フィードバック耐性メバロン酸キナーゼ
本発明は、フィードバック阻害に対する感受性の低い修飾メバロン酸キナーゼおよびそれをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらにこれらポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのようなベクターを含む宿主細胞に関係する。本発明は、修飾酵素の製法およびイソプレノイド化合物の製法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィードバック阻害に対する感受性の低い修飾メバロン酸キナーゼに関する。イソプレノイド化合物の製造、メバロン酸キナーゼの活性の減少を特徴とする障害の処置、および診断目的に、本修飾酵素およびそれをコードするポリヌクレオチドを使用できる。
【０００２】
メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）は、非常に多くの細胞性イソプレノイドの産生をもたらすメバロン酸経路における必須の酵素である。メバロン酸経路の産物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびその異性体化合物であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、全ての生物におけるイソプレノイドの基本構成ブロックである。イソプレノイドは、一次代謝および二次代謝の両方の２３，０００種を超える天然分子を含む。この天然産物のクラスが化学的に多様であることは、それらが全生体系に広範囲の生理学的役割をもつことを反映している。イソプレノイドには、例えば細菌におけるホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン；植物におけるカロテノイド、プラストキノン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖；ならびに哺乳動物におけるヘムＡ、キノン、ドリコール、ステロール／ステロイドおよびレチノイドがある。さらにイソプレノイドは、イソペンテニルｔＲＮＡ、タンパク質のプレニル化、および例えばヘッジホッグクラスの細胞シグナル伝達タンパク質のコレステロール修飾に関与している。
【０００３】
ＭＫ酵素は、多様な生物において生化学レベルおよび分子レベルの両方でキャラクタライズされた（Houtenら、Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000）。現在すでに多くのメバロン酸キナーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列が公知であり（例えばSwiss-Protアクセッション番号／ID P07277/kime_yeast; Q9ROO8/kime_mouse; P17256/kime_rat; Q03426/kime_human; P46086/kime_arath; Q09780/kime_schpo; Q9V187/kime_pyrab; 059291/kime_pyrho; Q8UOF3/kime_pyrfu; Q50559/kime_metth; 027995/kime_arcfu; Q58487/kime_metja; Q9Y946/kime_aerpe）、毎月公知のメバロン酸キナーゼ配列のリストに新しい記入が加わりうる。ゲノムシーケンシングプロジェクトから得られた上記の配列は、公知のメバロン酸キナーゼとの配列類似性に基づいて推定上のメバロン酸キナーゼの機能を割り当てられた。しかし、当業者にはこれらの配列が実際にメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明するのは簡単である。
【０００４】
調節に関して、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはメバロン酸経路における律速酵素であると広くみなされている（例えばGoldsteinおよびBrown、Nature 343, 425-430, 1990; Weinberger、Trends Endocrinol. Metab. 7, 1-6, 1996; Hamptonら、Trends Biochem. Sci. 21, 140-145, 1996; Houtenら、J. Biol. Chem. 278, 5736-5743, 2003）。この考えに一致して、培地へのメバロネートの補充は、ファフィア・ロドチマ（Phaffia rhodozyma)(Caloら、Biotechnol. Lett.17, 575-578, 1995）およびヘマトコッカス・プルバリス（Haematococcus pluvialis)(Kobayashiら、J. Ferment. Bioeng. 71, 335-339, 1991）の両方でカロテノイド産生を刺激することが示された。しかし、増え続ける近年の証拠は、メバロン酸キナーゼが、例えば下流の産物であるゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害を受けることを示している。このフィードバック阻害は、メバロン酸経路、よって一般にイソプレノイド生合成の調節および律速にも寄与している可能性がある。
【０００５】
ヒトでは、ヒト遺伝性障害であるメバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群の生化学的原因および分子的原因としてメバロン酸キナーゼの欠乏が同定されたことによって、メバロン酸キナーゼの重要性が実証された（Houtenら、2000; Nwokoroら、Mol. Genet. Metab. 74, 105-119, 2001）。これらの障害の病態生理はまだ分からないが、急性期応答および発熱に関するメバロン酸キナーゼおよびイソプレノイド生合成のインビボでの役割に関する知識を最終的に与えるであろう。メバロン酸キナーゼの欠乏は、例えばツェルヴェーガー症候群および肢根型点状骨端異形成にも関与していると思われる。肢根型点状骨端異形成は、メバロン酸キナーゼなどのペルオキシソーム酵素のサブセットがペルオキシソームに輸送されない、ペルオキシソームの生体発生の障害である（KelleyおよびHerman、Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2, 299-341, 2001）。最終的にメバロン酸キナーゼは、細胞増殖、細胞周期の調節および／または細胞の形質転換に役割を果たすと提案された（Graefら、Virology 208, 696-703, 1995; Hinsonら、J. Biol. Chem. 272, 26756-26760, 1997を参照されたい）。
【０００６】
これまでに研究された全てのメバロン酸キナーゼは、経路下流の産物によってフィードバック阻害される。例えばファルネシルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸によるフィードバック阻害に耐性であるとこれまでに記載されたメバロン酸キナーゼは、存在しない。フィードバック耐性メバロン酸キナーゼ酵素は、例えば（１）全ての種類のイソプレノイド化合物（例えばカロテノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＤ、ステロールなど）のバイオテクノロジーによる製造に、（２）例えば生体液中のメバロネート濃度の酵素測定のための診断用酵素として、または（３）メバロン酸尿症を有する患者におけるメバロネート濃度を低下させるための治療用酵素として、産業上の潜在能力を有しうる。フィードバック耐性ＭＫは、メバロン酸経路を通過するさらに大きな流れ、よってさらに高いイソプレノイドの生産性を可能にしうることから、バイオテクノロジーによるイソプレノイドの製造に特に適している。
【０００７】
本明細書において使用する「メバロン酸キナーゼ」という用語は、メバロネート（メバロン酸）から５−ホスホメバロネート（５−ホスホメバロン酸）への、またはメバロン酸アナログ（例えばWildeおよびEggerer, Eur. J. Biochem. 221, 463-473, 1994に記載されたような）から対応するリン酸化化合物へのリン酸化を触媒可能な任意の酵素を意味する。メバロネート（またはメバロン酸アナログ）をリン酸化できるためには、酵素は追加的に適切なリン酸供与体を必要とする。メバロン酸キナーゼのリン酸供与体として、種々の化合物が考えられる。最も好ましいリン酸供与体は、ＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）である。他の好ましいリン酸供与体は、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである（Gibsonら、Enzyme 41, 47-55, 1989を参照されたい）。「メバロン酸キナーゼ」は、アミノ酸配列が配列番号１〜１４に示される１個または複数の酵素と同一でありうる。「同一」は、配列番号１〜１４および３０に示されるとおりの１個または複数のアミノ酸配列と、少なくとも約６０％同一、好ましくは約７０％同一、さらに好ましくは少なくとも約８０％同一、一層さらに好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一であるメバロン酸キナーゼを指す。
【０００８】
当技術分野において公知である「一致率（％）」という用語は、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の列の間の一致によって決定される、そのような配列の間の近縁性の度合いを意味する。公知の方法によって、例えばプログラムＧＡＰ（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc.、9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国）で以下のパラメーターを用いて「一致率」を容易に決定できる：ギャップ作成ペナルティ８、ギャップ伸長ペナルティ２（デフォルトのパラメーター）。
【０００９】
「野生型酵素」または「野生型メバロン酸キナーゼ」は、本発明により（さらに多数の）フィードバック耐性突然変異体を設計するための出発点として使用される、配列番号１〜１４および３０の任意の一つと同一の任意のメバロン酸キナーゼを意味する。本来この定義は、そのような「野生型酵素」または「野生型メバロン酸キナーゼ」がメバロン酸経路下流の産物の、例えばＦＰＰまたはＧＧＰＰの生理学的または工業的に関連性のある濃度に対する阻害に感受性であることを意味している。本発明に関する「野生型」は、天然からだけ得られるメバロン酸キナーゼ／メバロン酸キナーゼの配列のみに本発明の範囲を限定するわけではない。合成メバロン酸キナーゼの変異体が本発明の教示のいずれかにより（さらに）フィードバック耐性にされうるのであれば、それらの変異体（配列番号１〜１４および３０の任意の一つに同一である限り）も「野生型」と称されることをここで明確に述べる。「野生型メバロン酸キナーゼ」および「非修飾メバロン酸キナーゼ」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
【００１０】
「突然変異体」、「突然変異酵素」、または「突然変異メバロン酸キナーゼ」は、本発明の教示により所定の（上記の定義による）野生型酵素／メバロン酸キナーゼから得ることができる、それぞれの野生型酵素よりも（さらに）フィードバック耐性である任意の変異体を意味する。本発明の範囲には、突然変異体がどのように得られるかは関係ない。例えば部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発／定方向進化、細胞／生物全体の化学的またはＵＶ突然変異誘発などによってそのような突然変異体を得られる。例えば合成遺伝子の設計によりおよび／またはインビトロ（無細胞）翻訳によりこれらの突然変異体を調製できる（例えばJermutusら、Curr. Opin. Biotechnol. 9, 534-548, 1998; Betton、Curr. Prot. Pept. Sci. 4,73-80, 2003; Martinら、Biotechniques 31, 948-, 2001を参照されたい）。フィードバック耐性を試験するために、当業者に公知の方法によって（例えば部位特異的突然変異誘発または合成遺伝子の設計による）突然変異体を発生できる。
【００１１】
本特許出願に関連して「イソプレノイド」は、天然または非天然経路（すなわち天然に存在せず、バイオテクノロジーにより設計された経路）のどちらか、好ましくは生化学経路によりメバロネートから得られる任意のおよび全ての代謝物およびプレニル化高分子を含む。イソプレノイドには、細菌におけるホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン；植物におけるカロテノイド、プラストキノン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖；ならびにヘムＡ、キノン、コエンザイムＱ１０、ドリコール、ステロール／ステロイド、ビタミンＤ、レチノイドなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００１２】
触媒性質が非修飾メバロン酸キナーゼよりも好都合である（すなわちフィードバック阻害に対する感受性がより低い）ように修飾されたメバロン酸キナーゼを提供することは、一般に本発明の目的である。
【００１３】
本発明は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減したフィードバック阻害に対する感受性を示す修飾メバロン酸キナーゼに関し、
（ｉ）修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、少なくとも１個の突然変異を含み、かつ
（ii）その少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すとおりのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。
【００１４】
本明細書に使用する「フィードバック阻害」という用語は、イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物によるメバロン酸キナーゼの酵素活性の阻害を意味する。イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物には、５−ホスホメバロネート、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ファルネソール、ドリコールリン酸、およびフィチルピロリン酸があるが、それらに限定されるわけではない（DorseyおよびPorter、J. Biol. Chem. 243, 4667-4670, 1968; Flint、Biochem. J. 120, 145-150, 1970; GrayおよびKekwick、Biochim. Biophys. Acta 279, 290-296, 1972; Hinsonら、J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997）。メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害は、イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物が酵素に結合することによるメバロン酸キナーゼのアロステリック調節に基づくと考えられている。
【００１５】
好ましくはフィードバック阻害は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）によるフィードバック阻害である。
【００１６】
本発明によれば修飾メバロン酸キナーゼは、フィードバック阻害に対して、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減している感受性を示す。好ましくは、本発明の修飾メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に対する感受性は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて（フィードバック耐性の測定および定量については下記を参照されたい）少なくとも５％低減している。
【００１７】
「フィードバック耐性」は、（上に定義するような）「フィードバック阻害」に対する耐性の任意の増加を意味する。当業者に公知の種々の方法でフィードバック耐性を分析できる。適切なアプローチをここに簡潔に説明する：不飽和濃度のＡＴＰ（または別のリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロン酸アナログ）で、すなわち反応速度がＡＴＰ（またはリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロン酸アナログ）の濃度の変化に感受性であるこれらの基質の濃度付近で、例えばこれらの基質に対する検討中の酵素のそれぞれのＫｍ値付近の濃度で、実施例２に記載したアッセイに類似した活性アッセイでメバロン酸キナーゼ活性を測定する。適切な濃度のフィードバック阻害剤、すなわち野生型メバロン酸キナーゼの有意な阻害を提供する濃度のフィードバック阻害剤の非存在下および存在下の両方で、他の点では同一の状態で、野生型メバロン酸キナーゼの活性およびこの酵素の変異体／突然変異体の活性の両方を測定する。フィードバック阻害剤による阻害の程度（例えば阻害率％）が野生型酵素よりも突然変異体の方が低いならば、突然変異体は本特許出願に関連して「フィードバック耐性」である。いったん「フィードバック耐性」変異体／突然変異体が同定されると、さらに改良された突然変異体、すなわちさらに一層フィードバック耐性である突然変異体を同定するために上記と同じ手順を適用できる。フィードバック耐性（％）は以下のように計算される：ａおよびｂがそれぞれフィードバック阻害剤（例えばＦＰＰ）の非存在下および存在下で野生型酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であり、ｃおよびｄがそれぞれ同じフィードバック阻害剤の非存在下および存在下で突然変異酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であるならば、フィードバック耐性（％）は：
耐性（％）＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
である。
【００１８】
好ましくはフィードバック耐性は、本出願の実施例２に記載された実験条件を参照する。およそ３〜３０mU/ml（パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼおよそ１〜１０μg/mlに対応）、好ましくはおよそ１０〜２０mU/mlのメバロン酸キナーゼ活性、および場合により４６μMのＦＰＰがアッセイ混合物に存在し、反応は３０℃で実施された。
【００１９】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２５％、一層さらに好ましくは少なくとも約４０％、なおさらに好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも約７０％のフィードバック耐性を示す。
【００２０】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に少なくとも１個の突然変異を含む。この突然変異は、付加、欠失および／または置換でありうる。好ましくは突然変異は、非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列に存在する所定のアミノ酸が、本発明の修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列における別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換である。修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に少なくとも１個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。さらなる態様において、修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、少なくとも二個、少なくとも三個、少なくとも四個、または少なくとも五個の置換を含む。本発明の他の態様において、修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に１から１０個、１から７個、１から５個、１から４個、２から１０個、２から７個、２から５個、２から４個、３から１０個、３から７個、３から５個、または３から４個のアミノ酸置換を含む。
【００２１】
１個または複数の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在してもよい。
【００２２】
好ましくは少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。別の好ましい態様において、少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、および１６９に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。
【００２３】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが単一のアミノ酸置換しか含まない場合、その単一のアミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸位置１７、４７、９３、９４、２０４、および２６６に対応する位置からなる群より選択される一つの位置に存在することが好ましい。さらに好ましくは、置換はＩ１７Ｔ、Ｇ４７Ｄ、Ｋ９３Ｅ、Ｖ９４Ｉ、Ｒ２０４Ｈ、またはＣ２６６Ｓである。
【００２４】
特に好ましい態様において、突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置１７に対応するアミノ酸位置に影響する置換である。非修飾メバロン酸キナーゼに存在するそのアミノ酸は、好ましくはイソロイシンである。非修飾メバロン酸キナーゼの配列におけるそのアミノ酸を、トレオニンまたはアラニンに取り替えることができる。最も好ましくは、配列番号１に示す配列の位置１７に対応するアミノ酸位置での置換が、イソロイシンからトレオニンへの交換からなる。
【００２５】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが少なくとも２個の突然変異を含む場合、突然変異の１個は、配列番号１の位置３７５に対応するアミノ酸位置に存在しうる。対応する非修飾メバロン酸キナーゼと比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが２個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は配列番号１の位置１３２／３７５、１６７／１６９、１７／４７、または１７／９３の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。組み合わせＰ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ、またはＩ１７Ｔ／Ｋ９３Ｅが最も好ましい。
【００２６】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが３個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は、配列番号１の位置１７／１６７／１６９、１７／１３２／３７５、９３／１３２／３７５、または１７／４７／９３の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。最も好ましくは、組み合わせＩ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｐ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｈ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｔ／Ｋ１６９Ｍ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｔ／Ｋ１６９Ｙ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｆ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｉ／Ｋ１６９Ｎ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｈ／Ｋ１６９Ｙ、Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ、またはＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｑである。
【００２７】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが４個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は、配列番号１の位置１７／４７／９３／１３２の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。組み合わせＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ａ、またはＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ｓが最も好ましい。
【００２８】
表１、２、３または４（下記参照）に開示された突然変異の組み合わせが最も好ましい。これらの例で同定されたアミノ酸位置を異なる起源のメバロン酸キナーゼに移してもよい。
【００２９】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに突然変異を導入することによって、本発明の修飾メバロン酸キナーゼを入手できる。非修飾メバロン酸キナーゼは、フィードバック阻害に感受性を示す任意のメバロン酸キナーゼであってもよい。非修飾メバロン酸キナーゼには、自然から得ることが可能なメバロン酸キナーゼがあるが、それらに限定されるわけではない。非修飾メバロン酸キナーゼにはさらに、配列番号１から１４および３０に示すとおりの任意の一つのアミノ酸配列に同一なメバロン酸キナーゼがある。
【００３０】
好ましい非修飾メバロン酸キナーゼには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる群より選択される配列を有するものがある。
【００３１】
非修飾メバロン酸キナーゼは、真核または原核生物、好ましくは真菌または細菌起源、さらに好ましくはアスペルギルス（Aspergillus）またはサッカロミセス（Saccharomyces）またはパラコッカスまたはファフィア（Phaffia）、最も好ましくは黒色こうじ菌（Aspergillus niger）またはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスまたはファフィア・ロドチマ（Phaffia rhodozyma）起源でありうる。一態様において、非修飾メバロン酸キナーゼは原核生物、好ましくは細菌起源、さらに好ましくはパラコッカス、最も好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス起源である。
【００３２】
好ましくはＦＰＰによる非修飾メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害は、実施例２に記載されたアッセイ（０または４６μMのＦＰＰ）で決定されるとき、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、もっとさらに好ましくは少なくとも３０％、なおさらに好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％である。
【００３３】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、好ましくはそのＮ末端またはＣ末端に外来アミノ酸を含みうる。「外来アミノ酸」は、天然（自然に存在する）メバロン酸キナーゼに存在しないアミノ酸、好ましくは天然メバロン酸キナーゼに存在しない少なくとも約３個、少なくとも約５個、または少なくとも約７個の隣接アミノ酸のストレッチを意味する。外来アミノ酸の好ましいストレッチには、組換え製造された修飾メバロン酸キナーゼの精製を容易にする「タグ」があるが、それらに限定されるわけではない。そのようなタグの例には、「Ｈｉｓ6」タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００３４】
別の態様において、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼは、１個または複数、例えば２個の欠失を含んでもよい。好ましくは欠失は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響し、酵素の機能的性質、例えば比活性を有意に低減しない。
【００３５】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、通常は非天然メバロン酸キナーゼである。好ましくは、修飾メバロン酸キナーゼの比活性は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼの比活性の少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、もっとさらに好ましくは少なくとも３５％、なおさらに好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％である。
【００３６】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、単離されたポリペプチドであってもよい。本明細書に使用する「単離されたポリペプチド」という用語は、他のポリペプチドを実質的に含まないポリペプチドを指す。単離されたポリペプチドは、好ましくは純度８０％超、好ましくは純度９０％超、さらに好ましくは純度９５％超、最も好ましくは純度９９％超である。当技術分野において公知の方法によって、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のタンパク質染色によって、純度を決定できる。次に、デンシトメトリーでタンパク質のバンドを定量できる。純度を決定するための追加の方法は、当技術分野のレベル内に入る。
