プロテアーゼ阻害剤
本発明は、乳由来のタンパク質であるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼインの加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤である。
【背景技術】
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシステインプロテアーゼ（チオールプロテアーゼ）と総称されている。カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫは、カルシウム依存性中性プロテアーゼ（ＣＡＭＰ）、パパイン、フィシン、ブロメライン等とともに代表的なシステインプロテアーゼの一つである。そしてこれらシステインプロテアーゼに対して阻害作用を有する物質は、システインプロテアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬等として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテプシンＬ、カテプシンＢと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、それによって、とりわけカテプシンＬ阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある（勝沼信彦著、「ＢＩＯ ｍｅｄｉａ」、第７巻、第６号、第７３〜７７ページ、１９９２年）。骨組織においては、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊（骨吸収）を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に２つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミンＤ誘導体、女性ホルモン（エストロゲン）等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシステインプロテアーゼ群、中でも特にカテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテプシンＬ及びＢは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによって古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテプシンＬ、カテプシンＢ及びカテプシンＫのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、タンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミンＤ、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテプシンＬ阻害、カテプシンＢ阻害、又はカテプシンＫ阻害のいわゆるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている（特開平７−１７９４９６号公報、特表２００２−５０１５０２号公報）が、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。
一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は１０日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシウムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピードが腎臓の処理能力を上回ったとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、このような目的に使用し得るシステインプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下のものが開示されている。
（１）カテプシンＬ特異的阻害ポリペプチド（特開平７−１７９４９６号公報）
（２）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平９−２２１４２５号公報）
（３）バリン誘導体およびその用途（特開２００１−１３９５３４号公報）
（４）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平７−２４２６００号公報）
（５）ＦＡ−７０Ｃ１物質（特開２０００−７２７９７号公報）
（６）ＦＡ−７０Ｄ物質、その製造法及びその用途（国際公開第９７／３１１２２号パンフレット）
しかしながら、食品素材として利用の点から、より汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
他方、これまでに、母乳中にプロテアーゼ阻害物質が存在することが知られている。母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチトリプシンが挙げられ、インターα２−トリプシン阻害物質、α２−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含まれている（清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第８０〜８１ページ）。
乳中において、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質については、すでに以下のものが開示されている。
（１）牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約５７ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−２８９６号公報）
（２）牛初乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−１２６２９４号公報）
（３）人乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規タンパク質およびその製造方法（特開平１０−８０２８１号公報）
（４）牛乳から調製された牛乳由来塩基性シスタチン及び／又は牛乳由来塩基性シスタチン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開２０００−２８１５８７号公報）
（５）乳塩基性蛋白質（ＭＢＰ）中に含まれるシスタチンＣ、及びインビトロにおける該シスタチンＣによる骨吸収阻害効果（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー［Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、日本、第６６巻、第１２号、２００２年、ｐ．２５３１−２５３６）
ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフェリン及びβ−カゼインなどが挙げられる。カゼインは、αｓ−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインに分類され、人乳中のカゼインは、β−カゼインがほとんどであり、αｓ−カゼインは存在しないが、又は痕跡程度認められるのみであるが、牛乳中のカゼインは、αｓ−カゼイン、β−カゼインをほぼ等量含む。カゼインは栄養成分としての働きの他に、最近ではそのタンパク質の一次構造に潜在的に含まれるカルシウム吸収促進作用やマクロファージ貪食活性化作用を有する生理活性ペプチド等が発見され、注目を集めている。また、カゼインは高い栄養価とともに、乳製品の原材料として、あるいは、チーズ、ヨーグルト、スキムミルク等の様々な食品に含まれ、我々の食生活に寄与している。
カゼインを利用した発明としては、本出願人により、すでにκ−カゼイン又はκ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤（特開平８−８１３８８号公報）が開示されている。
また、ヒト乳から分離したβ−カゼイン若しくはその組換え形態又はそのいずれかの水解物は、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着の阻害（特表平１０−５００１０１号公報）、及び哺乳動物細胞のＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）感染阻害（特表平１０−５００１００号公報）が開示されている。
更に、β−カゼイン加水分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性（特開平６−１２８２８７号公報及び特開平６−２７７０９０号公報）が開示されている。
しかしながら、カゼイン及びその部分ペプチドがシステインプロテアーゼ阻害作用を有することは知られていない。
【発明の開示】
本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
本発明者は、抗原性のない、安全な素材として利用する事が可能なシステインプロテアーゼ阻害物質を鋭意探索した結果、乳由来のタンパク質であるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及びカゼインの加水分解物にシステインプロテアーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下の（１）〜（２４）のとおりである。
（１） カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（２） カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である（１）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（３） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（４） 以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（５） カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（６） 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である（５）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（７） 前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である（５）又は（６）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（８） 前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである（５）〜（７）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（９） カゼイン加水分解物を全量に対して０．００５質量％以上含有する、（５）〜（８）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１０）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である（１）〜（９）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１１） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等である（１０）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１２） （１）〜（１１）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
（１３） （１）〜（１１）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
（１４） カゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（１５） カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である、（１４）の使用。
（１６） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（１７） 以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（１８） カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（１９） 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である（１８）の使用。
（２０） 前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である（１８）又は（１９）の使用。
（２１） 前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである（１８）〜（２０）のいずれかの使用。
（２２） カゼイン加水分解物をシステインプロテアーゼ阻害剤の全量に対して０．００５質量％以上含有させることを特徴とする、（１８）〜（２１）のいずれかの使用。
（２３） システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、（１４）〜（２２）のいずれかの使用。
（２４） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等である（２３）の使用。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ乳タンパク質の逆ザイモグラフィーの検出を示す図（写真）である。
図２は、ウシβ−カゼイン及びウシβ−カゼインペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
図３は、パパインに対するカゼイン類のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図４は、β−カゼインのシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを示す図である。
図５は、ヒトβ−カゼイン及びヒトβ−カゼインペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関する。本発明に用いられるカゼインとしては、市販の各種カゼイン、若しくはヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から常法（例えば、等電点沈殿法）により単離したもの、又は遺伝子組換え技術等によって生産されたものであってよい。カゼインは、α−カゼイン、β−カゼイン、及びκ−カゼインに分類されるが、本発明にはいずれのカゼインも用いることができ、好ましくはβ−カゼイン又はκ−カゼインを用いることができる。その中でも特にヒト由来のβ−カゼイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０５８１４に記載のアミノ酸配列を有するヒトβ−カゼイン）、及びウシ由来のβ−カゼイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２６６６に記載のアミノ酸配列を有するウシβ−カゼイン）が好ましい。具体的には、ヒトのβ−カゼインのアミノ酸配列を配列番号１、ウシのβ−カゼインのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明に用いられるカゼインの部分ペプチドとしては、例えば、前記カゼインを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解し、生成した部分ペプチドを精製することにより得ることができる。一例としては、カゼインを１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でリシルエンドペプチダーゼにより３５℃で３時間以上消化し、生成した部分ペプチドを高速クロマトグラフ法等により精製することにより製造することができる。
