プロサイモシンαの機能抑制用組成物を含む抗癌剤、およびプロサイモシンα遺伝子の発現抑制用組成物に含有される核酸
【課題】前立腺癌の治療を可能とする新たな抗癌剤を提供すること。また、簡便に前立腺癌の診断を可能とする前立腺癌細胞の検定方法を提供すること
【解決手段】本発明にかかる抗癌剤は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する。機能抑制用組成物として、特に、プロサイモシンαの発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子としてＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であることが好ましい。当該核酸は、少なくとも２重鎖領域を有し、２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、所定規則に従う配列（規定配列）と相同な塩基配列からなり、他方の鎖が、当該規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる。また、プロサイモシンα遺伝子の発現レベルを調べることにより、前立腺癌の進行度合いを判定することができる。
【解決手段】本発明にかかる抗癌剤は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する。機能抑制用組成物として、特に、プロサイモシンαの発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子としてＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であることが好ましい。当該核酸は、少なくとも２重鎖領域を有し、２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、所定規則に従う配列（規定配列）と相同な塩基配列からなり、他方の鎖が、当該規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる。また、プロサイモシンα遺伝子の発現レベルを調べることにより、前立腺癌の進行度合いを判定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を含む抗癌剤、およびプロサイモシンα遺伝子の発現抑制用組成物に含有される核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、アメリカにおける男性の最も一般的な悪性疾患である（例えば、非特許文献１参照）。日本における前立腺癌の発生率および死亡率は、アメリカに比べてかなり低いものの、急速に増加している（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
前立腺癌は、その発生および進行のメカニズムが解明されていないが、前立腺癌患者における生物学的不均一性や、進行度および死亡率の多様性（具体的には、何故非常に進行の早い前立腺癌患者とそうでない患者とがいるのか等）から、前立腺癌の発生や進行に多くの因子が関与していると考えられている（例えば、非特許文献３〜５参照）。そのような因子を一つずつ同定していくことは、前立腺癌の診断方法や治療方法の開発に非常に重要である。
【０００４】
一般的に、前立腺癌の発生や進行に関与する因子として、年齢、遺伝および環境／食事等といった要素の組み合わせが指摘されている。中でも、アンドロゲンが前立腺の成長および分化において重要な役割を果たすことから、前立腺癌とアンドロゲンとの関係について多くの研究がなされてきた。その結果、前立腺腫瘍の進行が、循環性のアンドロゲンであるテストステロンやジヒドロテストステロンのレベルの上昇に関連していることが明らかにされた（例えば、非特許文献６参照）。また、前立腺組織の上皮内に限定され、細胞異型と腺細胞の多層化によって診断される前立腺上皮内腫瘍（prostatic intraepithelial neoplasm：ＰＩＮ）が、前立腺癌の前段階にある病巣として注目されており、実際にＰＩＮから前立腺癌への進行も報告された例もある（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
前立腺癌の診断には、通常、腫瘍マーカである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）や前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）を用いた診断方法（具体的には、これらの血清中レベルの測定）や直腸診等が用いられ、診断結果は複数のステージ（病期）に分類される。例えば、Gleasonスコアと組み合わせた血清ＰＳＡレベルの判定は、前立腺癌の診断（病期分類）に有効である。
【０００６】
前立腺癌の治療には、前立腺全摘術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法が用いられる。これらの方法は、単独で診断／治療に用いられることもあるし、組み合わせて用いられることもある。
【０００７】
最近、これらの定法以外に、前立腺癌の診断や治療等への利用が期待される核酸等も開示されている（例えば、特許文献２および特許文献３参照）。
【非特許文献１】Jemal A,Murray T,Ward E,et al. Cancer statistics,2005.CA Cancer J Clin 2005;55(1):10-30.
【非特許文献２】Hsing AW,Tsao L,Devesa SS.International trends and patterns of prostate cancer incidence and mortality. Int J Cancer 2000;85(1):60-7.
【非特許文献３】Lalani el N,Laniado ME,Abel PD. Molecular and cellular biology of prostate cancer.Cancer Metastasis Rev 1997;16(1-2):29-66.
【非特許文献４】Bonkhoff H,Remberger K.Morphogenetic concepts of normal and abnormal growth in the human prostate. Virchows Arch 1998;433(3):195-202.
【非特許文献５】Roudier MP,True LD,Higano CS,et al.Phenotypic heterogeneity of end-stage prostate carcinoma metastatic to bone. Hum Pathol 2003;34(7):646-53.
【非特許文献６】Elizabeth A.Platz et al.,&Edward Giovannucci,Epidemiology of and Risk Factor for Prostate Cancer,Management of Prostate Cancer21(Eric A Klein,ed.2000)
【特許文献１】特開２００４−３１５４８０号
【特許文献２】特表２００２−５１８０４８号
【特許文献３】特表２００４−５３０４１３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前立腺癌の治療を可能とする新たな抗癌剤を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、簡便に前立腺癌の診断を可能とする前立腺癌細胞の検定方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、2-Samino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine（ＰｈＩＰ）を投与したラットにおいて、前立腺癌の発生が大豆イソフラボンにより抑制されること、また、大豆イソフラボンは、ラットの前立腺におけるプロサイモシンαの発現を抑制することを見出した（Carcinogenesis,Vol.25,No.3,381-387,March）。プロサイモシンαは、１１１個のアミノ酸で構成された小さな酸性タンパクであり、多岐種類に渡る組織で遍在的に発現する。
【００１０】
発明者らは、前立腺癌におけるプロサイモシンαの役割を明らかにするため鋭意努力した結果、プロサイモシンαの発現レベルと前立腺癌における細胞増殖および浸潤との間に相関があることを明らかにし、本発明の前立腺癌の検定方法を完成するに至った。さらに、前立腺癌由来の培養細胞において、プロサイモシンαの発現をＲＮＡ干渉により抑制することにより、癌細胞の増殖を抑制できることを明らかにし、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制方法や機能抑制方法、及びそれらを用いた前立腺癌の治療方法等を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の各項の通りである。
〔１〕前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤であって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する抗癌剤。
〔２〕前記機能抑制組成物が、プロサイモシンαの発現を抑制することにより前記プロサイモシンαの機能を抑制する、プロサイモシンαの発現抑制用組成物であることを特徴とする第１項記載の抗癌剤。
〔３〕前記発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することのできる核酸を含有することを特徴とする第２項記載の抗癌剤。
〔４〕プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせることにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することを特徴とする第３項記載の抗癌剤。
【００１２】
〔５〕プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、
２重鎖領域を有し、
前記２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸。
〔６〕前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする第５項記載の核酸。
【００１３】
〔７〕前記規則（３）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される１種以上の塩基であることを特徴とする第５または第６項記載の核酸。
〔８〕前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする第５〜第７項のいずれか１項記載の核酸。
【００１４】
〔９〕前記標的遺伝子の規定配列が、さらに下記（５）の規則；
（５） 導入される被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする第５〜第８項のいずれか１項記載の核酸。
【００１５】
〔１０〕２本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする第５〜第９項のいずれか１項記載の核酸。
〔１１〕前記２本鎖のポリヌクレオチドが、前記２重鎖領域の両端に、３’末端が突出したオーバーハング部を有することを特徴とする第１０項記載の核酸。
〔１２〕１本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする第５〜第９項のいずれか１項記載の核酸。
【００１６】
〔１３〕前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号１に項記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号２に項記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする第５〜１２のいずれか１つに項記載の核酸。
ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
〔１４〕前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号３に項記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号４に項記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする第５〜１２のいずれか１つに項記載の核酸。
ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
〔１５〕前記２重鎖領域において、少なくとも前記他方の鎖がＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ構成を有することを特徴とする第５〜第１４項のいずれか１項記載の核酸。
〔１６〕前記他方の鎖の２重鎖領域の３’末端から９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡであることを特徴とする第１５項記載の核酸。
【００１７】
〔１７〕第５〜第１６項のいずれか１項記載の核酸を、プロサイモシンαが発現している細胞に導入し、当該プロサイモシンαの発現を抑制することを特徴とするプロサイモシンαの発現抑制方法。
〔１８〕前立腺癌に由来する癌細胞に、第５〜第１６項のいずれか１項記載の核酸を導入することを特徴とする、癌細胞増殖および浸潤の抑制方法。
〔１９〕前記癌細胞が、ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖｌ、ＤＵｌ４５およびＰＣ３からなる群から選択される癌細胞であることを特徴とする第１８項記載の方法。
【００１８】
〔２０〕ほ乳類被検体から採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、
前記試料中のプロサイモシンαの発現量に基づいて検定を行うことを特徴とする検定方法。
〔２１〕ほ乳類被検体から採取した試料に対し、前立腺癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、
当該試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする前立腺癌診断キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、前立腺癌の治療を可能とする新たな抗癌剤を提供することが可能になった。また、簡便に前立腺癌の診断を可能とする前立腺癌細胞の検定方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
＜１＞本発明にかかる抗癌剤
本発明にかかる前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する。後述の実施例１で示すように前立腺癌の進行とプロサイモシンαの発現量との間には相関関係が見られ、また、後述の実施例２で示すようにプロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制されることから、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制が前立腺癌の治療に有効であることは明らかである。したがって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を含有した薬剤により、前立腺癌の抗癌剤を提供することが可能となる。
【００２３】
ここで、プロサイモシンαの機能抑制用組成物は、癌細胞内でのプロサイモシンαの機能を抑制することができる組成物であれば特に限定されず、例えば、プロサイモシンα遺伝子プロモーターのリプレッサー、あるいはアクチベーター阻害因子などを含有する転写レベルでの発現抑制用組成物やリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含有する翻訳レベルでの発現抑制用組成物、あるいは、抗プロサイモシンα抗体や抗プロサイモシンα機能阻害低分子化合物などを含有するタンパク質レベルでの機能抑制用組成物などを含むが、効果が高く、簡便であるため、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの核酸を含有する発現抑制用組成物であることが好ましく、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの、プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を含有する発現抑制用組成物がさらに好ましい。
【００２４】
これらの核酸は、遺伝子組み換え技術、化学的または酵素的合成等の公知技術を適宜用いることによって合成しうる。かかる核酸は、その名称（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）に関わらず、ＲＮＡから成っていても、ＤＮＡから成っていても、ＲＮＡとＤＮＡの両方から成っていてもよく、天然のヌクレオチドあるいは人工のヌクレオチドのいずれから構成されてもよく、また、これらの核酸の複数種類の混成であってもよい。人工のヌクレオチドとしては、例えば、天然のヌクレオチドの塩基の一部に化学修飾がなされているような核酸アナログでもよい。化学修飾としては、例えば、リン酸結合、リボース、核酸塩基、３’および／または５’末端等の化学修飾が挙げられる。
【００２５】
このようなプロサイモシンαの発現抑制用組成物を含む本発明の抗癌剤は、例えば、薬学的に許容され得る担体に発現抑制用組成物を医学的に有効な量配合して得られる。ここで、「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘ちょう剤、矯味剤、溶解補助剤等が挙げられる。かかる担体により、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、坐剤、およびペッサリー等の形態の抗癌剤が調製される。これらの抗癌剤は、その剤形に従って、経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００２６】
これらの抗癌剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間または当該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なり、投与量は特に限定されず、状況に適宜応じて投与することができる。例えば、注射剤の場合、生理食塩水または注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に発現抑制用組成物を溶解または懸濁することにより製造することができる。この場合、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等の非水性の希釈剤や、懸濁剤または乳濁剤として適宜調製してもよい。このようにして調製された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、一日あたり１〜数回投与することができる。
【００２７】
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸
上述のように、プロサイモシンαの機能抑制用組成物に含有される核酸の構成は特に限定されないが、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であることが好ましい。
【００２８】
ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸は、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖型であってもよく、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）等の１本鎖型であってもよい。ｓｈＲＮＡは、２重鎖領域における一方の鎖の３'末端と、当該２重鎖領域における他方の鎖の５'末端とがループ部で連結して１本鎖を構成するものである。かかるｓｈＲＮＡは、１本鎖ＲＮＡの５'末端または３'末端に、１重鎖の状態で突出したオーバーハング部を有していても良い。このようなｓｈＲＮＡは、ＷＯ０１／４９８４４等、公知の手法に従って設計することができる。
【００２９】
ここで、「ＲＮＡ干渉」とは、元来、標的遺伝子の一部分と相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）が、標的遺伝子の機能を阻害する現象のことであった。しかし、現在では、当該２本鎖ＲＮＡの一部がＤＮＡであっても、標的遺伝子の機能を阻害することができることが明らかになっている。従って、本明細書では一部にＤＮＡを含むものもｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡの概念に含める。
【００３０】
このように、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸は、プロサイモシンαの発現を有意に阻害するものであればヌクレオチドの構成、塩基配列、塩基長等は任意であり、種々公表されている所定のガイドラインに従って任意に設計された核酸を用いることが可能である。ＲＮＡ干渉の効果が高い程、プロサイモシンαの発現が大きく阻害されることから、ＲＮＡ干渉効果の高い核酸であることが好ましい。
【００３１】
特に好適に用いられる核酸は、プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、少なくとも２重鎖領域を有し、前記２重鎖領域における一方の鎖が、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなることを特徴とする。