【００３７】
本発明はさらに、本発明による修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」は、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＲＮＡ；一本鎖でありうるか、またはより典型的には二本鎖でありうるか、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合でありうる、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子があるが、それらに限定されるわけではない。「ポリヌクレオチド」という用語は、１個もしくは複数の異常な塩基、例えばイノシン、または１個もしくは複数の修飾塩基、例えばトリチル化塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、非修飾メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって容易に得られる。非修飾メバロン酸キナーゼをコードするそのようなポリヌクレオチド配列の例を、配列番号１６〜２９および３１に示す。非修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列に突然変異、例えば付加、欠失および／または置換を導入するための方法には、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲに基づく方法があるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理は、例えばWhiteら、Trends Genet. 5, 185-189, 1989に概説され、改良法は例えばInnisら［PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.(1990)］に解説されている。
【００４０】
当技術分野において公知のメバロン酸キナーゼをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列［配列情報については、例えば関連する配列データベース、例えばGenbank(Intelligenetics、カリフォルニア州、米国）、European Bioinformatics Institute(Hinston Hall、ケンブリッジ、英国）、ＮＢＲＦ（ジョージタウン大学医療センター、ワシントンＤＣ、米国）およびVecbase（ウィスコンシン大学、バイオテクノロジーセンター、マディソン、ウィスコンシン、米国）または図および配列リストに開示されている配列情報を参照されたい］から開始して、インビトロ突然変異誘発法［例えばSambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークを参照されたい］によって本発明のＤＮＡ配列を構築できる。もともとHutchisonおよびEdgell(J. Virol. 8, 181-189, 1971）によって概説されたそのような「部位特異的突然変異誘発」のための広く使用されている戦略は、突然変異を導入すべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域との、所望のヌクレオチド置換を保有する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを伴う（総説についてはSmith、Annu. Rev. Genet. 19, 423-462, 1985を；改良法についてはStanssenら、Nucl. Acids Res. 17, 4441-4454, 1989の参考文献２〜６を参照されたい）。本発明の実施にまた好ましい、所定のＤＮＡ配列を突然変異させる別の可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによる突然変異誘発である。当技術分野において公知であり、例えばSambrookら（Molecular Cloning）に解説されている方法によって、それぞれの株／生物から出発物質としてのＤＮＡを単離できる。しかし、公知のＤＮＡ配列に基づいても、例えば当技術分野で公知の方法による合成遺伝子の構築によっても（例えばＥＰ７４７４８３およびLehmannら、Prot. Eng. 13, 49-57, 2000に記載されているように）、本発明により構築／突然変異誘発されるべきメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡを調製できることが理解されている。
【００４１】
本発明による修飾メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を配列番号３２および３３に示す。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドでありうる。「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、他の染色体ならびに染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡを非限定的に例とする他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドを得るために、当業者に公知の通常の核酸精製法を使用できる。本用語は、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成されたポリヌクレオチドも包含する。
【００４３】
なお別の態様において本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。ベクターまたはプラスミドは、好ましくは少なくとも一つのマーカー遺伝子を含む。ベクターまたはプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結した調節エレメントをさらに含んでもよい。本明細書に使用する「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方に影響されるように単一核酸断片に核酸配列を結合させることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響できる場合に、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合に、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列と作動可能に連結しうる。「発現」という用語は、ｍＲＮＡへのＤＮＡ配列の転写および／またはアミノ酸配列へのｍＲＮＡの翻訳を意味する。「過剰発現」という用語は、対応する非修飾生物における産生のレベルを超えた、修飾生物（例えば形質転換またはトランスフェクションによって修飾された）における遺伝子産物の産生を意味する。
【００４４】
いったん本発明の完全ＤＮＡ配列が得られたなら、コードされたポリペプチドを適切な宿主系に（過剰）発現させるための当技術分野で公知であり、例えばSambrookら（刊行年なし）に記載された方法によって、それらのＤＮＡ配列をベクターに組み込むことができる。しかし当業者は、コードされるポリペプチドの（過剰）発現を得るために本発明の適切な宿主系を形質転換するためにＤＮＡ配列自体も使用できることを分かっている。適切な宿主系は、例えばアスペルギルス、例えば黒色こうじ菌もしくは米こうじ菌（Aspergillus oryzae）、またはトリコデルマ（Trichoderma）、例えばトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）などの真菌、あるいはサッカロミセス（Saccaromyces）、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Saccaromyces cerevisiae）またはピチア・パストリス（Pichia pastoris）のようなピチア（Pichia）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、例えばＨ．ポリモルファ（DSM5215）のような酵母である。当業者は、寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）もしくはDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）、または雑誌「Industrial Property」(vol. 1, pages 29-40, 1991)もしくはOfficial Journal of the European Patent Office(vol. 4, pages 155/156, 2003）に挙げられているような他の任意の寄託機関から、そのような微生物を入手できることを知っている。使用できる細菌は、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスなどの例えばパラコッカス（Paracoccus）、大腸菌（E. coli）、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）、または例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）などのストレプトマイセス（Streptomyces）である（例えばAnneおよびvan Mellaert in FEMS Microbiol. Lett. 114, 121-128, 1993を参照されたい）。使用できる大腸菌は、例えば大腸菌Ｋ１２株、例えばＭ１５（Villarejoら、J. Bacteriol. 120, 466-474,1974ではDZ291と記載されている）、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）または大腸菌ＳＧ１３００９（Gottesmanら、J. Bacteriol. 148, 265-273, 1981）である。
【００４５】
真菌に発現させるために使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばＥＰ４２０３５８に、またはCullenら（Bio/Technology 5, 369-376, 1987）、Ward(Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker、ニューヨーク、1991)、Upshallら（Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987)、Gwynneら（Bio/Technology 5, 71-79, 1987)、またはPuntら（J. Biotechnol. 17, 19-34, 1991)によって記載され、酵母についてはSreekrishnaら（J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117-4125, 1989)、Hitzemannら（Nature 293, 717-722,1981)によって、またはEP183070、EP183071、EP248227、EP263311に記載されている。大腸菌に発現させるために使用できる適切なベクターは、例えばSambrookら［刊行年なし］によって、またはFiersら、Proc. 8th Int. Biotechnol. Symp. [Soc. Franc. de Microbiol., Paris(Durandら編), pp. 680-697, 1988]、Bujardら（Meth. Enzymol., WuおよびGrossmann編、Academic Press, Inc., Vol. 155, 416-433, 1987)、もしくはStuberら（Immunological Methods、LefkovitsおよびPernis編、Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152, 1990）によって言及されている。バチルスでの発現に使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばEP207459またはEP405370に、YansuraおよびHenner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439-443 (1984))によって、またはHenner、Le GriceおよびNagarajan(Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990）によって記載されている。Ｈ．ポリモルファの発現に使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばGellissenら、Biotechnology 9, 291-295, 1991に記載されている。
【００４６】
そのようなベクターの各々がすでに調節エレメント、例えばプロモーターを有するか、またはそのようなエレメントを含むように本発明のＤＮＡ配列を設計できるかのどちらかである。使用できる適切なプロモーターエレメントは、当技術分野で公知であり、例えばトリコデルマ・レーセイについてはｃｂｈ１プロモーター（Haarkiら、Biotechnology 7, 596-600,1989）またはｐｋｉｌプロモーター（Schindlerら、Gene 130, 271-275,1993）、米こうじ菌についてはａｍｙプロモーター［Christensenら、Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987); Christensenら、Biotechnology 6,1419-1422,1988; Tadaら、Mol. Gen. Genet. 229, 301-306,1991］、黒色こうじ菌についてはｇｌａＡプロモーター（Cullenら、Bio/Technology 5, 369-376, 1987; Gwynneら、Bio/Technology 5, 713-719,1987; Ward「Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi」Marcel Dekker, New York, 83-106,1991）、ａｌｃＡプロモーター（Gwynneら、Bio/Technology 5, 718-719,1987）、ｓｕｃ１プロモーター（Boddyら、Curr. Genet. 24, 60-66, 1993）、ａｐｈＡプロモーター（MacRaeら、Gene 71, 339-348, 1988; MacRaeら、Gene 132, 193-198, 1993）、ｔｐｉＡプロモーター（McKnightら、Cell 46, 143-147, 1986; Upshallら、Bio/Technology 5,1301-1304,1987）、ｇｐｄＡプロモーター（Puntら、Gene 69, 49-57,1988; Puntら、J. Biotechnol. 17,19-37,1991）およびｐｋｉＡプロモーター（de Graaffら、Curr. Genet. 22, 21-27,1992）である。酵母における発現に使用できる適切なプロモーターエレメントは、当技術分野において公知であり、例えばサッカロミセス・セレビジエに発現させるためのｐｈｏ５プロモーター（Vogelら、 Mol. Cell. Biol. 9, 2050-2057, 1989; RudolfおよびHinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1340-1344, 1987）またはｇａｐプロモーター、および例えばピチア・パストリスのためのａｏｘｌプロモーター（Koutzら、Yeast 5, 167-177, 1989; Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988）、またはＨ．ポリモルファについてのＦＭＤプロモーター（Hollenbergら、EPA第0299108号）もしくはＭＯＸプロモーター（Ledeboerら、Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082, 1985）である。
【００４７】
細菌に発現させるための適切なプロモーターおよびベクターには、例えばGiacominiら（Gene 144,17-24, 1994）によって記載された合成プロモーターがある。適切なプラスミドによるか、またはメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡへの組み込みを介するかのどちらかで、請求項に記載された（突然変異）メバロン酸キナーゼを細菌に発現させるための適切な教示を、多数の箇所、例えば米国特許第６３２２９９５号から見出すことができる。
【００４８】
本発明はさらに、本発明のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞に関する。適切な宿主細胞は、真核または原核細胞でありうる。適切な宿主細胞の例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトマイセス、シアノバクテリア、枯草菌、および肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の細胞などの細菌細胞；酵母であるクルイベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス、担子菌類であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびアスペルギルスの細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９の細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１などの動物細胞；ならびに裸子植物または被子植物の細胞などの植物細胞があるが、それらに限定されるわけではない。
【００４９】
したがって、好ましくは細菌、真菌、酵母または植物宿主に本発明のポリヌクレオチドを発現させるための、前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのような形質転換された細菌、または真菌、酵母もしくは植物宿主も本発明の目的である。
【００５０】
本発明は、以下を含むイソプレノイド化合物の製造法に関する：
（ａ）宿主細胞における修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）場合により培地からイソプレノイド化合物を分離すること。
【００５１】
そのような方法は、任意の種類のイソプレノイド化合物またはイソプレノイド由来化合物：例えばフィトエン、リコペン、α−、β−およびγ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、アドニキサンチン（adonixanthin）、エキネノン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、およびそれらの誘導体を例とするが、それらに限定されるわけではないカロテノイド（Misawa & Shimada, J. Biotechnol. 59,169-181,1998; Miuraら、AppL Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998; Hirschberg, Curr. Opin. Biotechnol. 10, 186-191, 1999; Margalith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 431-438,1999; Schmidt-Dannert, Curr. Opin. Biotechnol.11, 255-261, 2000; Sandmann, Arch. Biochem. Biophys. 385, 4-12, 2001; Lee & Schmidt-Dannert, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 1-11, 2002）；ユビキノン（＝コエンザイムＱ）、メナキノン、プラストキノンおよびアントラキノン、好ましくはコエンザイムＱ６、コエンザイムＱ７、コエンザイムＱ８、コエンザイムＱ９、コエンザイムＱ１０またはコエンザイムＱ１１、最も好ましくはコエンザイムＱ１０を例とするがそれらに限定されるわけではないキノン（Clarke, Protoplasma 213, 134-147, 2000; Hanら、Plant Cell Tissue Organ Culture 67, 201-220, 2001; Kawamukai, J. Biosci. Bioeng. 94, 511-517, 2002）；ゴムおよびゴム誘導体、好ましくは天然ゴム（＝シス−１，４−ポリイソプレン；Mooibroek & Cornish, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 355-365, 2000）；エルゴステロール、コレステロール、ヒドロコルチゾンを例とするがそれらに限定されるわけではないステロールおよびステロール誘導体（Menard Szczebaraら、Nature Biotechnol. 21, 143-149,2003）、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、食物フィトステロール（Ling & Jones, Life Sci. 57,195-206,1995）および天然界面活性剤（Holmberg, Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. 6, 148-159, 2001）；ならびにモノテルペン、ジテルペン、セスキテルペンおよびトリテルペン、例えばタキソールを例とするがそれらに限定されるわけではない多数の他のイソプレノイド（Jennewein & Croteau, Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 13-19, 2001）およびジベレリン（Bruckner & Blechschmidt, Crit. Rev. Biotechnol. 11,163-192,1991）のバイオテクノロジーによる製造に使用できる。
【００５２】
適切な宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、藻類、植物または動物の細胞を例とするがそれらに限定されるわけではない、遺伝子修飾に従う全ての種類の生物である。遺伝子工学および代謝工学の方法は、当業者に公知である（例えばVerpoorteら、Biotechnol. Lett. 21, 467-479, 1999; Verpoorteら、Transgenic Res. 9, 323-343, 2000; Barkovich & Liao, Metab. Eng. 3, 27-39, 2001）。同様に、イソプレノイドおよびイソプレノイド由来の化合物および／または分子に（潜在的に）適した精製法は、ファインケミカルの生合成および製造の分野で周知である。
【００５３】
本発明によるイソプレノイドまたはイソプレノイド由来の化合物および／または分子のバイオテクノロジーによる製造方法は、上記のような細胞全体の発酵工程に限定されるわけではなく、例えば透過性宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば遠心分離もしくはろ過によって細胞残余物から清澄にされた細胞抽出物、またはそれどころか単離された酵素を用いて再構成された反応経路も使用できることが理解される。そのようなプロセスの組み合わせも、本発明の範囲内に属す。無細胞生合成（再構成された反応経路のような）の場合に、単離された酵素が、インビトロ転写／翻訳によって、またはさらに他の方法によって宿主細胞から調製され、単離されたかどうかは関係しない。
【００５４】
本発明はさらに、以下を含む、本発明の修飾メバロン酸キナーゼを産生させるための方法に関する：
（ａ）本発明の修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で本発明の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）細胞または培地から修飾メバロン酸キナーゼを回収すること。
【００５５】
発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から本発明の修飾メバロン酸キナーゼを調製できる。
【００５６】
本発明のポリペプチドの組換え産生のために、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはプラスミドを組み込むことができる。多数の標準的な実験マニュアル［例えばDavisら、Basic Methods in Molecular Biology (1986)、およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)］に記載されている方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、弾丸導入（ballistic introduction）および感染のような方法によって、宿主細胞へのポリヌクレオチドまたはベクターの導入を実施できる。
【００５７】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼを産生させるために多様な発現系を使用できる。そのようなベクターには、とりわけ上記のベクターがある。一般に、ポリヌクレオチドの維持、増大、もしくは発現、および／または宿主でのポリペプチドの発現に適した任意の系またはベクターをこれに関する発現に使用できる。
【００５８】
真核生物における組換え発現系では、小胞体の内腔、ペリプラスム間隙または細胞外環境に翻訳されたタンパク質を分泌させるために、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチドに内因性であるか、または異種シグナルであってもよい。
【００５９】
硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの周知の方法によって組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収および精製できる。一態様において、高速液体クロマトグラフィーが精製に採用される。単離および／または精製時にポリペプチドが変性した場合、活性コンホメーションを再生するタンパク質の再フォールディングのための周知の手法を採用できる。タンパク質の精製法は、例えばDeutscher, Protein Purification, Academic Press, New York, 1990; およびScopes, Protein Purification, Springer Verlag, Heidelberg, 1994に記載されている。
【００６０】
例えばPenら、Bio/Technology 11, 811-814, 1994またはEP449375に記載されているような方法により、植物に、好ましくは例えばEP449376に記載されているように種子に、本発明のメバロン酸キナーゼを発現させることもできる。プロモーターおよびターミネーターの適切な例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用できる効率的な植物プロモーターの一種類は、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と作動可能に連結しているそのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できるはずである。本発明に使用できる高レベル植物プロモーターには、例えばダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼのスモールサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Berry-Loweら、J. Mol. Appl. Genet. 1, 483-498, 1982）およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがある。これらの二つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが公知である（例えばGenetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum Press、NY (1983), pages 29-38; Coruzziら、J. Biol. Chem. 258,1399-1402,1983; およびDunsmuirら、J. Mol. Appl. Genet. 2,285-300,1983を参照されたい）。
【００６１】
当該タンパク質の商業的製造が望ましい場合に、多様な培養法を適用できる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特定遺伝子産物の大規模製造を回分培養法または連続培養法の両方で行うことができる。回分および流加培養法はよくみられ、当技術分野において周知であり、Thomas D. Brock「Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition」(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.またはDeshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36,227-234, 1992に例を見出すことができる。連続培養プロセスのために栄養素および増殖因子を調整する方法、ならびに産物の形成速度を最大にするための手法は、工業微生物の分野において周知であり、多様な方法がＢｒｏｃｋ（上記）によって詳述されている。
【００６２】
発酵用培地は適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な基質には、グルコースおよびフルクトースなどの単糖；乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖；デンプンもしくはセルロースまたはその混合などの多糖；および再生可能原料からの未精製混合物がありうるが、それらに限定されるわけではない。本発明に利用される炭素源は、基質を含む多様な炭素を包含でき、生物の選択によってのみ制限されることが意図されている。