本発明において使用することができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトβ−カゼイン、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するウシβ−カゼイン、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドも例示することができる。なお、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１５はシグナル配列である。
これらのカゼイン又はカゼインの部分ペプチドはシステインプロテアーゼ阻害活性を有するため、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤に用いることができる。また、完全長のカゼインがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１３３〜１５１を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１４２〜１６０を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらのペプチドは、例えば、本発明によりシステインプロテアーゼ阻害活性領域が明らかになったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数個の位置での１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じることがあるので、本発明に用いることができるカゼイン及びカゼイン部分ペプチドにおいても、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲でこのような変異を含むことが可能である。本発明に用いることができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド、並びに配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチドが例示される。ここで、複数とは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは、２から３個である。
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、又は、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合の複数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは、２から５個である。
さらに、本発明に用いることができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
前記のようなカゼインタンパク質又はペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、改変された塩基配列は従来知られている変異処理によっても取得されうる。変異を有する塩基配列は適当な細胞で発現させ、本発明の実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、カゼイン又はペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明においては、カゼインの加水分解物を用いることもできる。加水分解に用いるカゼインは、前述したようなものを挙げることができる。これらのカゼインを、以下のように加水分解酵素で加水分解することによって、カゼイン加水分解物を得ることができる。
すなわち、まず前記のような原料カゼインを水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で５〜１５％前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。得られた前記カゼインを含有する溶液を７０〜９０℃で１０分間〜１５秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。次いで、前記カゼインを含有する溶液にアルカリ剤又は酸剤を添加し、ｐＨを使用する加水分解酵素の至適ｐＨ又はその付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアルカリ剤又は酸剤であってもよい。具体的には、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等を、酸剤としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸等を例示することができる。
次いで、前記カゼイン溶液に加水分解酵素溶液を添加する。加水分解酵素は蛋白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、動物由来、又は微生物由来の酵素であることが好ましい。また、酵素はエンドペプチダーゼであることが好ましい。エンドペプチダーゼとしては、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ等、種々の酵素を使用することができる。尚、「由来」とは、元来上記の生物が保持していることを意味し、採取原を意味するものではない。例えば、バチルス・ズブチリスが産生するプロテアーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、同遺伝子を発現させることにより製造したプロテアーゼは、バチルス・ズブチリス「由来」である。
加水分解酵素はカゼイン１ｇ当たり２０〜２００活性単位（この単位については後記する）の割合で添加することが好ましい。ここで、活性単位は、例えば、次の方法により測定することができる。すなわち、プロテアーゼを含有する粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社製。以後Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応させ、その後３０％の酢酸溶液２ｍｌを添加して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。プロテアーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量を１活性単位と定義し、次式により求めることができる。
活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ）
ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニトロアニリンの吸光度を示す。
本発明において用いる加水分解酵素は１種でもよく、２種以上用いてもよい。２種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。
酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば３０〜６０℃、望ましくは４５〜５５℃に保持してカゼインの加水分解を開始する。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。尚、本発明において、カゼイン加水分解物の分解率は、６〜４５％が特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の分解率が６％以上であると、より分解が進んでいると考えられる。すなわち、分解率が６％未満であると、酵素反応を受けない未分解のカゼインが残存している可能性が考えられることから、分解率は６％以上が好ましい。
尚、蛋白質の分解率の算出方法は、例えば、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出することができる。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
加水分解反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。尚、得られた反応液は必要に応じてクエン酸等の酸によりｐＨを５．５〜７の範囲に調整しても良い。
本明細書において、数平均分子量とは、数平均分子量に関する文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６乃至１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されるとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。即ち、蛋白質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、蛋白質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の一般式Ｉにより定義される。
［一般式Ｉ］
尚、本発明において数平均分子量を測定する場合は、高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を測定し、検量線からＧＰＣ分析システムによりデータ解析することにより、数平均分子量を算出することができる。高速液体クロマトグラフィーの具体的条件としては、カラムとして、ポリハイドロキシエチル・アスパルアミド・カラム［Ｐｏｌｙ Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ： ポリ・エル・シー（Ｐｏｌｙ ＬＣ）社製。４．６ｍｍ×４００ｍｍ］を使用し、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭギ酸により、溶出速度０．５ｍｌ／分で溶出する条件を挙げることができる。検出はＵＶ検出器（島津製作所。２１５ｎｍ）を使用して分子量分布を測定し、分子量が既知のサンプルにより検量線を作成し、ＧＰＣ分析システム（波長２１５ｎｍ：島津製作所社製）によりデータ解析し、数平均分子量を求めることができる。
尚、本発明において、カゼイン加水分解物の数平均分子量は、２００〜５０００ダルトンが特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の数平均分子量が５０００ダルトン以下である場合は、加水分解反応を受けない未分解のカゼインは含まれず、本願発明の有効成分であるカゼイン加水分解物をより確実に得ることができると考えられることから、数平均分子量は５０００ダルトン以下が好ましい。
得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末、として使用することもできる。
上記のようにして得られるカゼイン加水分解物は、システインプロテアーゼ阻害作用を有する。したがって、システインプロテアーゼ阻害作用を指標として、カゼイン加水分解物を製造する際の条件は、適宜設定することができる。
本発明のプロテアーゼ阻害剤においては、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、または加水分解物を単独で使用することも、これらのうちの２種以上を併用して使用することも可能である。さらに、カゼインの部分ペプチド及び加水分解物は、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。
本発明に用いることができるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物は、カテプシンＢ、Ｌ及びパパイン等のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する。システインプロテアーゼ阻害活性は、Ｂａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］に従って測定することができる。例えば、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解したカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／または加水分解物を含む溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ− Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ− Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ４−Ｍｅｔｈｙｌ− Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ：最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を使用し、これらを公知の製剤学的に許容される製剤担体と組合わせることにより製造することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
本発明の製剤中に含まれるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物の量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％とするのがよい。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与することにより、システインプロテアーゼが関与する疾患を治療することができる。ここで、患者とは、ヒトであってもよいし、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物の量は、０．１〜１２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防・治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌（スタフィロコッカス・アウレウスＶ８等）やウイルス（ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、エイズウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤は、本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、本発明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化して使用時に組み合わせても良い。
本発明の飲食品組成物は、食品又は飲料の原料にカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、経口的に摂取することが可能である。前記原料は、通常の飲料や食品に用いられているものを使用することができる。本発明の飲食品組成物は、システインプロテアーゼ阻害剤を添加する以外は、通常の飲食品組成物と同様にして調製することができる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類：加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。