【００３２】
これらの核酸の、特に２重鎖領域におけるヌクレオチド構成は、ＲＮＡ型、ＤＮＡ型、ハイブリッド型、キメラ型のいずれであってもよい。ここで、「ＲＮＡ型」は、ＲＮＡからなる核酸、「ＤＮＡ型」は、ＤＮＡからなる核酸、「ハイブリッド型」は核酸が２重鎖領域を有するとき、２重鎖領域における一方の鎖がＲＮＡで、もう一方の鎖がＤＮＡから成る核酸、「キメラ型」は、２重鎖領域においてＲＮＡとＤＮＡが同一鎖に含まれている核酸をいう。
【００３３】
このハイブリッド型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されないが、センス鎖がＤＮＡで構成されアンチセンス鎖がＲＮＡで構成された２本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３４】
また、キメラ型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されない。ＲＮＡ干渉に用いられる核酸は、構造上、機能的なアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められることから、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５'末端側の半分、アンチセンス鎖の３'末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。キメラ構造を有する核酸では、被導入体内おける安定性や製造コスト等の点から、ＲＮＡの含量をできるだけ少なくすることが好ましい。そこで、高い標的遺伝子の発現抑制効果を維持しつつＲＮＡ含量を低減可能な核酸について鋭意検討したところ、２重鎖領域において、センス鎖の５’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分、およびアンチセンス鎖の３’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の前記各末端から１１ポリヌクレオチド、好ましくは１０ポリヌクレオチド、さらに好ましくは９ポリヌクレオチドの部分）はＲＮＡで構成されることが望ましく、特に、アンチセンス鎖の３’末端側が当該構成を有することが望ましい。なお、センス鎖のＲＮＡ部分とアンチセンス鎖のＲＮＡ部分とは、必ずしも、その位置が一致して相補的に結合していなくてもよい。
【００３５】
ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の塩基配列は、プロサイモシンα遺伝子から転写される転写産物が有する塩基配列であって、上記規則を満たすものであれば、遺伝子のどの部分でもかまわない。ここで、転写産物は、スプライシング前のｈｎＲＮＡでも、スプライシング後のｍＲＮＡでもよい。
【００３６】
本明細書中では、上記（１）から（４）の規則を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。また、「相補的な配列」とは、水素結合によって結合できる塩基対の並びによって構成される配列である。例えば、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては３つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては２つの水素結合部位が形成される。このため、Ｇ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。上述のように、「相補的な配列」には、これらの天然の塩基によって構成される配列だけでなく、イノシンや塩基アナログなどの人工的な塩基によって構成される配列も含む。従って、相補的な水素結合は、２つあるいは３つに限らず、１つでも４つ以上でも構わない。
【００３７】
また、「規定配列と相同な塩基配列」とは、標的遺伝子配列（又はその一部）に中程度または高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な塩基配列のことであり、規定配列を有する遺伝子に対し、その配列を有するポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉を生じさせることができることが好ましい。
【００３８】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的な条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，２００１に示されているが、例えば、高程度にストリンジェントな条件とは、ニトロセルロースフィルターを用いた場合、５０％ホルムアミド、２〜６×ＳＳＣまたは等価な濃度の塩存在下で、約４２℃以上でのハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。中程度にストリンジェントな条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、２〜６×ＳＳＣまたは等価な濃度の塩存在下で、約３７℃以上でのハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。一般に、ストリンジェンシーが高くなるほど、高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、ホルムアミドの非存在下では、６５ないし８０℃、２ないし６×ＳＳＣ）および／または洗浄（例えば、６８℃、０．２×ＳＳＣ）が行われる。しかし、核酸の解離温度は、例えばその核酸の長さや核酸を構成する各塩基の割合に依存するため、ストリンジェントな条件は、用いる核酸によって、個々に決定されなければならないが、当業者であれば、その条件を容易に決定することが可能である。すなわち、望ましい強さのストリンジェンシーを達成するためには、ハイブリダイゼーション反応と２本鎖の安定性を支配する基本原理を考慮することによって、洗浄温度と洗浄塩濃度が調整されると理解すべきである。
【００３９】
通常、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズする配列は、規定配列と５０〜１００％の相同性を有する。ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲であれば、塩基配列の一部に欠失、置換、挿入などの変異を含んでもよい。なお、許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズムを用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはBLASTsearchなどを好適に用いることができる。
【００４０】
より詳細には、核酸（ポリヌクレオチド）の相同性は、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereuxら、1984、Nucl.Acids Res.12:387）。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、Gribskov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry,1993）により決定され；WoottonおよびFederhen，「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol.266:544-71, 1996も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry,1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul,1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００４１】
規則（３）において、「リッチ」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、規定配列における３'末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよび／またはウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３'末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。
【００４２】
規則（４）について、規定配列の鎖長は、数塩基から転写産物の全長まで、いずれの長さであってもよい。しかし、生物種などの条件により、塩基数があまりに大きすぎる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）が細胞毒性を生じるため、極端に長い核酸は使えない場合がある。規定配列の塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合、哺乳動物由来の細胞においては、３０塩基数以上の鎖長を有するｓｉＲＮＡを導入するとインターフェロン応答が生じるため、ｓｉＲＮＡの塩基数は、３０以下、より好ましくは２８以下である。さらに好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下である。また、下限は、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を取得可能な限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上である。よって、規則（４）において、標的遺伝子の規定配列は塩基数が１３〜２８であることが好ましい。特に、哺乳動物由来の細胞等に導入する場合には、１３〜２８、好ましくは１５〜２３、さらに好ましくは１９〜２１塩基数である。標的遺伝子の規定配列は、かかる上限および下限をふまえた塩基数であることが特に好ましく、最も好ましくは１９塩基である。この１９塩基中、（３）の規則に鑑みると、規定配列の３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基上、特に好ましくは５塩基以上が、Ａ、Ｔおよび／またはＵである。
【００４３】
本発明にかかる核酸において、２重鎖領域の両端は平滑末端であっても、オーバーハング部を有していてもよいが、両端に３’末端が突出したオーバーハング部を有しているのが好ましい。オーバーハング部とは、２重鎖領域の端に存在する、１本鎖の状態で突出する部分である。オーバーハング部は、生物種などにもよるが、塩基数２であることが好ましい。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、例えば、ＴＴあるいはＵＵ等が好適に用いられる。
【００４４】
なお、上記（１）〜（４）の規則は、Ui-Teiらによるガイドライン（Ui-Tei,K.,Naito,Y.,Takahashi,F.,Haraguchi,T.,Ohki-Hamazaki,H.,Juni,A.,Ueda,R.,Saigo,K.の「Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference」,Nucleic Acids Research,2004,Vol.32,No.3,936-948）に基づくものであり、ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４８９３（ＷＯ２００４／０４８５６６）にも詳細に記載されている。
【００４５】
さらに、本発明の核酸において、標的遺伝子の規定配列は、さらに下記（５）の規則：
（５）被導入体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることが好ましい。
【００４６】
言い換えると、（５）の規則は、標的遺伝子と関係のない遺伝子におけるＲＮＡ干渉（これをオフターゲット効果と呼ぶ）を抑制するために、標的遺伝子の上記（１）〜（４）に従う規定配列は、これと同一又は類似の配列が他の遺伝子に含まれていない塩基配列であることが好ましいことを規定したものである。かかる規則を満たす規定配列を選択することにより、標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができ、オフターゲット効果の低いＲＮＡ干渉を実現することが可能となる。規定配列またはその相補配列と同一／類似の配列を検索する方法としては、一般的なホモロジー検索を行うソフトウェア等を用いた方法が挙げられる。
【００４７】
例えば、ＢＬＡＳＴ等を利用して標的遺伝子の規定配列と同一又は類似の配列を他の遺伝子について検索し、当該他の遺伝子に塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が存在するという検索結果が得られた場合には、このような標的遺伝子の規定配列は除外する。それにより、標的遺伝子に対する特異性の高い配列を選別することができる。具体的に、標的遺伝子の規定配列の塩基数が１９である場合には、他の遺伝子にミスマッチが２塩基以下、より好ましくは３塩基以下、さらに好ましくは４塩基以下の類似配列が存在する配列を規定配列から除外することが好ましい。類似性判断の閾値となるミスマッチ数の値の増加に伴って、特異性が高くなる。また、標的遺伝子の規定配列のみならずこれと相補的な配列の両方についても検索を行うことにより、さらに特異性の高い配列が得られる。
【００４８】
便宜上、塩基配列の類似性を判断する基準となるミスマッチ数を相同性で規定し、（５）の規則に従う配列であるかどうか、検索することにより類似性を判断して塩基配列を選別することが好ましい。かかる相同性は適宜設定されるものであり、当業者は、所望により規定配列と８５％以上、８０％以上、７５％以上のように適宜設定することが可能である。ここで、規定配列との相同性を低く設定するほど標的配列と類似する他の遺伝子が存在しないこととなる。
【００４９】
さらに、センス鎖のセンス配列は、上記（１）〜（４）あるいは（１）〜（５）の規則の他、下記（６）の規則に従う標的遺伝子の規定配列に相同な塩基配列を有することが好ましい。
（６）１０塩基以上Ｇ又はＣが連続する配列を含まない。
【００５０】
（６）の規則において、１０塩基以上グアニン及び／またはシトシンが連続するというのは、例えば、グアニンまたはシトシンの一方のみが連続する場合と、グアニンおよびシトシンとが混在する配列となっている場合の双方を含み、具体的には、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣのほか、ＧおよびＣの混合配列であるＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧなども含まれる。
【００５１】
なお、（５）及び（６）については、ＰＣＴ／ＩＢ２００３５／００１６４７明細書に、詳細に記載されている。
【００５２】
標的遺伝子の規定配列は、上記のような塩基配列上の規則だけでなく、これ以外の点に鑑みて適宜選択されてもよい。例えば、上記（１）〜（６）等の規則を満たす規定配列を標的遺伝子から複数選択した後、さらに、当該選択された規定配列の中から、別の条件を付加して配列の選択を行ってもよい。本発明にかかる核酸を設計するための規定配列の検索および選択は、例えば、上記の（１）〜（６）の規則に従う部分を検索可能なプログラムを搭載するコンピュータを用いることにより、効率的な検出および選択が実行可能である。このような核酸の設計により、ＲＮＡ干渉効果の高い核酸分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。
【００５３】
後述の実施例２では、本発明にかかる核酸の一態様として、下記のように配列番号１に示す塩基配列を有するセンス鎖と、配列番号２に示す塩基配列を有するアンチセンス鎖と、から構成された２本鎖ＲＮＡや、配列番号３に示す塩基配列を有するセンス鎖と、配列番号４に示す塩基配列を有するアンチセンス鎖から構成された２本鎖ＲＮＡなどのｓｉＲＮＡを例示する。これらのｓｉＲＮＡでは、１９塩基数のセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るセンス鎖が構成され、１９塩基数のアンチセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るアンチセンス鎖が構成されている。
センス鎖：ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
センス鎖：ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【００５４】
本発明にかかる核酸は、遺伝子組み換え技術（具体的な一例としては、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを２本鎖化するなどの手法）、化学的または酵素的合成等の公知技術を適宜用いることによって製造することができる。
【００５５】
＜３＞プロサイモシンαの発現抑制を利用した細胞増殖および浸潤の抑制方法
本発明にかかるプロサイモシンαの機能抑制方法の一実施形態として、上記＜２＞記載の核酸を、プロサイモシンαを発現している細胞に導入してプロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することにより、プロサイモシンαの機能を抑制することができる。ここで、本発明の発現抑制方法において、「プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制する」とは、プロサイモシンαの生成を減少させることを意味する。通常、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量が減少すれば（図７Ｂ参照）、プロサイモシンαの生成が抑制されるため（図７Ａ参照）、発現抑制のアッセイ系は、ｍＲＮＡのレベルを測定するものであっても良い。すなわち、ｍＲＮＡ量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、プロサイモシンαの発現抑制が実現されているとみなせる。上記＜２＞で述べた核酸を用いる本発明のプロサイモシンαの発現抑制方法によれば、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量を、ほぼ完全に無くすことが可能となり、また、当該核酸を用いれば、プロサイモシンαの発現抑制効果が１０日間程度持続する。
【００５６】
細胞に核酸としてｓｉＲＮＡを導入する方法は、常法に従い、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどで、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に取り込ませることもできる。あるいは、規定配列およびオーバーハング部からなる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、同様の方法によって、細胞内に導入する（ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／４９８４４）こともできる。
【００５７】
本発明にかかるプロサイモシンαの発現抑制方法によれば、プロサイモシンα遺伝子を標的として効率よくＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を用いるため、効率よく、また簡便にプロサイモシンαの発現を抑制することが可能となる。さらに、後述の実施例２で示すように、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制によって前立腺癌細胞の増殖および浸潤を抑制することができる。したがって、この方法を前立腺癌や前立腺上皮内腫瘍の患者に適用することにより、当該疾患の進行を抑制・阻害でき、それらの腫瘍に対する有効な治療方法が得られる。
【００５８】
＜４＞前立腺癌の検定方法
本発明にかかる前立腺癌の検定方法は、採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、前記試料中のプロサイモシンαの発現レベルに基づいて検定を行うことを特徴とする。言い換えれば、プロサイモシンαを前立腺癌の診断用マーカーとして利用する。
【００５９】
後述の実施例１で示すように、前立腺癌の進行とプロサイモシンαの発現量との間には、有意な相関が見られる。例えば、正常な前立腺上皮、前立腺上皮内腫瘍、前立腺癌の各場合について採取した細胞では、プロサイモシンαの発現量が前立腺癌の場合で最も多く、次いで、前立腺上皮内腫瘍の場合が多い（例えば、図２参照）。また、Gleasonパターンが２、３、４、５の各細胞では、パターン５の場合でプロサイモシンαの発現量が最も多く、パターン２に向かって順次発現量が低下する（例えば、図５参照）。したがって、このような相関関係に基づき、プロサイモシンαの発現量を用いることによって前立腺癌の進行度を判定することが可能となる。この方法を前立腺癌の診断に適用することにより、診断精度の向上が図られ、有効かつ簡便な診断が実現可能となる。
【００６０】
例えば、本発明の方法の一態様として、生検で取得した試料に対し、免疫組織化学的分析によりプロサイモシンαの発現量を測定してもよい。具体的には、後述の実施例１で示すように、酵素標識抗体法であるABC法（avidine-biotinylated peroxidase complex法）によりプロサイモシンαの発現量を測定し、当該測定結果に基づいて、前立腺癌の進行度を判定してもよい。この場合、隣接する正常前立腺管腔上皮の発現量と比較し、前立腺癌組織において、プロサイモシンαの発現量が少なければ進行度が低く、発現量が多ければ進行度が高いと判定する。かかる判定は、所定のプロサイモシンα発現量を閾値とし、かかる閾値に基づいて行ってもよい。
【００６１】