【００６３】
本発明はさらに、フィードバック阻害に対して低減した感受性を有するメバロン酸キナーゼの調製のための、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）フィードバック阻害に対して感受性を示す第一メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）ポリヌクレオチド配列に１個または複数の突然変異を導入し、突然変異ポリヌクレオチド配列が、第一メバロン酸キナーゼと比較した場合に少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む第二メバロン酸キナーゼをコードするようにする工程（少なくとも１個のアミノ酸突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する）；
（ｃ）突然変異ポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドに場合により挿入する工程；
（ｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターまたはプラスミドを適切な宿主細胞に導入する工程；および
（ｅ）宿主細胞を修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で培養する工程。
【００６４】
この方法の好ましい態様は、修飾メバロン酸キナーゼ、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド、宿主細胞、ならびに本明細書に記載された方法の好ましい態様に対応する。第一および第二メバロン酸キナーゼは、それぞれ非修飾および修飾メバロン酸キナーゼに対応する（上記参照）。
【００６５】
本発明の別の態様は、メバロン酸キナーゼ活性減少に関連する障害の処置用の医薬の製造のための本発明の修飾メバロン酸キナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。そのような障害には、メバロン酸尿症、高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群があるが、それらに限定されるわけではない。本発明の修飾メバロン酸キナーゼを治療用酵素として投与することが好ましい。投与様式には、経口、非経口、腹腔内、および／または皮下投与がある。本発明の修飾メバロン酸キナーゼおよびその塩を、少なくとも一つのそのような酵素を単独で、または薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤との混合物中に含む医薬組成物として製剤化（例えば顆粒剤、酵素結晶、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤、液剤など）できる。通常の方法により医薬組成物を製剤化できる。採用した特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、併用薬、および治療を受けている特定の疾患の重症度などの多様な要因に応じて、任意の特定患者に対する特異的用量レベルを採用する。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療プロトコルに使用できる。
【００６７】
本発明のなお別の態様は、生物学的液体中のメバロネート濃度を決定するための本発明の修飾メバロン酸キナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。生物学的液体の非限定的な例は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、涙、汗、ならびに他の任意の細胞内、細胞間および／または細胞外液である。
【００６８】
上記のような修飾メバロン酸キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド；そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクター；そのようなポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された宿主細胞；前記の宿主細胞を適切な培養条件で培養し、そのような宿主細胞または培地から当技術分野において公知の方法によってメバロン酸キナーゼを単離する、本発明のメバロン酸キナーゼの調製方法；ならびにそのようなポリペプチドもしくはベクターで形質転換され、かつ／または染色体にそのようなポリヌクレオチドを安定して組み込まれていてもよい宿主細胞に基づくイソプレノイドのバイオテクノロジーによる製造方法を提供することが、本発明の目的である。
【００６９】
（ｉ）本発明の少なくとも１個の特異的突然変異を有するメバロン酸キナーゼをコードし、かつ本発明の特異的修飾メバロン酸キナーゼの任意のＤＮＡ配列と標準条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列、または（ii）本発明の少なくとも一つの特異的突然変異を有するメバロン酸キナーゼをコードするが、遺伝コードの縮重が原因でハイブリダイズせず、本発明の特異的修飾メバロン酸キナーゼの任意のＤＮＡ配列と標準条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列と全く同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または（iii）上記のＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列（これは断片であるポリペプチドの活性性質を維持する）を提供することも本発明の目的である。
【００７０】
これに関連してハイブリダイゼーションのための「標準条件」は、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者によって一般に使用され、例えばSambrookら、“Molecular Cloning”, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, ニューヨークに記載されている条件、または好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および非ストリンジェントな洗浄条件、またはさらに好ましくは当業者に親しまれ、例えばSambrookら（刊行年なし）に記載されているいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントな洗浄条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mMのＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μg/ml変性シェアリング処理サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃、一晩インキュベート（例えば１５時間）した後に、約６５℃で０．１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。
【００７１】
本発明の具体的に記載されたＤＮＡ配列に基づいて設計されたＰＣＲプライマーによるいわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）によって得られるＤＮＡ配列を提供することは、さらに本発明の目的である。そのように得られたＤＮＡ配列は、それらが設計されるもととなりまた匹敵する活性性質を示すＤＮＡ配列と同じ突然変異を少なくとも有するメバロン酸キナーゼをコードすることが了解されている。
【００７２】
本明細書に記載した本発明の様々な態様を相互に組み合わせてもよい。
【００７３】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例証する。
【００７４】
実施例１：多重配列アラインメント
例えばパラメーター：ギャップ作成ペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐマトリックス（デフォルトのパラメータ）を用いたプログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc.、9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国）またはＢＬＯＳＵＭ交換マトリックスを用いたプログラムClustalW（バージョン１．７、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク、ドイツ）で種々のメバロン酸キナーゼの多重アミノ酸配列アラインメント（図１参照）を計算できる。当業者はそのような配列アラインメントを日常的に実施している（例えばChoら、J. Biol. Chem. 276,12573-12578, 2001）。
【００７５】
本発明に関連して同一メバロン酸キナーゼは、図１に示す任意のメバロン酸キナーゼと配列類似性を示しうる。図１は、マウス、ラット、ヒト、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＲＡＴＨ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（ＳＣＨＰＯ）、酵母（ＹＥＡＳＴ）、ピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）（ＰＹＲＡＢ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）（ＰＹＲＨＯ）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（ＰＹＲＦＵ）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（ＭＥＴＴＨ）、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）（ＡＲＣＦＵ）、メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）（ＭＥＴＪＡ）、エロピルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）（ＡＥＲＰＥ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＰＡＲＡＣＯＣＣＵＳ）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列についての多重配列アラインメントの例を示し、後者の配列は、例えば以前に名付けられた他の配列の位置が参照されるアミノ酸付番に対する参照としても使用される。さらに、Ｅ６Ｖ突然変異を有する修飾ラットのメバロン酸キナーゼは、上に定義されたような割り当てによる位置６（実際はラットのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置４）で天然に存在するＧｌｕ（「Ｅ」は標準ＩＵＰＡＣ一文字アミノ酸コードを参照している）がＶａｌ（「Ｖ」）に交換されているラットのメバロン酸キナーゼに他ならないものを意味する。本発明の全ての突然変異体／変異体はこのように称されている。
【００７６】
実施例２：メバロン酸キナーゼ活性およびフィードバック阻害剤による阻害の測定
メバロン酸キナーゼ活性を測定するための酵素アッセイは、例えばPopjak(Meth. Enzymol. 15, 393-, 1969)、Gibsonら（Enzyme 41, 47-55, 1989)、Hinsonら（J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997)、Schulteら（Anal. Biochem. 269, 245-254, 1999)、またはChoら（J. Biol. Chem. 276, 12573-12578, 2001）によって記載されている。基質としてメバロネートを調製するためにＤＬ−メバロン酸ラクトン（FLUKA Chemie AG、ブックス、スイス）１３０ｍｇを０．２ＭのＫＯＨ５．５mlに溶かし、５０℃で１５分間インキュベートした。次にこの溶液に室温（ＲＴ）で０．１ＭのＨＣｌを加えることでpH７．０に調整した。別に言及する場合を除き（実施例３を参照されたい）、アッセイ混合物は、１００mMのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、１mMのＡＴＰ、２mMのＭｇＣ１2、１mMメバロネート、０．５mMホスホエノールピルべート（ＰＥＰ）、０．３２mMのＮＡＤＨ、２０U/mlのピルビン酸キナーゼおよび２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）からなる。アッセイ混合物に入れて阻害剤として試験したＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰを全てSigmaから購入した。精製（Ｈｉｓ6タグ付き）メバロン酸キナーゼを添加した場合、光度計による３４０nmでの測定で、ＮＡＤＨの消費に反映される酵素反応を追跡した。メバロン酸キナーゼ活性１ユニット（１Ｕ）は、毎分メバロネート１μmolのリン酸化を触媒する。
【００７７】
実施例３：酵素アッセイの質の試験
最適なアッセイは、酵素濃度との直線性および時間との直線性のような多数の要求を満たすべきである。さらに本発明に関連してアッセイは、フィードバック阻害剤によるメバロン酸キナーゼの阻害の定量を可能にすべきである。本実施例の実験では、以下のアッセイ条件を使用した：１００mMのＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、０．１２５〜４mMのＡＴＰ、１．１２５〜５mMのＭｇＣｌ2（常にＡＴＰよりも１mM過剰！）、０．２５〜３mMメバロネート、０または４６μMのＦＰＰ、０．１６mMのＮＡＤＨ、０．５mMのＰＥＰ、２０U/mlピルビン酸キナーゼ、２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ、３０℃。種々の量の精製Ｈｉｓ6タグ付きパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼを使用した。
【００７８】
本実施例の実験は、メバロン酸キナーゼ活性アッセイが、実際に時間および酵素（メバロン酸キナーゼ）濃度に対して直線性を有し、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスについての所定の条件下でそれぞれ１mMのＭｇＡＴＰおよびメバロネート濃度がＦＰＰによるフィードバック阻害の信頼性の高い測定を可能にするのに最適でありうることを示している。
【００７９】
実施例４：フィードバック耐性突然変異体を得るためのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの突然変異誘発
ＥｃｏＲＩ制限部位、６×Ｈｉｓの配列、およびＡＴＧ開始コドンを有さないメバロン酸キナーゼの５′末端配列片をコードするプライマー、ならびに停止コドンを含めたメバロン酸キナーゼの３′末端配列およびＢａｍＨＩ制限部位を含むプライマーを用いたＰＣＲで、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来メバロン酸キナーゼのｃＤＮＡを増幅する。アガロースゲル電気泳動による精製後に、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでＰＣＲ産物を分解消化し、同酵素で分解消化したｐＱＥ−８０Ｌ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）に連結する。ｐＱＥ−８０Ｌは、ｌａｃオペレーターエレメントによって調節されるＴ５プロモーターを含み、ｐＱＥ−８０Ｌが同じくコードするｌａｃリプレッサーはこのオペレーターをシス阻害できる。次に、供給業者のプロトコルに従い、このプラスミドを用いてInvitrogen（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）の大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。大腸菌の対数増殖期にあるＯＤ600nmが０．６の時点で１００μMのＩＰＴＧを添加して、３０℃、４時間、２５０rpmの振盪でＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼを誘導する。QiagenのQIAexpressシステム／試薬を用いたＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーで、Ｈｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼおよびＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異酵素の精製を行う。
【００８０】
Stratagene（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州、米国）のTurbo-Pfu DNAポリメラーゼを用いたいわゆる「二工程ＰＣＲ」で、Ｈｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼの突然変異誘発を実現する。突然変異コドンを含むプライマー（プライマーＭ）およびｐＱＥ−８０Ｌの多重クローニング部位（ＭＣＳ）の５′末端にある配列片に対応するプライマーｐＱＥ−５′を用いて、第一ＰＣＲを実施する。テンプレートはｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ−Ｍｖｋである。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、第二ＰＣＲ反応用のプライマーとして使用する。第二ＰＣＲは、ＭＣＳの３′末端配列片を包含するプライマーｐＱＥ−３′およびテンプレートとして野生型ｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ−Ｍｖｋも含む。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで分解消化し、それを用いてＨｉｓ−ＭｖｋをｐＱＥ−８０Ｌにサブクローニングする。最後に、分解消化後の断片をアガロース電気泳動で精製し、同制限酵素で線状にしたｐＱＥ−８０Ｌに連結する。
【００８１】
実施例５：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの突然変異体のフィードバック耐性
メバロネートを実施例２に記載したように調製した。アッセイ混合物は、１００mMのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、１mMのＡＴＰ、１mMメバロネート、２mMのＭｇＣｌ2、０．５mMホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、０．３２mMのＮＡＤＨ、２０U/mlピルビン酸キナーゼおよび２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）からなる。アッセイ混合物に入れて阻害剤として試験したＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰを全てシグマから購入した。メバロン酸キナーゼ突然変異体を用いて実施した阻害アッセイに９２μMのＦＰＰまたは１７．６μMのＧＧＰＰを使用した。ＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰによる阻害を比べるために、１３８μMのこれらの中間体を加えた（実施例９）。精製（Ｈｉｓ6タグ付き）メバロン酸キナーゼの添加時に、３４０nmでの光度計測定によって、ＮＡＤＨの消費に反映される酵素反応を追跡した。
【００８２】
フィードバック耐性（％）を以下のように計算する：ａおよびｂは、フィードバック阻害剤（この場合ＦＰＰ）の非存在下および存在下でそれぞれ野生型酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であり、ｃおよびｄは、同フィードバック阻害剤の非存在下および存在下でそれぞれ突然変異酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であるとき、フィードバック耐性（％）は以下となる：
耐性（％）＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
【００８３】
【表１】
【００８４】
これらの突然変異がメバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に影響を有することは意外である。以前、ヒトのメバロン酸キナーゼの残基１３３から残基１５６までの保存された疎水性ストレッチは、イソプレノイドの結合の有望な候補と提案された（Riouら、Gene 148, 293-297,1994; Houtenら、Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000）。しかし、上記の突然変異のどれもパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの対応するストレッチ（残基１３７〜１６０）に局在していない。
【００８５】
かなり多数の突然変異がメバロン酸キナーゼ活性を低下させるか、または破壊することさえあり、かくしてヒト疾患であるメバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群を引き起こすと提案された（例えばＫ１３Ｘ、Ｈ２０Ｐ、Ｈ２０Ｎ、Ｌ３９Ｐ、Ｗ６２Ｘ、Ｓ１３５Ｌ、Ａ１４８Ｔ、Ｙ１４９Ｘ、Ｓ１５０Ｌ、Ｐ１６５Ｌ、Ｐ１６７Ｌ、Ｇ２０２Ｒ、Ｔ２０９Ａ、Ｒ２１５Ｑ、Ｔ２４３Ｉ、Ｌ２６４Ｆ、Ｌ２６５Ｐ、Ｉ２６８Ｔ、Ｓ２７２Ｆ、Ｒ２７７Ｃ、Ｎ３０１Ｔ、Ｇ３０９Ｓ、Ｖ３１０Ｍ、Ｇ３２６Ｒ、Ａ３３４Ｔ、Ｖ３７７Ｉ、およびＲ３８８Ｘ；全てヒトのメバロン酸キナーゼにおける突然変異；Houtenら、Eur. J. Hum. Genet. 9, 253-259, 2001; Cuissetら、Eur. J. Hum. Genet. 9, 260-266, 2001）。これらのうちわずか二つ（すなわちＰ１６５ＬおよびＲ２１５Ｑ）が、フィードバック耐性に影響を有することが示されたパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの残基（すなわちそれぞれ残基１６９および２０４）とのアミノ酸配列アラインメント内の位置に対応する残基に生じている。しかし、ヒトのメバロン酸キナーゼにおける上に記載された突然変異は、フィードバック耐性に作用を有することが示されておらず、むしろ酵素の（比）活性に負の影響を与えると示唆された。
【００８６】
実施例６：フィードバック阻害に対する酵素の耐性に影響を有することが以前に同定されたアミノ酸残基／位置でのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発に供されたコドンがランダム化配列から作られる方法で突然変異誘発プライマーを合成した以外は、突然変異誘発について上に記載したのと同じ方法で、飽和突然変異誘発を行った。
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
【００８９】
【００９０】
実施例７：フィードバック阻害耐性メバロン酸キナーゼを用いたイソプレノイド化合物であるコエンザイムＱ１０の産生の改善
メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に影響する突然変異のインビボ作用を試験するために、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいて複製可能な広範囲の宿主に対応するベクターにクローニングした機能的メバロン酸オペロンに、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｋ９３Ｅを導入した。イソプレノイド化合物であるコエンザイムＱ１０の産生を、Ｋ９３Ｅ突然変異の存在または非存在のみが異なるＰ．ゼアキサンチニファシエンスの二つの組換え株で直接比較した。
【００９１】
プラスミド構築
図２にプラスミドの構築を図示する。クローニングの詳細は以下のとおりであった。大腸菌株をＬＢ培地（Becton Dickinson、スパークス、メリーランド州、米国）で３７℃で増殖させた。組換え大腸菌株中にプラスミドを維持するために、培地にアンピシリン（１００μg/ml）および／またはカナマイシン（実験に応じて２５〜５０μg/ml）を加えた。固体培地には寒天（終濃度１．５％）を加えた。液体培養をロータリーシェーカーを用いて２００rpmで増殖させた。
【００９２】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ（図２）は、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のＳａｃＩ部位とＮｓｉＩ部位の間に挿入されたＰ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来メバロン酸オペロンをそのプロモーター領域込みで含む（Kovachら、Gene 166, 175-176,1995）。クローニングされたメバロン酸オペロンは、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＪ４３１６９６を有する配列のヌクレオチド２４６９〜９００１の配列に対応する。ＳａｃＩ部位とメバロン酸オペロン配列との間に短いリンカー配列があり、その配列はプラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）から得られたものであり、ＳａｃＩ部位からＰＣＲフラグメント挿入部位までの配列に対応する。アクセッション番号ＡＪ４３１６９６を有する配列は、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３３３５）由来であり、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来ではないことに注意すべきである。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ ２１５８８株とＲ１１４株との間のメバロン酸オペロン配列の唯一の差異は、Ｒ１１４株ではｍｖｋ遺伝子に突然変異が存在することである。この突然変異の結果、メバロン酸キナーゼにおけるアラニンからバリンへのアミノ酸２６５の変化（Ａ２６５Ｖ）が生じる。ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔにおけるメバロン酸オペロンがＡＴＣＣ２１５８８由来であることから、これは突然変異を含まず、よってｍｖｋのコドン２６５はＧＣＣである（そしてアクセッション番号ＡＪ４３１６９６におけるようなＧＴＣではない）。
【００９３】
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔに類似しているがＲ１１４株由来ｍｖｋ遺伝子を有するプラスミドも構築し、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４と名付けた。ｃｒｔＥプロモーター領域制御下のＰ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来ｄｄｓＡ遺伝子を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４のＥｃｌ１３６ＩＩとＳｐｅＩ部位との間に導入することによって、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtを得た（図２）。
【００９４】
最終工程は、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtと同一であるがｍｖｋ遺伝子にＫ９３Ｅ突然変異を含むプラスミドを創造することであった。ＸｍａＩ−ＳｐｅＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクター（Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州、米国）に３１６６ｂｐのＸｍａＩ−ＳｐｅＩ断片をサブクローニングすることによってプラスミドｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄ（図２）を構築した。プラスミドｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄは、メバロン酸オペロンの３′末端に突然変異ｍｖｋ遺伝子を導入するために便利で独特の制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｍａＩおよびＡｓｃＩを有する。プラスミドｐＱＥ−８０Ｌ−ｍｖｋ−Ｋ９３ＥをＸｍａＩおよびＡｓｃＩで切断した。Ｋ９３Ｅ突然変異を含めたｍｖｋの大部分を有する１ｋｂの断片を、ｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄをＸｍａＩ−ＡｓｃＩで切断した主鎖に連結させ、ｐＢｌｕ２ＫＳｐ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ−ｍｖｄを得た。ｍｖｋにＫ９３Ｅ突然変異を有する完全長メバロン酸オペロンを再構成するために、ｐＢｌｕ２ＫＳｐ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ−ｍｖｄをＸｍａＩおよびＳｐｅＩで切断し、３１６６ｂｐの断片を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtからの８．１８ｋｂのＸｍａＩ−ＳｐｅＩ断片と連結させ、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtを得た。このプラスミドにおけるｍｖｋ遺伝子のコドン２６５はＧＴＣである。それは、ｐＱＥ−８０Ｌ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅのｍｖｋ遺伝子がＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３３３５）に由来するからである。