本発明の飲食品組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％となるように添加すればよい。
本発明の飼料組成物は、飼料にカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。飼料組成物の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示され、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、酵母類等とともに混合して本発明の飼料組成物を製造することができる。
本発明の飼料組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％となるように添加すればよい。
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここに、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
以下に、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の有効成分として使用したカゼインの部分ペプチドまたはカゼイン加水分解物の製造例を示す。
［製造例１］
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドを、以下の方法により製造した。
尚、前記本発明のペプチドは、自動アミノ酸合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａ）を用いて合成を行い製造を行った。
２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン（アプライド・バイオシステムズ社製。以下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する）により、ペプチド合成用固相樹脂であるＨＭＰ樹脂（アプライド・バイオシステムズ社製）のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭＰで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−スレオニン［具体的には、合成するペプチドのＣ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸（アプライド・バイオシステムズ社製）］をＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）リージェントキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。次に、前記Ｆｍｏｃ基の切断、続いて、Ｃ末端から２番目のアミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アラニンの縮合、及び洗浄を行い、さらにＦｍｏｃ−アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、保護ペプチド樹脂を作製し、樹脂より粗製ペプチドを回収した。
前記粗製ペプチドから、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）によりペプチドの精製を行った。使用するカラムは逆相系のＣ１８−ＯＤＳ（メルク社製。Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００）を例示することができる。得られた精製ペプチドはＨＰＬＣ分析を行い、精製物が単一であることを更に確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列を、気相式自動アミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ）を用いて決定した結果、配列番号１のアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有していた。
尚、同様の方法により配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドも製造した。
［製造例２］
市販牛乳カゼイン「アラシッド」（蛋白質含量９０％、ニュージーランドミルクプロダクツ製）１００ｇを６０℃に加熱した精製水に１０％濃度に懸濁し、２．５ｇの水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した。その後、８５℃で１０分間の殺菌を行い、溶解液を５０℃に調整した後、加水分解酵素として、パンクレアチン（天野エンザイム社製、１１２，０００Ｕ／ｇ）を２５００Ｕ添加し、５０℃で４時間保持することによって加水分解し、９０℃で１０加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約１００ｇを得た。得られたカゼイン加水分解物の分解率は９．５％、数平均分子量は９１０ダルトンであった。
［製造例３］
市販カゼインナトリウム「アラネート」（蛋白質含量９０％、ニュージーランドミルクプロダクツ製）１００ｇを５０℃に加熱した精製水に１２％濃度に溶解した。その後、８５℃で１０分間の殺菌を行い、溶解液を４０℃に調整した後、加水分解酵素として、ブタトリプシン（ＰＴＮ６．０Ｓ；ノボザイム社製、１，２５０Ｕ／ｇ）を２５０Ｕ添加し、４０℃で６時間保持することによって加水分解し、９０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約１００ｇを得た。得られたカゼイン加水分解物の分解率は１０．８％、数平均分子量は７５０ダルトンであった。
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、乳中のシステインプロテアーゼ阻害物質を検出するために行った。
（１）検出法
本発明者はプロテアーゼ阻害物質の検出法として「逆ザイモグラフィー」という手法を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロテアーゼ阻害物質の検出を行った。逆ザイモグラフィーとは通常のザイモグラフィーの逆の手法によるものであり、基本的原理は次のとおりである。即ち、ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにプロテアーゼ阻害物質を含むサンプルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲル中のタンパク質を分解する。この操作により阻害物質が存在する部分はプロテアーゼの活性を阻害することから、ゼラチンはプロテアーゼによる分解を免れ、これが染色液によって染色されることにより、阻害物質を識別することが可能となる。
（２）試験方法
本発明における逆ザイモグラフィーの方法は以下のとおりである。
牛乳中の全タンパク質及び天然のウシβ−カゼインをサンプルとし、０．１％ゼラチンを含む１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）を行った。泳動後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に４５分間浸漬して洗浄した後、更に４５分間蒸留水に浸漬する操作を３回繰り返してゲルを洗浄した。このゲルを、１ｍｇパパイン（３１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに浸漬し、３７℃で１０時間保温してゼラチンを消化した。ゲルを蒸留水で洗浄後、染色液（０．０２５％クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）Ｒ−２５０、４０％メタノール、７％酢酸水溶液）で１時間染色し、その後脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸水溶液）で脱色を行った。
これとは別に、対照試験としてゼラチンを含まない１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて前記と同様に逆ザイモグラフィーを行った。さらに、通常の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
（３）試験結果
本試験の結果は図１に示すとおりである。図１は逆ザイモグラフィーのパターンを示す結果である。図１の１レーンは牛乳中の全タンパク質の通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン、２レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザイモグラフィーのパターン、３レーンは牛乳中の全タンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターン、６レーンは天然のウシβ−カゼインの逆ザイモグラフィーのパターン、７レーンは天然のウシβ−カゼインのゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターンを各々示している。尚、図中矢印は天然のウシ由来β−カゼイン（分子量３５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動位置を示している。尚、４レーン及び５レーンは、本試験例とは直接関係がない。
図１から明らかなとおり、２レーンにおいてウシβ−カゼインの泳動位置（３５ｋＤａ）とほぼ同位置に逆ザイモグラフィーのポジティブなバンドが確認された。このことより、牛乳中にシステインプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存在が確認された。また、６レーンにおいて天然のウシβ−カゼインを泳動したパパインを用いた逆ザイモグラフィーにおいて、ポジティブなバンドが確認された。
以上の結果から、ウシ由来のβ−カゼインにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが示唆された。
［試験例２］
本試験は、試験例１においてシステインプロテアーゼ阻害活性が示唆された３５ｋＤａのバンドについてＮ末端アミノ酸配列を決定するために行った。
（１）試験方法
試験例１で使用した牛乳中の全タンパク質サンプルを同様に使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＣＢＢで染色後、３５ｋＤａ付近に泳動された染色バンドを切り出した。このバンドについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図２に示すとおりである。図２は牛乳中の３５ｋＤａ染色バンドのアミノ酸配列を決定した結果である。その結果、３５ｋＤａ染色バンドのＮ末端アミノ酸配列はウシβ−カゼインのそれと完全に一致した。従って、本試験の結果と試験例１の結果の両者から、ウシβ−カゼインはシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例３］
本試験は、カゼイン分子中におけるシステインプロテアーゼ阻害活性を有する領域を検索するために行った。
（１）試験方法
ウシβ−カゼイン２５０μｇを、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、リシルエンドペプチダーゼにより３５℃で１６時間消化した。消化後のウシβ−カゼインペプチド混合物にシステインプロテアーゼ阻害活性が保持されているかどうかを確認するために、システインプロアーゼ阻害活性を測定した。
阻害活性の測定方法はＢａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］を参考にして、次のとおり行った。即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解したウシβ−カゼインペプチド混合物溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣの蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立社製）を用いて測定した。
測定の結果、ウシβ−カゼインペプチド混合物に阻害活性が保持されていることが確認されたので、引き続きペプチド混合物について、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＤＤＳ−８０Ｔｓカラム（東ソー社製）を用いた逆相ＨＰＬＣによるアセトニトリル直線濃度勾配溶出法によって、主要なピークを分離した。次に、分離したピークのサンプル（以下、ペプチドサンプルと記載する。）の各々について、前記と同様の方法でシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
ペプチドサンプルの阻害活性測定の結果、活性を有するペプチドサンプルについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてそのアミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図２に示すとおりである。その結果、阻害活性を有する主要なペプチドサンプルは、図２中のウシβ−カゼインのアミノ酸配列における１４２残基目Ｌｅｕから１６０残基目Ｈｉｓまでのアミノ酸配列（下線部：以下、該配列のペプチドをウシβ−カゼインペプチドと記載する。）を有することが判明した。
［試験例４］
本試験は、カゼイン類のシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として、ウシβ−カゼイン、ウシα−カゼイン、及びウシκ−カゼインを各々用いて、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により前記試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図３に示すとおりである。図３は、ウシβ−カゼイン、ウシα−カゼイン、及びウシκ−カゼインのパパインに対するシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、β−カゼイン及びκ−カゼインは１０−５Ｍの濃度でパパインを完全に阻害し、α−カゼインについても若干弱いながらも１０−４Ｍでパパインの活性をほぼ阻害することが判明した。従って、β−カゼインだけでなく、κ−カゼインやα−カゼインについてシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例５］
本試験は、ウシβ−カゼインのシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料としてウシβ−カゼイン、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬを使用して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図４に示すとおりである。図４は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するウシβ−カゼインの阻害効果を測定した結果である。その結果、ウシβ−カゼインが１０−５Ｍでパパインを完全に阻害することが判明した。またカテプシンＢ及びカテプシンＬについてもウシβ−カゼインが１０−４Ｍでそれらのプロテアーゼ活性をほぼ阻害することが判明した。従って、ウシβ−カゼインはパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬのプロテアーゼ活性を阻害し、幅広いシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを有することが明らかとなった。