さらに、本発明にかかる検定方法は、組織病理学上の分類方法（具体的には、従来の病期分類法やGleasonスコア等）に基づく検定方法や、ＰＳＡおよびＰＡＰに基づく検定方法や、直腸診に基づく検定方法等と併用して用いてもよい。それにより、より精度の高い診断が可能となる。病期分類はJewett Staging systemを用いてもよい。この分類は病期Aは臨床的に前立腺癌と診断されず、前立腺手術においてたまたま組織学的に診断された前立腺に限局する癌を指し,A1は限局性の高分化腺癌、A2は中あるいは低分化腺癌、あるいは複数の病巣を前立腺内に認めるものである。病期Bは前立腺に限局している腺癌で、B0は触診では触れず、PSA高値にて精査され組織学的に診断されるもの、B1は片葉内の単発腫瘍、B2は片葉全体あるいは両葉に存在するものを指す。病期Cは前立腺には留まっているが前立腺被膜は越えているか、精嚢に浸潤するもので、C1は臨床的に被膜外浸潤が診断されたもの、C2は膀胱頸部あるいは尿管の閉塞を来したものを指す。病期Dは転移を有するもので、D0は臨床的には転移を認めないが、血清酸性フォスファターゼの持続的上昇を認め、転移の存在が強く疑われるもの、D1は所属リンパ節転移を有するもの、D2は所属リンパ節以外のリンパ節転移、骨、その他臓器への転移、D3はD2に対する適切な内分泌療法後の再燃したものを指す。またGleason分類はThe Veterans Admionistration Cooperative Urological Research Group (VACURG)による1960年から1975年における患者の解析から生まれた分類である。基本的に低倍率で組織を顕微鏡観察して診断し、前立腺癌をその組織構築と浸潤様式により分類し、それをスコア化してGleason patternとして優位な組織像のスコアと次に優位な組織像のスコアを合計するものである。具体的にはGleason patternは１から５まで５段階に分類され、最も多くの面積を占める組織像をPrimary pattern、次に優位な組織像をsecondary patternとする。GleasonスコアはPrimary patternおよびsecondary patternの合計として示されるがsecondary patternが5%以下ならPrimary patternを２倍する。実例としてPrimary pattern 4, secondary pattern 5の症例のGleasonスコアは9であり、Gleasonスコア 4+5=9と表記する。
【００６２】
このように、本発明にかかる前立腺癌細胞の検定方法によれば、簡便かつ高精度で前立腺癌の診断（具体的には、進行の程度等の診断）が可能となる。前立腺癌は、悪性度の低い初期の小さな腫瘍細胞から悪性度の高い大きな癌に変化していく速度が極めて遅いことから、上記効果を奏する本発明の利用により、前立腺癌の早期発見および早期治療が可能となる。それにより、癌の進行を有効に抑制することが可能となり、癌による死亡率の低下が図られる。
【００６３】
＜５＞前立腺癌診断キット
本発明にかかる前立腺癌診断キットは、当該癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、被検体から採取した試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする。このような前立腺癌診断キットの構成は、上記＜４＞記載の検定方法を実現できる構成であれば特には限定されないが、例えば、プロサイモシンαの発現量の検出手段は、酵素標識抗プロサイモシンα抗体及び／または該酵素の基質であってもよく、あるいは、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量を測定するための試薬、例えばPCRの場合、TAQポリメラーゼ及び／またはプライマーであってもよい。かかるキットは、このような検出手段以外に、適宜、バッファー等の試薬類を含んで構成される。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。以下においては、プロサイモシンαを「ＰＴＭＡ」と記すことがある。
【００６５】
実施例１：前立腺癌の進行とプロサイモシンα遺伝子の発現との関係
実施例１において、前立腺癌の進行とプロサイモシンα遺伝子の発現との関係を調べるため、正常な前立腺、前立腺肥大症(ＢＰＨ)、限局性前立腺癌、ホルモン耐性前立腺癌の生検から試料を採取した。そして、各試料を用いて、１）ステージ（病期）分類および２）Gleasonスコアに基づく前立腺癌の進行度判定、リンパ節転移の確認、プロサイモシンαの発現量の測定、を行った。なお、ここでは、１）の方法として、米国泌尿器科学会（ＡＵＡ）により開発されたＡＵＡ分類システムを用いた。
以下、実施例１について、項目に沿って詳細に説明する。
【００６６】
１−１．試料
正常な前立腺の試料（n=5）は、膀胱癌のための膀胱前立腺全摘術を受けた患者から取得した。前立肥大症(ＢＰＨ)の試料（n= 15）は、前立腺肥大症のための局部的前立腺切除を受けた患者から取得した。限局性前立腺癌の試料（n= 59）は、前立腺癌のために前立腺全摘術を受けた患者から取得した。これらの試料を採取した患者は、いずれも、化学療法、放射線療法、ホルモン療法を予め受けていない。また、ホルモン耐性前立腺癌の試料（n=9）は、ホルモン療法にもかかわらず当該癌が進行して死亡したヒト検体から死後３〜４時間以内に採取した。
【００６７】
１−２．免疫組織化学的分析
ここでは、酵素標識抗体法であるavidine-biotinylated peroxidase complex法（以下、ＡＢＣ法と記載する）を用い、試料中におけるプロサイモシンαの発現レベルを調べた。ここでは、後述するように、ＡＢＣ法を用いた分析で取得された吸光度（Optical Density：Ｏ．Ｄ．）を、プロサイモシンαの発現レベルとした。
【００６８】
具体的には、まず、従来の方法にしたがって、採取した上記各試料をアルコール脱水およびパラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィン後、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中、当該切片を１２０℃で５分間オートクレーブし、その後、０．５％Ｈ２Ｏ２のメタノール溶液で３０分間処理した。さらに、この切片を、希釈した抗プロサイモシンα抗体（一次抗体に相当）とともに２時間室温で培養し、その後、ＰＢＳ中、スキムミルクを用いて３０分間培養した。抗プロサイモシンα抗体は、Alexis Biochemicals社製のanti-ProTα MAb（clone ２Ｆ１１）を用いた1:3,000）。続いて、切片を、ビオチン化二次抗体であるbiotin-labeled horse anti-mouse IgGと３０分間反応させた。この場合、免疫反応は、市販のavidin-biotin complex(Vector laboratories Inc.社製の「Vectastain ABC elite kit」)を用いて行った。その後、切片を3’3-diaminobenzidine（ＤＡＢ）で処理して発色させた。その後、光学顕微鏡による観察のため、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて切片の染色（ＨＥ染色）を行った。
【００６９】
なお、上記のＡＢＣ法や染色において、記載を省略した処理工程や試薬等については、従来法に順じている。また、ネガティブコントロールとして、上記の抗プロサイモシンα抗体を用いた実施例と並行して、１次抗体で処理しない実験も行い、抗プロサイモシンα抗体の特異性の確認を行った（後述の図１Ｃ参照）。
【００７０】
上記のようにＡＢＣ法で処理した切片に対し、光学顕微鏡で観察するとともに、住化テクノサービス株式会社製のImage Processor for Analytical Pathology（ＩＰＡＰ−ＷＩＮ）を用いて、プロサイモシンαの定量を行った。具体的には、病巣の腺構成成分における吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、得られた測定値をプロサイモシンαの発現レベルとみなした。
【００７１】
１−３．結果
図１Ａ〜１Ｌは、各切片の顕微鏡写真である。図１Ｂ〜図１Ｌにおいて、図中の黒色部分がプロサイモシンαの発現部分に相当する。以下、図１Ａ〜図１Ｌの詳細を述べる。
【００７２】
図１Ａ〜図１Ｃは、後述の図３の患者２の場合における前立腺の連続切片であり、図１Ａは、ＨＥ染色の結果を示し、図１Ｂは、抗プロサイモシンα抗体を用いた抗体染色の結果を示し、図１Ｃは、ネガティブコントロール（１次抗体無し）の結果を示す。図１Ａ〜図１Ｃにおいて、図中の矢印ｓの部分は正常上皮であり、矢印ｔの部分は腺癌である。
【００７３】
図１Ｄは、図３の患者２の前立腺正常上皮におけるプロサイモシンαの発現を示す。図１Ｅは、前立腺肥大症(ＢＰＨ)の前立腺におけるプロサイモシンαの発現を示す。図１Ｆは、図３の患者５１の前立腺上皮内腫瘍(ＰＩＮ)におけるプロサイモシンαの発現を示す。
【００７４】
図１Ｇ〜図１Ｌは、前立腺癌におけるプロサイモシンαの発現を示している。具体的に、図１Ｇは、図３の患者４４の前立腺癌におけるGleasonパターン３の原発巣での発現を示す。図１Ｈは、図３の患者２０の前立腺癌におけるリンパ節に転移した癌での発現を示す。図１Ｉは、図３の患者２０の前立腺癌におけるGleasonパターン５の原発巣での発現を示す。図１Ｊは、図３の患者５７の前立腺癌におけるGleasonパターン４の原発巣での発現を示す。図Ｋは、図３の患者５７の前立腺癌におけるGleasonパターン４の原発巣での発現を示す。図１Ｌは、後述の図４の患者ａ３の前立腺癌におけるGleasonパターン５の原発巣での発現を示す。
【００７５】
図２は、前立腺切除により採取された、正常上皮、前立腺肥大症(ＢＰＨ)、前立腺上皮細胞内癌(ＰＩＮ)、および前立腺癌（Ｃａｎｃｅｒ）の各々の場合におけるプロサイモシンαの発現レベルを示している。ここでは、前立腺肥大症の１５の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、前立腺上皮内腫瘍の４９の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、前立腺癌の１４０の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、５９人の前立腺癌患者の正常な上皮におけるプロサイモシンαの発現レベルについてそれぞれ調べた結果を示す。図中の縦軸は、プロサイモシンαの発現レベルに相当する吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。また、図中の「＃＃＃」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、p<0.0001の有意差をもって正常上皮から前立腺上皮内腫瘍、癌という悪性への進展に従い発現が上昇していくことを示している。また、「＊＊＊」は正常上皮およびＢＰＨに比較してp<0.001で有意に発現差があることを示している。
【００７６】
図３は、上述した方法で行った、前立腺癌の５９の患者における病期分類、Gleasonスコアおよびパターン、ならびにプロサイモシンαの発現レベルを示す図である。図３において、「Stage」の欄は、前述した上記１）の方法による病期分類を示している。「Gleason’s score」の欄は、前述した上記２）の方法によるGleasonスコアを示している。「signal intensity(O.D.)/Gleason’s pattern」の欄は、腺癌成分のGleasonパターンによる分類、および当該成分の領域における吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。「lymph node metastasis」の欄は、リンパ節転移が存在する場合の当該領域の吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。
【００７７】
図３の見方を説明すると、例えば、患者１の場合、病期分類は「Ｂ１」であり、Gleasonスコアは「６」であり、Gleasonパターンが「３」である病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で１８．０４である。この場合、リンパ節転移は、見られなかった。また、患者５７の場合、病期分類は「Ｄ１」であり、Gleasonスコアは「９」であり、Gleasonパターンが「４」である最も面積の大きい病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で６７．６７であり、Gleasonパターンが「５」である二番目に面積の大きい病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現量は吸光度で７８．０３であり、Gleasonパターンが「３」である病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度で４０．９４であり、リンパ節転移部分のプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で５４．４２である。このように、患者５７の場合には、１つの試料において、Gleasonパターンの異なる複数の腺癌が見られた。
【００７８】
図４は、ホルモン耐性前立腺癌により死亡した患者から試料を採取したａ１〜ａ９の９つの患者におけるGleasonパターンとプロサイモシンαの発現レベルとを示す図である。図４において、「Lesion」の欄は病巣の範囲を示しており、当該欄の「ＬＮ」の記載は、Lymph Nodeの略である。
【００７９】
図５は、組織学的な分類であるGleasonパターンとプロサイモシンαの発現レベルとの関係を示す図であり、パターン２からパターン５の各々におけるプロサイモシンαの発現レベルを示している。図５において、縦軸は、プロサイモシンαの発現レベルに相当する吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。また、図中の「＃＃＃」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、p<0.0001の有意差をもってGleasonパターン増加という悪性指標に従って発現が上昇していくことを示している。また、「＊＊＊」は、Gleasonパターン２や３に比較してp<0.001で有意に発現差があることを示している。
【００８０】
以下、図１Ａ〜図１Ｌ、図２、図３、図４および図５を参照して実施例１の結果を詳述する。図１Ａに示すように、プロサイモシンαは、細胞質（エオジンで赤く染色される図１Ａ中の暗色部分）および核（ヘマトキシリンで青く染色される部分であり図１Ａ中の透明部分に相当）の両方において免疫組織化学的に陽性を示すことから、細胞質および核の両方にプロサイモシンαが存在することが明らかになった。また、図１Ｄ〜図１Ｌおよび図２に示すように、プロサイモシンαは、正常な前立腺上皮、前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）および前立腺癌のいずれの場合においても発現するが、前立腺肥大症の場合は正常な前立腺上皮と同程度の低い発現レベルであるのに対して、前立腺上皮内腫瘍および前立腺癌の場合では、前立腺肥大症の場合や正常な前立腺上皮の場合に比べて、高い発現レベルを示す。正常な前立腺上皮では、分泌細胞の方が基底細胞に比べてプロサイモシンαの発現レベルが高かった。
【００８１】
図３〜図５に示すように、プロサイモシンαの発現レベルは、前立腺癌の進行に伴って増加した。このようなプロサイモシンαの発現レベルは、従来の病期分類法およびGleasonスコアに対して統計的に意味がある、言い換えれば、プロサイモシンαの発現レベルは病期分類法およびGleasonスコアと有意な相関を有している。例えば、病期分類法やGleasonスコアのような組織学的パターンに基づく診断で癌進行度が低いと判定された場合は、プロサイモシンαの発現量が低く、当該診断で癌進行度が高いと判定された場合は、プロサイモシンαの発現量が高いという相関関係が成り立つ。具体的には、病期分類法およびGleasonスコアとプロサイモシンαの発現量との間では、スピアマンの順位相関係数の検定における順位相関係数の有意水準Ｐが病期分類法およびGleasonスコアに対してそれぞれp<0.05、p<0.01であり、また、図５に示すように、Gleasonパターンとプロサイモシンαの発現量との間におけるスピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐはp<0.0001であった。また、図３に示すように、死亡に至る患者では、ほとんど全ての場合においてGleasonパターンが５であり、この場合のプロサイモシンαの発現量は高レベル、具体的には、多くの患者においてプロサイモシンαの発現レベル（Ｏ．Ｄ．値）が５０．０以上となることが示された。
【００８２】
以上より、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べることにより、前立腺癌の進行度を検定することができることが明らかである。
【００８３】
実施例２．ｓｉＲＮＡを用いた前立腺癌細胞におけるプロサイモシンα遺伝子の発現抑制
実施例２においては、前立腺癌細胞におけるプロサイモシンα遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により抑制し、それにより、前立腺癌細胞の細胞増殖および浸潤を抑制した。以下、詳細を各項目に沿って説明する。
【００８４】
２−１．プロサイモシンαの発現系選択
ここでは、プロサイモシンαを発現するヒト前立腺癌細胞を選択するため、ヒトの前立腺癌細胞系であるＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１を準備するとともに、前立腺上皮細胞であるＰｒＥＣを準備した。ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１は、American Type Culture Collectionから取得し、ＰｒＥＣは、Cambrex BioScience Walkersville,Inc.社製のものを用いた。
【００８５】
これらの前立腺細胞系ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、２２Ｒｖ１およびＰｒＥＣについて、抗プロサイモシンα抗体を用いた免疫ブロット法により、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べた。プロサイモシンα（clone ２Ｆ１１）のモノクローナル抗体は、Alexis Biochemicals社製のものを用いた。また、コントロール実験として、これらの前立腺細胞系におけるβ−アクチンの発現を抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いて同様の方法により調べた。
【００８６】
免疫ブロット法については、従来技術に従った。ここでは、まず、下記組成を有するＲＩＰＡ緩衝液に細胞を溶解させた。
【００８７】
＜ＲＩＰＡ緩衝液の組成＞
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％ ＮＰ−４０、０．５％ sodium deoxycholate、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ phenylmethylsulphonyl fluoride、１ｍＭ sodium orthovanadate、Protease inhibitor cocktail（Roche Diagnostics社製）
かかる細胞溶解物中から１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動し、分画したタンパク質を２０ｍＭの酢酸ナトリウム液（ｐＨ５．２）を用いてニトロセルロース膜に移し、０．５％グルタルアルデヒドで５分固定した。続いて、ニトロセルロース膜を５％脱脂乳／ＴＢＳ溶液でブロッキングした後、TBS中に１０００分の一希釈した抗プロサイモシンα抗体と室温で１時間反応させた。そして、同様に、二次抗体である抗マウスＩgＧ抗体（1:10,000、 アマシャム バイオサイエンス株式会社）と１時間反応させた。その後、ECL plus western blotting detection試薬（Amersham Biosciences社製：「Piscataway」）を用いて、プロサイモシンαのバンドの検出を行った。なお、内部マーカーとして、β−アクチンについても、プロサイモシンαの場合と同様の方法により分析を行った。
【００８８】
図６に、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、２２Ｒｖ１およびＰｒＥＣにおける上記免疫ブロット法の結果を示す。前立腺癌細胞であるＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１ではプロサイモシンαの発現が見られたが、前立腺上皮細胞であるＰｒＥＣでは、プロサイモシンαの発現がほとんど見られなかった。本実施例では、免疫ブロット法の結果と、後に述べる浸潤能検討実験を行いやすい点とを考慮し、プロサイモシンαの発現系に前立腺癌細胞であるＰＣ３及びＬＮＣａＰを用いた。
【００８９】
２−２．ＰＣ３に導入するｓｉＲＮＡの作製とＰＣ３細胞への導入