【００９５】
まとめると、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtは、後者のプラスミドにＫ９３Ｅ突然変異が存在することを除き同一である。
【００９６】
組換えＰ．ゼアキサンチニファシエンス株の構築
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株を２８℃で増殖させた。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスに使用した培地の組成を下に記載する。フラスコに増殖させたＰ．ゼアキサンチニファシエンスの液体培養を、他に明記しない限りロータリーシェーカーで２００rpmで振盪した。固体培地には寒天（終濃度２％）を加えた。培地をオートクレーブで滅菌した場合、グルコースを（濃縮原液として）滅菌後に加えて所望の終濃度にした。Ｆ培地は、トリプトン１０ｇ；酵母エキス１０ｇ；ＮａＣｌを３０ｇ；Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを１０ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏを５ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ろ過またはオートクレーブで滅菌する前にpHを７．０に調整する。培地３６２Ｆ／２は、Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを３３ｇ；酵母エキス１０ｇ；トリプトン１０ｇ；ＮａＣｌを５ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを２．５ｇを含む（蒸留水１ｌあたり）。ろ過またはオートクレーブで滅菌する前に培地のpHを７．４に調整する。滅菌後に、微量元素溶液、ＮＫＰ溶液およびＣａＦｅ溶液をそれぞれ２．５ml加える。後者の三つの溶液をろ過滅菌する。微量元素溶液は、（ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏを８０ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを６ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを２ｇ；ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏを０．２ｇ；ＥＤＴＡを６ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ＮＫＰ溶液は、Ｋ2ＨＰＯ4を２５０ｇおよび（ＮＨ4）2ＰＯ4を３００ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ＣａＦｅ溶液は、ＣａＣ１2・２Ｈ2Ｏを７５ｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを５ｇ；濃ＨＣｌを３．７５ml含む（蒸留水１ｌあたり）。
【００９７】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株のエレクトロコンピテント細胞の調製およびエレクトロポレーションを以下のように実施した：Ｆ培地１００mlにＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株の定常期培養液１．５mlを植菌し、６６０nmの吸光度が約０．５に達するまで２８℃、２００rpmで増殖させた。４℃、７０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞を回収し、氷冷したＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）１００mlで２回洗浄した。最終的に得られたペレットを氷冷したＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）０．１mlに再懸濁し、細胞を直ちにエレクトロポレーションに使用するか、またはグリセロールを終濃度１５％となるように加えて細胞を５０μlに小分けして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡ１〜５μlを無塩溶液に加え、氷冷した１mmキュベット中でエレクトロポレーションを１８kV/cmおよび１２９０hmで実施した。パルス長を概して４から５ミリ秒の間とした。Ｆ培地１mlを添加し、細胞を２８℃で１時間インキュベートした。２５〜５０μg/mlカナマイシンを含有するＦ寒天平板に希釈液を広げ、２８℃でインキュベートした。推定上の形質転換体について所望のプラスミドを含むことをＰＣＲ分析によって確認した。
【００９８】
コエンザイムＱ１０産生を評価するための培養条件
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株およびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株の流加培養におけるコエンザイムＱ１０の産生を試験した。凍結細胞懸濁液（２５％グリセロール貯蔵物として−８０℃で保存した）から全ての培養を開始した。３６２Ｆ／２培地がそれぞれ２００ml入った２ｌ容のバッフル付き振盪フラスコ２本に流加発酵用の前培養を調製した。解凍した細胞懸濁液２mlを各フラスコへの植菌として使用した。前培養の初発pHは７．２であった。前培養を２５０rpmで２８時間、２８℃で振盪しながらインキュベートした後、６６０nmにおける吸光度（ＯＤ660）は、使用した株に応じて吸光度単位１４から２２の間であった。以下の組成：Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏが２５ｇ；酵母エキス（Ｔａｓｔｏｎｅ９００）１７ｇ；ＮａＣｌが４．０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが６．２５ｇ；（ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏが０．５ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏが０．０３８ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏが０．０１３ｇ；ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏが０．００１ｇ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏが０．４７ｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏが０．０６２ｇ；ナイアシン０．０１ｇ；ＮＨ4Ｃｌが０．５ｇ；消泡剤０．１ml；ＫＰ溶液３．５mlを有する（蒸留水１ｌあたり）培地を入れたＢｉｏｓｔａｔ ＥＤバイオリアクター（B. Braun Biotech International、メルスンゲン、ドイツ）で本培養を行った。ＫＰ溶液の組成は、Ｋ2ＨＰＯ4が２５０ｇ；ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏが２００ｇ；（ＮＨ4）2ＨＰＯ4が１００ｇである（蒸留水１ｌあたり）。プラスミド保有株にはカナマイシン（終濃度５０mg/l）を培地に加えた。全ての工程に使用した流加溶液は、以下の組成を有した（蒸留水１ｌあたり）：Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを５５０ｇ；ＫＰ溶液１８．２５ml。バイオリアクターの（植菌後の）初発体積は８．０Ｌであった。バイオリアクターに４００mlを加えた場合に初発ＯＤ660値が０．５に達するように、必要に応じて前培養を蒸留水で希釈した。発酵条件を以下のように自動制御した：２８℃、pH７．２（２８％ＮＨ4ＯＨを添加してpH調整）、最低４０％相対値に溶存酸素を制御（撹拌を伴う工程流で）、最小撹拌速度３００rpm、および通気速度１v.v.m.（終体積に対して）。流加溶液を加えずに約２０時間これらの条件で培養を進めた（回分培養期）。この後、撹拌速度の減少、塩基消費の中止、pHの激しい増加およびＣＯ2産生の減少は、初回のグルコースが消費し尽くされたことを示したため、流加を開始した。標準的な流加プロフィルを以下のように規定した（流加開始時点から）：１７時間に５０ｇ／ｈから８０ｇ／ｈへの勾配、８０ｇ／ｈで７時間継続、１１時間かけて５５ｇ／ｈまで下方勾配、発酵の残りの時間５５ｇ／ｈで継続（総発酵時間＝７０時間）。本培養の終体積は約１０ｌであった。
【００９９】
分析法
試薬
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）は、高純度（puriss., p.a.）等級またはＨＰＬＣ等級であり、Fluka（スイス）から入手した。コエンザイムＱ１０をFlukaから購入した。メタノール（Lichrosolv）をＭｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツから購入した。カロテノイド標準をChemistry Research Department、Roche Vitamins Ltd.、スイスから入手した。
【０１００】
試料の調製と抽出
総培養液４００μlを１５ml容のディスポーザブルポリプロピレン遠心管に入れた。安定化抽出溶液（ＤＭＳＯ／ＴＨＦの１：１（v/v）混液に溶かした０．５g/lのＢＨＴ）４mlを加え、試料を実験用シェーカー（ＩＫＡ、ドイツ）で２０分間混合して抽出を促進した。最後に、試料を遠心分離し、上清を褐色ガラス製バイアルに移し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析に供した。
【０１０１】
ＨＰＬＣ
ユビキノンとそれに対応するヒドロキノンを同時に決定するための逆相ＨＰＬＣ法を開発した。この方法は、カロテノイドであるゼアキサンチン、フィトエン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよびリコペンをコエンザイムＱ１０からはっきりと分離することができる。温度制御オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムでクロマトグラフィーを実施した。本方法のパラメーターは次の通りであった：
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
計算、選択性、直線性、検出限界および再現性
ピーク面積に基づいて計算を行った。関連する基準化合物の標準溶液をインジェクトすることによって方法の選択性を検証した。標的化合物（コエンザイムＱ１０およびユビキノール１０）は完全に分離され、干渉を示さなかった。抽出溶液（上記）に溶かしたコエンザイムＱ１０の希釈系列を調製し、分析した。直線範囲は、５mg/lから５０mg/lにみられた。相関係数は０．９９９９であった。本ＨＰＬＣ法によるコエンザイムＱ１０の検出限界を４mg/lと決定した。抽出法を含めた本方法の再現性をチェックした。個別の１０個の試料調製物を比較した。相対標準偏差を４％と決定した。
【０１０５】
コエンザイムＱ１０産生の結果
上記の流加培養の条件で、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株によって産生されたコエンザイムＱ１０の終濃度は、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株で観察されたものよりも３４％高かった。この差は、二つの株の増殖の差を単に原因とできなかった。それは、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株がＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株に比べて１２％高いコエンザイムＱ１０の比産生（コエンザイムＱ１０のユニット／乾燥細胞質量（ｇ）／時間）も示したからである。さらに、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株は、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株に比べて培養液中のメバロネート蓄積の３１％の減少も示した。この比較から、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtにおけるＫ９３Ｅ突然変異がコエンザイムＱ１０の産生向上に直接寄与していることが示された。
【０１０６】
実施例８：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの溶解性に及ぼすＩ１７Ｔ突然変異の作用
ヒトのメバロン酸キナーゼでは、突然変異体Ｅ１９Ａ、Ｅ１９ＱおよびＨ２０Ａは大腸菌形質転換体をＩＰＴＧで誘導した後に完全に不溶性であることが示された（PotterおよびMiziorko、J. Biol. Chem. 272, 25449-25454,1997）。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４のＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ（配列番号１５）も、特にかなり高いイオン強度（例えば５０mMのＮａＨ2ＰＯ4（pH８．０）、３００mMのＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール）を有する緩衝溶液中で凝集／沈殿する顕著な傾向を示した。意外なことに、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４のＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔは同条件で完全に可溶性で安定であったため、この突然変異酵素は可溶性メバロン酸キナーゼを必要とする用途にずっとよく適している。
【０１０７】
実施例９：経路の種々の下流産物によるメバロン酸キナーゼのフィードバック阻害
種々のメバロン酸キナーゼがメバロン酸経路の以下の下流産物によるフィードバック阻害に感受性であると以前に報告された：ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰ、フィチル−ＰＰ、ファルネソール、ドリコールリン酸。１３８μMのＧＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＰＰ、ＩＰＰ、またはＤＭＡＰＰで、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼはそれぞれ９８％、８０．１％、１８．６％、１６．３％および１４．７％に阻害された。ＦＰＰ（９２μM）またはＧＧＰＰ（１７．６μM）によるフィードバック阻害に対するパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ｓの耐性は、それぞれ８３％および９２％であった。
【０１０８】
実施例１０：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼと同一であるメバロン酸キナーゼにおける対応する残基の同定
配列アラインメントプログラムＧＡＰ（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国；ギャップ作成ペナルティ８；ギャップ伸長ペナルティ２）を用いて、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の特異的アミノ酸位置に対応する以下の残基を同定した：
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の例には、以下のアミノ酸配列（配列番号１〜１５および３０）があるが、それらに限定されるわけではない。非修飾メバロン酸キナーゼ（配列番号１〜１４および３０）をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１６〜２９および３１に示す。
【０１１１】
配列番号１：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号２：ヒトのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ０３４２６）。
配列番号３：マウスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｒ００８）。
配列番号４：ラットのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ１７２５６）。
配列番号５：シロイヌナズナのメバロン酸キナーゼ のアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ４６０８６）。
配列番号６：酵母のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ０７２７７）。
配列番号７：シゾサッカロミセス・ポンベのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ０９７８０）。
配列番号８：ピロコッカス・アビシのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｖ１８７）。
配列番号９：ピロコッカス・ホリコシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５９２９１）。
配列番号１０：ピロコッカス・フリオサスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３）。
配列番号１１：メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカムのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５０５５９）。
配列番号１２：アーケオグロブス・フルギダスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｏ２７９９５）。
配列番号１３：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５８４８７）。
配列番号１３：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５８４８７）。
配列番号１４：エロピルム・ペルニクスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｙ９４６）。
配列番号１５：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号１６：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列。
配列番号１７：ヒトのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｍ８８４６８）。
配列番号１８：マウスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＦ１３７５９８）。
配列番号１９：ラットのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｍ２９４７２）。
配列番号２０：シロイヌナズナのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｘ７７７９３）。
配列番号２１：酵母のメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｘ０６１１４）。
配列番号２２：シゾサッカロミセス・ポンベのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＢ０００５４１）。
配列番号２３：ピロコッカス・アビシのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＪ２４８２８４）。
配列番号２４：ピロコッカス・ホリコシイのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＢ００９５１５；逆方向）。
配列番号２５：ピロコッカス・フリオサスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＥ０１０２６３；逆方向）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６：メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカムのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｕ４７１３４）。
配列番号２７：アーケオグロブス・フルギダスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＥ０００９４６；逆方向）。
配列番号２８：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｕ６７５５１）。
配列番号２９：エロピルム・ペルニクスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＰ００００６４）。
配列番号３０：ファフィア・ロドチマＡＴＣＣ９６５９４のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号３１：ファフィア・ロドチマＡＴＣＣ９６５９４のメバロン酸キナーゼの遺伝子（ＤＮＡ）配列。メバロン酸キナーゼ遺伝子は、４個のイントロンおよび５個のエキソンからなる。
エキソン１：１０２１〜１１２４
イントロン１：１１２５〜１６３０
エキソン２：１６３１〜１９５６
イントロン２：１９５７〜２０５１
エキソン３：２０５２〜２３６６
イントロン３：２３６７〜２４４６
エキソン４：２４４７〜２６５１
イントロン４：２６５２〜２７３２
エキソン５：２７３３〜３１８８
ポリＡ部位：３２８４
配列番号３２：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７ＴのＤＮＡ配列。
配列番号３３：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２ＳのＤＮＡ配列。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】プログラムＣｌｕｓｔａｌＷで計算したマウス、ラット、ヒト、酵母、シロイヌナズナ（ＡＲＡＴＨ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳＣＨＰＯ）、ピロコッカス・アビシ（ＰＹＲＡＢ）、ピロコッカス・ホリコシイ（ＰＹＲＨＯ）、ピロコッカス・フリオサス（ＰＹＲＦＵ）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（ＭＥＴＴＨ）、アーケオグロブス・フルギダス（ＡＲＣＦＵ）、メタノコッカス・ヤナシイ（ＭＥＴＪＡ）、エロピルム・ペルニクス（ＡＥＲＰＥ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＰＡＲＡＣＯＣＣＵＳ）由来メバロン酸キナーゼの多重配列アラインメントを示す図である。ナンバーリングは、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列に従った。
【図２】ｐＢＢＲ−Ｋに基づくプラスミド上のメバロン酸オペロンへのＫ９３Ｅメバロン酸キナーゼ突然変異の導入を示す図である。詳細については本文参照。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィードバック阻害に対する感受性の低い修飾メバロン酸キナーゼに関する。イソプレノイド化合物の製造、メバロン酸キナーゼの活性の減少を特徴とする障害の処置、および診断目的に、本修飾酵素およびそれをコードするポリヌクレオチドを使用できる。
【０００２】
メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）は、非常に多くの細胞性イソプレノイドの産生をもたらすメバロン酸経路における必須の酵素である。メバロン酸経路の産物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびその異性体化合物であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、全ての生物におけるイソプレノイドの基本構成ブロックである。イソプレノイドは、一次代謝および二次代謝の両方の２３，０００種を超える天然分子を含む。この天然産物のクラスが化学的に多様であることは、それらが全生体系に広範囲の生理学的役割をもつことを反映している。イソプレノイドには、例えば細菌におけるホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン；植物におけるカロテノイド、プラストキノン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖；ならびに哺乳動物におけるヘムＡ、キノン、ドリコール、ステロール／ステロイドおよびレチノイドがある。さらにイソプレノイドは、イソペンテニルｔＲＮＡ、タンパク質のプレニル化、および例えばヘッジホッグクラスの細胞シグナル伝達タンパク質のコレステロール修飾に関与している。
【０００３】
ＭＫ酵素は、多様な生物において生化学レベルおよび分子レベルの両方でキャラクタライズされた（Houtenら、Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000）。現在すでに多くのメバロン酸キナーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列が公知であり（例えばSwiss-Protアクセッション番号／ID P07277/kime_yeast; Q9ROO8/kime_mouse; P17256/kime_rat; Q03426/kime_human; P46086/kime_arath; Q09780/kime_schpo; Q9V187/kime_pyrab; 059291/kime_pyrho; Q8UOF3/kime_pyrfu; Q50559/kime_metth; 027995/kime_arcfu; Q58487/kime_metja; Q9Y946/kime_aerpe）、毎月公知のメバロン酸キナーゼ配列のリストに新しい記入が加わりうる。ゲノムシーケンシングプロジェクトから得られた上記の配列は、公知のメバロン酸キナーゼとの配列類似性に基づいて推定上のメバロン酸キナーゼの機能を割り当てられた。しかし、当業者にはこれらの配列が実際にメバロン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明するのは簡単である。
【０００４】
調節に関して、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはメバロン酸経路における律速酵素であると広くみなされている（例えばGoldsteinおよびBrown、Nature 343, 425-430, 1990; Weinberger、Trends Endocrinol. Metab. 7, 1-6, 1996; Hamptonら、Trends Biochem. Sci. 21, 140-145, 1996; Houtenら、J. Biol. Chem. 278, 5736-5743, 2003）。この考えに一致して、培地へのメバロネートの補充は、ファフィア・ロドチマ（Phaffia rhodozyma)(Caloら、Biotechnol. Lett.17, 575-578, 1995）およびヘマトコッカス・プルバリス（Haematococcus pluvialis)(Kobayashiら、J. Ferment. Bioeng. 71, 335-339, 1991）の両方でカロテノイド産生を刺激することが示された。しかし、増え続ける近年の証拠は、メバロン酸キナーゼが、例えば下流の産物であるゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸およびゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害を受けることを示している。このフィードバック阻害は、メバロン酸経路、よって一般にイソプレノイド生合成の調節および律速にも寄与している可能性がある。
【０００５】
ヒトでは、ヒト遺伝性障害であるメバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群の生化学的原因および分子的原因としてメバロン酸キナーゼの欠乏が同定されたことによって、メバロン酸キナーゼの重要性が実証された（Houtenら、2000; Nwokoroら、Mol. Genet. Metab. 74, 105-119, 2001）。これらの障害の病態生理はまだ分からないが、急性期応答および発熱に関するメバロン酸キナーゼおよびイソプレノイド生合成のインビボでの役割に関する知識を最終的に与えるであろう。メバロン酸キナーゼの欠乏は、例えばツェルヴェーガー症候群および肢根型点状骨端異形成にも関与していると思われる。肢根型点状骨端異形成は、メバロン酸キナーゼなどのペルオキシソーム酵素のサブセットがペルオキシソームに輸送されない、ペルオキシソームの生体発生の障害である（KelleyおよびHerman、Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2, 299-341, 2001）。最終的にメバロン酸キナーゼは、細胞増殖、細胞周期の調節および／または細胞の形質転換に役割を果たすと提案された（Graefら、Virology 208, 696-703, 1995; Hinsonら、J. Biol. Chem. 272, 26756-26760, 1997を参照されたい）。
【０００６】
これまでに研究された全てのメバロン酸キナーゼは、経路下流の産物によってフィードバック阻害される。例えばファルネシルピロリン酸またはゲラニルゲラニルピロリン酸によるフィードバック阻害に耐性であるとこれまでに記載されたメバロン酸キナーゼは、存在しない。フィードバック耐性メバロン酸キナーゼ酵素は、例えば（１）全ての種類のイソプレノイド化合物（例えばカロテノイド、コエンザイムＱ１０、ビタミンＤ、ステロールなど）のバイオテクノロジーによる製造に、（２）例えば生体液中のメバロネート濃度の酵素測定のための診断用酵素として、または（３）メバロン酸尿症を有する患者におけるメバロネート濃度を低下させるための治療用酵素として、産業上の潜在能力を有しうる。フィードバック耐性ＭＫは、メバロン酸経路を通過するさらに大きな流れ、よってさらに高いイソプレノイドの生産性を可能にしうることから、バイオテクノロジーによるイソプレノイドの製造に特に適している。
