抗原結合フラグメント。
【請求項５】
【化８】
から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をさらに含む、請求項４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
【化９】
から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
配列番号４８７／４４または９０／９２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項８】
請求項６または７に記載の抗体または抗原結合フラグメントのＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む、ｈＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項３、６、および７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントとｈＡＮＧＰＴＬ４への結合を競合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
請求項３、６、７、および９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと同一のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
請求項３、６、および７のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントであって、該抗体または抗原結合フラグメントがカニクイザルＡＮＧＰＴＬ４およびアカゲザルＡＮＧＰＴＬ４と交差反応する、抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０（配列番号４７１）（式中、Ｘ１はＡｌａであり、Ｘ２はＡｒｇまたはＬｙｓであり、Ｘ３はＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ４はＧｌｙ、Ａｓｐ、または不在であり、Ｘ５はＡｓｐまたは不在であり、Ｘ６はＬｅｕ、Ａｒｇ、または不在であり、Ｘ７はＡｒｇまたはＳｅｒであり、Ｘ８はＰｈｅ、Ｇｌｙ、またはＡｒｇであり、Ｘ９はＬｅｕ、Ｈｉｓ、またはＡｓｎであり、Ｘ１０はＡｓｐ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり、Ｘ１１はＴｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ１２はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｐであり、Ｘ１３はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ１４はＳｅｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ１５はＴｙｒであり、Ｘ１６はＰｈｅまたはＧｌｙであり、Ｘ１７はＬｅｕまたは不在であり、Ｘ１８はＡｓｐであり、Ｘ１９はＴｙｒ、Ｖａｌ、またはＰｈｅであり、Ｘ２０はＴｒｐである）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、および
（ｂ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０（配列番号４７４）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＡｓｎまたはＧｌｎであり、Ｘ３はＴｙｒまたはＬｅｕであり、Ｘ４はＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、またはＡｓｐであり、Ｘ５はＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｘ６はＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ７はＰｒｏ、Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり、Ｘ８はＬｅｕまたはＡｒｇであり、Ｘ９はＴｈｒであり、Ｘ１０はＰｈｅである）のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
（ｃ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４６９）（式中、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＰｈｅであり、Ｘ３はＳｅｒまたはＴｈｒであり、Ｘ４はＰｈｅであり、Ｘ５はＳｅｒであり、Ｘ６はＩｌｅ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒであり、Ｘ７はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ８はＨｉｓ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
（ｄ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８（配列番号４７０）（式中、Ｘ１はＩｌｅであり、Ｘ２はＡｓｎ、Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり、Ｘ３はＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり、Ｘ４はＡｒｇ、Ａｓｐ、またはＡｌａであり、Ｘ５はＧｌｙであり、Ｘ６はＧｌｙまたは不在であり、Ｘ７はＳｅｒ、Ａｓｎ、またはＡｓｐであり、Ｘ８はＴｈｒまたはＬｙｓである）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
（ｅ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６（配列番号４７２）（式中、Ｘ１はＧｌｎであり、Ｘ２はＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ３はＩｌｅであり、Ｘ４はＳｅｒまたはＡｓｎであり、Ｘ５はＡｓｐ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり、Ｘ６はＴｙｒまたはＴｒｐである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、および
（ｆ）式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号４７３）（式中、Ｘ１はＡｌａまたはＬｙｓであり、Ｘ２はＡｌａであり、Ｘ３はＳｅｒである）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２
をさらに含む、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトアンギオポエチン様タンパク質４（ｈＡＮＧＰＴＬ４）に特異的に結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ生殖系列遺伝子セグメント由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ならびにＶＫおよびＪＫ生殖系列遺伝子セグメント由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされる軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、ここで、該ＨＣＶＲおよび該ＬＣＶＲは、（ｉ）ＶＨ４−３４、ＤＨ３−３、ＪＨ４、ＶＫ１−２７、およびＪＫ４、または（ｉｉ）ＶＨ３−３０、ＤＨ５−１２、ＪＨ６、ＶＫ１−９、およびＪＫ４の組み合わせ由来のヌクレオチド配列セグメントによってコードされている、単離ヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体またはその抗原結合フラグメントの産生方法であって、該抗体またはそのフラグメントを産生させる条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を増殖させる工程、および産生された抗体またはそのフラグメントを取り出す工程を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項２０】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのインヒビター；コレステロール取り込みまたは胆汁酸再吸収またはその両方のインヒビター；リポタンパク質異化を増加させる薬剤、非致死性心臓発作数を減少させる薬剤；およびＬＸＲ転写因子のアクチベーターから選択される１つ以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
スタチン、ナイアシン、フィブラート、および抗ＰＣＳＫ９抗体から選択される１つ以上のさらなる治療薬をさらに含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
ＡＮＧＰＴＬ４活性の減少または阻害によって防止、回復、改善、または阻害される疾患または障害を防止または処置するための方法であって、治療有効量の請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、該疾患または障害の防止または処置を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害の改善、回復、阻害、または防止に用いるための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２４に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害の改善、回復、阻害、または防止に用いるための医薬の製造における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２７】
前記ＡＮＧＰＴＬ４媒介疾患または障害が、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、カイロミクロン血症、アテローム性脂質異常症、心血管疾患または障害、急性膵炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病、および肥満から選択される、請求項２６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１３−５１５４８６（Ｐ２０１３−５１５４８６Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６２２９（Ｐ２０１２−５４６２２９）
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１９８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９２５７
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１９８７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７９２５７
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９７１６０５１０）リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (50)
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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