［試験例６］
本試験は、ヒトβ−カゼインのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
常法に従って精製したヒトβ−カゼイン（例えば、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス［Ｊ．Ｄａｉｌｙ Ｓｃｉ．］、第５３巻、第２号、第１３６〜１４５ページ、１９７０年、に記載の方法によって精製）、及び実施例１で合成した配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトβ−カゼインのアミノ酸配列）のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド（図５中、ヒトβ−カゼインの下線部ペプチド：以下、該配列のペプチドをヒトβ−カゼインペプチドと記載する。）を各々試験試料として、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果、ヒトβ−カゼインは１０−５Ｍでパパインのプロテアーゼ活性をほぼ完全に阻害することが判明した。また、ヒトβ−カゼインペプチドは、１０−５Ｍでパパインのプロテアーゼ活性を６５％阻害し、１０−４Ｍでパパインのプロテアーゼ活性を完全に阻害することが判明した。
［試験例７］
本試験は、カゼイン加水分解物のシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試料の調製
加水分解物としてパンクレアチンをそれぞれ２０００、８０００、及び９０００ユニット（ｕｎｉｔｓ）添加して製造したこと以外は、製造例２と同一の方法により製造したカゼイン加水分解物を試験試料１、試験試料２及び試験試料３とした。尚、試験試料１、試験試料２及び試験試料３の分解率（％）は、それぞれ８．２、３３．５及び３８．０であった。また、試験試料１、試験試料２及び試験試料３の数平均分子量（ダルトン）は、それぞれ１０２０、２５０及び２１０であった。
（２）試験方法
０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解した試験試料溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼであるパパイン溶液（最終濃度１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣの蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定した。
（３）試験結果
本試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は、各試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を示す。その結果、試験試料１は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を３９％阻害し、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度では６１％阻害した。試験試料２は、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を７６％阻害し、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度においても５０％阻害した。試験試料３は、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を５３％阻害し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で４４％、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度においても３７％阻害した。
【表１】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
（ウシβ−カゼインを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
ウシβ−カゼイン（シグマ社製） ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシβ−カゼイン、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例２】
（カプセル入りウシβ−カゼインの調製）
乳糖（和光純薬工業社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びウシβ−カゼイン（シグマ社製）６００ｇを、５０メッシュ篩（ヤマト科学社製）により篩分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Ｃｅｓｅｒｅ Ｐｅｄｉｎｉ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６ Ｂｏｄｙ、空重量は７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、ウシβ−カゼイン８２ｍｇ入りのカプセル剤７，０００個を得た。
【実施例３】
（ウシβ−カゼインを添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、ウシβ−カゼイン（シグマ社製）１ｇを添加し、ウシβ−カゼイン約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例４】
（ウシβ−カゼインを添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及びウシβ−カゼイン（シグマ社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシβ−カゼインを含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【実施例５】
（ウシカゼイン加水分解物を配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
製造例２で製造したカゼイン加水分解物 ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシカゼイン加水分解物、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例６】
（ウシカゼイン加水分解物を添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、製造例２で製造したウシカゼイン加水分解物１ｇを添加し、ウシカゼイン加水分解物約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例７】
（ウシカゼイン加水分解物を添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及び製造例２で製造したウシカゼイン加水分解物６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシカゼイン加水分解物を含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【産業上の利用の可能性】
以上詳記したとおり、本発明はカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／又はカゼイン加水分解物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）食品素材として利用することができるタンパク質、その部分ペプチド及び／又はその加水分解物であるので、安全性に優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
（２）幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
（３）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
（４）特定保健用食品、栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用することが可能である。
（５）食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なシステインプロテアーゼ阻害剤である。
【背景技術】
活性中心にチオール基を有する蛋白分解酵素はシステインプロテアーゼ（チオールプロテアーゼ）と総称されている。カテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫは、カルシウム依存性中性プロテアーゼ（ＣＡＭＰ）、パパイン、フィシン、ブロメライン等とともに代表的なシステインプロテアーゼの一つである。そしてこれらシステインプロテアーゼに対して阻害作用を有する物質は、システインプロテアーゼが関与するとされる疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、頭部外傷時の意識障害や運動障害、多発性硬化症、末梢神経のニューロパシー、白内障、炎症、アレルギー、劇症肝炎、骨粗鬆症、高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、前立腺肥大症等の治療薬として、あるいは癌の増殖抑制、転移予防薬、血小板の凝集阻害薬等として期待される。また、近年に至り、勝沼等の研究によってカテプシンＬ、カテプシンＢと骨粗鬆症乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症との関係が解明され、それによって、とりわけカテプシンＬ阻害剤の骨粗鬆症治療剤乃至悪性腫瘍性高カルシウム血症治療剤としての医薬への適用が注目されつつある（勝沼信彦著、「ＢＩＯ ｍｅｄｉａ」、第７巻、第６号、第７３〜７７ページ、１９９２年）。骨組織においては、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）による骨形成と、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）による骨吸収が生涯を通じて行われており、成長期には骨形成が骨吸収を上回ることにより骨重量が増加し、一方老年期には逆に骨吸収が骨形成を上回るために骨重量が減少し、骨粗鬆症の発症となる。これら骨粗鬆症の原因としては様々なものがあるが、特に骨崩壊（骨吸収）を主原因の一つとして挙げることができる。これを更に２つの原因に分けると次のようになる。即ち、一つはカルシウムの吸収と沈着不全に起因するものであり、更に詳しくはカルシウムの供給量、転送、吸収、及び沈着が関係するものであり、ビタミンＤ誘導体、女性ホルモン（エストロゲン）等が関与していると考えられる。いま一つは、骨支持組織であるコラーゲンの分解促進を内容とするものであり、破骨細胞内リソゾームから分泌されるシステインプロテアーゼ群、中でも特にカテプシンＬ、カテプシンＢ、カテプシンＫによる骨コラーゲン分解が主たる原因である。破骨細胞内のリソゾームから分泌されたこれらカテプシンＬ及びＢは骨組織中のコラーゲンの分解を促進し、それによって古い骨は溶解され、ヒドロキシプロリンとともにカルシウムが血中に遊離放出させられる。従って、カテプシンＬ、カテプシンＢ及びカテプシンＫのコラーゲン分解能を阻害することによって過剰な骨崩壊を防止することが可能であり、ひいては骨粗鬆症の治療が可能となる。これら骨粗鬆症の治療剤としては、エストロゲン、タンパク同化ホルモン、カルシウム剤、ビタミンＤ、カルシトニン、あるいはビスホスホネート等が知られている。またカテプシンＬ阻害、カテプシンＢ阻害、又はカテプシンＫ阻害のいわゆるシステインプロテアーゼ阻害を作用機序とする骨粗鬆症治療剤についてもいくつかのシステインプロテアーゼ阻害剤をもちいた骨粗鬆症治療剤の開発が進められている（特開平７−１７９４９６号公報、特表２００２−５０１５０２号公報）が、さらなる骨粗鬆症治療剤の開発が望まれている。
一方、高カルシウム血症は、血清中のカルシウム濃度が正常値以上となる代謝異常であり、腫瘍患者に多く見受けられる。これを放置した場合、患者の寿命は１０日程度であると言われている。原因の多くは腫瘍の骨転移である。腫瘍が骨に転移すると、骨破壊が起こり、カルシウムが血中に放出される。このカルシウムは腎臓で処理されるが、骨破壊のスピードが腎臓の処理能力を上回ったとき、高カルシウム血症の発現となる。治療方法としては、フロセミドを併用した生理的食塩水の輸液を用いることにより腎臓からのカルシウム排泄を促進する方法や、骨粗鬆症治療薬であるカルシトニンを使用する方法等が知られている。即ち、骨吸収を抑制するような骨粗鬆症治療薬は悪性腫瘍性高カルシウム血症の治療剤としても有効であるといえる。
本発明者らにより、このような目的に使用し得るシステインプロテアーゼ阻害剤としてすでに以下のものが開示されている。
（１）カテプシンＬ特異的阻害ポリペプチド（特開平７−１７９４９６号公報）
（２）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平９−２２１４２５号公報）
（３）バリン誘導体およびその用途（特開２００１−１３９５３４号公報）
（４）チオールプロテアーゼ阻害剤（特開平７−２４２６００号公報）
（５）ＦＡ−７０Ｃ１物質（特開２０００−７２７９７号公報）
（６）ＦＡ−７０Ｄ物質、その製造法及びその用途（国際公開第９７／３１１２２号パンフレット）
しかしながら、食品素材として利用の点から、より汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤の開発が望まれていた。
他方、これまでに、母乳中にプロテアーゼ阻害物質が存在することが知られている。母乳に含まれるプロテアーゼ阻害物質として知られているものとしては、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチトリプシンが挙げられ、インターα２−トリプシン阻害物質、α２−アンチプラスミン、α２−マクログロブリン、アンチトロンビンＩＩＩ、アンチロイコプロテアーゼなどの阻害剤等も母乳に微量含まれている（清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第８０〜８１ページ）。
乳中において、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質については、すでに以下のものが開示されている。
（１）牛初乳由来の糖鎖を有する分子量約５７ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−２８９６号公報）
（２）牛初乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規システインプロテアーゼインヒビター（特開平７−１２６２９４号公報）
（３）人乳由来の分子量１６±２ｋＤａ又は１３±２ｋＤａの新規タンパク質およびその製造方法（特開平１０−８０２８１号公報）
（４）牛乳から調製された牛乳由来塩基性シスタチン及び／又は牛乳由来塩基性シスタチン分解物を有効成分とする骨吸収阻害剤（特開２０００−２８１５８７号公報）
（５）乳塩基性蛋白質（ＭＢＰ）中に含まれるシスタチンＣ、及びインビトロにおける該シスタチンＣによる骨吸収阻害効果（バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー［Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、日本、第６６巻、第１２号、２００２年、ｐ．２５３１−２５３６）