【０００７】
本明細書において使用する「メバロン酸キナーゼ」という用語は、メバロネート（メバロン酸）から５−ホスホメバロネート（５−ホスホメバロン酸）への、またはメバロン酸アナログ（例えばWildeおよびEggerer, Eur. J. Biochem. 221, 463-473, 1994に記載されたような）から対応するリン酸化化合物へのリン酸化を触媒可能な任意の酵素を意味する。メバロネート（またはメバロン酸アナログ）をリン酸化できるためには、酵素は追加的に適切なリン酸供与体を必要とする。メバロン酸キナーゼのリン酸供与体として、種々の化合物が考えられる。最も好ましいリン酸供与体は、ＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）である。他の好ましいリン酸供与体は、ＴＴＰ、ＩＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである（Gibsonら、Enzyme 41, 47-55, 1989を参照されたい）。「メバロン酸キナーゼ」は、アミノ酸配列が配列番号１〜１４に示される１個または複数の酵素と同一でありうる。「同一」は、配列番号１〜１４および３０に示されるとおりの１個または複数のアミノ酸配列と、少なくとも約６０％同一、好ましくは約７０％同一、さらに好ましくは少なくとも約８０％同一、一層さらに好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一であるメバロン酸キナーゼを指す。
【０００８】
当技術分野において公知である「一致率（％）」という用語は、場合によってはポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の列の間の一致によって決定される、そのような配列の間の近縁性の度合いを意味する。公知の方法によって、例えばプログラムＧＡＰ（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc.、9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国）で以下のパラメーターを用いて「一致率」を容易に決定できる：ギャップ作成ペナルティ８、ギャップ伸長ペナルティ２（デフォルトのパラメーター）。
【０００９】
「野生型酵素」または「野生型メバロン酸キナーゼ」は、本発明により（さらに多数の）フィードバック耐性突然変異体を設計するための出発点として使用される、配列番号１〜１４および３０の任意の一つと同一の任意のメバロン酸キナーゼを意味する。本来この定義は、そのような「野生型酵素」または「野生型メバロン酸キナーゼ」がメバロン酸経路下流の産物の、例えばＦＰＰまたはＧＧＰＰの生理学的または工業的に関連性のある濃度に対する阻害に感受性であることを意味している。本発明に関する「野生型」は、天然からだけ得られるメバロン酸キナーゼ／メバロン酸キナーゼの配列のみに本発明の範囲を限定するわけではない。合成メバロン酸キナーゼの変異体が本発明の教示のいずれかにより（さらに）フィードバック耐性にされうるのであれば、それらの変異体（配列番号１〜１４および３０の任意の一つに同一である限り）も「野生型」と称されることをここで明確に述べる。「野生型メバロン酸キナーゼ」および「非修飾メバロン酸キナーゼ」という用語は、本明細書において同義的に使用される。
【００１０】
「突然変異体」、「突然変異酵素」、または「突然変異メバロン酸キナーゼ」は、本発明の教示により所定の（上記の定義による）野生型酵素／メバロン酸キナーゼから得ることができる、それぞれの野生型酵素よりも（さらに）フィードバック耐性である任意の変異体を意味する。本発明の範囲には、突然変異体がどのように得られるかは関係ない。例えば部位特異的突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発／定方向進化、細胞／生物全体の化学的またはＵＶ突然変異誘発などによってそのような突然変異体を得られる。例えば合成遺伝子の設計によりおよび／またはインビトロ（無細胞）翻訳によりこれらの突然変異体を調製できる（例えばJermutusら、Curr. Opin. Biotechnol. 9, 534-548, 1998; Betton、Curr. Prot. Pept. Sci. 4,73-80, 2003; Martinら、Biotechniques 31, 948-, 2001を参照されたい）。フィードバック耐性を試験するために、当業者に公知の方法によって（例えば部位特異的突然変異誘発または合成遺伝子の設計による）突然変異体を発生できる。
【００１１】
本特許出願に関連して「イソプレノイド」は、天然または非天然経路（すなわち天然に存在せず、バイオテクノロジーにより設計された経路）のどちらか、好ましくは生化学経路によりメバロネートから得られる任意のおよび全ての代謝物およびプレニル化高分子を含む。イソプレノイドには、細菌におけるホパントリテルペン、ユビキノンおよびメナキノン；植物におけるカロテノイド、プラストキノン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、およびクロロフィルのプレニル側鎖；ならびにヘムＡ、キノン、コエンザイムＱ１０、ドリコール、ステロール／ステロイド、ビタミンＤ、レチノイドなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００１２】
触媒性質が非修飾メバロン酸キナーゼよりも好都合である（すなわちフィードバック阻害に対する感受性がより低い）ように修飾されたメバロン酸キナーゼを提供することは、一般に本発明の目的である。
【００１３】
本発明は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減したフィードバック阻害に対する感受性を示す修飾メバロン酸キナーゼに関し、
（ｉ）修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、少なくとも１個の突然変異を含み、かつ
（ii）その少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すとおりのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。
【００１４】
本明細書に使用する「フィードバック阻害」という用語は、イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物によるメバロン酸キナーゼの酵素活性の阻害を意味する。イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物には、５−ホスホメバロネート、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、ファルネソール、ドリコールリン酸、およびフィチルピロリン酸があるが、それらに限定されるわけではない（DorseyおよびPorter、J. Biol. Chem. 243, 4667-4670, 1968; Flint、Biochem. J. 120, 145-150, 1970; GrayおよびKekwick、Biochim. Biophys. Acta 279, 290-296, 1972; Hinsonら、J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997）。メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害は、イソプレノイド生合成におけるメバロネート下流の代謝物が酵素に結合することによるメバロン酸キナーゼのアロステリック調節に基づくと考えられている。
【００１５】
好ましくはフィードバック阻害は、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）またはゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）によるフィードバック阻害である。
【００１６】
本発明によれば修飾メバロン酸キナーゼは、フィードバック阻害に対して、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減している感受性を示す。好ましくは、本発明の修飾メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に対する感受性は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて（フィードバック耐性の測定および定量については下記を参照されたい）少なくとも５％低減している。
【００１７】
「フィードバック耐性」は、（上に定義するような）「フィードバック阻害」に対する耐性の任意の増加を意味する。当業者に公知の種々の方法でフィードバック耐性を分析できる。適切なアプローチをここに簡潔に説明する：不飽和濃度のＡＴＰ（または別のリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロン酸アナログ）で、すなわち反応速度がＡＴＰ（またはリン酸供与体）およびメバロネート（またはメバロン酸アナログ）の濃度の変化に感受性であるこれらの基質の濃度付近で、例えばこれらの基質に対する検討中の酵素のそれぞれのＫｍ値付近の濃度で、実施例２に記載したアッセイに類似した活性アッセイでメバロン酸キナーゼ活性を測定する。適切な濃度のフィードバック阻害剤、すなわち野生型メバロン酸キナーゼの有意な阻害を提供する濃度のフィードバック阻害剤の非存在下および存在下の両方で、他の点では同一の状態で、野生型メバロン酸キナーゼの活性およびこの酵素の変異体／突然変異体の活性の両方を測定する。フィードバック阻害剤による阻害の程度（例えば阻害率％）が野生型酵素よりも突然変異体の方が低いならば、突然変異体は本特許出願に関連して「フィードバック耐性」である。いったん「フィードバック耐性」変異体／突然変異体が同定されると、さらに改良された突然変異体、すなわちさらに一層フィードバック耐性である突然変異体を同定するために上記と同じ手順を適用できる。フィードバック耐性（％）は以下のように計算される：ａおよびｂがそれぞれフィードバック阻害剤（例えばＦＰＰ）の非存在下および存在下で野生型酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であり、ｃおよびｄがそれぞれ同じフィードバック阻害剤の非存在下および存在下で突然変異酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であるならば、フィードバック耐性（％）は：
耐性（％）＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
である。
【００１８】
好ましくはフィードバック耐性は、本出願の実施例２に記載された実験条件を参照する。およそ３〜３０mU/ml（パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼおよそ１〜１０μg/mlに対応）、好ましくはおよそ１０〜２０mU/mlのメバロン酸キナーゼ活性、および場合により４６μMのＦＰＰがアッセイ混合物に存在し、反応は３０℃で実施された。
【００１９】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、少なくとも５％、好ましくは少なくとも約１０％、さらに好ましくは少なくとも約２５％、一層さらに好ましくは少なくとも約４０％、なおさらに好ましくは少なくとも約６０％、最も好ましくは少なくとも約７０％のフィードバック耐性を示す。
【００２０】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に少なくとも１個の突然変異を含む。この突然変異は、付加、欠失および／または置換でありうる。好ましくは突然変異は、非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列に存在する所定のアミノ酸が、本発明の修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列における別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換である。修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に少なくとも１個のアミノ酸置換を含んでいてもよい。さらなる態様において、修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、少なくとも二個、少なくとも三個、少なくとも四個、または少なくとも五個の置換を含む。本発明の他の態様において、修飾メバロン酸キナーゼは、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に１から１０個、１から７個、１から５個、１から４個、２から１０個、２から７個、２から５個、２から４個、３から１０個、３から７個、３から５個、または３から４個のアミノ酸置換を含む。
【００２１】
１個または複数の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在してもよい。
【００２２】
好ましくは少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。別の好ましい態様において、少なくとも１個の突然変異は、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、および１６９に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する。
【００２３】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが単一のアミノ酸置換しか含まない場合、その単一のアミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸位置１７、４７、９３、９４、２０４、および２６６に対応する位置からなる群より選択される一つの位置に存在することが好ましい。さらに好ましくは、置換はＩ１７Ｔ、Ｇ４７Ｄ、Ｋ９３Ｅ、Ｖ９４Ｉ、Ｒ２０４Ｈ、またはＣ２６６Ｓである。
【００２４】
特に好ましい態様において、突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置１７に対応するアミノ酸位置に影響する置換である。非修飾メバロン酸キナーゼに存在するそのアミノ酸は、好ましくはイソロイシンである。非修飾メバロン酸キナーゼの配列におけるそのアミノ酸を、トレオニンまたはアラニンに取り替えることができる。最も好ましくは、配列番号１に示す配列の位置１７に対応するアミノ酸位置での置換が、イソロイシンからトレオニンへの交換からなる。
【００２５】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが少なくとも２個の突然変異を含む場合、突然変異の１個は、配列番号１の位置３７５に対応するアミノ酸位置に存在しうる。対応する非修飾メバロン酸キナーゼと比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが２個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は配列番号１の位置１３２／３７５、１６７／１６９、１７／４７、または１７／９３の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。組み合わせＰ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ、またはＩ１７Ｔ／Ｋ９３Ｅが最も好ましい。
【００２６】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが３個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は、配列番号１の位置１７／１６７／１６９、１７／１３２／３７５、９３／１３２／３７５、または１７／４７／９３の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。最も好ましくは、組み合わせＩ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｐ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ａ／Ｐ３７５Ｒ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｗ／Ｋ１６９Ｈ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｔ／Ｋ１６９Ｍ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｔ／Ｋ１６９Ｙ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｆ／Ｋ１６９Ｑ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｉ／Ｋ１６９Ｎ、Ｉ１７Ｔ／Ｒ１６７Ｈ／Ｋ１６９Ｙ、Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ、またはＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｑである。
【００２７】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼが４個のアミノ酸置換を含む場合、アミノ酸置換は、配列番号１の位置１７／４７／９３／１３２の組み合わせに対応する位置に存在することが好ましい。組み合わせＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ａ、またはＩ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ｓが最も好ましい。
【００２８】
表１、２、３または４（下記参照）に開示された突然変異の組み合わせが最も好ましい。これらの例で同定されたアミノ酸位置を異なる起源のメバロン酸キナーゼに移してもよい。
【００２９】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼに突然変異を導入することによって、本発明の修飾メバロン酸キナーゼを入手できる。非修飾メバロン酸キナーゼは、フィードバック阻害に感受性を示す任意のメバロン酸キナーゼであってもよい。非修飾メバロン酸キナーゼには、自然から得ることが可能なメバロン酸キナーゼがあるが、それらに限定されるわけではない。非修飾メバロン酸キナーゼにはさらに、配列番号１から１４および３０に示すとおりの任意の一つのアミノ酸配列に同一なメバロン酸キナーゼがある。
【００３０】
好ましい非修飾メバロン酸キナーゼには、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号３０に示すアミノ酸配列からなる群より選択される配列を有するものがある。
【００３１】
非修飾メバロン酸キナーゼは、真核または原核生物、好ましくは真菌または細菌起源、さらに好ましくはアスペルギルス（Aspergillus）またはサッカロミセス（Saccharomyces）またはパラコッカスまたはファフィア（Phaffia）、最も好ましくは黒色こうじ菌（Aspergillus niger）またはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスまたはファフィア・ロドチマ（Phaffia rhodozyma）起源でありうる。一態様において、非修飾メバロン酸キナーゼは原核生物、好ましくは細菌起源、さらに好ましくはパラコッカス、最も好ましくはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス起源である。
【００３２】
好ましくはＦＰＰによる非修飾メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害は、実施例２に記載されたアッセイ（０または４６μMのＦＰＰ）で決定されるとき、少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、もっとさらに好ましくは少なくとも３０％、なおさらに好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％である。
【００３３】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、好ましくはそのＮ末端またはＣ末端に外来アミノ酸を含みうる。「外来アミノ酸」は、天然（自然に存在する）メバロン酸キナーゼに存在しないアミノ酸、好ましくは天然メバロン酸キナーゼに存在しない少なくとも約３個、少なくとも約５個、または少なくとも約７個の隣接アミノ酸のストレッチを意味する。外来アミノ酸の好ましいストレッチには、組換え製造された修飾メバロン酸キナーゼの精製を容易にする「タグ」があるが、それらに限定されるわけではない。そのようなタグの例には、「Ｈｉｓ6」タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグなどがあるが、それらに限定されるわけではない。
【００３４】
別の態様において、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、修飾メバロン酸キナーゼは、１個または複数、例えば２個の欠失を含んでもよい。好ましくは欠失は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのＮまたはＣ末端アミノ酸に影響し、酵素の機能的性質、例えば比活性を有意に低減しない。
【００３５】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、通常は非天然メバロン酸キナーゼである。好ましくは、修飾メバロン酸キナーゼの比活性は、対応する非修飾メバロン酸キナーゼの比活性の少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、もっとさらに好ましくは少なくとも３５％、なおさらに好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％である。
【００３６】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼは、単離されたポリペプチドであってもよい。本明細書に使用する「単離されたポリペプチド」という用語は、他のポリペプチドを実質的に含まないポリペプチドを指す。単離されたポリペプチドは、好ましくは純度８０％超、好ましくは純度９０％超、さらに好ましくは純度９５％超、最も好ましくは純度９９％超である。当技術分野において公知の方法によって、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびその後のタンパク質染色によって、純度を決定できる。次に、デンシトメトリーでタンパク質のバンドを定量できる。純度を決定するための追加の方法は、当技術分野のレベル内に入る。
【００３７】
本発明はさらに、本発明による修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関する。本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」は、未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合であるＲＮＡ；一本鎖でありうるか、またはより典型的には二本鎖でありうるか、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合でありうる、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子があるが、それらに限定されるわけではない。「ポリヌクレオチド」という用語は、１個もしくは複数の異常な塩基、例えばイノシン、または１個もしくは複数の修飾塩基、例えばトリチル化塩基を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドは、非修飾メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチド配列を修飾することによって容易に得られる。非修飾メバロン酸キナーゼをコードするそのようなポリヌクレオチド配列の例を、配列番号１６〜２９および３１に示す。非修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列に突然変異、例えば付加、欠失および／または置換を導入するための方法には、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲに基づく方法があるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理は、例えばWhiteら、Trends Genet. 5, 185-189, 1989に概説され、改良法は例えばInnisら［PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.(1990)］に解説されている。
【００４０】
当技術分野において公知のメバロン酸キナーゼをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列［配列情報については、例えば関連する配列データベース、例えばGenbank(Intelligenetics、カリフォルニア州、米国）、European Bioinformatics Institute(Hinston Hall、ケンブリッジ、英国）、ＮＢＲＦ（ジョージタウン大学医療センター、ワシントンＤＣ、米国）およびVecbase（ウィスコンシン大学、バイオテクノロジーセンター、マディソン、ウィスコンシン、米国）または図および配列リストに開示されている配列情報を参照されたい］から開始して、インビトロ突然変異誘発法［例えばSambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークを参照されたい］によって本発明のＤＮＡ配列を構築できる。もともとHutchisonおよびEdgell(J. Virol. 8, 181-189, 1971）によって概説されたそのような「部位特異的突然変異誘発」のための広く使用されている戦略は、突然変異を導入すべき一本鎖ＤＮＡ配列の標的領域との、所望のヌクレオチド置換を保有する合成オリゴヌクレオチドのアニーリングを伴う（総説についてはSmith、Annu. Rev. Genet. 19, 423-462, 1985を；改良法についてはStanssenら、Nucl. Acids Res. 17, 4441-4454, 1989の参考文献２〜６を参照されたい）。本発明の実施にまた好ましい、所定のＤＮＡ配列を突然変異させる別の可能性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによる突然変異誘発である。当技術分野において公知であり、例えばSambrookら（Molecular Cloning）に解説されている方法によって、それぞれの株／生物から出発物質としてのＤＮＡを単離できる。しかし、公知のＤＮＡ配列に基づいても、例えば当技術分野で公知の方法による合成遺伝子の構築によっても（例えばＥＰ７４７４８３およびLehmannら、Prot. Eng. 13, 49-57, 2000に記載されているように）、本発明により構築／突然変異誘発されるべきメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡを調製できることが理解されている。
【００４１】
本発明による修飾メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドの非限定的な例を配列番号３２および３３に示す。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドでありうる。「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、他の染色体ならびに染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡを非限定的に例とする他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドを得るために、当業者に公知の通常の核酸精製法を使用できる。本用語は、組換えポリヌクレオチドおよび化学合成されたポリヌクレオチドも包含する。
【００４３】
なお別の態様において本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。ベクターまたはプラスミドは、好ましくは少なくとも一つのマーカー遺伝子を含む。ベクターまたはプラスミドは、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結した調節エレメントをさらに含んでもよい。本明細書に使用する「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方に影響されるように単一核酸断片に核酸配列を結合させることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響できる場合に、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合に、そのプロモーターはそのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列と作動可能に連結しうる。「発現」という用語は、ｍＲＮＡへのＤＮＡ配列の転写および／またはアミノ酸配列へのｍＲＮＡの翻訳を意味する。「過剰発現」という用語は、対応する非修飾生物における産生のレベルを超えた、修飾生物（例えば形質転換またはトランスフェクションによって修飾された）における遺伝子産物の産生を意味する。
【００４４】