ＰＣ３に導入するｓｉＲＮＡとして、以下のｓｉＲＮＡ（株式会社ＲＮＡｉ社製）を用いた。具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有する２１塩基のセンス鎖ＲＮＡと、配列番号２に示す塩基配列を有する２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡとから構成されるｓｉＲＮＡ（以下、このｓｉＲＮＡをＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１と呼ぶ）を準備するとともに、ネガティブコントロールとして、配列番号５に示す塩基配列を有する２１塩基のセンス鎖ＲＮＡと、配列番号６に示す塩基配列を有する２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡとから構成されるｓｉＲＮＡ（以下、このｓｉＲＮＡをＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡと呼ぶ）を用意した。これらの２本鎖ｓｉＲＮＡは、上記配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ反応溶液中、９０℃で３分間加熱し、そして、３７℃で１時間インキュベートした後に、室温になるまで放置して会合させることにより作製された。なお、これらの２本鎖ｓｉＲＮＡを、２％アガロースゲルで電気泳動し、センス鎖とアンチセンス鎖との会合を確認した。
【００９０】
＜ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
＜Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ（配列番号５）
アンチセンス鎖：ＵＡＣＧＡＡＵＧＡＣＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＵ（配列番号６）
ＰＣ３細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（InVitrogen社製）に０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を添加したものを用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。ｓｉＲＮＡのＰＣ３細胞への導入は、Amaxa社製のNucleofector IIを用い、１x１０６個の細胞に、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをそれぞれ３μｇ導入した。導入操作は当該機器のマニュアルに従って行った。
【００９１】
２−３．ＬＮＣａＰに導入するｓｉＲＮＡの作製とＬＮＣａＰ細胞への導入
ＬＮＣａＰに導入するｓｉＲＮＡとして、以下のＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２（株式会社ＲＮＡｉ社製）を用いた以外は、２−２と同様にｓｉＲＮＡを調整した。なお、ネガティブコントロールとしては、２−２と同様に、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを用いた。
【００９２】
ＬＮＣａＰ細胞の培養及びｓｉＲＮＡの導入も、ＰＣ３細胞と同様に行った。
【００９３】
＜ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２の塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【００９４】
２−４．ｓｉＲＮＡによるプロサイモシンαの発現抑制
＜１＞免疫ブロット法による解析
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをＰＣ３細胞へ導入し４８時間後に、ＰＣ３細胞を、５×１０３個／２００μｌ培地の濃度で９６穴プレートにトランスファーし、さらに培養を続けた。そして、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後および７日後に細胞を回収し、前述した免疫ブロット法を用いてプロサイモシンαの発現量を解析した。
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを、同様にＬＮＣａＰ細胞へ導入し、今回は、３日後、５日後、７日後、１０日後および１４日後に細胞を回収し、プロサイモシンαの発現量を解析した。
【００９５】
＜２＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析
さらに、ここでは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べた。このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、RNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Superscript II（InVitrogen社製）と下記塩基配列を有するプライマー対Ａ（配列番号７および配列番号８）とを用いて、逆転写によりプロサイモシンαにかかるｃＤＮＡを取得し、ＰＣＲで増幅させて発現を測定した（ 94℃5秒、60℃15秒、72℃30秒を 40cycle ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける測定データの収集および分析は、LightCycler（Roche Diagnostics社製）を用いて行った。
【００９６】
プライマー対Ａ（５’→３’）
ＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＧＣ（配列番号７）
ＧＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＴＣ（配列番号８）
また、ここでは、ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして利用し、ＧＡＰＤＨについてプロサイモシンαの場合と同様の操作を行ってＧＡＰＤＨの検出結果に基づきプロサイモシンαの測定結果を標準化した。ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲにおいては、下記塩基配列を有するプライマー対Ｂ（配列番号９および配列番号１０）を用いた。
【００９７】
プライマー対Ｂ（５’→３’）
ＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧ（配列番号９）
ＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号１０）
本実施例では、このようなプロサイモシンαおよびＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲによる発現測定を３回行った。
【００９８】
結果
図７Ａは、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをいずれも導入しなかった未処理の場合（図中の矢印ａで示す）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂで示す）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃで示す）における、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後、および７日後の免疫ブロット法の結果を示す図である。また、図７Ｂは、未処理の場合（図中の矢印ａで示す）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂで示す）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃで示す）における、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後、および７日後のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。図７Ｂ中において、縦軸は、未処理の場合のｍＲＮＡ量を１とした相対量を示している。また、図中の「＊＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡおよび未処理の場合に対し、p<0.0001であることを示している。
【００９９】
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（矢印ｃの場合）には、導入から７日後においてもプロサイモシンαの発現が抑制されており（図７Ａ参照）、また、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量が少なかった (図７Ｂ参照)。一方、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（矢印ｂの場合）には、未処理の場合（矢印ａの場合）と同様のプロサイモシンαの発現（図７Ａ参照）およびｍＲＮＡ量（図７Ｂ参照）が検出された。このことから、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１は、プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせて、それにより、プロサイモシンαの発現を抑制することが明らかとなった。
【０１００】
また、図８に示すように、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２を導入したＬＮＣａＰ細胞においても、ｓｉＲＮＡ導入後５日目までは、完全にｍＲＮＡが消失したが、７日目に少し発現が回復し、１４日目には、ほぼｓｉＲＮＡによる発現阻害効果は無くなった（図８）。
このように、どちらの場合においても、少なくとも１週間は、ｓｉＲＮＡによる発現阻害効果が有効に生じていた。
【０１０１】
２−５．ＰＣ３へのｓｉＲＮＡ導入による細胞増殖・浸潤抑制
ｓｉＲＮＡ導入によるＰＣ３の細胞増殖及び浸潤を調べるため、以下の解析を行った。この２つの分析においては、下記のようにＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入したものおよびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入したものについて調べるとともに、いずれのｓｉＲＮＡも導入しないで同様の処理を行った非処理のものについても調べた。
【０１０２】
＜１＞細胞増殖
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＰＣ３を、５×１０３個／２００μｌ培地の濃度で９６穴プレートに植えて培養するとともに、ＷＳＴ−１アッセイ法のマニュアルに従い、培地にＷＳＴ−１（Roche Diagnostics社製）を添加した。そして、ｓｉＲＮＡ導入から３日後および５日後の生細胞におけるＷＳＴ−１の吸光度を分光光度計を用いて測定し、細胞数を算定した。ＷＳＴ−１は、セルトランスフェレーション試薬であるテトラゾリウム塩であり、細胞におけるＷＳＴ−１の吸光度を測定することにより、細胞の代謝活性を測定し、細胞数とするアッセイシステムである。ここでは、このようなＷＳＴ−１アッセイ法による細胞数の測定を、それぞれ３回ずつ行った。
【０１０３】
＜２＞浸潤
細胞浸潤を促進する化学誘引物質であるフィブロネクチンを１０μｇ／ｍｌ含有する上記ＲＰＭＩ１６４０培地を分注した２４穴プレートの各ウエルに、Matrigel MatrixでコートしたCell culture insert（BD Biosciences社製）を入れた。そして、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＰＣ３のうち、ＰＲＭＩ１６４０培地中を浮遊する細胞（１×１０５個）をCell culture insertに播種し、５％CO2存在下、３７℃で２２時間培養した。培養後、Saitoらの方法（Saito K,Oku T,Ata N,Miyashiro H,Hattori M,Saiki I,A modified and convenient method for assessing tumor cell invasion and migration and its application to scriining for inhibitors.Biol Pharm Bull 1997;20(4):345-348）に従い浸潤能に対する影響を検討した。具体的にはCell culture insertをメタノールに浸して細胞を５分間固定した後、0.5%クリスタルバイオレットで30分間染色した。その後、蒸留水で洗浄しCell culture insertの膜上面に存在する細胞を綿棒で完全に除去した後十分に風乾した。その後Cell culture insertから膜を切り離して96-well plate内に入れ、各wellに１００μL ３０％酢酸を加えて５分間インキュベートし、膜下面に浸潤した細胞からクリスタルバイオレット色素を溶出した。浸潤細胞数に比例して色素の溶出量は増加するので、波長５９０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定することで浸潤細胞数を定量的に評価した。ここでは、このようなアッセイを３回行った。
【０１０４】
結果
図９は、未処理の場合（図中の矢印ａの場合）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂの場合）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃの場合）における、導入から３日後および５日後の上記＜ｂ−１＞のＷＳＴ−１アッセイの結果を示す図である。図９の縦軸は、３日後、および５日後の各経過時における未処理の場合の細胞数を１００％とした相対量を示している。また、図中の「＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの場合および未処理の場合に対し、p<0.01であることを示している。このグラフから、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入したＰＣ３においては、細胞増殖が抑制されていることが明らかである。
【０１０５】
図１０および図１１は、細胞浸潤を観察するための＜ｂ−２＞の分析における、未処理の場合（図中のａの場合）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中のｂの場合）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中のｃの場合）の結果を示す図である。図１０は、これらの各場合において取得された波長５９０ｎｍ帯の吸光度(Ｏ．Ｄ．)を示している。図中の「＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの場合および未処理の場合に対し、p<0.01であることを示している。図１１は、これら各場合の顕微鏡写真である。図１０および図１１に示すように、膜下面に浸潤したPC3細胞数は未処理、Cont.-siRNAの場合に比較してPTMA-siRNA導入により顕著に減少した。ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１導入の場合（ｃの場合）、すなわち図７Ａおよび図７Ｂで前述したＲＮＡ干渉によってプロサイモシンαの発現が抑制される場合には、浸潤が抑制されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の実施例１における、ＡＢＣ法によるプロサイモシンαの発現分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例１における、正常上皮、前立腺肥大症、前立腺上皮細胞内癌、および前立腺癌の各場合のプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図３】本発明の実施例１における、前立腺切除を行った５９の患者についての従来法による診断およびプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図４】本発明の実施例１における、検体から試料採取した場合についての従来法による診断およびプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図５】本発明の実施例１における、前立腺癌病巣のGleasonパターンとプロサイモシンαの発現量との相関を示す図である。
【図６】本発明の実施例２における、前立腺細胞系でのプロサイモシンαの発現を免疫ブロット法で分析した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例２における、ＰＣ３細胞に対する、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１のプロサイモシンα発現抑制効果を示す図である。
【図８】本発明の実施例２における、ＬＮＣａＰ細胞に対する、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２のプロサイモシンα発現抑制効果を示す図である。
【図９】本発明の実施例２における、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果をＷＳＴ−１アッセイ法で分析した結果示す図である。
【図１０】本発明の実施例２における、フィブロネクチンを細胞増殖促進剤として添加した場合のＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果をＷＳＴ−１アッセイ法で分析した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２における、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果を顕微鏡で調べた結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を含む抗癌剤、およびプロサイモシンα遺伝子の発現抑制用組成物に含有される核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、アメリカにおける男性の最も一般的な悪性疾患である（例えば、非特許文献１参照）。日本における前立腺癌の発生率および死亡率は、アメリカに比べてかなり低いものの、急速に増加している（例えば、非特許文献２参照）。
【０００３】
前立腺癌は、その発生および進行のメカニズムが解明されていないが、前立腺癌患者における生物学的不均一性や、進行度および死亡率の多様性（具体的には、何故非常に進行の早い前立腺癌患者とそうでない患者とがいるのか等）から、前立腺癌の発生や進行に多くの因子が関与していると考えられている（例えば、非特許文献３〜５参照）。そのような因子を一つずつ同定していくことは、前立腺癌の診断方法や治療方法の開発に非常に重要である。
【０００４】
一般的に、前立腺癌の発生や進行に関与する因子として、年齢、遺伝および環境／食事等といった要素の組み合わせが指摘されている。中でも、アンドロゲンが前立腺の成長および分化において重要な役割を果たすことから、前立腺癌とアンドロゲンとの関係について多くの研究がなされてきた。その結果、前立腺腫瘍の進行が、循環性のアンドロゲンであるテストステロンやジヒドロテストステロンのレベルの上昇に関連していることが明らかにされた（例えば、非特許文献６参照）。また、前立腺組織の上皮内に限定され、細胞異型と腺細胞の多層化によって診断される前立腺上皮内腫瘍（prostatic intraepithelial neoplasm：ＰＩＮ）が、前立腺癌の前段階にある病巣として注目されており、実際にＰＩＮから前立腺癌への進行も報告された例もある（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
前立腺癌の診断には、通常、腫瘍マーカである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）や前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）を用いた診断方法（具体的には、これらの血清中レベルの測定）や直腸診等が用いられ、診断結果は複数のステージ（病期）に分類される。例えば、Gleasonスコアと組み合わせた血清ＰＳＡレベルの判定は、前立腺癌の診断（病期分類）に有効である。
【０００６】
前立腺癌の治療には、前立腺全摘術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法が用いられる。これらの方法は、単独で診断／治療に用いられることもあるし、組み合わせて用いられることもある。
【０００７】
最近、これらの定法以外に、前立腺癌の診断や治療等への利用が期待される核酸等も開示されている（例えば、特許文献２および特許文献３参照）。
【非特許文献１】Jemal A,Murray T,Ward E,et al. Cancer statistics,2005.CA Cancer J Clin 2005;55(1):10-30.
【非特許文献２】Hsing AW,Tsao L,Devesa SS.International trends and patterns of prostate cancer incidence and mortality. Int J Cancer 2000;85(1):60-7.
【非特許文献３】Lalani el N,Laniado ME,Abel PD. Molecular and cellular biology of prostate cancer.Cancer Metastasis Rev 1997;16(1-2):29-66.
【非特許文献４】Bonkhoff H,Remberger K.Morphogenetic concepts of normal and abnormal growth in the human prostate. Virchows Arch 1998;433(3):195-202.
【非特許文献５】Roudier MP,True LD,Higano CS,et al.Phenotypic heterogeneity of end-stage prostate carcinoma metastatic to bone. Hum Pathol 2003;34(7):646-53.