ほ乳類乳に多量に含有されるタンパク質として、ラクトフェリン及びβ−カゼインなどが挙げられる。カゼインは、αｓ−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインに分類され、人乳中のカゼインは、β−カゼインがほとんどであり、αｓ−カゼインは存在しないが、又は痕跡程度認められるのみであるが、牛乳中のカゼインは、αｓ−カゼイン、β−カゼインをほぼ等量含む。カゼインは栄養成分としての働きの他に、最近ではそのタンパク質の一次構造に潜在的に含まれるカルシウム吸収促進作用やマクロファージ貪食活性化作用を有する生理活性ペプチド等が発見され、注目を集めている。また、カゼインは高い栄養価とともに、乳製品の原材料として、あるいは、チーズ、ヨーグルト、スキムミルク等の様々な食品に含まれ、我々の食生活に寄与している。
カゼインを利用した発明としては、本出願人により、すでにκ−カゼイン又はκ−カゼインの加水分解物を有効成分とする動脈硬化防止剤（特開平８−８１３８８号公報）が開示されている。
また、ヒト乳から分離したβ−カゼイン若しくはその組換え形態又はそのいずれかの水解物は、インフルエンザ菌のヒト細胞への付着の阻害（特表平１０−５００１０１号公報）、及び哺乳動物細胞のＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）感染阻害（特表平１０−５００１００号公報）が開示されている。
更に、β−カゼイン加水分解物のアンジオテンシン変換酵素阻害活性（特開平６−１２８２８７号公報及び特開平６−２７７０９０号公報）が開示されている。
しかしながら、カゼイン及びその部分ペプチドがシステインプロテアーゼ阻害作用を有することは知られていない。
【発明の開示】
本発明は、食品素材として幅広く利用することが可能であり、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等の予防・治療剤、並びに各種飲食品及び飼料等に利用することが可能な、汎用性の高いシステインプロテアーゼ阻害剤を提供することを目的としている。
本発明者は、抗原性のない、安全な素材として利用する事が可能なシステインプロテアーゼ阻害物質を鋭意探索した結果、乳由来のタンパク質であるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及びカゼインの加水分解物にシステインプロテアーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は以下の（１）〜（２４）のとおりである。
（１） カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（２） カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である（１）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（３） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（４） 以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（５） カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（６） 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である（５）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（７） 前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である（５）又は（６）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（８） 前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである（５）〜（７）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（９） カゼイン加水分解物を全量に対して０．００５質量％以上含有する、（５）〜（８）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１０）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である（１）〜（９）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１１） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等である（１０）のシステインプロテアーゼ阻害剤。
（１２） （１）〜（１１）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
（１３） （１）〜（１１）のいずれかのシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
（１４） カゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（１５） カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である、（１４）の使用。
（１６） 以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（１７） 以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
（１８） カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（１９） 前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である（１８）の使用。
（２０） 前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である（１８）又は（１９）の使用。
（２１） 前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである（１８）〜（２０）のいずれかの使用。
（２２） カゼイン加水分解物をシステインプロテアーゼ阻害剤の全量に対して０．００５質量％以上含有させることを特徴とする、（１８）〜（２１）のいずれかの使用。
（２３） システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、（１４）〜（２２）のいずれかの使用。
（２４） システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症等である（２３）の使用。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシ乳タンパク質の逆ザイモグラフィーの検出を示す図（写真）である。
図２は、ウシβ−カゼイン及びウシβ−カゼインペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
図３は、パパインに対するカゼイン類のシステインプロテアーゼ阻害効果を示す図である。
図４は、β−カゼインのシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを示す図である。
図５は、ヒトβ−カゼイン及びヒトβ−カゼインペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤に関する。本発明に用いられるカゼインとしては、市販の各種カゼイン、若しくはヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から常法（例えば、等電点沈殿法）により単離したもの、又は遺伝子組換え技術等によって生産されたものであってよい。カゼインは、α−カゼイン、β−カゼイン、及びκ−カゼインに分類されるが、本発明にはいずれのカゼインも用いることができ、好ましくはβ−カゼイン又はκ−カゼインを用いることができる。その中でも特にヒト由来のβ−カゼイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０５８１４に記載のアミノ酸配列を有するヒトβ−カゼイン）、及びウシ由来のβ−カゼイン（例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：Ｐ０２６６６に記載のアミノ酸配列を有するウシβ−カゼイン）が好ましい。具体的には、ヒトのβ−カゼインのアミノ酸配列を配列番号１、ウシのβ−カゼインのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明に用いられるカゼインの部分ペプチドとしては、例えば、前記カゼインを酸又はプロテアーゼにより公知の方法で加水分解し、生成した部分ペプチドを精製することにより得ることができる。一例としては、カゼインを１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でリシルエンドペプチダーゼにより３５℃で３時間以上消化し、生成した部分ペプチドを高速クロマトグラフ法等により精製することにより製造することができる。
本発明において使用することができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドの好ましい形態としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトβ−カゼイン、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドを例示することができる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するウシβ−カゼイン、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドも例示することができる。なお、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、及び配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１〜１５はシグナル配列である。
これらのカゼイン又はカゼインの部分ペプチドはシステインプロテアーゼ阻害活性を有するため、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤に用いることができる。また、完全長のカゼインがシステインプロテアーゼ阻害活性を有することから、配列表の配列番号１のアミノ酸番号１３３〜１５１を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチド、及び、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１４２〜１６０を含み、Ｎ末端側もしくはＣ末端側又はその両方に配列を延長させたアミノ酸配列を有するペプチドも、システインプロテアーゼ阻害活性を有すると考えられる。
これらのペプチドは、例えば、本発明によりシステインプロテアーゼ阻害活性領域が明らかになったので、該領域を含むアミノ酸配列に基づいて化学合成によって得ることもでき、また遺伝子組換え技術等により得ることもできる。例えば、該領域を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列をもとに適当なプライマーを作製し、該プライマーを用いて目的の塩基配列を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によって塩基配列を増幅し、得られた塩基配列を適当な発現系を用いて発現させることにより得ることができる。
また、通常遺伝子においては、種、属、個体等の違いによって、１又は複数個の位置での１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異が存在し、このような変異を有する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸においても変異が生じることがあるので、本発明に用いることができるカゼイン及びカゼイン部分ペプチドにおいても、システインプロテアーゼ阻害活性が損なわれない範囲でこのような変異を含むことが可能である。本発明に用いることができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド、並びに配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチドが例示される。ここで、複数とは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸、及び、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸において、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から５個、好ましくは、２から３個である。
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸、又は、配列表の配列番号２に記載のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸以外の範囲のアミノ酸において１又は複数個の置換・欠失等を含むものであってもよい。この場合の複数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、２から１０個、好ましくは、２から５個である。
さらに、本発明に用いることができるカゼイン又はカゼインの部分ペプチドとしては、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチド、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはペプチドと、アミノ酸配列において８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有し、システインプロテアーゼ阻害活性を有するタンパク質又はペプチドも例示される。
前記のようなカゼインタンパク質又はペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変することによって得られる。また、改変された塩基配列は従来知られている変異処理によっても取得されうる。変異を有する塩基配列は適当な細胞で発現させ、本発明の実施例に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性の測定法によってシステインプロテアーゼ阻害活性を調べることにより、カゼイン又はペプチドと実質的に同一のタンパク質又はペプチドをコードする塩基配列が得られる。
本発明においては、カゼインの加水分解物を用いることもできる。加水分解に用いるカゼインは、前述したようなものを挙げることができる。これらのカゼインを、以下のように加水分解酵素で加水分解することによって、カゼイン加水分解物を得ることができる。
すなわち、まず前記のような原料カゼインを水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、蛋白質換算で５〜１５％前後の濃度範囲にするのが効率性及び操作性の点から望ましい。得られた前記カゼインを含有する溶液を７０〜９０℃で１０分間〜１５秒間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から望ましい。次いで、前記カゼインを含有する溶液にアルカリ剤又は酸剤を添加し、ｐＨを使用する加水分解酵素の至適ｐＨ又はその付近に調整することが好ましい。本発明の方法に使用するアルカリ剤又は酸剤は、食品又は医薬品に許容されるものであれば如何なるアルカリ剤又は酸剤であってもよい。具体的には、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等を、酸剤としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸等を例示することができる。