いったん本発明の完全ＤＮＡ配列が得られたなら、コードされたポリペプチドを適切な宿主系に（過剰）発現させるための当技術分野で公知であり、例えばSambrookら（刊行年なし）に記載された方法によって、それらのＤＮＡ配列をベクターに組み込むことができる。しかし当業者は、コードされるポリペプチドの（過剰）発現を得るために本発明の適切な宿主系を形質転換するためにＤＮＡ配列自体も使用できることを分かっている。適切な宿主系は、例えばアスペルギルス、例えば黒色こうじ菌もしくは米こうじ菌（Aspergillus oryzae）、またはトリコデルマ（Trichoderma）、例えばトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）などの真菌、あるいはサッカロミセス（Saccaromyces）、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Saccaromyces cerevisiae）またはピチア・パストリス（Pichia pastoris）のようなピチア（Pichia）、またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、例えばＨ．ポリモルファ（DSM5215）のような酵母である。当業者は、寄託機関、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Centraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）もしくはDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）、または雑誌「Industrial Property」(vol. 1, pages 29-40, 1991)もしくはOfficial Journal of the European Patent Office(vol. 4, pages 155/156, 2003）に挙げられているような他の任意の寄託機関から、そのような微生物を入手できることを知っている。使用できる細菌は、例えばパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスなどの例えばパラコッカス（Paracoccus）、大腸菌（E. coli）、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）、または例えばストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）などのストレプトマイセス（Streptomyces）である（例えばAnneおよびvan Mellaert in FEMS Microbiol. Lett. 114, 121-128, 1993を参照されたい）。使用できる大腸菌は、例えば大腸菌Ｋ１２株、例えばＭ１５（Villarejoら、J. Bacteriol. 120, 466-474,1974ではDZ291と記載されている）、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ番号３３６９４）または大腸菌ＳＧ１３００９（Gottesmanら、J. Bacteriol. 148, 265-273, 1981）である。
【００４５】
真菌に発現させるために使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばＥＰ４２０３５８に、またはCullenら（Bio/Technology 5, 369-376, 1987）、Ward(Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker、ニューヨーク、1991)、Upshallら（Bio/Technology 5, 1301-1304, 1987)、Gwynneら（Bio/Technology 5, 71-79, 1987)、またはPuntら（J. Biotechnol. 17, 19-34, 1991)によって記載され、酵母についてはSreekrishnaら（J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117-4125, 1989)、Hitzemannら（Nature 293, 717-722,1981)によって、またはEP183070、EP183071、EP248227、EP263311に記載されている。大腸菌に発現させるために使用できる適切なベクターは、例えばSambrookら［刊行年なし］によって、またはFiersら、Proc. 8th Int. Biotechnol. Symp. [Soc. Franc. de Microbiol., Paris(Durandら編), pp. 680-697, 1988]、Bujardら（Meth. Enzymol., WuおよびGrossmann編、Academic Press, Inc., Vol. 155, 416-433, 1987)、もしくはStuberら（Immunological Methods、LefkovitsおよびPernis編、Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152, 1990）によって言及されている。バチルスでの発現に使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばEP207459またはEP405370に、YansuraおよびHenner(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439-443 (1984))によって、またはHenner、Le GriceおよびNagarajan(Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990）によって記載されている。Ｈ．ポリモルファの発現に使用できるベクターは、当技術分野において公知であり、例えばGellissenら、Biotechnology 9, 291-295, 1991に記載されている。
【００４６】
そのようなベクターの各々がすでに調節エレメント、例えばプロモーターを有するか、またはそのようなエレメントを含むように本発明のＤＮＡ配列を設計できるかのどちらかである。使用できる適切なプロモーターエレメントは、当技術分野で公知であり、例えばトリコデルマ・レーセイについてはｃｂｈ１プロモーター（Haarkiら、Biotechnology 7, 596-600,1989）またはｐｋｉｌプロモーター（Schindlerら、Gene 130, 271-275,1993）、米こうじ菌についてはａｍｙプロモーター［Christensenら、Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23 (1987); Christensenら、Biotechnology 6,1419-1422,1988; Tadaら、Mol. Gen. Genet. 229, 301-306,1991］、黒色こうじ菌についてはｇｌａＡプロモーター（Cullenら、Bio/Technology 5, 369-376, 1987; Gwynneら、Bio/Technology 5, 713-719,1987; Ward「Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi」Marcel Dekker, New York, 83-106,1991）、ａｌｃＡプロモーター（Gwynneら、Bio/Technology 5, 718-719,1987）、ｓｕｃ１プロモーター（Boddyら、Curr. Genet. 24, 60-66, 1993）、ａｐｈＡプロモーター（MacRaeら、Gene 71, 339-348, 1988; MacRaeら、Gene 132, 193-198, 1993）、ｔｐｉＡプロモーター（McKnightら、Cell 46, 143-147, 1986; Upshallら、Bio/Technology 5,1301-1304,1987）、ｇｐｄＡプロモーター（Puntら、Gene 69, 49-57,1988; Puntら、J. Biotechnol. 17,19-37,1991）およびｐｋｉＡプロモーター（de Graaffら、Curr. Genet. 22, 21-27,1992）である。酵母における発現に使用できる適切なプロモーターエレメントは、当技術分野において公知であり、例えばサッカロミセス・セレビジエに発現させるためのｐｈｏ５プロモーター（Vogelら、 Mol. Cell. Biol. 9, 2050-2057, 1989; RudolfおよびHinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1340-1344, 1987）またはｇａｐプロモーター、および例えばピチア・パストリスのためのａｏｘｌプロモーター（Koutzら、Yeast 5, 167-177, 1989; Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988）、またはＨ．ポリモルファについてのＦＭＤプロモーター（Hollenbergら、EPA第0299108号）もしくはＭＯＸプロモーター（Ledeboerら、Nucleic Acids Res. 13, 3063-3082, 1985）である。
【００４７】
細菌に発現させるための適切なプロモーターおよびベクターには、例えばGiacominiら（Gene 144,17-24, 1994）によって記載された合成プロモーターがある。適切なプラスミドによるか、またはメバロン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列の染色体ＤＮＡへの組み込みを介するかのどちらかで、請求項に記載された（突然変異）メバロン酸キナーゼを細菌に発現させるための適切な教示を、多数の箇所、例えば米国特許第６３２２９９５号から見出すことができる。
【００４８】
本発明はさらに、本発明のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞に関する。適切な宿主細胞は、真核または原核細胞でありうる。適切な宿主細胞の例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレプトマイセス、シアノバクテリア、枯草菌、および肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の細胞などの細菌細胞；酵母であるクルイベロミセス（Kluyveromyces）、サッカロミセス、担子菌類であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）およびアスペルギルスの細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９の細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ＣＶ−１などの動物細胞；ならびに裸子植物または被子植物の細胞などの植物細胞があるが、それらに限定されるわけではない。
【００４９】
したがって、好ましくは細菌、真菌、酵母または植物宿主に本発明のポリヌクレオチドを発現させるための、前記ポリヌクレオチドを含むベクターおよびそのような形質転換された細菌、または真菌、酵母もしくは植物宿主も本発明の目的である。
【００５０】
本発明は、以下を含むイソプレノイド化合物の製造法に関する：
（ａ）宿主細胞における修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で適切な培地中で本発明の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）場合により培地からイソプレノイド化合物を分離すること。
【００５１】
そのような方法は、任意の種類のイソプレノイド化合物またはイソプレノイド由来化合物：例えばフィトエン、リコペン、α−、β−およびγ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、β−クリプトキサンチン、アドニキサンチン（adonixanthin）、エキネノン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、およびそれらの誘導体を例とするが、それらに限定されるわけではないカロテノイド（Misawa & Shimada, J. Biotechnol. 59,169-181,1998; Miuraら、AppL Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998; Hirschberg, Curr. Opin. Biotechnol. 10, 186-191, 1999; Margalith, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 431-438,1999; Schmidt-Dannert, Curr. Opin. Biotechnol.11, 255-261, 2000; Sandmann, Arch. Biochem. Biophys. 385, 4-12, 2001; Lee & Schmidt-Dannert, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 1-11, 2002）；ユビキノン（＝コエンザイムＱ）、メナキノン、プラストキノンおよびアントラキノン、好ましくはコエンザイムＱ６、コエンザイムＱ７、コエンザイムＱ８、コエンザイムＱ９、コエンザイムＱ１０またはコエンザイムＱ１１、最も好ましくはコエンザイムＱ１０を例とするがそれらに限定されるわけではないキノン（Clarke, Protoplasma 213, 134-147, 2000; Hanら、Plant Cell Tissue Organ Culture 67, 201-220, 2001; Kawamukai, J. Biosci. Bioeng. 94, 511-517, 2002）；ゴムおよびゴム誘導体、好ましくは天然ゴム（＝シス−１，４−ポリイソプレン；Mooibroek & Cornish, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 355-365, 2000）；エルゴステロール、コレステロール、ヒドロコルチゾンを例とするがそれらに限定されるわけではないステロールおよびステロール誘導体（Menard Szczebaraら、Nature Biotechnol. 21, 143-149,2003）、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、食物フィトステロール（Ling & Jones, Life Sci. 57,195-206,1995）および天然界面活性剤（Holmberg, Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. 6, 148-159, 2001）；ならびにモノテルペン、ジテルペン、セスキテルペンおよびトリテルペン、例えばタキソールを例とするがそれらに限定されるわけではない多数の他のイソプレノイド（Jennewein & Croteau, Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 13-19, 2001）およびジベレリン（Bruckner & Blechschmidt, Crit. Rev. Biotechnol. 11,163-192,1991）のバイオテクノロジーによる製造に使用できる。
【００５２】
適切な宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、藻類、植物または動物の細胞を例とするがそれらに限定されるわけではない、遺伝子修飾に従う全ての種類の生物である。遺伝子工学および代謝工学の方法は、当業者に公知である（例えばVerpoorteら、Biotechnol. Lett. 21, 467-479, 1999; Verpoorteら、Transgenic Res. 9, 323-343, 2000; Barkovich & Liao, Metab. Eng. 3, 27-39, 2001）。同様に、イソプレノイドおよびイソプレノイド由来の化合物および／または分子に（潜在的に）適した精製法は、ファインケミカルの生合成および製造の分野で周知である。
【００５３】
本発明によるイソプレノイドまたはイソプレノイド由来の化合物および／または分子のバイオテクノロジーによる製造方法は、上記のような細胞全体の発酵工程に限定されるわけではなく、例えば透過性宿主細胞、粗細胞抽出物、例えば遠心分離もしくはろ過によって細胞残余物から清澄にされた細胞抽出物、またはそれどころか単離された酵素を用いて再構成された反応経路も使用できることが理解される。そのようなプロセスの組み合わせも、本発明の範囲内に属す。無細胞生合成（再構成された反応経路のような）の場合に、単離された酵素が、インビトロ転写／翻訳によって、またはさらに他の方法によって宿主細胞から調製され、単離されたかどうかは関係しない。
【００５４】
本発明はさらに、以下を含む、本発明の修飾メバロン酸キナーゼを産生させるための方法に関する：
（ａ）本発明の修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で本発明の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）細胞または培地から修飾メバロン酸キナーゼを回収すること。
【００５５】
発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から本発明の修飾メバロン酸キナーゼを調製できる。
【００５６】
本発明のポリペプチドの組換え産生のために、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターまたはプラスミドを組み込むことができる。多数の標準的な実験マニュアル［例えばDavisら、Basic Methods in Molecular Biology (1986)、およびSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)］に記載されている方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、弾丸導入（ballistic introduction）および感染のような方法によって、宿主細胞へのポリヌクレオチドまたはベクターの導入を実施できる。
【００５７】
本発明の修飾メバロン酸キナーゼを産生させるために多様な発現系を使用できる。そのようなベクターには、とりわけ上記のベクターがある。一般に、ポリヌクレオチドの維持、増大、もしくは発現、および／または宿主でのポリペプチドの発現に適した任意の系またはベクターをこれに関する発現に使用できる。
【００５８】
真核生物における組換え発現系では、小胞体の内腔、ペリプラスム間隙または細胞外環境に翻訳されたタンパク質を分泌させるために、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを組み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチドに内因性であるか、または異種シグナルであってもよい。
【００５９】
硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの周知の方法によって組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収および精製できる。一態様において、高速液体クロマトグラフィーが精製に採用される。単離および／または精製時にポリペプチドが変性した場合、活性コンホメーションを再生するタンパク質の再フォールディングのための周知の手法を採用できる。タンパク質の精製法は、例えばDeutscher, Protein Purification, Academic Press, New York, 1990; およびScopes, Protein Purification, Springer Verlag, Heidelberg, 1994に記載されている。
【００６０】
例えばPenら、Bio/Technology 11, 811-814, 1994またはEP449375に記載されているような方法により、植物に、好ましくは例えばEP449376に記載されているように種子に、本発明のメバロン酸キナーゼを発現させることもできる。プロモーターおよびターミネーターの適切な例には、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子からのものが挙げられる。使用できる効率的な植物プロモーターの一種類は、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と作動可能に連結しているそのようなプロモーターは、本遺伝子産物の発現を促進できるはずである。本発明に使用できる高レベル植物プロモーターには、例えばダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼのスモールサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Berry-Loweら、J. Mol. Appl. Genet. 1, 483-498, 1982）およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターがある。これらの二つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが公知である（例えばGenetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum Press、NY (1983), pages 29-38; Coruzziら、J. Biol. Chem. 258,1399-1402,1983; およびDunsmuirら、J. Mol. Appl. Genet. 2,285-300,1983を参照されたい）。
【００６１】
当該タンパク質の商業的製造が望ましい場合に、多様な培養法を適用できる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特定遺伝子産物の大規模製造を回分培養法または連続培養法の両方で行うことができる。回分および流加培養法はよくみられ、当技術分野において周知であり、Thomas D. Brock「Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition」(1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.またはDeshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36,227-234, 1992に例を見出すことができる。連続培養プロセスのために栄養素および増殖因子を調整する方法、ならびに産物の形成速度を最大にするための手法は、工業微生物の分野において周知であり、多様な方法がＢｒｏｃｋ（上記）によって詳述されている。
【００６２】
発酵用培地は適切な炭素基質を含有しなければならない。適切な基質には、グルコースおよびフルクトースなどの単糖；乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖；デンプンもしくはセルロースまたはその混合などの多糖；および再生可能原料からの未精製混合物がありうるが、それらに限定されるわけではない。本発明に利用される炭素源は、基質を含む多様な炭素を包含でき、生物の選択によってのみ制限されることが意図されている。
【００６３】
本発明はさらに、フィードバック阻害に対して低減した感受性を有するメバロン酸キナーゼの調製のための、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）フィードバック阻害に対して感受性を示す第一メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）ポリヌクレオチド配列に１個または複数の突然変異を導入し、突然変異ポリヌクレオチド配列が、第一メバロン酸キナーゼと比較した場合に少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む第二メバロン酸キナーゼをコードするようにする工程（少なくとも１個のアミノ酸突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する）；
（ｃ）突然変異ポリヌクレオチドをベクターまたはプラスミドに場合により挿入する工程；
（ｄ）ポリヌクレオチドまたはベクターまたはプラスミドを適切な宿主細胞に導入する工程；および
（ｅ）宿主細胞を修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で培養する工程。
【００６４】
この方法の好ましい態様は、修飾メバロン酸キナーゼ、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド、宿主細胞、ならびに本明細書に記載された方法の好ましい態様に対応する。第一および第二メバロン酸キナーゼは、それぞれ非修飾および修飾メバロン酸キナーゼに対応する（上記参照）。
【００６５】
本発明の別の態様は、メバロン酸キナーゼ活性減少に関連する障害の処置用の医薬の製造のための本発明の修飾メバロン酸キナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。そのような障害には、メバロン酸尿症、高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群があるが、それらに限定されるわけではない。本発明の修飾メバロン酸キナーゼを治療用酵素として投与することが好ましい。投与様式には、経口、非経口、腹腔内、および／または皮下投与がある。本発明の修飾メバロン酸キナーゼおよびその塩を、少なくとも一つのそのような酵素を単独で、または薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤との混合物中に含む医薬組成物として製剤化（例えば顆粒剤、酵素結晶、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤、液剤など）できる。通常の方法により医薬組成物を製剤化できる。採用した特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、併用薬、および治療を受けている特定の疾患の重症度などの多様な要因に応じて、任意の特定患者に対する特異的用量レベルを採用する。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療プロトコルに使用できる。
【００６７】
本発明のなお別の態様は、生物学的液体中のメバロネート濃度を決定するための本発明の修飾メバロン酸キナーゼまたは本発明のポリヌクレオチドの使用である。生物学的液体の非限定的な例は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、涙、汗、ならびに他の任意の細胞内、細胞間および／または細胞外液である。
【００６８】
上記のような修飾メバロン酸キナーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド；そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクター；そのようなポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換された宿主細胞；前記の宿主細胞を適切な培養条件で培養し、そのような宿主細胞または培地から当技術分野において公知の方法によってメバロン酸キナーゼを単離する、本発明のメバロン酸キナーゼの調製方法；ならびにそのようなポリペプチドもしくはベクターで形質転換され、かつ／または染色体にそのようなポリヌクレオチドを安定して組み込まれていてもよい宿主細胞に基づくイソプレノイドのバイオテクノロジーによる製造方法を提供することが、本発明の目的である。
【００６９】
（ｉ）本発明の少なくとも１個の特異的突然変異を有するメバロン酸キナーゼをコードし、かつ本発明の特異的修飾メバロン酸キナーゼの任意のＤＮＡ配列と標準条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列、または（ii）本発明の少なくとも一つの特異的突然変異を有するメバロン酸キナーゼをコードするが、遺伝コードの縮重が原因でハイブリダイズせず、本発明の特異的修飾メバロン酸キナーゼの任意のＤＮＡ配列と標準条件でハイブリダイズするＤＮＡ配列と全く同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、または（iii）上記のＤＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列（これは断片であるポリペプチドの活性性質を維持する）を提供することも本発明の目的である。
【００７０】
これに関連してハイブリダイゼーションのための「標準条件」は、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者によって一般に使用され、例えばSambrookら、“Molecular Cloning”, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, ニューヨークに記載されている条件、または好ましくはいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および非ストリンジェントな洗浄条件、またはさらに好ましくは当業者に親しまれ、例えばSambrookら（刊行年なし）に記載されているいわゆるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントな洗浄条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０mMのＮａＣｌ、１５mMクエン酸三ナトリウム）、５０mMリン酸ナトリウム（pH７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μg/ml変性シェアリング処理サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃、一晩インキュベート（例えば１５時間）した後に、約６５℃で０．１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。
【００７１】
本発明の具体的に記載されたＤＮＡ配列に基づいて設計されたＰＣＲプライマーによるいわゆるポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）によって得られるＤＮＡ配列を提供することは、さらに本発明の目的である。そのように得られたＤＮＡ配列は、それらが設計されるもととなりまた匹敵する活性性質を示すＤＮＡ配列と同じ突然変異を少なくとも有するメバロン酸キナーゼをコードすることが了解されている。