【非特許文献６】Elizabeth A.Platz et al.,&Edward Giovannucci,Epidemiology of and Risk Factor for Prostate Cancer,Management of Prostate Cancer21(Eric A Klein,ed.2000)
【特許文献１】特開２００４−３１５４８０号
【特許文献２】特表２００２−５１８０４８号
【特許文献３】特表２００４−５３０４１３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前立腺癌の治療を可能とする新たな抗癌剤を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、簡便に前立腺癌の診断を可能とする前立腺癌細胞の検定方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、2-Samino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine（ＰｈＩＰ）を投与したラットにおいて、前立腺癌の発生が大豆イソフラボンにより抑制されること、また、大豆イソフラボンは、ラットの前立腺におけるプロサイモシンαの発現を抑制することを見出した（Carcinogenesis,Vol.25,No.3,381-387,March）。プロサイモシンαは、１１１個のアミノ酸で構成された小さな酸性タンパクであり、多岐種類に渡る組織で遍在的に発現する。
【００１０】
発明者らは、前立腺癌におけるプロサイモシンαの役割を明らかにするため鋭意努力した結果、プロサイモシンαの発現レベルと前立腺癌における細胞増殖および浸潤との間に相関があることを明らかにし、本発明の前立腺癌の検定方法を完成するに至った。さらに、前立腺癌由来の培養細胞において、プロサイモシンαの発現をＲＮＡ干渉により抑制することにより、癌細胞の増殖を抑制できることを明らかにし、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制方法や機能抑制方法、及びそれらを用いた前立腺癌の治療方法等を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、以下の各項の通りである。
〔１〕前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤であって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する抗癌剤。
〔２〕前記機能抑制組成物が、プロサイモシンαの発現を抑制することにより前記プロサイモシンαの機能を抑制する、プロサイモシンαの発現抑制用組成物であることを特徴とする第１項記載の抗癌剤。
〔３〕前記発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することのできる核酸を含有することを特徴とする第２項記載の抗癌剤。
〔４〕プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせることにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することを特徴とする第３項記載の抗癌剤。
【００１２】
〔５〕プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、
２重鎖領域を有し、
前記２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸。
〔６〕前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする第５項記載の核酸。
【００１３】
〔７〕前記規則（３）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される１種以上の塩基であることを特徴とする第５または第６項記載の核酸。
〔８〕前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする第５〜第７項のいずれか１項記載の核酸。
【００１４】
〔９〕前記標的遺伝子の規定配列が、さらに下記（５）の規則；
（５） 導入される被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする第５〜第８項のいずれか１項記載の核酸。
【００１５】
〔１０〕２本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする第５〜第９項のいずれか１項記載の核酸。
〔１１〕前記２本鎖のポリヌクレオチドが、前記２重鎖領域の両端に、３’末端が突出したオーバーハング部を有することを特徴とする第１０項記載の核酸。
〔１２〕１本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする第５〜第９項のいずれか１項記載の核酸。
【００１６】
〔１３〕前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号１に項記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号２に項記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする第５〜１２のいずれか１つに項記載の核酸。
ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
〔１４〕前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号３に項記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号４に項記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする第５〜１２のいずれか１つに項記載の核酸。
ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
〔１５〕前記２重鎖領域において、少なくとも前記他方の鎖がＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ構成を有することを特徴とする第５〜第１４項のいずれか１項記載の核酸。
〔１６〕前記他方の鎖の２重鎖領域の３’末端から９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡであることを特徴とする第１５項記載の核酸。
【００１７】
〔１７〕第５〜第１６項のいずれか１項記載の核酸を、プロサイモシンαが発現している細胞に導入し、当該プロサイモシンαの発現を抑制することを特徴とするプロサイモシンαの発現抑制方法。
〔１８〕前立腺癌に由来する癌細胞に、第５〜第１６項のいずれか１項記載の核酸を導入することを特徴とする、癌細胞増殖および浸潤の抑制方法。
〔１９〕前記癌細胞が、ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖｌ、ＤＵｌ４５およびＰＣ３からなる群から選択される癌細胞であることを特徴とする第１８項記載の方法。
【００１８】
〔２０〕ほ乳類被検体から採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、
前記試料中のプロサイモシンαの発現量に基づいて検定を行うことを特徴とする検定方法。
〔２１〕ほ乳類被検体から採取した試料に対し、前立腺癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、
当該試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする前立腺癌診断キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、前立腺癌の治療を可能とする新たな抗癌剤を提供することが可能になった。また、簡便に前立腺癌の診断を可能とする前立腺癌細胞の検定方法を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２２】
＜１＞本発明にかかる抗癌剤
本発明にかかる前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤は、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する。後述の実施例１で示すように前立腺癌の進行とプロサイモシンαの発現量との間には相関関係が見られ、また、後述の実施例２で示すようにプロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制されることから、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制が前立腺癌の治療に有効であることは明らかである。したがって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を含有した薬剤により、前立腺癌の抗癌剤を提供することが可能となる。
【００２３】
ここで、プロサイモシンαの機能抑制用組成物は、癌細胞内でのプロサイモシンαの機能を抑制することができる組成物であれば特に限定されず、例えば、プロサイモシンα遺伝子プロモーターのリプレッサー、あるいはアクチベーター阻害因子などを含有する転写レベルでの発現抑制用組成物やリボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含有する翻訳レベルでの発現抑制用組成物、あるいは、抗プロサイモシンα抗体や抗プロサイモシンα機能阻害低分子化合物などを含有するタンパク質レベルでの機能抑制用組成物などを含むが、効果が高く、簡便であるため、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの核酸を含有する発現抑制用組成物であることが好ましく、ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどの、プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を含有する発現抑制用組成物がさらに好ましい。
【００２４】
これらの核酸は、遺伝子組み換え技術、化学的または酵素的合成等の公知技術を適宜用いることによって合成しうる。かかる核酸は、その名称（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）に関わらず、ＲＮＡから成っていても、ＤＮＡから成っていても、ＲＮＡとＤＮＡの両方から成っていてもよく、天然のヌクレオチドあるいは人工のヌクレオチドのいずれから構成されてもよく、また、これらの核酸の複数種類の混成であってもよい。人工のヌクレオチドとしては、例えば、天然のヌクレオチドの塩基の一部に化学修飾がなされているような核酸アナログでもよい。化学修飾としては、例えば、リン酸結合、リボース、核酸塩基、３’および／または５’末端等の化学修飾が挙げられる。
【００２５】
このようなプロサイモシンαの発現抑制用組成物を含む本発明の抗癌剤は、例えば、薬学的に許容され得る担体に発現抑制用組成物を医学的に有効な量配合して得られる。ここで、「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘ちょう剤、矯味剤、溶解補助剤等が挙げられる。かかる担体により、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、坐剤、およびペッサリー等の形態の抗癌剤が調製される。これらの抗癌剤は、その剤形に従って、経口あるいは非経口的に投与することができる。
【００２６】
これらの抗癌剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間または当該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なり、投与量は特に限定されず、状況に適宜応じて投与することができる。例えば、注射剤の場合、生理食塩水または注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に発現抑制用組成物を溶解または懸濁することにより製造することができる。この場合、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等の非水性の希釈剤や、懸濁剤または乳濁剤として適宜調製してもよい。このようにして調製された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、一日あたり１〜数回投与することができる。
【００２７】
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸
上述のように、プロサイモシンαの機能抑制用組成物に含有される核酸の構成は特に限定されないが、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であることが好ましい。
【００２８】
ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸は、ｓｉＲＮＡ等の２本鎖型であってもよく、ヘアピン構造を有するＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）等の１本鎖型であってもよい。ｓｈＲＮＡは、２重鎖領域における一方の鎖の３'末端と、当該２重鎖領域における他方の鎖の５'末端とがループ部で連結して１本鎖を構成するものである。かかるｓｈＲＮＡは、１本鎖ＲＮＡの５'末端または３'末端に、１重鎖の状態で突出したオーバーハング部を有していても良い。このようなｓｈＲＮＡは、ＷＯ０１／４９８４４等、公知の手法に従って設計することができる。
【００２９】
ここで、「ＲＮＡ干渉」とは、元来、標的遺伝子の一部分と相同なセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）が、標的遺伝子の機能を阻害する現象のことであった。しかし、現在では、当該２本鎖ＲＮＡの一部がＤＮＡであっても、標的遺伝子の機能を阻害することができることが明らかになっている。従って、本明細書では一部にＤＮＡを含むものもｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡの概念に含める。
【００３０】
このように、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸は、プロサイモシンαの発現を有意に阻害するものであればヌクレオチドの構成、塩基配列、塩基長等は任意であり、種々公表されている所定のガイドラインに従って任意に設計された核酸を用いることが可能である。ＲＮＡ干渉の効果が高い程、プロサイモシンαの発現が大きく阻害されることから、ＲＮＡ干渉効果の高い核酸であることが好ましい。
【００３１】
特に好適に用いられる核酸は、プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、少なくとも２重鎖領域を有し、前記２重鎖領域における一方の鎖が、前記標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなることを特徴とする。
【００３２】
これらの核酸の、特に２重鎖領域におけるヌクレオチド構成は、ＲＮＡ型、ＤＮＡ型、ハイブリッド型、キメラ型のいずれであってもよい。ここで、「ＲＮＡ型」は、ＲＮＡからなる核酸、「ＤＮＡ型」は、ＤＮＡからなる核酸、「ハイブリッド型」は核酸が２重鎖領域を有するとき、２重鎖領域における一方の鎖がＲＮＡで、もう一方の鎖がＤＮＡから成る核酸、「キメラ型」は、２重鎖領域においてＲＮＡとＤＮＡが同一鎖に含まれている核酸をいう。
【００３３】
このハイブリッド型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されないが、センス鎖がＤＮＡで構成されアンチセンス鎖がＲＮＡで構成された２本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３４】
また、キメラ型構造は、被導入体に導入した際に標的遺伝子の発現を抑制する活性を有するものであれば構造は特には限定されない。ＲＮＡ干渉に用いられる核酸は、構造上、機能的なアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められることから、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５'末端側の半分、アンチセンス鎖の３'末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。キメラ構造を有する核酸では、被導入体内おける安定性や製造コスト等の点から、ＲＮＡの含量をできるだけ少なくすることが好ましい。そこで、高い標的遺伝子の発現抑制効果を維持しつつＲＮＡ含量を低減可能な核酸について鋭意検討したところ、２重鎖領域において、センス鎖の５’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分、およびアンチセンス鎖の３’末端から９〜１３ポリヌクレオチドの部分（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の前記各末端から１１ポリヌクレオチド、好ましくは１０ポリヌクレオチド、さらに好ましくは９ポリヌクレオチドの部分）はＲＮＡで構成されることが望ましく、特に、アンチセンス鎖の３’末端側が当該構成を有することが望ましい。なお、センス鎖のＲＮＡ部分とアンチセンス鎖のＲＮＡ部分とは、必ずしも、その位置が一致して相補的に結合していなくてもよい。
【００３５】
ＲＮＡ干渉の標的となる標的遺伝子の塩基配列は、プロサイモシンα遺伝子から転写される転写産物が有する塩基配列であって、上記規則を満たすものであれば、遺伝子のどの部分でもかまわない。ここで、転写産物は、スプライシング前のｈｎＲＮＡでも、スプライシング後のｍＲＮＡでもよい。
【００３６】
本明細書中では、上記（１）から（４）の規則を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。また、「相補的な配列」とは、水素結合によって結合できる塩基対の並びによって構成される配列である。例えば、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては３つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては２つの水素結合部位が形成される。このため、Ｇ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。上述のように、「相補的な配列」には、これらの天然の塩基によって構成される配列だけでなく、イノシンや塩基アナログなどの人工的な塩基によって構成される配列も含む。従って、相補的な水素結合は、２つあるいは３つに限らず、１つでも４つ以上でも構わない。
【００３７】
また、「規定配列と相同な塩基配列」とは、標的遺伝子配列（又はその一部）に中程度または高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な塩基配列のことであり、規定配列を有する遺伝子に対し、その配列を有するポリヌクレオチドがＲＮＡ干渉を生じさせることができることが好ましい。
【００３８】
「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的な条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第３版，第６−７章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，２００１に示されているが、例えば、高程度にストリンジェントな条件とは、ニトロセルロースフィルターを用いた場合、５０％ホルムアミド、２〜６×ＳＳＣまたは等価な濃度の塩存在下で、約４２℃以上でのハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。中程度にストリンジェントな条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、２〜６×ＳＳＣまたは等価な濃度の塩存在下で、約３７℃以上でのハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。一般に、ストリンジェンシーが高くなるほど、高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、ホルムアミドの非存在下では、６５ないし８０℃、２ないし６×ＳＳＣ）および／または洗浄（例えば、６８℃、０．２×ＳＳＣ）が行われる。しかし、核酸の解離温度は、例えばその核酸の長さや核酸を構成する各塩基の割合に依存するため、ストリンジェントな条件は、用いる核酸によって、個々に決定されなければならないが、当業者であれば、その条件を容易に決定することが可能である。すなわち、望ましい強さのストリンジェンシーを達成するためには、ハイブリダイゼーション反応と２本鎖の安定性を支配する基本原理を考慮することによって、洗浄温度と洗浄塩濃度が調整されると理解すべきである。
【００３９】
通常、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズする配列は、規定配列と５０〜１００％の相同性を有する。ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲であれば、塩基配列の一部に欠失、置換、挿入などの変異を含んでもよい。なお、許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズムを用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはBLASTsearchなどを好適に用いることができる。
【００４０】