次いで、前記カゼイン溶液に加水分解酵素溶液を添加する。加水分解酵素は蛋白質を加水分解する酵素であれば特に制限されず、動物由来、又は微生物由来の酵素であることが好ましい。また、酵素はエンドペプチダーゼであることが好ましい。エンドペプチダーゼとしては、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ等、種々の酵素を使用することができる。尚、「由来」とは、元来上記の生物が保持していることを意味し、採取原を意味するものではない。例えば、バチルス・ズブチリスが産生するプロテアーゼをコードする遺伝子をエシェリヒア・コリに導入し、同遺伝子を発現させることにより製造したプロテアーゼは、バチルス・ズブチリス「由来」である。
加水分解酵素はカゼイン１ｇ当たり２０〜２００活性単位（この単位については後記する）の割合で添加することが好ましい。ここで、活性単位は、例えば、次の方法により測定することができる。すなわち、プロテアーゼを含有する粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解して酵素溶液を調製する。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社製。以後Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応させ、その後３０％の酢酸溶液２ｍｌを添加して反応を停止させる。反応液をメンブランフィルターで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定する。プロテアーゼの活性単位は、１分間に１μｍｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量を１活性単位と定義し、次式により求めることができる。
活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ）
ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラニトロアニリンの吸光度を示す。
本発明において用いる加水分解酵素は１種でもよく、２種以上用いてもよい。２種以上の酵素を用いる場合は、それぞれの酵素反応は同時に行ってもよく、別々に行ってもよい。
酵素を添加した溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば３０〜６０℃、望ましくは４５〜５５℃に保持してカゼインの加水分解を開始する。加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ける。尚、本発明において、カゼイン加水分解物の分解率は、６〜４５％が特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の分解率が６％以上であると、より分解が進んでいると考えられる。すなわち、分解率が６％未満であると、酵素反応を受けない未分解のカゼインが残存している可能性が考えられることから、分解率は６％以上が好ましい。
尚、蛋白質の分解率の算出方法は、例えば、ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２頁、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７ページ、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出することができる。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
加水分解反応の停止は、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０〜１３０℃の温度範囲で３０分間〜２秒間の保持時間で行うことができる。尚、得られた反応液は必要に応じてクエン酸等の酸によりｐＨを５．５〜７の範囲に調整しても良い。
本明細書において、数平均分子量とは、数平均分子量に関する文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６乃至１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されるとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。即ち、蛋白質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、蛋白質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の一般式Ｉにより定義される。
［一般式Ｉ］
尚、本発明において数平均分子量を測定する場合は、高速液体クロマトグラフィーにより分子量分布を測定し、検量線からＧＰＣ分析システムによりデータ解析することにより、数平均分子量を算出することができる。高速液体クロマトグラフィーの具体的条件としては、カラムとして、ポリハイドロキシエチル・アスパルアミド・カラム［Ｐｏｌｙ Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ： ポリ・エル・シー（Ｐｏｌｙ ＬＣ）社製。４．６ｍｍ×４００ｍｍ］を使用し、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭギ酸により、溶出速度０．５ｍｌ／分で溶出する条件を挙げることができる。検出はＵＶ検出器（島津製作所。２１５ｎｍ）を使用して分子量分布を測定し、分子量が既知のサンプルにより検量線を作成し、ＧＰＣ分析システム（波長２１５ｎｍ：島津製作所社製）によりデータ解析し、数平均分子量を求めることができる。
尚、本発明において、カゼイン加水分解物の数平均分子量は、２００〜５０００ダルトンが特に好適である。ここで、カゼイン加水分解物の数平均分子量が５０００ダルトン以下である場合は、加水分解反応を受けない未分解のカゼインは含まれず、本願発明の有効成分であるカゼイン加水分解物をより確実に得ることができると考えられることから、数平均分子量は５０００ダルトン以下が好ましい。
得られたカゼイン加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じて、この溶液を公知の方法により濃縮した濃縮液、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥した粉末、として使用することもできる。
上記のようにして得られるカゼイン加水分解物は、システインプロテアーゼ阻害作用を有する。したがって、システインプロテアーゼ阻害作用を指標として、カゼイン加水分解物を製造する際の条件は、適宜設定することができる。
本発明のプロテアーゼ阻害剤においては、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、または加水分解物を単独で使用することも、これらのうちの２種以上を併用して使用することも可能である。さらに、カゼインの部分ペプチド及び加水分解物は、１種を単独で使用することも、複数種を混合して用いることも可能である。
本発明に用いることができるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、またはカゼイン加水分解物は、カテプシンＢ、Ｌ及びパパイン等のシステインプロテアーゼに対して阻害活性を有する。システインプロテアーゼ阻害活性は、Ｂａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］に従って測定することができる。例えば、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解したカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／または加水分解物を含む溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ− Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ− Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ ４−Ｍｅｔｈｙｌ− Ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−Ａｍｉｄｅ：最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣ（７−Ａｍｉｎｏ−４−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉｎ）の蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を使用し、これらを公知の製剤学的に許容される製剤担体と組合わせることにより製造することができる。本発明の製剤の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等を例示できる。製剤化にあたっては製剤担体として通常の薬剤に汎用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
本発明の製剤中に含まれるカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物の量は特に限定されず適宜選択すればよいが、例えばいずれも通常製剤中に０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％とするのがよい。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤を経口的、又は非経口的に患者に投与することにより、システインプロテアーゼが関与する疾患を治療することができる。ここで、患者とは、ヒトであってもよいし、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。本発明の製剤の投与方法は特に限定されず、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定される。本発明の製剤の有効成分の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常有効成分としてのカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物の量は、０．１〜１２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのが良く、１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えばアレルギー、筋ジストロフィー、筋萎縮症、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、白内障、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、前立腺肥大症、乳癌、前立腺癌、歯周病等の予防・治療剤、若しくは癌細胞の増殖や転移の抑制剤、又は細菌（スタフィロコッカス・アウレウスＶ８等）やウイルス（ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、エイズウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防・治療効果、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制効果を高めることができる。併用する公知の前記疾患の予防・治療剤、又は前記細菌・ウイルス増殖抑制剤は、本発明の阻害剤中に有効成分として含有させても良いし、本発明の阻害剤中には含有させずに別個の薬剤として組合わせて商品化して使用時に組み合わせても良い。
本発明の飲食品組成物は、食品又は飲料の原料にカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、経口的に摂取することが可能である。前記原料は、通常の飲料や食品に用いられているものを使用することができる。本発明の飲食品組成物は、システインプロテアーゼ阻害剤を添加する以外は、通常の飲食品組成物と同様にして調製することができる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類：加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。
本発明の飲食品組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加する量は、飲食品組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の食品又は飲料中０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％となるように添加すればよい。
本発明の飼料組成物は、飼料にカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加して製造することができ、一般的な哺乳動物や家畜類、養魚類、愛玩動物に経口的に投与することが可能である。飼料組成物の形態としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が例示され、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、酵母類等とともに混合して本発明の飼料組成物を製造することができる。
本発明の飼料組成物において、カゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／またはカゼイン加水分解物を添加する量は、飼料組成物の形態によって適宜設定されるが、通常の飼料中０．００５〜８０質量％、好ましくは０．０５〜６０質量％となるように添加すればよい。
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、システインプロテアーゼが関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここに、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
以下に、本発明のシステインプロテアーゼ阻害剤の有効成分として使用したカゼインの部分ペプチドまたはカゼイン加水分解物の製造例を示す。
［製造例１］
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドを、以下の方法により製造した。
尚、前記本発明のペプチドは、自動アミノ酸合成装置（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４３３Ａ）を用いて合成を行い製造を行った。