【００７２】
本明細書に記載した本発明の様々な態様を相互に組み合わせてもよい。
【００７３】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例証する。
【００７４】
実施例１：多重配列アラインメント
例えばパラメーター：ギャップ作成ペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐマトリックス（デフォルトのパラメータ）を用いたプログラム「ＰＩＬＥＵＰ」（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc.、9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国）またはＢＬＯＳＵＭ交換マトリックスを用いたプログラムClustalW（バージョン１．７、ＥＭＢＬ、ハイデルベルク、ドイツ）で種々のメバロン酸キナーゼの多重アミノ酸配列アラインメント（図１参照）を計算できる。当業者はそのような配列アラインメントを日常的に実施している（例えばChoら、J. Biol. Chem. 276,12573-12578, 2001）。
【００７５】
本発明に関連して同一メバロン酸キナーゼは、図１に示す任意のメバロン酸キナーゼと配列類似性を示しうる。図１は、マウス、ラット、ヒト、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）（ＡＲＡＴＨ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（ＳＣＨＰＯ）、酵母（ＹＥＡＳＴ）、ピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）（ＰＹＲＡＢ）、ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikoshii）（ＰＹＲＨＯ）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（ＰＹＲＦＵ）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）（ＭＥＴＴＨ）、アーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）（ＡＲＣＦＵ）、メタノコッカス・ヤナシイ（Methanococcus jannaschii）（ＭＥＴＪＡ）、エロピルム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）（ＡＥＲＰＥ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＰＡＲＡＣＯＣＣＵＳ）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列についての多重配列アラインメントの例を示し、後者の配列は、例えば以前に名付けられた他の配列の位置が参照されるアミノ酸付番に対する参照としても使用される。さらに、Ｅ６Ｖ突然変異を有する修飾ラットのメバロン酸キナーゼは、上に定義されたような割り当てによる位置６（実際はラットのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置４）で天然に存在するＧｌｕ（「Ｅ」は標準ＩＵＰＡＣ一文字アミノ酸コードを参照している）がＶａｌ（「Ｖ」）に交換されているラットのメバロン酸キナーゼに他ならないものを意味する。本発明の全ての突然変異体／変異体はこのように称されている。
【００７６】
実施例２：メバロン酸キナーゼ活性およびフィードバック阻害剤による阻害の測定
メバロン酸キナーゼ活性を測定するための酵素アッセイは、例えばPopjak(Meth. Enzymol. 15, 393-, 1969)、Gibsonら（Enzyme 41, 47-55, 1989)、Hinsonら（J. Lipid Res. 38, 2216-2223, 1997)、Schulteら（Anal. Biochem. 269, 245-254, 1999)、またはChoら（J. Biol. Chem. 276, 12573-12578, 2001）によって記載されている。基質としてメバロネートを調製するためにＤＬ−メバロン酸ラクトン（FLUKA Chemie AG、ブックス、スイス）１３０ｍｇを０．２ＭのＫＯＨ５．５mlに溶かし、５０℃で１５分間インキュベートした。次にこの溶液に室温（ＲＴ）で０．１ＭのＨＣｌを加えることでpH７．０に調整した。別に言及する場合を除き（実施例３を参照されたい）、アッセイ混合物は、１００mMのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、１mMのＡＴＰ、２mMのＭｇＣ１2、１mMメバロネート、０．５mMホスホエノールピルべート（ＰＥＰ）、０．３２mMのＮＡＤＨ、２０U/mlのピルビン酸キナーゼおよび２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）からなる。アッセイ混合物に入れて阻害剤として試験したＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰを全てSigmaから購入した。精製（Ｈｉｓ6タグ付き）メバロン酸キナーゼを添加した場合、光度計による３４０nmでの測定で、ＮＡＤＨの消費に反映される酵素反応を追跡した。メバロン酸キナーゼ活性１ユニット（１Ｕ）は、毎分メバロネート１μmolのリン酸化を触媒する。
【００７７】
実施例３：酵素アッセイの質の試験
最適なアッセイは、酵素濃度との直線性および時間との直線性のような多数の要求を満たすべきである。さらに本発明に関連してアッセイは、フィードバック阻害剤によるメバロン酸キナーゼの阻害の定量を可能にすべきである。本実施例の実験では、以下のアッセイ条件を使用した：１００mMのＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、０．１２５〜４mMのＡＴＰ、１．１２５〜５mMのＭｇＣｌ2（常にＡＴＰよりも１mM過剰！）、０．２５〜３mMメバロネート、０または４６μMのＦＰＰ、０．１６mMのＮＡＤＨ、０．５mMのＰＥＰ、２０U/mlピルビン酸キナーゼ、２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ、３０℃。種々の量の精製Ｈｉｓ6タグ付きパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼを使用した。
【００７８】
本実施例の実験は、メバロン酸キナーゼ活性アッセイが、実際に時間および酵素（メバロン酸キナーゼ）濃度に対して直線性を有し、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスについての所定の条件下でそれぞれ１mMのＭｇＡＴＰおよびメバロネート濃度がＦＰＰによるフィードバック阻害の信頼性の高い測定を可能にするのに最適でありうることを示している。
【００７９】
実施例４：フィードバック耐性突然変異体を得るためのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの突然変異誘発
ＥｃｏＲＩ制限部位、６×Ｈｉｓの配列、およびＡＴＧ開始コドンを有さないメバロン酸キナーゼの５′末端配列片をコードするプライマー、ならびに停止コドンを含めたメバロン酸キナーゼの３′末端配列およびＢａｍＨＩ制限部位を含むプライマーを用いたＰＣＲで、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４由来メバロン酸キナーゼのｃＤＮＡを増幅する。アガロースゲル電気泳動による精製後に、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩでＰＣＲ産物を分解消化し、同酵素で分解消化したｐＱＥ−８０Ｌ（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）に連結する。ｐＱＥ−８０Ｌは、ｌａｃオペレーターエレメントによって調節されるＴ５プロモーターを含み、ｐＱＥ−８０Ｌが同じくコードするｌａｃリプレッサーはこのオペレーターをシス阻害できる。次に、供給業者のプロトコルに従い、このプラスミドを用いてInvitrogen（カールズバッド、カリフォルニア州、米国）の大腸菌ＤＨ５αを形質転換する。大腸菌の対数増殖期にあるＯＤ600nmが０．６の時点で１００μMのＩＰＴＧを添加して、３０℃、４時間、２５０rpmの振盪でＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼを誘導する。QiagenのQIAexpressシステム／試薬を用いたＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーで、Ｈｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼおよびＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異酵素の精製を行う。
【００８０】
Stratagene（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州、米国）のTurbo-Pfu DNAポリメラーゼを用いたいわゆる「二工程ＰＣＲ」で、Ｈｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼの突然変異誘発を実現する。突然変異コドンを含むプライマー（プライマーＭ）およびｐＱＥ−８０Ｌの多重クローニング部位（ＭＣＳ）の５′末端にある配列片に対応するプライマーｐＱＥ−５′を用いて、第一ＰＣＲを実施する。テンプレートはｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ−Ｍｖｋである。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、第二ＰＣＲ反応用のプライマーとして使用する。第二ＰＣＲは、ＭＣＳの３′末端配列片を包含するプライマーｐＱＥ−３′およびテンプレートとして野生型ｐＱＥ−８０Ｌ−Ｈｉｓ−Ｍｖｋも含む。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで分解消化し、それを用いてＨｉｓ−ＭｖｋをｐＱＥ−８０Ｌにサブクローニングする。最後に、分解消化後の断片をアガロース電気泳動で精製し、同制限酵素で線状にしたｐＱＥ−８０Ｌに連結する。
【００８１】
実施例５：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの突然変異体のフィードバック耐性
メバロネートを実施例２に記載したように調製した。アッセイ混合物は、１００mMのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4（pH７．０）、１mMのＡＴＰ、１mMメバロネート、２mMのＭｇＣｌ2、０．５mMホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、０．３２mMのＮＡＤＨ、２０U/mlピルビン酸キナーゼおよび２７U/ml乳酸デヒドロゲナーゼ（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）からなる。アッセイ混合物に入れて阻害剤として試験したＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰを全てシグマから購入した。メバロン酸キナーゼ突然変異体を用いて実施した阻害アッセイに９２μMのＦＰＰまたは１７．６μMのＧＧＰＰを使用した。ＦＰＰ、ＧＧＰＰ、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰおよびＧＰＰによる阻害を比べるために、１３８μMのこれらの中間体を加えた（実施例９）。精製（Ｈｉｓ6タグ付き）メバロン酸キナーゼの添加時に、３４０nmでの光度計測定によって、ＮＡＤＨの消費に反映される酵素反応を追跡した。
【００８２】
フィードバック耐性（％）を以下のように計算する：ａおよびｂは、フィードバック阻害剤（この場合ＦＰＰ）の非存在下および存在下でそれぞれ野生型酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であり、ｃおよびｄは、同フィードバック阻害剤の非存在下および存在下でそれぞれ突然変異酵素から測定されたメバロン酸キナーゼ活性であるとき、フィードバック耐性（％）は以下となる：
耐性（％）＝１００・（（ｄ／ｃ）−（ｂ／ａ））／（１−（ｂ／ａ））
【００８３】
【表１】
【００８４】
これらの突然変異がメバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に影響を有することは意外である。以前、ヒトのメバロン酸キナーゼの残基１３３から残基１５６までの保存された疎水性ストレッチは、イソプレノイドの結合の有望な候補と提案された（Riouら、Gene 148, 293-297,1994; Houtenら、Biochim. Biophys. Acta 1529, 19-32, 2000）。しかし、上記の突然変異のどれもパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの対応するストレッチ（残基１３７〜１６０）に局在していない。
【００８５】
かなり多数の突然変異がメバロン酸キナーゼ活性を低下させるか、または破壊することさえあり、かくしてヒト疾患であるメバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群を引き起こすと提案された（例えばＫ１３Ｘ、Ｈ２０Ｐ、Ｈ２０Ｎ、Ｌ３９Ｐ、Ｗ６２Ｘ、Ｓ１３５Ｌ、Ａ１４８Ｔ、Ｙ１４９Ｘ、Ｓ１５０Ｌ、Ｐ１６５Ｌ、Ｐ１６７Ｌ、Ｇ２０２Ｒ、Ｔ２０９Ａ、Ｒ２１５Ｑ、Ｔ２４３Ｉ、Ｌ２６４Ｆ、Ｌ２６５Ｐ、Ｉ２６８Ｔ、Ｓ２７２Ｆ、Ｒ２７７Ｃ、Ｎ３０１Ｔ、Ｇ３０９Ｓ、Ｖ３１０Ｍ、Ｇ３２６Ｒ、Ａ３３４Ｔ、Ｖ３７７Ｉ、およびＲ３８８Ｘ；全てヒトのメバロン酸キナーゼにおける突然変異；Houtenら、Eur. J. Hum. Genet. 9, 253-259, 2001; Cuissetら、Eur. J. Hum. Genet. 9, 260-266, 2001）。これらのうちわずか二つ（すなわちＰ１６５ＬおよびＲ２１５Ｑ）が、フィードバック耐性に影響を有することが示されたパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの残基（すなわちそれぞれ残基１６９および２０４）とのアミノ酸配列アラインメント内の位置に対応する残基に生じている。しかし、ヒトのメバロン酸キナーゼにおける上に記載された突然変異は、フィードバック耐性に作用を有することが示されておらず、むしろ酵素の（比）活性に負の影響を与えると示唆された。
【００８６】
実施例６：フィードバック阻害に対する酵素の耐性に影響を有することが以前に同定されたアミノ酸残基／位置でのパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの飽和突然変異誘発
飽和突然変異誘発に供されたコドンがランダム化配列から作られる方法で突然変異誘発プライマーを合成した以外は、突然変異誘発について上に記載したのと同じ方法で、飽和突然変異誘発を行った。
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
【００８９】
【００９０】
実施例７：フィードバック阻害耐性メバロン酸キナーゼを用いたイソプレノイド化合物であるコエンザイムＱ１０の産生の改善
メバロン酸キナーゼのフィードバック阻害に影響する突然変異のインビボ作用を試験するために、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスにおいて複製可能な広範囲の宿主に対応するベクターにクローニングした機能的メバロン酸オペロンに、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｋ９３Ｅを導入した。イソプレノイド化合物であるコエンザイムＱ１０の産生を、Ｋ９３Ｅ突然変異の存在または非存在のみが異なるＰ．ゼアキサンチニファシエンスの二つの組換え株で直接比較した。
【００９１】
プラスミド構築
図２にプラスミドの構築を図示する。クローニングの詳細は以下のとおりであった。大腸菌株をＬＢ培地（Becton Dickinson、スパークス、メリーランド州、米国）で３７℃で増殖させた。組換え大腸菌株中にプラスミドを維持するために、培地にアンピシリン（１００μg/ml）および／またはカナマイシン（実験に応じて２５〜５０μg/ml）を加えた。固体培地には寒天（終濃度１．５％）を加えた。液体培養をロータリーシェーカーを用いて２００rpmで増殖させた。
【００９２】
プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔ（図２）は、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ−２のＳａｃＩ部位とＮｓｉＩ部位の間に挿入されたＰ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来メバロン酸オペロンをそのプロモーター領域込みで含む（Kovachら、Gene 166, 175-176,1995）。クローニングされたメバロン酸オペロンは、ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＪ４３１６９６を有する配列のヌクレオチド２４６９〜９００１の配列に対応する。ＳａｃＩ部位とメバロン酸オペロン配列との間に短いリンカー配列があり、その配列はプラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）から得られたものであり、ＳａｃＩ部位からＰＣＲフラグメント挿入部位までの配列に対応する。アクセッション番号ＡＪ４３１６９６を有する配列は、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３３３５）由来であり、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来ではないことに注意すべきである。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ ２１５８８株とＲ１１４株との間のメバロン酸オペロン配列の唯一の差異は、Ｒ１１４株ではｍｖｋ遺伝子に突然変異が存在することである。この突然変異の結果、メバロン酸キナーゼにおけるアラニンからバリンへのアミノ酸２６５の変化（Ａ２６５Ｖ）が生じる。ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔにおけるメバロン酸オペロンがＡＴＣＣ２１５８８由来であることから、これは突然変異を含まず、よってｍｖｋのコドン２６５はＧＣＣである（そしてアクセッション番号ＡＪ４３１６９６におけるようなＧＴＣではない）。
【００９３】
ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−ｗｔに類似しているがＲ１１４株由来ｍｖｋ遺伝子を有するプラスミドも構築し、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４と名付けた。ｃｒｔＥプロモーター領域制御下のＰ．ゼアキサンチニファシエンスＡＴＣＣ２１５８８株由来ｄｄｓＡ遺伝子を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４のＥｃｌ１３６ＩＩとＳｐｅＩ部位との間に導入することによって、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtを得た（図２）。
【００９４】
最終工程は、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtと同一であるがｍｖｋ遺伝子にＫ９３Ｅ突然変異を含むプラスミドを創造することであった。ＸｍａＩ−ＳｐｅＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ＋ベクター（Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州、米国）に３１６６ｂｐのＸｍａＩ−ＳｐｅＩ断片をサブクローニングすることによってプラスミドｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄ（図２）を構築した。プラスミドｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄは、メバロン酸オペロンの３′末端に突然変異ｍｖｋ遺伝子を導入するために便利で独特の制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｍａＩおよびＡｓｃＩを有する。プラスミドｐＱＥ−８０Ｌ−ｍｖｋ−Ｋ９３ＥをＸｍａＩおよびＡｓｃＩで切断した。Ｋ９３Ｅ突然変異を含めたｍｖｋの大部分を有する１ｋｂの断片を、ｐＢｌｕ２ＳＰ−ｍｖｋ−ｍｖｄをＸｍａＩ−ＡｓｃＩで切断した主鎖に連結させ、ｐＢｌｕ２ＫＳｐ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ−ｍｖｄを得た。ｍｖｋにＫ９３Ｅ突然変異を有する完全長メバロン酸オペロンを再構成するために、ｐＢｌｕ２ＫＳｐ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ−ｍｖｄをＸｍａＩおよびＳｐｅＩで切断し、３１６６ｂｐの断片を、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtからの８．１８ｋｂのＸｍａＩ−ＳｐｅＩ断片と連結させ、ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtを得た。このプラスミドにおけるｍｖｋ遺伝子のコドン２６５はＧＴＣである。それは、ｐＱＥ−８０Ｌ−ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅのｍｖｋ遺伝子がＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３３３５）に由来するからである。
【００９５】
まとめると、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−Ｒ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtおよびｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtは、後者のプラスミドにＫ９３Ｅ突然変異が存在することを除き同一である。
【００９６】
組換えＰ．ゼアキサンチニファシエンス株の構築
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンス株を２８℃で増殖させた。Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスに使用した培地の組成を下に記載する。フラスコに増殖させたＰ．ゼアキサンチニファシエンスの液体培養を、他に明記しない限りロータリーシェーカーで２００rpmで振盪した。固体培地には寒天（終濃度２％）を加えた。培地をオートクレーブで滅菌した場合、グルコースを（濃縮原液として）滅菌後に加えて所望の終濃度にした。Ｆ培地は、トリプトン１０ｇ；酵母エキス１０ｇ；ＮａＣｌを３０ｇ；Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを１０ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏを５ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ろ過またはオートクレーブで滅菌する前にpHを７．０に調整する。培地３６２Ｆ／２は、Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを３３ｇ；酵母エキス１０ｇ；トリプトン１０ｇ；ＮａＣｌを５ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを２．５ｇを含む（蒸留水１ｌあたり）。ろ過またはオートクレーブで滅菌する前に培地のpHを７．４に調整する。滅菌後に、微量元素溶液、ＮＫＰ溶液およびＣａＦｅ溶液をそれぞれ２．５ml加える。後者の三つの溶液をろ過滅菌する。微量元素溶液は、（ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏを８０ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを６ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏを２ｇ；ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏを０．２ｇ；ＥＤＴＡを６ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ＮＫＰ溶液は、Ｋ2ＨＰＯ4を２５０ｇおよび（ＮＨ4）2ＰＯ4を３００ｇ含む（蒸留水１ｌあたり）。ＣａＦｅ溶液は、ＣａＣ１2・２Ｈ2Ｏを７５ｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏを５ｇ；濃ＨＣｌを３．７５ml含む（蒸留水１ｌあたり）。
【００９７】
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株のエレクトロコンピテント細胞の調製およびエレクトロポレーションを以下のように実施した：Ｆ培地１００mlにＰ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４株の定常期培養液１．５mlを植菌し、６６０nmの吸光度が約０．５に達するまで２８℃、２００rpmで増殖させた。４℃、７０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞を回収し、氷冷したＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）１００mlで２回洗浄した。最終的に得られたペレットを氷冷したＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）０．１mlに再懸濁し、細胞を直ちにエレクトロポレーションに使用するか、またはグリセロールを終濃度１５％となるように加えて細胞を５０μlに小分けして−８０℃で保存した。プラスミドＤＮＡ１〜５μlを無塩溶液に加え、氷冷した１mmキュベット中でエレクトロポレーションを１８kV/cmおよび１２９０hmで実施した。パルス長を概して４から５ミリ秒の間とした。Ｆ培地１mlを添加し、細胞を２８℃で１時間インキュベートした。２５〜５０μg/mlカナマイシンを含有するＦ寒天平板に希釈液を広げ、２８℃でインキュベートした。推定上の形質転換体について所望のプラスミドを含むことをＰＣＲ分析によって確認した。
【００９８】
コエンザイムＱ１０産生を評価するための培養条件
Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株およびＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株の流加培養におけるコエンザイムＱ１０の産生を試験した。凍結細胞懸濁液（２５％グリセロール貯蔵物として−８０℃で保存した）から全ての培養を開始した。３６２Ｆ／２培地がそれぞれ２００ml入った２ｌ容のバッフル付き振盪フラスコ２本に流加発酵用の前培養を調製した。解凍した細胞懸濁液２mlを各フラスコへの植菌として使用した。前培養の初発pHは７．２であった。前培養を２５０rpmで２８時間、２８℃で振盪しながらインキュベートした後、６６０nmにおける吸光度（ＯＤ660）は、使用した株に応じて吸光度単位１４から２２の間であった。以下の組成：Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏが２５ｇ；酵母エキス（Ｔａｓｔｏｎｅ９００）１７ｇ；ＮａＣｌが４．０ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏが６．２５ｇ；（ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2・６Ｈ2Ｏが０．５ｇ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏが０．０３８ｇ；ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏが０．０１３ｇ；ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏが０．００１ｇ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏが０．４７ｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏが０．０６２ｇ；ナイアシン０．０１ｇ；ＮＨ4Ｃｌが０．５ｇ；消泡剤０．１ml；ＫＰ溶液３．５mlを有する（蒸留水１ｌあたり）培地を入れたＢｉｏｓｔａｔ ＥＤバイオリアクター（B. Braun Biotech International、メルスンゲン、ドイツ）で本培養を行った。ＫＰ溶液の組成は、Ｋ2ＨＰＯ4が２５０ｇ；ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏが２００ｇ；（ＮＨ4）2ＨＰＯ4が１００ｇである（蒸留水１ｌあたり）。プラスミド保有株にはカナマイシン（終濃度５０mg/l）を培地に加えた。全ての工程に使用した流加溶液は、以下の組成を有した（蒸留水１ｌあたり）：Ｄ−グルコース・Ｈ2Ｏを５５０ｇ；ＫＰ溶液１８．２５ml。バイオリアクターの（植菌後の）初発体積は８．０Ｌであった。バイオリアクターに４００mlを加えた場合に初発ＯＤ660値が０．５に達するように、必要に応じて前培養を蒸留水で希釈した。発酵条件を以下のように自動制御した：２８℃、pH７．２（２８％ＮＨ4ＯＨを添加してpH調整）、最低４０％相対値に溶存酸素を制御（撹拌を伴う工程流で）、最小撹拌速度３００rpm、および通気速度１v.v.m.（終体積に対して）。流加溶液を加えずに約２０時間これらの条件で培養を進めた（回分培養期）。この後、撹拌速度の減少、塩基消費の中止、pHの激しい増加およびＣＯ2産生の減少は、初回のグルコースが消費し尽くされたことを示したため、流加を開始した。標準的な流加プロフィルを以下のように規定した（流加開始時点から）：１７時間に５０ｇ／ｈから８０ｇ／ｈへの勾配、８０ｇ／ｈで７時間継続、１１時間かけて５５ｇ／ｈまで下方勾配、発酵の残りの時間５５ｇ／ｈで継続（総発酵時間＝７０時間）。本培養の終体積は約１０ｌであった。