より詳細には、核酸（ポリヌクレオチド）の相同性は、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereuxら、1984、Nucl.Acids Res.12:387）。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、Gribskov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry,1993）により決定され；WoottonおよびFederhen，「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol.266:544-71, 1996も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry,1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul,1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００４１】
規則（３）において、「リッチ」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、規定配列における３'末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよび／またはウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３'末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。
【００４２】
規則（４）について、規定配列の鎖長は、数塩基から転写産物の全長まで、いずれの長さであってもよい。しかし、生物種などの条件により、塩基数があまりに大きすぎる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）が細胞毒性を生じるため、極端に長い核酸は使えない場合がある。規定配列の塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、例えば、ｓｉＲＮＡの場合、哺乳動物由来の細胞においては、３０塩基数以上の鎖長を有するｓｉＲＮＡを導入するとインターフェロン応答が生じるため、ｓｉＲＮＡの塩基数は、３０以下、より好ましくは２８以下である。さらに好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下である。また、下限は、ＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を取得可能な限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１３以上、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは１８以上、より好ましくは２０以上である。よって、規則（４）において、標的遺伝子の規定配列は塩基数が１３〜２８であることが好ましい。特に、哺乳動物由来の細胞等に導入する場合には、１３〜２８、好ましくは１５〜２３、さらに好ましくは１９〜２１塩基数である。標的遺伝子の規定配列は、かかる上限および下限をふまえた塩基数であることが特に好ましく、最も好ましくは１９塩基である。この１９塩基中、（３）の規則に鑑みると、規定配列の３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基上、特に好ましくは５塩基以上が、Ａ、Ｔおよび／またはＵである。
【００４３】
本発明にかかる核酸において、２重鎖領域の両端は平滑末端であっても、オーバーハング部を有していてもよいが、両端に３’末端が突出したオーバーハング部を有しているのが好ましい。オーバーハング部とは、２重鎖領域の端に存在する、１本鎖の状態で突出する部分である。オーバーハング部は、生物種などにもよるが、塩基数２であることが好ましい。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、例えば、ＴＴあるいはＵＵ等が好適に用いられる。
【００４４】
なお、上記（１）〜（４）の規則は、Ui-Teiらによるガイドライン（Ui-Tei,K.,Naito,Y.,Takahashi,F.,Haraguchi,T.,Ohki-Hamazaki,H.,Juni,A.,Ueda,R.,Saigo,K.の「Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference」,Nucleic Acids Research,2004,Vol.32,No.3,936-948）に基づくものであり、ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４８９３（ＷＯ２００４／０４８５６６）にも詳細に記載されている。
【００４５】
さらに、本発明の核酸において、標的遺伝子の規定配列は、さらに下記（５）の規則：
（５）被導入体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることが好ましい。
【００４６】
言い換えると、（５）の規則は、標的遺伝子と関係のない遺伝子におけるＲＮＡ干渉（これをオフターゲット効果と呼ぶ）を抑制するために、標的遺伝子の上記（１）〜（４）に従う規定配列は、これと同一又は類似の配列が他の遺伝子に含まれていない塩基配列であることが好ましいことを規定したものである。かかる規則を満たす規定配列を選択することにより、標的遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせることができ、オフターゲット効果の低いＲＮＡ干渉を実現することが可能となる。規定配列またはその相補配列と同一／類似の配列を検索する方法としては、一般的なホモロジー検索を行うソフトウェア等を用いた方法が挙げられる。
【００４７】
例えば、ＢＬＡＳＴ等を利用して標的遺伝子の規定配列と同一又は類似の配列を他の遺伝子について検索し、当該他の遺伝子に塩基配列のミスマッチ数が小さい類似配列が存在するという検索結果が得られた場合には、このような標的遺伝子の規定配列は除外する。それにより、標的遺伝子に対する特異性の高い配列を選別することができる。具体的に、標的遺伝子の規定配列の塩基数が１９である場合には、他の遺伝子にミスマッチが２塩基以下、より好ましくは３塩基以下、さらに好ましくは４塩基以下の類似配列が存在する配列を規定配列から除外することが好ましい。類似性判断の閾値となるミスマッチ数の値の増加に伴って、特異性が高くなる。また、標的遺伝子の規定配列のみならずこれと相補的な配列の両方についても検索を行うことにより、さらに特異性の高い配列が得られる。
【００４８】
便宜上、塩基配列の類似性を判断する基準となるミスマッチ数を相同性で規定し、（５）の規則に従う配列であるかどうか、検索することにより類似性を判断して塩基配列を選別することが好ましい。かかる相同性は適宜設定されるものであり、当業者は、所望により規定配列と８５％以上、８０％以上、７５％以上のように適宜設定することが可能である。ここで、規定配列との相同性を低く設定するほど標的配列と類似する他の遺伝子が存在しないこととなる。
【００４９】
さらに、センス鎖のセンス配列は、上記（１）〜（４）あるいは（１）〜（５）の規則の他、下記（６）の規則に従う標的遺伝子の規定配列に相同な塩基配列を有することが好ましい。
（６）１０塩基以上Ｇ又はＣが連続する配列を含まない。
【００５０】
（６）の規則において、１０塩基以上グアニン及び／またはシトシンが連続するというのは、例えば、グアニンまたはシトシンの一方のみが連続する場合と、グアニンおよびシトシンとが混在する配列となっている場合の双方を含み、具体的には、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣのほか、ＧおよびＣの混合配列であるＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧなども含まれる。
【００５１】
なお、（５）及び（６）については、ＰＣＴ／ＩＢ２００３５／００１６４７明細書に、詳細に記載されている。
【００５２】
標的遺伝子の規定配列は、上記のような塩基配列上の規則だけでなく、これ以外の点に鑑みて適宜選択されてもよい。例えば、上記（１）〜（６）等の規則を満たす規定配列を標的遺伝子から複数選択した後、さらに、当該選択された規定配列の中から、別の条件を付加して配列の選択を行ってもよい。本発明にかかる核酸を設計するための規定配列の検索および選択は、例えば、上記の（１）〜（６）の規則に従う部分を検索可能なプログラムを搭載するコンピュータを用いることにより、効率的な検出および選択が実行可能である。このような核酸の設計により、ＲＮＡ干渉効果の高い核酸分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。
【００５３】
後述の実施例２では、本発明にかかる核酸の一態様として、下記のように配列番号１に示す塩基配列を有するセンス鎖と、配列番号２に示す塩基配列を有するアンチセンス鎖と、から構成された２本鎖ＲＮＡや、配列番号３に示す塩基配列を有するセンス鎖と、配列番号４に示す塩基配列を有するアンチセンス鎖から構成された２本鎖ＲＮＡなどのｓｉＲＮＡを例示する。これらのｓｉＲＮＡでは、１９塩基数のセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るセンス鎖が構成され、１９塩基数のアンチセンス配列の３’末端に２塩基のオーバーハング部が設けられて２１塩基から成るアンチセンス鎖が構成されている。
センス鎖：ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
センス鎖：ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【００５４】
本発明にかかる核酸は、遺伝子組み換え技術（具体的な一例としては、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを２本鎖化するなどの手法）、化学的または酵素的合成等の公知技術を適宜用いることによって製造することができる。
【００５５】
＜３＞プロサイモシンαの発現抑制を利用した細胞増殖および浸潤の抑制方法
本発明にかかるプロサイモシンαの機能抑制方法の一実施形態として、上記＜２＞記載の核酸を、プロサイモシンαを発現している細胞に導入してプロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することにより、プロサイモシンαの機能を抑制することができる。ここで、本発明の発現抑制方法において、「プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制する」とは、プロサイモシンαの生成を減少させることを意味する。通常、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量が減少すれば（図７Ｂ参照）、プロサイモシンαの生成が抑制されるため（図７Ａ参照）、発現抑制のアッセイ系は、ｍＲＮＡのレベルを測定するものであっても良い。すなわち、ｍＲＮＡ量が実質的に減少していれば、その変化の幅の大小にかかわらず、プロサイモシンαの発現抑制が実現されているとみなせる。上記＜２＞で述べた核酸を用いる本発明のプロサイモシンαの発現抑制方法によれば、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量を、ほぼ完全に無くすことが可能となり、また、当該核酸を用いれば、プロサイモシンαの発現抑制効果が１０日間程度持続する。
【００５６】
細胞に核酸としてｓｉＲＮＡを導入する方法は、常法に従い、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどで、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に取り込ませることもできる。あるいは、規定配列およびオーバーハング部からなる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、同様の方法によって、細胞内に導入する（ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ０１／４９８４４）こともできる。
【００５７】
本発明にかかるプロサイモシンαの発現抑制方法によれば、プロサイモシンα遺伝子を標的として効率よくＲＮＡ干渉を生じさせる核酸を用いるため、効率よく、また簡便にプロサイモシンαの発現を抑制することが可能となる。さらに、後述の実施例２で示すように、プロサイモシンα遺伝子の発現抑制によって前立腺癌細胞の増殖および浸潤を抑制することができる。したがって、この方法を前立腺癌や前立腺上皮内腫瘍の患者に適用することにより、当該疾患の進行を抑制・阻害でき、それらの腫瘍に対する有効な治療方法が得られる。
【００５８】
＜４＞前立腺癌の検定方法
本発明にかかる前立腺癌の検定方法は、採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、前記試料中のプロサイモシンαの発現レベルに基づいて検定を行うことを特徴とする。言い換えれば、プロサイモシンαを前立腺癌の診断用マーカーとして利用する。
【００５９】
後述の実施例１で示すように、前立腺癌の進行とプロサイモシンαの発現量との間には、有意な相関が見られる。例えば、正常な前立腺上皮、前立腺上皮内腫瘍、前立腺癌の各場合について採取した細胞では、プロサイモシンαの発現量が前立腺癌の場合で最も多く、次いで、前立腺上皮内腫瘍の場合が多い（例えば、図２参照）。また、Gleasonパターンが２、３、４、５の各細胞では、パターン５の場合でプロサイモシンαの発現量が最も多く、パターン２に向かって順次発現量が低下する（例えば、図５参照）。したがって、このような相関関係に基づき、プロサイモシンαの発現量を用いることによって前立腺癌の進行度を判定することが可能となる。この方法を前立腺癌の診断に適用することにより、診断精度の向上が図られ、有効かつ簡便な診断が実現可能となる。
【００６０】
例えば、本発明の方法の一態様として、生検で取得した試料に対し、免疫組織化学的分析によりプロサイモシンαの発現量を測定してもよい。具体的には、後述の実施例１で示すように、酵素標識抗体法であるABC法（avidine-biotinylated peroxidase complex法）によりプロサイモシンαの発現量を測定し、当該測定結果に基づいて、前立腺癌の進行度を判定してもよい。この場合、隣接する正常前立腺管腔上皮の発現量と比較し、前立腺癌組織において、プロサイモシンαの発現量が少なければ進行度が低く、発現量が多ければ進行度が高いと判定する。かかる判定は、所定のプロサイモシンα発現量を閾値とし、かかる閾値に基づいて行ってもよい。
【００６１】
さらに、本発明にかかる検定方法は、組織病理学上の分類方法（具体的には、従来の病期分類法やGleasonスコア等）に基づく検定方法や、ＰＳＡおよびＰＡＰに基づく検定方法や、直腸診に基づく検定方法等と併用して用いてもよい。それにより、より精度の高い診断が可能となる。病期分類はJewett Staging systemを用いてもよい。この分類は病期Aは臨床的に前立腺癌と診断されず、前立腺手術においてたまたま組織学的に診断された前立腺に限局する癌を指し,A1は限局性の高分化腺癌、A2は中あるいは低分化腺癌、あるいは複数の病巣を前立腺内に認めるものである。病期Bは前立腺に限局している腺癌で、B0は触診では触れず、PSA高値にて精査され組織学的に診断されるもの、B1は片葉内の単発腫瘍、B2は片葉全体あるいは両葉に存在するものを指す。病期Cは前立腺には留まっているが前立腺被膜は越えているか、精嚢に浸潤するもので、C1は臨床的に被膜外浸潤が診断されたもの、C2は膀胱頸部あるいは尿管の閉塞を来したものを指す。病期Dは転移を有するもので、D0は臨床的には転移を認めないが、血清酸性フォスファターゼの持続的上昇を認め、転移の存在が強く疑われるもの、D1は所属リンパ節転移を有するもの、D2は所属リンパ節以外のリンパ節転移、骨、その他臓器への転移、D3はD2に対する適切な内分泌療法後の再燃したものを指す。またGleason分類はThe Veterans Admionistration Cooperative Urological Research Group (VACURG)による1960年から1975年における患者の解析から生まれた分類である。基本的に低倍率で組織を顕微鏡観察して診断し、前立腺癌をその組織構築と浸潤様式により分類し、それをスコア化してGleason patternとして優位な組織像のスコアと次に優位な組織像のスコアを合計するものである。具体的にはGleason patternは１から５まで５段階に分類され、最も多くの面積を占める組織像をPrimary pattern、次に優位な組織像をsecondary patternとする。GleasonスコアはPrimary patternおよびsecondary patternの合計として示されるがsecondary patternが5%以下ならPrimary patternを２倍する。実例としてPrimary pattern 4, secondary pattern 5の症例のGleasonスコアは9であり、Gleasonスコア 4+5=9と表記する。
【００６２】
このように、本発明にかかる前立腺癌細胞の検定方法によれば、簡便かつ高精度で前立腺癌の診断（具体的には、進行の程度等の診断）が可能となる。前立腺癌は、悪性度の低い初期の小さな腫瘍細胞から悪性度の高い大きな癌に変化していく速度が極めて遅いことから、上記効果を奏する本発明の利用により、前立腺癌の早期発見および早期治療が可能となる。それにより、癌の進行を有効に抑制することが可能となり、癌による死亡率の低下が図られる。
【００６３】
＜５＞前立腺癌診断キット
本発明にかかる前立腺癌診断キットは、当該癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、被検体から採取した試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする。このような前立腺癌診断キットの構成は、上記＜４＞記載の検定方法を実現できる構成であれば特には限定されないが、例えば、プロサイモシンαの発現量の検出手段は、酵素標識抗プロサイモシンα抗体及び／または該酵素の基質であってもよく、あるいは、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量を測定するための試薬、例えばPCRの場合、TAQポリメラーゼ及び／またはプライマーであってもよい。かかるキットは、このような検出手段以外に、適宜、バッファー等の試薬類を含んで構成される。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。以下においては、プロサイモシンαを「ＰＴＭＡ」と記すことがある。
【００６５】
実施例１：前立腺癌の進行とプロサイモシンα遺伝子の発現との関係
実施例１において、前立腺癌の進行とプロサイモシンα遺伝子の発現との関係を調べるため、正常な前立腺、前立腺肥大症(ＢＰＨ)、限局性前立腺癌、ホルモン耐性前立腺癌の生検から試料を採取した。そして、各試料を用いて、１）ステージ（病期）分類および２）Gleasonスコアに基づく前立腺癌の進行度判定、リンパ節転移の確認、プロサイモシンαの発現量の測定、を行った。なお、ここでは、１）の方法として、米国泌尿器科学会（ＡＵＡ）により開発されたＡＵＡ分類システムを用いた。
以下、実施例１について、項目に沿って詳細に説明する。
【００６６】
１−１．試料
正常な前立腺の試料（n=5）は、膀胱癌のための膀胱前立腺全摘術を受けた患者から取得した。前立肥大症(ＢＰＨ)の試料（n= 15）は、前立腺肥大症のための局部的前立腺切除を受けた患者から取得した。限局性前立腺癌の試料（n= 59）は、前立腺癌のために前立腺全摘術を受けた患者から取得した。これらの試料を採取した患者は、いずれも、化学療法、放射線療法、ホルモン療法を予め受けていない。また、ホルモン耐性前立腺癌の試料（n=9）は、ホルモン療法にもかかわらず当該癌が進行して死亡したヒト検体から死後３〜４時間以内に採取した。
【００６７】
１−２．免疫組織化学的分析
ここでは、酵素標識抗体法であるavidine-biotinylated peroxidase complex法（以下、ＡＢＣ法と記載する）を用い、試料中におけるプロサイモシンαの発現レベルを調べた。ここでは、後述するように、ＡＢＣ法を用いた分析で取得された吸光度（Optical Density：Ｏ．Ｄ．）を、プロサイモシンαの発現レベルとした。
【００６８】
具体的には、まず、従来の方法にしたがって、採取した上記各試料をアルコール脱水およびパラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。続いて、脱パラフィン後、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中、当該切片を１２０℃で５分間オートクレーブし、その後、０．５％Ｈ２Ｏ２のメタノール溶液で３０分間処理した。さらに、この切片を、希釈した抗プロサイモシンα抗体（一次抗体に相当）とともに２時間室温で培養し、その後、ＰＢＳ中、スキムミルクを用いて３０分間培養した。抗プロサイモシンα抗体は、Alexis Biochemicals社製のanti-ProTα MAb（clone ２Ｆ１１）を用いた1:3,000）。続いて、切片を、ビオチン化二次抗体であるbiotin-labeled horse anti-mouse IgGと３０分間反応させた。この場合、免疫反応は、市販のavidin-biotin complex(Vector laboratories Inc.社製の「Vectastain ABC elite kit」)を用いて行った。その後、切片を3’3-diaminobenzidine（ＤＡＢ）で処理して発色させた。その後、光学顕微鏡による観察のため、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて切片の染色（ＨＥ染色）を行った。
【００６９】
なお、上記のＡＢＣ法や染色において、記載を省略した処理工程や試薬等については、従来法に順じている。また、ネガティブコントロールとして、上記の抗プロサイモシンα抗体を用いた実施例と並行して、１次抗体で処理しない実験も行い、抗プロサイモシンα抗体の特異性の確認を行った（後述の図１Ｃ参照）。
【００７０】