２０％ピペリジン含有Ｎ−メチルピロリドン（アプライド・バイオシステムズ社製。以下、Ｎ−メチルピロリドンをＮＭＰと略記する）により、ペプチド合成用固相樹脂であるＨＭＰ樹脂（アプライド・バイオシステムズ社製）のアミノ保護基であるＦｍｏｃ基を切断除去し、ＮＭＰで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−スレオニン［具体的には、合成するペプチドのＣ末端アミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アミノ酸（アプライド・バイオシステムズ社製）］をＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）リージェントキット（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用して縮合させ、ＮＭＰで洗浄した。次に、前記Ｆｍｏｃ基の切断、続いて、Ｃ末端から２番目のアミノ酸に相当するＦｍｏｃ−アラニンの縮合、及び洗浄を行い、さらにＦｍｏｃ−アミノ酸の縮合及び洗浄を繰り返し、保護ペプチド樹脂を作製し、樹脂より粗製ペプチドを回収した。
前記粗製ペプチドから、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）によりペプチドの精製を行った。使用するカラムは逆相系のＣ１８−ＯＤＳ（メルク社製。Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００）を例示することができる。得られた精製ペプチドはＨＰＬＣ分析を行い、精製物が単一であることを更に確認した。また、精製ペプチドのアミノ酸配列を、気相式自動アミノ酸シーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製。Ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ）を用いて決定した結果、配列番号１のアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有していた。
尚、同様の方法により配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドも製造した。
［製造例２］
市販牛乳カゼイン「アラシッド」（蛋白質含量９０％、ニュージーランドミルクプロダクツ製）１００ｇを６０℃に加熱した精製水に１０％濃度に懸濁し、２．５ｇの水酸化ナトリウムを加えて完全に溶解した。その後、８５℃で１０分間の殺菌を行い、溶解液を５０℃に調整した後、加水分解酵素として、パンクレアチン（天野エンザイム社製、１１２，０００Ｕ／ｇ）を２５００Ｕ添加し、５０℃で４時間保持することによって加水分解し、９０℃で１０加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約１００ｇを得た。得られたカゼイン加水分解物の分解率は９．５％、数平均分子量は９１０ダルトンであった。
［製造例３］
市販カゼインナトリウム「アラネート」（蛋白質含量９０％、ニュージーランドミルクプロダクツ製）１００ｇを５０℃に加熱した精製水に１２％濃度に溶解した。その後、８５℃で１０分間の殺菌を行い、溶解液を４０℃に調整した後、加水分解酵素として、ブタトリプシン（ＰＴＮ６．０Ｓ；ノボザイム社製、１，２５０Ｕ／ｇ）を２５０Ｕ添加し、４０℃で６時間保持することによって加水分解し、９０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活した後、凍結乾燥することによりカゼイン加水分解物約１００ｇを得た。得られたカゼイン加水分解物の分解率は１０．８％、数平均分子量は７５０ダルトンであった。
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、乳中のシステインプロテアーゼ阻害物質を検出するために行った。
（１）検出法
本発明者はプロテアーゼ阻害物質の検出法として「逆ザイモグラフィー」という手法を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のゲル上に存在するプロテアーゼ阻害物質の検出を行った。逆ザイモグラフィーとは通常のザイモグラフィーの逆の手法によるものであり、基本的原理は次のとおりである。即ち、ゼラチンを含むＳＤＳポリアクリルアミドゲルにプロテアーゼ阻害物質を含むサンプルをアプライし、電気泳動を行った後にゲルをプロテアーゼ溶液に浸漬してゲル中のタンパク質を分解する。この操作により阻害物質が存在する部分はプロテアーゼの活性を阻害することから、ゼラチンはプロテアーゼによる分解を免れ、これが染色液によって染色されることにより、阻害物質を識別することが可能となる。
（２）試験方法
本発明における逆ザイモグラフィーの方法は以下のとおりである。
牛乳中の全タンパク質及び天然のウシβ−カゼインをサンプルとし、０．１％ゼラチンを含む１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、電気泳動（以下、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をＳＤＳ−ＰＡＧＥと略記することがある。）を行った。泳動後、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液に４５分間浸漬して洗浄した後、更に４５分間蒸留水に浸漬する操作を３回繰り返してゲルを洗浄した。このゲルを、１ｍｇパパイン（３１ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに浸漬し、３７℃で１０時間保温してゼラチンを消化した。ゲルを蒸留水で洗浄後、染色液（０．０２５％クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）Ｒ−２５０、４０％メタノール、７％酢酸水溶液）で１時間染色し、その後脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸水溶液）で脱色を行った。
これとは別に、対照試験としてゼラチンを含まない１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて前記と同様に逆ザイモグラフィーを行った。さらに、通常の１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）を行った。
（３）試験結果
本試験の結果は図１に示すとおりである。図１は逆ザイモグラフィーのパターンを示す結果である。図１の１レーンは牛乳中の全タンパク質の通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥのパターン、２レーンは牛乳中の全タンパク質の逆ザイモグラフィーのパターン、３レーンは牛乳中の全タンパク質のゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターン、６レーンは天然のウシβ−カゼインの逆ザイモグラフィーのパターン、７レーンは天然のウシβ−カゼインのゲルにゼラチンを含まない逆ザイモグラフィー（対照）のパターンを各々示している。尚、図中矢印は天然のウシ由来β−カゼイン（分子量３５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる泳動位置を示している。尚、４レーン及び５レーンは、本試験例とは直接関係がない。
図１から明らかなとおり、２レーンにおいてウシβ−カゼインの泳動位置（３５ｋＤａ）とほぼ同位置に逆ザイモグラフィーのポジティブなバンドが確認された。このことより、牛乳中にシステインプロテアーゼ阻害活性を有する物質の存在が確認された。また、６レーンにおいて天然のウシβ−カゼインを泳動したパパインを用いた逆ザイモグラフィーにおいて、ポジティブなバンドが確認された。
以上の結果から、ウシ由来のβ−カゼインにシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが示唆された。
［試験例２］
本試験は、試験例１においてシステインプロテアーゼ阻害活性が示唆された３５ｋＤａのバンドについてＮ末端アミノ酸配列を決定するために行った。
（１）試験方法
試験例１で使用した牛乳中の全タンパク質サンプルを同様に使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＣＢＢで染色後、３５ｋＤａ付近に泳動された染色バンドを切り出した。このバンドについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図２に示すとおりである。図２は牛乳中の３５ｋＤａ染色バンドのアミノ酸配列を決定した結果である。その結果、３５ｋＤａ染色バンドのＮ末端アミノ酸配列はウシβ−カゼインのそれと完全に一致した。従って、本試験の結果と試験例１の結果の両者から、ウシβ−カゼインはシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例３］
本試験は、カゼイン分子中におけるシステインプロテアーゼ阻害活性を有する領域を検索するために行った。
（１）試験方法
ウシβ−カゼイン２５０μｇを、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、リシルエンドペプチダーゼにより３５℃で１６時間消化した。消化後のウシβ−カゼインペプチド混合物にシステインプロテアーゼ阻害活性が保持されているかどうかを確認するために、システインプロアーゼ阻害活性を測定した。
阻害活性の測定方法はＢａｒｒｅｔｔ等の方法［メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第８０巻、第５３５〜５６１ページ、１９８１年］を参考にして、次のとおり行った。即ち、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解したウシβ−カゼインペプチド混合物溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼ（本試験ではパパイン：シグマ社製）溶液（最終濃度：１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣの蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立社製）を用いて測定した。
測定の結果、ウシβ−カゼインペプチド混合物に阻害活性が保持されていることが確認されたので、引き続きペプチド混合物について、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＤＤＳ−８０Ｔｓカラム（東ソー社製）を用いた逆相ＨＰＬＣによるアセトニトリル直線濃度勾配溶出法によって、主要なピークを分離した。次に、分離したピークのサンプル（以下、ペプチドサンプルと記載する。）の各々について、前記と同様の方法でシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
ペプチドサンプルの阻害活性測定の結果、活性を有するペプチドサンプルについて、ヒューレットパッカード社製Ｇ１００５Ａプロテインシーケンシングシステムを用いてそのアミノ酸配列を決定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図２に示すとおりである。その結果、阻害活性を有する主要なペプチドサンプルは、図２中のウシβ−カゼインのアミノ酸配列における１４２残基目Ｌｅｕから１６０残基目Ｈｉｓまでのアミノ酸配列（下線部：以下、該配列のペプチドをウシβ−カゼインペプチドと記載する。）を有することが判明した。
［試験例４］
本試験は、カゼイン類のシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料として、ウシβ−カゼイン、ウシα−カゼイン、及びウシκ−カゼインを各々用いて、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により前記試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は、図３に示すとおりである。図３は、ウシβ−カゼイン、ウシα−カゼイン、及びウシκ−カゼインのパパインに対するシステインプロテアーゼ阻害効果を示す。その結果、β−カゼイン及びκ−カゼインは１０−５Ｍの濃度でパパインを完全に阻害し、α−カゼインについても若干弱いながらも１０−４Ｍでパパインの活性をほぼ阻害することが判明した。従って、β−カゼインだけでなく、κ−カゼインやα−カゼインについてシステインプロテアーゼ阻害活性を有することが明らかとなった。
［試験例５］
本試験は、ウシβ−カゼインのシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを測定するために行った。
（１）試験方法
試験試料としてウシβ−カゼイン、システインプロテアーゼとしてパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬを使用して、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを測定した。
（２）試験結果
本試験の結果は図４に示すとおりである。図４は、パパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬに対するウシβ−カゼインの阻害効果を測定した結果である。その結果、ウシβ−カゼインが１０−５Ｍでパパインを完全に阻害することが判明した。またカテプシンＢ及びカテプシンＬについてもウシβ−カゼインが１０−４Ｍでそれらのプロテアーゼ活性をほぼ阻害することが判明した。従って、ウシβ−カゼインはパパイン、カテプシンＢ、及びカテプシンＬのプロテアーゼ活性を阻害し、幅広いシステインプロテアーゼ阻害活性スペクトルを有することが明らかとなった。
［試験例６］
本試験は、ヒトβ−カゼインのシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試験方法
常法に従って精製したヒトβ−カゼイン（例えば、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス［Ｊ．Ｄａｉｌｙ Ｓｃｉ．］、第５３巻、第２号、第１３６〜１４５ページ、１９７０年、に記載の方法によって精製）、及び実施例１で合成した配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列（ヒトβ−カゼインのアミノ酸配列）のうち、アミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド（図５中、ヒトβ−カゼインの下線部ペプチド：以下、該配列のペプチドをヒトβ−カゼインペプチドと記載する。）を各々試験試料として、試験例３に記載のシステインプロテアーゼ阻害活性測定方法と同様の方法により、試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を測定した。
（２）試験結果
本試験の結果、ヒトβ−カゼインは１０−５Ｍでパパインのプロテアーゼ活性をほぼ完全に阻害することが判明した。また、ヒトβ−カゼインペプチドは、１０−５Ｍでパパインのプロテアーゼ活性を６５％阻害し、１０−４Ｍでパパインのプロテアーゼ活性を完全に阻害することが判明した。
［試験例７］
本試験は、カゼイン加水分解物のシステインプロテアーゼに対する阻害効果を測定するために行った。
（１）試料の調製
加水分解物としてパンクレアチンをそれぞれ２０００、８０００、及び９０００ユニット（ｕｎｉｔｓ）添加して製造したこと以外は、製造例２と同一の方法により製造したカゼイン加水分解物を試験試料１、試験試料２及び試験試料３とした。尚、試験試料１、試験試料２及び試験試料３の分解率（％）は、それぞれ８．２、３３．５及び３８．０であった。また、試験試料１、試験試料２及び試験試料３の数平均分子量（ダルトン）は、それぞれ１０２０、２５０及び２１０であった。
（２）試験方法