【００９９】
分析法
試薬
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）は、高純度（puriss., p.a.）等級またはＨＰＬＣ等級であり、Fluka（スイス）から入手した。コエンザイムＱ１０をFlukaから購入した。メタノール（Lichrosolv）をＭｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツから購入した。カロテノイド標準をChemistry Research Department、Roche Vitamins Ltd.、スイスから入手した。
【０１００】
試料の調製と抽出
総培養液４００μlを１５ml容のディスポーザブルポリプロピレン遠心管に入れた。安定化抽出溶液（ＤＭＳＯ／ＴＨＦの１：１（v/v）混液に溶かした０．５g/lのＢＨＴ）４mlを加え、試料を実験用シェーカー（ＩＫＡ、ドイツ）で２０分間混合して抽出を促進した。最後に、試料を遠心分離し、上清を褐色ガラス製バイアルに移し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析に供した。
【０１０１】
ＨＰＬＣ
ユビキノンとそれに対応するヒドロキノンを同時に決定するための逆相ＨＰＬＣ法を開発した。この方法は、カロテノイドであるゼアキサンチン、フィトエン、β−クリプトキサンチン、β−カロテンおよびリコペンをコエンザイムＱ１０からはっきりと分離することができる。温度制御オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムでクロマトグラフィーを実施した。本方法のパラメーターは次の通りであった：
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
計算、選択性、直線性、検出限界および再現性
ピーク面積に基づいて計算を行った。関連する基準化合物の標準溶液をインジェクトすることによって方法の選択性を検証した。標的化合物（コエンザイムＱ１０およびユビキノール１０）は完全に分離され、干渉を示さなかった。抽出溶液（上記）に溶かしたコエンザイムＱ１０の希釈系列を調製し、分析した。直線範囲は、５mg/lから５０mg/lにみられた。相関係数は０．９９９９であった。本ＨＰＬＣ法によるコエンザイムＱ１０の検出限界を４mg/lと決定した。抽出法を含めた本方法の再現性をチェックした。個別の１０個の試料調製物を比較した。相対標準偏差を４％と決定した。
【０１０５】
コエンザイムＱ１０産生の結果
上記の流加培養の条件で、Ｐ．ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株によって産生されたコエンザイムＱ１０の終濃度は、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株で観察されたものよりも３４％高かった。この差は、二つの株の増殖の差を単に原因とできなかった。それは、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株がＲ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株に比べて１２％高いコエンザイムＱ１０の比産生（コエンザイムＱ１０のユニット／乾燥細胞質量（ｇ）／時間）も示したからである。さらに、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株は、Ｒ１１４／ｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐＲ１１４−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwt株に比べて培養液中のメバロネート蓄積の３１％の減少も示した。この比較から、プラスミドｐＢＢＲ−Ｋ−ｍｅｖ−ｏｐ−（ｍｖｋ−Ｋ９３Ｅ）−ＰｃｒｔＥ−ｄｄｓＡwtにおけるＫ９３Ｅ突然変異がコエンザイムＱ１０の産生向上に直接寄与していることが示された。
【０１０６】
実施例８：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼの溶解性に及ぼすＩ１７Ｔ突然変異の作用
ヒトのメバロン酸キナーゼでは、突然変異体Ｅ１９Ａ、Ｅ１９ＱおよびＨ２０Ａは大腸菌形質転換体をＩＰＴＧで誘導した後に完全に不溶性であることが示された（PotterおよびMiziorko、J. Biol. Chem. 272, 25449-25454,1997）。パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４のＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ（配列番号１５）も、特にかなり高いイオン強度（例えば５０mMのＮａＨ2ＰＯ4（pH８．０）、３００mMのＮａＣｌ、２５０mMイミダゾール）を有する緩衝溶液中で凝集／沈殿する顕著な傾向を示した。意外なことに、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスＲ１１４のＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔは同条件で完全に可溶性で安定であったため、この突然変異酵素は可溶性メバロン酸キナーゼを必要とする用途にずっとよく適している。
【０１０７】
実施例９：経路の種々の下流産物によるメバロン酸キナーゼのフィードバック阻害
種々のメバロン酸キナーゼがメバロン酸経路の以下の下流産物によるフィードバック阻害に感受性であると以前に報告された：ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＧＰＰ、フィチル−ＰＰ、ファルネソール、ドリコールリン酸。１３８μMのＧＧＰＰ、ＦＰＰ、ＧＰＰ、ＩＰＰ、またはＤＭＡＰＰで、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼはそれぞれ９８％、８０．１％、１８．６％、１６．３％および１４．７％に阻害された。ＦＰＰ（９２μM）またはＧＧＰＰ（１７．６μM）によるフィードバック阻害に対するパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２Ｓの耐性は、それぞれ８３％および９２％であった。
【０１０８】
実施例１０：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼと同一であるメバロン酸キナーゼにおける対応する残基の同定
配列アラインメントプログラムＧＡＰ（GCG Wisconsin Package、バージョン１０．２、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road、サンディエゴ、CA92121-3752、米国；ギャップ作成ペナルティ８；ギャップ伸長ペナルティ２）を用いて、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の特異的アミノ酸位置に対応する以下の残基を同定した：
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の例には、以下のアミノ酸配列（配列番号１〜１５および３０）があるが、それらに限定されるわけではない。非修飾メバロン酸キナーゼ（配列番号１〜１４および３０）をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１６〜２９および３１に示す。
【０１１１】
配列番号１：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号２：ヒトのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ０３４２６）。
配列番号３：マウスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｒ００８）。
配列番号４：ラットのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ１７２５６）。
配列番号５：シロイヌナズナのメバロン酸キナーゼ のアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ４６０８６）。
配列番号６：酵母のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｐ０７２７７）。
配列番号７：シゾサッカロミセス・ポンベのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ０９７８０）。
配列番号８：ピロコッカス・アビシのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｖ１８７）。
配列番号９：ピロコッカス・ホリコシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５９２９１）。
配列番号１０：ピロコッカス・フリオサスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ８Ｕ０Ｆ３）。
配列番号１１：メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカムのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５０５５９）。
配列番号１２：アーケオグロブス・フルギダスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｏ２７９９５）。
配列番号１３：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５８４８７）。
配列番号１３：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ５８４８７）。
配列番号１４：エロピルム・ペルニクスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列（Swiss-Protアクセッション番号Ｑ９Ｙ９４６）。
配列番号１５：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号１６：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列。
配列番号１７：ヒトのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｍ８８４６８）。
配列番号１８：マウスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＦ１３７５９８）。
配列番号１９：ラットのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｍ２９４７２）。
配列番号２０：シロイヌナズナのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｘ７７７９３）。
配列番号２１：酵母のメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｘ０６１１４）。
配列番号２２：シゾサッカロミセス・ポンベのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＢ０００５４１）。
配列番号２３：ピロコッカス・アビシのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＪ２４８２８４）。
配列番号２４：ピロコッカス・ホリコシイのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＢ００９５１５；逆方向）。
配列番号２５：ピロコッカス・フリオサスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＥ０１０２６３；逆方向）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６：メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカムのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｕ４７１３４）。
配列番号２７：アーケオグロブス・フルギダスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＥ０００９４６；逆方向）。
配列番号２８：メタノコッカス・ヤナシイのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号Ｕ６７５５１）。
配列番号２９：エロピルム・ペルニクスのメバロン酸キナーゼのＤＮＡ配列（Genbankアクセッション番号ＡＰ００００６４）。
配列番号３０：ファフィア・ロドチマＡＴＣＣ９６５９４のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列。
配列番号３１：ファフィア・ロドチマＡＴＣＣ９６５９４のメバロン酸キナーゼの遺伝子（ＤＮＡ）配列。メバロン酸キナーゼ遺伝子は、４個のイントロンおよび５個のエキソンからなる。
エキソン１：１０２１〜１１２４
イントロン１：１１２５〜１６３０
エキソン２：１６３１〜１９５６
イントロン２：１９５７〜２０５１
エキソン３：２０５２〜２３６６
イントロン３：２３６７〜２４４６
エキソン４：２４４７〜２６５１
イントロン４：２６５２〜２７３２
エキソン５：２７３３〜３１８８
ポリＡ部位：３２８４
配列番号３２：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７ＴのＤＮＡ配列。
配列番号３３：パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのＨｉｓ6タグ付きメバロン酸キナーゼ突然変異体Ｉ１７Ｔ／Ｇ４７Ｄ／Ｋ９３Ｅ／Ｐ１３２ＳのＤＮＡ配列。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】プログラムＣｌｕｓｔａｌＷで計算したマウス、ラット、ヒト、酵母、シロイヌナズナ（ＡＲＡＴＨ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＳＣＨＰＯ）、ピロコッカス・アビシ（ＰＹＲＡＢ）、ピロコッカス・ホリコシイ（ＰＹＲＨＯ）、ピロコッカス・フリオサス（ＰＹＲＦＵ）、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（ＭＥＴＴＨ）、アーケオグロブス・フルギダス（ＡＲＣＦＵ）、メタノコッカス・ヤナシイ（ＭＥＴＪＡ）、エロピルム・ペルニクス（ＡＥＲＰＥ）、およびパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（ＰＡＲＡＣＯＣＣＵＳ）由来メバロン酸キナーゼの多重配列アラインメントを示す図である。ナンバーリングは、パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンスのメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列に従った。
【図２】ｐＢＢＲ−Ｋに基づくプラスミド上のメバロン酸オペロンへのＫ９３Ｅメバロン酸キナーゼ突然変異の導入を示す図である。詳細については本文参照。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィードバック阻害に対して、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減した感受性を示す修飾メバロン酸キナーゼであって、
（ｉ）該対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、該修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列が少なくとも１個の突然変異を含み、かつ
（ii）該少なくとも１個の突然変異が、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する、修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項２】
フィードバック阻害が、ファルネシル二リン酸またはゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害である、請求項１記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項３】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて少なくとも１０％のフィードバック耐性を示す、請求項１または２記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項４】
突然変異がアミノ酸置換である、請求項１〜３のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項５】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に２個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項６】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に３個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項７】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に４個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項８】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に１個の置換を含み、該置換が配列番号１に示す配列のアミノ酸位置１７に対応するアミノ酸位置に存在する、請求項１〜７のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項９】
配列番号１に示す配列の位置１７に対応するアミノ酸位置に存在する置換が、イソロイシンからトレオニンへの交換からなる、請求項８記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項１０】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および３０に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３２および３３のヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載のポリヌクレオチドを含む、ベクターまたはプラスミド。
【請求項１４】
少なくとも１個のマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１３記載のベクターまたはプラスミド。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１６】
大腸菌（E.coli）またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）またはロドバクター（Rhodobacter）またはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisae）の細胞である、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）適切な培地中で請求項１５または１６記載の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）場合により該培地からイソプレノイド化合物を分離すること
を含む、イソプレノイド化合物を製造するための方法。
【請求項１８】
イソプレノイド化合物がコエンザイムＱ１０である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）適切な培地中で請求項１５または１６記載の宿主細胞の集団を培養すること；および
（ｂ）場合により該細胞または該培地から修飾メバロン酸キナーゼを回収すること
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼを産生するための方法。
【請求項２０】
（ａ）フィードバック阻害に感受性を示す第一メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチド配列に１個または複数の突然変異を導入して、突然変異ポリヌクレオチド配列が、該第一メバロン酸キナーゼに比べた場合に少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む第二メバロン酸キナーゼをコードするようにする工程（ここで、該少なくとも１個のアミノ酸突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する）；
（ｃ）該突然変異ポリヌクレオチドを場合によりベクターまたはプラスミドに挿入する工程；
（ｄ）該ポリヌクレオチドまたは該ベクターまたは該プラスミドを適切な宿主細胞に導入する工程；および
（ｅ）該宿主細胞を修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で培養する工程
を含む、フィードバック阻害に対して低減した感受性を有するメバロン酸キナーゼを調製するための方法。
【請求項２１】
メバロン酸キナーゼの活性減少に関連する障害の処置用医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
メバロン酸キナーゼの活性減少に関連する障害が、メバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
生物学的液体中のメバロネート濃度を決定するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
イソプレノイド化合物の産生を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１】
フィードバック阻害に対して、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて低減した感受性を示す修飾メバロン酸キナーゼであって、
（ｉ）該対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に、該修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列が少なくとも１個の突然変異を含み、かつ
（ii）該少なくとも１個の突然変異が、配列番号１に示すパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）のメバロン酸キナーゼのアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する、修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項２】
フィードバック阻害が、ファルネシル二リン酸またはゲラニルゲラニル二リン酸によるフィードバック阻害である、請求項１記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項３】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼに比べて少なくとも１０％のフィードバック耐性を示す、請求項１または２記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項４】
突然変異がアミノ酸置換である、請求項１〜３のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項５】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に２個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項６】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に３個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項７】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に４個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項８】
修飾メバロン酸キナーゼが、対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列と比べた場合に１個の置換を含み、該置換が配列番号１に示す配列のアミノ酸位置１７に対応するアミノ酸位置に存在する、請求項１〜７のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項９】
配列番号１に示す配列の位置１７に対応するアミノ酸位置に存在する置換が、イソロイシンからトレオニンへの交換からなる、請求項８記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項１０】
対応する非修飾メバロン酸キナーゼのアミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および３０に示すアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３２および３３のヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載のポリヌクレオチドを含む、ベクターまたはプラスミド。
【請求項１４】
少なくとも１個のマーカー遺伝子をさらに含む、請求項１３記載のベクターまたはプラスミド。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項１６】
大腸菌（E.coli）またはパラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス（Paracoccus zeaxanthinifaciens）またはロドバクター（Rhodobacter）またはサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisae）の細胞である、請求項１５記載の宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）適切な培地中で請求項１５または１６記載の宿主細胞を培養すること；および
（ｂ）場合により該培地からイソプレノイド化合物を分離すること
を含む、イソプレノイド化合物を製造するための方法。
【請求項１８】
イソプレノイド化合物がコエンザイムＱ１０である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）適切な培地中で請求項１５または１６記載の宿主細胞の集団を培養すること；および
（ｂ）場合により該細胞または該培地から修飾メバロン酸キナーゼを回収すること
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼを産生するための方法。
【請求項２０】
（ａ）フィードバック阻害に感受性を示す第一メバロン酸キナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチド配列に１個または複数の突然変異を導入して、突然変異ポリヌクレオチド配列が、該第一メバロン酸キナーゼに比べた場合に少なくとも１個のアミノ酸突然変異を含む第二メバロン酸キナーゼをコードするようにする工程（ここで、該少なくとも１個のアミノ酸突然変異は、配列番号１に示すアミノ酸配列の位置１７、４７、９３、９４、１３２、１６７、１６９、２０４、および２６６に対応するアミノ酸位置からなる群より選択される１個または複数のアミノ酸位置に存在する）；
（ｃ）該突然変異ポリヌクレオチドを場合によりベクターまたはプラスミドに挿入する工程；
（ｄ）該ポリヌクレオチドまたは該ベクターまたは該プラスミドを適切な宿主細胞に導入する工程；および
（ｅ）該宿主細胞を修飾メバロン酸キナーゼの発現を可能にする条件で培養する工程
を含む、フィードバック阻害に対して低減した感受性を有するメバロン酸キナーゼを調製するための方法。
【請求項２１】
メバロン酸キナーゼの活性減少に関連する障害の処置用医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
メバロン酸キナーゼの活性減少に関連する障害が、メバロン酸尿症および高免疫グロブリン血症Ｄおよび周期熱症候群からなる群より選択される、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
生物学的液体中のメバロネート濃度を決定するための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２４】
イソプレノイド化合物の産生を増加させるための、請求項１〜１０のいずれか１項記載の修飾メバロン酸キナーゼまたは請求項１１もしくは１２記載のポリヌクレオチドの使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００７−５２３６１２（Ｐ２００７−５２３６１２Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５６２２（Ｐ２００６−５１５６２２）
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００４／０００３５３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１２１４
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００４／０００３５３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１２１４
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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