上記のようにＡＢＣ法で処理した切片に対し、光学顕微鏡で観察するとともに、住化テクノサービス株式会社製のImage Processor for Analytical Pathology（ＩＰＡＰ−ＷＩＮ）を用いて、プロサイモシンαの定量を行った。具体的には、病巣の腺構成成分における吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、得られた測定値をプロサイモシンαの発現レベルとみなした。
【００７１】
１−３．結果
図１Ａ〜１Ｌは、各切片の顕微鏡写真である。図１Ｂ〜図１Ｌにおいて、図中の黒色部分がプロサイモシンαの発現部分に相当する。以下、図１Ａ〜図１Ｌの詳細を述べる。
【００７２】
図１Ａ〜図１Ｃは、後述の図３の患者２の場合における前立腺の連続切片であり、図１Ａは、ＨＥ染色の結果を示し、図１Ｂは、抗プロサイモシンα抗体を用いた抗体染色の結果を示し、図１Ｃは、ネガティブコントロール（１次抗体無し）の結果を示す。図１Ａ〜図１Ｃにおいて、図中の矢印ｓの部分は正常上皮であり、矢印ｔの部分は腺癌である。
【００７３】
図１Ｄは、図３の患者２の前立腺正常上皮におけるプロサイモシンαの発現を示す。図１Ｅは、前立腺肥大症(ＢＰＨ)の前立腺におけるプロサイモシンαの発現を示す。図１Ｆは、図３の患者５１の前立腺上皮内腫瘍(ＰＩＮ)におけるプロサイモシンαの発現を示す。
【００７４】
図１Ｇ〜図１Ｌは、前立腺癌におけるプロサイモシンαの発現を示している。具体的に、図１Ｇは、図３の患者４４の前立腺癌におけるGleasonパターン３の原発巣での発現を示す。図１Ｈは、図３の患者２０の前立腺癌におけるリンパ節に転移した癌での発現を示す。図１Ｉは、図３の患者２０の前立腺癌におけるGleasonパターン５の原発巣での発現を示す。図１Ｊは、図３の患者５７の前立腺癌におけるGleasonパターン４の原発巣での発現を示す。図Ｋは、図３の患者５７の前立腺癌におけるGleasonパターン４の原発巣での発現を示す。図１Ｌは、後述の図４の患者ａ３の前立腺癌におけるGleasonパターン５の原発巣での発現を示す。
【００７５】
図２は、前立腺切除により採取された、正常上皮、前立腺肥大症(ＢＰＨ)、前立腺上皮細胞内癌(ＰＩＮ)、および前立腺癌（Ｃａｎｃｅｒ）の各々の場合におけるプロサイモシンαの発現レベルを示している。ここでは、前立腺肥大症の１５の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、前立腺上皮内腫瘍の４９の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、前立腺癌の１４０の病巣におけるプロサイモシンαの発現レベル、５９人の前立腺癌患者の正常な上皮におけるプロサイモシンαの発現レベルについてそれぞれ調べた結果を示す。図中の縦軸は、プロサイモシンαの発現レベルに相当する吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。また、図中の「＃＃＃」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、p<0.0001の有意差をもって正常上皮から前立腺上皮内腫瘍、癌という悪性への進展に従い発現が上昇していくことを示している。また、「＊＊＊」は正常上皮およびＢＰＨに比較してp<0.001で有意に発現差があることを示している。
【００７６】
図３は、上述した方法で行った、前立腺癌の５９の患者における病期分類、Gleasonスコアおよびパターン、ならびにプロサイモシンαの発現レベルを示す図である。図３において、「Stage」の欄は、前述した上記１）の方法による病期分類を示している。「Gleason’s score」の欄は、前述した上記２）の方法によるGleasonスコアを示している。「signal intensity(O.D.)/Gleason’s pattern」の欄は、腺癌成分のGleasonパターンによる分類、および当該成分の領域における吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。「lymph node metastasis」の欄は、リンパ節転移が存在する場合の当該領域の吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。
【００７７】
図３の見方を説明すると、例えば、患者１の場合、病期分類は「Ｂ１」であり、Gleasonスコアは「６」であり、Gleasonパターンが「３」である病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で１８．０４である。この場合、リンパ節転移は、見られなかった。また、患者５７の場合、病期分類は「Ｄ１」であり、Gleasonスコアは「９」であり、Gleasonパターンが「４」である最も面積の大きい病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で６７．６７であり、Gleasonパターンが「５」である二番目に面積の大きい病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現量は吸光度で７８．０３であり、Gleasonパターンが「３」である病巣の腺癌成分におけるプロサイモシンαの発現レベルは吸光度で４０．９４であり、リンパ節転移部分のプロサイモシンαの発現レベルは吸光度（Ｏ．Ｄ．）で５４．４２である。このように、患者５７の場合には、１つの試料において、Gleasonパターンの異なる複数の腺癌が見られた。
【００７８】
図４は、ホルモン耐性前立腺癌により死亡した患者から試料を採取したａ１〜ａ９の９つの患者におけるGleasonパターンとプロサイモシンαの発現レベルとを示す図である。図４において、「Lesion」の欄は病巣の範囲を示しており、当該欄の「ＬＮ」の記載は、Lymph Nodeの略である。
【００７９】
図５は、組織学的な分類であるGleasonパターンとプロサイモシンαの発現レベルとの関係を示す図であり、パターン２からパターン５の各々におけるプロサイモシンαの発現レベルを示している。図５において、縦軸は、プロサイモシンαの発現レベルに相当する吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示している。また、図中の「＃＃＃」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、p<0.0001の有意差をもってGleasonパターン増加という悪性指標に従って発現が上昇していくことを示している。また、「＊＊＊」は、Gleasonパターン２や３に比較してp<0.001で有意に発現差があることを示している。
【００８０】
以下、図１Ａ〜図１Ｌ、図２、図３、図４および図５を参照して実施例１の結果を詳述する。図１Ａに示すように、プロサイモシンαは、細胞質（エオジンで赤く染色される図１Ａ中の暗色部分）および核（ヘマトキシリンで青く染色される部分であり図１Ａ中の透明部分に相当）の両方において免疫組織化学的に陽性を示すことから、細胞質および核の両方にプロサイモシンαが存在することが明らかになった。また、図１Ｄ〜図１Ｌおよび図２に示すように、プロサイモシンαは、正常な前立腺上皮、前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）および前立腺癌のいずれの場合においても発現するが、前立腺肥大症の場合は正常な前立腺上皮と同程度の低い発現レベルであるのに対して、前立腺上皮内腫瘍および前立腺癌の場合では、前立腺肥大症の場合や正常な前立腺上皮の場合に比べて、高い発現レベルを示す。正常な前立腺上皮では、分泌細胞の方が基底細胞に比べてプロサイモシンαの発現レベルが高かった。
【００８１】
図３〜図５に示すように、プロサイモシンαの発現レベルは、前立腺癌の進行に伴って増加した。このようなプロサイモシンαの発現レベルは、従来の病期分類法およびGleasonスコアに対して統計的に意味がある、言い換えれば、プロサイモシンαの発現レベルは病期分類法およびGleasonスコアと有意な相関を有している。例えば、病期分類法やGleasonスコアのような組織学的パターンに基づく診断で癌進行度が低いと判定された場合は、プロサイモシンαの発現量が低く、当該診断で癌進行度が高いと判定された場合は、プロサイモシンαの発現量が高いという相関関係が成り立つ。具体的には、病期分類法およびGleasonスコアとプロサイモシンαの発現量との間では、スピアマンの順位相関係数の検定における順位相関係数の有意水準Ｐが病期分類法およびGleasonスコアに対してそれぞれp<0.05、p<0.01であり、また、図５に示すように、Gleasonパターンとプロサイモシンαの発現量との間におけるスピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐはp<0.0001であった。また、図３に示すように、死亡に至る患者では、ほとんど全ての場合においてGleasonパターンが５であり、この場合のプロサイモシンαの発現量は高レベル、具体的には、多くの患者においてプロサイモシンαの発現レベル（Ｏ．Ｄ．値）が５０．０以上となることが示された。
【００８２】
以上より、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べることにより、前立腺癌の進行度を検定することができることが明らかである。
【００８３】
実施例２．ｓｉＲＮＡを用いた前立腺癌細胞におけるプロサイモシンα遺伝子の発現抑制
実施例２においては、前立腺癌細胞におけるプロサイモシンα遺伝子の発現を、ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉により抑制し、それにより、前立腺癌細胞の細胞増殖および浸潤を抑制した。以下、詳細を各項目に沿って説明する。
【００８４】
２−１．プロサイモシンαの発現系選択
ここでは、プロサイモシンαを発現するヒト前立腺癌細胞を選択するため、ヒトの前立腺癌細胞系であるＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１を準備するとともに、前立腺上皮細胞であるＰｒＥＣを準備した。ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１は、American Type Culture Collectionから取得し、ＰｒＥＣは、Cambrex BioScience Walkersville,Inc.社製のものを用いた。
【００８５】
これらの前立腺細胞系ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、２２Ｒｖ１およびＰｒＥＣについて、抗プロサイモシンα抗体を用いた免疫ブロット法により、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べた。プロサイモシンα（clone ２Ｆ１１）のモノクローナル抗体は、Alexis Biochemicals社製のものを用いた。また、コントロール実験として、これらの前立腺細胞系におけるβ−アクチンの発現を抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いて同様の方法により調べた。
【００８６】
免疫ブロット法については、従来技術に従った。ここでは、まず、下記組成を有するＲＩＰＡ緩衝液に細胞を溶解させた。
【００８７】
＜ＲＩＰＡ緩衝液の組成＞
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１％ ＮＰ−４０、０．５％ sodium deoxycholate、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ phenylmethylsulphonyl fluoride、１ｍＭ sodium orthovanadate、Protease inhibitor cocktail（Roche Diagnostics社製）
かかる細胞溶解物中から１０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動し、分画したタンパク質を２０ｍＭの酢酸ナトリウム液（ｐＨ５．２）を用いてニトロセルロース膜に移し、０．５％グルタルアルデヒドで５分固定した。続いて、ニトロセルロース膜を５％脱脂乳／ＴＢＳ溶液でブロッキングした後、TBS中に１０００分の一希釈した抗プロサイモシンα抗体と室温で１時間反応させた。そして、同様に、二次抗体である抗マウスＩgＧ抗体（1:10,000、 アマシャム バイオサイエンス株式会社）と１時間反応させた。その後、ECL plus western blotting detection試薬（Amersham Biosciences社製：「Piscataway」）を用いて、プロサイモシンαのバンドの検出を行った。なお、内部マーカーとして、β−アクチンについても、プロサイモシンαの場合と同様の方法により分析を行った。
【００８８】
図６に、ＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、２２Ｒｖ１およびＰｒＥＣにおける上記免疫ブロット法の結果を示す。前立腺癌細胞であるＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３および２２Ｒｖ１ではプロサイモシンαの発現が見られたが、前立腺上皮細胞であるＰｒＥＣでは、プロサイモシンαの発現がほとんど見られなかった。本実施例では、免疫ブロット法の結果と、後に述べる浸潤能検討実験を行いやすい点とを考慮し、プロサイモシンαの発現系に前立腺癌細胞であるＰＣ３及びＬＮＣａＰを用いた。
【００８９】
２−２．ＰＣ３に導入するｓｉＲＮＡの作製とＰＣ３細胞への導入
ＰＣ３に導入するｓｉＲＮＡとして、以下のｓｉＲＮＡ（株式会社ＲＮＡｉ社製）を用いた。具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有する２１塩基のセンス鎖ＲＮＡと、配列番号２に示す塩基配列を有する２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡとから構成されるｓｉＲＮＡ（以下、このｓｉＲＮＡをＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１と呼ぶ）を準備するとともに、ネガティブコントロールとして、配列番号５に示す塩基配列を有する２１塩基のセンス鎖ＲＮＡと、配列番号６に示す塩基配列を有する２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡとから構成されるｓｉＲＮＡ（以下、このｓｉＲＮＡをＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡと呼ぶ）を用意した。これらの２本鎖ｓｉＲＮＡは、上記配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＮａＣｌ反応溶液中、９０℃で３分間加熱し、そして、３７℃で１時間インキュベートした後に、室温になるまで放置して会合させることにより作製された。なお、これらの２本鎖ｓｉＲＮＡを、２％アガロースゲルで電気泳動し、センス鎖とアンチセンス鎖との会合を確認した。
【００９０】
＜ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
＜Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＧＵＡＣＣＧＣＡＣＧＵＣＡＵＵＣＧＵＡＵＣ（配列番号５）
アンチセンス鎖：ＵＡＣＧＡＡＵＧＡＣＧＵＧＣＧＧＵＡＣＧＵ（配列番号６）
ＰＣ３細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（InVitrogen社製）に０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を添加したものを用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。ｓｉＲＮＡのＰＣ３細胞への導入は、Amaxa社製のNucleofector IIを用い、１x１０６個の細胞に、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをそれぞれ３μｇ導入した。導入操作は当該機器のマニュアルに従って行った。
【００９１】
２−３．ＬＮＣａＰに導入するｓｉＲＮＡの作製とＬＮＣａＰ細胞への導入
ＬＮＣａＰに導入するｓｉＲＮＡとして、以下のＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２（株式会社ＲＮＡｉ社製）を用いた以外は、２−２と同様にｓｉＲＮＡを調整した。なお、ネガティブコントロールとしては、２−２と同様に、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを用いた。
【００９２】
ＬＮＣａＰ細胞の培養及びｓｉＲＮＡの導入も、ＰＣ３細胞と同様に行った。
【００９３】
＜ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２の塩基配列（５’→３’）＞
センス鎖：ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
アンチセンス鎖：ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【００９４】
２−４．ｓｉＲＮＡによるプロサイモシンαの発現抑制
＜１＞免疫ブロット法による解析
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをＰＣ３細胞へ導入し４８時間後に、ＰＣ３細胞を、５×１０３個／２００μｌ培地の濃度で９６穴プレートにトランスファーし、さらに培養を続けた。そして、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後および７日後に細胞を回収し、前述した免疫ブロット法を用いてプロサイモシンαの発現量を解析した。
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを、同様にＬＮＣａＰ細胞へ導入し、今回は、３日後、５日後、７日後、１０日後および１４日後に細胞を回収し、プロサイモシンαの発現量を解析した。
【００９５】
＜２＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法による解析
さらに、ここでは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を調べた。このリアルタイムＲＴ−ＰＣＲでは、RNeasy Mini kit（Qiagen社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Superscript II（InVitrogen社製）と下記塩基配列を有するプライマー対Ａ（配列番号７および配列番号８）とを用いて、逆転写によりプロサイモシンαにかかるｃＤＮＡを取得し、ＰＣＲで増幅させて発現を測定した（ 94℃5秒、60℃15秒、72℃30秒を 40cycle ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおける測定データの収集および分析は、LightCycler（Roche Diagnostics社製）を用いて行った。
【００９６】
プライマー対Ａ（５’→３’）
ＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＧＣ（配列番号７）
ＧＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＧＴＣ（配列番号８）
また、ここでは、ＧＡＰＤＨを内部コントロールとして利用し、ＧＡＰＤＨについてプロサイモシンαの場合と同様の操作を行ってＧＡＰＤＨの検出結果に基づきプロサイモシンαの測定結果を標準化した。ＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲにおいては、下記塩基配列を有するプライマー対Ｂ（配列番号９および配列番号１０）を用いた。
【００９７】
プライマー対Ｂ（５’→３’）
ＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧ（配列番号９）
ＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号１０）
本実施例では、このようなプロサイモシンαおよびＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲによる発現測定を３回行った。
【００９８】
結果
図７Ａは、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡをいずれも導入しなかった未処理の場合（図中の矢印ａで示す）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂで示す）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃで示す）における、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後、および７日後の免疫ブロット法の結果を示す図である。また、図７Ｂは、未処理の場合（図中の矢印ａで示す）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂで示す）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃで示す）における、ｓｉＲＮＡ導入から３日後、５日後、および７日後のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。図７Ｂ中において、縦軸は、未処理の場合のｍＲＮＡ量を１とした相対量を示している。また、図中の「＊＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡおよび未処理の場合に対し、p<0.0001であることを示している。
【００９９】