０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５．５に溶解した試験試料溶液に、基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（最終濃度２０ｍＭ：ペプチド研究所社製）を添加し、システインプロテアーゼであるパパイン溶液（最終濃度１５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を添加して混合し、３７℃で１０分間反応させた後、消化を受けた基質から遊離したＡＭＣの蛍光強度（励起波長：３７０ｎｍ、発光波長：４６０ｎｍ）を蛍光分光度計（日立製作所社製）を用いて測定した。
（３）試験結果
本試験の結果は、表１に示すとおりである。表１は、各試験試料のシステインプロテアーゼ阻害活性を示す。その結果、試験試料１は、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を３９％阻害し、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度では６１％阻害した。試験試料２は、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を７６％阻害し、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度においても５０％阻害した。試験試料３は、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でパパインによるシステインプロテアーゼ活性を５３％阻害し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で４４％、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度においても３７％阻害した。
【表１】
【実施例】
次に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。尚、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
（ウシβ−カゼインを配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
ウシβ−カゼイン（シグマ社製） ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシβ−カゼイン、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例２】
（カプセル入りウシβ−カゼインの調製）
乳糖（和光純薬工業社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びウシβ−カゼイン（シグマ社製）６００ｇを、５０メッシュ篩（ヤマト科学社製）により篩分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（Ｃｅｓｅｒｅ Ｐｅｄｉｎｉ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．Ｙｅｌｌｏｗ Ｎｏ．６ Ｂｏｄｙ、空重量は７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、ウシβ−カゼイン８２ｍｇ入りのカプセル剤７，０００個を得た。
【実施例３】
（ウシβ−カゼインを添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、ウシβ−カゼイン（シグマ社製）１ｇを添加し、ウシβ−カゼイン約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例４】
（ウシβ−カゼインを添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及びウシβ−カゼイン（シグマ社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシβ−カゼインを含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【実施例５】
（ウシカゼイン加水分解物を配合した錠剤の調製）
次の組成からなる錠剤のシステインプロテアーゼ阻害剤を次の方法により製造した。
製造例２で製造したカゼイン加水分解物 ４０．０（％）
乳糖（森永乳業社製） １８．５
トウモロコシ澱粉（日清製粉社製） ３０．７
ステアリン酸マグネシウム（太平化学産業社製） １．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム（五徳薬品社製） ９．４
ウシカゼイン加水分解物、乳糖、トウモロコシ澱粉及びカルボキシメチルセルロースカルシウムの混合物に、滅菌精製水を適宜添加しながら均一に混練し、５０℃で３時間乾燥させ、得られた乾燥物にステアリン酸マグネシウムを添加して混合し、常法により打錠し、錠剤を得た。
【実施例６】
（ウシカゼイン加水分解物を添加した飲料の調製）
脱脂粉乳（森永乳業社製）９０ｇを５０℃の温湯８００ｍｌに溶解し、砂糖（日新製糖社製）３０ｇ、インスタントコーヒー粉末（ネスレ社製）１４ｇ、カラメル（昭和化工社製）２ｇ、及びコーヒーフレーバー（三栄化学社製）０．０１ｇ、を攪拌しながら順次添加して溶解し、１０℃に冷却し、製造例２で製造したウシカゼイン加水分解物１ｇを添加し、ウシカゼイン加水分解物約０．１％を含むシステインプロテアーゼ阻害効果を有する乳飲料を調製した。
【実施例７】
（ウシカゼイン加水分解物を添加した経腸栄養食粉末の調製）
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更にホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後に、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及び製造例２で製造したウシカゼイン加水分解物６０ｇを添加し、均一に混合して、ウシカゼイン加水分解物を含有するシステインプロテアーゼ阻害効果を有する経腸栄養食粉末約５７ｋｇを製造した。
【産業上の利用の可能性】
以上詳記したとおり、本発明はカゼイン、カゼインの部分ペプチド、及び／又はカゼイン加水分解物を有効成分とするシステインプロテアーゼ阻害剤に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）食品素材として利用することができるタンパク質、その部分ペプチド及び／又はその加水分解物であるので、安全性に優れ、日常的に長期間投与又は摂取が可能である。
（２）幅広いシステインプロテアーゼに対して阻害活性スペクトルを有する。
（３）システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤として使用することが可能である。
（４）特定保健用食品、栄養補助食品を含む機能性食品等の製造等の用途に利用することが可能である。
（５）食品加工分野における食品の物性調節剤として利用することが可能である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である請求項１に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項４】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項５】
カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項６】
前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である請求項５に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項７】
前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である請求項５又は６に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項８】
前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項９】
カゼイン加水分解物を全量に対して０．００５質量％以上含有する、請求項５〜請求項８のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１０】
システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１１】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症である請求項１０に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
【請求項１４】
カゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項１５】
カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項１７】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項１８】
カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項１９】
前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである請求項１８〜請求項２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
カゼイン加水分解物をシステインプロテアーゼ阻害剤の全量に対して０．００５質量％以上含有させることを特徴とする、請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、請求項１４〜請求項２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症である請求項２３に記載の使用。
【請求項１】
カゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である請求項１に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項３】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項４】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドを有効成分として含むシステインプロテアーゼ阻害剤。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項５】
カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物を有効成分として含有するシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項６】
前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である請求項５に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項７】
前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である請求項５又は６に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項８】
前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項９】
カゼイン加水分解物を全量に対して０．００５質量％以上含有する、請求項５〜請求項８のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１０】
システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１１】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症である請求項１０に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシステインプロテアーゼ阻害剤を患者に投与することを特徴とする、システインプロテアーゼが関与する疾患の治療方法。
【請求項１４】
カゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項１５】
カゼイン又はその部分ペプチドがヒト又はウシ由来である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１３３〜１５１のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項１７】
以下の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すカゼイン又はその部分ペプチドの、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチド。
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくともアミノ酸番号１４２〜１６０のアミノ酸配列を有するペプチドであって、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、且つシステインプロテアーゼ阻害活性を有するペプチド。
【請求項１８】
カゼインを加水分解酵素で加水分解することによって得ることができ、かつ、システインプロテアーゼ阻害作用を有するカゼイン加水分解物の、システインプロテアーゼ阻害剤の製造のための使用。
【請求項１９】
前記加水分解酵素が、動物又は微生物由来の加水分解酵素から選択される１種又は複数種である請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記カゼイン加水分解物の分解率が６〜４５％である請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記カゼイン加水分解物の数平均分子量が２００〜５０００ダルトンである請求項１８〜請求項２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
カゼイン加水分解物をシステインプロテアーゼ阻害剤の全量に対して０．００５質量％以上含有させることを特徴とする、請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
システインプロテアーゼ阻害剤が、システインプロテアーゼが関与する疾患の予防・治療剤である、請求項１４〜請求項２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
システインプロテアーゼが関与する疾患が、骨粗鬆症、悪性腫瘍性高カルシウム血症、乳癌、前立腺癌、歯周病、又は細菌・ウイルス感染症である請求項２３に記載の使用。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０１１８
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７０７１９（Ｐ２００４−５７０７１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４２６３
【国際出願日】平成１５年１１月１０日（２００３．１１．１０）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４２６３
【国際出願日】平成１５年１１月１０日（２００３．１１．１０）
【出願人】（０００００６１２７）森永乳業株式会社 (269)
【Ｆターム（参考）】
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