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（矢印ｃの場合）には、導入から７日後においてもプロサイモシンαの発現が抑制されており（図７Ａ参照）、また、プロサイモシンαのｍＲＮＡ量が少なかった (図７Ｂ参照)。一方、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（矢印ｂの場合）には、未処理の場合（矢印ａの場合）と同様のプロサイモシンαの発現（図７Ａ参照）およびｍＲＮＡ量（図７Ｂ参照）が検出された。このことから、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１は、プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせて、それにより、プロサイモシンαの発現を抑制することが明らかとなった。
【０１００】
また、図８に示すように、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２を導入したＬＮＣａＰ細胞においても、ｓｉＲＮＡ導入後５日目までは、完全にｍＲＮＡが消失したが、７日目に少し発現が回復し、１４日目には、ほぼｓｉＲＮＡによる発現阻害効果は無くなった（図８）。
このように、どちらの場合においても、少なくとも１週間は、ｓｉＲＮＡによる発現阻害効果が有効に生じていた。
【０１０１】
２−５．ＰＣ３へのｓｉＲＮＡ導入による細胞増殖・浸潤抑制
ｓｉＲＮＡ導入によるＰＣ３の細胞増殖及び浸潤を調べるため、以下の解析を行った。この２つの分析においては、下記のようにＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入したものおよびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入したものについて調べるとともに、いずれのｓｉＲＮＡも導入しないで同様の処理を行った非処理のものについても調べた。
【０１０２】
＜１＞細胞増殖
ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＰＣ３を、５×１０３個／２００μｌ培地の濃度で９６穴プレートに植えて培養するとともに、ＷＳＴ−１アッセイ法のマニュアルに従い、培地にＷＳＴ−１（Roche Diagnostics社製）を添加した。そして、ｓｉＲＮＡ導入から３日後および５日後の生細胞におけるＷＳＴ−１の吸光度を分光光度計を用いて測定し、細胞数を算定した。ＷＳＴ−１は、セルトランスフェレーション試薬であるテトラゾリウム塩であり、細胞におけるＷＳＴ−１の吸光度を測定することにより、細胞の代謝活性を測定し、細胞数とするアッセイシステムである。ここでは、このようなＷＳＴ−１アッセイ法による細胞数の測定を、それぞれ３回ずつ行った。
【０１０３】
＜２＞浸潤
細胞浸潤を促進する化学誘引物質であるフィブロネクチンを１０μｇ／ｍｌ含有する上記ＲＰＭＩ１６４０培地を分注した２４穴プレートの各ウエルに、Matrigel MatrixでコートしたCell culture insert（BD Biosciences社製）を入れた。そして、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＣｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後のＰＣ３のうち、ＰＲＭＩ１６４０培地中を浮遊する細胞（１×１０５個）をCell culture insertに播種し、５％CO2存在下、３７℃で２２時間培養した。培養後、Saitoらの方法（Saito K,Oku T,Ata N,Miyashiro H,Hattori M,Saiki I,A modified and convenient method for assessing tumor cell invasion and migration and its application to scriining for inhibitors.Biol Pharm Bull 1997;20(4):345-348）に従い浸潤能に対する影響を検討した。具体的にはCell culture insertをメタノールに浸して細胞を５分間固定した後、0.5%クリスタルバイオレットで30分間染色した。その後、蒸留水で洗浄しCell culture insertの膜上面に存在する細胞を綿棒で完全に除去した後十分に風乾した。その後Cell culture insertから膜を切り離して96-well plate内に入れ、各wellに１００μL ３０％酢酸を加えて５分間インキュベートし、膜下面に浸潤した細胞からクリスタルバイオレット色素を溶出した。浸潤細胞数に比例して色素の溶出量は増加するので、波長５９０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定することで浸潤細胞数を定量的に評価した。ここでは、このようなアッセイを３回行った。
【０１０４】
結果
図９は、未処理の場合（図中の矢印ａの場合）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中の矢印ｂの場合）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中の矢印ｃの場合）における、導入から３日後および５日後の上記＜ｂ−１＞のＷＳＴ−１アッセイの結果を示す図である。図９の縦軸は、３日後、および５日後の各経過時における未処理の場合の細胞数を１００％とした相対量を示している。また、図中の「＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの場合および未処理の場合に対し、p<0.01であることを示している。このグラフから、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入したＰＣ３においては、細胞増殖が抑制されていることが明らかである。
【０１０５】
図１０および図１１は、細胞浸潤を観察するための＜ｂ−２＞の分析における、未処理の場合（図中のａの場合）、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡを導入した場合（図中のｂの場合）、およびＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１を導入した場合（図中のｃの場合）の結果を示す図である。図１０は、これらの各場合において取得された波長５９０ｎｍ帯の吸光度(Ｏ．Ｄ．)を示している。図中の「＊＊」は、スピアマンの順位相関係数の検定において、順位相関係数の有意水準Ｐが、Ｃｏｎｔ．−ｓｉＲＮＡの場合および未処理の場合に対し、p<0.01であることを示している。図１１は、これら各場合の顕微鏡写真である。図１０および図１１に示すように、膜下面に浸潤したPC3細胞数は未処理、Cont.-siRNAの場合に比較してPTMA-siRNA導入により顕著に減少した。ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１導入の場合（ｃの場合）、すなわち図７Ａおよび図７Ｂで前述したＲＮＡ干渉によってプロサイモシンαの発現が抑制される場合には、浸潤が抑制されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明の実施例１における、ＡＢＣ法によるプロサイモシンαの発現分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例１における、正常上皮、前立腺肥大症、前立腺上皮細胞内癌、および前立腺癌の各場合のプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図３】本発明の実施例１における、前立腺切除を行った５９の患者についての従来法による診断およびプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図４】本発明の実施例１における、検体から試料採取した場合についての従来法による診断およびプロサイモシンαの発現量を示す図である。
【図５】本発明の実施例１における、前立腺癌病巣のGleasonパターンとプロサイモシンαの発現量との相関を示す図である。
【図６】本発明の実施例２における、前立腺細胞系でのプロサイモシンαの発現を免疫ブロット法で分析した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例２における、ＰＣ３細胞に対する、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１のプロサイモシンα発現抑制効果を示す図である。
【図８】本発明の実施例２における、ＬＮＣａＰ細胞に対する、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ２のプロサイモシンα発現抑制効果を示す図である。
【図９】本発明の実施例２における、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果をＷＳＴ−１アッセイ法で分析した結果示す図である。
【図１０】本発明の実施例２における、フィブロネクチンを細胞増殖促進剤として添加した場合のＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果をＷＳＴ−１アッセイ法で分析した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２における、ＰＴＭＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞増殖抑制効果を顕微鏡で調べた結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤であって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
前記機能抑制組成物が、プロサイモシンαの発現を抑制することにより前記プロサイモシンαの機能を抑制する、プロサイモシンαの発現抑制用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することのできる核酸を含有することを特徴とする請求項２記載の抗癌剤。
【請求項４】
プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせることにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項３記載の抗癌剤。
【請求項５】
プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、
２重鎖領域を有し、
前記２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸。
【請求項６】
前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする請求項５記載の核酸。
【請求項７】
前記規則（３）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される１種以上の塩基であることを特徴とする請求項５または６記載の核酸。
【請求項８】
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項９】
前記標的遺伝子の規定配列が、さらに下記（５）の規則；
（５） 導入される被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１０】
２本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項５〜９のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１１】
お前記２本鎖のポリヌクレオチドが、前記２重鎖領域の両端に、３’末端が突出したオーバーハング部を有することを特徴とする請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
１本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項５〜９のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１３】
前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号２に記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項５〜１２のいずれか１つに記載の核酸。
ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
【請求項１４】
前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号３に記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号４に記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項５〜１２のいずれか１つに記載の核酸。
ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【請求項１５】
前記２重鎖領域において、少なくとも前記他方の鎖がＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ構成を有することを特徴とする請求項５〜１４のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１６】
前記他方の鎖の２重鎖領域の３’末端から９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれか１つに記載の核酸を、プロサイモシンαが発現している細胞に導入し、当該プロサイモシンαの発現を抑制することを特徴とするプロサイモシンαの発現抑制方法。
【請求項１８】
前立腺癌に由来する癌細胞に、請求項５〜１６のいずれか１つに記載の核酸を導入することを特徴とする、癌細胞増殖および浸潤の抑制方法。
【請求項１９】
前記癌細胞が、ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖｌ、ＤＵｌ４５およびＰＣ３からなる群から選択される癌細胞であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ほ乳類被検体から採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、
前記試料中のプロサイモシンαの発現量に基づいて検定を行うことを特徴とする検定方法。
【請求項２１】
ほ乳類被検体から採取した試料に対し、前立腺癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、
当該試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする前立腺癌診断キット。
【請求項１】
前立腺癌の治療に用いるための抗癌剤であって、プロサイモシンαの機能抑制用組成物を有効成分として含有する抗癌剤。
【請求項２】
前記機能抑制組成物が、プロサイモシンαの発現を抑制することにより前記プロサイモシンαの機能を抑制する、プロサイモシンαの発現抑制用組成物であることを特徴とする請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
前記発現抑制用組成物が、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することのできる核酸を含有することを特徴とする請求項２記載の抗癌剤。
【請求項４】
プロサイモシンα遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせることにより、プロサイモシンα遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項３記載の抗癌剤。
【請求項５】
プロサイモシンα遺伝子を標的遺伝子とし、当該標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる核酸であって、
２重鎖領域を有し、
前記２重鎖領域における一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（１）〜（４）の規則；
（１） ３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルであり；
（２） ５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンであり；
（３） ３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる一種又は二種以上の塩基がリッチであり；
（４） 塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である
に従う規定配列と相同な塩基配列からなり、そして、
前記２重鎖領域における他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列を有する塩基配列からなる
ことを特徴とする核酸。
【請求項６】
前記規定配列と相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が、前記規定配列の塩基配列と一致することを特徴とする請求項５記載の核酸。
【請求項７】
前記規則（３）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される１種以上の塩基であることを特徴とする請求項５または６記載の核酸。
【請求項８】
前記規則（４）において、塩基数が１３〜２８であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項９】
前記標的遺伝子の規定配列が、さらに下記（５）の規則；
（５） 導入される被検体の全遺伝子配列のうち、前記標的遺伝子以外の他の遺伝子の塩基配列中に、当該規定配列と９０％以上の相同性を有する配列が含まれない
に従う配列であることを特徴とする請求項５〜８のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１０】
２本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項５〜９のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１１】
お前記２本鎖のポリヌクレオチドが、前記２重鎖領域の両端に、３’末端が突出したオーバーハング部を有することを特徴とする請求項１０記載の核酸。
【請求項１２】
１本鎖のポリヌクレオチドから成ることを特徴とする請求項５〜９のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１３】
前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号２に記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項５〜１２のいずれか１つに記載の核酸。
ＣＵＵＣＣＣＧＵＣＵＣＡＧＡＡＵＣＵＡＡＡ（配列番号１）
ＵＡＧＡＵＵＣＵＧＡＧＡＣＧＧＧＡＡＧＵＧ（配列番号２）
【請求項１４】
前記２重鎖領域の一方の鎖が下記配列番号３に記載の塩基配列を有し、かつ、前記２重鎖領域の他方の鎖が下記配列番号４に記載の塩基配列を有する
ことを特徴とする請求項５〜１２のいずれか１つに記載の核酸。
ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＧＧＵＡＵＡＣＵＡＡＡ（配列番号３）
ＵＡＧＵＡＵＡＣＣＧＵＧＣＵＣＵＧＣＣＵＧ（配列番号４）
【請求項１５】
前記２重鎖領域において、少なくとも前記他方の鎖がＲＮＡとＤＮＡとからなるキメラ構成を有することを特徴とする請求項５〜１４のいずれか１つに記載の核酸。
【請求項１６】
前記他方の鎖の２重鎖領域の３’末端から９〜１３ヌクレオチドがＲＮＡであることを特徴とする請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれか１つに記載の核酸を、プロサイモシンαが発現している細胞に導入し、当該プロサイモシンαの発現を抑制することを特徴とするプロサイモシンαの発現抑制方法。
【請求項１８】
前立腺癌に由来する癌細胞に、請求項５〜１６のいずれか１つに記載の核酸を導入することを特徴とする、癌細胞増殖および浸潤の抑制方法。
【請求項１９】
前記癌細胞が、ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖｌ、ＤＵｌ４５およびＰＣ３からなる群から選択される癌細胞であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ほ乳類被検体から採取した試料における前立腺癌の進行度判定に用いられる前立腺癌の検定方法であって、
前記試料中のプロサイモシンαの発現量に基づいて検定を行うことを特徴とする検定方法。
【請求項２１】
ほ乳類被検体から採取した試料に対し、前立腺癌の進行度の判定に用いられる前立腺癌診断キットであって、
当該試料中のプロサイモシンαの発現量を検出する検出手段を含むことを特徴とする前立腺癌診断キット。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−７５０７２（Ｐ２００７−７５０７２Ａ）
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７０８５６（Ｐ２００５−２７０８５６）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【出願人】（５０５３５０３７４）
【出願人】（５０４３１９３６７）株式会社アルファジェン (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【出願人】（５０５３５０３７４）
【出願人】（５０４３１９３６７）株式会社アルファジェン (4)
【Ｆターム（参考）】
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